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WO2001014885A2 - Indikatorpeptid zur diagnose und/oder vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen erkrankungen, antikörperzusammensetzung und immunoassay - Google Patents

Indikatorpeptid zur diagnose und/oder vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen erkrankungen, antikörperzusammensetzung und immunoassay Download PDF

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Publication number
WO2001014885A2
WO2001014885A2 PCT/AT2000/000224 AT0000224W WO0114885A2 WO 2001014885 A2 WO2001014885 A2 WO 2001014885A2 AT 0000224 W AT0000224 W AT 0000224W WO 0114885 A2 WO0114885 A2 WO 0114885A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
procnp
antiköφer
seq
complex
immunoassay
Prior art date
Application number
PCT/AT2000/000224
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2001014885A3 (de
Inventor
Wolfgang Woloszczuk
Gerhard Hawa
Original Assignee
Biomedica Gesellschaft Mbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomedica Gesellschaft Mbh filed Critical Biomedica Gesellschaft Mbh
Priority to DE10082504T priority Critical patent/DE10082504B4/de
Priority to AU64150/00A priority patent/AU6415000A/en
Publication of WO2001014885A2 publication Critical patent/WO2001014885A2/de
Publication of WO2001014885A3 publication Critical patent/WO2001014885A3/de

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin

Definitions

  • Indicator peptide for the diagnosis and / or prediction of cardiovascular and / or endothelial diseases.
  • the invention relates to an indicator peptide for the diagnosis and / or prediction of cardiovascular and / or endothelial diseases, to an antibody composition for the determination of C-type natriuretic peptides and to an immunoassay method for pro CNP (1-80), an immunoassay for Determination of human pro CNP (l-80) and an in vitro diagnostic or progno sev experienced.
  • Cardiovascular damage is a common clinical disease that contributes to or is responsible for various syndromes, especially in the elderly, such as for arteriosclerosis, kidney failure and the like.
  • CNP C-type natriuretic peptide
  • CNP C-type natriuretic peptide
  • T. Sudoh and his collaborators Biochem-Biophys.Res. Commun., 168: 863-879, 1990.
  • human CNP is produced in the human vascular system by endothelial cells (S. Suga et al, J.Clin Invest 1992: 90: 1145-9). It is believed that human C-type natriuretic peptide is produced as a precursor consisting of 126 amino acids.
  • proCNP proCNP or CNP (1-103)
  • ProCNP is cleaved before or during secretion to form the biologically active form of CNP, CNP-22.
  • a prolonged form at the N-terminus, CNP 53, is the molecular form of CNP which occurs mainly in the porcine brain (Minamino et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 170: 973-9).
  • CNP immunoreactivity was found in human vascular endothelial cells (Singo et al Am.
  • proCNP (1-80) and proCNP (1-50), i.e. the peptides consisting of the first 80 and 50 amino acids, respectively, calculated from the N-terminus of proCNP, are in patients suffering from endothelial diseases (e.g. arteriosclerosis, Naruka T. et al, Circulation 1996; 94: 3103-8) and kidney failure (Igaki T. et al, Kidney Int. Suppo. 1996, 55: 144-7).
  • the present invention is based on the consideration that the N-terminal fragments of human proCNP (1-103) (SEQ ID NO: 1), similar to proCNP (1-80) and proCNP (1-50), due to their versus CNP -Hormones (CNP-22 or CNP 53) long half-life as good diagnostic indicators or means of prognosis for all cases of endothelial damage or renal diseases, eg Risk for
  • Arteriosclerosis septic shock or chronic kidney dysfunction can serve.
  • ProCNP (1-80) SEQ ID NO: 1
  • an immunogenic Fragment therefrom can advantageously be conjugated to an immunogenic protein or peptide as is known from the prior art.
  • the invention is to provide an indicator polypeptide
  • polypeptide according to the invention being the N-terminal fragment proCNP (1-80) (SEQ ID NO: 1) of the C-type natriuretic precursor amino acid
  • polypeptides can be used to obtain polyclonal or monoclonal antibodies that are specific for CNP (1-80) (SEQ ID NO: 1).
  • Another aspect of the present invention is a
  • Immunoassays are of course known in the art, e.g. RIA, EIA, fluorescence immunoassay (FIA) or dry chemistry test strip immunoassays.
  • a monoclonal or polyclonal antibody according to the invention in immobilized form, e.g. on a microtiter plate, on membranes or particles to isolate the target compound proCNP (l-SO).
  • the bound antigen can be detected in a sandwich assay by means of an additional soluble antibody according to the invention, which can be a monoclonal or polyclonal antibody.
  • This antibody can either carry a label or, even more simply, can be labeled even later by reacting with a second antibody that carries a label.
  • the second antibody can be an anti-sheep antibody.
  • Suitable labels include radionuclides, fluorescent substances, for example europium based hybrid processes, dyes or colored particles, such as colloidal gold.
  • a binding assay can be used in which a known amount of labeled human proCNP (1-80) (SEQ.ID NO.l) or an antigenic fragment thereof is added to an analyte solution and brought into contact with a limited amount of immobilized antibody, whereby the amount of labeled antigen that is immobilized is inversely proportional to the amount of target antigen present in the analyte.
  • the present invention further provides an immunoassay kit made from human proCNP (1-80) (SEQ ID NO: 1), an antigenic fragment thereof or a polypeptide extension thereof, which contains the following:
  • Such an immunoassay and test kit can be used to examine related biological systems, as well as to diagnose or predict conditions in which the titer of human proCNP (1-80) (SEQ ID NO: 1) in body fluids is a diagnostic or is a preventive indicator.
  • Another object of the present invention is also a method for
  • human proCNP (1-80) (SEQ ID NO: 1) can also be used as a diagnostic tool for risk assessment for the development of arteriosclerosis (Naruka T. et al, circulation 1996, 94: 3103-8).
  • the body fluid on which the immunoassay is carried out can be any body fluid in which human proCNP (1-80) (SEQ ID NO: 1) is present; however, plasma serum or urine will usually be used. In some cases it may be appropriate to extract the peptides or otherwise treat the sample before performing the assay.
  • the human proCNP (1-80) (SEQ ID.NO.l) peptide or an antigen or immunogenic fragment thereof can be synthesized from the amino acids making them up using techniques well known in science, or formed by assembling pre-synthesized amino acid blocks. Recombinant expression of peptides is of course another very appropriate method of generating the antigen for immunization. Where marked material is necessary, the marking can be made using standard techniques.
  • the human proCNP (1-80) (SEQ.ID NO: 1) or an antigenic fragment thereof can be conjugated to an immunogenic protein or peptides as is known in the art.
  • the antibodies according to the invention can be produced by injecting proCNP antigen according to the invention into a host animal, etc. advantageously by a conjugate with an immunogenic protein as described above.
  • Suitable host animals are, for example, a sheep, either to produce a serum which contains polyclonal antibodies, or, for example, a mouse or a rabbit, to obtain spleen cells for conversion to hybridomas or immortalized cell lines and thus to produce monoclonal antibodies.
  • Example 1 Production of polyclonal or monoclonal antibodies against CNP (1-80)
  • proCNP (1-80) SEQ ID NO: 1
  • proCNP (1-19) proCNP (1-19)
  • proCNP proCNP
  • proCNP proCNP
  • proCNP proCNP
  • 51-79 proCNP
  • the sheep received 2 mg of the corresponding 10 antigen mixed with non-ulcerative Freund's adjuvant (Guildhay, GB) and BCG (bacillus Calmette Guerlin)
  • Microtiter plates were coated with synthetic proCNP peptide sequences (1 ⁇ g / ml). Sample blood was in phosphate buffer with 3% BSA 1:
  • Monoclonal antibodies can be produced analogously, mice or rabbits being used as host animals and hybridomas being produced by processes known in the art.
  • Example 2 Immunoassay for proCNP (1-80) (SEQ ID NO: 1) or immunoreactive fragments thereof.
  • the antibodies can be used in various types of immunoassay for proCNP (1-80) (SEQ ID NO: 1) or immunoreactive fragments thereof. These include
  • Enzyme-linked immunosorbent assay including 30 "sandwich” -type methods performed on microtiter plates or membranes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Indikatorpolypeptid zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen Erkrankungen, wobei das Peptid, das N-terminale Fragment proCNP (1-80)(SEQ.ID NO:1) des C-Typ-natriuretischen Precursers (1-26 Aminosäuren, Swiss Prot; P23582) ist.

Description

Indikatorpeptid zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen Erkrankungen. Antikörperzusammensetzung und Immunoassav
Die Erfindung bezieht sich auf ein Indikatorpeptid zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen Erkrankungen, auf eine Antikörperzusammensetzung zur Bestimmung von C-Typ natriuretischen Peptiden sowie auf ein Immunoassay-Verfahren für pro CNP(l-80), einen Immunoassay zur Bestimmung von humanem pro CNP(l-80) und ein in vitro-Diagnose- bzw. Pro gno s e v erfahren . Cardiovasculäre Schäden sind häufige klinische Krankheiten, die zu verschiedenen Syndromen beitragen oder, speziell bei älteren Personen, dafür verantwortlich sind, wie z.B. für Arteriosklerose, Nierenversagen u.dgl. Es gibt einige Marker, die in der Lage sind, die Diagnose von solchen Zuständen zu erleichtern. Es ist verständlich, daß einfache Screening-Verfahren, die Risikopersonen identifizieren und eine rasche Diagnose erlauben, hilfreich für ein zeitgerechtes Einschreiten und Verhindern des Fortschreitens der Krankheiten sind. Es ist daher wünschenswert, solche Risikopersonen schon zu identifizieren, bevor sich die Krankheit ausgebildet hat, um so ein zeitgerechtes Einschreiten der Medizin zu ermöglichen.
Derzeit gibt es wenige Methoden, die die Wahrscheinlichkeit von cardiovasculären Erkrankheiten vorherzusagen vermögen. Häufig beobachtete Probleme mit derartigen Verfahren sind die ungenügende Genauigkeit und Empfindlichkeit oder das Erfordernis nach Ausarbeitung von Untersuchungen oder einer teuren Ausrüstung, für die ein speziell trainiertes Personal erforderlich ist. Es besteht daher der Bedarf für ein einfaches Verfahren einer genauen und empfindlichen Methode, die nicht nur diagnostiziert, sondern auch die Wahrscheinlichkeit einer cardiovasculären Erkrankung vorhersagen kann. u.zw. entweder als chronischer Zustand oder als akuter Zustand, wie beispielsweise septische Komplikationen. Personen mit besonderem Risiko vor dem Auftreten größerer Schäden identifizieren, erfassen und behandeln zu können, würde große klinische Bedeutung haben. Derzeit existierende Behandlungen sind teuer und auch alternative Erfindungen sind kostenaufwendig, sodaß es nicht kosteneffektiv ist, jedermann ohne Indikation in der Absicht zu behandeln, das Entstehen einer Krankheit zu verhindern. C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) ist ein Polypeptid, das ursprünglich aus Schweinehirn durch T. Sudoh und seine Mitarbeiter (Biochem- Biophys.Res. Commun., 168:863-879, 1990) isoliert wurde. Nach Klonieren und Durchführen der Sequenzanalyse der cDNA, die für das Peptid kodiert, wurde gezeigt, daß menschliches CNP im menschlichen Vascularsystem durch Endothelialzellen erzeugt wird (S. Suga et al, J.Clin Invest 1992: 90: 1145 - 9). Es wird angenommen, daß menschliches C-Typ natriuretisches Peptid als ein Precurser, der aus 126 Aminosäuren besteht, produziert wird. Von den ersten 23 Resten wird angenommen, daß sie als Signalpeptid wirken, wobei diese ersten 23 Reste abgeschnitten werden, um proCNP zu erhalten (proCNP oder CNP(1-103)). ProCNP wird vor oder während der Sekretion gespalten, um die biologisch aktive Form von CNP, CNP-22 zu bilden. Eine am N-Terminus verlängerte Form, CNP 53, ist die hauptsächlich im Schweinehirn (Minamino et al, Biochem. Biophys. Res. commun. 1990, 170:973-9) vorkommende molekulare Form von CNP. CNP Immunreaktivität wurde in menschlichen Vascularendothelzellen (Singo et al Am. J.Physiol 199; 263: H1318-21) in Plasma und in Nieren (Mattingly et al. Kidney Int. 1994; 46: 744-7) gefunden. Die Plasmakonzentrationen von proCNP (1-80) und proCNP (1-50), das sind die Peptide, die aus den ersten 80 bzw. 50 Aminosäure, gerechnet vom N-Terminus von proCNP bestehen, sind in Patienten, die an endothelialen Erkrankungen (z.B. Arteriosklerose, Naruka T. et al, Circulation 1996; 94:3103-8) und Nierenversagen (Igaki T. et al, Kidney Int. Suppo.1996, 55: 144-7) leiden, erhöht.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Überlegung, daß die N-terminalen Fragmente von menschlichem proCNP (1-103)(SEQ ID NO:l), ähnlich wie proCNP (1-80) und proCNP (1-50), aufgrund ihrer gegenüber CNP-Hormonen (CNP-22 bzw. CNP 53) langen Halbwertszeit als gute diagnostische Indikatoren oder Prognosemittel für alle Fälle von endothelialen Schäden oder renalen Krankheiten, z.B. Risiko für
Arteriosklerose, septischen Schock oder chronischer Nierendisfunktion dienen können.
Menschliches proCNP (1-80) (SEQ ID NO: l) und proCNP (1-50) kann daher als
Basis entweder für ein Diagnose- oder für einen Prognosetest für die vorgenannten Zustände, und auch in erster Linie für die Biosynthese von Antikörpern, zum Gebrauch in solchen Tests dienen, weiters aber auch als Antigen für einen kompetitiven Bindungsimmunoassay. ProCNP(l-80) (SEQ ID NO:l) oder ein immunogenes Fragment daraus kann vorteilhafterweise an ein immunogenes Protein oder Peptid, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, konjugiert werden.
Demgemäß liegt die Erfindung in der Schaffung eines Indikatorpolypeptids zur
Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen Erkrankungen, wobei das Polypeptid erfindungsgemäß das N-terminale Fragment proCNP (1-80)(SEQ ID NO:l) des C-Typ natriuretischen Prekursers Aminosäure
(1-126) Swiss Prot. P23582) ist.
Derartige Polypeptide können zur Erzielung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper eingesetzt werden, die spezifisch auf CNP( 1-80) (SEQ ID NO:l) sind. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Immunoassay-Verfahren für menschliches CNP(1-80)(SEQ ID NO: l), ein antigenes Fragment davon, oder eine Polypeptidverlängerung davon zur Verfügung zu stellen, wobei der primäre Bindungspartner ein monoklonaler oder polyklonaler Antiköφer gemäß der vorliegenden Erfindung ist. Immunoassays sind natürlich im Stand der Technik bekannt, wie z.B. RIA, EIA, Fluoreszenzimmunoassay (FIA) oder Trockenchemieteststreifen-Immunoassays. So ein Immunoassay verwendet grundsätzlich einen monoklonalen oder polyklonalen Antiköφer gemäß der Erfindung in immobilisierter Form, z.B. an einer Mikrotiteφlatte, an Membranen oder Partikel, um die Ziel-Verbindung proCNP(l-SO) zu isolieren. In einem Sandwichassay kann das gebundene Antigen mittels eines zusätzlichen löslichen Antiköφers gemäß der Erfindung, der ein monoklonaler oder polyklonaler Antiköφer sein kann, nachgewiesen werden. Dieser Antiköφer kann entweder eine Markierung tragen oder, noch einfacher, selbst später durch Reaktion mit einem zweiten Antiköφer, der eine Markierung trägt, markiert werden. Wenn dabei also der erste Antiköφer gemäß der Erfindung in einem Schaf gezüchtet wurde, kann der zweite Antiköφer ein Antischafantiköφer sein.
Geeignete Markierungen umfassen Radionuklide, fluoreszierende Substanzen, z.B. Europium basierte Hybridverfahren, Farbstoffe oder gefärbte Partikel, wie z.B. kolloidales Gold. Alternativ kann ein Bindungsassay verwendet werden, bei welchem eine bekannte Menge von markiertem menschlichem proCNP(l-80) (SEQ.ID NO.l) oder ein antigenes Fragment davon einer Analytlösung zugesetzt und mit einer begrenzten Menge von immobilisiertem Antiköφer in Kontakt gebracht wird, wodurch die Menge des markierten Antigens, welches immobilisiert wird, umgekehrt proportional der Menge des im Analyt vorhandenen Zielantigens ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Immunoassay-Kit aus menschlichem proCNP(l-80)(SEQ ID NO:l), einem antigenen Fragment davon oder einer Polypeptidverlängerung davon, welche folgendes enthält:
(a) einen Antiköφer gemäß der vorliegenden Erfindung in immobilisierter Form, und
(b) eine weitere Komponente ausgewählt aus
(bi) , eine markierte Probe von menschlichem proCNP(l-80)(SEQ ID NO:l) oder ein antigenes Fragment davon,
(bii) ein Antiköφer in nicht immobilisierter Form, und
(biii) ein markierter zweiter Antiköφer, der spezifisch für den nicht immobilisierten Antiköφer gemäß (bii) ist.
Ein solcher Immunoassay und Testsatz kann dazu verwendet werden, verwandte biologische Systeme zu untersuchen, sowie auch Diagnosen oder Prognosen von Zuständen zu stellen, in welchen der Titer von menschlichem proCNP(l-80)(SEQ ID NO:l) in Köφerflüssigkeiten ein diagnostischer oder präventiver Indikator ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur
Diagnose oder Prognose von Zuständen, in welchen die Konzentration von menschlichem proCNP(l-80)(SEQ ID NO: l) oder einem antigenen Fragment oder einer Polypeptidverlängerung davon ein diagnostischer oder prädiktiver Indikator ist, bei dem Köφerflüssigkeit eines Patienten in vitro einem Immunoassay unterworfen wird, um die Gegenwart oder Menge von menschlichem proCNP(l-80)(SEQ ID NO:l) darin aufzufinden oder zu bestimmen. Resultate von unter Dialysebehandlung stehenden Patienten zeigen eindeutig, daß das proCNP -Niveau deutlich bei Patienten erhöht ist, welche an chronischer
Nierenfehlfunktion leiden. Dies wird auch noch dadurch gestützt, daß proCNP in sogenannten Hemofiltraten von Dialysepatienten aufgefunden wird (siehe auch
Schulz-Knappe et al J.Chromatogr.A776 (1997) 125-132), wie dies in Fig. 3 illustriert ist.
Folgende Konzentrationen wurden gefunden: CNP3:l,7 pmol/l CNP1: 12,4 pmo 1/1 Hemofiltrat.
Hemofiltrate wurden deshalb verwendet, weil sie nahezu unbeschränkt vorliegen und überdies die Peptidhormonkonzentrationen jener von menschlichem Plasma sehr ähnlich sind (Schulz-Knappe et al Eur.J.Med. Res.(1995/96) 1 :223-236). Demgemäß können die Immunoassays zur Beobachtung von chronischer
Nierenfehlfunktion eingesetzt werden.
Obwohl derzeit wenig dokumentiert, kann humanes proCNP (1-80) (SEQ ID NO:l) auch als diagnostisches Werkzeug zur Risikoabwägung für die Entwicklung von Arteriosklerose eingesetzt werden (Naruka T. et al, circulation 1996, 94:3103-8). Die Köφerflüssigkeit, an welcher der Immunoassay ausgeführt wird, kann jegliche Köφerflüssigkeit sein, in welcher menschliche proCNP(l-80)(SEQ ID NO:l) vorhanden ist; es wird aber üblicherweise Plasma-Serum oder Harn verwendet werden. In einigen Fällen kann es angezeigt sein, die Peptide zu extrahieren oder die Probe vor der Durchführung des Assays anderweitig zu behandeln. Das menschliche proCNP (1-80)(SEQ ID.NO.l) Peptid oder ein Antigen oder immunogenes Fragment davon kann mit in der Wissenschaft gut bekannten Techniken durch Synthese aus den sie bildenden Aminosäuren zusammengestellt oder durch das Zusammensetzen von vorsynthetisierten Aminosäureblöcken gebildet werden. Rekombinante Expression von Peptiden ist natürlich eine andere, sehr passende Methode zur Erzeugung des Antigens für die Immunisierung. Wo markiertes Material notwendig ist, kann die Markierung durch Standardtechniken eingebracht werden.
Zum Zweck der Herstellung von Antiköφem kann das menschliche proCNP(l-80)(SEQ.ID NO:l) oder ein antigenes Fragment davon an ein immunogenes Protein oder Peptide, wie es Stand der Technik ist, konjugiert werden. Die erfindungsgemäßen Antiköφer können durch Injizierung von proCNP-Antigen gemäß der Erfindung in ein Wirtstier hergestellt werden, u.zw. vorteilhafterweise durch ein Konjugat mit einem immunogenen Protein wie vorstehend beschrieben. Geeignete Wirtstiere sind z.B. ein Schaf, um entweder ein Serum, welches polyklonale Antiköφer enthält, oder z.B. eine Maus oder ein Kaninchen, um Milzzellen für die Umwandlung zu Hybridomas oder immortalisierten Zelllinien zu gewim en und damit monoklonale Antiköφer herzustellen. Beispiel 1 : Produktion von polyklonalen oder monoklonalen Antiköφem gegen CNP(l-80)
Konjugation:
3 synthetisierte Fragmente aus proCNP (1-80)(SEQ ID NO: l): proCNP (1-19), 5 proCNP (29-50) und proCNP (51-79) wurden durch die Fa. Pichem GmbH, in Graz (Österreich) synthetisiert und an ein passendes Trägeφrotein konjugiert (z.B. Thyroglobulin).
Immunisierung:
18 Schafe wurden verwendet. Die Schafe erhielten 2 mg des entsprechenden 10 Antigens, das mit nicht ulcerativem Freund'schem Adjuvans (Guildhay, GB) und BCG (bacillus Calmette Guerlin) gemischt ist
Screening:
Mikrotiteφlatten wurden mit synthetischen proCNP Peptidsequenzen (1 μg/ml) beschichtet. Probeblut wurde in Phosphatpuffer mit 3%igem BSA 1 :
15 1000/10000/100000 verdünnt, und die Bindung eines Antiköφers wurde durch Zusatz von Antischaf IgG-Peroxidase-Konjugat, gefolgt von Substratzugabe (TMB) nachgewiesen.
Monoklonale Antiköφer können analog hergestellt werden, wobei Mäuse oder Kaninchen als Wirtstiere verwendet werden und Hybridomas nach im Stand der 20 Technik bekannten Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 2: Immunoassay für proCNP(l-80) (SEQ ID NO:l) oder immunreaktive Fragmente davon.
Die Antiköφer können in verschiedenen Arten von Immunoassay für proCNP(l-80)(SEQ ID NO:l) oder immunreaktiven Fragmenten davon verwendet 25 werden. Diese sind u.a.
(a) Radioimmunoassay (RIA)
(b) Enzymimmunoassay (EIA)
(c) Enzymgebundenes Immunosorbentassay (ELISA) einschließlich 30 "sandwich"-Typ Methoden, die auf Mikrotiteφlatten oder Membranen ausgeführt werden.
(d) verschiedene trockenchemische Teststreifenimmunoassays. Nachfolgend ist ein Beispiel basierend auf einem kompetitiven Enzymimmunassay wiedergegeben. Mikrotiteφlatten werden mit Schafantiköφern vorbeschichtet. Dann wird der spezifische proCNP Antiköφer zugesetzt und für drei bis fünf Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ dazu können Platten, die mit proCNP vorbeschichtet sind und mit Karion F (Merk, Nr. 2993) stabilisiert sind, verwendet werden.
200 μl der Probe oder des Standards zusammen mit 50 μl eines Tracers (Biotin-markiertes proCNP(l-80) oder ein Fragment davon) wird in die Vertiefungen eingegeben und 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden gewaschen und mit 200 μl von Streptavidin-Peroxidase von Southern Biotechno logy (SB-7100-05) inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt und Zusatz von Substrat (Tetramethylenbenzidin, TMB) bildet sich eine Farbe aus, die umgekehrt proportional zu der proCNP -Konzentration der Probe ist und in einem Mikrotiteφlattenphotometer gemessen wird. Ein Beispiel einer Standardkurve für proCNP(l-19) und proCNP (51-79), die mit dieser Art von Assay erhalten wurden, ist in Fig. 2 wiedergegeben.
Sequenzprotokoll SEQUENZ ID.-Nr. 1
<110> Biomedica GmbH
<120> proCNP Immunoassay <160> 1
<210> 1
<211 > 80
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> Lys Pro Gly Ala Pro Pro Lys Val Pro Asn 1 5 10
Thr Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ala Glu Pro
15 20
Gin Ala Ala Gly Gly Gly Gin Lys Lys Gly
25 30
Asp Lys Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Asn
35 40
Leu Lys Gly Asp Arg Ser Arg Leu Leu Asn
45 50
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala
55 60
Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gin Glu His Pro
65 70
Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys

Claims

Patentansprüche:
1. Indikatoφolypeptid zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovascsulären und/oder endothelialen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid, das
N-terminale Fragment proCNP (1-80)(SEQ.ID NO:l) des C-Typ-natriuretischen Precurvers (1-126 Aminosäuren, Swiss Prot; P23582) oder ein Fragment davon ist.
2. Antiköφerzusammensetzung zur Bestimmung von C-Typ natriuretischen Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Antiköφer enthält, der spezifisch an ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 bindet, welches aus den Aminosäuren 1 - 80 des N-terminus des menschlichen pro C-Typ natriuretischen Peptiden (pro CNP(1 - 80)) (SEQ. ID. No. 1), oder eines Fragmentes davon besteht.
3. Antiköφerzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiköφer ein polyklonaler Antiköφer ist.
4. Antiköφerzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiköφer ein monoklonaler Antiköφer ist.
5. Antiköφerzusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiköφer mit einer Markierung versehen ist.
6. Antiköφerzusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung ein Radionuklid, Biotin, eine fluoreszierende Substanz, ein Enzym, ein
Farbstoff oder gefärbte Partikel sind.
7. Antiköφerzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiköφer an einem festen Träger immobilisiert ist.
8. Immunoassayverfahren für proCNP(l - 80), (SEQ. ID. No.l), gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Kontaktieren einer Patientenköφerflüssigkeit mit einem primären Antiköφer nach einem der Ansprüche 2 bis 6, um einen Komplex aus Antiköφer und proCNP(l - 80) (SEQ. ID. No. 1) zu bilden; und b) Messung der Bildung dieses Komplexes.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein an
Mikrotiteφlatten, Membranen oder Partikeln (Beads) immobilisierter Antiköφer eingesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Bildung des Komplexes aus Antiköφer und proCNP(l - 80) (SEQ. ID. No. 1) dieser Komplex mit einem zweiten Antiköφer, der an proCNP(l - 80) (SEQ. ID. No. 1) bindet, in Kontakt gebracht wird, um einen Sekundärkomplex aus beiden Antiköφern und proCNP zu bilden, der dann in Form eines Sandwichassays erfaßt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antiköφer am festen Träger immobilisiert wird und daß eine bekannte Menge von markiertem humanem proCNP(l - 80)(SEQ. ID. No. 1) oder ein markiertes Antigenfragment davon der in Lösung befindlichen Köφerflüssigkeit zugesetzt wird, um einen kompetitiven Bindungsassay zu erzielen.
12. Immunoassay zur Bestimmung von humanem CNP(1 - 80) (SEQ. ID. No. 1), welcher folgendes enthält: a) einen Antiköφer nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in immobilisierter Form und b) wenigstens eine weitere Zusammensetzung aus folgender Gruppe: b i) eine markierte Probe von menschlichem proCNP(l - 80) (SEQ. ID. No. 1) oder ein antigenes Fragment davon. b ii) ein Antiköφer nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie b iii) ein markierter zweiter Antiköφer, der speziell an einem
Antiköφer nach einem der Ansprüche 1 und 3 bindet.
13. In vitro-Diagnose- bzw. -Prognoseverfahren für Krankheiten, die zu einer erhöhten Bildung von proCNP führen, bei welchem eine Köφerflüssigkeit eines Patienten mit einem ersten Antiköφer nach einem der Ansprüche 2 bis 4 in Kontakt gebracht wird, um einen Komplex aus erstem Antiköφer und proCNP(l - 80)(SEQ. ID. No. 1) zu bilden, und die Bildung des genannten Komplexes gemessen wird, um die Konzentration von proCNP(l - 80)(SEQ. ID. No.l) in der Köφerflüssigkeit zu bestimmen, wobei eine erhöhte Konzentration von proCNP(l - 80)(SEQ. ID. No.l) im Vergleich zur Konzentration bei normalen Personen zur Diagnose von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen genutzt wird.
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