WO2001096575A1 - Ceramide kinase et adn la codant - Google Patents

Description

明 細 書

セラミドキナーゼおよびそれをコードする D NA

[技術分野]

本発明は、 神経性疾患、 炎症、 H I V、 2型糖尿病、 肥満、 敗血症、 動脈硬化 および癌の予防または治療薬の標的となりうる、 セラミ ドキナーゼ活性を有する 新規タンパク質、 該タンパク質をコードする D N A、 該 D N Aを含むことからな る組換え D NAベクター、 該組換え D N Aベクターで形質転換せしめた宿主、 該 セラミ ドキナーゼの製造方法および該タンパク質の用途に関する。

[背景技術]

スフインゴ脂質は従来、 グリセロリン脂質およびコレステロールとならぶ細胞 膜の主要な構成成分の一つと考えられてきた。 グリセ口リン脂質は細胞膜構造の 維持だけでなく、 その代謝産物として多くの生理活性物質を産生させ'ることが知 られてきたが、 スフインゴ脂質についてはその代謝産物の生理活性については最 近までほとんど知られていなかった。 近年、 いくつかのスフインゴ脂質の代謝産 物にアポトーシスの誘導や細胞増殖刺激作用などの生理活性が知られるようにな り、 スフインゴ脂質の代謝酵素が生理的反応や種々の病態に密接に関連する可能 性が示唆されるようになった。 なかでも、 セラミ ドは多くの細胞機能を調節する レギュレーターとして注目を集めている （Hannun, Y. A. and Obeid, L. M.

(1995) TIBS 20, 73- 77参照） 。 例えば、 セラミ ドは T N F— aや I L一 1 ]3などの炎症性サイトカインのセ力 ンドメッセンジャーとして機能し、 ホスホリパーゼ八₂等のァラキドン酸経路を 活性化することが知られている （Spiegel, S. et al. (1996) Curr. Opini. Cell Biol. 8, 159— 167および Mathias, S. et al. (1993) Science 259， 519- 522参照） 。 すなわち、 セラミ ドを各種炎症性疾患の増悪因子として捕らえるこ とができる。 また、 H I Vに感染した患者における C D 4 ⁺ T細胞のアポトーシ スを伴う減少や脳細胞への感染の際にもセラミドが増悪因子として機能している という報告がある （Coline, M. G. et al. (1997) Proc. Assoc. Am.

Physicians 109， 146— 153およぴ Wilt, S. et al. (1995) Ann. Neurol. 37, 381- 394参照） 。 さらには、 2型糖尿病や肥満において T N F— αがインシユリ ン抵抗性を引き起こすが知られているが、 セラミ ドはその下流においても増悪因 子として機能していると考えられている （Begum, N. et al. (1996) Eur. J. Biochem. 238, 214- 220および Hotamisligil, G. S. et al. (1996) Science 271, 665- 668参照） 。 また、 リポポリサッカライド （L P S ) 等が引き金になり起こ る敗血症においてもセラミドがセカンドメッセンジャーとして機能していると報 告されている （Beutler, B. and Kruys, V. (1995) J. Cardiovasc. Pharmacol. 25, S1-S8 参照） 。 さらには、 動脈硬化層形成の引き金となる L D Lの凝集反応 においてもスフインゴミエリナーゼの活性化に伴うセラミ ドの上昇が増悪因子と して機能するという報告がある （Schissel, S. し et al. (1996) J. Clin. , Invest. 98, 1455- 1464参照） 。 またこれらとは逆に、 癌治療における放射線療法や化学療法において、 癌細胞 のアポトーシスをセラミ ドが促進することが知られている （Michael, J. M. et al. (1997) Cancer Res. 57， 3600 - 3605および Bose, R. et al. (1995) Cell 82, 405 - 414および Jaffrezou, J. P. et al. (1996) EMB0 J. 15, 2417-2424参照） 。

—方、 セラミ ドの代謝産物であるセラミ ド— 1—リン酸およびその生成酵素で あるセラミ ドキナーゼに関してもいくつかの生理活性が知られている。 例えば、 脳のシナプスのおいて、 カルシウム刺激に応答してセラミ ドキナーゼが活性化さ れ、 生成したセラミ ドー 1一リン酸がシナプスからの神経伝達物質の放出を調節 している （Bajjalieh, S. M. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 14354-14360 およぴ Shinghal, R. et al. (1993) J. Neurochem. 61, 2279-2285参照） 。 した がって、 薬剤等によりセラミ ドキナーゼの活性を調節することは、 アルッハイマ 一病を含めた各種神経性疾患の治療法となる可能性がある。 また、 セラミ ドー 1 ーリン酸は上述した各種セラミ ドの機能をプロックする作用があると考えられて いる （Dressier, K. A. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 14917 - 14921参 照） 。 すなわち、 慢性関節炎等の各種炎症性疾患、 H I V、 インシュリン抵抗性 が引き金となる 2型糖尿病や肥満、 さらには敗血症、 動脈硬化といったセラミ ド が増悪因子として作用する疾患をセラミ ドー 1—リン酸により抑制できると考え られる。 したがクて、 薬剤等によりセラミ ドキナーゼを活性化することは、 各種 炎症性疾患、 H I V 2型糖尿病、 肥満、 敗血症や動脈硬化等の治療法となり得 る。 逆に、 癌の放射線療法や化学療法においては、 セラミ ドキナーゼ活性を抑制 することにより、 セラミ ド量を保ち、 治療効果を向上させることができると考え られる。 また上記の理由により、 セラミ ドの定量が各種病態の解析に重要と考えられて いる。 セラミ ドキナーゼを用いることにより、 細胞または組織内のセラミ ド含量 を特異的に簡便かつ高感度で定量する方法が提供できるものと考えられる。 セラ ミ ド定量法には、 マススペク トル、 H P L Cなど多くの方法が知られているが、 感度または簡便性に問題がある。 ジァシルグリセ口ールキナーゼを用いた方法 (Van Veldhoven, P. P. et al. (1995) Biochem. Mol. - Biol. Int. 36, 21 - 30 参照） も知られているが、 該酵素は本来ジァシルグリセロールをリン酸化する酵 素であり、 特異性および比活性の面で満足できるものとは言い難い。 よって、 セ ラミ ドキナーゼを用いることにより、 特異的かつ高感度なセラミ ドの検出または 定量法が確立できるものと考えられる。 しかしながら、 セラミ ドー 1一リン酸の生成酵素であるセラミ ドキナーゼに関し ては精製、 クローユングの報告がなく、 詳細に関しては不明な点も多く残されてい る。 そこで上記各種疾患の治療または予防剤の探索手段としてより好ましく利用で きるよう、 セラミ ドキナーゼ遺伝子をクローユングし、 そのコードするタンパク質 を発現させることが望まれていた。 なお、 既知のマウススフインゴシンキナーゼの配列に基づいて、 N C B I ' (National Center for Biotechnology Information, 米国） 'の d b E S Tデータべ —スに対して相同性検索を行うと、 本発明のタンパク質をコ一ドする D N Aの一部 分に相当する Expresseed Sequence Tag (以下 「EST」 という） 配列が開示されて いるが、 該 ESTデータには、 本発明のタンパク質の機能に関する具体的示唆は開 示されていない。

すなわち、 本発明の目的は、 ヒ トに存在する新規セラミ ドキナーゼをコードす る遺伝子をクローニングすることによって、 神経性疾患治療薬、 抗炎症剤、 H I V治療薬、 抗 2塱糖尿病薬、 抗肥満薬、 抗敗血症薬、 抗動脈硬化薬および制癌剤 の候補物質を探索するための新規な手段や各種病態の解析手段を提供することに ある。 そのような新しいタイプの薬剤の候補物質探索は、 本発明のタンパク質の セラミドキナーゼ活性を活性化または阻害する物質をスクリーニングすることに より行われ、 各種病態の解析は本発明のタンパク質を用いて各種標品中セラミ ド を標識することにより行われ得る。

[発明の開示]

本発明者らは、 マウススフインゴシンキナーゼと部分的にホモロジ一を有する 新規タンパク質をコードする c DNAをクローユングし、 この新規タンパク質の 全一次構造を解明することに成功した。 さらにこの新規タンパク質を発現させ、 この新規タンパク質がセラミ ドキナーゼ活性を有することを確認することに成功 し、 本発明を完成させた。 本発明は第一に、 下記の i ) 乃至 i i i ) のいずれか一つに記載のタンパク質： i ) 配列表の配列番号 2のァミノ酸番号 1から 537に示されるァミノ酸配列から なるタンパク質； i i ) 分子中に配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 53 7に示されるアミ ノ酸配列の一つもしくは二つ以上のアミノ酸が付加、 欠失および Zまたは置換さ れているアミノ酸配列を含み、 セラミ ドキナーゼ活性を有することを特徴とする タンパク質；

i i i ) 形質転換大腸菌 E. c o l i p CR 3. l—CERKl SANK 70300 (FERM B P— 7 1 84 ) が保持するプラスミ ドに揷入されてい る DNAにコードされるタンパク質、 ' に関する。 第二に、 本発明は、 上記タンパク質をコードする DNAに関する。 そのような 本発明の DNAとしては、 分子中に配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1 2 4から 1 734に示されるヌクレオチド配列を含む DN A；配列表の配列番号 1 のヌクレオチド番号 1 24から 1 7 34に示されるヌクレオチド配列からなる D NAとス トリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、 セラミ ドキナーゼ活性を 有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする DN A；または形質転換大腸菌 E. c o l i p CR 3. l—CERKl SANK 70300 (FERM B P— 7 1 84 ) が保持するプラスミ ドに揷入されてい る DN Aが好適であるが、 本発明は、 これらに限定されず、 上記タンパク質をコ 一ドするヌクレオチド配列を有する DN Aをすぺて含むものである。 第三に、 本発明は、 上記 DNAを含む組換え DNAベクターに関する。 そのよ うな本発明のベクターとして好適なものは、 形質転換大腸菌 E. c o l i p C R 3. l—CERKl SANK 70 300 (FERM B P— 71 84) に 保持されている組換え DNAベクター p C R 3. l—CERK l ；または発現べ クタ一である組換え DNAベクターであるが、 本発明はこれらに限定されるもの ではない。 第四に、 本発明は、 上記組換え DN Aベクターで形質転換された宿主細胞に関 する。 そのような本発明の宿主細胞として好適なものは、 形質転換大腸菌 E. c o 1 i p C R 3. l—CERK l SANK 70300 (FERM B P— 7 1 84) ；または発現ベクターである本発明の組換え DNAベクターで形質転 換された宿主細胞であるが、 本発明はこれらに限定されない。 第五に、 本発明は、 上記タンパク質の製造方法に関する。 その一つの例は、 遺 伝子工学的手法によるものであり、 上記発現べクタ一で形質転換された宿主細胞 をセラミ ドキナーゼ活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養し、 次 いで、 該培養物よりセラミ ドキナーゼ活性を有するタンパク質を回収することを 特徴とする。 本発明のタンパク質の製造方法のもう一つの例は、 生化学的手法によるもので あり、 下記の （·. i ) 乃至 （ i i i ) の工程を含む：

( i ) カルモジュリンを含まない溶媒に溶解させた （1 ) 乃至 （3 ) のいずれ か一つに記載のタンパク質を含む材料の抽出物を、 置換基としてカルモジュリン を有するァフィ二ティークロマトグラフィー樹脂に吸着させる ；

( i i ) ( i ) の樹脂をカルモジュリンを含まない溶媒で洗浄する ；

( i i i ) ( i i ) で洗浄された樹脂から、 エチレングリコールビス （ 一ァ ミノエチルエーテル) 一 N， N , N ' , N ' —四酢酸 （E G T A) またはェチレ ンジァミン四酢酸 （E D T A) を含む溶媒でセラミ ドキナーゼ活性を有するタン パク質を溶出ざせる。 第六に、 本発明は、 上記タンパク質、 該タンパク質が特異的にリン酸化する基質 および任意の化合物または組成物試料を共存させ、 次いで、 該タンパク質により リ ン酸化された基質の量を測定し、 その結果を該化合物または組成物を添加しなかつ た場合のリン酸化基質の量と比較することを特徴とする、 化合物または組成物試料 のセラミ ドキナーゼ活性化または阻害効果を試験する方法に関する。 第七に、 本発明は、 上記タンパク質、 被検試料および標識されたアデノシン 5 ' 一三リン酸 （以下 「A T P」 という） とを共存させ、 次いで、 標識されたセラミ ド を検出または定量することを特徴とする、 被^試料中のセラミ ドを検出または定量 する方法に関する。 第八に、 本発明は、 新規タンパク質である上記タンパク質と特異的に結合する抗 体に関する。 ， すなわち、 本発明は、 セラミ ドキナーゼ活性を有する新規タンパク質、 該タン パク質をコードする DNA、 該 DNAを含む組換えベクター、 該ベクターで形質 転換された宿主細胞、 該タンパク質の製造方法、 該タンパク質の用途およぴ該タ ンパク質と特異的に結合する抗体を提供するものである。 本発明において 「セラミ ドキナーゼ活性」 とは、 D—エリスロースフインゴ、ン ン · N—ァセチル体 （以下 「C₂セラミド」 という） 、 D—エリスロースフィン ゴシン · N—へキサノィル体 （以下 「C₆セラミ ド」 とレ、う） 、 D—エリス口一 スフインゴシン . N—ォクタノィル体 （以下 「C₈セラミ ド」 という） 、 D—ェ リスロースフィンゴシン . N—パルミ トイル体 （以下 「C₁₆セラミ ド」 とレヽ う） およびゥシ胎児脳由来セラミド等の各種セラミ ドおよびそれらの各種光学異 性体の 1位の水酸基をリン酸化し、 セラミド— 1一リン酸を生成せしめる活性、 すなわち、 下記式：

【化 1】

(式中、 Rは CH₃ (C₂セラミ ドの場合） 、 C₅H„ (C₆セラミ ドの場合） 、 C₇H₁₅ (C₈セラミ ドの場合） 、 C₁₅H₃₁ (C₁₆セラミ ドの場合） 、 C₁₇H₃₅

(C₁₈セラミ ドの場合） 等を表す）

で表される反応を触媒する活性をいう。 また本発明のタンパク質が有するセラミ ドキナーゼ活性によりリン酸化される基質として好適なものは、 C₂セラミ ド、 c₆セラミ ド、 c₈セラミ ド、 c₁₆セラミ ド、 ゥシ胎児脳由来セラミ ド （主とし て c₁₈セラミ ドが含有される） 等の各種セラミ ドおよびその各種光学異性体で あり、 より好適には c₆セラミ ドであるが、 これらに限定されない。 本発明のタンパク質をコードする DNAは、 例えば、 本タンパク質を発現する 培養細胞などから mRN Aを調製した後、 これを铸型として cDNAを合成し、 その中から本発明のタンパク質をコードする c DNAを公知の方法によりスクリ 一ユングするなど、 本発明の技術分野において周知の方法により得ることができ る。 具体的には例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNAは、 マウススフィ ンゴシンキナ一ゼの c DNAの全配列または部分配列に基づいてプローブを作成 し、 哺乳動物由来の c DNAライブラリ一からストリンジエンシーの弱い条件で のコロニーハイプリダイゼーシヨン法を行って得られるクローンの配列を解析し て、 配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 124— 1 734に示されるヌクレ ォチド配列との間に高い相同性を示す配列を有するクローンを選択することによ り、 その一部または全部を取得することができる。 また同様に、 既知のマウスス フインゴシンキナーゼの配列に基づいてプライマーを作成し （より好適には系統 発生的に保存された領域の配列に基づいてプライ.マーを作成し） 、 哺乳動物由来 の c DNAライブラリーを錶型にポリメラーゼ連鎖反応 （以下 「PCR」 という。 Saiki, R. K. et al. (1988) Science 239, 487 - 491参照） を行う力 哺乳動物 由来の mRNAを铸型にリバ一ストランスクリプターゼーポリメラーゼ連鎖反応 (以下 「RT— PCR」 という） を行って、 その産物の配列を解析し、 配列表の 配列番号 1のヌクレオチド番号 1 24— 1 734に示されるヌクレオチド配列と の間に高い相同性を示す配列を有するクローンを選択することにより、 本発明の タンパク質をコードする DN Aの一部を得ることができる。 さらに、 本発明のタンパク質をコードする c DN Aの全長は、 例えば、 上記の ようにして得られた部分配列に基づいてプローブを作成し、 哺乳動物由来の c D NAライブラリ一に対するストリンジェントな条件でのコロニ一ハイブリダィゼ ーシヨン法により得られたクローンの配列を解析するか、 または、 該部分配列に 基づいてブライマ一を作成し、 哺乳動物由来の cDNAライプラリーを铸型にし た PC Rまたは哺乳動物由来の mRN Aを铸型にした RT— P CRを行ってその 産物の配列を解析し、 必要によりさらに Rapid Amplification of cDNA Ends [以 下 「RACE」 という。 実験医学， （1994), 12(6), 35-38参照。 部分配列に基づ くプライマーと哺乳動物由来の niRNAを用いる力 \ または市販のキットと cD N Aライブラリーを用いる] を行うことにより得られる。 この inRNAの供給源となる動物細胞は、 ヒ ト胚子腎臓細胞 HEK 293 (A TCC CRL- 1 573) が好ましいが、 各種の哺乳動物由来の細胞または組 織、 あるいは他の培養細胞株 （ヒト由来のものを含む） を使用することもできる。 mRNAの抽出にあたっては、 チォシアン酸グァニジン .塩化セシウム超遠心 法、 チォシアン酸グァ-ジン .ホットフエノール法、 グァニジン塩酸法、 酸性チ オシアン酸グァュジン ·フエノール ·クロ口ホルム法も採用しうるが、 市販の m RN A分離キットを用いることもできる。 真核細胞の細胞質に存在する mRNAの多くは、 その 3' 末端にポリ （A) 配 列を持つことが知られているので、 この特徴を利用してピオチン化したオリゴ

(d T) プローブに mRNAを吸着させ、 さらにストレプトアビジンを固定化し た常磁性粒子に、 ビォチン/ストレプトアビジン間の結合を利用して mRNAを 捕捉し洗浄操作の後、 mRNAを溶出することにより精製することができる。 ま た、 オリゴ （dT) セルロースカラムに mRNAを吸着させて、 次にこれを溶出 して精製する方法も採用し得る。 さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、 mR N Aをさらに分画することもできる。 上記のごとくして得られた mRNAがセラミ ドキナーゼ活性を有するタンパク 質をコードするものであることを確認するためには、 mRNAをタンパク質に翻 訳させ酵素活性を調べるか、 該タンパク質に特異的な抗体を用いてそのタンパク 質を同定する等の方法を用いることができる。 例えば、 アフリカッメガエル (Xenopus laevis) の卵母細胞に mRNAを注入して翻訳させることができ (Gardon, j. B. et al. (1972) Nature 233, 177-182)、 あるいは、 ゥサギ網状 赤血球系やコムギ胚芽系といった無細胞翻訳系を利用できる （Schleif, R. F. and Wensink, P. C. (1981)： Practical Methods in Molecular Biology , Springer-Verlag, NY. ) ₀ ' また、 上記方法で得た mRNAを踌型として、 逆転写酵素を用いて一本鎖 c D NAを合成した後、 この一本鎖 c DNAから二本鎖 c DNAを合成することがで きる。 その方法としては、 S 1ヌクレア一ゼ法 （Efstratiadis, A. et al. (1976) Cell 7, 279-288)、 Land法 （Land, H. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2251-2266)、 0. Joon Yoo法 （Yoo, 0. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1049-1053) なども採用し得るが、 本発明の目的には Okayama-Berg法 (Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161— 170)が好適である。 次に、 得られた c D N A断片をラムダファージベクターに揷入し自己複製させ ることにより c DNA断片を持つ組換えファージを安定に保持し、 増幅させるこ とができる。 例えば、' ラムダファージ又 ZAP I I (ス トラタジーン社製） を用 いる場合、 宿主大腸菌 XL 1 -B 1 u e MRF ' 株や J M 1 09株にプラーク を作らせ、 それらのプラークの 5—ブロモ _4一クロ口 _ 3—インドリル一 β一 D—ガラク トピラノシド （5_Bromo-4 - chloro-3- indolyl- β - D - galactopyranoside (X- g a 1 ) ) 代謝による発色の有無から組換え体を選別 することができる。 なお、 ベクターとしては、 ラムダ系のファージベクター以外 に、 プラスミ ドベクターも用いることができる。 また、 市販の各種 c DNAライブラリー （例えば、 クローンテック社製） を用 いることもできる。 上記のようにして得られるライブラリーから、 目的のセラミ ドキナーゼ活性を 有するタンパク質をコードする c DNAを有するクローンを選別する方法として は、 例えば以下に示す各種方法のいずれかを揉用できる。

(1) 合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法： 目的の タンパク質のアミノ酸配列の全部、 または一部が解明されている場合 （該配列は、 複数個連続した特異的配列であれば、 目的のタンパク質のどの部分でもよい） 、 該アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し （コドンの縮重のある アミノ酸に対しては、 使用頻度の高いコドンを用いても、 または考えられるコド ンを組み合わせて複数個のヌクレオチド配列を合成してもよく、 また後者の場合、 イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる） 、 これを³² P、 ³⁵Sまた はピオチン等で標識したものをプローブとして、 組換えファージ DNAを変性固 定した二トロゼノレ口一スフイノレタ一またはナイ口ンフイノレターとハイブリダイズ させ、 得られた陽性クローンを検索して、 これを選択する。

(2) ポリメラーゼ連鎖反応により作製したプローブを用いるスクリーニング 法： 目的のタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合、 該アミノ酸配列の N末端側の一部に対応するセンス鎖と、 同じく C末端側の一部 に対応するアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドを合成し、 PCRを行い、 目的 のタンパク質をコードする DN A断片を増幅する。 ここで用いる鎵型 DNAとし ては、 本発明のタンパク質を産生する細胞の mRN Aより逆転写反応にて合成し た cDNA、 またはゲノム DNAを用いることができる。 このようにして調製し た DNA断片を、 ³²P、' ³⁵Sまたはピオチン等で標識し、 これをプローブとし て用いたプラークハイブリダィゼーシヨンまたはコロニーハイプリダイゼーショ ンによる cDNAライブラリ一やゲノムライブラリーのスクリ一ユングを実施し て、 目的のクローンを選択する。 (3) 他の動物細胞株でセラミ ドキナーゼ活性を有するタンパク質を産生させて スクリーニングする方法： 前記のようにして得た cDN Aを発現べクタ一に揷入 したプラスミ ド （自己複製可能で、 転写プロモーター領域を含むプラスミ ド、 もし くは動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミ ドのいずれも使用できる） で動物細胞宿主を形質転換し、 それら c DN Aにコードされたタンパク質を産生さ せ、 その培養上清または細胞抽出物中の、 セラミ ドキナーゼ活性を測定するか、 ま たは、 本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、 および該抗体に対する二次抗 体を用いて、 本発明のタンパク質の存在を検出することにより、 本発明のタンパク 質をコードする c DN Aを有する株を選択する。 なお、 動物細胞宿主としては CO Sや CHO等の汎用される細胞株を使用できるが、 外来遺伝子産物としての本発明 のタンパク質の検出を容易にするため、 宿主自体は一定の培養条件下で本発明のタ ンパク質を産生しない細胞であることが好ましい。

(4) セレクティブ 'ハイブリダィゼーシヨン . トランスレーションの系を用 いる方法： 形質転換株から得られる c DNAを、 ニトロセルロースフィルター またはナイロンフィルターなどにブロッ 卜し、 本発明のタンパク質の産生能を有 する組織または細胞から抽出した mRNAをハイブリダィズさせた後、 c DNA に結合した mRNAを解離させ、 回収する。 回収した： mRNAを、 タンパク質翻 訳系 （例えば、 アフリカッメガエルの卵母細胞への注入や、 ゥサギ網状赤血球ラ ィゼートや、 コムギ胚芽などの無細胞系） でタンパク質に翻訳させ、 そのタンパ ク質のセラミ ドキナーゼ活性を調べるか、 またはセラミ ドキナーゼ活性を有する タンパク質に対する抗体を用いて検出し、 目的の株を選択する。 上記のようにして得られた目的の形質転換株からの本発明のタンパク質をコー ドする DN Aの採取は、 公知の方法 （Maniatis, T. et al. (1982) ：

Molecular Cloning A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Laboratory, NY) に従い実施できる。 例えば、 細胞よりプラスミ ド DNAに相当する画分を分 離し、 該プラスミ ド DNAより c DNA領域を切り出すことにより行い得る。 また、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の取得に際しては、 PCR法に よる DNAZRNA増幅法も好適に利用できる。 殊にライブラリーから全長の c DN Aが得られないような場合には、 前記 RACEによって全長 c DN Aの両端 まで取得することができる。 かかる P CR法の採用に際して使用されるプ イマ 一は、 本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、 常法に従い 合成することができる。 このようにして得られる本発明の DN Aのヌクレオチド配列の決定は、 例えば、 マキサム一ギルバートの化学修飾法 （Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) ：

"Methods in Enzymology" 65, 499-559) や M 1 3ファージを用いるジデォキシ ヌクレオチド鎖終結法 （Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-

276) などにより行うことができる。 また、 ラジオアイソトープの代わりに蛍光 色素を用いた自動 DN A配列解析装置 （例えば、 パーキンエルマ一 ' ジャパン ' アプライ ドバイオシステムズ社製モデル 3 73 A等） を使用することもできる。 なお、 本発明のタンパク質として最も好適なものをコードする c DNAが揷入さ れたプラスミ ドを保持する形質転換大腸菌株 E. c o l i p CR 3. 1一 CER

K 1 SANK 70300は、 2000年 6月 2日付けで日本国茨城県つくば市 東 1丁目 1番 1号の産業技術総合研究所 ·特許生物寄託センターに国際寄託され、 受託番号 FERM B P— 7 1 8.4が付されている。 したがって、 本発明のタンパ ク質をコードする遺伝子は、 該菌株から取得することが可能である。

上記のようにしてクローン化された、 本発明のタンパク質をコ一ドする遺伝子 を含む断片をベクター DN Aに組み込むことにより、 他の原核生物、 または真核 生物の宿主細胞を形質転換させることができる。 さらにこれらのベクターに適当 なプロモーター、 および形質発現に関わる配列を導入することにより、 それぞれ の宿主において遺伝子を発現させることが可能である。 原核細胞の宿主としては、 例えば、 大腸菌 （Escherichia coli) や枯草菌 (Bacillus subtilis) などが挙げられる。 目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内 で形質転換させるには、 宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点 と、 調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。 ま た、 ベクターとしては、 形質転換細胞に表現形質 （表現型） の選択性を付与する ことができる配列を有するものが好ましい。 例えば、 大腸菌としては K 1 2株などがよく用いられ、 ベクターとしては、 ― 般に p B R 3 2 2や p U C系のプラスミ ドが用いられるが、 これらに限定されず、 公知の各種菌株、 およびベクターがいずれも使用できる。 プロモーターとしては、 大腸菌においては、 トリプトファン （trp) プロモー ター、 ラク トース （lac) プロモーター、 トリプトフアン ' ラク トース （tac) プ 口モーター、 リポプロテイン （lpp) プロモーター、 ポリペプチド鎖伸張因子 Tu (tufB) プロモーター等が挙げられ、 どのプロモーターも本発明のタンパク質の 産生に使用することができる。 枯草菌としては、 例えば 2 0 7— 2 5株が好ましく、 ベクターとしては p T UB S 2 8 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87 - 93) などが用いられ るが、 これに限定されるものではない。 プロモーターとしては、 枯草菌のひ一アミラーゼのシグナルぺプチド配列をコ ードする D N A配列を連結することにより、 菌体外での分泌発現も可能となる。 真核細胞の宿主細胞には、 脊椎動物、 昆虫、 酵母などの細胞が含まれ、 脊椎動 物細胞としては、 例えば、 サルの細胞である C O S細胞 （Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、 A T C C C R L— 1 6 5 0 ) やチャイニーズ 'ハムスター 卵巣細胞 （C H O細胞、 A T C C C C L - 6 1 ) のジヒ ドロ葉酸還元酵素欠損 株 （Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) 等がよく用いられているが、 これらに限定されない。 脊椎動物細胞の発現プロモータ一としては、 通常発現しようとする遺伝子の上 流に位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、 ポリアデュル化部位、 お よび転写終結配列等を有するものを使用でき、 さらにこれは必要により複製起点 を有してもよい。 該発現べクタ一の例としては、 S V40の初期プロモータ一を 有する p S V 2 d h f r (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) 等が挙げられるが、 これに限定されない。 宿主細胞として、 COS細胞を用いる場合を例に挙げると、 発現 クタ一とし ては、 SV40複製起点を有し、 COS細胞において自立増殖が可能であり、 さ らに、 転写プロモーター、 転写終結シグナル、 および RN Aスプライス部位を具 えたものを用いることができる。 該発現べクタ一は、 ジェチルアミノエチル （D EAE) —デキス トラン法 （Luthman, H. and agnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、 リン酸カルシウム— D N A共沈殿法 （Graham, F. し and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457) 、 および電気パルス 穿孔法 （Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) などにより COS細 胞に取り込ませることができ、 かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。 また、 宿主細胞として CHO細胞を用いる場合には、 発現ベクターと共に、 抗生 物質 G4 1 8耐性マ一カーとして機能する n e o遺伝子を発現し得るベクター、 例えば p RSVn e o (Sambrook, J. et al. (1989) ： "Molecular Cloning A Laboratory Manual " Cold Spring Harbor Laboratory, NY) や p SV2— n e o

(Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1， 327-341) などをコ ' トランスフエタトし、 G4 1 8耐性のコロニーを選択することにより、 本発明のタンパク質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。

昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、 鱗翅類ャガ科の Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞 （S f — 9または S f — 21) や

Trichoplusia niの卵細胞由来 High Five細胞 （Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391 - 396) などが宿主細胞としてよく用いられ、 バキュ口 ウィルス トランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウィルス （A c NP V) のポリへドリンタンパク質のプロモーターを利用した p—VL 1 39 2 / 1 3 9 3がよく用いられる （Kidd, I. M. and V. C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and

Biotechnology 42, 137-159) 。 この他にも、 ノくキュロウィルスの P 1 0や同塩 基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。 さらに、 A c N P Vのエンベロープ表面タンパク質 G P 6 7の分泌シグナル配列を目的タンパ ク質の N末端.側に繋げることにより、 組換えタンパク質を分泌タンパク質として 発現させることも可能である （Zhe- mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem. , 379, 167-174)。

■ 真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、 酵母が一般によく知られており、 その中でもサッカロミセス属酵母、 例えばノ ン酵母 Saccharomyces cerevisiaeや 石油酵母 Pichia pastorisが好ましい。 該酵母などの真核微生物の発現ベクター としては、 例えば、 アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター （Bennetzen, J. し and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018 - 3025) や酸性フォスフ ァターゼ遺伝子のプロモーター （Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5) などを好ましく利用できる。 また、 分泌型タンパク質 として発現させる場合には、 分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテア ーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位を N末端側に持つ組換え体として発 現することも可能である。 例えば、 トリプシン型セリンプロテア一ゼのヒ トマス ト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、 N末端側に酵母の αファタ ターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つ Κ Ε Χ 2プロテア一ゼの切断部位をつ なぎ発現させることにより、 活性型ト 'リブターゼが培地中に分泌されることが知 られてレヽる (Andrew, L. Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28, 125-131)。 上記のようにして得られる形質転換体は、 常法に従い培養することができ、 該 培養により細胞内、 または細胞外に本発明のタンパク質が産生される。 該培養に 用いられる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適 宜選択でき、 例えば、 上記 C O S細胞であれば、 R P M I 1 6 4 0培地やダルべ 1フ ッコ改変イーグル培地 （以下 「D M E M」 という） などの培地に、 必要に応じゥ シ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。 このようにして発現させた本発明のタンパク質は、 その物理化学的性質、 化学 的性質等を利用した各種の分離操作 （ 「生化学データプック I I」 、 1175-1259 項、 第 1版第 1刷、 1980年 6月 23日株式会社東京化学同人発行； Biochemistry, vol. 25, No. 25, p8274-8277 (1986) ; Eur. J. Biochem. , 163, p313~321 (1987)等参照） により分離、 精製できる。 該方法としては、 具体的には例えば通 常の再構成処理、 蛋白質沈殿剤による処理 （塩析法） 、 遠心分離、 浸透圧ショッ ク法、 凍結融解法、 超音波破砕、 限外ろ過、 ゲル濾過、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交.換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 高速液体 クロマトグラフィー （H P L C ) 等の各種液体クロマトグラフィー、 透析法、 そ れらの組み合わせ等を例示できる。 特に、 本発明のタンパク質のアミノ酸配列中にはカルモジュリン結合配列とし て知られている配列モチーフ 「1— 8— 1 4モチーフ タイプ B (Rhoads, A. R. and Friedberg, F, The FASEB Journal 11, 331-340参照) J に相当する配列

(配列表の配列番号 2の 4 2 2 - 4 3 5に示されるアミノ酸配列） が存在するの で、 本発明のタンパク質を含む標品を、 置換基としてカルモジュリンを有するァ— フィニティークロマトグラフィー樹脂 （例えば、 カルモジュリン 'セファロー ス） に吸着させ、 次いでこの榭脂をカルモジュリンを含まない溶媒で洗浄した後、 E G T Aまたは E D T Aを含む溶媒で本発明のタンパク質を溶出させる方法によ り、 本発明のタンパク質を効率よく精製 ·回収することが可能である。 また、 発現させる組換えタンパク質に 6残基からなるヒスチジンタグを繋げるこ とにより、 ニッケルァフィ二ティーカラムで効率的に精製することができる。 上記方法を組み合わせることにより容易に髙収率、 高純度で本発明のタンパク質 を大量に製造で.きる。 なお、 上記のようにして精製された本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、 自 動タンパク質アミノ酸配列決定装置 （例えば、 パーキンエルマ一ジャパン 'ァプ ライドバイオシステムズ社製モデル 4 9 2 ) を用いて確認することができる。 このようにして本発明の D N Aから遺伝子工学的手法により得られるタンパク 質がセラミ ドキナーゼ活性を発現するためには、 必ずしも配列表の配列番号 2の アミノ酸番号 1一 5 3 7に示されるアミノ酸配列と完全に一致する配列からなる ものである必要はなく、 例えばその部分配列であっても、 それがセラミ ドキナー ゼ活性を示す限り、 そのような部分配列からなるものもまた本発明のタンパク質 に包含される。 また、 該タンパク質をコードする D N Aも本発明に含まれる。 一般に真核生物の遺伝子は、 インターフヱロン遺伝子などで知られているよう に、 多型現象 （polymorphism) を示すと考えられ （例えば、 Nishi, T. et al. (1985) J. Biochem. 97， 153-159を参照） 、 この多型現 によって、 一個または それ以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、 ヌクレオチド配列の置換はあつ てもアミノ酸は全く変わらない場合もある。 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 一 1から 5 3 7に示されるアミノ酸配列からなる本発明のタンパク質アミノ酸配 列中の、 一つもしくは二つ以上の部位において、 一つもしくは二つ以上のァミノ 酸残基が欠失、 付加、 挿入おょぴ Zまたは置換されているタンパク質でも、 セヲ ミ ドキナーゼ活性を有することが多い [天然型のアミノ酸配列が置換したァミノ 酸配列を有するタンパク質が、 天然型タンパク質と同等の活性を有する例として、 例えば、 インターロイキン 2 ( I L - 2 ) 遺伝子のシスティンに相当するヌクレ ォチド配列をセリンに相当するヌクレオチド配列に変換して得られたタンパク質 、 I L一 2活性を保持することが知られている。 （Wang, A. et al. (1984) Science 224, 1431-1433) ] 。 それらのタンパク質は、 セラミ ドキナーゼ活性を 有する限り、 全て本発明に含まれる。 また、 これらのタンパク質をコードする、 同効のヌクレオチド配列からなる D N Aも全て本発明に含まれる。 このような各種の本発明の D N Aは、 上記セラミ ドキナーゼ活性を有するタン パク質の情報に基づいて、 例えばホスフアイト · トリエステル法 （Hunkapiller, M. et al. (1984) Nature 310, 105-111) などの常法に従い、 核酸の化学合成に より製造することもできる。 なお、 所望のアミノ酸に対応するコドンは、 その選択も任意でよく、 例えば利 用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。 （Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 143-174) 。 さらに、 これらヌクレオチ ド配列のコドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコードする合成オリゴ ヌクレオチドからなるプライマーを利用した、 部位特異的変異導入法 （site specific mutagenesi s/Mark, D. F. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666) などに従うことができる。 また、 任意の一つもしくは二つ 以上のアミノ酸残基を欠失させた改変体を作製するためには、 ェキソヌクレア一 ゼ B a 1 3 1等を用いて D N Aを末端から削る方法 （岸本 利光ら "続生化学実 験講座 1 ·遺伝子研究法 I I " 335-354) 、 カセット変異法 （岸本 利光、 "新 生化学実験講座 2 ·核酸 I I I組換え D N A技術 " 242-251) などに従うことが できる。 上記のようなセラミ ドキナ一ゼ活性を有するタンパク質のうち、 好適なものと しては、 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号 1のメチォ ェン残基を N末端とする 5 3 7個のアミノ酸からなるタンパク質を例示できる。 また、 ある D N Aが配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1 2 4から 1 7 3 4に示されるヌクレオチド配列からなる D N Aとハイブリダィズするか否かは、 例えば目的とする D N Aをランダムプライマー法 （Anal. Biochem. , 132 : 6013 (1983) ) やニックトランスレーション法 （Maniatis, T. et al. (1982) in Molecular Cloning A Laboratory Mannual Cold Spring harbor Laboratory, NY. ) 等に従い、 [ _α _ ^{3 2} Ρ ] d C T P等で標識したプローブを用いてハイプリ ダイゼーションを行い調べることができる。 ハイブリダィゼーシヨンに用いる D N Aは、 公知の方法、 例えば-トロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、 加 熱あるいは紫外線照射により固相化させる。 次いで、 その膜を例えば 6 X S S C、 5% デンハート （Denhardt) 溶液および 0, 1 % ドデシル硫酸ナトリウム (以下 「SD S」 という） を含むプレハイプリダイゼーシヨン溶液に浸し、 5 5 °Cで 4時間以上保温する。 その後、 先に作成した標識プローブを同様のプレハ ィブリダイゼーション溶液に最終比活性 1 X 1 0⁶ c p m/m 1 となるように加 え、 6 0°Cでー晚保温する。 膜を 5 7 °Cで 5分間洗浄する操作を 5回繰り返し、 さらに 5 7 °Cで 20分間洗浄後、 オートラジオグラフィーを行うことにより、 ノヽ イブリダィズしたか否かを判定することができる。 この方法を利用して、 各種動 物細胞由来の c DNAライブラリ一から、 配列表の配列番号 1のヌクレオチド番 号 1 24から 1 734に示されるヌクレオチド配列からなる DN Aとハイブリダ ィズする cDNAを単離することができる。 （Maniatis, T. et al. (1982) in "Molecular Cloning A Laboratory Mannual Cold Spring Haroor Laboratory, NY. ) 。 上記のような本発明のタンパク質をコードする DNAとして好適なものとして は、 配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1から 446 3で示されるヌクレオ チド配列からなる DN Aを例示でき、 より好適には配列表の配列番号 1のヌクレ ォチド番号 1 24から 1 7 34で示されるヌクレオチド配列からなる DNAを例 示できる。 本発明のタンパク質がセラミ ドキナーゼ活性を有することは、 例えば基質に放射 性の³² P— AT Pを用いるスフィンゴシンキ^ "一ゼ活性測定用のシュピーゲルらの 方法 （Olivers, A. and Spiegel, S. (1993) Nature 365, 557- 560参照） を改変し た以下の方法に従って確認することができる。 具体的には、 当該タンパク質を含む溶液と、 塩化マグネシウム、 EDTA、 ジチ オスレィ トール、 バナジン酸ナトリ ウム、 プロテアーゼインヒビター （例えば、 コ ンプリート （商標名。 ベーリンガーマンハイム社製） ） を含むへぺス緩衝液 （pH 7. 0) , 基質 [ゥシ血清アルブミン （以下 「： B SA」 という） 溶液 （4mgZm 1 ) に溶解した C ₆セラミ ド、 もしくはォクチルダルコシドを用いてミセル化したセ ラミ ド （ゥシ胎児脳よりの精製品 （シグマ社製） ) ] 、 さらには放射標識^{3 2} P— A T Pを混合し、 3 7 °Cで保温することによりセラミ ドキナーゼ反応を行う。 次に、 1 N塩酸を加えることにより反応を停止させ、 クロ口ホルム：メタノール：濃塩酸

( 1 0 0 : 2 0 0 : 1、 v / v ) を加えて抽出操作を施し、 得られた下層 （クロ口 ホルム層） を薄層クロマトグラフィー （以下 「T L C」 という） で展開、 分析する。 セラミ ドキナーゼ活性は上記 T L Cにおいて、 生成物であるセラミ ド—1一リン酸

(以下 「C e r— 1— P J という） のスポットを定量することにより得られる。

ただし、 本発明のタンパク質のセラミ ドキナーゼ活性検出方法はこれらの方法 に限定されず、 本発明のタンパク質が限定的にリン酸化し得る他の基質 （例えば ³ Hや^{1 4} C放射標識セラミ ドゃ各種蛍光標識セラミ ド等） を使用することも可能 である。 ' また、 上記のセラミ ドキナーゼ活性検出方法において、 合成された化合物ゃ微生 物培養物からの抽出物等の被検試料を基質リン酸化反応時に共存させ、 該被検試料 が本発明のタンパク質のセラミ ドキナーゼ活性を活性化または阻害するか否かを調 ベることにより、 セラミ ドキナーゼ活性化剤または阻害剤の評価乃至スクリーニン グが可能である。 例えば、 ある化合物を基質リン酸化反応時に共存させたときのリ ン酸化基質の量 （ 「a」 とする） を、 該化合物を添加しなかった場合のリン酸化基 質の量 （ 「b」 とする） と比較し、 aが bよりも大きくなる場合は、 該化合物はセ ラミ ドキナーゼの活性化作用があると判定でき、 逆に、 aが bよりも小さくなる場 合は、 該化合物はセラミ ドキナーゼの阻害作用があると判定できる。 特に、 本発明 のタンパク質のセラミ ドキナーゼ活性を特異的に活性化する作用が強く、 他のリン 酸化酵素 （キナーゼ） の活性に影響しないような物質については、 セラミ ドキナー ゼ特異的活性化剤として前述の各種病態 （各種炎症性疾患、 H I V、 2型糖尿病、 肥満、 敗血症、 動脈硬化等） 'における薬効が期待できる。 一方、 本発明のタンパク 質のセラミ ドキナーゼ活性を特異的に阻害する作用が強く、 他のリン酸化酵素 （キ ナーゼ） の活性に影響しないような物質については、 セラミ ドキナーゼ特異的阻害 剤として前述の用途 （癌の放射線療法や化学療法における治療効果の向上等） にお ける薬効が期待できる。

また、 本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の例として、 本発明のタン パク質と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、 その取 得方法は、 以下に記載する通りである。 モノクローナル抗体の製造にあたっては、 一般に下記のような作業工程が必要 である。 すなわち、

( a ) 抗原として使用する生体高分子の精製、

( b ) 抗原を動物に注射することにより免疫した後、 血液を採取しその抗体価を 検定して脾臓摘出の時期を決定してから、 抗体産生細胞を調製する工程、

( c ) 骨髄腫細胞 （以下 「ミエローマ」 という） の調製、

( d ) 抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、

( e ) 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマ群の選別、

( f ) 単一細胞クローンへの分割 （クローニング） 、

( g ) 場合によっては、 モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイプリ ド 一マの培養、 またはハイプリ ドーマを移植した動物の飼育、

( h ) このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、 およびその認 識特異性の検討、 あるいは標識試薬としての特性の検定、

等である。 以下、 モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、 該抗体の 作製法はこれに制限されず、 例えば脾細胞以外の抗体産生細胞おょぴミエローマ を使用することもできる。

( a ) 抗原の精製

抗原としては、 前記したような方法で調製した本発明のタンパク質またはその 一部を使用することができる。 さらに、 本発明により該タンパク質の一次構造が 明らかにされたので、 例えば、 当業者に周知の方法を用いて該タンパク質の部分 ペプチドを化学合成し、 これを抗原として使用することもできる。

( b ) 抗体産生細胞の調製

工程 （a ) で得られた抗原と、 フロインドの完全または不完全アジュバント、 ま たは力リミヨゥバンのような助剤とを混合し、 免疫原として実験動物に免疫する。 実験動物としては、 マウスが最も好適に用いられるが、 これに限定されない。 マウス免疫の際の免疫原投与法は、 皮下注射、 腹腔内注射、 静脈内注射、 皮内 注射、 筋肉內注射いずれでもよいが、 皮下注射または腹腔内注射が好ましい。 免疫は、 一回、 または、 適当な間隔で （好ましくは, 1週間から 5週間間隔で） 複数回繰返し行なうことができる。 その後、 免疫した動物の血清中の抗原に対す る抗体価を測定し、 抗体価が十分高くなつた動物を抗体産生細胞の供給原として 用いれば、 以後の操作の効果を高めることができる。 一般的には、 最終免疫後 3 〜5日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ましい。 ここで用いられる抗体価の測定法としては、 放射性同位元素免疫定量法 （以下 「R I A法」 とレヽう） 、 固相酵素免疫定量法 （以下 「E L I S A法」 とレヽう） 、 蛍光抗体法、 受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、 検出感度、 迅速性、 正確性、 および操作の自動化の可能性などの観点から、 R I A法または E L I S A法がより好適である。 ' 本発明における抗体価の測定は、 例えば E L I S A法によれば、 以下に記載す るような手順により行うことができる。 まず、 精製または部分精製した抗原を E L I S A用 9 6穴プレート等の固相表面に吸着させ、 さらに抗原が吸着していな い固相表面を抗原と無関係なタンパク質、 例えば B S Aにより覆い、 該表面を洗 浄後、 第一抗体として段階希釈した試料 （例えばマウス血清） に接触させ、 上記 抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。 さらに第二抗体として酵素標 識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、 洗浄後該酵素 の基質を加え、 基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することによ り、 抗体価を算出する。

(c) ミエローマの調製工程

ミエローマとしては、 一般的にはマウスから得られた株化細胞、 例えば 8—ァ ザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） ミエローマ株 P3X63Ag8U.1(P3- U1)

[Yelton, D. E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978)] 、 P3/NSI /1-Ag4 - 1 (NS - 1) [Kohler, G. et al. European J.

Immu nology, 6, 511-519 (1976) ] 、 Sp2 /0 - Agl4 (SP - 2) [Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)] 、 P3X63Ag8.653 (653) [Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)] 、 P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)] などを用いることが好ま しい。 これらの細胞株は、 適当な培地、 例えば 8—ァザグァニン培地 [RPM I — 1 640培地にグルタミン、 2 _メルカプトエタノール、 ゲンタマイシン、 お よびゥシ胎児血清 （以下 「FCS」 とレヽう） を加えた培地に 8—ァザグァニンを カロえた培地] 、 イスコフ改変ダルベッコ培地 （Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium ；以下 「 I MDM」 という） 、 または DM EMで継代培養するが、 細胞 融合の 3乃至 4日前に正常培地 [例えば、 1 0 % FC Sを含む. A S F 1 04培 地 （味の素 （株） 社製） ] で継代培養し、 融合当日に 2 X I◦ ⁷以上の細胞数を 確保しておく。

(d) 細胞融合

抗体産生細胞は、 形質細胞、 およびその前駆細胞であるリンパ球であり、 これ は個体のいずれの部位から得てもよく、 一般には脾、 リンパ節、 末梢血、 または これらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、 脾細胞が最も一般的 に用いられる。 最! ^免疫後、 所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、 例えば脾臓.を摘出し、 抗体産生細胞である脾細胞を調製する。 この脾細胞と工程 (c) で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われて いるのは、 細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレンダリコールを 用いる方法である。 この方法は、 例えば以下の手順よりなる。 脾細胞とミエ口一マとを無血清培地 （例えば RPM I 1 640) 、 またはリン 酸緩衝生理食塩液 （以下 「PB S」 とレ、う） でよく洗浄し、 脾細胞とミエローマ の細胞数の比が 5 ： 1〜1 0 ： 1程度になるように混合し、 遠心分離する。 上清 を除去し、 沈澱した細胞群をよくほぐした後、 撹拌しながら 1 m 1の 50% (w /v) ポリエチレングリコール （分子量 1 000〜4000) を含む無血清培地 を滴下する。 その後、 1 Om lの無血清培地をゆつくりと加えた後遠心分離する。 再ぴ上清を捨て、 沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン■アミノプテリン .チミ ジン （以下 「HAT」 という） 液おょぴマウスインターロイキン一 2 (以下 「I L一 2」 とレ、う） を含む正常培地 （以下 「HAT培地」 という） 中に懸濁して培 養用プレート （以下 「プレート」 という） の各ゥエルに分注し、 5% 炭酸ガス 存在下、 3 7 °Cで 2週間程度培養する。 途中適宜 HAT培地を補う。

(e) ハイプリ ドーマ群の選択

上記ミエローマ細胞が、 8—ァザグァニン耐性株である場合、 すなわち、 ヒポ キサンチン ' グァニン .ホスホリポシルトランスフェラーゼ （HGPRT) 欠損 株である場合、 融合しなかった該ミエローマ細胞、 およびミエローマ細胞どうし の融合細胞は、 HAT含有培地中では生存できない。 一方、 抗体産生細胞どうし の融合細胞、 あるいは、 抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイプリ ドーマは生 存することができるが、 抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。 したが つて、 HAT含有培地中での培養を続けることによって、 抗体産生細胞とミエ口 一マ細胞とのハイプリ ドーマのみが生き残り、 結果的にハイブリ ドーマを選択す ることができる。 コロニー状に生育してきたハイプリ ドーマについて、 HAT培地からアミノプ テリンを除いた培地 （以下 「HT培地」 とレ、う） への培地交換を行う。 以後、 '培 養上清の一部を採取し、 例えば、 EL I S A法により抗体価を測定する。 以上、 8—ァザグァニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、 その他の細 胞株もハイプリ ドーマの選択方法に応じて使用することができ、 その場合使用す る培地組成も変化する。

( f ) クローニング

工程 （b ) の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、 特異的抗体を 産生することが判明したハイプリ ドーマを、 別のプレートに移しクローニングを 行う。 このクローニング法としては、 プレートの 1ゥエルに 1個のハイプリ ドー マが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、 軟寒天培地中で培養しコ口- 一を回収する軟寒天法、 マイクロマ二ュピレ一ターによって 1個づつの細胞を取 り出し培養する方法、 セルソーターによって 1個の細胞を分離する 「ソータク口 ーン」 などが挙げられるが、 限界希釈法が簡便でありよく用いられる。 抗体価の認められたゥエルについて、 例えば限界希釈法によるクローニングを 2〜4回繰返し、 安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗 体産生ハイプリ ドーマ株として選択する。

( g ) ハイプリ ドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製

クローユングを完了したハイブリ ドーマは、 培地を H T培地から正常培地に換 えて培養される。 大量培養は、 大型培養瓶を用いた回転培養、 あるいはスピナ一 培養で行われる。 この大量培養における上清を、 ゲル濾過等、 当業者に周知の方 法を用'いて精製することにより、 本発明のタンパク質に特異的に結合するモノク ローナル抗体を得ることができる。 また、 同系統のマウス （例えば、 上記の B A L B / c ) 、 あるいは N u ZN uマウスの腹腔内で該ハイプリ ドーマを増殖させ ることにより、 本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができ る。 精製の簡便な方法としては、 市販のモノクローナル抗体精製キット （例えば、 MA b T r a p G I ίキット ； フアルマシア社製） 等を利用することもできる。 かくして得られるモノクローナル抗体は、 本発明のタンパク質に対して高い抗 原特異性を有する。 2フ

( h ) モノクローナル抗体の検定

得られたモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの決定は以下の ように行うことができる。 まず、 同定法としてはォクテルロニー

(Ouchterlony) 法、 E L I S A法、 または R I A法が げられる。 ォクテル口 ニー法は簡便ではあるが、 モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が 必要である。 一方、 E L I S A法または R I A法を用いた場合は、 培養上清をそ のまま抗原吸着固相と反応させ、 さらに第二次抗体として各種ィムノグロブリン アイソタイプ、 サブクラスに対応する抗体を用いることにより、 モノクローナル 抗体のアイソタイプ、 サブクラスを同定することが可能である。 また、 さらに簡 便な方法として、 市販の同定用のキット （例えば、 マウスタイパーキット ；バイ ォラッド社製） 等を利用することもできる。 さらに、 タンパク質の定量は、 フォーリンロウリー法、 および 2 8 0 n mにお ける吸光度より算出する方法 [ 1 . 4 ( O D _{2 8 0}) =ィムノグロブリン l m g / m 1 ] により行うことができる。 このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、 その特異性を利用し た本発明のタンパク質の検出や分離精製に用いることができる。 本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド は、 該タンパク質の有するセラミ ドキナーゼ活性が治療または予防に有効である. ような疾患 （各種炎症性疾患、 H I V感染、 2型糖尿病、 肥満、 敗血症、 動脈硬 化等） の遺伝子治療に用いることができる。 遺伝子治療においては、 本発明のタ ンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを、 例えばゥ ィルスべクタ一に組み込んで、 該組換えウィルスベクターを有するウィルス （無 毒化されたもの） を患者に感染させる。 患者体内では本発明のタンパク質が産生 され、 セラミドキナーゼ活性を表すので、 前述の疾患において症状を改善したり 進行を抑制することができる。 遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、 ウィルスベクターを利用した 遺伝子導入方法、 あるいは非ウィルス性の遺伝子導入方法 （日経サイエンス， 199 4年 4月号， 20- 45頁、 実験医学増刊， 12 (15) (1994)、 実験医学別冊 「遺伝子治療の 基礎技術」 ，羊土社 （1996) ) のいずれの方法も適用することができる。 ウィルスベクターによる遺伝子導入方法としては、 例えばレトロウイルス、 ァ デノウィルス、 アデノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシェアウィルス、 ボックスウィルス、 ポリオウイルス、 シンビスウィルス等の D N Aウィルスまた は R N Aウィルスに、 T R 4あるいは変異 T R 4をコードする D N Aを組み込ん で導入する方法が挙げられる。 このうち、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 ァ デノ関連ウィルス、 ワクシニアウィルスを用いた方法が、 特に好ましい。 非ウイ ルス性の遺伝子導入方法としては、 発現プラスミ ドを直接筋肉内に投与する方法 (D N Aワクチン法） 、 リボソーム法、 リポラエクチン法、 マイクロインジエタ シヨン法、 リン酸カルシウム法、 エレク ト口ポレーシヨン法等が挙げられ、 特に D N Aワクチン法、 リボソーム法が好ましい。 また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、 D N Aを直接体内に導 入するインビボ （in vivo) 法およびヒトからある種の細胞を取り出し体外で D N Aを該細胞に導入し、 その細胞を体内に戻すエタスビボ （ex vivo) 法がある

(日経サイエンス， 1994年 4月号， 20- 45頁、 月刊薬事， 36 (1) , 23 - 48 (1994) 、.実験 医学増刊， 12 (15) (1994) ) 。 例えば、 該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、 疾患、 症状等 に応じ、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋肉内等、 適当な投与経路により投与される 。 またインビボ法により投与する場合は、 該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等 とされるが、 必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。 また、 リボソームまたは 膜融合リボソーム （センダイウィルス一リボソーム等） の形態にした場合は、 懸 濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤とすることができる。 配列表の配列番号 1に示されるヌクレオチド配列の部分配列に相補的なヌクレ ォチド配列は、 いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。 アンチセンス 分子は、 配列表の配列番号 1に示されるヌクレオチド配列の一部に相補的な、 通 常 1 5乃至 3 O m e rからなる D N A、 もしくはそのホスホロチォエート、 メチ ルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体などの安定な D N A誘導体、 2 ' —〇 —アルキル R N Aなどの安定な R N A誘導体として用いられ得る。 そのようなァ ンチセンス分子を、 微量注入、 リボソームカプセル化により、 あるいはアンチセ ンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、 本発明の技術分野におい て周知の方法で、 細胞に導入することができる。 このようなアンチセンス療法は 、 配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1 2 4— 1 7 3 4に示されるヌクレオ チド配列がコードするタンパク質の活性を減少させることにより、 例えば、 癌の 放射線療法や化学療法における治療効果の向上が期待できる。

.オリゴヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、 医薬 として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。 このよう な担体と製造方法の例は、 レミントンの Pharmaceutical Sciencesに記載されて いる。 そして、 配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1 2 4— 1 7 3 4に示さ れるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現やその遺伝子産物の活性に異常の認め られる動脈硬化の治療に十分な量を各人に投与される。 その有効量は、 各人の状 態、 体重、 性別、 及ぴ年齢などの種々の因子や、 皮下、 局所、 経口、 及び筋肉内 といった投与方法の違いによって変化し得る。 例えば、 静脈注射する場合には、 0 . 0 2乃至◦. 2 m g Z k g /時間で 2時間、 また、 皮下投与の場合には、 1 乃至 2 0の^ ^^ノ日のょぅに変化し得る

[発明を実施するための最良の形態]

以下、 実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらに限 定されるものではない。 なお、'下記実施例において、 遺伝子操作に関する各操作 は特に明示がない限り、 「モレキュラークローニング （Molecular Cloning) J LSambrook, J. , Fritsch, E. F.および Maniatis, T. 、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に発刊] に記載の方法により行う力 または、 市販 の試薬ゃキッ を用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。 [実施例 1] cDNAクロー-ング '

1 ) マウススフィンゴシンキナーゼ 1と弱い相同性をもつ c DNAクローンの 検索とヌクレオチド配列の解析

既知のマウススフインゴシンキナーゼ 1のアミノ酸配列に基づいて、 NCB Iの d b E S Tデータベースに対して tblastnのアルゴリズムを用いて相同性検索を行レ、、 マウススフィンゴシンキナーゼ 1のに相同性のある E S Tクローン （GenBank accesion number AA355581) 兒出した。 この E S Tクローンのヌクレオチド配列をコードする c DNAのクローンを得る ため、 以下に記載する方法により、 PCRにより作製したプローブを用いてライブ ラリースクリーニングを行った。

2) P CRによる c DNA断片の増幅

E S Tクローン AA355581に基づく以下の 2つのオリゴヌクレオチドプライマ一： 0 - tcaccactgacatcatcgttactgaacatgcta - 3' cerkl：酉己歹 (J表の酉己歹 (1番^■ 3 ) ；ぉ よび

0 - caacgatatgcagcgccgaggtttctgcgtcgctg -3' cerkal：酉己歹 (J表の酉 3歹リ番 4 ) を合成した。 次いで、 市販 c DNAライブラリーを錄型として、 LA PCRキット 'パージ ヨン 2. 1 (宝酒造 （株） 社製） を用いた PCRを行なった。 すなわち、 5 μ 1の cDNAライブラジ一 (Marathon-Ready human leukemia (クロンテック社製) ) と、 オリゴヌクレオチドプライマー （cerklおよび cerkal) 各 0. 4 μ M、 ならびに d A TP、 dGTP、 d CTP、 dTTP各 400 μΜ、 2. 5 mM 塩化マグネシゥ ムを含む I X LA PCR緩衝液、 0. 05単位の LA T a q DNAポリメラ —ゼ （以上キットに添付） からなる 50 μ 1の反応液を調製した。 この反応液を 9 4°Cで 2分間加熟した後、 94°Cで 1分、 60°Cで 1分、 72°Cで 2分の温度サイ クルを 30サイクル繰り返してから、 72°Cで 1 0分間保温した （タカラ PCRサ 一マルサイクラ一 MP (宝酒造 （株） 社製） を使用）。 この反応液を 1 %ァガロ ースゲル電気泳動で解析した結果、 目的とする 300 b pに近い大きさの DNA断 片のバンドが観察された。 このバンドを含むゲル片を切りだし、 該ゲル片からこの バンドの DNA断片を、 抽出用キット （Q I Aクイックゲルェクストラクシヨンキ ット。 キアゲン社製） を用いて回収した。 得られた DNA断片を、 T/Aクロー二 ング法 （Clark, J. M. et al. (1988) Nucleic Acid Res. 16:9677-9686) により p CR 2. 1ベクター （真核生物用 TAクローユングキット （インビトロゲン社製） に添付） に連結し、 大腸菌 TOP 1 0 F' 株 （真核生物用 T Aクローユングキット に添付） に導入した。 得られた形質転換株よりプラスミ ド DNA p CR 2. 1— CERKMを抽出し、 揷入されている c DNAの全ヌクレオチド配列をジデォキシ ヌクレオチド鎖終結法によりヌクレオチド配列を決定した。 その結果、 得られたヌ クレオチド配列は、 上記 1) の E STクローン AA355581のヌクレオチド配列の一部 (配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 6 1 1〜9 1 0) をコードするものであ つた。

3) プラークハイブリダィゼーシヨン用フィルターの調製

市販の c DNAライブラリ一 （Lambda ZAP IIライブラリー （ス トラタジーン社 製） ） を用いてライブラリースクリーニングを行った。 まず Lambda ZAP IIライブラリーの力価を以下に記載する方法により決定した。 大 腸菌 XL— 1 B l u e MRF' 株を 1 0mM 硫酸マグネシウムおよび 0. 2 % ,マルト一スを含む LB培地 （1 0 gの塩化ナトリウム、 1 0 gのバク トトリ プトンおよび 5 gの酵母エキスを水 1 リットルに溶解、 pH7. 0に調整した培 地） 中、 37°Cで培養した。 対数増殖期に、 遠心して大腸菌体を回収し、 600 η mの吸光度 （OD ₆₀₀) が 0. 5となるように 1 0mM 硫酸マグネシウム溶液を 加えて懸濁した。 ファージ液を TE緩衝液で 1 0⁴— 1 0⁷倍になるよう希釈し、 各 希釈液 1 μ 1を 200 μ 1の大腸菌懸濁液と混合し、 37 °Cで 1 5分間保温した後、 48 °Cに保温した軟寒天培地 [LB培地 （1 0 gの塩化ナトリゥム、 1 0 gのバタ トトリプトンおよび 5 gの酵母エキスを水 1 リットルに溶解、 pH7. 0に調整し た培地） に 0. 7%のァガーを加えたもの] を加え、 滅菌済プラスチックシャーレ に播種した。 このものを 37°Cで 6乃至 8時間培養後、 プラークを計数することに より、 力価を算出した結果、 得られたプライマリーライブラリーの力価は 4. 6 X 1 0⁶プラーク形成単位 （以下 「p f u」 という） であった。 プライマリ一ライブラリ一は一般に不安定であるので、 1 X 1 0⁶p f u相当のプ ライマリーライブラリーを上述と同様の方法で再度大腸菌に感染させて増幅したも のを回収し、 Lambda ZAP IIライブラリ一を得た。

Lambda ZAP IIライプラリーのうち、 5 X 1 0⁵プラーク相当の DNAを二トロセ ルロースフィルター （ストラタジーン社製） に固定した。 すなわち、 c DNAライ ブラリーを有するファージの感染した大腸菌を直径 1 5 cmのプレートあたり 5 X 1 0⁴個のプラークが形成されるように分散させた。 エトロセルロースフィルタ一は プレートに乗せて、 1 8Gの注射針で 3力所穴を空けることにより、 後で位置を同 定するための印を付けた。 室温で 2分間放置してファージプラークを移しとつた後、 フィルターを剥がし、 アルカリ溶液 （0. 5N 水酸化ナトリウムおよび 1. 5M 塩化ナトリウム） 中に 2分間、 次いで中和溶液 （1. 5M 塩化ナトリウムを含む 0. 5M トリスー塩酸 (pH8. 0) ) 中に 5分間、 さらに洗浄液 （2 X S SC を含む 0. 2M トリス一塩酸 (pH7. 5) ) 中に 30秒間浸した後、 室温で 2 時間風乾させた。 風乾後のフィルタ一はさらに 80°Cにて 2時間加温してプラーク を固相化させた。

4) プローブの作製おょぴハイブリダイゼーション

上記 2) で得られたプラスミ ド p CR 2. 1— CERKMを制限酵素 E c o R I で消化して得られた揷入 DNA断片 （300 b p) を DNAラベリングキット （ラ ンダムプライマーラベリングシステム、 ギブコ BRL社製） を使用して³² P標識し た （Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochetn. 132， 6) 。 次に ゲル濾過用樹脂を充填したマイクロスピンカラム （プローブ ' クアント G— 50マ イクロカラム、 フアルマシア社製） を用いて、 取り込まれなかったヌクレオチドを 除去した。 一方、 上記 3) で調製したプラーク転写済ニトロセルロースフィルターを、 5 0%ホルムアミ ド、 5 XS S C、 5 Xデンハート （Denhardt) 溶液、 0. 1% S D Sおよび 1 00 μ g/m 1の変性サケ精子 DNAを含む溶液中で、 37°C、 2時 間インキュベーションを行なった (プレハイブリダィゼ一シヨン) 後、 ³² P標識し たプローブを 1 X 1 0⁶ c pm/フィルタ一となるよう添加し、 37°Cで 1 2乃至 1 8時間インキュベーションした （ハイブリダィゼーシヨン） 。 その後、 フィルター を 1 X S SC、 0. 1% SDSを含む溶液中で 37°Cで 20分間、 さらに 0. 1 XS SC、 0. 1% SDSを含む溶液中で 60°Cで 1時間洗浄してから、 オート ラジォグラフィーを行なった。 その結果、 1次スクリーユングで 1 2個の陽性プラークが同定された。 これらの プラークをプレートから採取し、 そのそれぞれについて上述のスクリーニング操作 を繰り返すことにより、 最終的に 7個の陽性クローンを得た。 個々の陽性クローン について Lambda ZAP II Library (ストラタジーン社製） に添付されたヘルパーファ, ージ （ExAssist) と共に大腸菌 SOLR株に共感染させることにより、 目的の c D NAを含む p B l u e s c r i p tファージミ ドベクターへの切り出しを行った。 以上の操作により、 p B l u e s c r i p tファ一ジミ ドベクターに目的の c DN Aが揷入されたプラスミ ドを保持する形質転換大腸菌株を得た。 これらファージミ ド DNAについて制限酵素 E c 0 R Iによる消化を行って、 ポリアクリルアミ ドゲ ル電気泳動を実施し、 目的の c DN Aの長さを調べた。 その結果、 挿入 cDNAの 長さがそれぞれ約 1. 5 k b p、 約 3. 5 k b pおよび約 4. 4 k b pである 3種 類のプラスミ ド （p BK— 29、 p BK— 5および p BK— 33) が得られた。

5) ヌクレオチド配列の決定

上記 4) で得られたプラスミ ド p BK— 29、 p BK— 5および p BK— 33に 挿入されている c DNAの全ヌクレオチド配列をジデォキシヌクレオチド鎖終結法 により決定した。 なお、 一部の配列は全自動 DNA配列解析装置 （モデル 373 A、 (株） パーキンエルマ一■ ジャパン ·アプライ ドバイオシステムズ社製） を使用し て解析した。 その結果、 p BK— 33に挿入されている c DNAは、 P BK— 29 および p B K— 5の揷入 c DNAの全配列を含む 446 3 b pからなるヌクレオチ ド配列 （配列表の配列番号 1) を有していた。 さらに、 このヌクレオチド配列およ び該ヌクレオチド配列に含まれるオープンリーディングフレーム （以下 「ORF」 という） にコードされているアミノ酸配列 （配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1 から 537) について、 G e n B a n kおよび EMB Lの DNAデータベースなら ぴに SWI S S— PLOTプロテインデータベースに対して相同性検索を行った結 果、 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 537に示されるアミノ酸配列には 特に高い相同性を有する機能既知のタンパク質はなく、 新規タンパク質であること が判明した。 また、 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 537に示されるァ ミノ酸配列とヒ トスフィンゴシンキナーゼ 1または 2との全長にわたるアミノ酸配 列相同性は 29%しかないものの、 スフインゴシンキナーゼに種を越えて系統的に 保存されたドメイン部分 （T. Kohama et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 23722- 23728参照） については相同性が高かった。 さらに、 モチーフ検索を行ったところ、 PHドメイン （A. D. Ma & S. Abraras (1999) Thromb. Haemost, 82， 399- 406参 照） とジァシルグリセロールキナーゼドメイン （F. Sakana & H. Kanoh (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 1139-1143参照） を有することが示唆された。 このよ うにして得られた新規タンパク質をコードする c DNAを h CERK 1と命名した。

[実施例 2] 組換え体の発現

1) 発現ベクターの作製

脊椎動物細胞発現系を利用して、 実施例 1で得られた hCERKlを発現させ、 発 現タンパク質を得た。 まず、 サイ トメガロウィルスのプロモーターの下流に、 配列 表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 537に示すアミノ酸配列をコードする c D N A領域を有し、 該 cDN Aを発現させるための真核生物発現ベクターを構築した。 上記べクタ一作製のために、 実施例 1の 4 ) で得られた p B K— 33を制限酵素 S a c I Iで消化し、 揷入 c DNAを含む約 2. 3 k b pの断片を単離した。 一方、 真核生物発現用べクタ一 p CR 3. 1 (インビトロゲン社製） を制限酵素 E c o R Iで消化しアルカリフォスファタ一ゼで脱リン酸化した。 上記 2. ,3 k b p断片お よび p CR3. 1ベクターについて、 DNAブランティングキッ ト (宝酒造 （株） 社製） を用いて平滑末端化処理を行った後、 T4DNAリガーゼ （宝酒造 （株） 社 製） を用いた反応により両者を連結し、 大腸菌 TOP 1 0 F' 株に導入した。 得ら れた形質転換株よりプラスミ ド DNA p CR 3. 1— CERK 1を抽出し、 挿入 されている c DNAの全ヌクレオチド配列をジデォキシヌクレオチド鎖終結法によ り確認した。 なお、 この発現用プラスミ ド p CR 3. 1— CERK 1を保持する形質転換大腸 菌株 E. c 0 1 i p CR 3. 1 -CERK 1 SANK 70300は、 2000年 6月 2日付で日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号の産業技術総合研究所■特許 生物寄託センターに国際寄託され、 受託番号 FERM BP— 71 84が付された。

2) 動物細胞での発現

本発明のタンパク質がセラミ ドキナーゼ活性を有するか否かを確認するため、 上 記で得られた発現ベクター p CR 3. 1— CERK1を、 ヒ ト胚子腎臓細胞 HE K

293 (ATC C CRL— 1 573) にトランスフエクシヨンした。 すなわち、 組織培養用ポリリジンコート 6ゥヱルプレート （岩城硝子 （株） 社製） に 1ゥェル あたり 6 X 1 0⁵個の HE K 293細胞を入れて、 37°Cで 24時間培養した後に、 l gの p CR3. 1— CERK1をトランスフエクション試薬 （リボフエタタミ ン 'プラス、 ライフテクノロジ一社製） を添付のプロトコールにしたがって用いる ことにより トランスフエクシヨンした。 トランスフエクション操作終了後の細胞を

37 °Cで 1 日間培養した後、 培地を除去してから、 緩衝液 A (1 0% グリセロー ノレ、 ImM ジチオスレィ トール、 ImM EDTA、 1 mM バナジン酸ナトリ ゥム、 プロテアーゼインヒビター （コンプリート ^TM、 ベーリングマンハイム社製） 20 OmM へぺス緩衝液、 pH7. 0) にて細胞を回収した。 回収した細胞を、 プローブ型ソ-ケータ一 （セル 'ディスラブター 200、 ブランソン社製） にて超 音波破砕し、 この細胞破碎液を希釈して実施例 3に示す酵素活性測定に用いた。 また、 p CR3. 1発現ベクターは、 抗生物質 G41 8耐性マ一カーとして機能 する n e 0遺伝子を有するので、 p CR3. 1— CERK1をトランスフエクショ ンした後の HE K 293細胞を G 41 8存在下で培養することにより、 G41 8耐 性のコロニーを選択した。 このようにして、 本発明のタンパク質を安定に産生する 形質転換細胞を得た。

[実施例 3] セラミ ドキナーゼ活性の測定

セラミ ドキナーゼ活性の測定は、 上記実施例 2で調製した本発明のタンパク質 を含む細胞破砕液を用い、 [³'²Ρ]- γ— ATPおよび各種セラミ ドを基質として 用い、 以下に記載する方法に従って行った。 具体的には、 実施例 2で調製した本発明のタンパク質を含む 1 80 μ 1の緩衝液 Β [ 1 mM ジチオスレィ トール、 lmM EDTA、 1 mM バナジン酸ナトリ ゥム、 プロテアーゼインヒビタ.一 (コンプリ一ト ΤΜ、 ベ一リンガ一マンハイム社 製） 、 lmM 塩化カルシウム、 200mM へぺス緩衝液、 pH7. 0] に、 B S A溶液 （4mg/m 1 ) を用いて調整した 1 mM C₆セラミ ド 10 μ 1および 1 0 OmM 塩化マグネシウムと 2 の放射標識 [³² P] — γ— ATP (ΝΕΝ 社製） との混合液 Ι Ο μ Ιを添加し、 37 °Cで 20分間保温することによりセラ ミ ドキナーゼ反応を行った。 次に、 IN塩酸 20 μ 1を加えることにより反応を 停止させ、 クロ口ホルム ： メタノール：濃塩酸 （1 00 : 200 : 1、 ν/ν) 8 00 1 , 2. 5Μ 塩化カリ ウム 250 μ 1およびク Ρ口ホルム 250 μ 1 を加えて抽出操作を施し、 抽出液を 2000 X gで遠心分離した後、 得られた下層 (クロ口ホルム層） を TLCで展開、 分析した。 なお、 TLCに用いる展開溶媒と しては、 ブタノール一エタノール一水一酢酸 （80 : 20 : 1 0 : 20) が好適で あった。 セラミ ドキナーゼ活性は上記 TLCにおいて、 生成物であるセラミ ド一 1 —リン酸 （以下 「C e r— 1— P」 という） に相当するスポット （空のベクター p CR 3. 1で形質転換した細胞由来の試料を用いた陰性対照反応液の抽出液と比較 して、 p CR3. 1— CERK 1で形質転換した細胞由来の試料を用いた反応の抽 出物で強く表れるスポットとして同定される） の放射活性をイメージングアナライ ザ一 （BAS 2000、 富士フイ^^ム） で定量することにより得た。 上記方法で測定した結果、 実施例 2で得られた本発明のタンパク質を含む酵素液 のセラミ ドキナ一ゼ活性は、 基質が C₆セラミ ドの場合は 1 280 pmo 1 /m i n /mgであった。 C₆セラミ ドに対する Km値は 7 であった。 なお、 陰性反応対 照として p CR 3. 1ベクターのみを HE K 293細胞にトランスフエクシヨンし た際の細胞破砕液を酵素液として同様に測定した際のセラミ ドキナーゼ活性は 7 p m o 1 /m i nZmgであった。 また、 ゥシ胎 脳由来のセラミ ドなど天然型のセラミ ドを基質とするときにはォ クチルダルコシドなどの界面活性剤を用いてセラミ ドをミセル化した方がより好適 であった。 すなわち、 クロ口ホルムに溶解した必要量のセラミ ドを窒素気流下で乾 固し、 0. 2%ォクチルダルコシドをふくむ緩衝液 Bを加えて超音波処理し、 1 0 0 /zM セラミ ド溶液をつくつた。' その基質溶液 1 00 μ 1に酵素液を含む緩衝液 B 90 ί 1、 1 ひ OmM 塩化マグネシウムおよび 2 mM 放射標識 [³²P] — γ— ATPの混合液 10 1を添加し、 3'7°Cで 20分間保温することによりセ ラミ ドキナ一ゼ反応を行った。 C e r— 1—Pの抽出操作は上記と同様に行った。 この方法で測定した本発明のタンパク質を含む酵素液のセラミ ドキナーゼ活性は、 基質がゥシ胎児脳由来セラミ ドの場合は 200 pmo 1 /m i n/mgであった。 次に C₆セラミ ドを基質に用いて本発明のタンパク質の至適アツセィ条件の検討を 行った。 その結果、 本発明のタンパク質の至適 pHは 7— 7. 5であり、 塩化マグ ネシゥム、 塩化カルシウムによって活性化された。 また、 トライ トン X— 1 00や コール酸などの界面活性剤ゃホスファチジルセリン、 トリス緩衝液により本セラミ ドキナーゼ活性は阻害された。 また、 本発明のタンパク質を発現させた細胞破砕液 より、 3000 X gで未破砕細胞を除いた後、 l O O O O O X gで膜画分と細胞質 可溶性画分に分けて、 それぞれの画分のセラミ ドキナーゼ活性を測定したところ、 膜画分により強力なセラミ ドキナーゼ活性が認められた。 セラミ ドキナーゼ活性は、 今までに神経シナプス小胞 （S. M. Bajjalieh, et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 14354 - 14360参照） 、 H L— 60細胞 （K. A.

Dressier, et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 14917- 14921参照) 、 好中球 (V. T. Hinkovska-Galcheva, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 33203- 33209参照） 等で 報告されており、 それらの共通の性質として、 カルシウムで活性化されること、 膜 結合型であること、 至適 pHが中性であることが挙げらているが、 本発明のタンパ ク質組換え体のセラミ ドキナーゼ活性はこれらの全ての性質を有していた。 また、 本発明のタンパク質はジァシルグリセロール （以下 「DG」 とレヽう） キナ ーゼドメイン （F. Sakana & H. Kanoh (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 1139-1143参照） を有するものの、 DGキナーゼには影響しないカルシウムによって 活性化されること、 DGキナーゼの活性化因子であるホスファチジルセリン （H. Kanoh et al. (1883) J. Biol. Chem. 258, 1767- 1774参照） により阻害されること など、 D Gキナーゼとは明らかに異なる性質を有していた。'' 次に、 本発明のタンパク質の基質特異性を調べるため、 上記のように p CR3. 1— CERK1を HEK 293細胞に発現させた場合と、 p CR 3. 1ベクターの みを HE K 293細胞に発現させた場合 （HEK 293細胞の内在性の酵素活性） とで、 各種脂質を基質とした際のリン酸化活性を比較した （表 1) 。

【表 1】 リン酸化活性 活性比 pCR3.1-CERK1 pCR3.1 (pCR3.1-CERK1/ で形質転換 で形質転換 pCR3.1)

C 6セラミ ド 1280 7 183 ゥシ胎児脳由来セラミ ド 200 10 20

DG 150 130 1

D—エリスロースフインゴ 'シン 50 50 1 本発明のタンパク質は C ₆セラミド、 天然型ゥシ胎児脳由来セラミド等の各種セ ラミドを高効率にリン酸化した。 一方、 上記セラミドキナーゼの至適アツセィ条件 下では D Gやスフインゴシン等の脂質はほとんどリン酸化せず、 セラミドに対する 高い基質特異性を示した。

[産業上の利用の可能性]

以上述べたごとく、 本発明により、 セラミ ドキナーゼ活性を有する新規タンパ ク質おょぴ該タンパク質をコードする D NAが提供された。 さらに本発明は、 該 タンパク質を使用したセラミ ドキナーゼ活性化剤または阻害剤の試験方法および 該タンパク質を使用した特異的かつ高感度なセラミド定量方法を提供した。 本発 明のタンパク質またはそれをコードする D N Aは、 セラミ ドキナーゼに対して特 異的な活性化または阻害活性を有し、 神経性疾患治療薬、 抗炎症剤、 H I Vの治 療薬、 抗 2型糖尿病薬、 抗肥満薬、 抗敗血症薬、 抗動脈硬化薬および制癌剤とし て有用な新規化合物の探索や、 上記各種病態の解析に有用である'。

Claims

請 求 の 範 囲

1. 下記の i) または i i) の特徴を有するタンパク質：

i) 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 537に示されるアミノ酸配列から なるタンパク質；

i i ) 分子中に配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 5 37に示されるァミノ 酸配列の一つもしくは二つ以上のアミノ酸が付加、 欠失および/または置換されて いるアミノ酸配列を含み、 セラミ ドキナーゼ活性を有することを特徴とするタンパ ク質。

2. 配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1から 5 3 7に示されるアミノ酸配 列からなるタンパク質。

3. 形質転換大腸菌 E. c 0 1 i p CR 3. 1一 CERK1 SANK

70300 (FERM B P— 7 1 84 ) が保持するプヲスミ ドに揷入されてい る DNAにコードされるタンパク質。

4. 請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか一つに記載のタンパク質をコー ドする DNA。

5. 分子中に配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1 24から 1 7 34に 示されるヌクレオチド配列を含む DNA。

6. 配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1 24から 1 734に示されるヌ クレオチド配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 セラミ ドキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むこ とを特徴とする DNA。

7. 形質転換大腸菌 E. c o l i p CR 3. l—CERKl 'SANK

70300 (FERM B P— 7 1 84 ) が保持するプラスミ ドに揷入されてい る DNA。

8. 請求の範囲第 4項乃至第 7項のいずれか一つに記載の DNAを含む組換 え DNAベクター。

9. 形質転換大腸菌 E. c o l i p CR 3. 1— CERK1 SANK 7 0300 (FERM B P— 71 84) に保持されていることを特徴とする、 請求 の範囲第 8項記載の組換え. DN Aベクター。

10. 発現ベクターであることを特徴とする、 請求の範囲第 9項記載の組換 え DN Aベクター。

11. 請求の範囲第 8項乃至第 10項のいずれか一つに記載の組換え DN A ベクターで形質転換された宿主細胞。

12. 形質転換大腸菌 E. c o l i p CR 3. 1 -CERK1 SANK 70300 (FERM B P— 7184 ) であることを特徴とする、 請求の範 囲第 1 1項記載の宿主細胞。

13. 請求の範囲第 10項記載の組換え DN Aベクターで形質転換された宿 主細胞。

14. 請求の範囲第 13項記載の宿主細胞を、 セラミドキナーゼ活性を有する タンパク質の産生が可能な条件下で培養し、 次いで、 該培養物よりセラミ ドキナー ゼ活性を有するタンパク質を回収することを特徴とする、 セラミドキナーゼ活性を 有するタンパク質の製造方法。

15. 下記の （i) 乃至 （i i i) の工程を含む、 請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれか一つに記載のタンパク質の製造方法：

( i ) カルモジュリンを含まない溶媒に溶解させた請求項 1乃至 3のいずれか 一つに記載のタンパク質を含む材料の抽出物を、 置換基としてカルモジュリンを 有するァフィ二ティークロマトグラフィ一樹脂に吸着させる；

( i i ) ( i ) の樹脂をカルモジュリンを含まない溶媒で洗浄する ；

( i i i ) ( i i ) で洗浄された樹脂から、 EGTAまたは EDTAを含む溶 媒でセラミ ドキナーゼ活性を有するタンパク質を溶出させる。

16. 下記の工程を含む、 化合物または組成物試料のセラミ ドキナーゼ活性 化または阻害効果を試験する方法：

( i) 請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか一つに記載のタンパク質、 該タン パク質が特異的にリン酸化する基質および該化合物または組成物試料を共存させ た混合物を調製し、 一方、 該化合物または組成物試料を添加せず、 該タンパク質 および該基質を共存させた混合物を調製する ；

( i i ) 上記 （ i) で調製された各混合物における、 リン酸化された基質の量を 測定し比較する。

1 7. 請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか一つに記載のタンパク質が特異 的にリン酸化する基質が、 C₂セラミド、 C₆セラミド、 C₈セラミド、 C₁₆セラミ ドぉょぴゥシ胎児脳由来セラ'ミドからなる群から選択されるものであることを特徴 とする、 請求の範囲第 1 6項記載の方法。

1 8. 被検試料中のセラミ ドを検出または定量する方法であって、 請求の範 囲第 1項乃至第 3項のいずれか一つに記載のタンパク質、 被検試料および標識さ れたアデノシン 5' —三リン酸とを共存させ、 次いで、 標識されたセラミ ドを検 出または定量することを特徴とする方法。 '

1 9. セラミド検出または定量用キットの製造のための、 請求の範囲第 1項 乃至第 3項のいずれか一つに記載のタンパク質の使用。 ,

20. 請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれか一つに記載のタンパク質と特 異的に結合する抗体。

2 1. 請求の範囲第 4項乃至第 7項のいずれか一つに記載の DN Aを有効成 分として含むことを特徴とする医薬組成物。

22. 配列表の配列番号 1に示されるヌクレオチド配列中の連続した 1 5乃 至' 30ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列のアンチセンス配列からなる核酸。

23. 請求の範囲第 22項に記載の核酸を有効成分として含むことを特徴と する医薬組成物。