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WO2001047911A1 - Cationic amphiphiles, uses and synthesis method thereof - Google Patents

Cationic amphiphiles, uses and synthesis method thereof Download PDF

Info

Publication number
WO2001047911A1
WO2001047911A1 PCT/FR2000/003669 FR0003669W WO0147911A1 WO 2001047911 A1 WO2001047911 A1 WO 2001047911A1 FR 0003669 W FR0003669 W FR 0003669W WO 0147911 A1 WO0147911 A1 WO 0147911A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
compound
compounds
peptide
represent
Prior art date
Application number
PCT/FR2000/003669
Other languages
French (fr)
Inventor
Jadwiga Chroboczek
Maxim Balakirev
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique, Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Publication of WO2001047911A1 publication Critical patent/WO2001047911A1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D339/00—Heterocyclic compounds containing rings having two sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D339/02—Five-membered rings
    • C07D339/04—Five-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 2, e.g. lipoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the present invention relates to cationic amphiphiles derived from lipoic acid, to their applications as DNA transfection vectors and to their synthesis process.
  • Gene therapy is based on the therapeutic administration of nucleic acids; it requires the use of efficient and safe vectors for the transfer of therapeutic genes and its success therefore depends on the efficiency of the transfer of genes into the desired cells.
  • Many compositions capable of transfecting eukaryotic cells with selected genetic material have already been described and belong essentially to two main types of transfection vectors:
  • non-viral agents capable of promoting the transfer and expression of chemical substances such as DNA in eukaryotic cells.
  • Non-viral vectors mention may especially be made of preparations of cationic lipids, which can be cytotoxic, techniques of encapsulation of DNA in liposomes, polycationic polymers, such as poly (L-lysine) , protamine, polyethylenimine or even catio- nics (polyamidoamines). Both cationic lipids and polycationic polymers have variable transfection efficiencies depending on their structure and the target cell type.
  • cationic lipids and cationic polymers - cationic lipids, which generally consist of two domains: a cationic head allowing the binding to DNA , one or more hydrophobic chains and possibly a spacer separating these two elements ( Figure 2).
  • the prototype cationic lipid used for gene transfer is bromide or 2,3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium chloride (DOTMA), an amphiphilic quaternary ammonium (see Figure 1).
  • DOTMA 2,3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium chloride
  • DNA formulated with cationic lipids such as DOTMA and a neutral phospholipid forms lipocomplexes (in micellar form or in liposomal form) capable of transfecting cells with a large efficacy, in vitro and in the absence of serum proteins.
  • cationic lipids such as DOTMA and a neutral phospholipid (most commonly, dioleoylphosphatidylethanolamine or DOPE)
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • the lipid part which interacts with and / or destabilizes the membranes allows the fusion and entry of the DNA / liposome complex.
  • DNA transfection with liposomes although less immunogenic than that carried out using cationic polymers, is in fact a relatively ineffective process.
  • Agents capable of increasing the release of DNA from endosomal vesicles and its passage into the nucleus can increase the rate of gene transfer.
  • cationic lipids Since the demonstration of the transfecting efficiency of particles composed of DNA and DOTMA / DOPE, a large variety of cationic lipids has been synthesized and tested, with the aim of increasing the efficiency of transfection into the absence as in the presence of serum or, in vivo, to reduce the cytotoxicity of the formulations and to improve the bioavailability of the DNA-lipid particles.
  • a number of cationic lipids is commercially available (Lipofectin ® , Lipofectamine ® , Transfectam ® , TransfectACE ® ) and is used in basic research.
  • DOTMA 1,2-dioleoyloxypropyl chloride -trimethylammonium
  • DDAB dimethyldioctadecylammonium bromide
  • DOSPA diocta-decylamidoglycyl sperm
  • CTAB tricyclotyl-dimethyl-1-propanammonium
  • DC-Chol 1,2-dimyristyl-oxypropyl-3-dimethyl-hydroxylammonium bromide
  • - polycationic polymers such as poly (L-lysine), protamine, polyethylenimine or even cationic dendrimers (polyamidoamines), associate with DNA by multiple electrostatic interactions generating a cooperative process, which produces particles called polyplexes; such cationic polymers are however quite often toxic in vivo.
  • cationic polymers are however quite often toxic in vivo.
  • Different compositions based on cationic lipids, useful as vectors, have been described: - American Patent 5,264,618 in the name of Felgner et al. describes cationic lipids useful as transfection vectors. They present the following formula:
  • Yi and Y 2 which may be identical or different are in particular groups -OC (O), -O-, or -S-,
  • Ri and R 2 which may be identical or different, represent in particular a C 1-23 alkyl or alkylene group (for example, an aliphatic fatty acid chain),
  • R 3) Rt and R 5 which may be identical or different, represent in particular a C ⁇ -2 alkyl group
  • R ⁇ represents for example an alkyl group
  • lipid molecules carrying a cationic charge and their use in the transfection of nucleic acids. More precisely, these are thiocationic lipids which have the following general formula: CH 2 -Y, -R,
  • Ri and R which may be identical or different, represent in particular a C ⁇ - 23 alkyl or aralkyl group
  • R 3 represents in particular a d. ⁇ 2 alkyl or aralkyl group or a peptide (di, tri, tetra or pentapeptide) or a amino acid.
  • cationic lipids can be used in pharmaceutical formulations, in the form of complexes with a biomolecule, or in combination with other lipid substituents. These compounds include a positively charged S + sulfonium ion. Some of the formulations which contain liposomes based on said cationic lipids also further comprise vitamin D and an amphiphilic substance sensitive to pH.
  • the cationic lipids proposed in the prior art as vectors for transfection have the major drawback of not being destroyed in the cells into which they penetrate; such behavior has the consequence of making them cytotoxic; in addition, their bioavailability is generally low.
  • the Applicant has therefore set itself the goal of proposing new structures which better meet the needs of the practice than the structures of the prior art.
  • a non-viral gene therapy vector must have the following properties: transfer efficiency, high bioavailability, reduced cytotoxicity, cell targeting and crossing of cell membranes.
  • the subject of the present invention is cationic amphiphiles, characterized in that they are selected from the group consisting of:
  • Y represents one of the following groups: -O-, -O-CO- (CH 2 ) r -O-, -O-CO - (CH 2 ) r -NH-,
  • X represents a positively charged group, selected from the group consisting of:
  • R ' 4 represents a hydrogen atom or (CH) 3 -NH + 3
  • r and p are whole numbers between 1 and 10
  • m is an integer between 0 and 5, preferably equal to 0
  • Z is a non-toxic anion.
  • R represents a reduced group (z a ) -S- (CH 2 ) 2 - (( ⁇ HH)) - S, the two groups R 3 forming said group (z b ) ;
  • said targeting peptide is selected from the group consisting of peptides derived in whole or in part from an adenovirus fiber and comprising at least one zone consisting of at least 50% of hydrophobic amino acids selected from the group consisting of alanine, valine, phenylalanine, isoleucine, leucine, proline and methionine; said targeting peptide comprises at least: - a segment of an NLS sequence derived from an adenovirus fiber comprising between 4 and 5 amino acids,
  • hydrophobic sequence comprising between 7 and 50 amino acids, derived from an adenovirus fiber
  • said targeting peptide can be branched and comprises at least two fragments derived from an adenovirus fiber; said fragments each comprise a segment of an NLS sequence and a hydrophobic sequence, as defined above.
  • Such peptides are described in particular in French Patent Application No. 97 13771; said targeting peptides are grafted to the cationic amphiphilic polymer, during polymerization (FIGS. 3 and 5), which peptide is linked to said compound B by a sulfur atom.
  • Preferred cationic amphiphiles according to the invention are in particular shown in FIG. 3.
  • the present invention also relates to a composition capable of transferring a nucleic acid sequence to a eukaryotic cell, characterized in that it comprises a nucleic acid and a cationic amphiphilic polymer as defined above, operatively coupled to said nucleic acid.
  • the cationic amphiphilic B2 is capable of complexing a plasmid DNA and of transferring it through a cell membrane. This complexation with DNA is reversible by intracellular thiols, resulting in the release of DNA within the cell.
  • composition it also comprises at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • composition also comprises an endosomolytic agent, capable of transporting said nucleic acid through the cytoplasmic or endosomal membranes of said eukaryotic cell.
  • the present invention also relates to a process for the synthesis of said cationic polymer derived from lipoic acid which comprises:
  • FIG. 2 illustrates the structure of cationic lipids and in particular of DOTAP
  • FIG. 3 illustrates different structures of compounds A and B according to the invention
  • FIG. 4 illustrates the structure of lipoic acid
  • FIG. 8 illustrates the transfection of a cell with a cationic amphiphilic polymer-pDNA composition
  • FIG. 9 illustrates the method of preparation of products of formula A, in which X + comprises a spermine (or a spermidine).
  • Lipoic acid anhydride A mixture of lipoic acid
  • 3-Dimethylamino-1,2-propanediol (40 mg, 0.3 mmol) was added to 4 ml of a solution of lipoic acid anhydride (0.25 M), containing 50 mg (0.4 mmol) of 4- (dimethylamino) pyridine. After stirring overnight, under nitrogen, at ambient temperature, the reaction is stopped with methanol; the product is concentrated in vacuo and the residue is purified on an HPLC column (silica gel, 3% methanol in chloroform). The reaction makes it possible to obtain 105 mg of N- [1- (2,3-dilipoyloxy) propyl] -N, N, -dimethylamine with a yield of 70%.
  • compound Al was confirmed by its UN spectra (characteristic absorption at 333 nm) and IR, its mass spectrum m / z 511: (MH + ) and its elementary analysis (difference between C, H, N, S calculated and determined ⁇ 0.4%).
  • compound Al is unstable and undergoes partial polymerization on drying, it is stored in chloroform, at 4 ° C., in the dark. Polymerization reaction (compounds B2 and C).
  • the solution of compound Al in chloroform (1 mg, 0.002 mmol) is evaporated and the residue is dried under vacuum (20 h, room temperature, 0.03 mmol).
  • the film obtained is dissolved in 50 ⁇ l of DMSO and the solution obtained is mixed with 500 ⁇ l of TNE buffer (25 mM Tris, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.5). After blowing nitrogen bubbles into the solution, the polymerization is induced by adding DTT (30 ⁇ l of a 2 mM solution) or fiber peptide (1 mg, 0.0004 mmol) and the reaction is allowed to proceed. for 48 h, at 37 ° C, under nitrogen.
  • TNE buffer 25 mM Tris, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.5
  • DTT 30 ⁇ l of a 2 mM solution
  • fiber peptide (1 mg, 0.0004 mmol
  • Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOH) - (CH 2 OH) 0.55 g of the compound Boc 4 SperCO 2 H is added to a solution of dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.18 g) in 3 ml of DMF / pyridine mixture (1: 1), with stirring for 30 min at room temperature. 3-amino-1,2-propanediol (300 ⁇ l in 0.5 ml of DMF / Py) is then added; the mixture is stirred for 20 h. The reaction products are precipitated and washed with ethyl ether and the compound Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOH) - (CH 2 OH) is purified by HPLC on silica gel.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOLip) - (CH 2 OLip) the compound Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOLip) - (CH 2 OLip) is obtained by esterification of the compound Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOH) - (CH 2 OH) with lipoic acid anhydride as described for the compound N- (1- (2,3-dilipoyloxy) propyl) - NN-dimethylamine and purified by HPLC.
  • Compound A2 (figure 9)
  • Compound 3 is prepared by reduction of either the compound
  • the reduction of the 1,2-dithiolane cycle is more effective with sodium borohydrate than with DTT, however significant hydrolysis of the diester bonds is observed in this case.
  • Compound 3 purified by chromatography on a Sephadex G10 column has an absorption at 333 nm.
  • the treatment of the preformed complex between compound B2 and pADN with DTT causes the release of pADN, illustrated by the increase in fluorescence of propidium iodide (Fig 7, box).
  • Similar effects have been observed after reduction of the B2-pDNA complex with other thiols such as reduced lipoate, glutathione and even the lipoamide / lipoamide dehydrogenase enzyme system; however, the DNA release kinetics observed are slower than those observed with DTT.
  • the formation of the DNA-amphiphilic complexes was also studied by agarose gel electrophoresis.
  • the complex is prepared with pDNA (pGL3-luc, 21 ⁇ M of phosphate) and different concentrations of amphiphiles, in 100 ⁇ l of TNE buffer, pH 7.4. The mixture is incubated for 30 min at room temperature before being loaded onto a 1% agarose gel. The electrophoresis is carried out in TBE buffer and the DNA is visualized after staining with ethidium bromide.
  • the treatment of pDNA with increasing concentrations of polymer B2 induces the formation of the B2-pDNA complex and the delay in migration of pADN.
  • the transfection efficiency of compounds B2, C2, and 3 was evaluated in cell culture. Since the expression of the reporter gene depends on the promoter and on the cell type, different plasmids (pSN-lacZ, pG3-luc and pCMN-luc) as well as different cell lines (HeLa, A549 and BHK) were tested with these compounds,
  • HeLa, A549 and BHK cells were cultured in flasks, at 37 ° C., in a humid atmosphere in the presence of 5% CO 2 , in a DMEM medium supplemented with 20 mM L-glutamine and 10% of fetal calf serum (GIBCO / BRL / Life technologies).
  • the cells were seeded in 24-well plates (Falcon) and transfected at 60-80% confluence with complexes comprising 1.5 ⁇ g of DNA.
  • the luciferase activity (pGL3-luc and pCMN-luc) is measured by a luminescence test (F. Zhang et al., 1999, cited above). Each transfection was carried out several times, in duplicate and the results were expressed in luminescence units per mg of proteins (protein assay test, Biorad). - Results
  • compounds B2 and C made it possible to obtain transfection levels 1.5 to 3 and 6 to 10 times higher than those observed with DOTAP.
  • Compound 3 reduced does not increase expression of the reporter gene, possibly due to its inability to bind solidly to AD ⁇ .
  • the highest levels of transgene expression were obtained in HeLa cells, using plasmids carrying the luciferase gene under the control of the CMN promoter (Fig. 8).
  • transfection efficiency of compounds B2 and C could be increased by adding lysosomotropic agents such as chloroquine at 100 ⁇ M or fusogenic lipid such as phosphatidyl ethanolamine (molar ratio 1: 1), suggesting a similar mechanism of penetration of the transfection complex, in both cases.
  • lysosomotropic agents such as chloroquine at 100 ⁇ M or fusogenic lipid such as phosphatidyl ethanolamine (molar ratio 1: 1)
  • EXAMPLE 4 Vectorization of polymer B2 by the peptide of the adenovirus fiber ( ⁇ compound C).
  • a 20 amino acid peptide derived from the ⁇ -terminal region of the adenovirus fiber protein (SEQ ID ⁇ O: 1) can alone translocate pDNA through the cell membrane and direct the complex of transfection in the nucleus.
  • This peptide includes a nuclear localization signal for the fiber protein, as well than an NPXY sequence known to be involved in the internalization of several cell surface receptors.
  • the targeting of the B2-pDNA complex for the cell nucleus is significantly improved when this peptide is coupled to the polymer B2.
  • the AKRARLSTSFNPNYPYEDESC peptide (SEQ ID ⁇ O: 1), containing an additional C-terminal cysteine, was synthesized and used as an inducer of the polymerization reaction A1-> B2 (FIG. 6).
  • the reaction was completed in 2 days, as shown by the loss of absorption of 1,2-dithiolane at 333 nm, confirmed by TLC chromatography.
  • the reaction between compound A1 and the thiolate occurs under very mild conditions and can be used for the attachment of various ligands to polymer B2.

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Abstract

The invention concerns cationic amphiphiles derived from lipoic acid, their uses as DNA transfection vectors and their synthesis method.

Description

AMPHIPHILES CATIONIQUES, LEURS APPLICATIONS ET LEUR CATIONIC AMPHIPHILES, THEIR APPLICATIONS AND THEIR
PROCEDE DE SYNTHESE.SYNTHESIS PROCESS.
La présente invention est relative à des amphiphiles cationiques dérivés de l'acide lipoïque, à leurs applications comme vecteurs de transfection d'ADN et à leur procédé de synthèse.The present invention relates to cationic amphiphiles derived from lipoic acid, to their applications as DNA transfection vectors and to their synthesis process.
La thérapie génique est fondée sur l'administration thérapeutique d'acides nucléiques ; elle nécessite l'utilisation de vecteurs efficaces et sûrs pour le transfert des gènes thérapeutiques et son succès dépend donc de l'efficacité du transfert des gènes dans les cellules souhaitées. De nombreuses compositions aptes à transfecter des cellules euca- ryotes avec un matériel génétique sélectionné ont déjà été décrites et appartiennent essentiellement à deux grands types de vecteurs de transfection :Gene therapy is based on the therapeutic administration of nucleic acids; it requires the use of efficient and safe vectors for the transfer of therapeutic genes and its success therefore depends on the efficiency of the transfer of genes into the desired cells. Many compositions capable of transfecting eukaryotic cells with selected genetic material have already been described and belong essentially to two main types of transfection vectors:
- les vecteurs de transfection viraux, qui sont efficaces mais qui présentent des limites d'utilisation : non-spécificité tissulaire, nécessité d'obtenir des constructions pour chaque gène d'intérêt, risques potentiels pour l'environnement qui conduisent à la mise en place d'infrastructures cliniques coûteuses et contraignantes pour le malade et le personnel, problèmes de réponse immunitaire, de production par recombinaison homologue de particules virales et d'effets oncogènes potentiels ;- viral transfection vectors, which are effective but which have limits of use: non-specific tissue, need to obtain constructs for each gene of interest, potential risks for the environment which lead to the establishment costly and restrictive clinical infrastructures for the patient and the staff, problems of immune response, production by homologous recombination of viral particles and potential oncogenic effects;
- des agents non-viraux (vecteurs synthétiques), capables de pro- mouvoir le transfert et l'expression de substances chimiques telles que l'ADN dans les cellules eucaryotes.- non-viral agents (synthetic vectors), capable of promoting the transfer and expression of chemical substances such as DNA in eukaryotic cells.
Ces vecteurs synthétiques doivent avoir essentiellement deux fonctions : condenser l'ADN à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement les membranes nucléaires ; de tels vecteurs doivent donc mimer le fonctionnement des virus, pour être efficaces ; toutefois, il apparaît que les différents vecteurs proposés dans l'art antérieur ne présentent pas ces deux fonctions de manière optimale et peuvent en outre, selon les cas, être toxiques pour les cellules.These synthetic vectors must have essentially two functions: to condense the DNA to be transfected and to promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and possibly the nuclear membranes; such vectors must therefore mimic the functioning of viruses to be effective; however, it appears that the various vectors proposed in the prior art do not have these two functions in an optimal manner and can also, depending on the case, be toxic to cells.
Parmi ces vecteurs non-viraux, on peut notamment citer les prépara- tions de lipides cationiques, qui peuvent être cytotoxiques, les techniques d'encapsulation de l'ADN dans des liposomes, les polymères polycationiques, tels que la poly(L-lysine), la protamine, le polyéthylénimine ou encore les dendrimères catio- niques (polyamidoamines). Aussi bien les lipides cationiques que les polymères poly- cationiques présentent des efficacités de transfection variable suivant leur structure et le type cellulaire cible.Among these non-viral vectors, mention may especially be made of preparations of cationic lipids, which can be cytotoxic, techniques of encapsulation of DNA in liposomes, polycationic polymers, such as poly (L-lysine) , protamine, polyethylenimine or even catio- nics (polyamidoamines). Both cationic lipids and polycationic polymers have variable transfection efficiencies depending on their structure and the target cell type.
Plusieurs paramètres sont à prendre en considération dans le choix du vecteur synthétique :Several parameters have to be taken into account when choosing the synthetic vector:
(1) compacter et protéger l'ADN des nucléases,(1) compact and protect DNA from nucleases,
(2) promouvoir la fixation cellulaire de l'ADN,(2) promote cellular attachment of DNA,
(3) promouvoir le passage de l'ADN à travers la membrane plasmique ou endosomique et (4) promouvoir le trafic intracellulaire et la pénétration nucléaire de l'ADN, lorsque l'on cherche à transfecter des cellules quiescentes.(3) promote the passage of DNA through the plasma or endosomal membrane and (4) promote intracellular trafficking and nuclear penetration of DNA, when seeking to transfect quiescent cells.
Ces fonctions sont remplies, partiellement pour la quatrième, par deux types de vecteurs-non viraux : les lipides cationiques et les polymères cationiques : - les lipides cationiques, qui sont généralement constitués de deux domaines : une tète cationique permettant la liaison à l'ADN, une ou plusieurs chaînes hydrophobes et éventuellement un espaceur séparant ces deux éléments (figure 2). Le lipide cationique prototype utilisé pour le transfert de gène est le bromure ou le chlorure de 2,3-dioléoyloxypropyl-triméthylammonium (DOTMA), un ammonium quaternaire amphiphile (voir figure 1). L'ADN formulé avec des lipides cationiques comme le DOTMA et un phospholipide neutre (le plus couramment, la dioléoyl- phosphatidyléthanolamine ou DOPE), forme des lipocomplexes (sous forme micel- laire ou sous forme liposomique) capables de transfecter des cellules avec une grande efficacité, in vitro et en l'absence de protéines sériques. La partie lipidique qui interagit avec et/ou déstabilise les membranes permet la fusion et l'entrée du complexe ADN/liposome. Cependant, la transfection d'ADN par les liposomes, bien que moins immunogénique que celle réalisée à l'aide des polymères cationiques, est en fait un procédé relativement inefficace.These functions are fulfilled, partially for the fourth, by two types of non-viral vectors: cationic lipids and cationic polymers: - cationic lipids, which generally consist of two domains: a cationic head allowing the binding to DNA , one or more hydrophobic chains and possibly a spacer separating these two elements (Figure 2). The prototype cationic lipid used for gene transfer is bromide or 2,3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium chloride (DOTMA), an amphiphilic quaternary ammonium (see Figure 1). DNA formulated with cationic lipids such as DOTMA and a neutral phospholipid (most commonly, dioleoylphosphatidylethanolamine or DOPE), forms lipocomplexes (in micellar form or in liposomal form) capable of transfecting cells with a large efficacy, in vitro and in the absence of serum proteins. The lipid part which interacts with and / or destabilizes the membranes allows the fusion and entry of the DNA / liposome complex. However, DNA transfection with liposomes, although less immunogenic than that carried out using cationic polymers, is in fact a relatively ineffective process.
Le mécanisme majeur de l'entrée des complexes ADN/liposomes, est, semble-t-il, l'endocytose ; en conséquence, l'ADN transfecte est piégé dans les vésicules intracellulaires et détruit par les enzymes lysosomales. Même si une partie de l'ADN transfecte est libéré dans le cytoplasme par un effet d'action de masse, seulement une petite fraction de cet ADN se retrouve effectivement dans le noyau.The major mechanism of entry of DNA / liposome complexes, it seems, is endocytosis; as a result, the transfected DNA is trapped in the intracellular vesicles and destroyed by lysosomal enzymes. Even if part of the transfected DNA is released into the cytoplasm by a mass action effect, only a small fraction of this DNA is actually found in the nucleus.
Des agents capables d'augmenter la libération de l'ADN des vési- cules endosomiques et son passage dans le noyau peuvent augmenter le taux de transfert génique.Agents capable of increasing the release of DNA from endosomal vesicles and its passage into the nucleus can increase the rate of gene transfer.
Depuis la mise en évidence de l'efficacité transfectante des particules composées d'ADN et de DOTMA/DOPE, une grande variété de lipides cationiques a été synthétisée et testée, avec pour objectif d'augmenter l'efficacité de trans- fection en l'absence comme en présence de sérum ou encore, in vivo, de réduire la cytotoxicité des formulations et d'améliorer la biodisponibilité des particules ADN- lipide. Un certain nombre de lipides cationiques est disponible commercialement (Lipofectine®, Lipofectamine®, Transfectam®, TransfectACE®) et est utilisé en recherche fondamentale. Il s'agit notamment d'analogues de structure du DOTMA, de lipides cationiques contenant du cholestérol, de lipopolyamines dont la tête cationique est généralement dérivée de la spermine ou de polyamines d'architectures variées (figure 1 : chlorure de 1 ,2-dioléoyloxypropyl-triméthylammonium (DOTAP) ; bromure de diméthyldioctadécylammonium (DDAB) ; 2,3-dioléoyloxy-N-2- (sperminecarboxamido)éthyl-N-N-diméthyl-l-propanammonium (DOSPA) ; diocta- décylamidoglycylspermme (DOGS) ; bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) ; (diméthylaminoéthane carbamoyl) cholestérol (DC-Chol) ; bromure de 1,2-dimyristyl- oxypropyl-3-diméthyl-hydroxylammonium (DMRIE)). En modifiant la structure, on peut améliorer l'efficacité de transfert de gène en présence de sérum et/ou réduire la cytotoxicité ; - les polymères polycationiques, tels que la poly(L-lysine), la protamine, le polyéthylénimine ou encore les dendrimères cationiques (polyamido- amines), s'associent à l'ADN par des interactions électrostatiques multiples engendrant un processus de coopérativité, ce qui produit des particules appelées polyplexes ; de tels polymères cationiques sont toutefois assez souvent toxiques in vivo. Différentes compositions à base de lipides cationiques, utiles comme vecteurs, ont été décrites : - le Brevet américain 5,264,618 au nom de Felgner et al. décrit des lipides cationiques utiles comme vecteurs de transfection. Ils présentent la formule suivante :Since the demonstration of the transfecting efficiency of particles composed of DNA and DOTMA / DOPE, a large variety of cationic lipids has been synthesized and tested, with the aim of increasing the efficiency of transfection into the absence as in the presence of serum or, in vivo, to reduce the cytotoxicity of the formulations and to improve the bioavailability of the DNA-lipid particles. A number of cationic lipids is commercially available (Lipofectin ® , Lipofectamine ® , Transfectam ® , TransfectACE ® ) and is used in basic research. These are in particular analogs of DOTMA structure, cationic lipids containing cholesterol, lipopolyamines whose cationic head is generally derived from spermine or polyamines of various architectures (FIG. 1: 1,2-dioleoyloxypropyl chloride -trimethylammonium (DOTAP); dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB); 2,3-dioleoyloxy-N-2- (sperminecarboxamido) ethyl-NN-dimethyl-1-propanammonium (DOSPA); diocta-decylamidoglycyl sperm (DOGS); CTAB); (dimethylaminoethane carbamoyl) cholesterol (DC-Chol); 1,2-dimyristyl-oxypropyl-3-dimethyl-hydroxylammonium bromide (DMRIE)). By modifying the structure, it is possible to improve the efficiency of gene transfer in the presence of serum and / or reduce the cytotoxicity; - polycationic polymers, such as poly (L-lysine), protamine, polyethylenimine or even cationic dendrimers (polyamidoamines), associate with DNA by multiple electrostatic interactions generating a cooperative process, which produces particles called polyplexes; such cationic polymers are however quite often toxic in vivo. Different compositions based on cationic lipids, useful as vectors, have been described: - American Patent 5,264,618 in the name of Felgner et al. describes cationic lipids useful as transfection vectors. They present the following formula:
CH,-Y,-R, ICH, -Y, -R, I
CH-Y2-R2 CH-Y 2 -R 2
II
I R3 IR 3
I I (CH^- -R, X-
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :II (CH ^ - -R, X-
Figure imgf000005_0001
in which :
Yi et Y2 qui peuvent être identiques ou différents sont notamment des groupes -OC(O), -O-, ou -S-,Yi and Y 2 which may be identical or different are in particular groups -OC (O), -O-, or -S-,
Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents représentent notamment un groupe alkyle ou alkylène en C1-23 (par exemple, une chaîne d'acide gras aliphatique),Ri and R 2 , which may be identical or different, represent in particular a C 1-23 alkyl or alkylene group (for example, an aliphatic fatty acid chain),
R3) R-t et R5, qui peuvent être identiques ou différents représentent notamment un groupe alkyle en Cι-2 ,R 3) Rt and R 5 , which may be identical or different, represent in particular a Cι -2 alkyl group,
Rβ représente par exemple un groupe alkyle,Rβ represents for example an alkyl group,
R7 représente par exemple un peptide ayant des spécificités de liaison à l'ADN ou représente un polypeptide comprenant au moins arg, his, lys ou une ornithine, et n = l à 8.R 7 represents, for example, a peptide having specificities for binding to DNA or represents a polypeptide comprising at least arg, his, lys or an ornithine, and n = 1 to 8.
- le Brevet américain 5,756,352 au nom de Sridhar et al. décrit des molécules lipidiques porteuses d'une charge cationique et leur utilisation dans la transfection d'acides nucléiques. Il s'agit plus précisément de lipides thiocationiques qui présentent la formule générale suivante : CH2-Y,-R,- American Patent 5,756,352 in the name of Sridhar et al. describes lipid molecules carrying a cationic charge and their use in the transfection of nucleic acids. More precisely, these are thiocationic lipids which have the following general formula: CH 2 -Y, -R,
II
CH-Y2-R2 CH-Y 2 -R 2
II
CH2-(CH2)m-S+-(CH2)0-CH3 |CH 2 - (CH 2 ) m -S + - (CH 2 ) 0 -CH 3 |
(CH2)m-Y3-R3. dans laquelle : Yi, Y2 et Y qui peuvent être identiques ou différents sont notamment des groupes -OC(O), -O- ou -S-,(CH 2 ) m -Y 3 -R 3 . in which : Yi, Y 2 and Y which may be identical or different are in particular groups -OC (O), -O- or -S-,
Ri et R , qui peuvent être identiques ou différents représentent notamment un groupe alkyle ou aralkyle en Cι-23, R3 représente notamment un groupe alkyle ou aralkyle en d.ι2 ou un peptide (di, tri, tétra ou pentapeptide) ou un acide aminé.Ri and R, which may be identical or different, represent in particular a Cι- 23 alkyl or aralkyl group, R 3 represents in particular a d.ι 2 alkyl or aralkyl group or a peptide (di, tri, tetra or pentapeptide) or a amino acid.
Ces lipides cationiques peuvent être utilisés dans des formulations pharmaceutiques, sous la forme de complexes avec une biomolécule, ou en combinaison avec d'autres substituants lipidiques. Ces composés comprennent un ion sulfonium S+ chargé positivement. Certaines des formulations qui contiennent des liposomes à base desdits lipides cationiques comprennent également en outre de la vitamine D et une substance amphiphile sensible au pH.These cationic lipids can be used in pharmaceutical formulations, in the form of complexes with a biomolecule, or in combination with other lipid substituents. These compounds include a positively charged S + sulfonium ion. Some of the formulations which contain liposomes based on said cationic lipids also further comprise vitamin D and an amphiphilic substance sensitive to pH.
- le Brevet américain 5,759,519 au nom de Sridhar et al. est relatif à une méthode de transport de biomolécules dans des cellules qui met en œuvre les lipides thiocationiques tels que décrits dans le Brevet américain 5,756,352. Il est en particulier précisé dans ce document que les lipides cationiques (dérivés des glycéro- lipides comportant un groupement contenant un ammonium ou un sulfonium chargé positivement) sont utiles dans des formulations liposomales pour le transport intra- cellulaire de biomolécules chargées négativement (oligonucleotides, par exemple). Il est considéré que les ions sulfonium confèrent aux lipides thiocationiques des propriétés qui facilitent l'interaction du lipide ave les membranes cellulaires, tout en diminuant la cytotoxicité.- American Patent 5,759,519 in the name of Sridhar et al. relates to a method of transporting biomolecules into cells which uses thiocationic lipids as described in US Patent 5,756,352. It is in particular specified in this document that the cationic lipids (derivatives of glycerolipids comprising a group containing a positively charged ammonium or sulfonium) are useful in liposomal formulations for the intra-cellular transport of negatively charged biomolecules (oligonucleotides, example). It is believed that sulfonium ions give thiocationic lipids properties that facilitate the interaction of the lipid with cell membranes, while decreasing cytotoxicity.
- le Brevet américain 5,777,153 au nom de Lin et al. décrit des lipides cationiques aptes à transporter des polymères anioniques (acides nucléiques) dans les cellules. Ces lipides sont considérés comme significativement plus efficaces que les lipides décrits dans l'art antérieur (Lipofectine®, Transfectam® ou Lipo- fectamine®).- American Patent 5,777,153 in the name of Lin et al. describes cationic lipids capable of transporting anionic polymers (nucleic acids) in cells. These lipids are considered significantly more effective than the lipids described in the prior art (Lipofectin ®, ® or LiPo Transfectam fectamine ®).
D'autres composés comprenant une ou plusieurs liaisons disulfures ont été décrits pour la construction de vecteurs pour le transfert de gènes. Trubetskoy et al. (N.A.R., 1998, 26, 4178-4185), décrivent la condensation de molécules d'ADN en utilisant la polymérisation de polymères cationiques par des agents couplants portant des ponts S-S clivables. Les particules ADN-polymères formées sont actives biologiquement ; cependant un niveau d'expression satisfaisant du gène n'a été observé qu'en ajoutant des lipides cationiques dans le complexe de transfection. Dans une autre approche, l'oxydation de détergents cationiques, à base de cystéines en lipide-cystine cationiques a été décrite pour stabiliser des particules d'ADN de l'ordre du nm, condensées par des détergents (Blessing et al., P.N.A.S., 1998, 95, 1427- 1431). Cependant, en l'absence d'excès de charges cationiques de surface, ces particules ne peuvent pas transfecter les cellules.Other compounds comprising one or more disulfide bonds have been described for the construction of vectors for gene transfer. Trubetskoy et al. (NAR, 1998, 26, 4178-4185), describe the condensation of DNA molecules using the polymerization of cationic polymers by coupling agents carrying cleavable SS bridges. The DNA-polymer particles formed are biologically active; however, a satisfactory level of expression of the gene was observed only by adding cationic lipids to the transfection complex. In another approach, the oxidation of cationic detergents, based on cysteines to cationic lipid-cystine has been described to stabilize DNA particles of the order of nm, condensed by detergents (Blessing et al., PNAS, 1998, 95, 1427-1431). However, in the absence of excess cationic surface charges, these particles cannot transfect the cells.
Les lipides cationiques proposés dans l'art antérieur comme vecteurs de transfection présentent l'inconvénient majeur de ne pas être détruits dans les cellules dans lesquelles ils pénètrent ; un tel comportement a pour conséquence de les rendre cytotoxiques ; en outre, leur biodisponibilité est, de manière générale, faible.The cationic lipids proposed in the prior art as vectors for transfection have the major drawback of not being destroyed in the cells into which they penetrate; such behavior has the consequence of making them cytotoxic; in addition, their bioavailability is generally low.
La Demanderesse s'est, en conséquence, donnée pour but de proposer de nouvelles structures qui répondent mieux aux besoins de la pratique que les structures de l'art antérieur.The Applicant has therefore set itself the goal of proposing new structures which better meet the needs of the practice than the structures of the prior art.
En effet, pour répondre aux besoins de la pratique, un vecteur non- viral de thérapie génique doit posséder les propriétés suivantes : efficacité de transfert, biodisponibilité élevée, cytotoxicité réduite, ciblage cellulaire et franchissement des membranes cellulaires. La présente invention a pour objet des amphiphiles cationiques, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par :Indeed, to meet the needs of practice, a non-viral gene therapy vector must have the following properties: transfer efficiency, high bioavailability, reduced cytotoxicity, cell targeting and crossing of cell membranes. The subject of the present invention is cationic amphiphiles, characterized in that they are selected from the group consisting of:
(a) les composés A qui répondent à la formule générale A suivante :(a) the compounds A which correspond to the following general formula A:
(CH2)-(CH2)m.X+ Z" (CH 2 ) - (CH 2 ) m .X + Z "
I CH-Y-R,I CH-Y-R,
II
CH2-Y-R2 CH 2 -YR 2
(A) dans laquelle : Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupement -O=C-(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un atome d'hydrogène (résidu d'acide gras) ou un groupe (za) :(A) in which: Ri and R 2 , which may be identical or different, represent a group -O = C- (CH 2 ) p -R 3 , in which R 3 represents a hydrogen atom (acid residue bold) or a group (z a ):
Figure imgf000007_0001
au moins l'un des groupes Ri ou R2 comprenant un groupe (za), Y représente l'un des groupements suivants : -O-, -O-CO-(CH2)r-O-, -O-CO-(CH2)r-NH-,
Figure imgf000007_0001
at least one of the groups Ri or R 2 comprising a group (z a ), Y represents one of the following groups: -O-, -O-CO- (CH 2 ) r -O-, -O-CO - (CH 2 ) r -NH-,
X représente un groupement chargé positivement, sélectionné dans le groupe constitué par :X represents a positively charged group, selected from the group consisting of:
R'iR '
X+—RbX + —Rb
J- dans lequel X représente un atome d'azote ou un atome de soufre, R'i, R'2 et R'3, qui peuvent être identiques ou différents représentent une liaison à un autre groupement, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CpC24, NH+ 2-R'4 J- in which X represents a nitrogen atom or a sulfur atom, R'i, R ' 2 and R' 3 , which may be identical or different represent a bond to another group, a hydrogen atom or a CpC 24 alkyl group, NH + 2 -R ' 4
//
• un groupe -NH-CO-CH• a group -NH-CO-CH
(CH2)3-NH+ 2-(CH2)3-NH+ 3 (CH 2 ) 3 -NH + 2 - (CH 2 ) 3 -NH + 3
dans lequel R'4 représente un atome d'hydrogène ou (CH )3-NH+ 3, r et p sont des nombres entiers compris entre 1 et 10, m est un nombre entier compris entre 0 et 5, de préférence égal à 0 et Z est un anion non-toxique.in which R ' 4 represents a hydrogen atom or (CH) 3 -NH + 3 , r and p are whole numbers between 1 and 10, m is an integer between 0 and 5, preferably equal to 0 and Z is a non-toxic anion.
(b) les composés B, obtenus par réduction et/ou polymérisation du/des groupe(s) (za) des composés de formule A :(b) compounds B, obtained by reduction and / or polymerization of the group (s) (z a ) of the compounds of formula A:
- la réduction d'un groupe (za) conduit à la formation d'un groupe -S-(CH2)2-CH-S ; la réduction de deux groupes (za) conduit à la formation d'un groupe (zb) -S-(CH2)2-(CH)-S-S-(CH)-(CH2)2-S. La formation d'un groupe (zb) correspond au cas où Ri et R2 sont identiques et représentent un groupement -O=Ç-the reduction of a group (z a ) leads to the formation of a group -S- (CH 2 ) 2 -CH-S; the reduction of two groups (z a ) leads to the formation of a group (z b ) -S- (CH 2 ) 2 - (CH) -SS- (CH) - (CH 2 ) 2 -S. The formation of a group (z b ) corresponds to the case where Ri and R 2 are identical and represent a group -O = Ç-
(CH2)P-R3, dans lequel R représente un groupe (za) réduit -S-(CH2)2- ((ÇÇHH))--S, les deux groupes R3 formant ledit groupe (zb) ;(CH 2 ) P -R 3 , in which R represents a reduced group (z a ) -S- (CH 2 ) 2 - ((ÇÇHH)) - S, the two groups R 3 forming said group (z b ) ;
- la polymérisation d'un groupe (za) ou d'un groupe (Zb) conduit à la formation d'un groupe -[S-(CH2)2-(CH)-S-S-(CH)-CH2-S]n- dans lequel n est compris entre 2 et 10 ; et (c) les composés C, formés par greffage d'un peptide de ciblage sur des composés A ou des composés B, soit au niveau du groupement X, soit au niveau de R3, lorsque ce dernier comprend un atome de soufre.- the polymerization of a group (z a ) or of a group (Z b ) leads to the formation of a group - [S- (CH 2 ) 2 - (CH) -SS- (CH) -CH 2 -S] n - in which n is between 2 and 10; and (c) compounds C, formed by grafting a targeting peptide onto compounds A or compounds B, either at the level of the group X, or at the level of R 3 , when the latter comprises a sulfur atom.
Selon un mode de réalisation avantageux desdits amphiphiles, ledit peptide de ciblage est sélectionné dans le groupe constitué par des peptides dérivant en tout ou en partie d'une fibre d'adénovirus et comportant au moins une zone constituée d'au moins 50 % d'aminoacides hydrophobes sélectionnés dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la phénylalanine, l'isoleucine, la leucine, la proline et la méthionine ; ledit peptide de ciblage comprend au moins : - un segment d'une séquence NLS dérivée d'une fibre d'adénovirus comprenant entre 4 et 5 aminoacides,According to an advantageous embodiment of said amphiphiles, said targeting peptide is selected from the group consisting of peptides derived in whole or in part from an adenovirus fiber and comprising at least one zone consisting of at least 50% of hydrophobic amino acids selected from the group consisting of alanine, valine, phenylalanine, isoleucine, leucine, proline and methionine; said targeting peptide comprises at least: - a segment of an NLS sequence derived from an adenovirus fiber comprising between 4 and 5 amino acids,
- une séquence hydrophobe comprenant entre 7 et 50 aminoacides, dérivée d'une fibre d'adénovirus,- a hydrophobic sequence comprising between 7 and 50 amino acids, derived from an adenovirus fiber,
- ou une autre séquence peptidique connue pour assurer le ciblage spécifique cellulaire ou tissulaire.- or another peptide sequence known to ensure specific targeting of cells or tissues.
De manière avantageuse, ledit peptide de ciblage peut être branché et comprend au moins deux fragments dérivant d'une fibre d'adénovirus ; lesdits fragments comportent chacun un segment d'une séquence NLS et une séquence hydrophobe, tels que définis ci-dessus. De tels peptides sont notamment décrits dans la Demande de Brevet français n° 97 13771 ; lesdits peptides de ciblage sont greffés au polymère amphiphile cationique, en cours de polymérisation (figures 3 et 5), lequel peptide est relié audit composé B par un atome de soufre.Advantageously, said targeting peptide can be branched and comprises at least two fragments derived from an adenovirus fiber; said fragments each comprise a segment of an NLS sequence and a hydrophobic sequence, as defined above. Such peptides are described in particular in French Patent Application No. 97 13771; said targeting peptides are grafted to the cationic amphiphilic polymer, during polymerization (FIGS. 3 and 5), which peptide is linked to said compound B by a sulfur atom.
Selon une disposition avantageuse dudit peptide de ciblage, il correspond à la séquence : AKRARLSTSFNPNYPYEDES-C (SEQ ID ΝO :l) ; il comprend par rapport au peptide la de la Demande de Brevet français n° 97 13771 au nom du COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE, une cystéine additionnelle en C-terminal, qui est utilisée pour greffer un peptide sur le composé 2C comprenant 5 molécules de monomères amphiphiles pour un peptide (voir figure 5, n = 5). Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits amphiphiles, ils correspondent à un composé A dans lequel Y représente -O-, Ri et R2, sont iden- tiques et représentent un groupement -O= -(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un groupe (za), p étant compris entre 1 et 10.According to an advantageous arrangement of said targeting peptide, it corresponds to the sequence: AKRARLSTSFNPNYPYEDES-C (SEQ ID ΝO: 1); it comprises in relation to the peptide 1a of French Patent Application No. 97 13771 in the name of the COMMISSION OF ATOMIC ENERGY, an additional C-terminal cysteine, which is used to graft a peptide on the compound 2C comprising 5 molecules of amphiphilic monomers for a peptide (see Figure 5, n = 5). According to another advantageous embodiment of said amphiphiles, they correspond to a compound A in which Y represents -O-, Ri and R 2 , are identical ticks and represent a group -O = - (CH 2 ) p -R 3 , in which R 3 represents a group (z a ), p being between 1 and 10.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits amphiphiles, ils correspondent à un composé B, dans lequel Ri et R2 sont identiques et représentent un groupement -O=C-(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un groupe (za) réduit -S-According to another advantageous embodiment of said amphiphiles, they correspond to a compound B, in which Ri and R 2 are identical and represent a group -O = C- (CH 2 ) p -R 3 , in which R 3 represents a group (z a ) reduced -S-
(CH2)2-(CH)-S, les deux groupes R3 formant un groupe (zb) -S-(CH2)2-(CH)-S-S-(CH 2 ) 2 - (CH) -S, the two groups R 3 forming a group (z b ) -S- (CH 2 ) 2 - (CH) -SS-
(CH)-(CH2)2-S-, p étant compris entre 1 et 10.(CH) - (CH 2 ) 2 -S-, p being between 1 and 10.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits amphiphiles, ils correspondent à un composé C, dans lequel Ri et R2 sont identiques et représentent un groupement -O=C-(CH2)p-R , dans lequel R3 représente un groupe (za) réduit -S- (CH2)2-(CH)-S, les deux groupes R3 formant un groupe (z'b) R4-[S-(CH2)2-(CH)-S-S- (CH)-(CH2)2-S-]n, p étant compris entre 1 et 10, n étant supérieur à 2 et de préférence compris entre 2 et 10 et Rt correspondant à un peptide de ciblage de SEQ ID NO:l.According to another advantageous embodiment of said amphiphiles, they correspond to a compound C, in which Ri and R 2 are identical and represent a group -O = C- (CH 2 ) p -R, in which R 3 represents a group ( z a ) reduced -S- (CH 2 ) 2 - (CH) -S, the two groups R 3 forming a group (z ' b ) R 4 - [S- (CH 2 ) 2 - (CH) -SS- (CH) - (CH 2 ) 2 -S-] n, p being between 1 and 10, n being greater than 2 and preferably between 2 and 10 and Rt corresponding to a targeting peptide of SEQ ID NO: l .
Des amphiphiles cationiques selon l'invention préférés sont notam- ment représentés à la figure 3.Preferred cationic amphiphiles according to the invention are in particular shown in FIG. 3.
La présente invention a également pour objet une composition capable de transférer une séquence d'acide nucléique vers une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique et un polymère amphiphile cationique tel que défini ci-dessus, opérativement couplé audit acide nucléique. L'amphiphile cationique B2 est capable de complexer un ADN plasmidique et de le transférer au travers d'une membrane cellulaire. Cette complexation avec l'ADN est réversible par des thiols intracellulaires, aboutissant au relargage de l'ADN au sein de la cellule.The present invention also relates to a composition capable of transferring a nucleic acid sequence to a eukaryotic cell, characterized in that it comprises a nucleic acid and a cationic amphiphilic polymer as defined above, operatively coupled to said nucleic acid. . The cationic amphiphilic B2 is capable of complexing a plasmid DNA and of transferring it through a cell membrane. This complexation with DNA is reversible by intracellular thiols, resulting in the release of DNA within the cell.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.According to an advantageous embodiment of said composition, it also comprises at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend un composé C tel que défini ci-dessus, dans lequel Ri et R sont identiques et représentent un groupement -O=C-(CH2)p-R , dans lequel R3 représente un groupe (za) réduit -S-(CH )2-(CH)-S, les deux groupes R3 formant un groupe (z'b) R4-[S-(CH2)2-(CH)-S-S-(CH)-(CH2)2-S-]n, p étant compris entre 1 et 10, n étant supérieur à 2 et de préférence compris entre 2 et 10 et * correspondant à un peptide de ciblage de SEQ ID NO: 1.According to another advantageous embodiment of said composition, it comprises a compound C as defined above, in which Ri and R are identical and represent a group -O = C- (CH 2 ) p -R, in which R 3 represents a reduced group (z a ) -S- (CH) 2 - (CH) -S, the two groups R 3 forming a group (z ' b ) R 4 - [S- (CH 2 ) 2- (CH ) -SS- (CH) - (CH 2 ) 2 -S-] n, p being between 1 and 10, n being greater than 2 and preferably between 2 and 10 and * corresponding to a targeting peptide of SEQ ID NO: 1.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend en outre un agent endosomolytique, capable de transporter ledit acide nucléique à travers les membranes cytoplasmiques ou endosomales de ladite cellule eucaryote.According to another advantageous embodiment of said composition, it also comprises an endosomolytic agent, capable of transporting said nucleic acid through the cytoplasmic or endosomal membranes of said eukaryotic cell.
La présente invention est également relative à un procédé de synthèse dudit polymère cationique dérivé de l'acide lipoïque qui comprend :The present invention also relates to a process for the synthesis of said cationic polymer derived from lipoic acid which comprises:
* la synthèse du composé Al (voir figure 6), par estérification du 3- diméthylamino-l,2-propanediol avec l'anhydride d'acide (6,8-thioctique) lipoïque, puis l'alkylation du produit obtenu en présence de diméthyle sulfate, et* the synthesis of compound Al (see FIG. 6), by esterification of 3-dimethylamino-1,2-propanediol with lipoic (6,8-thioctic) acid anhydride, then the alkylation of the product obtained in the presence of dimethyl sulfate, and
* la polymérisation dudit composé Al, induite par addition d'un agent réducteur en quantités catalytiques (DTT (obtention d'un composé B2) ou peptide fibre de l'adénovirus (obtention d'un composé 2C) tel que défini ci-dessus) à 37°C, pendant au moins 48 heures sous atmosphère azotée.* the polymerization of said compound Al, induced by the addition of a reducing agent in catalytic amounts (DTT (obtaining a compound B2) or fiber peptide of the adenovirus (obtaining a compound 2C) as defined above) at 37 ° C, for at least 48 hours under a nitrogen atmosphere.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre les structures de différents lipides cationiques ;In addition to the foregoing provisions, the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention as well as to the accompanying drawings, which: - Figure 1 illustrates the structures of different cationic lipids;
- la figure 2 illustre la structure des lipides cationiques et en particulier du DOTAP ;- Figure 2 illustrates the structure of cationic lipids and in particular of DOTAP;
- la figure 3 illustre différentes structures de composés A et B selon l'invention ; - la figure 4 illustre la structure de l'acide lipoïque ;- Figure 3 illustrates different structures of compounds A and B according to the invention; - Figure 4 illustrates the structure of lipoic acid;
- la figure 5 illustre une structure de composé C ;- Figure 5 illustrates a structure of compound C;
- la figure 6 illustre les structures des composés Al et B2 selon l'invention : le composé Al est un composé de formule A dans lequel Y représente -O-, Ri et R2, sont identiques et représentent un groupement -O= -(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un groupe (za) et le composé B2 est un composé de formule A dans lequel Y représente -O-, Ri et R2, sont identiques et représentent un groupement -O-C-(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un groupe -S-(CH2)2-(ÇH)-S, les deux groupes R3 formant un groupe (z'b) R4[-S-(CH2)2-(CH)-S -S-(CH)-(CH2)2-S-]n, p étant compris entre 1 et 10 et i correspondant à un peptide de ciblage de SEQ ID NO:l, n étant de préférence supérieur à 2 ; la figure 6 illustre également la structure du composé 3, qui résulte de la réduction du composé B2 ; - la figure 7 illustre la liaison des amphiphiles cationiques selon l'invention à un ADN (pDNA) ;- Figure 6 illustrates the structures of the compounds Al and B2 according to the invention: the compound Al is a compound of formula A in which Y represents -O-, Ri and R 2 , are identical and represent a group -O = - ( CH 2 ) p -R 3 , in which R 3 represents a group (z a ) and the compound B2 is a compound of formula A in which Y represents -O-, Ri and R 2 , are identical and represent a group -OC - (CH 2 ) pR 3 , in which R 3 represents a group -S- (CH 2 ) 2 - (ÇH) -S, both groups R 3 forming a group (z ' b ) R 4 [-S- (CH 2 ) 2 - (CH) -S -S- (CH) - (CH 2 ) 2 -S-] n , p being between 1 and 10 and i corresponding to a targeting peptide of SEQ ID NO: 1, n preferably being greater than 2; FIG. 6 also illustrates the structure of compound 3, which results from the reduction of compound B2; - Figure 7 illustrates the binding of cationic amphiphiles according to the invention to DNA (pDNA);
- la figure 8 illustre la transfection d'une cellule avec une composition polymère amphiphile cationique-pDNA ;- Figure 8 illustrates the transfection of a cell with a cationic amphiphilic polymer-pDNA composition;
- la figure 9 illustre le mode de préparation des produits de formule A, dans lesquels X+ comprend une spermine (ou une spermidine).- Figure 9 illustrates the method of preparation of products of formula A, in which X + comprises a spermine (or a spermidine).
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
EXEMPLE 1 : Synthèse des polymères amphiphiles cationiques selon l'invention Matériels et méthodesEXAMPLE 1 Synthesis of cationic amphiphilic polymers according to the invention Materials and methods
Tous les réactifs chimiques sont des produits Sigma ou Aldrich etAll chemical reagents are Sigma or Aldrich products and
(S) dδ les réactifs de transfection, Lipofectine et Lipofectamine sont des produits Boehringer Mannheim. Les plasmides pSN-lacZ, pGL3-luc et pCMN-luc ont été amplifiés et purifiés comme décrits précédemment (F. Zhang et al., Gène Therapy, 1999, 6, 171-181). La séquence Ν-terminale de la protéine de fibre de l'adénovirus (AKRARLSTSΝPNYPYEDESC) (SEQ ID ΝO:l) a été synthétisée par une technique de chimie standard en phase solide Fmoc, en flux continu.(S) Due to the transfection reagents, Lipofectin and Lipofectamine are Boehringer Mannheim products. The plasmids pSN-lacZ, pGL3-luc and pCMN-luc were amplified and purified as described previously (F. Zhang et al., Gene Therapy, 1999, 6, 171-181). The Ν-terminal sequence of the adenovirus fiber protein (AKRARLSTSΝPNYPYEDESC) (SEQ ID ΝO: 1) was synthesized by a standard chemistry technique in solid phase Fmoc, in continuous flow.
Synthèse du N-[l-(2,3-diIipoyloxy)propyl]-N,N,N-triméthyl- ammonium méthylsulfate (composé Al) Le monomère Al est synthétisé par une réaction en deux étapes : estérification de [3-diméthylamino-l,2-propanediol] avec un anhydride de l'acide lipoïque (6,8-thioctic), puis alkylation par le sulfate de diméthyle.Synthesis of N- [1- (2,3-diIipoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium methylsulfate (compound Al) The monomer Al is synthesized by a two-step reaction: esterification of [3-dimethylamino- 1,2-propanediol] with an anhydride of lipoic acid (6,8-thioctic), then alkylation with dimethyl sulfate.
L'anhydride de l'acide lipoïque. Un mélange d'acide lipoïqueLipoic acid anhydride. A mixture of lipoic acid
(figure 4) (500 mg, 2,5 mmol) et de dicyclohexylcarbodiimide (330 mg, 1,5 mmol) a été agité dans 7 ml de chlorure de méthylène sec pendant 48 h à température ambiante, sous azote. Le précipité de dicyclohexylurée formé est éliminé par filtration et la solution d'anhydride résultante (IR, vc-.0 1735 and 1805 cm"1) a été utilisée sans purification supplémentaire. N-[l-(2,3-dilipoyloxy)propyl]-N,N,-diméthylamine. Du 3-diméthyl- amino- 1 ,2-propanediol (40 mg, 0,3 mmol) a été ajouté à 4 ml d'une solution d'un anhydride de l'acide lipoïque (0,25 M), contenant 50 mg (0,4 mmol) de 4-(diméthyl- amino)pyridine. Après une nuit d'agitation, sous azote, à température ambiante, la réaction est arrêtée avec du méthanol ; le produit est concentré sous vide et le résidu est purifié sur colonne d'HPLC (gel de silice, 3% méthanol dans chloroforme). La réaction permet d'obtenir 105 mg de N-[l-(2,3-dilipoyloxy)propyl]-N,N,-diméthyl- amine avec un rendement de 70 %.(Figure 4) (500 mg, 2.5 mmol) and dicyclohexylcarbodiimide (330 mg, 1.5 mmol) was stirred in 7 ml of dry methylene chloride for 48 h at room temperature, under nitrogen. The precipitate of dicyclohexylurea formed is removed by filtration and the resulting anhydride solution (IR, v c -. 0 1735 and 1805 cm "1 ) was used without further purification. N- [l- (2,3-dilipoyloxy) propyl] -N, N, -dimethyl-amine. 3-Dimethylamino-1,2-propanediol (40 mg, 0.3 mmol) was added to 4 ml of a solution of lipoic acid anhydride (0.25 M), containing 50 mg (0.4 mmol) of 4- (dimethylamino) pyridine. After stirring overnight, under nitrogen, at ambient temperature, the reaction is stopped with methanol; the product is concentrated in vacuo and the residue is purified on an HPLC column (silica gel, 3% methanol in chloroform). The reaction makes it possible to obtain 105 mg of N- [1- (2,3-dilipoyloxy) propyl] -N, N, -dimethylamine with a yield of 70%.
Composé Al. Un mélange de N-[l-(2,3-dilipoyloxy)propyl]-N,N,- diméthylamine (75 mg, 0,15 mmol) et de sulfate de diméthyle (20 mg, 0,16 mmol) est maintenu sous agitation dans 3 ml de chloroforme anhydre, à température ambiante, sous azote. Après 20 h de réaction, le produit est concentré à 1 ml, sous faible pression et séparé par HPLC sur colonne (chloroforme/méthanol/acide acétique, 95/5/1) pour donner 67 mg de produit final avec un rendement de 87 %. La structure du composé Al a été confirmée par ses spectres UN (absorption caractéristique à 333 nm) et IR, son spectre de masse m/z 511:(MH+) et son analyse élémentaire (différence entre C, H, N, S calculée et déterminée <± 0,4 %). Comme le composé Al est instable et subit une polymérisation partielle au séchage, il est conservé dans du chloroforme, à 4°C, à l'obscurité. Réaction de polymérisation (composés B2 et C). La solution du composé Al dans le chloroforme (1 mg, 0,002 mmol) est évaporée et le résidu est séché sous vide (20 h, température ambiante, 0,03 mmol). Le film obtenu est dissous dans 50 μl de DMSO et la solution obtenue est mélangée à 500 μl de tampon TNE (25 mM Tris, 140 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,5). Après avoir insufflé des bulles d'azote dans la solution, la polymérisation est induite par addition de DTT (30 μl d'une solution 2 mM) ou de peptide fibre (1 mg, 0,0004 mmol) et on laisse la réaction se dérouler pendant 48 h, à 37°C, sous azote. Composé A2. * Boc4Sper-CO-OH Ce composé est synthétisé à partir de la L-ornithine comme décrit dans Loeffler JP. et al., Methods in Enzymology, 1993, 217, 599, 618. * Boc4SperCO-NH-(CH2)-(CHOH)-(CH2OH) 0,55 g du composé Boc4SperCO2H est ajouté à une solution de dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0,18 g) dans 3 ml de mélange de DMF/pyridine (1 : 1), sous agitation pendant 30 min à température ambiante. Du 3-amino-l,2-propa- nediol (300 μl dans 0,5 ml de DMF/Py) est ensuite ajouté ; le mélange est agité pendant 20 h. Les produits de la réaction sont précipités et lavés avec de l'éthyl-éther et le composé Boc4SperCO-NH-(CH2)-(CHOH)-(CH2OH) est purifié par HPLC sur du gel de silice.Compound Al. A mixture of N- [1- (2,3-dilipoyloxy) propyl] -N, N, - dimethylamine (75 mg, 0.15 mmol) and dimethyl sulfate (20 mg, 0.16 mmol) is kept stirring in 3 ml of anhydrous chloroform, at room temperature, under nitrogen. After 20 h of reaction, the product is concentrated to 1 ml, under low pressure and separated by HPLC on a column (chloroform / methanol / acetic acid, 95/5/1) to give 67 mg of final product with a yield of 87% . The structure of compound Al was confirmed by its UN spectra (characteristic absorption at 333 nm) and IR, its mass spectrum m / z 511: (MH + ) and its elementary analysis (difference between C, H, N, S calculated and determined <± 0.4%). As compound Al is unstable and undergoes partial polymerization on drying, it is stored in chloroform, at 4 ° C., in the dark. Polymerization reaction (compounds B2 and C). The solution of compound Al in chloroform (1 mg, 0.002 mmol) is evaporated and the residue is dried under vacuum (20 h, room temperature, 0.03 mmol). The film obtained is dissolved in 50 μl of DMSO and the solution obtained is mixed with 500 μl of TNE buffer (25 mM Tris, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.5). After blowing nitrogen bubbles into the solution, the polymerization is induced by adding DTT (30 μl of a 2 mM solution) or fiber peptide (1 mg, 0.0004 mmol) and the reaction is allowed to proceed. for 48 h, at 37 ° C, under nitrogen. Compound A2. * Boc 4 Sper-CO-OH This compound is synthesized from L-ornithine as described in Loeffler JP. et al., Methods in Enzymology, 1993, 217, 599, 618. * Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOH) - (CH 2 OH) 0.55 g of the compound Boc 4 SperCO 2 H is added to a solution of dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.18 g) in 3 ml of DMF / pyridine mixture (1: 1), with stirring for 30 min at room temperature. 3-amino-1,2-propanediol (300 μl in 0.5 ml of DMF / Py) is then added; the mixture is stirred for 20 h. The reaction products are precipitated and washed with ethyl ether and the compound Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOH) - (CH 2 OH) is purified by HPLC on silica gel.
* Boc4SperCO-NH-(CH2)-(CHOLip)-(CH2OLip) le composé Boc4SperCO-NH-(CH2)-(CHOLip)-(CH2OLip) est obtenu par estérification du composé Boc4SperCO-NH-(CH2)-(CHOH)-(CH2OH) avec de l'anhydride de l'acide lipoïque tel que décrit pour le composé N-(l-(2,3- dilipoyloxy)propyl)-NN-diméthylamine et purifé par HPLC. * Composé A2 (figure 9)* Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOLip) - (CH 2 OLip) the compound Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOLip) - (CH 2 OLip) is obtained by esterification of the compound Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOH) - (CH 2 OH) with lipoic acid anhydride as described for the compound N- (1- (2,3-dilipoyloxy) propyl) - NN-dimethylamine and purified by HPLC. * Compound A2 (figure 9)
0,25 g du composé Boc4SperCO-NH-(CH2)-(CHOLip)-(CH2OLip) est déprotégé avec 2 ml d'acide trifluoroacétique à température ambiante pendant 15 min ; le TFA est ensuite évaporé aboutissant au composé A2.0.25 g of the compound Boc 4 SperCO-NH- (CH 2 ) - (CHOLip) - (CH 2 OLip) is deprotected with 2 ml of trifluoroacetic acid at room temperature for 15 min; the TFA is then evaporated, resulting in compound A2.
Composé 3. Le composé 3 est préparé par réduction soit du composéCompound 3. Compound 3 is prepared by reduction of either the compound
Al, soit du polymère B2, pendant 20 h, sous azote, en présence de DTT, dans une solution de TNE. La réduction du cycle 1,2-dithiolane est plus efficace avec le borohydrate de sodium qu'avec le DTT, cependant une hydrolyse significative des liaisons diesters est observée dans ce cas. Le composé 3 purifié par chromatographie sur colonne Sephadex G10 présente une absorption à 333 nm.A1, ie polymer B2, for 20 h, under nitrogen, in the presence of DTT, in a solution of TNE. The reduction of the 1,2-dithiolane cycle is more effective with sodium borohydrate than with DTT, however significant hydrolysis of the diester bonds is observed in this case. Compound 3 purified by chromatography on a Sephadex G10 column has an absorption at 333 nm.
EXEMPLE 2 : Mise en évidence de la formation du complexe amphiphile-ADN.EXAMPLE 2 Demonstration of the formation of the amphiphilic-DNA complex.
L'incorporation d'iodure de propidium à l'ADN a été utilisée pour évaluer la formation de complexes entre l'ADN plasmidique (pADN) et les polymères amphiphiles cationiques selon l'invention. Une faible quantité (< 3 μl) de la solution stock du composé cationique dans le DMSO a été ajoutée au pADN (pGL3-luc,The incorporation of propidium iodide into the DNA was used to evaluate the formation of complexes between the plasmid DNA (pDNA) and the cationic amphiphilic polymers according to the invention. A small amount (<3 μl) of the stock solution of the cationic compound in DMSO was added to the pDNA (pGL3-luc,
0,7 μg), dans 100 μl de TNE pH 7,4. La solution est incubée à température ambiante pendant 30 min, pour permettre la formation du complexe, puis diluée avec 900 μl d'une solution d'iodure de propidium 0,2 μM dans du TNE. La concentration finale est de 2 μM de résidus phosphate de pADN et de 0-100 μM de polymère amphiphile0.7 μg), in 100 μl of TNE pH 7.4. The solution is incubated at room temperature for 30 min, to allow the formation of the complex, then diluted with 900 μl of a solution of propidium iodide 0.2 μM in TNE. The final concentration is 2 μM of pADN phosphate residues and 0-100 μM of amphiphilic polymer
(concentration de sous-unités de monomère pour le composé B2). Après 10 min, la fluorescence est mesurée avec un spectromètre à luminescence (AMINCO 2) en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 535 nm et une longueur d'onde d'émission de 617 nm, les valeurs étant exprimées en unités arbitraires de fluorescence. Les constantes apparentes d'association des composés Al, B2 et 3 ont été estimées à partir des courbes de titrage de l'ADN (Fig 7), en considérant un rapport 1 : 1 amphi- phile/phosphate et en utilisant une équation simplifiée KA=1/(C*-0.5XCDNA), OÙ C* est la concentration d'amphiphile correspondant au point de transition et CDNA la concentration totale d'ADN. - Résultats Cette technique permet la détermination des constantes apparentes d'association et repose sur le fait que la formation de complexes entre l'ADN et l'amphiphile cationique empêche l'interposition du colorant dans l'ADN, diminuant ainsi sa fluorescence réelle (16). La comparaison des constantes d'association montre que le polymère B2 fixe l'ADN 15 à 200 fois plus fortement que les composés Al et 3, respectivement (Fig. 8). La différence entre les constantes d'association peut-être discutée en terme de force motrice pour la formation de complexes. Pour l'interaction des polymères amphiphiles cationiques avec l'ADN à des concentrations d'amphiphile inférieures à celles de la concentration critique micellaire, la force motrice majeure est de nature électrostatique à laquelle s'ajoute l'effet hydrophobe (1, 17). Ainsi la formation du composé B2 à partir du monocation Al provoque une augmentation de plusieurs ordres de la composante électrostatique, laissant la composante hydrophobe inchangée. A l'inverse, le composé 3 réduit aura le même impact électrostatique que le composé Al ; cependant l'interaction hydrophobe sera considérablement réduite en raison de l'augmentation de polarité du résidu lipoate réduit (18). La différence d'affinité des composants B2 et 3 pour l'ADN explique la différence dans le mécanisme de libération de l'ADN à partir du complexe avec le cation amphiphile. La réduction du polymère B2 dans le complexe avec le pADN induira la formation du composé 3 réduit et le relargage de pADN libre (Fig 7, cadre, flèche). En effet, le traitement du complexe préformé entre le composé B2 et le pADN par le DTT provoque la libération du pADN, illustrée par l'augmentation de fluorescence de l'iodure de propidium (Fig 7, cadre). Des effets similaires ont été observés après réduction du complexe B2-pADN avec d'autres thiols tels que le lipoate réduit, le glutathion et même le système enzymatique lipoamide/lipoamide deshydrogènase ; cependant les cinétiques de libération de l'ADN observées sont plus lentes que celles observées avec le DTT.(concentration of monomer subunits for compound B2). After 10 min, the fluorescence is measured with a luminescence spectrometer (AMINCO 2) using an excitation wavelength of 535 nm and an emission wavelength of 617 nm, the values being expressed in arbitrary units of fluorescence. The apparent association constants of the compounds A1, B2 and 3 were estimated from the DNA titration curves (FIG. 7), by considering an amphiphilic / phosphate 1: 1 ratio and using a simplified equation K A = 1 / (C * -0.5XC DNA ), WHERE C * is the concentration of amphiphilic corresponding to the transition point and C DNA the total concentration of DNA. - Results This technique allows the determination of the apparent association constants and is based on the fact that the formation of complexes between DNA and the cationic amphiphile prevents the interposition of the dye in DNA, thus reducing its real fluorescence (16 ). Comparison of association constants shows that polymer B2 binds DNA 15 to 200 times more strongly than compounds A1 and 3, respectively (Fig. 8). The difference between the constants of association can be discussed in terms of driving force for the formation of complexes. For the interaction of cationic amphiphilic polymers with DNA at amphiphilic concentrations lower than those of the critical micellar concentration, the major driving force is of electrostatic nature to which is added the hydrophobic effect (1, 17). Thus the formation of compound B2 from the monocation Al causes an increase of several orders of the electrostatic component, leaving the hydrophobic component unchanged. Conversely, the reduced compound 3 will have the same electrostatic impact as the compound Al; however the hydrophobic interaction will be considerably reduced due to the increased polarity of the reduced lipoate residue (18). The difference in affinity of components B2 and 3 for DNA explains the difference in the mechanism of release of DNA from the complex with the amphiphilic cation. The reduction of polymer B2 in the complex with pADN will induce the formation of the reduced compound 3 and the release of free pADN (FIG. 7, box, arrow). Indeed, the treatment of the preformed complex between compound B2 and pADN with DTT causes the release of pADN, illustrated by the increase in fluorescence of propidium iodide (Fig 7, box). Similar effects have been observed after reduction of the B2-pDNA complex with other thiols such as reduced lipoate, glutathione and even the lipoamide / lipoamide dehydrogenase enzyme system; however, the DNA release kinetics observed are slower than those observed with DTT.
La formation des complexes pADN-amphiphile a également été étu- diée par électrophorèse en gel d'agarose. Le complexe est préparé avec pDNA (pGL3- luc, 21 μM de phosphate) et différentes concentrations d' amphiphiles, dans 100 μl de tampon TNE, pH 7,4. Le mélange est incubé 30 min à température ambiante avant d'être chargé sur un gel d'agarose 1 %. L' électrophorèse est effectuée dans du tampon TBE et l'ADN est visualisé après coloration au bromure d'éthidium. Le traitement du pADN avec des concentrations croissantes du polymère B2 induit la formation du complexe B2-pADN et le retard de migration du pADN. En présence de 5mM DTT qui induit la réduction de B2 en 3, aucun retard de migration de l'ADN n'a été observé. Ces résultats montrent que la réduction des complexes de transfection B2-pADN avec des résidus thiols intracellulaires libérera l'ADN qui sera plus accessible pour la machinerie cellulaire transcriptionnelle. En prenant en compte le gradient de concentration intracellulaire de résidus thiols, à savoir : de 1 à 3 mM dans le compartiment cytoplasmique (E.J. Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 9171-5), de 10 à 20 mM dans le noyau (D.M. Voehringer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 2956-60), on peut s'attendre à un relargage maximum de pADN dans le noyau, là où la transcription a lieu. EXEMPLE 3 : Transfection des cellules. - MéthodeThe formation of the DNA-amphiphilic complexes was also studied by agarose gel electrophoresis. The complex is prepared with pDNA (pGL3-luc, 21 μM of phosphate) and different concentrations of amphiphiles, in 100 μl of TNE buffer, pH 7.4. The mixture is incubated for 30 min at room temperature before being loaded onto a 1% agarose gel. The electrophoresis is carried out in TBE buffer and the DNA is visualized after staining with ethidium bromide. The treatment of pDNA with increasing concentrations of polymer B2 induces the formation of the B2-pDNA complex and the delay in migration of pADN. In the presence of 5mM DTT which induces the reduction of B2 to 3, no delay in DNA migration was observed. These results show that the reduction of the B2-pDNA transfection complexes with intracellular thiol residues will release the DNA which will be more accessible for the transcriptional cellular machinery. By taking into account the intracellular concentration gradient of thiol residues, namely: from 1 to 3 mM in the cytoplasmic compartment (EJ Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 9171-5) , from 10 to 20 mM in the nucleus (DM Voehringer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 2956-60), we can expect a maximum release of pDNA in the nucleus, where the transcription takes place. EXAMPLE 3 Transfection of the cells. - Method
L'efficacité de transfection des composés B2, C2, et 3 a été évaluée en culture cellulaire. Puisque l'expression du gène rapporteur dépend du promoteur et du type cellulaire, différents plasmides (pSN-lacZ, pG3-luc et pCMN-luc) ainsi que différentes lignées cellulaires (HeLa, A549 et BHK) ont été testés avec ces composés,The transfection efficiency of compounds B2, C2, and 3 was evaluated in cell culture. Since the expression of the reporter gene depends on the promoter and on the cell type, different plasmids (pSN-lacZ, pG3-luc and pCMN-luc) as well as different cell lines (HeLa, A549 and BHK) were tested with these compounds,
® par comparaison avec le DOTAP (Boehringer Mannheim).® compared to DOTAP (Boehringer Mannheim).
De manière plus précise, des cellules HeLa, A549 et BHK ont été cultivées dans des flacons, à 37°C, en atmosphère humide en présence de 5% CO2, dans un milieu DMEM supplémenté avec 20 mM L-glutamine et 10 % de sérum de veau fœtal (GIBCO/BRL/Life technologies). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits (Falcon) et transfectées à 60-80 % de confluence avec des complexes comprenant 1,5 μg d'ADN. L'activité luciférase (pGL3-luc et pCMN-luc) est mesurée par un test de luminescence (F. Zhang et al., 1999, précité). Chaque transfection a été effectuée plusieurs fois, en double et les résultats ont été exprimés en unités de luminescence par mg de protéines (test de dosage de protéines, Biorad). - RésultatsMore specifically, HeLa, A549 and BHK cells were cultured in flasks, at 37 ° C., in a humid atmosphere in the presence of 5% CO 2 , in a DMEM medium supplemented with 20 mM L-glutamine and 10% of fetal calf serum (GIBCO / BRL / Life technologies). The cells were seeded in 24-well plates (Falcon) and transfected at 60-80% confluence with complexes comprising 1.5 μg of DNA. The luciferase activity (pGL3-luc and pCMN-luc) is measured by a luminescence test (F. Zhang et al., 1999, cited above). Each transfection was carried out several times, in duplicate and the results were expressed in luminescence units per mg of proteins (protein assay test, Biorad). - Results
Quel que soit le gène rapporteur (β-galactosidase ou luciférase) ou bien le type cellulaire utilisé, les composés B2 et C, respectivement, ont permis d'obtenir des niveaux de transfection 1,5 à 3 et 6 à 10 fois supérieurs à ceux observés avec le DOTAP . Le composé 3 réduit n'entraîne aucune augmentation de l'expression du gène rapporteur, probablement en raison de son incapacité à se lier solidement à l'ADΝ. Les niveaux d'expression du transgène les plus élevés ont été obtenus dans les cellules HeLa, en utilisant des plasmides portant le gène luciférase sous le contrôle du promoteur CMN (Fig. 8). L'efficacité de transfection des composés B2 et C a pu être augmentée par addition d'agent lysosomotropes comme la chloroquine à 100 μM ou de lipide fusogènique comme la phosphatidyl-éthanolamine (rapport molaire 1: 1), suggérant un mécanisme similaire de pénétration du complexe de transfection, dans les deux cas.Whatever the reporter gene (β-galactosidase or luciferase) or the cell type used, compounds B2 and C, respectively, made it possible to obtain transfection levels 1.5 to 3 and 6 to 10 times higher than those observed with DOTAP. Compound 3 reduced does not increase expression of the reporter gene, possibly due to its inability to bind solidly to ADΝ. The highest levels of transgene expression were obtained in HeLa cells, using plasmids carrying the luciferase gene under the control of the CMN promoter (Fig. 8). The transfection efficiency of compounds B2 and C could be increased by adding lysosomotropic agents such as chloroquine at 100 μM or fusogenic lipid such as phosphatidyl ethanolamine (molar ratio 1: 1), suggesting a similar mechanism of penetration of the transfection complex, in both cases.
La dépolymérisation du polymère, induite par la réduction du pont disulfure dans les cellules provoquerait la libération de l'ADΝ à partir du complexe de transfection et augmenterait donc l'efficacité d'expression du transgène.Depolymerization of the polymer, induced by the reduction of the disulfide bridge in the cells, would cause the release of ADΝ from the transfection complex and therefore increase the efficiency of expression of the transgene.
Les cellules n'ont pas montré de traces de cytotoxicité jusqu'à 100 μM de polymère B (voir figure 8 pour comparaison des conditions optimales de transfection). EXEMPLE 4 : Vectorisation du polymère B2 par le peptide de la fibre de l'adénovirus (→composé C).The cells did not show traces of cytotoxicity up to 100 μM of polymer B (see FIG. 8 for comparison of the optimal transfection conditions). EXAMPLE 4 Vectorization of polymer B2 by the peptide of the adenovirus fiber (→ compound C).
Puisque le transport nucléaire de pADΝ est considéré comme l'une des étapes les plus importantes, limitant l'efficacité de transfection, plusieurs tentatives ont été faites pour améliorer l'entrée de pADΝ dans le noyau de la cellule. Un peptide de 20 amino-acides dérivé de la région Ν-terminale de la protéine de fibre de l'adénovirus (SEQ ID ΝO: l) peut à lui seul effectuer la translocation de pDNA au travers de la membrane cellulaire et diriger le complexe de transfection dans le noyau. Ce peptide comprend un signal de localisation nucléaire pour la protéine de fibre, ainsi qu'une séquence NPXY connue pour être impliquée dans l'internalisation de plusieurs récepteurs de la surface cellulaire. Le ciblage du complexe B2-pADN pour le noyau cellulaire est significativement amélioré quand ce peptide est couplé au polymère B2. Pour ce faire, le peptide AKRARLSTSFNPNYPYEDESC (SEQ ID ΝO:l), contenant une cystéine C-terminale additionnelle a été synthétisé et utilisé comme inducteur de la réaction de polymérisation A1->B2 (Fig 6). En présence de 20% mol du peptide, la réaction a été achevée en 2 jours, comme l'a montré la perte d'absorption du 1,2-dithiolane à 333 nm, confirmée par la chromatographie TLC. L'analyse du spectre de masse du mélange de réaction a révélé la présence d'un signal majeur à m/z: 4984 (MH+), correspondant au composé C, contenant cinq molécules de monomère d'amphiphile pour une molécule de peptide (Fig 5, n=5). La réaction entre le composé Al et le thiolate se produit dans des conditions très douces et peut-être utilisée pour l'attachement de divers ligands au polymère B2.Since nuclear transport of pADΝ is considered to be one of the most important steps, limiting transfection efficiency, several attempts have been made to improve the entry of pADΝ into the cell nucleus. A 20 amino acid peptide derived from the Ν-terminal region of the adenovirus fiber protein (SEQ ID ΝO: 1) can alone translocate pDNA through the cell membrane and direct the complex of transfection in the nucleus. This peptide includes a nuclear localization signal for the fiber protein, as well than an NPXY sequence known to be involved in the internalization of several cell surface receptors. The targeting of the B2-pDNA complex for the cell nucleus is significantly improved when this peptide is coupled to the polymer B2. To do this, the AKRARLSTSFNPNYPYEDESC peptide (SEQ ID ΝO: 1), containing an additional C-terminal cysteine, was synthesized and used as an inducer of the polymerization reaction A1-> B2 (FIG. 6). In the presence of 20 mol% of the peptide, the reaction was completed in 2 days, as shown by the loss of absorption of 1,2-dithiolane at 333 nm, confirmed by TLC chromatography. Analysis of the mass spectrum of the reaction mixture revealed the presence of a major signal at m / z: 4984 (MH + ), corresponding to compound C, containing five molecules of amphiphilic monomer for one molecule of peptide ( Fig 5, n = 5). The reaction between compound A1 and the thiolate occurs under very mild conditions and can be used for the attachment of various ligands to polymer B2.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation, embodiment and application which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may come to the mind of the technician in the matter, without departing from the framework, or the scope, of the present invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Amphiphiles cationiques, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par :1) Cationic amphiphiles, characterized in that they are selected from the group consisting of:
(a) les composés A qui répondent à la formule générale A suivante :(a) the compounds A which correspond to the following general formula A:
(CH2)-(CH2)m-X+ z " (CH 2 ) - (CH 2 ) m -X + z "
II
CH-Y-R,CH-Y-R,
I CH2-Y-R2 I CH 2 -YR 2
(A) dans laquelle :(A) in which:
Ri et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupement -O=Ç-(CH2)p-R , dans lequel R3 représente un atome d'hydrogène (résidu d'acide gras) ou un groupe (za),Ri and R 2 , which may be the same or different, represent a group -O = Ç- (CH 2 ) p -R, in which R 3 represents a hydrogen atom (fatty acid residue) or a group (z a ),
ss
,s, s
(Za) au moins l'un des groupes Ri ou R2 comprenant un groupe (za), Y représente l'un des groupements suivants : -O-, -O-CO-(CH2)r-O-, -O-CO-(CH2)r-NH-,(Za) at least one of the groups Ri or R 2 comprising a group (z a ), Y represents one of the following groups: -O-, -O-CO- (CH 2 ) r -O-, - O-CO- (CH 2 ) r- NH-,
X représente un groupement chargé positivement, sélectionné dans le groupe constitué par :
Figure imgf000019_0001
X represents a positively charged group, selected from the group consisting of:
Figure imgf000019_0001
• X+— R'2 • X + - R ' 2
J. dans lequel X représente un atome d'azote ou un atome de soufre, R'i, R'2 et R'3, qui peuvent être identiques ou différents représentent une liaison à un autre groupement, un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Cι-C24,J. in which X represents a nitrogen atom or a sulfur atom, R'i, R ' 2 and R' 3 , which may be identical or different represent a bond to another group, a hydrogen atom or a Cι-C 24 alkyl group,
NH+ 2-R'4 NH + 2 -R ' 4
XX
• un groupe -NH-CO-CH \• a group -NH-CO-CH \
(CH2)3-NH+ 2-(CH2)3-NH+ 3 dans lequel R'4 représente un atome d'hydrogène ou (CH2)3-NH+ 3, r et p sont des nombres entiers compris entre 1 et 10, m est un nombre entier compris entre 0 et 5, et Z est un anion non-toxique.(CH 2 ) 3 -NH + 2 - (CH 2 ) 3 -NH + 3 in which R ' 4 represents a hydrogen atom or (CH 2 ) 3 -NH + 3 , r and p are whole numbers between 1 and 10, m is an integer between 0 and 5, and Z is a non-toxic anion.
(b) les composés B, obtenus par réduction et/ou polymérisation du groupe (za) des composés de formule A ; et(b) compounds B, obtained by reduction and / or polymerization of the group (z a ) of the compounds of formula A; and
(c) les composés C, formés par greffage d'un peptide de ciblage sur des composés A ou des composés B, soit au niveau du groupement X, soit au niveau de R3, lorsque ce dernier comprend un atome de soufre.(c) compounds C, formed by grafting a targeting peptide onto compounds A or compounds B, either at the level of the group X, or at the level of R 3 , when the latter comprises a sulfur atom.
2°) Amphiphiles selon la revendication 1, caractérisés en ce que ledit peptide de ciblage est sélectionné dans le groupe constitué par des peptides dérivant en tout ou en partie d'une fibre d'adénovirus et comportant au moins une zone constituée d'au moins 50 % d'aminoacides hydrophobes sélectionnés dans le groupe constitué par l'alanine, la valine, la phénylalanine, l'isoleucine, la leucine, la proline et la méthionine ; ledit peptide de ciblage comprenant au moins :2 °) Amphiphiles according to claim 1, characterized in that said targeting peptide is selected from the group consisting of peptides derived in whole or in part from an adenovirus fiber and comprising at least one zone consisting of at least 50% of hydrophobic amino acids selected from the group consisting of alanine, valine, phenylalanine, isoleucine, leucine, proline and methionine; said targeting peptide comprising at least:
- un segment d'une séquence NLS dérivée d'une fibre d'adénovirus comprenant entre 4 et 5 aminoacides,- a segment of an NLS sequence derived from an adenovirus fiber comprising between 4 and 5 amino acids,
- une séquence hydrophobe comprenant entre 7 et 50 aminoacides, dérivée d'une fibre d'adénovirus,- a hydrophobic sequence comprising between 7 and 50 amino acids, derived from an adenovirus fiber,
- ou une autre séquence peptidique apte à assurer un ciblage spécifique cellulaire ou tissulaire.- or another peptide sequence capable of ensuring specific targeting of cells or tissues.
3°) Amphiphiles selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce que ledit peptide de ciblage correspond à la séquence : AKRARLSTSFNPNYPYEDES-C (SEQ ID ΝO : 1 ).3 °) Amphiphiles according to claim 1 or claim 2, characterized in that said targeting peptide corresponds to the sequence: AKRARLSTSFNPNYPYEDES-C (SEQ ID ΝO: 1).
4°) Amphiphiles selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils correspondent à un composé A dans lequel Y représente -O-, Ri et R2, sont identiques et représentent un groupement -O=C-(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un groupe (za), p étant compris entre 1 et 10. 5°) Amphiphiles selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils correspondent à un composé B, dans lequel Ri et R2 sont identiques et représentent un groupement -O=C-(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un groupe (za) réduit -S-(CH2)2-( H)-S, les deux groupes R formant un groupe (zb) -S-(CH2)2-(CH)-S -S-(CH)-(CH2)2-S-, p étant compris entre 1 et 10.4 °) Amphiphiles according to any one of claims 1 to 3, characterized in that they correspond to a compound A in which Y represents -O-, Ri and R 2 , are identical and represent a group -O = C- (CH 2 ) p -R 3 , in which R 3 represents a group (z a ), p being between 1 and 10. 5 °) Amphiphiles according to any one of Claims 1 to 4, characterized in that they correspond to a compound B, in which Ri and R 2 are identical and represent a group -O = C- (CH 2 ) p -R 3 , in which R 3 represents a reduced group (z a ) -S- (CH 2 ) 2- (H) -S, the two R groups forming a group (z b ) -S- (CH 2 ) 2 - (CH) -S -S- (CH) - (CH 2 ) 2-S-, p being between 1 and 10.
6°) Amphiphiles selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils correspondent à un composé C, dans lequel Ri et R2 sont identiques et représentent un groupement -O=C-(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un groupe (za) réduit -S-(CH2)2-(CH)-S, les deux groupes R3 formant un groupe (z'b) R4-[S-(CH2)2-(ÇH)-S-S-(CH)-(CH2)2-S-]n, p étant compris entre 1 et 10, n étant supérieur à 2 et de préférence compris entre 2 et 10, et R4 correspondant à un peptide de ciblage de SEQ ID NO: 1. 7°) Composition capable de transférer une séquence d'acide nucléique vers une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique et un polymère amphiphile cationique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, opérativement couplé audit acide nucléique.6 °) Amphiphiles according to any one of claims 1 to 5, characterized in that they correspond to a compound C, in which Ri and R 2 are identical and represent a group -O = C- (CH 2 ) p - R 3 , in which R 3 represents a reduced group (z a ) -S- (CH 2 ) 2- (CH) -S, the two groups R 3 forming a group (z ' b ) R 4 - [S- ( CH 2 ) 2- (ÇH) -SS- (CH) - (CH 2 ) 2-S-] n, p being between 1 and 10, n being greater than 2 and preferably between 2 and 10, and R 4 corresponding to a targeting peptide of SEQ ID NO: 1. 7 °) Composition capable of transferring a nucleic acid sequence towards a eukaryotic cell, characterized in that it comprises a nucleic acid and a cationic amphiphilic polymer according to any one of claims 1 to 6, operatively coupled to said nucleic acid.
8°) Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.8 °) Composition according to claim 7, characterized in that it further comprises at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
9°) Composition selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé C, dans lequel Ri et R2 sont identiques et représentent un groupement -O=C-(CH2)p-R3, dans lequel R3 représente un groupe (za) réduit -S-(CH2)2-(CH)-S, les deux groupes R3 formant un groupe (z'b) Rr [S-(CH2)2-(CH)-S-S-(CH)-(CH2)2-S-]n, p étant compris entre 1 et 10, n étant supérieur à 2 et de préférence compris entre 2 et 10, et R correspondant à un peptide de ciblage de SEQ ID NO:l.9 °) Composition according to Claim 7 or Claim 8, characterized in that it comprises a compound C, in which Ri and R 2 are identical and represent a group -O = C- (CH 2 ) p -R 3 , in which R 3 represents a reduced group (z a ) -S- (CH 2 ) 2 - (CH) -S, the two groups R 3 forming a group (z ' b ) Rr [S- (CH 2 ) 2 - (CH) -SS- (CH) - (CH 2 ) 2-S-] n , p being between 1 and 10, n being greater than 2 and preferably between 2 and 10, and R corresponding to a peptide of targeting of SEQ ID NO: l.
10°) Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un agent endosomolytique, capable de transporter ledit acide nucléique à travers les membranes cytoplasmiques ou endosomales de ladite cellule eucaryote.10 °) Composition according to any one of claims 7 to 9, characterized in that it further comprises an endosomolytic agent, capable of transporting said nucleic acid through the cytoplasmic or endosomal membranes of said eukaryotic cell.
11°) Procédé de synthèse d'un polymère cationique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend :11 °) Process for the synthesis of a cationic polymer according to any one of Claims 1 to 6, characterized in that it comprises:
* la synthèse du composé Al, par estérification du 3-diméthyl- amino- 1 ,2-propanediol avec l'anhydride d'acide (6,8-thioctique) lipoïque, puis l'alkylation du produit obtenu en présence de diméthyle sulfate, et * la polymérisation dudit composé Al, induite par addition d'un agent réducteur en quantités catalytiques (DTT (obtention d'un composé B2)) ou peptide fibre de l'adénovirus selon la revendication 2 ou la revendication 3 à 37°C, pendant au moins 48 heures sous atmosphère azotée. * the synthesis of compound Al, by esterification of 3-dimethylamino-1,2-propanediol with lipoic (6,8-thioctic) acid anhydride, then the alkylation of the product obtained in the presence of dimethyl sulfate, and * the polymerization of said compound Al, induced by the addition of a reducing agent in catalytic amounts (DTT (obtaining a compound B2)) or adenovirus fiber peptide according to claim 2 or claim 3 at 37 ° C, during at least 48 hours under a nitrogen atmosphere.
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