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WO2000036122A1 - Procede de fabrication de l'apeline - Google Patents

Procede de fabrication de l'apeline Download PDF

Info

Publication number
WO2000036122A1
WO2000036122A1 PCT/JP1999/006903 JP9906903W WO0036122A1 WO 2000036122 A1 WO2000036122 A1 WO 2000036122A1 JP 9906903 W JP9906903 W JP 9906903W WO 0036122 A1 WO0036122 A1 WO 0036122A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
apelin
peptide
terminus
salt
reaction
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/006903
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masato Suenaga
Takashi Ito
Osamu Nishimura
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP1999/005456 external-priority patent/WO2000020439A1/ja
Application filed by Takeda Chemical Industries, Ltd. filed Critical Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority to CA002353560A priority Critical patent/CA2353560A1/en
Priority to EP99961284A priority patent/EP1138772A4/en
Priority to AU17971/00A priority patent/AU1797100A/en
Publication of WO2000036122A1 publication Critical patent/WO2000036122A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing aperin or a salt thereof by producing a fusion protein or polypeptide and then subjecting the fusion protein or polypeptide to a peptide bond cleavage reaction. Furthermore, N-terminal optionally oxidized methionine residue or diketone of the methionine residue can be efficiently removed from apelin having an optionally oxidized methionine residue or its salt. How to do it. Background art
  • the peptide When a peptide is produced using a genetic recombination technique, the peptide is often expressed in the form of a fusion protein because the peptide is susceptible to degradation in cells.
  • the target peptide can be cleaved from the fusion protein by a method of chemically cleaving with bromocyan (Itakura et al., Science, 198, 1056 (1977)) and a method of cleaving enzymatically by using Factor Xa (Nagai Methods in Enzyraolgy, 153, 46 (1987)).
  • the higher order structure, biological activity, and stability of the protein may be different from the molecular species with methionine added to the ⁇ terminus and the molecular species without methionine at the ⁇ terminus. It is possible that the addition to the protein may result in increased antigenicity. Therefore, from the viewpoint of industrial use, it is meaningful to establish a method for removing the terminal methionine corresponding to this start codon. It is considered to be.
  • the present inventors have eagerly studied a method for efficiently producing a novel physiologically active peptide, averine (Biochem. Biop. Res. Co. un., 251, 471-476, (1998)) or a salt thereof. After examination, a protein or polypeptide having a cysteine at the ⁇ -terminus and a fusion protein or polypeptide having an apelin linked to the ⁇ -terminus of the polypeptide were produced, and then subjected to a reaction for cleaving the peptide bond. It has been found that apelin can be produced efficiently.
  • aperin having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus represented by the formula (I) as shown in the following scheme 1 includes, for example, By reacting dalioxylic acid, a di-diketone, copper sulfate capable of donating a transition metal ion, and pyridine, a base (eg, amines), the transamination reaction of the methionine residue is carried out.
  • An apelin having a diketone is reacted with a base (eg, diamines) 3,4 diaminobenzoic acid to carry out a hydrolysis reaction, whereby an apelin having a diketone having a methionine residue is converted into a diketone having a methionine residue.
  • a base eg, diamines
  • 3,4 diaminobenzoic acid to carry out a hydrolysis reaction, whereby an apelin having a diketone having a methionine residue is converted into a diketone having a methionine residue.
  • m represents an integer of 0 to 2
  • X represents a peptide chain of apelin.
  • m is as defined above], wherein the partial structure represented by “a diketone of a methionine residue which may be oxidized” or “a diketone of a methionine residue”;
  • a compound represented by the general formula (III) is referred to as “apelin or a salt thereof having no methionine residue which may be oxidized at the N-terminus” or “methionine optionally oxidized at the N-terminus "Aperine having no diketone residue or a salt thereof”.
  • a fusion protein or peptide having a cysteine residue at the N-terminus of a protein or peptide having a cysteine residue at the N-terminus and an aperin optionally having an optionally oxidized methionine residue at the N-terminus is linked to A method for producing averine or a salt thereof, which is characterized by subjecting the peptide to a cleavage reaction of a peptide bond on the amino group side,
  • the transformant is cultured to express a fusion protein or peptide, and the expressed fusion protein or peptide is subjected to a cleavage reaction of a peptide bond on the amino group side of a cysteine residue, wherein a methionine residue is present at the N-terminus.
  • a method for producing apelin or a salt thereof which may have a group
  • the cleavage reaction is a reaction subjected to an S-cyanation reaction followed by a hydrolysis reaction.
  • apelin is a polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • a method for removing methionine residues comprising reacting apelin or a salt thereof having an optionally oxidized methionine residue at the N-terminus with a hydiketone, followed by hydrolysis.
  • (22) a method for producing apelin or a salt thereof, comprising hydrolyzing the compound according to (21), and
  • FIG. 1 shows the reaction mechanism in the reaction step of the present invention.
  • FIG. 2 shows the DNA fragment used in Example 1.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram for producing the double-chain human hyperpelin-36 obtained in Example 1.
  • FIG. 4 shows a construction diagram of the plasmid pTB960 13 obtained in Example 2.
  • the apelin used in the method of the present invention includes, for example, human aperin-36 (SEQ ID NO: 1) described in Biochem. Biopys. Res. Commun., 251, 471-476, (1998).
  • Polypeptide polypeptide represented by amino acid sequence at positions 24-36 of SEQ ID NO: 1
  • ⁇ -terminal amino acid (Gin) of apelin-13 was pyroglutamine-oxidized Peptides and the like. Any peptide may be used as long as it has a ligand activity to AP J (O'Dowd. BF, et al., Gene, 436, 355-359, 1993).
  • a receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 described in WO 99/33976 Japanese Patent Application No. 10-364656
  • the apelin of the present invention also includes those in which the N-terminal side of G1n is cleaved in a living body and the G1n is pyroglutamine-oxidized.
  • the peptide has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the R of the ester or alkylamide for example methyl, Echiru, n- propyl, d-6 alkyl group such as isopropyl or n- butyl, cyclopentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, phenyl, alpha - C 6, such as naphthyl - 12 Ariru group, benzyl, phenethyl, phenylene Lou C such as benzhydryl, one 2 alkyl, or ⁇ - naphthylmethyl etc. ⁇ - Nafuchiru CI - two alkyl Which C 7 4 Ararukiru other groups, such as Pibaroiruo carboxymethyl esters generally used as oral esters.
  • a salt with a physiologically acceptable base for example, an alkali metal or the like
  • an acid organic acid or inorganic acid
  • a physiologically acceptable acid addition salt is used.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) , Tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Tartaric acid citric acid, malic acid, oxalic acid
  • cysteine may be provided at the N-terminal by a method known per se.
  • the protein or peptide having a cysteine at the N-terminus preferably has a molecular weight of 100 to L00000, and more preferably has a molecular weight of 300 to 50,000.
  • the protein or peptide having a cysteine at the N-terminus preferably has 1 to 1000 amino acids, and more preferably has 3 to 500 amino acids.
  • the protein or peptide examples include various growth factors such as inulin ferrons, interleukins, fibroblast growth factors (aFGF, bFGF, etc.), (pro) perkinase, lymphotoxin, Tumor Necrosis Factor (TNF), enzymatic proteins such as 3-galactosidase, storage proteins, streptavicin, protein A, protein G, Tissue Plasminogen Act ivator (TPA), these mucins or some of them ( (Fragments) and others that have cysteine at the end.
  • fibroblast growth factor (aFGF, bFGF, etc.) or a mutin thereof or a part (fragment) thereof is preferably used.
  • the base sequence represented by R is linked to the DNA base sequence (SEQ ID NO: 2) coding for a polypeptide containing human apelin-136 via the base sequence coding for cysteine.
  • a DNA (plasmid) having an ATG at the 5 'end and a region encoding the fusion protein downstream thereof and a translation stop codon downstream of the ATG is obtained by chemically synthesizing or genetically engineering the known protein. It can be produced by processing cDNA or chromosome-derived DNA of the protein.
  • the gene encoding the fusion protein or peptide having a cysteine at the N-terminus or an aperin linked to the N-terminus of the peptide of the present invention can be obtained by using conventional DNA techniques, for example, site-directed mutagenesis. Can be converted to a gene that codes the mutin.
  • a plasmid used as a vector may be, for example, pBR322 derived from Escherichiacoli [Gene,, 95 (197) 7)], pBR 3 13 [gene,, 75 (1977)), pBR 324, pBR 325 [gene, A, 1 24 (1978)), PBR 327 , pBR3 28 [gene, _ ⁇ , 287 (1 980)], pBR32 9 [gene,, 79 (1 982)), pKY2 289 [gene, J_, 1 (1 978)], KY270 (biochemistry, ⁇ _2_, 770 (1980)), pACYC177, pACYC184 (Journal 'ob' bacteriology (Journal of Bacteriology), 134, 1 1 4 1 (1 978)), pRK248, pRK64 6, pDF [Metho
  • the DNA preferably has a promoter at the upstream of ATG, and the promoter may be any promoter as long as it is an appropriate promoter corresponding to the host used for the production of the transformant. .
  • S PO 1 promoter examples include promoters, penP promoters and the like, such as PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter and ADH promoter in yeast (Saccharomyces cerevisiae), and promoters derived from SV40 in animal cells. If necessary, a Shine and Dalgarno (SD) sequence may be inserted downstream of the promoter.
  • the 7 promoters include the 17 promoters found on T7D [; L.
  • a terminator operating in an E. coli system preferably a ⁇ terminator [FW Studier et al., J. Mol. Biol., 189: 113-130 (1986)] Is used.
  • T7 RNA polymerase gene examples include the T7 gene [FW Studier et al., J. Mol. Biol., 189: 113-130 (1896)].
  • the vector is preferably constructed by incorporating a T7 promoter and a T7 terminator into the above vector.
  • Such vectors include pET-1, ET-2, pET-3, pET-4, and pET-4. — 5 [AH Rosenberg, Gene _5_6: 1 2 5—
  • the transformant of the present invention can be prepared by subjecting the expression plasmid obtained by the above method to a method known per se [eg, Cohen S, N, et al., Prosessing ',' National 'Academy', 'Science' (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 (1972)].
  • Examples of the host of the microorganism to be transformed include Escherichia sp., Bacillus sp., Yeast, and animal cells.
  • Escherichia bacteria examples include Escherichia coli (Escherichia coli), and specifically, Escherichia coli (Escherichia coli) K12 DH1 [Proceedings of National Academy of Korea] Pro Atl. Acad. Sci. USA, 6_0, 160 (1968)], JM-103 [Nucleic Acids Research], 309 ( 1 9 8 1)], JA
  • Bacillus subtilis examples include Bacillus subtilis. Specifically, Bacillus subtilis M1114 (Gene, 2_4, 255 (1 983)), 207-21 [Journal of Obb. 'Journal of Biochemistry, _9_5, 87 (1984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae. Specifically, Saccharomyces cerevisiae AH22 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], XSB52 -23 C [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7_7_2173 (1980)], BH-641 ACATCC 28339), 20B-12 [Genetics, 85, 23 (19
  • animal cells examples include monkey cell COS-7 [Cell, _23_, 175 (1
  • the host of the transformant is ⁇ 7 RNA polymerase gene ( ⁇ 7 gene 1) [FW Studier et al., J. Mol. Biol. ⁇ 89: 113-130 (1986)] Escherichia coli strains, such as MM 294,
  • DH-1, C600, JM109, BL21, or T7 RNA polymerase Any strain, such as an Escherichia coli strain in which the gene (T7 gene 1) has been integrated with another plasmid, may be used.
  • MM 294 strain and BL21 strain in which ⁇ phage into which ⁇ 7 gene 1 has been incorporated are lysogenized are used.
  • the promoter of the T7 gene 1 a lac promoter whose expression is induced by isopropyl-1-thio-1) 3-D-galactopyranoside (may be abbreviated as IPTG) is used.
  • Transformation of a bacterium of the genus Bacillus as a host can be performed according to a known method such as, for example, Molecular and General Genetics (Molecular and General Genetics), 168, ⁇ 1 (1979).
  • Transformation using a yeast as a host can be performed according to a known method such as Pro atl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • Transformation using an animal cell as a host can be performed according to a known method such as, for example, Virology (Vi r 01 ogy, 52, 456 (1973)).
  • the fusion protein can be produced by culturing the above transformant in a medium and collecting the produced fusion protein.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • Examples of the culture medium for culturing the genus Escherichia include, for example, an M9 culture medium containing glucose and casamino acid CMiller, Journal of Experimen in 'Journal of Experiments in Molecular Genetics', 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972)). If necessary, a drug such as, for example, 3; 3-indolylacrylic acid or isopropyl / 3-D-thiogalactopyranoside (IPTG) can be added to make the promotion work efficiently.
  • IPTG 3-indolylacrylic acid or isopropyl / 3-D-thiogalactopyranoside
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Burkholder's minimal medium When culturing a transformant whose host is yeast, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., Prossings of National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 77, 4505 (1980) 3.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 0.2 to 20%, preferably about 5 to 20% of fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)), DME medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association (Journal of the American Medical Association) ), m, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biologcal Medicine, 73, 1 (1950)], etc. Is raised.
  • the pH is about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the fusion protein can be produced by culturing the above transformant, producing and accumulating the fusion protein in a culture, and collecting this.
  • M9 medium containing glucose and casamino acid Miller, J., Expermentin 'Molecular' Genetics (Experiments in Molecular Genetics), 431-433 (Cold Spring Horbor Laboratort, New York 197) 2)
  • 2 XYT medium 2 XYT medium [Messing, Methods in Enzymology, 101, 20 (1983)] LB medium and the like.
  • Culture is usually performed at about 15 to 43 t: for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the culture is performed at a temperature of about 15 to 36, preferably about 30 to 36 t, Preferably, the inactivation of the Ac Its reactor is performed at about 37 ° C. to 42 t.
  • a drug such as mitomycin C, naldixic acid, or irradiate ultraviolet rays, or The pH of the culture solution may be changed to the alkaline side.
  • T7 promoter system When using the T7 promoter system, (1) when expressing the T7 gene (RNA polymerase gene) linked downstream of the lac promoter, add IPTG or the like; or (2) due and this is to raise the temperature of the culture when expressing the lambda P L T 7 which is connected downstream of the promoter gene (RNA polymerase gene), specifically T by T 7 phage RNA polymerase 1 to produce 7 Activate the Promo All Day.
  • T7 gene RNA polymerase gene
  • the cells are collected by a known method, suspended in a buffer, for example, treated with a protein denaturant, treated with an enzyme such as lysozyme, sonicated, treated with glass beads, French pressed, frozen and thawed.
  • a buffer for example, treated with a protein denaturant, treated with an enzyme such as lysozyme, sonicated, treated with glass beads, French pressed, frozen and thawed.
  • the cells are disrupted by a treatment or the like, and a supernatant is obtained by a known method such as centrifugation.
  • a generally known protein purification method may be used. For example, gel filtration, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, high performance liquid chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, electrophoresis and the like can be appropriately combined.
  • a methionine derived from the translation initiation codon may be added to the N-terminus of the fusion protein obtained here.
  • the fusion protein may proceed to the next reaction step without purification or in a partially purified state.
  • the thus obtained fusion protein or peptide is subjected to a cleavage reaction of the peptide bond on the amino group side of the cysteine residue.
  • the cleavage reaction include an S-cyanation reaction and a hydrolysis reaction.
  • the cleavage reaction includes, for example, performing S-cyanation reaction followed by ammonolysis.
  • the S-cyanation reaction is carried out by reacting a starting compound with an S-cyanation reagent.
  • S-cyanation reagent examples include 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid (NTCB), 1-cyano-14-dimethylaminopyridinium salt (DMAP-CN), and CN ion.
  • NTCB 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid
  • DMAP-CN 1-cyano-14-dimethylaminopyridinium salt
  • CN ion examples include 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid (NTCB), 1-cyano-14-dimethylaminopyridinium salt (DMAP-CN), and CN ion.
  • the amount of the S-cyanation reagent may be about 2 to 50 times the total thiol group. More preferably, the amount is about 5 to 10 times.
  • the reaction temperature may be any as long as it is between about 0 ° and 80 ° C., and more preferably between about 0 ° and 50 °.
  • Solvents that do not react with the S-cyanation reagent Any buffer may be used, provided that it is, for example, Tris-HCl buffer, Tris-Acetate buffer, Phosphate buffer, Borate buffer, and the like.
  • the organic solvent may be present as long as it does not react with the S-cyanation reagent.
  • the reaction is preferably performed between ⁇ 1 and 12.
  • the pH is preferably 7 to 10
  • DMAP-CN is used
  • the pH is preferably 2 to 7 to prevent the SS exchange reaction.
  • a denaturant such as guanidine hydrochloride may be present in the reaction solution.
  • the hydrolysis treatment is performed.
  • the alkali treatment is performed by adjusting the pH of the aqueous solution containing the starting compound to 7-14.
  • the pH is adjusted by using a solution of, for example, sodium hydroxide, ammonia, an amino compound, trimbase (tris [hydroxymethyl] -aminomethane), sodium phosphate dibasic, potassium hydroxide, barium hydroxide, or the like.
  • a solution of, for example, sodium hydroxide, ammonia, an amino compound, trimbase (tris [hydroxymethyl] -aminomethane), sodium phosphate dibasic, potassium hydroxide, barium hydroxide, or the like An appropriate amount is added to an aqueous solution containing the compound, and sodium hydroxide is particularly preferable.
  • the concentration of the solution during the above reaction is, for example, about 0.
  • the reaction temperature may be any temperature as long as it is between about -20 and 80 ° C, and more preferably between about -10 and 5.
  • the reaction time is preferably about 1 to 60 minutes, preferably about 15 to 30 minutes for the S-cyanation reaction, about 5 minutes to 100 hours, preferably about 10 minutes to 15 hours for the hydrolysis reaction, and about 5 minutes for ammonolysis. Minutes to 24 hours, preferably about 10 to 180 minutes. It is thought that the reaction shown in [Fig. 1] occurs by the above-mentioned S-cyanation or hydrolysis.
  • X is R 1 — (NR 2 ) — (wherein R 1 and R 2 are the same or different, and (i) hydrogen, (ii) (3, -2.
  • alkyl examples include, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 1-ethylpentyl, hexyl, isohexyl, heptyl, octyl, nonanyl, denonyl, Pendeneil, dodecanil, tetradecanyl, pentadecanil, hexadekael, hepdecaneil, octadecanyl, nonadecanyl, eicosanil and the like.
  • the C 3 - Examples of 8 cycloalkyl e.g., cyclopropyl, Shikuropuchi Le, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl cyclohexane, etc. Shikurookuchiru the like.
  • Examples of the above C 6 , 4 aryl include phenyl, naphthyl, anthryl, phenanthril, and acenaphthylenyl.
  • d-3 alkyl such as benzyl, Fuenechi relay, 3-phenylpropyl, (1 one-naphthyl) methyl, (2-naphthyl) methyl and the like.
  • the C, - as an example of a s-alkoxy for example methoxy, ethoxy, Purobokishi, butoxy, Penchiruokishi, etc. Kishiruokishi the like to.
  • Examples of the above-mentioned optionally substituted amino substituent (iii) include, for example, amino acids, peptides consisting of 2 to 10 amino acids, and the like.
  • the amino acid may be L-integrated or D-isomer, and examples thereof include, for example, Ala, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Gly, His, lie, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val and the like.
  • Examples of the peptide include, for example, HD-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C 2 H 5 , H-Val-Al-Leu-D-Al a-Al a-Pro-Leu-Al a-Pro -Arg-OH and the like.
  • the isolated target peptide may be isolated according to a generally known peptide purification method. For example, gel filtration, ion exchange chromatography, high speed Liquid chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, thin-layer chromatography, electrophoresis, etc., can be combined as appropriate.
  • a methionine derived from the translation initiation codon may be added to the N-terminus of the target peptide obtained here.
  • ⁇ -diketones such as glyoxylic acid may be added according to the method described in detail below.
  • the methionine residue which may be oxidized indicates a methionine residue or an S-oxidized form thereof, and examples of the S-oxidized form of the methionine residue include sulfoxides and sulfone forms.
  • ⁇ Aperin having an optionally oxidized meteonin residue at its terminal includes:
  • m represents an integer of 0 to 2
  • X represents a peptide chain of apelin. And these may form a salt. Examples of the salt include those similar to the above-mentioned apelin salt.
  • the apelin having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof may be an aperin having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof produced by genetic engineering. preferable.
  • m is preferably 0.
  • the peptide chain of apelin represented by X includes the above-mentioned apelin.
  • apelin or a salt thereof may be refolded (activated, regenerated) before or after subjecting to a step of removing an N-terminal optionally oxidized methionine (Met) residue or a diketone of the methionine residue. ) Can be performed.
  • Apelin having a diketone body of a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof can be obtained by various reactions such as a chemical reaction or an enzymatic reaction.
  • a diketone of a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus by a transamination reaction of reacting apelin having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof with diketones To obtain apelin or a salt thereof.
  • ⁇ -diketones may be any as long as they can promote the transamination reaction of the above-mentioned apelin or a salt thereof.
  • the formula R 1 -CO-CO-R 2 [wherein R 1 represents hydrogen or a lower alkyl or phenyl group (preferably hydrogen or methyl, more preferably hydrogen) which may be substituted with a carboxyl group; R 2 represents a group substituted with a hydroxyl group, a lower alkoxy group or a lower alkyl; A good amino group (preferably a hydroxyl group). Or a salt thereof.
  • the lower alkyl group represented by R 1 includes alkyl having about 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, i-propyl, butyl, i-butyl, sec-butyl and t-butyl.
  • the lower alkoxy group represented by R 2 include methoxy, ethoxy, propoxy, i-propoxy, butoxy, i-butoxy, sec-butoxy, t-butoxy and other carbon-containing groups having about 1 to 6 carbon atoms.
  • an alkoxy group examples of the amino group optionally substituted with lower alkyl represented by R 2 include the above-mentioned amino group optionally having one or two lower alkyl groups represented by R 1 .
  • the salt include those similar to the above-mentioned salts of apelin having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus.
  • ⁇ -diketones include glyoxylic acid, pyruvic acid, oxalic acetic acid, phenyldalioxylic acid, and 2-oxodaltalic acid. Of these, glyoxylic acid is preferably used.
  • the ⁇ -diketones may form a salt, and examples thereof include salts of alkali metal such as sodium salt and potassium salt, and salts of inorganic acids such as hydrochloride.
  • the transamination reaction between aperin or a salt thereof having an optionally oxidized methionine residue and an ⁇ -diketone is usually performed in an amount of 10,000 to 10,000 mol per mol of aperin or a salt thereof ( About 200 to 4000 moles of the diketone is added at about 0 to 70 ° C (preferably about 20 to 40 ° C) for about 10 minutes to 5 hours (preferably about 2 to 40 hours). (0 minutes to 2 hours)
  • the reaction is carried out.
  • Any buffer eg, phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, etc.
  • the pH of the reaction is adjusted to about 2 to 9, especially about 4 to 7, especially about 5 or 6, and the reaction is allowed to proceed.
  • the heiketone In order to accelerate the amino transfer reaction, it is preferable to react the heiketone in the presence of a transition metal ion.
  • the amount of the diketone is from 0.001 to 0.1 mol per 1 mol of the diketone ( Preferably, about 0.01 to 0.05 mol) of a transition metal ion is used.
  • transition metal ions include copper ions (Cu +, Cu 2+ ), cobalt ions (Co 2+ , Co 3+ ), nickel ions (Ni 2+ , Ni 3+ ), iron ions (Fe 2+ , Fe 3+ ), zinc ion (Zn 2+ ), aluminum ion (A1 3+ ), manganese ion (Mn 2+, etc.), gallium ion (Ga 3+ ), indium ion (In 3+ ), magnesium ion (Mg 2+ ), calcium ion (Ca 2+ ) and the like can be used, and among them, copper ion, cobalt ion and the like, particularly, copper ion (Cu 2+ ) are preferably used.
  • transition metal ions are usually added to the reaction solvent as salts with inorganic acids such as sulfuric acid, nitric acid, hydrochloric acid, and perchloric acid, or salts with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, citric acid, and carbonic acid.
  • inorganic acids such as sulfuric acid, nitric acid, hydrochloric acid, and perchloric acid
  • organic acids such as acetic acid, oxalic acid, citric acid, and carbonic acid.
  • copper sulfate, copper acetate, especially, copper sulfate is preferably used.
  • the diketones are preferably reacted in the presence of a base.
  • a base usually, about 0.1 to 20 mol (preferably 0.5 to 10 mol) of a base is added to 1 mol of the diketone.
  • the base for example, Alkylamines such as triethylamine and triptylamine, and aromatic amines such as N, N-dimethylaniline, pyridine, lutidine, collidine, 4- (dimethylamino) pyridine and imidazole can be used, with pyridine being preferred. Used.
  • aperin or a salt thereof having an optionally oxidized methionine residue at the N-terminus during the transamination reaction, and methionine residue obtained by the amination reaction of the aperin or a salt thereof.
  • a buffer solution for transamination reaction it is preferable to add urea to the buffer so as to have a concentration of preferably about 1 to 8 M, more preferably about 3 to 6 M.
  • a hediketone in the presence of a transition metal ion and a base, and practically, three components of a transition metal ion, a base and a hediketone (for example, A mixture containing copper sulfate, pyridine, and dalioxylic acid) is added to an aqueous solution containing apelin having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof, and transamination is performed. To progress.
  • m represents an integer of 0 to 2
  • X represents a peptide chain of apelin.
  • a salt thereof (averine having a diketone form of a methionine residue or a salt thereof) is a known means for purifying peptides or proteins, for example, extraction, salting out, partitioning, partitioning, recrystallization, chromatography, etc. Can be isolated and purified from the reaction solution, but can be directly subjected to the next hydrolysis reaction.
  • Apelin having a diketone form of methionine obtained by transamination or a salt thereof is usually subjected to a hydrolysis reaction with a base to give an optionally oxidized N-terminal methionine residue or the methionine residue. Can be converted to apelin having no diketone or a salt thereof.
  • the base used in the hydrolysis reaction include alkylamines such as cysteamine, triethylamine, and triptylamine or salts thereof, N, N-dimethylaniline, pyridine, lutidine, collidine, 4_ (dimethylamino) pyridine, imidazole and the like.
  • Aromatic amines or salts thereof o-phenylenediamine, tolylene-3,4-diamine, 3,4-diaminobenzoic acid and N-alkyl-substituted products thereof (eg, N-methyl-1,2-phenylenediamine, Diamines such as N-ethyl-1,2-phenylenediamine, N-isopropyl-1,2, phenylenediamine, 2,3-diaminophenol, 4-chloro-1-o—phenylenediamine, etc.
  • N-methyl-1,2-phenylenediamine Diamines such as N-ethyl-1,2-phenylenediamine, N-isopropyl-1,2, phenylenediamine, 2,3-diaminophenol, 4-chloro-1-o—phenylenediamine, etc.
  • aromatic diamines especially 3,4 diaminobenzoic acid and its N-alkyl Conversion (eg, N-methyl-1,2-phenylenediamine, N-ethyl-1,2-phenylenediamine, N-isopropyl-11,2-phenylenediamine) or a salt thereof;
  • Amines such as thiosemicarbazides such as thiosemicarbazide, acetone thiosemicarbazide and phenylthiosemicarbazide, selenosemicarbazides such as selenosemicarbazide and acetone selenosemicarbazide or salts thereof can be used, and among them, amines, especially , Diamines or thiosemicarbazides or salts thereof are preferably used, and 3,4-diaminobenzoic acid or a salt thereof is particularly preferably used.
  • Examples of the salt of the base used in the hydrolysis reaction include, for example, those similar to the above-mentioned salts of apelin having a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus.
  • the amount of the base is usually about 1 to 10,000 mol, preferably about 200 to 300 mol, more preferably about 50 mol per mol of apelin having a diketone form of a methionine residue or a salt thereof. 0 to 300 moles.
  • the hydrolysis reaction usually proceeds at about 0 to 70 ° C (preferably about 20 to 40 ° C) for about 1 hour to 7 days (preferably about 10 hours to 5 days). Is preferred.
  • a buffer is preferably used as a solvent. Examples of the buffer include a phosphate buffer, an acetate buffer, a citrate buffer, and a formic acid buffer. Buffers and the like can be mentioned. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the above-mentioned hydrolysis reaction.
  • formic acid such as sodium acetate-sodium formate, sodium formate formate or sodium formate formate buffer is preferable.
  • a system buffer is preferably used.
  • the pH of the reaction is adjusted to about 2 to 9, especially about 3 to 7, especially about 4 to 6, and the reaction is allowed to proceed.
  • These buffers are preferably used at about 0.1 to 8 mol / L, more preferably at about 0.5 to 6 mol / L.
  • apelin having a diketone of a methionine residue which may be oxidized at the N-terminus or a salt thereof, and apelin having no methionine residue or a salt thereof which is formed by a hydrolysis reaction and which does not have the methionine residue It is preferable to add urea to the buffer for the hydrolysis reaction for the purpose of preventing precipitation and the like. For example, it is preferable to add urea to the buffer to a concentration of preferably about 1 to 6 M, more preferably about 2 to 5 M.
  • the thus obtained apelin or a salt thereof can be isolated and purified from the reaction solution by known purification means, for example, extraction, salting out, partitioning, recrystallization, chromatography, etc.
  • purification means for example, extraction, salting out, partitioning, recrystallization, chromatography, etc.
  • a purification method by ion exchange chromatography through SP-Sepharose (Pharmacia Biotech Co., Ltd.) or DEAE-5 PW (Tosoichi Co., Ltd.) may be mentioned.
  • the obtained apelin can be lyophilized to a powder if necessary.
  • stabilizers such as sorbitol, mannitol, dextrose, maltose, trehalose, and glycerol can be added.
  • the apelin or a salt thereof produced by the method of the present invention can be mixed with sterilized water, human serum albumin (HSA), physiological saline or other known physiologically acceptable carriers, and can be used in mammals (eg, It can be administered parenterally or topically to humans.
  • the daily dose per person is about 0.0 lmg-50 mg, preferably about 0.1 mg-1 Omg, administered parenterally by intravenous injection or intramuscular injection, etc. be able to.
  • the preparation containing apelin or a salt thereof produced by the method of the present invention may be a salt, diluted It may also contain other physiologically acceptable active ingredients such as agents, adjuvants, other carriers, buffers, binders, surfactants, and preservatives.
  • Preparations for parenteral administration may be sterile aqueous solutions or suspension ampules in physiologically acceptable solvents or sterile powders that can be diluted before use with physiologically acceptable diluents (usually a peptide solution). It is provided as an ampoule (obtained by freeze-drying).
  • apelin obtained by the production method of the present invention is involved in central nervous system function control, circulatory function control, immune function control, digestive function control, metabolic function control or genital function control, etc.
  • dementia caused by senile dementia, cerebrovascular dementia, and degenerative metamorphic diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, and Huntington's disease.
  • Dementia, endocrine, metabolic, and toxic diseases eg, hypothyroidism, vitamin B12 deficiency, alcohol poisoning, various drugs, poisoning by metals and organic compounds, etc. caused by viral infections.
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • [SEQ ID NO: 3] b Shows the amino acid sequence of FGF CS23 mutin.
  • SEQ ID NO: 7 This shows the base sequence of the primer used in the preparation of a structural gene for apelin-36 in Example 1.
  • SEQ ID NO: 8 This shows the base sequence of the primer used in Example 1 for preparing the structural gene for apelin-136.
  • SEQ ID NO: 10 This shows the base sequence of the primer used in the preparation of a structural gene for apelin-36 in Example 1.
  • SEQ ID NO: 11 This shows the base sequence of the primer used for preparation of the structural gene for apelin-136 in Example 1.
  • Example 1 Preparation of human aperin-I 36 structural gene
  • the phosphorylated DNA fragment obtained in a) above was combined with 1 g of each of # 1 and ⁇ to make 120 L. After keeping this mixed solution at 80 for 10 minutes, annealing was performed by gradually cooling to room temperature. Ligation reaction was performed using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo). After 30 L of solution II was added to 30 / L of the annealing solution and mixed well, 60 L of solution I was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 1 hour to perform ligation. After phenol treatment, the aqueous layer was collected, twice the amount of ethanol was added, the mixture was cooled to -70 ° C, and the DNA was precipitated by centrifugation.
  • PTB960-2 (EP-A-499990: Koyama et al., Journal of Biotechnology, 32, 273, 1994) digested with Xbal and Aval, and electrophoresed with 1% agarose to about 4.4 Kbp. was extracted using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 25 L of TE buffer.
  • the Xbal and Aval fragments of PTB960-2 and the structural gene of human apelin-36 prepared as described above were subjected to a ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit 2 (Takara Shuzo).
  • Plasmid PTB960-13 was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) strain (Novagen), seeded on LB agar medium containing 10 ug / mL tetracycline, cultured at 37 ° C for 1 day, and purified with human aperin-36-CS23.
  • the fusion protein expression strain BL21 (DE3) / pTB960-13 was obtained (FIG. 4).
  • Example 2 Transform the cells obtained in Example 2 into 2 liters using 1 L of LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) containing 5.mg of OmgZL tetracycline. The cells were shake-cultured at 37 ° C for 8 hours in a flask. The obtained culture solution was used in 19 liters of the main fermentation medium (1.6% sodium hydrogen phosphate, 0.1%). 3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 0.02% defoamer, 0.00025% ferrous sulfate, 0.
  • Example 2 To 550 g of the cells obtained in Example 2 was added 1500 ml of a solution of 1 OmM EDTA + 1 mM (p-amici'nofxnil) methanesulfonyl fluoride hydrochloride (pH 6.0), followed by ultrasonic treatment (BRA NSON SON After IFI ER MOD EL 450), centrifugation (10000 rpm, 60 min) was performed. The supernatant was pooled, and the same procedure was repeated for the precipitation.
  • 1 OmM EDTA + 1 mM (p-amici'nofxnil) methanesulfonyl fluoride hydrochloride pH 6.0
  • ultrasonic treatment BRA NSON SON After IFI ER MOD EL 450
  • the eluate was concentrated using a Pellicon minicassette (Millipore) while adding 0.1 M acetic acid to obtain a 0.1 M acetic acid solution of human apelin-36-CS23 fusion protein. After urea was added to this solution to a final concentration of 6 M, 35 mg of 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium salt (DMAP-CN) was added and reacted at room temperature for 15 minutes.
  • DMAP-CN 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium salt
  • reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (46 mm IDX 600 Margaret L, Pharmacia) equilibrated with 10% acetic acid, and the 10% acetic acid used for equilibration was 6: 111 1111 n
  • the S-cyanated human aperin-36-CS23 fusion protein fraction was obtained.
  • the eluate was concentrated and desalted with a Pellicon mini force set (Millipore) to obtain a desalted solution of the fusion protein of humanaperin-36-CS23. After adding urea to this desalted solution to a final concentration of 6 M, Further, IN caustic soda was added to a concentration of 0.06 N, and the reaction was performed at 0 ° C for 15 minutes.
  • the human caperin-36 fraction was passed through C 4 P-50 (21.5imnIDX300 recital L, Showa Denko) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid (TFA), and adsorbed and washed. Elution was performed with a step gradient of% B (B: 80% acetonitrile Z 0.1% TFA), and the fraction of humanaperin-36 was pooled, followed by freeze-drying to obtain a freeze-dried powder of humanaperin-136.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer).
  • amino acid composition was consistent with the amino acid composition predicted from the DNA sequence of human apelin-36 with methionine added to the N-terminal (Table 1).
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems Model 477A). As a result, the amino acid sequence of the obtained human aperin-136 was identical to the N-terminal amino acid sequence predicted from the DNA nucleotide sequence except that a methionine was added to the N-terminal (Table 2).
  • N-terminal amino acid sequence Detected nucleotide sequence of human aperin-36 Predicted from residue No PTH 1) -amino acid
  • Example 4 Human apelin-36 obtained in Example 4 was a molecular species in which methionine was added to its N-terminus (Met-human apelin-36).
  • Example 5 Bio activity measurement
  • Example 6 Removal of N-terminal methionine residue: Part 1
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer).
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems Model 477A). The results agreed with the N-terminal amino acid sequence predicted from the obtained DNA sequence of human aperin-136 (Table 5).
  • N-terminal amino acid sequence Detected human aperin-1 base sequence ij residue No PTH 1)-predicted from amino acid
  • Example 8 Removal of N-terminal methionine residue: Part 2
  • Dissolve 364 mg of the met-human caperin obtained in Example 4 in 3M urea After dissolving in 0.8 ml of the solution, a mixed solution of 0.05 ml of 80 mM copper sulfate, 0.46 g of glyoxylic acid, and 0.1 ml of pyridine was added, and the mixture was reacted at 25 for 1 hour. After completion of the reaction, the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (10 mm IDX 250 mmL) equilibrated with 2.5 M urea + 1 OmM phosphate buffer (pH 5.5) to allow equilibration.
  • the solution used was developed at a flow rate of 0.5 m 1 Z, and the human apelin-36 fraction having a diketone form of methionine residue was pooled. Subsequently, equal amounts of 2 M sodium formate, 4 M acetic acid, and 3 M urea solution were added to this fraction, and then 3,4-diaminobenzoic acid was added to a concentration of 4 OmM, followed by a reaction at 30 for 3 days. . After completion of the reaction, the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (25 mm ID x 600 mmL) equilibrated with 5 OmM phosphate buffer (pH 6.0), and the buffer used for equilibration was added in 4 ml.
  • the fraction was developed at a flow rate of 1 min, and 36 fractions of human apelin having no N-terminal methionine residue were pooled.
  • N-terminal amino acid sequence is converted to a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems) It was determined using the Stems model 477 A). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence predicted from the obtained DNA sequence of human aperin-36 (Table 8).
  • N-terminal amino acid sequence Detected '-36 nucleotide sequence Residue No PTH 1)-Predicted from amino acid
  • the C-terminal amino acids were analyzed using an amino acid analyzer (Hitachi L-850 A Amino Acid Analyzer) (Table 9).
  • Example 8 Using the human apelin obtained in Example 8, the activity was measured by the method (site sensor) described in Example 6 of W99 / 33976, and the activity equivalent to that of the synthetic product of human apelin-36 was measured. It was confirmed that it had. Industrial applicability
  • dementia caused by senile dementia cerebrovascular dementia
  • systemic degenerative degenerative disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.
  • infectivity Dementia endocrine, metabolic, or toxic diseases (eg, hypothyroidism, vitamin B12 deficiency, vitamin B12 deficiency, alcoholism, etc.) caused by diseases (eg, late viral infections such as Creutzfeldt-Jakob disease)
  • Dementia caused by drugs, metals, organic compounds, etc.
  • dementia caused by neoplastic diseases eg, brain tumors, etc.
  • dementia caused by traumatic diseases eg, chronic subdural hematomas, etc.
  • Depression hyperactive child (microbrain disorder) syndrome, consciousness disorder, anxiety disorder, schizophrenia, phobia, growth hormone secretion disorder (eg, giantosis, acromegaly, etc.), Eating disease, Bulimia
  • AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome: Acquired Immune insufficiency syndrome
  • AIDS Acquired Immune insufficiency syndrome

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Description

明 細 書 ァペリンの製造法 技術分野
本発明は、 融合蛋白質またはポリペプチドを製造し、 次いで該融合蛋白質また はポリべプチドをぺプチド結合の切断反応に付すことにより、 ァペリンまたはそ の塩を製造する方法に関する。 さらに、 N末端に酸化されていてもよいメチォ二 ン残基を有するァペリンまたはその塩から効率よく N末端の酸化されていてもよ いメチォ二ン残基あるいは該メチォニン残基のジケトン体を除去する方法に関す る。 背景技術
遺伝子組換え技術を用いて、 ペプチドを製造するに際しては、 ペプチドが細胞 内で、 分解を受けやすいために、 融合蛋白質の形で発現させることがしばしば行 なわれている。 融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出しには、 ブロムシアンを 用い化学的に切断する方法 （イタクラら、 Sc i ence, 198, 1056 (1977) ) 、 ファフ ター X aを用い酵素的に切断する方法 （ナガイら、 Me thods i n Enzyrao l ogy, 1 53, 46 (1987) ) が知られている。
さらに、 蛋白質中のペプチド結合を切断する方法として、 2—ニトロ一 5—チ オシァノ安息香酸によるァシルシスティン結合の切断が知られている （ 「生化学 実験講座」 1 , タンパク質の化学 I I , 日本生化学会編， 東京化学同人発行， 第 2 4 7〜2 5 0頁 1 9 7 6年） 。 しかしながら、 蛋白質からの目的ペプチドの切り 出しについては、 開示されていない。
蛋白質が細胞内で生合成される際には、その N末端は m R N Aの開始コドン A U Gに対応するメチォニンから始まっていることが知られている。 しかしながら このメチォニンは以後のプロセッシングによって取り除かれてしまうため、 完成 された成熟蛋白質分子にはもはや存在しないのが通例である。
遺伝子組換え技術の進歩により、 有用な蛋白質を微生物や動物細胞、 例えば大 腸菌を用いて産生することが可能となったが、 本手法により産生される蛋白質に は、 上記メチォニンが残存している例が見い出されている。 例えば、 大腸菌で発 現させたヒト成長ホルモンにおいてメチォニンの付加率はほぼ 100% [ネイチ ヤー （Nature) , 293， 408 (1 98 1) ] に達し、 インターフェロン一 α においては 50 % [ジャーナル'ォブ'インターフェロン ·リサーチ（L Interferon Res.) , 1, 381 ( 198 1 ) ] 、 非グリコシル化ヒトインタ一ロイキン— 2 では、 天然型ヒトインターロイキン一 2と同じくァラニンではじまる分子種 （r
1 L- 2) に加え、 ァミノ末端にさらにメチォニンの付加した （Ν末端にメチォ ニン残基を有する） 分子種 （Met— r I L- 2) の存在が認められている。
一方、 N末端のアミノ酸を化学的に除去する方法としては、 Dixon 力 DL- ァラニルダリシンにダリオキシル酸、 ピリジン、 酢酸銅を反応させるとァミノ基 転移反応が起こり、 ピルボイルグリシンが生成すること [バイオケミストリ一· ジャーナル （Biochem. J) , 92， 66 1 (1964) ] 、 さらに、 化合物にチ ォセミカルバジドを反応させるとアミド結合の解裂が起こり、 グリシンを生成す ることを報告している [バイオケミストリ一 'ジャーナル （Biochem. J) , 90，
2 C (1 964) ] 。 次いで、 この反応をチトクローム c -551 (Pseudomonas cytochrome c一 55 1) に応用し、 N末端グルタミン酸が除去されることを報告 している [バイオケミストリー 'ジャーナル （Biochem. J) , 94, 463 (1 965) ] 。
従来知られている技術において、 融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出しに 際し、 ブロムシアンを用いる場合には、 メチォニンを含有するペプチドの製造に は適用することはできないし、 切り出し時の収率等に問題が多い。
このように、 融合蛋白質またはポリペプチドから目的とするペプチドを効率良 く切り出す方法が望まれている。
さらに、 同じ蛋白質であっても、 Ν末端にメチォニンの付加した分子種と そうでない分子種とは蛋白質の高次構造、 生物活性、 安定性が相互に異なる 可能性があり、 さらにメチォニンの Ν末端への付加が抗原性の増加をもたら す可能性もありうるものと考えられる。 従って、 産業利用上の観点から、 こ の開始コドンに対応する Ν末端メチォニン除去法を確立することは意義あ ることと考えられる。
この課題を解決するため、 臭化シアン （B r C N ) 分解によってメチォ二 ンを取り除く方法 [サイエンス （Sc i ence) , 1 9 8， 1 0 5 6 ( 1 9 7 7 ) ] が提案されているが、 この場合は所望の成熟蛋白質中にメチォニン残基が存 在しないことが前提となる上、 過酷な化学反応を蛋白質に付す該方法によつ ては、 決して満足する結果は得られない。
N末端にメチォニン残基を有するペプチドまたは蛋白質から、 ぺプチドま たは蛋白質の種類に拘わらず、 選択的かつ効率的に、 N末端のメチォニン残 基を除去することを可能とする化学的な方法としては、 特開平 1 0 _ 7 2 4 8 9号 （E P— A— 8 1 2 8 5 6号） に記載の方法以外には全く知られてい ないが、 このことは、 最終生産物となるペプチドまたは蛋白質を変性させる ことなく、 マイルドな条件下で N末端のメチォニン残基を除去しうる化学的 な反応を見い出すことの困難性に起因すると考えられる。 特に、 分子量が比 較的大きく、 遺伝子工学的に製造される蛋白質、 なかでも、 医薬として用い ることを目的とした蛋白質から、 N末端に余分に付加したメチォニンを除去 する場合、 メチォニン除去後に蛋白質の活性が低下しないことが要求される ため、 通常、 弱酸性から弱アルカリの水溶液中で加熱することなく、 反応を 進行させる必要があり、 化学的な反応条件としては制限が多いので、 良好な 反応条件を見い出せないのが現状であった。 発明の開示
本発明者らは、新規生理活性ペプチドであるアベリン（Bi ochem. Bi op ys. Res. Co誦 un. , 251, 471-476, (1998) ) またはその塩を効率良く製造する方法につい て鋭意検討を加えたところ、 Ν末端にシスティンを有する蛋白質またはポリぺプ チドの Ν末端にァペリンを連結した融合蛋白質またはポリペプチドを製造し、 次 いでこれをペプチド結合を切断する反応に付すことにより、 ァペリンを効率良く 製造できることを見い出した。
さらに、 本発明者らは、 遺伝子工学的に製造されるァペリンにおける Ν末 端のメチォニン残基のみを切断することによる、 天然型のアミノ酸配列を有 するァペリンの製造法を提供すべく鋭意研究したところ、 下記のスキーム 1 に表されるとおり式 （ I ) で表わされる N末端に酸化されていてもよいメチ ォニン残基を有するァペリンに、 例えば、 ひ-ジケトン類であるダリオキシ ル酸、 遷移金属イオンを供与しうる硫酸銅、 塩基 （例えばアミン類） である ピリジンを反応させて、 アミノ基転移反応を行うことにより得られる該メチ ォニン残基のジケトン体を有するァペリンに塩基 （例えばジァミン類） であ る 3， 4ージァミノ安息香酸を反応させて加水分解反応を行うことにより、 該メチォニン残基のジケトン体を有するァペリンからメチォニン残基のジ ケトン体を予想外にも効率よく除去できることを見出した。 すなわち、 本発 明者らはメチォニン残基を有するァペリンから、 N末端の酸化されていても よいメチォニン残基を除去し、 その活性を低下させることなく、 N末端に酸 化されていてもよいメチォニン残基を有していないァペリンを予想外にも 高収率で得る方法を見い出し、 さらに研究を進め、 本発明を完成させるに至 つた。
(スキーム 1 )
Figure imgf000006_0001
[式 （I ) 中、 mは 0ないし 2の整数を示し、 Xはァペリンのペプチド鎖を 示す。 ] 本願明細書においては、 上記スキーム 1中、
(1) 一般式 （ I ) で表される化合物を 「N末端に酸化されていてもよいメ チォニン残基を有するァペリンまたはその塩」 または 「メチォニン残基を有 するアベリンまたはその塩」 ；
(2) 一般式 （ I ) において
Figure imgf000007_0001
[式中、 mは前記と同意義]で表される部分構造を 「酸化されていてもよいメ チォニン残基」 、 「メチォニン残基」 または 「メチォニン」 ；
(3) 一般式 （II) で表される化合物を 「N末端に酸化されていてもよいメ チォニン残基のジケトン体を有するァペリンまたはその塩」 または 「メチォ ニン残基のジケトン体を有するァペリンまたはその塩」 ；
(4) 一般式 （II) において
Figure imgf000007_0002
[式中、 mは前記と同意義]で表される部分構造を 「酸化されていてもよいメ チォニン残基のジケトン体」 または 「メチォニン残基のジケトン体」 ；およ び、
(5) 一般式 （III) に代表される化合物を 「N末端に酸化されていてもよ いメチォニン残基を有していないァペリンまたはその塩」 または 「N末端に 酸化されていてもよいメチォニン残基のジケトン体を有していないァペリ ンまたはその塩」 と、 それぞれ称することがある。
本発明は、 (1) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 N末端に 酸化されていてもよいメチォニン残基を有していてもよいァペリンを連結した融 合蛋白質またはペプチドをシスティン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反 応に付すことを特徴とするアベリンまたはその塩の製造法、
(2) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 N末端に メチォニン残基を有していてもよいァペリンを連結した融合蛋白質またはべプチ ドをコードする遺伝子を有するベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋 白質またはペプチドを発現させ、 発現された融合蛋白質またはペプチドをシステ イン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする N末端 にメチォニン残基を有していてもよいァペリンまたはその塩の製造法、
(3) 切断反応が S—シァノ化反応、 次いで加水分解反応に付す反応である上記
(I) または （2) 記載の製造法、
(4) ァペリンが配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリべプチド である上記 （1) または （2) 記載の製造法、
(5) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 N末端に メチォニン残基を有していてもよいァペリンを連結した融合蛋白質またはべプチ ド、、
(6) 上記 （5) 記載の融合蛋白質またはペプチドをコードする遺伝子を有する ベクター、
(7) 上記 （6) 記載のベクターを含有する形質転換体、
(8) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたはそ の塩とひージケトン類を反応させた後、 加水分解することを特徴とする該メチォ ニン残基の除去方法、
(9) N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンが遺伝子 工学的に製造されたァペリンである上記 （8) 記載の方法、
(10) 遷移金属イオンの存在下に α—ジケトン類を反応させることを特徴とす る上記 （8) 記載の方法、
(I I)塩基の存在下にひ—ジケトン類を反応させることを特徴とする上記（8) 記載の方法、 (12) 遷移金属イオンおよび塩基の存在下にひージケトン類を反応させること を特徴とする上記 （8) 記載の方法、
(13) α—ジケトン類がダリオキシル酸またはその塩である上記 （8) 記載の 方法、
(14) 遷移金属イオンが銅イオンである上記 （10) 記載の方法、
(15) 塩基がピリジンである上記 （1 1) 記載の方法、
(16) 塩基を用いて加水分解することを特徴とする上記 （8) 記載の方法、
(17) 塩基がアミン類である上記 （16) 記載の方法、
(18) 塩基がジァミン類またはチォもしくはセレノセミカルバジド類である上 記 （16) 記載の方法、
(19) ジァミン類が 0—フエ二レンジァミンまたは 3, 4—ジァミノ安息香酸 である上記 （18) 記載の方法、
(20) 遺伝子工学的に製造され、 Ν末端にメチォニンが付加したァペリンまた はその塩とダリオキシル酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反 応させた後、 0—フエ二レンジァミンまたは 3， 4ージァミノ安息香酸と反応させ ることを特徵とするアベリンまたはその塩の製造法、
(21) 式 CH3- S(0)m- (CH2)2- CO- CO- X 〔式中、 mは 0ないし 2の整数を、 Xはァ ペリンのペプチド鎖を示す。 〕 で表される化合物またはその塩、
(22) 上記 （21) 記載の化合物を加水分解することを特徴とするァペリンま たはその塩の製造法、 および
(23) N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 N末端 にメチォニン残基を有するァペリンを連結した融合蛋白質またはペプチドをシス ティン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付し、 N末端に酸化されて いてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたはその塩を得、 さらに、 該 N末 端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたはその塩とひ一 ジケトン類を反応させた後、 加水分解することを特徴とするアベリンまたはその 塩の製造法などに関する。 図面の簡単な説明 図 1は本発明の反応工程における反応メカニズムを示す。
図 2は実施例 1で用いられた DNAフラグメントを示す。
図 3は実施例 1で得られた 2重鎖構成のヒ卜ァペリンー 36を製造する模式図を 示す。
図 4は実施例 2で得られたプラスミド pTB960 _ 13の構築図を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法に用いられるァペリンとしては、 例えば Biochem. Biop ys. Res. Commun. , 251, 471-476, (1998) に記載のヒトァペリン一 36 (配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列で表されるポリペプチド） 、 ァペリン一 1 3 (配列番号： 1の第 24〜 36番目のアミノ酸配列で表されるポリペプチド） 、 ァペリン一 1 3の Ν末端のアミノ酸 （G i n) がピログルタミン酸化したペプチドなどがあげ られ、 AP J (O'Dowd. B. F. , et al., Gene, 436, 355-359, 1993) に対し、 リ ガンド活性を有するペプチドであれば、 如何なるものであっていてもよく、 具体 的には、 例えば W〇 99/33976 (特願平 1 0— 364656号） に記載の 「配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するレセプター蛋白質に結合能を有するポリペプチド」 などがあげら れる。
また、 本発明のァペリンには、 G 1 nの N端側が生体内で切断され、 該 G 1 n がピログルタミン酸化したものなども含まれる。
本明細書におけるペプチドはペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （アミ ノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表される ペプチドの C末端は、 カルボキシル基 （- C00H)、 カルボキシレート（-C00— )、 アミ ド （- C0NH2)、 アルキルアミド （-C0NHR) またはエステル (- C00R)であってもよレ 。 エステルまたはアルキルアミドの Rとしては、 例えばメチル、 ェチル、 n—プロ ピル、イソプロピルもしくは n—ブチルなどの d-6アルキル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3-8シクロアルキル基、 フエニル、 α—ナフチルなどの C 6 - 12ァリール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒドリルなどのフエ二ルー C,一 2アルキル、 もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C I -2アルキルな どの C 7 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるピバロィルォ キシメチルエステルなどがあげられる。
本発明のァペリンの塩としては、 生理学的に許容される塩基 （例えばアルカリ 金属など） や酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ生理学的に 許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ 酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リン ゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩な どが用いられる。
本発明の方法に用いられる N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチド としては、 特定されるものではない。 その N末端にシスティンを有しない蛋白質 またはべプチドの場合は、 自体公知の方法により N末端にシスティンを有するよ うにすればよい。
該 N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドとしては、 分子量が 10 0〜： L 00000のものが好ましく、 さらに、 分子量が 300〜50000のも のが好ましい。 また、 N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドとして は、 1〜1000個のアミノ酸を有するものが好ましく、 さらに 3〜500個の アミノ酸を有するものが好ましい。
該蛋白質またはペプチドとしては、 例えばイン夕一フエロン類、 インターロイ キン類、 線維芽細胞成長因子 （aFGF、 bFGFなど） 等各種成長因子類、 （プ 口）ゥロキナ一ゼ類、 リンホトキシン、 Tumor Necrosis Factor(TNF)、 3—ガ ラトシ夕一ゼなどの酵素タンパク類、 貯蔵タンパク類、 ストレプトアビシン、 プ 口ティン A、 プロテイン G、 Tissue Plasminogen Act ivator (T P A) , これらの ムティン又はこれらの一部 （断片） などの Ν末端にシスティンを有するものがあ げられる。 なかでも、 線維芽細胞成長因子 （aFGF、 bFGFなど） またはそ のムティンまたはこれらの一部 （断片） （例えば、 bFGF CS 23ムティンな ど） などが好ましく用いられる。
bFGF CS 23ムティンとしては、 例えば、
Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-
Figure imgf000012_0001
o 〇
s：， Iヽ ？s^ ¾ CGGCCCCGCCTCTCCCATAAGGGACCCATGCCTTTC-TGC または TGT- R (I)
〔式中、 Rは
CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGAC CCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGA GTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAG AGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGAT GGAAGATTACTAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAA TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAA CGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTT
CTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC (h b F G Fムティン C S 23の断片）からなる塩基 配列を示す。 〕 で表わされる DNAなどがあげられる。
上記式 （I) はヒト （human) ァペリン一 36を含有するポリペプチドをコードす る DNA塩基配列 （配列番号： 2) にシスティンをコードする塩基配列を介して Rで示される塩基配列が結合していることを示す。
5'末端に ATGを有し、その下流に該融合蛋白質をコードする領域、ついで翻 訳終止コドンを有する DNA (プラスミド）は、 化学合成で、 あるいは遺伝子工学 的に製造された公知の該蛋白質の cDNA、 もしくは、染色体由来の該蛋白質の D N Aを加工することにより製造することができる。
本発明の N末端にシスティンを有する蛋白質またはべプチドの N末端にァペリ ンを連結した融合蛋白質またはペプチドをコードする遺伝子を、 従来の DNA技 術、 例えば特定部位指向性変異誘発技術を用いて目的のムティンをコードする遺 伝子に変換することができる。
特定部位指向性変異誘発技術は周知であり、アール ·エフ ·レイザー (Lather, R. F.)及びジエイ · ピー ' レコック（Lecoq, J. P. )、 ジェネティック 'エンジニアリ ング (Genetic Engineering), ァカデミックプレス社（1983年）第 31— 50頁 に示されている。ォリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はェム 'スミス（Smi th, M.) 及びエス ·ギラム（Gil lam, S. )、 ジェネティック ·エンジニアリング：原理 と方法、 プレナムプムス社（1 98 1年） 3巻 1 _ 32頁に示されている。 該融合蛋白質をコードする領域を有する DNAを有するプラスミドを製造する にあたって、 ベクターとして用いられるプラスミドとしては、 例えば大腸菌 (Escherichiacoli) 由来の pBR 3 2 2 〔ジーン（Gene)， ， 9 5 (1 9 7 7)〕 ， pBR 3 1 3 〔ジーン， ， 7 5 ( 1 9 7 7)3 , pBR 3 24, pBR 3 2 5 〔ジ一 ン， A， 1 24 (1 9 7 8)) , PBR 32 7, pBR 3 2 8 〔ジーン， _^， 2 8 7 (1 980)〕 ， pBR 3 2 9 〔ジーン， ， 7 9 (1 9 8 2)) , pKY 2 2 8 9 〔ジ —ン， J_， 1 (1 9 78)〕， KY 2 7 0 0 〔生化学， ^_2_, 7 7 0 (1 9 8 0)) , pACYC 1 7 7,pACYC 1 84〔ジャーナル'ォブ'バクテリオロジ一（Journal of Bacteriology), 1 34, 1 1 4 1 (1 9 7 8)〕 ， pRK248, pRK64 6, pDF 〔メソッズ 'イン 'ェン ジーモロジ一（Methods inEnzymology), 6 8,
268 (1 9 7 9)〕， pUC 1 8， pUC 1 9 〔ャニシュ一ペロンら， ジーン（Gene),
3 3, 1 0 3 (1 98 5)〕 などがあげられる。 また、 ノ クテリオファ一ジ、 例え ば λファージを使用した Agi系の い λ C CProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 7 1 , 457 9 (1 9 74)] ， Agt · λ B [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 7_2_, 346 1 (1 9 7 5)〕 ， ADam 〔ジーン， 丄， 2 5 5 (1 9 7 7)〕 や シヤロンベクター 〔サイエンス， （Science), 1_9 6, 1 6 1 (1 9 7 7) ;ジャー ナル ·ォブ · ビーロロジ一（Journal of Virology), 2 9, 5 5 5 (1 9 79)〕 ， 繊維状ファージを使用した即系の即 1 8， ra 1 9 〔ャニシュ一ペロンら， ジーン (Gene) , _3_3, 1 0 3 (1 9 8 5)〕 ベクタ一などもあげられる。
上記 DNAは、 ATGの上流にプロモー夕一を有しているのが好ましく、 該プ ロモ—夕一は、 形質転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモーターで あればいかなるものでもよい。
例えば大腸菌（Escherichia col i)では ίΐ プロモータ一， lacプロモータ一, rec Aプロモータ一， λ PLプロモーター， lppプロモーター， T 7プロモーターなど、 枯草菌（Bacillus subtilis)では S PO 1プロモ一夕一， S P02プロモーター， penPプロモー夕一など、酵母（Saccharomyces cerevisiae)では PHO 5プロモー ター， PGKプロモーター， GAPプロモーター， ADHプロモーターなど、 動 物細胞では S V 40由来のプロモーターなどがあげられる。必要により S D (シャ インアンドダルガーノ）配列をプロモーターの下流に揷入してもよい。 T 7プロモーターの系を用いる場合には、 Τ 7プロモー夕一としては、 T 7D ΝΑ上で見い出されている 1 7種のプロモーター 〔； ί· L. Oakley ら， Proc. Natl. Acad. Sci, U. S. A, _± : 426 6 -4 2 70 (1 9 7 7), M. D. Rosa, Cell 1 6 : 8 1 5— 8 2 5 (1 9 7 9), N. Panayotatos ら， Nature, 2 8 0 : 3 5 (1 97 9), J. J. Dunn ら， J. Mol. Biol.， 1 6 6 : 47 7— 5 3 5 (1 9 8 3)〕 のいずれでもよいが φ 1 0プロモーター 〔A. H. Rosenberg ら， Gene, ^_6 ： 1 2 5— 1 3 5 (1 98 7)〕 が好ましい。
転写ターミネータ一としては、 大腸菌の系で作動するターミネータ一、 好まし くは ΤΦターミネータ一 〔F. W. Studier ら， J. Mol. Biol.， 1 8 9 : 1 1 3 - 1 3 0 (1 986)〕 が用いられる。
T 7 RN Aポリメラ一ゼ遺伝子としては T 7遺伝子〔F. W. Studier ら， J. Mol. Biol.， 1 8 9 ： 1 1 3 - 1 3 0 (1 9 8 6)] をあげることが出来る。
ベクタ一は上記ベクターに T 7プロモーター， T 7ターミネ一夕一を組み込ん で構築されるのが好ましく、 このようなベクターとしては、 pET— 1， ET- 2， pET— 3， pET- 4, pET— 5 [A. H. Rosenberg, Gene _5_6 : 1 2 5—
1 3 5 (1 9 8 7)) 、 pTB 96 0 _ 2 〔EP— A— 4 9 9 9 9 0〕 などをあげる ことができるが、 好ましくは pTB 9 6 0— 2が用いられる。
本発明の形質転換体は、 上記方法で得られる発現用ブラスミドを自体公知の方 法 〔例、 コーェン S, N, ら， プロシージング'ォブ 'ナショナル 'アカデミー ' ォブ 'サイエンス（Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A. ), 6 9， 2 1 1 0 (1 9 7 2)〕 で宿主を形質転換することにより製造することができる。
形質転換される微生物の宿主としては、 例えば、 ェシエリシァ（Escherichia) 属菌， バチリス（Bacillus)属菌， 酵母， 動物細胞などがあげられる。
上記ェシェリシァ属菌の例としては、 ェシェリシァ 'コリ（E. coli)があげられ、 具体的にはェシエリシァ 'コリ（Escherichia col i)K 1 2 DH 1 〔プロシーディ ングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー'ォブ ·サイェンシズ (Pro atl. Acad. Sci. U. S. A. ), 6_0, 1 6 0 (1 968)〕 ， JM— 1 03 〔ヌクレイック 'ァ シッズ ' リサ一チ， （Nucleic Acids Research)， ， 3 0 9 (1 9 8 1)〕 ， J A
22 1 〔ジャーナル ·ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー（Journal of Molecular Biology), 120, 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル ·ォ ブ 'モレ キユラ一 'バイオロジー， ^!, 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネティッ クス（Genetics), _3_9, 440 (1954)] ， N4830 〔セル（Cell), 25, 713 (1981)) ， K— 12 MM 294 〔プロシ一ディングス ·ォブ ·ナショ ナル 'アカデミー 'ォブ'サイェンシズ， 丄 ， 4174(1976)〕 BL— 2 1などがあげられる。
上記バチルス属菌としては、 例えばバチルス ·サチルス（Bacillus subtilis) があげられ、具体的にはバチルス'サチルス M 1 1 14 (ジーン， 2_4, 255 (1 983))， 207 - 21 〔ジャーナル 'ォブ 'バイオケミストリ一（Journal of Biochemistry), _9_5, 87 (1984)〕 などがあげられる。
上記酵母としてほ、 例えばサッカロマイセス ·セレビシァェ（Saccharomyces cerevisiae)があげられ、 具体的には、 サッカロマイセス ·セレビシァェ AH 22 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕 ， XS B 5 2 - 23 C [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7_7_ 2173 (1980)] ， BH -641 ACATCC 28339)， 20B— 12 [Genetics, 85, 23 (19
76)〕 ， GM3 C- 2 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7_8_ 2258 (19
81)〕 などがあげられる。
動物細胞としては、 例えばサル細胞 COS— 7 〔セル（Cell), _23_, 175 (1
981)〕 ， Vero 〔（日本臨床 1209 (1963)〕 ， チャイニーズハム スター細胞 CHO 〔ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンタル ·メディシン（J. Exp.
Med.), 108, 945 (1985)〕 ， マウス L細胞 〔ジャーナル'ォブ'ナショ ナル.キャンサー .インスティチュート（J. Nat. Cancer Inst. ), ±, 165 (1 943)〕， ヒト FL細胞〔プロシーディングス ·ォブ ·ザ'ソサエティ 'フォー ' エキスペリメンタル 'バイオロジー 'アンド ·メデイシン（Pro Soc. Exp. Biol. Med.), _9_4, 532 (1957)〕 , ハムスター C細胞などがあげられる。
T 7プロモーターの系を用いる場合には、 その形質転換体の宿主としては、 Τ 7RNAポリメラーゼ遺伝子（Τ7遺伝子 1) 〔F. W. Studierら， J. Mol. Biol. 丄 89 : 113- 130 (1986)) を組み込んだ大腸菌株、 例えば MM 294，
DH- 1 , C 600, JM109, BL 21, あるいは T 7 RNAポリメラ一ゼ 遺伝子（T 7遺伝子 1)を他のプラスミドと共に組込んだ大腸菌株など、 ならいず れでもよい。 好ましくは Τ 7遺伝子 1を組み込んだ λファージが溶原化した MM 294株および BL 2 1株が用いられる。 この場合 T 7遺伝子 1のプロモーター としては、イソプロピル一 1ーチォ一 ) 3— D—ガラクトピラノシド（I PTGと略 することがある。 ）で発現が誘導される lacプロモーターが用いられる。
バチルス属菌を宿主として形質転換するには、 例えばモレキュラー ·アンド ' ジェネラル 'ジェネティックス (Molecular and General Genetics), 168, Π 1 ( 1979)など公知の方法に従つて行なうことができる。
酵母菌を宿主として形質転換するには、 例えば Pro atl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)などの公知の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を宿主として形質転換するには、例えばヴィ一口ロジー (Vi r 01 ogy, 52, 456 ( 1973)などの公知の方法に従つて行なうことができる。
融合蛋白は、 上述の形質転換体を培地に培養し、 産生された融合蛋白を採取す ることにより製造することができる。
培地の pHは約 6〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 CMiller, ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ ·イン 'モレ キユラ一 ·ジェ不ティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972)) が好ましい。 ここ に必要によりプロモー夕一を効率よく働かせるために、 例えば 3 ;3—インドリル アクリル酸やイソプロピル /3—D—チォガラクトピラノシド （ I PTG) のよう な薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43 で約 3〜 24時間 行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜40°Cで約 6〜24時間行い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えばバークホー ルダー（Burkholder)最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシ一ジングス ·ォブ ·ナ ショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 77, 4505 (1980)3があげられる。培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養 は通常約 20°C〜35°Cで約 24~72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加 える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば約 0. 2〜20%好ましくは約 5〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス (Science), 122, 501 (1952)) , DME培地 〔ヴイロロジー（Virology), 8, 396 (1959)] , RPM I 1 640培地 〔ジャーナル 'ォブ ·ザ ·アメリカン 'メ アイカル ·ァソシエーション (The Journal of the American Medical Association), m, 519 (1967)] ， 199培地 〔プロシーデイング ·ォブ ·ザ ·ソサイエティ · フォー 'ザ'バイオロジカル ·メディスン（Proceeding of the Society for the Biologcal Medicine), 73, 1 (1950)] などがあげられる。 pHは約 6〜8である のが好ましい。 培養は通常約 30〜40°C、 培養時間は約 1 5〜60時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 一
融合蛋白質は、 上記形質転換体を培養し、 培養物中に該融合蛋白質を生成， 蓄 積せしめ、 これを採取することにより製造することができる。
培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含む M 9培地〔ミラー， J. , ェ クスペリメンッ 'ィン 'モレキュラー'ジエネテイクス（Experiments in Molecular Genetics), 43 1 -433 (Cold Spring Horbor Laboratort, New York 1 97 2)〕 ， 2 XYT培地 〔メシング， メソッド 'イン.ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology), 1 01, 20 ( 1 983)〕 L B培地などがあげられる。
培養は通常約 1 5〜43t:で約 3〜24時間行い、 必要により、 通気や撹拌を 加えてもよい。
Ac I tsリブレッサ一と、 λ Pし一プロモータ一を含有する発現ベクターとを有 する組換え体を使用する場合には、 培養は約 1 5〜36 好ましくは約 30 〜 36tの温度で行い、 Ac I tsリブレッサ一の不活化は約 37°C〜42tで行う のが好ましい。また rec Aプロモ一夕一をより効率良く働かせるため、すなわち rec A遺伝子発現抑制機能を低下せしめるため、 必要によりマイトマイシン C, ナル ジキシン酸などのような薬剤を添加したり、 紫外線を照射する、 あるいは培養液 の pHをアルカリ側に変化させてもよい。 T 7プロモーターの系を用いている場合には、（1 ) l acプロモーターの下流に連 結されている T 7遺伝子（R N Aポリメラーゼ遺伝子）を発現させる時は I P T G などを添加する、もしくは（2 ) λ P Lプロモーターの下流に連結されている T 7遺 伝子 （R N Aポリメラーゼ遺伝子） を発現させる時は培養の温度を上昇させるこ となどにより、 生成する T 7ファージ R N Aポリメラーゼ 1により特異的に T 7 プロモ一夕一を作動させる。
培養後、 公知の方法で菌体を集め、 例えば緩衝液に懸濁したのち、 例えば、 蛋 白変性剤処理， 超音波処理ゃリゾチームなどの酵素処理， グラスビーズ処理， フ レンチプレス処理， 凍結融解処理などを行って菌体を破砕し、 遠心分離など公知 の方法によって上清を得る。
上記により得られた上清から、 融合蛋白質を単離するには、 通常知られている 蛋白質の精製法に従えばよい。 例えば、 ゲル濾過法， イオン交換クロマトグラフ ィ一， 吸着クロマトグラフィー， 高速液体クロマトグラフィー， ァフィ二ティー クロマトグラフィー， 疎水クロマトグラフィー， 電気泳動等を適切に組み合せて 行うことができる。 ここに得られる該融合蛋白質の N末端には翻訳開始コドンに 由来するメチォニンが付加している場合がある。 また、 該融合蛋白質は、 精製す ることなく、 あるいは部分精製の状態で、 次の反応工程に進んでもよい。
次に、 このようにして得られる融合蛋白質やペプチドをシスティン残基のアミ ノ基側のペプチド結合の切断反応に付す。 該切断反応としては、 例えば、 S—シ ァノ化反応次いで加水分解反応があげられる。 ァペリンのアミドまたはその塩を 最終物として得る場合には、 該切断反応としては、 例えば、 S _シァノ化反応次 いでアンモノリシスを行うことがあげられる。 該 S—シァノ化反応は、 原料化合 物に、 S—シァノ化試薬を作用させることにより行なう。
S—シァノ化試薬としては例えば 2—ニトロ— 5—チオシァノ安息香酸（N T C B)， 1一シァノ一 4—ジメチルァミノピリジゥム塩（DMA P— C N) , C N一 イオンなどがあげられる。 該 S—シァノ化試薬の量は、 全チオール基の約 2倍か ら 5 0倍量であればよい。 より好ましくは約 5倍〜 1 0倍量であればよい。
反応温度は約 0 ° 〜8 0 °Cの間であれば、 いずれでもよく、 約 0 ° 〜5 0での 間がより好ましい。 用いる溶媒としては、 S—シァノ化試薬と反応しないもので あれば、 いずれの緩衝液でもよいが、 例えば、 トリスー塩酸緩衝液， トリスー酢 酸緩衝液， リン酸緩衝液， ホウ酸緩衝液， などがあげられる。 また、 有機溶媒は、 S—シァノ化試薬と反応しないものであれば、 存在していてもよい。
該反応は、 ρΗ1〜12の間で行なうのが良い。特に、 NT CBを用いる場合に は pH7〜l 0,DMAP— CNを用いる場合には S— S交換反応を防止するため、 pH2〜7の間が好ましい。 また、 反応液中には、 塩酸グァニジン等の変性剤が存 在していてもよい。
上記加水分解反応としては、 例えばアル力リ処理に付すことがあげられる。 該アルカリ処理としては、原料化合物を含有する水溶液の pHを 7〜14に、調 整することにより行なわれる。
該 pHの調整は、 例えば水酸化ナトリウム， アンモニア， ァミノ化合物， トリッ マべ一ス （トリス 〔ヒドロキシメチル〕 一ァミノメタン） ， リン酸第 2ナトリウ ム， 水酸化カリウム， 水酸化バリウム等の溶液を原料化合物を含有する水溶液に 適当量加えて行うが特に水酸化ナトリゥムなどが好ましい。
上記反応の際の溶液の濃度としては、たとえば水酸化ナトリゥムの場合は約 0.
01〜2?^好ましくは約0.05〜1N、アンモニアまたはァミノ化合物の場合は 約 0. 01〜15 N好ましくは約 0. 1〜3N、トリツマベースの場合は約 1 mM〜 1M好ましくは約 20mM〜200mM、リン酸第 2ナトリウムの場合は約 1 mM〜 1M好ましくは約 10mM〜l 0 OmM、水酸化カリウムの場合は約 0. 01〜4N 好ましくは約 0. 1〜2Nがあげられる。反応温度は約— 20 〜 80°Cの間であ ればいずれでもよく、 約— 1 O ：〜 5 の間がより好ましい。
反応時間は、 好ましくは、 S—シァノ化反応は約 1〜60分好ましくは約 15 〜 30分が、 加水分解反応は約 5分〜 100時間好ましくは 10分〜 15時間が、 アンモノリシスは約 5分〜 24時間好ましくは約 10〜180分があげられる。 上記の S—シァノ化または加水分解により、 〔図 1〕 に示される反応が起こると 考えられる。 〔図 1〕 において、 Xは R1— (NR2)— (式中、 R1および R2は同 一または異なって、 （i)水素、 （ii) (3, -2。アルキル， C3— 8シクロアルキル， C6- 14ァリール（aryl)または C6— 147リール— — 3アルキル（これらは置換基を有し ていないかあるいは 1〜 3個のアミノ基， 水酸基などを炭素原子上に有していて もよい）、 （i i i)置換されていてもよいアミノ、（iv)水酸基または — 6アルコキシ 基を示す。 ) または OHを示す。
上記 C ,— 2。アルキルの例としては、 例えば、 メチル， ェチル， プロピル， イソ プロピル， ブチル， sec-ブチル， ペンチル， イソペンチル， ネオペンチル， 1 一 ェチルペンチル， へキシル， イソへキシル， ヘプチル， ォクチル， ノナニル， デ 力ニル， ゥンデ力ニル， ドデカニル， テトラデカニル， ペンタデカニル， へキサ デカエル， ヘプ夕デカニル， ォクタデカニル， ノナデカニルおよびエイコサニル などがあげられる。
上記 C 3— 8シクロアルキルの例としては、 例えば、 シクロプロピル， シクロプチ ル， シクロペンチル， シクロへキシル， シクロへプチル， シクロォクチルなどが あげられる。
上記 C 6 - , 4ァリールの例としては、 フエニル， ナフチル， アンスリル， フエナ ンスリル， ァセナフチレニルなどがあげられる。
上記 C ァリール— d— 3アルキルの例としては、例えばベンジル， フエネチ リレ， 3—フエニルプロピル， （1 一ナフチル）メチル， （2—ナフチル）メチルなど があげられる。
上記 C , - sアルコキシの例としては、 例えばメトキシ， エトキシ， プロボキシ， ブトキシ， ペンチルォキシ， へキシルォキシなどがあげられる。
上記（i i i)の置換されていてもよいァミノの置換基の例としては、例えばァミノ 酸， 2〜 1 0個のアミノ酸からなるペプチドなどがあげられる。
上記アミノ酸としては、 L一体でも D—体でもよく、 その例としては、 例えば、 Al a, Arg, Asp, Asn, Gl u, Gin, Gl y, Hi s, l i e, Me t, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val などがあげられる。
上記ペプチドの例としては、 例えば、 H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5, H-Val- Al -Leu-D-Al a-Al a-Pro-Leu-Al a-Pro-Arg-OH などがあげられる。
該反応において、 アンモニアまたはァミノ化合物を用いた場合には、 対応する アミド体が得られる。
切り出された目的ペプチドを単離するには、 通常知られているペプチドの精製 法に従がえばよい。 例えば、 ゲル濾過法， イオン交換クロマトグラフィー， 高速 液体クロマトグラフィー， ァフィ二ティークロマトグラフィー， 疎水クロマトグ ラフィー， 薄層クロマトグラフィー， 電気泳動等を適宜組み合せて行うことがで きる。 ここで得られる目的ペプチドの N末端には翻訳開始コドンに由来するメチ ォニンが付加している場合があるが、 下記に詳述される方法に準じて、 例えば、 グリオキシル酸などの α—ジケトン類を反応 （好ましくは、 硫酸銅などの遷移金 属イオンとピリジンなどの塩基の存在下に反応） させた後、 0—フエ二レンジァ ミンなどのジァミン類を用いて加水分解することにより Ν末端のメチォニンを除 去することも可能である。 〔ァペリンの Ν末端のメチォニンの除去方法〕
本明細書において、 酸化されていてもよいメチォニン残基は、 メチォニン 残基またはその S酸化体を示し、 メチォニン残基の S酸化体としては、 スル ホキシドおよびスルホン体が挙げられる。
Ν末端に酸化されていてもよいメテオニン残基を有するァペリンとして は、
式 CH 3 - S (0) m- (CH 2 ) 2 - CH (NH 2 ) -C0 - X
[式中、 mは 0ないし 2の整数を示し、 Xはァペリンのペプチド鎖を示す。 ] で表されるペプチドが挙げられ、 これらは塩を形成してもよく、 塩としては、 上記したァペリンの塩と同様のものが挙げられる。
N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたは その塩は、 遺伝子工学的に製造された N末端に酸化されていてもよいメチォ ニン残基を有するァペリンまたはその塩であることが好ましい。
上記式中、 mとしては 0が好ましい。 また、 Xで示されるァペリンのぺプ チド鎖としては上記したァペリンが挙げられる。
上記のァペリンまたはその塩は、 N末端の酸化されていてもよいメチォ二 ン （M e t ) 残基または該メチォニン残基のジケトン体の除去工程に付す前 あるいは後にリフォールデイング （活性化、 再生化） を行うことができる。 本明細書において、 N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基のジケ トン体を有するァペリンまたはその塩とは、 式 CH 3 - S (0) m- (CH 2) 2 - CO- CO - X
[式中、 mは 0ないし 2の整数を示し、 Xはァペリンのペプチド鎖を示す。] で表される化合物またはその塩を示す。 N末端に酸化されていてもよいメチ ォニン残基のジケトン体を有するァペリンまたはその塩は、 化学反応または 酵素反応等各種反応により得ることができる。 例えば、 N末端に酸化されて いてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたはその塩をひ —ジケトン 類と反応させるアミノ基転移反応により、 N末端に酸化されていてもよいメ チォニン残基のジケトン体を有するァペリンまたはその塩を得ることがで さる。
本明細書において、 α—ジケトン類は、 上記したァペリンまたはその塩の アミノ基転移反応を進行させうるものであれば何れでもよく、 例えば式 R 1 - C O - C O - R 2 [式中、 R 1は水素またはカルボキシル基で置換されてい てもよい低級アルキルもしくはフエニル基 （好ましくは水素またはメチル、 さらに好ましくは水素） を示し、 R 2は水酸基、 低級アルコキシ基または低 級アルキルで置換されていてもよいアミノ基 （好ましくは水酸基） を示す。 ] で表される化合物またはその塩などが挙げられる。
上記式中、 R 1で示される低級アルキル基としては、 メチル、 ェチル、 プ 口ピル、 i —プロピル、 ブチル、 i —ブチル、 s e c—ブチル、 t 一ブチル などの炭素数 1ないし 6程度のアルキル基などが挙げられ、 R 2で示される 低級アルコキシ基としては、 メトキシ、 エトキシ、 プロボキシ、 i 一プロボ キシ、 ブトキシ、 i—ブトキシ、 s e c—ブトキシ、 t _ブトキシなどの炭 素数 1ないし 6程度のアルコキシ基などが挙げられる。 また、 R 2で示され る低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基としては、 前記した R 1で 示される低級アルキル基を 1ないし 2個有していてもよいアミノ基などが 挙げられる。 さらに、 塩としては、 上記した N末端に酸化されていてもよい メチォニン残基を有するァペリンの塩と同様なものが挙げられる。
α—ジケトン類の具体例としては、 グリオキシル酸、 ピルビン酸、 ォキサ ル酢酸、 フエニルダリオキシル酸、 2—ォキソダルタル酸などが挙げられる が、 なかでも、 グリオキシル酸が好ましく用いられる。 α—ジケトン類は塩を形成していてもよく、 ナトリウム塩、 カリウム塩な どのアル力リ金属塩、 塩酸塩などの無機酸の塩などがあげられる。
Ν末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたは その塩と α—ジケトン類とのアミノ基転移反応は、 通常、 ァペリンまたはそ の塩 1モルに対して、 1ないし 1万モル （好ましくは 20 0 0ないし 400 0モル） 程度のひ —ジケトン類を、 約 0ないし 7 0°C (好ましくは約 2 0な いし 40°C) で約 1 0分ないし 5時間 （好ましくは約 2 0分ないし 2時間） 反応させるのが好ましい。 上記したアミノ基転移反応を阻害しないものであ れば何れの緩衝液 （例、 リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 クェン酸緩衝液など） を用いてもよいが、 なかでも、 酢酸緩衝液が好ましく用いられる。 また、 反 応の pHは、 約 2ないし 9、 なかでも、 約 4ないし 7、 とりわけ、 約 5ない し 6に調整して反応を進行させるのがよい。
該ァミノ基転移反応を促進するため、 遷移金属イオンの存在下にひージケ トン類を反応させることが好ましく、 通常、 ひージケトン類 1モルに対して、 0. 0 0 1ないし 0. 1モル （好ましくは 0. 0 1ないし 0. 0 5モル） 程度の 遷移金属イオンを用いるのが好ましい。 遷移金属イオンとしては、 例えば、 銅イオン （Cu +， Cu 2+) 、 コバルトイオン （Co 2+， Co 3+) 、 ニッケルィォ ン （Ni 2+, Ni 3+) 、 鉄イオン （Fe 2 + , Fe 3+) 、 亜鉛イオン （Zn 2+) 、 ァ ルミニゥムイオン （A1 3+) 、 マンガンイオン （Mn 2+など） 、 ガリウムィォ ン （Ga 3+) 、 インジウムイオン （In 3+) 、 マグネシウムイオン （Mg 2+) 、 カルシウムイオン （Ca 2+) などを用いることができるが、 なかでも、 銅ィォ ン、 コバルトイオンなど、 とりわけ、 銅イオン （Cu 2+) が好ましく用いられ る。 これらの遷移金属イオンは、 通常、 硫酸、 硝酸、 塩酸、 過塩素酸などの 無機酸との塩または酢酸、 シユウ酸、 クェン酸、 炭酸などの有機酸との塩と して、 反応溶媒に添加することができ、 なかでも、 硫酸銅、 酢酸銅、 とりわ け、 硫酸銅が好ましく用いられる。
また、 塩基の存在下にひ —ジケトン類を反応させることが好ましく、 通常、 ひージケトン類 1モルに対して、 0. 1ないし 20モル （好ましくは 0. 5な いし 1 0モル） 程度の塩基を用いるのが好ましい。 塩基としては、 例えば、 トリェチルァミン、 トリプチルァミンなどのアルキルアミン類、 N , N—ジ メチルァニリン、 ピリジン、 ルチジン、 コリジン、 4— (ジメチルァミノ） ピリジン、 イミダゾールなどの芳香族ァミン類などを用いることができるが、 なかでも、 ピリジンが好ましく用いられる。
また、 アミノ基転移反応の際に、 N末端に酸化されていてもよいメチォ二 ン残基を有するァペリンまたはその塩、 および該ァペリンまたはその塩のァ ミノ基転移反応で得られるメチォニン残基のジケトン体を有するァペリン またはその塩の沈殿防止などを目的として、 アミノ基転移反応のための緩衝 液中に尿素を添加することが好ましい。 例えば、 緩衝液中に尿素を好ましく は約 1ないし 8 M、 より好ましくは約 3ないし 6 Mの濃度になるよう添加す ることが好ましい。
さらに、 上記したアミノ基転移反応は、 遷移金属イオンおよび塩基の存在 下にひージケトン類を反応させることが好ましく、 実用的には、 遷移金属ィ オン、 塩基およびひージケトン類の 3成分 （例えば、 硫酸銅、 ピリジンおよ びダリオキシル酸など） を含有する混合液を、 N末端に酸化されていてもよ いメチォニン残基を有するァペリンまたはその塩を含有する水溶液に添加 して、 アミノ基転移反応を進行させる。
該ァミノ基転移反応により得られる、
式 CH 3 - S (0) m- (CH 2 ) 2 - CO- CO- X
[式中、 mは 0ないし 2の整数を示し、 Xはァペリンのペプチド鎖を示す。] で表される化合物またはその塩 （メチォニン残基のジケトン体を有するアベ リンまたはその塩） は、 ペプチドまたは蛋白質の公知精製手段、 例えば、 抽 出、 塩析、 分配、 再結晶、 クロマトグラフィーなどにより、 反応溶液から単 離 ·精製することもできるが、 そのまま次の加水分解反応に付すこともでき る。
アミノ基転移反応で得られたメチォニンのジケトン体を有するァペリン またはその塩は、 通常、 塩基による加水分解反応に付して、 N末端の酸化さ れていてもよいメチォニン残基あるいは該メチォニン残基のジケトン体を 有していないァペリンまたはその塩に変換することができる。 加水分解反応に用いる塩基としては、 例えば、 システアミン、 トリェチル ァミン、 トリプチルァミンなどのアルキルアミン類またはその塩、 N , N— ジメチルァニリン、 ピリジン、 ルチジン、 コリジン、 4 _ (ジメチルァミノ） ピリジン、 イミダゾールなどの芳香族ァミン類またはその塩、 o —フエニレ ンジァミン、 トリレン— 3， 4ージァミン、 3 , 4—ジァミノ安息香酸およ びその N—アルキル置換体 （例えば、 N—メチルー 1， 2—フエ二レンジァ ミン、 N—ェチル _ 1， 2—フエ二レンジァミン、 N—イソプロピル一 1， 2 —フエ二レンジァミンなど） 、 2 , 3 —ジァミノフエノール、 4—クロ口 一 o —フエ二レンジァミンなどのジァミン類 （好ましくは芳香族ジァミン類、 なかでも、 3， 4ージァミノ安息香酸およびその N—アルキル置換体 （例え ば、 N—メチル— 1 , 2—フエ二レンジァミン、 N—ェチル— 1， 2—フエ 二レンジァミン、 N—イソプロピル一 1， 2—フエ二レンジァミンなど） ま たはそれらの塩など、 チォセミカルバジド、 アセトンチォセミカルバジド、 フエ二ルチオセミカルバジドなどのチォセミカルバジド類、 セレノセミカル バジド、 アセトンセレノセミカルバジドなどのセレノセミカルバジド類など のァミン類またはその塩などを用いることができるが、 なかでも、 アミン類、 とりわけ、 ジァミン類またはチォセミカルバジド類またはそれらの塩が好ま しく用いられ、 特に、 3 , 4—ジァミノ安息香酸またはその塩が好ましく用 いられる。
加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、 例えば上記の N末端に酸化 されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンの塩と同様のものなど があげられる。
塩基の量は、 通常、 メチォニン残基のジケトン体を有するァペリンまたは その塩 1モルに対して約 1ないし 1万モル、 好ましくは約 2 0 0ないし 3 0 0 0モル、 より好ましくは約 5 0 0ないし 3 0 0 0モルである。 加水分解反 応は、 通常、 約 0ないし 7 0 °C (好ましくは約 2 0ないし 4 0 °C) で約 1時 間ないし 7日間 （好ましくは約 1 0時間ないし 5日間） で進行させるのが好 ましい。 反応には、 緩衝液を溶媒として用いることが好ましく、 緩衝液とし ては、 例えば、 リン酸系緩衝液、 酢酸系緩衝液、 クェン酸系緩衝液、 ぎ酸系 緩衝液などが挙げられる。 上記した加水分解反応を阻害しないものであれば 何れの緩衝液を用いてもよいが、 なかでも、 酢酸—ぎ酸ナトリウム、 ぎ酸一 ぎ酸ナトリゥムまたはぎ酸一酢酸ナトリゥム緩衝液などのぎ酸系緩衝液が 好ましく用いられる。 また、 反応の p Hは、 約 2ないし 9、 なかでも、 約 3 ないし 7、 とりわけ、 約 4ないし 6に調整して、 反応を進行させるのがよい。 これらの緩衝液は、 好ましくは約 0 . l〜8 mo l/L、 より好ましくは約 0 . 5〜6 mo l/L用いられる。
また、 加水分解の際に、 N末端の酸化されていてもよいメチォニン残基の ジケトン体を有するァペリンまたはその塩および加水分解反応により生成 する該メチォニン残基を有していないァペリンまたはその塩の沈殿防止等 を目的として、 加水分解反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好ま しい。 例えば、 緩衝液中に尿素を、 好ましくは約 1ないし 6 M、 より好まし くは約 2ないし 5 Mの濃度になるよう添加することが好ましい。
このようにして得られるァペリンまたはその塩は、 公知の精製手段、 例え ば、 抽出、 塩析、 分配、 再結晶、 クロマトグラフィーなどにより、 反応溶液 から単離 ·精製することもできる力 好ましい例として、 例えば、 S P—セ ファロース （フアルマシア バイオテク（株）） あるいは、 D E A E— 5 P W (東ソ一（株）） を介したイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製法が 挙げられる。
得られるァペリンは、 必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることもでき る。 凍結乾燥に際しては、 ソルビトール， マンニトール， デキストロース， マル トース， トレハロ一ス， グリセロールなどの安定化剤を加えることができる。 本発明の方法で製造されるァペリンまたはその塩は滅菌水， ヒ卜血清アルブミ ン（H S A)， 生理食塩水その他公知の生理学的に許容される担体と混合すること ができ、 哺乳動物 （例、 ヒ卜） に対して非経口的に又は局所に投与することがで きる。 たとえば、 その 1日投与量は 1人あたり、 約 0. 0 l mg— 5 0 mg、 好ましく は、約 0. l mg- 1 O mgを、静注または筋注などにより非経口的に投与することが できる。
本発明の方法で製造されるァペリンまたはその塩を含有する製剤は、 塩， 希釈 剤， アジュバント， 他の担体， バッファー， 結合剤， 界面活性剤， 保存剤のよう な生理的に許容される他の活性成分も含有していてもよい。 非経口的投与製剤は、 滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液アンプル、 または生理学的 に許容される希釈液で用時希釈して使用しうる滅菌粉末 (通常べプチド溶液を凍 結乾燥して得られる）アンプルとして提供される。
本発明の製造法によって得られるァペリンは中枢神経機能調節作用、 循環機能 調節作用、 免疫機能調節作用、 消化器機能調節作用、 代謝機能調節作用あるいは 生殖器機能調節作用などに関与していることから、 たとえば老人性痴呆、 脳血管 性痴呆、 系統変成型の退行変成疾患 （例：アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ピック病、 ハンチントン病など） に起因する痴呆、 感染性疾患 （例：クロイツフ エルトーヤコブ病などの遅発ウィルス感染症など） に起因する痴呆、 内分泌性 · 代謝性 ·中毒性疾患 （例：甲状腺機能低下症、 ビタミン B 1 2欠乏症、 アルコー ル中毒、 各種薬剤 ·金属 ·有機化合物による中毒など） に起因する痴呆、 腫瘍性 疾患 （例：脳腫瘍など） に起因する痴呆、 外傷性疾患 （例：慢性硬膜下血腫など） に起因する痴呆などの痴呆、 鬱病、 多動児 （微細脳障害） 症候群、 意識障害、 不 安障害、 精神分裂症、 恐怖症、 成長ホルモン分泌障害 （例：巨人症、 末端肥大症 など） 、 過食症、 多食症、 高コレステロール血症、 高グリセリド ώ症、 高脂血症、 高プロラクチン血症、低血糖症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、糖尿病（例： 糖尿病性合併症、 糖尿病性腎症、 糖尿病性神経障害、 糖尿病性網膜症など） 、 癌 (例：乳癌、 リンパ性白血病、 肺癌、 膀胱癌、 卵巣癌、 前立腺癌など） 、 滕炎、 腎疾患 （例：慢性腎不全、 腎炎など） 、 ターナ一症候群、 神経症、 リウマチ関節 炎、 脊髄損傷、 一過性脳虚血発作、 筋萎縮性側索硬化症、 急性心筋梗塞、 脊髄小 脳変性症、 骨折、 創傷、 アトピー性皮膚炎、 骨粗鬆症、 喘息、 てんかん、 不妊症、 動脈硬化、 肺気腫、 肺水腫または乳汁分泌不全などの疾病の治療 ·予防剤として 用いることができる。 さらに催眠鎮静剤、 手術後の栄養状態改善剤、 昇圧剤、 降 圧剤などとしても用いることができる。
加えて、 H I V感染症、 エイズ （A I D S (Acqui red Immune Def ic i ency Syndrome) ：後天性免疫不全症候群） などの治療 ·予防剤として用いることがで さる。 本明細書および図面において、 アミノ酸， ペプチド， 保護基， 活性基， その他 に関し略号で表示する場合、 それらは I UP AC— I UB (Commission on Biochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分野における慣用略号に基 づくものであり、 その例を次にあげる。 また、 アミノ酸などに関し光学異性体が ありうる場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
RNA リボ核酸
EDTA エチレンジァミン四齚酸
Gly
Ala ァラニン
Val バリン
Leu
I le
Ser セリン
Thr スレオニン
Met メチォニン
Glu グルタミン酸
Asp ァスパラギン酸
Lys リジン
Arg アルギニン
His ヒスチジン
Phe フェニールァラニン
Tyr チロシン
Trp トリブトファン
Pro プロリン Asn ：ァスパラギン
Gin ：グルタミン
Cys ： システィン
ATP ：アデノシン三リン酸
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号： 1] ァペリン— 36のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 2] ァペリン一 36をコードする遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号： 3] b FGF CS 23ムティンのアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 4]式 （I)で表される融合蛋白質をコードする遺伝子の断片の塩基 配列を示す。
[配列番号： 5] 式 （I)で表される融合蛋白質をコードする遺伝子の断片の塩基 配列を示す。
[配列番号： 6] hbFGFムティン CS 23の断片をコードする遺伝子の塩基 配列を示す。
[配列番号： 7] 実施例 1においてァペリンー 36の構造遺伝子の調製に用いたプ ライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 8] 実施例 1においてァペリン一 36の構造遺伝子の調製に用いたプ ライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 9] 実施例 1においてァペリン一 36の構造遺伝子の調製に用いたブ ライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 10] 実施例 1においてァペリン— 36の構造遺伝子の調製に用いた プライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 1] 実施例 1においてァペリン一 36の構造遺伝子の調製に用いた プライマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 12] 実施例 1においてァペリン— 36の構造遺伝子の調製に用いた プライマーの塩基配列を示す。 実施例
以下に実施例をあげて、 本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。 実施例 1 ヒトァペリン一 36構造遺伝子の調製
図 2に示す 6種類の DN A断片 （#1， #5： グライナ一 ·ジャパン社、 #2, #6：キ コ一テック社、 #3, #4：アマシャム 'フアルマシア 'バイオテク） を用いてァペリ ンー 36の構造遺伝子を調製した （図 3) 。
a) DNAオリゴマーのリン酸化
5'末端になるべき #1及び #6を除いた 4種類のオリゴマー各 1 gを 100 L のリン酸化反応液 [50mMTris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, ImM スペルミジン、 10mM ジチオスレィ ] ル、 0. lmg/mLゥシ血清アルブミン、 ImM ATP、 10ユニット T4 ポリヌクレオチドキナーゼ （日本ジーン） ] 中で 37°C、 1時間反応させ、 5'末端 のリン酸化を行った。 フエノール処理を行った後、 水層を回収し 2倍量のェ夕ノ ールを加え、 一 70 に冷却した後、 遠心で DNAを沈殿させた。
b) DNAフラグメントの連結
上記 a)で得られたリン酸化 DNAフラグメントと #1及び Π各 1 gを合わせ 120 Lとした。 この混合液を 80 で 10分間保った後、 室温まで徐冷しァニーリン グを行った。 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲーショ ン反応を行った。 アニーリング液 30 / Lに II液 30 Lを加え良く混合した後、 I液 60 ； u Lを加え、 37°C、 1時間反応させ、 ライゲーシヨンを行った。 フエノ一 ル処理を行った後、水層を回収し 2倍量のエタノールを加え、 -70°Cに冷却した後、 遠心で DNAを沈殿させた。
c) 5'末端のリン酸化
沈殿を TE緩衝液（lOmMTris- HC1 (pH8.0), lmMEDTA) 10 Lに溶解し、 100 j Lのリン酸化反応液 [50mM Tris- HC1 (pH7.6), lOmM MgCl2, ImM スペルミジン、 lOmM ジチオスレィトール、 0. lmg/mLゥシ血清アルブミン、 lmMATP、 10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ （日本ジーン） ] 中で 37° (：、 1時間反応させ、 5'末 端のリン酸化を行った。 フエノール処理を行った後、 水層を回収し 2倍量のエタ ノールを加え、 _70°Cに冷却した後、 遠心で DNAを沈殿させ、 20 の丁£緩衝 液に溶解した。 実施例 2 ヒトァペリン一 36発現プラスミドの調製
PTB960-2 (EP-A- 499990：小山ら、 ジャーナル ·ォブ ·バイオテクノロジー、 32 巻、 273頁、 1 9 94年） を Xbal及び Avalで消化し、 1%ァガロース電気泳動を 行い約 4.4Kbpの DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社） を用い て抽出し、 25 Lの TE緩衝液に溶解した。 この PTB960-2の Xbal, Aval断片と 上記により調製したヒトァペリン— 3 6の構造遺伝子を TaKaRa DNA Li gat ion Ki t ver.2 (宝酒造） を用いてライゲーシヨン反応を行った。 すなわち PTB960-2の Xbal, Aval断片溶液 1 /z Lとヒトァペリン一 3 6の構造遺伝子溶液 4 Lを混合 し、 I液 5 Lを加え、 16°C、 30分間反応させ、 ライゲーシヨンを行った。 ライ ゲーシヨン液 10 Ai Lを用いて E. coli l 09コンビテントセル （東洋紡） を形 質転換し、 10 g lのテトラサイクリンを含む LB寒天培地上に播き、 37 で 1 日培養し、 生じたテトラサイクリン耐性コロニーを選んだ。 この形質転換体を L B培地でー晚培養し、 Q!Aprep8 Miniprep Kit (キアゲン社） を用いてプラスミ ド PTB960-13を調製した。 このヒトァペリン— 36構造遺伝子部分の塩基配列を アプライドバイオシステムズ社モデル 377 DNAシークェンサ一を用いて確認し た。 プラスミド PTB960- 13を大腸菌 BL21 (DE3)株 (Novagen社) に形質転換を行い、 10 u g/mLのテトラサイクリンを含む LB寒天培地上に播き、 37°Cで 1 日培養し、 ヒトァペリンー 3 6-CS23融合蛋白質発現株 BL21(DE3)/pTB960 - 13を得た（図 4)。 この形質転換大腸菌 BL21 (DE3)/pTB960-13は受託番号 FERM BP- 6590で 1998年 12 月 2日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。 また 1998 年 11月 11 日付で受託番号 IF016220として財団法人発酵研究所 （IF0) に寄託さ れた。 実施例 3
実施例 2で得られた形質転換細胞を、 5. OmgZLのテトラサイクリンを含 む LB培地 （1 %ペプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%塩化ナトリウム） 1 Lを用いて、 2リットル容フラスコ中で 3 7°C、 8時間振とう培養した。 得られ た培養液を 1 9リツトルの主発酵培地 （ 1. 6 8 %リン酸 1水素ナトリウム、 0. 3 %リン酸 2水素カリウム、 0. 1%塩化アンモニゥム、 0. 05%塩化ナトリ ゥム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 02%消泡剤、 0. 00025 %硫酸 第一鉄、 0. 00025 %塩酸チアミン、 1. 5%ブドウ糖、 1. 5%カザミノ 酸） を仕込んだ 50L容発酵槽へ移植して、 30°Cで通気撹拌培養を開始した。 培養液の濁度が約 500クレツト単位になった時点で、 ィソプロピル一 /3— D— チォガラクトビラノシドの最終濃度が 12mgZLになるように添加し、 さらに 4時間培養を行った。 培養終了後、 培養液を遠心分離し、 約 660 gの湿菌体を 取得し、 _ 80 で凍結保存した。 実施例 4 ヒトァペリン一 36の取得
実施例 2で得た菌体 550 gに 1 OmM EDTA + 1 mM (p-アミシ'ノフ xニル）メタンス ルホニルフルオリド塩酸塩 （pH6. 0) 溶液 1500mlを加え、 超音波処理 （BRA NSON SON I F I ER MOD E L 450 ) した後、 遠心分離 （ 1000 0 r pm、 60m i n) を行った。 上澄液はプールし、 沈殿は再び同様の操作を 行った。 プールした上澄液は PH6. 0に調整し、 50mM リン酸緩衝液 （pH 6. 0) で平衡化した AF-HeparinToyopearl 650Mカラム（30mmIDX 500mmL、 東ソ ―)に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 100%B (B= 5 OmM リン酸緩衝液 + 2M NaC l、 pH 6. 0) の段階勾配で溶出を行い、 530mlのヒトァ ペリン一 36— CS 23融合タンパク質画分を得た。
この溶出液をペリコンミニカセット （ミリポア社） で 0. 1M酢酸を加えなが ら濃縮を行い、 ヒトァペリン— 36— CS 23融合タンパク質の 0. 1M酢酸溶液 を得た。 この溶液に最終濃度 6Mとなるように尿素を添加した後、 1ーシァノ— 4—ジメチルァミノピリジニゥム塩 （DMAP— CN) 35 mgを加えて、 室温 で 15分間反応した。 反応終了後、 反応液を 10 %酢酸で平衡化した S e ph a d ex G— 25カラム（46mmIDX 600匪 L、 フアルマシア）に通液し、平衡化に用い た 10%酢酸を6：111 1111 nの流速で展開し、 S—シァノ化されたヒトァペリ ン— 36— CS 23融合タンパク質画分を得た。 この溶出液をペリコンミニ力セッ ト （ミリポア社） で濃縮 ·脱塩を行い、 ヒトァペリン— 36— CS 23融合タンパ ク質の脱塩液を得た。 この脱塩液に最終濃度 6 Mとなるように尿素を添加した後、 さらに、 0. 06 N濃度となるように IN苛性ソーダを加え、 0°Cで 15分間反 応した。 反応終了後、 酢酸で pH6. 0に調整し、 ヒトァペリン— 36を得た。 こ の反応液を 3 M尿素を含む 5 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 5) で平衡化した S P- 5 PW(21.5mmIDX150删 L、東ソ一）に通液し、吸着、洗浄した後、 0— 40 % B (B= 5 OmM リン酸緩衝液 + 1 M NaC 1 + 3 M尿素、 p H 6. 5) の段 階勾配で溶出を行い、 ヒトァペリン一 36を画分を得た。 このヒトァペリン— 36 画分を、 さらに 0. 1%トリフルォロ酢酸 （TFA) で平衡化した C 4 P— 50 (21.5imnIDX300誦 L、昭和電工）に通液し、吸着、洗浄した後、 15— 30%B (B： 80%ァセトニトリル Z 0. 1 %TFA) の段階勾配で溶出を行い、 ヒトァペリン -36画分をプールした後、凍結乾燥を行い、 ヒトァペリン一 36凍結乾燥粉末を得 た。
a) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L— 8500A Amino Acid Analyzer) を用いて決定した。
その結果、 N末端にメチォニンの付加したヒトァペリン— 36の DN A塩基配列か ら予想されるアミノ酸組成と一致した （表 1) 。
(表 1)
ァミノ酸組成分析
1モル当たりの ヒトァペリン— 36の塩基配列 アミノ酸 残 基 数 から予測される値
A s X 1 0
Th r 1) 0 0
S e r 1) 1 9 2
G 1 x 3 0 3
P r o 5 7 6
G 1 y 5 7 6
A 1 a 0 0
Cy s 2) N. D. 0 Va 1 0
Me t 2 0
I 1 e 0 0
Le u 2 0 2
Ty r 0 0
Ph e 1 9 2
H i s 1. 0
L y s 8 2
Ar g 7 3 8
T r p 0 9
酸加水分解 （6 N 塩酸一 4%チォグリコール酸、 1 10°C、 24, 48時間 加水分解）
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出 b)N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー （アプライドバイオシステ ムズ モデル 477 A) を用いて決定した。 その結果、 得られたヒトァペリン一 36の N末端にはメチォニンが付加していることのほかは DNA塩基配列から予 想される N末端アミノ酸配列と一致した （表 2) 。
(表 2)
N末端アミノ酸配列 検出された ヒトァペリン- 36の塩基配列 残基 No PTH 1 ) -アミノ酸 から予測される
、ρπιο0 アミノ酸
Me t (526)
2 Le u (648) Leu
3 Va 1 (513) V a 1 4 G 1 n (437) G 1 n
5 P r o (463) P r o
6 A r g (216) A r g
7 G 1 y (232) G 1 y
8 S e r (129) S e r
9 A r g (129) A r g
10 A s n (142) A s n
1 1 G 1 y (185) G 1 y
12 P r o (219) P r o
13 G 1 y (202) G 1 y
14 P r o (188) P r o
1 T r n o o r n
16 G 1 n (116) G 1 n
17 G 1 y (120) G 1 y
18 G 1 y (72) G 1 y
19 A r g (56) A r g
20 A r g (40) A r g
1 nmo 1を用いて分析を行った
1) フェニ- c) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立 L— 850 OA Amino Acid Analyzer) を用いて分析した （表 3)
(表 3)
C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸 回収率
ヒトァペリン一 36 (%)
P h e 38. 6 気相ヒドラジン分解法 （ 100 °C、 6時間）
以上の結果から実施例 4で得られたヒトァペリン一 36は、その N末端にメチォ ニンが付加した分子種 （Me t—ヒトァペリン— 36) であることがわかった。 実施例 5 (生物活性測定）
実施例 4で取得した Me t—ヒトァペリン— 36を用いて、 WO 99/339 76の実施例 6に記載の方法 （サイトセンサー） で活性を測定し、 合成品と同等 の活性を有することを確認した。 実施例 6 (N末端のメチォニン残基の除去：その 1 )
実施例 4で取得した Me t—ヒトァペリン— 36 4mgを 3M尿素溶液 0.8m 1に溶解した後、 80mM硫酸銅 0. 05m l、 ダリオキシル酸 0. 046 g、 ピリジン 0. 1m lの混合液を加え、 25 で 1時間反応した。 反応終了後、 反 応液を 2. 5 M尿素 + 10 mMリン酸緩衝液（ p H 5. 5) で平衡化したセフアデ ックス （S e ph ad e x) G— 25カラム （lOmmlDX 250mmL) に通液し、 平衡 化に用いた溶液を 0. 5m 1 分の流速で展開し、 Me t—ヒトァペリン一 36の ジケトン体画分をプールした。 続いてこの画分に等量の 4 M酢酸、 4 M酢酸ナト リウム、 3 M尿素溶液を加えた後、 o-フエ二レンジアミンを 4 OmM濃度になる ように添加して、 脱気、 窒素ガスシールを行い、 25 で 5日間反応した。 反応 終了後、 反応液を 5 OmMリン酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡化したセフアデッ クス G— 25カラム （25imnIDX 600mniL) に通液し、 平衡化に用いた緩衝液を 4 m 1 分の流速で展開し、 N末端にメチォニンの付加していないヒトァペリン _36 画分をプールした。 プ一ルしたヒトァペリン一 36画分を pH 6. 0に調整し、 5 01111^リン酸緩衝液+0. 3M NaC 1 +2. 5：\1尿素 （131^5. 0 ) で平衡化 した CM— 5 PW (7.5咖^ 75議し 東ソ一 （株）） に吸着した後、 0— 100 % B (B= 501111^ほぅ酸緩衝液+0. 3M NaC 1 +2. 5M尿素、 pH9. 0) の段階勾配で 40分間、 0. 8m 1 /分の流速で溶出を行い、 ヒトァペリン— 36 画分をプールした。さらに、 ヒトァペリン一 36を 0. 1 %TFAで平衡化した C 4P— 50 (10mmIDX 250mmL, 昭和電工 （株） ） に吸着した後、 1 5— 30%B (B=80%ァセトニトリル /0. 1 %TFA) の段階勾配で 40分間、 2 ml/ 分の流速で溶出した。 ヒトァペリン— 36のフラクションをプールした後、 凍結 乾燥を行い、 ヒトァペリン— 36を取得した。
a) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L— 8500A Amino Acid Analyzer) を用いて決定した。
その結果、 ヒトァペリン— 36の DNA塩基配列から予想されるアミノ酸組成 と一致した （表 4) 。
(表 4)
アミノ酸組成分析
1モル当たりの ヒトァペリン一 36の塩基配歹 IJ アミノ酸 残 基 数 から予測される値
A s X 0 1
Th r 1 ) 0 0
S e r 1) 1 8 2
G 1 3 0 3
P r o 5, 7 6
G 1 y 5, 6 6
A 1 a 0 0
Cy s 2) N. D. 0
Va 1 1. 0 1
Me t 1. 0 1
I 1 e 0 0
Le u 2, 0 2
Ty r 0 0
Ph e 8 2
H i s 0
L y s 8 A r g 7. 2 8
Tr p 0. 9
酸加水分解 （6N 塩酸— 4%チォグリコール酸、 10T：、 24， 48時間 加水分解）
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出 b)N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー （アプライドバイオシステ ムズ モデル 477 A) を用いて決定した。 その結果、 得られたヒトァペリン一 36の DN A塩基配列から予想される N末端アミノ酸配列と一致した （表 5) 。
(表 5)
N末端アミノ酸配列 検出された ヒトァペリン一 36の塩基配歹 ij 残基 No PTH 1 ) -アミノ酸 から予測される
ΐηοΐ) アミノ酸
1 L e u (570) Le u
2 Va 1 (611) Va 1
3 G 1 n (594) G 1 n
4 P r o (587) P r o
5 A r g (332) A r g
6 G 1 y (552) G 1 y
7 S e r (255) S e r
8 Ar g (277) Ar g
9 A s n (345) A s n
10 G 1 y (383) G 1 y
P r o (383) P r o
2 G 1 y (366) G 1 y 13 P r o (318) P r o
14 T r p (131) Tr p
15 G 1 n (210) G 1 n
16 G 1 y (218) G 1 y
17 G 1 y (281) G 1 y
18 Ar g (130) Ar g
19 A r g (190) Ar g
20 L y s (144) L y s
lnmolを用いて分析を行った。
1) フェニー c) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立 L— 850 OA Amino Acid Analyzer) を用いて分析した （表 6) 。
(表 6)
C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸 回収率
ヒトァペリン一 36 (%)
P h e 66. 3
気相ヒドラジン分解法 （100で、 6時間） 実施例 7 (生物活性測定）
実施例 6で取得したヒトァペリン— 36を用いて、 W〇 99Z33976の実 施例 6に記載の方法 （サイトセンサー） で活性を測定し、 合成品と同等の活性を 有することを確認した。 実施例 8 (N末端のメチォニン残基の除去：その 2)
実施例 4で取得した Me t—ヒトァペリン一 36 4mgを 3M尿素溶 液 0. 8m lに溶解した後、 80mM硫酸銅 0. 05m l、 グリオキシル 酸 0. 046 g、 ピリジン 0. 1m lの混合液を加え、 25 で 1時間反 応した。 反応終了後、 反応液を 2. 5M尿素 + 1 OmMリン酸緩衝液（pH 5. 5) で平衡化したセフアデックス （S e p h a d e x) G— 25カラム (10mmIDX 250mmL) に通液し、 平衡化に用いた溶液を 0. 5m 1 Z分の流速 で展開し、 メチォニン残基のジケトン体を有するヒトァペリンー 36画分を プールした。 続いてこの画分に等量の 2 Mギ酸ナトリウム、 4M酢酸、 3M 尿素溶液を加えた後、 3, 4—ジァミノ安息香酸を 4 OmM濃度になるよう に添加し、 30でで 3日間反応した。 反応終了後、 反応液を 5 OmMリン酸 緩衝液 （pH6. 0) で平衡化したセフアデックス G— 2 5カラム （25mmID X 600mmL) に通液し、 平衡化に用いた緩衝液を 4 m 1 分の流速で展開し、 N末端にメチォニン残基を有していないヒトァペリン一 36画分をプール した。 プールしたヒトァペリン一 36画分を p H 6. 0に調整し、 5 OmM リン酸緩衝液 + 0. 3M Na C 1 + 2. 51^1尿素 （13^15. 0 ) で平衡化 した CM— 5 PW (7· 5mmIDX75龍 L、 東ソ一 （株） ） に吸着した後、 0— 1 00 %B (B= 5 OmMほう酸緩衝液 + 0. 3 M N a C 1 + 2. 5 M尿素、 H 9. 0) の段階勾配で 40分間、 0. 8m 1 /分の流速で溶出を行い、 ヒトァペリン一 36画分をプールした。 さらに、 ヒトァペリン一 36を 0. 1 %TFAで平衡化した C4 P - 50 (10匪 IDX 250mmL、 昭和電工 （株） ） に吸着した後、 1 5— 30 %B (B = 80 %ァセトニトリルノ 0. 1 %T F Α) の段階勾配で 40分間、 2 ml/分の流速で溶出した。 ヒトァペリン— 36のフラクションをプールした後、 凍結乾燥を行い、 ヒトァペリン— 36 を取得した。
a) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L一 8500 A Amino Acid
Analyzer) を用いて決定した。
その結果、 ヒトァペリンー 36の DNA塩基配列から予想されるアミノ酸 組成と一致した （表 7) 。
(表 7) アミノ酸組成分析 モル当たりの '-36の塩基配列 アミノ酸 残 基 数 から予測される値
A s X 0 1
Th r 1) 0 0
S e r 1) 9 2
G 1 x 2 9 3
P r o 6 3 6
G 1 y 5 9 6
A 1 a 0 0
C y s 2) N. D. 0
Va 1 1. 0
Me t
I 1 e 0 0
Le u 2 0 2
Ty r 0 0
P h e 9 2
H i s 0 1
L y s 9 2
A r g 7 6 8
T r p 一 0 9
酸加水分解 （6 N 塩酸— 4%チォグリコール酸、 110°C、 24， 48時間 加水分解） -
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出 b)N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー （アプライドバイオシ ステムズ モデル 47 7 A) を用いて決定した。 その結果、 得られたヒトァ ペリンー 3 6の DNA塩基配列から予想される N末端アミノ酸配列と一致 した （表 8) 。
(表 8)
N末端アミノ酸配列 検出された '- 36の塩基配列 残基 No PTH 1) -アミノ酸 から予測される
、
(pmol) ア ノ酸
1 L e u (475) L e u
o V a 1 (845； V a 1
Vjr 1 n W βo [o；、 J 1 n
A T O 0Όό) r I O
c:
Ό Λ 、 W Λ rr
yj Vjr l y \¾ ώ*±ノ CI 1
7 S e r (1つ3 η9ヽ
； S e r
8 A r g (423) A r g
9 A s n (245) A s n
10 G 1 y (290) G 1 y
1 1 P r o (197) P r o
1 2 G 1 y (234) G 1 y
1 3 P r o (197) P r o
14 Tr p (lOl) T r p
1 5 G 1 n ( 76) G 1 n
16 G 1 y 84) G 1 y
1 7 G 1 y :130) G 1 y
1 8 A r g ： 79) A r g
1 9 A r g ( :116) A r g
20 L y s ( 43) L y s lnmolを用いて分析を行った。
1) フエ二一ルチオヒダントイン c) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L— 8 5 00 A Amino Acid Analyzer) を用いて分析した （表 9 ) 。
(表 9)
C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸 回収率
ヒトァペリン一 36 ( )
Ph e 86. 6
気相ヒドラジン分解法 （ 100 ：、 6時間） 実施例 9 (生物活性測定）
実施例 8で取得したヒトァペリン一 3 6を用いて、 W〇 99/33976 の実施例 6に記載の方法 （サイ トセンサー） で活性を測定し、 ヒトァペリン - 3 6の合成品と同等の活性を有することを確認した。 産業上の利用可能性
本発明の製造方法を用いると、 たとえば老人性痴呆、 脳血管性痴呆、 系統変成 型の退行変成疾患 （例：アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ピック病、 ハンチ ントン病など） に起因する痴呆、 感染性疾患 （例：クロイツフェルト一ヤコブ病 などの遅発ウィルス感染症など） に起因する痴呆、 内分泌性 ·代謝性 ·中毒性疾 患（例：甲状腺機能低下症、 ビタミン B 12欠乏症、 アルコール中毒、 各種薬剤 · 金属 ·有機化合物による中毒など） に起因する痴呆、 腫瘍性疾患 （例：脳腫瘍な ど） に起因する痴呆、 外傷性疾患 （例：慢性硬膜下血腫など） に起因する痴呆な どの痴呆、 鬱病、 多動児 （微細脳障害） 症候群、 意識障害、 不安障害、 精神分裂 症、 恐怖症、 成長ホルモン分泌障害 （例：巨人症、 末端肥大症など） 、 過食症、 多食症、 高コレステロール血症、 高グリセリ ド血症、 高脂血症、 高プロラクチン 血症、 低血糖症、 下垂体機能低下症、 下垂体性小人症、 糖尿病 （例：糖尿病性合 併症、 糖尿病性腎症、 糖尿病性神経障害、 糖尿病性網膜症など） 、 癌 （例：乳癌、 リンパ性白血病、 肺癌、 膀胱癌、 卵巣癌、 前立腺癌など） 、 塍炎、 腎疾患 （例： 慢性腎不全、 腎炎など） 、 ターナー症候群、 神経症、 リウマチ関節炎、 脊髄損傷、 一過性脳虚血発作、 筋萎縮性側索硬化症、 急性心筋梗塞、 脊髄小脳変性症、 骨折、 創傷、 ァトピー性皮膚炎、 骨粗鬆症、 喘息、 てんかん、 不妊症、 動脈硬化、 肺気 腫、 肺水腫または乳汁分泌不全などの疾病の治療 ·予防剤として用いることがで き、 さらに催眠鎮静剤、 手術後の栄養状態改善剤、 昇圧剤、 降圧剤、 H I V感染 症、 エイズ (AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) ：後天性免疫不 全症候群） などの予防および治療薬などとして用いることができるぺプチドをェ 業的かつ大量に製造できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 N末端に 酸化されていてもよいメチォニン残基を有していてもよいァペリンを連結した融 合蛋白質またはべプチドをシスティン残基のアミノ基側のぺプチド結合の切断反 応に付すことを特徴とするアベリンまたはその塩の製造法。
2 . N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 N末端に メチォニン残基を有していてもよいァペリンを連結した融合蛋白質またはべプチ ドをコードする遺伝子を有するベクタ一を保持する形質転換体を培養して融合蛋 白質またはペプチドを発現させ、 発現された融合蛋白質またはペプチドをシステ イン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする N末端 にメチォニン残基を有していてもよいァペリンまたはその塩の製造法。
3 . 切断反応が S—シァノ化反応、 次いで加水分解反応に付す反応である請求 項 1または 2記載の製造法。
4 . ァペリンが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド である請求項 1または 2記載の製造法。
5 . N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 N末端に メチォニン残基を有していてもよいァペリンを連結した融合蛋白質またはべプチ ド。
6 . 請求項 5記載の融合蛋白質またはペプチドをコードする遺伝子を有するベ クタ一。
7 . 請求項 6記載のベクターを含有する形質転換体。
8 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたはそ の塩とひ -ジケトン類を反応させた後、 加水分解することを特徴とする該メチォ ニン残基の除去方法。 9 . N末端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンが遺伝子 工学的に製造されたァペリンである請求項 8記載の方法。
1 0 . 遷移金属イオンの存在下にひージケトン類を反応させることを特徴とす る請求項 8記載の方法。
1 1 . 塩基の存在下にひ—ジケトン類を反応させることを特徵とする請求項 8 記載の方法。
1 2 . 遷移金属イオンおよび塩基の存在下にひ—ジケトン類を反応させること を特徴とする請求項 8記載の方法。
1 3 . ' ひージケトン類がダリオキシル酸またはその塩である請求項 8記載の方 法。
1 4 . 遷移金属イオンが銅イオンである請求項 1 0記載の方法。 1 5 . 塩基がピリジンである請求項 1 1記載の方法。
1 6 . 塩基を用いて加水分解することを特徴とする請求項 8記載の方法。
1 7 . 塩基がアミン類である請求項 1 6記載の方法。
1 8 . 塩基がジァミン類またはチォもしくはセレノセミカルバジド類である請 求項 1 6記載の方法。
1 9 . ジァミン類が o—フエ二レンジァミンまたは 3， 4—ジァミノ安息香酸 である請求項 1 8記載の方法。 2 0 . 遺伝子工学的に製造され、 N末端にメチォニンが付加したァペリンまた はその塩とグリォキシル酸またはその塩とを硫酸銅およびピリジンの存在下に反 応させた後、 0—フエ二レンジァミンまたは 3， 4—ジァミノ安息香酸と反応させ ることを特徴とするァペリンまたはその塩の製造法。 2 1 . 式 C - S (0) n- (CH2) 2- CO- CO- X 〔式中、 mは 0ないし 2の整数を、 Xはァ ペリンのペプチド鎖を示す。 〕 で表される化合物またはその塩。
2 2 . 請求項 2 1記載の化合物を加水分解することを特徴とするァペリンまた はその塩の製造法。
2 3 . N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドの N末端に、 N末端 にメチォニン残基を有するァペリンを連結した融合蛋白質またはペプチドをシス ティン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付し、 N末端に酸化されて いてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたはその塩を得、 さらに、 該 N末 端に酸化されていてもよいメチォニン残基を有するァペリンまたはその塩と α— ジケトン類を反応させた後、 加水分解することを特徴とするアベリンまたはその 塩の製造法。
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