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WO2000059926A1 - Procede de production de sous-unite de peptide issue d'une proteine de polymere - Google Patents

Procede de production de sous-unite de peptide issue d'une proteine de polymere Download PDF

Info

Publication number
WO2000059926A1
WO2000059926A1 PCT/JP2000/002127 JP0002127W WO0059926A1 WO 2000059926 A1 WO2000059926 A1 WO 2000059926A1 JP 0002127 W JP0002127 W JP 0002127W WO 0059926 A1 WO0059926 A1 WO 0059926A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
subunit
protein
subunit peptide
multimeric protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/002127
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Naoyuki Fukuchi
Shunsuke Kageyama
Morikazu Kito
Takashi Kayahara
Hiroshi Yamamoto
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Priority to US09/926,256 priority Critical patent/US7270972B1/en
Priority to AT00913065T priority patent/ATE303400T1/de
Priority to EP00913065A priority patent/EP1172372B1/en
Priority to JP2000609436A priority patent/JP4670150B2/ja
Priority to DE60022336T priority patent/DE60022336T2/de
Priority to AU34586/00A priority patent/AU3458600A/en
Priority to CA002369869A priority patent/CA2369869C/en
Publication of WO2000059926A1 publication Critical patent/WO2000059926A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a subunit peptide derived from a multimeric protein having a disulfide bond within a subunit and between subunits, and a subunit peptide that can be produced by the method.
  • Biological activities require proteins having various physiological activities. Many of these physiologically active proteins have disulfide bonds in the molecule, and many exist as multimers such as dimers composed of the same or different peptide chains, and disulfide bonds between the peptide chains. Is biosynthesized to form Many bioactive proteins that exist as dimers are required to be dimers for expression of biological activities, but proteins that do not necessarily need to be dimers are also known. .
  • PDGF Plater Derived Growth Factor
  • each of the dimeric peptide chains is similarly involved in the expression of the biological activity. It must bind to each peptide chain of the dimeric receptor and must be substantially dimeric (CH Heldin et al., Cell. Regul., 1, 555 -566, 1990).
  • one peptide chain (subunit) has the binding activity to the receptor, the enzymatic activity, etc., and the other peptide chains have the stability and solubility of the protein. Some are considered to be important in the biosynthesis process, etc., and only a single subunit may be essential for substantial physiological activity.
  • activin exists as a homodimer or heterodimer in living organisms, but its binding activity to its receptor has been reported for monomers. It has been reported that it retains a few percent of its biological activity (P. Husken-Hindi et al., J. Biol Chem., 269, 19380-19384, 1994).
  • PTTH protoracicotropic hormone
  • IgG immunoglobulin G
  • some dimeric protein monomers that show physiological activity in vivo have bioactivity even in the monomer, and some proteins that do not show bioactivity in the monomer. Some monomers also bind to their receptors. Therefore, when a protein that exists as a dimer is obtained as a monomer, the protein is bound as a protein having a physiological action, or has no physiological action but binds to a receptor to inhibit the binding of the original bioactive protein. By doing so, it can be considered that it can be used as a protein that inhibits the physiological action of the original bioactive protein.
  • hirudin a protein isolated from leech saliva, is known to bind to thrombin, a coagulation factor in blood, and inhibit its protease activity.
  • Proteins such as disintegrin and CHH-B that bind to the body and inhibit platelet aggregation are known.
  • CHH-B is a protein that binds to glycoprotein lb (GPIb), a glycoprotein on platelet membrane, and inhibits platelet aggregation
  • GPIb glycoprotein lb
  • CHH-B is a heterologous protein. It is a dimer, and it has been reported that its monomer has the same GPIb binding activity and platelet aggregation inhibitory activity as the heterodimer (N. Fukuchi et al., W095 / 08573).
  • monomers of the bioactive proteins as described above which are biosynthesized as dimers, can be used as an action protein (agonist) / action inhibition protein (antagonist), and can be used for various diseases. It is considered useful as a therapeutic.
  • the second problem is the potential for antigenic expression. If a protein that exists as a dimer in the living body is used as a monomer, the region that originally existed inside the molecule is exposed to the outside, so it is recognized as a heterologous protein, and it may have antigenicity. Conceivable. In the method of blocking a thiol group after reduction, which is the first method of preparing a monomer described above, it is conceivable that the compound used for blocking may exhibit antigenicity. In the second method for introducing a mutation, antigenicity due to a partial structure containing the mutated amino acid may be considered. In addition, proteins derived from different animal species also generally have antigenicity, and the expression of the same antigenicity also becomes an issue for monomers.
  • the present invention has been made in view of the above, and among proteins that originally exist as multimers such as dimers, a biologically active subunit is easily obtained as a monomer, and at the same time, its antigenicity is improved.
  • An object of the present invention is to provide a method for lowering the temperature.
  • the present inventor has conducted intensive studies in order to solve the above problems. As a result, when the subnet constituting the multimeric protein is denatured using a protein denaturing agent and the unwinding of the subnet is performed by removing the denaturing agent, the polyethylene having a functional group binding to the cysteine residue is obtained. It has been found that, when unwinding is carried out in the presence of glycol, a monomer peptide having a reduced antigenicity while maintaining the original activity of the subunit is obtained, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a method for producing a subunit peptide derived from a multimeric protein having a disulfide bond within and between subunits comprising the following steps:
  • step (b) The method according to (1), wherein the subunit peptide isolated in step (b) has reduced antigenicity.
  • step (b) The method according to (1), wherein the multimeric protein is a dimer.
  • the biological activity of the multimeric protein depends on the subunit peptide constituting the multimeric protein, and the subunit peptide to which the polyoxyalkylpolyester is bound has the biological activity (1). ) the method of.
  • cysteine residues of the subunit peptide those subunits whose polyoxyalkylpolyester bonds to cysteine residues that are originally involved in the formation of disulfide bonds between the subunits of the multimeric protein, resulting in reduced antigenicity Knit peptide.
  • FIG. 1 is a diagram showing the construction process of vector pTrcASWT expressing wild-type AS1051 (AS1051-WT).
  • FIG. 2 is a diagram showing the construction process of a vector pTrcASAla that expresses a mutant AS105KAS105 cell A1 a) in which a cysteine residue is substituted with an alanine residue.
  • FIG. 3 is a view showing the results of reverse phase HPLC analysis of samples before (a) and after (b) dialysis of AS1051-WT and AS1051-Ala after unwinding.
  • the horizontal axis indicates time, and the vertical axis indicates absorbance (216 ⁇ m), that is, the amount of dissolved protein.
  • FIG. 4 is a diagram showing the platelet count after repeated administration of guinea pigs of AS1051-Ala.
  • FIG. 5 shows the results of detection of anti-AS105-Ala antibody in plasma after repeated administration of AS1051-Ala in guinea pigs.
  • Figure 6 shows the reversed-phase liquid chromatogram of polyethyleneglycolated AS1051 (AS1051-PEG) after digestion with lysyl dendeptidase.
  • FIG. 7 shows ristocetin aggregation inhibitory activity of AS1051-Ala and AS1051-PEG.
  • FIG. 8 shows the activity of AS1051-Ala and AS1051-PEG to inhibit immobilized platelet-vWF binding.
  • FIG. 9 shows the platelet count after repeated administration of guinea pigs of AS105-Ala and AS1051-PEG.
  • the method of the present invention is a method for producing a subunit peptide derived from a multimeric protein having a disulfide bond within and between subunits and preferably having reduced antigenicity.
  • the multimeric protein used in the present invention is a subunit of two or more peptides. And has a disulfide bond in the peptide chain of at least one of the subunits, and has a disulfide bond between the subunits.
  • the multimeric protein examples include those in which the physiological activity of the multimeric protein depends on the subunit peptide constituting the multimeric protein.
  • the multimeric protein may be one whose biological activity is inhibited by a subunit peptide to which a polyoxyalkylpolyester obtained by the method of the present invention is bound.
  • AS 1051-PEG which is an example of the subunit peptide of the present invention shown in the examples, has the same antiplatelet activity as CHH-B, a dimeric peptide derived from snake venom derived from the subunit peptide. Having.
  • AS1051-PEG has a binding activity to platelet glycoprotein similarly to CHH-B which is a dimeric peptide from which AS1051-PEG is derived, and inhibits CHH-B binding.
  • CHH-B is a dimeric peptide from which AS1051-PEG is derived
  • the method of the present invention is a subunit peptide having a disulfide bond in a peptide chain, among the above-described subunit peptides constituting the multimeric protein, wherein the physiological activity or the activity of inhibiting the physiological activity is provided. And preferably a method for obtaining a subunit peptide having reduced antigenicity.
  • reduced antigenicity means that the antigenicity of a subunit peptide obtained by the method of the present invention is lower than the antigenicity of a subunit peptide obtained from a multimeric protein by a conventional method. That means.
  • Conventional methods include, for example, a method in which a multimeric protein is reduced using a reducing agent, and then a free thiol group is alkylated using an alkylating agent to obtain a monomer.
  • a method for producing a subunit peptide in which a cysteine residue involved in a disulfide bond between the amino acid residues is replaced with another amino acid residue as a recombinant protein is exemplified.
  • the multimeric protein to which the present invention can be applied includes two or more peptide subunits, has a disulfide bond in the peptide chain of at least one subunit, and has an intersubunit configuration.
  • a disulfide bond for example, Rus Horidas Horidas (Crotalus horridus orridus), Celestes * Cerastes (Cerastes cerastes), Vipera palestinae, Echis carinatus, Trimereslas azolepo ' ⁇ ⁇ bris' fris tris sur firis f fribris ⁇ fris tris Glycoproteins with glycoprotein Ib binding activity on platelet membranes, contained in snake venoms such as Naja haje, Naja nivea, and Crotarus admanteus, or Bioactive proteins (RM Scarborough, WO 92/08472) such as growth factors and site force proteins.
  • a multimeric protein obtained from a natural product such as snake venom may be used as it is, or a subunit peptide separated from the multimeric protein may be used.
  • a subunit peptide of the subunits constituting the multimeric protein, a subunit peptide having a biological activity or a subunit peptide having an activity of inhibiting the biological activity of the multimeric protein is used.
  • the term “subunit peptide” as used in the present invention means such a unit peptide unless otherwise specified.
  • the subunit peptide may be a recombinant protein produced by a gene recombination technique using DNA encoding the subunit peptide.
  • Cloning of DNA coding for the target subunit peptide can be performed in the same manner as ordinary gene cloning if the full length or a part of the amino acid sequence of the subunit peptide is known.
  • a gene of interest can be synthesized by PCR using primers based on a known nucleotide sequence.
  • the target gene is deposited at a depository institution, it is also possible to obtain the deposited gene.
  • the entire nucleotide sequence of the gene is known, it can be chemically synthesized. If the target subunit peptide cannot be identified from the subunit peptides constituting the multimer, the gene encoding the respective subunit peptide may be cloned.
  • the production as a recombinant protein can be carried out in the same manner as the method usually used for producing a useful protein. That is, a gene encoding a target subunit peptide is inserted into a vector containing an appropriate promoter, a host such as Escherichia coli is transformed with the obtained recombinant vector, and the transformant is cultured to culture the gene. May be expressed. Examples of the host include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast and the like.
  • the promoter may be any one that functions in the host to be used.
  • Examples thereof include lac, trp, tac ;, trc, recA, and T7 (Shinogen Chemistry Laboratory Course 1, Protein, VI synthesis and expression, Japan Biochemical Society, ⁇ 166, Yasue, Matsui, 1992, Tokyo Kagaku Dojin), PG K, ADH1, GPD, MF Hi 1, SUC2, PH05, GAL1 S GAL4 (New Chemistry Experiment Course 1, Protein, VI synthesis) And Expression, edited by The Biochemical Society of Japan, p215, Sakai et al., 1992, published by Tokyo Chemical Dojin.
  • the target subunit peptide itself may be directly expressed, or it may be expressed as a fusion protein with another protein. It may be accumulated in the cells as inclusion bodies, may be accumulated in the cells as a soluble form, or may be secreted outside the cells.
  • the fusion protein include a fusion protein with maltose binding protein (Maltose Binding Protein), glutathione S-transferase (Glutatione S-tranferase), histidine one (His-Tag) and the like.
  • the subunit peptide of a protein that originally exists as a multimer has a cysteine residue that is not involved in disulfide bonds in the subunit, and is rich in hydrophobicity that naturally binds to other subunit peptides.
  • the partial structure is present on the surface, and it is thought that the stability and solubility in solution of the subunit peptide alone are often poor. Poor stability due to the presence of cysteine residues not involved in disulfide bonds in the subunits is due to the fact that cysteine residues originally involved in disulfide bonds between subunits are alanine, This can be avoided by substituting an appropriate amino acid residue having no thiol group such as serine.
  • the gene encoding the subunit peptide is When the solubility and stability of the subunit peptide alone are poor, the subunit peptide may be obtained as an inclusion body or an insolubilized protein.
  • a subunit peptide is obtained from the multimeric protein or the subunit peptide thereof by the steps (a) and (b). Hereinafter, each step will be described.
  • the multimeric protein or its subunit peptide is denatured in a solution using a protein denaturant. Subsequently, in the presence of a polyoxyalkylpolyether having a functional group that reacts with a thiol group, the denaturant is removed from the solution, and the subunit peptide is rewound.
  • the solvent for the solution is generally water.
  • the protein denaturing agent is not particularly limited as long as it can reversibly modify the protein, and examples thereof include guanidine hydrochloride, urea and the like.
  • the concentration of the protein denaturing agent may be any concentration as long as the protein is dissolved. For example, a concentration between 1M and a saturation concentration can be used, and preferably between 2M and 8M.
  • the pH of the solution may be any value, but is preferably between 7 and 12 where the exchange of disulfide bonds and the bonding to the thiol group of polyethylene glycol described below are likely to occur.
  • the temperature of the solution may be any temperature, but preferably between 0 ° C and 40 ° C. The reaction time is appropriately selected.
  • Denaturation may be performed under either reducing or non-reducing conditions.
  • the disulfide bond of the multimeric or subunit peptide may be pre-cleaved using a reducing agent, but this is not essential.
  • a substance containing a cysteine residue such as glucanthione, a reducing agent such as dithiothreitol, an enzyme such as protein disulfide isomerase, etc. can be added. is there.
  • the denaturation is preferably performed under reducing conditions.
  • reducing conditions refers to a substance containing a cysteine residue, a reducing agent, and a protein disulfide isomerase.
  • zeolites and the like which means that the cleavage of disulfide bonds is promoted.
  • the cleavage of the disulfide bond is promoted, so that the reaction with the polyoxyalkylpolyester having a functional group that reacts with the thiol group in the unwinding process is promoted.
  • cleavage of a disulfide bond between subunits is promoted, and therefore, it is particularly preferable to carry out under denaturing conditions.
  • the denaturant is removed from the solution containing the denatured subunit peptide in the presence of a polyoxyalkyl polyether having a functional group that reacts with a thiol group. Removing the denaturant from the solution can be done, for example, by dialysis.
  • a functional group that reacts with a thiol group typically, a maleimide group (RJ Goodson et al., Bio / Technology, 8, 343, 1990), an orthopyridyl disulfide group (M. Yokoyama et al., Biochem. Biophys. Res. Co., 164, 1234, 1989), vinylsulfone group (Shearwater Polymers Inc. Item No. M-VS-5000), etc. Any functional group capable of binding to a thiol group may be used.
  • the polyoxyalkyl polyether include polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyhydroxyethyl glycerol, dextran, and carbohydrate polymer.
  • the molecular weight may be any size, but considering the solubility of the obtained subunit peptide, decreasing the antigenicity or reacting with the subunit peptide, the molecular weight is preferably in the range of 1,000 to 1,000,000, and is preferably in the range of 2,000 to 50,000. The range is more preferred.
  • the polyoxyalkyl polyether as described above may be added to the solution prior to the denaturation, may be added after denaturing the multimeric protein or the subunit peptide, or may be added before removing the denaturant. .
  • the above polyoxyalkyl polyether is added and reacted for a certain period of time, and then the denaturing agent is removed from the solution.
  • the amount of the polyoxyalkyl polyether is preferably an equimolar ratio or more based on the amount of the protein to be reacted.
  • a polyoxyalkyl polyether having a functional group which reacts with a thiol group during or after the modification By reacting with a polyoxyalkyl polyether having a functional group which reacts with a thiol group during or after the modification, the residue of cysteine residue of the subunit peptide is obtained.
  • a polyoxyalkyl polyester is bonded to the group.
  • a natural oxidation air oxidation
  • a polyoxygen having a functional group that reacts with a thiol group is added prior to the step of removing the denaturant from the solution containing the denatured subunit peptide.
  • a natural oxidation air oxidation
  • a polyoxygen having a functional group that reacts with a thiol group is added prior to the step of removing the denaturant from the solution containing the denatured subunit peptide.
  • the subunit peptide to which the polyoxyalkylether formed as described above is bound is isolated from the solution.
  • This procedure is used for ordinary protein purification, that is, commonly used methods such as ion exchange, gel filtration, reverse phase, etc., and chromatographic precipitation, electrophoresis, salting out and other precipitation, desalting, and concentration. Operations can be performed in combination.
  • the desired subunit peptide can be separated from the polyoxyalkyl polyester.
  • the target subunit peptide can be separated from other subunit peptides.
  • polyoxyalkyl polyethers bind to cystine residues that are involved in the formation of disulfide bonds between the subunits of the multimeric protein, resulting in a subunit having reduced antigenicity. Can be separated from other submit peptides.
  • the bonding position of the polyoxyalkyl polyether that binds to the subunit peptide is preferably a cysteine residue forming a disulfide bond between subunits in a multimeric protein. If it has not been determined, it may be any as long as it binds to a specific thiol group, has the desired activity, is stable in solution, and preferably has reduced antigenicity. Also, sub The other disulfide bonds in the unit are desirably the same as the disulfide bonds in the subunit in the original multimer, but may be different as long as they are substantially in the biologically active range. Good.
  • any molecule that can be identified as a single biologically active molecule and exists stably in a solution may be used.
  • the number of polyoxyalkyl polyether molecules bonded per molecule is desirably the same as the number of cysteine residues forming disulfide bonds between subunits in the original dimeric protein. If the number is not determined, the number is such that the obtained monomeric polyoxyalkyl polyetherified protein has biological activity, can be identified as a single molecule, and is stable in solution. Good.
  • the decrease in antigenicity of the obtained monomeric polyoxyalkyl polyetherified subunit peptide is due to the disulfide bond between the subunits in the non-polyoxyalkyl polyetherified subunit peptide or the original multimeric protein. It is sufficient that the antigenicity is substantially reduced as compared with a subunit peptide in which the cysteine residue forming the amino acid is replaced with another amino acid having no thiol group.
  • the obtained polyoxyalkyl polyetherated subunit peptide is used as the minimum necessary for immunization. After administration to animals for a limited number of times, it is sufficient that biological and biochemical reactions due to antigen-antibody reactions do not occur when re-administered.
  • the blood stability of the polyoxyalkyl polyetherified subunit peptide obtained by the method of the present invention is expected to be improved as compared with the case where polyoxyalkyl polyetherification is not performed.
  • CHH-B subunit peptide (H subunit) constituting CHH-B, which is a dimeric peptide contained in snake venom derived from Clonalus and Horidas horidus.
  • CHH-B binds to glycoprotein lb (GPIb), a platelet membrane glycoprotein.
  • Glycoprotein lb is known to be involved in thrombus formation by binding to blood protein von Willebrand factor (vWF) (JP Cean et al., J. Lab. Clin. Med., 87, 586- 596, 1976, K J. Clemetson et al., Thromb. Haemost., 78, 266-270, 1997).
  • vWF von Willebrand factor
  • AS1051 and AS1051-Ala under similar conditions confirmed that the solubility of AS1051 was extremely low.
  • Repeated administration of AS1051-Ala using guinea pigs confirmed thrombocytopenia, which is considered to be due to antigenicity.
  • the AS1051 obtained by the method of the present invention which has not been substituted with a polyethylene glycol-modified amino acid, has high solubility and no reduction in platelets was observed.
  • the peptide of the present invention is a subunit peptide derived from a multimeric protein having a disulfide bond within a subunit and between subunits, and among the cysteine residues of the subunit peptide, the disulfide between the subunits of the multimeric protein is originally used.
  • Such a submit peptide can be obtained, for example, by the method of the present invention described above.
  • the multimeric protein is a dimer having an activity of inhibiting the binding of von Willebrand factor to blood platelets, which is derived from the snake venom of Clostridium holidus Horidas. And those that are body peptides. More specifically, a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which a polyoxyalkyl polyester is bonded to a cysteine residue of amino acid number 81 in the same amino acid sequence, or a derivative thereof is mentioned. . The derivative has one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions at positions other than the cysteine residue of the amino acid number 81, and has antithrombotic properties. Peptides.
  • the peptide as described above retains the same platelet aggregation inhibitory activity as CHH-B, which is the original dimeric protein, or AS1051, which is the monomeric monomer of the subunit, and is a solution such as a buffer solution.
  • AS1051 which has high solubility in non-polyetherified but has antigenicity, whereas it has very low antigenicity.
  • subunit peptides obtained by the method of the present invention those having substantially the same biological action as the original multimeric protein can be used as a pharmaceutical agent as an active substance against the action of the protein. It is possible.
  • the biological action of the multimeric protein is inhibited by a mechanism such as inhibiting the binding between the original multimeric protein and its receptor.
  • Substances having physiological activity can also be used as pharmaceuticals as inhibitors of their action.
  • polyethylene glycolated AS1051 retains the same platelet aggregation inhibitory activity as CHH-B and AS1051, and has no antigenicity in animal administration. can do.
  • the peptide of the present invention may be in a form as it is, or may be a pharmaceutically acceptable salt. These can be used alone or as a mixture of two or more You can also. Further, it may have another active ingredient. Further, other ingredients commonly used in pharmaceutical preparations, such as proteins such as serum albumin, buffers, salts for adjusting osmotic pressure, carriers, and excipients, may be added.
  • Dosage forms include tablets, capsules, fine granules, syrups, suppositories, ointments, injections, eye drops and the like. Of these, injections are preferred.
  • the administration method may be any of intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, oral administration, ophthalmic administration, enteral administration, etc., of which intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, etc. Is preferred.
  • the expected effect can be expected in the range of usually 0.1 g / kg to 100 mg / kg as the amount of the same peptide. However, the most effective amount can be selected within this range.
  • RNA extract 4 M guanididium sociosinate, 0.1 M tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 1% mercaptoethanol, 0.1% lauryl sarcosyl sodium salt). (Kinematiri Co., Ltd.).
  • MRNA was prepared from total RNA using a POLY (A) Quik mRNA extraction kit (Stratagene) according to the protocol of the kit.
  • the cDNA was synthesized using a Time Savor DNA synthesis kit (Pharmacia) according to the protocol of the kit. That is, 3 ⁇ g of purified mRNA is mixed with a first strand reaction solution containing 0.3 ⁇ g of random hexamer primer, ImM dithiothreitol, and reverse transcriptase, and reacted at 37 ° C for 1 hour to synthesize the first strand. did.
  • This reaction mixture was mixed with a second strand reaction mixture containing E. coli RNaseH and E. coli DNA polymerase, and reacted at 12 ° C for 30 minutes and at 22 ° C for 1 hour to synthesize cDNA. After further incubating at 65 ° C for 10 minutes, the reaction solution was treated with phenol / chloroform to deactivate the enzyme. Next, unreacted primer was removed by centrifugation at 400 ⁇ G for 2 minutes using a gel filtration span column attached to the kit to obtain double-stranded cDNA (3 / g).
  • the EcoRI / Notl adapter attached to the TimeSavor DNA kit was ligated to both ends of the double-stranded cDNA obtained above in accordance with the protocol of the kit. That is, 3DNg of cDN A, 31 ⁇ 1 of EcoRI / Notl adapter, 30 zl of polyethylene glycol buffer, 11 of Hatcho solution, and 1 ⁇ 1 of T4 DNA ligase were mixed, and the ligation reaction was performed at 16 ° C for 1 hour. .
  • the cDNA with the adapter 1 ligated to both ends was ligated to the EcoRI site of a lambda phage vector; ZAPII (Stratagene) to prepare a recombinant phage DNA. That is, human ZAPII / EcoRI / CIA P-arm lg, ligation buffer (100 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM magnesium chloride, 300 mM sodium chloride), and enzyme solution B containing T4DN A ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) Ligation kit) was added in equal amounts, and the ligation reaction was performed at 26 ° C for 10 minutes.
  • ligation buffer 100 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM magnesium chloride, 300 mM sodium chloride
  • enzyme solution B containing T4DN A ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) Ligation kit) was added in equal amounts, and the ligation reaction
  • the packaging of the recombinant phage DNA obtained as described above was performed using a packaging kit GIGAPACKII GOLD (manufactured by Straugene) according to the kit protocol. That is, the above cDNA was ligated; packaging was carried out by mixing 3 g of IZAPII arm DNA and a packaging extract of the kit and reacting at 22 ° C for 2 hours. To this reaction solution, 500 zl of a phage diluent (0.58% sodium chloride, 0.2% magnesium sulfate, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.01% gelatin) was added.
  • a phage diluent 0.58% sodium chloride, 0.2% magnesium sulfate, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.01% gelatin
  • phage packaging reaction solution After checking the obtained recombinant phage in Thailand, use half of the phage packaging reaction solution, and use E. coli XL-1 Blue (Stratagene) as a recipient phage.
  • a library was prepared. That is, 20,000 plaques per plate per 10 plates of black forming medium with 150 diameters (1% pactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, magnesium sulfate ImM, 0.2% maltose) As described above, the phage diluted with the phage diluent and the recipient bacteria were plated and cultured at 37 ° C for 12 hours to obtain a recombinant phage library.
  • a DNA fragment encoding a platelet binding inhibitory peptide of von Willebrand factor was amplified by RT-PCR using all RNAs from Clonalus holidus horidus as material.
  • SEQ ID NO: 1 Based on the amino acid sequence of the peptide shown in SEQ ID NO: 1 (N. Fukuchi et al., Supra), select a site with low codon degeneracy and use it as a primer for RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction). One was made. Primers were chemically synthesized by commissioning Biologica. The nucleotide sequences of these primers are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 in the Sequence Listing. However, in SEQ ID NO: 2, the 3rd and 6th nucleotides are A and G, and the 12th nucleotide is a mixture of T, C, A and G.
  • the third nucleotide is a mixture of T, C, A and G
  • the sixth and fifteenth nucleotides are T and C
  • the ninth nucleotide is a mixture of A and G.
  • first strand reaction solution 51 PCR reaction buffer solution 10 ⁇ 1, lOmM dNTP 5 ⁇ 1, primer each 800 pmol, Taq polymerase 10u were mixed, and DNA thermal cycler was mixed.
  • This PCR reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and the amplified DNA was analyzed. As a result, a DNA band was observed at a position of about 300 base pairs.
  • the DNA fragment amplified as described above was subcloned into plasmid using pCR-ScriptSK (+) cloning kit (Stratagene) according to the protocol of the kit. That is, ligation buffer, 10 ng of pCRscript (manufactured by Stratagene) as a 1 mM ATPs vector, 5 units of restriction enzyme Srfl, and T4 DNA ligase were added to the PCR reaction mixture, and the mixture was ligated at 25 ° C for 1 hour. After the reaction, the reaction solution was incubated at 65 ° C for 10 minutes to inactivate ligase. Using this reaction product, E.
  • coli DH5 ⁇ was transformed by the competent cell method, and L-Ap plates (1% pact tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 0.5% sodium ambicilin sodium) were used. zg / ml) and cultured at 37 ° C for 18 hours. The colony-forming bacterial cells were separated from the plate, a part of which was cultured in liquid, and a plasmid was prepared by the alkaline method (Molecular Cloning, 2nd Edition, Vol. 1, Cold Spring Harbor Press). This plasmid was named pCHAprobe.
  • the nucleotide sequence of the cloned fragment of pCHAprobe was (Applied Biosystems) and M13M4 or M13reverse (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a primer, and the dye was analyzed by the dye terminator method according to the use of the same sequencer.
  • the cloned DNA fragment was composed of 272 base pairs and had the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • this sequence was translated into amino acids, it corresponded to a part of the desired peptide, and the obtained cloned fragment was one of the genes encoding the subunit (AS1051) of the target peptide CHH-B chain protein. It was proved to be a department.
  • pCHAprobe is digested with restriction enzymes Sacl and BaHI present at both ends of the cloned insert, and a 340 bp DNA fragment is separated by 2% agarose gel electrophoresis.
  • DNA was recovered using EAS YTRAP (Takara Shuzo) according to the protocol of the kit.
  • the DNA25ng have use the shed one 32 P] d CTP and random primers one labeling kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and radioisotope label. From the label reaction solution, the shed one 32 P] dCTP to remove unreacted using gel filtration Nick column (Pharmacia Co.), to obtain a labeled probe.
  • the gene encoding the full length of the AS1051 peptide from the cDNA phage library was screened by plaque hybridization using the above probe.
  • the plaque was transferred to a nylon filter Hybond N (manufactured by Amersham) in accordance with the instructions attached to the filter. After the phage was lysed by lyophilizing the filter, the phage DNA was fixed to the filter by baking at 80 ° C for 2 hours.
  • This filter was mixed with 32 P-labeled probe 1 x10 6 cpm / ml and 5 XS SPE buffer (20XSSPC: 3.6 M sodium chloride, 0.2 M sodium phosphate buffer pH 7.7, 20 mM EDTA disodium), 30% formamide, 5X Denhardt's solution (100x Denhardt's solution: 2% serum albumin, 2% Ficoll 400, 2% polyvinylpyrro And a solution containing 0.5% SDS at 37 ° C. for 16 hours.
  • E. coli HBlOl / pCHAl (E. coli AJ13023), which retains pCHAl, has been in use since August 12, 1994 by the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Biotechnology, Japan (Zip code 305-8566, Ibaraki, Japan) It has been deposited internationally under the Budapest Treaty under Tsukuba East 1-3-1) under the accession number of FERM BP-4781.
  • a DNA primer was synthesized for amplification by the PCR method.
  • a primer containing an Ncol recognition sequence (ASBN: SEQ ID NO: 7) was used as a primer on the 5 ′ end side so as to have an Ncol site at the 5 'end of the amplified fragment.
  • this primer has the nucleotide sequence ATG (nucleotide numbers 10 to 12 in SEQ ID NO: 7), which is the translation initiation codon, before the N-terminal amino acid aspartic acid codon of the AS1051 peptide at the 5 'end. ing.
  • This start codon overlaps with the Ncol recognition sequence (nucleotides 8 to 13 in SEQ ID NO: 7).
  • a primer containing a HindIII recognition sequence was used as the third side primer (SEQ ID NO: 8, the Hindlll recognition sequence was nucleotide numbers 4 to 9).
  • the gene encoding AS1051 peptide was amplified by a PCR reaction using the above primer.
  • the PCR reaction was repeated 25 times with one cycle consisting of 94 ° C for 15 seconds, 35 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the PCR reaction mixture was treated with phenol / mouth form to inactivate the Taq polymerase, and the amplified 400 bp DNA fragment was purified by ethanol precipitation, and then digested with the restriction enzymes BamHI and Hindlll.
  • This DNA fragment was ligated with a plasmid pUC18 (Takara Shuzo) digested with restriction enzymes BamHI and HindIII using a ligation kit (Takara Shuzo).
  • E. coli JM109 was transformed by a competent cell method, and cultured at 37 ° (16 hours) on a plate containing ampicillin to obtain a transformant.
  • Plasmid was prepared from the grown transformant by the alkaline SDS method.
  • the desired plasmid must be constructed by determining the nucleotide sequence using M13M4 primer and M13RV primer (both from Takara Shuzo) and 377PRISM DNA sequencer (PerkinElmer). It was confirmed.
  • the prepared plasmid was named pUCASB NH. 1 ⁇ 88 volumes were digested with the restriction enzymes ⁇ 01 and ⁇ 11 (1111), and 400 bp DNA was separated and purified by agarose gel electrophoresis. This DNA was expressed in the expression vector pTrcHisA
  • a mutation was introduced into the AS1051 gene so as to replace Using the primer ASBN (SEQ ID NO: 7) and newly synthesized primer ASAlaR (SEQ ID NO: 9) with pC HA1 as a type II, or newly synthesized ASAlaF (SEQ ID NO: 10) with primer ASH (SEQ ID NO: 8) ) was used to perform a PCR reaction. Each reaction product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the amplified MA fragment was extracted from the gel. Using these DNAs as type II primers, a second PCR reaction was performed using ASBN and ASH to produce mutant genes.
  • the PCR-amplified DNA was digested with restriction enzymes, subjected to agarose gel electrophoresis, and 40 Obp of MA was extracted from the gel. This 0 ⁇ was digested with restriction enzymes 8310111 and ⁇ 11 (1111. This DNA fragment and a plasmid pUC18 (Takara Shuzo) digested with the restriction enzymes BamHI and Hindll were ligated to a ligation kit (Takara Shuzo). The resulting plasmid was used to transform E. coli JM109 by the competent cell method, and cultured at 37 ° C for 16 hours on a plate containing ampicillin to obtain a transformant.
  • Plasmid was prepared from the grown transformant by the alkaline SDS method.
  • the desired plasmid must be constructed by determining the nucleotide sequence using M13M4 primer and M13RV primer (both from Takara Shuzo) and 377PRISM DNA sequencer (PerkinElmer). It was confirmed.
  • the prepared plasmid was named pUCASAla.
  • pUCASAla was digested with restriction enzymes Ncol and Hindi II, and 400 bp DNA was separated and purified by agarose gel electrophoresis.
  • the expression vector pTrcHisA (manufactured by Invitrogen) was digested with restriction enzymes Ncol and Hindll and It was connected using a kit. Using the obtained plasmid, E.
  • each of AS1051-WT and AS105-Ala is transformed into E. coli JM109, which carries pTr.cASWT and pTrcASAla, respectively.
  • E. coli JM109 which carries pTr.cASWT and pTrcASAla, respectively.
  • the cells were collected by centrifugation, washed, and suspended in 0.5 M EDTA solution, lysozyme was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the cell suspension is crushed using an ultrasonic crusher (200 W, 5 minutes), and the crushed liquid is centrifuged to remove the inclusion bodies.
  • a) is before dialysis and b) is after dialysis.
  • AS1051-Ala was stable even after removing guanidine hydrochloride, but it was found that the protein obtained by rewinding of AS105-WT was insolubilized by removing guanidine hydrochloride by dialysis.
  • the test for confirming the antigenicity of the AS1051 protein (AS105-Ala) in which the cysteine residue at position 81 was changed to an alanine residue against guinea pigs was performed as follows.
  • the amount of protein was quantified by a microassay method using Bio-Rad Protein Assay (manufactured by Bio-Rad), using serum albumin (BSA) as a standard.
  • Hartley guinea pigs (female, weighing 200 to 250 g) were administered with A105 (300 / g / kg) or saline three times every other day from the auricular vein.
  • the abdomen was opened under ether anesthesia, and 8 ml of blood was collected from the abdominal aorta using a 23G needle (0.38% sodium citrate was added).
  • Fig. 4 shows the results. Only the group in which both the pre-dose and the last dose were AS1051-Ala (AS / AS group) showed a marked decrease in platelets.
  • the platelet count was not different from that in the control group (both pre-administration and final administration were saline (saline / saline group)) Therefore, the thrombocytopenia observed in the AS / AS group was considered to be due to the antigenicity of AS1051-Ala given by pre-dose.
  • the collected guinea pig plasma 501 was added, left at 37 ° C for 1 hour, washed three times, and washed with alkaline phosphatase-labeled heron anti-guinea pig IgG (H + L) antibody (zymed Ltd.) and dilution buffer (0.05M tris-HCl (pH8.1), lmM MgC, 0. 15M NaC 0.05% Tween- 20, 0.02% NaN 3, ⁇ shea serum albumin) solution of 50 1 was diluted to 500-fold In addition, it was left at 37 ° C for 1 hour.
  • alkaline phosphatase-labeled heron anti-guinea pig IgG (H + L) antibody zymed Ltd.
  • dilution buffer 0.05M tris-HCl (pH8.1), lmM MgC, 0. 15M NaC 0.05% Tween- 20, 0.02% NaN 3, ⁇ shea serum albumin
  • FIG. 5 shows the absorbance of the AS1051-Ala coating (AS1051) and the non-coated (None) in the AS / saline group and the saline / saline group in the wells.
  • AS1051-PEG polyethylene glycolated protein
  • the preparation of the polyethylene glycolated protein (AS1051-PEG) of the present invention was performed by the following method. After dissolving the inclusion body of AS105-WT prepared in E. coli in the same manner as in Example 3 in 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 7 M guanidine hydrochloride and lOmM EDTA, 2.5 volumes Of distilled water was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C.
  • a polyethylene glycol-forming reagent having a molecular weight of about 5000 and having a molecular weight of about 5000 (Methoxy-PEG-mal, MW5000, Item No .: M-MAL-5000, Shearwater Polymers Co., Ltd.) so that the solution has a concentration of 0.2 mg / ml was added and left at room temperature for 3 hours.
  • This solution was dialyzed against distilled water using a dialysis membrane using Spectra Porl (manufactured by Spectra) to remove guanidine hydrochloride.
  • Polyethylene glycolated protein of AS1051 (AS1051-PEG20000) using the polyethylene glycolation reagent having a molecular weight of 20000 (Methoxy-PEG-mal, MW 20000, Item No .: M-MAL-20000, manufactured by Shearwater Polymers) of the present invention was prepared as follows. After dissolving the inclusion body of AS105-WT prepared in the same manner as in Example 3 using E. coli in 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 7 M guanidine hydrochloride and 10 mM EDTA, 2.5 Double volume of distilled water was added, and the mixture was left at 4 ° C overnight.
  • the above-mentioned polyethylene glycol reagent having a molecular weight of 20 000 and having a maleimide group was added to this solution so as to have a concentration of 0.8 mg / ml, and the solution was left at room temperature for 3 hours.
  • This solution was dialyzed against physiological saline using a dialysis membrane using Spectra Por 1 (manufactured by Spectra) to remove guanidine hydrochloride, and then TSK-gel CM-5PW (0.75 x 7.5 cm) And eluted with eluent A (50 mM ammonium acetate buffer (PH4.5)) and eluate B (0.5 M ammonium acetate buffer ( ⁇ 6.4)).
  • eluent A 50 mM ammonium acetate buffer (PH4.5)
  • eluate B 0.5 M ammonium acetate buffer ( ⁇ 6.4)
  • the molecular weight of the obtained AS1051-PEG was 25 Kda, which was about lOKda larger than that of the above-mentioned AS1051-Ala (15 Kda) which had not been polyethyleneglycolated by SDS electrophoresis.
  • Polyethylene glycol is observed in SDS electrophoresis to be twice as large as its original molecular weight due to hydration, so that one molecule of AS105-PEG is combined with one molecule of polyethylene glycol (molecular weight of about 5000). It was confirmed that.
  • the molecular weight of AS105-PEG20000 is 55 Kda, which is about 40 Kda larger than that of AS1051-Ala.
  • AS1051-PEG one molecule of AS1051-PEG20000 is bound to one molecule of polyethylene glycol (molecular weight: about 20,000). It was confirmed that it was doing.
  • the binding position of polyethylene glycol in AS105-PEG and the disulfide bond mode of other cystine residues were determined as follows.
  • AS105-PEG 100 g was treated with lysyl endopeptidase (5 g, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing MI EDTA for 5 hours at 37 ° C. Perform digestion and reverse phase column
  • beak 5 consists of two peptide chains containing one cysteine residue and one peptide chain containing two cysteine residues linked by disulfide bonds, for a total of three peptide chains. was something.
  • the peptide chain of beak 5 was further digested with V8 protease (5 g, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 25 ° C for 24 hours in lOmM ammonium carbonate buffer, and reverse phase column (Pegasil 0DS-II, The product was fractionated by using high performance liquid chromatography using SENSHI KAGAKU. Elution was performed with a linear gradient of water / acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) (0% acetonitrile / 20 minutes). Thus, the peptide chain digested with V8 protease was fractionated and subjected to amino acid sequence analysis.
  • V8 protease 5 g, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • reverse phase column Pegasil 0DS-II
  • the inhibitory activity of AS1051-PEG obtained in Example 5 on platelet aggregation was measured by the following method. First, 0.38% sodium citrate was added to human blood collected from a vein, and centrifuged at 100,000 rpm for 15 minutes to obtain platelet-rich plasma. The platelet aggregation inhibitory activity of AS1051-PEG and AS1051-Ala was measured by a platelet aggregation measuring device (HEMA TRACER 801; manufactured by Nikko Bioscience). Add test sample to 100/1 platelet-rich plasma in advance, stir and incubate at 37 ° C for 2 minutes, then add 1/10 volume of 10 times concentration of aggregation-inducing substance, platelet aggregation for 8 minutes Was observed.
  • HEMA TRACER 801 platelet aggregation measuring device
  • ristocetin As aggregation-inducing substances, ristocetin (1.2 mg / ml, manufactured by Sigma), collagen (10 ⁇ g / ml, manufactured by MC Medical), and adenosine diphosphate (10 zM, manufactured by Emsi Medical) was. As shown in FIG. 7, the ristocetin aggregation inhibitory activity of AS1051-PEG was slightly stronger than that of AS1051-Ala. In addition, both AS1051-Ala and AS1051-PEG did not inhibit the aggregation by collagen and the aggregation by adenosine diphosphate. ⁇ 2> Measurement of von Willebrand factor (vWF) binding inhibitory activity on platelets
  • botrocetin Purification of botrocetin was performed as follows. Botrops jararaca lyophilized freeze-dried product (Sigma, V-5625) lg 20% 0.9% 0.9% After dissolving in saline, insolubles were removed by centrifugation, and gel filtration was performed using Sephadex G-75 (05 x 90 cm) column (developing solution: 0.9% saline, flow rate: 4 ml / min). Collect 15 ml fractions, collect the active fractions (fractions No.
  • Preparation of immobilized platelets was performed as follows. To human platelet rich plasma (PRP) obtained by centrifuging fresh blood collected from a healthy person to 1/10 volume of 3.8% sodium citrate at 900 rpm for 15 minutes, the same volume Then, a 0.15 M aqueous solution of sodium chloride containing 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) in which 2% paraformaldehyde was dissolved was added, and the mixture was stored at 4 ° C for one hour. After storage, platelets were collected by centrifugation and washed twice with a 0.15 M aqueous sodium chloride solution containing 20m phosphate buffer (pH 7.4). After washing, the immobilized platelets were suspended in the same solution and stored.
  • PRP human platelet rich plasma
  • BSA / TBS 100/1
  • Example 4 The test for comparing the antigenicity of the polyethylene glycolated protein described in Example 6 (1) (AS105-PEG, PEG moiety having a molecular weight of 5000) with AS1051-Ala against guinea pigs is shown in Example 4.
  • the protein amount was determined in the same manner as in Example 4 for AS1051-Ala, and for AS1051-PEG, the elution peak area at 280 nm by reverse-phase HP LC was compared with that of AS105-Ala, and the same area was determined. The same amount of protein was used.
  • the dosage of AS1051-Ala and AS1051-PEG was 200 g / kg for both administrations.
  • Fig. 9 there was no difference in the platelet count between the AS-PEG group and the saline group, and the AS-Ala group showed a significant decrease in platelets compared to the AS-PEG group and the saline group. Was observed. This platelet reduction is considered to be due to antigenicity, as shown in Example 4.This result indicates that AS1051-PEG clearly reduced antigenicity compared to AS1051-Ala. Show. Industrial applicability
  • a peptide derived from a multimeric protein can be produced in a form that is superior in solubility and stability and has reduced antigenicity as compared with conventional methods.

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Description

明細書 多量体蛋白質に由来するサブュニットぺプチドの製造法 技術分野
本発明は、 サブュニッ ト内及びサブュニット間のジスルフィ ド結合を有する多 量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドを製造する方法、 並びに、 その方法 により製造され得るサブュニットぺプチドに関する。 背景技術
生物の生命活動には種々の生理活性を持つ蛋白質が必要である。 これら生理活 性蛋白質の多くは分子内にジスルフィ ド結合を持ち、 また多くは同種あるいは異 種のぺプチド鎖よりなる二量体等の多量体として存在し、 ぺプチド鎖間にジスル フィ ド結合を形成した状態に生合成される。 多くの二量体として存在する生理活 性蛋白質は、 二量体であることが生物学的な活性発現に必須であるが、 二量体で あることを必ずしも必須としない蛋白質も知られている。
例えば、 二量体であることが生理活性発現に必須なものの例としては、 PDGF (Platelet Derived Growth Factor) 等が挙げられ、 その生理活性発現には二量 体の各べプチド鎖が、 同様に二量体よりなる受容体の各べプチド鎖に結合するこ とが必要であり、 実質的に二量体であることが必須である （C. H. Heldin et al .， Cell. Regul . , 1， 555-566, 1990)。
しかし、 二量体の生理活性蛋白質の中には、 一つのペプチド鎖 （サブュニット） に受容体への結合活性、 酵素活性等が存在し、 他のペプチド鎖は、 その蛋白質の 安定性、 溶解性、 生合成過程等に重要であると考えられるものも知られており、 実質的な生理活性発現には単一のサブュニットのみが必須であることがある。 例 えばァクチビン （activin) は、 生体中では同種二量体 （homodimer) あるいは 異種二量体 （heterodimer) として存在しているが、 単量体 （monomer) でもそ の受容体に対する結合活性が報告されており、 生物学的な活性も数％程度は保持 していることが報告されている (P. Husken-Hindi et al.， J. Biol Chem. , 269， 19380-19384, 1994) 。 また、 昆虫に存在し、 生理作用を果たしている PTTH (prot oracicotropic hormone) は、 やはり生体内では同種二量体として存在し ているが、 その単量体にも約 50%の生物学的な活性が保存されていることが報告 されている (J. Ishibashi et al.， Biochemistry, 33， 5912 - 5919， 1994) 。 ま た、 ィムノグロブリン G ( IgG) も二量体であるが、 単量体にしても抗原に対する 結合性が保持されることが知られている (G. M. Edelman, Biochemistry, 7, 19 50， 1968)。
以上述べたように、 生体内で生理活性を示す二量体の蛋白質の単量体には、 単 量体においても生理活性を持つものがあり、 また単量体では生理活性を示さない 蛋白質の単量体でも、 その受容体に結合するものもある。 従って、 二量体として 存在する蛋白質を単量体として得た場合、 その蛋白質を、 生理作用を持つ蛋白質 として、 あるいは生理作用は持たないが受容体に結合し本来の生理活性蛋白質の 結合を阻害することにより、 本来の生理活性蛋白質の生理作用を阻害する蛋白質 として利用できることが考えられる。
また、 異なる動物種が生産する蛋白質が、 他の動物種に対して生理活性を示す 場合も数多く知られている。 例えばヒル唾液より単離される蛋白質ヒルジン (hirudin) は、 血中の凝固因子であるトロンビンに結合し、 そのプロテア一ゼ 活性を阻害することが知られており、 また蛇毒由来の蛋白質として血小板の受容 体に結合し血小板凝集を阻害するデイスインテグリン （disintegrin)、 CHH-B等 の蛋白質が知られている。 この様な異種蛋白質のうち、 CHH-Bは血小板膜上の糖 蛋白質である糖タンパク質 lb (glycoprotein lb (GPIb) ) に結合し、 血小板凝 集を阻害する蛋白質であるが、 CHH- Bは異種二量体であり、 その単量体にも異種 二量体と同等の GPIbに対する結合活性及び血小板凝集阻害活性が保持されている ことが報告されている （N. Fukuchi et al .， W0 95/08573) 。
すなわち、 二量体として生合成される、 上記に述べてきた様な生理活性蛋白質 の単量体は、 作用蛋白質 （agonist) /作用阻害蛋白質 （antagonist) として利 用可能であり、 種々の疾患の治療薬として有用であると考えられる。
しかし、 本来二量体として生合成され生体内に存在する蛋白質を単量体として、 安定、 かつ少なくとも生物活性を示す程度に立体構造を保った形で得ることにお いては、 大きく 2つの問題点が考えられる。
1点目は、 単量体を調製することが難しい点である。 本来二量体として存在す る蛋白質を単量体として得る方法として大きく 2つの方法が広く行われている。 二量体蛋白質を部分的に還元してサブュニット間のジスルフィ ド結合のみを切断 した後、 新たに生じた遊離のチオール基をブロックする方法と、 分子生物学的に サブュニット間のジスルフィ ド結合に関わるシスティン残基をァラニン残基ある いはセリン残基に置換した後、 動物細胞などを用いた蛋白質系を用いて生産させ る方法である。 前者の方法は、 前述した蛋白質の中では PTTH、 CHH-B及び IgGにつ いて行われており、 後者の方法は activin及び CHH-Bについて行われている。 前者 の方法では蛋白質によってサブュニット間のジスルフィ ド結合のみを切断する条 件設定が難しく、 活性を保持した形で単量体を得た例は多くない。 また、 後者の 方法では、 サブユニット間のジスルフィ ド結合に関与するシスティン残基があら かじめ同定されていなければならず、 さらに得られた遺伝子に点変異を入れなけ ればならず、 方法として繁雑である。
問題点の 2点目は、 抗原性の発現の可能性があることである。 生体内で二量体 として存在している蛋白質を単量体とした場合、 本来分子の内側に存在していた 領域が外側に露出するために異種蛋白質として認識され、 抗原性を示す可能性が 考えられる。 前述した単量体の調製法の 1つ目の方法である還元後にチオール基 をブロッキングする方法では、 このほかにブロッキングに用いた化合物が抗原性 を示すことが考えられる。 また、 2つ目の変異を入れる方法では、 変異したアミ ノ酸を含む部分構造による抗原性も考えられる。 また、 異なる動物種由来の蛋白 質も一般的に抗原性を持ち、 単量体にしたものについても同様の抗原性発現が問 題となる。
一方、 蛋白質の抗原性の低下は、 ポリエチレングリコール化を行えば成しうる ことは広く知られており （バイオコンジュゲート医薬品、 続医薬品の開発 臨時 増刊、 稲田、 谷本編、 廣川書店、 1993s A. Abuchowski et al.， J. Biol . Chem.， 252, 3578-3581, 1997) 、 特にポリエチレングリコールの蛋白質に対しての結 合個数及び結合位置をより限定するために、 システィン残基の遊離のチオール基 に結合する官能基を有するポリエチレングリコールを用いる方法も数多く報告さ れている (G. N. Cox et al .， WO 98/32003、 G. N. Cox et al .， WO 94/12219、 R. J . Goodson, USP 5 , 206 , 344, L. G. Armes W0 92/16221) 。 しかし、 いずれ も蛋白質の一部に人為的にシスティン残基を挿入あるいは置換する方法であり、 本来二量体を形成するサブュニットに人為的なアミノ酸置換を行わずに遊離のチ オール基にポリエチレングリコールを結合させることによって有用な蛋白質を得 た報告はない。 発明の開示
本発明は上記観点からなされたものであり、 二量体等の多量体として本来存在 する蛋白質のうち、 生物学的活性をもつサブュニットを単量体として容易に得、 かつ、 同時にその抗原性を低下させる方法を提供することを課題とする。
本発明者は、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った。 その結果、 多量体 蛋白質を構成するサブュニットを蛋白質変性剤を用いて変性させ、 該変性剤を除 去することによってサブュニッ卜の巻き戻しを行う際に、 システィン残基に結合 する官能基を有するポリエチレングリコールの存在下で巻き戻しを行うと、 サブ ユニット本来の活性を維持し、 かつ、 抗原性が低下した単量体ペプチドが得られ ることを見い出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下のとおりである。
( 1 ) サブュニット内及びサブュニット間のジスルフィ ド結合を有する多量体蛋 白質に由来するサブュニットペプチドを製造する方法であって、 以下のステップ を含む方法；
( a ) 前記多量体蛋白質又はそのサブユニットペプチドを、 蛋白質変性剤を用 いて溶液中で変性させ、 チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキ ルポリエ一テルの存在下で、 前記溶液から変性剤を除き、 サブユニットペプチド の巻き戻しを行うステップと、
( b ) 前記溶液からポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブュニヅト ぺプチドを単離するステップ。
( 2 ) ステップ （b ) で単離されるサブユニットペプチドが抗原性が低下したも のである前記 （ 1 ) の方法。 (3) 前記多量体蛋白質が二量体である （ 1) の方法。
( 4 ) 前記チオール基と反応する官能基を有するポリォキシアルキルポリエーテ ルが、 マレイミ ド基を有するポリエチレングリコールである （ 1) の方法。
(5) 前記多量体蛋白質に由来するサブュニットペプチドが、 遺伝子組換え蛋白 質である （ 1) の方法。
(6) 前記多量体蛋白質又はそのサブュニットペプチドを還元条件下で変性させ ることを特徴とする （ 1) の方法。
(7) 多量体蛋白質の生理活性が、 該多量体蛋白質を構成するサブユニットぺプ チドに依存し、 かつ、 ポリオキシアルキルポリェ一テルが結合したサブユニット ペプチドが前記生理活性を有する （ 1) の方法。
(8) ポリオキシアルキルポリェ一テルが結合したサブユニットペプチドが、 多 量体蛋白質の生理活性を阻害する活性を有する （ 1) の方法。
(9) サブユニットペプチドのシスティン残基のうち、 本来多量体蛋白質のサブ ュニット間のジスルフィ ド結合の形成に関与するシスティン残基にポリオキシァ ルキルポリエーテルが結合することを特徴とする （ 1) の方法。
( 10) ポリオキシアルキルポリェ一テルが結合したサブュニヅトペプチドが、 多量体蛋白質中の同サブユニット内のジスルフィ ド結合と同一のジスルフィ ド結 合を有する前記 （ 1) の方法。
( 1 1) サブュニット内及びサブュニット間のジスルフィ ド結合を有する多量体 ぺプチドに由来するサブュニットぺプチドであって、
サブュニットペプチドのシスティン残基のうち、 本来多量体蛋白質のサブュニ ット間のジスルフィ ド結合の形成に関与するシスティン残基にポリオキシアルキ ルポリエ一テルが結合し、 抗原性が低下したサブュニットペプチド。
( 12) 前記多量体蛋白質が、 蛇毒に由来するフォンビルブラント因子の血小板 結合を阻害する活性を有する二量体ペプチドである （1 1) のサブュニットぺプ チド。
( 13) 前記蛇毒がクロ夕ルス ·ホリダス 'ホリダスの蛇毒である （ 12) のサ ブュニットぺプチド。
( 14) 抗血栓活性を示す （ 12) のサブュニットぺプチド。 ( 1 5 ) 配列番号 1に示すアミノ酸配列を有し、 同アミノ酸配列においてァミノ 酸番号 8 1のシスティン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合したぺプ チド又はその誘導体である （ 1 4 ) のサブユニットペプチド。 図面の簡単な説明
図 1は、 野生型 AS1051 (AS1051-WT) を発現するべクタ一 pTrcASWTの構築過程 を示す図。
図 2は、 システィン残基がァラニン残基に置換された変異型 AS105KAS105卜 A1 a)を発現するべクタ一 pTrcASAlaの構築過程を示す図。
図 3は、 巻き戻し後の AS1051-WT及び AS1051- Alaの透析前 （a) 及び透析後 （b) の試料を逆相 HPLCで分析した結果を示す図。 横軸は時間を、 縦軸は吸光度 （216η m) 、 すなわち溶解蛋白質量を示す。
図 4は、 AS1051- Alaのモルモット反復投与後の血小板数を示す図。
図 5は、 AS1051-Alaのモルモット反復投与後の血漿中の抗 AS105卜 Ala抗体の検 出結果を示す図。
図 6は、 ポリエチレングリコ一ル化された AS1051 (AS1051-PEG) のリジルェン ドぺプチダーゼ消化後の逆相液体クロマトグラム。
図 7は、 AS1051- Ala及び AS1051-PEGのリストセチン凝集阻害活性を示す図。 図 8は、 AS1051- Ala及び AS1051- PEGの固定化血小板一 vWF結合阻害活性を示す 図。
図 9は、 AS105卜 Ala及び AS1051-PEGのモルモット反復投与後の血小板数を示す 図。 発明を実施するための最良の形態
< 1 >本発明のサブュニットぺプチドの製造法
本発明の方法は、 サブュニット内及びサブュニット間のジスルフィ ド結合を有 する多量体蛋白質に由来し、 好ましくは抗原性が低下したサブュニットペプチド を製造する方法である。
本発明に用いられる多量体蛋白質は、 2又はそれ以上のべプチドのサブュニッ トからなり、 少なくとも一つのサブユニットのペプチド鎖内にジスルフィ ド結合 を有し、 かつ、 サブユニット間にジスルフイ ド結合を有するものである。
また、 前記多量体蛋白質としては、 多量体蛋白質の生理活性が、 該多量体蛋白 質を構成するサブユニットペプチドに依存するものが挙げられる。 また、 前記多 量体蛋白質は、 その生理活性が、 本発明の方法により得られるポリオキシアルキ ルポリエ一テルが結合したサブュニッ トぺプチドにより阻害されるものであって もよい。 例えば、 実施例に示した本発明のサブユニットペプチドの一例である AS 1051-PEGは、 同サブュニットペプチドが由来する蛇毒由来の二量体ペプチドであ る CHH-Bと同様の抗血小板作用を有する。 また、 前記 AS1051-PEGは、 それが由来 する二量体べプチドである CHH-Bと同様に血小板の糖タンパク質との結合活性を 有し、 CHH-Bの結合を阻害する。 尚、 AS1051では、 CHH- Bが持つ血小板減少作用が 著しく低下しているが、 このように性質が変化するものであっても、 目的とする 生理活性を保持するものであれば差し支えない。
本発明の方法は、 上記のような多量体蛋白質を構成するサブュニットペプチド のうち、 ペプチド鎖内にジスルフィ ド結合を有するサブユニットペプチドであつ て、 前記生理活性又は該生理活性を阻害する活性を有し、 好ましくは抗原性が低 下したサブュニットぺプチドを得る方法である。
ここで、 「抗原性が低下した」 とは、 本発明の方法により得られるサブュニッ トぺプチドの抗原性が、 従来の方法によって多量体蛋白質から得られるサブュニ ットペプチドが有する抗原性に比べて低下したことをいう。 従来の方法とは、 例 えば、 多量体蛋白質を還元剤を用いて還元した後に、 遊離のチオール基をアルキ ル化剤を用いてアルキル化することにより単量体を得る方法、 あるいは、 サブュ ニット間のジスルフィ ド結合に関与するシスティン残基が他のアミノ酸残基に置 換されたサブュニットぺプチドを、 組換えタンパク質として製造する方法などが 挙げられる。
本発明を適用することができる多量体蛋白質としては、 2又はそれ以上のぺプ チドのサブュニッ卜からなり、 少なくとも一つのサブュニッ卜のペプチド鎖内に ジスルフィ ド結合を有し、 かつ、 サブユニット間にジスルフィ ド結合を有するも のであれば特に制限されないが、 例えばク口夕ルス · ホリダス · ホリダス (Crotalus horridus orridus) 、 セラステス *セラステス (Cerastes cerastes)、 ビペラ ·パレスチナ （Vipera palestinae) 、 エキス ·力リナタス （Echis carinatus) 、 トリメレスラス ·ァゾレポ'フブリス (Trimeresurus albolabris 、 トリメレスラス ' フラボビリデイス （Trimeresurus flaboviridis) 、 ナジャ 'ノ、 ジェ （Naja haje) 、 ナジャ ·二ベア （Naja nivea) 、 クロ夕ルス ·アドマンテ ウス （Crotarus admanteus) 等の蛇毒に含まれる血小板膜上の糖タンパク質 I b結合活性を持つ多量体蛋白質、 あるいは増殖因子、 サイ ト力イン等の生理活性 蛋白質 (R. M. Scarborough, WO 92/08472) が挙げられる。
本発明の方法においては、 蛇毒などの天然物から得られる多量体蛋白質をその まま用いてもよいし、 多量体蛋白質から分離されたサブュニットぺプチドを用い ることもできる。 サブユニッ トペプチドとしては、 多量体蛋白質を構成するサブ ユニットのうち、 生理活性を担うサブユニットペプチドか、 あるいは多量体蛋白 質の生理活性を阻害する活性を有するサブュニットペプチドを用いる。 本発明に いうサブュニットぺプチドとは、 特記しない限りこのようなサブュニットぺプチ ドを意味する。 さらに、 サブユニットペプチドは、 それをコードする D N Aを用 いて遺伝子組換え技術により製造した組換えタンパク質であってもよい。
目的のサブュニットぺプチドをコ一ドする D N Aをクローニングにすることは、 そのサブュニットぺプチドのアミノ酸配列の全長あるいは一部が明らかであれば、 通常の遺伝子クローニングと同様にして行うことができる。 例えば、 目的とする 遺伝子は、 既知の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて PCR
(polymerase chain reaction) 法を用いて得ることもでき、 同様にして作製した プローブを用いて cDNAラィブラリーからハイブリダイゼ一シヨンを行うことによ り取得することもできる。 また、 目的の遺伝子が寄託機関に寄託されている場合 は、 寄託されている遺伝子を入手することによつても可能である。 また、 遺伝子 の全塩基配列が既知である場合、 化学的に合成することも可能である。 多量体を 構成するサブュニットぺプチドのうち、 目的とするサブュニットぺプチドが特定 できない場合には、 それそれのサブュニットペプチドをコードする遺伝子をクロ 一二ングすればよい。
目的サブュニットぺプチドをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換え技術によ り組換えタンパク質として製造することは、 通常有用タンパク質の製造に用いら れる方法と同様にして行うことができる。 すなわち、 目的サブユニットペプチド をコードする遺伝子を、 適当なプロモー夕一を含むベクタ一に挿入し、 得られる 組換えベクターで大腸菌等の宿主を形質転換し、 形質転換体を培養して前記遺伝 子を発現させればよい。 宿主としては、 例えば大腸菌、 枯草菌、 酵母等が挙げら れる。 また、 プロモ一夕一は、 用いる宿主で機能するものであればよく、 例とし ては lac、 trp、 tac；、 trc、 recA、 T7 (新生化学実験講座 1、 タンパク質、 VI合成 及び発現、 日本生化学会編、 ρ166、 安枝、 松井、 1992年、 東京化学同人刊） 、 PG K、 ADH1、 GPD、 MFひ 1、 SUC2、 PH05、 GAL1S GAL4 (新生化学実験講座 1、 タンパ ク質、 VI合成及び発現、 日本生化学会編、 p215、 酒井ら、 1992年、 東京化学同人 刊） 等が挙げられる。
発現の形態は、 直接目的サブュニットぺプチドそのものを発現させても良く、 他の蛋白質との融合蛋白質として発現させてもよい。 また封入体として菌体内に 蓄積させても良く、 可溶型として菌体内に蓄積させてもよく、 あるいは菌体外に 分泌させてもよい。 融合蛋白質としては、 マルトース結合蛋白質 （Maltose Binding Protein) 、 グル夕チオン S—トランスフェラ一ゼ （ Glutatione S- Tranferase) 、 ヒスチジン一夕グ （His-Tag) 等との融合蛋白質が挙げられる。 尚、 本来多量体として存在する蛋白質のサブユニットペプチドは、 サブュニッ ト内のジスルフィ ド結合には関与しないシスティン残基を持ち、 また本来他のサ ブュニットペプチドと結合している疎水性に富む部分構造を表面に有する可能性 が高く、 サブュニットペプチド単独では溶液での安定性や溶解性が悪い場合が多 いと考えられる。 サブユニット内のジスルフィ ド結合には関与しないシスティン 残基が存在することによる安定性の悪さは、 従来の方法のように、 本来サブュニ ヅト間のジスルフィ ド結合に関与するシスティン残基をァラニン、 セリン等のチ オール基を持たない適当なアミノ酸残基に置換すれば回避できるが、 そのために は本来サブュニット間のジスルフィ ド結合に関与するシスティン残基を特定する 必要がある。 また前記システィン残基が特定されている場合であっても、 遺伝子 にアミノ酸置換を起こす変異を導入する必要があり、 その操作は繁雑である。 一方、 本発明の方法によれば、 サブユニットペプチドをコードする遺伝子をそ のまま発現させればよく、 サブュニットペプチド単独では溶解性や安定性が悪い 場合、 該サブュニットペプチドを封入体又は不溶化蛋白質として得ても差し支え ない。
本発明においては、 上記のような多量体蛋白質又はそのサブュニットペプチド から、 前記 （a ) 及び （b ) のステップによりサブユニットペプチドを得る。 以 下、 各ステップについて説明する。
( 1 ) ステップ （a )
はじめに、 多量体蛋白質又はそのサブユニットペプチドを、 蛋白質変性剤を用 いて溶液中で変性させる。 続いて、 チオール基と反応する官能基を有するポリオ キシアルキルポリエーテルの存在下で、 前記溶液から変性剤を除き、 サブュニヅ 卜べプチドの巻き戻しを行う。
溶液の溶媒は一般には水である。 蛋白質変性剤としては、 可逆的に蛋白質を変 性することができるものであれば特に制限されないが、 塩酸グァニジン、 尿素等 が挙げられる。 蛋白質変性剤濃度は、 該蛋白質が溶解すればいかなる濃度でも良 いが、 例えば 1Mから飽和濃度の間などが用いることができ、 好ましくは 2Mから 8M の間が用いられる。 溶液の pHはいかなる値でも可能であるが、 好ましくはジスル フィ ド結合の掛かり換えと、 後述するポリエチレングリコールのチオール基への 結合が起こりやすい 7から 12の間が用いられる。 また溶液の温度はいかなる温度 でも構わないが、 好ましくは 0°Cから 40°Cの間が用いられる。 また反応時間は適 宜選択される。 変性は、 還元条件下及び非還元条件下のいずれで行ってもよい。 多量体又はサブユニットペプチドのジスルフィ ド結合を、 還元剤を用いてあら かじめ切断しておいても良いが、 これは必須ではない。 また、 巻き戻し過程に先 立ってグル夕チオン等のシスティン残基を含む物質、 ジチオスレィ トール等の還 元剤、 蛋白質ジスルフィ ドイソメラ一ゼ （Protein Disulfide Isomerase) 等の 酵素などを添加することも可能である。
多量体蛋白質又はそのサブュニットに、 サブュニット間のジスルフィ ド結合が 存在する場合や本来のものとは異なるサブュニット内のジスルフィ ド結合が存在 する場合には、 変性を還元条件下で行うことが好ましい。 本発明において、 還元 条件とは、 システィン残基を含む物質、 還元剤、 蛋白質ジスルフィ ドイソメラ一 ゼ等の存在下のように、 ジスルフィ ド結合の切断が促進される条件を意味する。 還元条件下にすることにより、 ジスルフィ ド結合の切断が促進されることによつ て、 巻き戻し過程における、 チオール基と反応する官能基を有するポリオキシァ ルキルポリエ一テルとの反応が促進される。 多量体蛋白質の変性の場合には、 サ ブュニッ ト間のジスルフィ ド結合の切断が促進されるため、 還元条件下で行うこ とが特に好ましい。
次に、 チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテル の存在下で、 変性したサブユニットペプチドを含む溶液から変性剤を除く。 溶液 から変性剤を除くことは、 例えば透析によって行うことができる。
チオール基と反応する官能基としては、 代表的にはマレイミ ド （maleimide) 基 (R. J. Goodson et al . , Bio/Technology, 8， 343， 1990) 、 オルトピリジル ジスノレフィ ド (orthopyridyl disulfide) 基 (M. Yokoyama et al . , Biochem. Biophys. Res. Co腿 un.， 164, 1234， 1989) 、 ビニルスルフォン （vinylsulfone) 基 （Shearwater Polymers Inc. Item No. M-VS-5000) 等が挙げられるが、 優先 的にチオール基と結合する官能基であれば良い。 また、 ポリオキシアルキルポリ エーテルとしては、 ポリエチレングリコール、 ポリプロピレングリコール、 ポリ ヒドロキシェチルグリセロール、 デキストラン、 炭水化物ポリマ一等が挙げられ る。 分子量はいかなる大きさでも構わないが、 得られるサブユニットペプチドの 溶解性向上、 抗原性低下あるいはサブュニットペプチドとの反応性を考えると 10 00から 100万の範囲が好ましく、 2000〜 5万の範囲がより好ましい。
上記のようなポリオキシアルキルポリエーテルは、 変性に先立って溶液中に加 えてもよく、 多量体蛋白質又はサブュニットぺプチドを変性させた後に加えても よく、 変性剤を除く前に加えてもよい。 通常は、 多量体蛋白質又はサブユニット ぺプチドを変性剤で変性させた後に、 前記ポリオキシアルキルポリエーテルを加 えて一定時間反応させ、 その後に変性剤を溶液から除くことが好ましい。 ポリオ キシアルキルポリエーテルの量としては、 反応する蛋白質量に対して等モル比以 上であることが好ましい。
変性中又は変性後にチオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキル ポリエーテルと反応させることによって、 サブュニットぺプチドのシスティン残 基にポリオキシアルキルポリェ一テルが結合する。
上記のようにして溶液から変性剤を除くと、 変性したサブュニットぺプチドの 巻き戻しが起こり、 サブュニットペプチドが由来する多量体蛋白質の生理活性と 同じ生理活性活性、 又は同生理活性を阻害する活性を有するサブュニットぺプチ ドが得られる。
変性したサブユニッ トペプチドを含む溶液から変性剤を除くステップの前に、 自然酸化 （空気酸化） を行い、 サブユニット内のジスルフィ ド結合を形成させ、 その後にチオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテル を添加することにより、 ポリオキシアルキルポリエーテル基を、 本来多量体蛋白 質のサブユニット間のジスルフィ ド結合の形成に関与するシスティン残基に、 選 択的に結合させることを効率的に行うことができる。
( 2 ) ステップ （b )
上記のようにして生成されるポリオキシアルキルポリェ一テルが結合したサブ ユニットペプチドを、 溶液から単離する。 この操作は、 通常の蛋白質の精製に用 いられる操作、 すなわちイオン交換、 ゲル濾過、 逆相等の一般的に用いられるク 口マトグラフィ一、 電気泳動、 塩析等の沈殿操作、 脱塩操作、 濃縮操作等を組み 合わせて行うことができる。
上記操作により、 目的とするサブユニットペプチドと、 ポリオキシアルキルポ リエ一テルとを分離することができる。 また、 原料として多量体蛋白質を用いた 場合は、 目的とするサブュニットペプチドと他のサブュニットペプチドとを分離 することができる。 例えば、 サブユニットペプチドのシスティン残基のうち、 本 来多量体蛋白質のサブュニット間のジスルフィ ド結合の形成に関与するシスティ ン残基にポリォキシアルキルポリエーテルが結合し、 抗原性が低下したサブュニ ットペプチドと、 他のサブュニッ トペプチドとを分離することができる。
サブュニットぺプチドに結合するポリオキシアルキルポリエーテルの結合位置 は、 多量体蛋白質においてサブユニット間のジスルフィ ド結合を形成しているシ スティン残基であることが望ましいが、 該ジスルフィ ド結合の様式が決定されて いない場合は、 特定のチオール基に結合していて、 目的とする活性を持ち、 溶液 中で安定に存在し、 好ましくは抗原性が低下するものであればよい。 また、 サブ ユニット内の他のジスルフィ ド結合は、 本来の多量体中のサブユニット内のジス ルフィ ド結合と同様であることが望ましいが、 実質的に生理活性を持つ範囲であ れば、 異なっていてもよい。 また、 サブユニット内の本来のジスルフィ ド結合が 決定されていない場合は、 生理活性を持つ単一の分子として特定できる、 溶液中 で安定に存在するものであればよい。 また、 一分子あたりに結合するポリオキシ アルキルポリエーテル分子数は、 本来の二量体蛋白質においてサブュニット間の ジスルフィ ド結合を形成しているシスティン残基の個数と同一であることが望ま しいが、 その個数が決定されていない場合は、 得られた単量体ポリオキシアルキ ルポリエーテル化蛋白質が生理活性を持ち、 単一の分子として特定でき、 かつ、 溶液中で安定に存在するような個数であればよい。
また、 得られた単量体ポリオキシアルキルポリエーテル化サブュニットぺプチ ドの抗原性の低下は、 ポリォキシアルキルポリエーテル化していないサブュニッ トペプチド、 あるいは本来の多量体蛋白質においてサブュニット間のジスルフィ ド結合を形成しているシスティン残基を他のチオール基を持たないアミノ酸に置 換したサブユニットペプチドに比べ、 実質的に抗原性が低下していればよい。 上 記のようなポリオキシアルキルポリエーテル化していないサブユニットペプチド の抗原性に関する知見が得られていない場合には、 得られたポリオキシアルキル ポリエーテル化サブュニットペプチドを、 免疫に必要な最低限の回数動物に投与 後、 再投与した際に抗原抗体反応に起因する生物学的及び生化学的な反応が起こ らないものであればよい。
さらに、 本発明の方法により得られるポリオキシアルキルポリエーテル化サブ ュニットペプチドの血中安定性は、 ポリオキシアルキルポリエーテル化を行わな い場合に比べ向上することが期待される。
後記実施例では、 クロ夕ルス ，ホリダス ·ホリダス由来の蛇毒に含まれる二量 体ペプチドである CHH-Bを構成するサブユニッ トペプチド （ひサブユニット） に ついて、 本発明の方法を適用した例を示した。 CHH-Bは、 血小板膜糖蛋白質であ る糖タンパク質 lb (GPIb) に結合する。 糖タンパク質 lbは、 血中蛋白質フォンビ ルブラント因子 （vWF) と結合することによって血栓形成に関与することが知ら れている （J. P. Cean et al.， J. Lab. Clin. Med. , 87, 586-596， 1976、 K J. Clemetson et al .， Thromb. Haemost. , 78, 266-270， 1997) 。 さらに、 CHH-B の α鎖に GPIb結合部位が存在することが見出され、 a鎖のみを取り出した AS1051 に抗血栓活性が存在することが報告されている （N. Fukuchi et al . , WO 95/085 73) 。 N. Fukuchiら （WO 95/08573) は、 AS1051の調製法として、 CHH- Bからの部 分的還元とグル夕チオンによる遊離のチオール基の保護を含む方法を報告してい る。 さらに、 AS1051をコードする遺伝子をクロ一ニングし、 CHH-B中のサブュニ ヅト間のジスルフィ ド結合に関与するシスティン残基を特定し、 そのシスティン 残基がァラニン残基に置換された変異型 AS1051 (AS1051-Ala) を大腸菌で発現さ せる方法等を報告している。
しかし、 前記特許明細書では、 CHH-Bより部分還元により得たサブユニッ トべ プチド、 あるいは変異型 AS1051を用いた活性のデータは報告されているが、 大腸 菌で生産された野生型 AS1051の安定性については触れられておらず、 サブュニッ ト内のジスルフィ ド結合に関与しない余分なシスティン残基を持つこのサブュニ ットペプチドの安定性、 及び、 巻き戻し過程における効率は低いと考えられた。 また、 同明細書では動物を用いた抗血栓活性の評価は行っているが、 その抗原性 については触れられていない。 そこでまず、 大腸菌を用いて製造した AS1051の安 定性と、 安定であると考えられるァラニン置換体 （AS1051-Ala) の動物投与にお ける抗原性について検討を行った。
その結果、 AS1051及び AS1051-Alaについて同様の条件で変性及び巻き戻しを行 つたところ、 AS1051の溶解性が非常に低いことが確認された。 また、 AS1051- Ala について、 モルモットを用いた反復投与を行ったところ、 抗原性に基づくと考え られる血小板減少が確認された。 一方、 本発明の方法により得られたポリエチレ ングリコール化されたアミノ酸置換されていない AS1051は、 溶解性が高く、 血小 板減少も観察されなかった。
< 2 >本発明のぺプチド
本発明のペプチドは、 サブュニット内及びサブュニッ卜間のジスルフィ ド結合 を有する多量体蛋白質に由来するサブュニットぺプチドであって、 サブュニット ペプチドのシスティン残基のうち、 本来多量体蛋白質のサブュニット間のジスル フイ ド結合の形成に関与するシスティン残基にポリオキシアルキルポリエーテル が結合し、 抗原性が低下したサブユニットペプチドである。 このようなサブュニ ットペプチドは、 例えば上記の本発明の方法により得られる。
本発明のサブユニットペプチドとして具体的には、 前記多量体蛋白質が、 クロ 夕ルス ·ホリダス ·ホリダスの蛇毒に由来する、 フォンビルブラント因子の血小 板への結合を阻害する活性を有する二量体べプチドであるものが挙げられる。 さ らに具体的には、 配列番号 1に示すアミノ酸配列を有し、 同アミノ酸配列におい てアミノ酸番号 8 1のシスティン残基にポリオキシアルキルポリェ一テルが結合 したペプチド又はその誘導体が挙げられる。 前記誘導体としては、 前記のァミノ 酸番号 8 1のシスティン残基以外の位置において、 1若しくは数個のアミノ酸の 置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含み、 かつ、 抗血栓性を有するペプチドが 挙げられる。
上記のようなペプチドは、 本来の二量体蛋白質である CHH-B、 あるいはそのひ サブュニッ 卜の単量体べプチドである AS1051と同様の血小板凝集阻害活性を保持 し、 かつ緩衝液等の溶液における高い溶解性を有し、 ポリエーテル化されていな い AS1051が抗原性を示すのに対し、 抗原性が非常に低いという優良な性質を有す o
< 3 >本発明のぺプチドの用途
本発明の方法により得られたサブュニットぺプチドのうち、 実質的に本来の多 量体蛋白質と同様の生物学的作用を持つものは、 その作用の夕一ゲットに対する 作用物質として医薬品としての利用が可能である。 また、 本発明の方法により得 られたサブュニットペプチドのうち、 例えば本来の多量体蛋白質とその受容体と の結合を阻害する等の機作により、 多量体蛋白質の生物学的作用を阻害する生理 活性を持つものも、 その作用の夕一ゲッ卜に対する阻害物質として医薬品として の利用が可能である。
具体的には、 前記のポリエチレングリコール化された AS1051は、 CHH-B及び AS1 051と同様の血小板凝集阻害活性を保持し、 さらに動物投与における抗原性が見 られないことから、 抗血栓薬として利用することができる。
医薬組成物において、 本発明のペプチドは、 そのままの形態でも良く、 薬学的 に許容される塩であつもよい。 これらは 1種または 2種以上の混合物として使用 することもできる。 また、 他の有効成分を有していても良い。 さらに、 通常製剤 に用いるその他の材料、 例えば血清アルブミン等の蛋白質、 緩衝剤、 浸透圧調整 のための塩、 担体、 賦型剤等の成分を配合しても良い。
剤型としては錠剤、 カプセル剤、 細粒剤、 シロップ剤、 坐剤、 軟膏剤、 注射剤、 点眼剤等を挙げることができる。 これらのうちで注射剤が好ましい。 また、 投与 方法は静脈内投与、 皮下投与、 筋肉投与、 経口投与、 点眼投与、 経腸投与等のい ずれの方法であっても良いがこれらのうちで静脈内投与、 皮下投与、 筋肉投与等 が好ましい。
動物あるいはヒトに投与する際の投与量は、 例えばポリエチレングリコール化 AS1051の場合には、 同ペプチドの量として、 通常 0. 1 g/kg〜； I00mg/kgの範囲で 所期の効果が期待でき、 この範囲で最も優れた薬効が得られる量を選択できる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例 1 CHH-B a鎖蛋白質の遺伝子クローニング
CHH- Β α鎖蛋白質の遺伝子クローニングは、 N. Fukuchiらの方法 （W0 95/08573) にしたがって行った。 詳細には、 以下に示す手順で行った。
< 1 >クロ夕ルス ·ホリダス ·ホリダスの c D N Aライブラリーの作製
( 1 ) クロ夕ルス ·ホリダス ·ホリダスからの mR N Aの抽出
クロ夕ルス ·ホリダス ·ホリダスの毒腺を摘出し、 直ちに液体窒素にて凍結し、 使用時まで保存した。 この毒腺 1.7gを R N A抽出液 （4 M 塩酸グァニジゥムィ ソチオシァネート、 0.1M トリス塩酸 (pH7.5)、 1 % ?—メルカプトエタノール、 0. 1%ラウリルザルコシルナト リウム塩） 20ml中でポリ トロンホモジナイザ一 (キネマティ力社製） を用い破砕した。 この破碎液を 10000 X Gで 10分間遠心分 離し、 不溶物を取り除いた後、 上清を超遠心分離チューブ中の等量の密度平衡化 緩衝液 （4M塩化セシウム、 lOmM エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム、 pH7.5) に重層し、 30000rpm、 18時間、 20°Cで遠心分離し、 全 R N A 600 /gを分離した。 全 R N Aからの mR N Aの調製は、 POLY(A)Quik mRNA抽出キット （ストラ夕ジ —ン社製） を用い、 キットのプロトコ一ルに従って行った。 即ち、 取得された全 RNAのうち 500〃gをオリゴ dTカラムに吸着させ、 高塩緩衝液 200 /1で 2回、 低塩緩衝液 200 zlで 3回カラムを洗浄後、 65° (、 200 /1の溶出緩衝液を 4回カラ ムを通過させることにより、 mRNA (10〃g) を分離精製した。
(2) cDNAの合成
cDNAの合成は、 Time Savor DNA合成キッ ト （フアルマシア社製） を用い、 キットのプロトコールに従って行った。 即ち、 精製した mRNA3〃gに、 ラン ダムへキサマ一プライマー 0.3〃g、 ImMジチオスレィ トール、 逆転写酵素を含む ファーストストランド反応液を混合し、 37°Cで 1時間反応させてファーストスト ランドを合成した。
この反応液を大腸菌 RNaseH、 大腸菌 D N Aポリメラーゼを含むセカンドストラ ンド反応液に混合し、 12°Cで 30分、 22°Cで 1時間反応させて cDNAを合成した。 さらに 65°Cで 10分ィンキュペートした後、 反応液をフエノール/クロ口ホルム処 理し、 酵素を失活させた。 次にキット添付のゲル濾過スパンカラムを用い、 400 X Gで 2分間遠心分離することにより未反応のプライマ一を除去し、 二本鎖 c D NA (3 /g) を得た。
(3) c DNAライブラリーの作製
上記で得られた二本鎖 c DN Aの両端に、 TimeSavorDNAキッ卜に添付の Eco RI/Notlアダプターを、 キットのブロトコールに従って連結した。 即ち、 cDN A3〃g、 EcoRI/Notlアダプタ一 3〃1、 ポリエチレングリコール緩衝液 30 zl、 八丁 溶液1 1、 T4DNAリガ一ゼl〃lを混合し、 16°Cで 1時間連結反応を 行った。 更に反応液を 65°Cで 10分ィンキュベ一卜して酵素活性を失活させた後、 八丁？溶液1.5〃1、 T 4ポリヌクレオチドキナーゼ 1〃1を加え、 37°Cで 30分反 応させ、 アダプタ一の 5' 末端のリン酸化を行った。 この後、 反応液を 65°Cで 10 分ィンキュベ一トし、 さらにフヱノール/クロ口ホルム処理を行って酵素活性を 失活させた。 次にキッ ト添付のゲル濾過スピンカラムを用い、 反応液を 400XG で 2分遠心分離することにより未反応のアダプタ一を除去した。
アダプタ一を両末端に連結した cDN Aを、 ラムダファージベクター; ZAPII (ストラタジーン社製） の EcoRI部位に連結して、 組換えファージ DNAを作製 した。 即ち、 アダプターを連結した cDNA400ngに対し、 人 ZAPII/EcoRI/CIA Pアーム l g、 連結緩衝液 （lOOmM トリス塩酸 (pH7.6)、 25mM塩化マグネシゥ ム、 300mM塩化ナトリウム） を添加し、 さらに T 4 DN Aリガ一ゼを含む酵素液 B液 （宝酒造 （株） 製 ライゲーシヨンキット） を等量添加し、 26°Cで 10分連 結反応を行った。
上記のようにして得られた組換えファージ D N Aのパッケージングは、 パッケ —ジングキヅト GIGAPACKII GOLD (ストラ夕ジーン社製） を用い、 キッ卜のプロ トコ一ルに従って行った。 即ち、 上記の cDNAを連結した； IZAPIIアーム DN A 3〃gとキヅ トのパッケージング抽出液を混合し、 22°Cで 2時間反応させるこ とによりパッケージングを行った。 この反応液に 500 zlのファージ希釈液 （0.58 % 塩化ナトリウム、 0.2% 硫酸マグネシウム、 50mM トリス塩酸（pH7.5)、 0.01 % ゼラチン） を添加した。
得られた組換えファージのタイ夕一をチェックした後、 ファージのパッケージ ング反応液の半量を用い、 受容菌として大腸菌 E. coli XL-1 Blue (ストラ夕ジ —ン社製） を用いてファージライブラリ一を作製した。 即ち、 直径 150誦のブラ ーク形成培地 （パクトトリプトン 1%、 酵母エキス 0.5%、 塩化ナトリウム 0.5%、 硫酸マグネシウム ImM、 マルトース 0.2%) 10枚に、 1プレート当たり 20，000プ ラークになるように、 ファージ希釈液で希釈したファージと受容菌をプレーティ ングし、 37°Cで 12時間培養して、 組換えファージのライブラリ一を得た。
く 2 >目的遺伝子単離のためのプローブ DN Aの取得
(1) RT— PCR法による目的遺伝子部分断片の増幅
クロ夕ルス ·ホリダス ·ホリダスからの全 RN Aを材料として、 RT—PCR 法によりフォンビルブラント因子の血小板結合阻害べプチドをコードする DNA 断片の増幅を行った。
配列番号 1に記載のペプチドのアミノ酸配列 （N. Fukuchi et al.、 前述） を もとに、 コドンの縮重の少ない箇所をえらび、 RT— PCR (逆転写ポリメラ一 ゼ連鎖反応） 用のプライマ一を作製した。 プライマーはバイオロジカ社に依託し て化学合成した。 これらのプライマーの塩基配列を配列表配列番号 2、 3に示す。 但し、 配列番号 2において、 3番目及び 6番目のヌクレオチドは A及び Gの、 1 2番目のヌクレオチドは T、 C、 A及び Gの混合物である。 また、 配列番号 3に おいて、 3番目のヌクレオチドは T、 C、 A及び Gの、 6番目及び 15番目のヌ クレオチドは T及び Cの、 9番目のヌクレオチドは A及び Gの混合物である。 前記と同様にして調製したクロ夕ルス ·ホリダス ·ホリダスの全 RNAに対し、 上記プライマ一を用いて RT— P CRを行った。 ファーストストランドの合成は 全 RNA5 gに対し、 逆転写酵素 SUPERSCRIPT II(GIBC0社製） 2.5 /1、 酵素液 に添付のファーストストランド緩衝液 20 1、 0.1Mジチオスレィ トール 10//1、 1 0 mM dNTP 5 1を混合し、 42°Cで 1時間反応させてファーストストランドを 合成した。 反応液を 95°Cで 5分インキュベートして逆転写酵素を失活させた。 次 にこのファーストストランドを錶型として P CR反応を行った。 即ちファースト ストランド反応液 5 1、 P CR反応緩衝液 10〃1、 lOmM dNTP 5〃1、 ブラ イマ一各 800pmol、 Taqポリメラーゼ 10uを混合し、 DN Aサーマルサイクラ一
(パーキンエルマ一社製） を用い、 95°C0.5分、 52°C1分、 72°C2分を 1サイク ルとして 25サイクルの反応を行った。
この P CR反応液を 2 %ァガロースゲル電気泳動に供し、 増幅 DN Aを解析し た。 その結果、 約 300塩基対の位置に DN Aのバンドが観察された。
( 2 ) 増幅断片の塩基配列決定
上記のようにして増幅された DN A断片を、 pCR-ScriptSK ( + ) クローニング キット （ストラタジーン社製） を用い、 キットのプロトコールに従ってプラスミ ドにサブクローニングした。 即ち、 PCR反応液に、 ライゲーシヨン緩衝液、 1 mM ATPs ベクターとして pCRscript (ストラタジーン社製） 10ng、 制限酵素 Srfl を 5 units, 及び T4DNAリガ一ゼを添加混合し、 25°Cで 1時間連結反応を行 つた後、 反応液を 65°Cで 10分インキュベートしリガーゼを失活させた。 この反応 物を用いて、 コンビテントセル法により E. coli DH 5 αを形質転換し、 L— A pプレート （パクト トリプトン 1 %、 酵母エキス 0.5%、 塩化ナトリウム 0.5%、 アンビシリンナトリゥム 100 zg/ml) にプレーティングして 37°Cで 18時間培養し た。 コロニーを形成した菌体をプレートから分離し、 その一部を液体培養し、 ァ ルカリ法 （モレキュラークロ一ニング 2版 Vol.1 Cold Spring Harbor Press編） によりプラスミ ドの調製を行った。 このプラスミ ドを pCHAprobeと命名した。 pCHAprobeのクロ一ニング断片の塩基配列を、 DN Aシーケンサ一 A373 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を使用し、 プライマ一として M13M4あるい は M13reverse (宝酒造 （株） 製） を用い、 同シーケンサ一の使用法に従って dye Terminator法により解析した。 その結果、 クロ一ニングされた DN A断片は 272 塩基対からなり、 配列番号 4に示す塩基配列を有していた。 この配列をアミノ酸 に翻訳してみたところ、 求めるペプチドの一部に相当し、 得られたクロ一ニング 断片が目的ペプチド CHH-Bひ鎖蛋白質のサブユニット （AS1051) をコードする遺 伝子の一部であることが証明できた。
(3) プローブの標識
pCHAprobeを、 クローニングされた挿入断片の両端に存在する制限酵素 Sacl、 B a HIで切断し、 2 %ァガロースゲル電気泳動により 340塩基対の大きさの DN A 断片を分離し、 DNA回収キット （夕カラ EAS YTRAP ：宝酒造社製） を用 い、 キットのプロ トコールに従って DNAを回収した。 この DNA25ngを、 [ひ 一32 P]d CTP及びランダムプライマ一ラベリングキット （宝酒造社製） を用 い、 ラジオアイソトープラベルした。 ラベル反応液から、 ゲル濾過 Nickカラム (フアルマシア社製） を用いて未反応の [ひ一32 P]dCTPを除去し、 ラベル化 プローブを得た。
< 3 >プラークハイブリダィゼーシヨンによる目的遺伝子の取得
cDNAファージライブラリーから AS1051ぺプチドの全長をコ一ドする遺伝子 を、 上記プローブを用いたプラークハイブリダイゼ一シヨンによりスクリーニン グした。
前記のようにして人 ZAPIIcDNAファージライブラリーのプラークを形成さ せたプレートから、 ナイロンフィルターハイボンド N (アマシャム社製） に、 フ ィル夕一添付の説明書に従ってプラークを転写させた。 このフィル夕一をアル力 リ処理してファージを溶解した後、 80°Cで 2時間べ一キングすることによりファ —ジ DN Aをフィル夕一に固定した。
このフィル夕一を、 32Pラベル化プローブ 1 xl06cpm/mlと、 5 X S SPE緩 衝液 （20XSSPC： 3.6M塩化ナトリゥム、 0.2Mリン酸ナトリゥム緩衝液 pH7.7、 20m M EDTAニナトリウム） 、 30%ホルムアミ ド、 5 Xデンハルト溶液 （100xデンハ ルト溶液： 2 %ゥシ血清アルブミン、 2%フイコール 400、 2%ポリビニルピロ リ ドン） 、 及び 0.5% SD Sを含む溶液中で、 37°Cで 16時間ハイブリダィズさせ た。 この後、 フィル夕一を 6 X S S C (20XSSC： 3M塩化ナトリウム、 0.3Mクェ ン酸三ナトリウム） 、 0.1% S D S中で室温にて 2回、 さらに 2 X S S C、 0.1% SD S中で 50°Cにて 2回洗浄し、 フィル夕一に非特異的に結合したプローブを除 去した。 このフィル夕一を X線フィルム HP20 (フジフィルム （株） 製） に一 80 °Cで 24時間露光させた。 ファージプレートから、 フィルムの陽性スポットに相当 する位置のクローンを単離し、 一次スクリーニング陽性クローンとした。 同様の スクリーニング作業を繰り返し、 単一プラークを形成する陽性クローンを取得し た。
得られた陽性クローンの人 ZAPIIcDNAファージに、 ヘルパーファ一ジ ExAss ist (ストラタジーン社製） を感染させ、 非アンバーサブレッサ一大腸菌である SOLRセル （ストラタジーン社製） に感染させることにより、 cDNA断片が プラスミ ド pBluescriptSK (―) (ストラタジーン社製） の EcoRI部位に挿入された プラスミ ドを保持する大腸菌を得た。 この菌体からアルカリ SD S法にてプラス ミ ドを調製し、 DNAシーケンサー A373 (アプライ ドバイオシステムズ社製） を用い、 挿入断片の塩基配列を決定した。
その結果、 4つの陽性クローンが求めるぺプチドをコ一ドする塩基配列を有し ており、 それそれを保持しているプラスミ ドを pCHAl、 pCHAZ, pCHA3及び pCHA4と 命名した。 なお pCHAlを保持する Ε· coli HBlOl/pCHAl (E. coli AJ13023) は、 平成 6年 8月 12日より、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便 番号 305- 8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号） に、 FERM BP- 4781の受 託番号のもとでブダぺスト条約に基づき国際寄託されている。 上記のようにして クロ一ニングされた AS1051ぺプチドをコードする遺伝子の塩基配列を、 配列表配 列番号 5に、 この遺伝子によってコードされるぺプチドのアミノ酸配列を配列番 号 6に示す。 尚、 この遺伝子は、 翻訳開始アミノ酸であるメチォニン以下 23アミ ノ酸からなる典型的な分泌シグナルを有している。 実施例 2 CHH-Bひ鎖蛋白質 （AS1051) の大腸菌による発現系の構築
< 1 >野生型 CHH-Bひ鎖蛋白質の発現系の構築 変異を入れない CHH- Bひ鎖蛋白質 （AS105卜 WT) の大腸菌による発現系の構築は、 実施例 1で得られた遺伝子を用いて以下の通り行った。 クローニングした遺伝子 を用い、 大腸菌発現生産用べクタ一を構築した。
AS1051ペプチドをコードする遺伝子 （シグナルペプチドを除く） を発現べクタ 一に組み込むため、 P C R法により増幅するための D N Aプライマ一を合成した。 その際、 5 ' 末端側のプライマ一としては、 増幅断片の 5， 末端に Ncol部位を持 たせるように、 Ncol認識配列を含むプライマ一 （ASBN :配列番号 7 ) を用いた。 また、 このプライマ一は 5 ' 末端側に AS1051ペプチドの N末端アミノ酸のァスパ ラギン酸のコドンの前に翻訳開始コドンである塩基配列 A T G (配列番号 7にお いてヌクレオチド番号 10〜12) を有している。 尚、 この開始コドンは、 Ncol認識 配列 （配列番号 7においてヌクレオチド番号 8〜13) と重複している。 一方、 3 ， 側のプライマーとしては Hindl l l認識配列を含むプライマーを用いた （配列番 号 8、 Hindll l認識配列はヌクレオチド番号 4〜9) 。
上記プライマ一を用いた P C R反応により、 AS1051ぺプチドをコードする遺伝 子を増幅した。 PCR反応は、 94°C15秒、 35°C 1分、 72°C 2分を 1サイクルとし、 2 5サイクル繰り返した。 PCR反応液をフエノール /ク口口ホルム処理して T a qポ リメラーゼを失活させ、 増幅された 400塩基対からなる D N A断片をエタノール 沈殿法により精製した後、 制限酵素 BamHIと Hindlllで消化した。 この D N A断片 と、 制限酵素 BamHIと Hindl l lで消化したプラスミ ド pUC18 (宝酒造社製） をライ ゲーシヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結した。 得られたプラスミ ドを用い てコンビテントセル法にて E. coli JM109を形質転換し、 アンピシリン含有プレー トにて 37° (、 16時間培養し形質転換体を得た。
生育した形質転換体からアルカリ S D S法にてプラスミ ドを調製した。 M13M4 プライマ一と M13RVプライマー （ともに宝酒造社製） を用い、 377PRISM DNAシ一 ケンサ一 （パーキンエルマ一社製） を用いて塩基配列を決定することにより、 目 的のプラスミ ドが構築されていることを確認した。 作製したプラスミ ドを pUCASB NHと命名した。 1^八88冊を制限酵素^01と^11(1111で消化し、 ァガロースゲル電 気泳動にて 400塩基対の DNAを分離精製した。 この DNAを発現ベクター pTrcHisA
(インビトロゲン社製） を制限酵素 Ncolと Hindl l lで消化したものとライゲーシ ョンキットを用いて連結した。 得られたプラスミ ドを用いてコンビテントセル法 にて E. coli JM109を形質転換し、 アンビシリン含有プレートにて 37°C、 16時間培 養し形質転換体を得た。 この様に作製した発現ベクターを pTrcASWTと命名した。 以上のプラスミ ドの構築過程を図 1に示す。
< 2〉変異型 CHH-Bひ鎖蛋白質の発現系の構築
81番目のシスティン残基をァラニン残基に変異した蛋白質 （AS105卜 Ala) の大 腸菌による発現系の構築は、 以下の通り行った。 PCR protocols (Academic Press版） に記載の部位特異的塩基配列変異法により、 AS1051ペプチドのジスル フィ ド結合に関与していないシスティン残基 （配列番号 1において第 81番目のシ スティン残基） をァラニンに置換するように AS1051遺伝子に変異を導入した。 pC HA1を錡型にプライマー ASBN (配列番号 7 ) と新たに合成したプライマ一 ASAlaR (配列番号 9 ) を用い、 あるいはプライマ一 ASH (配列番号 8 ) と新たに合成し た ASAlaF (配列番号 1 0 ) を用い PCR反応を行った。 それそれの反応生成物をァ ガロースゲル電気泳動に供し、 ゲルから増幅 MA断片を抽出した。 これらの DNAを 錶型にプライマ一 ASBNと ASHを用い、 2回目の PCR反応を行い、 変異遺伝子を作製 した。
PCR増幅 DNAを制限酵素で消化し、 ァガロースゲル電気泳動に供し、 ゲルから 40 Obpの MAを抽出した。 この0^を制限酵素8310111と^11(1111で消化した。 この DNA断 片と、 制限酵素 BamHIと Hindl l lで消化したプラスミ ド pUC18 (宝酒造社製） をラ ィゲーシヨンキット （宝酒造社製） を用いて連結した。 得られたプラスミ ドを用 いてコンビテントセル法にて E. coli JM109を形質転換し、 アンピシリン含有プレ —トにて 37° 16時間培養し形質転換体を得た。
生育した形質転換体からアルカリ SDS法にてプラスミ ドを調製した。 M13M4ブラ イマ一と M13RVプライマ一 （ともに宝酒造社製） を用い、 377PRISM DNAシーケン サ一 （パーキンエルマ一社製） を用いて塩基配列を決定することにより、 目的の プラスミ ドが構築されていることを確認した。 作製したプラスミ ドを pUCASAlaと 命名した。 pUCASAlaを制限酵素 Ncolと Hindi I Iで消化し、 ァガロースゲル電気泳 動にて 400塩基対の DNAを分離精製した。 この DNAを発現べクタ一 pTrcHisA (イン ビトロゲン社製） を制限酵素 Ncolと Hindl l lで消化したものとライゲ一シヨンキ ットを用いて連結した。 得られたプラスミ ドを用いてコンビテントセル法にて E. coli JM109を形質転換し、 アンピシリン含有プレートにて 37°C、 16時間培養し形 質転換体を得た。 この様に作製した発現ベクターを pTrcASAlaと命名した。 以上 のプラスミ ドの構築過程を図 2に示す。 実施例 3 AS105卜 WT及び AS105卜 Alaの E. coliによる生産ならびに AS1051- WT及び
AS1051- Alaの卷き戻しによる活性体の取得
< 1 >AS1051- WT及び AS105卜 Alaの封入体の調製
AS1051-WT及び AS105卜 Alaのそれそれの発現べクタ一 pTr.cASWT及び pTrcASAlaを それそれ保有する形質転換 E. coli JM109を、 坂口フラスコを用いて L-broth (バ クト トリプトン 1 °ん 酵母エキス 0.5%、 塩化ナトリウム 0.5%、 アンビシリンナト リウム 100〃g/ml) 中、 37°Cにて培養し、 濁度が 0.5に達したときに IPTG (イソ プロピル一/?—チォガラクトビラノシド） を 10mMになるように添加し、 さらに 37 °Cで 4時間培養を行った。 菌体を遠心分離により回収、 洗浄後、 0.5M EDTA溶液に 菌体を懸濁しリゾチームを加えて室温で 1時間静置した。 菌体の懸濁液を超音波 破砕機 （200W、 5分） を用いて破砕し、 破碎液を遠心分離することにより封入体
( inclusion body) を沈殿として得た。
< 2 >AS1051-WT及び AS1051-Alaの巻き戻しによる活性体の取得
得られた封入体を、 7M塩酸グァニジン及び 10mM EDTAを含む 0.5Mトリス塩酸緩 衝液 （pH8.5) に溶解した後、 2.5倍量の蒸留水を加え、 4 °Cでー晚静置した。 溶 液を Spectra Porl (Spectra社製） を用いた透析膜を用いて、 0.9%食塩水に対し て透析を行い、 塩酸グァニジンを除いた。 AS105卜 WT及び AS1051-Alaそれそれの 透析前後の溶液を逆相カラム （Pegasil 0DS300, センシュ一科学社製） を用いて 高速液体クロマトグラフィー （HPLC) により分画した結果を図 3に示した。 図 3 中、 a) は透析前、 b) は透析後である。 AS1051-Alaは、 塩酸グァニジンを除去し ても安定であるが、 AS105卜 WTは透析による塩酸グァニジンの除去により、 巻き 戻しにより得られた蛋白質が不溶化することが分かった。
AS1051-Alaの透析後の溶液は、 1 / 9容の 0.5M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH4. 5) を加えた後、 CM-T0Y0PEML 650S (2.6x40cm) を用いたイオン交換カラムに吸 着させ、 溶出液 A (50mM酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH4.5) ) 及び溶出液 B (0.5 M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.4) ) を用いて溶出させた。 溶出条件は、 A:B=75 ： 25の溶液で 20分溶出させた後、 A: B=75： 25から A: B=50： 50へのリニアグラジェン ト （30分） で溶出するというものであった。 こうして、 精製された AS1051- Alaを 含む溶出画分を得た。 実施例 4 AS1051- Alaのモルモットに対する抗原性試験
81番目のシスティン残基をァラニン残基に変異した AS1051蛋白質 （AS105卜 Ala) の、 モルモットに対する抗原性を確認するための試験は以下のように行った。 な お、 タンパク質量の定量は、 Bio-Rad Protein Assay (Bio- Rad社製） を用いたマ イクロアッセィ法により、 ゥシ血清アルブミン （BSA) をスタンダードとして行 つた。
Hartley系モルモット （雌、 体重 200〜250g) を用い、 耳介静脈より AS105卜 Ala (300 /g/kg) あるいは生理的食塩水を隔日で 3回投与した。 投与用量は lml/kg で行い、 ともに n=10で行った。 3回目の投与から 3週間後、 各投与群を二分しそ れそれに AS1051- Ala ( 300 zg/kg) (n=5ずつ） あるいは生理食塩水 （n=5ずつ） を投与し、 約 20分後にエーテル麻酔下において開腹し、 23G注射針を用いて腹部 大動脈より 8ml採血 （0.38%クェン酸ナトリウム添加） した。 採血した血液中の血 小板数を、 自動血球計測装置 （Sysmex E- 2000、 東亜医用電子社製） を用いて測 定した。 結果を図 4に示す。 前投与及び最終投与がともに AS1051-Alaである群 (AS/AS群） のみに血小板の著しい減少が見られた。 前投与が生理食塩水で最終 投与が AS1051-Alaである群 （sal ine/AS群） では、 血小板数がコントロール群 (前投与及び最終投与ともに食塩水 （saline/saline群） ） と差がなかったこと から、 AS/AS群で見られた血小板減少が、 前投与によって与えられた AS1051-Ala の抗原性に起因するものであると考えられた。
さらに採血した血液から、 遠心分離 （4°C、 2700rpm, 10分） によって血漿を分 離し、 AS105卜 Alaに対する抗体の存在を ELISA (enzyme-linked immunocorbent assay) 法を用いて測定した。 ELISA用 96穴プレートの各ゥエルに AS1051- Ala ( 1 g/ml) あるいは緩衝液のみを 50 z l加え、 4 °Cで一晩放置し、 コーティングを 行った後、 0.05%Tween-20を含む PBS ( phosphate-buff erd saline) で 3回洗浄し、 5%スキムミルクを溶かした PBS ( 150 1) を加えてブロッキングを行った。 さら に 3回洗浄を行った後、 採取したモルモット血漿 50 1を加え、 37°Cで 1時間放 置後、 3回洗浄し、 アルカリフォスファターゼ標識ゥサギ抗モルモット IgG(H+L) 抗体 （zymed社製） を希釈バッファー （0.05Mトリス塩酸 （pH8.1 )、 lmM MgC , 0. 15M NaC 0.05% Tween- 20、 0.02% NaN3、 ゥシ血清アルブミン） で 500倍に希 釈した溶液を 50 1加え、 37°Cで 1時間放置した。 各ゥエルを 3回洗浄後、 lmg/m 1の発色基質 ( p-N i trophenyl phosphate ) 溶液 ( 1Mジェタノ一ルァミン（pH9.8)/ 0.5mM MgCL ) を加え、 適当時間反応後、 405nmの吸光度を測定した。 図 5に、 AS /sal ine群と saline/sal ine群の AS1051- Alaコーティング (AS1051) 及び非コ一テ イング （None) のゥエルにおける吸光度を示した。 その結果、 AS/saline群では、 AS1051-Alaに結合する抗体の存在が示された。 実施例 5 AS1051のポリエチレングリコール化蛋白質 （AS1051-PEG) の調製 ( 1 ) 分子量 5000の PEG化試薬を用いた方法
本発明のポリエチレングリコール化蛋白質 （AS1051- PEG) の調製は以下に示す 方法により行った。 実施例 3と同様にして E. coliを用いて調製した AS105卜 WTの 封入体を、 7M塩酸グァニジン及び lOmM EDTAを含む 0.5Mトリス塩酸緩衝液 （pH8.5) に溶解した後、 2.5倍量の蒸留水を加え、 4 °Cでー晚静置した。
さらに、 この溶液に 0.2mg/mlの濃度になるようにマレイミ ド基を持つ分子量約 5000のポリエチレングリコール化試薬 (Methoxy- PEG- mal，MW5000、 Item No. ： M- MAL- 5000、 Shearwater Polymers社製） を添加し、 3時間室温で静置した。 この 溶液を、 Spectra Porl (Spectra社製） を用いた透析膜を用いて、 蒸留水に対し て透析を行い、 塩酸グァニジンを除いた。 透析後の溶液は 1 / 9容の 0.5M酢酸ァ ンモニゥム緩衝液 （pH4.5) を加えた後、 CM- T0Y0PEARL 650S (2.6 x 40cm) を用 いたイオン交換カラムに吸着させ、 溶出液 A (50mM酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH 4.5) ) 及び溶出液 B (0.5M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.4) ) を用いて溶出さ せた。 溶出条件は、 A:B=80 :20から A:B=70 : 30へのリニアグラジェント （20分） で 溶出ざせた後、 A:B=70: 30から A:B=55 :45へのリニアグラジェント （30分） で溶出 するというものであった。 こうして、 精製された AS1051- PEGを含む溶出画分を得 た。
( 2 ) 分子量 20000の PEG化試薬を用いた方法
本発明の分子量 20000のポリエチレングリコール化試薬 （Methoxy- PEG-mal,MW2 0000、 Item No.： M-MAL-20000, Shearwater Polymers社製） を用いた AS1051のポ リエチレングリコール化蛋白質 （AS1051-PEG20000) の調製は以下のように行つ た。 実施例 3と同様にして E. col iを用いて調製した AS105卜 WTの封入体を、 7M 塩酸グァニジン及び 10mM EDTAを含む 0.5M トリス塩酸緩衝液 （pH8.5) に溶解し た後、 2.5倍量の蒸留水を加え、 4 °Cで一晩放置した。
さらに、 この溶液に 0.8mg/mlになるようにマレイミ ド基を持つ上述の分子量 20 000のポリエチレングリコール化試薬を添加し、 3時間室温で静置した。 この溶 液を Spectra Por 1 (Spectra社製） を用いた透析膜を用いて、 生理食塩水に対し て透析を行い、 塩酸グァニジンを除いた後、 TSK-gel CM-5PW (0.75 x 7.5cm) を 用いたイオン交換カラムに吸着させ、 溶出液 A (50mM酢酸アンモニゥム緩衝液 (PH4.5) ) 及び溶出液 B (0.5M酢酸アンモニゥム緩衝液 （ρΗ6·4) ) を用いて 溶出させた。 溶出条件は A:B=100 :0から A:B=40:60へのリニアグラジェント （20分） で溶出させた後、 A:B=40 :60から A:B=0: 100へのリニアグラジェント （5分） で溶 出するというものであった。 こうして、 精製された AS1051-PEG20000を含む溶出 画分を得た。 実施例 6 AS1051-PEGの構造
得られた AS1051-PEGの分子量は、 SDS電気泳動によりポリエチレングリコール 化されていない前述の AS1051-Ala ( 15Kda) に比べ、 約 lOKda大きい 25Kdaであつ た。 ポリエチレングリコールは SDS電気泳動においては、 水和により本来の分子 量の 2倍の大きさとして観察されることから、 1分子の AS105卜 PEGに 1分子のポ リエチレングリコール （分子量約 5000) が結合していることが確かめられた。 ま た、 AS105卜 PEG20000の分子量は、 AS1051-Alaに比べ、 約 40Kda大きい 55Kdaであ り、 AS1051- PEGと同様に 1分子の AS1051-PEG20000に 1分子のポリエチレングリ コール （分子量約 20000) が結合していることが確かめられた。 次に、 AS105卜 PEG中のポリエチレングリコールの結合位置とその他のシスティ ン残基のジスルフィ ド結合様式の決定を、 以下のように行った。 AS105卜 PEG ( 1 00 g) を MI EDTAを含む 0.1Mトリス塩酸緩衝液 (pH8.5)中でリジルェンドぺプチ ダ一ゼ （5〃g、 和光純薬社製） によって 37°Cで 5時間消化を行い、 逆相カラム
(Vydac 218TP54, Vydac社製） を用いた高速液体クロマトグラフィーを用いて分 取した。 溶出は、 0.1%トリフルォロ酢酸 （trifluoroacetic acid, TFA) を含む 水/ァセトニトリルのリニアグラジェント （0→50%ァセトニトリル/ 10分、 50 100%ァセトニトリル /5分） により行った。 こうして、 リジルエンドべプチダー ゼで消化されたペプチド鎖をピーク 1 〜 6として分取した （図 6 ) 。
各べプチド鎖のアミノ酸配列分析は、 プロティンシークェンサ一 model476A
(アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて行った。 ピーク 3は鎖内に 2残基 システィン残基を含むことから、 両システィン残基同士がジスルフィ ド結合を形 成していると結論した。 また、 ビーク 5はシスティン残基を 1残基含む 2本のべ プチド鎖と、 システィン残基を 2残基含む 1本のペプチド鎖がジスルフィ ド結合 によって結合した、 合計 3本のペプチド鎖より成るものであった。 このビーク 5 のペプチド鎖を、 さらに lOmM炭酸アンモニゥム緩衝液中で V8プロテア一ゼ （5 g、 和光純薬社製） によって 25°Cで 24時間消化を行い、 逆相カラム （Pegasil 0DS- II、 センシュ一科学社製） を用いた高速液体クロマトグラフィーを用いて分取した。 溶出は、 0.1%トリフルォロ酢酸 （trifluoroacetic acid, TFA) を含む水/ァセ トニトリルのリニアグラジェント （0 50%ァセトニトリル/ 20分） により行った。 こうして V8プロテア一ゼで消化されたべプチド鎖を分取し、 アミノ酸配列分析を 行った。
その結果、 ポリエチレングリコール鎖は配列番号 1のアミノ酸番号 8 1番目に 対応するシスティン残基に結合していること、 及び、 図 6に示したようなジスル フィ ド結合をピーク 5のペプチドが有することが判明した。 以上の様に決定され た AS1051-PEGのジスルフィ ド結合様式は、 報告されている AS1051 (N. Fukuchi e t al .、 W0 95/08573) 、 あるいは他の類似の蛇毒由来蛋白質と同様であった。 実施例 7 AS1051-PEGのィンビトロにおける活性
< 1 >血小板凝集に対する AS1051-PEGの阻害活性の測定
実施例 5で得られた AS1051-PEGの血小板凝集に対する阻害活性の測定は、 以下 の方法で行った。 まず、 静脈より採血したヒト血液に 0.38%クェン酸ナトリウム を加えた後、 lOOOrpm, 15分間遠心分離を行い、 多血小板血漿を得た。 AS1051-PE G及び AS1051- Alaの血小板凝集阻害活性は、 血小板凝集測定装置 （HEMA TRACER 8 01、 二光バイオサイエンス社製） によって測定した。 100 / 1の多血小板血漿にあ らかじめ被験サンプルを加え、 37°Cで 2分間撹拌、 インキュベートした後、 1/10 容の 10倍濃度の凝集惹起物質を加え、 8分間血小板凝集の様子を観察した。 凝集 惹起物質として、 リストセチン （1.2mg/ml、 シグマ社製） 、 コラーゲン （10〃g/ ml、 ェムシーメディカル社製） 、 アデノシン二リン酸 （10 zM、 ェムシ一メディ カル社製） を用いた。 図 7に示した通り、 AS1051-Alaに比べ AS1051-PEGのリスト セチン凝集阻害活性は若干強かった。 また、 AS1051- Ala及び AS1051- PEGはともに コラーゲンによる凝集及びアデノシン二リン酸による凝集を阻害しなかった。 < 2 >血小板に対するフォンビルブラント因子 （vWF) 結合阻害活性の測定
AS1051- Ala及び AS1051- PEGの血小板と vWFとの結合に対する阻害を、 固定化血 小板と1 2 51ラベル化フォンビルプラント因子 （vWF) を用いて調べた。
1 2 5 1ラベル化 vWFを、 以下の方法により調製した。 1 2 51ラベル化を行うチュー ブは、 予め lodogen (Piearce社製、 0.5mg/ml) のジクロロメタン溶液 1.5mlを加 えた後、 窒素気流下で溶媒を除去し、 lodogenの固相化を行った。 ゲル濾過によ り得た高分子量 vWF (0.19mg/1.5ml) を lodogenを固相化したチューブに入れ、 Na 1 2 51、 18.5Mbqを加えて室温で 2分間反応させた後、 あらかじめゥシ血清アルブ ミン （BSA) でブロッキングし洗浄した PD10 (Pharmacia Biotech社製） カラムに アプライし、 TBS (20mM Tris-HCl (pH7.4) , 0.15M NaCl) で溶出を行った。 溶出 液は、 0.5mlずつフラクション分取し、 各フラクションの1 2 5 1比活性をガンマ力 ゥン夕一 Packard Multi Prias 4を用いて測定した。 1 2 51- vWFを多く含むフラク シヨンを集め、 数本に分割した後、 使用まで- 80°Cで保存した。
ボトロセチンの精製は以下のように行った。 ボトロプス · ジャララ力 (Botrops jararaca) の粗毒凍結乾燥品 （Sigma社製、 V- 5625) lgを 20mlの 0.9% 食塩水に溶解後、 遠心分離により不溶物を除き、 Sephadex G-75 ( 05 x 90cm) 力 ラムを用いたゲル濾過を行った （展開溶液: 0.9%食塩水、 流速: 4ml/分） 。 15mlず つフラクション分取し、 活性画分 （フラクション No.49〜58、 150ml) を集め、 1M Tris-HCl (pH7.4) を 1/10容加えた後、 DEAE-T0Y0PEARL 650M ( 016 x 300誦） に 吸着させ、 NaClの濃度勾配 （0.15M/200分、 0.15M 0.4M/400分、 流速： 0.5ml/ 分） で溶出した。 活性画分 （570〜630分、 30ml) を集め、 精製ボトロセチンを得 た。
固定化血小板の調製は以下の様に行った。 1/10容の 3.8%クェン酸ナトリウムを 添加した、 健常人より採血した新鮮血液を 900rpmで 15分間遠心して得たヒト多血 小板血漿 （platelet rich plasma： PRP) に、 これと同容の、 2 %パラホルムァ ルデヒドを溶解した 20mMリン酸緩衝液 （pH7.4) を含む 0.15M塩化ナトリウム水溶 液を加え、 4 °Cで一晚静置保存した。 保存後、 遠心分離により血小板を回収し、 20m リン酸緩衝液 （pH7.4) を含む 0.15M塩化ナトリウム水溶液で 2回洗浄した。 洗浄後、 同溶液に固定化血小板を懸濁し、 保存した。
アツセィを行う 96ゥエルフィル夕一プレート （Millipore Multiscreen HV、 Millipore社製、 0.45〃M) は、 予め BSA/TBS ( 100 / 1) を各ゥエルに加え、 数 時間静置することによりフィル夕一のブロッキングを行った。 前述の固定化血小 板懸濁液を TBSで 10倍に希釈した懸濁液 20〃1、 被験サンプルを 5 l加え、 さらに 0.8〃g/mlのボトロセチン （上記） 、 あるいは 2.4mg/mlのリストセチン （Sigma社 製） を含む1 2 5 I-vWF溶液 （約 800, 000cpm) 20 / 1を加えて、 30分静置した。 吸引 によりゥェル中の溶液を濾過した後、 0.05% Tween-20を含む TBS ( 100 / 1) を加 え、 さらに吸引することにより洗浄を行った。 上記洗浄後の 96ゥエルフィルター プレートからパンチ （Millipore社製、 型番 APK 896 0B) を用いてフィル夕一を 離脱し、 6ml容ポリスチレンチューブに分注して、 Packard Multi Prias 4を用い て1 2 51の放射線量を測定した。
以上の結果、 図 8に示したように、 AS105卜 Alaに比べ AS1051- PEGの固定化血小 板に対するリストセチン及びボトロセチンにより惹起される vWF結合阻害活性は 若干弱いものの、 ほぼ同等であることが確かめられた。 また、 AS105卜 PEG20000 も、 いずれの方法においても AS1051-PEGとほぼ同一の活性を有していた。 実施例 8 AS1051- PEGのモルモットに対する抗原性試験
実施例 6 ( 1 ) に記載のポリエチレングリコール化蛋白質 （AS105卜 PEG、 PEG 部分の分子量が 5000のもの） と AS1051- Alaのモルモットに対する抗原性を比較す るための試験は、 実施例 4に示した方法と同様にして行った。 タンパク質量の定 量は AS1051- Alaについては実施例 4と同様に行い、 AS1051-PEGについては逆相 HP LCによる 280nmの溶出ピーク面積を、 AS105卜 Alaと比較することにより行い、 同 じ面積を同じタンパク質量とした。 AS1051- Ala及び AS1051-PEGの投与量は、 いず れの投与においても 200 g/kgとし、 AS- Ala群 （AS1051- Alaの前投与 3回、 AS105 1- Alaの最終投与） 、 AS-PEG群 （AS1051- PEGの前投与 3回、 AS1051- PEGの最終投 与） 、 及び saline群 （生理食塩水 （saline) の前投与 3回、 生理食塩水の最終投 与） の 3群に分け、 n=4 (AS- PEG群は n=3) で実験を行った。 その結果、 図 9に示 したように、 AS-PEG群は saline群に比べて血小板数の差が見られず、 AS- Ala群で は AS- PEG群及び saline群に比べ有意に血小板の減少が認められた。 この血小板減 少は実施例 4で示した様に、 抗原性に由来するものと考えられることから、 本結 果は AS1051- PEGは AS1051-Alaに対して、 明らかに抗原性が低下したことを示す。 産業上の利用の可能性
本発明により、 多量体蛋白質に由来するペプチドを、 従来の方法に比べて溶解 性及び安定性に優れ、 かつ抗原性が低下した形態で製造することができる。

Claims

請求の範囲
1 . サブュニット内及びサブュニッ ト間のジスルフィ ド結合を有する多量 体蛋白質に由来するサブュニットペプチドを製造する方法であって、 以下のステ ップを含む方法；
( a ) 前記多量体蛋白質又はそのサブユニットペプチドを、 蛋白質変性剤を用い て溶液中で変性させ、 チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキル ポリエーテルの存在下で、 前記溶液から変性剤を除き、 サブユニットペプチドの 巻き戻しを行うステップと、
( b ) 前記溶液からポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブュニットぺ プチドを単離するステップ。
2 . ステップ （ b ) で単離されるサブユニットペプチドが抗原性が低下し たものである請求項 1記載の方法。
3 . 前記多量体蛋白質が二量体である請求項 1記載の方法。
4 . 前記チオール基と反応する官能基を有するポリォキシアルキルポリェ —テルが、 マレイミ ド基を有するポリエチレングリコールである請求項 1記載の 方法。
5 . 前記多量体蛋白質に由来するサブュニットぺプチドが、 遺伝子組換え 蛋白質である請求項 1記載の方法。
6 . 前記多量体蛋白質又はそのサブュニットぺプチドを還元条件下で変性 させることを特徴とする請求項 1記載の方法。
7 . 多量体蛋白質の生理活性が、 該多量体蛋白質を構成するサブユニット ペプチドに依存し、 かつ、 ポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサプュ二 ットぺプチドが前記生理活性を有する請求項 1記載の方法。
8 . ポリオキシアルキルポリェ一テルが結合したサブュニットペプチドが、 多量体蛋白質の生理活性を阻害する活性を有する請求項 1記載の方法。
9 . サブユニットペプチドのシスティン残基のうち、 本来多量体蛋白質の サブュニット間のジスルフィ ド結合の形成に関与するシスティン残基にポリオキ シアルキルポリエーテルが結合することを特徴とする請求項 1記載の方法。
1 0 . ポリオキシアルキルポリェ一テルが結合したサブュニットペプチド が、 多量体蛋白質中の同サブユニット内のジスルフィ ド結合と同一のジスルフィ ド結合を有する請求項 1記載の方法。
1 1 . サブュニット内及びサブュニット間のジスルフィ ド結合を有する多 量体蛋白質に由来するサブュニットペプチドであって、
サブュニットぺプチドのシスティン残基のうち、 本来多量体蛋白質のサブュニ ット間のジスルフィ ド結合の形成に関与するシスティン残基にポリオキシアルキ ルポリエーテルが結合し、 抗原性が低下したサブュニットペプチド。
1 2 . 前記多量体蛋白質が、 蛇毒に由来するフォンビルブラント因子の血 小板結合を阻害する活性を有する二量体べプチドである請求項 1 1記載のサブュ ニットぺプチド。
1 3 . 前記蛇毒がクロ夕ルス ·ホリダス ·ホリダスの蛇毒である請求項 1 2記載のサブュニットぺプチド。
1 4 . 抗血栓活性を示す請求項 1 2記載のサブュニットペプチド。
1 5 . 配列番号 1に示すアミノ酸配列を有し、 同アミノ酸配列においてァ ミノ酸番号 8 1のシスティン残基にポリォキシアルキルポリエーテルが結合した ペプチド又はその誘導体である請求項 1 4記載のサブュニットペプチド。
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