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WO1999056126A2 - Immuno-adsorption matrix, a method for the production thereof, and the utilization thereof - Google Patents

Immuno-adsorption matrix, a method for the production thereof, and the utilization thereof Download PDF

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Publication number
WO1999056126A2
WO1999056126A2 PCT/DE1999/001228 DE9901228W WO9956126A2 WO 1999056126 A2 WO1999056126 A2 WO 1999056126A2 DE 9901228 W DE9901228 W DE 9901228W WO 9956126 A2 WO9956126 A2 WO 9956126A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antigen
fragments
matrix
binding
immunoadsorption
Prior art date
Application number
PCT/DE1999/001228
Other languages
German (de)
French (fr)
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WO1999056126A3 (en
Inventor
Wolfgang RÖNSPECK
Frank Gebauer
Original Assignee
Affina Immuntechnik Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affina Immuntechnik Gmbh filed Critical Affina Immuntechnik Gmbh
Priority to AU46000/99A priority Critical patent/AU4600099A/en
Publication of WO1999056126A2 publication Critical patent/WO1999056126A2/en
Publication of WO1999056126A3 publication Critical patent/WO1999056126A3/en

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    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Definitions

  • the invention relates to a new immunoadsorption matrix, processes for its preparation and its use for therapeutic, diagnostic, preparative, analytical and medical purposes.
  • An immuno-chromatographic method is referred to as immunoadsorption, in which the specific bond between the antibody and antigen is used to isolate one of the reactants from complex mixtures of biogenic origin (Carlsson, J. et al. 1989).
  • Affinity chromatography has the ability to produce molecules with the help of
  • Carrier material fixed antibodies made prior art (Goding, J.W.
  • immunapheresis In a treatment method called immunapheresis, the patient's plasma circulates in a closed circuit through columns with specific carrier-fixed antibodies, with the aid of which the concentration of the harmful component in the plasma is reduced (Stoffel, W. 1981, Ulbricht, CJ 1991). Lowering serum cholesterol with the help of LDL immunoadsorption is now recognized as a treatment method for patients with familial hypercholesterolemia (Richter, WO and Schwandt, P. 1995, Jansen, M. et al. 1996).
  • the antibodies are usually covalently bound via their primary amino groups.
  • This type of coupling requires chemical activation of the matrix with correspondingly reactive groups.
  • a preferred activation method is the formation of cyanate esters or imidocarbonates after the action of cyanogen bromide on a matrix with vicinal hydroxyl groups (Axen, R. and Ernback, p. 1971, Jacoby, WV and Wilchek, M. 1975).
  • Other common reactive groups are N-hydroxysuccinimide esters (Cuatrecasas, P. and Parikh, I. 1972) or also N-hydroxysuccinimide and imidazoyl carbonates (Wilchek, M. and Miron, T.
  • Hyperdiffusion resins are available, which are up to 50 times higher in chromatography
  • this carrier material can be activated in the same way as conventional material.
  • these antigen-binding structures must be coupled to a carrier material via a covalent bond.
  • the aim of the coupling is a high yield of coupled antigen-binding structures in relation to the amount used, coupled with the highest possible activity retention in relation to the specific binding for the antigen.
  • the problem is that covalent bonds can also occur in the region of the antigen-binding region, thereby impairing the antigen-binding properties and reducing the activity.
  • a problem with many applications is an unsatisfactory binding capacity of the immunoadsorption matrix.
  • a high binding capacity enables the use of smaller column volumes and thus saves time and material in routine use
  • the binding capacity is usually given in mg bound antigen per ml adsorption matrix, or per mg coupled antigen-binding structure. It is dependent on the affinity of the antigen-binding structure for the antigen and on the loading density, ie the amount of functionally intact antigen-binding structures which can be coupled to a certain amount of the immunoadsorption material.
  • the loading density is usually given in mmol or mg coupled antigen-binding structure per ml column matrix.
  • a high loading density is usually achieved by using a carrier material with a large available matrix surface and a high concentration of functional or reactive groups on the matrix surface, to which the antigen-binding structures can be coupled under suitable conditions.
  • a maximum binding capacity higher by a factor of 1.7 can be expected if, with the same quantitative loading, given in mg antigen-binding structure per ml carrier matrix, their F (ab) fragments are coupled instead of complete immunoglobulins. Due to the smaller molecular weight, the percentage of binding sites for the antigen is higher. The F (ab) fragment has only 1 antigen binding site. Similar increases should also apply to the coupling of single chain antibodies or peptides (with an antigen binding site) compared to complete immunoglobulins.
  • the object was achieved in that additional functional Groups are introduced into the antigen-binding structure, while the binding site for the antigen was protected.
  • antigen-binding structure All molecules that contain an antigen-binding region and can react in the sense of an antigen-antibody binding are referred to below as the antigen-binding structure.
  • Antigen-binding structures can be polyclonal or monoclonal antibodies (e.g. single chain antibodies) or fragments thereof. However, they can also be recombinant or synthetically produced peptides or proteins.
  • the antigen-binding structures can be directed against a wide variety of antigens or haptens, whereby haptens are understood to mean compounds which alone do not produce antibodies in the organism, but only after coupling to a polymeric carrier. However, they can still be bound very efficiently by antigen-binding structures.
  • Support materials to which the antigen-binding structures are covalently bound are preferably used.
  • these are matrices as carrier material, which consist of organic, inorganic, synthetic polymers or of mixed polymers and which may be chemically activated.
  • the functional groups introduced can either be suitable for coupling to a chemically activated matrix or can themselves represent an activated group which can couple to a suitable functional group of a matrix.
  • the amino groups of the antigen binding structures can e.g. reacted with succinic anhydride and the carboxyl groups introduced after activation with e.g. l-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) can be coupled to an amino-containing matrix.
  • EDC l-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • carboxyl groups of the antigen-binding structures can also be reacted with EDC and a suitable diamine and coupled to, for example, an N-hydroxysuccinimide or cyanogen bromide-activated matrix via the introduced amino group.
  • EDC succinimidyl 3 (2-pyridyldithio) propionate
  • DTT dithiothreitol
  • SH groups can be introduced, for example to a maleimido group. supporting matrix can be coupled.
  • SH groups Another possibility for the introduction of SH groups is the reaction with N-succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA) and aftertreatment with hydroxylamine. SPDP and SATA have the advantage over the Traut see reagent that the SH group is only released after separation from the antigen.
  • SATA N-succinimidyl-S-acetylthioacetate
  • Antigens of interest for immunapheresis are e.g. Autoantikö ⁇ er, Low density lipoprotein (LDL), ß2-microglobulin, fibrinogen, antibodies to factor VIII or endotoxin.
  • LDL Low density lipoprotein
  • ß2-microglobulin ß2-microglobulin
  • fibrinogen antibodies to factor VIII or endotoxin.
  • the Fc fragments of mouse immunoglobulins can be suitable antigens.
  • the binding region of the antigen-binding structure is protected according to the invention during the derivatization by temporary, reversible binding to the antigen and, after separation from the antigen, is bound to a suitable, appropriately derivatized matrix via the newly introduced functional groups.
  • the matrices produced according to the invention surprisingly show significantly increased binding capacities. So they show an unexpected increase up to a factor of 3.69.
  • the matrices according to the invention are therefore outstandingly suitable for use for therapeutic, diagnostic, preparative, analytical and medical technology purposes.
  • F (ab) fragments are derived from chicken antibodies (immunoglobulin Y), the specificity of which is directed against human immunoglobulin.
  • Immunology adsorbents - 1. Isolation of antibody by means of a cellulose-protein antigen,
  • SCA Single chain antibody
  • Plasmapheresis and immunoadsorption in the treatment of a patient with thrombotic thrombocytopenic Pu ⁇ urea TTP
  • Wiener Klinische Wienschrift 108 suppl 1, 27 TTP
  • the matrix m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B which is preferably used for coupling immunoglobulin Y (IgY) or its F (ab) fragments (IgY-F (ab)), is prepared as described below.
  • Dried bromine-activated Sepharose 4B is suspended in 1 mM HCl and washed with 70 times the volume of 1 mM HCl.
  • the bromocyan-activated Sepharose 4B is then mixed with twice the volume of 0.5 M diaminoethane, adjusted to pH 8.2 with 1 M HCl, and shaken for 18 h at room temperature.
  • the amino-Sepharose 4B thus produced is washed with physiological phosphate-buffered saline (PBS) and can be stored in PBS with the addition of 0.05% sodium azide at 2-8 ° C.
  • PBS physiological phosphate-buffered saline
  • the amino-Sepharose 4B is washed with 50 times the volume of 0.1 M sodium phosphate pH 8.0 and with twice the volume of a mixture of 50% (v / v) dimethyl sulfoxide and 50% (v / v ) 0.1 M sodium phosphate pH 8.0 resuspended. If necessary, the pH is adjusted by adding 1 M NaOH. A solution of 10 mg of m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide in 0.2 ml of dimethyl sulfoxide is then added to each 1 ml of Amino-Sepharose 4B and the reaction mixture is shaken at room temperature for 18 h.
  • the m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B is washed immediately before further processing with 10 times the volume of dimethyl sulfoxide and resuspended in 0.1 M sodium phosphate pH 6.5.
  • additional sulfhydryl groups are preferably introduced in IgY-F (ab) (specifically against human immunoglobulin) as described below.
  • human immunoglobulin coupled to Sepharose 4B is incubated in a solution of IgY-F (ab) up to the maximum load.
  • the matrix loaded with IgY-F (ab ') is washed with PBS, buffered in an alkaline buffer such as triethylamine-HCl buffer pH 8.0 (50 mM triethylamine, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA-Naj) and in 2- times the volume of the same buffer resuspended.
  • the suspension is, under N 2 atmosphere with 2-iminothiolane-HCl (Traut's reagent, Jue R. et al. 1978), the molar amount of which preferably corresponds to 8 times the amount of bound IgY-F (ab) present.
  • the matrix loaded with IgY-F (ab) is rinsed with 0.1 M sodium phosphate pH 6.5, pre-gassed with N 2 .
  • the IgY-F (ab) (IgY-F (ab) -SH) derivatized with 2-iminothiolane are then eluted from the matrix with 0.1 M sodium phosphate-HCl pH 2.5 (pre-gassed with N 2 ).
  • the eluate is brought to pH 6.5 with 0.5 M sodium phosphate pH 9.1, pre-gassed with N 2 , and immediately used for coupling to the m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B.
  • a defined volume of the prepared IgY-F (ab ') - SH solution is mixed with a defined volume of the prepared m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B.
  • the mixture is shaken at 2-8 ° C for 18 h.
  • Unbound IgY-F (ab) -SH is then eluted with 0.1 M sodium phosphate pH 6.5. From the quantification of the remaining amount of IgY-F (ab) -SH, the amount of coupled IgY-F (ab ') - SH and thus the loading of m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B (mg protein / ml gel) can be concluded.
  • the amount of the eluted protein is determined spectrophotometrically and its identity (> 90% human immunoglobulin) in the
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • steps 1 to 4 The procedure described in steps 1 to 4 is also applied to the coupling of IgY to Sepharose 4B (coupling product IgY-SH / S 4B).
  • IgY is coupled to bromocyan-activated Sepharose 4B without prior derivatization.
  • the coupling product is mixed with twice the volume of 0.1 M ethanolamine-HCl pH 8.0 and shaken for 2 hours at room temperature. After a subsequent wash with 50 times the volume of 0.1 M sodium bicarbonate pH 8.2 / 0.5 M NaCl and 50 times the volume of 0.1 M glycine-HCl pH 2.5, it becomes 0.05 in PBS % Sodium azide buffered and stored at 2-8 ° C. 1 ml of the coupling product (IgY / S 4B) is tested as described in step 4.
  • IgY anti-human IgG achieved binding capacities of 0.23 to 0.27 mg human IgG per mg bound IgY.
  • a comparison of experiments 9 and 7 or 8 and 6 in Table 1 shows an increase of approximately 1.7 in each case in the binding of human IgG per mg IgY-F (ab) fragment compared to the value of the coupled complete immunoglobulin (IgY ).
  • the binding capacity of the immunoadsorption material could already be increased to 0.30 mg to 0.38 mg human IgG.
  • immunosorbent materials can be produced on the basis of the exemplary embodiment presented, which have binding capacities of more than 19 mg human IgG per ml Sepharose 4B. (See Experiment 3 in Table 1). This capacity could not be achieved with conventional coupling methods, even when using far higher concentrations of antigen-binding structures. (See Experiment 7 in Table 1)
  • This increase in binding capacity enables the volume of an immunoadsorption column to be reduced for a given capacity and thus allows shorter times for loading with the antigen, for rinsing, for eluting the antigen and for regeneration of the column. Sensitive antigens are protected by the shorter residence time in the mostly harmful elution buffer. On the other hand, larger yields can be achieved at the same time for a given column volume.
  • the method used here to couple antigen-binding structures can be easily transferred from Sepharose to other substrates.
  • the treatment times can be shortened or the concentrations of the substance to be removed can be significantly reduced with the same treatment time.
  • Antigen binding site derivatizes IgY-SH complete IgY, with thiol groups (SH) under the protection of
  • Antigen binding site derivatizes IgY-F (ab) IgY-F (ab) fragments, not derivatized and without protection of the
  • Antigen binding site coupled IgY complete IgY, not derivatized and without protection of the

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Abstract

The invention relates to a novel immuno-adsorption matrix, a method for the production thereof, and the utilization thereof for therapeutic, diagnostic, preparative, analytic and medicine technological purposes. By coupling to a supporting material, antigen binding structures are derivatized and/or activated while protecting the antigen binding site with functional groups which are suited for coupling to a chemically activated matrix or which represent an activated group themselves.

Description

Immunadsorptionsmatrix, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungImmunoadsorption matrix, process for its preparation and its use
Die Erfindung betrifft eine neue Immunadsorptionsmatrix, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung für therapeutische, diagnostische, präparative, analytische und medizintechnische Zwecke.The invention relates to a new immunoadsorption matrix, processes for its preparation and its use for therapeutic, diagnostic, preparative, analytical and medical purposes.
Als Immunadsoφtion wird ein affinitätschromatographisches Verfahren bezeichnet, bei dem die spezifische Bindung zwischen Antiköφer und Antigen zur Isolierung eines der Reaktionspartner aus komplexen Mischungen biogenen Ursprungs genutzt wird (Carlsson, J. et al. 1989).An immuno-chromatographic method is referred to as immunoadsorption, in which the specific bond between the antibody and antigen is used to isolate one of the reactants from complex mixtures of biogenic origin (Carlsson, J. et al. 1989).
Ursprünglich wurde diese Methode eingesetzt, um mit an Trägermaterial (Matrix) fixiertem Antigen die Antiköφer einer bestimmten Spezifität aus Serum zu gewinnen (Campbell, D.H. et al. 1951).Originally, this method was used to obtain the antibodies of a certain specificity from serum with antigen fixed to carrier material (matrix) (Campbell, D.H. et al. 1951).
Umgekehrt war es mit dem Vorliegen aufgereinigter Antiköφer einer bestimmtenConversely, it was the presence of purified antibodies of a certain one
Spezifität möglich, diese als Liganden an Trägermaterial fixiert zur Gewinnung vonSpecificity possible, these fixed as ligands on carrier material for the extraction of
Antigen einzusetzen.Use antigen.
Die Möglichkeit, über das Immunsystem spezifische Antiköφer gegen eine Vielzahl vonThe ability to use the immune system to specific antibodies against a variety of
Molekülen zu produzieren, hat die Affinitätschromatographie mit Hilfe von anAffinity chromatography has the ability to produce molecules with the help of
Trägermaterial fixierten Antikörpern zum Stand der Technik gemacht (Goding, J.W.Carrier material fixed antibodies made prior art (Goding, J.W.
1986).1986).
Neben ihrem Einsatz für analytische und präparative Zwecke in Forschung und Industrie gewinnt die Immunadsoφtion mit trägerfixierten Antikörpern auch zunehmende Bedeutung in der Medizin. Speziell auf dem Gebiet der Stoffwechsel- und Autoimmunerkrankungen sowie bei Transplantatabstoßungsreaktionen, deren komplexe Krankheitsbilder oft auf die Anwesenheit und Konzentration einer einzigen Substanz bzw. Substanzklasse in der Köφerflüssigkeit zurückzuführen sind, läßt sich die Spezifität der Antigen-Antiköφer-Reaktion extrakoφoral therapeutisch nutzen.In addition to its use for analytical and preparative purposes in research and industry, immunoadsorption with carrier-fixed antibodies is also becoming increasingly important in medicine. Especially in the field of metabolic and autoimmune diseases as well as in graft rejection reactions, whose complex clinical pictures are often due to the presence and concentration of a single substance or substance class in the body fluid, the specificity of the antigen-antibody reaction can be used extracoφorally for therapeutic purposes.
Bei einer als Immunapherese bezeichneten Behandlungsmethode zirkuliert das Patientenplasma im geschlossenen Kreislauf durch Säulen mit spezifischen trägerfixierten Antiköφern, mit deren Hilfe die Konzentration der schädlichen Komponente im Plasma reduziert wird (Stoffel, W. 1981, Ulbricht, C.J. 1991). So gilt die Senkung des Serumcholesterins mit Hilfe der LDL-Immunadsoφtion mittlerweile als anerkanntes Behandlungsverfahren bei Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie (Richter, W.O. und Schwandt, P. 1995, Jansen, M. et al. 1996).In a treatment method called immunapheresis, the patient's plasma circulates in a closed circuit through columns with specific carrier-fixed antibodies, with the aid of which the concentration of the harmful component in the plasma is reduced (Stoffel, W. 1981, Ulbricht, CJ 1991). Lowering serum cholesterol with the help of LDL immunoadsorption is now recognized as a treatment method for patients with familial hypercholesterolemia (Richter, WO and Schwandt, P. 1995, Jansen, M. et al. 1996).
Die spezifische Entfernung von Immunglobulinen aus dem Plasma von Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Patienten nach einer Transplantation ist ein relativ neues, sich aber ständig erweiterndes Anwendungsgebiet der Immunadsoφtion. So führte die Reduktion von Autoantikörpern im Plasma zu einer deutlichen Verbesserung des Krankheitsbildes bei Patienten mit thrombotischer thrombozytopenischer Puφurea (Schlee, H. et al. 1996) oder dilatativer Kardiomyopathie (Dörffel, W.V. et al. 1996, Wallukat, G. et al. 1996). Bei weiteren Autoimmunerkrankungen zeichnet sich eine Verdrängung der bisherigen Plasmapherese durch die schonendere Immunadsoφtion ab (Richter, W.O. et al. 1995).The specific removal of immunoglobulins from the plasma of patients with autoimmune diseases or patients after a transplant is a relatively new, but constantly expanding field of application of immunoadsorption. The reduction of autoantibodies in plasma led to a significant improvement in the clinical picture in patients with thrombotic thrombocytopenic Puφurea (Schlee, H. et al. 1996) or dilated cardiomyopathy (Dörffel, WV et al. 1996, Wallukat, G. et al. 1996 ). In other autoimmune diseases, the previous plasmapheresis is being replaced by the gentler immunoadsorption (Richter, W.O. et al. 1995).
Die Abstoßung von Transplantaten durch präformierte anti-HLA- oder zytotoxische Antiköφer im Plasma des Empfängers wurde mit Hilfe der Immunadsoφtion ebenfalls vermieden (Schaumann, D. et al. 1994, Leventhal, J.R. et al. 1995). Genauso konnte bei Hämophilie-Patienten mit hohem Antikörperspiegel gegen die Gerinnungsfaktoren V bzw. VIII nach Immunadsoφtion die Wirksamkeit der entsprechenden Präparate wieder hergestellt werden (Tribl, P. et al. 1995, Knöbl, P. et al. 1995).The rejection of grafts by preformed anti-HLA or cytotoxic antibodies in the plasma of the recipient was also avoided with the help of immunoadsorption (Schaumann, D. et al. 1994, Leventhal, J.R. et al. 1995). In the same way, the effectiveness of the corresponding preparations could be restored in hemophilia patients with a high antibody level against the coagulation factors V or VIII after immunoadsorption (Tribl, P. et al. 1995, Knöbl, P. et al. 1995).
Es ist damit zu rechnen, daß die Immunadsoφtion mit Antiköφern entsprechender Spezifität demnächst auch zur Entfernung von Toxinen und immunologischen Regulator-Substanzen (z.B. Zytokine bzw. Zytokin-Rezeptor- Komplexe) aus dem Plasma eingesetzt wird.It can be expected that immunoadsorption with antibodies of appropriate specificity will soon also be used to remove toxins and immunological regulator substances (e.g. cytokines or cytokine-receptor complexes) from the plasma.
Zur Fixierung an das Trägermaterial werden die Antiköφer in der Regel über ihre primären Aminogruppen kovalent gebunden. Diese Kopplungsart setzt eine chemische Aktivierung der Matrix mit entsprechend reaktiven Gruppen voraus. Eine bevorzugte Aktivierungsmethode ist die Bildung von Cyanatestern bzw. Imidocarbonaten nach der Einwirkung von Bromcyan auf eine Matrix mit vicinalen Hydroxylgruppen (Axen, R. und Ernback, S. 1971, Jacoby, W.V. und Wilchek, M. 1975). Weitere gebräuchliche reaktive Gruppen sind N-Hydroxysuccinimidester (Cuatrecasas, P. und Parikh, I. 1972) oder auch N-Hydroxysuccinimid- und Imidazoyl- carbonate (Wilchek, M. und Miron, T. 1985, Hearn, M.T.W. 1987), die eine Matrix mit Carboxyl- bzw. Hydroxyl-Gruppen voraussetzen. Seltener ist die Einführung von Aldehydgruppen in beispielsweise eine Polysaccharidmatrix (Sanderson, C.J. und Wilson, D.V. 1971). Bevorzugte Trägermaterialien sind großporige Polymere auf Kohlenhydrat-, Acryl-, Acrylamid- oder Styrolbasis. Mischpolymerisate auf der Basis dieser Polymere werden ebenfalls genutzt.For fixation to the carrier material, the antibodies are usually covalently bound via their primary amino groups. This type of coupling requires chemical activation of the matrix with correspondingly reactive groups. A preferred activation method is the formation of cyanate esters or imidocarbonates after the action of cyanogen bromide on a matrix with vicinal hydroxyl groups (Axen, R. and Ernback, p. 1971, Jacoby, WV and Wilchek, M. 1975). Other common reactive groups are N-hydroxysuccinimide esters (Cuatrecasas, P. and Parikh, I. 1972) or also N-hydroxysuccinimide and imidazoyl carbonates (Wilchek, M. and Miron, T. 1985, Hearn, MTW 1987), the one Assume matrix with carboxyl or hydroxyl groups. The introduction of aldehyde groups into, for example, a polysaccharide matrix (Sanderson, CJ and Wilson, DV 1971) is less common. Preferred carrier materials are large-pore polymers based on carbohydrates, acrylics, acrylamides or styrene. Copolymers based on these polymers are also used.
In neuerer Zeit stehen als Trägermaterial auch sogenannte Perfusions- oderIn more recent times, so-called perfusion or
Hyperdiffusionsharze zur Verfügung, die bei der Chromatographie bis zu 50-fach höhereHyperdiffusion resins are available, which are up to 50 times higher in chromatography
Durchflußraten erlauben (Afeyan, N.B. et al. 1990, Fulton, S.P. et al. 1991).Allow flow rates (Afeyan, N.B. et al. 1990, Fulton, S.P. et al. 1991).
Nach entsprechender Derivatisierung kann dieses Trägermaterial genauso wie herkömmliches Material aktiviert werden.After appropriate derivatization, this carrier material can be activated in the same way as conventional material.
Erhältlich sind diese Materialien z.B. unter der Bezeichnung POROSR (Fa. PerseptiveThese materials are available, for example, under the name POROS R (Perseptive
Biosystems) oder HYPER D™ (Fa. Biosepra).Biosystems) or HYPER D ™ (from Biosepra).
Zur Immunadsoφtion können neben kompletten Antiköφern auch deren chemische oder enzymatische Spaltprodukte eingesetzt werden, sofern die antigenbindende Region funktioneil intakt enthalten bleibt. Dazu gehören insbesondere die in der Literatur häufig beschrieben F(ab ) - bzw. F(ab )2 -Fragmente, die durch kontrollierte enzymatische Spaltung von Antikörpern entstehen. (Porter, R.R. 1959, Nisonoff, A. et al. 1961). Weitere Möglichkeiten bestehen in der Verwendung von sogenannten ' Single chain antibodies' (Davis, G.T. et al. 1991) oder auch synthetischen Oligo- oder Polypeptiden, die chemisch oder gentechnisch hergestellt werden können.In addition to complete antibodies, their chemical or enzymatic cleavage products can also be used for immunoadsorption, provided that the antigen-binding region remains functionally intact. These include, in particular, the F (ab) or F (ab) 2 fragments frequently described in the literature, which are produced by controlled enzymatic cleavage of antibodies. (Porter, RR 1959, Nisonoff, A. et al. 1961). Further possibilities exist in the use of so-called 'single chain antibodies' (Davis, GT et al. 1991) or also synthetic oligo- or polypeptides, which can be produced chemically or genetically.
Für die Immunadsoφtion müssen diese antigenbindenen Strukturen über eine kovalente Bindung an ein Trägermaterial gekoppelt werden.For immunoadsorption, these antigen-binding structures must be coupled to a carrier material via a covalent bond.
Die Zielstellung bei der Kopplung ist eine in Bezug auf die eingesetzte Menge hohe Ausbeute an gekoppelten antigenbindenden Strukturen, gepaart mit einem möglichst hohen Aktivitätserhalt in Bezug auf die spezifische Bindung für das Antigen.The aim of the coupling is a high yield of coupled antigen-binding structures in relation to the amount used, coupled with the highest possible activity retention in relation to the specific binding for the antigen.
Das Problem besteht darin, daß kovalente Bindungen auch im Bereich der antigenbindenden Region erfolgen können, dadurch die antigenbindenden Eigenschaften beeinträchtigen und die Aktivität verringern.The problem is that covalent bonds can also occur in the region of the antigen-binding region, thereby impairing the antigen-binding properties and reducing the activity.
Ein weiteres Problem bei vielen Anwendungen ist eine unbefriedigende Bindungskapazität der Immunadsoφtionsmatrix. Eine hohe Bindungskapzität ermöglicht die Verwendung kleinerer Säulenvolumina und führt damit zu Zeit- und Materialersparnis in der RoutineanwendungAnother problem with many applications is an unsatisfactory binding capacity of the immunoadsorption matrix. A high binding capacity enables the use of smaller column volumes and thus saves time and material in routine use
Die Bindungskapazität wird üblicherweise angegeben in mg gebundenes Antigen pro ml Adsoφtionsmatrix, oder pro mg gekoppelte antigenbindende Struktur. Sie ist abhängig von der Affinität der antigenbindenden Struktur zum Antigen und von der Beladungsdichte, d.h. der Menge an funktioneil intakten antigenbindenden Strukturen, die an eine bestimmte Menge des Immunadsoφtionsmaterials gekoppelt werden können. Die Beladungsdichte wird meist in mmol oder mg gekoppelte antigenbindende Strukur pro ml Säulenmatrix angegeben.The binding capacity is usually given in mg bound antigen per ml adsorption matrix, or per mg coupled antigen-binding structure. It is dependent on the affinity of the antigen-binding structure for the antigen and on the loading density, ie the amount of functionally intact antigen-binding structures which can be coupled to a certain amount of the immunoadsorption material. The loading density is usually given in mmol or mg coupled antigen-binding structure per ml column matrix.
Eine hohe Beladungsdichte wird üblicherweise durch Verwendung eines Trägermaterials mit einer großen verfügbaren Matrixoberfläche und einer hohen Konzentration an funktionellen oder reaktiven Gruppen auf der Matrixoberfläche erreicht, an die die antigenbindenden Strukturen unter geeigneten Bedingungen gekoppelt werden können.A high loading density is usually achieved by using a carrier material with a large available matrix surface and a high concentration of functional or reactive groups on the matrix surface, to which the antigen-binding structures can be coupled under suitable conditions.
In der Regel geht mit maximalen Bedingungen für eine hohe Beladungsdichte eine mehrfache kovalente Bindung einer antigenbindenden Strukturen an die Matrix einher. Das beeinträchtigt einmal die Beweglichkeit des Liganden und zum anderen steigt die Wahrscheinlichkeit, daß eine der kovalenten Bindungen im Bereich der Antigenbindungsstelle erfolgt. Beides führt zu einer Verminderung der Bindungskapazität.As a rule, maximum conditions for a high loading density are accompanied by multiple covalent binding of an antigen-binding structure to the matrix. This affects the mobility of the ligand on the one hand and on the other hand increases the probability that one of the covalent bonds occurs in the area of the antigen binding site. Both lead to a reduction in the binding capacity.
Eine maximal um den Faktor 1,7 höhere Bindungskapazität kann erwartet werden, wenn bei gleicher mengenmäßiger Beladung , angegeben in mg antigenbindende Struktur pro ml Trägermatrix, anstelle von kompletten Immunglobulinen deren F(ab )-Fragmente gekoppelt werden. Aufgrund des kleineren Molekulargewichts ist der prozentuale Anteil an Bindungsstellen für das Antigen höher. Das F(ab )-Fragmente weist dafür aber nur 1 Antigenbindungsstelle auf. Ähnliche Erhöhungen sollten auch bei der Kopplung von 'single chain antibodies' oder Peptiden (mit einer Antigenbindungsstelle) im Vergleich zu kompletten Immunglobulinen gelten.A maximum binding capacity higher by a factor of 1.7 can be expected if, with the same quantitative loading, given in mg antigen-binding structure per ml carrier matrix, their F (ab) fragments are coupled instead of complete immunoglobulins. Due to the smaller molecular weight, the percentage of binding sites for the antigen is higher. The F (ab) fragment has only 1 antigen binding site. Similar increases should also apply to the coupling of single chain antibodies or peptides (with an antigen binding site) compared to complete immunoglobulins.
In der Literatur beschriebene Vergleiche der Bindungskapazitäten von gekoppelten F(ab ) - Fragmenten bzw. 'single chain antibodies' mit den korrespondierenden Antikörpern zeigten allerdings nicht die zu erwartende Kapazitätserhöhung. (Lebedin, Y.S. et al. 1991, Canaan-Haden, L. et al. 1995).Comparisons of the binding capacities of coupled F (ab) fragments or 'single chain antibodies' with the corresponding antibodies described in the literature did not, however, show the expected increase in capacity. (Lebedin, Y.S. et al. 1991, Canaan-Haden, L. et al. 1995).
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, eine effektive Immunadsoφtionsmatrix mit einer möglichst hohen Bindungskapazität bereitzustellen, indem für das entsprechende Antigen spezifische antigenbindende Strukturen so an eine Trägermatrix gekoppelt werden, daß die Aktivität in bezug auf die Bindung des Antigens auch bei hoher Beladung nahezu vollständig erhalten bleibt.It was therefore the object of the invention to provide an effective immunoadsorption matrix with the highest possible binding capacity by coupling specific antigen-binding structures for the corresponding antigen to a carrier matrix in such a way that the activity with respect to the binding of the antigen is almost completely retained even with a high load .
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zusätzliche funktioneile Gruppen in die antigenbindende Struktur eingeführt werden, währenddessen die Bindungsstelle für das Antigen geschützt war.The object was achieved in that additional functional Groups are introduced into the antigen-binding structure, while the binding site for the antigen was protected.
Alle Moleküle, die eine antigenbindende Region enthalten und im Sinne einer Antigen- Antiköφer-Bindung reagieren können, werden im Folgenden als antigenbindende Struktur bezeichnet.All molecules that contain an antigen-binding region and can react in the sense of an antigen-antibody binding are referred to below as the antigen-binding structure.
Antigenbindende Strukturen können polyklonale oder monoklonale Antikörper (z.B. Einzelkettenantikörper 'single chain antibodies') oder Fragmente davon sein. Es können aber auch rekombinante oder synthetisch hergestellte Peptide bzw. Proteine sein.Antigen-binding structures can be polyclonal or monoclonal antibodies (e.g. single chain antibodies) or fragments thereof. However, they can also be recombinant or synthetically produced peptides or proteins.
Die antigenbindenden Strukturen können gegen die unterschiedlichsten Antigene oder Haptene gerichtet sein, wobei man unter Haptenen Verbindungen versteht, die alleine im Organismus keine Antiköφeφroduktion bewirken, sondern erst nach Kopplung an einen polymeren Träger. Sie können aber trotzdem sehr effizient durch antigenbindende Strukturen gebunden werden.The antigen-binding structures can be directed against a wide variety of antigens or haptens, whereby haptens are understood to mean compounds which alone do not produce antibodies in the organism, but only after coupling to a polymeric carrier. However, they can still be bound very efficiently by antigen-binding structures.
Vorzugsweise werden Trägermaterialien verwendet, an welche die antigenbindenden Strukturen kovalent gebunden werden. Insbesondere handelt es sich um Matrizes als Trägermaterial, welche aus organischen, anorganischen, synthetischen Polymeren oder aus Mischpolymeren bestehen und die ggf. chemisch aktiviert werden.Support materials to which the antigen-binding structures are covalently bound are preferably used. In particular, these are matrices as carrier material, which consist of organic, inorganic, synthetic polymers or of mixed polymers and which may be chemically activated.
Die eingeführten funktioneilen Gruppen können sich entweder zur Kopplung an eine chemisch aktivierte Matrix eignen oder selbst eine aktivierte Gruppe darstellen, die an eine geeignete funktionelle Gruppe einer Matrix koppeln kann.The functional groups introduced can either be suitable for coupling to a chemically activated matrix or can themselves represent an activated group which can couple to a suitable functional group of a matrix.
Es gibt eine Reihe von chemischen Gruppen und chemischen Methoden, mit denen diese Aufgabe gelöst werden kann.There are a number of chemical groups and chemical methods that can be used to accomplish this task.
Die Aminogruppen der antigenbindenden Strukturen können z.B. mit Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt und die eingeführten Carboxylgruppen nach Aktivierung mit z.B. l-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) an eine aminohaltige Matrix gekoppelt werden. Vernetzungen der antigenbindenden Strukturen untereinander sind durch die Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid unterbunden.The amino groups of the antigen binding structures can e.g. reacted with succinic anhydride and the carboxyl groups introduced after activation with e.g. l-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) can be coupled to an amino-containing matrix. Cross-linking of the antigen-binding structures with one another is prevented by the reaction with succinic anhydride.
Es können aber auch die Carboxylgruppen der antigenbindenden Strukturen mit EDC und einem geeignetem Diamin umgesetzt und über die eingeführte Aminogruppe an z.B. eine N-Hydroxysuccinimid- oder Bromcyan-aktivierte Matrix gekoppelt werden. Nach Reaktion mit Succinimidyl 3(2-pyridyldithio) propionate (SPDP) und nachfolgender Reduktion mit z.B. Dithiothreitol (DTT), oder nach Reaktion mit dem Traut sehen Reagenz (2-Iminothiolan) können SH-Gruppen eingeführt werden, die z.B. an eine Maleimidogruppen-tragendende Matrix gekoppelt werden können. Eine weitere Möglichkeit zur Einführung von SH-Gruppen ist die Umsetzung mit N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) und Nachbehandlung mit Hydroxylamin. SPDP und SATA haben gegenüber dem Traut sehen Reagenz den Vorteil, daß die SH- Gruppe erst nach Abtrennung vom Antigen freigetzt wird.However, the carboxyl groups of the antigen-binding structures can also be reacted with EDC and a suitable diamine and coupled to, for example, an N-hydroxysuccinimide or cyanogen bromide-activated matrix via the introduced amino group. After reaction with succinimidyl 3 (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) and subsequent reduction with, for example, dithiothreitol (DTT), or after reaction with the Traut see reagent (2-iminothiolane), SH groups can be introduced, for example to a maleimido group. supporting matrix can be coupled. Another possibility for the introduction of SH groups is the reaction with N-succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA) and aftertreatment with hydroxylamine. SPDP and SATA have the advantage over the Traut see reagent that the SH group is only released after separation from the antigen.
Für die Immunapherese interessante Antigene sind z.B. Autoantiköφer, Low density lipoprotein (LDL), ß2-Mikroglobulin, Fibrinogen, Antiköφer gegen Faktor VIII oder Endotoxin. Für andere Anwendungen wie z.B. zur Präparation von monoklonalen Antiköφern können die Fc-Fragmente von Immunglobulinen der Maus geeignete Antigene darstellen.Antigens of interest for immunapheresis are e.g. Autoantiköφer, Low density lipoprotein (LDL), ß2-microglobulin, fibrinogen, antibodies to factor VIII or endotoxin. For other applications such as for the preparation of monoclonal antibodies, the Fc fragments of mouse immunoglobulins can be suitable antigens.
In allen Fällen wird der Bindungsbereich der antigenbindenden Struktur erfindungsgemäß während der Durchführung der Derivatisierung durch temporäre, reversible Bindung an das Antigen geschützt und nach Abtrennung vom Antigen über die neu emgeführten funktioneilen Gruppen an eine geeignete, entsprechend derivatisierte Matrix gebunden.In all cases, the binding region of the antigen-binding structure is protected according to the invention during the derivatization by temporary, reversible binding to the antigen and, after separation from the antigen, is bound to a suitable, appropriately derivatized matrix via the newly introduced functional groups.
Die erfindungsgemäß hergestellten Matrizes zeigen überraschend wesentlich erhöhte Bindungskapazitäten. So weisen sie einen unerwarteten Anstieg bis zum Faktor 3,69 auf.The matrices produced according to the invention surprisingly show significantly increased binding capacities. So they show an unexpected increase up to a factor of 3.69.
Die erfindungsgemäßen Matrizes sind somit hervorragend für eine Anwendung zu therapeutischen, diagnostischen, präparativen, analytischen und medizintechnischen Zwecken geeignet.The matrices according to the invention are therefore outstandingly suitable for use for therapeutic, diagnostic, preparative, analytical and medical technology purposes.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante werden F(ab )-Fragmenten aus Antiköφern vom Huhn (Immunglobulin Y) derivatisiert, deren Spezifität gegen humanes Immunglobulin gerichtet ist.In a preferred embodiment variant, F (ab) fragments are derived from chicken antibodies (immunoglobulin Y), the specificity of which is directed against human immunoglobulin.
Mit Hilfe von 2-Iminothiolan werden an die an Antigen gebundenen F(ab )-Fragmente Sulfhydryl-Gruppen addiert, über die sie an eine mit m-Maleimidobenzoyl-Gruppen aktivierte Sepharose 4B als Matrix koppeln. LiteraturWith the help of 2-iminothiolane, sulfhydryl groups are added to the F (ab) fragments bound to antigen, via which they couple to a Sepharose 4B activated with m-maleimidobenzoyl groups as a matrix. literature
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Appl. Biochem. Biotechnol. 11,191-193. AusführungsbeispielAppl. Biochem. Biotechnol. 11.191-193. Embodiment
Arbeitsschritt 1:Step 1:
Die zur Kopplung von Immunglobulin Y (IgY) oder dessen F(ab )-Fragmente (IgY- F(ab )) vorzugsweise verwendete Matrix m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B wird wie nachstehend beschrieben hergestellt.The matrix m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B, which is preferably used for coupling immunoglobulin Y (IgY) or its F (ab) fragments (IgY-F (ab)), is prepared as described below.
Getrocknete bromcyanaktivierte Sepharose 4B wird in 1 mM HCl suspendiert und mit dem 70-fachen Volumen 1 mM HCl gewaschen. Anschließend wird die bromcyanaktivierte Sepharose 4B mit dem 2-fachen Volumen 0,5 M Diaminoethan, mit 1 M HCl auf pH 8,2 eingestellt, versetzt und 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die so hergestellte Amino- Sepharose 4B wird mit physiologischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung ( phosphate buffered saline, PBS) gewaschen und kann in PBS mit einem Zusatz von 0,05 % Natriumazid bei 2-8 °C aufbewahrt werden.Dried bromine-activated Sepharose 4B is suspended in 1 mM HCl and washed with 70 times the volume of 1 mM HCl. The bromocyan-activated Sepharose 4B is then mixed with twice the volume of 0.5 M diaminoethane, adjusted to pH 8.2 with 1 M HCl, and shaken for 18 h at room temperature. The amino-Sepharose 4B thus produced is washed with physiological phosphate-buffered saline (PBS) and can be stored in PBS with the addition of 0.05% sodium azide at 2-8 ° C.
Zur weiteren Verarbeitung wird die Amino-Sepharose 4B mit dem 50-fachen Volumen 0, 1 M Natriumphosphat pH 8,0 gewaschen und mit dem 2-fachen Volumen einer Mischung aus 50 %(v/v) Dimethylsulfoxid und 50 %(v/v) 0,1 M Natriumphosphat pH 8,0 resuspendiert. Der pH- Wert wird nötigenfalls durch Zugabe von 1 M NaOH nachgestellt. Dann wird je 1 ml Amino-Sepharose 4B eine Lösung von 10 mg m-Maleimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimid in 0,2 ml Dimethylsulfoxid zugegeben und der Reaktionsansatz 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt.For further processing, the amino-Sepharose 4B is washed with 50 times the volume of 0.1 M sodium phosphate pH 8.0 and with twice the volume of a mixture of 50% (v / v) dimethyl sulfoxide and 50% (v / v ) 0.1 M sodium phosphate pH 8.0 resuspended. If necessary, the pH is adjusted by adding 1 M NaOH. A solution of 10 mg of m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide in 0.2 ml of dimethyl sulfoxide is then added to each 1 ml of Amino-Sepharose 4B and the reaction mixture is shaken at room temperature for 18 h.
Die m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B wird unmittelbar vor der Weiterverarbeitung mit dem 10-fachen Volumen Dimethylsulfoxid gewaschen und in 0, 1 M Natriumphosphat pH 6,5 resuspendiert.The m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B is washed immediately before further processing with 10 times the volume of dimethyl sulfoxide and resuspended in 0.1 M sodium phosphate pH 6.5.
Arbeitsschritt 2:Step 2:
Für die Kopplung an m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B werden vorzugsweise in IgY- F(ab ) (spezifisch gegen humanes Immunglobulin) wie nachstehend beschrieben zusätzliche Sulfhydryl-Gruppen eingeführt.For the coupling to m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B, additional sulfhydryl groups are preferably introduced in IgY-F (ab) (specifically against human immunoglobulin) as described below.
Dazu wird an Sepharose 4B gekoppeltes humanes Immunglobulin bis zur maximalen Beladung in einer Lösung aus IgY-F(ab ) inkubiert.For this, human immunoglobulin coupled to Sepharose 4B is incubated in a solution of IgY-F (ab) up to the maximum load.
Die mit IgY-F(ab') beladene Matrix wird mit PBS gewaschen, in einen alkalischen Puffer wie z.B.Triethylamin-HCl-Puffer pH 8,0 (50 mM Triethylamin, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA-Naj) umgepuffert und im 2-fachen Volumen desselben Puffers resuspendiert. Die Suspension wird unter N2-Atmosphäre mit 2-Iminothiolan-HCl (Traut sches Reagenz, Jue, R. et al. 1978) versetzt, dessen molare Menge vorzugsweise dem 8-fachen der vorliegenden Menge an gebundenem IgY-F(ab ) entspricht.The matrix loaded with IgY-F (ab ') is washed with PBS, buffered in an alkaline buffer such as triethylamine-HCl buffer pH 8.0 (50 mM triethylamine, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA-Naj) and in 2- times the volume of the same buffer resuspended. The suspension is, under N 2 atmosphere with 2-iminothiolane-HCl (Traut's reagent, Jue R. et al. 1978), the molar amount of which preferably corresponds to 8 times the amount of bound IgY-F (ab) present.
Nach 1 h Reaktion unter N2-Begasung bei Raumtemperatur wird die mit IgY-F(ab ) beladene Matrix mit 0,1 M Natriumphosphat pH 6,5, vorbegast mit N2, gespült. Anschließend werden die mit 2-Iminothiolan derivatisierten IgY-F(ab ) (IgY-F(ab )-SH) mit 0, 1 M Natriumphosphat-HCl pH 2,5 (mit N2 vorbegast) von der Matrix eluiert. Das Eluat wird mit 0,5 M Natriumphosphat pH 9,1, vorbegast mit N2, auf pH 6,5 gebracht und sofort für die Kopplung an die m-Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B eingesetzt.After 1 h of reaction with N 2 gassing at room temperature, the matrix loaded with IgY-F (ab) is rinsed with 0.1 M sodium phosphate pH 6.5, pre-gassed with N 2 . The IgY-F (ab) (IgY-F (ab) -SH) derivatized with 2-iminothiolane are then eluted from the matrix with 0.1 M sodium phosphate-HCl pH 2.5 (pre-gassed with N 2 ). The eluate is brought to pH 6.5 with 0.5 M sodium phosphate pH 9.1, pre-gassed with N 2 , and immediately used for coupling to the m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B.
Arbeitsschritt 3:Step 3:
Entsprechend der gewünschten Beladung wird ein definiertes Volumen der vorbereiteten IgY-F(ab')-SH-Lösung mit einem definiertem Volumen der vorbereiteten m- Maleimidobenzoyl-Sepharose 4B gemischt. Der Ansatz wird 18 h bei 2-8 °C geschüttelt. Nicht gebundenes IgY-F(ab )-SH wird danach mit 0,1 M Natriumphosphat pH 6,5 eluiert. Aus der Quantifizierung der Restmenge IgY-F(ab )-SH kann auf die Menge des gekoppelten IgY-F(ab')-SH und damit auf die Beladung der m-Maleimidobenzoyl- Sepharose 4B (mg Protein/ml Gel) geschlossen werden.Depending on the desired loading, a defined volume of the prepared IgY-F (ab ') - SH solution is mixed with a defined volume of the prepared m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B. The mixture is shaken at 2-8 ° C for 18 h. Unbound IgY-F (ab) -SH is then eluted with 0.1 M sodium phosphate pH 6.5. From the quantification of the remaining amount of IgY-F (ab) -SH, the amount of coupled IgY-F (ab ') - SH and thus the loading of m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B (mg protein / ml gel) can be concluded.
Zur Abreaktion überschüssiger reaktiver Gruppen wird die m-Maleimidobenzoyl- Sepharose 4B mit dem 2-fachen Volumen 0, 1 M Cystein-HCl in 0, 1 M Natriumphosphat pH 6,5 versetzt und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt.To react excess reactive groups, 2 times the volume of 0.1 M cysteine-HCl in 0.1 M sodium phosphate pH 6.5 is added to the m-maleimidobenzoyl-Sepharose 4B and shaken at room temperature for 2 h.
Anschließend wird das Kopplungsprodukt (IgY-F(ab )-SH/S 4B) mit dem 50-fachen Volumen 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8,2 enthaltend 0,5 M NaCl und dem 50-fachen Volumen 0,1 M Glycin-HCl pH 2,5 gewaschen. Zur Lagerung bei 2-8 C wird es in PBS mit 0,05 % Natriumazid umgepuffert.Then the coupling product (IgY-F (ab) -SH / S 4B) with 50 times the volume of 0.1 M sodium bicarbonate pH 8.2 containing 0.5 M NaCl and 50 times the volume of 0.1 M glycine HCl pH 2.5 washed. For storage at 2-8 C it is buffered in PBS with 0.05% sodium azide.
Arbeitsschritt 4:Step 4:
Auf Säulen mit jeweils 1 ml des Kopplungsproduktes wird Humanserum im Überschuß aufgetragen, um die maximale Beladung zu erreichen.Excess human serum is applied to columns with 1 ml each of the coupling product in order to achieve the maximum loading.
Nach einer Spülung der Säule mit PBS wird das gebundene humane Immunglobulin mitAfter rinsing the column with PBS, the bound human immunoglobulin is added
0,1 M Glycin-HCl-Puffer eluiert.0.1 M glycine-HCl buffer eluted.
Nach anschließender Neutralisation mit 2 M Tris wird die Menge des eluierten Proteins spektrophotometrisch bestimmt und seine Identität ( > 90 % humanes Immunglobulin) imAfter subsequent neutralization with 2 M Tris, the amount of the eluted protein is determined spectrophotometrically and its identity (> 90% human immunoglobulin) in the
ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) bestätigt. Der Quotient aus der Menge an eluiertem humanen Immunglobulin und dem Volumen des Kopplungsproduktes wird als Bindungskapazität bezeichnet (mg Human-IgG/ml Gel).ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) confirmed. The quotient of the amount of eluted human immunoglobulin and the volume of the coupling product is called the binding capacity (mg human IgG / ml gel).
Arbeitsschritt 5:Step 5:
Das in den Arbeitsschritten 1 bis 4 beschriebene Verfahren wird auch auf die Kopplung von IgY an Sepharose 4B angewandt (Kopplungsprodukt IgY-SH/S 4B).The procedure described in steps 1 to 4 is also applied to the coupling of IgY to Sepharose 4B (coupling product IgY-SH / S 4B).
Arbeitsschritt 6:Step 6:
Zum Vergleich der Bindungskapazitäten wird IgY ohne vorhergehende Derivatisierung an bromcyanaktivierte Sepharose 4B gekoppelt.To compare the binding capacities, IgY is coupled to bromocyan-activated Sepharose 4B without prior derivatization.
Dazu wird getrocknete bromcyanaktivierte Sepharose 4B in 1 mM HCl suspendiert und mit dem 70-fachen Volumen 1 mM HCl gewaschen. Gereinigtes IgY wird in 0, 1 M Natriumbicarbonat pH 8,2 enthaltend 0,5 M NaCl umgepuffert. Ein definiertes Aliquot der Lösung wird mit einem definierten Volumen der vorbereiteten Matrix gemischt und 18 h bei 2-8 °C geschüttelt. Nicht gebundenes IgY wird danach mit dem Kopplungspuffer eluiert. Aus der Quantifizierung der Restmenge IgY kann auf die Menge des gekoppelten IgY und damit auf die Beladung der Sepharose (mg Protein/ml Gel) geschlossen werden. Zur Abreaktion überschüssiger reaktiver Gruppen wird das Kopplungsprodukt mit dem 2- fachen Volumen 0,1 M Ethanolamin-HCl pH 8,0 versetzt und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach einer anschließenden Wäsche mit dem 50-fachen Volumen 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8,2 / 0,5 M NaCl und dem 50-fachen Volumen 0,1 M Glycin-HCl pH 2,5 wird es in PBS mit 0,05 % Natriumazid umgepuffert und bei 2-8 °C gelagert. Jeweils 1 ml des Kopplungsproduktes (IgY/S 4B) wird wie in Arbeitsschritt 4 beschrieben getestet.For this, dried bromocyan-activated Sepharose 4B is suspended in 1 mM HCl and washed with 70 times the volume of 1 mM HCl. Purified IgY is buffered in 0.1 M sodium bicarbonate pH 8.2 containing 0.5 M NaCl. A defined aliquot of the solution is mixed with a defined volume of the prepared matrix and shaken at 2-8 ° C for 18 h. Unbound IgY is then eluted with the coupling buffer. From the quantification of the remaining amount of IgY, the amount of coupled IgY and thus the loading of Sepharose (mg protein / ml gel) can be concluded. To react excess reactive groups, the coupling product is mixed with twice the volume of 0.1 M ethanolamine-HCl pH 8.0 and shaken for 2 hours at room temperature. After a subsequent wash with 50 times the volume of 0.1 M sodium bicarbonate pH 8.2 / 0.5 M NaCl and 50 times the volume of 0.1 M glycine-HCl pH 2.5, it becomes 0.05 in PBS % Sodium azide buffered and stored at 2-8 ° C. 1 ml of the coupling product (IgY / S 4B) is tested as described in step 4.
ErgebnisseResults
Ergebnisse der Kopplungen von komplettem IgY und den korrespondierenden IgY-(Fab )- Fragmenten sowie Vergleiche in Bezug auf die Bindungskapazität der daraus resultierenden Immunadsoφtionsmaterialien sind in Tabelle 1 dargestellt.Results of the coupling of complete IgY and the corresponding IgY (Fab) fragments as well as comparisons with regard to the binding capacity of the resulting immunoadsorption materials are shown in Table 1.
Immunadsoφtionsmaterialen auf der Basis von Sepharose 4B und konventionell mit BrCN durchgeführten Kopplungen von komplettemImmunoadsorption materials based on Sepharose 4B and conventional coupling with BrCN of complete
IgY-anti-Human-IgG erreichten Bindungskapazitäten von 0,23 bis 0,27 mg Human-IgG pro mg gebundenem IgY. Die Bindungskapazität der korrespondierenden IgY-F(ab )-Fragmente, beide unter gleichen Bedingungen an Bromcyan-aktivierte Sepharose gekoppelt, ergaben unter Berücksichtigung der Test-bedingten Fehlerbreite die erwartete Erhöhung der Bindungskapazität. Ein Vergleich der Versuche 9 und 7 bzw. 8 und 6 in Tabelle 1 zeigt bei der Bindung von Human-IgG pro mg IgY-F(ab )-Fragment jeweils eine Erhöhung um ungefähr 1,7 gegenüber dem Wert des gekoppelten kompletten Immunglobulins (IgY).IgY anti-human IgG achieved binding capacities of 0.23 to 0.27 mg human IgG per mg bound IgY. The binding capacity of the corresponding IgY-F (ab) fragments, both coupled under the same conditions to cyanogen-activated Sepharose, gave the expected increase in binding capacity, taking into account the test-related error range. A comparison of experiments 9 and 7 or 8 and 6 in Table 1 shows an increase of approximately 1.7 in each case in the binding of human IgG per mg IgY-F (ab) fragment compared to the value of the coupled complete immunoglobulin (IgY ).
Nach Derivatisierung von komplettem IgY mit Thiolgruppen unter Schutz der Antigenbindungsstelle und nachfolgender Kopplung an MBS-aktivierte Sepharose 4B konnte die Bindungskapazität des Immunadsoφtionsmaterials bereits auf 0,30 mg bis 0,38 mg Human-IgG gesteigert werden.After derivatization of complete IgY with thiol groups while protecting the antigen binding site and subsequent coupling to MBS-activated Sepharose 4B, the binding capacity of the immunoadsorption material could already be increased to 0.30 mg to 0.38 mg human IgG.
Anhand der bisherigen Überlegungen wäre bei der Kopplungsmethode nach Schutz der Antigenbindungsstelle für das Immunadsoφtionsmaterial mit F(ab )-Fragmenten eine Bindungskapazität von etwa 0,65 mg IgG pro mg gekoppeltem F(ab )-Fragment zu erwarten gewesen. Diese Erhöhungen entsprechen den Ergebnissen, die bei den Versuchen mit BrCN-aktivierter Sepharose gefunden wurden.Based on the previous considerations, a binding capacity of about 0.65 mg IgG per mg coupled F (ab) fragment would have been expected with the coupling method after protection of the antigen binding site for the immunoadsorption material with F (ab) fragments. These increases correspond to the results found in the experiments with BrCN-activated Sepharose.
Überraschenderweise zeigte sich, daß die so mit den IgY-F(ab')-Fragmenten hergestellten Immunadsoφtionsmaterialien mit 1,28 mg bis 1,48 mg eine wesentlich höhere Bindungskapazität aufwiesen.Surprisingly, it was found that the immunoadsorption materials thus produced with the IgY-F (ab ') fragments had a significantly higher binding capacity with 1.28 mg to 1.48 mg.
Für die Anwendung in der Immunadsoφtion ergeben sich durch das erfindungsgemäße Kopplungsverfahren mit derivatisierten Antikörperfragmenten entscheidende Vorteile. Wie in Tabelle 1 dargestellt ist, können anhand des vorgestellten Ausführungsbeispiels Immunadsoφtionsmaterialien hergestellt werden, die Bindungskapazitäten von über 19 mg Human-IgG pro ml Sepharose 4B aufweisen. (Siehe Versuch 3 in Tabelle 1). Diese Kapazität konnte mit herkömmlichen Kopplungsverfahren auch bei Einsatz weit höherer Konzentrationen an antigenbindenden Strukuren nicht erreicht werden. (Siehe Versuch 7 in Tabelle 1)The coupling method according to the invention with derivatized antibody fragments has decisive advantages for use in immunoadsorption. As shown in Table 1, immunosorbent materials can be produced on the basis of the exemplary embodiment presented, which have binding capacities of more than 19 mg human IgG per ml Sepharose 4B. (See Experiment 3 in Table 1). This capacity could not be achieved with conventional coupling methods, even when using far higher concentrations of antigen-binding structures. (See Experiment 7 in Table 1)
Diese Erhöhung der Bindungskapazität ermöglicht bei gegebener Kapazität eine Verringerung des Volumens einer Immunadsoφtionssäule und erlaubt damit kürzere Zeiten beim Beladen mit dem Antigen, beim Spülen, beim Eluieren des Antigens und bei der Regeneration der Säule. Empfindliche Antigene werden durch die kürzere Verweilzeit im meist schädlichen Elutionspuffer geschont. Andererseits können bei einem gegebenen Säulenvolumen in gleicher Zeit größere Ausbeuten erzielt werden. Die hier angewandte Methode der Kopplung von antigenbindenden Strukturen kann problemlos von der Sepharose auf andere Trägermaterialien übertragen werden.This increase in binding capacity enables the volume of an immunoadsorption column to be reduced for a given capacity and thus allows shorter times for loading with the antigen, for rinsing, for eluting the antigen and for regeneration of the column. Sensitive antigens are protected by the shorter residence time in the mostly harmful elution buffer. On the other hand, larger yields can be achieved at the same time for a given column volume. The method used here to couple antigen-binding structures can be easily transferred from Sepharose to other substrates.
Bei der Immunapherese zur Entfernung von Immunglobulinen oder auch LDL aus dem Blut von Patienten können die Behandlungszeiten verkürzt werden oder bei gleicher Behandlungszeit die Konzentrationen der zu entfernenden Substanz deutlich weiter abgesenkt werden. In the case of immunapheresis for removing immunoglobulins or LDL from the blood of patients, the treatment times can be shortened or the concentrations of the substance to be removed can be significantly reduced with the same treatment time.
Tabelle 1 Vergleich der Bindungskapazitäten von Immunadsoφtionsmaterialien auf der Basis von Sepharose 4B nach Kopplung der antigenbindenden Strukturen IgY-F(ab )-anti-human-IgG bzw. IgY-anti-human-IgG unter verschiedenen Bedingungen.Table 1 Comparison of the binding capacities of immunoadsorption materials based on Sepharose 4B after coupling of the antigen-binding structures IgY-F (ab) -anti-human-IgG or IgY-anti-human-IgG under different conditions.
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(+) Die erreichten Bindungskapazitäten wurden als mol gebundenes hu-IgG pro val an Sepharose gekoppelte Ag-bS berechnet und das Ergebnis des Versuches Nr. 9 auf 1 normiert. Entsprechend ist der Anstieg der Bindungskapazität in den Versuchen 1-3 um den Faktor 3,17 bis 3,69 erhöht. Diese Werte sind höher als erwartet. (+) The binding capacities achieved were calculated as moles bound hu-IgG per val Ag-bS coupled to Sepharose and the result of experiment No. 9 was normalized to 1. Correspondingly, the increase in binding capacity in experiments 1-3 was increased by a factor of 3.17 to 3.69. These values are higher than expected.
Legende zur Tabelle 1Legend for table 1
IgY-F(ab ')-SH IgY-F(ab ')-Fragmente, mit Thiolgruppen (SH) unter Schutz derIgY-F (ab ' ) -SH IgY-F (ab ' ) fragments, with thiol groups (SH) under protection of the
Antigenbindungstelle derivatisiert IgY-SH komplettes IgY, mit Thiolgruppen (SH) unter Schutz derAntigen binding site derivatizes IgY-SH complete IgY, with thiol groups (SH) under the protection of
Antigenbindungstelle derivatisiert IgY-F(ab ) IgY-F(ab )-Fragmente, nicht derivatisiert und ohne Schutz derAntigen binding site derivatizes IgY-F (ab) IgY-F (ab) fragments, not derivatized and without protection of the
Antigenbindungsstelle gekoppelt IgY komplettes IgY, nicht derivatisiert und ohne Schutz derAntigen binding site coupled IgY complete IgY, not derivatized and without protection of the
Antigenbindungsstelle gekoppelt hu-IgG humanes ImmunglobulinAntigen binding site coupled to hu-IgG human immunoglobulin
Ag-bS antigenbindende StrukturAg-bS antigen binding structure
IA-S Immunadsoφtionsmaterial auf SepharosebasisIA-S immunoadsorption material based on Sepharose
MBS m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidMBS m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide
BrCN Bromcyan val 1 Val entspricht dem Molekulargewicht der antigenbindenden StrukturBrCN Bromcyan val 1 Val corresponds to the molecular weight of the antigen-binding structure
/ Anzahl seiner Antigenbindungsstellen / Number of its antigen binding sites

Claims

Patentansprücheclaims
1. Verfahren zur Herstellung einer effektiven Immunadsoφtionsmatrix dadurch gekennzeichnet, daß man antigenbindende Strukturen unter Schutz der Antigenbindungsstelle mit funktioneilen Gruppen, die sich zur Kopplung an eine chemisch aktivierte Matrix eignen oder selbst eine aktivierte Gruppe darstellen, derivatisiert und/oder aktiviert und nachfolgend an ein Trägermaterial koppelt.1. A process for the preparation of an effective immunoadsorption matrix, characterized in that antigen binding structures are derivatized and / or activated with protection of the antigen binding site with functional groups which are suitable for coupling to a chemically activated matrix or which are themselves an activated group and subsequently to a carrier material couples.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antigenbindenden Strukturen vor ihrer Derivatisierung an eine polymere Matrix gebunden werden, an welches das Antigen kovalent gekoppelt ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the antigen-binding structures are bound before their derivatization to a polymer matrix to which the antigen is covalently coupled.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antigenbindenden Strukturen nach ihrer Derivatisierung an das Trägermaterial gekoppelt werden.3. The method according to claim 1, characterized in that the antigen-binding structures are coupled to the carrier material after their derivatization.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that
Trägermaterialien verwendet werden, an welche die antigenbindenden Strukturen kovalent gebunden werden.Support materials are used to which the antigen-binding structures are covalently bound.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß5. The method according to claim 4, characterized in that
Matrizes als Trägermaterial verwendet werden, welche aus organischen, anorganischen, synthetischen Polymeren oder aus Mischpolymeren bestehen die ggf. chemisch aktiviert werden.Matrices are used as carrier material, which consist of organic, inorganic, synthetic polymers or of mixed polymers which may be chemically activated.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als antigenbindende Strukturen F(ab )-Fragmente von Immunglobulinen, F(ab )2- Fragmente von Immunglobulinen, andere Fragmente von Immunglobulinen, Einzelkettenantiköφer, synthetische Peptide, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, oder Gemische davon, eingesetzt werden. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that as antigen-binding structures F (ab) fragments of immunoglobulins, F (ab) 2 - fragments of immunoglobulins, other fragments of immunoglobulins, single-chain antibodies, synthetic peptides that have an antigen binding site contain, or mixtures thereof, are used.
. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die. A method according to claim 6, characterized in that the
F(ab )-Fragmente oder F(ab )2-Fragmente oder anderen Fragmente von Immunglobulinen, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, aviären oder mammaliären Ursprungs, oder Mischungen aus beiden, sind.F (ab) fragments or F (ab) 2 fragments or other fragments of immunoglobulins, which contain an antigen binding site, of avian or mammalian origin, or mixtures of both, are.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Derivatisierung und/oder Aktivierung der zu koppelnden antigenbindenden Strukturen nach adsoφtiver Bindung oder nach an das Antigen erfolgter Bindung zum Schütze der Antigenbindungsstelle durchgeführt wird.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the derivatization and / or activation of the antigen-binding structures to be coupled is carried out after adsorptive binding or after binding to the antigen to protect the antigen binding site.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als funktioneile Gruppen Sulfhydryl-, Amino- oder Carboxylgruppen eingeführt werden.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that sulfhydryl, amino or carboxyl groups are introduced as functional groups.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that
F(ab )-Fragmente mit Sulfhydrylgruppen unter Schutz der Antigenbindungsstelle derivatisiert und anschließend an eine Maleimido-aktivierte Sepharosematrix gekoppelt werden.F (ab) fragments with sulfhydryl groups are derivatized under the protection of the antigen binding site and then coupled to a maleimido-activated Sepharose matrix.
11. Verwendung einer Immunadsoφtionsmatrix hergestellt nach einem der Ansprüche11. Use of an immunoadsorption matrix produced according to one of the claims
1 bis 10 zu therapeutischen, diagnostischen, präparativen, analytischen und medizintechnischen Zwecken.1 to 10 for therapeutic, diagnostic, preparative, analytical and medical purposes.
12. Immunadsoφtionsmatrix gekennzeichnet durch ein an sich bekanntes Trägermaterial, das ggf. chemisch aktiviert vorliegt und an das mit funktioneilen Gruppen derivatisierte antigenbindende Strukturen unter Erhalt der Antigenbindungsstelle gekoppelt sind.12. Immunoadsorption matrix characterized by a carrier material known per se, which is optionally chemically activated and to which antigen-binding structures derivatized with functional groups are coupled while maintaining the antigen-binding site.
13. Immunadsoφtionsmatrix nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß antigenbindende Strukturen F(ab )-Fragmente von Immunglobulinen, F(ab )2-Fragmente von Immunglobulinen, andere Fragmente von Immunglobulinen, Einzelkettenantiköφer, synthetische Peptide, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, oder Gemische davon sind, die mit Sulfhydryl-, Amino- oder Carboxylgruppen derivatisiert vorliegen.13. Immunoadsorption matrix according to claim 12, characterized in that antigen-binding structures F (ab) fragments of immunoglobulins, F (ab) 2 fragments of immunoglobulins, other fragments of immunoglobulins, single chain antibodies, synthetic peptides which contain an antigen binding site, or mixtures thereof are, which are derivatized with sulfhydryl, amino or carboxyl groups.
14. Immunadsoφtionsmatrix nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial aus organischen, anorganischen, synthetischen Polymeren oder aus Mischpolymeren besteht und ggf. chemisch aktiviert wurde.14. Immunoadsorption matrix according to claim 12 or 13, characterized in that the carrier material consists of organic, inorganic, synthetic polymers or of mixed polymers and has optionally been chemically activated.
15. Immunadsoφtionsmatrix nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie15. Immunoadsorption matrix according to one of claims 12 to 14, characterized in that it
IgY-F(ab )-Fragmente, die mit Sulfhydrylgruppen derivatisiert sind, und die gekoppelt an eine Maleimido-aktivierte Sepharosematrix sind, enthält. Contains IgY-F (ab) fragments that are derivatized with sulfhydryl groups and that are coupled to a maleimido-activated Sepharose matrix.
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