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WO1997044462A1 - Use of chemokine antagonist molecules for their antiviral activity, particularly against an hiv type retrovirus - Google Patents

Use of chemokine antagonist molecules for their antiviral activity, particularly against an hiv type retrovirus Download PDF

Info

Publication number
WO1997044462A1
WO1997044462A1 PCT/FR1997/000900 FR9700900W WO9744462A1 WO 1997044462 A1 WO1997044462 A1 WO 1997044462A1 FR 9700900 W FR9700900 W FR 9700900W WO 9744462 A1 WO9744462 A1 WO 9744462A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antagonist
amino acid
polypeptide
rantes
use according
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/000900
Other languages
French (fr)
Inventor
Fernando Arenzana-Seisdedos
Jean-Louis Virelizier
Françoise BACHELERIE
Marco Baggiolini
Ian Clark-Lewis
Original Assignee
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Priority to AU30369/97A priority Critical patent/AU3036997A/en
Priority to EP97925120A priority patent/EP0953051A1/en
Publication of WO1997044462A1 publication Critical patent/WO1997044462A1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present application relates to the use of compounds antagonists of molecules of the chemokines family or antagonists of products derived from chemokines having preserved all the biological properties of chemokines, said compounds being characterized in that they make it possible to obtain l inhibition of a viral infection or of its m vitro or m vivo effects, said compounds preferably exhibiting anti-viral activity with respect to infections due to retroviruses causing immunodeficiency in a host, and in particular in a hurmm patient, in particular retroviruses of the HIV or HIV type (human immunodeficiency virus)
  • Chemokines are molecules of the cytokine family, which have activation properties, in particular of cells of the leukocyte family involving in particular chemoattractive properties, calcium mobilizing properties by increasing intracellular calcium and enzyme release properties (exocytosis) These chemokines are known for their possible role as mediators of inflammation
  • Chemokines have been described by their structure by their affinity for one or more receptors and by their biological properties in a publication by Baggiolmi M et al (Advances in Immunology (1994), vol 55, pages 97-179)
  • these chemokines are characterized by the presence in their primary structure, of conserved cysteine residues (1 to 4 residues in particular) on the basis of which several sub-families have been distinguished according to the position of the first two cystems These families include those of the CXC proteins or of the CC proteins The presence of these cysteine residues induces the formation of disulfide bridges Among these chemokines, different molecules have been the subject of specific studies In this regard, mention will be made of the RANTES molecule described in the publication by Schall TJ et al (The Journal of Immunology, August 1, 1988, vol 141, 1018-1025, No 3) La RANTES molecule (abbreviation of Regulated upon Activation, Normal T-Express and presumably Secreted) was described in this article, in particular using the nucleotide sequence of its complementary DNA and using the amino acid sequence of the open reading phase The biological properties of RANTES have been described in particular in the aforementioned article by Baggiolini These receptors, specific
  • chemokines such as MIP (Macrophage Inflammatory Protem) chemokines observed, isolated and purified from mouse macrophages (WOLPE SD et al, J Ex Med (1988), 167-170) have been described from the point of view of their biological properties in the article by Baggiohni et al (1994)
  • MCP Monocyte Chemotactic Protem
  • the authors of the present application are interested in the effect that chemokines can exert on the replication of the HIV retrovirus and after having verified the anti-viral effect of molecules such as RANTES, MIP1 ⁇ and MIP1 ⁇ vis-à-vis HIV, the inventors of the present application are interested in the biological mechanism allowing the interference of chemokines with the rephcation of the HIV retrovirus in T lymphocytes
  • the inventors have characterized compounds, lacking the biological activities of chemokines and having notably lost the chemo-attractive activity of chemokines with respect to cells of the leukocyte type, in particular lymphocytes or monocytes, compounds which are susceptible nevertheless play a role in the control, or even the inhibition, of the effects of a viral infection, in particular of an infection of cells by a retrovirus of the HIV type
  • chemokine antagonists for example chemokine antagonists of the CXC family or of the CC family, in particular of RANTES and / or MIP and / or MCP can oppose rephcation primary HIV retrovirus isolates in normal peripheral blood lymphocytes (PBLs)
  • PBLs peripheral blood lymphocytes
  • the subject of the invention is therefore an antagonist compound also called an "antagonist" of one or more molecules of the family of chemokines for use in the treatment or prevention of infection due to a virus and more particularly to a retrovirus of the HIV type.
  • the antagonist compound is used in particular for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of infection due to an HIV-type retrovirus.
  • the term “antagonist” refers to a compound whose presence in a host and in particular in a human patient, is capable of affecting the activity of one or more chemokines while having the capacity prevent or inhibit viral infection in vivo or in vitro; in particular, such an antagonist can block or displace the binding of one or more chemokines to one or more chemokine receptors, on cells, for example, lymphocytes, monocytes or macrophages, and, therefore, if necessary indirect, this antagonist is likely to affect the biological cell activation properties of these chemokines
  • the desired properties thus defined of this antagonist can advantageously be verified by means of a test carried out in vitro on normal PBL lymphocytes stimulated by a mitogen and infected with Primary isolates of HIV retrovirus
  • the expression "prevention or treatment of an infection due to an HIV retrovirus” means the ability of the abovementioned antagonist compound to intervene either in the viral rephcation of isolates primary forms of HIV in cells participating in host
  • This expression also includes the prevention and treatment of infections such as so-called opportunistic infections or tumors preceding and / or accompanying the development of the AIDS disease and therefore defined as diseases related to infection by an HIV retrovirus.
  • infections such as so-called opportunistic infections or tumors preceding and / or accompanying the development of the AIDS disease and therefore defined as diseases related to infection by an HIV retrovirus.
  • the test carried out in vitro on PBL lymphocytes (peripheral blood lymphocytes) infected with primary strains of HIV is a relevant indication of the therapeutic or prophylactic properties sought for the antagonists described.
  • the term "HIV” includes human viruses and retroviruses or animals capable of inducing an immunodeficiency, such as the retroviruses known under the names of HIV-1 and HIV-2 and in particular the various isolates characterized to date, whether they are primary isolates or isolates modified to respond to m vitro culture constraints or infectious HIV clones from primary isolates
  • the antagonistic compounds according to the invention make it possible, in the context of the treatment or prevention of an infection due to an HIV-type retrovirus, to reduce the rephcation and / or dissemination of the retrovirus in the organism of the infected host and / or correct the immune deficiency resulting from this infection or its manifestations
  • the antagonist is a compound capable of entering into competition with one or more chemokines, for binding to one or more cell receptor (s) of this (these) dem ⁇ ère (s)
  • the molecules belonging to the chemokine family are known to have at least for some of them, the capacity to bind different cellular receptors present on the cells derived from the lymphoid or myeloid lines, and in particular several receptors present on lymphocyte, monocyte, basophilic, or eosmophilic type cells.
  • the antagonist usable in the context of the present application can according to a first particular embodiment of the invention, be selected for its ability to interfere with the normal interaction between the chemokines and their receptor (s) and in particular to modify the access, for example the conformational recognition of one or more chemokines vis-à-vis its receptor (s) or to block the binding of one or more chemokines with one or more natural cellular receptors of these chemokines
  • this antagonist replaces one or more chemokine in the activity of binding to one or more receptors
  • the invention also relates, according to another particular embodiment, to antagonistic compounds selected for their specific affinity with respect to '' a specific receptor or a determined number of chemokine receptors
  • the antagonist used is chosen for its ability to displace the binding of one or more chemokines with respect to one or more cellular receptors of the latter
  • the antagonist has a competitive activity with one or more chemokines chosen from RANTES, MIP1 ⁇ , MIP1 ⁇ , MCP1, MCP3 Structural relationships have been observed between the various aforementioned chemokines , in particular between the RANTES and MIP chemokines, both in terms of the amino acid sequence forming the primary structure of these chemokines and their secondary or three-dimensional structures as established by the nuclear magnetic resonance spectroscopy technique ( Wells TNC et al, Journal of Leukocyte Biology, vol 59, January 1996, pages 53-60)
  • antagonists of the RANTES molecule are for example capable of binding the receptors of several chemokines, in particular those of RANTES, MCP3 and MCP1.
  • Such antagonists have quite interesting properties, due to their capacity to occupy the sites normally occupied by RANTES, said occupation resulting in verifiable anti-viral activity in particular in vitro on normal lymphocytes infected with primary HIV isolates.
  • An antagonistic compound of interest in the context of carrying out the invention is for example a compound whose structure is derived from the structure of a chemokine, for example of a chemokine chosen from the RANTES, MIP or MCP molecules defined above.
  • this antagonist is further characterized in that it is devoid of the biological properties of chemokine or Chemokines whose activity it affects.
  • the invention relates to chemokine antagonists lacking the chemoattraction properties usually recognized in chemokines and advantageously in the RANTES molecule
  • the antagonist can be characterized in that it lacks the ability to transduce a signal in the cells to which it is linked via one or more determined receptors.
  • the antagonist is characterized in that it transduces no biological activity through the receptor (s) to which it is linked.
  • this antagonist nevertheless retains the antiviral activity recognized by the RANTES molecule, at least to a level to reduce rephcation or viral spread or their effect and advantageously to inhibit it
  • an antagonist according to the invention can also be characterized in that it is devoid of the natural capacity of the RANTES molecule on the one hand to induce the release or the entry of calcium into the cells to which it is linked by a receptor and / or on the other hand, to affect the exocytosis by release of enzymes from these cells.
  • the invention advantageously provides molecules having anti-viral effects from one or more chemokines which are nevertheless devoid of the side effects of active chemokines
  • An interesting antagonist according to the invention can also be characterized in that it is a polypeptide derived from a chemokine, the structure of which comprises at least one, or even two disulfide bridges
  • a polypeptide type antagonist derived from the RANTES polypeptide responding to the acid sequence.
  • polypeptide refers to an amino acid structure comprising from 10 to 100, preferably from 10 to 70 amino acids, which structure can be used in linear form or in conformational form.
  • the invention advantageously relates to antagonists having a structure corresponding to the structure conferred by the presence of several and in particular of two disulfide bridges such that observes it in cytokmes, especially in RANTES, MIP and MCP molecules
  • a polypeptide derived from the RANTES polypeptide, which can be used in the context of the invention is for example obtained by deletion of all or part of its N-terminal sequence and in particular by deletion of all or part of the sequence between the acid residues amino acids 1 and 15 or between amino acids 1 and 9 or 1 and 8 (including the extreme residues) of the amino acid sequence shown in Figure 1 C
  • the antagonist which can be used for the treatment or prevention of an infection due to an HIV retrovirus is a polypeptide corresponding to the following amino acid sequence (called RANTES 9-68)
  • amino acid sequences are identified by reference to the letter code usually used.
  • This antagonist can be used in the form of its primary structure or in a t ⁇ -dimensional form, for example in a form reproducing the essential characteristics of the conformational structure of the RANTES molecule at the very least from the part of this molecule involved in the binding to its receptor (s) cellula ⁇ re (s) This structure was reported in the article by Wells TNC supra and Chung CW (Biochemistry 34, 9307-9314)
  • the antagonist which can be used in the context of the invention is a polypeptide derived from the RANTES polypeptide which is represented by its amino acid sequence in FIG. 1C, by deletion of all or part of its C-terminal sequence comprised between the amino acid residues 50 and 68, preferably 60 and 68 of the sequence represented in FIG. 1 C
  • An antagonist derived from the RANTES polypeptide by substitution or by mutation can alternatively be characterized in that approximately 5% to approximately 10% of the amino acid residues, with the exception of the cysteine residues involved in the formation of disulfide bridges, are replaced.
  • Residues of substituted amino acids can be replaced by neutral amino acids, or constituting a conservative substitution or chosen if necessary, taking into account the size
  • lysine residues can be replaced by isoleucine, leucine or vahne residues
  • such antagonists which can be used for carrying out the invention correspond to one of the following amino acid sequences
  • the antagonist used is characterized in that it is a RANTES molecule the N-terminal end of which has been lengthened by the addition of at least one acid residue amino or alternatively of a RANTES molecule whose N- and C- terminal ends or whose internal sequences in these N- or C- termal regions have been lengthened by addition of one or more amino acid residues under conditions allowing to obtain the desired antagonistic effect.
  • the subject of the invention is also a nucleotide sequence comprising a sequence coding for a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence shown in FIG. 1, by deletion of all or part of the N-term sequence of this latest. According to an advantageous embodiment of the invention, this sequence codes for an antagonistic polypeptide as it was defined in the preceding pages
  • the nucleotide sequence is characterized in that it responds to the following sequence •
  • a nucleotide sequence according to the invention may optionally also include exogenous sequences, in particular regulatory and / or activation sequences capable of controlling and / or regulating the expression of the sequence coding for an antagonist according to the invention in a host cell, in vitro or m vivo
  • a nucleotide sequence of the invention can be fused with all or part of a sequence coding for ⁇ -galactosidase.
  • the coding sequence for ⁇ -galactosidase contains before the first codon corresponding to the first amino acid prohne of the molecule R9-68 or R8-68, a peptide sequence of the X-glycyl-L-propyl type, recognized specifically by a collagenase, thus allowing the achievement of a specific cleavage after the glycine residue of the polypeptide formed, releasing the antagonist.
  • This technique is described in European patent application 01 15974.
  • the nucleotide sequence is characterized in that it is inserted into an expression vector or adsorbed on a support capable of being internalized in a eukaryotic cell or even in a bacterium capable to enter eukaryotic cells such as Shigella according to the method described by Courvalin P et al (CR Acad Sci Pans, 1995, 318 1207-12)
  • This vector is advantageously chosen to allow expression in vitro in a cellular host, d an antagonist as defined above or to allow expression in vivo in a host to which it is administered, in particular in a patient infected with an HIV retrovirus, for the purposes of transient or continuous expression of an antagonist as defined in the preceding pages
  • nucleotide sequences thus defined in the context of the invention can, for example, be used in the context of a gene therapy protocol aimed at preventing or treating an infection due to an HIV retrovirus
  • vectors usable in the context of these therapies such as those described in the international patent applications published under the numbers WO 95/14785 and WO 94/24298
  • nucleotide sequences can also be administered using the techniques described in the patent FR 271 1670 or in international patent application WO 90/1 1092, for the expression m vivo
  • vectors may be used allowing the administration or the controlled or even delayed release of these nucleotide sequences or of their expression product in the treated host, in order to obtain a continuous or iterative antiviral effect at least over a period sufficient to reduce or even inhibit the retrovirus or its effects.
  • techniques such as those involving the use of a calcium phosphate gel can be used to obtain a release with delayed effect of an active product. Such techniques are for example described in French patent 2,543,439. Sequences recognized by cellular or extracellular proteases can be used to allow the production of mature forms of the antagonist molecules of RANTES from these vectors.
  • the mature form of the RANTES protein is indeed produced after cleavage of a sequence of 23 amino acids located upstream of the first residue (seine) of the active form of the protein
  • the serum levels to be reached in treated patients would be in the range of 1 to 100 nM.
  • the subject of the invention is also a polypeptide corresponding to the expression product in a host cell, for example a bacterial cell or a eukaryotic cell, in particular a yeast cell, a mammalian cell, for example CHO, of a sequence of nucleotides as defined above.
  • a host cell for example a bacterial cell or a eukaryotic cell, in particular a yeast cell, a mammalian cell, for example CHO, of a sequence of nucleotides as defined above.
  • Another antagonistic polypeptide which can be used in the context of the invention is, for example, a RANTES polypeptide modified by the addition of one or more amino acid residues upstream of its N-terminal end.
  • a methionine in upstream of the first residue (seine) of the mature form of RANTES would have the advantage of inhibiting the chemoattractive capacity of chemokine while retaining its capacity to inhibit viral infection, thanks to its unmodified capacity to bind specifically to its receiver
  • modified molecules of RANTES or other antagonistic polypeptides can be carried out by chemical synthesis or by recombination and expression in a prokaryotic or eukaryotic cell, for example in yeast or in E coli
  • the polypeptide is an antagonist of one or more chemokines chosen from RANTES, MIP or MCP, characterized in that it is derived from the RANTES polypeptide responding to the amino acid sequence represented in FIG. 1, by substitution, addition or deletion of at least one amino acid residue, said antagonist being devoid of the chemoattractive properties of chemokines, for example with respect to leukocytes, in particular lymphocytes, said polypeptide being in the form of a fusion polypeptide, capable of binding the cellular receptor (s) of RANTES and / or MIP and / or MCP
  • polypeptides of the invention can be prepared by genetic engineering or by chemical synthesis for example on an apparatus (Applied Biosystems) or by synthesis on solid phase described by Merrifiel, for example according to the technique described in application WO 95/09868
  • the invention also relates to a composition characterized in that it comprises, for the separate or simultaneous administration, an antagonist compound of one or more molecules of the chemokine family as defined above, and one or more active agents capable of being used in the treatment of an infection by an HIV retrovirus, for example an agent which can be used in chemotherapy such as a reverse anti-transeptase compound or viral anti-protease compound or a compound such as a CD4 receptor antagonist present on lymphocytes of patients infected with an HIV retrovirus or a compound which can be used in immunotherapy, for example a cytokine and in particular mterleukin 2
  • said composition comprises, in addition to the antagonist compound of one or more chemokines and one or more active substances in antiviral chemotherapy, and / or an agent for treating opportunistic infections that develop during infection with an HIV retrovirus or during the course of infection in vivo
  • the compounds of the invention can in this regard be administered by injection by intravenous route, for example by infusion, by intramuscular or subcutaneous
  • intravenous route for example by infusion
  • intramuscular or subcutaneous In the case of the use in gene therapy of the compounds described in the invention, recourse may be had to patient cells, for example fibroblasts, myoblasts or hematopoietic cells treated with appropriate vectors containing the sequences nucleotides of the invention, these cells then being reimplanted in the patient for the express the above nucleotide sequences
  • the effectiveness of the treatment thus carried out can be evaluated by monitoring and monitoring the viral, plasma and cellular load and by examining the evolution of the number of lymphocytes carrying CD4 receptors, as well as the immunological and inflammatory status of the patient.
  • Figure 1 Nucleotide and amino acid sequence of RANTES A: cDNA sequence comprising the coding sequence B Coding sequence of the mature RANTES protein C. Amino acid sequence of RANTES Figure 2 Nucleotide and amino acid sequence of the polypeptides
  • R9-68 and R8-68 and of substituted polypeptides A- Coding sequence of R9-68 and of R8-68 B Sequence of the R9-68 and R8-68 polypeptides
  • a RANTES chemokine antagonist was defined and obtained in the form of a truncated polypeptide whose amino acid sequence corresponds to amino acid residues 9 to 68 of the amino acid sequence of the RANTES molecule as defined in FIG. 1
  • the antagonist RANTES 9-68 was produced using the technique described in the publication by Gong JH et al (JBC vol 271 N18, issue of may 3, 1996 p 10521 -10527)
  • a clone of a primary isolate obtained from the cerebrospinal fluid of an affected patient of AIDS (designated by HIV JR-CSF Koganagi Y et al Science 236 819, 1987 and Cann AJ et al, J Virol 64 4735, 1990) was used as well as a clone PYU2 corresponding to a primary strain of HIV having a troptsm for T lymphocytes and monocytes and isolated from the brain (Li et al, J Virol, 1992, vol 66-6587)
  • the proviral DNA was transfected into COS7 cells and the supernatant obtained after three days of the transfected culture containing the infectious particles was used to infect PBL
  • the antiviral capacity of R9-68 demonstrated in cells infected with HIV pYU2 and HIV JR
  • the antiviral properties of the antagonist R9-68 were tested by determining the capacity of this antagonist to block the rephcation of the HIV virus.
  • the ability of a molecule to block the rephcation of the HIV virus could be tested using the technique using leukocytes isolated on a Ficoll gradient from healthy donors, which leukocytes were infected in vitro with primary viral isolates. , unable to replicate in transformed cell lines.
  • cells from six different donors were infected for 2 or 3 hours with HIV isolates.
  • the amount of viral inoculum was estimated by quantification of the GAG P24 protein and was found to be between 150 to 5000 programs per 10 000 000 cells.
  • the cells were cultured on of 96-well microplates (2 ⁇ 10 5/200 microliters) in the presence of the tested molecules purified in an enriched culture medium in the interleukin 2. the culture supernatants were collected periodically and the cell cultures were subcultured with fresh media and the molecules tested.
  • PHA-treated blasts have also been added to bring the infected culture fresh cells serving as a target for HIV Viral rephcation was measured using the P24 ELISA kit (Dupont de Nemours) (detection threshold 3 pg / ml)
  • the cells infected with pYU2 and treated with R9-68 at the concentration of 1000 nM produced 7 pg / ml of p24 protein on day 11 (76 and 24 pg / ml on days 6 and 8 respectively)
  • La p24 protein was not detected in cultures of this same donor infected with JR-CSF in the presence of R9-68 on day 11 (62 and 15 pg / ml were detected on days 6 and 8 respectively)
  • Control cultures infected with pYU2 and JR-CSF but not treated with R9-68 showed an intense viral rephcation which generated 7 ng / ml and 1 13 ng / ml of P24 protein on day 1 1 respectively
  • the antagonist AAR-IL8 1000 nM of the protein IL8 was devoid of antiviral effect
  • Proviral DNA has revealed a deep decrease in the specific signal in infected cells in the presence of R9-68
  • the specificity of the signal obtained from proviral DNA was demonstrated by its abolition in infected cells and treated with the reverse viral transc ⁇ ptase inhibitor, 3'-az ⁇ do-3'deoxyth ⁇ m ⁇ d ⁇ ne (AZT)
  • ZT reverse viral transc ⁇ ptase inhibitor

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Abstract

The invention discloses the use of an antagonist compound (designated 'antagonist') of one or several molecules of the chemokine family for preparing a medicine for the prevention or the treatment of a viral infection.

Description

UTILISATION DE MOLECULES ANTAGONISTES DE CHEMOKINES POUR LEUR ACTIVITE ANTIVIRALE NOTAMMENT CONTRE UN RETROVIRUS DE TYPE VIH.USE OF ANTAGONIST MOLECULES OF CHEMOKINES FOR THEIR ANTIVIRAL ACTIVITY IN PARTICULAR AGAINST AN HIV-TYPE RETROVIRUS.
La présente demande a pour objet l'utilisation de composés antagonistes de molécules de la famille des chemokines ou des antagonistes des produits dérivés de chemokines ayant conservé toutes les propriétés biologiques des chemokines, lesdits composés étant caractérisés en ce qu'ils permettent d'obtenir l'inhibition d'une infection virale ou de ses effets m vitro ou m vivo, lesdits composés présentant à titre préférentiel une activité anti-virale vis-à-vis d'infections dues à des rétrovirus provoquant une immunodéficience chez un hôte, et en particulier chez un patient hurmm, notamment des rétrovirus de type HIV ou VIH (virus de hmmunodéficience humaine) Les chemokines sont des molécules de la famille des cytokines, qui présentent des propriétés d'activation, notamment de cellules de la famille des leucocytes faisant intervenir notamment des propriétés chemoattractives, des propriétés de mobilisation du calcium par augmentation du calcium intracellulaire et des propriétés de relargage d'enzymes (exocytose) Ces chemokines sont connues pour leur rôle éventuel en tant que médiateurs de l'inflammationThe present application relates to the use of compounds antagonists of molecules of the chemokines family or antagonists of products derived from chemokines having preserved all the biological properties of chemokines, said compounds being characterized in that they make it possible to obtain l inhibition of a viral infection or of its m vitro or m vivo effects, said compounds preferably exhibiting anti-viral activity with respect to infections due to retroviruses causing immunodeficiency in a host, and in particular in a hurmm patient, in particular retroviruses of the HIV or HIV type (human immunodeficiency virus) Chemokines are molecules of the cytokine family, which have activation properties, in particular of cells of the leukocyte family involving in particular chemoattractive properties, calcium mobilizing properties by increasing intracellular calcium and enzyme release properties (exocytosis) These chemokines are known for their possible role as mediators of inflammation
Les chemokines ont été décrites par leur structure par leur affinité pour un ou plusieurs récepteurs et par leurs propriétés biologiques dans une publication de Baggiolmi M et al (Advances in Immunology (1994), vol 55, pages 97-179)Chemokines have been described by their structure by their affinity for one or more receptors and by their biological properties in a publication by Baggiolmi M et al (Advances in Immunology (1994), vol 55, pages 97-179)
Une publication de Wells T N C. et al (Journal of Leukocyte Biology, vol 59, January 1996, 53-60) décrit la structure tπ-dimensionnelle de plusieurs chemokines et leurs récepteurs spécifiques ou nonA publication by Wells T N C. et al (Journal of Leukocyte Biology, vol 59, January 1996, 53-60) describes the tπ-dimensional structure of several chemokines and their specific or non-specific receptors
De façon générale, ces chemokines sont caractérisées par la présence dans leur structure primaire, de résidus cystéine conservés (1 à 4 résidus notamment) sur la base desquels plusieurs sous-familles ont été distinguées selon la position des deux premières cystémes Ces familles comprennent celles des protéines CXC ou des protéines CC La présence de ces résidus cystéine induit la formation de ponts disulfure Parmi ces chemokines, différentes molécules ont fait l'objet d'études spécifiques A cet égard, on citera la molécule RANTES décrite dans la publication de Schall T J et al (The Journal of Immunology, August 1 , 1988, vol 141 , 1018-1025, No 3) La molécule RANTES (abréviation de Regulated upon Activation, Normal T-Express and presumably Secreted) a été décrite dans cet article, notamment a l'aide de la séquence nucléotidique de son ADN complémentaire et a l'aide de la séquence d'acides aminés de la phase ouverte de lecture Les propriétés biologiques de RANTES ont été décrites notamment dans l'article de Baggiolini précité Ces récepteurs, spécifiques ou non, ont ete identifies dans la publication de Wells précitée ou dans les articles auxquels elle se réfèreGenerally, these chemokines are characterized by the presence in their primary structure, of conserved cysteine residues (1 to 4 residues in particular) on the basis of which several sub-families have been distinguished according to the position of the first two cystems These families include those of the CXC proteins or of the CC proteins The presence of these cysteine residues induces the formation of disulfide bridges Among these chemokines, different molecules have been the subject of specific studies In this regard, mention will be made of the RANTES molecule described in the publication by Schall TJ et al (The Journal of Immunology, August 1, 1988, vol 141, 1018-1025, No 3) La RANTES molecule (abbreviation of Regulated upon Activation, Normal T-Express and presumably Secreted) was described in this article, in particular using the nucleotide sequence of its complementary DNA and using the amino acid sequence of the open reading phase The biological properties of RANTES have been described in particular in the aforementioned article by Baggiolini These receptors, specific or not, have been identified in s the aforementioned publication by Wells or in the articles to which it refers
D'autres chemokines telles que les chemokines MIP (Macrophage Inflammatory Protem) observées, isolées et purifiées à partir de macrophages de souris (WOLPE S D et al, J Ex Med (1988), 167-170) ont été décrites du point de vue de leurs propriétés biologiques dans l'article de Baggiohni et al (1994)Other chemokines such as MIP (Macrophage Inflammatory Protem) chemokines observed, isolated and purified from mouse macrophages (WOLPE SD et al, J Ex Med (1988), 167-170) have been described from the point of view of their biological properties in the article by Baggiohni et al (1994)
Une autre catégorie de chemokines, appelées MCP (Monocyte Chemotactic Protem) a été identifiée à partir de basophiles Dans les familles MIP et MCP, on connaît notamment les chemokines MIP1α, MIP1 β, MCP1 , MCP2 et MCP3 Dans une publication de Cocchi F et al (Science, 15 DécembreAnother category of chemokines, called MCP (Monocyte Chemotactic Protem) has been identified from basophils. In the MIP and MCP families, the chemokines MIP1α, MIP1 β, MCP1, MCP2 and MCP3 are known. (Science, December 15
1995, vol 270, 181 1 -1815), les auteurs ont émis l'hypothèse que des molécules telles que RANTES, MIP1α et MIP1 β produites notamment par des lymphocytes T CD8+, pourraient constituer des facteurs suppresseurs de la réplication des isolats primaires du VIH Ils ont ainsi émis l'hypothèse que les protéines RANTES, MIP1α et MIP1 β produites par des lymphocytes T exprimant des récepteurs CD8 pourraient participer au contrôle de l'infection par un rétrovirus VIH en tant que facteur suppresseur de la réplicatioπ Des anticorps obtenus contre les chemokines RANTES ou MIP1α ou MIP1 β ont selon Cocchi et al , la capacité de bloquer partiellement ou totalement, lorsqu'ils sont utilisés conjointement, l'activité anti-HIV des chemokines1995, vol 270, 181 1 -1815), the authors hypothesized that molecules such as RANTES, MIP1α and MIP1 β produced in particular by CD8 + T lymphocytes, could constitute factors suppressing the replication of primary isolates of HIV They hypothesized that the RANTES, MIP1α and MIP1 β proteins produced by T lymphocytes expressing CD8 receptors could participate in the control of infection by an HIV retrovirus as a factor suppressing the replicatioπ Antibodies obtained against the RANTES or MIP1α or MIP1 β chemokines have according to Cocchi et al, the ability to partially or totally block, when used together, the anti-HIV activity of chemokines
L'article de Cocchi et al précité ne contient pas de données expérimentales sur le rôle et le stade de l'intervention des chemokines dans le contrôle de l'infection par un rétrovirus VIHThe aforementioned article by Cocchi et al does not contain experimental data on the role and stage of chemokine intervention in the control of infection by an HIV retrovirus.
Les auteurs de la présente demande se sont intéresses à l'effet que peuvent exercer les chemokines sur la replication du rétrovirus VIH et après avoir vérifié l'effet anti-viral des molécules telles que RANTES, MIP1α et MIP1 β vis-à-vis de HIV, les inventeurs de la présente demande se sont intéresses au mécanisme biologique permettant l'interférence de chemokines avec la rephcation du rétrovirus VIH dans les lymphocytes TThe authors of the present application are interested in the effect that chemokines can exert on the replication of the HIV retrovirus and after having verified the anti-viral effect of molecules such as RANTES, MIP1α and MIP1 β vis-à-vis HIV, the inventors of the present application are interested in the biological mechanism allowing the interference of chemokines with the rephcation of the HIV retrovirus in T lymphocytes
De façon surprenante, les inventeurs ont caractérisé des composés, dépourvus des activités biologiques des chemokines et ayant perdu notamment l'activité chemo-attractive des chemokines vis-à-vis des cellules de type leucocytes, en particulier des lymphocytes ou des monocytes, composés susceptibles néanmoins de jouer un rôle dans le contrôle, voire l'inhibition, des effets d'une infection virale, en particulier d'une infection de cellules par un rétrovirus de type VIHSurprisingly, the inventors have characterized compounds, lacking the biological activities of chemokines and having notably lost the chemo-attractive activity of chemokines with respect to cells of the leukocyte type, in particular lymphocytes or monocytes, compounds which are susceptible nevertheless play a role in the control, or even the inhibition, of the effects of a viral infection, in particular of an infection of cells by a retrovirus of the HIV type
Ainsi, les inventeurs ont mis en évidence que des antagonistes de chemokines, par exemple des antagonistes de chemokines de la famille CXC ou de la famille CC, notamment de RANTES et/ou de MIP et/ou de MCP peuvent s'opposer à la rephcation d'isolats primaires du rétrovirus VIH dans des lymphocytes du sang périphérique (PBL) normauxThus, the inventors have demonstrated that chemokine antagonists, for example chemokine antagonists of the CXC family or of the CC family, in particular of RANTES and / or MIP and / or MCP can oppose rephcation primary HIV retrovirus isolates in normal peripheral blood lymphocytes (PBLs)
L'invention a donc pour objet un composé antagoniste encore appelé « antagoniste » d'une ou plusieurs molécules de la famille des chemokines pour l'utilisation pour le traitement ou la prévention d'une infection due à un virus et plus particulièrement à un rétrovirus du type VIH. Dans le cadre de cette définition, le composé antagoniste est utilisé notamment pour la préparation d'un médicament pour la prévention ou le traitement de l'infection due à un rétrovirus de type VIH.The subject of the invention is therefore an antagonist compound also called an "antagonist" of one or more molecules of the family of chemokines for use in the treatment or prevention of infection due to a virus and more particularly to a retrovirus of the HIV type. In the context of this definition, the antagonist compound is used in particular for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of infection due to an HIV-type retrovirus.
Dans le cadre de la présente description, le terme « antagoniste » fait référence à un composé dont la présence chez un hôte et notamment chez un patient humain, est susceptible d'affecter l'activité d'une ou plusieurs chemokines tout en ayant la capacité d'empêcher ou d'inhiber une infection virale in vivo ou in vitro ; en particulier, un tel antagoniste peut bloquer ou déplacer la liaison d'une ou plusieurs chemokines à un ou plusieurs récepteurs de chemokines, sur des cellules, par exemple, des lymphocytes, des monocytes ou des macrophages, et, donc le cas échéant de façon indirecte, cet antagoniste est susceptible d'affecter les propriétés biologiques d'activation cellulaire de ces chemokines Les propriétés recherchées ainsi définies de cet antagoniste peuvent être avantageusement vérifiées grâce à un test effectué m vitro sur des lymphocytes PBL normaux stimulés par un mitogène et infectés par des isolats primaires de rétrovirus VIH Selon la présente demande, on entend par l'expression « prévention ou traitement d'une infection due à un rétrovirus de type VIH » la capacité du composé antagoniste précité d'intervenir soit sur la rephcation virale d'isolats primaires de VIH dans des cellules participant à l'immunité de l'hôte, et en particulier dans des lymphocytes du sang périphérique, par exemple des lymphocytes T-normaux. Cette expression englobe également la prévention et le traitement des infections telles que les infections dites opportunistes ou des tumeurs précédant et/ou accompagnant le développement de la maladie SIDA et de ce fait, définies comme maladies reliées à l'infection par un rétrovirus VIH Le test effectué m vitro sur des lymphocytes PBL (lymphocytes du sang périphérique) infectés à l'aide de souches primaires de VIH, est une indication pertinente des propriétés thérapeutiques ou prophylactiques recherchées des antagonistes décrits Le terme « VIH » comprend les virus et rétrovirus humains ou animaux susceptibles d'induire une immunodéficience, tels que les rétrovirus connus sous les noms de VIH-1 et VIH-2 et notamment les différents isolats caractérises jusqu'à ce jour, qu'il s'agisse d'isolats primaires ou d'isolats modifiés pour répondre à des contraintes de culture m vitro ou des clones HIV infectieux provenant d'isolats primairesIn the context of the present description, the term “antagonist” refers to a compound whose presence in a host and in particular in a human patient, is capable of affecting the activity of one or more chemokines while having the capacity prevent or inhibit viral infection in vivo or in vitro; in particular, such an antagonist can block or displace the binding of one or more chemokines to one or more chemokine receptors, on cells, for example, lymphocytes, monocytes or macrophages, and, therefore, if necessary indirect, this antagonist is likely to affect the biological cell activation properties of these chemokines The desired properties thus defined of this antagonist can advantageously be verified by means of a test carried out in vitro on normal PBL lymphocytes stimulated by a mitogen and infected with Primary isolates of HIV retrovirus According to the present application, the expression "prevention or treatment of an infection due to an HIV retrovirus" means the ability of the abovementioned antagonist compound to intervene either in the viral rephcation of isolates primary forms of HIV in cells participating in host immunity, and in particular in lymphocytes peripheral blood, such as normal T-cells. This expression also includes the prevention and treatment of infections such as so-called opportunistic infections or tumors preceding and / or accompanying the development of the AIDS disease and therefore defined as diseases related to infection by an HIV retrovirus. The test carried out in vitro on PBL lymphocytes (peripheral blood lymphocytes) infected with primary strains of HIV is a relevant indication of the therapeutic or prophylactic properties sought for the antagonists described. The term "HIV" includes human viruses and retroviruses or animals capable of inducing an immunodeficiency, such as the retroviruses known under the names of HIV-1 and HIV-2 and in particular the various isolates characterized to date, whether they are primary isolates or isolates modified to respond to m vitro culture constraints or infectious HIV clones from primary isolates
Les composes antagonistes selon l'invention permettent, dans le cadre du traitement ou de la prévention d'une infection due à un rétrovirus de type VIH, de diminuer la rephcation et/ou la dissémination du rétrovirus dans l'organisme de l'hôte infecté et/ou de corriger le déficit immunitaire résultant de cette infection ou ses manifestationsThe antagonistic compounds according to the invention make it possible, in the context of the treatment or prevention of an infection due to an HIV-type retrovirus, to reduce the rephcation and / or dissemination of the retrovirus in the organism of the infected host and / or correct the immune deficiency resulting from this infection or its manifestations
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, l'antagoniste est un composé susceptible d'entrer en compétition avec une ou plusieurs chemokines, pour la liaison à un ou plusieurs récepteur(s) cellulaιre(s) de cette (ces) demιère(s) Les molécules appartenant à la famille des chemokines sont connues pour avoir au moins pour certaines d'entre elles, la capacité de lier différents récepteurs cellulaires présents sur les cellules dérivées des lignées lymphoide ou myéloide, et en particulier plusieurs récepteurs présents sur des cellules de type lymphocytes, monocytes, basophiles, ou éosmophiles.According to a first embodiment of the invention, the antagonist is a compound capable of entering into competition with one or more chemokines, for binding to one or more cell receptor (s) of this (these) demιère (s) The molecules belonging to the chemokine family are known to have at least for some of them, the capacity to bind different cellular receptors present on the cells derived from the lymphoid or myeloid lines, and in particular several receptors present on lymphocyte, monocyte, basophilic, or eosmophilic type cells.
L'antagoniste utilisable dans le cadre de la présente demande, peut selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, être sélectionné pour sa capacité à interférer avec l'interaction normale entre les chemokines et leur(s) récepteur(s) et en particulier à modifier l'accès, par exemple la reconnaissance conformationnelle d'une ou plusieurs chemokines vis-à-vis de son(ses) récepteur(s) ou encore à bloquer la liaison d'une ou plusieurs chemokines avec un ou plusieurs récepteurs cellulaires naturels de ces chemokinesThe antagonist usable in the context of the present application, can according to a first particular embodiment of the invention, be selected for its ability to interfere with the normal interaction between the chemokines and their receptor (s) and in particular to modify the access, for example the conformational recognition of one or more chemokines vis-à-vis its receptor (s) or to block the binding of one or more chemokines with one or more natural cellular receptors of these chemokines
Avantageusement, cet antagoniste se substitue à une ou plusieurs chemokine dans l'activité de liaison à un ou plusieurs récepteursAdvantageously, this antagonist replaces one or more chemokine in the activity of binding to one or more receptors
En dépit de l'existence d'une multi-spécificité de liaison des chemokines à des récepteurs cellulaires, l'invention a également pour objet selon un autre mode de réalisation particulier, des composés antagonistes sélectionnés pour leur affinité spécifique vis-à-vis d'un récepteur détermtné ou d'un nombre déterminé de récepteurs de chemokinesDespite the existence of a multi-specificity for the binding of chemokines to cellular receptors, the invention also relates, according to another particular embodiment, to antagonistic compounds selected for their specific affinity with respect to '' a specific receptor or a determined number of chemokine receptors
Selon une variante de réalisation de l'invention, l'antagoniste mis en oeuvre est choisi pour sa capacité à déplacer la liaison d une ou plusieurs chemokines vis-à-vis d'un ou plusieurs récepteurs cellulaires de ces dernièresAccording to an alternative embodiment of the invention, the antagonist used is chosen for its ability to displace the binding of one or more chemokines with respect to one or more cellular receptors of the latter
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, l'antagoniste a une activité de compétition avec une ou plusieurs chemokines choisies parmi RANTES, MIP1 α, MIP1 β, MCP1 , MCP3 Des parentés de structures ont été constatées entre les différentes chemokines précitées, en particulier entre les chemokines RANTES et MIP, tant au niveau de la séquence d'acides aminés formant la structure primaire de ces chemokines que de leurs structures secondaires ou tri¬ dimensionnelles telles qu'établies par la technique de spectroscopie de Resonnance Magnétique Nucléaire (Wells T N C et al, Journal of Leukocyte Biology, vol 59, Janvier 1996, pages 53-60)According to a particularly advantageous embodiment of the invention, the antagonist has a competitive activity with one or more chemokines chosen from RANTES, MIP1 α, MIP1 β, MCP1, MCP3 Structural relationships have been observed between the various aforementioned chemokines , in particular between the RANTES and MIP chemokines, both in terms of the amino acid sequence forming the primary structure of these chemokines and their secondary or three-dimensional structures as established by the nuclear magnetic resonance spectroscopy technique ( Wells TNC et al, Journal of Leukocyte Biology, vol 59, January 1996, pages 53-60)
Les inventeurs ont constaté que des antagonistes de la molécule RANTES sont par exemple capables de lier les récepteurs de plusieurs chemokines en particulier ceux de RANTES, MCP3 et MCP1 De tels antagonistes présentent des propriétés tout-à-fait intéressantes, du fait de leur capacité à occuper les sites normalement occupés par RANTES, ladite occupation entraînant une activité anti-virale véπfiable notamment in vitro sur des lymphocytes normaux infectés par des isolats primaires de VIH. Un composé antagoniste intéressant dans le cadre de la réalisation de l'invention est par exemple un composé dont la structure est dérivée de la structure d'une chemokine, par exemple d'une chemokine choisie parmi les molécules RANTES, MIP ou MCP définies précédemment.The inventors have found that antagonists of the RANTES molecule are for example capable of binding the receptors of several chemokines, in particular those of RANTES, MCP3 and MCP1. Such antagonists have quite interesting properties, due to their capacity to occupy the sites normally occupied by RANTES, said occupation resulting in verifiable anti-viral activity in particular in vitro on normal lymphocytes infected with primary HIV isolates. An antagonistic compound of interest in the context of carrying out the invention is for example a compound whose structure is derived from the structure of a chemokine, for example of a chemokine chosen from the RANTES, MIP or MCP molecules defined above.
On peut considérer qu'une structure est dérivée de celle d'une chemokine lorsque le composé ayant cette structure est différent par exemple dans sa nature, sa composition, sa conformation, par rapport à la chemokine de référence tout en conservant les propriétés de ladite chemokine pour la réalisation de la fonction d'antagoniste définie ci- dessus, par exemple la capacité de se lier à un ou plusieurs récepteurs De façon particulièrement avantageuse cet antagoniste est en outre caractérisé en ce qu'il est dépourvu des propriétés biologiques de la chemokine ou des chemokines dont il affecte l'activité A cet égard, l'invention vise des antagonistes de chemokines dépourvus des propriétés de chemoattraction habituellement reconnues aux chemokines et avantageusement à la molécule RANTESWe can consider that a structure is derived from that of a chemokine when the compound having this structure is different for example in its nature, its composition, its conformation, compared to the reference chemokine while retaining the properties of said chemokine. for the performance of the antagonist function defined above, for example the ability to bind to one or more receptors. In a particularly advantageous manner, this antagonist is further characterized in that it is devoid of the biological properties of chemokine or Chemokines whose activity it affects In this regard, the invention relates to chemokine antagonists lacking the chemoattraction properties usually recognized in chemokines and advantageously in the RANTES molecule
D'autres propriétés biologiques peuvent être atténuées voire supprimées dans lesdits antagonistes.Other biological properties can be attenuated or even eliminated in said antagonists.
Par exemple, l'antagoniste peut être caractérisé en ce qu'il est dépourvu de la capacité de transduction d'un signal dans les cellules auxquelles il est lié par l'intermédiaire d'un ou plusieurs récepteurs déterminés. En d'autres termes, l'antagoniste est caractérisé en ce qu'il ne transduit aucune activité biologique à travers le ou les récepteurs auxquels il est lié. De façon essentielle, cet antagoniste conserve néanmoins l'activité antivirale reconnue à la molécule RANTES, à tout le moins à un niveau permettant de réduire la rephcation ou la dissémination virale ou leur effet et de façon avantageuse, de l'inhiberFor example, the antagonist can be characterized in that it lacks the ability to transduce a signal in the cells to which it is linked via one or more determined receptors. In other words, the antagonist is characterized in that it transduces no biological activity through the receptor (s) to which it is linked. Essentially, this antagonist nevertheless retains the antiviral activity recognized by the RANTES molecule, at least to a level to reduce rephcation or viral spread or their effect and advantageously to inhibit it
Outre la diminution, votre la disparition des propriétés chemoattractives dévolues à la molécule native RANTES, un antagoniste selon l'invention peut également être caractérisé en ce qu'il est dépourvu de la capacité naturelle de la molécule RANTES d'une part à induire la libération ou l'entrée du calcium dans les cellules auxquelles elle est liée par un récepteur et/ou d'autre part, à affecter l'exocytose par relargage d'enzymes à partir de ces cellules Ainsi, l'invention met avantageusement à disposition des molécules ayant des effets anti-viraux d'une ou plusieurs chemokines qui sont néanmoins dépourvues des effets secondaires des chemokines activesIn addition to the reduction, your disappearance of the chemoattractive properties devolved to the native RANTES molecule, an antagonist according to the invention can also be characterized in that it is devoid of the natural capacity of the RANTES molecule on the one hand to induce the release or the entry of calcium into the cells to which it is linked by a receptor and / or on the other hand, to affect the exocytosis by release of enzymes from these cells. Thus, the invention advantageously provides molecules having anti-viral effects from one or more chemokines which are nevertheless devoid of the side effects of active chemokines
Un antagoniste intéressant selon l'invention peut en outre être caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide dérivé d'une chemokine, dont la structure comprend au moins un, voire deux ponts disulfureAn interesting antagonist according to the invention can also be characterized in that it is a polypeptide derived from a chemokine, the structure of which comprises at least one, or even two disulfide bridges
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention pour l'utilisation dans le traitement d'une infection due à un rétrovirus VIH, on aura recours à un antagoniste de type polypeptidique, dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par substitution, addition ou deletioπ d au moins un résidu d'acides aminés, ledit antagoniste étant dépourvu des propriétés chemo-attractives des chemokines vis à vis des leucocytes, en particulier des lymphocytesThus, according to a preferred embodiment of the invention for use in the treatment of an infection due to an HIV retrovirus, use will be made of a polypeptide type antagonist, derived from the RANTES polypeptide responding to the acid sequence. amines represented in FIG. 1, by substitution, addition or deletion of at least one amino acid residue, said antagonist being devoid of the chemo-attractive properties of chemokines with respect to leukocytes, in particular lymphocytes
Le terme « polypeptide » fait référence à une structure d'acides aminés comprenant de 10 à 100, de préférence de 10 à 70 acides aminés, laquelle structure peut être utilisée sous forme linéaire ou sous forme conformationnelle A cet égard, l'invention concerne avantageusement des antagonistes ayant une structure correspondant à la structure conférée par la présence de plusieurs et notamment de deux ponts disulfure telle qu'on l'observe dans les cytokmes, notamment dans les molécules RANTES, MIP et MCPThe term “polypeptide” refers to an amino acid structure comprising from 10 to 100, preferably from 10 to 70 amino acids, which structure can be used in linear form or in conformational form. In this regard, the invention advantageously relates to antagonists having a structure corresponding to the structure conferred by the presence of several and in particular of two disulfide bridges such that observes it in cytokmes, especially in RANTES, MIP and MCP molecules
Un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES, utilisable dans le cadre de l'invention est par exemple obtenu par délétion de tout ou partie de sa séquence N-terminale et en particulier par délétion de tout ou partie de la séquence comprise entre les résidus d'acides aminés 1 et 15 ou entre les acides aminés 1 et 9 ou 1 et 8 (y compris les résidus extrêmes) de la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 CA polypeptide derived from the RANTES polypeptide, which can be used in the context of the invention is for example obtained by deletion of all or part of its N-terminal sequence and in particular by deletion of all or part of the sequence between the acid residues amino acids 1 and 15 or between amino acids 1 and 9 or 1 and 8 (including the extreme residues) of the amino acid sequence shown in Figure 1 C
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'antagoniste utilisable pour le traitement ou la prévention d'une infection due à un rétrovirus VIH est un polypeptide repondant à la séquence d'acides aminés suivante (appelée RANTES 9-68 )According to a preferred embodiment of the invention, the antagonist which can be used for the treatment or prevention of an infection due to an HIV retrovirus is a polypeptide corresponding to the following amino acid sequence (called RANTES 9-68)
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKWV REY1NSLEMS ou la séquence R8-68suιvante,PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKWV REY1NSLEMS or the following sequence R8-68,
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREY1NSLEMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREY1NSLEMS
La suppression de ces résidus diminue les effets de signalisation a travers les récepteurs de chemokines occupés, tout en gardant l'activité anttvirale de cet antagonisteThe suppression of these residues decreases the signaling effects through the receptors of occupied chemokines, while retaining the anttviral activity of this antagonist
Les séquences d'acides aminés sont identifiées par référence au code à une lettre habituellement utilisé Cet antagoniste peut être utilisé sous la forme de sa structure primaire ou sous une forme tπ-dimensionnelle par exemple sous une forme reproduisant les caractéristiques essentielles de la structure conformationnelle de la molécule RANTES à tout le moins de la partie de cette molécule impliquée dans la liaison à son ou ses récepteur(s) cellulaιre(s) Cette structure a été rapportée dans l'article de Wells T N C précité et de Chung C W (Biochemistry 34, 9307-9314)The amino acid sequences are identified by reference to the letter code usually used. This antagonist can be used in the form of its primary structure or in a tπ-dimensional form, for example in a form reproducing the essential characteristics of the conformational structure of the RANTES molecule at the very least from the part of this molecule involved in the binding to its receptor (s) cellulaιre (s) This structure was reported in the article by Wells TNC supra and Chung CW (Biochemistry 34, 9307-9314)
Alternativement ou au contraire selon une caractéristique supplémentaire, l'antagoniste utilisable dans le cadre de l'invention est un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES lequel est représenté par sa séquence d'acides aminés à la figure 1 C, par délétion de tout ou partie de sa séquence C-terminale comprise entre les résidus d'acides aminés 50 et 68, de préférence 60 et 68 de la séquence représentée à la figure 1 CAlternatively or on the contrary according to an additional characteristic, the antagonist which can be used in the context of the invention is a polypeptide derived from the RANTES polypeptide which is represented by its amino acid sequence in FIG. 1C, by deletion of all or part of its C-terminal sequence comprised between the amino acid residues 50 and 68, preferably 60 and 68 of the sequence represented in FIG. 1 C
Un antagoniste dérivé du polypeptide RANTES par substitution ou par mutation peut alternativement être caractérisé en ce que environ 5% à environ 10% des résidus d'acides aminés, à l'exception des résidus cystéine impliqués dans la formation de ponts disulfure, sont remplacés.An antagonist derived from the RANTES polypeptide by substitution or by mutation can alternatively be characterized in that approximately 5% to approximately 10% of the amino acid residues, with the exception of the cysteine residues involved in the formation of disulfide bridges, are replaced.
Les résidus d'acides aminés substitués peuvent l'être par des acides aminés neutres, ou constituant une substitution conservatrice ou choisis le cas échéant en tenant compte de l'encombrement stéπqueResidues of substituted amino acids can be replaced by neutral amino acids, or constituting a conservative substitution or chosen if necessary, taking into account the size
A titre d'exemple des résidus lysine peuvent être remplacés par des résidus isoleucine, leucine ou vahneFor example, lysine residues can be replaced by isoleucine, leucine or vahne residues
A titre d'exemple, de tels antagonistes utilisables pour la réalisation de l'invention répondent à l'une des séquences d'acides aminés suivantesBy way of example, such antagonists which can be used for carrying out the invention correspond to one of the following amino acid sequences
MPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREYINSLEMSMPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV RQYINSLQMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV AQYINSLQMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV RQYINSLQMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV AQYINSLQMS
MTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK WVREYINSLEMSMTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK WVREYINSLEMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VRQYINSLQMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VRQYINSLQMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VAQYINSLQMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VAQYINSLQMS
Selon une variante de l'invention, l'antagoniste mis en oeuvre est caractérisé en ce qu'il s'agit d'une molécule RANTES dont l'extrémité N- terminale a été allongée par addition d'au moins un résidu d'acide aminé ou alternativement d'une molécule RANTES dont les extrémités N- et C- terminales ou dont les séquences internes à ces régions N- ou C- termmales ont été allongées par addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés dans des conditions permettant d'obtenir l'effet antagoniste recherché.According to a variant of the invention, the antagonist used is characterized in that it is a RANTES molecule the N-terminal end of which has been lengthened by the addition of at least one acid residue amino or alternatively of a RANTES molecule whose N- and C- terminal ends or whose internal sequences in these N- or C- termal regions have been lengthened by addition of one or more amino acid residues under conditions allowing to obtain the desired antagonistic effect.
L'invention a également pour objet une séquence de nucléotides comprenant une séquence codant pour un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par délétion de tout ou partie de la séquence N- termmale de ce dernier. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, cette séquence code pour un polypeptide antagoniste tel qu'il a été défini dans les pages précédentesThe subject of the invention is also a nucleotide sequence comprising a sequence coding for a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence shown in FIG. 1, by deletion of all or part of the N-term sequence of this latest. According to an advantageous embodiment of the invention, this sequence codes for an antagonistic polypeptide as it was defined in the preceding pages
De façon préférée, la séquence de nucleotides est caractérisée en ce qu'elle répond à l'enchaînement suivant • Preferably, the nucleotide sequence is characterized in that it responds to the following sequence •
CCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC GGGAGTACAT CAACTCTTTG GAGATGAGCT AG ou à l'enchaînement suivantCCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC GGGAGGTTCAT
ACACCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC GGGAGTACAT CAACTCTTTG GAGATGAGCT AGACACCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTT GGGAGAGTAG
Une séquence de nucleotides selon l'invention peut le cas échéant comprendre également des séquences exogènes, notamment des séquences de régulation et/ou d'activation capables de contrôler et/ou de réguler l'expression de la séquence codant pour un antagoniste selon l'invention dans une cellule hôte, in vitro ou m vivoA nucleotide sequence according to the invention may optionally also include exogenous sequences, in particular regulatory and / or activation sequences capable of controlling and / or regulating the expression of the sequence coding for an antagonist according to the invention in a host cell, in vitro or m vivo
Elle peut également être recombinée avec une autre séquence codante susceptible d'exprimer dans un hôte cellulaire un polypeptide d'intérêt, notamment dans le but de traiter ou de prévenir une infection due à un rétrovirus VIH ou avec une séquence codante pouvant remplir la fonction de molécule porteuse Par exemple, une séquence de nucleotides de l'invention peut être fusionnée avec tout ou partie d'une séquence codant pour la β-galactosidase. Dans ce cas, la séquence codante de la β- galactosidase contient avant le premier codon correspondant au premier acide aminé prohne de la molécule R9-68 ou R8-68, une séquence peptidique du type X-glycyl-L-propyl, reconnue spécifiquement par une collagénase , permettant ainsi la réalisation d'une coupure spécifique après le résidu glycine du polypeptide formé, libérant l'antagoniste. Cette technique est décrite dans la demande de brevet européen 01 15974.It can also be recombined with another coding sequence capable of expressing in a cellular host a polypeptide of interest, in particular for the purpose of treating or preventing an infection due to an HIV retrovirus or with a coding sequence capable of fulfilling the function of Carrier molecule For example, a nucleotide sequence of the invention can be fused with all or part of a sequence coding for β-galactosidase. In this case, the coding sequence for β-galactosidase contains before the first codon corresponding to the first amino acid prohne of the molecule R9-68 or R8-68, a peptide sequence of the X-glycyl-L-propyl type, recognized specifically by a collagenase, thus allowing the achievement of a specific cleavage after the glycine residue of the polypeptide formed, releasing the antagonist. This technique is described in European patent application 01 15974.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence de nucleotides est caractérisée en ce qu'elle est insérée dans un vecteur d'expression ou adsorbée sur un support susceptible d'être internahsé dans une cellule eucaryote ou encore dans une bactérie capable d'entrer dans des cellules eucaryotes telle que Shigella selon le procédé décrit par Courvalin P ét al (C R Acad Sci Pans, 1995, 318 1207-12) Ce vecteur est avantageusement choisi pour permettre l'expression m vitro dans un hôte cellulaire, d'un antagoniste tel que défini précédemment ou pour permettre l'expression m vivo chez un hôte auquel il est administré, notamment chez un patient infecté par un rétrovirus VIH, à des fins d'expression transitoire ou continue d'un antagoniste tel que défini dans les pages qui précèdentAccording to another embodiment of the invention, the nucleotide sequence is characterized in that it is inserted into an expression vector or adsorbed on a support capable of being internalized in a eukaryotic cell or even in a bacterium capable to enter eukaryotic cells such as Shigella according to the method described by Courvalin P et al (CR Acad Sci Pans, 1995, 318 1207-12) This vector is advantageously chosen to allow expression in vitro in a cellular host, d an antagonist as defined above or to allow expression in vivo in a host to which it is administered, in particular in a patient infected with an HIV retrovirus, for the purposes of transient or continuous expression of an antagonist as defined in the preceding pages
Les séquences de nucleotides ainsi définies dans le cadre de l'invention sont par exemple utilisables dans le cadre d'un protocole de thérapie génique visant à prévenir ou à traiter une infection due à un rétrovirus VIH A cet égard, on pourra avoir recours à des vecteurs utilisables dans le cadre de ces thérapies, tels que ceux décrits dans les demandes de brevet internationales publiées sous les numéros WO 95/14785 et WO 94/24298 Ces séquences de nucleotides peuvent aussi être administrées en faisant appel aux techniques décrites dans le brevet FR 271 1670 ou dans la demande de brevet internationale WO 90/1 1092, pour l'expression m vivoThe nucleotide sequences thus defined in the context of the invention can, for example, be used in the context of a gene therapy protocol aimed at preventing or treating an infection due to an HIV retrovirus In this regard, recourse may be had to vectors usable in the context of these therapies, such as those described in the international patent applications published under the numbers WO 95/14785 and WO 94/24298 These nucleotide sequences can also be administered using the techniques described in the patent FR 271 1670 or in international patent application WO 90/1 1092, for the expression m vivo
De façon générale, et compte tenu des caractéristiques particulières de l'infection par un rétrovirus VIH, on peut avoir recours à des vecteurs permettant l'administration ou le relargage contrôlé voire retardé de ces séquences nucléotidiques ou de leur produit d'expression chez l'hôte traité, afin d'obtenir un effet antiviral continu ou itératif à tout le moins sur une période suffisante pour diminuer voire inhiber l'infection par le rétrovirus ou ses effets. A cet égard, des techniques telles que celles faisant appel à l'utilisation d'un gel de phosphate de calcium peuvent être utilisées pour obtenir un relargage avec effet retard d'un produit actif. De telles techniques sont par exemple décrites dans le brevet français 2 543 439. Des séquences reconnues par des protéases cellulaires ou extracellulaires peuvent être utilisées pour permettre la production de formes matures des molécules antagonistes de RANTES à partir de ces vecteurs. La forme mature de la protéine RANTES est en effet produite après clivage d'une séquence de 23 acides aminés situés en amont du premier résidu (senne) de la forme active de la protéineIn general, and taking into account the particular characteristics of infection with an HIV retrovirus, vectors may be used allowing the administration or the controlled or even delayed release of these nucleotide sequences or of their expression product in the treated host, in order to obtain a continuous or iterative antiviral effect at least over a period sufficient to reduce or even inhibit the retrovirus or its effects. In this regard, techniques such as those involving the use of a calcium phosphate gel can be used to obtain a release with delayed effect of an active product. Such techniques are for example described in French patent 2,543,439. Sequences recognized by cellular or extracellular proteases can be used to allow the production of mature forms of the antagonist molecules of RANTES from these vectors. The mature form of the RANTES protein is indeed produced after cleavage of a sequence of 23 amino acids located upstream of the first residue (seine) of the active form of the protein
Les taux sériques à atteindre chez les patients traités seraient de l'ordre de 1 à 100 nM.The serum levels to be reached in treated patients would be in the range of 1 to 100 nM.
L'invention a également pour objet un polypeptide correspondant au produit d'expression dans une cellule hôte, par exemple une cellule bactérienne ou une cellule eucaryote, notamment une cellule de levure, une cellule de mammifère, par exemple CHO, d'une séquence de nucleotides telle que définie précédemment.The subject of the invention is also a polypeptide corresponding to the expression product in a host cell, for example a bacterial cell or a eukaryotic cell, in particular a yeast cell, a mammalian cell, for example CHO, of a sequence of nucleotides as defined above.
Un polypeptide particulier est un polypeptide caractérisé en ce qu'il répond à l'une des séquences d'acides aminés suivantes :A particular polypeptide is a polypeptide characterized in that it responds to one of the following amino acid sequences:
MPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREYINSLEMSMPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV RQYINSLQMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMS PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV RQYINSLQMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV AQYINSLQMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV AQYINSLQMS
MTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK WVREYINSLEMSMTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK WVREYINSLEMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VRQYINSLQMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VRQYINSLQMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VAQYINSLQMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VAQYINSLQMS
Un autre polypeptide antagoniste utilisable dans le cadre de l'invention est par exemple un polypeptide RANTES modifié par addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés en amont de son extrémité N- termmale Par exemple, l'addition d'une methionine en amont du premier résidu (senne) de la forme mature de RANTES présenterait l'avantage d'inhiber la capacité chemoattractive de la chemokine tout en conservant sa capacité d'inhibition de l'infection virale, grâce à sa capacité non modifiée à se lier spécifiquement à son récepteurAnother antagonistic polypeptide which can be used in the context of the invention is, for example, a RANTES polypeptide modified by the addition of one or more amino acid residues upstream of its N-terminal end. For example, the addition of a methionine in upstream of the first residue (seine) of the mature form of RANTES would have the advantage of inhibiting the chemoattractive capacity of chemokine while retaining its capacity to inhibit viral infection, thanks to its unmodified capacity to bind specifically to its receiver
La production de molécules modifiées de RANTES ou d'autres polypeptides antagonistes peut être réalisée par synthèse chimique ou par recombinaison et expression dans une cellule procaryote ou eucaryote par exemple dans la levure ou chez E coliThe production of modified molecules of RANTES or other antagonistic polypeptides can be carried out by chemical synthesis or by recombination and expression in a prokaryotic or eukaryotic cell, for example in yeast or in E coli
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le polypeptide est un antagoniste d'une ou plusieurs chemokines choisies parmi RANTES, MIP ou MCP, caractérisé en ce qu'il est dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par substitution, addition ou délétion d'au moins un résidu d'acides aminés, ledit antagoniste étant dépourvu des propriétés chemoattractives des chemokines par exemple vis-à-vis des leucocytes, en particulier des lymphocytes, ledit polypeptide étant sous forme d'un polypeptide de fusion, capable de lier le(les) récepteurs cellulaires de RANTES et/ou MIP et/ou MCPAccording to another advantageous embodiment of the invention, the polypeptide is an antagonist of one or more chemokines chosen from RANTES, MIP or MCP, characterized in that it is derived from the RANTES polypeptide responding to the amino acid sequence represented in FIG. 1, by substitution, addition or deletion of at least one amino acid residue, said antagonist being devoid of the chemoattractive properties of chemokines, for example with respect to leukocytes, in particular lymphocytes, said polypeptide being in the form of a fusion polypeptide, capable of binding the cellular receptor (s) of RANTES and / or MIP and / or MCP
Les polypeptides de l'invention peuvent être préparés par génie génétique ou par synthèse chimique par exemple sur un appareil (Applied Biosystems) ou par synthèse sur phase solide décrite par Merrifiel, par exemple selon la technique décrite dans la demande WO 95/09868The polypeptides of the invention can be prepared by genetic engineering or by chemical synthesis for example on an apparatus (Applied Biosystems) or by synthesis on solid phase described by Merrifiel, for example according to the technique described in application WO 95/09868
L'invention vise également une composition caractérisée en ce qu'elle comprend pour l'administration séparée ou simultanée un composé antagoniste d'une ou plusieurs molécules de la famille des chemokines telles que définies précédemment, et un ou plusieurs agents actifs susceptibles d'être utilisés dans le traitement d'une infection par un rétrovirus VIH, par exemple un agent utilisable en chimiothérapie tel qu'un composé anti-transcπptase inverse ou anti-protéase virale ou un composé tel qu'un antagoniste du récepteur CD4 présent sur des lymphocytes de patients infectés par un rétrovirus VIH ou encore un composé utilisable en immunothérapie, par exemple une cytokine et notamment l'mterleukine 2The invention also relates to a composition characterized in that it comprises, for the separate or simultaneous administration, an antagonist compound of one or more molecules of the chemokine family as defined above, and one or more active agents capable of being used in the treatment of an infection by an HIV retrovirus, for example an agent which can be used in chemotherapy such as a reverse anti-transeptase compound or viral anti-protease compound or a compound such as a CD4 receptor antagonist present on lymphocytes of patients infected with an HIV retrovirus or a compound which can be used in immunotherapy, for example a cytokine and in particular mterleukin 2
Le cas échéant, ladite composition comprend, outre le composé antagoniste d'une ou plusieurs chemokines et une ou plusieurs substances actives en chimiothérapie antivirale, et/ou un agent de traitement des infections opportunistes se développant lors de l'infection par un rétrovirus VIH ou lors de l'évolution de l'infection in vivoWhere appropriate, said composition comprises, in addition to the antagonist compound of one or more chemokines and one or more active substances in antiviral chemotherapy, and / or an agent for treating opportunistic infections that develop during infection with an HIV retrovirus or during the course of infection in vivo
Les produits définis αans l'invention, qu'il s'agisse des antagonistes ou des séquences de nucleotides codant pour de tels antagonistes, le cas échéant en combinaison avec d'autres éléments, sont utilisables pour le traitement de patients a tous les stades de l'infection par un rétrovirus de type VIH et notamment pour le traitement des enfants nés de mères séropositives ou des personnels soignants contaminés accidentellement Les composés de l'invention peuvent être a cet égard administrés par injection par voie intraveineuse par exemple par perfusion, par voie intramusculaire ou sous-cutanée Dans le cas de l'utilisation en thérapie génique des composés décrits dans l'invention, on pourra avoir recours à des cellules du patient, par exemple des fibroblastes, myoblastes ou cellules hématopoiétiques traitées avec des vecteurs appropriés contenant les séquences nucleotidiques de l'invention, ces cellules étant ensuite réimplantées chez le patient pour l'expression des susdites séquences de nucleotidesThe products defined in the invention, whether antagonists or nucleotide sequences coding for such antagonists, if appropriate in combination with other elements, can be used for the treatment of patients at all stages of infection with a retrovirus of the HIV type and in particular for the treatment of children born to HIV positive mothers or nursing staff accidentally contaminated. The compounds of the invention can in this regard be administered by injection by intravenous route, for example by infusion, by intramuscular or subcutaneous In the case of the use in gene therapy of the compounds described in the invention, recourse may be had to patient cells, for example fibroblasts, myoblasts or hematopoietic cells treated with appropriate vectors containing the sequences nucleotides of the invention, these cells then being reimplanted in the patient for the express the above nucleotide sequences
L'efficacité du traitement ainsi effectue peut être évaluée en contrôlant et en suivant la charge virale, plasmatique et cellulaire et en examinant l'évolution du nombre de lymphocytes porteurs de récepteurs CD4, ainsi que le statut immunologique et inflammatoire du patientThe effectiveness of the treatment thus carried out can be evaluated by monitoring and monitoring the viral, plasma and cellular load and by examining the evolution of the number of lymphocytes carrying CD4 receptors, as well as the immunological and inflammatory status of the patient.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples et la figure qui suiventOther characteristics and advantages of the invention will appear in the examples and the figure which follow.
Figure 1 Séquence de nucleotides et d'acides aminés de RANTES A: Séquence de cDNA comprenant la séquence codante B Séquence codante de la protéine RANTES mature C. Séquence d'acides aminés de RANTES Figure 2 Séquence de nucleotides et d'acides aminés des polypeptidesFigure 1 Nucleotide and amino acid sequence of RANTES A: cDNA sequence comprising the coding sequence B Coding sequence of the mature RANTES protein C. Amino acid sequence of RANTES Figure 2 Nucleotide and amino acid sequence of the polypeptides
R9-68 et R8-68 et de polypeptides substitués A- Séquence codante de R9-68 et de R8-68 B Séquence des polypeptides R9-68 et R8-68R9-68 and R8-68 and of substituted polypeptides A- Coding sequence of R9-68 and of R8-68 B Sequence of the R9-68 and R8-68 polypeptides
C (a) (b) (c) Séquence des polypeptides R9-68 et R8-68 substitués dans la partie C-terminaleC (a) (b) (c) Sequence of R9-68 and R8-68 polypeptides substituted in the C-terminal part
EXEMPLES Evaluation de l'activité antivirale de l'antagoniste RANTES 9-68EXAMPLES Evaluation of the antiviral activity of the antagonist RANTES 9-68
Un antagoniste de la chemokine RANTES a été défini et obtenu sous la forme d'un polypeptide tronqué dont la séquence d'acides aminés correspond aux résidus d'acides aminés 9 à 68 de la séquence d'acides aminés de la molécule RANTES telle que définie à la figure 1 L'antagoniste RANTES 9-68 a été produit en utilisant la technique décrite dans la publication de Gong JH et al (J B C vol 271 N18, issue of may 3, 1996 p 10521 -10527)A RANTES chemokine antagonist was defined and obtained in the form of a truncated polypeptide whose amino acid sequence corresponds to amino acid residues 9 to 68 of the amino acid sequence of the RANTES molecule as defined in FIG. 1 The antagonist RANTES 9-68 was produced using the technique described in the publication by Gong JH et al (JBC vol 271 N18, issue of may 3, 1996 p 10521 -10527)
Il a été utilisé à des concentrations variables de 1000 nM à 10 nMet a été ajouté à des cultures cellulaires après infection par différents isolats de VIH A cet effet, un clone d'un isolât primaire obtenu à partir du fluide cérébrospinal d'un patient atteint de SIDA (designé par VIH JR-CSF Koganagi Y et al Science 236 819, 1987 et Cann AJ et al, J Virol 64 4735, 1990) a été utilisé ainsi qu'un clone PYU2 correspondant à une souche primaire de VIH ayant un troptsme pour les lymphocytes T et les monocytes et isolé à partir du cerveau (Li et al, J Virol , 1992, vol 66- 6587) Pour obtenir le clone JR-CSF, l'ADN proviral a été transfecté dans des cellules COS7 et le surnageant obtenu après trois jours de la culture transfectée contenant les particules infectieuses a été utilisé pour infecter des PBL La capacité antiviraie de R9-68 mise en évidence dans des cellules infectées par HIV pYU2 et HIV JR-CSF était similaire à celle de MIP1 a. En effet, des niveaux de suppression de la rephcation virale supérieurs ou égaux à 95% des cultures contrôles infectées ont été obtenus à la concentration de 10nM, la plus faible concentration de MIP1 a à induire un tel effet suppresseur sur la rephcation de HIV-JR-CSF ou HIV-pYU2It was used at varying concentrations from 1000 nM to 10 nM and was added to cell cultures after infection with different HIV isolates For this purpose, a clone of a primary isolate obtained from the cerebrospinal fluid of an affected patient of AIDS (designated by HIV JR-CSF Koganagi Y et al Science 236 819, 1987 and Cann AJ et al, J Virol 64 4735, 1990) was used as well as a clone PYU2 corresponding to a primary strain of HIV having a troptsm for T lymphocytes and monocytes and isolated from the brain (Li et al, J Virol, 1992, vol 66-6587) To obtain the clone JR-CSF, the proviral DNA was transfected into COS7 cells and the supernatant obtained after three days of the transfected culture containing the infectious particles was used to infect PBL The antiviral capacity of R9-68 demonstrated in cells infected with HIV pYU2 and HIV JR-CSF was similar to that of MIP1 a. In fact, levels of suppression of viral rephcation greater than or equal to 95% of the infected control cultures were obtained at the concentration of 10 nM, the lowest concentration of MIP1 has to induce such a suppressing effect on the rephcation of HIV-JR -CSF or HIV-pYU2
Les propriétés antivirales de l'antagoniste R9-68 ont été testées en déterminant la capacité de cet antagoniste à bloquer la rephcation du virus VIH.The antiviral properties of the antagonist R9-68 were tested by determining the capacity of this antagonist to block the rephcation of the HIV virus.
La capacité d'une molécule à bloquer la rephcation du virus VIH a pu être testée en utilisant la technique mettant en oeuvre des leucocytes isolés sur un gradient de Ficoll à partir de donneurs sains, lesquels leucocytes ont été infectés in vitro avec des isolats viraux primaires, incapables de se répliquer dans des lignées cellulaires transformées.The ability of a molecule to block the rephcation of the HIV virus could be tested using the technique using leukocytes isolated on a Ficoll gradient from healthy donors, which leukocytes were infected in vitro with primary viral isolates. , unable to replicate in transformed cell lines.
A cet égard, des cellules de six donneurs différents, le plus souvent des blastes induits par un traitement à la phytohémaglutinine (PHA) pendant 48 à 72 heures ont été infectés pendant 2 ou 3 heures avec les isolats de VIH. La quantité d'inoculum viral a été estimée par quantification de la protéine GAG P24 et s'est avérée être comprise entre 150 à 5000 programmes pour 10 000 000 de cellules Après des lavages pour éliminer les particules virales résiduelles, les cellules ont été cultivées sur des microplaques de 96 puits (2 x 105/200 microlitres) en présence des molécules testées purifiées dans un milieu de culture enrichi en interleukine 2. Les surnageants de culture ont été collectés périodiquement et les cultures cellulaires ont été repiquées avec des milieux frais et les molécules testées. Dans certains cas, les blastes traités avec la PHA ont également été ajoutés pour apporter à la culture infectée des cellules fraîches servant de cible pour VIH La rephcation virale a été mesurée en utilisant le kit ELISA P24 (Dupont de Nemours) (seuil de détection 3 pg/ml)In this regard, cells from six different donors, most often blasts induced by phytohemaglutinin (PHA) treatment for 48 to 72 hours, were infected for 2 or 3 hours with HIV isolates. The amount of viral inoculum was estimated by quantification of the GAG P24 protein and was found to be between 150 to 5000 programs per 10 000 000 cells. After washing to remove the residual viral particles, the cells were cultured on of 96-well microplates (2 × 10 5/200 microliters) in the presence of the tested molecules purified in an enriched culture medium in the interleukin 2. the culture supernatants were collected periodically and the cell cultures were subcultured with fresh media and the molecules tested. In some cases, PHA-treated blasts have also been added to bring the infected culture fresh cells serving as a target for HIV Viral rephcation was measured using the P24 ELISA kit (Dupont de Nemours) (detection threshold 3 pg / ml)
Ainsi, pour un des donneurs les cellules infectées par pYU2 et traitées avec R9-68 à la concentration de 1000nM ont produit 7 pg/ml de protéine p24 au jour 1 1 (76 et 24 pg/ml aux jours 6 et 8 respectivement) La protéine p24 n'a pas été détectée dans les cultures de ce même donneur infectées par JR-CSF en présence de R9-68 au jour 1 1 (62 et 15 pg/ml ont été détectés aux jours 6 et 8 respectivement) Des cultures contrôles infectées par pYU2 et JR-CSF mais non traitées par R9-68 ont montré une rephcation virale intense qui a généré 7 ng/ml et 1 13 ng/ml de protéine P24 au jour 1 1 respectivement Au contraire de R9-68, l'antagoniste AAR-IL8 (1000 nM de la protéine IL8 était dépourvu d'effet antiviral Pour approfondir la connaissance des mécanismes d'interférence dans la rephcation du VIH, induits par R9-68, des expériences visant l'analyse de l'internahsation de particules infectieuses et la rétrotranscription de l 'ARN viral génomique en ADN proviral ont été réalisées Après infection par la souche JR-CSF de cellules mononuclées du sang activées par la PHA, en présence ou en l'absence de 100nM de R9- 68, des extractions d'ADN ont été pratiquées 3h post-infection, ou d'ADN 20h post-infection Les cultures infectées en présence de R9-68 ont été maintenues en présence de la molécule jusqu'à extraction de l'ARN ou de l'ADN Par des techniques d'amplification par PCR soit du RNA génomique rétrotranscπt in vitro, soit de l'ADN proviral, une légère diminution de l'accumulation de RNA génomique viral intracellulaire a été mise en évidence dans les cellules traitées par R9-68 par rapport aux contrôles de cellules infectées mais non traitées En revanche l'analyse de l'ADN proviral a révélé une profonde diminution du signal spécifique dans les cellules infectées en présence de R9-68 La spécificité du signal obtenu de l 'ADN proviral était démontrée par son abolition dans des cellules infectées et traitées par l'inhibiteur de la réverse transcπptase virale, 3'- azιdo-3'deoxythιmιdιne (AZT) Des résultats comparables ont été obtenus avec RANTES dans des expériences réalisées en parallèle avec celles ci- dessus décritesThus, for one of the donors, the cells infected with pYU2 and treated with R9-68 at the concentration of 1000 nM produced 7 pg / ml of p24 protein on day 11 (76 and 24 pg / ml on days 6 and 8 respectively) La p24 protein was not detected in cultures of this same donor infected with JR-CSF in the presence of R9-68 on day 11 (62 and 15 pg / ml were detected on days 6 and 8 respectively) Control cultures infected with pYU2 and JR-CSF but not treated with R9-68 showed an intense viral rephcation which generated 7 ng / ml and 1 13 ng / ml of P24 protein on day 1 1 respectively Unlike R9-68, the antagonist AAR-IL8 (1000 nM of the protein IL8 was devoid of antiviral effect To deepen the knowledge of the interference mechanisms in the rephcation of HIV, induced by R9-68, experiments aiming at the analysis of the internahsation of particles infectious diseases and the retrotranscription of viral genomic RNA into proviral DNA have were performed After infection with the JR-CSF strain of PHA-activated mononuclear blood cells, in the presence or absence of 100 nM of R9-68, DNA extractions were performed 3 h post-infection, or DNA 20h post-infection Cultures infected in the presence of R9-68 were maintained in the presence of the molecule until extraction of RNA or DNA By amplification techniques by PCR or genomic RNA retrotranscπt in vitro , or proviral DNA, a slight decrease in the accumulation of intracellular viral genomic RNA was demonstrated in cells treated with R9-68 compared to controls on infected but untreated cells. Proviral DNA has revealed a deep decrease in the specific signal in infected cells in the presence of R9-68 The specificity of the signal obtained from proviral DNA was demonstrated by its abolition in infected cells and treated with the reverse viral transcπptase inhibitor, 3'-azιdo-3'deoxythιmιdιne (AZT) Comparable results have been obtained with RANTES in experiments carried out in parallel with those described above.
Ces résultats indiquent que l'interférence de R9-68 et aussi celle de RANTES, dans la rephcation de t'isolât primaire HIV-JR-CSF aurait heu précocement mais de préférence après internahsation du virus Des données similaires concernant l'activité antivirale des chemokines RANTES et MIP1α ou de l'antagoniste R9-68 ont été obtenues lorsque des blastes traités avec la PHA provenant d'un autre donneur ont été infectés avec l'isolât JR-CSF ayant subi deux semaines de passage dans des cultures de PBL traitées avec l'IL2 Dans tous les cas la viabilité des cellules traitées avec R9-68 ou avec RANTES était comparable à celle des cultures contrôles infectées mais non traitées Les méthodes de mesure ont et faite en comparaison des thymidmes tritiées ou du contage direct du nombre de cellules à la fin des périodes de culture These results indicate that the interference of R9-68 and also that of RANTES, in the rephcation of the primary isolate HIV-JR-CSF would have occurred early but preferably after internahsation of the virus Similar data concerning the antiviral activity of chemokines RANTES and MIP1α or the antagonist R9-68 were obtained when PHA-treated blasts from another donor were infected with the JR-CSF isolate which had undergone two weeks of passage in PBL cultures treated with IL2 In all cases, the viability of cells treated with R9-68 or with RANTES was comparable to that of infected control cultures but not treated. The measurement methods were and made in comparison with tritiated thymidms or direct counting of the number of cells. at the end of the growing periods

Claims

REVENDICATIONS
1 Utilisation d'un composé antagoniste (appelé « antagoniste ») d'une ou plusieurs molécules de la famille des chemokines, pour la préparation d'un médicament pour la prévention ou le traitement d'une infection virale1 Use of an antagonist compound (called an "antagonist") of one or more molecules of the chemokine family, for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a viral infection
2 utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'infection est due à un rétrovirus de type VIH2 use according to claim 1, characterized in that the infection is due to an HIV type retrovirus
3 Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que l'antagoniste est un composé ayant une activité de compétition avec une ou plusieurs chemokines, pour la liaison à un ou plusieurs récepteur(s) cellulaιre(s) de cette (ces) derπιere(s) ou ayant une activité de blocage de l'accès de la (des) chemokιne(s) audit (auxdits) récepteur(s)3 Use according to claim 1 or claim 2, characterized in that the antagonist is a compound having a competitive activity with one or more chemokines, for binding to one or more receptor (s) cellulaιre (s) of this ( ces) derπιere (s) or having an activity blocking the access of (the) chemokιne (s) to said (these) receiver (s)
4 Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'antagoniste déplace la liaison d'une ou plusieurs chemokιne(s) vis à vis d'un ou plusieurs recepteur(s) cellulaιre(s) de cette (ces) dernières4 Use according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the antagonist displaces the connection of one or more chemokιne (s) with respect to one or more receptor (s) cellulaιre (s) of this (these last
5 Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'antagoniste a une activité de compétition avec les chemokines RANTES et/ou MIP1α et/ou MlP1 β et/ou MCP1 et/ou MCP3 ou une activité de blocage de l'accès d'une ou plusieurs de ces chemokines à leur(s) récepteur(s) cellulaιre(s)5 Use according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the antagonist has a competitive activity with the chemokines RANTES and / or MIP1α and / or MlP1 β and / or MCP1 and / or MCP3 or an activity of blocking access of one or more of these chemokines to their cell receptor (s)
6 Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'antagoniste est un composé dont la structure est dérivée de la structure d'une chemokine6 Use according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the antagonist is a compound whose structure is derived from the structure of a chemokine
7 Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la chemokine appartient à la famille des chemokines de type CC 217 Use according to claim 6, characterized in that the chemokine belongs to the family of CC type chemokines 21
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'antagoniste est un composé dépourvu des propriétés chemoattractives de la (des) chemokιne(s) vis-à-vis des leucocytes, en particulier des lymphocytes 9 Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'antagoniste est dépourvu des propriétés biologiques essentielles de la (des) chemokines, en particulier est dépourvu de la capacité de transduction de signal à partir d'un ou plusieurs récepteurs 10 Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'antagoniste est un polypeptide dérivé d'une chemokine, dont la structure comprend au moins un, voire deux ponts disulfure8. Use according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the antagonist is a compound devoid of the chemoattractive properties of (the) chemokιne (s) vis-à-vis leukocytes, in particular lymphocytes 9 Use according to any one of Claims 1 to 7, characterized in that the antagonist is devoid of the essential biological properties of the chemokine (s), in particular is devoid of the signal transduction capacity from one or more Use according to claim 7, characterized in that the antagonist is a polypeptide derived from a chemokine, the structure of which comprises at least one, or even two disulfide bridges
11 Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'antagoniste est un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par substitution, addition ou délétion d'au moins un résidu d'acides aminés, ledit antagoniste étant dépourvu des propriétés chemoattractives de chemokines vis à vis des leucocytes, en particulier des lymphocytes et étant capable de lier un ou plusieurs récepteur(s) de chemokines11 Use according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the antagonist is a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence shown in Figure 1, by substitution, addition or deletion of at at least one amino acid residue, said antagonist being devoid of the chemoattractive properties of chemokines with respect to leukocytes, in particular lymphocytes and being capable of binding one or more chemokine receptor (s)
12 Utilisation selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que l'antagoniste est un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par délétion de tout ou partie de sa séquence N-terminale comprise entre les résidus d'acides aminés 1 et 15 de la séquence représentée à la figure 112 Use according to claim 1 1, characterized in that the antagonist is a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence shown in Figure 1, by deletion of all or part of its N-terminal sequence between amino acid residues 1 and 15 of the sequence shown in Figure 1
13. Utilisation selon la revendication 11 , caractérisée en ce que l'antagoniste est un polypeptide répondant à l'une des séquences d'acides aminés suivantes13. Use according to claim 11, characterized in that the antagonist is a polypeptide corresponding to one of the following amino acid sequences
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMS TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMS TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMS
MPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREYINSLEMSMPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREYINSLEMS
MTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK WVREYINSLEMSMTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK WVREYINSLEMS
14 Utilisation selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que l'antagoniste est un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés14 Use according to claim 1 1, characterized in that the antagonist is a polypeptide comprising the amino acid sequence
R9-68 modifiée en position N-terminale par l'addition d'un résidu Glycine et de tout ou partie de la séquence d'acides aminés de la β-galactosidaseR9-68 modified in the N-terminal position by the addition of a Glycine residue and all or part of the amino acid sequence of β -galactosidase
15 Utilisation selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que l'antagoniste est un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par délétion de tout ou partie de sa séquence C-terminale comprise entre les résidus d'acides aminés 50 et 68 de préférence 60 et 68 de la séquence représentée à la figure 115 Use according to claim 1 1, characterized in that the antagonist is a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence shown in Figure 1, by deletion of all or part of its C-terminal sequence between amino acid residues 50 and 68 preferably 60 and 68 of the sequence shown in Figure 1
16 Utilisation selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que l'antagoniste est un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par délétion de tout ou partie de sa séquence N-terminale comprise entre les résidus d'acides aminés 1 et 8 et de tout ou partie de sa séquence C-terminale comprise entre les résidus d'acides aminés 50 et 68, de préférence 60 et 68 de la séquence représentée à la figure 116 Use according to claim 1 1, characterized in that the antagonist is a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence shown in Figure 1, by deletion of all or part of its N-terminal sequence between amino acid residues 1 and 8 and all or part of its C-terminal sequence between amino acid residues 50 and 68, preferably 60 and 68 of the sequence shown in Figure 1
17 Utilisation selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisée en ce que l'antagoniste est un dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , comprenant la substitution ou la mutation d'environ 5% à environ 10% des résidus d'acides aminés à l'exception des résidus cystéine conservés impliqués dans la formation de ponts disulfure17 Use according to any one of claims 11 to 16, characterized in that the antagonist is a derivative of the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence represented in FIG. 1, comprising the substitution or the mutation of approximately 5 % to about 10% of amino acid residues except for conserved cysteine residues involved in the formation of disulfide bridges
18 Utilisation selon la revendication 11 , caractérisée en ce que l'antagoniste est un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par délétion de tout ou partie de sa séquence N-terminale comprise entre les résidus d'acides aminés 1 et 8 et de tout ou partie de sa séquence C-terminale comprise entre les résidus d'acides aminés 50 et 68, de préférence 60 et 68 de la séquence représentée à la figure 1 , ledit polypeptide étant en outre modifié par rapport au polypeptide RANTES par substitution d'au moins un résidu d'acide aminé18 Use according to claim 11, characterized in that the antagonist is a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence shown in FIG. 1, by deletion of all or part of its N-terminal sequence between amino acid residues 1 and 8 and all or part of its C-terminal sequence between amino acid residues 50 and 68, preferably 60 and 68 of the sequence shown in Figure 1, said polypeptide being further modified with respect to the RANTES polypeptide by substitution of at least one amino acid residue
19 Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'antagoniste répond à l'une des séquences d'acides aminés suivantes PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMS19 Use according to claim 17, characterized in that the antagonist responds to one of the following amino acid sequences PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV RQYINSLQMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV RQYINSLQMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV AQY1NSLQMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV AQY1NSLQMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VRQYINSLQMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VRQYINSLQMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VAQYINSLQMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VAQYINSLQMS
20. Séquence de nucleotides comprenant une séquence codant pour un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par délétion de tout ou partie de sa séquence N-terminale, par exemple par délétion des nucleotides codant pour les acides aminés en position 1 à 8 de la séquence du susdit polypeptide RANTES. 21. Séquence de nucleotides selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide antagoniste selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 1920. Nucleotide sequence comprising a sequence coding for a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence represented in FIG. 1, by deletion of all or part of its N-terminal sequence, for example by deletion of the nucleotides coding for the amino acids in position 1 to 8 of the sequence of the above RANTES polypeptide. 21. Nucleotide sequence according to claim 20, characterized in that it codes for an antagonistic polypeptide according to any one of claims 1 1 to 19
22. Séquence de nucleotides selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21 , caractérisée en ce qu'elle répond à l'un des enchaînements suivants22. Nucleotide sequence according to any one of claims 20 or 21, characterized in that it responds to one of the following sequences
CCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC GGGAGTACAT CAACTCTTTG GAGATGAGCT AGCCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC GGGAGTAGATACAT
ACACCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC GGGAGTACAT CAACTCTTTG GAGATGAGCT AGACACCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTT GGGAGAGTAG
23 Séquence de nucleotides selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, caractérisée en ce qu'elle est insérée dans un vecteur d'expression.23 Nucleotide sequence according to any one of claims 20 to 22, characterized in that it is inserted into an expression vector.
24. Séquence de nucleotides selon la revendication 23, caractérisée en ce que le vecteur d'expression est susceptible d'être administré chez un patient humain 25. Utilisation d'une séquence de nucleotides selon l'une quelconque des revendications 20 à 22 pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'une infection virale. O 97/44462 PC17FR 724. Nucleotide sequence according to claim 23, characterized in that the expression vector is capable of being administered to a human patient 25. Use of a nucleotide sequence according to any one of claims 20 to 22 for the preparation of a medicament for the treatment of a viral infection. O 97/44462 PC17FR 7
2727
26. Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que l'infection est due à un rétrovirus de type VIH.26. Use according to claim 25, characterized in that the infection is due to an HIV-type retrovirus.
27. Utilisation d'une séquence de nucleotides comprenant une séquence codant pour un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés est représentée à la figure 1 , par délétion de tout ou partie de sa séquence N-terminale pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'une infection due à un rétrovirus de type VIH27. Use of a nucleotide sequence comprising a sequence coding for a polypeptide derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence is represented in FIG. 1, by deletion of all or part of its N-terminal sequence for the preparation of a drug to treat an infection caused by an HIV retrovirus
28. Polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit du produit d'expression dans une cellule hôte, d'une séquence de nucleotides selon l'une quelconque des revendications 20 à 22.28. A polypeptide characterized in that it is the expression product in a host cell, of a nucleotide sequence according to any one of claims 20 to 22.
29. Polypeptide caractérisé en ce qu'il répond à l'une des séquences d'acides aminés suivantes :29. Polypeptide characterized in that it responds to one of the following amino acid sequences:
MPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREYINSLEMSMPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW VREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV REYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV RQYINSLQMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV RQYINSLQMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV AQYINSLQMSPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV AQYINSLQMS
MTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK WVREYINSLEMS TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMSMTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK WVREYINSLEMS TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW VREYINSLEMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VRQYINSLQMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VRQYINSLQMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VAQYINSLQMSTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW VAQYINSLQMS
30. Polypeptide antagoniste d'une ou plusieurs chemokines choisies parmi RANTES, MIP ou MCP, caractérisé en ce qu'il est dérivé du polypeptide RANTES répondant à la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 , par substitution, addition ou délétion d'au moins un résidu d'acides aminés, ledit antagoniste étant dépourvu des propriétés chemo-attractives des chemokines vis à vis des leucocytes, en particulier des lymphocytes, ledit polypeptide étant sous forme d'un polypeptide de fusion, capable de lier le(les) récepteurs cellulaires de RANTES et/ou MIP et/ou MCP.30. Antagonist polypeptide of one or more chemokines chosen from RANTES, MIP or MCP, characterized in that it is derived from the RANTES polypeptide corresponding to the amino acid sequence represented in FIG. 1, by substitution, addition or deletion of at least one amino acid residue, said antagonist being devoid of the chemo-attractive properties of chemokines with respect to leukocytes, in particular lymphocytes, said polypeptide being in the form of a fusion polypeptide capable of binding the (the ) cellular receptors of RANTES and / or MIP and / or MCP.
31 Composition caractérisée en ce qu'elle comprend, pour l'administration séparée ou simultanée, un composé antagoniste d'une ou plusieurs molécules de la famille des chemokines tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 19, et un agent actif dans le traitement ou la prévention d'une infection due à un rétrovirus VIH choisi parmi les composés ayant une activité anti-transcπptase inverse, ou anti-protéase virale ou une activité antagoniste vis-à-vis du récepteur CD4 présent sur des lymphocytes infectés par un rétrovirus de type VIH, ou un composé actif en immunothérapie, ou un composé actif spécifiquement contre une ou plusieurs infections opportunistes associées à la présence du rétrovirus VIH chez un patient 32. Composition selon la revendication 31 ou séquence de nucleotides selon l'une quelconque des revendications 20 à 24 ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 28 à 30, caractérisés en ce qu'elle(il) est formulé(e) pour être libéré(e) avec un effet retard chez un patient auquel il est administré. 31 Composition characterized in that it comprises, for separate or simultaneous administration, an antagonist compound of one or more molecules of the chemokine family as defined in any one of claims 1 to 19, and an active agent in the treatment or prevention of an infection due to an HIV retrovirus chosen from compounds having an anti-reverse transeptase activity, or viral anti-protease or an antagonistic activity vis-à-vis the CD4 receptor present on lymphocytes infected with an HIV retrovirus, or a compound active in immunotherapy, or a compound active specifically against one or more opportunistic infections associated with the presence of the HIV retrovirus in a patient 32. Composition according to claim 31 or nucleotide sequence according to any one of claims 20 to 24 or polypeptide according to any one of claims 28 to 30, characterized in that it (it) is formulated to be released with a delayed effect in a patient to whom it is administered.
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