WO1993010256A1

WO1993010256A1 - Process for producing saccharide

Info

Publication number: WO1993010256A1
Application number: PCT/JP1992/001498
Authority: WO
Inventors: Shigeaki Maruo; Noriyuki Tachikake; Yohji Ezure
Original assignee: Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 1991-11-19
Filing date: 1992-11-17
Publication date: 1993-05-27
Also published as: EP0676475A1; AU2933792A; MX9206591A; EP0676475A4; US5612203A

Description

明細書

糖類の製造法技術分野

本発明は、グルコース、マルト一ス、マルトオリゴ糖、又はイソマルトオリゴ糖等の特定の鎖長の糖類を、単品でしかも高純度に得る製造法に関する。

本発明の製造法によつて取得することができる特定の鎖長の糖類のうち分枝のないものの代表的な例として、グルコース及び下記のものを挙げることができる。

mは整数を表す。 mは、好ましくは、 0〜 5の整数を表す。

上記のうち、マルト一ス（m= 0 ) 、マルトトリオ一ス（m= l ) . マルトテトラオース（m= 2 ) 、マルトペン夕オース（m= 3 ) 、マルトへキサオース（m= 4 ) 等は、医薬品、食品、診断薬等の原料として用いることができる。背景技術

特定の鎖長の糖類を単品で高純度に得る方法としては、これまで、澱粉等に代表される、任意の鎖長を有する糖類を単独又は 2種以上の適当なアミラーゼ類で分解し、これを公知の様々なカラムクロマトグラフィ一等によって他の目的としないォリゴ糖ゃ単糖から分離するか（澱粉科学ハンドブック， P452, 1987ほか）、又はそれを更に結晶に導いて他の混在している目的としないォリゴ糖ゃ単糖から分離する方法（殺粉科学ハンドブック， P456, 1987) 等が知られている。

上記いずれの方法もグルコースや未切断のデキストリン、その他目的としないォリゴ糖の副生を回避することができず、本質的な欠点を有していた。

マルト一スに関しては、地上澱粉を利用した高純度の製造法の提示等があるが（特開平 4-158795号公報）、澱粉の高濃度仕込みができず、工業的に満足のできるものではなかった。

これらの問題点を解決するため、 PCT/JP91/00984号（国際公開 W0 92/01805) 特許出願に係る発明がなされた。これは目的とする特定の鎖長の糖類に対し実質的に分離可能な物質（以下「分離可能物質 J という）に、糖転移酵素により直接又は中間体を介して他の糖鎖供耠源から糖鎖を転移させ、得られたオリゴ糖に、オリゴ糖に対して特定の鎖長の糖鎖をェキソ型に切り出す酵素（以下「ェキソ型切断酵素 j という）を作用させて目的とする特定の鎖長の糖類を単雕するものであつた。

また、これに関連しては、アミロースにェキソ型切断酵素を作用させる方法に関しては、ナカキクら（ T. NA AKIKU, . AZUMA, . AINUMA, Carbohydrate Research, 128 (1984) 297- 310)があり、過ヨウ素酸-酸化の応用等についてはマーシャルら（J. J. MARSHALL, W. J. WHELAN Anal. , Bi ochem. , 43(1971) 316-321) があるが、これらは本発明の技術全体に直接関係するものではない。

この方法は上記課題を解決する斬新な技術ではあつたが、以下の欠点を有していた。

①糖転移酵素を必須の構成要素とするため、糖鎖供給源からの糖鎖の供給をしなければならず、この点で収率が良くなかった。

②糖転移酵素を作用させるため、分離可能物質は、糖転移酵素の受容体となることができる構造を有している必要があった（例えば、 2、 3、 4位の水酸基の配位がグルコース型の配位を有する物質、又はァスコルビン酸等）。

③ェキソ型切断酵素を作用させて目的とする特定の鎖長の糖類を生成させた後、これを単離する操作が必須であり収率をあげるのに限界カあった。発明の開示

本発明の目的は、上記の技術的欠点を克服することにあった。本発明者らは、上記欠点を解決するため種々研究を重ねたところ

①糖転移酵素を使用することなく目的を達することができること、

②そのため、グルコース型の配位を有する分離可能物質を使用する必要がなくなつたこと、 ③その上で、イオン交換樹脂の上でェキソ型切断酵素を作用させることにより、その後の目的物単離が格段に改善させること、等の新しい事実を見出し、本発明を完成した。本発明の要旨は、任意の鎖長を有する糖類又はその混合物に対してその糖類の還元末端を修飾したのち、このものに特定の鎖長の糖鎖をェキソ型に切り出す酵素を作用させ、目的とする特定の鎖長の糖類を生成させ、その後その目的とする特定の鎖長の糖類を取得するという一連の操作そのものにある。本発明においては、糖転移酵素を使用することがない。

本発明のいま一- 3の要旨は、上記一連の操作を実行するにあたつて、原料である任意の鎖長を有する糖類を修飾しイオン交換樹脂に吸着させた後にェキソ型切断酵素を作用させるという、操作限定を施したとある。

ここに修飾とは、還元末端に化学的処理を加えて、例えばイオン交換樹脂処理、溶媒抽出、濾過又は遠心分離等の簡単な分離操作によって分雜することができる化合物（例えば後述する化合物 A、 B C、 D又は E ) に誘導することをいう。この修飾の中には、外部から化学反応により還元末端に特定の官能基が導入させる場合も含まれるし、また還元末端の部分構造が官能基に変化する場合も含まれ O

本明細書においては、還元末端とは、任意の鎖長を有する糖類等の糖類の末端に位置する単糖における 1位のァノメリック炭素（an- oraeric carbon ) 位をいうものとする。一般には、このようなァノメリック炭素位を有する単糖をも還元末端と称することがあり、本明細書においても還元末端を有する単糖をも還元末端ということがめ。

本発明によれば、上に説明した従来技術（国際公開 W092/01805) にいう分離可能物質に相当するものを、糖類の還元末端を修飾する機能を有する化合物（以下「還元末端修飾剤」という。）を使用することにより得ることができる。本発明においてはまた、糖類の還元末端を、例えば酸化することにより、又は置換若しくは無置換のァミノ基を導入することにより還元末端の修飾を実施することができる。

このような置換ァミノ基の置換基としては、置換又は無置換のァルキル、置換又は無置換のァリール（ary l ) 等を挙げることができる。

本発明においては、本発明に係る効果を挙げるために、イオン交換樹脂を効果的に適用させることができる。

この場合には、本発明において還元末端を修飾した後にその糖類をイオン交換樹脂に吸着させることができる。このようにした後、公知の方法で洗浄することにより、本発明に係る還元末端を修飾された糖類のみをイオン結合によりィオン交換樹脂内に止めることができる。その後ここに本発明に係るェキソ型切断酵素を反応させることができる。しかる後、イオン交換樹脂内で生成した目的とする特定の鎖長の糖類を、洗浄又は溶出という単純な操作を施すことにより取得することができる。

本発明に係る上記一連の操作を施すことにより、本発明に係る目的物生成後の単離操作は極めて簡単に実施することができるようになった。また、取得する目的物の純度を極めて高いものとすることができるようになつた。

本発明を以下に更に詳述する。

本発明においては、原料として任意の鎖長を有する糖類を使用する。

このような糖類の好ましい例としては、例えば、地上澱粉、地下澱粉、化工澱粉等の澱粉を挙げることができる。

化工澱粉とは、酸処理澱粉、酸化澱粉、架橋澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル、グラフト共重合等の化学的変性を起こした殺粉、湿熱処理澱粉、 or -澱粉等の物理的変性を起こした澱粉、デキストリン、アミロース、高含アミロース等の酸素変性を起こした澱粉等を意味する。

このような糖類の重要なものの一つとして、グルコース鎖の結合形式が α— 1, 4-結合である糖類を挙げることができる。また — 1， 6 -結合を有する糖類であっても、適用することができる。更に、 β 一 1，4-結合であってもよい。

本発明においては、例えば、澱粉等の α - 1， 4-結合を有する糖類に 3 -アミラーゼ等の後述するェキソ型切断酵素を作用させることにより、最終的に目的物であるマルトオリゴ糖を取得することがでさる

本発明においては、例えば、澱粉等の : - 1， 4-結合を有する糖類にグルコアミラ一ゼ等の後述するェキソ型切断酵素を作用させることにより、最終的に目的物であるグルコースを取得することができ

-S) ο

本発明においては、例えば、デキストラン等の - 1， 6-結合を有する糖類にィソマルトデキストラナ一ゼ等のェキソ型切断酵素を作用させて、最終的に目的物であるイソマルトース等のイソマルトォリゴ糖を取得することができる。

本発明においては、例えば、セルロース等の / S - 1, 4-結合を有する糖類にセルラーゼ等のェキソ型切断酵素を作用させて、最終的に目的物であるセロビオース等のセロオリゴ糖を取得することができる o

本発明によつて取得する目的物は、後述するェキソ型切断酵素を適宜選択することにより、選択することができる。

上記した本発明の原料となる任意の鎖長を有する糖類は、直鎖状であっても分枝していても良い。また、これらの混合物であってもよい。

このような糖類としては、例えば、地上澱粉、地下澱粉、化工澱粉、デキストリン、及びこれらの混合物等を挙げることができる。

上記の澱粉類を更に、ひ -アミラーゼ等で液化したもの、液化後にプルラナ一ゼ、イソアミラ一ゼ等の枝切り酵素で処理したもの、又は水あめ等も、このような糖類の例として挙げることができる。このような液化は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化バリゥム、炭酸バリウム、塩化バリウム、水酸化アルミニウム、塩化ァルミニゥム等の一価又は多価金属の水酸化物、塩類等を添加することにより行うことができる。

このような糖類としては、また、アミロース、マルトペンタォ一ス、その他のマルトオリゴ糖及びそれらの混合物等も適当なものとして推奨することができる。本発明においては、これらの混合物をも使用することができる。

ここに掲げた化工澱粉の一種である酸化澱粉は、本発明の原料として用いることができるが、本発明に係る還元末端修飾法の一つである酸化処理を施した後の糖類を意味するものではない（二国ニ朗監修「澱粉科学ハンドブック j 501頁、朝倉書店（1987)、中村道徳、貝沼圭ニ編「澱粉関連糖質実験法」 298頁、朝倉書店（1989)、加藤博通ら「新農産物利用学」 35頁、朝倉書店（1987) ) 。

上記の任意の鎖長を有する糖類を原料として使用して行う本発明の製造法を、以下にその還元末端修飾方法の類型ごとに分けて説明するが、本発明はこれらの類型のみに限定されるものではない。

〔還元末端修飾の類型 I - (1) 〕

X

また合す。 nは mよりも大きい整数を表す。

本発明においては、まず糖類に還元末端修飾剤 Xを結合させることができる。

本明の還元末端修飾剤としては、本発明に係る糖類の還元末端と反応する化合物であれば、いかなるものであっても適用することができる。このようなものの具体例は後述するが、例えば、本発明に係る糖類の還元末端と反応する化合物であって、塩基性又は酸性の極性官能基を有する化合物等を挙げることができる。

本発明においては、これらの還元末端修飾剤によって、例えば、イオン交換樹脂等に吸着する性質を有する化合物 Aを製造することができる。

このような還元末端修飾剤としては、アミノ基を有する化合物を挙げることができる。代表的な例としては、例えば、フエニルヒドラジン、 2， 4-ジニトロフヱニルヒドラジン等の置換基を有するフェニルヒドラジン、セミカルバゾン、ヒドロキシルァミン、置換基を有してもよいアルキルアミン等のアミン類、置換基を有してもよいフエニルを有するアルキルアミン又はアミン類等を挙げることがでさ。

上記のほか、本発明の還元末端修飾剤としては、例えば、 2-アミノ - ピリジン等のへテロ環を有しかつアルデヒドとの反応性官能基を有する化合物等を挙げることができるし、また、他の形でアミン類を供与することができる化合物、例えば、酢酸アンモニゥム等を用いることができる。

以上の反応においては、通常、いわゆるシッフのベースとしてよく知られている化合物が生成されるが、反応中に、ソジゥムボロハィドレ一ト、ソジゥムシァノボ口ハイドレ一ト等を添加して反応させ、シッフのベースの二重結合を一重結合としてより安定な化合物を生成させることができる。また、シッフのベースを生成した後、ラネーニッケル、パラジウムカーボン等の適当な触媒を用いて水添により還元することもできる。〔還元末端修飾の類型 I - (2) 、 I 一（3) 〕

類型 I 一（1) において、還元末端修飾剤が高分子の場合には、以下のようにして本発明を実施することができる。この場合には、例えば、濾過等の簡単な処理によって、後の分離操作を容易にすることができる。

本発明において、糖類に、例えばシァノポロハイドレート、齚酸ァンモニゥム等の還元末端修飾剤を反応させて、塩基性^有する化合物 Bに誘導することができる。

その後、例えば、いわゆる二反応性官能基を有するスぺーサ一、例えば、グルタルアルデヒド、 1， 4-ブタンジオールジグリシジルエーテル等を用いて、高分子化合物（例えば、弱塩基性イオン交換樹脂等）に化学的に結合させることができる（類型 I — (2) ) 。

S P (スベーザ一).

本発明においては、糖類に、例えば、臭素、塩素、臭素水、次亜ヨウ素酸、次亜塩素酸、さらし粉、過酸化水素等の還元末端修飾剤を反応させて、酸性を有する化合物 Cに誘導することができる。

この場合の酸化は、後述する類型 I I I の箇所で詳しく説明する酸化と同様の酸化方法により同様に行うことができる。

その後、この Cを、例えば ω —アミノアルキルアミンァガロース等のアミノ基を有する高分子化合物に、水溶性カルポジイミドを縮合剤として化学的に結合させることができる（類型 I -（3) ) 。

このようにして高分子化合物と結合させた後、ェキソ型酵素を反応させれば、濾過により目的物質を単離することができる。

キシノを有する高 ^ この場合において糖類を高分子化合物に化学的に結合させるにあたって、高分子化合物を予め活性化した後（例、エポキシァクティベ一ティドアクリルアミド、エポキシァクティべーテイドセフアローズ等とした後）、反応させることもできる。

これらの高分子化合物は、水等に不溶の化合物でもよいが、例えば、分子量数千〜数万以上で、水等に溶ける化合物であってもよい。その場合には、限外濾過によって目的を達成することができる。高分子化合物が有する官能基は、そのすベてをスぺーサ一等と反応させる必要はない。一部の極性官能基を残してあれば、特に高分子が水等に溶ける場合には、これらの極性官能基を利用して、例えば、イオン交換樹脂等によって分離するのに好都合となる。

糖類の還元末端を修飾する方法としては、更に以下の場合を举げることができる。

糖類の還元末端のアルデヒドを、シアンヒドリン等の二トリルを有する化合物へと導き、これを還元してァミノ基を有する化合物へと導いた後、本発明の目的を達成することもできる。また、亜硫酸水素塩等を用いたアルデヒドの亜硫酸水素塩付加物への誘導反応によって取得される亜硫酸水素塩付加物、又は、例えば、それらにより誘導されるスルホン酸基を有する化合物として本発明の目的を達成することもできる。

(以下.次頁）〔還元末端修飾の類型 I I 〕

Ψ Y

本発明においては、他の類型を挙げることができる。このようなものとして、還元末端修飾剤として、例えば、置換されていてもよい低級アルキルアルコール又はフノール誘導体を使用する場合を挙げることができる。

そのような置換されていてもよい低級アルキルアルコール又はフェノール誘導体は、アミノ基等の塩基性官能基又はスルホン酸、力ルボン酸等の酸性官能基（これらは適当に保護されていてもよい）を有する必要がある。

これらは、還元末端修飾剤としてァノメリック炭素位の水酸基に作用させれば目的とする化合物 Dを取得することができる。この反応には、例えば、鉱酸、ルイス酸、陽イオン交換樹脂等を酸触媒として使用することができる。保護基を有した還元末端修飾剤を用いたときは、脱保護すれば化合物 Dを取得することができる。他の例は、酸又は塩基触媒と酸無水物、又は酸ハロゲン化物との反応による還元末端のァシル化反応である。即ち、酸無水物等が例えば適当に保護されたアミノ基を有する場合、ァシル化した後、脱保護をすれば化合物 Dを取得することができる。

本発明の糖類と還元末端修飾剤との反応は、通常の化学反応の形態によって提出される反応方法を適用することができる。反応温度、反応時間等は、適合する反応に至適のものを自由に選択して適用させることができる。反応生成物を取得するためには、 pHの調整、遠心分離、析出、濾過等の一般的手法を適宜適用することができる。〔還元末端修飾の類型 I I I〕

酸化

(化 E)

本発明においては、糖類の還元末端を酸化して糖類のァノメリック炭素位をカルボン酸に変換して化合物 Eを取得することができる, このような酸化は、例えば、次亜ヨウ素酸、次亜塩素酸、次亜臭素酸等の次亜ハロゲン酸、次亜ヨウ素酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリゥム、次亜臭素酸ナトリウム、次亜ヨウ素酸力リゥム、次亜塩素酸カリウム、次亜臭素酸カリウム等の次亜ハロゲン酸の金属塩、臭素、塩素、ヨウ素、さらし粉、過酸化水素等の酸化剤を反応させることにより、することができる。その中でも、臭素、塩素、次亜ヨウ素酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム、次亜臭素酸ナトリゥム等の次亜ハロゲン酸の金属塩が好ましい。

酸化はまた、反応液に塩素を吹き込むことによっても行うことができ、この場合には、反応液の pH は特に限定されないが、澱粉等の原料糖類の安定性及び塩素の効率的反応性等を考慮するとカセィソ一ダ、カセイカリ、水酸化カルシウム、水酸化バリウム等で反応液をアル力リ性に保ちながら塩素を吹き込むのが好ましい。

本発明に係る上記酸化は、またパラジウムカーボン等の触媒を用いた空気酸化等によりすることができる。

このような酸化にあたっては、例えば、炭酸バリウム等の緩衝剤を適宜共存させることができる。

また上記の酸化は、電解酸化、アルド一スデヒドロゲナ一ゼ活性を有する微生物、又はアルドースデヒドロゲナーゼを用いる生物学的酸化によっても、することができる。

過ヨウ素酸による酸化は、還元末端以外の部分も同時に酸化する傾向が強いので、本発明には適していない。

また、以上の酸化反応においては、酸化反応の条件によっては、例えば、アルカリ性溶液中での次亜塩素酸ナトリウムを用いる反応では、酸化反応の過程で原料である糖のごく僅かの糖の還元末端が異性化して非還元糖であるケト一スとなる場合もあるが、これらのケトースも酸化反応中に酸化され結果として、還元末端にカルボン酸等を有する酸性糖になり、従って、このような条件下においても、本発明にとつて問題とならないのは自明のことである。

〔還元末端修飾の類型 I V〕

上述した類型のいずれにも属さない本発明の類型を挙げることができる。

本発明においては、還元末端の 1位を 0 -ァセチル化した後、ノヽ πゲン化水素で処理して 1個がハロゲンによつて置換されたハラィドとし、この化合物を用いることにより、例えばリン酸エステル等の本発明に係る分離可能な極性基を有する物質に導くことができる。

また、糖の還元末端をグリカールに誘導し、これより本発明に係る分餱可能な極性基を有する物質に導くことができる。これらのものは、本発明の類型として掲げた A、 B、 C . D又は Eの範疇には入らない物質である。

上に例示した I〜 I Vの類型によって本発明に係る還元末端修飾反応を実施することができる。

本発明においては、上記の還元末端修飾反応を終えたのち直ちにェキソ型切断酵素を作用させることができる。このような場合としては、例えば、最終的に多少の目的とはしない糖類若しくは還元末端修飾反応に供されることがなかった原料糖類が混入していても差支えない場合、本発明の反応条件が良く精製処理を行うことなく本発明の目的を達成することができる場合等が考えられる。

本発明においては、上記の還元末端修飾反応を終えたのち、ェキソ型切断酵素を作用させる前に、極性官能基に注目した分離操作を適用することができる。

例えば、上記の化合物 A、 D又は Eにおいては、必要に応じて有機溶媒等で過剰の未反応試薬を取り除き又は透析等の手段で除去し、上記還元末端修飾反応類型の I - ( 1 ) 等において必要があるときには、ィォン交換樹脂によってこれらの処置を施すことができる。このようなイオン交換樹脂としては後述するものを挙げることができる。

上記から明らかなように、本発明においては、還元末端修飾反応を終えたのち、上記措置（極性官能基に注目した分離操作）を施すか又は施さずにェキソ型切断酵素を作用させることとなる。

本発明においてェキソ型切断酵素を作用させる場合には、ェキソ型切断酵素に適した pH においてすることができる。

作用させるェキソ型切断酵素の種類は、取得しょうとする特定の鎖長の糖類の種類によって適宜選択することができる。

ェキソ型切断酵素の添加量は、用いるェキソ型切断酵素の種類等により適宜選択することができる。

また、反応温度及び反応時間は、使用する酵素の種類及び量に応じて適宜変化させることができる。

ェキソ型切断酵素を作用させる場合においては、同時にプルラナーゼ、イソアミラーゼ、 α—アミラーゼ等の他の酵素を共存させた状態でェキソ型切断酵素を作用させることができる。

本発明に係るェキソ型切断酵素としては、代表的なものとして例えば、グルコア'ミラ一ゼ、 3—アミラーゼ、マルトオリゴ糖生成酵素等を挙げることができる。

このようなェキソ型切断酵素として更に詳しくは、マルトトリオ一ス生成酵素としては、例えば、ストレプトミセスグリセウス Ν A - 4 6 8 ( FERM-2227 ) 、澱粉科学 25巻、 155-161頁（1978) 記載の酵素等を挙げることができる。

マルトテトラオース生成酵素としては、例えば、シュ一ドモナススタツテリィ Arch. Bioc era. Biophys. 145卷、 105-114頁（197

1)記載の酵素、シュ—ドモナスサッカロフイラ I A M 1 5 0 4、「日本農芸化学会 j 昭和 60年大会要旨集 370頁記載の酵素等を挙げることができる。

マルトペンタオース生成酵素としては、例えば、シユードモナス K 0 - 8 9 4 0 (FERM. P-7456). 「日本農芸化学会」昭和 59年大会要旨集 181頁記載の酵素等を挙げることができる。

イソマルト一ス生成酵素としては、例えば、イソマルトデキストラナ一ゼ等を挙げることができる。セロビオース生成酵素としては、例えば、セルラーゼ等を挙げることができる。

例えば、マルト一スを製造する場合、 /3—アミラーゼを用いることができるが、用いる S—アミラ一ゼに適した pH 4〜10、好ましくは、 pH 7. 6に反応液を調整し、 ^ 一アミラーゼを反応液に入れ、反応温度 25〜65での間で数時間〜 2 日閭反応させるのが適当である。また例えば、マルトテトラオース生成酵素の場合には、マルトテトラオ一ス生成酵素に適した pH 4 〜10、好ましくは、 pH 8. 0で温度 25〜55で、数時間〜 2 日間で反応させ目的を達成することができる。ェキソ型切断酵素は、回収することにより再利用することもできェキソ型切断酵素は、溶液状で用いることもできるが、汎用されている公知の画定化酵素を製造する方法で調製した固定化酵素の型で反応させることもできる。特に、粗酵素を用いる場合には、固定化酵素を用いることは夾雑物を少なくすることができ、精製工程上有利である。

本発明においては、ェキソ型切断酵素を作用させた後、例えば、イオン交換樹脂又は電気透析等により処理することによって、実質的に目的とする特定の鎖長の糖類のみを単離することができる。

本発明においてェキソ型切断酵素を作用させた後目的物を単離する目的でイオン交換樹脂を用いるときには、反応混合物をイオン交換樹脂に負荷（charge) させた後、このものを十分に洗浄することにより洗浄液中から目的物を取得することができる。脱塩処理等は、イオン交換樹脂の処理で兼用することもできる。

本発明において使用するイオン交換樹脂としては、必要に応じて酸性イオン交換樹脂又は塩基性イオン交換樹脂を使用することができる。このような樹脂としては、例えば、ダウエックス 50W X 2 登録商標）、ダウエックス 1 X 2 (登録商標）、ダウエックス SBR ( 登録商標）、ダウエックス 66 (登録商標）、ダイヤイオン SK - 104 ( 登録商標）、ダイヤイオン SA- 1 1A (登録商標）、ダイヤイオン WK-2 04 (登録商標）、ダイヤイオン WA- 20 (登録商標）、ダイヤイオン CR- 10 (登録商標）、ダイヤイオン PA-306 (登録商標）、ダイヤィオン PA-406 (登録商標）、ァンバーライ卜 I R- 120 (登録商標）、ァンバ一ライト HFS-471X (登録商標）等を挙げることができる。これらのイオン交換樹脂の量は、適宜増減することができる。

更に、本発明において、本発明の一実施態様である糖類の還元末端を、例えば、カルボン酸にする方法においては、例えば、出発原料として澱粉を用い、ェキソ型酵素を作用させた反応液中には、デキストリン等の高分子化合糖、目的とする特定の鎖長の糖、ェキソ型酵素反応後切断された形で残存する還元末端がカルボン酸となつた糖類、無機物などが存在する。このような場合において、これらの反応液中の不純物をアル力リ金属型またはアル力リ土類金属型強酸性イオン交換樹脂を用いて効率的に除去し、そのことにより高純度の特定の鎖長の糖を製造することができる。

この方法は、上記一連の本発明に係わる工程を研究するうち、これらの反応液中の不純物をアル力リ金属型またはアル力リ土類金属型強酸性イオン交換樹脂を用いて効率的に除去できることを、見いだしたことにより確立されたものである。

本発明の一実施態様であるこの方法は、上に説明した①原料糖類の還元末端修飾反応、 ②ェキソ型切断酵素による反応、 ③精製、と云う一連の工程のうち、 ③をアル力リ金属型またはアル力リ土類金属型強酸性イオン交換樹脂を用いて行なおうとするものである。

この方法においては、上に説明したェキソ型酵素反応を施したのちの反応液を、必要に応じて活性炭処理、濾過、濃縮等をしたのち、アルカリ金属型またはアル力リ土類金属型強酸性イオン交換樹脂のカラムを通過させたのち、水等で展開し、目的とする特定の鎖長の糖を含有する面分を集めることによりすることができる。

この方法は、ェキソ型酵素反応後切断された形で残存する還元末端がカルボン酸となった糖類が、アル力リ金属型またはアル力リ土類金属型強酸性イオン交換樹脂のカラムを用いると、目的とする特定の鎖長の糖より速やかに溶出することを見いだしたことにより可能となったのである。このことは、この方法の驚くべき効果の一つである。

この方法によれば、澱粉工業で用いられている既存の設備（例えば、アル力リ金属型あるいはアル力リ土類金属型強酸性イオン交換樹脂の疑似移動層型カラムまたは通常のイオン交換樹脂カラム等）を用いることができ、しかもイオン交換樹脂の再生回数を著しく減らすことができる。 '

本発明においては、上記一連の工程中において、ェキソ型切断酵素を作用させる工程を、還元末端を修飾された糖類をイオン交換樹脂に吸着させた状態で実施することができる。

この方法は、上記一連の本発明に係る工程を研究するうち、ェキソ型切断酵素による反応がィオン交換樹脂内においても見事に進行する事実を見いだしたことにより確立されたものである。

本発明の一実施態様であるこの方法は、上に説明した①原料糖類の還元末端修飾反応、 ②精製、 ③ェキソ型切断酵素による反応、 ④ 精製、という一連の工程のうち、 ②と④を省略し、 ③をイオン交換樹脂内において行おうとするものである。

この方法によれば、上記に説明した還元末端修飾反応を施したのち、還元末端を修飾された糖類をイオン交換樹脂に吸着させることができる。このようなイオン交換樹脂としては、前記したものを挙げることができる。

しかる後、このものを、水等で洗浄することができる。

この方法においては、この過程において、還元末端修飾反応が不充分である等の理由により混合している未修飾の糖類は、イオン交換樹脂に吸着せずに分離して溶出するから、極めて簡単に原料の精製をも完了させることができる。このことは、この方法の驚くべき効果の一^ 3である。

この方法においては、その後イオン交換樹脂内に前記のェキソ型切断酵素を通過させることにより酵素反応を進行させることができる

この方法においては、ェキソ型切断酵素反応時においても目的とする物質は中性物質であるためイオン交換樹脂により分離することができるが、より好ましくは、ェキソ型切断酵素反応の終了後に水で洗浄して充分に目的物を集めることができる。

この方法によれば、本発明における全体の工程が単純化することができる。また、生成する目的物の純度を高めることができる。

この方法をも含め、本明細書に開示した本発明に係るすべての製法において、その工程中で実施される精製は、公知の方法を組み合わせてすることができる。

例えば、還元末端修飾反応を終了させた後において直ちにェキソ型切断酵素を作用させた場合においては、ェキソ型切断酵素を作用させた後に、濾過、活性炭処理、限外濾過、脱塩等を適用することができる。

またェキソ型切断酵素を作用させた後、切断された形で残存する還元末端修飾済の糖類等を除去するためには、電気透析器、イオン交換樹脂処理、濃縮、再結晶、乾燥等を処理を適宜組み合わせて適用することができる。

また、例えば、澱粉に還元末端修飾反応を終了させた後、ェキソ型切断酵素を作用させる前に、濾過、イオン交換樹脂処理等によつて、極性官能基に注目した分離操作を行った場合には、分離操作後に得られた反応混合物にェキソ型切断酵素を作用させた後、反応液を、電気透析器、イオン交換樹脂等により、ェキソ型切断酵素作用後に切断された形で残存する還元末端の修飾された糖類等を除去した後、必要に応じて活性炭処理、濾過、濃縮、再結晶又は乾燥等の処理を適宜組み合わせて適用することができる。

これらの精製操作において、例えば、糖類の還元末端を修飾して酸性物質に誘導した場合には、その後の処理に必要なイオン交換樹脂等の必要量を減少させるために、又は電気透析器の処理を有利に導くために、反応液に水酸化カルシウム、水酸化バリウム等を加えて濃縮し、大多数の、ェキソ型切断酵素作用後に切断された形で残存する還元末端の修飾された糖類等を沈殿させ除去する等の手段を組み入れることができる。

これらの精製操作において、例えば、糖類の還元末端修飾反応において、次亜塩素酸ソ一ダ等の酸化剤を用いた場合は、必要に応じて亜硫酸ナトリゥム等の還元剤を用いて過剰の酸化剤を不活化した後、上記の精製手段を実施することもできる。

また還元末端修飾反応に疎水性化合物を用いた場合等には、有機溶媒抽出等の手段を組み入れることもできる。

本発明によれば、特定の鎖長の糖類のみが得られるという利点だけでなく、従来法と比較して製造工程が非常に簡易となり、経費、労力等を大幅に節減することができ、収率も充分に高めることがでさ Φ 本発明の製造法で得られる糖類、例えば、マルトース（m = 0の場合）は、特に高純度が要求される医薬用に有用であり、その形態としては、点滴剤等を挙げることができる。

また、当然に食品用としても用いることができる。マルト一スは食品用としても非常に利用価値の高いものであるし、高純度が要求される点においても医薬用と同様であって、本発明の製造法を有効に適用することができる典型的な応用分野である。

本発明の製造法によって取得することができる糖類のうち、マルトトリオース（m = l ) 、マルトテトラオース（m = 2 ) 、マルトベン夕オース（m = 3 ) 、マルトへキサオース（m = 4 ) 等は、診断薬等の原料として用いることができる。

更に、マルト一スを還元して製造される甘味剤のマルチトールの結晶化は、原料のマルト一スが純粋なものほど良好であるので、本発明の製造法で製造されるマルトースは、この点に対しても非常に有効である。

マルトテトラオース、マルトペン夕オース等は経腸栄養剤としても有用である（食品工業 1990年 8月 30日号、 52頁）。

本発明に係る糖類を医薬用として適用する例としては、例えば、輸液等を挙げることができる。输液に適用する場合に、例えばマルトースはその 10%溶液が等張であり、等量のグルコースの 2倍のェネルギー価を有すること等から、グルコース等よりも有益であることが知られており（「麻酔と蘇生」 20巻 3号 163頁。 1984年〉、同様に等張のマルトトリオース 15%溶液はグルコースの 3倍のエネルギー価を有して有効性が更に高い。本発明に係る糖類を医薬用に適用する場合には、例えば、後に輸液組成例として掲げる組成のものを適用することができるが、一般的には、糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペン夕オース、マルトへキサオース等）を単独で、又はグルコース若しくはマルトースと同時に含有させ、適宜塩化ナトリウム、塩化カリゥム、酢酸ナトリウム等の無機塩を含有させることができる。

本発明において、前記した還元末端修飾反応を実施するに際して適用する酸化剤の反応は、通常は、 50て以下の温度において行われるが、 5CTC以上の温度、必要なら 90〜 1 00 °C以上の温度で短時間で反応を行うことができる。

高温度では、酸化剤の分解も早いが反応も早いので、工業的規模で本発明を実施する場合、例えば、連続式液化装置、連銃糖化装置のようなパイプライン中で本発明に係る澱粉等の乳液、液化液を高温度で流しながら処理する過程において、酸化剤を加えてパイブラィン中で連続的に反応を行うことができるようになる。

また、例えば、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム等の酸化剤を用いた場合には、反応缶の材質は、その酸化作用等のために制限を受け、通常、澱粉工業等で使用されている材質の反応缶では、不適切な場合があるが、パイプライン中で反応した反応液を連続的に、枝切り酵素反応、糖化反応等の次の反応を行う反応缶に流加する場合、パイプライン中で反応が終了していれば、ほとんどの酸化剤等は、パイプライン通過中で消費してしまい、次の反応は、通常の反応缶で行うことができるようになる。このとき反応温度にみあった適切なパイプラインの長さを選択すれば、広い反応温度範囲でパイプライン中での反応が可能となる。また、そのパイプラインの部材を適当なものとすれば、酸化剤によるパイプラインの浸食も防止することができ、設備綞費、維持経費等の面で有利となる。本発明により、以下の効果をあげることができるようになった。

(1) 糖転移酵素を用いることがないので、極めて良い収率で目的物を取得することができた。

(2) 地上澱粉、地下澱粉、化工澱粉、デキストリン、各種オリゴ糖、及びそれらの混合物等の各種の糖類を、原料として幅広く活用することができた。

(3) 液化、糖化反応だけでは従来法では製造することができなかつた高純度の目的物を取得することができ、またその収量をあげることができた。

(4) 精製工程が簡単になった。

(5) 還元末端修飾後の澱粉は低粘性を有するから、工業上高い濃度で粉を反応させることができるようになり、生産性が向上するとともにコストダウンが可能となった。

(6) コーンスターチ等は特に高濃度においては著しい白濁が見られるが、これを原料として適用するときに、還元末端修飾後には白濁が減少し溶解度が増大して、後の精製工程を簡略化することができ

7 o

(7) 酸化によって還元末端を修飾する場合において、例えば次亜塩素酸ソーダ等の食品添加物を使用することも可能となり、食品用の目的物を取得しょうとするときには、極めて合目的的となった。発明を実施するための最良の形態

本発明の実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明する。以下の実施例 7、 8、 11、 13、 14、 15、 16、 17において、マルトースおよびマルトテトラオースの純度は、 HPLCにより測定された値で、それらはマルトオリゴ糖中におけるマルトースおよびマルトテトラオースの純度を意味する。

実施例 1

マルトペンタオース 200rag (生化学工業社製、純度 98%以上）を 20ralの蒸留水に溶解させ、これにフヱニルヒドラジン溶液（フエ二ルヒドラジン：酢酸：水 = 2:1:1 体積比として混合したもの）を 4 ral加え、 90分間沸騰水浴中で煮沸した。放冷後 1M の炭酸ナトりゥ厶を 16.5ml添加して pHを弱アルカリ（pH 8.65 ) にし、等量の酢酸ェチルで 3回抽出後、水層を旭化成社製卓上脱塩装置マイクロァシライザ一 G1 (アンプレックスカートリッジ AC- 220- 10) を用いて脱塩した。（処理後の試料液量 21.3ml) 。このマルトペンタォ一ス—ォサゾンの生成、及び原料であるマルトべンタオースの消滅は、シリカゲル 60 F ₂₄₅ プレート（メルク社製、展開溶媒 1—プロパノール：アンモニア：水 = 6:1:2 体積比）により確認した。以下の薄層クロマトグラフィ一（TLC) はすべてこの方法を用いた。

このマルトペンタオース—ォサゾン溶液（液量 21.3 ral、 pH 9.2) に、 /3—アミラーゼ（ BC 3.2.1.2. シグマ社製、スイートポテト由来）を 6658.5 ュニット（蛋白量として 6.9mg) 添加し、 40。Cで 60分閭ィンキュペートした。マルト一スの生成を TLC で確認した後、氷冷下で沈澱する物質を析出させて遠心分離（14250GX 15分）により除去した。この上清に液量が 100mlとなるように蒸留水を加えたもの（pH 7.08 ) を強酸性イオン交換樹脂（Dowex 50W X2 、 H⁺ 型） 100mlを充填した 25mm0 x 50cmカラムにのせた。非吸着画分を通過面分とし、水洗を行い、各 100mlずつ分画した。各分面を減圧乾固し蒸留水 l mlに溶解後、 TLC分析により目的とするマルト一スが通過面分及び最初の洗浄面分 lOOmlに溶出されていることを確認した。これら両面分を混合し 5.0mlにしたものに対して、メタノール 1.2mlと活性炭（Darco G-60 和光純薬社製） 40mgを加え 30分、 50°Cでインキュベートした。 14250GX15分で遠心分離を行い、活性炭を除去後、上清を減圧乾固した結果、 53.4ragのマルト—スを取得した。収率 66.8 %。このものは、 TLC分析にて単一のスポットを与えた。

実施例 2

アミロース A 200rag (ナカライテスク社製、コーンスターチ由来、平均分子量約 2900) を 20mlの蒸留水に加熱溶解させ、これにフエ二ルヒドラジン溶液（フヱニルヒドラジン：酢酸：水 = 2:1:1 体積比として混合したもの）を 4ml加え、 90分間沸腾水浴中で煮沸した。放冷後 1 M の炭酸ナトリゥムを 13.0ml添加して pHを 9.25とし、等量の酢酸ェチルで 3回抽出した後、水層を旭化成社製卓上脱塩装置マイクロアシライザ一 G1 (ァシプレックスカートリッジ AG-220-10) を用いて脱塩した。（処理後の試料液量 29.8ml) 。このアミロース A—ォサゾン溶液（PH7.57) に、 /3—ァミラ.一ゼ（ EC 3.2.1.2. シグマ社製、スィートポテト由来）を 6658.5 ュニット（蛋白量として 6.9mg) 添加し、 40でで 60分閭インキュベー卜した。マルト一スの生成を Tし C で確認した後、氷冷下で沈殿する物質を析出させて遠心分離（ 14250GX 15分）により除去した。この上清に液量が 100 mlとなるように蒸留水を加えたもの（pH 6.96 ) を強酸性イオン交換樹脂（Dowex 50W X2 、 H⁺ 型） 100mlを充塡した 25rara0 x 50cm カラムにのせた。非吸着画分を通過画分とし、水洗を行い、各 100 mlずつ分画した。各分画を上述のマイク πァシライザ一で処理し、減圧乾固した後、蒸留水 l mlに溶解させ、 TLC分析により目的とするマルト一スが通過画分及び最初の洗浄画分 100mlに溶出されていることを確認した。これら両画分を混合し、 5.0mlにしたものに対して、メタノール 1.2mlと活性炭（Darco G-60 和光純薬社製） 40 ragを加え 30分、 50^eCでインキュベートした。 14250GX 15分で遠心分離を行い、活性炭を除去後、上清を減圧乾固した結果、 123.5ing のマルト一スを取得した。収率 69.5 %。このものは、 TLC分析にて単一のスポットを与えた。

実施例 3

マルトペンタオース 300mg (生化学工業社製、純度 98%以上）を 30mlの蒸留水に溶解し、 0でに冷却後、臭素 0.3ralを加え、遮光下室温にて 17時間攪拌した。 TLC (展開溶媒； n-ブタノール：エタノ —ル：水 = 5 : 3 : 2 ) にてマルトペン夕オースの消失を確認後、反応液に空気を吹き込み、過剰の臭素を除去し更に亜硫酸ナトリゥムを 300mg加えた。 2N-水酸化ナトリウムにて pHを 6.17とし、 β — アミラーゼ（EC3.2.1.2.シグマ社製スイートポテト由来）を 6658 .5ュニツト（蛋白量として 6.9rag) 加え、 40°Cにて 2時間反応させた。 TLCにてマルト一スの生成を確認後、反応液を旭化成社製卓上脱塩装置マイクロアシライザ一 G1 (ァシプレックス力一卜リッジ AC- 230- 10) にて処理した。マルトースの生成量を HPLCにて定量し、 80. 3rogの生成を認めた。このものは、 TLC分析にて単一のスポットを与えた。

実施例 4

メタノール溶液（メタノール：蒸留水 =9 : 1 体積比） 10ml にマルトペン夕オース（林原生物化学研究所製、純度 98% 以上） 0. 25腿 o l (207. 18mg)、酢酸アンモニゥム 20miDo l ( 1. 54g)及びシァノ水素化ホゥ素ナトリゥム 10匪 ol (630mg) を溶解させ常温で 40時間反応した。

6N塩酸を 6. 5ral 添加後、旭化成社製卓上脱塩装置マイクロァシライザ一 Gl( ァシプレックス力一トリッジ AC-220- 10) を用いて脱塩した。試料溶液を蒸留水で 50ml に調節後、強酸性イオン交換樹脂

( Dowex 50W X 2 H + 型） 50mlを充塡した 20mm ø x 30cmカラムにのせた。 300ml 蒸留水で洗浄後、アンモニア 300ml にて溶出する画分を集め減圧濃縮した。この溶液（6ml、 PH9. 05) に —アミラーゼ（E C 3. 2. 1. 2 シグマ社製、スィー卜ポテト由来）を 6658. 5ュニット ( 蛋白量として 6. 9mg) 添加し、 40でで 120 分間ィンキュペートした。マルトースの生成を TLC で確認後、試料溶液を蒸留水で 50mlに調節し再度上記の条件にて樹脂処理を行つた。非吸着面分を通過面分とし、水洗を行い、各々 100ml ずつ分面した。各画分を上述のマイクロアシライザ一で処理し減圧乾固した後、蒸留水 lml に溶解させ、 TLC 分析により目的とするマルトースが通過画分及び最初の洗浄面分 100ml に溶出されていることを確認した。これら両面分を混合し減圧乾固した結果、 66. 1ragのマルト一スを取得した。収率 78. 4 % 。このものは、 TLC 分析にて単一のスポットを与えた。

実施例 5

アミロース A 3g (ナカライテスク社製、コーンスターチ由来、平均分子量 2900) を 100ml の蒸留水に加熱溶解し、冷却後臭素 lml を加え、遮光下室温にて 2 日間撹拌した。空気を吹き込み過剰の臭素を除去し、さらに溶液の色が消えるまで撹拌した。これを強塩基性イオン交換樹脂（DIAION SA-10A, OH" 型） 200ml に供し、水洗 20 00mlを行った後、 0.5N-HC1 2000ml によるカルボン酸誘導体の溶出を行った。溶出液は、 K0H にて中和後、旭化成社製卓上脱塩装置マイクロアシライザ一 G3 (アンプレックスカートリッジ AC- 220- 4 00) を用いて脱塩した。これを減圧濃縮後、濃縮液を凍結乾燥し、 1.40g の粉末を得た。この粉末から 200mg を秤量し、 20mM Acetate bufferC pH4.8) 10mlに加熱溶解し、冷却後 /3 -アミラーゼ（シグマ社製、スイートポテト由来）を 2219.5ユニット（蛋白量として 2. 3mg ) 加え、 4(TCで 3 時間インキュベートした。反応液を遠心分離して不溶物を除去し、上清をマイクロァシライザ一 G1 (アンプレックスカートリツジ AC- 230-10 ) を用いて脱塩及び/ S—アミラーゼ切断残渣の除去を行った後に、 HPLCによるマルト一スの定量を行い、 137mg の生成を認めた。

輸液組成例

マルトトリオ一ス 15 g、塩化力リウ厶 0.03g、塩化カルシゥム 0.02g、塩化ナトリウム 0.6g、乳酸ナトリウム 0.31 gを混合し、輸液 100mlの組成とする。

参考例 1 マルトトリオース生成酵素の調製ストレプトミセスグリセウス NA - 4 6 &株をデキストリン

3 %、大豆粉 2 %、酵母エキス 0. 1 %、ポリペプトン 0. 1 96、 KH₂ P 04 0. 3 %、 C a C 12 0. 5 %、 (NH₄ ) 2 S

04 0. 196, (pH 7.0) からなる組成の培地に植菌して、 27で、 4 日間振齄培養した。培養液の遠沈上清の 40-60%飽和の硫安沈澱面分をとり 0.01M酢酸緩衝液（PH 5.8) に対して透析し、その遠沈上清をマルトト Iオース生成酵素とした。

参考例 2 マルトテトラオース生成酵素の調製

シユウードモナススタ、 yテリ I F 0— 3 7 7 3株をバクトカジトン 1. 0 %、酵母エキス 0. 5 %、 KH₂ P 04 0. 2 8 %、 K₂ HP O 4 0. 1 % CpH 7.0) の組成でなる培地に植菌して 30 でで 18 時間培養した。疏安沈澱、透析により部分精製したものをマルトテトラオース生成酵素とした。

参考例 3 5 %バラヂゥム -カーボン触媒の調製

P d C 1₂ (320 mg) を濃塩酸（5 ml) に溶解後、蒸留水（30ml) と活性炭（白鴛 Z ； 3.8g ) を加えた。 10 N—水酸化ナトリウム溶液で pH 5.0 に調製後、 N a BH₄ (341 mg) を蒸留水（10 ml) に溶解した水溶液を速やかに加えた。これを濾過、水洗して 5 %パラジウム—力一ボン触媒とした。

実施例 6

馬鈴薯澱粉をな- ァミラ一ゼおよびプルラナーゼで処理した溶液 (198 mg/20 ml ) にフエニルヒドラジン溶液（フヱニルヒドラジン：醉酸：水 = 2 _: 1 ： 1体積比として混合したもの）を 4 ml加えて 90分閭沸縢水浴中で加温した。放冷後、 1Mの炭酸ナトリウム溶液を 17ml 添加して p Hを弱アルカリにし等量の酢酸ェチルで 3回抽出後、水層を旭化成卓上脱塩装置マイク αァシライザ一 G 1 (ァシプレクスカートリヂ A C— 2 2 0 — 1 0 ) を用いて脱塩した。この澱粉一才サゾン溶液（pH 7.6) に -アミラーゼ（シグマ社製、スィ一トポテト由来）を 6660ュニット（蛋白量として 6.9 rag ) 添加して、 40°Cで 60 分間インキュベートした。マルト一スの生成を T L Cで確認したのち、氷冷下で析出する沈澱を遠心で除去した。この上清液を強酸性陽ィオン交換樹脂（D o w e x 5 0 Wx 2 ) 100ml を充填したカラムにかけ非吸着画分と洗浄画分の初流部分にマルト —スが溶出されていたので集めた。分析の結果 T L Cにて単一スポットの 75.7rag のマルト一スを得た。収率 3 8. 2 %であった。

実施例 7

蒸留水 70 ralにコーンスターチ 30gを溶解させ、 1M塩化カルシュム Itnlを加えた。さらに一アミラーゼ（シグマ社製、バチルスリツケニフォルミス由来）を 2400 ュニット（蛋白量として 2.4mg) を加え、 8 5 で 50 分間反応した。ォ一トクレーブで反応を停止させたのち、プルラナーゼ（林原社製、クレブシラニューモニァェ由来）を蛋白量として 3.5mg添加して 50 で 20 時間インキュベートした。この澱粉液化液の 8mlに臭素 1 を加え、遮光下室温で 70 時間攪拌した。空気を吹き込み臭素を除去後、水酸化ナトリウム溶液で PH 6.0 に調整して、 3—アミラーゼ（シグマ社製、スイートポテト由来）を 48 ュニット（蛋白量として 50 g ) 添加して 40 でで 24 時間反応させた。 H P L Cでの純度は 9 6 %であり収率は 6 1 %であつた。実施例 8

馬鈴薯澱粉 15gを蒸留水 135mlに懸濁し、アミラーゼ（シグマ社製、バチルスリツケニフォルミス由来） 2.5 1 (蛋白質量 75 z ， 75ュニット）を加え、 85。Cで 20 分間激しく攪拌した。その後ォ一トクレーブして反応を止め冷却後、プルラナーゼ溶液（林原社製） 1 ral (蛋白質量 4.1 rag ) を加え 50 てで 4時間反応させた。冷却後、臭素を 2ral加え、遮光後室温で 2日閭攪拌した。空気吹き込みにより臭素を除去して水酸化ナトリゥムで中和後、旭化成卓上脱塩装置マイクロァシライザ一 G 3 (ァシプレクス力一トリッジ AC— 22 0— 4 0 0 ) を用いて 24.4 mg/mlの酸化液化澱粉液を得た。この溶液の 10ml をとり —アミラーゼ（長瀕産業社製、大豆由来） 20 1 (蛋白質量 185 ) を加え、 40でで 22 時間反応させた。旭化成卓上脱塩装置マイクロアシラーザ一 S 1 (ァシプレックスカートリッジ AC— 2 2 0— 1 0 ) 及び活性炭処理を行つた後、 HP L Cによるマルト一スの定量を行い 113mgのマルト一スの生成を認めた。収率 4 6. 3 %、純度9 8. 7 %であった。

実施例 9

蒸留水 4mlにフジオリゴ 6 · 7 (日本食品加工社製） 200mg を溶解させ 2 - アミノビリジン 3.6g , 醉酸 1.6ral 、メタノール 14 .4mlを添加した。溶液が均一になった後にシァノ水素化ホウ素ナトリウム 1.4g を加えて 75 でで 75時問反応した。 6N塩酸を 8ml添加後、旭化成卓上脱塩装置マイクロァシライザ一G.1 (ァシプレクスカートリッジ AC— 22 0— 1 0) を用いて脱塩した。その後、強酸性陽イオン交換樹脂（Dowex 50W X2 . H ⁺ 型） 25ml のカラムにかけ水洗後、 INアンモニア 150ml で溶出する画分を集めて濃縮乾固させ、 5ml の水に再溶解させて pH を 6.0に合わせた。参考例 1 にて示した方法で調製したマルト卜リオース生成酵素を 53 ュニット（蛋白量として 1.2mg ) 添加して 40°Cで 4時間インキュベー卜した。マルトトリオースの生成を T L Cで確認後、再度上記と同様のイオン交換樹脂処理を行つた。非吸着画分と洗浄画分初流を集めて再度脱塩処理を行い 20ragのマルトトリオースを得た。 T L C的に単一スポットで H P L C純度は 8 9 %であった。

実施例 1 0

蒸留水 lralにサンオリゴ 5 ， 6 (参松工業社製） 227rag を溶解させて次に 2N-水酸化ナトリウム ΙΟΟ ζ Ι 、酢酸アンモニゥム 1.5g を添加した。溶液が均一になったところでメタノールを加え、シァノ水素化ホウ素ナトリウム 630ragを加えて室温で 62 時間反応した。 6N塩酸で中和後、旭化成社製卓上脱塩装置マイクロァシライザ— G 1 (ァシプレクスカートリッジ A C— 2 2 0 - 1 0 ) で脱塩した。その後、強酸性陽イオン交換樹脂（Dowex 50W x2 、 H ⁺ 型） 50ml に吸着させ水洗後、 1Nアンモニア 300mlにて溶出する画分を集めて濃縮乾固した。これを 5ml の水に再溶解させて p Hを 6.0に合わせて参考例 1 にて示した方法により調製したマルトトリオース生成酵素を 53 ュニット（蛋白質量にして 1.2i»g) 添加して 40 てで 2 時間インキュベートした。マルトトリオースの生成を確認してから反応液を上記の条件と同様に樹脂処理して非吸着画分と洗浄画分初流を合わせた。これを再度脱塩処理して 55.7mg のマルトトリオースを得た。 H P L Cで 9 7 %の純度であった。実施例 1 1

馬鈴薯を原料として実施例 8に記載されているのと同様の方法で得られた還元末端酸化液化澱粉を 720rag とり 9.3ralの蒸留水に溶かし、 0.5M酢酸緩衝液（p H6.0 、 0. IMC a C 1 ₂ を含有） 500 1 及び参考例 2に示した方法で調製したマルトテトラオース生成酵素 (53ュニ、)、ト Znil) 250 β 1を添加して 30でで反応させた。 H P L C分析の結果、純度は 8 4. 8 %であり収率は 4 5. 6 %であった。実施例 1 2

サンオリゴ 5 · 6 (：.参松工業社製） 10gを蒸留水 190mlに溶解させて参考例 3で記載の方法で調製した 5 %パラジウム—カーボン触媒全量を加えて、 50で、 p Hは 9-10に 10N 水酸化ナトリウムで保ちながら空気を 41inl /min で吹き込みながら 13 時閭攪拌した。この反応液を濾過、水洗した後、濾液を 200mlに濃縮した。 Ρ Η4.Ό に調整して /5—ァミラ一ゼ（長瀬産業社製、大豆由来、 500 zl 、 1670ュニット）を加え、 40^eC、 7 時閭反応させた。反応液を旭化成卓上脱塩装置マイクロァシライザ一 G 3 (ァシプレクスカートリツジ AC— 22 0 — 4 0 0 ) で脱塩と ^—ァミラーゼ切断残渣の除去を行った。 HP L C分析により 2.4g のマルト一スの生成を認めた。純度は 9 2. 5 %であった。一方酸化を行わないサンオリゴ 5 • 6に /8—アミラ一ゼを作用させるとマルト一スの純度は 7 0 %でめつ 7こ。

実施例 1 3

臭素 88mgを 0.2N NaOH 10ml に溶解させ 10N- N a OHでpH を 13 に調整後、マルトペンタオース（生化学工業社製） 0.46'gを添加して共栓をして室温で一夜攪拌した。この反応液を電気透析（旭化成工業社製、マイクロァシライザ一 S 1 , ァシプレクス力一トリジ AC- 1 1 0 - 1 0 ) にかけ脱塩後、 0.2M酢酸緩衝液（ p H5.0 ) 0.5ml及び実施例 1 2で使用したのと同じ /3 -アミラーゼ

0.5mlを添加し、 40でで一夜反応した。これを H P L Cにより分析した結果、マルト一スの純度 9 7. 1 %、生成率 3 6. 9 % (理論値 4 3. 5 であった。

実施例 1 4

コーンスターチ 4.5kgを蒸留水 10.35リットル、 1M C a C 1 ₂ • 2 H 2 0溶液 150ml に懸濁させ 3 0 % (W/W) スターチミルクとし.、さらに α—アミラーゼ 12ml (シグマ社製、バチルスリツケニフォルミス由来、コーンスターチ lg 当り 80 ュニットを添加）を加え 90でで 50分間液化した。（この液は D. E . 値が 3.7であつた。）その後、 121 °C, 10分間オートクレーブ処理して α—ァミラ —ゼを失活させた。続いて、プルラナ一ゼ「D E - 250 」天野製薬社製） 320ral (コーンスターチ lg 当り 17.78 ュニット）を加え、 50-55 でで 16時間反応させた。（この時の D. E. 値は 8.2 であつた。）この反応液の 5ml をとり、さらに水 5ml を加え pH 11.1 に調整した有効塩素濃度、約 8.5-13.5 %の次亜塩素酸ナトリゥム溶液 (アンチフオルミン、半井化学社製） 1.25IB1を水で 2倍に希釈して、 INN a OH溶液で p Hを 11.05— 11.25 、液温を 40 に保ちながら加えた。その後、 40てで 2時間反応させた後、亜硫酸ナトリゥ厶 200ragを加え、 5 分閭攪拌した後、 3N塩酸で p Hを 6.54 に調整した。この液を電気透析器（旭化成工業社製、マイクロァシライザ -S I , ァシプレクスカートリッジ A C - 1 1 0— 1 0 ) にかけた後、 pHを 5から 6に調整して、実施例 1 2で使用したのと同じ /S - アミラーゼ 0.5ral を添加して 4(TCで 18時間反応させた。反応液中の沈澱を遠心分離で除去後、限外濾過（ミリポア社製、ウルトルラフリ一 C 3 LCC) にかけその濾液を H P L Cにて分析した結果、生成したマルト一スの純度 9 5. 6 %、収率は 6 7. 8 %であった。実施例 1 5 ·

実施例 1 4で得られた 3 0 % (W/W) のコーンスターチ液化反応液（D. B. 値は 8.2 ) の 20 m 1をとり、 ION N a◦ H 0. lm I を加え p Hを 11.5 に調整した。液温 26で、 3NN a OHで p Hを 11.1— 11.6に保ちながら有効塩素 8. 5 - 1 3. 5 %の次亜塩素酸ソーダ（アンチフオルミン、半井化学社製） 4ml を除々に滴下した。その後、 26でで 5時閭反応させた。実施例 1 4と同じように 3 -ァミラーゼを反応させてマルトース純度 9 9. 1 %の反応液を得た。収率は 3 7. 8 %であった。

実施例 1 6

実施例 1 4で得られた 3 0 % (W/W) のコーンスターチ液化反応液（D. B. 値は 8.2 ) の 20ml をとり、 ION N a 0 H 0. lral を加え pHを 10.7 に調整した。液温 40で、 ION Na OHで pHを 10.7— 11.4に保ちながら有効塩素 8. 5 - 1 3. 5 %の次亜塩素酸ソーダ（アンチフオルミン、半井化学社製） 4ml を除々に滴下した。その後、 40でで 3時間反応させた。反応後、 .饞塩酸で《[を 5.8に合わせ実施例 1 2で使用したのと同じ -アミラーゼ 1.2mlを添加して 40 で、 18時間反応させマルトース純度 9 9. 3 %の反応液を得た。収率は 5 5. 7 %であった。

実施例 1 7

実施例 1 4で得られた 3 0 % (W/W) のコーンスターチ液化反応液（D. E . 値は 8.2 ) の 20 ml をとり、 ION N a 0 H 0. lm] を加え p Hを 10.7 に調整した。液温 40て、 ION N a OHで p Hを 10.7 - 11.4に保ちながら有効塩素 8. 5 1 3. 5 %の次亜塩素酸ソ一ダ（アンチフオルミン、半井化学社製） 4ml を除々に滴下した。その後、 40でで 3時間反応させた。反応後、濃塩酸で p Hを 5.8に合わせ実施例 1 2で使用したのと同じ 3 -アミラーゼ 1.2mlと実施例 1 2で使用したプルラナ一ゼ 0. lmlを同時に添加して 55 て、 3 時間反応させマルト一ス純度 9 9. 0 %の反応液を得た。収率は 7 1. 9 %であった。

実施例 1 8

実施例 8で得られた酸化液化澱粉液を凍結乾燥したものの 2 g をとり、適当な水溶液として陰イオン交換樹脂（Dowex 1 X2， OH 一型） 3 g に吸着させ、水で充分洗浄した。樹脂 1 mlあたり 2 5 1 mg の酸化液化澱粉が吸着された。この樹脂の 1.3 nilを外とう管つきのカラム（ ø 9 mrax 1 2 cm) につめ、 5 raiの水と実施例 1 2で使用したものと同じ 3—アミラーゼを 8 // 1加えて 4 0てで 5時間循環させながら反応した。反応液を採取し、 H P L C分析により純度 1 0 0. 0 %のマルト一スが 1 0 8 rag (収率 4 3 % ) 得られた。

実施例 1 9

実施例 1 7 と同様にして 5 の次亜塩素酸ソ一ダで酸化したコーンスターチ液化物を電気透析器（旭化成工業社製、マイクロァシラィザ一 SI ァシブレックスカートリッジ AC-110 - 10) に力、け、更にイオン交換樹脂（Dowex 1 2, OH ― 型）に充分に吸着させ、樹脂 l ffllあたり 1 1 2 ragの上記酸化物が吸着したものを得た。このものの 1 mlを、実施例 1 8と同様に外とう管付のカラムにつめ、 β - アミラーゼでマルト一スを生産させたところ、 9 9. 6 %のマルトースを 2 5 mg得た。

実施例 2 0

実施例 8 と同様にして得られた馬鈴薯澱粉の液化酸化物を（D o w e - 1 X 2 , 0H_ 型）に充分吸着させ、樹脂 lralあたり 2 3 3 mgの上記酸化物が吸着したものを得た。この lralをとり、実施例 1 8と同様に外とう管付のカラムにつめ、グルコアミラーゼ（生化学工業社製、リゾブス二べウス由来、 3 9. 4 u/mg) 1. 3nigを加え 4 0でで 1 6時間循環させながら反応した。反応液を採取し、 HP L C分析により、純度 1 0 0. 0 %のグルコース 5 5 ragを得た。実施例 2 1

実施例 1 5で得られた高純度マルトース含有反応液 1 0m 1を遠心分離して得られた上澄液の 1 m 1を強酸性イオン交換樹脂ダウェヅクス 5 0 WX 2 (N a ⁺型、 5 0— 1 0 0メッシュ）のカラム（直径 1. 5 cm、長さ 2 3. 5 c m) を通過させ、続いて水で溶出した。デキストリン等の高分子化合物、 -アミラ一ゼ反応後切断された形で残存する還元末端の酸化された糖類および無機物は、先に溶出しマルトースと容易に分離できた。マルトース面分を減圧下に濃縮乾固し固型物中のマルトース純度が 99.3%である高純度マルトース 5 8 m gを得た。

Claims

請求の範囲

1 . 任意の鎖長を有する糖類又はその混合物に対して、糖転移酵素を使用することなくその糖類の還元末端を修飾したのち、このものに特定の鎖長の糖鎖をェキソ型に切り出す酵素を作用させて目的とする特定の鎖長の糖類を生成させ、その後その目的とする特定の鎖長の糖類を取得することを特徴とする糖類の製造法。

2 . 任意の鎖長を有する糖類が、澱粉、化工澱粉又はこれらの加水分解物である請求項 1記載の糖類の製造法。

3 . その糖類の還元末端を修飾する方法が、その糖類の還元末端を修飾する機能を有する化合物を作用させることである、請求項 1記載の糖類の製造法。

4 . その糖類の還元末端を修飾する方法が、任意の鎖長を有する糖類又はその混合物の還元末端を酸化することである、請求項 1記載の糖類の製造法。

5 . その糖領の還元末端を修飾する方法が、任意の鎖長を有する糖類又はその混合物の還元末端に置換又は無置換のァミノ基を導入することである、請求項 1記載の糖類の製造法。

6 . 任意の鎖長を有する糖類又はその混合物に対して、糖転移酵素を使用することなくその糖類の還元末端を修飾したのち、このものをィオン交換樹脂に吸着させ、しかる後に特定の鎖長の糖鎖をェキソ型に切り出す酵素を作用させて目的とする特定の鎖長の糖類を生成させ、その後生成した目的とする特定の鎖長の糖類をイオン交換樹脂から分離することを特徴とする糖類の製造法。

7 . 任意の鎖長を有する糖類が、澱粉、化工澱粉又はこれらの加水分解物である請求項 6記載の糖類の製造法。

8 . その糖類の還元末端を修飾する方法が、その糖類の還元末端を修飾する機能を有する化合物を作用させることである、請求項 6記載の糖類の製造法。

9 . その糖類の還元末端を修飾する方法が、任意の鎖長を有する糖類又はその混合物の還元末端を酸化することである、請求項 6記載の糖類の製造法。

1 0 . その糖類の還元末端を修飾する方法が、任意の鎖長を有する糖類又はその混合物の還元末端に置換又は無置換のァミノ基を導入することである、請求項 6記載の糖類の製造法。

1 1 . その目的とする特定の鎖長の糖類を取得することが、イオン交換樹脂、電気透析器、又はこれらの組合せによってその目的とする特定の鎖長の糖類以外の糖類を除去することである、請求項 1 の糖類の製造法。