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WO1982003087A1 - Marqueurs genetiques selectifs pour cellules eucaryotes, procede de mise en oeuvre de tels marqueurs et application des cellules contenant un tel marqueur a la fabrication de proteines determinees apres leur transformation par un adn correspondant - Google Patents

Marqueurs genetiques selectifs pour cellules eucaryotes, procede de mise en oeuvre de tels marqueurs et application des cellules contenant un tel marqueur a la fabrication de proteines determinees apres leur transformation par un adn correspondant Download PDF

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Publication number
WO1982003087A1
WO1982003087A1 PCT/FR1982/000036 FR8200036W WO8203087A1 WO 1982003087 A1 WO1982003087 A1 WO 1982003087A1 FR 8200036 W FR8200036 W FR 8200036W WO 8203087 A1 WO8203087 A1 WO 8203087A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
dna
marker
gene
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/FR1982/000036
Other languages
English (en)
Inventor
Pasteur Inst
Original Assignee
Garapin Florence
Garapin Axel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Garapin Florence, Garapin Axel filed Critical Garapin Florence
Publication of WO1982003087A1 publication Critical patent/WO1982003087A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Definitions

  • Selective genetic markers for eukaryotic cells process for using such markers and application of cells containing such a marker to the production of proteins determined after their transformation with a corresponding DNA.
  • the invention relates to a new, dominant genetic marker capable of penetrating a wide variety of eukaryotic cells, more particularly those originating from higher organisms and of giving them a stable specific character allowing the easy detection of the cells thus transformed, when these these are placed in specific culture media.
  • the invention therefore also relates to a method for detecting eukaryotic cells to which a particular character has thus been conferred, as well as the application of such cells to the production of specific proteins, prokaryotes, eukaryotes or virals, when these cells have previously been transformed by a foreign DNA fragment containing a DNA sequence, such as a gene or cDNA coding for said protein.
  • the enzymatic activities induced by these DNAs more particularly thymidine kinase and adenine phosphoribosyl transferase can be detected easily.
  • the techniques used remain difficult to implement, however, since they involve the use of cultures of cells having characteristic mutations, in particular cells which have undergone an induced or induced mutation affecting the corresponding gene.
  • the detection technique using a herpes virus thymidine kinase gene can be carried out in type L mouse cells first modified by an induced or induced mutation affecting their endogenous thymidine kinase genes , as already described by M. WIGLER et al. ("Cell.”, Vol. II, 223-232, 1977).
  • TK cells thymidine kinase genes
  • HAT medium containing hypo ⁇ anthine, aminopterin and beyond. thymidine
  • mutant cells used in the labeling tests generally do not have the stability character of mouse TK- L cells. The character acquired by the mutation produced is quickly lost during the successive cell divisions of the cells in question.
  • transposen of signs DNA elements of which many representatives are well known, which contain a gene coding for a "transposase”, allowing them as well to integrate into a first DNA, in particular that of the genetic heritage of a first type of cells , than detaching from it to transpose or incorporate into another DNA, for example that of a bacteriophage.
  • the object of the invention is to make eukaryotic cells, and more particularly to those originating from higher organisms, applicable to labeling techniques involving resistance genes or analogs to those of antibiotics which, such as G418, are revealed or will prove to be capable of inhibiting the development of these eukaryotic cells.
  • the invention naturally also has for its object the methods using such markers, as well as the application of the cells thus labeled to the use of cultures producing particular proteins, after their prior transformation by a DNA containing the sequence coding for such a specific protein.
  • the marker according to the invention consists of DNA, circular or not, containing a eukaryotic promoter or recognized by its capacity to direct the expression in a eukaryotic cell of a gene which is normally associated with it and a DNA sequence coding for an enzyme capable of inactivating an antibiotic, such as the antibiotic G418, linked to this promoter and under its direct control.
  • the DNA sequence coding for the inactivation enzyme is chosen from those which code for an aminoglycoside 3'-phosphotransferase
  • the process according to the invention for labeling eukaryotic cells is characterized by bringing these cells into contact with the marker according to the invention under conditions suitable for allowing the transformation of at least part of these cells and for putting them in culture in a medium suitable for their development and containing an antibiotic, such as the antibiotic G418, normally toxic towards these cells and capable of being inactivated by the inactivation enzyme, in particular an aminoglycoside 3'-phosphotransferase synthesized by the above DNA sequence '.
  • an antibiotic such as the antibiotic G418, normally toxic towards these cells and capable of being inactivated by the inactivation enzyme, in particular an aminoglycoside 3'-phosphotransferase synthesized by the above DNA sequence '.
  • the marker according to the invention comprises, on the one hand, a part originating from a prokaryotic DNA, such as phage or preferably plasmid comprising an origin of replication allowing its cloning in a bacterial culture, and, on the other hand , incorporated into this part of prokaryotic DNA, the aforementioned eukaryotic promoter or capable of directing the expression of an associated gene in a eukaryotic cell, as well as said DNA sequence coding for the inactivation enzyme, in particular an APH ( 3 ') under the direct control of this promoter.
  • a prokaryotic DNA such as phage or preferably plasmid comprising an origin of replication allowing its cloning in a bacterial culture
  • the promoter is that under the control of which the transcription of the thymidine kinase gene is exerted in the cells from which it originates, and the gene coding for APH (3 ′) -II is a gene for resistance to kanamycin and / or to neomycin, such as that carried by the transposon well known under the designation "Tn5".
  • promoters such as those of the genetic markers previously used and which have been identified above, or alternatively promoters belonging to viruses known for their ability to infect the eukaryotic cells used, for example.
  • promoters such as those of the genetic markers previously used and which have been identified above
  • promoters belonging to viruses known for their ability to infect the eukaryotic cells used for example.
  • any sequence capable of synthesizing an enzyme endowed with inactivation properties vis-à-vis the antibiotic which will be used may be used.
  • the culture medium used to operate the selection of the cells in which the genetic marker will have been incorporated in the case where the antibiotic incorporated in the medium is constituted by the antibiotic G419, it is advantageous to have recourse to phosph ⁇ rylatlon enzymes of the APH type (3) already mentioned. It goes without saying that one can have recourse to all other types of DNA sequences synthesizing an enzyme having a similar inactivation capacity of the antibiotic, for example by acetyiation of the corresponding hydroxyl functions of the antibiotic.
  • the DNA sequence of the genus in question can come from any source appropriate.
  • the advantage of having more specifically the sequence coding for the enzyme will result from the explanations given below, as regards the preferred genetic markers of the invention.
  • the first nucleotide pairs of the DNA sequence coding for APH (3 ') or the like are made as close as possible to the last pairs of promoter nucleotides in the direction of transcription, in particular at a distance, expressed in number of pairs of nucleotides, less than 1,000, more preferably 500, or even less than 100 pairs of nucleotides. It has in fact been observed that the reduction of this distance, in particular by the use of appropriate deletions, has "the effect of a considerable increase in the transformation yield, as will appear during the description below of preferred markers conforming to the invention.
  • the marker DNAs of the invention also contain, downstream of the APH gene (3 ′), a polyadenylation site, this latter being preferably also made as close as possible, to the last pair. of nucleotides of the gene coding for APH (3 ′).
  • the distance expressed in number of base pairs between the end of this latter gene and either the polyadenylation site or the "stop codons" for translation of this gene is less than 1,000, this preference at 500 base pairs or even less than
  • the labeling yield can be further increased if the marker DNA is given a eukaryotic origin of replication by incorporation of a fragment containing it, such as, for example, repetitive fragments of the DNA of the virus known under the designation " Saimiri herpes virus ".
  • a fragment containing it such as, for example, repetitive fragments of the DNA of the virus known under the designation " Saimiri herpes virus ".
  • Saimiri herpes virus The existence of episcmal forms of this virus and DNA subunits of 1.4 kilobases in multimeric forms in corresponding defective genomes suggests that these subunits contain an origin of replication.
  • Preferred markers according to the invention are obtained by modification of the plasmids pAGO or pFG5, themselves derived from pBR322.
  • the plasmid pAGO is preferred in that it comprises, in addition to a TK gene, two additional resistance factors to ampicillin and to tetracycline.
  • the structure of pAGO is shown schematically in Figure 1 of the drawings.
  • the TK gene is notably represented therein schematically by a circular arc in broken lines and various restriction sites more particularly taken advantage of in the construction of preferred markers in accordance with the invention, the description of which will be given below.
  • the arrow T of the TK gene gives the direction of transcription.
  • the point O corresponds to the EcoRI site of this plasmid.
  • the EPR and PAS sites correspond to the positions of the region of the promoter of the TK gene and of the site of polyadenylation of the TK gene respectively:
  • the preferred genetic markers according to the invention are those which result from the recombination of pAGO and of the transposon Tn5 (described by JORGENSEN, HA, ROTHSTEIN, SJ and REZNIKOFF, V;. S. (1979), "Kolec. Gen. Genêt.” 177, 65-72), whose figure 2 provides a schematic representation and which were obtained from the bacterial plasmid ColEl Tn5 contained in the strain of E.
  • the preferred antibiotic used in the above-mentioned detection methods is certainly constituted by the antibiotic G-418, the ability of which has been recognized to penetrate into most eukaryotic cells and destroy them by a toxic process. It goes without saying that another antibiotic can be used, provided that it proves to be toxic in the same way with regard to the type of eukaryotic cells which will be used in the detection process. will then be applied under the conditions of the invention.
  • the corresponding marker must consequently contain a DNA sequence capable of synthesizing an inactivation enzyme capable of more particularly inhibiting the antibiotic chosen. Additional characteristics of the invention will become apparent during the description of preferred markers whose constitutions and constructions schematically result from Figures 2 to 13 of the drawings.
  • the bacterial strains used for the transformations were E. co li 1 1 06 (803r- k m- k ) and 1107 (803r- k m + k ) (MURRAY, NE, BRAMHAR, WJ and MURRAY, K. ( 1976), "Molec. Gen. Genêt.”, 1 50, 53-61).
  • the eukaryotic strains used were 1D clones of L TK- mice, Vero chimpanzee cells, MKO cells and HeLa human cells. The cultures of these cells were carried out in an EAGLE medium modified by DULBECCO, supplemented with 5 or 10% calf serum.
  • the transformed cells expressing the enzyme APH (3 ') - II were selected in a medium containing from 10 to 400 micrograms per milliliter of the antibiotic G418.
  • the TK cells were selected from the HAT medium, also under the conditions described by COLBEREGARAPIN and Coll. For the cloning of the cells, the individual colonies were isolated at random and cultivated until producing confluent cultures.
  • the promoter used comes from the "eukaryotic promoter region" originating from the HSV1 TK EPR gene (hereafter called EPR) and which in the plasmid pAGO is located between the PvuII and Hindi site at the start of the TK gene (FIG. 1).
  • EPR comprises at the 5 ′ end of the gene two TATA regions (TATA boxes), one of which is now known to play an important role for the transcription of the TK gene (MC KNIGHT, SL (1930) Nucl. Acids Res., 8, 5949-5964).
  • a recombinant is produced by ligation on the one hand of a DNA fragment HincII-HincII of 2480 base pairs in which is incorporated the gene for resistance to kanamycin (schematically represented by the arrow "kana r ”) which normally contains transposon Tn5, which has been shown diagrammatically in FIG. 2, and, on the other hand, the plasmid pAG0 opened at the Hindi site by partial digestion in the presence of this restriction enzyme.
  • the recombinant obtained was used for the transfection of a strain of Es che r ich ia co li 1106 (803 r- k m k -) the colonies resistant to the three antibiotics are kanamycin, t.tracycline and 1 'ampicillin.
  • Two recombinant plasmids, pAG-40 and pAG45 were thus obtained. Restriction analysis shows that the 2480 base pair fragment. from Tn5 was incorporated into the HincII site located in the sequence TKla position 2301 de-pAGO (Fig.1). The orientation of this fragment was determined by analysis of these plasmids with the mcyen of restrictions by Xhol and EcoRI.
  • the Xhol site of Tn5 is located near the 5 'end of the APH (3') - II gene. It can be seen (FIG. 3) that the Xhol site is very close in pAG-40 to the Hindi site, itself contiguous to the TK EPR region. On the contrary, the fragment is in the opposite direction in the plasmid ⁇ AG45.
  • the plasmid pAG40 was therefore recognized as suitable for expression in eukaryotic cells. This plasmid which turns out also contain the bacterial promoter of APH (3 ') - II was able to resist up to 60 ⁇ g / ml kanamycin.
  • the distance in pAG40 between the EPR and the first tripletAUG of the gene coding for APH (3 ') - II is approximately 1500 base pairs.
  • a new recombinant was formed between, on the one hand, a BglII fragment located in pAG40 between the coordinates 3670 and 4795 of its restriction map, and on the other hand pAGO, which had been open at the BglII site of the TK DMA fragment.
  • the plasmids obtained, pAG50 (Fig.
  • pAG55 which differ from pAGO by the presence of an insert of 1125 base pairs delimited by BglII ends, the closest to the latter being at a distance of about 130 pairs of bases of the EPR region.
  • SmaI restriction by means of the enzyme SmaI and by analysis on gels, it was determined that the 5 ′ end of the APH gene (3 ′) - II was connected to the TK ⁇ PR, while the insert was integrated into the opposite direction in the plasmid pAG55. It is therefore the plasmid pAG50 which was chosen for obtaining the expression of the enzyme under the control of the regulatory region of TK.
  • the molecular weight of pAG50 (like that of pAG55) is 7490 ⁇ 50 base pairs.
  • the TK polyadenylation site (NOT in the drawings) is located in pAG50 Immediately downstream of the SmaI site in the direction of transcription of the TK gene (in the region of coordinates 4608 in Figure 4.
  • the distance separating the 3 'end of the APH gene (3') - II and the TK polyadenylation site (McKNIGHT ) has been reduced by 1365 base pairs.
  • the TK codc ⁇ tcp TGA is located at a distance corresponding to 21 base pairs downstream of the Smal site.
  • the position of the stop codon of APH (3 ') - ÎI is not exactly known, but it is very close to it
  • the new plasmid obtained has been designated by the expression pAG60 (FIG. 5) and has a length corresponding to approximately 6,150 base bones.
  • pAG60 FOG. 5
  • pAG60 pAG60
  • the defective genome mentioned above of the DNA of the Herpes Saimiri virus was used, this genome of staff comprising a multimeric form of a subunit of 1.4 kilobases which is believed to contain an origin of replication.
  • This workforce gene (from strain 11 of the Herpes Saimiri virus, described by Fleckenstein et al. (1979) Biochim.
  • the antibiotic G-418 has an activity of synthesis of a large variety of inhibitory proteins. The toxicity of this antibiotic has therefore been tested against L mouse cells. TK-, clone ID, of chimpanzee cells (uncloned or cloneVCI0) and of OMK cells as well as with respect to human HeLa cells. The number of cells doubled in cultures in the first 48 hours after the addition of G-418. At a concentration of 25 ⁇ g / ml of antibiotic the ID cells did not become detached for a month. Using the usual antibiotic concentration (150 ⁇ g / ml) the ID cells died and detached from the plaques within 10 days.
  • L TK- mouse cells The clone ID of L TK- mouse cells is highly sensitive to transfection, as shown by WIGLER et al. (1978) Cell, 14, 725-731). These cells were therefore chosen to study the transfer and expression capacity of the selective marker of the invention.
  • the transfections were carried out as indicated above in bottles each containing approximately 3.10 6 cells.
  • the selective agent G-418 was added 48 hours after transfection, at a concentration of 150 ⁇ g / ml. Colonies were counted three weeks after transfection. The results are presented in Table I below.
  • the table shows that transformed colonies resistant to the antibiotic G-418 were obtained after transfection with the recombinant plasmids containing the APH (3 ') - II gene.
  • Relatively low transformation yields of the order of 1 to 3 colonies per ⁇ g of DNA, were obtained with the bacterial transposon Tn5 and the plasmids pAG45, pAG40 and pAG55.
  • pAG50 in which the TK promoter region has been brought much closer to the 5 'end of the APH (3') - II gene (20 to 30 colonies per ⁇ g).
  • the antibiotic resistance phenotype G-418 is stable under the culture conditions used for the selection. It is the same again, even when the cells are cultivated in the same medium, but in the absence of the antibiotic. The cells do not become sensitive to the antibiotic G-418, even after several passes. Transformation by recombinant plasmids of monkey cells and human cells.
  • the HSVl TK gene was used because of its easy detection capacity.
  • the circularized plasmids pAG6 ⁇ and pFG24 carrying respectively the APH (3 ') - II and TK genes respectively were used in order to effect co-transformations or simultaneous transformations of TK-1D cells.
  • the "two plasmids were used in mass proportions corresponding to 5 AFH (3 ') - II for 8 TK.
  • This test is obviously representative of the possibilities offered by the selective genetic markers according to the invention, of locating eukaryotic cells transformed by another DNA, the expression of which could be sought, such as for example a DNA or cDNA coding for a protein. , such as insulin, human interferon, etc., or a viral protein intended for the production of vaccines, such as the HBs antigen of the viral hepatitis B virus, etc.
  • the transformation yield and of detection is obviously likely to be more important if recourse is had, not to a co-transformation of the cells, as described above by way of example, with a marker plasmid conforming to invention and by a separate plasmid carrying the DNA sequence whose expression is sought, but to a transformation by the marker plasmid according to the invention itself, into which the tooth DNA sequence will have been inserted beforehandthe expression is searched.
  • This last insertion can, in the case of the preferred plasmids which have been described above, be carried out with advantage in one of the sites containing the factors of resistance to tetracycline and to ampicillin, which they have in common with pAGO and which were not affected by the modification which led to the plasmids according to the invention.
  • markers according to the invention For purposes of illustration, from the foregoing, a preferred application of the markers according to the invention will be described, more particularly their use as vectors containing an insert derived from a fragment of the genome of the viral hepatitis B virus, containing more particularly the S gene thereof and the genetic information to allow its expression in eukaryotic cells. Even if this is a preferred case, it is naturally understood that the invention cannot be limited thereto.
  • FIG. 7 is in fact a representation of the plasmid pAG 60, therefore very similar to that indicated in FIG. 5.
  • additional sites of restriction enzymes which will be used in the construction of the final marker.
  • These are two Sph I sites located approximately 565 and 2,827 nucleotides respectively from the Eco RI site (represented by the letter “O” in the figures).
  • the approximate position of an additional Pvu II site has been specified, in particular in the kanamycin resistance gene "kana r ", a site which is also used in the construction of the modified plasmid marker described below.
  • FIG. 8 schematically represents a fragment delimited by Rsa I and Hinc II ends (hereinafter called Rsa I-Hinc II fragment), as it can be extracted from the plasmid pCP 10 described in European patent application No. 81,400,634, extraction which comprises the stages which consist in treating under conventional conditions said plasmid with the two corresponding restriction enzymes and in recovering the corresponding fragment, more particularly that comprising of the order of 820 base pairs and which happens to be provided with the above extremities.
  • the Rsa I-Hinc II fragment of FIG. 8 is inserted into the Pvu II site located in the "kana r " gene of pAG 60, this genetic recombination being rendered particularly easy due to the blunt ends of the fragments to recombine, which is carried out under conventional conditions in the presence of a ligase.
  • the resulting plasmid XAP I is shown diagrammatically in FIG. 9.
  • the fragment represented in FIG. 10 is re-extracted and delimited, on the one hand, by the Sph I site which in the Rsa I-Hinc II fragment of the figure 8 was a short distance from the Hinc II end and on the other hand the Sph I site at the position of the order of 3 017 (opposite the Eco RI site identified by the sign "0" in the fig) of XAP I.
  • the fragment obtained contains a large proportion of the S gene and of the genetic information necessary for its expression in eukaryotic cells.
  • This fragment is then reinserted into the plasmid pAG 60, more particularly in its Sph I site at position 565, which leads to the plasmid pAG 61 of FIG. 11.
  • this pla-smide does not contain all of the genetic information necessary for the expression of the S gene, it is preferable to carry out an additional genetic recombination of this plasmid with a complementary sequence extracted from DNA-HBV, represented in FIG. 12 and delimited by ends Xba I and Taq I at positions 2 938 and 1 276 according to the numbering of GALIBERT et al.
  • Plasmid pAG 66 is thus obtained, which then contains a larger fragment of DNA HBV, extending from position 680 to position 1276 according to the numbering of GALIBERT et al (via site 2938).
  • This marker plasmid containing an insert, itself containing the entire hepatitis B virus S gene as well as the genetic information necessary for its expression in eukaryotic cells is only one example of the numerous markers -vectors allowing the recognition of those of eukaryotic cells transformable by the latter. It goes without saying that all forms of inserts extracted from DNA HBV can be used, for example those described in European patent applications 81 400 634, 0 013 828; 0 020 251 and 81 00577. In particular, recourse may be had to the insertion of any sequence extracted from HBV DNA containing all the genetic information necessary for the expression of the S gene, however excluding the parts of HBV DNA which can be considered responsible for the infectivity of the viral genome.
  • the invention applies naturally in the same way and under conditions analogous to the transformation and detection of higher eukaryotic cells transformed by a DNA or cDNA coding for any other determined proteins.
  • the markers according to the invention are of very particular interest for the transformation of eukaryotic cells of higher organisms, more particularly animal or human cells, or also plant cells.
  • the invention relates more particularly to the application of the markers as defined above and in which a nucleic acid fragment has been inserted comprising all the genetic information necessary for its replication and its expression in eukaryotic cells, to the production of the corresponding expression product, this application involving a process comprising the culture of the cells thus transformed and the recovery of said expression products, either from the cells, or from the medium when the expression product, in particular protein, is excreted in the culture medium.
  • the invention lends itself in particular to the production of proteins having immunogenic properties, capable of inducing the production of antibodies, capable in turn of neutralizing the hepatitis B virus, and this all the more that a large part of the protein produced is excreted in the culture medium. It can be recovered from it by conventional purification techniques, using either physicochemical separation methods or immunological methods, for example affinity chromatographies on a substrate on which have previously been attached corresponding antibodies.
  • the selective system which has been described has a number of particularly interesting characteristics and advantages.
  • the selection does not imply the use of special metabolic pathways or nucleotide synthesis pathways special, contrary to what the prior techniques require using as markers TK, APRT, XGPRT or DHFR genes.
  • the method according to the invention can also be applied to the study of the relative efficiencies of different promoters, whether these efficiencies are expressed in transformation yields with respect to a given type of cell line or with respect to the more or less important number of eukaryotic cells of different origins that can transform each of the promoters tested. It is in this respect interesting to note the very particular effectiveness of the promoters which normally control the transcription of the TK genes.
  • the invention therefore provides markers which can be expressed in various mammalian cell lines, particularly in cell lines devoid of any oncogenic character, such as, for example, the heterolooid Vero cell lines of non-human primates, such as those described by PETRICCIANI, JC, KIRSCHSTEIN, RL, HINES, JE, WALLACE, RE and MARTIN, DP (1973), "J. Natl. Cancer Inst.” 51, 191-196, the latter cells having been found to be non-tumorigenic, even when tested in monkeys subjected to immunosuppressive treatment.
  • any oncogenic character such as, for example, the heterolooid Vero cell lines of non-human primates, such as those described by PETRICCIANI, JC, KIRSCHSTEIN, RL, HINES, JE, WALLACE, RE and MARTIN, DP (1973), "J. Natl. Cancer Inst.” 51, 191-196, the latter cells having been found to be non-tumori
  • non-tumorigenic cells available in banks of cells of the ATCC CCL 81 type (Vero cells) or kidney cells of the vervet monkey or of other non-tumorigenic eukaryotic cells which are preserved in the American Type Culture Collection.
  • ATCC CCL 81 type Vero cells
  • kidney cells of the vervet monkey or of other non-tumorigenic eukaryotic cells which are preserved in the American Type Culture Collection.
  • the labeled cells obtained are therefore particularly useful for the synthesis of products intended for biological or therapeutic uses, whether these are polypeptide sequences corresponding to the HBs antigen of the viral hepatitis B virus, as more particularly envisaged above, or any other active ingredient in vaccines or other useful proteins, such as such as insulin or interferon.
  • the invention extends to all the equivalents of the various markers which have been described or defined above. In this regard, it is also important to make the following additional comments.
  • eukaryotic promoter known or recognized by its ability to direct the expression in a eukaryotic cell of a gene which is normally associated with it also extends to promoters associated with genes homologous in other types of cells or microorganisms, including promoters under the control of which there are viral genes which code for a protein homologous to that specified by the corresponding eukaryotic gene.
  • these are promoters associated with "complementation DNA”, in the sense given to this expression in European patent application No. 80400828 filed on June 9, 1980. In particular, it was makes use of such a promoter in the above example.
  • the invention naturally and generally relates to all the methods of labeling eukaryotic cells, characterized by bringing such cells into contact with a marker as defined above, under conditions suitable for allowing the transformation of at least part of these cells and by culturing these cells in a medium suitable for their development and containing an antibiotic inactivable by the enzyme for which codes the DNA sequence of the above marker.
  • the invention also relates to eukaryotic cells, in particular originating from monkeys or humans, more particularly suitable for the manufacture of vaccines and containing the marker according to the invention as a selective internal genetic marker.

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Abstract

Marqueur genetique selectif constitue par un ADN, circulaire ou non, contenant un promoteur eucaryote (EPR) et une sequence d'ADN tel qu'un gene de resistance a la kanamycine (kanar) codant une enzyme d'inactivation d'un antibiotique, tel que celui connu sous la designation G418, qui est capable de detruire des cellules eucaryotes, cette sequence etant liee au promoteur EPR. Ce marqueur est utilisable pour detecter les cellules eucaryotes transformees par un tel marqueur et qui, grace a celui-ci, peuvent se developper dans un milieu contenant l'antibiotique en question.

Description

Marqueurs génétiques sélectifs pour cellules eucaryotes, procédé de mise en oeuvre de tels marqueurs et application des cellules contenant un tel marqueur à la fabrication de protéines déterminées après leur transformation par un ADN correspondant.
L'invention concerne un nouveau marqueur génétique, dominant, susceptible de pénétrer dans une grande variété de cellules eucaryotes, plus particulièrement celles provenant d'organismes supérieurs et de leur conférer un caractère spécifique stable permettant la détection aisée des cellules ainsi transformées, lorsque celles-ci sont placées dans des milieux de culture spécifiques.
L'invention concerne donc également un procédé de détection de cellules eucaryotes auxquelles un caractère particulier aura ainsi été conféré, ainsi que l'application de telles cellules à la fabrication de protéines déterminées, procaryotes, eucaryotes ou virales, lorsque ces cellules auront au préalable été transformées par un fragment d'ADN étranger contenant une séquence d'ADN, telle que gène ou cADN codant pour ladite protéine.
Il est bien connu que l'une des difficultés les plus importantes à surmonter, à la suite d'une opération tendant à transformer par un tel ADN des cellules eucaryotes d'une culture effectuée dans les conditions appro- priées, réside dans la détection et l'isolement de celles des cellules eucaryotes dans lesquelles l'ADN aura été effectivement transféré, parmi les cellules en nombre. considérablement plus, important qui n'auront pas été affectées par ce même ADN. II n'a guère été envisagé jusqu'à ce jour de mettre à profit, dans des cultures de cellules eucaryotes, les techniques bien connues dans le domaine des cellules procaryotes, consistant à incorporer à celles des cellules procaryotes qui doivent être détectées, un facteur de résistance à un antibiotique et à réaliser une culture des cellules en cause dans un milieu approprié contenant l'antibiotique correspondant, seules les cellules marquées étant alors aptes à survivre et à former des colonies. Ces techniques n'ont cependant guère été jusqu'à ce jour transposées à des cultures de cellules eucaryotes, ne serait-ce que pour la raison que la plupart des antibiotiques ne sont pas susceptibles de pénétrer dans la plupart des cellules eucaryotes et/ou de les détruire par un processus toxique.
C'est pour remédier à cette difficulté que la plupart des essais de transfert de gènes dans des cellules eucaryotes ont été faits jusqu'à ce jour en mettant en oeuvre des marqueurs génétiques constitués par des fragments d'ADN, voire même les ADN entiers, du type de ceux qui sont connus pour leur capacité à pénétrer et à être exprimés dans des cellules eucaryotes. A ce type d'ADN appartiennent notamment ceux du virus dit "Herpès simplex Virus" du type 1 (HSV1), le gène de la thymidine kinase (TK), le gène de l'adénine phosphoribosyl transférase (APRT) et de la dihydrofolate réductase (DHFR), etc. ou de l'enzyme xanthine-guanine phosphoribosyl transférase (XGPRT).
Les activités enzymatiques induites par ces ADN, plus particulièrement de la thymidine kinase et de l'adénine phosphoribosyl transférase peuvent être détectées aisément.
Les techniques utilisées restent cependant d'une mise en oeuvre difficile, car elles impliquent l'utilisation de cultures de cellules présentant des mutations caractéristiques, notamment des cellules ayant fait l'objet d'une mutation induite ou provoquée affectant le gène correspondant. Par exemple, la technique de détection mettant en oeuvre un gène de thymidine kinase du virus de l'herpès, peut être réalisée dans des cellules de souris du type L d'abord modifiées par une mutation induite ou provoquée affectant leurs gènes de thymidine kinase endogène, comme cela a déjà été décrit par M. WIGLER et coll. ("Cell.", vol. II, 223-232, 1977). En outre, ces cellules doivent être cultivées dans des milieux spéciaux, par exemple en ce qui concerne les cellules présentant une déficience au niveau de leurs gènes de la thymidine kinase (cellules dites TK-),dans un milieu tel que celui connu sous le nom "milieu HAT" (contenant de l'hypoκanthine, de l'aminoptérine et delà. thymidine). Seules peuvent alors se développer dans un tel milieu les cellules TK- dont le patrimoine génétique aura été modifié par incorporation du gène TK du virus de l'herpès. Des techniques semblables ont été mises en oeuvre avec d'autres gènes. Cependant les cellules mutantes mises en oeuvre dans les essais de marquage ne présentent en général pas le caractère de stabilité des cellules L TK- de souris. Le caractère acquis par la rnutation produite se perd rapidement au cours des divisions cellulaires successives des cellules en cause.
Aux difficultés d'isoler les mutants appropriés, s'ajoutent donc de façon générale celles résultant de la perte rapide des phénotypes recherchés et la nécessité chaque fois de mettre en oeuvre des milieux de culture spécifiques.
Une autre voie d'investigation a récemment été ouverte par A. JIMENEZ et J. DAVIES dans un article intitulé "Expression of a transposable antibiotic résistance élément in Saccharomyce s " (Expression d'un élément transposable de résistance à un antibiotique dans Sacahara myc e s ) ("Nature", volume 287 du 30 octobre 1980, pages 869-871).
Ces auteurs ont mis en évidence la propriété que possède un antibiotique appartenant à la famille des aminoglycosides, ayant une structure proche de celle de la gentamicine, connue sous la désignation G418, d'inhiber le développement de certaines souches de levure, telles que Saccharomyce s ce re vi s iae - pour produire des colonies résistant à cet antibiotique dans un milieu de culture le contenant, après incorporation préalable, dans les cellules ayant donné naissance à ces colonies, d'un gène porté par un "élément transposable" ou "traπspcson" et codant pour l'aminoglycoside phosphotransférase (3')-I (APH(3')-!), cette enzyme étant apte à phosphoryler et inactiver un certain nombre d'antibiotiques du glycoside.
On rappellera que l'expression "transposen" de signe des éléments d'ADN dont de nombreux représentants sont bien connus, qui contiennent un gène codant pour une "transposase", leur permettant aussi bien de s'intégrer dans un premier ADN, notamment celui du patrimoine génétique d'un premier type de cellules, que de s'en détacher pour se transposer ou s'incorporer dans un autre ADN, par exemple celui d'un bactériophage.
Mais, comme l'indique également ces auteurs, la résistance des cellules de levure transformées par l'antibiotique G418 tend à se perdre lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu ne contenant plus les antibiotiques.
Le défaut de stabilité et la faible proportion de cellules effectivement transformées rendent cette technique difficilement transposable au marquage des cellules eucaryotes, surtout lorsque celles-ci proviennent d'organismes supérieurs. On sait que les phénomènes déjà très rares (inférieurs à 10-7)qu'ont représentés l'incorporation au hasard, dans les conditions décrites par ces auteurs, d'un gène procaryote dans 1 'ADN des levures mises en oeuvre lesquelles sont encore elles-mêmes proches des cellules procaryotes, et leur expression sous le contrôle d'un promoteur endogène, ne peuvent se produire que plus rarement encore à l'égard de cellules eucaryotes plus complexes, notamment celles provenant d'organismes supérieurs. L'invention a pour but de rendre applicables 1 des cellules eucaryotes, et plus 'particulièrement à celles provenant d'organismes supérieurs, les techniques de marquage mettant en jeu des gènes de résistance ou analogues à ceux des antibiotiques qui, tels le G418, se sont révélés ou qui se révéleront encore aptes à inhiber le développement de ces cellules eucaryotes.
Elle a encore pout but l'obtention de marqueurs génétiques sélectifs utilisables en rapport avec une grande diversité de cellules eucaryotes, y inclus celles provenant d'organismes supérieurs, autorisant une grande efficacité de transformation desdites cellules et leur conférant un caractère stable oui soit maintenu parmi les descendants des cellules transformées au cours de leurs divisions successives, sans qu'il soit besoin de toujours réaliser les cultures en présence d'un tel antibiotique.
L'invention a naturellement également pour but les procédés mettant en oeuvre de tels marqueurs, ainsi que l'application des cellules ainsi marquées à la mise en oeuvre de cultures productrices de protéines particulières, après leur transformation préalable par un ADN contenant la séquence codant pour une telle protéine déterminée.
Le marqueur selon l'invention est constitué par un ADN, circulaire ou non, contenant un promoteur eucaryote ou reconnu par sa capacité à diriger l'expression dans une cellule eucaryote d'un gène qui lui est normalement associé et une séquence d'ADN codant pour une enzyme capable d'inactiver un antibiotique, tel que l'antibiotique G418, lié à ce promoteur et sous son contrôle direct. Avantageusement, la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation est choisie parmi celles qui codent pour un aminoglycoside 3'-phosphotransférase
(APH(3')).
Le procédé selon l'invention de marquage de cellules eucaryotes est caractérisé par la mise en contact de ces cellules avec le marqueur selon l'invention dans des conditions aptes à permettre la transformation d'une partie au moins de ces cellules et de les mettre en culture dans un milieu approprié à leur développement et contenant un antibiotique, tel que l'antibiotique G418, normalement toxique à l'égard de ces cellules et susceptible d'être inactivé par l'enzyme d'inactivation, notamment une aminoglycoside 3'-phosphotransférase synthétisée par la susdite séquence d'ADN'.
Avantageusement, le marqueur selon l'invention comporte, d'une part, une partie originaire d'un ADN procaryote, tel que phage ou de préférence plasmide comprenant une origine de réplication permettant son clonage dans une culture bactérienne, et, d'autre part, incorporés dans cette partie d'ADN procaryote, le susdit promoteur eucaryote ou apte à diriger l'expression d'un gène associé dans une cellule eucaryote, ainsi que ladite séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation, notamment une APH(3') sous le contrôle direct de ce promoteur.
Avantageusement, dans un marqueur préféré de l'invention, le promoteur est celui sous le contrôle duquel s'exerce la transcription du gène de la thymidine kinase dans les cellules dont il est originaire, et le gène codant pour l'APH(3')-II est un gène de résistance à la kanamycine et/ou à la néomycine, tel que celui porté par le transposon bien connu sous la désignation "Tn5".
On peut naturellement avoir recours à d'autres promoteurs, tels que ceux des marqueurs génétiques antérieurement utilisés et qui ont été identifiés plus haut, ou encore à des promoteurs appartenant à des virus connus pour leur aptitude à infecter les cellules eucaryotes mises en oeuvre, par exemple des promoteurs ρrovenant de l'ADN du virus de l'hépatite virale B lorsque les cellules eucaryotes mises en oeuvre sont constituées par des cellules provenant de chimpanzés.
En ce qui concerne la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation, on peut avoir recours à toute séquence apte à synthétiser une enzyme douée de propriétés d' inactivation vis-à-vis de l'antibiotique qui sera mis en oeuvre dans le milieu de culture utilisé pour opérer la sélection des cellules auxquelles aura été incorporée le marqueur génétique. Dans le cas où l'antibiotique incoroporé au milieu est constitué par l'antibiotique G419, il est avantageux d'avoir recours aux enzymes de phosphσrylatlon du type APH(3 ) déjà mentionné. Il va naturellement de soi que l'on peut avoir recours à tous autres types de séquences d'ADN synthétisant une enzyme ayant une capacité d'inactivation analogue de l'antibiotique, par exemple par acétyiation des fonctions hydroxyle correspondantes de l'antibiotique. La séquence d'ADN du genre en question peut provenir de toute source appropriée. On peut par exemple substituer au transposon Tn5 susmentionné, le transposon Tn601(903) mentionné par JIHENEZ et DAVIES, ou tout autre gène de résistance à des antibiotiques susceptible d' interagir avec l'antibiotique de sélection utilisé dans le milieu de culture, le cas échéant après avoir établi au préalable la carte de restriction du gène de résistance en question, notamment pour en isoler la séquence d'ADN codant spécifiquement pour l'enzyme d'inactivation. L'intérêt de disposer plus spécifiquement de la séquence codant pour l'enzyme résultera des explications données ci-après, en ce qui concerne les marqueurs génétiques préférés de l'invention.
Naturellement, on peut également avoir recours à des séquences homologues au gène susdit, notamment à des cADN résultant de la transcription chimique ou enzymatique d'ARN messagers correspondants.
Conformément à une caractéristique préférée supplémentaire de l'invention, les premières paires de nucléotides de la séquence d'ADN codant pour l'APH(3') ou analogue sont rendues aussi proches que possible des dernières paires de nucléotides du promoteur dans la direction de la transcription, notamment à une distance, exprimée en nombre de paires de nucléotides, inférieure à 1.000, de préférence encore à 500, voire même inférieure à 100 paires de nucléotides. Il a en effet été constaté que la réduction de -cette distance, notamment par le recours à des délétions appropriées, avait" pour effet une considérable augmentation du. rendement de transformation, comme cela apparaîtra au cours de la description plus loin de marqueurs préférés conformes à l'invention.
De préférence encore les ADN marqueurs de l'invention contiennent également, en aval du gène de l'APH(3') un site de polyadénylation, celui-ci étant de préférence également rendu aussi proche qu'il est possible, de la dernière paire de nucléotides du gène codant pour l'APH(3'). Ce préférence, la distance exprimée en nombre de paires de bases entre l'extrémité de ce dernier gène et, soit le site de polyadénylation, soit les "codons stop" de traduction de ce gène, est inférieure à 1.000, ce préférence à 500 paires de bases, voire même encore inférieure à
100 paires de bases.
Le rendement de marquage peut encore être accru si l'on confère à l'ADN marqueur une origine eucaryote de replication par incorporation d'un fragment le contenant, tel que par exemple les fragments répétitifs de l'ADN du virus connu sous la désignation "virus de l'herpès Saimiri". L'existence de formes épiscmales de ce virus et de sous-unités d'ADN de 1,4 kilobases en formes multimeres dans des génomes correspondants défectifs donnent à penser que ces sous-unités contiennent une origine de replication.
Des marqueurs préférés selon l'invention sont obtenus par modification des plasmides pAGO ou pFG5, eux-mêmes dérivés de pBR322. Le plasmide pAGO est préféré en ce qu'il comporte, outre un gène TK, deux facteurs de résistance supplémentaires à l'ampicilline et à la tétracycline. On a représenté schématiquement la structure de pAGO dans la figure 1 des dessins. Y sont notamment représentés schématiquement le gène TK par un arc de cercle en traits interrompus et divers sites de restriction plus particulièrement mis à profit dans la construction de marqueurs préférés conformes à l'invention dont la description sera fournie plus loin. La flèche tr du gène TK donne le sens de la transcription. Le point O correspond au site EcoRI de ce plasmide. Les sites EPR et PAS correspondent aux positions de la région du promoteur du gène TK et du site de polyadénylation du gène TK respectivement: Les marqueurs génétiques préférés selon l'invention sont ceux qui résultent de la recombinaiscn de pAGO et du transposon Tn5 (décrite par JORGENSEN, H. A., ROTHSTEIN, S.J. et REZNIKOFF, V; . S . (1979), "Kolec. Gen. Genêt." 177, 65-72), dont la figure 2 fournit une représentation schématique et qui ont été obtenus à partir du plasmide bactérien ColEl Tn5 contenu dans la souche de E. co l i GM4pHN5 déposée à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes le 2 mars 1981 sous le n° I-149. L'antibiotique préféré mis en oeuvre dans les procédés de détection sus-indiqués est certes constitué par l'antibiotique G-418 dont a été reconnue la capacité de pénétrer dans la plupart des cellules eucaryotes et de les détruire par un processus toxique . Il va naturellement de soi que l'on pourra utiliser un autre antibiotique, pour autant qu'il se révèle toxique de la même façon à l'égard du type de cellules eucaryotes qui seront mises en oeuvre dans le procédé de détect.lun qui leur sera alors appliqué dans les conditions de l'invention. Bien entendu, le marqueur correspondant devra comporter en conséquence une séquence d'ADN apte à synthétiser une enzyme d'inactivation susceptible d'inhiber plus particulièrement l'antibiotique choisi. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description de marqueurs préférés dont les constitutions et constructions résultent schématiquement des figures 2 à 13 des dessins.
Pour le clivage en des sites spécifiques des plasmides et pour les ligatures, on a eu recours respectivement aux endonucléases de. restriction procuites par BIOLABS et à la T4 DNA-ligase produite par BETHESDA RESEARCH LABORATORIES (Rockville, H.D.). Les conditions de réaction mises en oeuvre ont été celles recommandées par les fabricants.
Les souches bactériennes utilisées pour les transformations ont été les souches E. co l i 1 1 06 (803r-km-k) et 1107 (803r-km+ k) (MURRAY, N.E., BRAMHAR, W.J. and MURRAY, K. (1976), "Molec. Gen. Genêt.", 1 50, 53-61). Les souches eucaryotes utilisées ont été des clones 1D de souris L TK-, des cellules de chimpanzés Vero, des cellules OMK et des cellules humaines HeLa. Les cultures de ces cellules ont été réalisées dans un milieu de EAGLE modifié par DULBECCO, complété avec du sérum de veau à 5 ou 10 % . Les techniques de transformât ion des cellules par les ADN de plasmide ont été réalisées comme décrit par COLBERE-GARAPIÏ? et al ( COLBERE-GARAPIN, F., CHOUSTERHAN, S., HORODNICEANU , F., XOURILSKY, P. et GARAPIN, A.C. (1979), "Proc. Natl. Acad. Sci., U.S. A." , 76, 3755-3759), en mettant en oeuvre la technique de précipitation par le calcium de GRAHAM et VAN DER E3 (GRAHAM, F.L. et VAN DER EB (1973), "Virology", 52, 456-^67). Les cellules transformées exprimant l'enzyme APH(3')-II ont été sélectionnées dans un milieu contenant de 10 à 400 microgrammes par millilitre de l'antibiotique G418. Les cellules TK ont été sélectionnées dans le milieu de HAT, également dans les conditions décrites par COLBEREGARAPIN et Coll. Pour le clonage des cellules, les colonies individuelles ont été Isolées au hasard et cultivées jusqu'à produire des cultures confluentes.
Construction des plasmides recombinants
Le promoteur utilisé provient de la"région du promoteur eucaryote" provenant du gène HSVl TK EPR(ciaprès dénommé EPR) et qui dans le plasmide pAGO se trouve située entre le site PvuII et Hindi au début du gène TK (figure 1). Cet EPR comprend à l'extrémité 5' du gène deux régions TATA (TATA boxes), l'une d'entre elles étant maintenant connue comme jouant un rôle important pour la transcription du gène TK (MC KNIGHT, S.L. (1930) Nucl.Acids Res., 8, 5949-5964). On produit un recombinant par ligation d'une part d'un fragment d'ADN HincII-HincII de 2480 paires de bases auquel est incorporé le gène de résistance à la kanamycine (schématiquement représenté par la flèche "kanar") que contient normalement le transposon Tn5, lequel a été représenté de façon schématique à la figure 2, et, d'autre part, du plasmide pAG0 ouvert au niveau du site Hindi par digestion partielle en présence de cette enzyme de restriction. Le recombinant obtenu a servi à la transfection d'une souche d' Es che r ich ia co l i 1106 (803 r-k mk- ) on sélectionne les colonies résistantes aux trois antibiotiques que sont la kanamycine, la té.tracycline et 1 ' ampicilline. Deux plasmides recombinants, pAG-40 et pAG45 ont ainsi été obtenus. L'analyse par restriction montre que le fragment de 2480 paires de bases . issues de Tn5 a été incorporé dans le site HincII situé dans la séquence TKla position 2301 de-pAGO (Fig.1). L'orientation de ce fragment a été déterminée par analyse de ces plasmides au mcyen de restrictions par Xhol et EcoRI. Le site Xhol de Tn5 est situé à proximité de l'extrémité 5' du gène APH(3')-II. On constate (Fig. 3) que le site Xhol est très proche dans pAG-40 du site Hindi, lui-même contigu à la région TK EPR. Au contraire le fragment est dans la direction opposée dans le plasmide ρAG45. Le plasmide pAG40 a donc été reconnu comme approprié pour expression dans des cellules eucaryotes. Ce plasmide qui s'avère également contenir le promoteur bactérien de APH(3')-II a été capable de résister jusqu'à 60 ;jg/ml de kanamycine. La distance dans pAG40 entre l'EPR et le premier tripletAUG du gène codant pour APH(3')-II est d'environ 1500 paires de bases. Afin d'obtenir une expression améliorée ultérieure, un nouveau recombinant a été formé entre,d'une part ,un fragment BglII situé dans pAG40 entre les coordonnées 3670 et 4795 de sa carte de restriction, et d'autre part pAGO, lequel avait été ouvert au niveau du site BglII du fragment TK DMA. Les plasmides obtenus, pAG50 (Fig. 4 ) et pAG55, lesquels se distinguent de pAGO par la présenced'un insert de1125 paires de bases délimité par des extrémités BglII, la plus proche de ces dernières se trouvant à une distance d'environ 130 paires de bases de la région EPR. Par restriction au moyen de l'enzyme Smal et par analyse sur gels il a été déterminé que l'extrémité 5' du gène APH(3')-II était connectée à l'ΞPR de TK, alors que l' insert était intégré dans la direction opposée dans le plasmide pAG55. C'est donc le plasmide pAG50 qui a été choisi pour l'obtention de l'expression de l'enzyme sous le contrôle de la région régulatrice de TK. Le poids moléculaire de pAG50 (comme celui de pAG55) est de7490 ± 50 paires de bases.
Le site de polyadénylation TK (PAS dans les dessins) est situé dans pAG50 Immédiatement en aval du site Smal dans la direction de transcription du gène TK (dans la région de coordonnées 4608 dans la figure 4. Par excision d'un fragment d'ADN de 1,2 k/bâse entre les deux sites Smal (de coordonnées 3243 et 4608 dans la carte) de pAG50, la distance séparant l'extrémité 3' du gène APH(3')-II et le site de polyadénylation TK (McKNIGHT) a été réduite de 1 365 paires de bases. Le codcn πtcp TGA de TK est situé à une distance correspondant à 21 paires de bases en aval du site Smal. La position du codon stop de APH(3')-ÎI n'est pas exactement connue. Elle en est néanmoins très proche. Le nouveau plasmide obtenu a été désigné sous l'expression pAG60 (Fig.5). Il a une longueur correspondant à environ 6 150 oaires de bases. Dans le but d'améliorer encore davantage l'efficacité de transformation de pAG60, on a tenté de lui incorporer une origine de replication eucaryote. A cette fin on a eu recours au génome defectifs mentionné plus haut de l'ADN du virus de l'Herpès Saimiri, ce génome d'effectifs comprenant une forme multimère d'une sousunité de 1, 4 kilobases dont on pense qu'elle contient une origine de replication. Ce gène d'effectifs (provenant de la souche 11 du virus de l'Herpès Saimiri, décrit par Fleckenstein et coll. (1979) Biochim. Biophys. Acta 560 301 - 342) a été clivé par l'enzyme Taql puis ligaturé au vecteur pAGO lui-même préalablement clivé car l'enzyme Clal. Les plasmides recombinants obtenus contenaient soit une (pFG22) scit deux unités répétitives en tandem (pFG 24). Les séquences répétitives isolées de pFG 24 par excision au moyen de l'enzyme Taql, ont été liées par ligation à pAG60 préalablement linéarisé par Clal, pour former le plasmide recombinant pAG70 (Fig. 6). Les effets de G-418 sur des cellules eucaryotes
Comme l'ont déjà indiqué JIMENEZ et DAVIES, l'antibiotique G-418 a une activité de synthèse d'une grande variété de protéines inhibitrices .La toxicité de cet antibiotique a par conséquent été testée vis-à-vis des cellules de souris L TK-, clone ID, de cellules de chimpanzés (non clonées ou cloneVCI0) et de cellules OMK ainsi qu'à l'égard de cellules humaines HeLa. Le nombre des cellules a doublé dans les cultures dans les premières 48 heures qui ont suivi l'addition deG-418. Sous une concentration de 25 μg/ml d'antibiotique les cellules ID ne se détachèrent pas avant un mois. Fiais à la concentration usuelle d'antibiotique (150 μg/ml) les cellules ID moururent et se détachèrent des plaques dans les 10 jours. Contrairement aux cellules ID, les cellules Vero non clonées ne moururent qu'un mois plus tard à la même concentration de G-418. Des colonies présentant des résistances spontanées n'ont jamais é obtenues à des doses de 50 à 400 μg/ml (fréquence de colonies à résistance spontanée <4.10-8, dans le cas de cellules ID).
Transformation des cellules de souris avec les plasmides recombinants
Le clone ID des cellules de souris L TK- est fortement sensible à la transfection, comme l'ont montré WIGLER et coll. (1978) Cell, 14 , 725-731). Ces cellules ont donc été choisies pour étudier la capacité de transfert et d'expression du marqueur sélectif de l'Invention. Les transfections ont été réalisées comme indiqué plus haut dans des flacons contenant chacun environ 3.106 cellules. L'agent sélectif G-418 a été ajouté 48 heures après la transfection, à une concentration de 150 μg/ml. Les colonies ont été comptées trois semaines après la transfection. Les résultats sont présentés dans le tableau I ci-après.
Figure imgf000017_0001
Le tableau fait apparaître eue l'on a obtenu des colonies transformées résistant à l'antibiotique G-418 après transfection avec les plasmides recombinants contenant le gène APH(3')-II. Des rendements de transformation relativement faibles, de l'ordre de 1 à 3 colonies par μg d'ADN, ont été obtenues avec le transposon bactérien Tn5 et les plasmides pAG45, pAG40 et pAG55. On constate cependant que l'on a obtenu une efficacité de transformation beaucoup plus importante avec pAG50 dans lequel la région promoteur de TK a été rapprochée de beaucoup de l'extrémité 5' du gène APH(3')-II (20 à 30 colonies par μg) . On a obtenu une efficacité de transformation encore davantage accrue, avec le plasmide pAG60, dans lequel le site de polyadénylation TK a été rapproché de l'extrémité 3' du gène APH(3')-II (70-80 co!onies/μg) Un a obtenu un rendement de 50 % encore plus élevé avec le plasmide pAG70 contenant les sous-unités répétitives du virus Herpès Saimiri. Il a été constaté que le rendement de transformation n'était pas dépendant dans une grande mesure des concentrations en G-418 à des doses comprises entre 150 et 300 μg/ml ni de l'intervalle de temps séparant la transfection et l'addition du G-418. On constate cependant que les rendements de transformation se réduisent à des doses de G-418 supérieures à 400 μg/ ml).
Ces résultats ont été obtenus avec des ADN circularisés, linéaires (notamment par ouverture de ρAG60 au moyen de Clal). Dans le dernier cas l'on obtient des rendements de transformation de 2 à 3 fois plus grands (175 colonies par μg d'ADN).
Le phénotype de résistance à l'antibiotique G-418 est stable dans les conditions de culture mis en oeuvre en vue de la sélection. Il en est encore de même, même lorsque les cellules sont cultivées dans le même milieu, mais en l'absence de l'antibiotique. Les cellules ne deviennent pas sensibles à l'antibiotique G-418, même après plusieurs passages. Transformation par les plasmides recombinants de cellules de singes et de cellules humaines.
On a comme dans le cas précédent obtenu des lignées résistantes à l'antibiotique G-418, après transfection de cellules de singes (VC10, OMK) et de cellules humaines (lignée HeLa) après transfection avec les plasmides pAG50 et pAG60. Aucune colonie résistante n'a cependant été obtenue en utilisant uniquement le support ADN issu du sperme de saumon. Le rendement de transformation obtenu avec ces cellules, a été inférieur à celui auquel ont conduit les cellules de souris L TK- . pAG50 s'est révélé transformer les cellules HeLa avec une efficacité d'environ une colonie par μg d'ADN. pAG60 a permis la transformation de cellules de singes VC10 et OMK avec une efficacité de 0.1 à 1 colonie par μg d'ADN.
Transferts simultanés du gène HSVl TK et du marqueur sélectif APH(3')-II
Pour étudier les possibilités de co-transformation ou de transformations simultanées d'un gène déterminé avec le marqueur sélectif APH(3')-II on a eu recours au gène HSVl TK du fait de sa capacité de détection aisée. Les plasmides circularisés pAG6θ et pFG24 portant respectivement les gènes APH(3')-II et TK respectivement ont été utilisés en vue d'opérer des co-transformations ou transformations simultanées de cellules TK- 1D. Les" deux plasmides ont été utilisés dans des proportions massiques correspondant à 5 AFH(3')-II pour 8 TK.
Après une opération de sélection dans un milieu ne contenant que l'antibiotique G-418, on a isolé 20 clones. Neuf clones parmi les 20 précédents (soit 45 % ) se sont révélés capables de se développer également dans le milieu sélectif HAT. Ces 9 clones possédaient par conséquent à la fois le phénotype APH(3')-II et TK+. Partant de colonies répliquées à partir de 5 des clones résistants au milieu HAT de 4 clones sensibles au milieu HAT et après culture en présence du seul G-418, on a testé l'activité TK in vitro des 9 cultures obtenues. Les 5 clones oui présentaient le phenotype TK+ se sont révélés avoir une activité enzymatique importante. Des résultats semblables ont été obtenus avec des cellules co-transformées par pAG50 et pFG24.
Cet essai est évidemment représentatif des possibilités qu'offrent les marqueurs génétiques sélectifs selon l'invention, de repérer les cellules eucaryotes transformées par un autre ADN, dont l'expression pourrait être recherchée, tel que par exemple un ADN ou cADN codant pour une protéine, telle que l'insuline, l'interféron humain, etc., ou une protéine virale destinée à la production de vaccins, telle que l'antigène HBs du virus de l'hépatite virale B, etc... Le rendement de transformation et de détection est évidemment susceptible d'être plus important si l'on a recours, non à une co-transformation des cellules, telle qu'elle a été décrite ci-dessus à titre d'exemple, par un plasmide marqueur conforme à l'invention et par un plasmide distinct, porteur de la séquence d'ADN dont l'expression est recherchée, mais à une transformation par le plasmide marqueur selon l'invention lui-même, dans lequel aura été insérée au préalable la séquence d'ADN dent l'expression est recherchée. Cette dernière insertion peut, dans le cas des plasmides préférés qui ont été décrits cidessus, être réalisée avec avantage dans l'un des sites contenant les facteurs.de résistance à la tétracycliπe et à l'ampicilline, qu'ils ont en commun avec pAGO et qui n'ont pas été affectés par la modification qui a conduit aux plasmides selon l'invention.
Dans un but d'illustration, de ce qui précède on décrira une application préférée des marqueurs selon l'invention, plus particulièrement leur utilisation comme vecteurs contenant un insérât dérivé d'un fragment du génome du virus de l'hépatite virale B, contenant plus particulièrement le gène S de celui-ci et 1 ' information génétique propre à permettre son expression dans des cellules eucaryotes. Même s'il s'agit d'un cas préféré, il est naturellement entendu que l'invention ne saurait y être limitée.
La construction d'un tel plasmide marqueur contenant un tel insérât est illustrée dans les figures 7 à 13. La figure 7 est en fait une représentation du plasmide pAG 60, très semblable donc à celle indiquée à la figure 5. On y a néanmoins représenté plus particulièrement des sites supplémentaires d'enzvmes de restriction , qui seront utilisées dans la construction du plamidemarqueur final. Il s'agit en l'occurence de deux sites Sph I situés respectivement à environ 565 et 2 827 nucléotides à partir du site Eco RI (représenté par la lettre "O" dans les figures). De même on a précisé la position approximative d'un site Pvu II supplémentaire, notamment dans le gène de résistance à la kanamycine "kanar", site qui est également mis en oeuvre dans la construction du marqueur-plasmide modifié décrit ci-après .
La figure 8 représente schématiquement un fragment délimité par des extrémités Rsa I et Hinc II (ciaprès dénommé fragment Rsa I-Hinc II), tel qu'il peut être extrait du plasmide pCP 10 décrit dans la demande de brevet européen n° 81 400634, extraction qui comporte les étapes qui consistent à traiter dans des conditions classiques ledit plasmide avec les deux enzymes de restriction correspondantes et à récupérer le fragment correspondan , plus particulièrement celui comportant de l'ordre de 820 paires de bases et qui se trouve être pourvu des susdites extrémités. 'Elles correspondent respectivement aux sites Rsa.I et Hinc II, respectivement aux posicions 600 et 1 500 environ, de part et d'autre du site Eco RI de la carte de restriction de la séquence d'ADN connue sous la désignation DNA-HBV correspondant au génome du virus de l'hépatite B, selon le mode de numéxotation exposé par F. GALIBERT et al, dans l'article intitulé . "Nucleotide Séquence of the Hepatitis B virus génome (sub-type AYW) cloned in E-coli" de NATURE 1979, Vol. 281, pp. 646 - 650.
Les astérisques qui accompagnent certains des nombres fournis dans les figures font référence au fait que les numérotations de positions auxquelles ces nombres se réf èrent à celles des pos itions de nucléotides correspondants dans le DNA-HBV selon la numérotation de GALIBERT et al .
Par recombinaison génétique on insère le fragment Rsa I-Hinc II de la figure 8 dans le site Pvu II situé dans le gène "kanar" de pAG 60 , cette recombinaison génétique étant rendue par ticulièrement ais ée du fait des extrémités franches des fragments à recombiner , ce qui est réalisé dans des conditions classiques en pré sence d ' une ligase . Le plasmide résultant XAP I est schématisé à la figure 9 .
Par hydrolyse ménagée de XAP I par l ' enzyme de restriction Sph I on rééxtrait le fragment représenté à la figure 1 0 et délimité , d ' une part, par le site Sph I qui dans le fragment Rsa I-Hinc II de la f igure 8 se trouvait a faible distance de l ' extrémité Hinc I I et d ' autre part le site Sph I a la oosition de l 'ordre de 3 017 ( vis à vis du site Eco RI repéré par le signe " 0 "sur la fig) de XAP I. Le fragment obtenu contient une proportion importante du gène S et de l ' information génétique nécessaire à son expression dans des cellules eucaryotes.
Ce fragment est alors réinséré dans le plasmide pAG 60, plus particulièrement dans son site Sph I à la position 565, ce qui conduit au plasmide pAG 61 de la figure 11.
Dans le mesure où ce pla-smide ne contient pas la totalité de l'information génétique nécessaire à l' expression du gène S, il est préférable de procéder à une recombinaison génétique supplémentaire de ce plasmide avec une séquence complémentaire extraite de DNA-HBV, représentée à la figure 12 et délimitée par des extrémités Xba I et Taq I aux positions 2 938 et 1 276 selon la numérotation de GALIBERT et al. Par la mise en oeuvre d'une nouvelle recombinaison génétique mettant en jeu les sites Xba I qu'ont en commun l'insérât extrait de DMA-HBV contenu dans pAG 61 et le site correspondant contenu dans le fragment représenté schématiquement à la figure 11, on substitue la partie du fragment de DNA-HBV de la figure 12, délimitée par les extrémités Xba I d'une part et Taq I d'autre part, aux fragments délimités dans le plasmide pAG 61 par les extrémités Xba I d'une part et Cla I d'autre part. On obtient ainsi le plasmide pAG 66 , lequel contient alors un fragment plus important de DNA HBV, s' étendant de la position 680 à la position 1276 selon la numérotation de GALIBERT et al (en passant par le site 2938).
Ce plasmide-marqueur contenant un insérât, contenant lui-même la totalité du gène S du virus de l'hépatite B ainsi que l'information génétique nécessaire à son expression dans les cellules eucaryotes, ne constitue que l'un des exemples des nombreux marqueurs-vecteurs permettant la reconnaissance de celles des cellules eucaryotes transformables par ces derniers. Il va de soi que l'on peut avoir recours à toutes formes d'insérats extraits de DNA HBV, par exemple ceux décrits dans les demandes de brevets européens 81 400 634, 0 013 828 ; 0 020 251 et 81 00577. En particulier on pourra avoir recours à l'insertion de toute séquence extraite de DNA HBV contenant toute l'information génétique nécessaire à l'expression du gène S, cependant à l'exclusion des parties de DNA HBV qui peuvent être considérées comme responsables de l'infectivité du génome viral. L'invention s'applique naturellement de la même manière et dans des conditions analogues à la transformation et à la détection de cellules eucaryotes supérieures transformées par un ADN ou cADN codant pour toutes autres protéines déterminées. Les marqueurs selon l'invention sont d'un Intérêt tout particulier pour la transformation de cellules eucaryotes d'organismes supérieurs, plus particulièrement de cellules d'animaux ou humaines, ou encore de cellules végétales. On peut avoir recours à toute technique de transformation en soi classique ou encore à celles qui ont déjà été indiquées plus haut. L'invention concerne encore plus particulièrement l'application des marqueurs tels qu'ils ont été définis dans ce qui précède et dans lesquels ont été insérés un fragment d'acide nucléique comprenant toute l'information génétique nécessaire à sa replication et à son expression dans des cellules eucaryotes, à la production du produit d'expression correspondant, cette application mettant en jeu un procédé comprenant la culture des cellules ainsi transformées et la récupération desdits produits d'expression, soit à partir des cellules, soit à partir du milieu lorsque le produit d'expression, notamment la protéine, est excrétée dans le milieu de culture. A cet égard l'invention se prête en particulier à la production des protéines ayant des propriétés immunogènes, capables d'induire la production d'anticorps, susceptibles à leur tour de neutraliser le virus de l'hépatite B, et ce d'autant plus qu'une grande partie de la protéine produite est excrétée dans le milieu de culture. Elle peut être récupérée à partir de celui-ci par des techniques de purification classiques, mettant en oeuvre soit des procédés physico-chimiques de séparation, soit des procédés immunologiques, par exemple des chromatographies d'affinité sur un substrat sur lequel ont au préalable été fixés des anticorps correspondants.
Les résultats qui précèdent démontrent que l'invention peut être mise en oeuvre pour la transformation et la détection de lignées cellulaires de singes (Vero et OMK) et humaines HéLa, pour ne retenir que quelques exemples. En particulier, les résultats précédents font apparaître que les séquences contenant un facteur de résistance à certains antibiotiques, tel que le gène du transposon Tn5 qui code pour l'APH(3')-II, qui est dépourvu d'introns, peuvent être exprimés après leur transfert dans des cellules de mammifères.
Le système sélectif qui a été décrit présente un nombre de caractéristiques et d'avantages particulièrenent intéressants. Tout d'abord, on observe que la sélection n'implique pas l'utilisation de voies métaboliques spéciales ou de voies de synthèse de nucléotides spéciales, contrairement à ce que requièrent les techniques antérieures utilisant à titre de marqueurs des gènes TK, APRT, XGPRT ou DHFR. Le procédé selon l'invention peut également être appliqué à l'étude des efficacités relatives de différents promoteurs, que ces efficacités s'expriment en rendements de transformation vis-à-vis d'un type de lignée cellulaire déterminée ou à l'égard du nombre plus ou moins important de cellules eucaryotes d'origines différentes que peut transformer chacun des promoteurs testés. Il est à cet égard intéressant de noter l'efficacité toute particulière des promoteurs qui normalement contrôlent la transcription des gênes TK. L'invention fournit par conséquent des marqueurs qui peuvent être exprimés dans des lignées variées de cellules de mammifères, particulièrement dans des lignées cellulaires dépourvues de tout caractère oncogëne, comme par exemple les lignées cellulaires hétéroploïdes Véro de primates non humains, telles que celles décrites par PETRICCIANI, J.C., KIRSCHSTEIN, R.L., HINES, J.E., WALLACE, R.E. et MARTIN, D.P. (1973) , "J. Natl. Cancer Inst." 51, 191-196, ces dernières cellules s'étant révélées non tumorigènes, même lorsque testées dans des singes soumis à un traitement immunosuppresseur. On citera également encore les cellules non tumorigènes disponibles dans des banques de cellules du type ATCC CCL 81 (cellules Vero) ou des cellules de rein du singe vervet ou des autres cellules eucaryotes non tumorigènes qui sont conservées à l'American Type Culture Collection. On peut utilement se reporter aux catalogues de souches publiés par cette collection." .
Les cellules marquées obtenues sont donc particulièrement utiles pour la synthèse de produits destinés à des usages biologiques ou thêrapeutiqeus, que ce soit des séquences polypeptidiques correspondant à l'antigène HBs du virus de l'hépatite virale B, comme plus particulièrement envisagé ci-dessus, ou à tous autres principes actifs de vaccins ou autres protéines utiles, telles que par exemple l'insuline ou l'interf éron.
D'une façon générale, l'invention s'étend à tous les équivalents des différents marqueurs qui ont été décrits ou définis plus haut. A cet égard, il importe encore de faire les observations complémentaires suivantes.
La définition "promoteur eucaryote connu ou reconnu par sa capacité à diriger l'expression dans une cellule eucaryote d'un gène qui lui est normalement associé", s'étend aussi aux promoteurs associés à des gènes homologues dans d'autres types de cellules ou micro-organismes, y inclus les promoteurs sous la dépendance desquels se trouvent des gènes viraux qui codent pour une protéine homologue à celle spécifiée par le gène eucaryote correspondant. En l'occurrence, il s'agit des promoteurs associés à des "ADN de complémentation", au sens qui a été donné de cette expression dans la demande de brevet européen n° 80400828 déposée le 9 juin 1980. En particulier, il a été fait usage d'un tel promoteur dans l'exemple sus-exposé.
Il est signalé que les plasmides pAGO et pGF5 sont également décrits dans la susdite demande de brevet européen.
L'invention concerne naturellement et d'une façon générale tous les procédés de marquage des cellules eucaryotes, caractérisés par la mise en contact de telles cellules avec un marqueur tel qu'il a été défini ci-dessus, dans des conditions aptes à permettre la transformation d'une partie au moins de ces cellules et par la mise en culture de ces cellules dans un milieu approprié à leur développement et contenant un antibiotique inactivable par l'enzyme pour lequel code la séquence d'ADN du susdit marqueur. L'invention concerne aussi les cellules eucaryotes, notamment originaires du singe ou de l'homme, plus particulièrement appropriées à la fabrication de vaccins et contenant le marqueur selon l'invention à titre de marqueur génétique interne sélectif.
Tous les documents antérieurs cités dans ce texte y sont "incorporés par référence"; en d'autres ternes les descriptions de ces documents font partie de la présente demande, dans la mesure où leurs descriptions pourraient être nécessaires à l'intelligence de la description de la présente dsnande.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Marqueur génétique sélectif constitué par un ADN, circulaire ou nom contenant un promoteur eucaryote ou reconnu par aa capacité à diriger l'expression dans une cellule eucaryote d'un gène qui lui est norrmalement associé et une séquence d'ADN codant pour une enzyme susceptible d' inactiver un antibiotique, capable de pénétrer dans au moins certaines cellules eucaryotes ou de les détruire par un processus toxique ou les deux à la fois, cette séquence étant liée au promoteur susdit et sous son contrôle direct. 2 - Marqueur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour l'enzyme capable d' inactiver un antibiotique est choisie parmi celles qui codent pour uneenzyme capable d' inactiver l'antibiotique G418. 3 - Marqueur selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation est choisie parmi celles qui codent pour une aminoglycoside 3'-phosphotransférase (APH(3')). 4 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d' inactivation est un gène de résistance à la kanamycine ou à la néomycine ou aux deux à la fois. 5 - Marque.ur selon, l'une quelconque des revendications 1 à 4 , caractérisé en ce que le promoteur est celui sous le contrôle duquel s'exerce la transcription du gène ou fragment d'ADN codant pour une thymidine kinase, notamment du promoteur du gène TK du virus de l'herpès.
6 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le promoteur appartient à l'un de ceux sous le contrôle desquels s'exerce normalement la transcription du gène de l'adénine phosphoribosyl transférase, de la dihydrofolate réductase ou de l'enzyme xanthine-guanine phosphoribosyl transférase. 7 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte une partie originaire d'un ADN procaryote, tel que phage ou de préférence plasmide, comprenant une origine de réplication permettant son clonage dans une culture bactérienne, le susdit promoteur et la susdite séquence d'ADN codant pour l'enzyme d'inactivation étant incorporés à cette partie de l'ADN .
8 - Marqueur selon la revendication 7 , caractérisé en ce qu'il est dérivé du plasmide pBR322, de préférence encore plus particulièrement des plasmides pAGO ou pFG5.
9 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les dernières paires de nucléotides du promoteur dans la direction de la transcription se trouvent à une distance exprimée en nombre de paires de nucléotides inférieure à 1.000, de préférence à 500, voire même encore inférieure à 100 paires de nucléotides. 10 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la distance exprimée en nombre 'de paires de bases entre l'extrémité de la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d' inactivation et, soit le site de polyadénylation, soit les "codons stop" de réduction de cette séquence d'ADN, est inférieure à 1.000, de préférence à 500, voire même encore inférieure à 100 paires de nucléotides. 11 - Marqueur selon L'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence supplémentaire comportant une origine eucaryote de replication, telle qu'un fragment correspondant au fragment répétitif de l'ADN du virus connu sous la désignation "virus de l'herpès Saimiri".
12 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la séquence codant pour l'enzyme d'inactivation correspond au gène codant pour l'enzyme de phosphorylation contenue dans le transposon Tn5 ou Tn601 et le promoteur correspond au promoteur du gène TK du virus de l 'herpès.
13 - Marqueur selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il comporte dans une autre région de son génome un insérât consistant en une séquence d 'ADN comprenant toute l ' information génétique nécessaire à la transcription et l ' expression d ' une protéine déterminée .
14 - Marqueur selon la revendication 13 caractérisé en ce que l ' insérât consiste en un fragment de DNA HBV, contenant plus particulièrement le gène S de DNA HBV. 15 - Cellules eucaryotes , notament originaires du singe ou de l 'homme , et appropriées à la fabrication de vaccins , caractérisées en ce qu ' elles contiennent, à titre de marqueur génétique interne sélectif , le marqueur selon l ' une des revendications 1 à 14. 16 - Procédé de marquage des cellules eucaryotes, caractérisé par la mise en contact de telles cellules avec un marqueur conforme à l ' une quelconque des revendications 1 à 15 , dans des conditions aptes à permettre la transformation d ' une partie au mchs de ces cellules et par la mise en culture de ces cellules dans un milieu approprie à leur développement et contenant un antibiotique inactivable par l ' enzyme pour lequel code la séquence d'ADN du susdit marqueur.
17 - Procédé selon la revendication 15 , caractérisé en ce que le marqueur contient une séquence d'ADN codant pour une enzyme de phosphorylation ou d ' acétylation conduisant à l ' inactivation de l ' antibiotique G418 , et en ce que la culture est réalisée au sein d ' un milieu, contenant l ' antibiotique G418 , et en ce qu ' après ma culture on recuille les colonies ayant incorporé le marqueur génétique sélectif ,
18 - Procédé de fabrication d'une protéine déterminée, comprenant la transformation de cellules eucaryotes avec un marqueur génétique sélectif conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 15 et avec un vecteur contenant l'ADN codant pour la protéine déterminée du genre en question, caractérisé en ce que le marqueur et l'ADN codant pour la protéine déterminée, soit sont tous deux contenus dans un même vecteur, soit sont contenus dans des vecteurs distincts.
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