UA112863C2 - Імуногенна композиція для профілактики і/або лікування інфекції, яка викликана вірусом віл - Google Patents

Abstract

Винахід стосується імуногенної композиції, що містить антигенний пептид, для попередження і/або лікування інфекції, яка викликана вірусом ВІЛ-1. Винахід також стосується антигенного пептиду, способу детектування і/або кількісного визначення антитіл до антигенного пептиду у зразку та набору для такого визначення.

Description

Галузь техніки

Даний винахід відноситься до попередження і лікування інфекції індивідуумів, яка викликана вірусом ВІЛ-1 (вірус імунодефіциту людини).

Рівень техніки

Приблизно 90 95 ВІЛ-інфекцій людини викликано вірусом ВІЛ-1. Вірус імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1) характеризується сильною генетичною мінливістю, що викликано накопиченням мутацій, які виникають протягом реплікації вірусу, і також викликаною явищами рекомбінації.

Відсутність результату протягом тривалого періоду хіміотерапевтичних методів лікування ВІЛ значною мірою пояснюється високою мутагенною активностю вірусних штамів ВІЛ-1. Раніше було показано, що стійкі різновиди вірусу швидко виникали у пацієнтів після різних курсів антиретровірусної терапії і навіть після терапії з використанням багатьох лікарських засобів (НАААВТ-високоактивна антиретровірусна терапія). Дані стійкі віруси несуть певні зміни в конформації і структурі своїх білків. Зазвичай такі мутації, відповідальні за ухилення ВІЛ-1 від сучасних способів лікування, які зберігаються в наступних поколіннях вірусу і накопичуються, як результат селекції в умовах лікування.

Лікування лікарськими засобами проти ВІЛ-1 повністю не блокує реплікацію вірусу, що робить можливим добір і накопичення заздалегідь існуючих мутацій, які асоційовані зі стійкістю, а також знову виникаючих мутацій, таким чином, даючи можливість вірусу продовжувати поширюватися. Існуючі антиретровірусні лікарські засоби (МКТІ (нуклеозидний інгібітор зворотної транскриптази), ММЕТІ (ненуклеозидний інгібітор зворотної транскриптази) інгібітори протеаз, інгібітори злиття та їх суміші, що подібні до НААКТ) можуть тільки сповільнити реплікацію ВІЛ-1 протягом більш або менш тривалого періоду часу, до виникнення і репродукції стійких вірусних штамів. Широке поширення стійких різновидів ВІЛ-1! викликає серйозні побоювання і вимагає наявності додаткових терапевтичних засобів проти ВІЛ-1.

Були розглянуті різні терапевтичні стратегії проти ВІЛ, що відрізняються від терапевтичних стратегій проти ВІЛ із застосуванням хімічних антиретровірусних речовин, які включають (Її) застосування антитіл проти ВІЛ, (ії) вакцини на основі частинок зруйнованого вірусу ВІЛ, (їїї) вакцини на основі пептидів ВІЛ та (ім) вакцини на основі ДНК плазміди або вірусного вектора, причому будь-яка включає в себе свої конкретні недоліки.

Зо Так як пандемія ВІЛ продовжує інфікувати мільйони людей щороку, зростає потреба в ефективній вакцині. Розвиток вакцин проти ВІЛ було сильно уповільнено внаслідок складності, що виникає при розробці імуногенного продукту, здатного викликати утворення нейтралізуючих антитіл проти ВІЛ широкого спектру дії.

Індукування при утворенні нейтралізуючих антитіл широкого спектру дії (БМАБ) проти первинних ізолятів вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) залишається головним і нереалізованим завданням при дослідженні вакцини проти СНІДу (синдром набутого імунодефіциту). Ранні спроби використання вакцин на основі капсул приводили до утворення антитіл, які є ефективними тільки проти ізолятів, адаптованих для використання в лабораторії. У даних прикладах захист корелював із високим титром БМАБ, спрямованим на гіперваріабельну область МЗ3 др120. Однак утворена нейтралізуюча дія є головним чином специфічною по відношенню до ізоляту і є мінімально ефективною по відношенню до більшості первинних ізолятів ВІЛ-1. Нездатність вакцин на основі субодиниці др120 захищати від інфікування ВІЛ-1 на Фазі І клінічних випробувань підкреслює складність завдання.

Тим не менш, БМАБ може бути часто виявленим у ВІЛ-інфікованих індивідуумів. Відповіді, які викликано рано при інфікуванні, зазвичай є вузькоспецифічними, нейтралізуючи віруси, які поширюються у господаря, але не збігаються в часі. Такі відповіді поширюються протягом інфікування у деяких довгожителів, які здатні контролювати свою інфекцію у відсутності антивірусного лікування. Однак, суть відповіді, що полягає в утворенні перехресно- нейтралізуючих антитіл, і механізми, що призводять до його виникнення, не зрозумілі.

У природних умовах, МАБ проти Епу (ген білка оболонки) утворюються в межах тижнів після інфікування, але дана рання відповідь є ефективною лише проти певного вірусного підтипу; однак, БМАБ (перехресно-реагуючі нейтралізуючі антитіла) можуть вироблятися протягом розвитку ВІЛ. Нещодавно у кількох масштабних дослідженнях було показано, що приблизно 25 95 ВІЛ-інфікованих пацієнтів (інфікованих протягом щонайменше 1 року) мають відповідь у вигляді утворення БМАБ, і 1 96 "елітних нейтралізуючих агентів" з дуже високою активністю проти переважної більшості кладів. Важливо відзначити, що дані результати демонструють здатність імунної системи інфікованих індивідуумів до утворення Мар іп мімо проти ВІЛ-1, протягом розвитку захворювання. Вони також наводять на думку про те, що активність Маб, реагуючих в широкій області, переважно, розвивається з часом, і їй сприяє тривала антигенна бо стимуляція, у відсутності знань щодо титру ВМАБ, який був би захисним.

Постійна реплікація вірусу з низьким рівнем перешкод, призводить до постійної еволюції Епм для ухилення від МАБ. Така антигенна еволюція може зосереджувати увагу на новій стратегії вакцинації на основі більш консервативної області білка Епу, та наводить на думку про те, що імуногенні вакцини могли б бути призначені для імітації ключових, висококонсервативних епітопів.

Однією з головних проблем розробки ефективних вакцин проти ВІЛ було те, що мішенню

БМАБ є білок вірусної оболонки (Епу), яка є високоваріативною, тоді як консервативні елементи, переважно, є слабо імуногенними. Це означає, що кінетичні та просторові обмеження ускладнюють доступ БМАБ до потенційно чутливих сайтів під час зв'язування з рецептором і процесів злиття. Насправді було описано невелику кількість МАБ. Наприклад, першим ідентифікованим БМАБ був 612, який закриває сайт зв'язування СО4 на одр120 і запобігає прикріпленню СО4. Субодиниця др41 є набагато більш консервативною, ніж др120, включаючи конформаційні перебудови, що характерні для всіх штамів. Дуже низьку БМАБ активність виявляють по відношенню до консервативних структурних елементів ор41, які захищені, важкодоступні або є нестійкими; дані БМАБ, включаючи 2Е5 і 4Е10, націлені на найближчу до мембрани ектодоменну область (МРЕК) ор41. Однак імунізація даними ключовими епітопами не приводила в результаті до утворення активності БМАБ. Дане розділення між антигенними та імунологічними характеристиками все ще не зрозуміло.

У даній галузі все ще існує необхідність у терапевтичних засобах, які спрямовані на попередження або лікування інфекції, яка викликана вірусом ВІЛ-1.

Короткий опис винаходу

Даний винахід відноситься до імуногенної композиції, що включає в себе антигенний пептид нижченаведеної формули (1):

МІ-5-Х1-Х2-Х3-К-Х4-СЯ (І) (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 1-СЯ, де - Мі складається з пептиду, що включає в себе від 0 до 100 амінокислот у довжину, - Сі складається з пептиду, що включає в себе від 0 до 100 амінокислот у довжину, - кожен з Х1-Х4 складається з амінокислотного залишку, де: - (Ї) Х1 позначає конкретну амінокислоту МУ, або (ії) Х1 позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком МУ,

Зо - () Х2 позначає конкретну амінокислоту 5, або (ії) Х2 позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком 5, - (Ї) ХЗ позначає конкретну амінокислоту М, або (ії) ХЗ позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком М, - (ї) Х4 позначає конкретну амінокислоту 5, або (ії) Хі позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком 5, за умови, що - три з чотирьох амінокислотних залишків ХІІ, Х2, ХЗ і Х4 позначають конкретну амінокислоту, що вищевказано у їх відповідному значенні (Її), і - амінокислотний залишок, який залишився серед Х1-Х4 позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком конкретного амінокислотного залишку, визначеного у своєму значенні (Її), за умови, що пептид формули (І) не означає пептид 5ЕО ІЮ Мо 18, який розкрито у заявці РСТ, поданої 22 червня 2010 року за Мо РСТ/О5З2010/001784 і опублікованої 13 січня 2011 року за Мо

УМО 2011/005289 від імені Президента і Членів ради Гарвардського коледжу.

Даний винахід також відноситься до імуногенної композиції, що включає антигенний пептид формули (І), як описано вище, для застосування в якості лікарського засобу.

Даний винахід також відноситься до імуногенної композиції, що включає антигенний пептид формули (І), як описано вище, для застосування в способі попередження і/або лікування інфекції індивідуума, що викликано вірусом ВІЛ-1.

Даний винахід відноситься до застосування імуногенної композиції, що включає антигенний пептид формули (І), як описано вище, для виготовлення лікарського засобу для запобігання і/або лікування інфекції індивідуума, що викликано вірусом ВІЛ-1.

У переважних втіленнях, значення (її) одного чи більш ніж одного з Х1, Х2, ХЗ і хХ4 незалежно один від одного вибрано з групи амінокислотних залишків, що складається з цистеїну (Суз або С), аланіну (Аа або А), гліцину (Су або с) і валіну (мМаїЇ або М), проліну (Рго або Р) і, найбільш переважно, аланіну.

У переважних втіленнях, тільки один з Х1-Х4 позначає амінокислотний залишок, який відрізняється від МУ (для Х1), 5 (для Х2), М (для ХЗ) і 5 (для Х4), відповідно.

У переважних втіленнях антигенний пептид формули (І) обрано із групи, що складається з: - РРУУМАБАБМКОЇ ЮОБІМ/ (ЗЕО ІЮ Мо 12), - РУУМАБУМАМК5БІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 13), 60 - РУУМАБУУЗАКЗІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 14) і

- РУУМАБУУЗМКА ГГ ОБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 15),

Даний винахід також відноситься до імуногенної композиції, що включає антигенний пептид формули (1).

У переважних втіленнях антигенний пептид формули (І) ковалентно зв'язаний з молекулою- носієм.

У переважних втіленнях даної імуногенної композиції антигенний пептид формули (1), можливо пов'язаний з молекулою-носієм, яку об'єднано з одним чи більш ніж одним імуноад'ювантом.

Даний винахід також відноситься до пептиду формули (І), як описано в даному описі.

Винахід також відноситься до застосування антитіл, дія яких спрямована проти пептиду формули (І), при виготовленні лікарського засобу для запобігання і/або лікування індивідууму, якого інфіковано вірусом ВІЛ-1.

Даний винахід також відноситься до антитіл, дія яких спрямована проти пептиду вищевказаної формули (1).

Даний винахід також відноситься до способів діагностики ВІЛ-17, а також наборів для діагностики ВІЛ-1, в яких застосовується пептид формули (1).

Даний винахід відноситься до способів прогнозування ВІЛ-1, а також наборів для прогнозування ВІЛ-1, в яких застосовується пептид формули (1).

Він також відноситься до способів моніторингу стану ВІЛ-1 інфекції, при яких застосовується пептид формули (І), особливо у пацієнтів, які знаходяться на терапевтичному лікуванні ВІЛ-1 інфекції, а також наборів для здійснення таких способів моніторингу.

Опис графічних матеріалів

Фіг. 1. Вирівнювання амінокислотних послідовностей декількох пептидів формули (1).

Дикий тип: амінокислотна послідовність, що включає в білку др41 штам НХВ2 ВІЛ-1, яка може називатися "35".

З613А (МІ) і Кб17А (М5): амінокислотні послідовності що включають в себе високу амінокислотну ідентичність із вищевказаним "Диким типом".

МУ/614А, 5615А, М616А і 56184: конкретні втілення пептиду формули (1).

Фіг. 2. Інфікуюча здатність ВІЛ-1 вірусу МІ4.3, що включає аланінову заміну в мотиві зо зБ/араї.

Клітини МТ-2 інфікували 100 нг/мл р24 еквівалентного антигену з дикого типу (М/Т, білі стовпчики на діаграмі) або які мутували по аланіну З35/др41 (чорні стовпчики на діаграмі) вірусів

МІ 4.3. (А) антиген ра24 кількісно визначали на 6-й день після інфікування. Результати, виражені у відносних одиницях по відношенню до дикого типу, представляють середнє х 50 (стандартне відхилення) від трьох до семи незалежних препаратів клона плазміди, в залежності від мутантів. (Б) Утворення синцитію кількісно визначали на 4-й день після інфікування, за допомогою стандартної фазово-контрастної мікроскопії. Результати, виражені у відносних одиницях по відношенню до дикого типу, представляють середнє ж 50 (стандартне відхилення) від двох до чотирьох окремих препаратів клону плазміди, в залежності від мутантів. (В) Вивчення кінетики продукції антигену р24 в клітинному супернатанті первинних СА: Т клітин, які інфіковано диким типом (МУТ, х) або мутованим по аланіну З35/д9р41 МІ 4.3 вірусом, включаючи 561ЗА (ш), МУ614А (р), 5615А (2), МбІбА (0), Кб17А (Ф) і 5618А (0). Даний експеримент відповідає 2 незалежним експериментам, які проведено з окремими препаратами клона плазміди на очищених клітинах С04-Т від двох незалежних здорових донорів. (ГУ) Інфікуюча здатність Неїа клітин РАС5 диким типом (М/Т, білі стовпчики на діаграмі) або мутованим по аланіну З5/др4і1 (чорні стовпчики на діаграмі) МІ 4.3 вірусом. Клітини інфікували в трьох паралельних повторюваннях 4 нг/15000 клітин еквівалентного антигену р24 протягом 48 год., а активність ВД-галактозидази визначали в клітинних екстрактах. Результати, виражені у відносних одиницях щодо дикого типу, що є середнім ж 50 від трьох до чотирьох незалежних препаратів клона плазміди. Мутовані по аланіну віруси МІ 4.3 називаються: 5613А, УУб14А, 5615А, Мб16А, Кб17А і 5618А.

Фіг. 3. Експресія МКр44Ї в 004: Т клітинах і дегрануляцію МК (природній кілер) клітин, опосередкована 35/др41 мутантами по аланіну. (А) Очищені клітини СОА-Т не інфікували (пунктирні лінії), інфікували протягом ночі диким типом (М/Т) (чорні лінії) або різним мутованим по аланіну вірусом МІ4.3. Клітини фарбували лігандами для МСЕК (природний рецептор цитотоксичності) (МКр30-І9д, МКр44-Іу або МКр46-Ід білки злиття). Порогове значення на гістограмах встановлювали по СО4-Т клітинам.

Накладення показує експресію лігандів МСК на ВІЛ-інфікованих клітинах в порівнянні з неінфікованими клітинами. Числа відповідають частці СО4-Т клітин, що експресують ліганди

МОВ. (Б) Експресія МКр44Ї на очищених СО: Т клітинах, які не обробляли (ШТ) або обробляли пептидами з дикого типу (М/Т) або з мутованими по аланіну синтетичними пептидами З35/др41 мотиву З35/др41. Клітини або фарбували або тАбр (моноклональне антитіло) проти МКр44їЇ. або ізотопічним контролем ІДМ (імуноглобулін) (пунктирні лінії). Порогове значення на гістограмах встановлювали по підгрупі СО4-. Накладення показує експресію МКр441ї. порівняно з ізотопічним контролем. Числа відповідають частці 204-Т клітин, що експресуючих МКр44ї. (В) Активність дегрануляції оцінювали на активованих ІЇ (інтерлейкін 2) клітинах МК (природна клітина-кілер) проти аутологічних клітин СО4-Т, при Е/Г співвідношенні: 1/1, у присутності тАб проти СО107а. Очищені клітини СОА-Т не інфікували (МІ) або інфікували вночі диким типом (М/Т) або мутованими по аланіну З35/д9р41 вірусами Мі 4.3. На точковому графіку відкладали кількість МК клітин СО3-СО56", в залежності від експресії МКр44 і СО107а. Число на будь-якій панелі відповідає частці позитивних МК клітин. (ГУ Ефективність дегрануляції МК клітин проти аутологічних очищених СО4- Т клітин при співвідношенні Е/Т: 1/1, у присутності тАб проти СО107а. Са: Т клітини не обробляли (ОТ) або обробляли пептидами від дикого типу (М/Т) або мутованим по аланіну синтетичними пептидами мотиву З5/др41. С04-Т клітини інкубували з аутологічними МК клітинами, активованими 1/2.

Порогове значення на гістограмах встановлювали по клітинам МК СО3С0567, експресуючим

МКр44. Накладення показує експресію СО107а МК клітинами, що аналізовано в присутності аутологічних клітин СОА-Т, які оброблено або диким типом (МТ), або синтетичними пептидами з5/др41 з мутацією по аланіну, порівняно з необробленими клітинами. Числа відповідають частці МК клітин, що експресують СО107а. Мутовані по аланіну віруси МІ 4.3, віруси або пептиди з5/др41 називаються 5613А, УУб14А, 5615А, Мб16А, Кб17А і 5618А.

Фіг 4. Нейтралізація вірусної інфекції та інгібування МКр44Ї на СО4: Т клітинах і дегрануляції МК клітин за допомогою мишачих Ід, що утворюються у даних мутантів 35/9р41 по аланіну.

Очищені клітини СО4-Т інфікували Мі4.3 (ліва панель) або МОК (права панель) компетентними вірусами, попередньо інкубованими протягом 30 хв з очищеним Ід, які отримано з мишей, імунізованих тільки ад'ювантом (Ід-Ааі, ф), дикого типу (М/Т, х) або мутованим по аланіну З5/др41вірусом МІ 4.3, що включає 5613А ( ш), МУ614А (р), 5615А (2), Мб16А (0), Кб17А (Ф) і 56184А (П). (А) Компетентні віруси (200ТС1ІО50о) інкубували з очищеним Ід в різній концентрації, що знаходиться в інтервалі від 0 до 20 мкг/мл, протягом 30 хв з подальшим додаванням РНА (фітогемаглютинін)-активованих очищених СО4-Т клітин. На 6 день після інфікування антиген рг24 визначали кількісно в клітинному супернатанті. (Б) Вплив, що залежить від часу. Компетентні віруси (200ТС1ІЮОз5о) інкубували з 1Омкг/мл Ід протягом 30 хв з подальшим додаванням РНА-активованих очищених СО4-Т клітин. Рівень р24 аналізували в клітинному супернатанті кожні 2 дні протягом 10 днів після інфікування. (В) Експресію МКр44їЇ на С04-Т визначали через 17 годин після інфікування. На гістограмах відкладали підгрупу клітин СО4-. Показана методом накладання експресія МКр44ї порівняно з ізотиповим контролем ІДМ. Числа відповідають частці позитивних клітин. (Г) Дегрануляція аутологічних МК клітин. СО4-Т клітини інкубували з аутологічними. МК клітинами при співвідношенні Е/Т: 1/1 в присутності тАб проти СО107а. На точковому графіку відкладали кількість клітин МК СО3-СО56:" в залежності від експресії МКр44 і Ср107а. Число на будь-якій панелі відповідає частці позитивних клітин. Мутовані по аланіну віруси МІ 4.3 або пептиди 35/д9р41 називають 5613А, УМ614А, 5615А, Мб616А, Кб17А і 56184А.

Фіг. 5. Нейтралізація вірусної інфекції та інгібування МКр44їЇ на бра: клітинах і дегрануляція клітин МК за допомогою імунопреципітованого антитіла до М/614А, виділеного з ВІЛ-інфікованих пацієнтів.

РНА-активовані СО4-Т клітини інфікували МІ 4.3 (ліва панель) або МОК (права панель) компетентними вірусами, попередньо інкубованих протягом 30 хв з моноклональним антитілом до 3-5-МТ (Апіі-45, 0), з очищеним імуносорбційним методом антитілом до 35-М/Т, що отримано від 1 ВІЛ-інфікованого пацієнта (2117, (І) або з очищеним імуносорбційним методом антитілом до 35-МУ614А, що отримано від 5 ВІЛ-інфікованих пацієнтів: 224 (Ф), 544 (т), Яб5 (А), 1 (ж)і оо (Ф). (А) Компетентні віруси (200ТСІЮ5о) інкубували з очищеним імуносорбційним методом антитілом в різній концентрації, що знаходиться в інтервалі від 0 до 2 мкг/мл, протягом 30 хв з подальшим додаванням СО4-Т клітин. На 6 день після інфікування антиген р24 визначали бо кількісно в клітинному супернатанті.

(Б) Вплив, що залежить від часу. Компетентні віруси (200ТСІО50о) інкубували з мкг/мл очищеного імуносорбційним методом АБ протягом 30 хв з подальшим додаванням РНА- активованих очищених СО4-Т клітин. Рівень р24 аналізували в клітинному супернатанті кожні 2 дні протягом 10 днів після інфікування. (В) Експресію МКр44ї на клітинах СО4-Т визначали через 17 годин після інфікування. На гістограмах відкладали підгрупу клітин СО4-Т. Показана методом накладання експресія МКр44ї. порівняно з ізотопічним контролем ІДМ. Числа відповідають частці позитивних клітин. (Г) Дегрануляція аутологічних МК клітин. СО4-Т клітини інкубували з аутологічними. МК клітинами при співвідношенні Е/Т: 1/1 в присутності тАб проти СО107а. На точковому графіку відкладено число клітин МК СОЗ3-СО56: в залежності від експресії МКр44 і СО107а. Число на будь-якій панелі відповідає частці позитивних клітин МК. Мутовані по аланіну віруси Мі 4.3 або пептиди 35/д9р41 називають 5613А, УМ614А, 5615А, Мб616А, Кб17А і 56184А.

Фіг. 6. Експресія МКр44Ї та дегрануляція аутологічних клітин МК, опосередкована інактивованими нагріванням мутантами по аланіну 35/9р4і1 на клітинах СОА-Т.

Очищені клітини СО4-Т не обробляли або обробляли протягом ночі 100 нг р24 еквівалентного антигену на мл інактивованого нагріванням вірусу дикого типу (М/Т) МІ 4.3 або з різними мутантами за аланину вірусів 35/др41. (А) Експресію МКр44Ї на СО4-Т визначали через 17 годин після інфікування. Порогове значення на гістограмах встановлювали по підгрупі клітин СО4-Т. Накладення показує експресію МКр44| порівняно з ізотопічним контролем ДМ. Числа відповідають частці позитивних клітин. (Б) Дегрануляція аутологічних МК клітин. СО4-Т клітини інкубували з аутологічними МК клітинами при співвідношенні Е/Т: 1/1 в присутності тАб проти СО107а. На точковому графіку відкладено число клітин МК СОЗ3-СО56: в залежності від експресії МКр44 і СО107а. Число на будь-якій панелі відповідає частці позитивних клітин МК. Мутовані по аланіну віруси МІ 4.3 або пептиди 35/д9р41 називають 5613А, УМ614А, 5615А, Мб616А, Кб17А і 56184А.

Докладний опис винаходу

Згідно з даним винаходом головним чином запропоновано імуногенні композиції або вакцинні композиції проти ВІЛ-1, де імуногенні композиції або композиції вакцини включають

Зо конкретні антигенні пептиди, що роблять, переважно, можливою індукцію утворення нейтралізуючих антитіл проти ВІЛ-1 широкого спектру дії.

В ідеальному випадку ефективна ВІЛ-1 вакцина повністю блокує інфекцію. В дійсності може бути більш реалістичним розробити близьку до оптимальної безпечну і ефективну вакцину, яка значно знижує інфікування, так і запобігає елімінацію СО4-Т клітин. Головна мета даної стратегії пов'язана зі здатністю генерувати утворення нейтралізуючих антитіл широкого спектру дії (БМАБ), володіють також здатністю діяти на елімінацію СО4-Т клітин, що здавалося нездійсненним на попередньому рівні техніки.

Таким чином, згідно з даним винаходом запропоновано нові речовини і композиції для попередження і/або лікування інфекції організму ссавця, переважно людину, яку викликано вірусом ВІЛ-1.

Згідно винаходу виявили, що сімейство конкретних пептидів, які розділяють високу ідентичність послідовності з відомим др41-похідним пептидом під назвою "35", викликають іп мімо продукцію БМАБ проти ВІЛ-1.

В даному документі показано, що дані конкретні пептиди викликають високу нейтралізуючу активність і нейтралізуючу активність широкого спектру дії проти різних клінічних ізолятів вірусу

ВІЛ-1, порівняно з відомими пептидами, які є похідними від др41 білка ВІЛ-1, включаючи відомий пептид "357, який наведено вище.

Дуже важливим є те, що згідно винаходу було також виявлено, що дані конкретні пептиди не ініціюють чутливість СО4-Т клітин до лізису, що здійснюються клітинами МК, незважаючи на те, що повна функціональність клітин МК, включаючи дегрануляцію, залишається незмінною.

Крім того, показали, що антитіла до даних конкретних пептидів блокують чутливість СО4-Т клітин до лізису, що здійснюються МК клітинами, який стимулюється при розвитку інфекції, що викликано вірусом ВІЛ-1.

Даний винахід відноситься до імуногенної композиції, що включає в себе антигенний пептид нижченаведеної формули (1):

МІ-5-Х1-Х2-Х3-К-Х4-СЯ (І) (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 1-СЯ, де - Мі складається з пептиду, що включає в себе від 0 до 100 амінокислот у довжину, - Сі складається з пептиду, що включає в себе від 0 до 100 амінокислот у довжину, - кожен з Х1-Х4 складається з амінокислотного залишку, де:

- (Ї) Х1 позначає конкретну амінокислоту МУ, або (ії) Х1 позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком МУ, - () Х2 позначає конкретну амінокислоту 5, або (ії) Х2 позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком 5, - () ХЗ позначає конкретну амінокислоту М, або (ії) ХЗ позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком М, - (ї) Х4 позначає конкретну амінокислоту 5, або (ії) Хі позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком 5, за умови, що - три із чотирьох амінокислотних залишків Х71, Х2, ХЗ і Х4 позначають конкретну амінокислоту, яку визначено у їх відповідному вищевказаному значенні (Її), і - амінокислотний залишок, який залишився серед Х1-Х4 позначає будь-який амінокислотний залишок, за винятком конкретного амінокислотного залишку, визначеного у своєму значенні (1), за умови, що пептид формули (І) не означає пептид 5ЕО ІО Мо 18, який розкрито у заявці РСТ, що опубліковано як УМО 2011/005289.

Пептид ЗЕО ІО Мо 18, який описано у заявці РСТ, що опубліковано як УМО 2011/005289, має наступну амінокислотну послідовність: "Ас-ІНМНАІАТМРАЇІМК(Ас) ТЕМУ 6БМКАКВІСОСО-МН»г" (5ЕО ІО Мо 16 даної заявки на патент).

МЕ пептид, що включає в себе від 0 до 100 амінокислотних залишків у довжину, охоплює пептиди, що включають в себе 0,1,2,3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 і 100 амінокислотних залишків у довжину.

СІ пептид, що включає в себе від 0 до 100 амінокислотних залишків у довжину, охоплює пептиди, що включають в себе 0,1,2,3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, Зб, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 991100

Зо амінокислотних залишків у довжину.

Як вже згадувалося раніше, пептид формули (І), при застосуванні в імуногенній композиції, переважно в комбінації з одним чи більш ніж одним імуноад'ювантом, викликає продукцію антитіл, які блокують інфікування СОА-Т клітин вірусами ВІЛ-1 і/або блокують поширення вірусу

ВІЛ-1 на неінфіковані СО4-Т клітини, як показано, на майже невиявленій продукцією р2і4 САТ клітинами, що наведено в контакт як з вірусами ВІЛ-1, так і з антитілами, що спрямовані проти пептиду формули (1).

Додатково, на відміну від інших ВІЛ-похідних пептидів, які застосовували в даній області в якості антигенів ВІЛ, включаючи "35" пептид (що показано на фіг. 1), пептид формули (І) не ініціює експресію МКр44їЇ на поверхні СОА-Т клітин і таким чином не ініціює руйнування СОА-Т клітин клітинами МК.

Більш того, антитіла, що утворені в індивідуума, імунізованих пептидом формули (І), здатні блокувати опосередкований МКр44їЇ лізис СО4-Т клітин, що здійснюється МК клітинами, без порушення будь-якої іншої функції МК клітин, які включають дегрануляцію.

Таким чином, згідно з даним винаходом запропоновано високоефективний терапевтичний засіб, який можна застосовувати для профілактики, і для лікування інфекції, яку викликано вірусом ВІЛ-1.

Імуногенна композиція, яку застосовують згідно винаходу, включає антигенний пептид формули (І), який, при введенні даної імуногенної композиції індивідууму, збільшує продукцію антитіл, спрямованих проти зазначеного пептиду формули (І), які наділені нейтралізуючими властивостями по відношенню до безлічі клінічних ізолятів ВІЛ-1, як показано в прикладах в даному документі. Як проілюстровано додатково в даному описі, антигенний пептид формули (І) може бути переведений в імуногенний стан за допомогою сполуки з молекулою-носієм і/або за допомогою комбінації з одним чи більш ніж одним імунним ад'ювантом.

Імуногенну композицію, що включає поліпептид формули (І), можна застосовувати профілактично проти інфекції, що викликано вірусом ВІЛ-1, викликаючи утворення антитіл, які сильно знижують або навіть блокують інфікування клітин СО4 даним вірусом ВІЛ-1.

Імуногенну композицію, що включає поліпептид формули (І), можна застосовувати для лікування інфікованого ВІЛ-1 індивідуума, викликаючи утворення антитіл, які сильно знижують або навіть блокують інфікування СО4-Т клітин вірусами ВІЛ-1, які вже реплікувались в бо інфікованому індивідуумі.

Як показано в прикладах в даному документі, антитіла проти ВІЛ-1, які отримують після імунізації ссавця імуногенною композицією, що включає в себе антигенний пептид формули (І), яка складаються з нейтралізуючих антитіл, які можуть володіти ІСзо (напівмаксимальна інгібуюча концентрація) менше ніж 20 мкг/мл, в аналізі СО4-Т клітин-рг24.

Зазвичай аналіз СО4-Т клітин-р24 включає стадії: а) отримання досліджуваної суміші за допомогою приведення компетентного по відношенню до реплікації вірусу ВІЛ-1 у контакт з відомою кількістю антитіл, що підлягають тестуванню, б) інкубування РНА-активованих СО4-Т клітин з тестуючою сумішшю, що отримано наприкінці стадії а), в присутності ІІ -2 ї в) визначення активності р24 в клітинних культурах СОА-Т, отриманих у кінці стадії б), і г) визначення значення ІСво тестованих антитіл за допомогою порівняння активності р24, визначеної на стадії в), для відомої кількості антитіл, які додано на стадії а), з активністю ра24, що виявлено в тому ж самому тесті, де стадію а) проводять у відсутності антитіл проти ВІЛ.

Як правило, для виконання аналізу нейтралізації описаного вище, проводять серію випробувань, коли на стадії а) застосовують зростаючу відому кількість антитіл, які тестуються.

Повністю докладний опис аналізу нейтралізації надано в прикладах даного документу.

Отримані авторами винаходу результати показують, що імуногенну композицію, що включає антигенний пептид формули (І), можна застосовувати з високим ступенем безпеки для індивідуума, який потребує її, так як дана імуногенна композиція не викликає небажаних побічних ефектів, а саме не впливає на функціональність клітин СОА-Т, порівняно з відомими антигенними пептидами проти ВІЛ (наприклад, "35" пептид, показаний на фіг. 1).

Додатково, імуногенна композиція, що включає в себе антигенний пептид формули (Її), є дуже потужним терапевтичним засобом проти ВІЛ завдяки своїй плейотропній дії проти ВІЛ-1 інфекції, включаючи (ї) утворення антитіл, наділених нейтралізуючою активність широкого спектру дії проти цілого ряду клінічних ізолятів ВІЛ-1 і (ії) блокування лізису СОА-Т клітин, що здійснюється клітинами МК.

Більш того, імуногенна композиція, що включає в себе антигенний пептид формули (Її), наділена високою селективністю дії, так як, для ілюстрації, вона порушує виключно активність

МК клітин, яка спрямована проти СО4, в той же самий час, не надаючи впливу на важливу

Зо функцію антимікробного імунітету клітин МК, подібно дегрануляції.

Таким чином, імуногенна композиція, що включає в себе антигенний пептид формули (1), (ї) має активність, яка спрямована проти ВІЛ-1, за допомогою індукції утворення нейтралізуючих антитіл проти ВІЛ-1 широкого спектру дії, і (її) захищає функціональність імунної системи ВІЛ-1- інфікованого індивідуума, (а) захищаючи С04-Т клітини від руйнування і (б) стежить за тим, щоб неспецифічні антимікробні функції імунної системи залишалися повністю функціональними.

Ілюстративні втілення пептидів формули (І) розкриті на фіг. 1, які включають "М/614А" або "М2" (ЗЕО ІО Мо 12 в даному документі), (ії) "5615А" або "М3" (5ЗЕО ІЮО Мо 13 в даному документі), (іїї) "МБ16А" або "Ма" (ЗЕО ІО Мо 14 в даному документі) і (ім) "5618А" або "Мб" (ЗЕО

ІО Мо 15 в даному документі).

Важливим є те, що, як показано у прикладах даного документа, інші пептиди, які включають в себе високий рівень амінокислотної ідентичності з пептидами формули (І), які подібні конкретним пептидам, названим 5613А (або "М1") ї Кб17А (або "М5"), що представлено на фіг. 1, не наділені будь-якою властивістю проти ВІЛ пептидів формули (І). Для ілюстрації, пептиди

З613А і Кб17А (ії) не викликають утворення нейтралізуючих антитіл проти ВІЛ, (ії) ініціюють експресію МКр44їЇ клітинами С04 і таким чином також чутливість СО4-Т клітин до лізису, що здійснюється МК клітинами, і (ії) не викликають продукцію антитіл, здатних знижувати або блокувати чутливість СО4-Т клітин до лізису, що здійснюється МК клітинами.

Дуже несподівано, як показали автори винаходу, що пептиди З5613А і Кб17А, які вищевказано, викликають утворення антитіл, які добре розпізнають послідовності дикого типу, який експресовано вірусами ВІЛ-1, незважаючи на те, що дані пептиди не здатні викликати утворення нейтралізуючих антитіл проти ВІЛ-1 вірусів.

Також дуже несподівано, як показано в прикладах даного документа, що пептиди формули (ЇЇ викликають утворення антитіл, які не взаємодіють з послідовностями дикого типу, який експресовано вірусами ВІЛ-1, як показано в Таблиці 4. Дані несподівані результати говорять про те, що пептиди формули (І) структурно відрізняються від відповідних послідовностей ВІЛ-1 дикого типу, хоча вони викликають утворення нейтралізуючих антитіл проти ВІЛ-1 широкого спектру дії. Дані результати явно суперечать тому, що очікував би фахівець в даній області при пошуку антигенних сполук для індукції ефективної імунної відповіді на інфекцію, що викликано вірусом ВІЛ-1.

З іншої сторони, пептиди, які включають в себе послідовності, близькі до пептиду формули (І), що подібні до наведених вище 5613А і Кб17А пептидів, очевидно, структурно тісно пов'язані з послідовностями ВІЛ-1 дикого типу і здатні викликати утворення антитіл, які розпізнають дані послідовності дикого типу, хоча дані антитіла не володіють будь-якими властивостями антитіл проти ВІЛ-1.

Результати, викладені в даному документі, показують, що спеціаліст в даній області не міг очікувати (ї) ні безпеки пептиду формули (І), ні (її) різних, спрямованих проти ВІЛ властивостей антитіл до пептиду формули (І).

Додатково, очікується, що пептид формули (І) володіє лінійною просторовою структурою.

Автори винаходу також показали, що антитіла, які спрямовані проти пептиду формули (1), можуть бути виявлені у невеликого числа індивідуумів, інфікованих ВІЛ-1 вірусом. Виявили сильну кореляцію між (ії) наявністю антитіл, спрямованих проти пептиду формули (І) у даних

ВІЛ-1-інфікованих індивідуумів, і (її) низьким ВІЛ-1 вірусним навантаженням, а також великою кількістю СО4-Т клітин. Дані результати очевидно показують високу ефективність іп мімо антитіл, які спрямовані проти пептиду формули (І), для попередження і/або лікування інфекції індивідуума, що викликано вірусом ВІЛ-1.

Приклади даного документа також ілюструють, що мутація вірусу ВІЛ-1, яка кодує мутантний білок др41, що несе одну з мутацій УМ/б614А і 5618А, які представлені у втіленнях пептидів формули (І), включають в себе сильно знижену здатність інфікувати людську лімфобластну клітинну лінію і не ініціюють експресію МКр44Ї СрА-Т клітинами. Дані результати говорять про те, що нездатність пептиду формули (І) ініціювати експресію МКр44Ї С0А-Т клітинами також виявляють в суцільних вірусах, які експресують конкретні варіанти др41 білків.

У даному контексті попередження або лікування інфекції індивідуума, яку викликано ВІЛ-1 вірусом, охоплює (І) попередження або лікування захворювання, пов'язаного з інфекцією даного індивідуума, яку викликано вірусом ВІЛ-1, включаючи СНІД, та (ії) попередження розвитку ВІЛ-1 захворювання.

У даному контексті термін "ВІЛ-інфекція" головним чином охоплює інфікування тварини- хазяїна, переважно людини, вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ-1) типу 1. "ВІЛ-1" можна використовувати в даному документі для того, щоб посилатися на будь-які штами, форми, підтипи, клади та різновиди в сімействі ВІЛ-1. Таким чином, лікування ВІЛ-1 інфекції буде охоплювати лікування суб'єкта, який є носієм будь-якого з сімейства ВІЛ-1 ретровірусів, або суб'єкта, у якого діагностовано активний СНІД, а також лікування або профілактику станів, пов'язаних зі СНіДом, у таких суб'єктів. Носія ВІЛ-1 можна ідентифікувати будь-якими способами, відомими з рівня техніки. Наприклад, суб'єкт може бути ідентифікований як носій

ВІЛ-1 на основі того, що суб'єкт є позитивним щодо антитіл проти ВІЛ-1 або ВІЛ-1-позитивним, або має симптоми СНІДу. Тобто, під "лікуванням ВІЛ-1 інфекції" слід розуміти лікування пацієнта, який перебуває на будь-якій одній з декількох стадій розвитку інфекції ВІЛ-1, які, наприклад, включають синдром гострої первинної інфекції (які можуть бути безсимптомними або пов'язані з грипоподібним захворюванням та лихоманками, поганим самопочуттям, діареєю та неврологічною симптоматикою, такий як головний біль), безсимптомну інфекцію (яка є тривалим латентним періодом з поступовим зниженням числа циркулюючих в крові САТ клітин) і СНІД (який характеризується більш серйозними захворюваннями, які визначаються як

СНІД, і/або зниженням числа циркулюючих в крові СО4 клітин нижче рівня, який сумісний з ефективною імунною функцією). Додатково, "лікування або попередження ВІЛ-1 інфекції" буде також охоплювати лікування пацієнта з підозрою на інфекцію, викликану ВІЛ-1, після впливу на підозрюваного ВІЛ-1, внаслідок, наприклад, контакту із зараженою ВІЛ-1 кров'ю, переливання крові, заміни рідин організму, "небезпечного" сексу з інфікованим суб'єктом, випадкового уколу голкою, нанесення татуювання або голюоювколювання зараженими інструментами, або передачі вірусу від матері до дитини під час вагітності, пологів або незабаром після цього.

Термін "лікування ВІЛ-1 інфекції" слід розуміти в контексті антиретровірусної терапії, є пацієнти повністю сприйнятливими або частково сприйнятливими до такої терапії з точки зору вірусного навантаження і/або числа СО4-Т клітин.

Термін "попередження ВІЛ-1 інфекції" може охоплювати лікування суб'єкта, який не інфіковано ВІЛ-1, але, як вважають, піддається ризику інфікування ВІЛ-1, рано чи пізно.

Під терміном "лікування СНІДу" мається на увазі лікування пацієнта, у якого виявляються більш серйозні захворювання, що визначають СНІД, і/або зниження кількості циркулюючих в крові клітин СОА-Т клітини нижче рівня, який сумісний з ефективною імунною функцією. Термін "лікування СНІДу" також охоплює лікування пов'язаних зі СНІДом станів, під якими маються на увазі розлади і захворювання, властиві або пов'язані зі СНІД або ВІЛ-1 інфекцією, такі як СНІД- бо асоційований комплекс (АКС), прогресуюча генералізована лімфаденопатія (РОЇ),

захворювання, позитивні по відношенню до антитілам проти ВІЛ, і ВІЛ - позитивні захворювання, неврологічні захворювання, пов'язані зі СНІДом, (такі як деменція або тропічний парапарез), саркома Капоші, тромбоцитопенія пурпурова і пов'язані опортуністичні інфекції, такі як інтерстиціальна плазмоклітинна пневмонія, мікробактеріальний туберкульоз, кандидоз стравоходу, токсоплазмоз мозку, СММ (цитомегаловірусний) ретиніт, енцефалопатія, пов'язана з ВІЛ, синдром виснаження при ВІЛ-1-інфекції і т.д.

Таким чином, під терміном "попередження СНІДу" в даному контексті мається на увазі попередження у пацієнта, у якого є ВІЛ-1 інфекція, або пацієнта з підозрою на ВІЛ-1 інфекцію, або пацієнта, який наражається на ризик інфікування ВІЛ-1, розвитку СНІДу (який характеризується більш серйозними захворюваннями, який визначається як СНІД, і/або зниженням числа циркулюючих в крові СО4-Т клітин нижче рівня, який сумісний з ефективною імунною функцією) і/або захворювань, пов'язаних зі СНІДом.

Таким чином, під терміном "попередження розвитку ВІЛ-1" в даному контексті мається на увазі попередження у пацієнта, у якого є ВІЛ-1 інфекція, зниження його кількості СЮО4-Т клітин іабо попередження збільшення вірусного навантаження, двох головних маркерів, пов'язаних з ускладненням захворювання і збільшенням тяжкості захворювання.

В даному контексті амінокислотні залишки охоплюють аланін (також названий "А" або "Аїа"), аргінін (також названий ("К" або "Агд"), аспарагін (також названий "М" або "Авп"), аспарагінова кислота (також названа "О" або "Азр"), цистеїн (також названий "С" або "Сув"), глутамін (також названий "ОО" або СіІп"), глутамінова кислота (також названа "Е" або "Сіи), гліцин (також названий "с" або "СіІу"), гістидин (також названий "Н" або "Нів"), ізолейцин (також названий "і" або "Пе"), лейцин (також названий "І" або "І еи"), лізин (також названий "К" або "Гув"), метіонін (також названий "М" або "Меї"), фенілаланін (також названий "Р" або "Рпе"), пролін (також названий "Р" або "Рго"), серин (також названий "5" або "Зег"), треонін (також названий "Т" або "Тпг"), триптофан (також названий "МУ" або "Тгр"), тирозин (також названий "У" або "Туг") і валін (також названий "У" або "Ма!").

Всі амінокислоти в пептидах щодо винаходу можуть перебувати як у О-, так і в І -формі, хоча в природі зустрічаються переважно І -форми.

Таким чином, в пептиді вищенаведеної формули (І), коли амінокислотний залишок Х1 позначає (ії) будь-який амінокислотний залишок, за винятком МУ, тоді амінокислотний залишок

Х1 може позначати будь-які з амінокислотних залишків А, Б, М, О, С, ОО, Е, б, Н, І, С, К, М, Е, Р,

Т, 5, М або М. Таке ж пояснення застосовують для позначень будь-яких Х1, Х2, ХЗ і Х4 амінокислотних залишків антигенного пептиду формули (1).

Не бажаючи бути пов'язаними з будь-якою певною теорією, автори винаходу вважають, що пептид формули (І) є просторово лінійним, будучи суспендованим в фізіологічно сумісному сольовому розчині (наприклад, 0,15 М розчин масі).

Таким чином, в деяких втіленнях пептиду формули (І) значення (ії) будь-якого з амінокислотних залишків Х1, Х2, ХЗ і Х4, включає в себе амінокислотний залишок, який не генерує зміну просторової конформації, в порівнянні з амінокислотним залишком позначення (і)

Х1, Х2, Х3З і ХА відповідно.

У деяких втіленнях пептиду формули (І), значення (ії) будь-якого з амінокислотних залишків

Х1, Х2, Х3З і Х4 включає в себе незаряджений амінокислотний залишок невеликого розміру.

У деяких втіленнях пептиду формули (І) значення (ії) будь-якого з амінокислотних залишків

Х1, Х2, ХЗ їі Х4 вибрано з групи, що складається з аланіну (АЇа або А), цистеїну (Су або С), гліцину (Су або С) і валіну (Маї або М).

У деяких втіленнях пептиду формули (І) значення (ії) будь-якого з амінокислотних залишків

Х1, Х2, ХЗ їі Х4 вибрано з групи, що складається з аланіну (АЇа або А), цистеїну (Су або С), гліцину (Су або с), валіну (Маї або М) і проліну (Рго або Р).

В деяких переважних втіленнях пептиду формули (І) значення (ії) будь-якого з амінокислотних залишків Х1, Х2, ХЗ і Х4 включає незаряджений амінокислотний залишок невеликого розміру, що включає неполярний бічний ланцюг. Деякі переважні незаряджені амінокислотні залишки невеликого розміру вибрані з групи, що складається з гліцину (Су або

С), аланіну (Аа або А), валіну (маї або М), лейцину (Гец або ГІ), ізолейцину (Іе або І), метіоніну (Меї або М), фенілаланіну (Ріє або РЕ), проліну (Рго або Р) і триптофану (Тгтр або УМ). Більш переважно, незаряджені амінокислотні залишки невеликого розміру, що включають неполярний бічний ланцюг, які вибрано з групи, що складається з гліцину (Су або с), аланіну (Аа або А), валіну (мМаї або М), лейцину (І еи або І), ізолейцину (Іе або І), проліну (Рго або Р) і метіоніну (Меї або М). В інших переважних втіленнях незаряджені амінокислотні залишки невеликого розміру, що включають неполярні бічні ланцюги, які вибрано з групи, що складається з гліцину (Су або

С), аланіну (АЇа або А), валіну (мМаї або М), лейцину (І ем або ГІ), ізолейцину (Іе або І) і метіоніну (Меї або М).

У деяких даних переважних втіленнях значення (ії) будь-якого з амінокислотних залишків Х1,

Х2, ХЗ і Х4 вибрано з групи, що складаються з аланіну (Аа або А), гліцину (Су або с) і валіну (ма! або М).

У деяких переважних втіленнях пептиду формули (І) значення (ії) будь-якого з амінокислотних залишків Х1, Х2, Х3 і Х4 включає залишок аланіну (Аа або А).

У деяких втіленнях пептиду формули (І) кожен з чотирьох амінокислотних залишків Х1, Х2,

ХЗ І Х4 позначає своє значення (ії).

У деяких втіленнях пептиду формули (І) три амінокислотні залишки серед Х1, Х2, ХЗ і хХ4 позначають, незалежно один від двох інших, своє значення (ії), а четвертий амінокислотний залишок серед Х1, Х2, ХЗ і Х4 позначає своє значення (і).

У деяких втіленнях пептиду формули (І) два амінокислотні залишки серед Х1, Х2, ХЗ і ХА позначають, незалежно один від двох інших, своє значення (ії), а два інших амінокислотні залишки серед Х1, Х2, ХЗ і Х4 позначають, незалежно один від іншого, своє значення (і).

В деяких переважних втіленнях пептиду формули (І) тільки один амінокислотний залишок серед Х1, Х2, Х3З і Х4 позначає значення (ії), а будь-який з інших амінокислотних залишків серед

Х1, Х2, ХЗ і Х4 позначає своє значення (|).

Таким чином, в деяких переважних втіленнях пептиду вищенаведеної формули (1): - Х1 позначає вищенаведене значення (ії), а кожен із Х2, ХЗ і Х4 позначає своє відповідне вищенаведене значення (ії), або - Х2 позначає вищенаведене значення (ії), а кожен з Х1, ХЗ і Х4 позначає своє відповідне вищенаведене значення (ії), або - ХЗ3 позначає вищенаведене значення (ії), а кожен з Х1, Х2 і Х4 позначає своє відповідне вищенаведене значення (і), або - Хі позначає вищенаведене значення (ії), а кожен з Х1, Х2 і ХЗ позначає своє відповідне вищенаведене значення (і).

Вищенаведені втілення є найбільш переважними, так як вважають, що одна заміна амінокислоти (тобто один амінокислотний залишок, що позначає значення (ії)) серед Х1, Х2, ХЗ і

Зо Ха мінімізує ризик зміни просторової конформації порівняно з пептидом, де всі із Х1, Х2, ХЗ і Хх4 залишків позначають своє відповідне значення (ї), і таким чином збільшить шанси того, щоб обумовлювати хороші властивості, спрямовані проти ВІЛ, тобто викликати утворення нейтралізуючих антитіл проти ВІЛ.

У ще одних втіленнях антигенного пептиду формули (І) даний антигенний пептид включає амінокислотну довжину, становить не більше ніж 200 амінокислотних залишків. Дані втілення охоплюють пептиди формули (І), що включають 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 і 200 амінокислотних залишків у довжину. У деяких з даних переважних втілень пептид формули (І) включає від 10 до 26 амінокислотних залишків у довжину, який включає від 15 до 20 амінокислотних залишків у довжину.

Пептид формули (І) у даному контексті можна отримувати відомим методом клонування або шляхом хімічного синтезу.

Наприклад, ДНК, що кодує пептид формули (І), отримують шляхом застосування методу клонування і вставляють у автономно реплікаційний вектор з отриманням рекомбінантної ДНК.

Рекомбінантну ДНК вводять до відповідного господаря, такого як ЕвсПегісніа сої, Васйив5 5ибійй5, Асііпотусев, дріжджі, нитковий гриб, рослинна клітина, клітина комахи і тваринна клітина, з отриманням трансформанта. З культивованого продукту трансформанта можна отримувати пептид, що включає пептид формули (І). В якості альтернативи, отримують ДНК, що кодує пептид формули (І) і поміщають її в безклітинну білковосинтезуючу систему з використанням зародків пшениці і клітинного екстракту з ЕзсПегіспіа соїї для синтезу пептиду щодо винаходу. У деяких втіленнях, коли пептид формули (І) пов'язаний з білком-носієм, тоді імуногенний продукт, що складається з білка злиття, що складається як з пептиду формули (Її),

так ії з необхідного білока-носіяї, може бути синтезований за допомогою технології рекомбінантних ДНК.

Більш того, застосовуючи загальноприйнятий спосіб хімічного синтезу для пептиду формули (І), такий як "твердофазний метод" або "рідкофазний метод", амінокислоти вдало пов'язують і подовжують за допомогою дегідратації/конденсації.

Крім того, коли пептид формули (І) пов'язаний з необхідним пептидом або поліпептидом, наприклад, з білковою молекулою-носієм, можна синтезувати імуногенний продукт, що включає антигенний пептид формули (1).

Пептид формули (І) охоплює наступні антигенні пептиди: - М5-Х-5-М-К-5-СІ (Іа) - (М5ЕО ІЮО Ме2-С), - М5-МУ-Х-М-К-5-СЯ (16) - (МІ-ЗЕО ІЮО Мо 3-СЮ, - МІ-5-МУ-5-Х-К-5-СЯ (Ів) - (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 4-СЮ і - МІ-5-МУ-5-М-К-Х-СІ (Іг) - (МІ-ЗЕО ІЮО Мо 5-С1), де: - МГ ї Сї відносяться до одного і того ж значення, як для пептиду формули (І), визначеного вище, і - Х є будь-яким амінокислотним залишком, за винятком: УМ (Іа), З (Іб), М (Ів) та 5 (Іг).

У даних втіленнях пептиду формули (І) даний "будь-який амінокислотний залишок" є залишком аланіну (також названий "А"). В даних втіленнях амінокислотний залишок "Х" будь- якого з пептидів формул (Іа)-(Іг) означає "А".

У переважних втіленнях пептид формули (І) обраний із групи, що складається з: - МЕЕЗАБМКО-СЇ (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 6-СЯ), - МЕ БУМАМК5-СЇ (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 7-СЯ), - МЕ ЗБМ/БАК5Б-СІ (МІ-ЗЕО ІЮО Мо 8-СЮ і - М БМ/ЗМКА-СІ (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 9-С4).

У переважних втіленнях антигенного пептиду формули (І) МЕ (для "М-кінцевої області") складається з пептиду, що включає в себе від 1 до 10 амінокислотних залишків у довжину, який включає від 1 до 5 амінокислотних залишків у довжину. Таким чином, згідно з даними втіленням

МІ є пептид, що складається з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислотних залишків у довжину.

У деяких втіленнях Мі включає 5 або 6 амінокислотних залишків у довжину.

У переважних втіленнях пептиду формули (І) Мі включає в себе або в якості альтернативи складається з амінокислотної послідовності МН2-РУМА-СООН |ЗЕО ІО Мо 10).

У переважних втіленнях антигенного пептиду формули (І) Сі (для "С-кінцевої області) складається з пептиду, що включає в себе від 1 до 10 амінокислотних залишків у довжину, який включає від 1 до 5 амінокислотних залишків у довжину. Таким чином, згідно з даними втіленням

СІ є пептидом, що складається з 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислотних залишків у довжину. У деяких втіленнях Сі включає 5 або 6 амінокислотних залишків у довжину.

У переважних втіленнях пептиду формули (І) Сі включає в себе або в якості альтернативи складається з амінокислотної послідовності МНо- ОБІМ-СООН |ЗЕО ІЮ Мо 111.

Кожен із МЕ і Сі пептидів безпосередньо зв'язаний ковалентним зв'язком з відповідним кінцем пептиду 5-Х1-Х2-Х3-К-Х4, переважно ковалентного пептидного зв'язку.

У імуногенній композиції згідно винаходу один із Мі або Сі пептидів або обидва з них можуть включати в себе або складатися з полімеру однієї амінокислоти в якості мономеру. Для ілюстрації, даний амінокислотний полімер може складатися з полімеру поліаланіну, поліглутаміну або полілізину.

З - і/або М-кінцева області пептиду формули (І) можуть відрізнятися від природних послідовностей, точно описаних у даному документі, внаслідок модифікації кінцевої МНео-групи

Мабо СООН-групи, і/або модифікації МНо-групи і/або СООН-групи бічного ланцюга амінокислотного залишку, що знаходяться в ній. Дані групи можуть, наприклад, бути ациліровані, ацетиліровані, амідировані або модифіковані для забезпечення сайту зв'язування для молекули носія.

У переважних втіленнях антигенний пептид обрано із групи, що складається з: - РУУМАБАЗМК5БІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 12), - РУУМАБУМАМК5БІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 13), - РУУМАБМУЗАК5БІ ОСІ (5ЕО 1ОЮ Мо 14) і - РУУМАБУУЗМКА ГГ ОБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 15).

У конкретних втіленнях імуногенної композиції згідно винаходу антигенний пептид формули (І) ковалентно зв'язаний з молекулою-носієм.

Типи молекул-носіїв, що застосовуються для утворення імуногенного продукту, що включає бо поліпептид формули (І), пов'язаний з молекулою-носієм, добре відомі спеціалісту в даній області. Функція молекули-носія полягає в тому, щоб забезпечити допомогу цитокіну (або допомогу Т-клітині) для того, щоб підсилити імунну відповідь, спрямовану проти ВІЛ-1.

Молекула-носій, з якою можливо пов'язаний пептид, може бути обрана з широкого різноманіття відомих носіїв. Приклади молекул-носіїв в цілях вакцини охоплюють білки, такі як людський або бичачий сироватковий альбумін, і гемоціанін молюска Медаїнига степиїаїа (КІ Н) та жирні кислоти. Інші втілення молекул-носіїв, з якими антигенний пептид формули (І) може бути ковалентно зв'язаний, включають бактеріальні токсини або анатоксини, такі як дифтерійні, холерні, Е.соїї термолабільні і правцеві анатоксини, зовнішній білок мембран М. тепіпідніаіє (європейська патентна заявка Мо ЕРОЗ372501), синтетичні пептиди (європейська патентна заявка

Мо ЕРОЗ378881 і Мо ЕРО427347), білки теплового шоку (заявка РСТ Мо УМО93/17712), білки

Репив5і5 (заявка РСТ Мо МУО98/58668), білок ЮО з Н. іпїйцеплає (РСТ заявка Мо М/О00/56360) і токсин А або В з С. аййсіє (Міжнародна патентна заявка М/О00/61761).

Будь-яка відповідна реакція кон'югації може бути використана з будь-яким відповідним лінкером, при необхідності. Приклади в даному документі ілюструють втілення імуногенної композиції, де пептиди формули (І) ковалентно пов'язані з молекулою - носієм КІ Н.

Даний винахід також відноситься до антигенного пептиду формули (І), як описано в даному документі, можливо ковалентно зв'язаний з молекулою-носієм, для застосування в якості лікарського засобу, у тому числі для застосування в якості імуногенного активного інгредієнта лікарського засобу.

Даний винахід також відноситься до антигенною пептиду формули (І), як описано в даному документі, можливо пов'язаний з молекулою-носієм, для застосування в способі попередження і/або лікування інфекції індивідуума, яку викликано вірусом ВІЛ-1.

Даний винахід відноситься до застосування антигенного поліпептиду формули (І), можливо ковалентно зв'язаний з молекулою-носієм, для виготовлення лікарського засобу для запобігання і/або лікування ВІЛ-1-інфікованого індивідуума, тобто для попередження і/або лікування інфекції індивідуума, яку викликано вірусом ВІЛ-1.

Даний винахід відноситься до способу попередження і/або лікування індивідуума, яку інфіковано вірусом ВІЛ-1, тобто для попередження і/або лікування інфекції індивідуума, яку викликано вірусом ВІЛ-1, що включає стадію запровадження даному індивідууму імуногенної

Зо композиції, що включає антигенний пептид формули (І), переважно пов'язаний з молекулою- носієм.

У переважних втіленнях імуногенна композиція, яка застосовується згідно винаходу, включає антигенний пептид формули (І) в кількості від 10 нг до 1 мг пептиду формули (І), яке адаптоване для введення індивідууму, що потребує у цьому, для профілактичної або терапевтичної мети.

Кількість антигенного пептиду формули (І), становить від 10 нг до 10 мг, охоплює кількість пептиду формули (І), становить приблизно 20 нг, 30 нг, 40 нг, 50 нг, 60 нг, 70 нг, 80 нг, 90 нг, 100 нг, 150 нг, 200 нг, 250 нг, 300 нг, 350 нг, 400 нг, 450 нг, 500 нг, 550 нг, 600 нг, 700 нг, 800 нг, 900 нг, 1 мкг, 2 мкг, З мкг, 4 мкг, 5 мкг, б мкг, 7 мкг, 8 мкг, 9 мкг, 10 мкг, 20 мкг, 30 мкг, 40 мкг, 50 мкг, 60 мкг, 70 мкг, 80 мкг, 90 мкг, 100 мкг, 110 мкг, 120 мкг, 130 мкг, 140 мкг, 150 мкг, 160 мкг, 170 мкг, 180 мкг, 190 мкг, 200 мкг, 250 мкг, 300 мкг, 350 мкг, 400 мкг, 450 мкг, 500 мкг, 550 мкг, 600 мкг, 650 мкг, 700 мкг, 750 мкг, 800 мкг, 850 мкг, 900 мкг, 950 мкг і 1 мг.

Кількість пептиду формули (І), який вибрано з групи пептидів зЗЕО ІЮ Мо 12, 13, 14 або 15, може становити, приблизно 200 мкг, 500 мкг або 1 мг.

Спеціаліст у даній галузі може легко адаптувати кількість пептиду формули (І) за допомогою проведення рутинних аналізів і визначення діапазону кількості пептиду, який при введенні іп мімо викликає антитільну відповідь, що блокує інфікування СО4-Т клітин вірусом ВІЛ-1 і/або блокує поширення вірусу ВІЛ-1 на неінфіковані СО04-Т клітини, використовуючи відомі аналізи, включаючи один або більше ніж один аналіз, описаний у прикладі даного документа.

Причому, кількість пептиду формули (І) може варіювати в залежності від його амінокислотної довжини і таким чином в залежності від його молекулярної маси, при цьому приймається до уваги, що відношення числа послідовностей "5-Х1-Х2-Х3-К-Х4" до маси пептиду формули (І) варіює з довжиною Сі і Мі пептидів, що знаходяться в даному пептиді формули (І), і таким чином варіює з молекулярною масою даного пептиду.

Також, у переважних втіленнях, де антигенний пептид формули (І) пов'язаний з молекулою- носієм, і де пацієнту вводять імуногенну композицію, що включає в себе або складається з даного пептиду формули (І), пов'язаного з даною молекулою-носієм, кількість імуногенного пептиду, що підлягає введенню, може варіювати в залежності від (ї) молекулярної маси пептиду формули (І), так і (ії) молекулярної маси молекули-носія, яку застосовують.

Кількість імуногенного з'єднання, яке підлягає введенню індивідууму, легко визначається або адаптується спеціалістом в даній області, який в першу чергу керується діапазоном ефективної кількості пептиду формули (І), який включає діапазон ефективної кількості пептиду формули (І), який вибрано з групи, що складається з 5ЕО ІЮО Мо 12-15, і потім молекулярною масою імуногенного з'єднання, яке він збирається вводити.

У деяких втіленнях кількість імуногенного пептиду, що підлягає введенню, може становити приблизно 0,1 мкг, 0,5 мкг, 1 мкг, 5 мкг, 10 мкг або 20 мкг даного імуногенного з'єднання.

Кількість пептиду формули (І) може становити не більше 10000 мг пептиду формули (1).

Кількість пептиду формули (І), який описано вище, також застосовується, коли даний пептид формули (І) кон'югований з молекулою-носієм, в імуногенній композиції згідно винаходу.

Для ілюстрації, при застосуванні для людей, імуногенна композиція, що включає пептид формули (І), кон'югований з молекулою-носієм КІН, може складатися від 0,1 мкг до 50 мкг кон'югата - імуногенного продукту КІ Н-пептид формули (1).

У даних втіленнях імуногенну композицію вводять щонайменше двічі індивідууму, що потребує цього. В даних втіленнях другу стадію введення імуногенної композиції згідно винаходу проводять у період часу, що становить від 2 тижнів до 6 місяців після стадії першого введення.

У даних втіленнях імуногенну композицію вводять щонайменше три рази індивідууму, що потребує цього. В даних втіленнях другу стадію введення даної імуногенної композиції згідно винаходу проводять у період часу, що становить від 2 тижнів до 6 місяців після стадії першого введення. В даних втіленнях третю стадію введення даної імуногенної композиції проводять у період часу, що становить від б місяців до приблизно одного року після стадії першого введення.

У деяких втіленнях дану імуногенну композицію потім знову вводять імунізованому індивідууму, наприклад, в період часу кожні 5 років або в період часу кожні 10 років.

Даний винахід також відноситься до імуногенної композиціям, що включає антигенний поліпептид формули (І), як описано в даному документі.

У даних втіленнях антигенний пептид формули (І) ковалентно зв'язаний з молекулою-носієм.

У даних втіленнях імуногенна композиція згідно винаходу додатково складається з одного

Ко) або більше ніж одного імуноад'юванта.

Імуногенну композицію, яку визначено в даному документі, що включає імуногенний продукт, який включає в себе пептид формули (І), переважно імуногенний продукт, що складається з кон'югату, який утворено між даним пептидом формули (І) і молекулою-носієм, і яка додатково складається з одного чи більш ніж одного з'єднання імуноад'юванта, у даному описі можна також назвати "вакцинною композицією".

У деяких втіленнях не існує конкретної відмінності, яку можна було б зробити між імуногенною композицією згідно винаходу і вакцинною композицією згідно винаходу, крім термінів, які використовуються для визначення таких композицій.

Точніше, імуногенна композиція націлена на утворення антитіл, спрямованих проти пептиду формули (І), коли її вводять в організм ссавця, наприклад, миші, кролику, вівці, коню чи козі, в ситуаціях, коли не припускають, що утворені антитіла надають попереджувальну або терапевтичну дію в імунізованному організмі ссавця. Імуногенні композиції згідно винаходу можна використовувати для отримання антитіл, спрямованих проти пептиду формули (І), для додаткового нетерапевтического застосування даних антитіл, наприклад, в якості реагенту для виявлення вірусу ВІЛ-1 або реагенту для виявлення ВІЛ - похідного пептиду.

З іншого боку, вакцинна композиція згідно винаходу націлена на утворення антитіл, спрямованих проти пептиду формули (І) в організмі ссавця, яким вводять дану вакцинну композицію, в ситуаціях, коли не припускають, що утворені антитіла надають попереджувальну або терапевтичну дію в імунізованному організмі ссавця.

Їмуноад'юванти охоплюють, але не обмежуються Зійтціоп'"Мм, (05-21 (Адиійа

Віорпаптасецііса!в5, Іпс., Егатіпупат, Ма55.); МРІ м (3-О-деацилірованний монофосфорилліпід

А; Согіха, Натікоп, Мопі.), 529 (з'єднання аміноалкілтглюкозамінфосфат, Согіха, Натійоп, Мопі.),

І/-12 (Сепеїісв Іпзійшеє, Сатбргідає, Мав5.); ОМ-С5Е (Іттипех Согр., Зеаше, УМазі.); М-ацетил- мураміл-! -треоніл-О-ізоглутамін ((Шг-МОР); М-ацетил-нормураміл-! -аланіл-О-ізоглутамін (СОР 11637, що називається пог-МОР); М-ацетилмураміл-! -аланіл-О-ізоглутамініл-Ї -аланін-2-(1-2- дипальмітоіл-5п-гліцеро-3-гідроксофосфорилокси-етиламін) (СОР 19835А, що називається

МТР-РЕ); і холерний токсин. Інші імуноад'юванти або сполуки, які можна застосовувати, охоплюють нетоксичні похідні холерного токсину, включаючи його субодиницю А і/або кон'югати, або генетично сконструйовані злиття поліпептиду М. Мепіпойіде5 з холерним токсином або його бо субодиницею ("СТВ"), термоіїнактивований агрегат холерного ентеротоксину, полісахариди грибів, що включають шизофілан, мурамілдипептид, похідні мурамілдипептиду ("МОР"), складні форболові ефіри, термолабільний токсин Е. соїї, блокполімери або сапоніни.

Для ілюстрації, приклади в даному документі ілюструють вакцинну композицію, що включає в себе (ї) кон'югат, утворений між КІН і пептидом формули (І), в якості імуногенного продукту і (ії) повний ад'ювант Фрейнда як імуноад'юванта.

Склад таких імуногенних композицій добре відомий спеціалістам в даній області. Імуногенні композиції з винаходу переважно включають фармацевтично прийнятний носій. Відповідні фармацевтично прийнятні носії і/або розріджувачі включають будь-які і всі традиційні розчинники, диспергуюче середовище, наповнювачі, тверді носії, водні розчини, покриття, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, і ті що затримують абсорбцію, тощо.

Відповідні фармацевтично прийнятні носії включають, наприклад, один чи більш ніж один носій, вибраний з води, фізіологічного розчину, фосфатно-сольового буферного розчину, декстрози, гліцерину, етанолу тощо, а також їх комбінації. Фармацевтично прийнятні носії можуть додатково включати малу кількість допоміжних речовин, таких як зволожуючі або емульгуючі агенти, консерванти або буфери, які збільшують термін придатності при зберіганні або ефективність антитіла. Отримання і застосування фармацевтично прийнятних носіїв добре відомо з рівня техніки. За винятком випадків, коли будь-яке звичайне середовище або агент є несумісним з активним інгредієнтом, передбачається їх застосування в імуногенних композиціях згідно даного винаходу.

Такі імуногенні композиції можна вводити парентерально, наприклад, за допомогою ін'єкції, або під шкіру або внутрішньом'язово, а також перорально або інтраназально. При інших способах введення, наприклад, поміж іншого використовують пероральні композиції, інгаляційні композиції, супозиторії та трансдермальне застосування. Пероральні композиції, наприклад, включають такі, які зазвичай використовують ексципієнти, такі, наприклад, як фармацевтичного ступеня чистоти маніт, лактоза, крохмаль, магнію стеарат, натрію сахарин, целюлоза, карбонат магнію тощо, крім іншого.

Даний винахід також відноситься до вакцинної композиції, що включає антигенний пептид формули (І), описаний у даному документі, в комбінації з одним чи більш ніж одним з'єднанням імуноад'юванта.

Зо Даний винахід також відноситься до вакцинної композиції, що включає (ї) імуногенний продукт, що включає в себе пептид формули (І), який об'єднаний з (ії) одним чи більш ніж одним з'єднанням імуноад'юванта.

Як правило, імуногенна або вакцинна композиція згідно винаходу включає 1, 2, 3, 4 або найбільше 5 різних сполук імуноад'юванта.

У переважних втіленнях імуногенна або вакцинна композиція згідно винаходу включає 1 або 2 різних з'єднання імуноад'юванта.

В деяких переважних втіленнях імуногенної або вакційної композиції антигенний пептид формули (І) обраний із групи, що складається 3: - МЕЕЗАБМКО-СЇ (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 6-СЯ), - МІЕБУМ АМК5-СІ (МІ-ЗЕО ІО Мо 7-С, - МЕ ЗБМ/БАК5Б-СІ (МІ-ЗЕО ІЮО Мо 8-СЮ і - М БМ/ЗМКА-СІ (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 9-СЯ),

В деяких переважних втіленнях імуногенної або вакційної композиції антигенний пептид формули (І) обраний із групи, що складається 3: - РУУМАБАЗМК5БІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 12), - РУУМАБУМАМК5БІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 13), - РУУМАБУУЗАКЗІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 14) і - РУУМАБУУЗМКА ГГ ОБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 15).

В деяких переважних втіленнях антигенний поліпептид формули (І) ковалентно зв'язаний з молекулою-носієм.

Даний винахід також відноситься до антигенного пептиду формули (І), як детально описано в даному описі, як активний агент вакційної композиції, яка спрямована на попередження і/або лікування ВІЛ-1-інфікованого індивідуума.

Загалом, даний винахід також відноситься до пептиду формули (І) рег 5е, як детально описано в даному описі.

Антитіла, спрямовані проти пептиду формули (І)

Як докладно обговорювали і експериментально проілюстрували в даному документі, імунізація індивідуума імуногенною композицією, що включає пептид формули (І), викликає виробництво нейтралізуючих антитіл проти ВІЛ-1 широкого спектру дії. Дані нейтралізуючі антитіла проти ВІЛ-1 широкого спектру дії можна застосовувати самі по собі в якості активних агентів проти ВІЛ-1.

Антитіла, спрямовані проти пептиду формули (І), можна застосовувати для попередження

ВІЛ-1 або в терапевтичних цілях щодо ВІЛ-1, а також в цілях діагностики ВІЛ-1.

У деяких втіленнях антитіла, які спрямовані проти пептиду формули (І), складаються з антитіл, що утворено після імунізації ссавця, включаючи людину, імуногенною композицією, що включає пептид формули (І), як описано в даному документі.

У деяких втіленнях антитіла, спрямовані проти пептиду формули (І), отримують з ВІЛ-1 інфікованих індивідуумів, у яких було викликано імунну відповідь на ВІЛ-1.

В обох втіленнях, наведених вище, дані антитіла можна отримувати за допомогою очищення зразка, головним чином зразка крові, взятої у даного ссавця, у тому числі в даної людини.

В обох втіленнях, наведених вище, дані антитіла можна також отримувати за допомогою клонування даних ДНК у якості матеріалу, що кодує їх, наприклад, починаючи з В-клітин, які отримано з даного ссавця, у тому числі з даної людини.

В обох втіленнях, наведених вище, дані антитіла можна також отримувати за допомогою визначення послідовностей амінокислотних залишків даних антитіл, які було зібрано у даного ссавця, в тому числі з даної людини, і потім синтезу молекули ДНК, що кодує дане антитіло або його частину, що включають в себе його СОК (гіперваріативна область), для отримання відповідних рекомбінантних антитіл, що спрямовано проти пептиду формули (1).

Даний винахід також відноситься до антитіл, які спрямовано проти пептиду формули (І), як описано в даному документі.

У деяких переважних втіленнях дані антитіла спрямовані проти пептиду формули (І), який вибрано з групи, що складається з: - МЕЕЗАБМКО-СЇ (МІ-ЗЕО ІЮ Мо 6-СЯ), - МІЕБУМ АМК5-СІ (МІ-ЗЕО ІО Мо 7-С, - МЕ ЗБМ/БАК5Б-СІ (МІ-ЗЕО ІЮО Мо 8-СЮ і - М БМ/ЗМКА-СІ (МІ-ЗЕО 1Ю Мо 9-СЯ

В деяких інших переважних втіленнях дані антитіла спрямовано проти пептиду формули (1), вибраного з групи, що складається з:

Зо - РУУМАБАЗМК5БІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 12), - РУУМАБУМАМК5БІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 13), - РУУМАБУУЗАКЗІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 14) і - РУУМАБУУЗМКА ГГ ОБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 15).

Отримання антитіл, спрямованих проти пептиду формули (І), за допомогою імунізації імуногенною композицією, що включає в себе пептид формули (І), переважно, які описано в прикладах даного документа. В якості альтернативи, антитіла, спрямовані проти пептиду формули (І), можна розглядати від ВІЛ-1 інфікованих пацієнтів, у яких вже є в нормі такі антитіла; їх можна також отримувати після іморталізації людських В - лімфоцитів, презентування їх; їх КДНК (комплементарна ДНК) можна також клонувати і застосовувати додатково для їх презентування або їх похідних за допомогою технології рекомбінантних ДНК.

Даний винахід також відноситься до застосування антитіл проти ВІЛ-1, отриманих із індивідуума, імунізованих імуногенною композицією, що описано в даному документі, для виготовлення лікарського засобу для запобігання і/або лікування ВІЛ-1 інфікованого індивідуума.

Термін "антитіло" у даному документі застосовується для того, щоб посилатися на молекулу, яка має відповідну специфічність зв'язування антигену. Спеціалісти в даній області швидко зрозуміють, що даний термін може також охоплювати поліпептиди, які є фрагментами або похідними антитіл, які ще можуть показувати таку ж або дуже схожу функціональність. Такі фрагменти антитіл або похідні, як мається на увазі, в даному контексті охоплені терміном антитіло. Під "антитілом" або "молекулою антитіла" для мети пасивної імунотерапії в даному документі мається на увазі не тільки цілі молекули імуноглобуліну, але також його фрагменти, такі як Раб, Е(аб», Ем і інші його фрагменти, які зберігають нейтралізуючу активність проти ВІЛ- 1 вірусів. Схожим чином, термін антитіло включає генетично сконструйовані похідні антитіл, такі як молекули одноланцюгового Ем (ЗСЕм) і доменні антитіла (аАБ).

Виготовлення композицій, що складається з очищених антитіл в пептиді формули (І), як описано в даному документі в прикладах.

У деяких втіленнях антитіло в пептиді формули (І) включає поліклональне антитіло.

Отримання композиції, що складається з очищених поліклональних антитіл в пептиді формули (І), як описано в прикладах даного документа.

Термін "моноклональне антитіло" застосовується в даному документі для того, щоб охопити всі виділені антитіла, такі як традиційне моноклональне антитіло, що презентується гібридами, а також для того, щоб охопити виділені моноспецифічні антитіла, що презентується будь-якою клітиною, такі як, наприклад, зразок ідентичних людських імуноглобулінів, експресованих в клітинній лінії ссавців.

Варіабельні важкі (Мн) і варіабельні легкі (Му) домени антитіла залучені до розпізнавання антигену, факт вперше визнаний внаслідок ранніх експериментів по протеолітичному розщепленню. Додаткове підтвердження виявили за допомогою "гуманізації" антитіл гризунів.

Варіабельні домени гризунів за походженням можуть бути злиті з константними доменами людського походження, так що отримане в результаті антитіло зберігає специфічність відносно антигену антитіла, який походить від гризуна (Моггізоп еї аї. (1984) Ргос. Ма!й!. Асайд. сі. ОА 81, 6851-6855). Те, що специфічність по відношенню до антигену надається варіабельними доменами і не залежить від константних доменів, як відомо з експериментів, які включають бактеріальну експресію фрагментів антитіл, причому всі включають один чи більш ніж один варіабельний домен. Дані молекули включають ЕРаб-подібні молекули (Вейбег еї а! (1988) Зсіепсе 240, 1041); Ем молекули (5Кеїта еї а! (1988) Зсіепсе 240, 1038); молекули одноланцюгового Ем (ЗсЕм), де Мн ії Мі домени-партнери пов'язані за допомогою гнучкого олігопептиду (Віга еї аї (1988) 5сіепсе 242, 423; Нивіюоп еї а! (1988) Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 85, 5879), і однодоменні антитіла (дар), що включають одиничні М домени (Мага еї а! (1989) Майшге 341, 544). Загальний огляд способів, які залучені в синтез фрагментів антитіл, які зберігають свої специфічні сайти зв'язування, можна знайти в Уміпіег 5 Міїстеїп (1991, Маїиге 349, 293-299).

Під "молекулами 5сгЕУ" маються на увазі молекули, де Мн і Мі домени-партнери пов'язані за допомогою гнучкого олігопептиду. Сконструйовані антитіла, такі як антитіла ЗСЕм, можна отримувати, використовуючи методики і підходи, описані в .). Нив5іоп еї аї, (1988) "Ргоїевіп апібоду епдіпеегіпа ої Біпаіпу 5іїе5: тесомегу ої зресіїйс асіїмпу іп ап апіі-дідохіп віпдіє спаіп Гм апаіодиє ргодисеа іп Е. соїї", Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 85, рр. 5879-5883, і в А. РіпскІпип, (1991) "Апіїроду епдіпеегіпу; Адмапсевз їгот иве ої Е. соїї ехргезвіоп зубзієтв", ВіоЛесппоіоду 9 (6): 545- 51, які включено в даний документ шляхом посилання.

Відповідні моноклональні антитіла, які є реактивними, як описано в даному документі, можна отримувати за допомогою відомих методик, наприклад, методик, які описано в "Мопосіопаї

Апійродіе5; А тапиа! ої їесппідоеб5", Н 20іа (СКС Ргез5, 1988) і в "Мопосіопа! Нубгідота

Апііродієв: Тесппіднез апа Арріїсайоп", 5 С А Ниттеєї! (САС Ргезв, 1982).

Додаткове втілення охоплює гуманізовані антитіла, де області мишачого антитіла, які контактували з антигеном, гіперваріабельні області (СОК), переносили в каркас людського антитіла. Такі антитіла майже повністю людські і рідко викликають будь-які шкідливі відповіді антитіл при введенні пацієнтам. Кілька химерних або гуманізованих антитіл було зареєстровано як терапевтичні лікарські засоби і зараз широко використовуються при різних показаннях (Воттераєск 8 Сапіззоп, 2001, Сит. Оріп. Рнаптасої. 1: 404-408).

Переважно, коли антитіло є гуманізованим антитілом. Належним чином отримані нелюдські антитіла можуть бути "гуманізованими" відомими способами, наприклад, за допомогою вставки

СОК областей мишачих антитіл в каркас людських антитіл. Гуманізовані антитіла можна створювати, використовуючи методики і підходи, описані в Мегпоеуеп еї аї (1988) 5сіепсе, 239, 1534-1536 і в КеШерогоцоп еї аї, (1991) Ргоївіп Епдіпеегіпо, 14 (7), 773-783.

Інші втілення антитіл охоплюють повністю людські антитіла, які можна отримувати, використовуючи технології рекомбінантних ДНК. Переважно застосовують великі бібліотеки, що включають мільярди різних антитіл. На відміну від попередніх методик, що використовують химеризацію або гуманізацію, наприклад, мишачих антитіл, дана технологія не грунтується на імунізації тварин для отримання специфічного антитіла. Замість цього, рекомбінантні бібліотеки включають величезне число попередньо створених варіантів антитіл, де ймовірно, бібліотека буде включати принаймні одне антитіло, специфічне для будь-якого антигену.

При пасивному лікуванні ВІЛ-1 інфекції, як наведено в даному документі, антитіла по даному винаходу будуть вводити, переважно, внутрішньовенно пацієнтам, які потребують цього.

Частота введення може бути визначена клінічно за допомогою нижчеописаного зменшення титрів антитіл у сироватці пацієнтів з часом, але в будь-якому випадку може відбуватися з частотою від 1 до 52 раз в рік, і найбільш переважно між 1 і 12 разів на рік. Кількість антитіл може варіювати відповідно до тяжкості захворювання або часу напівжиття антитіла в сироватці, але переважно буде знаходитися в інтервалі від 1 до 10 мг/кг пацієнта і переважно в інтервалі від 1 до 5 мг/кг пацієнта і найбільш переважно від 1 до 2 мг/кг пацієнта.

Способи та набори для діагностики, прогнозування, здійснення контролю за ВІЛ-1

Як описано в прикладах даного документа, антитіла, які спрямовано проти пептиду формули (І), можна виявити у пацієнтів, інфікованих ВІЛ-1.

Отже, пептид формули (І), може бути використаний в якості виявлення реагенту для визначення наявності і при необхідності кількості антитіл, які спрямовано проти даного пептиду, в індивідуума, який обстежується.

Даний винахід відноситься до способу детектування і/або кількісного визначення антитіл, спрямованих проти пептиду формули (І) у зразку, що включає наступні стадії: а) приведення зразка, що підлягає тестуванню, у контакт з одним чи більш ніж одним пептидом формули (І), і б) детектування і/або кількісна оцінка формування комплексів між даними пептидами формули (І) і антитілами, які присутні у даному зразку.

Даний винахід також відноситься до набору для детектування і/або кількісного визначення антитіл, спрямованих проти пептиду формули (І), у зразку, що включає в себе: а) один або більше ніж один пептид формули (І) і б) один або більше ніж один реагент для детектування комплексів, які утворено між даними пептидами і антитілами, які присутні у даному зразку.

У деяких втіленнях зразок, що підлягає тестуванню, складається із зразка, який попередньо зібрано у індивідуума, який включає (ї) індивідуум з підозрою на інфекцію, викликану вірусом

ВІЛ-1, і (ії) індивідуум, який був інфікований вірусом ВІЛ-1.

У деяких втіленнях даний зразок складається з препарату, який ймовірно включає антитіла, спрямовані проти пептиду формули (І), такого як (ї) препарат антитіл, очищених із зразків, які зібрано у ссавця, імунізованого імуногенною композицією, що включає пептид формули (1), і (ії) препарат моноклональних антитіл або рекомбінантних антитіл, які спрямовано проти пептиду формули (1).

У деяких втіленнях наведеного вище способу детекції пептид(іи) формули (1) іммобілізованоїйї) на підкладці.

У деяких втіленнях пептид формули (І) можна застосовувати у якості реагенту для діагностування інфекції індивідуума, яку викликано вірусом ВІЛ-1.

Таким чином, даний винахід також відноситься до способу діагностики інфекції, яку

Зо викликано вірусом ВІЛ-1, у індивідуума, що включає наступні стадії: а) приведення зразка, який зібрано у даного індивідуума, контакт з одним чи більш ніж одним пептидом формули (І), і б) детектування утворення комплексів між даними пептидами формули (І) і антитілами, які присутні у даному зразку.

У деяких втіленнях стадії б) способу комплекси, утворені даними пептидами формули (1) і антитілами, у разі присутності, визначають кількісно.

Даний винахід також відноситься до набору для діагностики інфекції, викликаної вірусом

ВІЛ-1, у індивідуума, який включає в себе: а) один або більше ніж один пептид формули (І) і б) один або більше ніж один реагент для детектування комплексів, які утворено між даними пептидами формули (І) і антитілами, що присутні в зразку, який зібрано з даного індивідуума.

У деяких втіленнях способу діагностики або вищеописаного набору для діагностики даний пептид(и) формули (І) іммобілізованоїї) на підкладці, як це описано додатково у даному описі.

Відповідно до вищеописаного способу ВІЛ-1 інфекцію визначають, якщо детектують утворення комплексів, які утворені між пептидом(ами) формули (І) і антитілами, що включені в зразок, які зібрано раніше у індивідуума, що обстежується.

Відповідно до вищеописаного способу діагностики рівень імунної відповіді ВІЛ-1- інфікованого індивідуума на вірус ВІЛ-1ї визначають за допомогою кількісного визначення комплексів, що утворено між пептидом(ами) формули (І) і антитілами, які присутні у зразку, які зібрано раніше у індивідуума, що обстежується.

У деяких втіленнях пептид формули (І) можна застосовувати у якості реагенту для здійснення прогнозування розвитку інфекції індивідуума, яку викликано вірусом ВІЛ-1.

Таким чином, даний винахід відноситься до способу прогнозування розвитку інфекції, яку викликано вірусом ВІЛ-1, у індивідуума, що включає наступні стадії: а) приведення зразка, зібраного у даного індивідуума, в контакт з одним або більш ніж одним пептидом формули (І), і б) детектування і кількісне визначення утворення комплексів між даними пептидами формули (І) і антитілами, які перебувають у даному зразку.

Даний винахід також відноситься до набору для прогнозування у індивідуума розвитку бо інфекції, яку викликано вірусом ВІЛ-1, яка включає:

а) один або більш ніж один пептид формули (І) і б) один або більш ніж один реагент для детектування комплексів, які утворено між даними пептидами формули (І) і антитілами, які присутні в зразку, який зібрано у даного індивідуума.

Відповідно до вищеописаного способу ВІЛ-1 інфекцію визначають, якщо детектують утворення комплексів між пептидом(ами) формули (І) і антитілами, що присутні в зразку, взятому раніше у індивідуума, який обстежується.

Відповідно до вищеописаного способу прогнозування, рівень імунної відповіді ВІЛ-1 інфікованого індивідуума на ВІЛ-1-вірус визначають на стадії б).

При здійсненні вищеописаного способу прогнозування сприятливий результат очікують, коли на стадії б) визначають високий рівень антитіл до поліпептиду формули (1). | навпаки, несприятливий результат очікують, коли на стадії б) визначають низький рівень антитіл до поліпептиду формули (1).

У даному контексті "високий" рівень антитіл до пептиду формули (І), визначають шляхом порівняння з одним чи більш ніж одним еталонним значенням.

У деяких втіленнях вищеописаного способу прогнозування сприятливого результату може бути визначено, якщо в зразку, раніше взятому у даного ВІЛ-1 інфікованого індивідуума, детектують наявність антитіл до поліпептиду формули (І), оскільки, як показано в прикладах даного документа, що індивідууми, у яких включено сироваткові антитіла до пептиду формули (І), як виявили, володіють хорошими клінічними показники, такі як низьке вірусне навантаження і високу кількість клітин СО4-Т.

Вищеописаний спосіб діагностики, вищеописаний спосіб прогнозування, а також набори для здійснення даних способів, які можна застосовувати для здійснення контролю за ефективністю спрямованого проти ВІЛ-1 терапевтичного лікування індивідуума, якого інфіковано ВІЛ-1.

Даний винахід відноситься до способу здійснення контролю за спрямованим проти ВІЛ-1 терапевтичним лікуванням ВІЛ-1 інфікованого індивідуума, що включає стадії: а) проведення курсу лікування проти ВІЛ-1 для даного ВІЛ-1-інфікованого індивідуума і б) визначення рівня антитіл до пептиду формули (І) у зразку, що взято у даного пацієнта.

У деяких втіленнях способу здійснення контролю рівень антитіл до пептиду формули (І) визначають перед проведенням курсу лікування, що спрямовано проти ВІЛ-1, для даного індивідуума, таким чином, перед стадією а) способу.

У деяких втіленнях способу здійснення контролю, особливо коли лікування, спрямоване проти ВІЛ-1, що включає безліч стадій введення даному індивідууму фармацевтичної композиції проти ВІЛ-1, вищеописаний спосіб здійснення контролю виконують на будь-якій стадії введення або тільки на одній чи більш ніж одній стадії введення, або після останньої стадії введення.

У даному документі описано, що втілення терапевтичного лікування ВІЛ-1 інфекції, за якими можна здійснювати контроль, згідно способу, що вище описано, охоплюють імунізацію ВІЛ-1- інфікованого індивідуума вакцинною композицією, що включає пептид формули (І), як описано в даному документі.

Фрази, такі як "зразок, що включає в себе антитіло" або "детектування антитіла у зразку", не призначені для виключення зразків або визначень (спроб детекції), де не включається або не детектується антитіло. У загальному сенсі, даний винахід включає аналізи для визначення того, чи є у зразку антитіло, що утворюється у відповідь на інфікування і протягом перебігу захворювання, яке викликано вірусом ВІЛ-1, незалежно від того, детектують його чи ні.

Умови для взаємодії пептидів і антитіл, так що вони взаємодіють специфічно, добре відомі спеціалістам в даній області. См., наприклад, Сиггепі Ргоїосої!5 іп Іттипоіоду (Соїїдап еї аї., еййогв, доп Уміеу 5 5опв5, Іпс) або Приклади в даному документі.

Спосіб діагностики включає взяття зразка рідини або тканини організму, які ймовірно включають в себе антитіла. Антитіла можуть бути, наприклад, тип Ідс, ІДЕ, дО, ІДМ або ІдА.

Зазвичай виявляють ІДМ і/або ІдА антитіла, наприклад, при виявленні ранньої інфекції. до антитіла можуть детектувати, коли деякі з додаткових пептидів, що обговорено вище, застосовують у способі (наприклад, пептиди для детекції білків джгутиків). Зразок переважно такий, що не становить труднощів для його отримання, і він може бути сироваткою або плазмою, яку отримано із зразка венозної крові або навіть при взятті крові з пальця. Тканина з інших частин організму або інші рідини організму, такі як спинномозкова рідина (С5БЕ), слина, шлункова секреція, слиз і т.д., як відомо, включають антитіла і можуть бути використані в якості джерела зразка.

Як тільки пептидний антиген і антитіло зразка отримують можливість взаємодіяти. у відповідному середовищі, для визначення наявності або відсутності взаємодії антитіло-пептид проводять аналіз. Серед багатьох типів відповідних аналізів, які будуть очевидними для бо спеціаліста, є аналізи імунопреципітації і аглютинації.

У втіленнях винаходу аналіз може включати (1) іммобілізацію антитіл(а) у зразку, додавання пептиду по винаходу, а потім детектування рівня антитіла, пов'язаного з пептидом, наприклад, за допомогою мічення пептида або за допомогою додавання міченої речовини (кон'югат, партнер по зв'язуванню), такого як мічене антитіло, яке специфічно розпізнає пептид; (2) іммобілізацію пептиду щодо винаходу, додавання зразка, що включає антитіло(ла), а потім детектування кількості антитіла, який пов'язано з пептидом, наприклад, за допомогою додавання міченої речовини (кон'югат, партнер по зв'язуванню), такого як мічене антитіло, яке специфічно розпізнає антитіло; або (3) взаємодія пептиду і зразка, що включає антитіло(ла) без будь-якого з іммобілізованих реагентів, а потім детектування кількості комплексів антитіла з пептидом, наприклад, за допомогою мічення пептиду або за допомогою додавання міченої речовини (кон'югат, партнер по зв'язуванню), такого як мічене антитіло, яке специфічно розпізнає пептид.

Іммобілізація пептиду щодо винаходу може бути або ковалентною, або нековалентною, а нековалентна іммобілізація може бути неспецифічною (наприклад, неспецифічне зв'язування з поверхнею полістиролу, наприклад, у лунки планшета для мікротитрування). Специфічного або напівспецифічного зв'язування з твердим або напівтвердий носієм, підкладкою або поверхнею можна досягати за допомогою пептиду, що включає, пов'язане з ним, групування, яке дозволяє йому ковалентно або нековалентно зв'язуватися з твердим або напівтвердий носієм, підкладкою або поверхнею. Наприклад, групування може володіти афінністю по відношенню до компоненту, який прикріплено до носія, підкладці або поверхні. У даному випадку, при групуванні може бути, наприклад, біотин або біотиніл групи або їх аналог, пов'язаний з амінокислотною групою пептиду, такий як б-аміногексанова кислота, а компонентом тоді є авідін, стрептавідін або їх аналог. Альтернативним варіантом є ситуація, в якій угрупування включає амінокислотну послідовність Нів-Нівз-Ніб-Ніб-Нібв-Ніз (ЗЕО ІЮ МО: 17), а носій включає похідне нітрилотриуксусної кислоти (МТА), що заряджене іонами Мі-. Серед відповідних носіїв, підкладок або поверхні можна назвати, наприклад, магнітні кульки або латекс кополімерів, таких як стирол-дивінілбензол, гідроксилірований стирол-дивінілбензол, полістирол, карбоксилірованний полістирол, частинки вуглецевої сажі, неактивоване або активоване скло на основі полістиролу або полівінілхлориду, епокси-активоване пористе магнітне скло, желатин

Зо або частинки полісахариду або інші білкові частинки, еритроцити, моно - або поліклональні антитіла або Раб фрагменти таких антитіл.

Протоколи для імуноаналізів з використанням антигенів для детекції специфічних антитіл добре відомі з рівня техніки. Наприклад, можна застосовувати традиційний аналіз "сендвіч»- типу або можна застосовувати традиційний конкурентний аналіз. Для обговорення деяких підходящих типів аналізів, див. Сигтепі Ргоїосої5 іп ІттипоЇоду (вище). У переважному аналізі пептид щодо винаходу іммобілізований на твердій або напівтвердій поверхні або носії за допомогою ковалентного або нековалентного зв'язування, або до, або після додавання зразка, що включає в себе антитіло.

Пристрої для виконання аналізів специфічного зв'язування, головним чином імунсаналізів, відомі і можуть бути швидко пристосовані для застосування в даних способах. Твердофазні аналізи, загалом, легше виконувати, ніж методи гетерогенного аналізу, які вимагають стадії поділу, такий як преципітація, центрифугування, фільтрація, хроматографія або магнетизм, оскільки розподіл реагентів швидше і простіше. Пристрої для твердофазного аналізу включають планшети для мікротитрування, пристрої для проточного аналізу, тест-смужки та пристрої для імунокапіляторного або імунохроматографічного імуноаналіза.

У втіленнях винаходу тверда або напівтверда поверхня або носій є дном або стінкою лунки планшета для мікротитрованоїї фільтруючої поверхню або мембрану (наприклад, нітроцелюлозна мембрана або мембрана РМОЕ (полівініліденфторид), така як мембрана

Іппторійоп); порожнисте волокно; гранульоване хроматографічне середовище (наприклад, агарозний або поліакриламідний гель); магнітний мікроносій; волокнисту целюлозну матрицю;

ВЕРХ матрицю (високоефективна рідинна хроматографія); ЕР С матрицю (рідинна експрес- хроматографія білків); речовина, що включає молекули такого розміру, що молекули з пептидним зв'язком, будучи розчиненими або розсіяними в рідкій фазі, можуть бути утримані за допомогою фільтра; речовина, здатна утворювати міцели або брати участь в утворенні міцел, даючи можливість рідкій фазі змінюватися і обмінюватися без захвачування міцел; водорозчинний полімер; або будь-який інший відповідний носій, підкладку або поверхню.

У деяких втілень винаходу пептид забезпечений відповідною міткою, яка робить можливою детекцію. Можна застосовувати традиційні мітки, які здатні самі по собі або разом з іншими композиціями або сполуками, забезпечувати детектуючий сигнал. Відповідні способи детекції 60 включають, наприклад, детекцію агента, який є міченим, прямо або побічно, флуоресцентною міткою за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії, включаючи конфокальну мікроскопію або проточну цитометрію (БАСзсап); детекцію радіоактивно міченого агента за допомогою авторадіографії; електронну мікроскопію; імунофарбування; субклітинне фракціонування або тому подібне. В одному втіленні радіоактивний елемент (наприклад, радіоактивну амінокислоту) вводять безпосередньо в пептидний ланцюг; в іншому втіленні флуоресцентна мітка асоційована з пептидом через взаємодію біотин/авідін, зв'язок з антитілом, кон'югованим з флуоресцеїном, або тому подібне. В одному втіленні детектуючий специфічний партнер для зв'язування антитіла додають в суміш. Наприклад, партнер зв'язування може бути представленим як детектуюче вторинне антитіло, що зв'язується з первинним антитілом. Дане вторинне антитіло може бути міченим, наприклад, радіоактивною, ферментативною, флуоресцентною, люмінесцентною або іншою детектуючою міткою, такою як система авідін/біотин.

У втіленнях винаходу спосіб детектування включає спостереження за видимим комплексом антитіло-пептид при зміні кольору або спостереження за комплексом антитіло- пептид при фізико-хімічній зміні. Фізико-хімічні зміни можуть відбуватися з реакціями окислення або іншими хімічними реакціями. Їх можна детектувати на око, використовуючи спектрофотометр або тому подібне.

В одному втіленні способу пептид або суміш пептидів піддають електроблотінгу або дот- блотінгу на нітроцелюлозний папір. Після цього, біологічну рідину (наприклад, сироватка або плазма) інкубують з антигеном, підданим блоттингу, і антитілу в біологічній рідині дається можливість зв'язуватися з антигеном(ами). Пов'язане антитіло можна детектувати, наприклад, стандартними імуноферментними методами.

В іншому втіленні способу, латексні кульки кон'югують з антигеном(ами) щодо винаходу.

Далі біологічну рідину інкубують з кон'югатом кульку/пептид, з утворенням, таким чином, реакційної суміші. Реакційну суміш потім аналізують для визначення наявності антитіл.

Один переважний аналіз для скринінгу крові продуктів або інших фізіологічних або біологічних рідин є твердофазний імуноферментний аналіз, тобто ЕГІЗА. Зазвичай у ЕГІ5А виділений антиген(іни) щодо винаходу адсорбується на поверхні лунки планшета для мікротитрування безпосередньо або за допомогою матриці для захоплення (наприклад,

Зо антитіло). Залишкові неспецифічні сайти зв'язування білка на поверхні потім блокують відповідним агентом, таким як бичачий сироватковий альбумін (В5А), інактивована нагріванням нормальна сироватка кози (МО5) або ВГОТТО (забуференний розчин знежиреного сухого молока, який також містить консервант, солі та піногасник). Потім лунку інкубують з біологічним зразком, що потенційно включає в себе антитіла проти ВІЛ-1. Зразок можна застосовувати нерозведеним, або частіше він може бути розведений, переважно в забуференому розчині, який включає невелику кількість (0,1-5,0 мас. 95) білка, такого як ВБА, МО5 або ВІ ОТТО. Після інкубування протягом достатнього періоду часу для того, що б дозволити відбутися специфічному зв'язуванню, лунку промивають для видалення незв'язаного білка і потім інкубують з оптимальною концентрацією відповідного антитіла до імуноглобуліну (наприклад, у разі суб'єктів, які Є людьми, антитіло до людського імуноглобуліну з іншого тваринного, такого як собака, миша, корова тощо), яке кон'юЮюговано з ферментом або іншою міткою за допомогою стандартних способів, і розчинено у блокувальному буфері. Мітку можна вибрати з безлічі ферментів, що включає пероксидазу хрону (НКР), бета-галактозидазу, лужну фосфатазу, глюкозооксидазу і т. д. Надають достатньо часу для того, щоб знову сталося специфічне зв'язування, потім лунку знову промивають для видалення незв'язаного кон'югату і додають відповідний субстрат для ферменту. Дозволяють розвинутися забарвленню, та визначають оптичну густину вмісту лунки візуально або інструментально (вимірюють при відповідній довжині хвилі). Граничне значення ОО (оптична щільність) можна визначати як середнє ОО ж стандартне відхилення (505) щонайменше 50 зразків сироватки, які зібрано у індивідуумів, які не інфіковані вірусом ВІЛ-1, або за допомогою інших таких традиційних визначень. У разі дуже специфічного аналізу, в якості граничного значення можна використовувати 00250.

В одному втіленні ЕГІЗА пептид щодо винаходу мобілізують на поверхні, такий як 96- лунковий планшет ЕГІ5БА або еквівалентна тверда фаза, яка покрита стрептавідином або еквівалентним біотинзв'язуючим з'єднанням в оптимальній концентрації лужного покриваючого буфера, і інкубують при 4 "С всю ніч. Після відповідного числа промивок стандартними відмивальними буферами в будь-якій лунці використовують оптимальну концентрацію бутильованої форми композиції/антигену з даного винаходу, що розчинено в традиційному блокувальному буфері; додають зразок; і аналіз триває, як описано вище.

Іншим корисним форматом аналізу є формат латерального струму. Антитіло до людського 60 або тваринного антитіла або антитілам до стафілококових білків А і З мітять генератором сигналу або репортером (тобто колоїдним золотом), яке сушать і розміщують на підкладку зі скловолокна (підкладка для нанесення зразка). Діагностичний пептид імобілізують на мембрані, такій як мембрана РУОЕ (полівініліденфторид), (наприклад, мембрана Іттобіїоп (Мійіроге)) або нітроцелюлозній мембрані. Коли розчин зразка (кров, сироватка і т.д.) наносять на підкладку для нанесення зразка, він розчиняє мічений колоїдним золотом репортер, і він зв'язується з усіма антитілами в зразку. Дану суміш переносять на наступну мембрану (РМОР або нітроцелюлозу, що включає в себе діагностичний пептид) за допомогою капілярного дії. Якщо антитіла до діагностичного пептиду присутні, вони зв'язуються з діагностичним пептидом, що нанесено на мембрану, сгенеруючи сигнал. Для отримання контрольного сигналу використовують додаткове антитіло, специфічне до антитіла, що мічено колоїдним золотом (таке як антитіло кози проти мишиного Ід).

Спеціалісту в даній галузі слід розуміти, що можна спланувати будь-яке число форматів традиційного аналізу білків, переважно форматів імуноаналізу, з використанням виділених пептидів з даного винаходу для детекції у суб'єкта інфекції ВІЛ-1. Даний винахід, таким чином, не обмежується відбором певного формату аналізу, і, як вважають, охоплює формати аналізу, які відомі фахівцям в даній області.

Реагенти для ЕГІЗА або інших аналізів згідно даного винаходу можуть бути надані у формі наборів. Такі набори корисні для діагностування інфекції, яку викликано ВІЛ-1 вірусом, з використанням зразка, який зібрано у суб'єкта (наприклад, людини або іншої тварини). Такий набір для діагностики може включати в себе пептид щодо винаходу (і, при необхідності, додаткові пептиди, як обговорюється вище) і можливо систему (засоби, що дозволяють) для детекції пептиду щодо винаходу, пов'язаного з антитілом, спрямованим проти пептиду формули (І), або поверхню, з якої пептид може бути пов'язаний. В одному втіленні набір включає суміш відповідних пептидів або засоби для отримання таких сумішей, і/або реагенти для детектування комплексів пептид-антитіло.

Набір може включати в себе планшети для мікротитрування, на яких пептид(и) щодо винаходу були заздалегідь адсорбовані, індий пристрій для відповідного аналізу, різні розчинники та буфери, мічені кон'югати або інші агенти для детекції специфічно пов'язаних антигенів або антитіл, і інші, які генерують сигнал реагенти, такі як субстрати ферментів,

Зо кофактори і хромогени. Інші компоненти набору можуть бути легко визначені фахівцем в даній області. Такі компоненти можуть включати реагенти для покриття, поліклональні або моноклональні іммобілізовані антитіла, специфічні для пептиду щодо винаходу, або суміш двох або більше двох антитіл, очищені або напівочищені екстракти даних антигенів в якості стандартів, що ідентифікують МАБ антитіла, антитіло до мишиного і людського антитіла з молекулою-індикатором, кон'юЮговано з ним, планшет ЕГІ5БА, приготовлено для абсорбції, індикаторні графіки для калориметричних порівнянь, одноразові рукавички, інструкції щодо деконтамінації, смужки-аплікатори або контейнери, посудина для приготування зразка і т.д. В одному втіленні набір включає в себе буфери або інші реагенти, які підходять для складання реакційної суміші, роблячи можливим утворення комплексу пептид-антитіло. Такі набори забезпечують для клінічної лабораторії зручний, ефективний шлях для діагностики інфекції, яку викликано вірусом ВІЛ-1.

У деяких втіленнях способи діагностики і набори, що описано в даному документі, можна застосовувати в основному для визначення наявності антитіл до ВІЛ у зразку, який зібрано раніше у індивідуума. В деяких інших втіленнях способи діагностики і набори, описані в даному документі, можна застосовувати для ідентифікації підродини вірусу ВІЛ-1, яким був інфікований індивідуум, що обстежується в даний час.

У деяких втіленнях способи діагностики і набори, що описано у даному документі, використовується тільки один пептид, який зібрано з пептидів, що належать сімейству пептидів формули (1).

В інших втіленнях способи діагностики і набори, що описано у даному документі, використовується безліч пептидів, які зібрано з пептидів, що належать сімейству пептидів формули (1).

Для ілюстрації, у втіленнях способів діагностики і набору, описаних у даному документі, використовується безліч пептидів формули (І), які вибрано з групи, що складається 3: - РЛ/УМАБАБМКОІ ЮРІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 12), - РУУМАБУМАМК5БІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 13), - РУУМАБУУЗАКЗІ ЮБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 14) і - РУУМАБУУЗМКА ГГ ОБІМУ (ЗЕО ІЮ Мо 15).

Нижче, даний винахід додатково проілюстровано прикладами, але не обмежується ними. 60 Приклади

Матеріал і Методи 1. Отримання вірусу

Мутантів отримували з плазміди рМІ 4.3 з використанням набору ОціскСпапде ЇЇ Хі. для сайт-спрямованого мутагенезу (Зігаїадепез з подальшою перевіркою за допомогою ДНК.

Плазміди рМі 4.3 дикого типу і мутовані по аланіну З35/9р41 трансфікували за допомогою липофектаміну (Іпмігодеп) в клітини 2937 в середовищі Оріїта. Після 48-годинної трансфікції збирали супернатант, який не включає в себе клітин, і визначали концентрацію головного коров'ячого білка ВІЛ р24 з використанням набору Міда5 Ад р24 ІІ (Віотегієих). Вірусні супернатанти зберігали при -80 "С. 2. Пептиди і антитіла

Очищені некон'юговані і КІ Н-кон'юговані синтетичні пептиди дикого типу і мутовані по аланіну З35/9р41 (Фіг. 1) отримували з Сомаїаре (МіПйеиграппе, Франція). Мишам двічі внутрішньовенно вводили, з приблизно 2-х тижневим інтервалом між будь-якою ін'єкцією, 20 мг пептиду, пов'язаного з КІН, у присутності неповного ад'юванта Фрейнда. Сироватки титрували за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5БА) з використанням планшетів

Махізогр (Мипс), покритих, на ніч при 4 "С, 100 нг пептидів дикого типу або мутованих по аланіну з5/дра1, як описано (Мміейага еї а! АІЮОЗ 2006). 3. Очищення вихідних здорових клітин СЮО4-Т

Лейкоцити із зразків цільної крові, що взято у здорових донорів, отримували за допомогою центрифугування з утворенням лейкоцитарної плівки з "ЕЄїабіїззетепі Егапсаї5 ди запд" (Норіга!

Ріїе-ЗаІремніеге, Париж, Франція). Клітини СО4-Т очищували за допомогою СО4 магнітних мікрогранул (Мікепуї). Проточний цитометричний аналіз показав чистоту СО4 клітин, що становить понад 95 95. Клітини активували протягом З днів 1 мкг/мл РНА-Г!. (Мигех) в КРМІ-1640

СіІшатах середовищі (Іпмігодеп) з додаванням 10 95 фетальної телячої сироватки (ЕС5) і потім культивували з 100 МО (міжнародні одиниці)/мл пролейкіна-2 (Спігоп), що додається кожні З дні. 4. Аналіз інфікування

Очищені активовані клітини СО4- Т, МТ2 ії клітин ЧУигкаї (107 клітин) інкубували з 100 нг еквівалентів антигену р24 протягом 17 год. і 2 год. при 37 "С відповідно. Клітини потім промивали двічі в РВв5 (фосфатно-сольовий буферний розчин/ЕОТА

Зо (етилендиамінтетраоцтова кислота) і ресуспендіювали до 105/мл За продукцією вірусу стежили кожні 2 дні після інфікування за допомогою ЕГІЗА з вимірюванням концентрації р24 з допомогою набору Міда Ад р24 ІІ (Віотегівих). Утворення синцитія на інфікованих МТ2 клітинах оцінювали після 96 год. за допомогою фазово-контрастної мікроскопії. 5. Одноетапний аналіз інфекційності ВІЛ-1

Неїа РА4С4, люб'язно подаровані А. Моїгттів і О. 5спугагі» (Інститут Пастера, Париж, Франція), спільно трансфікували з СО4: і СС5У, і включали інтегровану копію ВІЛ-1 довгого кінцевого повтору (ГТК), пов'язаного з геном люциферази і В-галактозидази (Атага еї а! У. Ехр. Меа. 1997). Клітини висівали за один день напередодні і інфікували 4 нг р24/мл дикого типу або мутованих по аланіну 35/9р41 вірусів МІ 4.3. Через 48 год. після інфікування вимірювали активність ВД-галактозидази в клітинних лізатах Неіа-Р4С5 з використанням набору СРКО Веїа-

СаїІасіовідазе (072 ріозсієпсев). 6. Аналіз нейтралізації

Фракцію поліклональних дО з антисироваток мишей виділяли з використанням набору Мар

Ргоївїіп АХЗ 5ріп і потім висолювали з використанням колонок для висолювання 7ебра 5ріп, обидва з Тпегто 5сіепійіс, згідно інструкцій виробника. Фракції імуноглобуліну концентрували з використанням Сепігісоп Сепігїида! Бійег Опійв5 (Мійроге) і потім кількісно визначали з використанням набору ВСА ргоївіп аззау (Тпепто Зсіепіййс). Очищені Ар тестували при початкових концентраціях 20 мкг/мл з наступними п'ятьма 2-кратними розведеннями.

Людські антитіла до М/Т або до М/614А 35/д9р41 очищали за допомогою імунопреципітації з інактивованим нагріванням плазми інфікованого ВІЛ-1 пацієнта з використанням набору Ріегсе рігесі ІР за допомогою прямої імунобілізації синтетичного пептиду на агарозній підкладці з реакційноздатними аміногрупами. Очищені антитіла потім піддавали діалізу проти РВ5 (5ІіЇде-А-

Гузег Оіаїузіз саззеце, Ріегсе) і кількісно визначали. Очищені антитіла тестували при початкових концентраціях 2 мкг/мл з наступними п'ятьма 2-кратними розведеннями.

Два аналізи з використанням інфекційних вірусів проводили для аналізу нейтралізації очищених антитіл (Репуб ейа РІо5 опе 2009): (1) Для порівняння дієвості (концентрації, що вимагаються для досягнення 50 95 (ІСво| і 90 бо

ПСзо| інгібування) антитіла, спочатку використовували аналіз "904-Т клітини-р24". Інфекційні реплікуючі компетентні віруси (200ТСІОзо) інкубували з різними концентраціями Ід протягом 30 бо хв з подальшим додаванням РНА-активованих очищених СО4-Т клітин у присутності І 2. Сім днів після ініціації інфекції зразки в двох повторюваннях відбирали для вимірювання ра24 (набір

Мідаз Аяд рга4 ІІ, Віотетгівих). (2) Для оцінки можливості при розрізненій нейтралізуючій активності різних очищених Ар вимірювали їх здатність інгібувати проникнення ВІЛ-1 у різних штамів Х4 (МІ 4.3, ВКО, МОК) і К5 (У8-С5БЕ, МО-2) або КОЮ НІМ-2 з використанням клітин Неіа-Р4С5 і/або Т2М-БІ (МІН АІЮрЗ

Везеагсіп апа Кетїегепсе Кеадепі Ргодгат), люб'язно наданих Сіагієб5е Вегіо»-Готепі (Іпвійш

Соспіп, Париж, Франція). Інфекційні реплікуючі компетентні віруси (200ТСІЮОзо) інкубували з Ід в різних концентраціях протягом 30 хв з подальшим додаванням клітин Неїа РАС5. Через 48 год. після інфікування вимірюють р-галактозидазну активність в лізатах Неіа-Р4С5 з використанням набору СРО Веїа-СаїЇасіозідазеї (07 Біозсіепсе5), а активність люциферази вимірюють в лізатах ТАМ-БІ з використанням Вгіїеійе Ріиз Кеадепі (РегКіп ЕІтег). Граничне значення 2,5- кратного фону застосовували для визначення позитивних значень в аналізах ТСІЮО (доза, що інфікує культуру тканини). Дані виражали в ТСІЮОво і ТСІЮОв5. 7. Проточна цитометрія

ЕАС5 аналіз (сортування флуоресцентно-активованих клітин) проводили на очищених

СОрА-Т клітинах у присутності життєздатного або інактивованого нагріванням вірусу протягом 17 годин або оброблених пептидами З35/9р41 протягом 4 год. при 37 "С. Зразки інкубували з 1 мкг будь-якого антитіла: антитіла до МКр44ї або з білками злиття (МКр30-І4, МКр44-Ід або МКр46-

Ід) протягом 2 год. при 4 "С у присутності РВБ/В5А1 95. Потім клітини промивали в РВБЗ/В5А1 95 та інкубували протягом 30 хв при 4 "С зі специфічними вторинними антитілами (розведеними 1100 в РВЗ/В5А 965), і, нарешті, фарбували безпосередньо тАб проти СО4 і фіксували з використанням розчину ВО СеїЇРіх (ВО Віозсіепсе), як описано (мМіейага еї а! РМАЗ 2005). На

ЕАСбСапіо (ВО Віозсіепсе5) або Маміо5 (СоцШег) детектували щонайменше 10000 подій у клітинах СОУ». 8. Аналіз дегрануляції

Неінфіковані СО4-Т клітини або СО4-Т клітини, інфіковані диким типом або мутовані по аланіну З35/9р41 вірусами Мі4.3, ресуспендіювали у співвідношенні 1:11 у присутності аутологічних РВМС (мононуклеарні клітини периферичної крові), активованих аутологічними

І/2, ї тАбБ проти СО107а (Н4АЗ; Весіоп ОісКіпбзоп). Після 1 год. інкубації додавали З мМ монензин для додаткових З год. інкубації, як описано раніше (Веліаї еї а! РГо5 Опе 2010). МК клітини фарбували тАБб проти СОЗ, проти СО56 і проти МКр44 та аналізували на ГЕАСЗзСапіо (ВО Віозсіепсе5) або Маміо5 (СошНег). Щонайменше аналізували 5000 подій СОЗ-СО56-.

Приклад 1: Цілісність З35/др41 СА при інфікуванні СО4-Т клітин

Щоб визначити роль мотиву 35/9р41 в життєвому циклі вірусу, залишки, розташовані між положенням 5613 і 5618 в межах 35 мотиву білка др41 із штаму ВІЛ-1 МІ 4.3, індивідуально вводили одиничні точкові заміни. Для вивчення того, чи включають поодинокі заміни вплив на вірусну інфекційність, клітини МТ-2 стимулювали 100 нг еквівалентного антигена р24 з будь- якого вірусного препарату. На Фіг. 2А показано, що впливи, які надаються замінами мотиву з5/др4а1, варіюють від майже повної відмови вірусної продукції до відсутності впливу відносно вірусу, що експресує мотив дикого типу. Дійсно, 5613А мутований вірус зберігав свою абсолютну здатність інфікувати МТ-2, в той час як Кб17А все ще показував 662-110 95 від рівня, який спостерігається для дикого типу, а інші мутанти - менш ніж 22 95. Очевидно, що М/614А і

З618А не здатні встановлювати інфекцію у МТ-2 клітинах (Фіг. 2А). Ці дані підтверджували здатність даних мутантів здійснювати утворення синцитія з абсолютною відсутністю даних гігантських клітинних структур у клітинах МТ-2, інфікованих або УУб614А і 5618А мутованих вірусів, порівняно з диким типом (Фіг. 2Б). Ці дані наводять на думку про те, що обидва положення, УУ614А і 5618А, мотиву З35/9р41 можуть відігравати критичну роль при вірусній інфекції.

Вивчення кінетики інфікування в очищених СО4-Т клітинах показало, що дикий тип і 5613А і

Кб17А мутанти показали дуже продуктивну реплікацію вірусу (аж до 187 пкг/мл р24) з піком продукції р24, відповідно до 8 днів після інфікування (Фіг. 2В). І навпаки, незалежно від періоду часу, інфекційний рівень 5615А і М616А мутованих вірусів залишається дуже низьким, з 13,5 95 і 17,3 пкг/мл на піку вірусного навантаження відповідно і залишається невизначеним у разі

МІ614А і 5618А (Фіг. 28). Схожі результати спостерігали у присутності інфікованих клітин Уигкаї (дані не показано).

Далі намагалися визначити, на яку стадію вірусного циклу впливала мутація в мотиві з5/др41. Для оцінки інфекційності мутантів 35/9р41 вірусні супернатанти з трансфікованих клітин 293Т тестували на індикаторних клітинах Неїа Р4С5, причому похідна клітинна лінія Неїа включала ВІЛ-І ТА І ас-2 касету, яку активовано Таї при ВІЛ-1 інфікуванні (Атага еї а! У Ехр Мей бо 1997). Як показано на фіг. 2Г, як у 5613А, так і Кб17А мутантів зберігається здатність інфікувати клітини, подібно до дикого типу. І навпаки, у присутності 5615А, М616А і 5618А мутантів рівень інфекційності щонайменше в 10 разів нижче, ніж у випадку дикого типу та абсолютно невизначений у разі М/6Є14А мутанта. Це вказує на те, що специфічні заміни в конкретних положеннях в мотиві З35/4р4і1 інгібують надходження вірусу в клітини СЮ4-Т.

Приклад 2: Точкові мутації в мотиві 35/9р41 припиняють експресію МКр44ї.

Як показано раніше іншими авторами винаходу, ВІЛ-1 інфекція індукує експресію певних

МКК лігандів, включаючи МКра441ї. (МівейШага еї ан! 2005; ага еї а! 2007). Хотілося визначити, чи здатний вірус, що включає в себе 35/9р41 заміни, також викликати експресію МКр44їЇ на очищених клітинах СО4-Т. Після інфікування вірусом клітини дикого типу з високою частотою експресували МКр44! (56,295). Подібні результати були отримані на клітинах СОА-Т, інфікованих мутантами 5613А або Кб17А, з 61,0 і 67,6 95 клітин, що експресують МКра44ї, відповідно. Більш цікавий той факт, що експресію не детектували у випадку інших мутантів;

МУ614А, 5615А, Мб16А і 56184А. Згідно з попередніми даними (МієїПага єї а! 2005; УМага єї а! 2007) експресія лігандів МКрзо ії МКр46 не індукувалась в клітинах, які інфіковано або диким типом, або мутованими по аланіну З35/др41 вірусами, незалежно від положення заміни (Фіг. ЗА).

Далі досліджували можливість того, що експресія МКр44Ї по-різному регулюється у відсутності інфекційних частинок. Таким чином, у присутності інактивованого нагріванням вірусу (Фіг. 6А) або після стимуляції синтетичними 35-пептидами, включаючи різні заміни на аланін в мотиві 35/др41 (Фіг. ЗБ), були отримані результати, схожі з результатами, які отримано у разі компетентного вірусу, при збереженні заміни їх конкретного залишку. Дійсно, експресія МКр44ї. індукується лише в присутності 5613А і Кб17А мутованих елементів на рівні, близькому до рівня, що спостерігається у разі дикого типу, тоді як інші неінфекційні частинки або пептиди- мутанти не здатні індукувати МКр441ї.

Приклад 3: Модуляція дегрануляції МК клітин у присутності аутологічних СО4-Т клітин, інфікованих 35/др41 мутантами вірусу

Оскільки виявили МКр44Ї на СО4-Т клітинах, які інфіковано Мі 4.3 вірусом, що включає конкретні 35/д9р41 мутації (Фіг. 2А), досліджували можливість того, що клітини-мішені, що експресують даний ліганд, є більш чутливими до цитотоксичних МК. Очищені СО4-Т клітини, які інфіковані або диким типом, або різними мутованими вірусами, інкубували з аутологічними ІІ 2- активованими МК клітинами для визначення їх здатності до дегрануляції. На Фіг. ЗВ показано, що високий рівень експресії СО107а в МКр44І-МК клітинах детектували в присутності вірусу дикого типу (28,8 95) або 5613А (29,5 95) і Кб17А (29,9 95) мутантів, порівняно з неінфікованими клітинами (4,2 95) у відповідності з даними, що показують високий рівень експресії МКр44ї в

СрА-Т клітинах-мішенях (Фіг. ЗА). На відміну від інших мутантів, для яких не спостерігають індукції МКр44їЇ в клітинах СО4-Т, рівень дегрануляції залишається майже близьким до рівня дегрануляції, що спостерігається у разі неінфікованих клітин (Фіг. ЗВ). Схожі результати отримували в присутності інактивованих нагріванням вірусних часток (Фіг. 6Б) і синтетичних пептидів (Фіг. 4Г).

В цілому, дані результати суворо вказують на те, що заміни специфічних залишків у межах високо консервативного З5/9р41 мотиву викликають великі наслідки, що стосуються модуляції чутливості клітин-мішеней СО4- до МК клітин.

Приклад 4: Еліситація 35-подібних нейтралізуючих антитіл широкого спектру дії в мишах

У зв'язку з вищевикладеним проводили імунізацію мишей диким типом і будь-яким мутованим по аланіну 35/9р41 пептидом виробляти специфічні антитіла. Для будь-якого з них спостерігали стійкі імунні відповіді на свою специфічну послідовність 35/9р41 при використанні

ЕГІЗА з захопленням вільних пептидів (дані не показано). Цікавий той факт, що величина перехресної серологічної реакції залежить від пептидного компонента; причому антисироватка взаємодіє з будь-яким синтетичним пептидом прямо пропорційно своїй здатності індукувати експресію МКр44Ї. Таким чином, сильну перехресну серологічну реакцію спостерігали між диким типом і 5613А і Кб17А мутантами, тоді як даний ефект сильно знижується з іншими мутантами, у відповідності з передбачуваними конформаційними модифікаціями, що викликано специфічними замінами.

Більше того, цілі імуноглобуліни (9) елюювали з будь-якою сироваткою для оцінки їх ефективності та широти дії нейтралізації на крос-кладі К5 і Х4 ВІЛ-1 штамах. Використовуючи різні класичні аналізи нейтралізації з використанням клітин ТАМ-БІ і Неіа-Р4С5, підтвердили присутність значної нейтралізуючої активності антитіл до 35 дикого типу проти ВІЛ-1 (Таблиця 2 і 3), як описано раніше (Міейага АБ 2006). Схожі результати спостерігали у присутності очищеного Ід з імунізованих 5613А і Кб17А мутантних мишей. Несподівано, високу нейтралізуючу активність широкого спектру дії детектували для мутантів М/614А, 5615А, М6б16А і 60 5618А. Дійсно, значні відповіді були викликані будь-яким із даних мутантів на різні Х4 (МІ 4.3,

ВКИ, ії МОК) ї К5 (ОК-С5Е і МО-2) ВІЛ-1 штами зі значенням ІСво, що знаходяться між 3,3 і 17,7 мг

Ід/мл (Таблиця 2). Більш того, Ід з М/614А здатні нейтралізувати всі тестовані Х4 і К5 ВІЛ-1 штами зі значенням ІСзе5, що знаходяться між 6,7 і 19,5 мкг/мл в клітинах Неіа-Р4АС5 (Таблиця 2) і між 3,9 і 10,3 мкг/мл в клітинах ТАМ-БІ (Таблиця 3), в залежності від вірусів. Як і очікувалося, у присутності штаму ВІЛ-2 (КОВО) нейтралізуючу активність не детектували, незалежно від стану (Таблиця 3), що узгоджується зі специфічною делецією мотиву 35/9р41 в послідовностях штаму

ВІЛ-2 (Міейага РМАБЗ 2005).

Для остаточного підтвердження вищевказаних даних визначали ефективність вірусної нейтралізації за допомогою детекції продукції р24 очищених клітин СО4-Т, інфікованих МІ 4.3 або МОК штамами ВІЛ-1. На Фіг. 4А підтверджується відсутність нейтралізуючої активності проти МІ 4.3, що викликається Ід з УМТ або мутантів 5613А і Кб17А, незалежно від їх концентрації. | навпаки, значне зниження продукції р24 спостерігали у присутності Ід з мутантів

МІ614А, 5615А, М616А і 5618А. Цікаво те, що при концентрації, що перевищує 10 мкг/мл Ід з

М/614А, антиген р24 залишається невизначеним. Схожі результати спостерігали після інфікування МОК (Фіг. 4А). Крім того, вивчення кінетики показало, що продукція р24 повністю припиняється при 10 мкг/мл Ід з мутанта М/614А, незалежно від часу після інфікування і значно затримується у разі Ід з 5615А, М616А і 5618А мутантів, порівняно з диким типом і мутантами

З61З3А і Кб17А (Фіг. 4Б). Загалом, вищевказані дані повністю підтверджують, що заміна в конкретних положеннях в високо консервативному мотиві 35/9р41 викликала утворення нейтралізуючої активності широкого спектру дії в мишах.

Для додаткової оцінки ефективності інгібування МКр44їЇ, що здійснюються Ід, очищеним з мутантів 35/9р41 по аланіну, очищені клітини СО4-Т від здорових донорів інкубували з пептидом 35/д9р41 дикого типу, попередньо обробленим очищеним Ід з імунізованих мишей. На

Фіг. 4АВ показано, що 35-індукована експресія МКр44ї. значно знижується в присутності Ід із 35-

М/Т (9,4 Фо), порівняно з контрольними клітинами (35,5 95), що відповідає попереднім даним, отриманим з тАБб проти 35 дикого типу (Мейрага еї а! РМАЗ 2005). Крім того, сильне інгібування експресії МКр44| також спостерігали у присутності З5/др41 мутантів по аланіну, але трохи більш виражене у разі Ід з 5613А і Кб17А, ніж УМ614А, 5615А, М616А і 5618А мутантів (Фіг. 4В).

Вищевказані результати узгоджуються з даними по дегрануляції ІЇ-2-активованих МК клітин

Зо стосовно аутологічних клітин СО4-Т, які оброблено 35-пептидом у присутності антитіл з М/Т або мутантів 35/др41 по аланіну. Таким чином, дегрануляція інгібувалась як у М/І на 91,4 95, такі в мутантів 35/9р41 по аланіну на 78,3244,8 9565, незалежно від положення заміни (Фіг. 4Г). Це показало, що Ід, утворені у відповідь на 35/9р41 пептид зі специфічними замінами, набувають нейтралізуючу здатність широкого спектру дії при захисті, роблячи можливим інгібування експресії МКр44ї. в СО4-Т клітинах.

Приклад 5: МАБ широкого спектру дії проти М/614А 35 мутанта в плазмі від ВІЛ-1- інфікованих пацієнтів

Нещодавно показали, що активність реакційноздатних Мар широкого спектру дії, очевидно, що розвивається з часом у ВІЛ-1 - інфікованих пацієнтів. Для отримання інформації по частоті, з якою індукується утворення БМАБ до заміщеного 35/9р41 мотиву, при ВІЛ інфекції, проаналізували нейтралізуючу активність у 106 зразках плазми крові, які отримано від ВІЛ-1- інфікованих пацієнтів із різним клінічним станом. Зі 106 оцінених зразків 55/106 (52 95) включали в себе рівень антитіл, такий що виявляється до 35-М/Т зі значеннями, що знаходяться в інтервалі між 15 і 325 АШ (оптична одиниця)/мл Тест Спірмена показує високо значущий взаємозв'язок між кількістю антитіл до 35 і числом СО4 клітин (р«0,0001) (дані не показані), як описано (міейага еї а! АІО5 2006). Несподівано, антитіла, специфічно спрямовані проти М/614А мутованого мотиву 35/9р41, детектували у 5 з 106 зразках плазми (4,7 95) за допомогою ЕГІЗА.

Для будь-якого з них високий рівень антитіл був детектованим (знаходиться між 120 і 250

АЦШ/мл). Дані специфічні антитіла є ізотипами Ідос (дані не показані), і їх винятково детектували у пацієнтів з високим числом СО04 (8222589 СОр4/мм3), і недетектованим вірусним навантаженням (нижче ніж 20 копій/мл) (Таблиця 3). Слід зазначити, що дані антитіла, специфічно спрямовані проти МУ614А мутованого 35/др41 мотиву, не є детектованим в плазмі здорових донорів (дані не показані), а також антитіла до мотиву дикого типу (міейага ега! АІЮ5З 2006).

Зразки плазми від даних 5 незвичайних пацієнтів досліджували, і рівні нейтралізації, виражені як кратність розведення плазми, показали нейтралізуючу активність проти ВІЛ крос- клади для всіх даних зразків плазми, з ІС5о»100 для всіх із них, у присутності ХА МІ 4.3 ії К5 МО-2 вірусів. Цікаво, що плазма в 1 із даних пацієнтів (2109) нейтралізувала щонайменше 95 95 ВІЛ часток (Таблиця 3). Для підтвердження того, що нейтралізуюча активність пов'язана з антитілом, специфічно спрямованих проти М/б614А 35/д9р41 мутованого мотиву, антитіла з бо сироваток 5 ВІЛ-інфікованих пацієнтів очищали імуносорбційним методом з відповідним синтетичним пептидом. Дані елюйовані антитіла показують значну нейтралізуючу активність з

ІСво значеннями, що знаходяться в інтервалі між «0,2 і 1,9 мкг/мл або «0,2 і 1,9 мкг/мл, у клітинах НеІа-Р4С5 ії ТАМ-БІ відповідно, для щонайменше двох різних ВІЛ-1 штамів (Таблиця 3).

Вражаюче, очищені антитіла від 1 з 5 пацієнтів (2109) показують подібну широту нейтралізуючої активності проти всіх ХА і К5 штамів ВІЛ з ІСе5, що знаходиться між 0,6 і 1,9 мкг/мл, незалежно від аналізу нейтралізації (Таблиця 3). Вищевказані дані підтверджували продукцією р24 на очищених СО4-Т клітинах, що показують сильну нейтралізуючу активність, що змінюється між 0,2 і 1,0 мкг/мл і 0,11 і 1,8 мкг/мл після інфікування Мі 4.3 і МОК відповідно (Фіг 5А). Крім того, вивчення кінетики показує, що продукція р24 в супернатанті, яка не включає клітин, дуже сильно знижується у разі 1 мкг/мл очищені імуносорбційним методом антитіла від ВІЛ-1-інфікованих пацієнтів, незалежно від часу після інфікування, у порівнянні з контролями (Фіг. 5Б).

Далі, хотіли визначити ефект інгібування МКр44їЇ,, що здійснювали даними нейтралізуючими

БМАБ, які специфічно розпізнають М/614А 35/9р41 мутованний мотив, очищений з ВІЛ-1 - інфікованих пацієнтів. На Фіг. 5В показано, що всі МАВ проти М/614А зберігали свою здатності інгібувати МКр44ї, порівняно з 35-сенсибілізованими контрольними клітинами; однак, порівняно з антитілом до 35-д9р41 дикого типу із мишей або очищений із ВІЛ-1 пацієнта (2117), ефективність трохи зменшена. Дійсно, 21,9 95 клітин експресували МКр44|Ї в присутності очищеного Ар проти 35-МУ/Т, тоді як від 21,9 до 34,6 95 клітин залишаються МКр441" після обробки БМАБ проти МУ614А мутованого З35/др41 від ВІЛ-1-інфікованих пацієнтів. Важливо, що спільно культивовані аутологічні СО4-Т клітини, оброблені диким типом або очищеним антитілом до М/614А З5/др41, з аутологічними ІЇ2-активованими МК клітинами показали, що експресія СО107а значно знижена або припинена, зі значеннями, що змінюються між 1,8 та 7,8 6 б0107аМКра4-МК клітин, порівняно з 28,6 95 у разі МК клітин, спільно культивованих з

З5-сенсибілізованими клітинами мішенями СО4-Т у відсутності АБ (Фіг. 5Г). В цілому вищевказані дані показують, що еліситація природних БМАБ проти специфічної мутованої форми мотиву З5/др41 спостерігається у деяких інфікованих ВІЛ-1, володіючи дихотомічними ефектами, які об'єднують як нейтралізацію вірусу, так і інгібування виснаження популяції СО4.

Таблиця 1

Аналіз нейтралізації в клітинах Неїа РАС5 мяз | 77777777 177171717171717х4111171111111115201 1111120 пи ЕСЕ ТЯ ПО КОТ ПО ПО ПО 1111111 ДВА Ї77777771111111111171ї111111113541 11111174 пед ЕС ПО ПО ПОН КОН ПО 1111111 (МІВ Ї777777717171717171717171711111111115811117|111111195..ШЖЩГ 1111111 ФЕТА 17711111 11112 ни ЕСЕ ОО КОН: Я ООН НО ПО в 1 77777777777171717117171711717171717х411117111111115201 1111120 пи ЕСЕ ТЯ ПО КОТ ПО ПО по пи КТТТ:Х ЕТО ПО НО Я: ЗОНИ КОХ з Я ДО пи ЕС ПО ПОН Ук НОЯ КОН по ни ТТ ТЯ ПОН НО УК: ЗОНИ ПОН з Ж ОН 1111111 ФЕТА 17711111 11112 пи ЕСЕ ОО КОН: ЗОНИ НО ПО

МКГ 77777777777111111171171111717х4111117111111115201 1111120 пи ЕСЕ ТЯ ПО КОТ ПО ПО по пи КТТТ:Х ЕТ ПО НО УК: ЗОНИ ПО КР: ПО пи ЕС ПО ПО З: ХОДИ ПО по 111111 (МІЯ Ї77777777771717111111117111111111421 1111120 1111111 ФЕТА 17711111 11112 п ЕСЕ ТЯ Ох КОН: Ж: ХОДИ НО ПО

МЕТ: пої: вЙШИЙ ПН КОН С: ПОН КОН ТЕ: ЯК НОЯ КОН ПОН пи ЕСЕ ТЯ ПО ПОТ ПО ПО по 111111 ДМА Її в111171|111117195

Продовження таблиці 1 пи ЕС ПО ПО НЯ ОО ПО по 111111 (МІВ ЇЇ 7777777717171717171711111111115611111|111112о 1111111 ФЕТА Ї77111111111111111111111112о1 11112 пил ЕСЕ ОО КОН ТК ООН НО ПО ге т Пил ПО С Я ПОЕТ ПО ПО по пи ЕСЕ ТЯ ПО КОТ ПО ПО по 1111111 ДВА Її 11111195 111111 8Ї8вІБАСЇ1111111111111111111111111111ия1 111120 ни ТТ ТЯ ПОН КОН : ЯК: ЗОНИ НО ПОН 1111111 ФЕТА Ї77111111111111111111111112о1 11112 111111 Ї56ВА177711111Ї111111111111111111111111111111681 111112

Таблиця 2

Аналіз нейтралізації в клітинах ТАМ-БІ мая ЇЇ 77777771 Х411111711111111520 пе ЕТ ЕТ ПО КО т ПО ПО ПО 111111 ДМВІЖА/ Ї7111111111111111111111111111111541111 11111174 в /1777777771111111111111171Ї111117х41111171111111115201 111120 111111 986ІЗА1Ї1111111111111111111111111111112о1 1112 111111 0МВІЖА С Ї771111111111111111111111111111361 111118

МК 111111111Г11111717х41111171111111115201 111120 пе ЕТ ЕТ ПО КО Е Т пОЯ ПО ПО 0000111 0МВІЖА Її 6311117111111188

МЕТ: ної: ВИЙ ПНО ПОН х С: ПОН НО ПО ПОН ПО пе ЕТ ЕТ ПО КО т ПО ПО ПО 11111 0МВІЖА/ Ї71111111111111111111111111118ви11111в6

Ме 1 11111111внь1111111111111»2о1 1112 пе ЕТ ЕТ ПО КО т ПО ПОТ ПО 111111 0МВІЖА/ Ї7111111711111111111111111111111о81 1111201

КсТоїв ДИ ПОН ПОН: ТИ БЕ ЗНО КОНЯ НО пе ЕТ ЕТ ПО КО ТП ПО ПО 11111 ДМвАГГ/ Ї77771717171717171717111111112го 1 |111с2го1

Таблиця З

Характеристики та нейтралізуюча активність ВІЛ-інфікованих пацієнтів, які утворюють антитіла до МУб14А-35/др41, специфічні до М/614 35/др41 мутанту 10010111 ВіЛаінфікованіпацієнтиїд//:///СС 11111111 рожа | йга | я | 65 | й | то

Відношення СО4/СО8 1007 1 10 | 71 | 08 | 07 | 12

АктивністьМаруплазмеї 77111111 Ї111111Ї11111Ї11 (Сюйсе)їуГ 77777111

Бій НН ПОН ПОЛЯ НЕННЯ ННЯ НОЯ антитіломе

ЦСюйСе)їуГ 77711111

Продовження таблиці З

ВО 77111111 | 22 | »б/2 | »гіха | тро | 5252 ііі НН ПНЯ НОЯ КОНОНКО НОЯ антитілом" (СюйСе)їГ 77777711

ВО 77777111» | 22 | »б/2 | »гіза | тра | 5252 а 107: зразок ВІЛ-інфікованого, який не утворює антитіла до М/614-3579р, але 125 АШ/мл антитіла до 35 М/". Специфічні антитіла очищали імуносорбційним методом із сироваток з пептидом 35-МУТ в якості контролю 6 Активність МАБ в сироватці виражена як кратність розбавлення інактивованої нагріванням плазми, яка встановила 50 95(ІСво) або 95 95 (ІСео) інгібування, відповідно, вірусної інфекції в клітинах Неїа Р4С5. в Активність МАЮ у очищеного антитіла виражена в мікрограмах антитіла, яка встановлює 95 (ІСво) або 95 95 (ІСео) інгібування, відповідно, вірусної інфекції в клітинах Неїа РАС5. г Активність МАБ у очищеного антитіла виражена в мікрограмах антитіла, яка встановлює 50 95 (ІСво) або 95 95 (ІСео) інгібування, відповідно, вірусної інфекції в клітинах ТАМ-БІ.

Таблиця 4 11100001 полілептидиї///////7/777711111111111сСсСС 71111 Мт | БбІЗА | М/бІ4А | 5бІБА | МбІібА | КбІ7А | 56185 мб | 7640 | 7640 | ї20 | 1760 | 760 | 140 | х17280

5450525 СОКВЕСТЕВ. ЕХ

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«Мох 1) ІННАВІРВАКС 2) ІНСТІТУТ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛА САНТ ЕТ ДЕ ЛА РЕШЕРШ МЕДІКАЛЬ «120» КОМПОЗИЦІЇ для ПОПЕРЕДЖЕННЯ Й

Т/АБО ЛІКУВАННЯ ІНФЕКЦІЇ, ВИКЛИКАНОЇ ВІРУСОМ ВІЛ-Ї «130» РЕЗ5302 «1405 РСТ/ТВ2012/051842 «іі» 2012-04-13 «1505 ЕВ 11305451,4 «151» 2011-04-15 «ї60» (20 «170» Версів, що латентується 3.5 «щН «вії» б «1» ПР, . . х213У штучні послідовності «2 ха2З3» пептид «кое0» х221» змішана властивість «ах 003.6) , й й з0І3х три з чотирьох амінокислотних залишків, що розташовані у позиціях 7, 3, 3 позначають конкретну амінокислоту, яку визначено у їх відповідному значенні 013 1 й і -четнертий амінокислотний залишок, який Залишився, визначено у сярєму значенні (313 егох С Я «2ї» змішана властивість «га» 083.08) і | о «273» 1) позначає ю або (ії) позначає будь-який з А, я, В, М, С, 9, Е, б, Н,

І, Є

Ок, в, М, в, 5, т, ж; або М «ггОх й , «221» Змішана властивість «вай» С33..033 й «ВЗ. сі) позначає 5 4бо сії) позначає будь-який з А, й, М, Б, С, 0, Е, б, Н,

І, Б, і Е, М, Р, Кк, т, У, ж вбо м хе20» й «221» Змішана властивість «Еф (4). (4) Що «43» Сі) позначає М або (11) лозначає будь-який з А, Кк, 5, 0, С, 0, ЕЕ, б, Н, ї, Кк,

Б. в, М, Р, Т, Ж, М або М «220» й . «22ії» змішана властивість «бом 0 (83..563 . «23» (і) позначає 5 або (іт) позначає будь-який З А, Кк. М, Б, С, 0, Е, б, Н, т. Кк,

Б. Б, М.В. т, Ж, М або х

54540.:5725 СОВВЕСТЕВ. Ех «00» 1 5ег Хаа Хаз Хаа Бу хай 1 5 «іх 2 «гії» 5 «рївж ОВТ , , «81ї3х штучні послідовності «ЙО «23» пейтид «вд» . . «221» змішаня властивість «ай 0 23..023 «223» ХХ позначає будь-який з А, й, 0,МУ С 0, ЕЕ, б, НН, Її. Б, Кк, Б, М, В, 5, т ' ж, аба У «00х 0

Бе" хай 5ег Ази Сух Баг 1 5 «21йх 3 «іїх 6 «кій ПРЕ , «213» штучні послідовності «220» «223» пейтид «2205. «1» Змішана властивість «рах (33...) . «223» ХХ позначає будь-який З А, Кк, 0.М, С, 0, ЕЕ, б, НН, І, ї, Кк, Б, М, К,Т, У, ж аба у -8005 3 зег Тер о хва деп Був Бек 1 5 «8105 4 х231» 6 «212 тет «213» штучні послідовності «720» «2235» пептид «2205 , «2215 Змішана властивість «й2ах 43,4) й «223» Х позначає будь-який з й, В, Б, С, 0, ЕЕ, б, НН, 7, Б, ЖК, БЕ, М, Р, 5, Т, у, х або У ка0б» 4

5аАЗМО 525 СОВКЕСТЕО їх зас оТгрозег ха вує баг 1 5 «г0х 5 «Ії» 6 «тій ОПР й Й «213х штучні послідовності «220 «223» пептид каййх І й «221» змішана нластивість «вай» 0 с63.К6) й «223» ХХ позначає будь-який з А, К, 0б,М, С, ЕЕ, 5, Н, Ж, ЦК, КЕ, М, Р. т, й ' або хм «400х 5 сег Тер о зег Аби гсув 'хай 1 5 «91055 «11» 6 «фах пПРТ , «?13У штучні послідовності «д20х «283» пептид «0 6 «ек діа зег Ап вуз 5ег 1 5 «АН «21їх б «2125 пвт й й «213х штучні послідовності «г20х «223» пептид -4005 7 зер тер АТа дви гу вег 1 й «205 8 «-211» 5 «21аж РТ «213х штучні послідовності «ФР» «223» пептид «400» 8

Бек о ттробер Аза ух вет 1 З

ЗА5щО 5125 СОБКЕСТЕВ. ХО «2105 9 «її 6 «втйх ПРТ І І «РІЗ» штучні постідовності «в» «ггЗх пептид «00» 5 зЗег Тгро5ег дбп бу Аа ї з «210и 10 «2115 4 «в12» ПРІ «213х дйтучні послідовності «220» «223» пептид «ВМО 10 рго тв о А5п Аа 1 «21025 1 «ек 5 «вій ПРЕ «213» штучні послідовності «дО» «дах пептид «1005 (М

Мем дер АБр тів тгр 1 5 «2105 12 «ії» 15 «2125 ПР й «213» штучні послідовності «20» «их пептид «МОХ 12

Рго тгроАби Аза зег АТа бек Ап Гуз 5ег цей Ар Ар тів тир 1 5 10 15 «21025 1 «711» І5 «12 ДРТ о «213з штучні послідовності «Ох «223» пептид «4005 13 рго тер Азп Аїа бек тер АТа ди бух зег цен Або Ав тів тгр 1 5 ї1а 15

5450 5725 СОВА ЕСТЕО. ЕХ «210» (14 «211» 15 «ід пет о «2132» штучні послідовності «220» «веЗ» пентид « «4005 14 вбго ТгроаАбп АТа бе Ттробег АТа цуб5 5ег Бей Ар оАБр Хе тр 1 З 16 15 «210» 15 - «11» 15 «в12» ПРЕ «2135 штучні послідовності «ах «2235 пептид «ФО» 15

Рго ТгтроА5п АТа чего тТрробег А5п обу АТа бен А5р Авр хе тор 1 5 10 15 «2105 (16 «1125 30 «125 ПРІ «23»: Людина розумна ох «феї» / СЄПЕЦИФ. ЗАЛИШОК «вай КН «де» АЦЕТИЛЮВАННЯ «ви» «2215 / СПЕЦИФ. ЗАЛИШОК «вай (143, ,014) «беЗ» АЦЕТИЛЮВАННЯ «А» 016

Ахпонів А5й Ні Агу ї1е Ага Тпго деп вго АТа тТе Уа! був тигосів ї 5 10 15 депо бек тер 5ег оз буз Аїд бух збе жів суб віп сот іп «210» 17 її» 56 «й ОНР «13» штучні послідовності «во» «да3» Полі-гістидин о таг «005 17 ні нів Ні нів Ні НІ 1 5

54505125 СОККЕСТЕВ, ХХ «2105 18 «1 16 «аж РТ ше ; «213» штучні послідовності «0» що «223» ВІЛ-Ї МНХВ2 штам-похідні арії пептиду «А0О0х 18

Суб вВго тер Аби діа за тер об5ег дей Гу зеб гей дер. АбБр тів тгр 1 5 10 | 15 «2105 ДЦ «І» 16 «вій ОПР, . о «ІЗ» штучні послідовності «220х «223» ЗБІЗА мутований пептид «4005 19 сСуз вго тТрр Аби Аїа АТа тгроб5ег деп Су» заг оте Ар Ар тв тер 1 5 10 15 «210» 20 кгїї» 16 «а ОНР. о о «2135 щтучні послідовності «20» Й «223» КбБІТА мутований пептид «4005 (20 суз вго Тер Аби Аа зе тер обег деп АТа забогец АвБр о Авр їїе тер

А 5 10 15

Claims (8)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Імуногенна композиція, що містить антигенний пептид, вибраний з групи, що складається з: - РРУУМАБАБМКОІ Ю0БІМ/ (ЗЕО ІЮ МО: 12), - РУУМАБУУАМКОІ ЮОІМ/ (ЗЕО ІЮ МО: 13), - РМ/МАБУУЗАКЗІ ЮБІМУ (ЗЕО ІО МО: 14) і - РУУМАБМУМУЗМКАГ ОБІМ/ (ЗЕО ІЮ МО: 15).

2. Імуногенна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що антигенний пептид ковалентно зв'язаний з молекулою-носієм.

З. Імуногенна композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що антигенний пептид об'єднаний щонайменше з одним імуноад'ювантом.

4. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що складається з вакцинної композиції, де антигенний пептид об'єднано щонайменше з одним імуноад'ювантом.

5. Антигенний пептид, вибраний з групи, що складається з: - РРУУМАБАБМКОІ Ю0БІМ/ (ЗЕО ІЮ МО: 12), - РУУМАБУУАМКОІ ЮОІМ/ (ЗЕО ІЮ МО: 13), - РМ/МАБУУЗАКЗІ ЮБІМУ (ЗЕО ІО МО: 14) і - РУУМАБМУМУЗМКАГ ОБІМ/ (ЗЕО ІЮ МО: 15).

6. Антигенний пептид за п. 5, який відрізняється тим, що даний антигенний пептид ковалентно зв'язаний з молекулою-носієм.

7. Спосіб детектування і/або кількісного визначення антитіл до антигенного пептиду у зразку, що включає в себе наступні стадії: а) приведення зразка, що підлягає тестуванню, у контакт з одним чи більш ніж одним антигенним пептидом за п. 5, б) детектування і/або кількісне визначення комплексів, які утворено між даними антигенними пептидами і антитілами, що присутні у даному зразку.

8. Набір для детектування і/або кількісного визначення антитіл до антигенного пептиду у зразку, що містить: а) один або більше ніж один антигенний пептид за п. 5, і б) один або більше ніж один реагент для детектування комплексів, що утворені між даними антигенними пептидами і антитілами, які присутні у даному зразку. дикий тип: МНи-С-РА-М АВМ КО ОТ Я-СООН Зб1ЗА (МІ) : МНА-С-Р-М-КАА-АН-ВМ-К-В-1-А0-0-І1-М-СООН МО14А (М2) МН2г-СеР-ЩМАМ-А-ВАДАВ-М-К-8-1-р-р-Т- Ясон ББбБІЗА (М3) : МНО-СерР-И-М-А- ВАМ КАВА ОТ СОН Мб1ібА (Ма) : МНС РАНМ-А-ВА ВАК 5 О-р-Т-Щ-СООН КбіТА (МА) : мНнаеСвАММ АВ ема БАБА 0-0-1-М-СООБ з6бівА (МБ) : МНС -Ме Ан ВИ ВМ КАНОН

ФІГ. 1 А во 75 Ес ' "у як і Б ВО і В 13 я Б ко Ж жк 5 ЗО ю Я в в ї в В в З Я 5 Б п З Ішш с Б. т а 5 Ва МО ча ї її Б Ох то їх 5 ВОЗ М УТ 56І13А ХерА 56І5А МбБА КІТА БбІВА «ріг; 2А

ЩО три ие ше ще З о ; ш щ- че іх КО ЗО» ВО Е ії А п а 3 Б х ї Її м г ЕХ Кк я у Е ШИ - о. ва в в ІшШШЕ о. МТ 5БІЗА ЗуУвІЗА ББІЗА МеівА КОІ7А ЗІВА

Фіг. 25 С Ю З - | Донна Ше й 8 150 Не Е й Е Ж Ї; З х йо с да Ж : ЗШ Бе Ї га мо ч 850 г а Е Ко У а 4 5 15 16 Ківькість днів після віфікування

Фрі. 28 В ТВО три І 51 о. я ГК : З СЕ х Б х ХО ОХ їх 50 5 ї ї БО В з 5 ї ОО Ж ї З 5 ОХ БО Е ШЕ |! а Ж В 5 КОХ ХО зн БО ТТ БезЗА ЗУуУвІЖА ЯБІЗА МБІБА КвІТА 6іЖА ФГ

АТ ЗА віз А : и, 1 рі ВД не, шк; гу ї Н з і З Кров ав ШИ на а в а чО15А МмбівА: КВІ7А «Є18А і : й й р ; --1-- 0-1 п шиншшни шен ши Те ще Нр Еш ЕК і Я ще А ваша Ач чи фіг ЗА Е явіза вм не ще Ше ше ! ! Н НЕ: ай НН Я ши ним и в ни НЕ щ ШИНИ ще р ! дна ни пащі МКмаа кін сн ва снуд ен АННИ яка МБівА Юта Бета Га ко жит Ще пря т ! пня 1 с Ж й і яні и ши НН и аз ш ше | ! щі Іл р / ше Я ! ж ! і «Фіг. ЗА (продовження) т ява чена І ! і НИ

Що. шин шини щі ще МИНЕ : і я о чи 4 Я 1 і ї ій Краб МРТ хви кутею и 00 «Клфодтттекуу тт т явіЗА МебА Квіта щеїжА пн не т ! питних фнентинннинннннннннтя

А. и й ще ши що ен КН нн М НО Й | І що і | | . ! і ї НИ р ; пк щ и Емо Чин ШЕ НН : М тної Кдннтчидн кін Фіг: ЗА (продовження)

ПЕ УТ 51 ЗА аз аА пив пн жи м чдаиии и на АННИ АГ гі лх Й рН ІЗ ТІВ к о! і і и иш деде ши Е ї Н З Ь х Н мкрачу г шечаши КА М звіЗА Мме1ібА КОТА 5618А пнненнннннннннннннннтт, - ТИ шини гг -1- ши щі . ! І ше ! у. А | І; чи у п А т ІК ИН 1 ЩЕ пише Я Н ІЙ : дк а шк І Зичу ютттттнниї й тен Джен Е синте кто - «няння Мунтян

Фіг. ЗБ М Ж ній жд і С паітія | озю ів 1жк є ві їжею по З З Помткк и то і ОО о В НН Б з ОНКО НН У НН я САНИ м о ви зі їі сш 4 в п о о о ва по ВЛ ЕК Е ЯМА МІЛА, КВІТА ЗНА Я с одлвнваі сінна ІК ДНІ ІОВ У хист плине пенні пів | зві 1» : ле І ШИ ЕЕ Ве які меш і ! і и і і ше ши: ша: Ше ше ше ее й В З ха ШЕ ШИ ПОХЛМВЖВИХ ес п ви УСС А ОТТО СОТ ем Мк

Фі. зв п Зе1ТЗА. БІ, чвіЗА ее як ВИ ШЕ е я я и пон м по Ам х | | ші 1 ЛУ Ї ц і НІ АД ї у і Я 1 ша шина ШИ! КАК Ту їх й Е З і х з і, шенні ли чн вла чи сення меж каі7А цвівА пнИижачаанНннажаВаНнашашншлшншлЛлЛллааи ке пола оно о о а п мл а в в Я 51 ; ха 1 ї А - ГАГА ! і х 1 і : Е 4 Щ : р |! 1 ще ше ; Ох г ши шще Е А и АКТИ ни ла те їх пеетстхКоекоекуініінжркатня Мудвепчннннно Можете свита Фіг, г

703 в Й Пп плтоттнннниця. ІЗ 150 одне НА одвдрннікен Осо, ї | ше - пов « НЮЗ Х. Шах -х сан ни й нн На а їх Но; 15 хо Позмкоім) 2001 денні джен 3 и Ин Ес 15о НОВ, сх "вових т З Енн я МЕ х, с дн ск а хо | а дн Он Ше СОННИЙ с Дрю терну нтнння я ЕТКЮМ Що 5 Ів ІЗ ко Пец(мкгми

ФІГ. ЗА щю ї - зма У. З зв юв- дж я ри - і -е де МИ й й дос кла ДАМ сле спон З "я о З Я 6 5 10 Кількість днів після Інфікування КК: пп в щ 9 с Й 2 що є ра тод о. як Е Й дн все, Кк ов шк 4 507 й дження дес я скннннвн в. м аллтслн пн а 2 З е 8 1 Кількість днів після інфікування

Фіг. 45 і А | | | Дозв2 в Ав 0 ЗБУТ З5ків-з613ЗА ЗБЕ УМО14А, і чу її: ' що Да А 05 ка ше 35-е-9615А 35416-МбІбА ! д із А і4о оно я бе іс вна ній ПКТ ВИКОН Ві втеюттютний З5е-КбІТА 358-5618А Що дово, МКраді.

Ф.48

: ва і важ | З оз | за! 3 ва І кв Яолоолоутя я полю ! Ї Щек нене о оса Кох І о еко ШК ННЯ оо ИН о ВН НК ії . КОКО, г ПТ пе ши и не тая ма) ек перева аа и за а п п В ак уче крн вв ; ні св ИН вок Но осо ИЙ їз і та і о НЕ зві

Е г. ї Н і КУ, | ОУН ї БО і що плив ї В НЕ | - Бо овен 3 - п ОМ | пух. ВОМ ! дО ледве епі е гово о осн р ес с ЗНЙ і ОО : МО нс род ее ой ШЕ Н Ши КУТЯ я Го. Е зі емро,. ям ! Б ро з 4 род па Я поту пектин ОХ оккотуєти тю т мчати кекс. Се суикиююди леткляня дин НІЖНА. КА. ЗВ ВІВ. Тв | | ва ав її оя 1 тай! В: Клин 1. ви | і. я і ШИ зона НК КН ИЙ ЕВ Е ШЕ Б і І во КИ | СТУК і зас же ої зв тре яза Ро) звер вала і винкс панасьи вм с НА ЧАН ПУ ЛОТА пун т ву ум ту Ту т У у Й вк анг. 4Г 0 І писк Я о нини ПО нннвнннннн Е 150 А Й й пив Я 309- щ -к шу В і, б. я й уд я а в ій 15 20 Поацмкгіми) 03 шо. о (З р - Кос пан ні ни нини ї Е 200 дк У с ще йно | ка х та ж 1 а во хх ій йо Пооазсоідин НО 0 5 Ю 15 Ще; Похмкгмл) ФІГ, 5А дю ноти ет ут об шко рр то нодсн с жий Ши ц 150 я Ко по Ню ; - т 7 в г а е ще о 2 Я 6 я тю Кількість днів після інфікування щі нн ре їх ско 200 рани НАШ 5 дит ШИ: сс у з а ко до КИ кенсжас шненані о нс тн я най З й 4 й г 10 Кількість днів лісля інфікування Фіг, БВ МТ 35 Аті-35 : вв ЕТ й 15 рої 1 ва . шк зе щі ши КЕ В жа Ов І Б 1 КО Ба : З 1 КЗ ПО ОХ і ГУ па обо 1 : Не о НН Ї 17 24 44 й па о озе 11 яя Щроосянінннннняї шини шин і! ЩІ І. : я ЩЕ шк шк ! І | Ї а ! Гук ! ГУК Н СХ 00 ЗЕ Й ш ш ши ! КИ, І ОД Й 255 71 119 рун ренту рн НЕ а 15 На зло РКО пня роя

Й. Щі. ЩЕ кі їх що ооо НН в З ес ен Коток піоки Аа Ані Мкрац,

«нг. 5

. п ; г М 35 дпі-48 105 мч уч у ин з : х 5 Н лід пр ще і 05 я

ЯН . 13 ДО І І МОЙ кош | ША оо, Бех 5 НЕ НИННе Ух кое в ЗВ Ще Я їх: З ОК ! : СО ши ИНА ше ла Ян ск ж БЕ щу т ЯК пет їв п а ДК й вл, й т зе жлре дес нтащетя ния рн Й й Я вза оон ту ванн Е страт рент ел а 3 ІЖ бла в 1, тт ї і став ам я тя 00 ЕН Вл і ДОН НН 14 т і ни 5 НИ 07 З ї проеюех і ПИ и НН Ти. і АЕН ж шва ОО В Сх У фе ДО ння КОЗАК ві еЕ її т с на ЩЕ шо по Не роя туя ШИК па Й Соч ічкдчен хі Фіджі За 564 ? кни ннневи т ми Геменнинн ннннн сш. Як ї ; г се-- Я 08 - 5 09 І ва 1123 | ! г й І ЯЗси: і ' ; Ба ці Н з і Ялті ям ти нн НН Пд | оду Ї 1 й Б я НЕ Б мя І Ї ши й І пт г А ства Й сце Я до ПИ Еш ай поема і зар вав ча ТУ а а і гвкко звіт ва вно ДВ во со Кок нки вн МД ОК З вза

ФІГ. 5Г щих я м ЗА др ну НАХ, зБіХ рення Я 5ВІХА Май туш чит МА КОСА хАгВ і ВИС 4 ї Ж ї | 1 Що: тт о Бона : Я о ї ! ве Ши Ше і й з | Й --м НУ Б ЗУ 1 ІК У пиши КЕ : А Ко НЕ і пш ЛЕ А Я і ЕВ; іх НВ; Дача; І щі пд п Конні Кейн інн Кі А ія | ШЕ р у пдсння; скржижииж свлжжхиажжя сет туя имутек Хе і пеуміннечетст тече н пткекстнтттнння

МК. м Фіг. БА ТЯ у лит М веіза і | Петля пон оно М Соли Мі їв гора Н 145 в шен піпнттннтнннн З | ик НЕ НИ ти ичми шеу Ли ї с княжна і Коди І ро ше, р: НК З ще ше - Вик ГЕ шу о г нео ЗЕ й и ї сн в Я лини Б ОН сі Б фен Ас умо, 4 ще - : Е Шо ОМ фон і ше 0 ШН ще ! В в її Де щі 1 и БИЧ Б з ШЕ Н Меса їх й і А тех ря ня КО, Н Пи ня Кл Фі Дуччетентюф тертя ДА ПІНИ шк Я ОЗ і вин ЕЕ пи па 4 ща УЖ і в. вія мне жк с о ЗД ДВ ї мий нд щі 5БІЗА дів пежетев етнічне кррогтртт МеБА Кв й ї за ре Пн оння ин вІТА 35 ; там | ро і зі є: сне пиши: МИ і щи осо і Я ха і ї ОБ иА т УК і Кол аг | М р-Ш- |! пек І еще ще я ще ; не меш в ШЕ Ба Пи Кей м НЕ ооо нн в і Й ОА Ок З ше З А ЩЕ ше шик є ОЗНАК і ПТО Н в. Н о КО і Тов КМУ ді ї в ай М М шо і о МИ пз тових 41 ОТ ОО о. р ев ін в Й З Опов осот Шй сек влажн з й ИЙ віх МКоі.

Фіг. 55