UA119965C2 - Регуляторний елемент рослин та його застосування - Google Patents
Регуляторний елемент рослин та його застосування Download PDFInfo
- Publication number
- UA119965C2 UA119965C2 UAA201510009A UAA201510009A UA119965C2 UA 119965 C2 UA119965 C2 UA 119965C2 UA A201510009 A UAA201510009 A UA A201510009A UA A201510009 A UAA201510009 A UA A201510009A UA 119965 C2 UA119965 C2 UA 119965C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- expression
- dna molecule
- plant
- ehr
- dna
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title description 94
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 272
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 185
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 139
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 186
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 41
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 26
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 11
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 4
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 80
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 61
- 241000266501 Ormosia ormondii Species 0.000 description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 52
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 48
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 43
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 36
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 35
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 34
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 30
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 28
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 28
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 27
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 18
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 17
- 238000001810 electrochemical catalytic reforming Methods 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 12
- 102100040618 Eosinophil cationic protein Human genes 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 9
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 7
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 6
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 6
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 4
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 101100162205 Aspergillus parasiticus (strain ATCC 56775 / NRRL 5862 / SRRC 143 / SU-1) aflI gene Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 241001316290 Gypsophila Species 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 101150097977 arch-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 101100389815 Caenorhabditis elegans eva-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108010049994 Chloroplast Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000027288 circadian rhythm Effects 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007380 fibre production Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- NJNFCDQQEIAOIF-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxy-2-methylsulfanylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(CCN)C(SC)=C1OC NJNFCDQQEIAOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006409 Acacia auriculiformis Species 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 description 1
- 241001167922 Babka Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 235000017788 Cydonia oblonga Nutrition 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 244000115658 Dahlia pinnata Species 0.000 description 1
- 235000012040 Dahlia pinnata Nutrition 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 1
- 241001547860 Gaya Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 1
- 101100377374 Mus musculus Znf568 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000018242 Obba <basidiomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 241000795633 Olea <sea slug> Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241001520299 Phascolarctos cinereus Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 description 1
- 101150081327 Sb gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000010432 cotyledon development Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000010864 dual luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 description 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000015141 kefir Nutrition 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019629 palatability Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002165 photosensitisation Effects 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004069 plant analysis Substances 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
Винахід стосується молекули ДНК, яка містить послідовність ДНК, що має ген-регуляторну активність, і гетерологічну полінуклеотидну молекулу, що транскрибується. Винахід також стосується клітини трансгенної рослини, трансгенної рослини або її частини, рослини-потомка трансгенної рослини, трансгенного насіння та способу отримання трансгенної рослини.
Description
(54) РЕГУЛЯТОРНИЙ ЕЛЕМЕНТ РОСЛИН ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ (57) Реферат:
Винахід стосується молекули ДНК, яка містить послідовність ДНК, що має ген-регуляторну активність, і гетерологічну полінуклеотидну молекулу, що транскрибується. Винахід також стосується клітини трансгенної рослини, трансгенної рослини або її частини, рослини-потомка трансгенної рослини, трансгенного насіння та способу отримання трансгенної рослини.
ПОСИЛАННЯ ДО СПОРІДНЕНИХ ЗАЯВОК
ІЇО0О1| Ця заявка заявляє пріоритет попередньої заявки США Ме 61/785268, поданої 14 березня 2013 року, яка включена в цю заявку у повному обсязі шляхом посилання.
ВКЛЮЧЕННЯ СПИСКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Ї0О2| Список послідовностей містяться у файлі під назвою "МОМ5ЗЗ2УО. і" розміром 52,7 Кб (розмір виміряно в Містобзой УУіпдом/єФ), що був створений 11 березня 2014 року, подається при цьому в електронній формі і включений у цей документ шляхом посилання.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
І0ОЗ| Цей винахід відноситься до галузі молекулярної біології рослин, генетичної інженерії рослин та молекул ДНК, придатних для модуляції експресії генів у рослинах.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
ЇО0О4| Регуляторні елементи являють собою генетичні елементи, які регулюють активність генів шляхом модуляції транскрипції функціонально зв'язаної молекули ДНК, яка транскрибується. Такі елементи включають промотори, лідери, енхансери, інтрони та 3 нетрансльовані області та можуть бути використані в галузі молекулярної біології рослин та генетичної інженерії рослин.
СУТЬ ВИНАХОДУ
ЇОО5| У цьому винаході запропоновані нові регуляторні елементи для використання в рослинах та генетичні конструкції, які містять регуляторні елементи. У цьому винаході також запропоновані трансгенні клітини рослин, рослини та насіння, які містять регуляторні елементи. В одному варіанті реалізації винаходу, описаному в цьому документі, регуляторні елементи, ,функціонально зв'язані з молекулою ДНК, яка транскрибується. У деяких варіантах реалізації винаходу молекула ДНК, яка транскрибується, є гетерологічною відносно послідовності регуляторного елемента. У цьому документі також запропоновані способи одержання та застосування регуляторних елементів, описаних у цьому документі, включаючи генетичні конструкції, які містять регуляторні елементи та трансгенні клітини рослин, рослини і насіння, які містять регуляторні елементи, функціонально зв'язані з молекулою ДНК, яка транскрибується, гетерологічною відносно регуляторного елемента.
ЇОО6Ї| Таким чином, в одному аспекті у винаході запропонована рекомбінантна молекула
ДНК, яка містить послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з: а) послідовності
ДНК із щонайменше близько 85 відсотками ідентичності послідовності до будь-якої з ФЕО ІЮ
Мо: 1-37; б) послідовності ДНК, яка містить будь-яку з ФЕО ІЮ Мо: 1-37; і в) фрагмента будь-якої з ЗЕО ІО Мо: 1-37, причому цей фрагмент має ген-регуляторну активність; при цьому послідовність ДНК функціонально зв'язана з гетерологічною молекулою ДНК, яка транскрибується. Під «гетерологічною молекулою ДНК, яка транскрибується» мають на увазі молекулу ДНК, яка транскрибується, яка є гетерологічною відносно послідовності ДНК з якою вона функціонально зв'язана. У конкретних варіантах реалізації винаходу рекомбінантна молекула ДНК містить послідовність ДНК, що має щонайменше 90 відсотків, щонайменше 91 відсотка, щонайменше 92 відсотків, щонайменше 93 відсотків, щонайменше 94 відсотків, щонайменше 95 відсотків, щонайменше 9б відсотків, щонайменше 97 відсотків, щонайменше 098 відсотків або щонайменше 99 відсотків ідентичності послідовності до послідовності будь-якої ДНК з 5ЕО ІЮО Ме: 1-37. У конкретних варіантах реалізації винаходу гетерологічна молекула ДНК, яка транскрибується, містить ген, який представляє агрономічний інтерес, наприклад, ген, здатний надавати рослинам стійкість до гербіцидів або шкідників. У ще інших варіантах реалізації винаходу у винаході запропонована генетична конструкція, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, як запропоновано в цьому документі.
Ї007| В іншому аспекті в цьому документі пропонуються трансгенні клітини рослин, які містять рекомбінантну молекулу ДНК, яка включає послідовність ДНК, обрану із групи, що складається 3: а) послідовності ДНК із щонайменше близько 85 відсотками ідентичності
БО послідовності до будь-якої з 5ЕС ІО Мо: 1-37; б) послідовності ДНК, яка містить будь-яку з
ЗЕО ІЮ Мо: 1-37; і в) фрагмента будь-якої з БЕО ІО Мо: 1-37, причому цей фрагмент має ген- регуляторну активність; при цьому послідовність ДНК функціонально зв'язана з гетерологічною молекулою ДНК, яка транскрибується. У деяких варіантах реалізації винаходу трансгенна клітина рослини являє собою клітину однодольної рослини. В інших варіантах реалізації винаходу трансгенна клітина рослини являє собою клітину дводольної рослини. 008) У ще іншому аспекті в цьому документі нижче наведено трансгенну рослину або її частину, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка містить послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з: а) послідовності ДНК із щонайменше 85 відсотками ідентичності послідовності до будь-якої з 5ЕО ІЮО Мо 1-37; б) послідовності ДНК, яка містить будь-яку з бо ЗЕО ІО Ме: 1-37; і в) фрагмента будь-якої з ФЕО ІО Мо: 1-37, причому цей фрагмент має ген-
регуляторну активність; при цьому послідовність ДНК функціонально зв'язана з гетерологічною молекулою ДНК, яка транскрибується. Уконкретних варіантах реалізації винаходу трансгенна рослина являє собою рослину- нащадок будь-якого покоління відносно вихідної трансгенної рослини та містить молекулу рекомбінантної ДНК. Трансгенна насінина, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка породжує таку трансгенну рослину при вирощуванні, також пропонується у цьому винаході.
Ї0О09| В іншому аспекті у винаході запропонований спосіб отримання товарного продукту, який включає отримання трансгенної рослини або її частини, що містять, рекомбінантну молекулу ДНК відповідно до цього винаходу, і отримання товарного продукту з них. В одному аспекті реалізації винаходу товарний продукт являє собою оброблене насіння, зерна, частини рослин і борошно грубого помелу.
ЇО0О10| У ще одному аспекті винаходу також запропоновано спосіб отримання трансгенної рослини, що містить, рекомбінантну молекулу ДНК згідно з цим винаходом, що включає трансформацію рослинної клітини рекомбінантною молекулою ДНК згідно цього винаходу, щоб отримати трансформовану рослинну клітину та регенерування трансгенної рослини з трансформованої рослинної клітини.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
0011) Фіг. 1. Демонструє конфігурацію експресійної касети відповідно до цього винаходу.
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
І0012| 5ЕО ІО Ме: 1-30, 38-41, 49 і 56 являють собою послідовності 3'-нетрансльованої області (3' НТО).
Ї0013| 5ЕО ІО Мо: 31, 35, 42, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54 і 55 являють собою послідовності груп регуляторних експресійних елементів (ЕХР), які містять промоторну послідовність, функціонально зв'язану 5' кінцем з лідерною послідовністю, яка функціонально зв'язана 5' кінцем з послідовністю інтрону, або промоторну послідовність, функціонально зв'язану 5' кінцем з лідерною послідовністю. 00141) 5ЕО ІО Мо: 32, 36 і 43 являють собою промоторні послідовності. (0015) 5ЕО ІО Ме: 33 ї 37 являють собою лідерні послідовності. 0016) 5ЕО ІО Ме: 34 являє собою послідовність інтрону.
Ко) Ї0017| 5ЕО ІО Ме: 44 являє собою послідовність, яка кодує ВД-глюкуронідазу (Б05), яка вирізає інтрон, що вирізається. 0018) 5ЕО ІО Ме: 45 і 46 являють собою послідовності, які кодують люциферазу.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
ІЇ0019| Цей винахід відноситься до молекул ДНК, які мають ген-регуляторну активність у рослинах. Нуклеотидні послідовності цих молекул ДНК наводяться в 5ЕБО ІЮО Ме: 1-37. Ці молекули ДНК, здатні впливати на експресію функціонально зв'язаної молекули ДНК, яка транскрибується, у тканинах рослин і, отже, регулювати експресію функціонально зв'язаного трансгена в трансгенних рослинах. Цей винахід також відноситься до способів їх модифікації, створення і застосування. Цей винахід також відноситься до композицій, які включають трансгенні клітини рослин, рослини, частини рослин і насіння, що містять рекомбінантні молекули ДНК відповідно до цього винаходу, та до способів їхнього отримання і застосування.
І0020О| Наступні визначення та способи пропонуються з метою кращого окреслення винаходу і спрямування до фахівців у цій галузі техніки при застосуванні цього винаходу. Якщо не вказано інше, терміни слід розуміти відповідно до загальноприйнятого використання фахівцями в цій галузі техніки.
Молекули ДНК
І00211| Використаний у цьому документі термін «ДНК» або «молекула ДНК» відноситься до дволанцюгової молекули ДНК клітинного або синтетичного походження, тобто до полімеру дезоксирибонуклеотидних основ. Використаний у цьому документі термін «ДНК послідовність» застосовується до нуклеотидної послідовності молекули ДНК. Номенклатура, використана в цьому документі, відповідає такій за документом 37 «Зведення федеральних нормативних актів Сполучених Штатів» 5 1.822 і викладена у таблицях МІРО стандарту 51.25 (1998), додаток 2, таблиці 1 та 3.
І0022| Як використовується в цьому документі, «рекомбінантна молекула ДНК» являє собою молекулу ДНК, яка містить комбінацію молекул ДНК, які б не об'єдналися природним шляхом без втручання людини. Наприклад, рекомбінантна молекула ДНК може бути молекулою ДНК, яка складається щонайменше з двох гетерологічних по відношенню одна до одної молекул ДНК; молекулою ДНК, що містить послідовність ДНК, яка відхиляється від існуючих у природі послідовностей ДНК; або молекулою ДНК, яка була вбудована у ДНК бо клітини-хазяїна шляхом генетичної трансформації.
ІЇ0023| Як використовується в цьому документі, термін «ідентичність послідовностей» відноситься до ступеня, в якому дві оптимально вирівняні послідовності ДНК є ідентичними. Оптимальне вирівнювання послідовностей створюється шляхом вирівнювання двох послідовностей ДНК вручну, наприклад, референсної послідовності та іншої послідовності ДНК, для створення максимальної кількості відповідностей між нуклеотидами при вирівнюванні послідовностей із відповідними внутрішніми нуклеотидними вставками, делеціями або розривами. Використаний у цьому документі термін «референсна послідовність» відноситься до послідовності ДНК, яка наводиться в 5ЕО ІЮО Ме: 1-37.
І0024| Використаний в цьому документі термін «відсоток ідентичності послідовностей» або «відсоток ідентичності», або «95 ідентичності» являє собою частку ідентичності помножену на 100. «Частка ідентичності» для послідовності ДНК, оптимально вирівняної із початковою послідовністю, являє собою число відповідностей між нуклеотидами при оптимальному вирівнюванні поділене на загальне число нуклеотидів у референсній послідовності, наприклад, на загальне число нуклеотидів всієї повнорозмірної референсної послідовності. Таким чином, в одному варіанті реалізації винахід відноситься до молекули ДНК, яка містить послідовність ДНК, котра при оптимальному вирівнюванні з референсною послідовністю, представленою в цьому документі як 5ЕО І Мо: 1-37, має щонайменше близько 85 відсотків ідентичності, щонайменше близько 86 відсотків ідентичності, щонайменше близько 87 відсотків ідентичності щонайменше близько 88 відсотків ідентичності, щонайменше близько 89 відсотків ідентичності щонайменше близько 90 відсотків ідентичності, щонайменше близько 91 відсотка ідентичності, щонайменше близько 92 відсотків ідентичності, щонайменше близько 93 відсотків ідентичності, щонайменше близько 94 відсотків ідентичності, щонайменше близько 95 відсотків ідентичності, щонайменше близько 96 відсотків ідентичності щонайменше близько 97 відсотків ідентичності, щонайменше близько 98 відсотків ідентичності, щонайменше близько 99 відсотків ідентичності або щонайменше близько 100 відсотків ідентичності з референсною послідовністю.
Регуляторні елементи
І0025| Регуляторні елементи такі як промотори, лідери, енхансери, інтрони та області
Зо термінації транскрипції (або 3' НТО) відіграють суттєву роль у загальній експресії генів у живих клітинах. Термін «регуляторний елемент», який використовується в цьому документі, відноситься до молекул ДНК, які мають ген-регуляторну активність. Термін «ген-регуляторна активність», який використовується в цьому документі, відноситься до здатності впливати на експресію функціонально зв'язаної молекули ДНК, яка транскрибується, наприклад, шляхом впливу на транскрипцію та/або трансляцію функціонально зв'язаної молекули ДНК, яка транскрибується. Регуляторні елементи, такі як промотори, лідери, енхансери та інтрони, З'
НТО, які функціонують у рослинах, є, таким чином, корисними для модифікації фенотипів рослин за допомогою генетичної інженерії. 0026) Використана в цьому документі «група регуляторних елементів експресії» або «ЕХР» послідовність може відноситися до групи функціонально зв'язаних регуляторних елементів, таких як енхансери, промотори, лідери та інтрони. Таким чином, група регуляторних елементів експресії може складатися, наприклад, із промотору, функціонально зв'язаного 5' кінцем з лидерною послідовністю, яка, у свою чергу, функціонально зв'язана 5' кінцем з послідовністю інтрону.
І0027| Регуляторні елементи можуть бути охарактеризовані за своїм характером експресії генів, наприклад, за позитивним і/або негативним впливами, такими як конститутивна, тимчасова, просторова, залежна від стадії розвитку, тканинна, залежна від оточення, фізіологічна, патологічна, клітинного циклу і/або хімічно чутлива експресія, і будь-яка з їхніх комбінацій, а також за кількісними або якісними показниками. Використаний в цьому документі
БО термін «характер експресії гена» являє собою будь-яку особливість транскрипції функціонально зв'язаної молекули ДНК в молекулу РНК, яка транскрибується. Молекула РНК, яка транскрибується, може бути трансльована для отримання молекули білка або може утворити антисмислову або іншу регуляторну молекулу РНК, таку як дволанцюгова РНК (ДДРНК), транспортна РНК (тРНК), рибосомальна РНК (рРНК), мікроРНК (мікроРНК) тощо.
І0028| Використаний в цьому документі термін «експресія білка» являє собою будь-яку особливість трансляції молекули РНК, яка транскрибується, в молекулу білка. Експресія білка може бути охарактеризована за своїми часовими, просторовими, належними до стадії розвитку або морфологічними якостями, а також за кількісними або якісними показниками.
І0029| Промотор є корисним в якості регуляторного елемента для модуляції експресії бо функціонально зв'язаної молекули ДНК, яка транскрибується. Як використовується в цьому документі термін «промотор» відноситься в загальному розумінні до молекули ДНК, яка бере участь у розпізнаванні та зв'язуванні РНК-полімерази ЇЇ та інших білків, таких як транс-діючі фактори транскрипції, для ініціації транскрипції. Промотор може первісно розпізнаний на 5' нетрансльованої області (5 НТО) гена. В альтернативному варіанті промотори можуть бути отримані синтетичним шляхом або в результаті маніпулювання молекулою ДНК. Промотори також можуть бути химерними. Химерні промотори отримують шляхом злиття двох або більше гетерологічних молекул ДНК. Промотори, корисні у практичній реалізації винаходу, включають 5ЕО ІО Мо 32 та 36, включаючи їхні фрагменти або варіанти. У конкретних варіантах реалізації винаходу заявлені молекули ДНК та будь-які їхні варіанти або похідні, описані в цьому документі, далі визначаються як такі, що мають промоторну активність, тобто здатні діяти як промотор у клітині хазяїна, такого як трансгенна рослина. У ще додаткових конкретних варіантах реалізації винаходу фрагмент може бути визначений як такий, що виявляє промоторну активність, яку має вихідна молекула промотору, з якої він був отриманий, або фрагмент може містити «мінімальний промотор», який забезпечує основний рівень транскрипції та включаєТтАТА-бокс або еквівалентну послідовність ДНК для розпізнавання і зв'язування комплексу РНК-полімерази ІІ з метою ініціації транскрипції.
ЇООЗО| В одному варіанті реалізації винаходу фрагменти забезпечені промоторною послідовністю, описаною в цьому документі. Фрагменти промоторів можуть включати промоторну активність, як описано вище, та можуть бути корисними окремо або в комбінації з іншими промоторами і фрагментами промоторів, наприклад, при створенні химерних промоторів або в комбінації з іншими ЕХР і фрагментами ЕХР. У конкретних варіантах реалізації винаходу пропонуються фрагменти промотору, що містять щонайменше близько 50, щонайменше близько 75, щонайменше близько 95, щонайменше близько 100, щонайменше близько 125, щонайменше близько 150, щонайменше близько 175, щонайменше близько 200, щонайменше близько 225, щонайменше близько 250, щонайменше близько 275, щонайменше близько 300, щонайменше близько 500, щонайменше близько 600, щонайменше близько 700, щонайменше близько 750, щонайменше близько 800, щонайменше близько 900, або щонайменше близько 1000 послідовних нуклеотидів або більше, молекули ДНК, яка має промоторну активність, як описано в цьому документі. Способи отримання таких фрагментів
Зо із вихідної молекули промотору добре відомі у цій галузі техніки.
Ї0О0ОЗ311| Композиції, отримані з будь-яких промоторів, представлених у 5ЕО ІЮ Мо: 32 та
Зб, такі як внутрішні або 5' делеції, наприклад, можуть бути отримані з використанням добре відомих у цій галузі техніки способів поліпшення або зміни експресії, включаючи видалення елементів, які мають позитивні чи негативні впливи на експресію; подвоєння елементів, які мають позитивні чи негативні впливи на експресію; та/або подвоєння або видалення елементів, які мають тканино- або клітино-специфічні впливи на експресію.
Композиції, отримані з будь-яких промоторів, представлених у 5ЕО ІО Мо: 32 та З6, які містять З3' делеції, в яких елемент ТАТА-боксу або його еквівалентна послідовність ДНК та послідовність, яка знаходиться нижче, видалені, можуть бути використані, наприклад, для створення енхансерних елементів. Додаткові делеції можуть бути внесені для видалення будь-яких елементів, які мають позитивні чи негативні, тканино-специфічні, клітино- специфічні або часо-специфічні (такі як, проте не обмежуючись цими, добові ритми) впливи на експресію. Будь-який із промоторів, представлений у 5ЕБЕО ІО Мо: 32 та Зб, і фрагменти або енхансери, отримані з них, можуть бути використані для отримання композицій химерних регуляторних елементів.
ІЇ00ОЗ2| Відповідно до цього винаходу, промотор або фрагмент промотору можуть бути проаналізовані на наявність відомих промоторних елементів, тобто характеристик послідовності ДНК, таких як ТАТА-бокс та інших відомих мотивів сайтів зв'язування транскрипційних факторів. Ідентифікація таких відомих промоторних елементів може бути використана фахівцем у цій галузі техніки для розробки варіантів промотору, які мають схожий характер експресії, як і вихідний промотор. 0033) Використаний у цьому документі термін «лідер» відноситься до молекули ДНК, що розпізнається з 5 нетрансльованої області (5 НТО) гена і визначається в загальному розумінні як сегмент ДНК між сайтом ініціації транскрипції (СІТ) ії початковим сайтом послідовності, яка кодує білок. В альтернативному варіанті лідери можуть бути отримані синтетичним шляхом або в результаті маніпулювання елементам ДНК. Лідер може бути використаний як 5 регуляторний елемент для модуляції експресії функціонально зв'язаної молекули ДНК, яка транскрибується. Молекули лідерів можуть бути використані з гетерологічним промотором або з їхнім нативним промотором. Лідери, корисні у практичній 60 реалізації винаходу, включають 5ЕО ІЮО Ме: 33 та 37, або їхні фрагменти, або варіанти. У конкретних варіантах реалізації винаходу такі послідовності ДНК можуть бути визначені як здатні діяти як лідер в клітині-хазяїні, включаючи, наприклад, трансгенну клітину рослини.
В одному варіанті реалізації винаходу такі послідовності ДНК можуть бути розшифровані як такі, що включають лідерну активність. 00341 Лідерні послідовності, представлені в 5ЕО ІО Мо: 33 та 37, можуть складатися з регуляторних елементів або можуть приймати вторинні структури, які впливають на транскрипцію або трансляцію функціонально зв'язаної молекули ДНК, що транскрибується.
Лідерні послідовності, представлені в 5ЕО ІО Мо: Мо: 33 та 37, можуть бути використані, відповідно до винаходу, для створення химерних регуляторних елементів які впливають на транскрипцію або трансляцію функціонально зв'язаної молекули ДНК. 0035) Використаний у цьому документі термін «інтрон» відноситься до молекули ДНК, яка може бути виділена або ідентифікована з геномної копії гена і може бути визначена в загальному розумінні як область, яка вирізається під час процесингу інформаційної РНК (МРНК) до трансляції. В альтернативному варіанті інтрон може бути отриманий синтетичним шляхом або в результаті маніпулювання елементом ДНК. Інтрон може містити енхансерні елементи, які впливають на транскрипцію функціонально зв'язаних генів. Інтрон може бути використаний як регуляторний елемент для модуляції експресії функціонально зв'язаної молекули ДНК, яка транскрибується. Генетична конструкція може містити інтрон, та інтрон може бути чи не бути гетерологічним відносно молекули ДНК, яка транскрибується.
Приклади інтронів у цій галузі техніки включають інтрон актину рису та інтрон НОР7О кукурудзи.
Ї0ООЗ6)| У порівнянні з генетичними конструкціями без інтрону, включення деяких інтронів у генетичні конструкції призводить до збільшення накопичення мРНК і білка в рослинах. Цей ефект був названий як «інтрон-опосередковане підсилення» (ІМЕ) експресії генів. Інтрони, які стимулюють експресію в рослинах, були ідентифіковані в генах кукурудзи (наприклад,
ТАТ, Аант, НІ та Біт), в генах рису (наприклад, ірі) та в генах дводольних рослин, таких як петунія (наприклад, греб5), картопля (наприклад, 51-І51) і Агабідорзіз ІНнаійапа (наприклад, иразЗ і рай). Було показано, що делеції або мутації у межах сайтів сплайсингу інтрону знижують експресію генів, вказуючи на те, що сплайсинг може бути необхідний для ІМЕ. Однак ІМЕ було показано для дводольних рослин, за допомогою точкових мутацій в межах сайтів
Зо сплайсингу рай гена з А. Шаїїапа. Було показано, що багаторазове використання одного і того самого інтрону в одній рослині, за деяких обставин, виявляє недоліки. У таких випадках необхідно мати колекцію основних елементів контролю для створення відповідних рекомбінантних елементів ДНК.
Ї0ОЗ37| Інтрони, корисні в застосуванні винаходу на практиці включають 5ЕО ІЮО Мо: 34.
Композиції, отримані з інтрона представленого як послідовність 5ЕО ІО Мо: 34 можуть складатися з внутрішньоклональних делецій або дуплікацій цис-регуляторних елементів; та/або змін 5'и 3'-послідовності ДНК, що містить інтрон/екзон кодон сплайсингу, можуть бути використані для поліпшення експресії або специфічності експресії, при функціональному звязку з промотором 4 лідером або химерним промотором -- лідером і послідовністю, що кодує.
Модифікація інтрон/«екзон граничної послідовності може бути вигідна, щоб уникнути використання нуклеотидної послідовності АТ або нуклеотиду А безпосередньо перед 5- кінцем сайту сплайсингу (СТ) і нуклеотиду Сі або нуклеотидної послідовності ТО, відповідно, відразу за 3' кінцем сайту сплайсингу (АС), щоб усунути потенційні небажані стартові кодони, які формуються у ході процесингу РНК в кінцевий транскрипт. Послідовність ДНК навколо 5 '3' кінця сайту кодону сплайсингу інтрона може бути модифікована таким чином. Інтрони і варіанти інтрона змінені, згідно з цим винаходу, і за допомогою методів, відомих в цій області техніки можуть бути перевірені емпірично, як описано в робочих прикладах, щоб визначити вплив інтрона на експресію функціонально пов'язаної молекули ДНК. Зміни 5' з' ділянок, що містять інтрон/«екзон кодон сплайсингу також може бути проведено, щоб зменшити ймовірність отримання помилкових старт - і стоп-кодонов у кінцевих транскриптах після процесингу і сплайсингу РНК. Інтрони можуть бути перевірені емпірично, як описано в робочих прикладах, щоб визначити вплив інтрона на експресію трансгена.
І00З38| Використані в цьому документі терміни «3 молекула термінації транскрипції», «3' нетрансльована область» або «3 НТО» відноситься до молекули ДНК, яка використовується під час транскрипції із нетрансльованої області 3 частини молекули мРНК. 3' нетрансльована область молекули мРНК може бути отримана шляхом специфічного розщеплення і 3 поліаденилюванням, також відомим як полі(А)-хвіст. З НТО може бути функціонально зв'язана з молекулою ДНК, яка транскрибується, і розташовуватися нижче від неї, і може включати сигнал поліаденилювання та інші регуляторні сигнали, здатні впливати бо на транскрипцію, процесинг мРНК або експресію генів. Вважають, що полі(А)-хвости виконують функції стабілізації мРНК та ініціації трансляції. Приклади 3 молекул термінації транскрипції у цій галузі техніки являють собою 3 область нопалінсинтази, 3 область
Нп5р17 пшениці, 3 область малої субодиниці РиВізСО гороху, 3' область Еб бавовни і 3 НТО бусенника..
Ї0ООЗ39| 3 НТО, як правило, знаходять корисне застосування для рекомбінантної експресії специфічних молекул ДНК. Слабка 3 НТО може генерувати наскрізне зчитування, що може вплинути на експресію молекули ДНК, розташованої у сусідніх експресійних касетах.
Відповідний контроль для термінації транскрипції може запобігти наскрізному зчитуванню в послідовностях ДНК (наприклад, інших експресійних касет), локалізованих нижче, і може додатково забезпечити ефективне повторне використання РНК-полімерази, для поліпшення експресії генів. Ефективна термінація транскрипції (звільнення РНК- полімерази ІІ із ДНК) є передумовою для наступної ініціації транскрипції і, таким чином, безпосередньо впливає на загальний рівень транскрипту. Після термінації транскрипції зріла мРНК звільняється з місця синтезу, і матриця транспортується в цитоплазму. Еукаріотичні мРНК накопичуються в формах полі(А) іп мімо, що ускладнює виявлення сайтів термінації транскрипції загальноприйнятими способами. Однак передбачення функціональних та ефективних 3'
НТО за допомогою біоінформатичних способів може бути ускладнене, оскільки існує мало консервативних послідовностей ДНК, які дозволяють легко передбачати ефективну 3' НТО.
ЇО040| Із практичної точки зору, як правило, корисно, щоб 3 НТО, використана в експресійній касеті мала наступні характеристики. 3 НТО повинна бути здатною раціонально та ефективно завершувати транскрипцію трансгена та запобігати наскрізному зчитуванню транскрипту в будь-якій із сусідніх послідовностей ДНК, яка може міститися в іншій експресійній касеті, як і у випадку декількох експресійних касет, які належать одній трансферній ДНК (Т-ДНК), або сусідній хромосомній ДНК, в яку Т-ДНК була вбудована. У біотехнології рослин 3 НТО часто використовується для затравки реакцій ампліфікації РНК, яка зворотно транскрибується, виділеної із трансформованих рослин, та використовується для: 1) оцінки транскрипційної активності або експресії експресійної касети, інтегрованої у хромосому рослини; 2) оцінки кількості копій вставок у ДНК рослини; та 3) оцінки зиготности отриманої насінини після розмноження. З НТтТО також використовується в реакціях
Зо ампліфікації ДНК, екстрагованої із трансформованих рослин, для визначення інтактності вбудованої касети.
Ї0041| Використаний у цьому документі термін «енхансер» або «енхансерний елемент» відноситься до цис-діючого регуляторного елемента, названого цис-елементом, який надає аспект загального характеру експресії, але, як правило, недостатній сам по собі для контролювання транскрипції функціонально зв'язаної молекули ДНК, що транскрибується. На відміну від промоторів, енхансерні елементи зазвичай не включають сайт ініціації транскрипції (СІТ) або ТАТА-бокс, або еквіваленту послідовність ДНК. Промотор або фрагмент промотору за природою може містити один або більше енхансерних елементів, які впливають на транскрипцію функціонально зв'язаної молекули ДНК, що транскрибується. Енхансерний елемент також може бути об'єднаний із промотором для отримання химерного промоторного цис-елемента, що додає аспект загальної модуляції експресії генів.
І0042| Вважають, що численні енхансерні елементи промотору зв'язують ДНК- зв'язуючі білки талабо впливають на топологію ДНК, створюючи локальні конформації, які вибірково дозволяють або обмежують доступ РНК-полімерази до ДНК-матриці або які полегшують вибіркове відкривання подвійної спіралі на ділянці ініціації транскрипції. Енхансерний елемент також може виконувати функцію зв'язування транскрипційних факторів, які регулюють транскрипцію. Деякі енхансерні елементи зв'язують більш ніж один фактор транскрипції, і транскрипційні фактори можуть взаємодіяти із різною афінністю із більш ніж одним доменом енхансеру. Енхансерні елементи можуть бути ідентифіковані за допомогою ряду методів, включаючи аналіз делецій, тобто видалення одного або більше нуклеотидів із
Б кінця або всередині промотору; аналіз ДНК- зв'язуючого білка, з використанням футпринтінгу ДНКази І!, інтерференцію метилювання, аналізи зсуву електрофоретичної мобільності, іп мімо геномний футпринтінг шляхом лігування-опосередкованої полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та інших загальноприйнятих аналізів; або шляхом аналізу подібності послідовностей ДНК, використовуючи відомі мотиви цис-елементів або енхансерних елементів, як цільову послідовність або цільовий мотив, із загальноприйнятими способами порівняння послідовностей ДНК, таких як ВГАБТ. Тонка структура домену енхансеру може бути додатково досліджена шляхом мутагенезу (або заміщення) одного або більше нуклеотидів або іншими загальноприйнятими способами, відомими у цій галузі техніки. бо Енхансерні елементи можуть бути отримані шляхом хімічного синтезу або шляхом виділення із регуляторних елементів, які включають такі елементи, і вони можуть бути синтезовані з додатковими фланкуючими нуклеотидами, які включають корисні сайти рестрикції для полегшення подальших маніпуляцій. Таким чином, розробка, створення і використання енхансерних елементів, у відповідності до способів, описаних у цьому документі, для модуляції експресії функціонально зв'язаних молекул ДНК, які транскрибуються, охоплюються за цим винаходом. 0043) Використаний цьому документі термін «химерний» відноситься до окремої молекули
ДНК, отриманої шляхом злиття першої молекули ДНК із другою молекулою ДНК, де ані перша, ані друга молекула ДНК зазвичай не будуть міститися у такій конфігурації, тобто не будуть об'єднані одна із одною. Химерна молекула ДНК, таким чином, являє собою нову молекулу ДНК, інакше кажучи, таку, яка не зустрічається зазвичай у природі. Використаний у цьому документі термін «химерний промотор» відноситься до промотору, який отримано за допомогою такого маніпулювання молекулами ДНК. Химерний промотор може об'єднувати два або більше фрагментів ДНК, наприклад, злиття промотору із енхансерним елементом. Таким чином, розробка, створення і використання химерних промоторів, у відповідності до способів, описаних у цьому документі, для модуляції експресії функціонально зв'язаних молекул ДНК, які транскрибуються, охоплюються відповідно до цього винаходу.
І0044| Використаний у цьому документі термін «варіант» відноситься до другої молекули
ДНК, такої як регуляторний елемент, яка аналогічна за композицією, але не ідентична першій молекулі ДНК, і причому друга молекула ДНК все ще зберігає загальну функціональність, тобто такий самий або аналогічний характер експресії, наприклад, через більшу або меншу, або еквівалентну транскрипційну або трансляційну активність у порівнянні із першою молекулою ДНК. Варіант може бути укороченою або усіченою версією першої молекули ДНК та/або зміненою версією послідовності першої молекули ДНК, такої як варіант із різними сайтами рестрикції та/(або внутрішніми делеціями, замінами та/або вставками. "Варіант" може також включати регулюючий елемент, що має нуклеотидну послідовність, що включає заміни, делеції і/або вставки одного або кількох нуклеотидів еталонної послідовності, при якому похідний регулюючий елемент має більше або менше або еквівалент транскрипційної або трансляційної активністі, чим відповідні нативні регуляторні молекули.
Зо «Варіанти» регуляторного елемента також охоплюють варіанти, які виникають у результаті мутацій, котрі відбуваються під час або в результаті трансформації клітин бактерій та рослин. У цьому винаході послідовність ДНК, наведена в 5ЕО ІЮО Ме: 1-37, може бути використана для створення варіантів, які аналогічні за композицією, але не ідентичні послідовності ДНК вихідного регуляторного елемента, хоча все ще зберігають загальну функціональність, тобто такий самий або аналогічний характер експресії, як і вихідний регуляторний елемент.
Отримання таких варіантів відповідно до цього винаходу знаходиться в межах звичайної кваліфікації у цій галузі техніки у висвітленому описі та здійснено в межах обсягу цього винаходу.
Ї0045| Химерні регуляторні елементи можуть бути розроблені для включення різних складових елементів, які можуть бути функціонально зв'язані різними способами, відомими в цій галузі техніки, такими як розщеплення ферментами рестрикції та лігування, клонування незалежне від лігувания, модульне збирання продуктів ПЛР у процесі ампліфікації або прямий хімічний синтез регуляторного елемента, а такожіншими способами, відомими в цій галузі техніки. Отримані різні химерні регуляторні елементи можуть складатися із тих самих або варіантів тих самих складових елементів, але відрізнятися за послідовністю ДНК, або послідовностей ДНК, які включають зв'язуючу послідовність ДНК, або послідовностей, які дозволяють складовим частинам бути функціонально зв'язаними. У винаході послідовність ДНК, що наводиться в 5ЕО ІО Ме: 1- 30 або 31-37, може забезпечити референсну послідовність регуляторного елемента, в якій складові елементи, які включають референсну послідовність, можуть бути з'єднані способами, відомими в цій галузі техніки, та можуть включати заміни, делеції та/або вставки одного або більше нуклеотидів або мутацій, які зазвичай зустрічаються при трансформації клітин бактерій та рослин. 0046) Дієвість модифікацій, дублікацій або делецій, описаних у цьому документі, на бажані аспекти експресії конкретної молекули ДНК, що транскрибується може бути перевірена емпірично у стабільних і транзієнтних тестах рослин, таких як ті, що описані в робочих прикладах у цьому документі, для підтвердження результатів, які можуть варіювати залежно від проведених змін і мети зміни вихідної молекули ДНК.
Генетичні конструкти
Ї0047| Використаний у цьому документі термін «генетична конструкція» означає будь-яку бо рекомбінантну молекулу ДНК, таку як плазміда, косміда, вірус, фаг або лінійну або кільцеву молекулу ДНК або РНК, отриману із будь-якого джерела, здатну до геномної інтеграції або автономної реплікації яка включає молекулу ДНК, де щонайменше одна молекула ДНК зв'язана з іншою молекулою ДНК функціонально діючим способом, тобто функціонально зв'язані між собою. Використаний у цьому документі термін «вектор» означає будь-яку генетичну конструкцію, яка може бути використана з метою трансформації, тобто введення гетерологічної ДНК або РНК у клітину хазяїна. Генетична конструкція, як правило, включає одну або більше експресійних касет. Як використано в цьому документі «експресійна касета» відноситься до молекули ДНК, що містить щонайменше молекулу ДНК, яка транскрибується, функціонально зв'язану із одним або більше регуляторних елементів, як правило, щонайменше із промотором і 3' НТО.. 0048) Використаний у цьому документі термін «функціонально зв'язаний» відноситься до першої молекули ДНК, з'єднаної з другою молекулою ДНК, причому перша і друга молекули
ДНК розташовані так що перша молекула ДНК впливає на функцію другої молекули ДНК.
Дві молекули ДНК можуть бути або не бути частиною єдиної неперервної молекули ДНК і можуть бути чи не бути суміжними. Наприклад, промотор є функціонально зв'язаним із молекулою ДНК, яка транскрибується, якщо промотор здатний впливати на транскрипцію або трансляцію молекули ДНК, яка транскрибується.
Ї0049| Генетичні конструкції відповідно до цього винаходу можуть бути запропоновані в одному варіанті реалізації винаходу як генетичні конструкції, які складаються із двох граничних областей пухлиноіндукуючої плазміди (Ті), що мають області правої граничної ділянки (АВ або АСНВШ.АВ) і лівої граничної ділянки (ІВ або АСВШ.ІВ) Ті -плазміди, ізольованої з Адгобрасієгйт ІШтеїасієпо, яка містить Т-ДНК, яка разом із перенесенням молекул, що забезпечується клітинами А. іштеїасіеп5, дозволяє інтеграцію Т-ДНК у геном клітини рослини (див., наприклад, патент США 6603061). Генетичні конструкції також можуть містити сегменти плазмідного каркасу ДНК, які забезпечують функцію реплікації та селекції на антибіотику в клітинах бактерій, наприклад, реплікації ЕвсНегісніа соїї, такий як огіЗз22, реплікації для широкого спектру хазяїв, такий як огімМ або огіві, і кодуючу область селективного маркера, такого як брес/5ігр, який кодує Тп7 аміноглікозид аденілтрансферазу (аадА), що надає стійкість до спектиноміцину або стрептоміцину, або селективний маркерний
Зо ген гентаміцину (Сип, Сепі). Для трансформації рослин часто використовують бактеріальний штам хазяїна АВІ, С58 або І ВА4404 А. Шштеїасієп5, проте інші штами, відомі фахівцям у галузі трансформації рослин, можуть функціонувати у цьому винаході.
ЇООБ5ОЇ У цій галузі техніки відомі способи для збірки та введення генетичних конструкцій у клітину у такий спосіб, що молекула ДНК, яка транскрибується, транскрибується у функціональну молекулу мРНК, яка транслюється та експресується у вигляді білка. Для здійснення винаходу на практиці загальноприйняті композиції та способи отримання і використання генетичних конструкцій та клітин хазяїна добре відомі фахівцям у цій галузі техніки. Наприклад, типові вектори, використані для експресії нуклеїнових кислот у вищих рослинах, добре відомі у цій галузі техніки та включають вектори, отримані з Ті- плазміди
Адгорасієйит Шштптегасієпо та рбамусм контрольного вектора для перенесення.
Ї0051| Різні регуляторні елементи можуть бути включені в генетичну конструкцію, включаючи будь-який з тих, що запропонований у цьому документі. Будь-які такі регуляторні елементи можуть бути запропоновані в поєднанні з іншими регуляторними елементами. Такі комбінації можуть бути розроблені або модифіковані для отримання бажаних регуляторних функцій. В одному варіанті реалізації винаходу генетичні конструкції відповідно до цього винаходу містять щонайменше один регуляторний елемент, функціонально зв'язаний із молекулою ДНК, яка транскрибується, яка функціонально зв'язана з 3' НТО. 0052 Генетичні конструкції відповідно до цього винаходу можуть включати будь-який промотор або лідер, запропоновані в цьому документі або відомі у цій галузі техніки.
Наприклад, промотор за винаходом може бути функціонально зв'язаний із гетерологічним нетрансльованим 5' лідером, таким як один з отриманих із гена білка теплового шоку. В альтернативному варіанті лідер за винаходом може бути функціонально зв'язаним із гетерологічним промотором, таким як 355 промоторний транскрипт вірусу мозаїки цвітної капусти (Саційомег Мозаїс Мігив)..
І0053| Експресійні касети також можуть включати кодуючу послідовність транзитного пептиду, яка кодує пептид, корисний для внутрішньоклітинного спрямування функціонально зв'язаного білка, зокрема, до хлоропласту, лейкопласту або іншої пластидної органели, мітохондрії, пероксисоми, вакуолі або позаклітинного простору. Багато білків, локалізованих у хлоропластах, експресуються генами ядра як попередники і спрямовуються до хлоропласту за бо допомогою транзитного пептиду хлоропласту (ТПХ). Приклади таких білків, ізольованих із хлоропластів, включають, але не обмежуються цими, білки, асоційовані з малою субодиницею (МСО) рибулозо-1,5,-біросфат карбоксилази, фередоксин, фередоксин оксидоредуктазу, білок І і білок Ії фотосенсибілізуючого комплексу, тіоредоксин Е і енолпірувіл шикимат фосфатсинтазу (ЕПШФС). Транзитні пептиди хлоропластів описані, наприклад, в патенті
США Мо 7193133. Було показано, що нехлоропластні білки можуть бути спрямовані до хлоропласту при експресії гетерологічного ТПХ, функціонально зв'язаного з молекулою ДНК, яка транскрибується, що кодує нехлоропластні білки.
Молекула ДНК, яка транскрибується
Ї0054| Використаний у цьому документі термін «молекула ДНК, яка транскрибується» відноситься до будь-якої молекули ДНК, здатної транскрибуватися в молекулу РНК, включаючи, але не обмежуючись цим, ті, що мають послідовності, які кодують білок, і ті, що утворюють молекули РНК, які мають послідовності, корисні для супресії гена. Тип молекули
ДНК може включати, але не обмежується цими, молекулу ДНК із тієї самої рослини, молекулу ДНК з іншої рослини, молекулу ДНК з іншого організму або синтетичну молекулу
ДНК, таку як молекула ДНК, що містить антисмислову послідовність гена, або молекулу
ДНК, що кодує штучну, синтетичну або іншим чином модифіковану версію трансгена.
Типова молекула ДНК, яка транскрибується, для включення в генетичні конструкції за винаходом включає, наприклад, молекули ДНК або гени з іншого виду, ніж той, в який молекула ДНК вбудована, або гени, які походять з або присутні в тому самому виді, але які включені в клітини-реципієнти способами генетичної інженерії, а не класичними методами розмноження.
Ї0055| «Трансген» відноситься до молекули ДНК, яка транскрибується, гетерологічною для клітини-хазяїна щонайменше щодо її розташування в геномі клітини-хазяїна та/або молекули ДНК, яка транскрибується, яка штучно включена в геном клітини-хазяїна у цьому або у будь-якому із попередніх поколінь клітин.
Ї0056| Регуляторний елемент, такий як промотор відповідно до цього винаходу, може бути функціонально зв'язаним із молекулою ДНК, яка транскрибується, яка гетерологічна відносно регуляторного елемента. Використаний у цьому документі термін «гетерологічний» відноситься до комбінації із двох або більше молекул ДНК, якщо така комбінація зазвичай не
Зо зустрічається у природі. Наприклад, дві молекули ДНК можуть бути отримані з різних видів і або дві молекули ДНК можуть бути отримані з різних генів, наприклад, різних генів одного і того самого виду, або ж одних і тих самих генів із різних видів. Регуляторний елемент є, таким чином, гетерологічним відносно функціонально зв'язаної молекули ДНК, яка транскрибується, якщо така комбінація зазвичай не зустрічається у природі, тобто молекула ДНК, яка транскрибується, зазвичай не буває функціонально зв'язаною із регуляторним елементом.
Ї0057| Молекула ДНК, яка транскрибується, у загальному розумінні може бути будь- якою молекулою ДНК, для якої бажана експресія транскрипту. Така експресія транскрипту може призводити до трансляції отриманої молекули мРНК і, відповідно, до експресії білка. В альтернативному варіанті, наприклад, молекула ДНК, яка транскрибується, може бути розроблена так, щоб у підсумку викликати зменшення експресії конкретного гена або білка. В одному варіанті реалізації цього винаходу це може бути досягнуто за допомогою молекули
ДНК, яка транскрибується, орієнтованої в антисмисловому напрямку. Фахівець у цій галузі техніки добре обізнаний із використанням такої антисмислової технології. Будь-який ген може негативно регулюватися у такий спосіб, і в одному варіанті реалізації винаходу молекула
ДНК, яка транскрибується, може бути розроблена для супресії конкретного гена шляхом експресії ддРНК, міРНК або мікроРНК молекули.
ЇОО58| Таким чином, в одному варіанті реалізації цього винаходу представляється рекомбінантна молекула ДНК, яка містить регуляторний елемент за винаходом, такий як ті, що запропоновані в 5ЕО ІЮО Ме: 1-37, функціонально зв'язаний з гетерологічною молекулою
ДНК, яка транскрибується, для модулювання транскрипції молекули ДНК, яка транскрибується, на бажаному рівні або за бажаним характером, коли генетична конструкція інтегрована в геном клітини трансгенної рослини. В одному варіанті реалізації цього винаходу молекула
ДНК, яка транскрибується, містить область гена, яка кодує білок, а в іншому варіанті реалізації цього винаходу молекула ДНК, яка транскрибується, містить антисмислову ділянку гена.
Гени, які представляють агрономічний інтерес
ЇОО59| Молекула ДНК, яка транскрибується, може бути геном, який представляє агрономічний інтерес. Використаний у цьому документі термін «ген, який представляє агрономічний інтерес» відноситься до молекули ДНК, яка транскрибується, котра при бо експресії у конкретній тканини рослин, клітині або типі клітини надає бажану характеристику.
Продукт гена, який представляє агрономічний інтерес, може діяти всередині рослини для того, щоб впливати на морфологію рослини, фізіологію, ріст, розвиток, врожайність, композицію зерна, поживний профіль, стійкість до хвороб або шкідників та/або толерантність до факторів навколишнього середовища або хімічних факторів, або може діяти в якості пестицидного агента в раціоні шкідника, який харчується рослиною. В одному варіанті реалізації цього винаходу регуляторний елемент за винаходом включений у генетичну конструкцію таким чином, що регуляторний елемент функціонально зв'язаний з молекулою
ДНК, яка транскрибується, котра є геном, який представляє агрономічний інтерес. У трансгенній рослині, яка містить таку генетичну конструкцію, експресія гена, який представляє агрономічний інтерес, може надати корисну агрономічну рису. Корисна агрономічна риса може включати, але не обмежується цими, наприклад, толерантність до гербіцидів, боротьбу з комахами, модифікування врожайності, стійкість до хвороб, стійкість до патогена, модифікування росту і розвитку рослини, модифікований вміст крохмалю, модифікований вміст олії, модифікований вміст жирних кислот, модифікований вміст білка, модифіковане дозрівання плодів, покращене харчування тварин і людини, виробництво біополімерів, стійкість до стресових факторів навколишнього середовища, фармацевтичні пептиди, поліпшені властивості для переробки, поліпшення смаку, корисне виробництво гібридного насіння, покращене виробництво волокна і бажане виробництво біопалива. 0060) Приклади генів, які представляють агрономічний інтерес, відомих у цій галузі техніки, включають стійкість до гербіцидів (патенти США Мо 6803501, 6448476, 6248876, 6225114, 6107549, 5866775, 5804425, 5633435 та 5463175), підвищення врожайності (патенти США Мо
ИБАЕЗ8446, 6716474, 6663906, 6476295, 6441277, 6423828, 6399330, 6372211, 6235971, 6222098 та 5716837), боротьба з комахами (патенти США Мо 6809078, 6713063, 6686452, 6657046, 6645497, 6642030, 6639054, 6620988, 6593293, 6555655, 6538109, 6537756, 6521442, 6501009, 6468523, 6326351, 6313378, 6284949, 6281016, 6248536, 6242241, 6221649, 6177615, 6156573, 6153814, 6110464, 6093695, 6063756, 6063597, 6023013, 5959091, 5942664, 5942658, 5880275, 5763245 та 5763241), стійкість до грибкових захворювань (патенти США Мо 6653280, 6573361, 6506962, 6316407, 6215048, 5516671, 5773696, 6121436, 6316407 та 6506962), стійкість до вірусів (патенти США Мо 6617496, 6608241, 6015940, 6013864, 5850023 та
Ко) 5304730), стійкість до нематоди (патент США Мо 6228992), стійкість до бактеріальних захворювань (патент США Ме 5516671), ріст і розвиток рослин (патенти США Мо 6723897 і 6518488), накопичення крохмалю (патенти США Ме 6538181, 6538179, 6538178, 5750876, 6476295), виробництво модифікованих олій (патенти США Мо 6444876, 6426447 та 6380462), підвищена продукція олій (патенти США Мо 6495739, 5608149, 6483008 та 6476295), модифікований вміст жирних кислот (патенти США Мо 6828475, 6822141, 6770465, 6706950, 6660849, 6596538, 6589767, 6537750, 6489461 та 6459018), підвищена продукція білків (патент США Мо 6380466), дозрівання плодів (патент США Мо 5512466), покращене харчування тварин і людини (патенти США Ме 6723837, 6653530, 6541259; 5985605 та 6171640), біополімери (патенти США Мо О5БАЕЗ37543, 6228623 та 5958745, і 6946588), стійкість до стресових факторів навколишнього середовища (патент США Мо 6072103), фармацевтичні пептиди і пептиди, які секретуються (патенти США Мо 6812379, 6774283, 6140075 та 6080560), поліпшені властивості для переробки (патент США Мо 6476295), поліпшена засвоюваність (патент США Ме 6531648), з низьким вмістом рафінози (патент
США Мо 6166292), промислове виробництво ферменту (патент США Мо 5543576), покращений смак (патент США Мо 6011199), фіксація азоту (патент США Ме 5229114), виробництво гібридного насіння (патент США Мо 5689041), виробництво волокна (патенти
США Мо 6576818, 6271443, 5981834 та 5869720) та виробництво біопалива (патент США Мо 5998700).
ІЇ0061| В альтернативному варіанті ген, який представляє агрономічний інтерес, може вплинути на вищезгадані характеристики рослини або фенотипи шляхом кодування молекули
РНК, яка спричиняє спрямовану модуляцію експресії ендогенного гена, наприклад, через антисмислові (див., наприклад, патент США 5107065), інгібіторні РНК («РНК-інтерференції», які включають модуляцію експресії генів за допомогою мікроРНК-, міРНК-, транс-діючих міРНкК- та фазових малих РНК-опосередкованих механізмів, наприклад, як описано в опублікованих заявках США 2006/0200878 і 2008/0066206 та в заявці на патент США 11/974469), або косупрессорно-опосередковані механізми. РНК також може бути каталітичною молекулою РНК (наприклад, рибозимом або рибосвітчем, див., наприклад, опубліковану заявку США 2006/0200878), розробленою для відщеплення бажаного ендогенного продукту мРНК. У цій галузі техніки відомі способи для розробки та введення генетичних конструкцій в клітину, таким 60 чином, що молекула ДНК, яка транскрибується, транскрибується в молекулу здатну викликати супресію гена.
Селективні маркери
ІЇ0062| Селективні маркерні трансгени також можуть бути використані з регуляторними елементами відповідно до цього винаходу. Використаний у цьому документі термін «селективний маркерний трансген» відноситься до будь-якої молекули ДНК, яка транскрибується, чия експресія в трансгенній рослині, тканини або клітині, або відсутність таких, може піддаватись скринінгу або підраховуватись якимось чином. Селективні маркерні гени і зв'язані з ними методи відбору та скринінгу, призначені для використання винаходу на практиці, відомі у цій галузі техніки і включають, але не обмежуються цими, молекули ДНК, які транскрибуються, котрі кодують бета-глюкуронідазу (0305), люциферазу, зелений флуоресцентний білок (СЕР), білки, які надають стійкості до антибіотиків і білки, які надають стійкості до гербіцидів.
Трансформація клітин
Ї0ОО6З| Винахід також спрямовується до способу отримання трансформованих клітин та рослин, які містять один або більше регуляторних елементів, функціонально зв'язаних з молекулою ДНК, яка транскрибується. 00641 Термін «трансформація» відноситься до введення молекули ДНК до реципієнтного хазяїна. Використаний у цьому документі термін «хазяїн» відноситься до бактерій, грибів або рослин, включаючи будь-які клітини, тканини, органи, або до нащадків бактерій, грибів або рослин. Тканини та клітини рослин, які представляють особливий інтерес, включають протопласти, калюс, корені, бульби, насіння, стебла, листя, паростки, зав'язіта пилок.
Ї0065| Використаний у цьому документі термін «трансформований» відноситься до клітини, тканини, органу або організму, в який молекула чужорідної ДНК, така як генетична конструкція, була введена. Введена молекула ДНК може бути інтегрована в геномну ДНК клітини, тканини, органу або організму реципієнта таким чином, що введена молекула ДНК успадковується надалі у нащадків. «ГТрансгенна» або «трансформована» клітина або організм також може включати нащадків клітини або організму і нащадків, отриманих в результаті програми розмноження з використанням такого трансгенного організму як батьківської форми при схрещуванні, та проявляє змінений фенотип як результат присутності чужорідних молекул
Зо ДНК. Введена молекула ДНК також може бути тимчасово введеною в клітину-реципієнт таким чином, що введена молекула ДНК не успадковується надалі у нащадків. Термін «трансгенний» відноситься до бактерії, гриба або рослини, які містять одну або більше гетерологічних молекул ДНК. 0066) Існує багато способів, добре відомих фахівцям у цій галузі техніки, для введення молекули ДНК у клітини рослин. Процес, як правило, включає етапи вибору відповідної клітини-хазяїна, трансформації клітини-хазяїна вектором та отримання трансформованої клітини-хазяїна. Методи та матеріали для трансформації клітин рослин через введення рослинної генетичної конструкції у геном рослин, у реалізації винаходу на практиці, можуть включати будь-який із відомих і показаних способів. Відповідні способи включають, але не обмежуються цими, бактеріальну інфекцію (наприклад, Аагорасієгцт), бінарні БШХ вектори, пряме перенесення ДНК (наприклад, ПЕГ-опосередковану трансформацію, поглинання ДНК, опосередковане висушуванням/інгібуванням, електропорацію, перемішування із волокнами карбіду кремнію та прискорення частинок, вкритих ДНК) із числа інших.
Ї0О67| Клітини-хазяїни можуть являти собою будь-яку клітину або організм, наприклад, клітину рослини, клітину водорості, водорості, клітину гриба, гриби, бактеріальну клітину чи клітинку комах. У конкретних варіантах реалізації цього винаходу клітини-хазяїни та трансформовані клітини можуть включати клітини культурних рослин.
Ї0068| Трансгенна рослина згодом може бути регенерована із клітини трансгенної рослини відповідно до цього винаходу. Із використанням загальноприйнятих методів розмноження або самозапилення можна отримати насіння із цієї трансгенної рослини.
Таке насіння та отримана в результаті рослина-нащадок, вирощена із такого насіння, будуть містити рекомбінантну молекулу ДНК відповідно до цього винаходу і, отже, будуть трансгенними.
Ї00О69| Трансгенні рослини відповідно до цього винаходу можуть бути самозапилені, для надання насіння гомозиготних трансгенних рослин за винаходом (гомозиготних за рекомбінантною молекулою ДНК), або схрещені з нетрансгенними рослинами або іншими трансгенними рослинами, для надання насіння гомозиготних трансгенних рослин за винаходом (гомозиготних за рекомбінантною молекулою ДНК). Як гомозиготні, так і гетерозиготні трансгенні рослини згадуються в цьому документі як «рослини-нащадки». 60 Рослини-нащадки являють собою трансгенні рослини, які походять від вихідної трансгенної рослини і містять рекомбінантну молекулу ДНК відповідно до цього винаходу. Насіння, отримане з використанням трансгенної рослини відповідно до цього винаходу, може бути зібране і використане для вирощування поколінь трансгенних рослин, тобто рослин-нащадків відповідно до цього винаходу, які включають генетичну конструкцію цього винаходу та експресію гена, який представляє агрономічний інтерес. Описи способів розмноження, які зазвичай використовуються для різних культур, можуть бути знайдені в одному із декількох книжкових посилань, див., наприклад, АЇПага, Ртгіпсіріев5 ої Ріапі Вгеєдіпуд, Чдойп Ууйеу в 5опв5,
ММ, ШО. ої СА, Оамі5, СА, 50-98 (1960); біттопав5, Рііпсіріеє5 ої Стор Ітргометепі, І опдтап,
Іпс., ММ, 369-399 (1979); Зпеер апа Непагікзеп, Ріапі Бгеєдіпд Регзресіїме5, Мадепіпдеп (єд),
Сепіег ог Адгісийига! Рибріїєпіпу апа Ооситепіайоп (1979); Ренг, 5оуреапе: Ітпргометепі,
Ргодисіоп апа Обеб5, 2па Еайоп, Моподгари, 16: 249 (1987); Ренг, Рііпсіріеє5 ої Маїгієїу
ОемеІортепі, ТНеогу апа Теснпідие, (Мої. 1) їі Стор Зресіез боубєап (Мої.2), сума біаїє Опім.,
Мастійап Риб. Со., МУ, 360-376 (1987).
Ї0070| Трансформовані рослини можуть бути проаналізовані на наявність цільового гена або генів і за рівнем експресії талабо профілем, наданим регуляторними елементами за винаходом. Фахівцям у цій галузі техніки відомі численні способи, доступні для аналізу трансформованих рослин. Наприклад, методи аналізу рослин включають, але не обмежуються цими, Саузерн блот або нозерн блот, підходи на основі ПЛР, біохімічні аналізи, способи фенотипічного скринінгу, польові апробації та імунодіагностичні аналізи.
Експресія молекули ДНК, яка транскрибується, може бути виміряна з використанням реагентів ТадМапФ (Арріїєй Віозувієтве, Бовзієї Сйу, СА) та за способами, описаним виробником, і за кількістю циклів ПЛР, визначеною з використанням ТадМапФ Тевіїпд Маїйіх. В альтернативному варіанті реагенти Іпмадекж (Ті! МУ/аме ТесПппоіодієх, Мадівоп, УМ!) та способи, описані виробником, можуть бути використані для оцінки експресії трансгена. 0071) Винахід також відноситься до частин рослини відповідно до цього винаходу. Частини рослин включають, але не обмежуються цими, листя, стебла, корені, бульби, насіння, ендосперм, сім'ябруньку та пилок. Частини рослин відповідно до цього винаходу можуть бути життєздатними, нежиттєздатними, здатними та/"або не здатними до регенерації. У винаході також включені та запропоновані трансформовані клітини рослини, що містять молекулу
Зо ДНК відповідно до цього винаходу. Трансформовані клітини або клітини трансгенної рослини за винаходом включають клітини здатні та/або не здатні до регенерації.
Ї0072| Винахід пропонує також товарний продукт, який вироблений з трансгенної рослини або її частини, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК згідно винаходу. Товарні продукти, згідно винаходу, містять визначаєму кількість ДНК, що містить послідовність ДНК, виділену з групи, що складається з 5ЕО ІЮ Ме: 1-37. Використаний у цьому винаході термін "товарний продукт" відноситься до будь-якої композиції або продукту, що складаються з матеріалу, отриманого з трансгенної рослини, насінини, рослинної клітини, або частини рослини, що містять рекомбінантну молекулу ДНК згідно винаходу. Товарні продукти включають, але не обмежуються цим, оброблене насіння, зерна, частини рослин і борошно грубого помелу. Товарний продукт за винаходом буде містити кількість ДНК, що може бити визначене, відповідно до рекомбінантної молекули ДНК згідно винаходу. Виявлення однієї чи більше цих послідовностей ДНК у зразку може бути використане для визначення змісту або джерела товарного продукту. Будь-який стандартний спосіб виявлення для молекул ДНК може бути використаний, у тому числі способи виявлення, розкриті в цьому винаході.
Ї007З| Винахід може бути більш легко зрозумілим через посилання на наступні приклади, які запропоновані в якості ілюстрації і не призначаються для обмеження винаходу, якщо це не встановлено. Фахівцям у цій галузі техніки повинно бути зрозуміло, що способи, описані в наступних прикладах, являють собою способи, виявлені авторами винаходу, для нормального функціонування при застосуванні винаходу. Однак фахівцям у цій галузі техніки повинно бути зрозуміло, у висвітленні цього опису, що численні зміни можуть бути зроблені в конкретних описаних варіантах реалізації винаходу, і, як і раніше, вийде схожий або аналогічний результат без відступу від сутності та обсягу винаходу, тому все, що має значення, розміщується далі або показується у доданих графічних матеріалах і повинно інтерпретуватися в ілюстративному, а не обмежуючому розумінні.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1
Ідентифікація та клонування регуляторних елементів 0074) Групи регуляторних елементів експресії (ЕХР) та ділянки термінації транскрипції (З'
НТО) були ідентифіковані і клоновані з геномної ДНК дводольного виду Медісадо ігппсаїшціа 60 (люцерна усічена) Вибір 3 НТО від Медісадо ігпипсаїша був частково заснований на паттернах експресії, що спостерігалися в гомологічних генах сої.
Ї0075| Ідентифікація та клонування 3 НТО Медісадо іпипсаїшіа почалося з вибору необхідних генів сої на підставі патерну експресії генів сої в обстежених тканинах сої і пропрієтарних експериментів з транскрипції. Обрані гени сої потім використовувалися для пошуку гомологічних генів у Медісадо Шипсаїйіа з використанням загальнодоступних послідовностей ДНК. Потім зразки тканин, отримані від Медісадо ігипсаїша були виділені з рослин, вирощених за різних умов навколишнього середовища. Після цього матрична РНК (МРНК), була виділена з тканин люцерни та використана в експериментах із застосуванням полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі (ПЛР), з метою визначення характеру експресії генів люцерни. Отримана в цих експериментах підмножина генів Медісадо ігипсаїша була обрана для клонування та опису.
Ї0076| Біоїнформаційний аналіз було проведено з застосуванням загальнодоступних послідовностей Медісадо Шипсаїша, щоб визначити регуляторні елементи локусів обраного гена люцерни. Наприклад біоінформаційний аналіз проводився 3 метою визначення послідовності З' НТО, що містить поліаденілювання і кінцеві ділянки мРНК і послідовностей, що продовжуються до кінця ідентифікованого локусу гена. Праймери для ампліфікації були сконструйовані та використані для ампліфікації кожного з виявлених регуляторних фрагментів ДНК, таких як 3 НТО фрагменти ДНК, ДНК-фрагменти, що містять промотор, лідер і інтрон, і фрагменти ДНК, що містять промотор і лідер. Отримані фрагменти ДНК були ліговані в стандартні рослинні експрессійні вектори і сіквеновані.
ІЇ0077| Для застосовуваних фрагментів ДНК потім проводився аналіз початку сайту транскрипції регуляторних елементів (СНТ) і інтрон/екзон кордону сплайсингу з застосуванням трансформованих протопластів рослин. У цьому аналізі, протопласти були трансформовані з використанням експресійних векторів рослин, що містять клоновані фрагменти ДНК функціонально зв'язані з гетерологічною молекулою ДНК, що транскрибується. Далі, 5'
ВАСЕ система швидкої ампліфікації кінців КДНК, версія 2.0 (Іпмйгодеп, Карлсобад, Каліфорнія 92008) була використана для підтвердження регуляторних елементів (СНТ) і інтрон/екзон кордону сплайсингу шляхом аналізу послідовності ДНК сконструйованих транскриптів мРНК. 0078) Послідовності ДНК ідентифікованих 3' НТО представлені в цьому документі в якості
ЗЕБЕО ІО Мо: 1-30. Крім того, ідентифіковані послідовності ДНК промоторів, які представлені в цьому документі в якості 5ЕО ІО Ме: 32 та 36; ідентифіковані лідерні послідовності ДНК, які представлені в цьому документі в якості БЕО ІО Ме: 33 та 37; і ідентифікована інтрона послідовність ДНК, яка представлена як 5ЕБЕСО ІЮО Ме: 34. Крім того, послідовності ДНК, ідентифікованих ЕХР представлені в цьому документі в якості 5БЕО 10 Мо: 31 ї 35. Група регуляторних елементів експресії ЕХР-МІ.Ора2:1:2 (5ЕО ІЮ Ме: 31) містить промотор Р-
МІ ОБаг2-1:1:1 (5ЕО ІО Мо: 32), функціонально зв'язаний 5-кінцем з лідером І-МіОбБд2г-1:1:1 (ЗЕО І Ме: 33), функціонально зв'язаним з 5-кінцем з інтроном І-МІ.Орд2-1:11:2 (ЗЕО ІЮ Мо: 34), і група регуляторних елементів експресії ЕХР- МІАС145767м28:1:1 (5ЕО ІЮ Мо: 35) містить промотор Р-МІ.АС145767м28-1:2:1 (5ЕО ІО Мо: 36), функціонально зв'язаний 5'-кінцем з лідером І-МІАС145767м28-1:112 (5БЕО ІЮО Ме: 37). Всі послідовності ДНК ідентифіковані і клоновані з Медісадо ігипсаїціа наведені в Таблиці 1.
Таблиця 1
З'НТО, групи регуляторних елементів експресії, промотори, лідери і інтрони, клоновані з Медісадо ігипсаїша
Т-АМЕЕРТаїя: | 06 |факторелонгаціїлальфа./:/ /(: оС заяюте 00018 тв нене нення фермент 1 тжнюте 00 |з дерен фермент 2 метілтрансфераза
Приклад 2
Аналіз ефекту 3' НТО на конститутивну експресію СЩИО5 у протопластах з листківв сої
Ї0079| Протопласти з листків сої були трансформовані з застосуванням векторів, зокрема, плазмідних конструктів, для оцінки впливу обраних З НТО Меадісадо іпопсаїшіа на експресію.
Протопласти з листків сої були трансформовані з використанням ДНК векторів, які містять конститутивну послідовність ЕХР, що регулює експресію трансгена ДВ-глюкуронідази (С05) функціонально зв'язану з З НТО люцерни. Ці трансформовані з допомогою 3 НТО люцерни протопласти з листків сої були порівняні з протопластами з листків сої в яких експресія трансгена (СИ05 регулюється конститутивним промотором і трансген СИ5 функціонально зв'язаний з З НТО, яка отримана з (Схоззурішт Піст або Со55зурійт
Баградепзе. 0080 Рослинні вектори, як використовуються в цих експериментах, були сконструйовані з використанням способів клонування, відомих в цій галузі техніки. Отримані вектори, що містять ліву граничну ділянку від А. Штеїасіеп5; першу трансгенну експресійну касету для відбору трансформованих рослинних клітин, що проявляють стійкість або до гербіциду гліфосату, або до антибіотика спектиноміцину (обидва керуються промотором Асіїп 7 арабідопсису); другу трансгенну експресійну касету для аналізу активності З НТО, що містить ЕХР або промоторну послідовність функціонально зв'язану 5--кінцем з послідовністю ДНК для (15, яка містить інтрон, який вирізається (305-2, ЗЕО ІЮ Мо: 44), який функціонально зв'язаний 5'- кінцем з З НТО, отриманої з Медісадо ігипсаїша, Соввзурішт Пігзшіит або Соззурійт
Брагбадепзе; и праву гранічну ділянку від А. штеїасієпв.
Вектори, які містять З НТО, що отримана з люцерни (тобто. РМОМ109593, РМОМ116803, рМОМ116812, рмоМ116813, рмоМ116815, рмоОмМ116826, рмомМ116827, рмМоОМ116830, рмомМ122852, рмомМ122853, рмомМ122854, рмом122855, рмоМм122856, рмом122857, рмоМм122858, рмоОмМ122859, рмом122862, рмомМм122864, рмом122865, рмом122866, рмом122867, та РМОМ122868) використовують групу регуляторних елементів експресії ЕХР-
Саму.355-епп--РиИ.ЮОпак:1:3 (5ЕО ІО Мо: 42) для керування 2И5. Вектори, які містять 3 НТО, що отримана з Споз5урішт Нігцішт або Сбо5зурішт Багтадепбзе (тобто рмомМ81345, рмМоОМ81347, та РМОМ83002) використовують конститутивний промотор Р-Самм.355- епр-1:171 (5ЕО ІО Ме: 43) для керування 15. 0081 У таблиці 2 наводяться плазмідні конструкти, які містять відповідну З' НТО і 5ЕО І
Мо, які використані для трансформації протопластів сої в експериментах, представлених у цьому прикладі.
Таблиця 2
Опис плазмідних конструктів використаних для трансформації протопластів з листків сої та З' НТО рМмОоМмі2г2855 0000 |ТАМЕЕВАЯЯВ -:: 77777777 Ї7771711718 1,
І0082| Два рослинних вектора, зокрема плазмідні конструкції, для використання в ко- трансформації та нормалізації даних були сконструйовані з використанням способів клонування, відомих в цій галузі техніки. Кожна з плазмідних конструкцій містила специфічну послідовність, що кодує люциферазу, яка керується конститутивною ЕХР. Рослинний вектор РМОМ19437 містить експресійну касету з конститутивню ЕХР, що містить промотор, функціонально зв'язаний 5'-кінцем з лідерною послідовністю, яка функціонально зв'язана 5'- кінцем з інтроном (ЕХР-Саму.355-ЕМН--2т.Опак:1:1, 5ЕО ІЮ Мо: 47), функціонально зв'язаним
Б-кінцем з послідовністю люциферази світляка (Ріоїїпи5 ругаїїз) (ГОСІРЕВАБЕ:1:3, 5ЕО ІЮ Мо: 45), функціонально зв'язаною 5-кінцем з З НТО від гена нопалин синтази Адгобасієгійт їмтеїасієпв (Т-АСАШ.по5-1:1:13, 5ЕО ІО Мо: 49). Рослинний вектор рМОМб63934 містить експресійну касету з конститутивню ЕХР, що містить промотор, функціонально зв'язаний 5'- кінцем з лідерною послідовністю, яка функціонально зв'язана 5'-кінцем з інтроном (ЕХР-
Саму.355-епип-Ї ср, 5ЕО І Мо: 48), функціонально зв'язаним 5-кінцем з послідовністю люциферази реніли морської (Вепійа гепітоптів) (СВ-Кеп.пАВепійа І исіте-0:0:1, 5ЕО І Мо: 46), функціонально зв'язаною 5- кінцем з З НТО від гена нопалин синтази Адгобасієгійт
Тїмтеїасієпв (Т-АСРІШ.пов5-1:1:13, ЗЕО ІО Мо: 49).
ЇОО8З3| Протопласти з листків сої були перетворені з використанням способу трансформації, заснованому на застосуванні поліетиленгліколю (ПЕГ), який добре відомий у цій галузі техніки. Кожен протопласт був трансформований плазмідним конструктом рРМОМ19437, плазмідним конструктом рМОМ63934, і одним з плазмідних конструктів, представлених у Таблиці 2. Після трансформації трансформовані протопласти листків сої інкубували протягом ночі в повній темряві. В слід за цим проводилося вимірювання СИ5 і люциферази шляхом розміщення аліквоти препарату лізованих трансформованих клітин у двох різних малих лотках. Один лоток використовувався для вимірювання СІ, а другий - для виконання подвійного аналізу люциферази з використанням системи аналізу репортерного гена подвійної люциферази (Рготеда Согр., Мадізоп, МУУ!І; см., например,
Рготеда Моїез Мада?гіпе, Ме: 57, 1996, р.ог).
Ї0084|Ї Одна або дві трансформації були виконані для кожного плазмідного конструкта представленого в Таблиці 2. Середні значення експресії для кожної 3' НТО були визначені від декількох зразків з кожної трансформації. Заміри зразків проводили з використанням чотирьох повторів для кожної трансформації плазмідним конструктом, або ж, три повтору для кожного
Зо плазмідного конструкта на один з двох експериментів з трансформації. Середнє значення рівнів експресії (05 і люциферази наведені в Таблиці 3. У цій таблиці значення люциферази світляка (наприклад, при експресії РМОМ19437) представлені в стовпці "Рі ис" і значення люциферази реніли морської (наприклад, при експресії рМОМб63934) представлені в стовпці "АГис".
Таблиця З
Значення аналізів О5 та люциферази в трансформованих протопластах з листків сої
ЗЕО
Плазмідний конструкт Опис 3 НТО ІО ав ЕСис ВГис
Мо: рМОМІі22855 | Т-МЕРВА-75 | 8 /40383| 17826 | 50299
Продовження таблиці З 0085) Крім того, для порівняння відносної активності кожного 3 НТО, значення СШ5 були представлені як відношення СО до активності люциферази та нормовані до кращого значення експресії без 3' НТО люцерни, тобто Т-С6Б.ЕРБІ 2-1:1:11 (5ЕО ІО Мо: 41). У Таблиці 4 наведені співвідношення (3О0б/люцифераза і нормалізовані співвідношення. Також в цій таблиці значення люциферази світляка позначені "Рі цс", значення люциферази реніли морської представлені як "Ві ис"
Таблиця 4
Значення експресії СОБ/РІ ис і БО5/ВІ ис у трансформованих протопластах із листків сої, нормалізовані по відношенню до Т-(46.ЕБІ 2-1:171 (5ЕО ІО Ме: 41)
ЕО аИ/Ріис аИ/НІис ' нормалізо- | нормалізовано
Опис З НТО Ко. ,ИБ/Е ис аи5Б/ВІ ис вано до Т- | до Т- СЬ.ЕБІ 2-
Ш С.І 2- 1:11 1 111 тбп.ЕбЯА-021 7 | 38 | 012 | 009 | 037 | 042 (
Т-МЕРВА-ТЛ5 7777777 | 8 | 227 | 080 | 665 | 374 (
Т-МЕАСІ53125уУ10-121 | 4 | 202 | 066 | 592 | 309 0086) Як показано в Таблиці 4, експресія (ОО була збільшена за допомогою обраних 3
НТО люцерни, в порівнянні з З НТО з Сюовззурішт Пітшит або Со55урішт бБагбадепзе.
Наприклад, експресія ЩОБ була в 2,1 - 18,3 рази вища, при використанні отриманих з 3 НТО люцерни на підставі співвідношень СШБ5/Рі ис, нормованих по відношенню до Т-Ср.РБІ 2- 17:71, кращих експресій 3' НТО, отриманих з Соззурішт Нігшіит або Соззурішт Баградепзе.
Так само, експресія в (35 була 1.61 - 10.48 рази вища, при використанні отриманих з 3'
НТО люцерни на підставі співвідношень СИБ/РІ ис, нормованих по відношенню до Т-С6.РБІ 2-
Приклад З
Аналіз впливу 3 НТО на конститутивну експресію ЩОБ у стабільно трансформованих рослинах сої
ЇОО87| Рослини сої були трансформовані за допомогою векторів, зокрема плазмідних конструктів, для встановлення впливу окремих 3 НТО Меаісадо Шипсаїша на експресію.
Зокрема, рослини сої трансформували векторами, які містять конститутивну послідовність ЕХР, яка керує експресією трансгена Д-глюкуронідази (405) функціонально зв'язаного з 3 НТО люцерни. Ці рослини сої, які трансформовані за допомогою З3' НТО від люцерни порівнювали з трансформованими рослинами сої в яких експресія трансгена (СШ5 керувалася конститутивним промотором, і трансген СО був функціонально зв'язаний з 3 НТО, яка отримана з Ссо5зуріит Багбадепзе.
ЇО088| Рослинні вектори, використані в експериментах були сконструйовані з використанням способів клонування відомих в цій галузі техніки. Отримані вектори, містили ліву граничну ділянку від А. іштеїасієпе; першу трансгенну експресійну касету для відбору трансформованих рослинних клітин, які проявляють стійкість до антибіотика спектиномицину (що керується промотором Асійїп 7 арабідопсису); другу трансгенну експресійну касету для аналізу активності 3' НТО, що містить групу регуляторних елементів експресії ЕХР-Саму.355- епп-РИ.Опак:1:3 (5ЕО ІО Мо: 42), функціонально зв'язану 5'-кінцем з кодуючою послідовністю для СШ5, яка містить інтрон, що вирізається (005-2, ЗЕО ІО Мо: 44), який функціонально зв'язаний 5'-кінцем з 3З' НТО, що отримана з Медісадо ігипсаїша або Соззуріит Багбадепзе; і праву граничну ділянку від А. Штеїасієп5. Вектори, які містять З НТО, яка отримана з
Меадісадо Шпипсаїша: рМОМ109593, рМОМ116803, рМОМ116812, рМОМ116813, рмМоОМ116815, рРМОМ116826, рмоМ116827, рмМоОМ116830, рмомМ122850, рмомМм122851, рмом122852, рмМмоОМ122853, рмомМ122854, рмомМ122855, рмоМ122856, рмом122857, рмом122858, рмоМм122859, рмомМм122861, рмомМ122862, рмМомМ122863, рмомМм122864, рмом122865, рмомМм122866, рмомМ122867, і рРМОМ122868 . Вектор, який містить 3 НТО, що отримана з
Сюоззурішт Багбадепзе - РМОМ102167.
Ко) Ї0089| Таблиця 5 представляє плазмідні конструкти з відповідною З' НТО і 5ЕО ІЮО Ме, які використовуються для трансформації рослин в експериментах, представлених у Прикладі.
Таблиця 5
Плазмідні конструкти, які використовуються для трансформації рослин і опис 3 НТО рМОМІ22855 0 ОІТ-МЕЕВАЙЯИб --: 77777777 1178
Продовження таблиці 5 рМОМІ22863 0000 (Т-МЕЕлТали? 77777771 116
ЇО0О90О| Рослини сої були трансформовані з використанням агробактеріальних способів трансформації, відомих в цій галузі техніки. Експресія СО була кількісно виміряна за допомогою гістологічних зрізів відібраних тканин. Для гістохімічного аналізу ЩО повноцінні зрізи тканин інкубували з СО5-забарвлюючим розчином Х-Сіис (5-бромо-4- хлоро-3-індол-р- глюкуронід) (1 мг/мл) протягом відповідного періоду часу, промивали і візуально досліджували на наявність синього забарвлення. С05 активність якісно визначається шляхом прямого візуального огляду або огляду під мікроскопом, використовуючи вибрані органи і тканини рослин. ВО покоління рослин було проаналізовано на наявність експресії в
Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, НІ зрілому листі, НІ! черешку, В1 квітці, зародку жовтого боба (приблизно НВ8 стадія розвитку), сім'ядолі жовтого боба (приблизно Н8 стадія розвитку), ВЗ незрілій насінині, ВЗ бобі, і В5 сім'ядолі. 00911 Кількісні зміни в експресії СО пов'язані з експресією обумовленої РМОМ102167, який містить З НТО, яка отримана з Со5з5зуріит Багбадепзе,було також проаналізовано, як продемонстровано в Таблицях 6-13. Для цього кількісного аналізу загальний білок екстрагували з обраних тканин трансформованих рослин. Один мікрограм загального білка був використаний з флюорогенним субстратом 4-метилумбреліферил-В-О- глюкуронід (МУГ) у загальному реакційному об'ємі 50 мкл. Продукт реакції, 4- метилумбреліферил (4-МУ), максимально флуоресціює за умов високого рН, коли гідроксильна група іонізована.
Додавання лужного розчину карбонату натрію одночасно зупиняє аналіз та регулює рН для підрахунку флуоресцентного продукту. Флуоресценцію вимірювали зі збудженням при 365 нм, емісією при 445 нм, використовуючи Ріпоготах-3 (Ногіба; Кіото, Японія) з Містотах Неавдбг", із шириною щілини, що встановлена на збудження на 2 нм та З нм на емісію.
Ї0092| Таблиці б і 7 демонструють середнє значення кількісних рівнів експресії, які виміряно у тканинах рослин покоління НО. Тканини, які не аналізували показано як порожні клітинки в обох таблицях.
Таблиця 6
Середнє значення кількісних рівнів експресії ЩОБ у Мп5 корені, Мп5 молодому листі,
Мп5 зрілому листі, НІ зрілому листі, АТ черешку, і А1 квітці рослин покоління Ко
Упь о. Уп5 ВІ ВІ
Плазмідний | Одисз'нто | ЗБОЮ) Мп5 | Моло-| зрілий | Зрілий Чере- | В! конструкт Мо: Корінь дий Квітка пист лист лист шок рМОМмі02167 |Т-6р.Еб-30 1 | 40 |400,90| 551,61 | 60529 | 350939 (| 412,30
Т-МІ.АС140914
Продовження таблиці 6 оМОМ122851 | Т-МІ.ВО22-1:2:1 897,98 | 287,52 | 667,63 | 325,50 І1056,16) 407,35 оОМОМ122852 | Т-МІ.Мейт-1:2:1 852,05 |11003,70| 456,38 | 883,30 | 560,70 | 184,02 оОМОМ122853 |Т-МЕРІіх-1:171 01 019 | 858,88 | 591,51 | 362,40 | 841,82 ) 459,48 | 220,29
ОМОМІ 22854 | Т-МІ.Сарап-1:2:1 957,90 1 910,53 | 343,90 | 583,62 | 570,15 | 198,11 оОМОМ122855 ІТ-МЕЕВА-1:11:5 | 8 |1293,27| 396,14 | 338,26 | 167,55 | 113,14 | 94,21 оМОМ122856 | Т-МІ.2тр-1:2:1 254,48 | 250,56 | 154,27 | 425,90 | 223,53 | 115,33 рРМОМІ122857 вві 600 800 тозБаз 1014,18| 579,85 1631,94 921,34 | 421,81
ОМОМ122858 |Т-МЕМР21-1:2:11 | 16 | 408,94 | 299,07 | 282,34 | 315,48 | 562,46 | 308,11 оМОМ122859 |Т-МЕОхі-12:и1 | 017 13228,98|11315,58) 2092,77 | 849,69 | 406,58 | 98,10 оМОоМі22861 |Т-МЕАрх-1:11:2 | 55 974,70 | 433,60 | 510,50 | 263,00 | 103,70 | 117,70 оМОМ122862 | Т-МІбці1-1:11:2 | 29 |1131,24| 710,62) 604,88 | 342,22 | 182,58 | 219,67 оОМОМ122863 | Т-МЕЕРТа-1:1:2 | 6 | 667,00 | 281,00 | 398,30 | 171,40 | 323,10 | 281,30 оОМОМ122864 |Т-МЕРірі-1:2:1 | 18 | 448,00 | 203,00 | 240,00 | 401,00 ) 369,00 | 355,00
Т-МІЕАС153125
РМОМ122865 |/40. 4-2-4 4 1385,42 )160,51 |298,16 |239,01 104,64 |32,62 оОМОМ122866 | Т-МІі.Заїї3-2-1:2и| 26 |2274,7011176,10) 1490,54 | 976,91 | 753,02 | 45,26 оМОМ122867 | Т-МІ.Нерг0-1:2:1 753,94 | 544,73 | 395,30 | 675,68 | 668,83 | 255,68 оМОМ122868 |Т-МЕЕхрії-1:2:11 | 7 |1151,60| 608,21 | 692,82 | 235,62) 87,40 | 157,45
Таблиця 7
Середнє значення кількісних рівнів експресії ОБ у зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба, ВЗ незрілій насінині, ВЗ бобі, і В5 сім'ядолі рослин покоління Ко
Сім'ядо є, Зародо ВЗ
Плазмідний Опис З НТО ЗЕО о жовтого ля Незріла ВЗ й Во конструкт Мо: боба жовтого насінина боб сім'ядоля боба оМОМ102167 | Т-С6.Е6-361 1 47,86 | 4945 | 6745 433,54 101,34
ОМОМ109593 | Т-МЕРН-1:2:2 18,56 | 170,11 | 28,63 406,13 71,91 рМОМ116803 реа ШРІ 10042 181,62 20992 | 467,72 | 190,51
ОМОМ116812 | Т-М пср2-1:21 74,53 | 120,30 | 163,76 | 526,08 407,40 оМОМ116813. | Т-МЕ.РБІ-Т В-1:2 1 127,65 | 279,84 | 78/12 282,34 50,92 рМОМ116815 ТЕстивА Зз5В,ОЗ 1192,69| 989,47 | 2309772 | 566,93 оМОМ116826 |Т-МіГох-1-122 1014 280,48 577,87 | 231,15 | 2868,17 341,60 оМОМм116827 | Т-МЕ.Орі-1:2:1 118,18 1 127,74 | 10,96 37,22 27,80
ОМОМ116830 | Т-Мі.Єср-1:2:1 57,11 | 72,33 | 23,96 271,88 98,36 оМОМ122850 | Т-МІ.Врі 3-12: 265,30 | 489,70 | 57,40 487,50 264,40 оМОМ122851 | Т-МІ.ВО22-1:2:1 95,88 | 189,41 | 121,12 | 1045,20 72,23
ОМОМ122852. | Т-МІ.Мейт-1:2 1 153,46 | 320,64 | 53,24 686,92 518,51 оОМОМ122853 | Т-МЕ.Ріх-171 1 46,64 | 146,53 | 38,64 360,48 103,28 оМОМ122854. | Т-МІ.Саранп-1:2:1 165,11 | 160,40 | 66,44 464,75 245,85 оМОМ122855 | Т-МІ.ЕВА-1:1:5 08117221) 381,32) 111,57 | 496,04 306,13 оМОМ122856 | Т-МІ.Ар-1:2:1 46,37 | 44,66 | 87,51 775,69 57,17
РМОМ122857 поло бго 142,78 | 243,74 4558 | 615,99 452,09
ОМОМ122858. | Т-МІ.МР21-1:2:1 102,11 | 260,98 | 137,76 | 667,18 169,16
ОМОМ122859 |Т-МІ.ОхІ-1:2:1 192,92 | 539,13 | Й 74,44 950,85 43,69
ОМОМ122861 |Т-МІ.Арх-1:1:2 5З,О | 217,70 | 37,90 95,30 174,50
ОМОМ122862 | Т-МІ.биці1-1:1:2 195,81 | 502,37 | 6210 135,60 500,71 оМОМ122863 |Т-МЕЕРТа-ї:1:2 | 6 11360801 27020| 127,20 1 38710 150,00 оОМОМ122864. | Т-МІ.Рір1-1:27 140,00 | 220,00 | 87,00 398,00 102,00
Продовження таблиці 7 поси | ввів! | | ню рМОМі22866 Т-МіЗайЗ-е-ї2л | 26 )|126,53|33427| | -- | 5933
Ї0О093| В таблицях 6 і 7 продемонстровано, що експресія, що керується однаковими ЕХР відрізнялася в тканинах стабільно трансформованих рослин сої, що містять різні 3 НТО люцерни, порівняно з 3' НТО, які отримано з Соззуріит Браградепзе.
ЇО094| Таблиці 8 і 9 демонструють кратні зміни експресії в тканинах стабільно трансформованих рослин сої, що містять різні 3 НТО люцерни, порівняно з З НТО, які отримані з Совз5зурійт рагадепзе.
Таблиця 8
Кратність змін експресії у Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, В1 зрілому листі і ВТ квітці трансформованих рослин сої покоління Но . - Упь Упь ВІ конструкт Мо: Корінь | - Квітка й лист лист лист рМОМі16830|Т-МіЗср-ї271 1 27 | 060 | 0,34 | 055 | 032 | ОО рМОМмі22851 |Т-Мівр22-121 124 1 224 | 052 | 1лЛоО | 093 | 0,99 рМОМмі22853 |Т-МЕРІТ 7777/1119 1 214 | 707 | 060 | 240 | 0,53 рМОМі22855 |Т-МіЕРВА-1715 1/8 1 5323 | 072 | 056 | 048 | 023 рМОМмі22857 |Т-МіАСІ39600у16-12 | З | 258 | 184 | 096 | 465 | 71,02 рМОМмі22858 |Т-МЕМР2І-ї:21 | 16 | 102 | 054 | 047 | 090 | 0,75 рМОМмі22863 |Т-МСЕРТа-їл:2 | 6 | 166 | 051 | 066 | 049 | 0,68 рМОМі22865|Т-МІАСІ53125У10-1271) 4 | 096 | 029 | 049 | 068 | 0,08 рМОМмі22867 |Т-МіНер2го-ї21 | 12 | 1,88 | 099 | 065 | 1,93 | 0,62
Таблиця 9
Кратність змін експресії у зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба,
ВЗ незрілій насінині, ВЗ бобі, і 85 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління Ко . М ЗЕО | Зародок! Сім'ядоля ВЗ
Плазмідний Опис З НТО ІЮ |жовтого| жовтого | Незріла ВЗ . Н5 конструкт Мо: боба боба насінина боб | сім'ядоля омМоМм102167 | Т-С6.Еб-36 1 1 оМОМ109593 | Т-МЕРН-1:2:2 оМОмМ116812 | Т-МЕпор2-1:21 оМОМ116813 | Т-МЕРЗІІ-Т В-1г21 оМОмМ116826 | Т-Міох-1-1:2 11,69 оМОМ116827 | Т-Мі.Орі-1:2 11 | 247 | 258 | об |009| 027 оМОМ116830 | Т-Мі.Бср-1:271 оМОМ122850 | Т-МІ.Врі-3-1:2:1 25 | 554 | 990 / 085 |ї1л2| 261 оМОоМ122851 | Т-МЕВО22-1 2 оМОМ122852 | Т-МІ.Меїйт-1:2:1 оМОМ122853 | Т-МЕРіх-1 1 оМОМ122854 | Т-Мі-Сарап-1 21 ло | 345 | 324 | 0899 |107| 243 оМОМ122855 | Т-МІ.ЕВА-1:1:5 8 | 360 | 771 | 165 |1л4| 302 оМОМ122856 | Т-Мі.2ір-1:21 зо | 097 | 090 / то |179| 056 оМОМ122858 | Т-МЕМР21-1:21 оМОМ122859 | Т-МЕОхІ-1:21 10,90 оМОМ122861 | Т-МЕАрх-172 оМОМ122862 | Т-МЕ.5Мі1-1:1:2 10,16 оМОМ122863 | Т-МЕЕРТа-1:1:2 6 | 286 | 546 | 189 /|089| 148 оМОмМ122864 | Т-МЕРірі1-т21 оМОМ122866 | Т-Мі. ЗаїїЗ-2-1:2 1 26 | 264 | 676 | | | 059 оМОМ122867 | Т-МІНергб-1:21 оМОмМ122868 | Т-МЕЕхрі1-1:21
Ї0О095| У таблицях 8 та 9 продемонстровано, що експресія в тканинах трансформованих рослин сої, які містять різні 3 НТО люцерни відрізнялася при порівнянні з рослинами сої, трансформованими з використанням рмМоОМ102167, що містять 3 НТтТО отримані з
Сюоззурішт Багбадепзе. Наприклад, дві З НТО люцерни Т-МІЕАС145767м28-1:1:2 (ЗЕО ІЮО Ме: 1) і Т-МЕГох-1-1:2:11 (5ЕО ІО Ме: 14) приводили до посиленої експресії конститутивної ЕХР, ЕХР-
Саму.355-епп--РиИ.ЮОпакК:1:3 (5ЕО ІО Мо: 42) у всіх тканинах. Інші 3 НТО люцерни приводили до посиленої експресії конститутивної ЕХР в одних тканинах, знижуючи її в інших. Наприклад
З НТО Т-Мі.Заїї3-2-122:11 (5ЕБО ІО Ме: 26 призводила до 2,19-8,05-разового посилення експресії в Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, НІ зрілому листі, зародку жовтого боба і сім'ядолі жовтого боба, при цьому знижуючи експресію в НІ квітці і В5 сім'ядолі.
До того ж 3" НТО Т-МЕАС140914у20-1:2:11 (5ЕО ІО Мо: 2) призводила до 1,88-4,12 -разового посилення експресії в Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, зародку жовтого боба і сім'ядолі жовтого боба ВЗ незрілій насінині і В5 молодому листі, при цьому знижуючи експресію в НІ зрілому листі, НА1 квітці і зберігаючи експресію на відносно незмінному рівні в З бобі. Крім того 3 НТО Т-МіОхі-122:11 (5ЕО ІЮО Мо: 17) забезпечувала 2,19-10,90 -разове посилення експресії в Мп5 корені, Мпи5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, НІ зрілому листі, зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба і ВЗ бобі, при цьому знижуючи експресію в В1 квітці і В5 сім'ядолі і зберігаючи експресію на відносно незмінному рівні в ВЗ незрілій насінині.
Ї0096| Деякі трансформовані рослини сої, що містять різні 3 НТО люцерни використовувалися для отримання покоління НІ. Таблиці 10 їі 11 демонструють середнє значення експресії (05 у досліджених тканинах. Таблиці 12 ії 13 демонструють кратні зміни експресії щодо 3' НТО, які отримані з Совззуріит Баградепзе.
Таблиця 10
Середнє значення експресії ОБ у Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, ВІ зрілому листі, ВІ черешку, і АТ квітці трансформованих рослин сої покоління Ві о. Уп5 Уп5 ВІ ВІ
Плазмідний / Одису'нто 0960) Мп5 | молодий Зрілий) Зрілий | Чере-| ВІ конструкт ІО Ме: | Корінь . лист лист лист шок | Квітка оМОМ102167 | Т-Я6.Е6-3671:1 40 Щ193422| 992,31 | 1210,30| 856,01 | 570,64 | 603,61
ОМОМ116813 | Т-МЕРБІ-ТВ-1:2:11 | 21 М462,92| 1169,79 /11495,65| 115928 | 647,86 | 506,70 рРМОМ116815 ТЛЕАСТБУВАЯВІ У ІвББТ? 5146,48 |4447,42) 265413 2825,41|2584,82 оМОМ122859 | Т-МІ.ОхІ-1:2:1 17 3726,08І 3090,41 |3862,55) 2666,68 |1160,6611041,40 оОМОМ122866 | Т-МІ.бЗаїі3-2-1:2:и1 | 26 1І3438,35| 2856,04 |2510,49| 2012,63 |1087,69| 919,57
Таблиця 11
Середнє значення експресії ОБ у зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба,
ВЗ незрілій насінині, ВЗ бобі, і 85 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління Ві
Сім'я- . й Зародок ВЗ
Плазмідний ' ЗЕО доля : ВЗ дь конструкт Опис З НТО І Ме:| Жовтого | Жовтого Незріла боб | сім'ядоля боба боба насінина оМОМ102167 Т-С6.Еб6-36И 85,27 | 17411 | 298,03 | 567,48 | 851
ОМОМ116813 Т-МЕРБІІ-Т В-1:2:1 468,66 | 537,77 | 171,00 | 976,84 | 342,29 рРМОМ116815 гоже а 131444 | 2134,97 | 1039,30 | 4506,45| 1842,61 оОМОМ122859 Т-МЕОХІ-1:2:1 730,81 |1098,62 | 245,45 |1947,45| 423,40 оМОМ122866 Т-МІ.Заїї3-2-1:2:1 686,08 | 988,27 | 488,62 |1068,10| 75712
ЇО097| Таблиці 10 їі 11 демонструють, що експресія, яка керується однаковими ЕХР відрізняється в різних тканинах стабільно трансформованих рослин сої, що містять різні 3 НТО люцерни порівняно з 3 НТО, отриманими з Созз5зурішт бБагбадепзе. Таблиці 12 і 13 демонструють кратність змін експресії в тканинах стабільно трансформованих рослин сої, що містять різні 3 НТО люцерни по відношенню до тканин, які трансформовані із застосуванням рМОМ102167, який містить З3' НТО, що отримані з Соззурійт раградепзе.
Таблиця 12
Кратність змін експресії у Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі,
В1 зрілому листі, АТ черешку, і ВІ квітці трансформованих рослин сої покоління В:
Упь ни ЗЕО Уп5 ВІ ВІ
Плазмідний | опис нто юю | уп9 | Моло-| зрідий| Зрілий| Чере- конструкт Ме: Корінь| дий пист пист ШОК Квітка
Щ лист оМОоМт1О2167 | Т-Ср.Еб-367 оМОМ116813 | Т-МЕРЗІЇ-Т В-1:21 мото ДИКО оМОМ122859 | Т-МЕОхІ-1:27 оМОМ122866 | Т-Мі.ЗаїїЗ-2-1:2:1
Таблиця 13
Кратність змін експресії у зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба,
ВЗ незрілій насінині, ВЗ бобі, і 85 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління Ві . М ЗЕО | Зародок) Сім'ядол ВЗ Вь
Мо: боба боба насінина доля 00981) Таблиці 12 і 13 демонструють, що деякі 3 НТО люцерни приводили до посиленої експресії конститутивної ЕХР ЕХР-Самм.355-епп-РИ.Опаки:з (5ЕБО 10 Ме: 42) по відношенню до рослин, які трансформовані з використанням РМОМ102167, що містить З3' НТО, отримані з Сюовззурішт Багбадепзе покоління ВІТ. Наприклад, З НТО, Т- МІЕАС145767ми28-1:1:2 (ЗЕО ІО Мо: 1) забезпечує посилення експресії СЩИО5 у 3,10-21,65 рази у всіх досліджених тканинах. 3 НТО, Т-Мі.ЗаїїЗ3-2-122:11 (5ЕО ІО Мо: 26) забезпечує посилення експресії СО5 у 1,52-8,90 рази у всіх досліджених тканинах. З НТО, Т-МіОхІ- 1:21 (5ЕБО ІЮ Мо: 17) забезпечує посилення експресії в більшості тканин, проте призводить до її зниження в ВЗ незрілій насінині, відносно до рослин, які трансформовані з використанням Т-С20.Еб6-3Б:11 (5ЕО
ІОМо: 40).
І0099| Вищезазначені експерименти демонструють, що З НТО люцерни приводили до посиленої експресії конститутивної елементів ЕХР ЕХР-Самм.355-епп-РиИ.ЮОпак:1:3 (ЗЕО ІО Мо: 42) різними шляхами, в залежності від обраної 3' НТО. У багатьох випадку спостерігалося посилення експресії в деяких тканинах рослин, трансформованих із застосуванням рослинних експресійних векторів, що містить З НТО люцерни, порівняно з рослинами, трансформованими за допомогою рРМОМ102167, що містить 3 НТО, отриману з Сюззурійт
Брагбадепзе. Однак ефект посилення спостерігався не у всіх тканинах рослини, і в деяких випадках застосування 3 НТО люцерни експресія послаблювалася в одних тканинах і посилювалася в інших. Таким чином, застосування конкретної З НТО люцерни дозволяє добитися "тонкої настройки" профілю експресії конкретного трансгена і може бути використана в поєднанні з різними елементами експресії, такими як промотори, лідери і інтрони функціонально зв'язаними з молекулою ДНК, що транскрибується, для забезпечення оптимальної експресії в конкретних тканинах, при одночасному зниженні експресії в тканинах, які є менш бажаними для конкретної молекули ДНК, що транскрибується.
Приклад 4
Аналіз впливу 3' НТО на експресію 115 у насінні стабільно трансформованих рослин сої
ЇОО10О0| Рослини сої були трансформовані за допомогою векторів, зокрема плазмідних конструктів, для встановлення впливу окремих З НТО люцерни на експресію. Зокрема,
Зо рослини сої трансформували векторами, які містять конститутивну послідовність ЕХР,яка керує експресією трансгена р-глюкуронідази (205) функціонально зв'язаного з 3 НТО люцерни. Ці рослини сої, трансформовані за допомогою 3 НтТО від люцерни порівнювалися з трансформованими рослинами сої, в яких експресія трансгена (СШ5 управлялася експресійними послідовностями ЕХР насіння, і трансген БО функціонально зв'язан з 3' НТО, яка отримана з Соззурішт Багбадепзе
ЇОО1О1| Рослинні вектори, використані в експериментах були сконструйовані з використанням методів клонування відомих в цій галузі техніки. Отримані вектори, містили ліву граничну ділянку від А. іштеїасієпе; першу трансгенну експресійну касету для відбору трансформованих рослинних клітин, що проявляють стійкість до антибіотика спектиноміцину (яка керується промотором Асіїп 7 арабідопсису); другу трансгенну експресійну касету для аналізу активності З НТО, що містить групу регуляторних елементів експресії ЕХР-
Ст.5рпа5з1:1:1 (ЗЕО ІО Мо: 50), що забезпечує експресію в насінні, функціонально зв'язану 5'- кінцем з кодуючою послідовністю для (505, яка містить інтрон, що вирізається (405-2, 5ЕО І
Мо: 44), який функціонально зв'язаний 5-кінцем з 3 НТО, що отримана з Медісадо іШипсаїша або Сюззурішт Багбрадепзе; і праву граничну ділянку від А. Шптеїасіеп5. Вектори, які містять
З НТО отриману з Медісадо іпшпсашіа: рмоОмМ116832, рмоОМ116834, рмомМ116835,
рМОМ116841, рмомМ122869, рмомМ122870, рмМоОМ122871, рмомМ122872, рмоМм122873, рмом122874, рмомМ122875, рмМоОМ122876, рмомМ122878, рмМоОМ122879, рмом122880, рмомМм122881, рмомМм122882, рмМоОмМ122883, рмомМ122885, рмом122887, рмоМмМ122888, і рмоМм126122 . Вектор, який містить З3' НТО отриману з Соззуріит Багбадепзе - рМОМ8З028. 00102) У таблиці 14 наводяться плазмідні конструкти з відповідною З' НТО і 5ЕО ІЮ Ме і покоління, для яких проводяться кількісні аналізи.
Таблиця 14
Плазмідні конструкти, які використовуються для трансформації рослин сої та відповідні 3З' НТО конструкт Мо: надаються дані рМОМІТ6832 |Т-МЕАСІЯО914У20-12177777111111112 01111, рМОМІ16834 |Т-МЕРБІСТ Аа 77777777777777117111120 (ВС рМОМІ16835 |Т-МЕАСІ45767М28-142 77777711 0111, рМОМміТ6841 (Т-МЕРБІНТ В-2Я /777777777771771711121 0111, рМОМі22869 |Т-МЕАрщУЯ ай 777777777777777111171111125 (ВС, рМОМі22870 |ТмМЕврггяаи 77777777777777771111171111124 (1111 рМОМі22871 |Т-МЕМештт2й 777777777777771711111517 (ВС, рМОМі22872 |ТМЕРОЯСТЯЯ 777777777171717171717111111111191 01111, рМОМі22873 |Т-Мебарап-тей ///777777771111111111110 011 у рМОМі22874 |Т-МЕЕВАЧ Й 7777777777777717177171711719|11СсСс1С у рМОМі22876 |Т-МЕАСІЗОбО0УТв-217777777111111113 0111, рМОМі22878 |Т-МЕОхетай 777777777777711111111111117 01111 рМОМі22881 |Т-МЕЕлТалите 77777776 |ВоЇВв СС рМОМі22882 |Т-МЕРІрІ-таеЯ 777777777777717117111171111118 |В) рМОМі22883 |Т-МЕАСІБЗІ25У10-12177777771111111114 0111, рМОМі22885 |Т-МЕЕ»:ХрРИ-ТаМ 777777777777171717111177 8111, рМОМі22887 |ТМЕРИ-Я22 777777777777777111111111122 (ВС, рМОМі22888 |ТМЕРЕЯ22 77777711 23 (Су рмомі2б122 |Т-МЕЕгєХрИ-Тат 77777717 17111177 |6711СсСсС 00103) Трансформування рослини сої та аналіз ФО5 проводилися як описано в Прикладі 3.
Таблиці 15 і 16 демонструють кількісні середні значення (05 для стабільно трансформованих рослин сої покоління Ко.
Таблиця 15
Середнє значення експресії ОБ у зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба,
ВЗ незрілій насінині, ВЗ бобі, і В5 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління Ко
ЗЕО Зародок | Сім'ядоля ВЗ ВЗ В5
Плазмідний конструкт ІО жовтого | жовтого Незріла б :,
Мо: боба боба насінина об сім 'ядоля
Т-МЕАСІ40914у20-121. | 2 | 572 | 71045 | 9 | 6 | 8
Т-МЕРБІСТ А-2Я 77 | 20 1 210 | зл | 7 | 6 | 6
Т-МЕАСІ45767м28-11:2 | 1 1 71445 | 4264 | 11 | 8 | ШЩ 4-7
АМЕРБІ-Т В-12Я 7777 2117 218 | 774 | 15 | 16 | 60 т-МЕАріЗ-2Я 77777777 | 25 | 683 | 7087 | Й | 1777777 л-МЕМешт-тай | 115 | 459 | 2136 | 7 | 6 | щ 74
АМЕРИСТЯЯ 77777711 1719 1 7109 | 74 | 9 | 6 | щ 42 о г-Мебарап-т2й | 10 1 21 | 745 | 6 | 5 її
Продовження таблиці 15
ТАМЕЕВА-Я2Я 77777777 | 19 | 622 | 772 | 10 | 6 | 00
ТА-МЕАСІЗОбОСУТ6-121 | 3 171319 | 2150 | 8 | 6 | ющ 157
АМЕАржТта 7 | 15 | 4 | 272 | 10 | 9 | Дю
АМЕЕРТалтте | 16 1777717777117171 ло | 9 1 7
ТАМЕРІрі-тал 7 | 18 | 670 | 64 | 8 | 9. щ 5
Т-МЕАСІ5З125У10-ї24 | 4 | 2079 | 4192 | 8 | 6 | 62 -АМЕЕХрИ-тал | 7177 1 527 | 71122 | 15 | 6 | 154
Таблиця 16
Середнє значення експресії (305 у Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, ВІ зрілому листі, ВІ черешку, і АТ квітці трансформованих рослин сої покоління Ко опеменюютх КУ до кр журн рн зон Же ке
Плазмідний конструкт ис З ІО Корі Молодий | Зрілий) Зрілий | Чере- й нтО Мо; орінь лист лист лист шок Квітка
Т-МЕАСІ40914у20-121 | 2 | 23 | 4 | 6 | 4|4|41 4
Т-МЕРБІ-Т А-ї2 120) 29 | 5 | 8 | 6 | з | з | З
Т-МЕАСІ45767м28-112 | 1 | ло | з | 4 | 0 0 | 0 о
АМЕРБ-Т В-Я2Я7 121 | 8 | 5 | 5 | 5| 5 | 6 / 6 т-МЕАріЗ-і21 77777 125| 60 | 26 | 22 | 7 | 8 | 9 | 5 л-МеМейт-2л 1715 8 | 4 | 4 | 010 | 0 о лАМЕРОЄТЛЯ 7 1719, 5 | 5 | 5 | 00 | 0 о т-Мебаран-т21 110 го | 8 | 6 / 8| 6 | 8 / 8
АМЕЕВА-Я2Я 7777777 1791 9 | 3 | з 18 | 15 | 17 | 7 -Міль-і2л 7 130 4 | 13 | 74 | 7 | 5 | 6 6
Т-МЕАСІЗОбО0Ут6-121 З | 7 | 5 | 5 | 00 | 0 о
МОХ 77 117! 7 | 3 | 8 | 010 10 о
АМЕЕРТаїте 1716 8 | 3 | з | 16 | 19 | 179 / 15
ТАМЕРІрі-т2л 1718 715 | 7 | 6 | 8| 4 |з з
Т-МЕАСІ53125У10-ї24 | 4 | 16 | 5 | з (01 0 | о о
АМЕЕХрИ-т2л 1177 | 22 | 8 | ло | 6 | з | з | з
АМЕРН-ї22 7 122| 8 | 6 | 5 | 5 | 6 | 6 / 6
ТАМЕРЕ-Т22 123 | 34 | п | "7 1 6 | 6 | 6 | 6 лАМЕЕХхри-т2л | 7 | 715 | 6 | 8 | 5 | 4 | 4 | 4 00104) Як видно з таблиць 15 і 16, більшість 3 НТО люцерни впливали на експресію конститутивної ЕХР насінини ЕХР-Ст.5рнав1:1:11 (5ЕБЕО ІО Ме: 50), за винятком Т-МІ.Арх-1:11:2 (ЗЕО ІО Ме: 5), яка посилювала експресію СО в ВІ зрілому листі, ВІ сім'ядолі, і В квітці. Деякі З НТО люцерни забезпечували високу експресію в зародку жовтого боба і сім'ядолі жовтого боба, такі як Т-МІАС145767м28-1:1:2 (ЗЕО ІЮ Мо: 1), Т- МІ.!О22-1:271 (5ЕО
ІОЮО Ме: 24) ії Т-МІАС153125М10-12:1 (5ЕО ІО Мо: 4). Тому ці 3 НТО будуть ідеальні для посилення експресії промотора в насінні на пізніх етапах формування насіння. З НТО Т-
МЕЕХрг1-1:271 (5ЕО ІО Мо: 7) забезпечує високий рівень експресії як у В5 сім'ядолі, так і в сім'ядолі жовтого боба порівняно з іншими З' НТО, що може бути вигідно для забезпечення експресії в широкому часовому відрізку розвитку насінини. У деяких випадках 3' НТО, такі як
Т-МЕЕВА-1:2:1 (5ЕО І Ме: 9), Т-МІ.2АТр-1:2:1 (ЗЕО ІО Мо: 30), Т-МІ.Рір1-12271 (5ЕО ІЮО Мо: 18), ї
Т-МЕРІФ-1:2:2 (5ЕО ІО Ме: 23) забезпечують більш рівномірний рівень експресії в насінині, як у зародку жовтого боба, так і в сім'ядолі жовтого боба.
ЇОО10О5| Рослини покоління НО, містять Т-МІ.2АТр-12:и1 (5ЕБО ІО Ме: 30), Т-МЕАрх- 1:12 (ЗЕО ІО Ме: 5), Т-МІ.Бийі1-1:1:2 (5ЕО ІО Ме: 29), і Т-МКЕЕтТа-1:1:2 (5ЕО ІО Ме: 6) дали насіння, яке було висаджено для вивчення покоління Н1. Таблиця 17 демонструє порівняння середніх значень кількісних аналізів цих, рослин покоління НІ, які містять З'НТО люцерни і рослин, трансформованих із застосуванням РМОМ83028, яка містить 3 НТО Т-02р.Еб6-36:171 (5ЕО І
Мо: 40), що отримана з Со55зурійт Брагбадепзе.
Таблиця 17
Середнє значення експресії ЩИ5 у зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба, і В5 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління В1 й - Зародок ,
Плазмідний Опис 3 НТО ЗЕО о жовтого Сім'ядоля | Во конструкт Мо: боба жовтого боба Сім'ядоля рмомі22881 |ТМОЕЕлТалле | 6 | 415 | 1059. | 1 00106) Як видно з Таблиці 17, 3 НТО люцерни впливає на експресію інакше, ніж Т-С20.Еб- 30:11 в зародкових і сім'ядольних тканинах. Наприклад, Т-МІ.Арх-1:1:2 (ЗЕО ІО Мо: 5) ії Т-Мі.5ийі1-1:1:22 (5ЕО ІО Ме: 29) посилюють експресію ЕХР в насінні в зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба, і В5 сім'ядолі, у порівнянні з Т-С20.Еб6-3р:171. Т- МЕЕРЕТа-1:1:2 (ЗЕОІЮО Ме: 6) підсилює експресію в зародку жовтого боба і сім'ядолі жовтого боба, але не в ВА5 сім'ядолі. Т-МІ.2АїТр-1:271 (5ЕБЕО І Мо: 30) знижує експресію на пізніх етапах розвитку зародку жовтого боба і сім'ядолі жовтого боба, однак посилює в К5 сім'ядолі.
Ї00107| Таким чином, кожен конкретний 3 НТО люцерни диференціально впливає на розвиток насіння, коли він функціонально зв'язаний з промотором насіння. Ці відмінності у впливі на експресію можуть бути використані для забезпечення більш точного та індивідуального підходу регуляції експресії в насінні і може ідеально підходити для "тонкої настройки" профілю експресії конкретно молекули ДНК, що транскрибується, для забезпечення експресії в насінні.
Приклад 5
Аналіз впливу 3 НТО на конститутивну експресію (05 у стабільно трансформованих рослинах сої
ЇО0О10О8)| Рослини сої були трансформовані за допомогою векторів, зокрема плазмідних конструктів, для встановлення впливу окремих 3 НТО люцерни на експресію. Зокрема, рослини сої трансформували векторами, які містять 2 різних конститутивнх послідовності ЕХР, які керують експресією трансгена ВД-глюкуронідази (405) функціонально зв'язаного з 3 НТО
Зо люцерни. Ці рослини сої що трансформовані за допомогою 3 НТО від люцерни порівнювалися з трансформованими рослинами сої, в яких експресія трансгена СИ5 функціонально зв'язана з 3 НТО отриманої з Соззурішт Багбадепзе.
ЇО0О109| Рослинні вектори, використані в цих експериментах були сконструйовані з використанням способів клонування відомих в цій галузі техніки. Отримані вектори, містили ліву граничну ділянку від А. їштеїасієпе; першу трансгенну експресійної касету для відбору трансформованих рослинних клітин, що проявляють стійкість до антибіотика спектиномицину (яка керується промотором Асіїп 7 арабідопсису); другу трансгенну експресійної касету для аналізу активності З НТО, що містить елементи експресії ЕХР- ЕХР-Саму.355- епп-РАИ.ОпакК:1:З (5ЕБЕО ІО Ме: 42) або ЕХР-бамм.Рт:1:2 (5БО ІО Ме: 51), функціонально зв'язану 5'-кінцем з кодуючою послідовністю (505, яка містить інтрон, що вирізається (405-2,
ЗЕО ІО Мо: 44), який функціонально зв'язаний з 5і-кінцем 3' НТО, яка отримана з Медісадо типсаїша або Соз5зуріит Багбадепзе; і праву граничну ділянку від А. Шптеїасієпе. Вектори, які містять 3 НТО отриману з Медісадо ігипсаїша: рРМОМ118768, РМОМ153701 і рРМОМ116803.
Вектори, які містять З НТО отриману з Сюов5зуріит Баградепзе: РМОМ121042 і рРМОМ102167.
Ї00110| Таблиця 18 демонструє плазмідні конструкти, з відповідними елементом ЕХР, З
НТО і 5ЕО ІО Мо, що використані для трансформації рослин сої, представлених в цьому
Прикладі.
Таблиця 18
Плазмідні конструкти, які використовуються для трансформації рослин сої, відповідні ЕХР і 3 НТО
Плазмідний ЕХР З нт д Опис ЕХР ЗЕОІЮ Опис З НТО ЗЕО І конструкт Мо: Мо:
ОМОМ121042 | ЕХР-бамум.гт:1:2 51 0 |Т-ОБ6.Е6-36И
ОМОМІ118768 | ЕХР-бамум.гт:1:2 51 0 |Т-Мі.баїї3-2-1:2:1
ОМОМ153701 | ЕХР-бамум.гт:1:2 5100 |Т-МЕСАС140914у20-1:2:1
ОМОМ102167 | ЕХР-Саму.355-еєпп-Ри.ОпакК:ї:3 | 0042 |Т-2Б.Еб6-3Б:1
ОМОМІ122866 | ЕХР-Саму.355-еєпп-Рп.Опак:ї:3 | 0042 | Т-Мі.Заїї3-2-1:2:1
ОМОМ116803 | ЕХР-Самм.355-еєпп-Ри.Опак:ї:3 | 0042 |Т-МЕАС140914у20-1:2:1 00111) Трансформування рослини сої та аналіз (05 проводився як описано в Прикладі 3.
Таблиці 19 і 20 демонструють кількісні середні значення (05 для стабільно трансформованих рослин сої покоління Ко.
Таблиця 19
Середнє значення експресії (05 у Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі,
ВІ зрілому листі, НІ черешку, і В1 квітці трансформованих рослин сої покоління Но мп5 Упь Уп5 ВІ ві
Опис ЕХР Опис З НТО й Молодий)! Зрілий | Зрілий ВА1 Квітка
Корінь Черешок лист лист | лист
ЕХР-бамм.єит:1:2 | Т-саБ.Еб6-36:1:1 780,79 | 688,93 ) 509,35 | 320,02| 379,69 | 467,94
ЕХР-бамум.єт:1:2 | Т-Мі. Заїї3-2-1:2:1 4782,43 | 1009,59 |1208,48| 363,55 | 1425,76 | 1398,80
ЕХР-раму. іти |1ДАСТЮВТЯУЙО |3792,66|725,38 1106,9 1831,99 4792,28 | 739,97
ЕХР-Самм.355- 4. еппа РИ. Опак-1 3 тТ-Ср.Еб-367 71 400,90 | 551,61 | 605,29 | 350,93 ЩІ д12,30
ЕХР-СаМУ3587 | Меваїйд-о-і2 0227470 |117610 |1490,541976,91 753,02. | 45,26 епп--РИ.Опак:1:3
ЕХР-Самм.355- Т-МІ.АС140914у20- еппа РИ. Опак-1 3 ТМСТОвТЬЯО 806,76 2269,95 |2187,61| 344,78 | 480,47 | 243,11
Таблиця 20
Середнє значення експресії ЩОБ у зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба, і В5 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління Во
Заро- Сім'ядоля З ВЗ в5
Опис ЕХР Опис З НТО д жовтого | Незріла о, жЖовто- й боб сім'ядоля боба насінина го боба
ЕХР-баму.гит:1:2 | Т-ср.Е6-30:1.1 104,58| 115,16 340,02 859,14 64,18
ЕХР-баму.мРит:1:2 | Т-МІ.Заїї3-2-1:2:1 1582,51| 832,99 84,88 1157,18 247,15
ЕХР-раму. Ріта |1ДРАСТЯОВІЯУ?О |евіл4 лова | 456,55 | гаБББЗ | Вб1И
ЕХР-Самм.355- 4. еппа РИ. Опак-1 3 Т-СБ.Е6-3Б:1.1 47,86 49,45 67,45 433,54 101,34
ЕХР-Самм.355- . зв. схем |тМевайелтй безе? | 00100000 593
ЕХР-Самм.355- Т-МІ.АС140914у20- еппа РИ. Опак-1 3 100,42| 181,62 209,92 467,72 190,51
І00112| Як представлено в Таблицях 19 і 20, 3 НТО люцерни Т-МІ.Заїї3-2-1:271 (5ЕО
ІО Мо: 26) ії Т-МІАС140914ми20-1:271 (5ЕО ІО Мо: 2) впливають на експресію конститутивного елемента ЕХР ЕХР-Ваму.гІ Т1:2 (5ЕО ІО Ме: 51) інакше, ніж 3 НТО Т- С2р.ЕеЕ6-3Б:11 (5ЕО ІО
Мо: 40) отриманий з (хо55урішт Багтадепбе. У багатьох зразках тканин спостерігалося посилення експресії при використанні З НТО люцерни. Що стосується 3 НТО люцерни Т-
МІ.АС140914у20-1:2:1, посилення спостерігалося в більшості тканин рослин, також містять елемент ЕХР ЕХР-Саму.355-епп-РИ.ЮОпак:1:3 (5ЕО ІО Ме: 42). Таблиці 21 і 22 демонструють кратність відмінностей в кількісній експресії СО, по відношенню до експресії, забезпеченої рмМОМ121042 (Т-С26.Еб6-30:11 (5ЕБЕО ІО Мо: 40)), що містить 3 НТО , отриману з Сювззурійт рагбадепзе.
Таблиця 21
Кратність змін експресії у Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі,
В1 зрілому листі, АТ черешку, і ВІ квітці трансформованих рослин сої покоління В:
Упь
Уп5 ВІ ВІ орінь дий Квітка лист лист шок лист
ЕХР-раму. РТ с2 | Т-О6Б.Еб-367 1
ЕХР-раму. Р-т 2 | Т-Мі.ЗаїїЗ-2-121
ЕХР-Ваму.вРІт:1:2. | Т-МІАС140914му20-1:2:1 12,62
ЕХР-Саму.355- 4.
ЕХР-Саму.355- ! в.
ЕХР-Саму.355- а.
Таблиця 22
Кратність змін експресії у зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба, і 25 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління Ві
Зародок Сімя: З в
Опис ЕХР Опис З НТО жовтого жовтого Незріла| ВАЗ боб сім'я- боба насінина доля боба
ЕХР-раму. РТ: 1:2 | Т-О6Б.Е6-3Б:1 1
ЕХР-Юаму.вІ-т:1:2. | Т-Мі.баїї3-2-1:2:1 15,13
ЕХР-Баму.нІ Т:1:2. | Т-МІ.АС140914у20-1:2:1 13,42
ЕХР-Саму.355- 4.
ЕХР-Саму.355- ! зв.
ЕХР-Саму.355- а. 00113) Вищезазначені експерименти демонструють, що кожен 3' НТО люцерни має різний ефект она рівень експресії кожного з конститутивних елементів ЕХР, зв'язаних з рМОМм121042 (Т-26.Е6-36:171 (5БО ІО Мо: 40), що містить 3 НТО, отриману з Соз55зурійт рагбадепзе. Наприклад, експресія ЕХР-Вбаму.гРІ Т:1:2 підсилювалася в 1.14-15.13 разів у Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, НІ зрілому листі, АТ черешку, НІ квітці, в зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба, ВЗ бобі і В5 сім'ядолі, однак зменшувалася в ВАЗ незрілій насінині при використанні Т-Мі.Заїї3-2-1:2:1. Цей же ЕХР, при комбінуванні з
Т-МЕАС140914у20-1:2:11 приводив до 1.34-13.42-кратного посилення експресії в Мп5 корені,
Мп5 зрілому листі, ВІ! зрілому листі, ВІ! черешку, НІ квітці, в зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба, З бобі, З незрілому зерні і 85 сім'ядолі, проте зберігав ті ж значення, що і Т-С26.Е6-30:1:11 (5ЕО ІО Ме: 40) в Мп5 молодому листі. Експресія в зародку жовтого боба була близько в 2 рази вища ніж у сім'ядолі жовтого боба при використанні Т-
МІ. ЗаїїЗ-2-1:2:1 (15,13-проти 7,23-кратне посилення), в той час як експресія була практично однаковою в цих двох тканинах при використанні Т- МІАС140914му20-1:2:1 (9,19- проти 9,13- кратне посилення). Що стосується елемента ЕХР ЕХР-Самум.355-епп--РиИ.ОпакК:1:3, комбінація з Т-МСАС140914у20-122:11 продемонструвала менше посилення експресії в багатьох зразках тканин, у порівнянні з тими самими 3' НТО, комбінованими з ЕХР-Баму.рІ Т:1:2. В ВІ1 квітках спостерігалося зниження експресії щодо /Т-(026.Еб-3Б:1:11, коли ЕХР-Саму.355- епп-РиИ.Опак:1:3 комбінувався з Т-МІАС140914му20-1:2:1. Комбінування ЕХР-Самум.355- епп-Ри.Опак:1:З з Т-Мі.ЗаїїЗ-2-122:11 забезпечувало посилення експресії в Мп5 корені, Мп5 молодому листі, Мп5 зрілому листі, ВІЇ зрілому листі, Її черешку, в зародку жовтого боба і сім'ядолі жовтого боба, однак знижував експресію в НІ квітці і В5 сім'ядолі по відношенню до Т- СБ.Еб6-3671:1 (ЗЕО ІО Ме: 40).
ЇО0114| Кожна з двох 3 НТО люцерни Т-Мі.Заїї3-2-1:2:11 і Т-МІАС140914у20-1:27 впливала по-різному на експресію різних конститутивних елементів ЕХР ЕХР- раму. т:1:2 і
ЕХР-Саму.355-епп-РиИ.ЮОпакК:1:3 по-різному. У більшості тканин спостерігалося посилення експресії в порівнянні з Т-С246.Е6-3Б:1:1 (5ЕО ІО Ме: 40), однак в деяких тканинах спостерігалося зниження експресії. Таким чином, при використанні різних З3' НТО люцерни можливо більш точно контролювати експресію в рослині і "тонко налаштовувати" експресію специфічних молекул ДНК, що транскрибуються, щоб забезпечити оптимальну експресію, де потрібно експресія молекул ДНК, що транскрибуються в той же час знижуючи експресії в тканинах, де це може негативно вплинути на рослину.
Приклад 6 3 НТО Медісадо ігипсаїша Т-МІАС145767м28-1:1:2 призводить до посилення транскрипції при комбінуванні з різними ЕХР в стабільно трансформованих рослинах сої
ЇО0О115| Рослини сої були трансформовані за допомогою векторів, зокрема плазмідних конструктів, для встановлення впливу З НТО люцерни Т-МЕАС145767м28-1:1:2 (5ЕО ІО Ме: 1) на експресію. Зокрема, рослини сої трансформували векторами, які містять кілька різних
ЕХР, з конститутивним профілем експресії що контролює експресію трансгена р-
Зо глюкуронідази (2405) функціонально зв'язаного з 3 НТО люцерни Т-МІ.АС145767м28- 1:12 (ЗЕБЕО 10 Ме: 1). Ці рослини сої, трансформовані за допомогою 3 НТО від люцерни порівнювалися з трансформованими рослинами сої в яких експресія трансгена 05 керувалася конститутивним промотором, і трансген БОБ функціонально зв'язаний з 3 НТО отриманої з Сх5о55уріит Багбадепзе.
ЇО0116| Рослинні вектори, використані в цих експериментах були сконструйовані з використанням способів клонування, відомих у цій галузі техніки. Отримані вектори, містили ліву граничну ділянку від А. Шштеїасієпе; першу трансгенну експресійну касету для відбору трансформованих рослинних клітин, які виявляють стійкість до антибіотика спектиноміцину (що керується промотором Асіїп 7 арабідопсису); другу трансгенну експресійну касету для аналізу активності З3' НТО Т-МІАС145767м28-11:2 (5БО ІО Ме: 1), що містить ЕХР: ЕХР-
МІЕАС145767м28:1:1 (5ЕО ІО Мо: 35), ЕХР-Саму.355- епп-Ри.Опакил:3 (5ЕО ІО Мо: 42), ЕХР-
ВЗАСУММ.РІ Т:1:2 (5ЕБО 10 Мо: 52), ЕХР- СЕВМ.РГ Т:1:2 (5ЕО І Ме: 53), ЕХР-баму.РІ т: 2 (ЗЕО ІО Мо: 51), ЕХР-СОСте.еЕнТа::1 (5ЕО ІЮО Мо: 54), або ЕХР-МІ.Орд2:1:2 (ЗЕО ІЮО Мо: 31) функціонально зв'язану 5'-кінцем з кодуючою послідовністю для (305, яка містить інтрон, що вирізається (005-2, 5ЕБЕО ІЮО Ме: 44), яка функціонально зв'язана 5-кінцем з 3 НТО, що отримана з Меадісадо Ігипсайціа або з 3' НТО Т-с65.Є6-36:1 71 (5ЕО ІО Мо: 40) або Т-СЮ.РБІ 2-1: 71 (ЗЕБЕО ОО Мо: 41), що отримана від Сюззурішт Баградепзе; і праву граничну ділянку від А. їмітеїасієп5. Вектори, які містять Т-МІАС145767м28-1:112 (5БО ІО Ме: 1): рМоОМ118798, рМОМ116815, РМОМ118769, рРМОМ153709, РМОМ118771, РМОМ153707 і РрРМОМ155502.
Зокрема вектор РМОМ118798 містить нативний ЕХР-МІАС145767м28:1:11, який складається з промотора, функціонально зв'язаного з лідером, клонованим з того ж локусу гена, що і з3'
НТО Т-МіЕАС145767м28-1:11:2 (5БО 10 Ме: 1). Вектори, які містять 3 НТО отриману з
Сюззуріит Багфадепзе: рМОМ102167, рРМОМ113874, РМОМ121030, рРМОМ121042, РМОМ140827 і РМОМ125841.
ЇО0117| В таблиці 23 наводяться плазмідні конструкти, які містять відповідний елемент
ЕХР, 3' НТО і 5ЕО ІЮО Ме використані для трансформації рослин сої, представлені в цьому
Прикладі.
Зо
Таблиця 23
Плазмідні конструкти, використані для трансформації рослин сої і відповідні ЕХР та 3' НТО
Плазмідни ЕХР З нТо
Опис ЕХР 5ЕО І Опис З НТО 5ЕОІЮ конструкт Мо: Ме:
ОМОМІ1 18798 | ЕХР-МІ.АС145767у28:1 1 Т-МЕАС145767у28-1:1:2.
ЕХР-Саму.355- 4.
РМОМ102167 | єппиРН.Опак-1:-3 Т-СБ.Е6-361 1
ЕХР-Саму.355- 4.
РМОМ116815| «пп иРИ.Опак-1 З Т-МЕАС145767м28-1:1:2
ОМОМІ1 13874 | ЕХР-В5АСУММУ. ГІ-Т1:2 Т-С5.Е6-361:1
ОМОМІ 18769 | ЕХР-В5АСУММУ. ГІ-Т1:2 Т-МЕАС145767у28-171:2
ОМОМ121030 | ЕХР-СЕВУ. РІ-Т:1:2 Т-С5.Е6-361:1
ОМОМ153709 | ЕХР-СЕВУ. РІ-Т:1:2 Т-МЕАС145767у28-1:1:2. оМОМ121042 | ЕХР-раму. РІ-Т:1:2 Т-С5.Е6-361:1
ОМОМ118771 | ЕХР-раму. РІ-Т:1:2 5100 |Т-МЕАС145767му28-1:1:2
ОМОМ140827 | ЕХР-СОСте.еЕЕТа: 1 Т-СБ.ЕБІ 2-11
ОМОМ153707 | ЕХР-СОСте.еЕЕТа: 1 Т-МЕАС145767у28-1:1:2.
ОМОМ125841 | ЕХР-МІ.Орд2г:1:2 031000 1Т-СБЕБІ 2-17
ОМОМ155502 | ЕХР-МІ.Орд2г:1:2 Т-МЕАС145767у28-1:1:2. 00118) Трансформування рослин сої та аналіз 755 проводився як описано в Прикладі 3.
Таблиці 24 ї 25 демонструють кількісні середні значення (305 для стабільно трансформованих рослин сої покоління Но. Клітинки, позначені як "ндр" позначають тканини, які проаналізовані, однак експресія в них була нижче рівня детекції. Таблиці 26 їі 27 демонструють кратність змін експресії кожного елемента ЕХР, функціонально зв'язаної з Т-
МІ.АС145767м28-1:1:2 у порівнянні з Т-26.Е6-36:и171(5ЕО ІО Ме: 40).
Таблиця 24
Середнє значення експресії ЩОБ у Мп5 корені, Мпи5 молодому листку, Мп5 зрілому листку,
ВІ зрілому листку, НІ черешку, і В1 квітці трансформованих рослин сої покоління Но
Уп5 мабо о Моло-| 079 | ВТО АТО) ду у Уп5
Опис ЕХР Опис З НТО : в Зрілий | Зрілий | Чере-|,,.. Ко-
Корінь дий Квітка! . листок ЛИСТОК шок рІіНЬ листок
ЕХР-МІАС145767 | Т-МЕАС145767 28-14 умов. 41-42 59,00 | 71,00 | 32,00 | 34,00 |33,00 23,00 Я
ЕХРСаМУ3587 т -овеб-зьи | 400,90 | 618,03 551,61 | 605,29 350,93 412,30 епп-РиИ.ЮОпак:1:3
ЕХР-Саму.355- Т-МЕАСІ145767 1393,61| 1001, еппаРи.Опак-ї З умов. 41-42 381728 Щ 1939,40 | 3250,38 ТАЄ ТВ Івтв ов
ЕХР- дл.
В5АСУММ ІТ? Т-СБ.Е6-361 | 11112 Щ 19,96 | 19,46 17,47 | 88,14 | 64,38
ЕХР- Т-МЕАС145767 1380,
ВеАСУМУ. РТ о умов. 41-42 6514,58 |1081,72| 477,98 | 419,52 оотт2| ЗО 581,97
ЕХР-СЕВМ.РІ Т:1:22 |Т-06.Е6-30и:и 01 378,02| | 34415 | 480,25 | 177,64285,151130,87 дл. Т-МЕАС145767 2995,01| 5071, | 3608,
ЕХР-СЕВМ.РШТИ2 | ов. 440 671126 ЩІ 1618,72 | 3262,73
ЕХР-Баму.гіт:1:2 |Т-О5.Е6-3Б:1 1 780,79| 688,93 | 509,95 ІЗ20,02І379,691467,94 4. Т-МІЕАС145767 2313, | 3610, | 2191,
ЕХР-раму.Рити2 | ов. 4410 9322,50 |3655,79 5870,15 | 3923,47
ЕХР- 4,
СусСте еєвтач Т-СБ.ЕрБІ 2-1:11:11 | 189,24 |153,52| 59,60 ) 37,44 |103,011130,601130,38
Продовження таблиці 24
ЕХР- Т-МЕАСІ45767 1628,
Состееввіачя ов зобов! 160,99 | 216,21 тала 05,97
ЕХР-МІ. ба? 2 т-вр.грі2-1:1:1 | 800,93 Щ 202,73 | 275,48 143,60 Та" 48213
ЕХР-МІ. ба? 2 пол 855,00 Щ 293,68 | 1118,76 |(254,25І875,67 398,10
Таблиця 25
Середнє значення експресії (05 в зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба,
ВЗ незрілому насінні, ВЗ бобі і В5 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління Ко
Ток доля Аз ВЗ Но
Опис ЕХР Опис З НТО жовтого жовтого Незріле боб Сім'я- боба боба насІння доля
ЕХР-МІ.АС145767у28:1:1 ІМБетавтвлеВ: 3100 | 27,00 ндоондоо | 26,00
ЕХР-Саму.355- т
ОРЕ лак Т-ФБ.Еб-36 4786 4945 | 67,45 | 433,54 | 101,34
ЕХР-Саму.355- Т-МЕАСІ45767у28-
ОРЕ лак ТЛЕЛСТІБУВИМИВ зов оз 1192,69 | 98947 2309,72| 566,93
ЕХР-ВЗАСУМУ БІТ 2 000 1Т-ОБЕ6ЗБЯ 28311 62631 2408 |115,001 1135
ЕХР-В5АСУМУ. РІ. т? ІМБетавтвлеВ: 547,4? 207,69 | 12815 | 92748| 65,67
ЕХР-СЕВУ ЕТ? Т-СБЕб-3Б 68,57 | 7012 6442 |264621 3443
ЕХР-СЕВУ.РІ т 2 ІМБетавтвлеВ: 1474,35 4242,09 | 244101 |7209,69| 900,82
ЕХР-Ббаму ЕТ? Т-СБЕб-3Б 104,58 115,16 1 340,02 | 8591141 6418
ЕХР-ВОВМУ. БІТ 2 ІМБетавтвлеВ: 2806,65| 1814,87 | 518,90 |3720,59| 401,66
ЕХР-СОСтееЕнтал Т-СБЕБІ2-11 200281 291,26 | 58,21 | 131,17 | 11429
ЕХР-СОСте еЕЕТач ІМстаБувлиВ: 1029,69| 1883,48 | 209,77 |1122,51) 521,64
ЕХР-МІОБба2:12 ТОБ ЕБІ2-1:1 129,84 8345 1 40015 875751 72,66
ЕХР-МЕОбд2 12 ІМБетавтвлеВ: о 247,18 1324,98| 352,81
Таблиця 26
Кратність змін експресії в Мп5 корені, Ми5 молодому листку, Мп5 зрілому листку,
ВІ зрілому листку, НІ черешку, і В1 квітці трансформованих рослин сої покоління Ві
Уп5 мпа5 | Ві |. ві
Опис ЕХР Описз'нто | 079 | Моло-| зрідий| Зріли Череші
Корінь| дий - Квітка лист и лист ок лист
ЕХР-Саму.355- т впирьрлаюта 00 поевезьий оо | оо | лою оо
ЕХР-СаМУ.355- Т-МЕАСІ45767
ЕХР-ВЗАСУММ.БРІ ТИ 2 | Т-О6.Еб-3Ь 1
ЕХР-ВЗАСУМУ ІТИ 0 БВез | 2394 21,56 1303 | 15,67
ЕХР-СЕВУ.РІ-Т:1 22 Т-СБ.Е6-36 1
ЕХР-СЕВУ.НІ.Т 2 МАВ 17л 470 вл9 1686 17,79 27,57
Продовження таблиці 26
ЕХР-БбаМУ. РТ 2 Т-ср.Еб6-361 1
ЕХР-СОСтеевРтай:и |Т-ср.РоГ2-1:1
ЕХР-СИСтеевттали У 125 1247
ЕХР-МІШбрда:1 2 т-свр.гБі 2-11
ЕХР-МЕОбд2 12 ТМЕАСТ5ИвИУ 1107 | 145 | 406 | 177 | 073... 083 м28- 1:11:2
Таблиця 27
Кратність змін експресії в зародку жовтого боба, сім'ядолі жовтого боба,
ВЗ незрілому насіння, ВЗ бобі, і В5 сім'ядолі трансформованих рослин сої покоління. ВІ
Зародок Сімя: З ВЗ дь
Опис ЕХР Опис З НТО жовтого д незріле сім'я- жовтого й боб боба насіння доля боба
ЕХР-Саму.355- 4.
ЕХР-Саму.355- Т-МІ.АС145767м28-
ЕХР-ВБАСУМУ.РІТ:2 | Т-06.Еб-367
ЕХР-СЕВУ. РТ 2 Т-ср.Еб6-361 1
ЕХР-СЕВУ.РІ ТИ 2 ІМБИСТВІВЛЯВ ово | воБО | 3789 | 2725 | 2616
ЕХР-БбаМУ. РТ 2 Т-ср.Еб6-361 1
ЕХР-ОЗМУ. НІ ТИ 2 ТІМ СТВІВЛЯВ І оввя | 1576
ЕХР-СОСте.еЕЕТа: 7 Т-СБ.ЕБІ 2-1:1 1
ЕХР-МІШбрда:1 2 тр. гбі2-1717 Ї7777717117177771717117 1 лоо | оо | оо
ЇО0119| Як представлено в таблицях 24 і 25, 3 НТО люцерни Т-МІАС145767ми28-1:1:2 (ЗЕО ІО Ме: 1) підвищувало експресію шести конститутивних елементів ЕХР, у порівнянні з Т-
СЬ.Еб6-3671:1(5ЕО ІО Мо: 40), але в різних випадках залежно від конкретного елемента ЕХР і тканини. Елемент ЕХР ЕХР-МІ.АС145767м28:1:11, коли використовувався для контролю (305, функціонально зв'язаний з його нативної НТО Т-МІАС145767м28-1:1:22 експресувався дуже слабо у всіх проаналізованих тканинах і був не виявлений в ВЗ незрілому насіння, ВЗ бобі і
ВІ квітці. Деякі тканини рослин, які містять елемент ЕХР ЕХР-МІОрд2:1:2 її 3 НО Т-
МІЕАС145767м28-1:11:2 демонстрували зниження експресії, порівняно з комбінацією ЕХР-
МЕ ОБаг:1:2 ії Т-Ср.ЕБІ 2-1:111. Це зниження експресії спостерігалося в ВЗ незрілому насінні,
ВІ квітці і 81 черешку, на відміну від Ми5 молодого листка і Н5 сім'ядолі, де експресія зростала більше ніж у чотири рази. У Мп5 корені не спостерігалися зміни експресії з ЕХР-
МІ. ОБба?2:1:2 і будь-3' НТО.
ІЇ00120| Групи регуляторних елементів експресії ЕХР-СЕВМ.РІ 1:12 і ЕХР-ВБаму.гІт1:2 забезпечували найвищий рівень експресії. Як продемонстровано у таблиці 26 і 27 ці два ЕХР підвищувалися у всіх тканинах з Т-МІАС145767м28-1:11:2 у порівнянні з тими ж ЕХР, комбінованими з Т-С20.Е6-3Б6:1:1(5ЕО ІО Мо: 40). Група регуляторних елементів експресії ЕХР-
СЕВМУ.РІ Т:1:2 посилювалася в 60,50 раз в сем'ядолі жовтого боба і менше в зародках жовтого боба (21,50 рази), в той час як група регуляторних елементів експресії ЕХР-баму.вт1:2 найбільш посилювалася в зародку жовтого боба, на відміну від сім'ядолі жовтого боба (26,80 раз проти 15,76 разів відповідно). Ці відмінності в експресії і стимуляції дають можливість забезпечити спеціалізовану експресію трансгена на пізній стадії розвитку насінини. Група регуляторних елементів експресії ЕХР-В5АСУММ. РІ Т:1:2 експресується найбільшою мірою в
ВАЗ бобі і Мп5 корені при комбінуванні з Т-С20.Еб- З3р:1:1 (див. Таблиці 25 і 26). Експресія
ЕХР-ВБАСУММ.РІ Т:122 в цих двох тканинах помітно зростала при комбінуванні з Т-
МІЕАС145767м28-1:1:2, особливо в Мп5 корені. Крім того експресія ЕХР-В5АСУММ. РІ Т:1:2 зростала до 58,63 раз при комбінуванні з Т-МІАС145767му28-1:1:2 у порівнянні з тією ж ЕХР, комбінованою з Т-(246.Е6-30:1:19 (5ЕО ІО Мо: 40).
ЇОО121| Загалом, 3 НТО Медісадо Шипсаїша Т-МІАС145767м28-1:112 (5БО ІО Ме: 1) посилювала експресію шести різних конститутивних ЕХР, які були отримані з ДНК геному рослин і генома вірусів рослин. Крім того, ця 3 НТО посилювала експресію ЕХР ЕХР-
Ст.5Зрпав1:171 (5ЕО ІО Ме: 54) у насінні, порівняно з більшістю інших З' НТО, отриманих з люцерни. Відповідно, ця З НТтТО підходить для забезпечення підвищеної експресії промотору або комбінації функціонально зв'язаних елементів експресії в конструкті.
Приклад 7
Аналіз ЕХР-МІ Обд2г:1:2 (З5ЕО ІО Ме: 31) у стабільно трансформованих рослинах сої
ІЇ00122| Рослини сої були трансформовані за допомогою векторів, зокрема плазмідних конструктів, які містять конститутивну групу регуляторних елементів експресії ЕХР- МІ.Орд2г:12 (ЗЕО ІО Мо: 31), функціонально зв'язану з коюодуючою СИ послідовністю. Ці трансформовані рослини потім аналізували на експресію СО5 у стабільно трансформованих рослинах.
ЇО0123| Рослинні вектори, використані в цих експериментах були сконструйовані з використанням способів клонування, відомих в цій галузі техніки. Отримані вектори, містили ліву граничну ділянку від А. Шштеїасієпе; першу трансгенну експресійну касету для відбору трансформованих рослинних клітин, які виявляють стійкість до антибіотика спектиноміцину (що керується промотором Асіїп 7 арабідопсису); другу трансгенну експресійну касету для аналізу активності ЕХР-МІ.ОБд2:1:2 (5БО 10 Ме: 31), яка містить ЕХР-МіЕОрд2:1:2 функціонально зв'язану з 5'-кінцем кодуючої послідовністі для Д- глюкуронідази (205), яка містить інтрон, що вирізається (405-2, ЗЕО ІЮО Мо: 44), яка зв'язана 5-кінцем з 3' НТО Т-
Коо) МІ.АС145767м28-1:1:2 (5ЕО ІО Ме: 1), отриманої з Медісадо ШМипсаїша або з 3 НТО Т-СБ.Еб6- 30:11 (БО 10 Ме: 40) або Т-Ср.РрІ2-1:1171 (5БО ІО Ме: 41), отриманої від Сов5зурійт
Брагбадепзе; і праву граничну ділянку від А. їштегасіепв5.
І00124| Отримані вектори використовували для трансформації рослин сої як описано в
Прикладі 3. Таблиці 28 і 29 демонструють кількісні середні значення експресії 205 в різних тканинах та на різних етапах розвитку для стабільно трансформованих рослин сої.
Таблиця 28
Середнє значення рівня експресії СО5 в листку, корені і квітці стабільно трансформованої рослини сої, що містить ЕХР-МІ.Орд21:2 (ЗЕО ІО Мо: 31)
Упь о. Уп5 ВІ
Плазмідний , Уп5 Моло- п вия ВІ ВІ листок | листок листок
Таблиця 29
Середнє значення рівня експресії (05 у бобі, тканинах насінини стабільно трансформованої рослини сої, що містить ЕХР-МІ.Ордг:1:2 (ЗЕО ІО Мо: 31)
Сім'яд . й Зародок ВЗ
Плазмідний Опис З НТО жовтого Оля Незріла ВЗ боб : Во конструкт боба Жжевтого асінина сім'ядоля боба рМОМмі55502|Т-МЕАС145767м28-1с2| 247,18 |1324,98| З5281
І0О125| Як було продемонстровано в таблиці 28 і 29 ЕХР-МІЮОБрд2:11:2 (5ЕБО ІО Ме: 31) здатний контролювати конститутивну експресію молекули ДНК, що транскрибується у стабільно трансформованих рослинах сої. Також різні З НТО проявляли різну ступінь експресії в кожній тканини. Наприклад, комбінування ЕХР-МІ.Орд2:1:2 з Т-2р.Еб6-3Б:1:11 призводило до низької експресії у всіх проаналізованих тканинах, порівняно з іншими двома 3 НтТО Т-
СБ.ЕБІ 2-1:1111 їт- МЕАС145767м28-1:1122. Однак, незалежно від того, яка 3 НтТО використовувалася, ЕХР- МІ.Орд2:11:22 виявляла конститутивну експресію в діапазоні від середньої до високої, ступінь якої може бути змінена шляхом вибору 3 НТО, яка буде функціонально поєднана з ЕХР.
Приклад 8
Енхансери, отримані від регуляторних елементів
І00126| Енхансери можуть бути похідними промоторних елементів, запропонованих в цьому документі, таких, які представлені в 5ЕО ІЮО Мо: 32 і 36. Енхансерний елемент може мати один або більше цис-регуляторних елементів, які, у разі, коли вони функціонально зв'язані через 5' чи З' кінець з промотором, або через 5'чи 3' з додатковим енхансерним елементом, який функціонально зв'язаний з промотором, можуть підвищувати або модулювати експресію ДНК, яка транскрибується або забезпечити експресію ДНК, яка транскрибується в конкретному типі клітин або органі рослини, або на конкретній тимчасовій точці в розвитку чи циркадному ритмі. Енхансери створюють шляхом видалення ТАТА-боксу або функціонально подібних елементів і нижчезазначених послідовностей, що дозволяє ініціювати транскрипцію з промоторів, у тому числі їхніх фрагментів.
І00127| Енхансерні елементи можуть бути отримані з промоторних елементів, описаних у цьому документі, та клоновані з використанням способів, відомих в цієї області техніки, таким чином, щоб вони були функціонально зв'язані через 5'- 3 кінець з промоторним елементом або функціонально зв'язані через 5'- 3' кінець з додатковими енхансерними елементами, які функціонально зв'язані з промотором. В альтернативному варіанті енхансерні елементи клонують, використовуючи способи, відомі в цій області техніки, таким чином, щоб вони
Зо були функціонально зв'язані з однією або більше копій енхансерного елемента, який функціонально зв'язаний через 5'- 3' кінець з промоторним елементом або функціонально зв'язаний через 5'- 3 кінець з додатковими енхансерними елементами, які функціонально зв'язані з промотором. Надалі, енхансерні елементи також можуть бути клоновані таким чином, щоб вони були функціонально зв'язані через 5'- 3' кінець з промоторним елементом, отриманим з організму іншого роду, або функціонально зв'язані через 5 - 3 кінець з додатковими енхансерними елементами, отриманими з організмів іншого роду або організму того ж роду, які функціонально зв'язані з промотором, отриманим з організму того або іншого роду, в результаті чого утворюється химерний регуляторний елемент. Експресійний вектор з геном (5 для трансформації рослин, створений з використанням способів, відомих в цій області техніки, подібно до генетичних конструкцій, описаних у попередніх прикладах, в яких підсумкові рослинні експресійні вектори містять праву граничну область
А. Штеїасієп5, першу трансгенну селекційну касету, яка надає стійкість до антибіотика або гербіциду, і використовується для вибору трансформованих рослинних клітин; і другу касету трансгена, в якому енхансерний елемент, функціонально зв'язаний з промотором, створюючи химерний промоторний елемент, який функціонально зв'язаний з 5 лідером, який функціонально зв'язаний 5' кодуючою послідовністю (305, яка містить інтрон, який вирізається (405-2, ЗЕО ІО Ме: 44), функціонально зв'язаний з 3' НТО, такий як Т-С2р.Еб-3Б: 1: 1 або будь- який з описаних вище з Медісадо мипсаїцшіа; і правою граничною ділянкою з А. Штеїасієпв.
00128) Експресія гена СБ під контролем регуляторного елемента, який містить один або більше енхансерів, оцінюється при випробуваннях рослин зі стабільною трансформацією або з транзієнтною експресією для визначення впливу енхансерного елемента на експресію молекули ДНК, яка транскрибується. Модифікації одного або більше енхансерних елементів або дуплікація одного або більше енхансерних елементів здійснюється на основі емпіричних досліджень та підсумкової регуляції експресії генів, що спостерігається при використанні композиції кожного регуляторного елемента. Зміна відносних позицій одного або більше енхансерів в підсумковому регуляторному або химерному регуляторному елементі може впливати на транскрипційну активність або специфічність регуляторного або химерного регуляторного елемента і визначається емпірично для визначення найкращих енхансерів для бажаного профілю експресії трансгена у межах рослини кукурудзи або рослини іншого роду.
Приклад 9
Аналіз впливу З'НТО на експресію конститутивної СО у стабільно трансформованих рослинах кукурудзи
ЇО0129| Рослини кукурудзи були трансформовані бінарними плазмідними конструктами для оцінки впливу З НТО Т-МіОхІ-ї: 211 люцерни (ЗЕО ІЮО Мо: 17) на експресію по відношенню до двох 3 НТтТО часто використовуються в рослинах кукурудзи. Зокрема, рослини кукурудзи, були трансформовані векторами, які містять ЕХР, що вставлені в конститутивний профіль експресії контролю експресії трансгена ВД-глюкуронідази (405), який функціонально зв'язаний з З НТО Т-МіЕОхІ-1: 2: 1 люцерни (ЗЕО ІО Ме: 17). У таких трансформованих рослинах кукурудзи, порівняно з трансформованими рослинами кукурудзи, були 105 функціонально зв'язані або з 3 НТО Т-АСАРШ.по5-1: 1: 13 (5ЕО ІО Мо: 49) або З "НТО Т-О51І1 ТР: 1 (5ЕО І Мо: 56). 00130 Бінарні плазмідні конструкції, які використовуються в цих експериментах, були побудовані з використанням способів клонування, відомих в цій галузі техніки. Отримані вектори містять праву граничну область А. іШштеїасієпе; перша експресійна касета для аналізу 3 НТО послідовності, що включає конститутивну групу регуляторних елементів експресії ЕХР-ЕММ.355-епи--Та.Ї псбБ1-4-7т.Опак:1:2 (5ЕО ІО Мо: 56), функціонально зв'язану
Ко) з 5 кодуючою СИ5 послідовністю, що містить інтрон, який вирізається (3405-2, ЗЕО ІЮО Мо: 44), який функціонально зв'язаний з 5' однієї з трьох наступних З'НТО: Т- МІОХхІ-1:27 (5ЕО
ІО Ме: 17), Т-АСАШ.пов5-1:1:13 (5ЕО ІО Ме: 49) або Т-О5.Г ТРИ (5ЕО ІО Мо: 56); друга експресійна касета трангена, використовувана для відбору трансформованих рослинних клітин, що надає стійкість до гліфосату (контроль промотору актину 1 рису); і ліва гранична область А. їмтеїасієпв. Отримані плазміди були використані для трансформації рослин кукурудзи.
Ї00131| Гістохімічні аналіз (305 був використаний для якісного аналізу експресії трансформованих рослин. Ділянки цілої тканини інкубували з (05 забарвлюючим розчином х- аїше (5-бром-4-хлор-3-індол-бета-глюкуронід) (1 мг/мл) протягом відповідного періоду часу, промивали і перевіряли візуально по синьому забарвленню. (305 активність якісно визначалася шляхом прямої візуальної перевірки або перевірки під мікроскопом, використовуючи вибрані органи і тканини рослини. НО рослини були перевірені на експресію в коренях і листках, а також у пиляку, стовпчиках маточки, насінні і зародках, що розвиваються, через 21 день після запилення (21 ДПЗ).
І00132| Для кількісного аналізу, загальний білок екстрагували з обраних тканин трансформованих рослин кукурудзи. Один мікрограм загального білка був використаний з флюорогенним субстратом 4-метилумбеллиферил-В-Ю-глюкуронідом (МОСС) у загальному обсязі реакції 50 мкл. Продукт реакції, 4-метилумбеллиферон (4-МІ)), максимально флуоресціює при високих значеннях рН, де гидроксильна група іонізується. Додавання лужного розчину карбонату натрію одночасно зупиняє реакцію і доводить рН, для кількісного виміру флуоресцентного продукту. Флуоресценцію вимірювали при довжині хвилі збудження 365 нм, випромінювання - 445 нм з використанням РіІпоготах-3 (Ногівра; Кіото,
Японія) з Місготах Неадег, з встановленою шириною щілини: 2 нм - на збудження і З нм - на випромінювання.
Ї00133| В таблиці 30 представлена виміряна середня кількісна експресія СО5, яка демонструє різний вплив кожного З3' НТО на конститутивну експресію ЕХР.
Зб
Таблиця 30
Середня експресія (05 у трансформованих рослинах кукурудзи, трансформованих різними З НТО
Стадія рмом128881 Т- | РМОМ119693 Т-- рмоМ132035 Т- развитку Тканина МІОХІ-1:2:1 О5І ТР АСсЕчи.Мое:13
ЗЕО ІО Мо: 17 ЗЕО ІО Мо: 56 ЗЕО ІО Мо: 49
УТ маточки 00134) Як видно в таблиці 30, кожен 3' НТО мав різний вплив на конститутивну експресію, контрольовану ЕХР-ЕММ.355-епп--Та.Ї псЬ1 -7т.Опак:1:2 (ЗЕО ІЮО Ме: 56). Наприклад, 3 НТО
Т-О5. ТР: 1 (5БО 10 Ме: 56) виявилося підсилює експресію в МТ кореня і ВІ початку/стовпчиках маточки відносно двох інших З'НТО. 3 НТО Т-МіОхІ- 1:21 (5ЕО ІО Мо: 17) виявилося підсилює експресію в насінні ВЗ, як в 21ДПЗ ендосперму, так і 21ДПЗ зародків по відношенню до Т-АСіРІш.пов5-1:1:13 (5ЕО ІО Мо: 49) ії Т-О5.1 ТР: 1 (5ЕО ІО Мо: 56). Експресія в квітцілиляку також вище при використанні Т-МІОхІі-1:2:11 (5ЕО ІО Ме: 17) порівняно з двома іншими З' НТО. Відмінності в експресії, що спостерігаються для кожного з 3 НТО демонструють корисність кожного З3З' НТО в модуляції експресії. Таким чином, ці експерименти показують, що вибір З НТО можна використовувати в трансгенних касетах для тонкої настройки експресії певної молекули ДНК, яка транскрибується. Цей експеримент демонструє здатність 3 НТО, отриманих з дводольних, такий як тре-МІ.ОхІ-1:2:71, впливати на транскрипцію однодольних видів, таких як кукурудза.
Приклад 10
Аналіз інтронного посилення СИ активності з використанням протопластів рослинного походження 00135) Загалом, інтрон, обраний на підставі експериментування і порівняння з експресією контрольного безінтронного вектора для емпіричного вибору інтрона і конфігурації в межах розташування елементів перенесення ДНК (Т-ДНК) вектора для оптимальної експресії трансгена. Наприклад, при експресії гена стійкості до гербіциду, такого як СРА (патент США
Мо 39247), який надає толерантність до гліфосату, бажано отримувати експресію трансгена у репродуктивних тканинах, а також у вегетативних тканинах, для запобігання втрати врожаю після застосування гербіциду. Інтрон, функціонально зв'язаний з конститутивним промотором, в даному випадку буде обрано за його здатністю посилювати експресію стійкості до гербіциду, що надається трансгеном, зокрема, в репродуктивних клітинах і тканинах трансгенної рослини і, таким чином, забезпечувати як вегетативну, так і репродуктивну толерантність трансгенної рослини при обприскуванні гербіцидом. У більшості генів убіквітину 5 НТО
Зо складається з лідера, який має послідовність інтрона, вбудовану в нього. Тому, регуляторні елементи, отримані з таких генів, аналізували з використанням усієї 5 НТО, що містить промотер, лідер і інтрон. Для досягнення різних профілей експресії або модулювання рівня експресії трансгена, інтрон з такого регуляторного елемента може бути видалений або заміщений гетерологічним інтроном.
ЇО0136| Інтрони, представлені в цьому документі 5ЕО ІО Мо: 34, ідентифікували з використанням геномних ДНК контигів порівняно з експресованими кластерами тегових послідовностей або кДНК контигів, для ідентифікації послідовностей екзонів і інтронів в межах геномної ДНК. На додаток, 5 НТО або лідерні послідовності також використовуються для визначення інтрон/екзон сплайсингових зчленувань одного або більше інтронів в умовах, коли послідовність гена кодує лідерну послідовність, яка переривається одним або більше інтроном. Інтрони клонували з використанням способів, відомих в цій області техніки, у вектор для трансформації рослин так, щоб були функціонально зв'язаними з 3- регуляторним елементом і фрагментом лідера і функціонально пов'язаними з 5'- або другого фрагмента лідера, або кодуючими послідовностями, наприклад, як показано в експресійних касетах, представлених на фіг. 1.
І00137| Так, наприклад, перша можлива експресійна касета (конфігурація експресійної касети 1 на фіг. 1) складається з промотора або химерного промоторного елемента (ЦАЇ, функціонально зв'язаного з 5' лідером |В|, функціонально зв'язаного з 5'і--естованим інтронним елементом (|СІ)Ї, функціонально зв'язаного з кодуючою ділянкою (ОЇ, яка функціонально зв'язана з 3 НТО елементом (Е). В альтернативному варіанті, друга можлива експресійна касета (конфігурація експресійної касети 2 на фіг. 1) складається з промотора або химерного промоторного елемента (Р), функціонально зв'язаного з 5'- першим лідерним елементом або фрагментом першого лідерного елемента |С)|, функціонально зв'язаного з 5- тестованим інтронним елементом |ІНІ, функціонально зв'язаного з 5- другим лідерним елементом або другим фрагментом першого лідерного елемента ||, функціонально зв'язаного з кодуючою ділянкою |Л, яка функціонально зв'язана з 3' НТО елементом ІК). Додатково, третя можлива експресійна касета (конфігурація експресійної касети З на фіг. 1) складається з промотора або химерного промоторного елемента |Ц), функціонально зв'язаного з 5- лідерним елементом (|ІМІ, функціонально зв'язаного з 5- першим фрагментом елемента кодуючої послідовності (МІ, функціонально зв'язаного з 5'інтронним елементом (ОЇ, функціонально зв'язаного з 5- другим фрагментом елемента кодуючої послідовності ІР|, яка функціонально зв'язана з 3 НТО елементом ІО). Особливо, конфігурація експресійної касети З розроблена для забезпечення сплайсингу інтрона таким способом, щоб отримати повну відкриту рамку зчитування без зсуву рамки між першим і другим фрагментом кодуючої послідовності.
ЇО0О138| Як обговорювалося раніше, може бути кращим уникнення використання нуклеотидної послідовності АТ або нуклеотиду А безпосередньо перед 5-кінцем сайту сплайсингу (СТ) і нуклеотиду (2 або нуклеотидної послідовності ТО, відповідно, безпосередньо після 3-кінця сайту сплайсингу (АС,)), для усунення потенційних небажаних стартових кодонів, що формуються під час процесингу інформаційної РНК в кінцевий
Зо транскрипт. Послідовність ДНК поблизу 5- і 3-кінцевих сайтів сплайсингових зчленувань інтрона, таким чином, може бути модифікована.
Ї00139| Інтрони тестували на ефект посилення через можливість посилювати експресію при аналізі транзиентної експресії або стабільної експресії в рослині. Для аналізу інтронного посилення транзиентної експресії, сконструювали базовий рослинний вектор з використанням способів, відомих в цій галузі техніки. Інтрон клонували в базовий рослинний вектор, який містить експресійну касету, яка складається з конститутивного ЕХР, що включає промотор і лідер такі як ЕХР-Самм.355-епп-Ри.ОпаК::3 (5БО ІЮ Мо: 42), функціонально зв'язаним з 5- тестованим інтронним елементом (наприклад один 5ЕСО 10 Мо: 34), функціонально зв'язаних з кодуючою послідовністю (305, яка або містить інтрон, що вирізається (405-2, ЗЕО ІЮ Ме: 44), який функціонально зв'язаний з З3' НТО з (Т-С20.Е6-3Б111,
ЗЕО ІЮО Ме: 40). Клітини протопластів, отримані з тканини рослини сої або іншого роду, трансформували базовим рослинним вектором і контрольними векторами з геном люциферази, як описано раніше вище в прикладі 2, і аналізували в них активність. Для порівняння відносної здатності інтрона посилювати експресію, значення СИ виражали як відношення активності (3405 до активності люциферази і порівнювали їх з рівнями тих, що отримували за допомогою генетичної конструкції, що містить конститутивний промотор, функціонально зв'язаний з відомим стандартом інтрона, таким як фактор елонгації 4А10 гена
ІМЕКе!Р4АТ0-1:171 (5БО 10 Мо: 57) Місойапа їарасит, а також генетичної конструкції, що містить конститутивний промотор, але без інтрона, функціонально зв'язаного з промотором.
Ї00140| Для аналізу в стабільно трансформованих рослинах інтронів, представлених у
ЗБЕО ІО Мо: 34, розроблено експресійний вектор з геном БОБ для трансформації рослин аналогічний генетичних конструкцій, описаних у попередніх прикладах, в яких підсумкові рослинні експресійні вектори містять праву граничну ділянку А. іштеїасіеп5, першу експресійну касету для тестування інтрона, що складається з конститутивного ЕХР такого як промотор і лідер ЕХР-Самм.355-епп-РиИ.ЮОпак:1:3 (ЗЕО ІО Мо: 42), функціонально зв'язаним з
Б'--естованим інтронним елементом (5ЕО ІЮО Мо: 34), функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю (305, яка або містить інтрон, що вирізається (305-2, 5ЗЕБЕО ІЮ Мо: 44), функціонально зв'язаний з 3' НТО Созвурішт Баградепзе (Т-С2р0.Е6-35:117, 5ЕБО ІЮО Ме: 40).
Клітини протопластів, отримані з тканини рослини сої або іншого роду, трансформували 60 базовим рослинним вектором і контрольними векторами з геном люциферази, як описано раніше в прикладі 2 вище, і аналізували в них активність. Для порівняння відносної здатності інтрона посилювати експресію, значення 05 виражали як відношення активності СОЄ до активності люциферази і порівнювали їх з рівнями тих, що отримували за допомогою генетичної конструкції, що містить конститутивний промотор, функціонально зв'язаний з відомим стандартом інтрона, таким як фактор елонгації 4А10 гена І-МЕеІг4А10-1:17 (5ЕО І
Мо: 57) Місоїапа їабасит, а також генетичної конструкції, що містить конститутивний промотор, але без інтрона, функціонально зв'язаного з промотором.
ЇО0О141| Слід зазначити, що інтрон, представлений як 5ЕО ІО Мо: 34, може бути модифікований різними способами, такими як видалення фрагментів у межах послідовності інтрона, яке може зменшувати експресію, або дуплікація фрагментів з інтроном, яка може посилювати експресію. На додаток, послідовності ДНК в межах інтрона, які можуть впливати на специфічність експресії або в конкретних типах клітин, або в тканинах і органах, можуть бути дуплікоївні або змінені або видалені, з метою вплинути на експресію і характери експресії трансгена. На додаток, інтрони, запропоновані в цьому документі, можуть бути модифіковані для видалення будь-яких потенційних стартових кодонів (АТО), які можуть стати причиною непередбачених транскриптів, експресованих з неправильно сплайсованих інтронів, як ті, що відрізняються, подовжені або укорочені білки. Після того, як інтрон був емпірично перевірений або змінений на підставі проведеного дослідження, інтрон використовується для посилення експресії трансгена у стабільно трансформованих рослинах, які можуть представляти собою однодольні або дводольні рослини будь-якого роду, за умов, що інтрон забезпечує посилення трансгена. Інтрон також може бути використаний для посилення експресії в інших організмах, таких як водорості, гриби або клітини тварин, за умов, що інтрон забезпечує посилення або послаблення, або специфічність експресії трансгена, з яким функціонально зв'язаний.
І00142| З ілюстрацій і опису принципів винаходу фахівцям цієї області техніки буде очевидно, що форма і деталі цього винаходу можуть бути модифіковані без відступу від цих принципів. Ми заявляємо всі модифікації, які знаходяться в межах суті та обсягу формули винаходу. Всі публікації та опубліковані патентні документи, цитовані в цьому документі, включені через посилання в тому ступені, якби кожна окрема публікація або заявка на патент
Зо конкретно і індивідуально вказувалися як включені через посилання.
кі Майвавнко тесппозїоЯгм Бо «ке РЕГУЛЯТОРНІ ЕЛЕМЕНТИ ВБОСЛИН ТА ЇХНЄ ЗАСТОСУВАННЯ «30» МоМма: 332 «10» в1/785853 «іЗїх 014-33-14 «1605 57 «ВИ їх
МАЮ Зою
Кей КК жи Мваїсаво Спаса іл «ацОУ І: савссдосе чзавстчсс зососзеасачтоа сайта дазсвевтсає сЕстазеах о асссеваєсо сачеЕсезес ассосасства газавасвіо Єва ускаїї втсаккєзає 155 вЕсатстоса свесоцчесте ссрбеввоєає аавспаєзаче ссессвсясСа бдсасоєсвтя 155 ссзксзасія пече со серпи овЕ Кстоазскес ссатсвакІ зе сЗзгчазив 4 авсчснечсс асагсвісара спаїпссаке свсуалвасва вссасточко асеввкЕсаако 95 сасварссає всзсвіогча Бресвасрсає савазасаною счдозсвосаа сасебесскоа 369 чсадозават ссазасваса свасвссваза їзавссазас стазссвата соптаєтова Яхо ассузазуча ссрсвавсвва спсавзавачває совадствоасі еасуавиттс засбазнтває аю заасцчайнио чЧемеовалав ОИ «киш» ра «Ех пов «еще» днк «квїЗ» Медієвшо Єкацовспів «аїю» 2 зазочовевс Ечесвозане БсвкасЕсос ажхастовас стпечеавовас паливна 5 сатдацаесе сорт акса сабодесквЕ хавстастоя сшІсадевсо Чазссвават ОЙ хкакецнави ахасваває савовалтвзс сеокстоавкад сбхсенеака Босссоскесе ЗНО ччассевакває асстзотач вето скпосвкаав сс слайеапя ит «кцевзакусх защсстсаве саєслаатос Каїсзшчете срасеткасо шеавзсвоєви 300 виссеісчча зсвечачасе стодувасова цес сса зе Егоадсяа сСрачессяво ЗВО азбсіватоава тжерадеваа зайсаеостьо йозстаие поскчавуть стави чва 4хО
Чежесрасвва васкесвая обесоаксвор абваїдесва зсссвозаоч вагатвогох ЯН пиесадавнут флак о за
ВІ З
«211 ЗО
Унине днЕ «І Мечісачо Бртопоатціа «сао» З. чесвнідвасва спаасопсає звабтосвро Зевс касастатсу сететасовх 0 ваза ашс побарУугссж поса савта аапссссвах адаисататає ссзсвавеес 18 пттасгластав псзазавадес чайна ксос завасідЧавсь сааваєсавас агсадасиго шо сцавачзадіс зспчсЯЧас Есаввакссе варто Сазейаезаса БебЯсодЕска и австтссаса васпасзвиа вацсустасва аптаваьсчав асвеаассає таеаїлсамк 00 чтісвсстаса савтастасас аагсвазава саскабизаж Се КоСЄ ксастсаєкк Зо збавкіссіца васссседес бссассавве двавосасаа Бе свВкЯ зававотака 2 чезсаваїсв запзустеоча бавассЧчеєс тускеоспає аассассуоу пеабсзасста до паст ддаяа заздовасску Зо «ІТ10У 4 «ТІЇ 500 «шо ДЕК «13 Ммачісвчо бсчпсодівій «ОО й заазністсто гЕсаавксооз аваусаксє збазгазоваа сттасусасба аусававсоЯ 55 зл кстоданк асасвачіса зачоусагиає чецачнийакас врасвтоасва коала їеО ваті гссас акта еях псістассва збнеосазц часі чато атвисвквувк ТВО сесвеовссша заайачаєста педзасовзаєа ассвавтакс басатсассво йгасзецеи сао тваасессаз асаосасгча Феодаслотах зсжсевасвко сег чвеиЕс авобавтсосто ЗІ залачсттца газ сусає сзазвассзівз грозові сяза васіссвауси ззвачагосет З6 савсчзатевс казасксзеч вес сФасастсвоача зоавзусаза азтсостосава ча агчсваксаву зазаавобах стсовосааєва савазавваях чбсастасав сізпасавев 50 свзавс-ава сзатааксоу Уго «ух аа кеійт днк срі3 Медчісадо сЕхцтствисія «НИ х щш позасаоке: осодасоєст вовосеаєод сосаїсстівс абазесктса бадвсаєрую КО «севБахтстсу васосодаєє овкосасаєє соувасеске содасесаке свосвадаса 120 сазвічавоЗе Зуавссвуас вдеоКксроЄ астоївзабсо сісвсостаза євасаєвєдов 180 зачрзатаве Бсосззоїас сосзоівека сгасеСосся асодссдстсї вссасябукс 260 согазадіасі соєтоддачсс сксобесосоп бріваєсова ссодаастса ссіласаура 300 блаєдвстох Бтсдевастся шсхвстсеся заовевтєсс седосастав ясастаєтою Бо чвтядачесас гсазо-кЕхсхва всассацаас Гсасаазада сс ссхаваса суачвасека 4ко
Жсвавваатає Баксазкаєк састоуатат саяскациса аааст 125 «Ех ГУ «ЕІ 472 «шви х дне «тав Мейісацде скнпраєнів «ат» в сесадсвсся Содбсовшсвс асаасстаке соєвкєсаак восбсоєтак сбізтосаья 60 ксстазивьс гсоспаєбтсс адосвеЕраєрь феорсзоміке вааваєсвтас адвассодує 125 сстказесда сласвусасс сестеЕтоФех седатсчоса вузосесттоа пазсттЯевк 159 сесазвзудо апсссалачу псхдасассї таасегтесу ассовсдавае селі вакта 16 сатттїакех асавспасвах ЕкЕцЕлАЕо паваєскеве зБікаровее вксстевкяє 359 сСЕтсосавссо ссубесусвнеа песо родь созакбокссу кебаб вас сосоюа ЗБЕ апієкасріс савазаєсає сісрстЗсая зеБазстеєа осохусЕєаа чссзесвоов бо сахагекаас бапебваккс сазадааєсає досставсгса Басусадсву Ся «79 «ву» 7 зі Зло си пн твІЗ мейїсааю Бколевкаїа
КАН й звагатлавьс зоптахазаї зцасекоува севуаєсесє взстотесквє сасстстяює 8 созсотавсє сіатавлаєтсв зсостаєссс сабсптосват аакостатст спадтуєтся 180
Тіяскасаст БФувссдавя ркасузвоаає созактсвсу сусстсссяє засбочбсвя 180 хззасущаха звозаазіор застктвсто окттосттчи сдістіходе стссдасотв сао зєзадааасс савгцазісь зсівасвеет Скебуалаше сСсізабтузіа газспасаю по си сасоищчеси савесвиноє Аня авздавзадено дпааанавсях почазастах КН аєпвасавіс ссоткачажік вксобСсазаде ватсолавех сЕсассваво акдоспайта оо сівосазвціса зазссвчсда чачозасясе сгасусекса сгсабссадаос вечвясвада 48
Чааваєсяассс Босподавссе ЗО «Ох 5 «ар» 52 «тій» Не «віях мечісапе ксписакнів «40Ох З пзчаздссачац ЄкачЗкУтее Есттусвачас тачайсавчє чека сСста сш ВЕЕТ во «Фчапоаптізсе чесстаастте соадасваве вазстусво Ччадксстаєш ББЖ 120 кекс сспсСазсаас сорсзсагіса Уубасасгово Бссвасссаз дсазаводчех 189 гаскасайвеа саясваєсксо звпоовачеЕ сівоствосва сі цЧавасте БосУЧчевксе 40 кхгасасвиі ачвоссвсвї сосвзевисва ссозаваєсо авозако сваставдеат 00 хе ккд я оо ред ет фев това в я оо козир рев оненуч ні аа ца псковаззасо засвасаУке бскссзував сссаувУче ГкостосУсв зауасаавах 350 зтасцтсстав зкасассоназ сабазакако ачсассассе ссзоассоофа бовзатазая яко севісчаціє сечі Задса кадсгеоте що 455 че В тех За «уз дяк сі» Мейісаце Ктлпоахиїа ках а тЧадкєсвавч сечу сге кЕсклавоас гзпававаче чсхсягсввоа пет катькек вк заграти тч сопосдасьвя сзалдзсацва свестчасоЗ сбачевівео ЕЕрЕсСатесі 120
Ес тастс ссЕдаєває збслодооса сбшсеасесеч шосаасосдв позаазазос 5о бїасіасзаава свехасетсй чазедайикУ сек това гттсвавтга вубоцЕсса УЛ
Естасасатт айякесесак соссзавтІвя ксейаввеса аспек сааставеаЕ 300 кгптдазавьЗк чЧазаукасик пстбсвчтає ссевзкзащес спсттосоас зЗадосавсог 560 звів сас чбзсасовавй сагадавокЯ васашевскс гівассзочя стазвазєацчта яд прасттвео Іру сзапса свУсссеКеЄ стовласаь ссостзвакя своя зав НО хкесктевкто Заспадакте вод кю Дшх 15 чиї» 20О «їй Кн рака их сасо Стпйсасоїа
«ах Іо досчекковУ КасгУсаУса зсросахтава созуссосаси вЕсростсю сгасасссса: БО бСедоссбаасв чосоассаса спос са ввідсватав зосцайсвсо судасрез еш зачсстстсп суквсглаас сЗсвотатеье ктсакЕдссс васасоввіста васаастази 8 тасствсудах штзсахчсас сезссудаве гтастспддас часачсвадчс чпсоквксва 940 тапссезсвав свідссасЧа заавачусвоє чавасспсав свзевассавоє поаторясаав 370 зсатлазаевЕ чсасосчеактоа завзаазачя зчечакссава счесааукосєї зако Б чвасскетес згасає стдсаєоває абстесквео сасвассувя савссквЕве пи аеквагтжвса Зевс встлосктсо агисасскос гсспсвслваї взстабадзеав Іва
ХссатєтачЕн пттсватех Зоо «ах її чих Ой «Вр дик хо МмезісвЯОо БЕпИОоЗие
Оп» іх сесоксавта состозасеоо застосовано сЕповоаси спала пІвтгатова ви зставсасвкї Басктабсаєа аовиочексав сво весват зочтаЗскнчнас татостацав 15 стдазаєвсос ацосеЕссвох бабасасащи сзвосатасаУ спасосавує багабскова 590 сзїспьсрад ачлавтасаац сЕбтоскеса себЕсвЯсге КобОсаваєт засаздісзаєеа ях
ІтЕхаєствна засвцаскіЯ4 Кадавксав З БЕБЕктадва бскрацайєтіа вастаєтивя 305 аЕсавкстоаї стіавдессії зззбадатав сзасбдасьс зоабсодідає сісуаєвавь 360 паші квЕІсСсВІСВЕ вЕлолЛовВтац вазазечіза октава чЧовщакесве па25 счокавався зсачозсосЕ зсахачсвос ссоздекассеє зуссалавос чезсоосовк 480 зате росте та «ВЯП» 15 я ва «ві» ПЕК «ЖЕ Мезісасо бтнйсевніа «апох І асбасакаско взусьстваее асеотчктве садессоуаза асаскасзах сват Гая кФсоасакест шкбссасуна вааосавесс сзЗзкуваєта бВБЕсвуба» дувасававо 190 забчсвавчвас сце сваєьа сеанс сапажецчьхк спласдеста встав 5 срлЕвнетов сгссасооя всвсзносао їавівасеалос асалтатава коспсаснеся КК астайуєсай зсвакасссв сдіпавасах сівауаайза ааваасватах часова За
З З 59 еетахтстсте пеітатксвої тессачесає скстосжкос свист сідавачств о З50 чзсачовтьаст дЧетвоїткстї аспосвесев секс таадев стобсотесста сасавтлавте Ядо віспа кастісесвно радо ангпсаттігадвд паса теав пзпдслетв, 185 кВ пове Басов щастя всссаскгав пасок чопассоов Оу вутзачєьоссо ваводсовав зр ие ІЗ «Ех що «Тих НЕ нн чейпісвчо Безпсягоїта
КО 13 часа асвеадечас сс осачев даваїбстУстЯ стесгватсвктоа батексвуве БО и ен СИЧ «у шов ях ил, су шк ие дю кож сонні ст з я пики я ода ие Мсих чгасшвЕтувпаєсг стра ссосотв соелаолпозаш пасасаастом паеапчавосстю спвлсчсецоскУ ща ч Б; ДЕ зсрасескся ссапвтоїтва сасавзасв чдаасаасса ЕВ чес що зстбабасчіс: вовзабацез абсоспачав вучссвасст сСбабасаса зчіовчавса 90 ок ою нт пи ий френч кор рю вот - Фея Клум су фо ев» 7 ккхастатучас Свреспадти акчасСьЕсуза ствассскоє чіварссака Есповтасю око кесчЕсавкї зубасааасв здасвасава есасосзвнос сазагаватазаж асовссввєт о 309 асттааасеаг зазавсцсяах їсавассаве сзвоасЕсоасво зтавссастцс ассвзавтає Зо зч:сазаєово зассвзават Бгто сасває асевсбчаєтс абеватасує Сстрлаваааа Зк аабгствость кткасекаєту сасокососа зааасксвої спсвелеспа асссвавиви 489 чЧчЕвВаВЕВЕсВ дгшсласавая ЗО
ШЕУ Та ка115 У «вій? дНЕ «Ай» МеЗісаде КЕпебсалиха ранок їв зааласьвчЕ задссгасета стакеатасєса бсокагсоссЕ свзтазачЧач апастсваве 6 счЧаспазлаз бавасваача БусБссвзчає васосввост ассстапаєка панував ова 159 окасзсає БЕсрСткссво Сстасепоса ссекоЧкуїає свтсвсзасає стосваєсту 180 засстксдав сткцчсвотау ббазсовайса агааовосвії бабеваскта паста каєс 4 пласта ст вопавекжс сек БЕТЕКе вокогвстес коБеКаєсвоа салоаввсся 300 павасескав ЕсассЕавісЇ ававсіссва всаоссасац бівзсасчусся сгтосоавтоу 360 сосен бобааотесв ЖаззЗстасвс тоабавбостя зіспаласає астстаєсаєе ЯйО абептчасе вусссаасош пагсасавча статті вссс айва еп восек Я о свасчцектЯабу садаебуаси зо «их 18
«11 Бо
-еї» янк
«2135 Мейісаде Зхспсасоів
«Ох ї5 зазалісссза сдавачачаа сосбсоалсатс сасастчаве са счасо сзссвсесвосва.
БИ зассасраваес сссесасьока чабсассксва засл сзаєвтстад зпласксадеа 17О казрссоаспа дсавактаах ссоссостоссо завактісас сровссосас Бескскевхв 180 ктксовайсах суссабатос зочссоостоо сасвассіст зісцамасиа саайбсЕсися 40 цекстоасдса васваїсаву васастїсаа сЕсзстаєво бравзасесао стсавнсст 30) тчавсассач зисасацово сасастассє ст ссасуав селі сасз сосакоасея 36 павччзачь чессваввнсЯЄ Сазатусуає став уве саабаєсеов сазахаачай БО асвавсстав вйсвавачова яасссаваєтх соваїсассяа чбвассСавса ссгбасяаєтв а ївЕСстастоє зазаєвоста 5 «аїйх 16 хеі їх Зо
«Ещей дяк
«и Де Мейцісдоо Єтапсвзбиіва
400» 15 ппедесктві абахозтазу сазсеЗвеке бсгазвекта суссосахтее чдгазаакеви 5 штжккдасна Есе сасасє Щітссастех стада со вЕсктасЕКсС векоскчЧаа 120 сіуадастос соавастуазас ваиседчазчсва Бавассчаво ссцестаска свашеваєі и 350 їастазнатав ато иксвв агтбостассва дігидазява совзаваєсаєс Ерусасснн 24 здаайвлвила дасбсалалса ссавастіза везасвазавс пссаанссса авестайєься 300 ч«вЕБгадВвис бсабжігсвт вавзлаввава заззовксак бБоисатссавсе авта Зо авсрсозовас авсфівасссс зсоцаотсасх сасотасисяа тасатзадва Босак БО пакєкасаває тТсабвабтос їогскУухвос асасеаксот стжкосксва толазабаза 48 затізсагав апузасасад хо «Та» її
«11 чо вол ик тех Мейісало Єгилоаенія
«Во 17 ваасйаатцяа аксацесьсо гессвстсає авазазссаЕ дез за ау БО чЧетаїтвсаса сайте паесоасічес стаєш чесє вЕссадозсі асеекессвв 15 «сдосесЧса абз ку состассакс дсазасвасо сясссаасза асвасуважо 150 їогваєос т угзактозую чаачевейсу саависові бусеаоічке бевЕрачекс 840 таавоессессЕ сабдсовседе сЕсодастас саксатасса сссктавсстї Збобаавеак 30У чЧасїкісатчо всазосвувау сСговазссви зстссразті са сореассстує саваєстдах ій їссасвасаца саабасасов зазаосваса савсобацтаї соісаставтов собесааваро то товсасеоши ссабвесаєе сгсавасетїе асалтссвос атйсгтасвад тісааассів 480 аск ЕЧеаває всвисачЕВе 500
СИТО 18 «ії» МК
АЕТаР. як «их мейїсвує брирсаєвіз «4 ІВ їсаатссвіс ассвісудса са КаЯсЕКо ЕЕ Сегссую огскаєЄеску деоаавксях 5о агахттсвтак стассеслсаз абсастасчя зскастосає зоптадкчекк сабогссоса 159 дасілнатзое віїсааснру сбагочасхо сзпацевєеое кссзоадсьяає свесгасквк 30 часчетскоск БЕсрівстсс стсазавосе дастасесаз абесстаттв дасассвста 230 аззатаваза отдатагчео Хбаставсац сзегсажяче гслакасзаас весаковадта 300
Кетазнатса зооБокаасєс спо БУС ссаоуізчаст строцасрсс вгестасвята Бо кастчстцсо сСлусзаства чогесскосаї азбапаианлеє сСоспчсатазчс поссасевомя й пессзсазаа зеопвосоасі чес ФарсСасто гссузаазач сбазавайса дасасвачса Яно манка ксає адславцасе ОВ «Їй» 13 «її» Зоо «2152 Дук вних, Медзігсаяо пхцрсабоій «во тв пговаозвода стаяасваєода свасьуеЕ весвгдванає Сзазясайс серпа о
КІсгатавах Ббассазаася поссзакоух сдзуватвац засссраоУх Ксдявасада 120 аксскчвасє зосазооаає січствзавч сопаадасккас авптахеєк асстсвага 1850 чкасеававии бос зассаїссоя асокукееса кгчскават репайїасота а
Есававьстоа сакаскксее сроссассса вдівзваавої аваспацтаєо Чеведентсо 300 зацдешжЕтаса сЕсЄастаєва патбакасвиї вБессессктач допасасасяь аабасасаса 50 тататЕкпав васодадеваа вавазгасас бсштвастасо зоабвагааа ззашастасао во света сахз ацісевавко сстзсадача слазазвгтасє дааавасрасо ссачцееасьаєс 450 зчаїваєссзе встсвсавка ЕЗЯ) «Ас а: «ЙА1» 8 «А дик пах Мечісвов Мтиссати1в касу йо ччаттсваче штаскросс Сеаслосчсав баса сазсовя чаточечакя ебвУаето БО «ЕЕхавтсяи сайсокаста стКЕастаста псецеїкаїав гБставадавч себазвасось ий честсасстіа авсчусассса аасслеачікс азсстачїавао чЧесезвассо азгсваката УВО такожасаува всксбачсвс боасесатаве зазсксазсає ассасвасех савкавссаФос ко часктастаюк секоетазчок ЕКС а відео ЕСресових 289 «гій 21 «1» За
Соня дик кі меайісвоє пузнасвн в «а ох 21 паваолчозое сОаосбсасода чевасодзащво зипіоесчако аташе зо иусоеща ви спасясатсав» ссстдцавзвосс часаспавсвс сувсвсмовос азгуізсяазчцЯ ватсзоепнав То штхлостсваєх стабсачазя сасоааса бсвасотаса сзЕссваєсо степова мо
БавЕЕсакад дессраасво ЕЕ ссЕЄт асо вакя тасавзесзац КУБ утахе схяо каз оссове сосвасебохв сЕЗчсастаке аазесава зсахказЗьеЕ вЕвсасяааиа ОО сосасбвайльк спосо ск стотаЗсчсв апсоостсва тУстспассо засдлаааваат явО гавпаваатЕ ссабосаувая ва вх ех ий
АВ тоб «й М МНЕ.
Ах Медісвсо бинпсвозів «ОО Ве чсвасцасаа :сабснасве пзспаласча асоітесееев сапЕсосясос внатвиат 5 асгтакцяаса свиїстадав сповсвавоськезсосоісках собака петбаєсцадчекх 120
Фріда ьса сеасаасоас ссовуєосьає чзоссоскабь діавовстоа ядсастасама 180 азбука ссоптуаксо зкаскаскта вечкосакке СсесаекКуса сваєсвестї 550 їачсесстрУє бсдадастча зусрастоце собетвуусає брааєсаєва чЧесевевстк 300 тесравасяв асасчєвява сссбовекЕ: зуасссаадж асвстодаєс сваєсюсать 360 ссвадсстта Ссавісасса взабкссзаєь зсасеЯкься 480 «2102 23 «ей» 535 ке Медісадо ступсави ма «ау» до асглдсацтсв сазсвіава гасссугяса гаасатозак сааккесава теедсвасайє БО цист аава ссігазвосе хептасьессс сассесасад сов ссватт азовавєсаєх 12 аЕКЕЕНеакЯ Втсбєвстар сідав тве заавцясто вазаудвакж теросуьєє 180 сбрасвіцгав асесеваавес ставчкЕсве слсссабсщу басосассае асбсвосоага 283 чека одал вгсвадітас азссчсствоеу асадттвсва стекло сеас пав оо 530О засявацеов Бібсвавсах ато даз сасєссазас базуссзєкчя стохсотакь 360 сесазівака асогвавоосх згас етка чкзбасняає звагастасв Зваватокав по здосесточь: діавккзкас КСсасоваяє ч«серастаєє Бжебвасуоа сосврадосет 490 усккідачаєс ссадарзаса Бохакесоою бпссттссте аптгсвссає вакісктсаї 4 сктевескас асткроеко пасуявуваоє зосвавваєв свеспауєєв стіаасстає 600 ст статадчи вачЧасаваїа свеозасєсад завсСсапаває сезвусабская сбведавови жо агат тада взаавзсазесві: састаєсзве авссокеває вах «их 24 «ВІ о) «рід» пе «иї Мебісвоо Боапевшами «40 да аватавтсави босассттої бсватансва стаствтата сдівсапазо савстістяа й затасвгравх воїсубакся Свазсссво сасоссчуаає Фіссгасуві зчазассачац 12 твсавабсто соовзадтаса абсовававае сотогєсває дтаасуєсва астазвааєтьв 150 істасуессї сесітязраза засзасобов зрісавсгас сгтабасаєа сазбстстяаа 240 гуска атак асбосваясю посстпасса зігтадтова зазпавеатек ЗП0 зчадсяасазу Ббтоссзчов всавтточає Єаавобсосттс веЕжтаЧчесес чеЕкечакав Зо чассаїасст чдазависсає пЕсссскува ссбрразваисо вк спассоуада зео чЧазватзоасв засстазауа сепостеЕста аквсспсаза свбезастата состав Зо цесдсічсоя Бесвчесссв Бош «Й й
КОН ОО;
Ей дик «ке і» Медісавуз бхупзаєвів «005 25
ЕгасЗасаче сплеск даза сУстсоосвас ссашсеЕса тус оКтя ссаесеа ех БО твазосатає зстдссссса попувсаєвї бвагаасірот вбсстсасоав хаштповацет 199 ак за Я : В З З : З :
Ерестаксов Сграспосаду ер ЯвКї свабскссає сезаскекс совксвгаст 180 щовзаттоса зер Етаст спорі ско вазастткса сітахсттага стссспоята 45 зер сзсварсЯсяз СКессаеБЕла агевттавцє бербовесота заг озосяве апо прешчевіаа прзсвсссаєс азевсесвса состав сорсасасео бас Еиусає 56 аЕсКАтЯєкЕ врсавтсксот зааїгазаєх погавієков чаєзаксесь ксктякуяає ЯКО засовдазвса ссср овіви себсабкав свавкчссеЄ шсзслаят КЕссасасає 48 пвачавзесов есахвало ОО я кори
ОА ве хирІ» БО «Ей де -2135 Мейісазчю Сжипсаєнівя «а ве зпачсвстобо свасассдас асассаєача зстесатазс чутаавсзасу сабо БО
Р с Та : ча я: точ оУ У авіа сосааскист скяпесвасх взвапстацавдк болвасвеова сезсЕмешає БО що З Я Яні і се 5 кн шкасссптави пазловсаах спвозсиЧчевтх затеапаскас заксаклпхта хазиапоадку хо звайвсчсесак дове ссСась тата Казеотесвва аопасасни пташка ся засвосксяс авазеаавЗох сасскисвас асовязсяко австоБкоса вазааовада ЗО чатсавзатс ззааксзадеа ваші сасау звхсазвЕакЕ Єбзадчвавер сжікеадавя БО аєхаязазиса вакавадеЕв сецвоссвсю сазазсвсса песо ово сісоуЗапишч по асстдатксв восаеасако свксвостев ссаЕтпцасас «Фепогвачак асактвеяноо Я ях іх. в дути Как птезчряасава сопададнев БІЗБЯ
«ЗДО 2 че115 ЗО
Кей дик «КЗ» мейїідвас гЕЗлоаспів «опо 27 сазвастчстав чес сесх закскацЕвс зазсаєсукта аусаавуатас посвавасіх бо чезвзгІіасвної асбастастас вда касгтаза Чезасчпаї авселпнссда пагчіслпадаї 155 штока асесулясивю. йЯспадееяа чЧовасаслес авоочиакап пас слива У
Чазвайсгап вавзавешат гсазоучав всссоЗакаст засно чЧачо ссврвачачс Бо асосацаєвко атоссвоссв васчвосачс абявасчода сосвсвоваєс асвсогявайт 250 зстжсатасс Бссвсавелає стааастась сааствсяху ссссдажкьхте ссахеасовшт 30 зстсовавзе бепаааастат стсссвобя кессеасеасс абавіасвок Сбазатсаба Зб сЕсказаста збатвсвайв счбосавсна адасасасаз васгусабссає всаататаєє дай савазсдвас салахагаєа гатвававзаа атапсоЗяв дсаглазеіся вазаавадза ВИ вЕастассяк сосоведасеї шо «аїйх В кгі115 5 «2159 лнЕ «21» хейїселе стапсаєвій кА» ей кчвасезацав бвассчагтсв Еблаїсчето азгасхнаває счазпаваск кебЕсатане 5 жсевідавг сашсвааака состав сЯе сдеддасвач засгосазої бозанаєсвах 20 аксевлазкс цісавоадачс стоєказаєо часа скав бабка сасстсвайа 185
Чкакрайячек ксаєсксавє фЗассакокоз автаєзаєте бастазасо севатасцта 4 стаавастлоу свудевЕсЕк деосовокса затпйааате ваттачеасе Час леквсю ЗО зачієктайх пбрастайаа свібратеют квіток оїзс; адасвосайак вабесурата 369 часавпиттає засажасваа авзавакасає шстваскахс псвравтдчй сааладасве Я яЗгсгатчоу васусваивиУ шетасізазах ваапасчаєуь аваковаст сксаотвивс ЯВо паїв всксасавка щи «1 й ах 418 хЕ1ївх АК. 1 Ммечісзає вкапселівів 405 З зсопзскчува зетсвсовао зспаааоєко сабо сес азпосавсе улеакаєах ва азбвксдісрасс здколавсеео Кссасассоко Чавоатаєсок сзаєсаотіахї чаїлсастат 15 сКакочлавько ебаасакоов зсасувіоча зсесвсзеса ксвЕабацо сскастєсва ТВ сваїнЕчЧеаЄ спазвауажнакЕ сбвтавтась ссактвадсв Фсбесзтавос сеЧезеаеоує 4о сгасттсвас сбассевасв адузсвеовЕ всовЧаєтьса азакксвІнса босеостачцє З0ПО
ЕтсЧавосввЯ став Єсявсавств евазаавеек зтіуасскава ассасосаює 65 іжесеаасвЄ ссобвавчібк: сваваїсвіс ссаавбазва Безсачатоє гоотосзаув 4 чосдавакоє бохоособс стбтсозачк адаесдкевчає ссгоЧчавссї адосапсоевуу Я а зві се аз «Елі апи «их Мак теїах мМещісвцо скцрвсвоців «ПО 7ло сезсооспаеасе безсоссЕвБе сствоасвес сопссдосвпа зЕтаскбаєї кевзасєтеаве БО зацасзасатя Боско Є девкбоваче оссоссодаая свбздзавачяЯ засадою 15 ааачксссто вауданаасс спсекієвЕсв ЕоЗоєскав бе сетвас соабравсвс ТВО всаснбіасо касвасксса соопзачесача сеездвааєссс ЕБрсостсоба вастчеевяє 840 чЕжосстаст ваолазааааа абсоспсваса ачапевучев спстоссаза зсапуатвою 309 верста ке ат раосвс аікацтсвов вастворерк босстасаєто швсазавсй Зо гегсакаса спевеостоо гІчбстасца ачкчоалвнстоа велось ає завасчавист Чо атчаякіавку увакасекахт сасавассав зеЕсоіїадаве зсадовтасє сеспесттат 80
Чсіаестасек ска ястле астобоссус чес саїса савзссосоє сеавассстова сах ксажукіова абІбшваавзов віка с савалосСаза Ясна ттах зесзахтавк 690 «1» Як «а1ї5 таза сві ДН «рід Мейісвше бюро Уа
КА» 3 айтаттвааниа абрпопаває Чпсавчедсає тавазиазсу дазадестяй стос твяааа 60 тепйнайсес вевсовИсок зхавсчсває песасостає сапу согасзекао Та асгазаєссуїх цавачечава Бассачевах сазвеєссеуса босіссааса сацалласава 15 сксатайссву ахвсстясас зсчзворато апаїтазьва сккозасвих базсвсатав 245 пЕкаксочас засів согв песпспесаєв абасасзеата азесссссва здабасевсає Зо азакасусає оссжоавааа сасозвдауї зазавазсза дасазсоєся сайзваєкса ЗО їстасааакдт втакцахєтса ассвжачаба Сссяссвава павсжбавесоє ссчасєдеває 45 зстіваваатс атасстсска влдааоаасЯ тачсчязпача Чесзчасвезу спезасваса АВ сбтааасахав їсвасасква сдобссссеча вдач ссх ссоаавсасса сассасвассда 559 завакоставата сстасссвсва паваасікої ававваєтов сі свасавт сасаєстпаєг боб декЕВЕхзаз засесотаксї гстаблаєва сзасвактазта азозаєзатс азсчкславс БО шЕКсСттозвия гаесвачтво зсбабапасєс вісзбтазвся паксвтаайас сагівссзва 7 пичсвопетв абсо авазаскасо васбосвоЗа сопобсаваю вреоскасосу 78 сепстціака зсаассцасо бсаостацяа савзкіаксто увлоозасас азузсаєюдає 84) дсевсачаєсо сочаскососЕ бабассвайае фовпісакає свовзадуує сазусаясяв о 900 чЧиісасаЧьеє чЕшСАСсЯтаЯЄ сасуусусттая сочоаасцвос сусосавкодо цізасасвас яву адссавісца спЕседстав гавдобааат садугсаваст завстессео абкссктхви 1090 косссвссчс базваавоссо чості ззавзадаєє сасссазаєтс базовссста 1080 пісроабБссса всапаєдасєс свое ставє рссбссаєва бістаєвась апсадстваєт 1140 агсоссставс суаєстссівс спр цасосу Бсзвзавсоктваа зссавсотау пак ево 100 тЕжкЕсЕсєсов сетузскова аксстбстоаж аттсяаоссте Єгастплавок ктасстутсвв 195 ссптавцаєт свасеокеко ЕсЕЕтсавас дсацієтеса сассзковие адодоастсав 1520 втааатссес аувсесваає ссесЗсвссою сазсуасссва авласасуєс тесуватстач 1559 астячгтайає сірасасессЕ пассосзвков актуа овс вузлова чвасу бавовна паб декжвккоа кчостчуєкче азакраласт пасоавенавке цеецавскос спскуссаче 1599 шЕревсяасо сасврусксї каасссткасє сгабасараа бозевазсто зсавсоовкІ 560 забав кестЕЧКЕЄу цаессатаєм па І594 «ш1ї2 іп «Ваз дек ши Медісвяє бкопсвизі в «Ох 52 зессопввасцв асп увввс укол с гвзадазааасо ваавдасзча псасоттатяая ща завасасасвс апасовчєиї зісвсссває астассттас ссасєдагссо докасвсваз 1хо зплеввсстає лавадацаєа КБагсазтрасє зазазсопса баскьоватєа садалестраеа 180 стпасатесза асаєогтасує взодаяавесот асаєхваєьн ссгавзивт: газбянатак оо сЕсассдову зсссвсусав бассстасає асгзсасзаєу асзтссссва Затавсосове зо ачаеасУуєаЕ ссевзозвзаза свгчезназо засазачісв свовасЯсво сзаазаєтся 3650 говтІвавЕас асбасовоєоа абсбсгваянеов сбасатсацта савессспанос содасавнавс 59 асктазгваст апавкссвса вссзазчавсо сазстацада чабавсесач стадвсавова ВО тЕвавстаааяня СЕааЕЯгЕвЖ шо сєва база ЕКесЄ соіоззсасса базбтаватяа ВВ вазі ваєся пчзвзпікаєва чавЗасеЕЄ завазаєков вс звасвахє сасаєчевох Се чечтреглаза йватгусаєосх ссівгааєсза сасвнаягрзака авчачраатє ачкассвато СБ віспесстсава сервант ветагавзро ахзкФеотався басгсатеачеь састассдта Зап вщазгасостха зп т дзадассояст автосвоока сетоабасвах зістаб5асеоя 780 сассоссотаєс всавісчаєс сгадтісацава дзастасосіс дазасучечс васасвуєсви Я згвасвзсасу сосассстса сакассавас досссрсоатає сагаласачх гадясзасва 09 зісвовоасех дпссасавує паст сав сгрозазсвоас гудссЯссчас зіваєвсаво Зв асссавссзв вІглсоасоще валзадеанає саядваанс 1505
УНН я «и з «Я не «алу мейїзсачо Кучпюатіка «1592 43 «васевсосЕс зе врсосвспеде сасазавсша ЧОБссСкЕа вазадаате Бо. заїхксвавос гадсасосав боса Бов ап ЗЕ «еще БК кЕ1їх ДНЯ сеї дик «жІїМ Бейісаао шгтупсабута «80» За чгакайпссассгеогасьо ссодаттсвьх вамевисе пазствсявь сдибтоавесо бо абострожее Біуаєссанс ваалеЕснавь ксзакевузс Ессе Іс русввх 150 схчактсавакх соссссдавнс счавосоасс еасбкізаЕс всхчєскасю увовбавета 19о вксствецкх зо сачачає аЯопсивсала кіссазисвао дчЗвКсСаетав ваденеЕтас па ака ЧАТ сСіобВвкоЗкаА савЕксаваа аасаосдпсас спасвсацях спадпсасвзжо заб штат а сеорсвевтас повз сат пчачавзосоя апсздсазає ос сдату БО кзкУвеслтав азгбованпіта Ебаяйвастле соавсстзсва спеіссвчЕс ссасвасосса 490 тсагженттка аспепкопкоцю вийсасавігя азавассчоє Застоуаевий безатеилис я тест воч вебвсасаду де ох «ій 3 «УК 114Х «17» дяк «Вії» МеЯїсзпо срцпсвеЧея «ау» 35 папастваке Басесасчасв пу соцсна расова севаєракрсо гевБрепекає по автішиспечс Чвааусочсс ватсосассоє сесаваєвас СЕЛЕЕсов асасвавайя 12О здетазазав взяалаїсуєт ЖХассуєсксої всстсчвЕсВ Садаясадаз псссвадаси 150 кааїслайсо стабалааса зсазаузєву Кааабсоткос вавтазаата завзатоаде о чЧічссуасза ацдосвацасе Бпасасават кУяоусаєта заватексась сасутстясю ЗО сабсваєсатв сткасвсстса аіабтсссса ссозабодіаа азбусозода десасстова 360 сектвоаваає плас сЕко ссттоазсвач асптівозав гсзабтаса бТахавеповає 420
Чтвакаїпсвя ссзассатас астаастсаї сзбасспезсу аставзїсавз савувеавес 80 сепчассусв апочасхосв акасассасс азсассавах сСазазастао савовеисвк о8о со сосавЗ задагсзаба апесозвіво савзасосяв с5авокист Сбвасасаба оо взаскрсазЕч зрезасокує саздесчана забсчєчави сСбсхкатоус аквайєсавя бо сечдкхацссс регтассоза стсуєттазе сісзаєсссаї весасклазе остасстся 75 зівасчьасс пввесоьа|вЕ свусссспаос їацдоасдцєс зсасааяасув досодавосс 18 аслісжствш авадастке ссостосоас срааваєкас їсастсеств дакстаєоцяа 840 дачставоссс акасесодусєв ссвоковасзу суваствасс сасассобев скцекадеєь 0 ачссоватсов стсКпсвааї сдайцюваєс васоссаеаа протсаосає пауксвастста ей спедстзазав апзсоезадос совасєваєст ссасстуває савадсавкіо васваовсва 1589 ззачучасив язоалааекьк співа язсссвокав одзсссвамо собом ачав Т08О аачЧезссас довссчевк: спеасасзсасв сор ссвсас зсацавасовз асазссадав 1159 4 114 «40 36 «ЕВ т107 «р1ЙУх док «вл Мейісвзав бтипсвкнїа «ух КК сачавсвас: сабккопаст бдпектобказ сбаутвеках ссавзсовссс БОсЕсЕстяас Бо вассссчачо чЧеазастеусс аЕвдватвек стсававвас КЕЕСКТассї зрахазайва 00 зовцачаваа вапсатезЕс своксостсУ «сттсдаков бячувасвова осстазуавстї 180 кавісвавосй сіліазаваесв асаведаїай разобссьсо анасазваса айзаасцадча 250 пссідасвя апоссзавасс спасасзавнт зазоЗдассв азаадетасо сабасотаря ОПО гпахкаваксвивй оссяасастса вгясуєссоа ссавічЧасав аатбксовеяа зстеастсова 50 скстачазас свавкеоее себе дасааоа азпсостачзав кава ста зара жвцЧаче йо ровчабатоса совассатах чЄєсзасксає патасшчесзко аоствесава савсасесдяєс во стсцасдаса асбуатсаїв агасассасо дасасгдват бвавайьсач савуєесенкк дЯо
Ехо сусва ваваставася апбсазасаєс сазавросова БсЕВасесее біваєвссов ВО вабгбісасз дісвасстає сабуаоцдвав автсосувааї ЗЕЕсовдбос всвадссвва 50 сечттсвисес еЕрасесза сісаньсвах стсвнаєстсзі абсастєдас бстассртвося ля асзацчстасс завасочсо савчусседасс гассвлодоє зсабсазакса зесуславсай 50 чсевтшкстса аайаатьоте ссостоссат сбавдаттпс ксасбссопкОо заботакозя 040. звастазосо зпасбссося ссасровзаст згадогаассо сасаєтчвов стчсразаєь 90 азиссавгсв ЕМ Еаавас сдауссивос вагова ЧЕсвевсас Явка БО пссусідазаа зсчссаадєсо счачцісвясе їсарсоззаве саззсцянаєє аасааєсеся ЗО звасочачва зазаосавкеко сосежсе є засссеассве зчксозасе сскЕсгалаа 108 зачцадссвов асастасов себе їла «10 3 «кві їх 35 сеї» ДН «2132 Медісасою капс «ап 37 асвснасгса басвеовсава ссаавєаисся ваша -За їх ЗВ чтй1ї ав «вх соввУуріцив Пів хаб з8 сщивчкасбас БВоссстасв скоЗаєЧечУ Уа едеова Чвасносаве сезайвсваача БО встачелома еївтявозат заадсзотвоеУ усазЕтавні затсочоваа вазслесайту ТИ зачесазавї гесасввх цзасссеосз зббаскпсоє зепавкуано сюБвЕсавок Во гепзасвасва табсауєсеос ссодстоєсба ваїзставач зсововов Зсбакчивох а ле ее сосок их среавоссста бозазоаати сЕговакааа забудову ре «М» 15 «її» 436 «вІ1йж ЛЕ яю х соваувгцт Ваптрайелве «ас» за часаазачви пуссссасах споавіссав вастеслбва СЧЕссовукс ассттоасі вах І516; птрсдасстне же ксвоу адкссвоцаЯ спопаїсобаке вкакоучяст Стостасввза 150 зааасогаса сбпвесскасе актзсактає астстрочау асастлютих Таскеквека ЗО ссгесспЗаоб зсастсВвос сСтсціатст аацазаєека седсставкт гукжсцояак го аЕЧеяЕЦаКЕ ЧоаілевЕос пагбспаїаса їастататавй йаосавттає досвапловада ЗО засцоадхаз дазстсасав асасавачаЄ судахєсссзя ассгсовіоса вассазтска 359 сгазвоссасає запеїгазса сгаазавтаво чочагбсоцтх взгаввттєсд вагстстоту о шЕтанЕВуЧ спав ї 138 «10» їй «ух 315 «дя днк «Ед бовауріцт Бахвадезе ко» о кавтсасстоя ссасасачев Бссотасахв сбчаїпсогруа серб чаада зевтсавася Бо заасвацевс садесреЕнат акчвсдасва деаставузь застава Бооддеанава жо саасавілза чосазавеве сатжкастиа чЧесспіцепує зайобесосто сосасавлокк 8о
КУЕЕсСЕжвЕв спека кає збдсаЗівіо ЗбтеооскКЯ вадкоствав озбЕссадаєт 40 ауісвтдоко слекенЕсвт сспсоботекЕ шЕКжадсоКЕс абсвасаснва гавкав 300 зва всашт а «а10 4 «2115 315 «ий Ак рах ссевуріми Бахозавиве «ем т авссвстасзчаєс астчзкасає чКасевісас сСебосвусвна Обов Еоує тата що зсарочІвВа саавазааву «Сас ЧаАсст васваковас длчсаввсось ссатбсзсстя 120 зтчасспавсз босі чсата сабпасазахь стзлазечавт зваусквєаєа сіаквотова СВО яестазсскто засустцетр соваеас са всдссавсвв асекоактЕса савессваюо я лацентвіас кахзиьвіс кс дстовалактаи Каїксевсев аскдевавке падсатвост 0 сбаксацєвь встсє ТЕЗ «рій» 42 «її» ЗБ «1 дяк ча штучна поблідсвяість хоп» «вх шщівс Ебвицше ше Тр. яп тря тв: г ЧЕ ктлях жура Хжрой х па тр виеьет ги до сах я, сю «Ка Група хімерних регуляторних елементів транскрипції бо лизжті.
ВАК, «а0ох їх
Часссчаєчо чачассскоо васвавочех вихарссода вассобесютва сапеоссвегу о псесасстасо рсастоса споровазах єзхоздазаза савлуєтесс сестаслваєо 199 сєсаєссаєвтос дбасваайзаха зудосатсЯає сспазоазцєс ссідцосояса чісстсоссва 180 алабозассс сслоосавода ссачсвсЧе солазавова оасчвсссаа ссаосцсеопоєс 4 «вачсвачко дача авкпсіссзає Бопозсоко сваасаваззаа савастассстоа Зоо азвчсскссес счасросяву аЯзссвускас отароясісь зоба сдавча восадлава 360 чачачосує гссгасянахє чосассасвя содахзазтоа чвочеесвсо склзачаєує Я шхискчссовс засчшсоссоса засасочасс оссвоссасо заспапсвисо босалваааа яЯО зчасчвтсса зссасяссЕх саепдсавах чспастаасає дасазкссоса безасопава ЗО зчасдяасеса сазсоссаст абсостсуса вувассосісс сокатасбава павузксяке 605 ссасгбісоач возасаєсс азасвдвава абісчоваса ідо гсаса вассокосвані 665 звЕсастсако гавстЗбсаз сстбсвваск осел ВаКековеда ВЕ ту ких 43 її» ві3 «Ей дик вий» йпвучна побпідовніЕсть «ех як мес ква Ке «аури (1... (543) вла Побилений 355 промотоВ влоруєт моватки цвітнеї капусти.
Оп «З паїссезасає зашеаспінео васала засвнссозіав вассвсостсЯ зассесаєти 50 спесацетатеш Сбухевсосквз брас оваовЕ зУсаславай павзтдтадет ссеасават Тай ссгкатсартос Часавасова содоссвссог боевасвоссо тотооспаса збодпипсосав Ії ачасочуасся ссасссаосс чЧовосессче: чЧазазаадава часоскесваа ссавопьссвс што завасвзазкЗ цайбсзасесу агоцссодає сдвдасевЕв содсзеазоя базсавесоящ ЗИ квасстеєстс одоувсеоссасх досовустає седтєвоївІ вгсобтоваца гапсоадааав 360 учазасчсоус ссстасваває сссассас ся суасаавачуа заспооесассу сблпвадабус 420 птісстдестас вдсочісссвз азпабозасо сссвасссася яочадосвкса спузваавача НО ацпвсабїсса арсасоресЕ сяавацеяаоцв зсчабковісі чабарстосса сісаоусяв БО сзасчасопса сазпспсаєх врсстосзса завссептсо сствтасгава зпадзеславве бо гсзвогтодая вод БІ «1 4 «т ОК тиїй ДНК «РІ» Штучна послідовність кри вет тізс Кеавктише шу 1. КАМЮ «ие Нативва пссліцевніств 508 з інтронком, який вирізається «ке ща акадіссясс соосадчавас сссавсосує чЧазахсвава застссасеу сеча БИ пссацісссо вподессвавне спозчазваси зерсоазсшів Чого аавас сосцвраслав ТО
Чцзавазссзод савксяскає пссзоасявь гтїнасовес вззсбсзссов бусадатєвеєх 189 сетсавтовзеч сзасахсух стзусасова сусовадтос ткагассуга зузгкчеазса 245 чЧассзавака сочозессоисо тексоасасу зчісасотате зсдосвавчте ЧеосзчЧєсаає З00 чаїсзалаао забзчаса бсадчодосаює сагаєвцссає стлавдєста зосовосссо ЗВО сесчррасой сочазаво сЗзЕзезчсава сЕМесассо тасокиссчає аоятарасах Я
Бяастассає бзвгстстад бватаясвата госсавачає пжересвивя зезачасааг ЯКБИ зівссасаха доваслясве состоснакі гасвяаарчвя Беквісссаз сбсвсачевк 545 сЕспватака сЧасснайвь сс лавзх пслодхацєев сосочка лдеайпейсдяно 500 праазасхясс зедссвтсос зоссовсасзайлта зідЧассассод восданазспо салозаляля зв) пацпшствясї БссевтзчаїтвЕ стбравоссву досудавесо вассзсваєсує вабосоство ТВО впоеасзшспа зсасстодог чпсастатгатс асспіспсов соасактассас осазвдавєтає КО звссатасої січиссасту зозоЧесево зссаасузт ат'агсазео гзЧазсптотоак ба запасосвс сасачесаУє подсавсїозча сазудсаста седцечасике псаазсоеке 90 ааксесодеснсю гспочевасс упакчазчеє гатхскспасюв гаскусосяє свсзуссяава Зб ачессаводлсвуч заоч засве стасссасте сусстачуса оо ксате часвоссает 190 цпчсцазсяає ксксапвстаж обасавассу зескасеосСь Суодокогод сеозссяавува еВО пахпсочаає: со соссах асо ечас асо соча так асесста ссзоечезев 154 ассчасссов ссоаачассва ссосссвосяє ассскасасу зоссскасос славуаоьо 300 сксчассчоа сазакоавса сочсакочечЧ дечаєвадвсЯ аваєстаесцс касвадевве 9769 засстсссво Безутчсассяс сбосуавосЯ соусвасаваусє ссвазсввої усасадоцав ВЗ3ий ласпсатлосв зосудоваас працесвеауед слєспотаєвау сдвпіваяса чесдатадео 139 спіцясввав ассасповзаєт согзасзася Сазачсассо ссвзаєсдвасс довтасссят 1440 срзсазчуєо сасупцеавса кепедодоса сІсчсцават свзасаоасва астсвавсиоу 1500. зссилукссза ссасстосує сазозсвасоа стстоодасс стсасаєссза тассасозас 1565 пасстсїсоч асчусостлез сстсзвссоує саєсзезчаєї зУсапасоса звасоченеах БО сЕдуаазсоу бадзохачує зссоцазана звасевскоац сетоцсвзоцуа дзавсеарах 15853 сазссзаєств псассассча аслодусако чдабсасусктас пеочччсьзсе сесавсчкас 174 ассцасажчї Фаачсаваца зсассвоусУк ссасадесуд асаботасса сспсувсвек 1800 чаїссчсоьса деисестписяах сФпазкЧчазсово чеветазасе бсуссавекк Сосчассвсо Щїп59 свадсасекає гпочезсеЯа судіааєсває завузпаЄов сбасевуєча сочсазаєс 1899 зачосасспач сс овЯсв здсазвавсЯс соаасроадеа сдаастсесзо пузайвасся 1980 сачезсаозо Осавазсавст я 2ОщІ «Ом 5 «2115 1553 чиїм лк «ких твпобіпня рута1її5 «ОО 45 акдулацаєу ссвзаніаасаеає азадчеевово ссадедчесеь певассосео «чада света БО зссчевсави зосазоссаса свашоеставая зезвопасасч боссцавксо квазасваво 150 зесссгтасяд зпзсасатає сувозсчвас вЕсасссвод садяаевово собваясувес То
ЧессяаЕсоа сСвсвааестах звазсаасв саусосчазнна сзавссаесяе аагстпессава ай сасвдбовай вопстоєтосв актстжтахц сов оч бсасуєсаєє сабсазазье 305 псвоссссаю ссуєсзаасочв сСсасстасєває жвасчсазас баспрсавсяв бассваєснЕс 360
Есуслоасста бод бадеці зассгоосвка зачодиткщо заасвакрсс свасасчсва 80 таззаакттас савтаасосв савваєтєасу зсзабопеоо совачасозе біассаосу а
Сгттсвоїсов сатасволіс сотсасаїхсї савосассто содостісвна гузасасов 5830 сісасассаф ацеостсссв геабдасаива Ясаатсчусве боачсавесшав ссессовуда 600 секасталат сесставцач сусачсолсмт ссосасацає соч сЯє сао ев сзісисвуєу азсосувесее судсзаєсав ВЕКонІсосЯЯ зечстповах сбавоаєоте 720 чежбссовстос весасозкЕЄ Бдовабавсе есезсасводя часясссцає абукаватої 7850 сайссавот сваєогаєвт астсуавадва зазчзетаєсит сассоавессої сспздасовс БО завакісваз дпоспісоої аббассвасс старо ове сеспсопсав ваповстото ЗО асгцвсавас возасїсасо свзаєтсасас свавссчско сіссозчево ассбоктжеа сЯБО азадевсассст подвадчесеє сосвазаєсе ббссабсссс саздочавася асвачсаєво йо
Задпстсасіт ауастасабс здераспссд аскасаосспа вачслайвоа сазавосЯадас 1080 чочапспате забстауєтоє актесєссвцав суаазаска гзласссодва гассудаана 1150 авзчзессладоа стантсадаа асапсдавтсз сагабозаад двссствосає паці ссак 1590 саслізаавса вксосцуваве чдзссадеасс кгЧасссавса аззасчлаво всузсасксв ТиБО соавчаесасав зЕсвстоуча сдазувочав овстєсвосв євасеовасоу сстузацюсь 1370 стаяттавас: абаазбсата сапу соссустяває сдавредає вод овота 1380 басеспсавов косксдаєсос чдочсаусопев дчеесеоосу асзаєссасов созсдатось 1490 сподосасву тарі созосасоца звоассасца сауаазаавов дабсостеь 1500 касабсзсса апкЕсаядьвас васобсдаза авяткусасо Звчповавкає сбесстасає 1568 чвазакассса вадпоессскас содаваастс часусавсав вавосауала сзбсопсвса 1620 заддтесзвасв Вод Іоссвах сЕссяваєто ода 1653 «Ре в «31» 36 «ВІ» дак «ті» Кепвлііля гепібсоктів аа» шк асо задсчЧтасоца бесссвосаа сдосавоцеа бавксаєвош Фдтсвеваас БО тадпебпоасо зсвачезовяє: Чазсососту чзвстсосвЕла гсайстеаста сао 150 зачсводсоу зуаасуссяє часову сасзакавоу стасзсовацч оїассозхя Зо падшсаєсосод кусоксвосяї бузасессуза ссбзаакасв тсаБсостща ссгдакочує се агчатавші сеозусзазчаб сзудчавсзче тсасаєсусс Бсстадастсв стасвазчувс 00 скЕсасстосту пувісчассї осібваоско ссавазаваа свсосстеє зозоссвозас 150 кассчаосьх зсссбоооокЕ ссастасксос сасчадсваос зачасадоко сазвабчесакс ЗУ укесатоссо ааадхкчссої доасуазавіс сзассстзчЯо асчачідосв савсатєсзач 48о чазчисвисо спобсессав дзчочаваяа чЧасцчасваве кучсосіпча даававсьоо 24 кЕСЯВСцадВ стабопсссоо вадезадаос абусязайвос бузауессоя Зевса ОО пествоскаЯ адеспівсва чбасваЧчече чадассачає часевасоот стестадосе бБб сесзваатос сістсозства зпзвзосвач ссотасовся їссеалаєвяк сспсавслає ТІ азсатлосвсо песочаподя воавсазисвя ссівачаває безбодазчес спазосеоз но тЕсжсттссе впостастеє ссвадсааасх васавствосс ссзасасосса сексдочавнеа Веб чЧчЕлдзасодсо шосасьссза ссаздчапчас чдеоспосацаву ваассоллова човсяссвая 00 засстсаїво алпопсосчс зЗзазеадсчач сват. з36 «сип 47 «її 1т1адя какаг днк кв Шипусєна послідовність кий «ше що Еввбахге ших А. (1445) «вш» Група хімерних регуляторних елементів трванскрипицтй вс
ЕКК. «ДІНих 47 чексеозатк ацчассвоса зсвгвзозузка збагссваза ассбостсоя акесовЕкшо що сптадчсттвось сасевсоесках Бакодвлацасеа зчеацазазчу вачасзаскос спасаваєсоє 1550 саксаистсся зсазаутава зассвосвась ззазаєуєсє сочосласво бадесстсвав ТО заспосдсссо сдсосдсчад Запсагссаба сазнавлпави попе вссвас гасі са Ат заскнавсссоп сасссаслчед слелсастесЯ слизнлачвауч запалу дасте шара заоасавокоз аспдатасла сопсоосоаазіє ЧазЗасесссо азсаваечоаче пасе ссосов 800 ватсксстьсос закиоссавсод севадєтасо суттево та сіб озача забезчававас ЗБ чпавчаслисе сспасвавев совгврасвос датайвасоавза вауесахсЯе бозазасчсею 80 псепладссовск дпоадесссав ачатодаесост ссасосвоча Чаваасвессв зсгаававшщаа ії50 пасозустсда сеесавшото аавзсааос ахлодаччея алашснссас поасапайоя о чвстасчеве чагстсвоїв ссстссчова чесестстест совсаввачУч вазкеоввшє бо свитскчааля сласасзста асзазосавс пставасвцає стзссотсве бсуугасиоає 655
Ксеастссоєо спсечсскІ пбрассдесса сої соросістч загс стсЕ ЕЧсасоцково їх
Бтасісачазч бодексвосо доасскачна брасастокоа завьсзваєь стодосвтеоую 7ЯОо гчастастжа сезпсосєсса сзосзосвав ссвпеалосас апчасаувас пазесавзаде ЯО баззапосас всапсавгаєт часававохоа баеасггіпЧес сіпачетата ета тадо З90 се«сзтЯЧкецо басбатачауф озон свовачееся стаставсвх вуловсвоєе со стсакастас зсобсассаат адусвовасуа ссвзрассає аооспаєаєт везагравстк 3055 зпісцсстає дозасттасє вестпссаав ВвсувовкашЕ соссакЕсте БЕК ВЕДЕ Т5БО
ЧеФотаєкав астугсквасо ссбозвоува СвавтасСвав дастваааес сроввцЕкса 1140 кскссасобс ЕесСассохув совівачьсе зсассазасо свевеавіто завсвекоаєв 19500 зиссцавдега абаечьрастоЯ асачсаєсе чагасвесда ссбасЕкЧек ге жокавсв 1269 звакістваава вглавозаяку ксеслеєтлав босісхсеве зшбсссгсає зусатстаце 1595 жкссзссави: Ецасазката ссосековсї стасаєвсяв акобсчєтся ажхосоктевс 1380 псізасакЕсо ассастоста сгсвсатазчи соптадссиве гісаєЄсоасва сусаЗаєвся 1445 вазсза 1446
ЕТО «в «І 075 теща ди «иа Щеучна посвідевність ква»
КЕФІР шізс Геабике
ЖИ» ПЕР дека Група хімерних регуляторних елементів транскрипції або кВ. «8002 28 даїспеатої част вЕсс засазвазтує взапасосота засетесвепф зпаросево ко бо посзлдстаєо сспосвасієта бесдепазлає ваостодаваос павастадст ссівсавашеа 15 сезвкісабесо засанетоаж дудчосавсоє сдуазсаєзсо бШебдсссаса збаокессва 130 аласлзвассо ссассовсуа Зсадевнссує чЧодаавсспає зас босяя ссоасавшвог ля азвачезази часеласяьо ахзаоосствь човавеві сСоагасзавча чдезаєвсаоа 302 чазаєстосЕ соадвобосає Кдессадика петабсовоссо саєсосозай атачецавая ЗО «Чеазадасо спевкаєвая Косовссяке деовсаввоуу взааздосаєс яекоаааоракя 42 сспосассда сачеччЧЕсСст авачасодаєс сосожссовс даФувосвко дра ава ще вачасчиос забсбасусск козавоовяЯ сбаастчавоу уакатоес аосузсусав 340 чЧсзаспасоас всаасессає такссшявсос азуаососсос сестакасва совацектає 500 репассбозЗа заузавссас стсссзсваЗа обсвадссво восаксдцау азсасасвтє бо часвасасас сасам ть
«их 4а «81115 23 «Ей днк
СЕТИх вакоювосевгіци: бипекасієтів «ох З чакхсчігсва зсветкозосв асвавуекьс стайцахстЧа агсстаптспс сапксвЕдет бо акдарсдіса баптаватієсе сесовассаєс урсваосасоя савсвааства савоївавщо МО зізасзгстас гозтлазаєт зве тата зетачащисо сесавттата сасксадбас. 180 чечасадава асваватаса здоососвавс сзуздасвааь сгассцезсас дерева о о сук ЖЖ дюн Я м, во хх, зсзгвассв ах 25 «ЩО о «2115 ві: «і» Дяк
ЖЕ Біусіцвре жах «асп 59 зісававаса пскааБасУс зак кгаву завааватає зсваєваєве асттакевке о чаараксзає совівкусаї КеЕггпевавв сосабсасає зрблассває севавсайов Б5О тіагаксевс аснвавЕтьу сакєсебЕзбо забсроєсвся сег сіве сагаєктває 50 засчастаку сіссваслає сазісастає сспіасатау Зесасасає бусавссвка ЧО паавчкотвс віп савктт вествкочєоЗа сзосескса авссваваусоих ссаслодчесщ 300 сеЕсасслято за«тсузква сазесреаває сзассвовсв стсвтссеоє стосассава ЗБ вгїзассікч човлеспосча вішосасзас асечасствещі сопупоцахо апаасовавва до ссозасилдас зазводассас яазасасавс даплесвесо сКшсаадо застасслвая яО
ЕБсвсвадає ссзвасаваа асосваїсасй всасаззкчуйа саїсастові сбвосзчсва 54 хисжосвосс сиссоссСсеве вадававзявс сСосдпаспосва еноссасоса савсавехою що касксаєсєвна чупавсваіс дазсвулеся взасбсабєссвс сбавеесваєсє сассвсчвас ве ссасасвіїв чвар реста зссовасовс ваавесосвиви бобокусссв сасобсвшив й паспіаштвг свзасасссзх стазвспоасаї зсосасесспас дассвааваєх ссасоасятам о то тазсовадасс Ббаспдеастата заїзісвчса арсоксозссс вул сртсат сассвадави В . да с ЗБ че АЩ ві «КІ чий
ДЕ ДЯК: «13; піруйш можаїко жоржини:
Св кеОря Зі вісвазудад зеаасаавчає заазассвасє бастсасвтя авазаетає: зебоашему БИ састагсчзао созовасекс садасазччас чезачсассї бабоссосссь КБсззозаяото 185 ассассвага асчатуєває ча давсюв сссасівачь пастшесога свавсвостє 80 вазачассас Содссдвсова хсапавсобас ссопезсосоа сазаечеазає стосасказс 255 заїазсасва зесстасасе гтаспасаає сесасестсса апаасчсауа зазаовосяос Зо зчсаЧкдасе васаводосс завазасско сетасасват чеасавсвесо сссоасніа бо азассиссда зацієпавае авсаакобос стостовава вабосасеті Есвтовусєв 490 й зи
Ех п ване 935 «їй пк «ем вірус птриховності бвнана штам поотівата Бета «Об» Зх азесазостя двесзвтаха стовасаса кечсбасстас с ассаззаеау чавоестоеваос а астталоспьї зпдзачаїстоу восдавланасс вувасосзаб ссасствасо стасачавссу 170 ссаззазцдаєз тасдпасаєсо поузассотасї саасоуссвас авбавосаєсї саавчактсс 189 спадсасасод чеочаатоє гооаоссан стече асхв сосесвасса сусесчисца ЩО стзвкЧсспат одеса ссьве дос сспдса васткізоца зсбасісказа псавадесатте 00 сасазвсбтао чезсззачає авізаєоовс ссаоасгсувоа стЕгаБесах зазяссагт БО тхатспвсвос абссвкссзчає зссосусбтос асосівзачса абссосачев секс ова 35 ізязачзавос ссокуснатс асобесавас чепсваоео сеспстчосве зшисасйьиок НО зазессчать созсуковах влеадвісха «сссксскех саБаєестах ссобсвавця 540 ксласстіаа сопадовувах зсбалаасаває зоосеозаУ аЕКоссяест БЮ Ох
КАМИ 3 «т11 зна «р1й» днк кві» вішбуєс кідьцевого гревіювання своздики «Од 33 впсстснаси БосазесвЧа поссздовас сусавастст сачЧаїесга касове, ча згас ьскв візтазалай аазайпсласо чес лтсваваст сабзовясія сюсласдацев їй чЧчсавзабоста саатазезез содассевосе свсссжхосау зетпаїасвте аксаласвсх ЇВО чазеваєсзча соуассстас састаєссвнаа Фвзчачвиунс косовавач авазарнвко 24 сабсвжЕтавї забссассїв стбссдвсу свЕЯдсабаво ЧЕстаасаєо сасбсосвієс 300 асзисрісос пузсовсвса зазудасівва адхсісаксеа повасдосакс даааваазай 363 вскЕсзазЕсо асссстслай ад зве «ву» па рії іх сеї днк «РІЗ» Сллхнців мео «по а акнахкккайи застава доасвацттккк базцязгваає асвусскоаа завис БО заазігізасп дезузачаса всезакувда звачдвдвака носу сш десваздаця 18 апзочовваєє бсассоавоу зевКаєсова сопіскасьс авассктама аоостаскес 180 бросоувгсвда бсссвзаааьс всзсвовсос Збезазавеву чебсавБав сбосвавтсєс Яяи сагтасазас ссастієтав ссбзозоїса стікросяас пвсагаттая басесстадит 500 гсагабаєссов зІбасазаза бадевссікЕ развсаєссспвак зЧдвассібкУ авдастссква ЗО
Бадеїсаваз дасаесскркд авасвасара азтаакасЕкЕ бузвсососвв асазадатав 459 сСссячасвоо сокозаано сСоцисавоодв часпаозава бзасвазцвз вадвоваазав 480 севопсшкчива зпадосгосчсс чЧопазчасоспе счаодассве збдшавоачак ставав Бай сазгЧавочшст ассессосин йсазоазсавт прлзаратся касаеаачев псовсавасє бо пізЕвазсва зсссіссаве ссазісоса Беогресате сспоассдсаа пад ставора оо чЧевусстесте бсоссозУузео воЯчевЕссо сегабсвксв їв свкосв Соссстесає 9о пості оксс сзЕЕтаекся збадссссвв асешобсоио ссКЕБЯсКає есе срово Тео ївсавсосхаа сзідавактат засктоцетв чату веуо сББгаскеЗк заккаваоя, 54о всстлоІвов шоссе сашєЄ стісвсстоє сеуКоЧЕЧе Сорос е касок атцу ЗО скваквопас деешиепосоо зссавзісптає суп соя зоба цева їкссезвзрацес: БО човдатоевос аКссгізвиств мтс вуєтча Боцстабсоазе саке сосає бстесравеьв Ци о іасеЕвекої Ззбрскацевє ссатвавно сессвкатає вакгсаасаво екстоссвоасо ОВО давачів всасточспів здаахаїеєста зе стасщт Басклацабая сасчавалосва 140 звігвзвавітстач зассассево анастосрсицу забави безроассгоя пес певає ЗИ пепкастсшео сачхсссЕко ассеазенох савос 1235 «из За чашу 1
«их ДЕК «ІЗ» птучна послпідовністе код» ага щтізс Хеасоке «00» (..1865) «З» Група хікерних регуляторних елементів транскрипції або
ВК. «ібо» 55 авсвоксаць ссеазчсохє азсвазчатсвз ззасзсачав гессбанасс асевуссяая 080 випстасвуЯз пзосчабосаз дзассгосва бсавачетвнає стастасеоб зусасвктаса 15 ксасудесву савЯсСевово зававайасове осассдзвта згспавуєса чбодчевавово КО кЕзазайсзеа ссстшеовас асоцадсвчє срзсєсосуєя чозссовзовося вазавнсвавк йо часусачази пабкачссає востасовай вабабсобута осстнеясеЯс авелабаває 00 пацаквсссо Євузасавас доусавозва асбяасссчцев заздадекас ссєсдасасеє 50 сассовстав сасстаїлас дзвасосвасо асчассасаа вадваєскасо босавчегсва о тасттязпад састосатах садок ісавс снасавочтв суадосазесвк сасвтєвЕтс Но азаастсобаєт суссаазаєс авозатовас Боссатсстос ваауцетеоа ватсавужає 340 ссісалЕсса азпсесксавс авазотсвоазоа гасачаваєст ссвависякг ашосаавялавсе вБО0 асвучаувеї савсувачавй пссссвасса авосаааєта сопевесвос асаїзсясом Вб седесвасла зЕпЕсзувая вапасабсоя ссодвоасто язачесазчто досаюстіка Тай зазасавнсст блгсзесаїє чаусавссоад сегехочаса сеазрасазаав азосчааошУує о цезсзаваскає сасасасвасо бвссазавоав асетсвоєех Етвскураля деслеваова ко аксжсстсказ свсаястоуа одаасяаваса всосазаазе зацсрахссї засвоасосво о кбхсбавслео узасдвосве стсзусуяєсд с восвовеявЯ васросесест зкатавцава зво) псвилевЕсс псактсчаач баїсагсаза касадссасо крсслсовевсос теваассаса ЩТОйО стзссФтуада зсасаєвзо збаводовсо асазбузаєє чассаєовес чесаезедсе 1080 кадсібосдписо ссбдссс стаскубсас яса акдстовсот зло х 1145 їтссізеуцаб чззсееадсто зазросаданах сасастсяза зако басстабуск 1960 чактастсве сзбоспіпає восаспсалав бапаловвся слаєзлраст азасувачає 10 апаасоствса сачеваєвст азлаазічкоа вапітоастю спадепаках скасгріавзас 1320 дочка УчЕ ч«ЕБагазосе астусустаєіс ачевастсде сб созастів сосвзсвадех 1350 ссасвстаса Боупксвнава зсасасочак севсвсіпаїа сбесцатаств тавсавовта 154) ттсоїстоса заустватка стіадссавав сЕзпасатес сбваєтсакатє тесавЕкова 1500 касрчссава соаставсує созаацавас завбагавеї уесавйазаєєє був есак 1565 сотраставе сЕВсСВЯБбоВвО сабаасесва Заєсачакеє асгжокіЕка айсайккакта лето
Есхозвачаса павачевоваа сацпеевиоч впасавсчас спека застава асав 690 аахставаза Баваеудваск ссобосекдеє декспсонта сокссвузву усасстяаота Уа пзхассваєх чЧисастахєавь соасскотсЕВ васвтабсавба вовсосвода сороєтекєсс 1800 сказеціваа сезазсбвгвас срасасзасс ссрапесасе ссаєтасвахє десацеасатсся 1860 засад 1855 кт 0» в «2115 0 «дах дн «1 Окуха чзагіхта «400 5 аспгвасечне ссбосассо став рвос апассессвс асстасуєвев аведоссовв ва їасвасасацваи ссстосевоа сзутасссвава спабосссво госесасагаєс ваіябавсагоє 120 засцактстчає ставсасєтоє Бастасабна сЄбцаєссраєс ачссбоцвісв содтавевва Іво стастечив вес саааЕ вазацентии кесассса Кгавсваєта Яекасьесив оч тбусасовасє ссресатага астачвеваз срластасся вбтувасвеоч абчексдаву ЗО «105 57 кат». зах «ВТ НК «а135 Ммізоєвьниав бабаєсшше «ав з зчесашстастя сеСЕсЕтОсСТ стгсвасаве тавсосаКс сокросавнкя пово пота би пассцаасає ссдвавсткса бдастоавевоа сачвсглас Бзбазобзуч сЕсбогаєся 15 сзЕваєстатс стказесвЕЕ скосу Зсскескева кустамуєсо сбаєевтяа ХВО зазсассвес совстЕсанї зісведракс сука свнас зкавусваєє сор сров гло татитттвда вгсзавааєс спреваУсесу додсвавзад возствулав сседапссвнис о З00 асксцроІсроез Бдсваазеаеас ее пеяиВе чагвучічкх ситу азцави зстасссачЕ ЗО пикпоасоса себе зешсасе солпаазазо Чпузсазесзч звасссекса тасасвпчае Зо чкавасчгеаЧ ссатлаєває цесересссої зссасеєясе сістасаєее сродсавауе а
Екочсасчос Боебсзсраца саосовссдо бесодтасак ссспбозача зрдаадеашє ЯЗ тІвудпасстеу соч еевя схе топгсас яісчасссоза саесавятан хстазавадчав йо їзЗЧстазоах бесодсокоасня посвассвае зкаставляас вачечасьск баса ово БО востсс ої вся ч шоб рсаєв сазузазовза азсасбасвсх сочдесакасю ТЕО сптетрсссоу крсвабодка звоавоалзача всадагбвасу мтасклосцю сусазасаєв Іо кцуасассЕЧЕ ЧаїЗесвкоОв базевазуаєт ЄсеБЕкКЕхо оБЕесваВЕх адексавове Я тасстровзоса зтпттосасва доастватасєс асвапосве твісслоевас за ай
Claims (13)
1. Рекомбінантна молекула ДНК, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи, що складається з: а) послідовності ДНК зі щонайменше 95 відсотками ідентичності послідовності до будь-якої з ЗЕО ІЮ МО: 1-30; б) послідовності ДНК, яка містить будь-яку з ФЕО ІЮ МО: 1-30; та в) окремого фрагмента будь-якої з 5ЕО ІЮ МО: 1-30, причому цей фрагмент має ген- регуляторну активність; при цьому зазначена послідовність ДНК функціонально зв'язана з гетерологічною молекулою ДНК, яка транскрибується.
2. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що вказана послідовність ДНК має щонайменше близько 97 відсотків ідентичності послідовності до послідовності ДНК будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 1-30.
3. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що вказана послідовність ДНК містить будь-яку з БЕО ІЮ МО: 1-30.
4. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що гетерологічна полінуклеотидна молекула, яка транскрибується, містить ген, який представляє агрономічний інтерес.
5. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 4, яка відрізняється тим, що ген, який представляє агрономічний інтерес, обумовлює у рослин толерантність до гербіцидів.
6. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 4, яка відрізняється тим, що ген, який представляє агрономічний інтерес, обумовлює у рослин стійкість до шкідників.
7. Клітина трансгенної рослини, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка містить послідовність ДНК, вибрану із групи, що складається з: а) послідовності ДНК із щонайменше 95 відсотками ідентичності послідовності до будь-якої з ЗЕО ІЮ МО: 1-30; Ко) б) послідовності ДНК, яка містить будь-яку з ФЕО ІЮ МО: 1-30; і в) окремого фрагмента будь-якої з 5ЕО ІЮ МО: 1-30, причому цей фрагмент має ген- регуляторну активність; при цьому зазначена послідовність ДНК функціонально зв'язана з гетерологічною молекулою ДНК, яка транскрибується.
8. Клітина трансгенної рослини за п. 7, яка відрізняється тим, що вказана клітина трансгенної рослини являє собою клітину однодольної рослини.
9. Клітина трансгенної рослини за п. 7, яка відрізняється тим, що вказана клітина трансгенної рослини являє собою клітину дводольної рослини.
10. Трансгенна рослина або її частина, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи, що складається з: а) послідовності ДНК із щонайменше 95 відсотками ідентичності послідовності до будь-якої з ЗЕО ІЮ МО: 1-30; б) послідовності ДНК, яка містить будь-яку з ФЕО ІЮ МО: 1-30; і в) окремого фрагмента будь-якої з 5ЕО ІЮ МО: 1-30, причому цей фрагмент має ген- регуляторну активність; при цьому вказана послідовність ДНК функціонально зв'язана з гетерологічною молекулою ДНК, яка транскрибується.
11. Рослина-нащадок трансгенної рослини за п. 10, яка відрізняється тим, що рослина- нащадок містить молекулу рекомбінантної ДНК за будь-яким з пп. 1-4.
12. Трансгенна насінина із трансгенної рослини за п. 10, яка відрізняється тим, що трансгенна насінина містить молекулу рекомбінантної ДНК за будь-яким з пп. 1-4.
13. Спосіб отримання трансгенної рослини, який включає:
а) трансформацію клітини рослини рекомбінантною молекулою ДНК за п. 1 для отримання трансформованої клітини рослини; і б) регенерацію трансгенної рослини із трансформованої клітини рослини. Конфігурація ексиресійної касети 1 Кіюмотор або ХИМерннй с, Кодуюча промотор Лідер Литрон область тнІв ІАЇ НО Ів Ії т о Конфігурація експрецйної касети 2 Промотор бо Ккодуюча химерний Лідер Інтрон о Ліде У пи ІЕромотер щі Р область ІА) Не Ше Ії їх Конфігурація експресійної касети З Промотор або химерний . Кодукині Кодуюча шромотор Лідер область о Інтрон Область фнТо Шш пе Го і. РІ пен ЗЕК Ех ко ок з век 1.
ФІГ. 1
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361785268P | 2013-03-14 | 2013-03-14 | |
| PCT/US2014/023648 WO2014159434A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-03-11 | Plant regulatory elements and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA119965C2 true UA119965C2 (uk) | 2019-09-10 |
Family
ID=51535220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201510009A UA119965C2 (uk) | 2013-03-14 | 2014-03-11 | Регуляторний елемент рослин та його застосування |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US9222099B2 (uk) |
| EP (5) | EP3587437A1 (uk) |
| JP (1) | JP6580027B2 (uk) |
| KR (12) | KR102495524B1 (uk) |
| CN (12) | CN108823203B (uk) |
| AP (1) | AP2015008728A0 (uk) |
| AR (13) | AR095662A1 (uk) |
| AU (15) | AU2014240589B2 (uk) |
| BR (12) | BR122020011549B1 (uk) |
| CA (2) | CA2904408C (uk) |
| CL (12) | CL2015002574A1 (uk) |
| CR (1) | CR20150532A (uk) |
| EA (1) | EA029474B1 (uk) |
| ES (1) | ES2741223T3 (uk) |
| GT (1) | GT201500270A (uk) |
| MX (12) | MX352566B (uk) |
| NI (1) | NI201500132A (uk) |
| NZ (1) | NZ711986A (uk) |
| UA (1) | UA119965C2 (uk) |
| UY (11) | UY35414A (uk) |
| WO (1) | WO2014159434A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201506496B (uk) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ711986A (en) | 2013-03-14 | 2020-08-28 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| BR112015031127A2 (pt) | 2013-06-14 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | evento de soja transgênica mon87751 e métodos para sua detecção e utilização |
| NZ745763A (en) | 2016-03-11 | 2022-08-26 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| AU2018210139B2 (en) * | 2017-01-19 | 2024-02-01 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| US11377662B2 (en) | 2018-01-10 | 2022-07-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Agrobacterium-mediated and particle bombardment transformation method for cowpea and dry bean meristem explants |
| CN108676803B (zh) * | 2018-06-07 | 2022-02-08 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种植物蒺藜苜蓿花器官柱头外露基因及其编码的蛋白与应用 |
| CN118792304A (zh) | 2018-08-03 | 2024-10-18 | 孟山都技术公司 | 植物调控元件及其用途 |
| US11414669B2 (en) | 2018-09-06 | 2022-08-16 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for genome editing in planta |
| CA3057917A1 (en) * | 2018-10-16 | 2020-04-16 | Monsanto Technology Llc | Brassica event mon94100 and methods of use thereof |
| CA3111605A1 (en) * | 2019-01-10 | 2020-07-16 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| US11225669B2 (en) * | 2019-07-18 | 2022-01-18 | Monsanto Technology Llc | Intergenic sequence regions and uses thereof |
| WO2021081264A1 (en) * | 2019-10-24 | 2021-04-29 | Pairwise Plants Services, Inc. | Optimized crispr-cas nucleases and base editors and methods of use thereof |
Family Cites Families (126)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US38446A (en) | 1863-05-05 | Improvement in the manufacture of sheet-iron hollow ware | ||
| US37543A (en) | 1863-01-27 | Improvement in machinery for cutting corks and bungs | ||
| US139600A (en) * | 1873-06-03 | Improvement in food from wheat and processes of preparing the same | ||
| US5352605A (en) | 1983-01-17 | 1994-10-04 | Monsanto Company | Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters |
| EP0185005B1 (en) | 1984-12-10 | 1992-01-22 | Monsanto Company | Insertion of the bacillus thuringiensis crystal protein gene into plant-colonizing microorganisms and their use |
| US6774283B1 (en) | 1985-07-29 | 2004-08-10 | Calgene Llc | Molecular farming |
| US6617496B1 (en) | 1985-10-16 | 2003-09-09 | Monsanto Company | Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs |
| US6608241B1 (en) | 1985-10-29 | 2003-08-19 | Monsanto Technology Llc | Protection of plants against viral infection |
| US5107065A (en) | 1986-03-28 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells |
| TR27832A (tr) | 1987-04-29 | 1995-08-31 | Monsanto Co | Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler. |
| US5229114A (en) | 1987-08-20 | 1993-07-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants |
| ES2060765T3 (es) | 1988-05-17 | 1994-12-01 | Lubrizol Genetics Inc | Sistema promotor de ubiquitina en plantas. |
| US5597718A (en) | 1988-10-04 | 1997-01-28 | Agracetus | Genetically engineering cotton plants for altered fiber |
| WO1990010076A1 (en) | 1989-02-24 | 1990-09-07 | Monsanto Company | Synthetic plant genes and method for preparation |
| US5689041A (en) | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| US6426447B1 (en) | 1990-11-14 | 2002-07-30 | Monsanto Technology Llc | Plant seed oils |
| US5543576A (en) | 1990-03-23 | 1996-08-06 | Mogen International | Production of enzymes in seeds and their use |
| US5969214A (en) | 1990-06-11 | 1999-10-19 | Calgene, Inc. | Glycogen biosynthetic enzymes in plants |
| US5498830A (en) | 1990-06-18 | 1996-03-12 | Monsanto Company | Decreased oil content in plant seeds |
| RU2148081C1 (ru) | 1990-06-18 | 2000-04-27 | Монсанто Компани | Способ получения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала и рекомбинантная двухцепочечная днк-молекула |
| DE69132939T2 (de) | 1990-06-25 | 2002-11-14 | Monsanto Technology Llc | Glyphosattolerante pflanzen |
| USRE38446E1 (en) | 1990-07-20 | 2004-02-24 | Calgene, Llc. | Sucrose phosphate synthase (SPS), its process for preparation its cDNA, and utilization of cDNA to modify the expression of SPS in plant cells |
| US6483008B1 (en) | 1990-08-15 | 2002-11-19 | Calgene Llc | Methods for producing plants with elevated oleic acid content |
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| US5866775A (en) | 1990-09-28 | 1999-02-02 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases |
| JPH06504668A (ja) | 1990-12-26 | 1994-06-02 | モンサント カンパニー | 果実の成熟および植物の老化の制御 |
| US5304730A (en) | 1991-09-03 | 1994-04-19 | Monsanto Company | Virus resistant plants and method therefore |
| US5763245A (en) | 1991-09-23 | 1998-06-09 | Monsanto Company | Method of controlling insects |
| US6015940A (en) | 1992-04-07 | 2000-01-18 | Monsanto Company | Virus resistant potato plants |
| US5850023A (en) | 1992-11-30 | 1998-12-15 | Monsanto Company | Modified plant viral replicase genes |
| US6011199A (en) | 1992-12-15 | 2000-01-04 | Commonwealth Scientific | Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour |
| US6013864A (en) | 1993-02-03 | 2000-01-11 | Monsanto Company | Plants resistant to infection by luteoviruses |
| US5322687A (en) | 1993-07-29 | 1994-06-21 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects |
| JPH08509871A (ja) | 1993-09-30 | 1996-10-22 | アグラシータス インコーポレイテッド | 異種ペルオキシダーゼを生産するトランスジェニック綿植物 |
| CZ131796A3 (en) | 1993-11-24 | 1996-10-16 | Monsanto Co | Plant pathogen control process |
| US6828475B1 (en) | 1994-06-23 | 2004-12-07 | Calgene Llc | Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism |
| US6140075A (en) | 1994-07-25 | 2000-10-31 | Monsanto Company | Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells |
| US6080560A (en) | 1994-07-25 | 2000-06-27 | Monsanto Company | Method for producing antibodies in plant cells |
| US5750876A (en) | 1994-07-28 | 1998-05-12 | Monsanto Company | Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases |
| US5716837A (en) | 1995-02-10 | 1998-02-10 | Monsanto Company | Expression of sucrose phosphorylase in plants |
| US6946588B2 (en) | 1996-03-13 | 2005-09-20 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use |
| US6091002A (en) | 1996-03-13 | 2000-07-18 | Monsanto Company | Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants |
| US5958745A (en) | 1996-03-13 | 1999-09-28 | Monsanto Company | Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants |
| US5773696A (en) | 1996-03-29 | 1998-06-30 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US6166292A (en) | 1996-04-26 | 2000-12-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant |
| US5985605A (en) | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada | DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms |
| US5998700A (en) | 1996-07-02 | 1999-12-07 | The Board Of Trustees Of Southern Illinois University | Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof |
| US5750848A (en) | 1996-08-13 | 1998-05-12 | Monsanto Company | DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates |
| US6063756A (en) | 1996-09-24 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor |
| US6093695A (en) | 1996-09-26 | 2000-07-25 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP |
| EP0938573A2 (en) | 1996-10-29 | 1999-09-01 | Calgene LLC | Plant cellulose synthase and promoter sequences |
| US6017534A (en) | 1996-11-20 | 2000-01-25 | Ecogen, Inc. | Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity |
| US6713063B1 (en) | 1996-11-20 | 2004-03-30 | Monsanto Technology, Llc | Broad-spectrum δ-endotoxins |
| JP4389075B2 (ja) | 1996-11-20 | 2009-12-24 | モンサント・テクノロジー・エルエルシー | 広域スペクトルのデルタ−エンドトキシン |
| US5942664A (en) | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
| US6121436A (en) | 1996-12-13 | 2000-09-19 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US6171640B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-01-09 | Monsanto Company | High beta-conglycinin products and their use |
| AR013633A1 (es) | 1997-04-11 | 2001-01-10 | Calgene Llc | METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA. |
| US5972664A (en) | 1997-04-11 | 1999-10-26 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| US6372211B1 (en) | 1997-04-21 | 2002-04-16 | Monsanto Technolgy Llc | Methods and compositions for controlling insects |
| US6380466B1 (en) | 1997-05-08 | 2002-04-30 | Calgene Llc | Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat |
| KR20010013426A (ko) | 1997-06-05 | 2001-02-26 | 칼진 엘엘시 | 지방 아실-ＣｏＡ: 지방 알코올 아실트란스페라제 |
| US6716474B2 (en) | 1997-06-17 | 2004-04-06 | Monsanto Technology Llc | Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants |
| US6441277B1 (en) | 1997-06-17 | 2002-08-27 | Monsanto Technology Llc | Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants |
| US6072103A (en) | 1997-11-21 | 2000-06-06 | Calgene Llc | Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression |
| US6063597A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects |
| US6023013A (en) | 1997-12-18 | 2000-02-08 | Monsanto Company | Insect-resistant transgenic plants |
| US6060594A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-09 | Ecogen, Inc. | Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins |
| US6653530B1 (en) | 1998-02-13 | 2003-11-25 | Calgene Llc | Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds |
| US6107549A (en) | 1998-03-10 | 2000-08-22 | Monsanto Company | Genetically engineered plant resistance to thiazopyr and other pyridine herbicides |
| US6284948B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-09-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes and methods for control of nematodes in plants |
| WO1999063096A2 (en) | 1998-06-05 | 1999-12-09 | Calgene Llc | Acyl coa:cholesterol acyltransferase related nucleic acid sequences |
| ES2293726T3 (es) | 1998-06-12 | 2008-03-16 | Calgene Llc | Acidos grasos poliinsaturados en plantas. |
| EP1098962B1 (en) | 1998-07-02 | 2009-09-09 | Calgene LLC | Diacylglycerol acyl transferase proteins |
| BR9912019A (pt) | 1998-07-10 | 2002-02-19 | Calgene Llc | Expressão de peptìdeos de eucarióticos em plastìdeos de plantas |
| US6476294B1 (en) | 1998-07-24 | 2002-11-05 | Calgene Llc | Plant phosphatidic acid phosphatases |
| WO2000007430A2 (en) | 1998-08-04 | 2000-02-17 | Cargill, Incorporated | Plant fatty acid desaturase promoters |
| WO2000009722A2 (en) | 1998-08-10 | 2000-02-24 | Monsanto Company | Methods for controlling gibberellin levels |
| US6365802B2 (en) | 1998-08-14 | 2002-04-02 | Calgene Llc | Methods for increasing stearate content in soybean oil |
| US6468523B1 (en) | 1998-11-02 | 2002-10-22 | Monsanto Technology Llc | Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use |
| ES2325874T3 (es) | 1998-11-17 | 2009-09-22 | Monsanto Technology Llc | Plantas que matabolizan fosfonatos. |
| US6531648B1 (en) | 1998-12-17 | 2003-03-11 | Syngenta Participations Ag | Grain processing method and transgenic plants useful therein |
| CA2371442A1 (en) | 1999-05-04 | 2000-11-09 | Monsanto Technology Llc | Coleopteran-toxic polypeptide compositions and insect-resistant transgenic plants |
| AU4850600A (en) | 1999-05-13 | 2000-12-05 | Monsanto Technology Llc | Acquired resistance genes in plants |
| JP2003501065A (ja) | 1999-06-08 | 2003-01-14 | カルジーン エルエルシー | 脂肪酸のβ酸化に関わる蛋白質をコードする核酸配列とその使用法 |
| US6770465B1 (en) | 1999-06-09 | 2004-08-03 | Calgene Llc | Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity |
| WO2001004314A2 (en) | 1999-07-12 | 2001-01-18 | Monsanto Technology, Llc. | Nucleic acid molecules and proteins associated with sterol synthesis and metabolism |
| US7365185B2 (en) | 2000-07-19 | 2008-04-29 | Monsanto Technology Llc | Genomic plant sequences and uses thereof |
| US6603061B1 (en) | 1999-07-29 | 2003-08-05 | Monsanto Company | Agrobacterium-mediated plant transformation method |
| US20020192813A1 (en) | 1999-08-18 | 2002-12-19 | Timothy W. Conner | Plant expression vectors |
| US6501009B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
| PT1571219E (pt) * | 1999-09-01 | 2008-08-04 | Monsanto Technology Llc | Sequências reguladoras de plantas para o controlo selectivo de expressão de genes |
| EP1210446B1 (en) | 1999-09-09 | 2006-05-31 | Monsanto UK Ltd. | Modified ubiquitin regulatory system |
| BR0014516A (pt) | 1999-09-15 | 2002-07-02 | Monsanto Technology Llc | Composições e métodos de uso de delta-endotoxina do bacilo thuringiensis ativo de lepidopteran |
| US6573361B1 (en) | 1999-12-06 | 2003-06-03 | Monsanto Technology Llc | Antifungal proteins and methods for their use |
| US6657046B1 (en) | 2000-01-06 | 2003-12-02 | Monsanto Technology Llc | Insect inhibitory lipid acyl hydrolases |
| CA2396422A1 (en) | 2000-01-06 | 2001-07-12 | Monsanto Technology Llc | Preparation of deallergenized proteins and permuteins |
| DE60111613T2 (de) | 2000-03-09 | 2006-05-18 | Monsanto Technology Llc. | Verfahren zum herstellen von glyphosat-toleranten pflanzen |
| WO2001094394A2 (en) | 2000-06-09 | 2001-12-13 | Prodigene, Inc. | Plant ubiquitin promoter sequences and methods of use |
| US6518488B1 (en) | 2000-07-21 | 2003-02-11 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid molecules and other molecules associated with the β-oxidation pathway |
| US6706950B2 (en) | 2000-07-25 | 2004-03-16 | Calgene Llc | Nucleic acid sequences encoding β-ketoacyl-ACP synthase and uses thereof |
| WO2005033309A2 (en) * | 2003-09-30 | 2005-04-14 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Plant promoters and methods of use thereof |
| US8344211B2 (en) | 2008-08-13 | 2013-01-01 | Ceres, Inc. | Plant nucleotide sequences and corresponding polypeptides |
| EP1685155A2 (en) * | 2003-11-19 | 2006-08-02 | CropDesign N.V. | "seedy1" nuceic acids for making plants having changed growth characteristics |
| CA2569767C (en) | 2004-06-09 | 2011-07-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plastid transit peptides |
| CN101044153B (zh) | 2004-08-19 | 2013-05-29 | 孟山都技术有限公司 | 用于植物中的真核翻译起始因子基因调节元件 |
| SG184723A1 (en) * | 2004-09-24 | 2012-10-30 | Monsanto Technology Llc | Promoter molecules isolated from brassica napus for use in plants |
| US20060200878A1 (en) | 2004-12-21 | 2006-09-07 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression |
| CA2600536A1 (en) | 2005-03-16 | 2006-09-28 | Athenix Corporation | Cis-acting regulatory elements from tripsacum dactyloides |
| WO2006110506A2 (en) | 2005-04-07 | 2006-10-19 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Root-specific phoshate transporter promoters |
| WO2007078599A2 (en) | 2005-12-16 | 2007-07-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Functional arrays for high throughput characterization of gene expression regulatory elements |
| AU2007290367B2 (en) | 2006-08-31 | 2013-10-31 | Monsanto Technology, Llc | Phased small RNAs |
| US20120023627A1 (en) | 2008-06-04 | 2012-01-26 | Edenspace Systems Corporation | Plant gene regulatory elements |
| US8138392B2 (en) * | 2008-07-14 | 2012-03-20 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Disease resistant plants |
| US8168859B2 (en) | 2008-08-27 | 2012-05-01 | Pioneer Hi Bred International Inc | Ubiquitin regulatory elements |
| US8604276B2 (en) | 2009-06-09 | 2013-12-10 | University Of Tennessee Research Foundation | Switchgrass ubiquitin promoter (PVUBI2) and uses thereof |
| EP2440033B1 (en) | 2009-06-10 | 2017-03-15 | Evogene Ltd. | Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance |
| EP2440565A4 (en) | 2009-06-11 | 2013-04-03 | Syngenta Participations Ag | EXPRESSION CASSETTES FROM THE MAIZE |
| CA2768428C (en) * | 2009-08-04 | 2021-08-17 | Evogene Ltd. | Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or nitrogen use efficiency of plants |
| BR122021001267B1 (pt) * | 2010-01-14 | 2022-03-15 | Monsanto Technology Llc | Molécula de dna compreendendo elementos reguladores de plantas |
| CN102234646B (zh) | 2010-04-23 | 2014-10-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种启动子SbUbi1、其制备方法及用途 |
| CN103597078B (zh) * | 2011-03-02 | 2016-12-14 | 富途锐基尼以色列有限公司 | 具有功能失调的t3ss蛋白的抗菌性转基因植物 |
| MX359121B (es) | 2011-08-23 | 2018-09-14 | Evogene Ltd | Polinucleótidos y polipéptidos aislados y métodos de utilización de los mismos para aumentar el rendimiento y/o las características agrícolas de plantas. |
| WO2013107527A1 (en) | 2012-01-21 | 2013-07-25 | Vib Vzw | Novel genes and uses thereof for secondary metabolite production in plants |
| US9663793B2 (en) | 2012-04-20 | 2017-05-30 | Monsanto Technology, Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| NZ711986A (en) | 2013-03-14 | 2020-08-28 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
-
2014
- 2014-03-11 NZ NZ711986A patent/NZ711986A/en unknown
- 2014-03-11 BR BR122020011549-1A patent/BR122020011549B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 KR KR1020227009860A patent/KR102495524B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 BR BR122020011572-6A patent/BR122020011572B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 MX MX2015012554A patent/MX352566B/es active IP Right Grant
- 2014-03-11 AU AU2014240589A patent/AU2014240589B2/en active Active
- 2014-03-11 KR KR1020207033761A patent/KR102270078B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 BR BR112015022046A patent/BR112015022046B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-03-11 CN CN201810544675.0A patent/CN108823203B/zh active Active
- 2014-03-11 CN CN202211161376.1A patent/CN116064535A/zh active Pending
- 2014-03-11 BR BR122020011552-1A patent/BR122020011552B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 KR KR1020217019067A patent/KR102380386B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 BR BR122020011591-2A patent/BR122020011591B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 BR BR122020011544-0A patent/BR122020011544B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 CA CA2904408A patent/CA2904408C/en active Active
- 2014-03-11 EP EP19172717.1A patent/EP3587437A1/en active Pending
- 2014-03-11 BR BR122020011595-5A patent/BR122020011595B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 WO PCT/US2014/023648 patent/WO2014159434A1/en active Application Filing
- 2014-03-11 CN CN202211161677.4A patent/CN115927329A/zh active Pending
- 2014-03-11 CN CN201480022713.6A patent/CN105143240B/zh active Active
- 2014-03-11 BR BR122020011542-4A patent/BR122020011542B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 KR KR1020207033759A patent/KR102270070B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 KR KR1020227009856A patent/KR102495525B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 CN CN201810546053.1A patent/CN108823204B/zh active Active
- 2014-03-11 BR BR122020011592-0A patent/BR122020011592B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 CN CN202211161322.5A patent/CN115927327A/zh active Pending
- 2014-03-11 BR BR122020011565-3A patent/BR122020011565B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 US US14/205,251 patent/US9222099B2/en active Active
- 2014-03-11 CN CN202211161462.2A patent/CN116064536A/zh active Pending
- 2014-03-11 UA UAA201510009A patent/UA119965C2/uk unknown
- 2014-03-11 CN CN202211161380.8A patent/CN115927328A/zh active Pending
- 2014-03-11 EP EP19172710.6A patent/EP3587436A1/en active Pending
- 2014-03-11 CN CN201810541400.1A patent/CN108728442B/zh active Active
- 2014-03-11 KR KR1020207033757A patent/KR102270068B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 BR BR122020011546-7A patent/BR122020011546B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 EP EP14776232.2A patent/EP2970368B1/en active Active
- 2014-03-11 KR KR1020207033760A patent/KR102270071B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 CN CN201810544674.6A patent/CN108823237B/zh active Active
- 2014-03-11 KR KR1020227009857A patent/KR102495527B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 KR KR1020157028144A patent/KR102184976B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 JP JP2016501303A patent/JP6580027B2/ja active Active
- 2014-03-11 CN CN202211161283.9A patent/CN115927326A/zh active Pending
- 2014-03-11 MX MX2017011054A patent/MX369970B/es unknown
- 2014-03-11 AP AP2015008728A patent/AP2015008728A0/xx unknown
- 2014-03-11 KR KR1020207033755A patent/KR102270067B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 CA CA3145660A patent/CA3145660A1/en active Pending
- 2014-03-11 EA EA201591730A patent/EA029474B1/ru unknown
- 2014-03-11 CN CN202211161778.1A patent/CN115992136A/zh active Pending
- 2014-03-11 BR BR122020011551-3A patent/BR122020011551B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-11 EP EP19172699.1A patent/EP3587435A1/en active Pending
- 2014-03-11 KR KR1020207033758A patent/KR102270069B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-11 EP EP19169493.4A patent/EP3575308A1/en active Pending
- 2014-03-11 ES ES14776232T patent/ES2741223T3/es active Active
- 2014-03-11 KR KR1020217019068A patent/KR102380389B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-13 UY UY0001035414A patent/UY35414A/es active IP Right Grant
- 2014-03-14 AR ARP140101065A patent/AR095662A1/es active IP Right Grant
-
2015
- 2015-09-03 ZA ZA2015/06496A patent/ZA201506496B/en unknown
- 2015-09-10 NI NI201500132A patent/NI201500132A/es unknown
- 2015-09-10 GT GT201500270A patent/GT201500270A/es unknown
- 2015-09-10 CL CL2015002574A patent/CL2015002574A1/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019013239A patent/MX2019013239A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019013241A patent/MX2019013241A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019011317A patent/MX2019011317A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2020004385A patent/MX2020004385A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019011321A patent/MX2019011321A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019013244A patent/MX2019013244A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019013242A patent/MX2019013242A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019013238A patent/MX2019013238A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019013240A patent/MX2019013240A/es unknown
- 2015-09-11 MX MX2019013243A patent/MX2019013243A/es unknown
- 2015-10-09 CR CR20150532A patent/CR20150532A/es unknown
- 2015-11-23 US US14/949,694 patent/US9938535B2/en active Active
- 2015-11-23 US US14/949,690 patent/US9938534B2/en active Active
-
2017
- 2017-05-25 CL CL2017001343A patent/CL2017001343A1/es unknown
-
2018
- 2018-01-29 US US15/882,964 patent/US10501749B2/en active Active
- 2018-01-29 US US15/882,957 patent/US10465200B2/en active Active
- 2018-03-14 AU AU2018201835A patent/AU2018201835B2/en active Active
- 2018-03-14 AU AU2018201831A patent/AU2018201831B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204528A patent/AU2018204528B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204531A patent/AU2018204531B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204578A patent/AU2018204578B9/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204541A patent/AU2018204541B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204568A patent/AU2018204568B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204544A patent/AU2018204544B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204576A patent/AU2018204576B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204536A patent/AU2018204536B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204577A patent/AU2018204577B2/en active Active
- 2018-06-22 AU AU2018204575A patent/AU2018204575B2/en active Active
- 2018-12-14 CL CL2018003627A patent/CL2018003627A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003634A patent/CL2018003634A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003626A patent/CL2018003626A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003633A patent/CL2018003633A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003636A patent/CL2018003636A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003630A patent/CL2018003630A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003632A patent/CL2018003632A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003629A patent/CL2018003629A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003635A patent/CL2018003635A1/es unknown
- 2018-12-14 CL CL2018003637A patent/CL2018003637A1/es unknown
-
2019
- 2019-09-06 US US16/563,808 patent/US11485981B2/en active Active
-
2020
- 2020-02-19 AU AU2020201208A patent/AU2020201208B2/en active Active
- 2020-03-05 AR ARP200100612A patent/AR118261A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100609A patent/AR118258A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100611A patent/AR118260A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100606A patent/AR118255A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100616A patent/AR126558A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100615A patent/AR118264A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100614A patent/AR118263A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100604A patent/AR118253A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100613A patent/AR118262A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100605A patent/AR118254A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100608A patent/AR118257A2/es unknown
- 2020-03-05 AR ARP200100610A patent/AR118259A2/es unknown
-
2021
- 2021-10-28 UY UY0001039491A patent/UY39491A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039498A patent/UY39498A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039497A patent/UY39497A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039490A patent/UY39490A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039493A patent/UY39493A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039495A patent/UY39495A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039496A patent/UY39496A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039489A patent/UY39489A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039492A patent/UY39492A/es active IP Right Grant
- 2021-10-28 UY UY0001039494A patent/UY39494A/es active IP Right Grant
- 2021-11-11 AU AU2021266311A patent/AU2021266311A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-09-22 US US17/934,559 patent/US20230098193A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA119965C2 (uk) | Регуляторний елемент рослин та його застосування | |
| RU2675524C2 (ru) | Регуляторные элементы растений и их применение | |
| RU2670887C9 (ru) | Регуляторные элементы растений и их применение | |
| EP3571305B1 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| US10351866B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| US11932863B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| US12116582B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| EA046779B1 (ru) | Регуляторные элементы растений и их применение | |
| RU2774709C2 (ru) | Регуляторные элементы растений и варианты их применения | |
| OA19276A (en) | Plant regulatory elements and uses thereof. |