[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

UA115768C2 - Спосіб підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу - Google Patents

Спосіб підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу Download PDF

Info

Publication number
UA115768C2
UA115768C2 UAA201401195A UAA201401195A UA115768C2 UA 115768 C2 UA115768 C2 UA 115768C2 UA A201401195 A UAA201401195 A UA A201401195A UA A201401195 A UAA201401195 A UA A201401195A UA 115768 C2 UA115768 C2 UA 115768C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
plant
plants
protein
sequence
trehalose
Prior art date
Application number
UAA201401195A
Other languages
English (en)
Inventor
Шіб Басу
Джонатан Кон
Майкл Нуччіо
Original Assignee
Сінгента Партісіпейшнс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сінгента Партісіпейшнс Аг filed Critical Сінгента Партісіпейшнс Аг
Publication of UA115768C2 publication Critical patent/UA115768C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Винахід належить до способу підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу шляхом введення в рослину полінуклеотиду, який кодує поліпептид, що має трегалоза-6-фосфатфосфатазну активність, де поліпептид модифікований так, що він має знижену ферментативну активність у порівнянні з немодифікованим трегалоза-6-фосфатфосфатазою.

Description

Галузь техніки, до якої належить винахід
І0ОО1| Даний винахід належить, загалом, до галузі молекулярної біології й розглядає різні полінуклеотиди, поліпептиди й способи застосування, які можуть використовуватися для збільшення врожайності трансгенних рослин. Трансгенні рослини, які містять будь-який з полінуклеотидів або поліпептидів, описаних у даному документі, можуть проявляти будь-яку з ознак, що включають збільшену врожайність, збільшену стійкість до абіотичного стресу, збільшений клітинний ріст, збільшений коефіцієнт використання води й збільшений коефіцієнт використання поживних речовин.
Передумови винаходу
І002| Збільшення населення світу й виснаження запасу орних земель, доступних для сільського господарства, активізує потребу в дослідженні в галузі підвищення ефективності сільського господарства. Традиційні способи поліпшення сільськогосподарських і садових культур застосовують методики селекційного розведення для виявлення рослин, що мають необхідні характеристики. Однак такі методики селекційного розведення мають певні недоліки, а саме, що ці методики часто є трудомісткими й дають у результаті рослини, які часто містять гетерогенні генетичні компоненти, що не завжди може приводити до передачі необхідної ознаки від батьківських рослин. Успіхи в молекулярній біології дозволили людству модифікувати ідіоплазму тварин і рослин. Генна інженерія рослин передбачає виділення й маніпуляцію з генетичним матеріалом (як правило, у формі ДНК або РНК) і наступне введення цього генетичного матеріалу в геном рослини. Така технологія має здатність надавати сільськогосподарським культурам або рослинам різні поліпшені економічні, агрономічні або садівничі ознаки.
Короткий опис винаходу
ЇОО3| Викладений нижче короткий опис перераховує деякі варіанти здійснення об'єктів даного винаходу, а також, у багатьох випадках, перераховує зміни й перестановки цих варіантів здійснення. Даний короткий опис є винятково ілюстративним щодо численних і різноманітних варіантів здійснення. Згадування однієї або декількох репрезентативних ознак указаного варіанта здійснення також є ілюстративним. Такий варіант здійснення може типово мати місце зі згаданою ознакою(ами) або без неї; аналогічно, ці ознаки можуть застосовуватися щодо інших варіантів здійснення даного винаходу, незалежно від того, перераховані вони в короткому описі винаходу, чи ні. Щоб уникнути надмірного повторення, даний короткий опис не перераховує або припускає всі можливі комбінації таких ознак.
Ї004| Даний винахід передбачає нуклеотидні послідовності, що кодують поліпептиди трегалозного шляху, які при трансгенній експресії в рослині збільшують урожайність.
Поліпептиди Т6РР, описані в даному документі, містять модифікації, які змінюють активність білків трегалоза-6-фосфатфосфатаз (ТЄРР), причому активність знижується в порівнянні з немодифікованою ТбРР. Модифіковані ТбРР можуть містити консенсусну послідовність, проілюстровану в 5ЕО ІЮО МО: 9, і можуть мати щонайменше одну модифіковану амінокислоту.
Модифікована ТбРР може мати модифікацію, створену в консервативній амінокислоті, включаючи консервативні амінокислоти, які описані в консенсусній послідовності з«ЕО ІЮ МО: 9.
Модифіковані ТЄРР можуть викликати іп міго активацію ТЄРР дикого типу. Модифікація в ТЄРР може знаходитись в межах щонайменше одного з домену САР, фосфатазного домену, А- фосфатазного домену або В-фосфатазного домену. ТЄРР, що мають зменшене зв'язування із субстратом трегалоза-6-фосфатом (Т6Р), демонструють збільшену врожайність і підвищену стресостійкість при трансгенній експресії в рослинах, а також мають підвищену стійкість до стресу, включаючи посуху. Рослини, які експресують модифіковану Т6РР, включають однодольні або дводольні рослини, в тому числі рослини, вибрані із групи, що складається з маїсу, цукрового очерету, сої, рису, сорго або пшениці. Модифікації поліпептидів ТЄРР можуть включати одну з амінокислотних замін, амінокислотних делецій або амінокислотних вставок або їх комбінацію. Модифіковані ТЄРР можуть являтися членом надсімейства дегалогеназ галогенокислот (НАЮБ) фосфатаз. Ферментативна активність ТбРР може бути знижена щонайменше на 50 95, 60 95, 70 95, 80 о, 90 95, 95 Ус, 99 95 або 100 95.
ІЇОО5| Будь-який з описаних поліпептидів ТЄРР може застосовуватися для одержання полінуклеотидів. Полінуклеотиди, що кодують модифіковані поліпептиди ТЄРР, можна вводити в клітину-хазяїна. Клітина-хазяїн може включати рослинну клітину. Полінуклеотиди можуть бути включені в касети експресії, які забезпечують транскрипцію полінуклеотида в рослині. Касети експресії можуть включати промотор, який експресує полінуклеотид у репродуктивній тканині рослини. Крім того, репродуктивна тканина може бути вибрана з групи, що складається з тканини колоска, вузла качана, тканини приквітка, меристемної тканини колоска, тканини бо квітконіжки суцвіття й тканини незрілої квітки. Промотор, який експресує полінуклеотиди ТбРР,
може включати промотор О5МАЮО5 або промотор О5МАЮБбЄ. Екстракт, що містить полінуклеотиди або поліпептиди, можна отримати з будь-чого з клітин-хазяїнів, рослин, частин рослини або тканин рослини.
І0О6| Способи, розкриті в даному документі, додатково включають уведення в рослини полінуклеотидів, наприклад, як розкрито в даному документі. Трансгенні рослини, що містять полінуклеотиди, розкриті в даному документі, можуть проявляти збільшений клітинний ріст, збільшену міць рослин і/або сходів, збільшену врожайність, збільшену вагу насіння, збільшений коефіцієнт використання води та/або збільшену біомасу. Передбачається, що рослини, отримані за допомогою способів, розкритих у даному документі, мають підвищену стійкість до абіотичного стресу. Трансгенні рослини, описані в даному документі, можуть давати більш високу врожайність, як відносно врожайності біомаси, так і врожаю зерна рослини. Один аспект даного винаходу передбачає різні модифікації, які можна здійснювати щодо будь-якої даної генної послідовності Т6РР, що може використовуватися в трансгенних рослинах для забезпечення збільшеної врожайності. Альтернативно, щоб забезпечити в рослини збільшену врожайність та стресостійкість, можна застосовувати інші численні способи для збільшення рівнів ТР.
І007| Способи збільшення врожайності, збільшення стійкості рослини до абіотичного стресу або зменшення безпліддя в рослини, збільшення кількості качанів на рослину та/або зерен на рослину в умовах дефіциту води можуть включати введення у рослинну клітину касети експресії, що містить модифіковану Т6РР, а потім одержання трансгенної рослини. Рослина може являти собою однодольну рослину, наприклад, може являти собою рослину маїсу, рису, пшениці, сорго, цукрового очерету або газонної трави. Це може бути дводольна рослина, така як соя. Для способів підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу стрес може бути вибраний з групи, що складається зі стресу, викликаного нестачею води, теплового стресу або стресу, викликаного низькими температурами. Стрес, викликаний нестачею води, може бути обумовлений посухою. 0081 Крім того, включені способи модифікації в рослині рівня трегалоза-6-фосфату шляхом ідентифікації поліпептиду в трегалозному шляху; модифікації поліпептиду так, щоб він мав змінену ферментативну активність; уведення в рослину касети експресії, що містить полінуклеотид, який кодує модифікований поліпептид, і одержання рослини з модифікованими рівнями трегалоза-б6-фосфату. Поліпептид може мати активність, вибрану з групи, що складається з трегалоза-6-фосфат-синтазної; трегалоза-6-фосфатфосфатазної та трегалазної.
Модифіковані рівні трегалоза-6-фосфату можуть приводити до збільшення експресії генів у пентозофосфатному шунтовому шляху під час стресу, викликаного посухою, у тканині вузла качана рослини. Додатково або альтернативно, модифіковані рівні трегалоза-6-фосфату можуть обумовлювати збільшення рівня карбоангідрази в тканині вузла качана рослини.
Модифікований поліпептид може експресуватися у репродуктивних тканинах рослини, в тому числі у тканині колоска, вузлі качана, тканині приквітки, меристемній тканині колоска, тканині квітконіжки суцвіття й тканині незрілої квітки. Модифікований поліпептид модифікованого ферменту трегалозного шляху може мати знижену ферментативну активність і/або обумовлювати іп міго активацію трегалоза-б-фосфатфосфатази дикого типу. 009) Ці та інші ознаки, цілі й переваги даного винаходу стануть зрозумілішими з наступного опису. В описі наведене посилання на супровідні послідовності, що є його частиною та у яких показані з метою ілюстрації, а не обмеження, варіанти здійснення даного винаходу. Опис переважних варіантів здійснення не передбачений для обмеження даного винаходу, що охоплює всі модифікації, еквіваленти й альтернативи. Отже, необхідно привести посилання на варіанти здійснення, перераховані в даному документі для інтерпретації об'єму даного винаходу.
Короткий опис послідовностей у переліку послідовностей пі: нуклеотидна послідовність рі- білкова послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 1 трегалоза-6-фосфатфосфатаза (п), О5Т6РР-ЖТ
ЗЕО ІЮ МО: 2 трегалоза-6-фосфатфосфатаза (р), О5Т6РР-ЖТ
ЗЕО ІЮ МО: З трегалоза-6-фосфатфосфатаза - одинарна модифікація (по),
О5Т6РР-Н2г440
ЗЕО ІЮ МО: 4 трегалоза-6-фосфатфосфатаза - одинарна модифікація (ро),
О5Т6РР-Н2г440
ЗЕО ІЮ МО: 5 трегалоза-6-фосфатфосфатаза - подвійна модифікація а (пу),
О5ТбРР-129Е бо ЗЕО ІЮ МО: 6 трегалоза-6-фосфатфосфатаза - подвійна модифікація а (ро,
О5ТбРР-129Е
ЗЕО ІЮ МО: 7 трегалоза-6-фосфатфосфатаза - потрійна модифікація Б (п)
ЗЕО ІЮ МО: 8 трегалоза-6-фосфатфосфатаза - потрійна модифікація Б (ро
ЗЕО ІЮ МО: 9 консенсусна послідовність трегалоза-6-фосфатфосфатази
ЗЕО ІЮ МО: 10 фосфатазний домен трегалоза-б6-фосфатфосфатази
ЗЕО ІЮ МО: 11 А-фосфатазний бокс трегалоза-б6-фосфатфосфатази
ЗЕО ІЮ МО: 12 В-фосфатазний бокс трегалоза-б6-фосфатфосфатази
ЗЕО ІЮ МО: 13 промотор ОБМАЮ5б
ЗЕО ІЮ МО: 14 трегалоза-6-фосфатфосфатаза Агарідорбвів ІНаійапа 19925
ЗЕО ІЮ МО: 15 трегалоза-6-фосфатфосфатаза Агарідорвів Іпаійапа 19926
ЗЕО ІЮ МО: 16 трегалоза-6-фосфатфосфатаза Огула займа 19924
ЗБО ІЮ МО: 17 подібна до трегалоза-6-фосфатфосфатази Тпегторіахта асідорпйит (О9ЗНІМУ/7)
Опис графічних матеріалів
ІО10О| На Фіг. Т1А-1С показане вихідне вирівнювання послідовностей ТбРР з Агарідорзів
Інаійапа (19925; 5ЕО ІЮ МО: 14), Агарідорзів ІНаІйапа (19926; 5ЕО ІЮ МО: 15), Огуга заїїма (19924;
ЗЕО ІО МО: 16), Огула заїма (15777; О5Т6РР-М/Л дикого типу; 5ЕО ІЮО МО: 2) і Тнегторіазта асідорпішт (О9НІММ7; ЗЕО ІО МО: 17). Послідовності вирівнювали за допомогою Месіог МТІ із застосуванням способу СіиеаІМУу.
ІО11| На Фіг. 2 показане філогенетичне дерево, отримане від вирівнювання множинних білків
Т6РР. 0121 На Фіг. З показаний опис трегалозного шляху. Трегалозний шлях складається з двох біосинтетичних ферментів, трегалоза-6-фосфатсинтази (ТР) і трегалоза-6-фосфатфосфатази (Т6РР), і одного гідролізуючого ферменту, трегалази, що залучений в розщеплення.
ІО13) На Фіг. 4 показаний трегалозний шлях з додатковими продуктами низхідних стадій.
ОРОС одержують безпосередньо за допомогою сахарозосинтази; О6Р одержують із глюкози за допомогою інвертази й гексокінази або за допомогою фруктози й фруктоза-6-фосфату (ЕбР) за рахунок застосування сахарозосинтази, фруктокінази й фосфоглюкозаіїзомерази. ООРО і ОбР також являють собою два центральні активовані попередники, з яких зрештою можуть походити
Зо багато клітинних функціональних сполук. ШОРС є попередником для основних полісахаридів клітинної стінки й для гліколіпідів. ЗбР є попередником для синтезу крохмалю, МАОРН за рахунок окисної частини пентозофосфатного шляху, а АТР за рахунок гліколізу, циклу Кребса й окисного фосфорилування. Крім того, ЗбР може перетворюватися на фруктоза-6-фосфат і разом з ПОРО може застосовуватися для синтезу сахароза-б-фосфату, а потім сахарози.
Будучи зробленим з ШОРО і О6Р, ТР перебуває на перетинах основних вуглеводних потоків у рослинах. 014) На Фіг. 5 описаний вплив зв'язування Т6Р з ЗпПРК1. 5пКК1 є гетеротримерним білком та являє собою рослинний гомолог протеїнкінази тварин, що активується АМР, й протеїнкінази дріжджів, що не ферментує сахарозу (ЗпЕТ1). 0151 На Фіг. 6 показане залучення 5ПЕКІ у численні метаболічні шляхи в рослинах.
ІО16Ї На Фіг. 7 показане стрічкове графічне зображення гомологічної моделі ТЄРР рису.
Фермент містить два домени: а/В-гідролазний домен та менший "домен ій". Активний сайт знаходиться у верхній частині с/р-гідролазного домену (пляма); щілина для зв'язування із субстратом перебуває на границі між двома доменами. Ці два домени з'єднані гнучким лінкером, що дозволяє домену Їй відкриватися й закриватися під час каталізу. Оскільки матриця для гомологічного моделювання, бактеріальний ТЄРР-споріднений білок (код РОВ 1002), являє собою апофермент з порожнім активним сайтом, імовірно, що відносна орієнтація домену Їїд та гідролазного домену дещо відрізняється в справжньому фермент-субстратному комплексі.
І017| На Фіг. 8 показане розташування групи б6-фосфату Т6Р. Один з атомів кисню групи 6- фосфату розташований в екваторіальному положенні координаційної сфери Мд2 ж. Азр121, що акцептує фосфатну групу під час каталізу з утворенням проміжної сполуки з ковалентним зв'язком, приймає аксіального положення. І ух289 безпосередньо зв'язаний водневим зв'язком з фосфатною групою, а Ніб181 перебуває в безпосередній близькості. Обидва залишки оптимально розташовані для стабілізації негативного заряду, що утворюється на фосфатному фрагменті під час каталізу.
ІО18) На Фіг. 9 показані здатні до обертання зв'язки в субстраті Т6Р. У той час як положення й орієнтація піранозного кільця, що є найближчим до групи б-фосфату, точно визначена за допомогою фіксованої фосфатної групи, існує істотна гнучкість між першим і другим кільцями внаслідок наявності двох здатних до обертання глікозидних зв'язків (стрілки). Діапазон можливих положень для другого кільця отримували шляхом обертання двох зв'язків.
Конформації, у яких друге кільце перетинається з білком, відкидали.
ІО19| На Фіг. 10 показана консенсусна послідовність для ТЄРР (ЗЕО ІЮО МО: 9). Залишки, виділені жирним шрифтом і підкреслені, визначають висококонсервативні ділянки. Положення в консенсусній послідовності, що марковані "Х", указують на ділянки мінливості, де будь-яка інша окрема буква відповідає загальноприйнятому однобуквеному позначенню амінокислот, загальновживаному в даній галузі техніки. Підкреслені амінокислотні залишки вказують на ділянки, які можна модифікувати для конструювання поліпептидів ТЄРР, що забезпечують збільшену врожайність і/або підвищену витривалість до стресу у трансгенної рослини. Залишки, позначені ОМОСТІ ЗРІМ, кодують В-фосфатазний бокс.
ІО20| На Фіг. 11А-11С показане остаточне вирівнювання послідовностей Т6РР для
Агабідорвів ІНнаіапа (19925; 5ЕО ІЮ МО: 14), Агабідорвів ІНаіапа (19926; 5ЕО І МО: 15), Огуга займа (19924; 5ЕО ІО МО: 16) і Огула займа (15777; О5Т6РР-М/Т дикого типу; БЕО ІЮО МО: 2), а також ТбРР-спорідненого білка з Тпегторіазта асідорпйшт (О9НІМУ/7; 5ЕО ІЮО МО: 17).
Докладний опис винаходу
ІО21| При здійсненні даного винаходу на практиці будуть використовуватися, якщо не зазначене інше, загальноприйняті методики ботаніки, мікробіології, вирощування тканин, молекулярної біології, хімії, біохімії, генетики кількісних ознак рослин, статистики й технології рекомбінантної ДНК, що знаходяться у межах навичок фахівців у даній галузі. Такі методики роз'яснюються в повному об'ємі в літературі. Див., наприклад, І апдепінеїт апа Тнпітапп, (1982)
Воїапу: Ріапі Віоіоду апа її Неїайоп о Нитап Айаїг5, уопп Уміеу; Сеїї Сипйиге апа 5отаїййс Сеї
Сепеїісв ої Ріапів, мої. 1, Мавії, єд. (1984); Єгапіег, єї аї., (1986) Те Містгобіа! УУопа, 5ій єд.,
Ргепіісе-Наї!; Ойгіпдга апа 5іпсіаїг, (1985) Вазіс Ріапі РаїШоіоду Меїподз, САС Ргев5; Мапіаїїв, єї а!., (1982) МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїогу Мапиа!; ОМА Сіопіпд, моїв5. І апа Ії, Спомег, єа. (1985);
ОІїдописіеоїіде бупіпевзів, Сай, єд. (1984); Мисівїс Асіа Нубгіаіганоп, Натез апа Ніддіп5, едв. (1984); і серію Меїнодвз іп Епгутоіоаду, СоЇоулсК апа Каріап, єдво, Асадетіс Ргезв, Іпс., Зап ОРієдо,
Саїїї. 0221 Одиниці, префікси й символи можуть виражатися в їхній формі, прийнятній у системі 9І. Якщо не зазначене інше, нуклеїнові кислоти записані зліва направо в орієнтації 5' - 3"
Зо амінокислотні послідовності записані зліва направо в орієнтації від аміно- до карбокси-кінця, відповідно. Числові діапазони містять у собі числові значення, що визначають діапазон.
Амінокислоти в даному документі можуть позначатися або їхніми загальновідомими трибуквеними символами, або однобуквеними символами, які рекомендовані Комісією з біохімічної номенклатури ІРАС-ІОВ. Аналогічно, нуклеотиди можуть позначатися їхніми загальноприйнятими однобуквеними кодами. Вирази, що визначаються нижче, більш повно визначені за допомогою посилання на опис винаходу в цілому. 023) Якщо не визначене інше, усі технічні й наукові терміни, які застосовуються в даному документі, мають таке саме значення, що звичайно розуміється фахівцем у галузі, до якої належить даний винахід.
ЇО24| Слід розуміти, що даний винахід не обмежений конкретною методологією, протоколами, клітинними лініями, видами або родами рослин, конструктами й реагентами, фактично описаними. Слід також розуміти, що термінологія, яка застосовується в даному документі, представлена винятково з метою опису конкретних варіантів здійснення і не передбачена для обмеження об'єму даного винаходу.
ІЇ025| Форми однини, які застосовуються в даному документі, включають посилання на форми множини, якщо контекст явно не вказує на інше. Таким чином, наприклад, посилання на "вектор" являє собою посилання на один або кілька векторів і включає їхні еквіваленти, відомі фахівцям у даній галузі. 026) Вираз "приблизно" використовується в даному документі для позначення наближено, грубо, близько або в районі. Коли вираз "приблизно" використовується разом з числовим діапазоном, він модифікує цей діапазон шляхом розширення границь вище й нижче зазначених числових значень. Загалом, вираз "приблизно" використовується в даному документі для модифікації числового значення вище й нижче зазначеного значення за допомогою відхилення на 20 відсотків.
І027| Слово "або", як застосовується в даному документі, означає будь-якого члена конкретного переліку, а також включає будь-яку комбінацію членів з даного переліку. (028) Вирази "містить", "що містить", "включає", "що включає", "що має" і споріднені з ними за значенням слова означають "включаючи, але без обмеження". Вираз "що складається з" означає "включаючи й обмежуючись".
ІО29| Вираз "що складається практично з" означає, що композиція, спосіб або структура можуть включати додаткові інгредієнти, етапи та/або частини, але тільки якщо додаткові інгредієнти, етапи та/або частини не суттєво змінюють основні й нові характеристики заявленої композиції, способу або структури.
ІОЗ0) У всіх випадках, коли у даному документі вказується числовий діапазон, мається на увазі, що він включає будь-яке перераховане число (дробове або ціле) у межах вказаного діапазону. Фрази "у діапазоні/їзнаходиться у діапазони між" першим вказаним числом і другим вказаним числом і "у діапазоні/знаходиться у діапазоні від "першого вказаного числа" до "другого вказаного числа застосовуються в даному документі взаємозамінно та, мається на увазі, що вони включають перше й друге вказані числа і всі дробові та цілі числа між ними.
Вираз "спосіб", як застосовується в даному документі, стосується способів дії, засобів, методик і процедур для здійснення даного завдання, включаючи, але без обмеження, такі способи дії, засоби, методики й процедури, або відомі, або які легко розробити на основі відомих способів дії, засобів, технік і процедур фахівцям в хімічній, фармакологічній, біологічній, біохімічній та медичній галузях техніки. Слід розуміти, що певні ознаки даного винаходу, описані для ясності в контексті окремих варіантів здійснення, можуть також бути представлені в комбінації в одному варіанті здійснення. Навпаки, різні ознаки даного винаходу, описані для стислості в контексті одного варіанта здійснення, можуть також бути представлені окремо, або в будь-якій придатній субкомбінації, або у формі, що придатна у будь-якому іншому описаному варіанті здійснення даного винаходу. Певні ознаки, описані в контексті різних варіантів здійснення, не повинні розглядатися як суттєві ознаки цих варіантів здійснення, якщо тільки варіант здійснення є незастосовним без цих елементів.
ІО31| Під виразом "мікроб" розуміють будь-який мікроорганізм (включаючи як еукаріотичні, так і прокаріотичні мікроорганізми), такий як гриби, дріжджі, бактерії, актиноміцети, водорості й найпростіші, а також інші одноклітинні структури.
І032| Під виразом "ампліфікований" розуміють створення множинних копій послідовності нуклеїнової кислоти або множинних копій, комплементарних послідовності нуклеїнової кислоти, із застосуванням щонайменше однієї з послідовностей нуклеїнової кислоти у якості матриці.
Системи ампліфікації включають систему полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), систему
Зо лігазної ланцюгової реакції (ЛЛР), ампліфікацію на основі послідовності нуклеїнової кислоти (МА5ВА, Сапдепе, Міссіссога, Онтаріо), системи О-бета-реплікази, систему ампліфікації на основі транскрипції (ТАБ) та ампліфікацію з переміщенням ланцюга (ЗОБА). Див., наприклад,
Оіадповіїс Моїесшіаг Містобіоіоду: Ргіпсіріє5 апа Арріїсайопв, Регвіпод, єї аї., еєдв., Атегісап босієїу
Тог Містобіоіоду, Уазпіпдіюп, 0.0. (1993). Продукт ампліфікації має назву амплікон.
І0З3| Вираз "консервативно модифіковані варіанти" застосовується як щодо амінокислотних послідовностей, так і щодо послідовностей нуклеїнових кислот. Що стосується конкретних послідовностей нуклеїнової кислоти, консервативно модифікованими варіантами називають такі нуклеїнові кислоти, які кодують ідентичні або консервативно модифіковані варіанти амінокислотних послідовностей. Внаслідок виродженості генетичного коду велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодують будь-який даний білок. Наприклад, усі з кодонів СА, (СС, (збо і С кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у будь-якому положенні, де кодоном визначено аланін, кодон може бути змінений на будь-який з описаних відповідних кодонів без зміни поліпептиду, що кодується. Такі варіації нуклеїнових кислот являють собою "мовчазні варіації"! і представляють собою один вид консервативно модифікованої варіації. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти в даному документі, яка кодує поліпептид, також описує кожну можливу мовчазну варіацію нуклеїнової кислоти. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що кожний кодон у нуклеїновій кислоті (за винятком АОС, який, як правило, є єдиним кодоном для метіоніну; єдиним виключенням є Місгососси5 гибрепв5, для якого метіоніновим кодоном є СТО (ІзПігикКа, еї аї., (1993) У. Сзеп. Місгобіої. 139:425-32) може бути модифікований з одержанням функціонально ідентичної молекули. Відповідно, кожна мовчазна варіація нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид згідно з даним винаходом, передбачається в кожній описаній поліпептидній послідовності й включена в даний документ за допомогою посилання. (034) "Контрольна рослина" або "контроль", як застосовується в даному документі, може являти собою нетрансгенну рослину батьківської лінії, яку застосовували в даному винаході для створення трансгенної рослини. Контрольна рослина в деяких випадках може являти собою лінію трансгенних рослин, що включають порожній вектор або маркерний ген, але не містять рекомбінантний полінуклеотид згідно з даним винаходом, який експресується в трансгенній рослині, що підлягає оцінюванню. В інших випадках контрольна рослина являє собою 60 трансгенну рослину, яка експресує ген за допомогою конститутивного промотора. Як правило,
контрольна рослина являє собою рослину тієї ж лінії або сорту, що й трансгенна рослина, що підлягає тестуванню, яка не має специфічної рекомбінантної ДНК, що забезпечує ознаку, якою характеризується трансгенна рослина. Така рослина-попередник, яка не містить такої специфічної рекомбінантної ДНК, що забезпечує ознаку, може являти собою природну рослину, рослину дикого типу, елітну нетрансгенну рослину або трансгенну рослину без специфічної рекомбінантної ДНК, що забезпечує ознаку, якою характеризується трансгенна рослина.
Рослина-попередник, яка не містить специфічної рекомбінантної ДНК, що забезпечує ознаку, може являти собою сибс трансгенної рослини, яка має специфічну рекомбінантну ДНК, що забезпечує ознаку. Така рослина-попередник, що є сибсом, може включати іншу рекомбінантну
ДНК. 035) Що стосується амінокислотних послідовностей, фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що окремі заміни, делеції або вставки в послідовність нуклеїнової кислоти, пептидну, поліпептидну або білкову послідовність, які змінюють, додають або видаляють одну амінокислоту або невеликий відсоток амінокислот у послідовності, що кодується, приводять до "консервативно модифікованого варіанту", коли зміна відбувається в результаті заміщення амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. Таким чином, в такий спосіб можна змінювати будь-яке число амінокислотних залишків, вибране з групи цілих чисел, що складається з 1-15.
Відповідно, можна зробити, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 7 або 10 змін. Консервативно модифіковані варіанти, як правило, забезпечують біологічну активність, аналогічну такій немодифікованої поліпептидної послідовності, з якої вони походять. Наприклад, субстратна специфічність, ферментативна активність або зв'язування з лігандом/рецептором, як правило, становить щонайменше 30 95, 40 95, 50 о, 60 Зо, 70 95, 80 906 або 90 95, переважно 60-90 95 від нативного білка для його нативного субстрату. Таблиці консервативних замін, у яких наведені функціонально подібні амінокислоти, добре відомі в даній галузі техніки.
ІЇО36|Ї Кожна з наступних шести груп містить амінокислоти, що представляють собою консервативні заміни одна одної: 1) Аланін (А), Серин (5), Треонін (Т); 2) Аспарагінова кислота (0), Глутамінова кислота (Е); 3) Аспарагін (М), Глутамін (0);
Зо 4) Аргінін (К), Лізин (К); 5) Ізолейцин (І), Лейцин (І), Метіонін (М), Валін (М) і 6) Фенілаланін (Є), Тирозин (СУ), Триптофан (МЛ. 7) Див. також Стеідпіоп, Ргоїеїпв, М.Н. Егеетап апа Со. (1984).
ЇОЗ37| Як застосовується в даному документі, вирази "модифікований" або "модифікація" взаємозамінно стосуються спланованих або випадкових замін, делецій або вставок у послідовність нуклеїнової кислоти, пептидну, поліпептидну або білкову послідовність, які змінюють, додають або видаляють щонайменше один амінокислотний залишок у межах даного поліпептиду. Вираз "модифікована Т6РР", як застосовується в даному документі, стосується будь-якої нуклеїнової кислоти, що кодує Т6РР або пептиди, поліпептиди або білок, що має ТбРР активність, кожний з яких був модифікований таким чином, що отримана Т6РР забезпечує модифіковану Тб6РР активність і/або модифіковане зв'язування з ТбР, що приводить до збільшеної врожайності та/або стійкості до абіотичного стресу в рослини у порівнянні з немодифікованою Т6РР.
ІЇОЗ8) Як застосовується в даному документі, "гомологічне положення" стосується положення однієї або декількох амінокислот у поліпептиді або однієї або декількох пар основ у полінуклеотидній послідовності, які знаходяться в аналогічному або еквівалентному положенні в другому поліпептиді або полінуклеотиді, що є ортологом, паралогом або гомологом вихідної послідовності. Положення амінокислот може знаходитися в одній функціональній ділянці двох білків, але може не являти собою строго відповідне числове положення амінокислоти у двох поліпептидних послідовностях. Гомологічне положення амінокислот у двох білках може визначатися за допомогою декількох способів, добре відомих у даній галузі техніки, в тому числі, наприклад, вирівнювання послідовностей (наприклад, ВІА5Т), тривимірного моделювання білків (див., наприклад, Запаег С. апа Зспеїдег К., (1991) РЕОТЕЇМ5: бігисіШге,
Еипсіп апа Сепеїісв 9:56-68) і подібного.
ІО39| Під "що кодує" або "що кодується" стосовно певної нуклеїнової кислоти розуміють, що вона містить інформацію для трансляції в певний білок. Нуклеїнова кислота, що кодує білок, може містити послідовності, які не транслюються (наприклад, інтрони), серед ділянок нуклеїнової кислоти, які транслюються, або може не містити такі проміжні послідовності, які не транслюються (наприклад, як у кКДНК). Інформація, за якої кодується білок, визначається 60 шляхом застосування кодонів. Як правило, амінокислотна послідовність кодується нуклеїновою кислотою із застосуванням "універсального" генетичного коду. Однак варіанти універсального коду, такі як представлені в мітохондріях деяких рослин, тварин і грибів, бактерії Мусоріазта сарпісоїштп (Матао, єї аї., (1985)Ргос. Май. Асад. сі. БА 82:2306-9) або інфузорії
Масгописіеи5, можуть застосовуватися, коли нуклеїнову кислоту експресують із застосуванням цих організмів.
І040| Якщо нуклеїнову кислоту одержують або змінюють синтетичним шляхом, то можна отримати перевагу з огляду на використання відомих переважних кодонів у передбачуваного хазяїна, у якого буде експресуватися нуклеїнова кислота. Наприклад, хоча послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом можна експресувати як у видах однодольних, так і дводольних рослин, послідовності можна модифікувати з урахуванням специфічного переважного використання кодонів і переважного вмісту С в однодольних рослин або дводольних рослин, оскільки було показано, що ці переваги відрізняються (Митггау, еї аї!., (1989)
Мисієїс Асід5 Нев. 17:477-98 і в даний документ включена за допомогою посилання). Таким чином, переважний кодон маїсу для конкретної амінокислоти можна отримати від відомих генних послідовностей з маїсу. Частота використання кодону маїсу для 28 генів з рослин маїсу наведена в Таблиці 4 у Миїтау, еї аї., вище.
І041| Як застосовується в даному документі, "гетерологічний" у відношенні нуклеїнової кислоти являє собою нуклеїнову кислоту, яка походить з чужорідного виду, або, якщо вона походить із того самого виду, то є суттєво модифікованою в порівнянні з її нативною формою в композиції та/лабо геномному локусі шляхом навмисного втручання людини. Наприклад, промотор, функціонально пов'язаний з гетерологічним структурним геном, походить від виду, що відрізняється від того, від якого отримали структурний ген, або, якщо він походить від того самого виду, то один або обидва є суттєво модифікованими в порівнянні з їхньою вихідною формою. Гетерологічний білок може брати початок від чужорідного виду, або, якщо він походить від того самого виду, то він є суттєво модифікованим у порівнянні з його вихідною формою шляхом навмисного втручання людини. 0421 Під "клітиною-хазяїном" розуміють клітину, яка містить послідовність гетерологічної нуклеїнової кислоти за даним винаходом, яка містить вектор і підтримує реплікацію та/або експресію вектора експресії. Клітини-хазяї можуть являти собою прокаріотичні клітини, такі як Е.
Ко) соїї, або еукаріотичні клітини, такі як клітини дріжджів, комах, рослин, амфібій або ссавців.
Переважно, клітини-хазяї являють собою клітини однодольних або дводольних рослин, в тому числі, але без обмеження, маїсу, сорго, соняшника, сої, пшениці, люцерни, рису, бавовнику, каноли, ячменю, проса й томата. Особливо переважною клітиною-хазяїном з однодольної рослини є клітина-хазяїн маїсу.
І043| Вираз "гібридизаційний комплекс " включає посилання на дуплексну структуру нуклеїнової кислоти, що утворена двома одноланцюговими послідовностями нуклеїнової кислоти, які селективно гібридизовані одна з одною. 044) Вираз "введений" передбачає вставлення нуклеїнової кислоти в клітину за допомогою будь-якого способу, такого як "трансфекція", "трансформація" або "трансдукція", і він включає посилання на вбудовування нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, де нуклеїнова кислота може вбудовуватися в геном клітини (наприклад, в хромосомну, плазмідну, пластидну або мітохондріальну ДНК), перетворюватися на автономний реплікон, в якості частини мініхромосоми, або тимчасово експресуватися (наприклад, трансфікована мРНК). (045) Як застосовується в даному документі, вираз "пакет генів" стосується введення двох або більше генів у геном організму. У певних аспектах даного винаходу може бути бажаним здійснювати стекінг будь-якого гену, пов'язаного з абіотичним стресом (наприклад, білки холодового шоку, гени, пов'язані з реакцією АВА), з ТЄРР, що описана в даному документі.
Аналогічно, також може бути бажаним здійснювати стекінг генів трегалозного шляху, як описано в даному документі, з генами, що забезпечують витривалість до впливу комах, витривалість до хвороб, збільшену врожайність або будь-яку іншу сприятливу ознаку (наприклад, збільшену висоту рослини тощо), відому у даній галузі техніки. Альтернативно, у трансгенних рослин, що містять модифікований ген трегалозного шляху, можна здійснювати стекінг з алелями нативної ознаки, які забезпечують додаткові ознаки, такі як поліпшене використання води, підвищена витривалість до хвороб і подібне. В одному варіанті здійснення у рослин, які експресують модифіковані гени трегалозного шляху, здійснюють стекінг з алелями, які описані в
ММО2011/079277. Можна здійснювати стекінг ознак шляхом введення касет експресії із множинними генами або розмноження/схрещування рослин з однією або декількома ознаками з іншими рослинами, які мають одну або декілька додаткових ознак. 046) Вираз "виділений" стосується матеріалу, такого як нуклеїнова кислота або білок, який бо головним чином або практично не містить компонентів, що звичайно супроводжують його або взаємодіють з ним при знаходженні його в природному оточенні. Виділений матеріал необов'язково містить матеріал, що не зустрічається разом з матеріалом у його природному оточенні. Нуклеїнові кислоти, які є "виділеними", як визначено в даному документі, також називають "гетерологічними" нуклесновими кислотами. Якщо інше не заявлене, то вираз "нуклеїнова кислота МИОЄ" означає нуклеїнову кислоту, яка містить полінуклеотид ("полінуклеотид МОЕ"), що кодує поліпептид МОЕ повної або часткової довжини.
І047| Як застосовується в даному документі, "нуклеїнова кислота" включає посилання на дезоксирибонуклеотидний або рибонуклеотидний полімер у формі одинарного або подвійного ланцюга та, якщо немає обмежень, охоплює відомі аналоги, які мають основну властивість природних нуклеотидів, оскільки вони гібридизуються з одноланцюговими нуклеїновими кислотами в такий спосіб, що аналогічний нуклеотидам, які зустрічаються в природі (наприклад, пептидні нуклеїнові кислоти). 048) Під "бібліотекою нуклеїнових кислот" розуміють сукупність виділених молекул ДНК або
РНК, які в одному випадку включають основну представленість всієї частини генома певного організму, яка транскрибується. Про конструювання ілюстративних бібліотек нуклеїнових кислот, таких як бібліотеки геномних та кКДНК, повідомляється в стандартній літературі з молекулярної біології, такій як Вегдег апа Кіттеї, (1987) Сціде То МоїЇесціаг СіІопіпд Тесппідиев, із серії Меїпоа5 іп Еплутоіоду, мої. 152, Асадетіс Ргез5, Іпс., Зап Оієдо, Саїйї.; Затрбгоок, еї аї., (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А І абогаюгу Мапиаї, 2па едй., моіїв. 1-3; і Ситепі Ргоїосоїів іп Моїесшаг
Віоіоду, А!йзибеї, єї аїЇ., ей5, Ситепі РгоїосоЇв, а |оіїпі мепійге Беїмеєп Стеєпе Рибіїбзніпа
Авзвзосіаїев, Іпс. апа доп М/Пеу « 5опв, Іпс. (1994 Бурріетеп!). В іншому випадку "бібліотеку нуклеїнових кислот", як визначено в даному документі, можна також розуміти як таку, що представляє бібліотеки, які містять передбачену частину, або скоріше, які фактично представляють не весь геном певного організму. Наприклад, малі РНК, мРНК ї метильована
ДНК. Бібліотека нуклеїнових кислот, як визначається в даному документі, може також охоплювати варіанти конкретної молекули (наприклад, сукупність варіантів для конкретного білка).
Ї049| Як застосовується в даному документі, "функціонально пов'язаний" включає посилання на функціональний зв'язок між першою послідовністю, такою як промотор, і другою
Зо послідовністю, де промоторна послідовність ініціює й опосередковує транскрипцію ДНК, що відповідає другій послідовності. Звичайно "функціонально пов'язаний" означає, що послідовності нуклеїнових кислот, які є пов'язаними, є суміжними та, якщо є необхідність об'єднати дві області, що кодують білок, вони є суміжними та перебувають в одній рамці зчитування.
ІЇО50| Як застосовується в даному документі, вираз "рослина" включає посилання на цілі рослини, органи рослини (наприклад, листки, стебла, корені тощо), насіння й рослинні клітини та їхнє потомство. Рослинна клітина, як застосовується в даному документі, включає без обмеження насіння, суспензійні культури, зародки, меристематичні ділянки, калюсну тканину, листки, корені, пагони, гаметофіти, спорофіти, пилок і мікроспори. Клас рослин, які можна застосовувати в способах за даним винаходом, як правило, настільки широкий, як клас вищих рослин, які піддаються методикам трансформації, включаючи як однодольні, так і дводольні рослини, у тому числі види з родів: Сисигрйа, Коза, Мій5, Уидіап5, Егадагіа, І оїи5, Меадісадо,
Опоргуснів, Тиїоїйшт, ТиідопеїМа, Мідпа, Сйгив, Гіпит, Сегапішт, Мапіної, Оайсив, Агарідорвів,
Вгаззіса, Варпапивх, 5біпаріх5, Аїора, Сарзісит, Оаїшга, Нуозсуатив, Іусорегївісоп, Місоїапа,
ЗоіЇапит, Реїшпіа, Оідйнаїйв, Маіогапа, Сіапогішт, Неїїапійи5, Іасіиса, Вготив, Азрагадив,
Апійтнпіпит, Неїегосаїїї5, Метевів5, Реїагдопішт, Рапівит, Реппізейшт, Напипсиів5, зЗепесіо, заїрідіобззії, биситів, Вгоуааійа, Стіусіпе, Різит, РНазеоіи5, І оїшт, Огула, Амепа, Ногаєит, зесаїе, АМПит і Тгйісит. Особливо переважною рослиною є 7еа таув.
І051| Як застосовується в даному документі, "врожайність" може включати посилання на бушелі на акр зернових культур при збиранні, з поправкою на вологість зерна (для маїсу, наприклад, типово становить 15 95), та об'єм утвореної біомаси (для кормових культур, таких як люцерна, й розмір коренів рослини для сільськогосподарських культур, що дають кілька врожаїв на рік). Вологість зерна вимірюють у зерні при збиранні. Скориговану натурну вагу зерна визначають як вагу у фунтах на бушель, з поправкою на рівень вологості зерна при збиранні.
Біомасу вимірюють як вагу утвореного придатного для збирання рослинного матеріалу. На врожайність можуть впливати багато властивостей, у тому числі без обмеження висота рослини, кількість бобів, положення боба на рослині, кількість міжвузлів, частота розтріскування бобів, розмір зерна, ефективність утворення бульбочок і фіксації азоту, ефективність асиміляції поживних речовин, асиміляції вуглецю, структура рослини, відсоток проростання насіння, міць бо сходів і ювенільні ознаки. На врожайність також може впливати ефективність проростання
(включаючи проростання в стресових умовах), швидкість росту (включаючи швидкість росту в стресових умовах), кількість качанів, кількість насінин на качан, розмір насіння, склад насіння (крохмаль, олія, білок) і характеристики наливу насіння. Врожайність рослини можна вимірювати різними способами, включаючи натурну вагу, кількість насіння на рослину, вагу насіння, кількість насіння на одиницю площі (тобто насіння, або вага насіння на акр), у бушелях на акр, тоннах на акр або кілограмах на гектар. Наприклад, урожайність кукурудзи можна вимірювати як вихід обмолочених кукурудзяних зерен на одиницю продуктивної площі, наприклад, у бушелях на акр або метричних тоннах на гектар, про що часто повідомляють на основі поправки на вологість, наприклад, на вологість 15,5 відсотка. Більше того, бушель кукурудзи визначається за законом штату Айова як 56 фунтів за вагою, при цьому корисний коефіцієнт перетворення для врожаю кукурудзи такий: 100 бушелів на акр еквівалентні 6,272 метричної тонни на гектар. В даній галузі техніки загальноприйнятими на практиці є й інші вимірювання врожайності. У певних варіантах здійснення даного винаходу врожайність може бути збільшена в стресових умовах та/або безстресових умовах.
І052| Як застосовується в даному документі, "полінуклеотид" включає посилання на дезоксирибополінуклеотид, рибополінуклеотид або їхні аналоги, які мають основну властивість природного рибонуклеотиду, оскільки вони гібридизуються за жорстких умов гібридизації з практично такою самою нуклеотидною послідовністю, як і нуклеотиди, що зустрічаються в природі, та/"або забезпечують трансляцію в таку саму амінокислоту(и), як і нуклеотид(и), що зустрічається в природі. Полінуклеотид може бути нативним або гетерологічним структурним або регуляторним геном повної довжини або його підпослідовністю. Якщо не зазначене інше, вираз включає посилання на певну послідовність, а також її комплементарну послідовність.
Таким чином, ДНК або РНК із каркасами, модифікованими задля стабільності або з інших причин, являють собою "полінуклеотиди", як цей вираз передбачений в даному документі.
Більше того, ДНК або РНК, що містять незвичайні основи, такі як інозин, або модифіковані основи, такі як тритильовані основи, наведені лише два приклади, є полінуклеотидами, як даний вираз застосовують у даному документі. Слід розуміти, що у відношенні ДНК і РНК була зроблена велика різноманітність модифікацій, які слугують для багатьох корисних цілей, відомих фахівцям у даній галузі. Вираз "полінуклеотид", як він застосовується в даному
Зо документі, охоплює такі хімічно, ферментативно або метаболічно модифіковані форми полінуклеотидів, а також хімічні форми ДНК і РНК, що характерні для вірусів і клітин, включаючи серед іншого прості й складні клітини.
ІЇО53| Вирази "поліпептид", "пептид" і "білок' застосовуються в даному документі взаємозамінно для позначення полімеру з амінокислотних залишків. Вираз застосовують до амінокислотних полімерів, у яких один або декілька амінокислотних залишків є штучним хімічним аналогом відповідної амінокислоти, що зустрічається в природі, а також до полімерів з амінокислот, що зустрічаються в природі. (054) Як застосовується у даному документі, "промотор" включає посилання на ділянку ДНК вище від початку транскрипції та залучений у розпізнавання й зв'язування РНК-полімерази й інших білків для ініціації транскрипції. ""ослинний промотор" являє собою промотор, здатний ініціювати транскрипцію в рослинних клітинах. Ілюстративні рослинні промотори включають без обмеження такі, які одержують із рослин, рослинних вірусів і бактерій, що містять гени, які експресуються в рослинних клітинах, такі як Адгобасієгішт або КПпі2обішт. Прикладами є промотори, які переважно ініціюють транскрипцію в певних тканинах, таких як листки, корені, насіння, жилки, судини ксилеми, трахеїди або склеренхіма. Такі промотори називають "тканинопереважними". Специфічний для "типу клітин" промотор у першу чергу управляє експресією в певних клітинних типах в одному або декількох органах, наприклад, клітинах провідної тканини у коренях або листках. Промотор, "який індукується" або "який регулюється", являє собою промотор, що перебуває під контролем навколишнього середовища. Приклади умов навколишнього середовища, які можуть впливати на транскрипцію за допомогою промоторів, які індукуються, включають анаеробні умови або наявність світла. Іншим типом промотора є промотор, що регулюється стадією розвитку, наприклад, промотор, який управляє експресією під час розвитку пилку. Тканинопереважні, специфічні для типу клітин промотори, промотори, що регулюються стадією розвитку, й промотори, які індукуються, складають клас "неконститутивних" промоторів. "Конститутивний" промотор являє собою промотор, який є активним в більшості клітин за більшості умов навколишнього середовища.
І055| Будь-яка придатна промоторна послідовність може застосовуватися у конструкті з нуклеїнових кислот за даним винаходом. Згідно з деякими варіантами здійснення даного винаходу промотор являє собою конститутивний промотор, тканиноспецифічний промотор, або бо промотор, що індукується абіотичним стресом.
ІО56) Придатні конститутивні промотори включають, наприклад, промотор 355 Самм (зЕО
ІЮО МО:1546; Одеї! єї аїЇ., Маїште 313:810-812, 1985); промотор АІб669 Агабрідорзіє (ЗЕО ІЮ
МО:1652; див. РСТ публікацію Ме УУО04081173А2); Обі 1 маїсу (СНгізієпзенп еї аї., Ріапі Мої. Віо!. 18:675-689, 1992); актину рису (МеЕїЇгоу еї аї., Ріапі СеїЇ 2:163-171, 1990); РЕМИ (Гаві еї аї.,
ТНеог. Аррі. Сепеї. 81:581-588, 1991); 195 Саму (Ммії55оп еї а!., Рпузіої. Ріапі 100:456-462, 1997);
СсО52 (де Раїег єї аї., Ріапі ) Мометрег; 2(6):837-44, 1992); убіквітину (СНгізіепзеп евї аї., Ріапі
МОЇ. Віої. 18: 675-689, 1992); циклофіліну рису (Виспоїг єї аї., Ріапі Мої! Віої. 25(5):837-43, 1994); гістону НЗ маїсу (І ереїїй єї а!., Мої. Сеп. Сепеї. 231: 276-285, 1992); актину 2 (Ап еї аї., Ріапі .). 10(1);107-121, 1996), конститутивний промотор кореневого кінчика СТ2 (ЗЕО ІО МО:1535; див. також РОСТ заявку Ме І./2005/000627) і синтетичний Бирег МАЗ5 (МІ еї а!., Те Ріапі дошгпаї 7: 661- 76, 1995). Інші конститутивні промотори включають описані в патентах США МоМо 5659026, 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463 і 5608142.
ЇО57| Придатні тканиноспецифічні промотори включають, але без обмеження, специфічні для листків промотори (такі як описані, наприклад, МХМататоїйо еї аї., Ріапі 9. 12:255-265, 1997;
Кмоп еї аї!., Ріапі РНувзіої. 105:357-67, 1994; Мататоїо еї аї., Ріапі Сеї!Ї Рпузіо!. 35:773-778, 1994;
Сюоюог єї аї., Ріапі 9. 3:509-18, 1993; Ого2со вї аї., Ріапі Мої. ВіоІ. 23:1129-1138, 1993; і МаїзцокКа єї аІ.,, Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 90:9586-9590, 1993), насінняпереважні промотори (наприклад, з специфічних для насіння генів (бітоп, еї аї., Ріапі Мої. Віої. 5. 191, 1985; бсоїеїйсй, єї аї., 9. Віої!.
Спет. 262: 12202, 1987; ВавлслупеКі, єї аїЇ., Ріапі Мої. Віої. 14: 633, 1990), альбуміну бразильського горіха (Реагзоп" евї а!., Ріапі Мої. Віо!. 18: 235-245, 1992), легуміну (ЕЇв, єї а. Ріапі
Мої. Віої. 10: 203-214, 1988), глютеліну (рис) (ТаКаїма, єї аї., Мої. Сеп. Сепеї. 208: 15-22, 1986;
ТаКаїма, еї а!І., РЕВ5 І ейв5. 221: 43-47, 1987), зеїну (МаїгКе еї аї., Ріапі Мої Віої, 143).323-32 1990), парА (5іаїІрего, еї аї!., Ріапіа 199: 515-519, 1996), БРА пшениці (АїІбапівїа!, Ріапі Сеї,, 9: 171-184, 1997), олеозину соняшника (Ситітіп5, еї аї., Ріапі Мої. Віої. 19: 873-876, 1992)|, специфічні для ендосперму промотори (наприклад, І ММУУ і НМУУ пшениці, глютеніну-1 (Мої Сеп
Сепеї 216:81-90, 1989; МАВ 17:461-2), гліадинів а, Б ії 4 пшениці (ЕМВОЗ:1409-15, 1984), промотор ШІ ячменю, гордеїну ВІ, С, О ячменю (ТНєог Аррі Сеп 98:1253-62, 1999; Ріапі У) 4:343- 55, 1993; Мої Сеп Сепеї 250:750-60, 1996), ОРЕ ячменю (Мепа вї а!., Тне Ріапі дошигпаї, 116(1): 53-62, 1998), Ві22 (ЕРО9106056.7), синтетичний промотор (Місепів-Саграіфоза єї аї., Ріапі 4). 13:
Зо 629-640, 1998), МАРЗЗ проламіну рису, глобуліну (0-1 рису (УУи єї а!., Ріапі СеїІ Рнузіоіоду 39(8) 885-889, 1998), ВЕВ/ОНР-1 альфа-глобуліну рису (МаКазе еї аїЇ. Ріапі Мої. Віої. 33: 513-522, 1997), АОР-глюкози-РР рису (Ттап5 Не5 6:157-68, 1997), сімейства генів Е5А маїсу (Ріапі / 12:235-46, 1997), гамма-кафірину сорго (Ріапі Мої. Віо! 32:1029-35, 1996)), специфічні для зародків промотори (наприклад, ОБНІ рису (За еї аї., Ргос. Маїї. Асад. сі. ОБА, 93: 8117- 8122), КМОХ (Розіта-Наагзта ої аї, Ріапі Мої. Віо!. 39:257-71, 1999), олеозину рису (Ми еї аї, у.
Віоспет., 123:386, 1998)| і специфічні для квіток промотори (наприклад, АІРАРА, халкон-синтази (сНи5А) (Мап дег Меєег, вї аї., Ріапі Мої. Вісі. 15, 95-109, 1990), І АТ52 (Туеї! євї аЇ., Мої. Сеп Сепеї. 217:240-245; 1989), апетала-3; репродуктивних тканин рослини (наприклад, промотори ОБМАО5 (заявка на патент США Ме 2007/0006344)|.
ІЇ058| Придатні промотори, що індукуються абіотичним стресом, включають, але без обмеження, промотори, що індукуються сіллю, такі як ВО29А (Уатадиснпі-ЗНпіполаївї єї аї., Мої.
Сеп. Сепеї. 236:331-340, 1993); промотори, що індукуються посухою, такі як промотор гена гар17 маїсу (Ріа еї. а!., Ріапі Мої. Віої. 21:259-266, 1993), промотор гена гарг28 маїсу (Визк еї. аї.,
Ріапі 9. 11:1285-1295, 1997) і промотор гена Імг2 маїсу (РеїІезспі еї. а!., Ріапі Мої. Віої. 39:37 3- 380, 1999); промотори, що індукуються тепловим впливом, такі як промотор білка теплового шоку п5р 80 томата (патент США Мо 5187267).
І059| Мається на увазі, що вираз "ферментативна активність" включає деметилювання, гідроксилювання, епоксидування, М-окиснення, сульфокиснення, М-, 5- і О-деалкілування, десульфатацію, деамінування й відновлення азо, нітро й М-оксидних груп. Вираз "нуклеїнова кислота" стосується дезоксирибонуклеотидного або рибонуклеотидного полімеру в одноланцюговій або дволанцюговій формі, або сенсового або антисенсового, і якщо немає інших обмежень, який охоплює відомі аналоги природних нуклеотидів, що гібридизуються з нуклесновими кислотами способом, подібними такому у нуклеотидів, що зустрічаються в природі. Якщо не зазначене інше, конкретна послідовність нуклеїнової кислоти включає її комплементарну послідовність.
ІО6ОЇ "Структурний ген" являє собою таку частину гена, що містить сегмент ДНК, який кодує білок, поліпептид або його частину, та виключає 5'-послідовність, що управляє ініціацією транскрипції. Альтернативно, структурний ген може кодувати продукт, який не транслюється.
Структурний ген може являти собою ген, який у нормі зустрічається в клітині, або ген, який у бо нормі не зустрічається в клітині або місці в клітині, куди його вводять, у випадку чого його називають "гетерологічним геном". Гетерологічний ген може походити повністю або частково від будь-якого джерела, відомого в даній галузі технікию, включаючи бактеріальний геном або епісому, еукаріотичну, ядерну або плазмідну ДНК, кДНК, вірусну ДНК або хімічно синтезовану
ДНК. Структурний ген може містити одну або декілька модифікацій, які можуть впливати на біологічну активність або її характеристики, біологічну активність або хімічну структуру продукту експресії, швидкість експресії або спосіб контролю експресії. Такі модифікації включають без обмеження мутації, вставки, делеції й заміни одного або декількох нуклеотидів. Структурний ген може бути безперервною кодуючою послідовністю, або він може включати один або декілька інтронів, обмежених відповідними точками сплайсингу. Структурний ген може бути таким, що транслюється, або таким, що не транслюється, в тому числі геном в антисенсовій орієнтації.
Структурний ген може бути складеним з сегментів, що отримані з декількох джерел і з декількох генних послідовностей (таких, що зустрічаються в природі, або синтетичних, де синтетичною називається ДНК, яка є хімічно синтезованою).
І061| "Отриманий з" використовують у значенні взятий, здобутий, одержаний, виведений, реплікований або такий, що походить із джерела (хімічного та/або біологічного). Похідне можна одержувати за допомогою хімічної або біологічної маніпуляції (включаючи, але без обмеження, заміну, додавання, вставку, делецію, екстракцію, виділення, мутацію та реплікацію) вихідного джерела. (062) "Хімічно синтезована" відносно послідовності ДНК означає, що частини складових нуклеотидів збирали іп міго. Неавтоматизований хімічний синтез ДНК може здійснюватися із застосуванням загальноприйнятих процедур (Сагиїйег5, Мефйодоюду ої ОМА апа АМА зедцепсіпо, (1983), МУеіз5тап (еа.), Ргаедег Рибіїхпеге, Мем/ ХогКк, Спаріег 1); автоматизований хімічний синтез можна проводити із застосуванням одного з ряду комерційно доступних інструментів. 0631 Як застосовується в даному документі, "рекомбінантний" включає посилання на клітину або вектор, який був модифікований шляхом уведення гетерологічної нуклеїнової кислоти, або посилання на те, що клітина отримана із клітини, модифікованої в такий спосіб. Таким чином, наприклад, рекомбінантні клітини експресують гени, які не зустрічаються в такій самій формі в нативній (нерекомбінантній) формі клітини, або експресують нативні гени, які в інших випадках
Зо експресуються аномально, надекспресуються або не експресуються взагалі внаслідок навмисного втручання людини, або можуть мати знижену або пригнічену експресію нативного гена. Вираз "рекомбінантний", як застосовується в даному документі, не охоплює зміну клітини або вектора за допомогою подій, що зустрічаються в природі (наприклад, спонтанної мутації, природної трансформації/трансдукції/транспозиції), таких як події, що відбуваються без навмисного втручання людини. 064) Як застосовується в даному документі, вираз "касета експресії" являє собою конструкт нуклеїнової кислоти, утворений рекомбінантно або синтетично, з серії певних елементів нуклеїнових кислот, який робить можливою транскрипцію конкретної нуклеїнової кислоти в цільовій клітині. Касета експресії може бути вбудована в плазмідну, хромосомну, мітохондріальну ДНК, пластидну ДНК, фрагмент вірусу або нуклеїнової кислоти. Типово, частина касети експресії у векторі експресії включає серед інших послідовностей нуклеїнову кислоту, що підлягає транскрипції, і промотор.
ЇО65| Вирази "залишок", або "амінокислотний залишок" або "амінокислота" використовуються в даному документі взаємозамінно для позначення амінокислоти, яка вбудовується у білок, поліпептид або пептид (узагальнено "білок"). Амінокислота може являти собою амінокислоту, що зустрічається в природі, та, якщо немає інших обмежень, може включати відомі аналоги природних амінокислот, які можуть функціонувати способом, подібним такому в амінокислот, що зустрічаються в природі.
ІО66)| Вираз "селективно гібридизується" включає посилання на гібридизацію, за жорстких умов гібридизації, послідовності нуклеїнової кислоти з певною цільовою послідовністю нуклеїнової кислоти в помітно більшому ступені (наприклад, щонайменше в 2 рази в порівнянні з фоновим рівнем), ніж її гібридизація з нецільовими послідовностями нуклеїнової кислоти і з істотним виключенням нецільових нуклеїнових кислот. Послідовності, що селективно гібридизуються, як правило, мають приблизно щонайменше 40 95 ідентичність послідовності, переважно 60-90 95 ідентичність послідовності та найбільш переважно 100 95 ідентичність послідовності (тобто, є комплементарними) одна одній.
І067| Вирази " жорсткі умови" або " жорсткі умови гібридизації" включають посилання на умови, за яких зонд буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю у помітно більшому ступені, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше в 2 рази в порівнянні з бо фоновим рівнем). Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть відрізнятися за різних обставин. За допомогою контролю жорсткості умов гібридизації та/або відмивання можна ідентифікувати цільові послідовності, які можуть бути на 10095 комплементарні до зонду (гомологічне зондування). Альтернативно, умови жорсткості можна регулювати задля забезпечення деякої розбіжності у послідовностях, щоб виявляти більш низькі ступені подібності (гетерологічне зондування). Оптимально, зонд має приблизно 500 нуклеотидів у довжину, але його довжина може значно варіювати від менш ніж 500 нуклеотидів до такої, що дорівнює повній довжині цільової послідовності. (068) Як правило, жорсткі умови будуть такими, за яких концентрація солі становить менш ніж приблизно 1,5 М концентрацію іонів Ма, типово приблизно 0,01-1,0 М концентрацію іонів Ма (або інших солей) при рН 7,0-8,3, а температура становить щонайменше приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 "С для довгих зондів (наприклад, більш ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також досягатися шляхом додавання дестабілізуючих засобів, таких як формамід або розчин Денхардта. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином із 30-35 95 формаміду, 1 М Масі, 1 95 505 (додецилсульфат натрію) при 37 "С і відмивання в їх - 2х55С (20х550-3,0
М Масі/0,3 М тринатрійцитрат) при 50-55 "С. Ілюстративні умови помірної жорсткості включають гібридизацію в 40-45 95 формаміді, 1 М Масі, 1 95 505 при 37 "С і відмивання в 0,5х - 1х5552; при 55-60 "С. Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію в 50 95 формаміді, 1 М
Масі, 1 95 505 при 37 "С і відмивання в 0,1х55С при 60-65 "С. Специфічність типово залежить від постгібридизаційних відмивань, причому критичними факторами є іонна сила й температура кінцевого розчину для відмивання. Для гібридів ДНК-ДНК Тт можна приблизно розрахувати з рівняння МеїпКоїйп апа Умапйі, (1984) Апаї!. Віоспет., 138:267-84: Тт-81,5 "Ся16,6 (09 М)0,41 (95 (С)-0,61 (965 форм.)--500//; де М являє собою молярність моновалентних катіонів, 95 (зС являє собою процентне відношення гуанозинових і цитозинових нуклеотидів у ДНК, 96 форм. являє собою процент формаміду в розчині гібридизації, і Її являє собою довжину гібрида у парах основ. Тт являє собою температуру (за певної іонної сили й рН), за якої 50 95 комплементарної цільової послідовності гібридизується з абсолютно співпадаючим зондом. Тт знижують на приблизно 1 "С для кожного 1 95 розбіжності; таким чином, Тт, умови гібридизації та/або відмивання можна регулювати для гібридизації з послідовностями необхідної ідентичності.
Наприклад, якщо бажаними є послідовності з »90 95 ідентичністю, то тт можна знизити на 10 "С. Загалом, жорсткі умови вибирають так, щоб вони були на приблизно 5 "С нижче, ніж температурна точка плавлення (ТІт) для конкретної послідовності та комплементарної до неї послідовності при заданій іонній силі й рН. Однак за умов сильної жорсткості можуть використовуватися гібридизація та/або відмивання при температурі на 1, 2, З або 4 "С нижче, ніж температурна точка плавлення (Тт); за умов помірної жорсткості можуть використовуватися гібридизація та/або відмивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10 "С нижче, ніж температурна точка плавлення (ТІт); за умов низької жорсткості можуть використовуватися гібридизація та/або відмивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 "С нижче, ніж температурна точка плавлення (Тт). Застосовуючи рівняння, склади для гібридизації й відмивання та необхідну Тт, фахівцям буде очевидно, що варіації у жорсткості гібридизації та/або розчинах відмивання практично описані. Якщо необхідний ступінь розбіжності дає в результаті тт меншу ніж 45 "С (водний розчин) або 32 С (розчин формаміду), віддають перевагу збільшенню концентрації 55С таким чином, щоб можна було застосувати більш високу температуру.
Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в Ті|55єеп, І арогайгу Тесппідое5 іп Віоспетівігу апа Моїіесшаг Віоіоду-Нубргідігайоп м/їй Мисівїс Асійа Ргобез, рап |, спарієг 2, "Омегміем/ ої ргіпсіріез ої пубргіаігайоп апа пе з5ігагеду ої писівїс асій ргобе аззаув, "
ЕІземівеї, Мем Могк (1993); і Ситепі Ргоїосої5 іп МоїІесшаг Віоіоаду, спарієї 2, А!йвибеї, еї аї., єдв,
Стеепе Рибіїзпіпу апа УМїеу-Іпіегзсіепсе, Мем Могк (1995). Якщо не зазначене інше, у даній заявці високу жорсткість визначають як гібридизацію в 4х55С, 5х розчині Денхардта (5 г фіколу, 5 г полівінілпіролідону, 5 г альбуміну бичачої сироватки в 500 мл води), 0,1 мг/мл кип'яченої ДНК з молок лососевих і 25 мМ фосфату натрію при 65 "С і відмивання в 0,1х55С, 0,1 95 505 при 65. (069) Як застосовується в даному документі, "трансгенна рослина" включає посилання на рослину, яка містить у своєму геномі гетерологічний полінуклеотид. Як правило, гетерологічний полінуклеотид стабільно інтегрований у геном, так що полінуклеотид передається наступним поколінням. Гетерологічний полінуклеотид може бути інтегрований у геном окремо або як частина рекомбінантної касети експресії. "Трансгенний", як застосовується у даному документі, включає будь-яку клітину, клітинну лінію, калюс, тканину, частину рослини або рослину, генотип яких був змінений через наявність гетерологічної нуклеїнової кислоти, включаючи трансгенні бо організми, початково змінені таким чином, а також трансгенні організми, отримані шляхом статевих схрещувань або безстатевого розмноження з початкових трансгенних організмів.
Вираз "трансгенний", як застосовується в даному документі, не охоплює зміну генома (хромосомного або позахромосомного) за допомогою традиційних способів селекції рослин або за допомогою подій, що зустрічаються в природі, таких як випадкове перехресне запилення, нерекомбінантна вірусна інфекція, нерекомбінантна бактеріальна трансформація, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація.
І0О70| Як застосовується в даному документі, "вектор" включає посилання на нуклеїнову кислоту, яку застосовують у трансфекції клітини-хазяїна, та у яку можна ввести полінуклеотид.
Вектори найчастіше є репліконами. Вектори експресії забезпечують транскрипцію нуклеїнової кислоти, уведеної в них. 071) "Надекспресія" стосується рівня експресії в трансгенних організмах, який перевищує рівні експресії в нормальних або нетрансформованих організмах.
І072| "Рослинна тканина" включає диференційовані та недиференційовані тканини рослин, включаючи, але без обмеження, корені, стебла, пагони, листки, пилок, насіння, пухлинну тканину й різні форми клітин, а також культури, такі як окремі клітини, протопласт, зародки й калюсна тканина. Рослинна тканина може знаходитись в рослинах або в органі, культурі тканин або клітин.
І073| "Переважною експресією", "переважаючою транскрипцією" або "переважною транскрипцією" взаємозамінно називають експресію генних продуктів, які переважно експресуються на більш високому рівні в одній або декількох рослинних тканинах (просторове обмеження) і/або на одній або декількох стадіях розвитку рослини (часове обмеження), тоді як в інших тканинах/стадіях розвитку має місце відносно низький рівень експресії.
І074| "Первинним трансформантом" і "поколінням ТО" називають трансгенні рослини, які належать до того самого генетичного покоління, що і тканина, яка була першочергово трансформована (тобто такі, що не проходять через мейоз і запліднення після трансформації). "Вторинними трансформантами" і "поколіннями 11, Т2, ТЗ тощо" називають трансгенні рослини, що отримані з первинних трансформантів шляхом одного або декількох мейотичних циклів і циклів запилення. Вони можуть отримуватись шляхом самозапилення первинних або вторинних трансформантів або схрещувань первинних або вторинних трансформантів з іншими
Зо трансформованими або нетрансформованими рослинами.
І075| "Селективним маркерним геном" називають ген, експресія якого в рослинній клітині надає клітині селективної переваги. Селективна перевага, яку мають клітини, трансформовані за допомогою селективного маркерного гена, може бути обумовлена їхньою здатністю до росту в присутності негативного селективного засобу, такого як антибіотик або гербіцид, у порівнянні зі здатністю до росту нетрансформованих клітин. Селективна перевага, яку мають трансформовані клітини, може також бути обумовлена їхньою посиленою здатністю, у порівнянні з нетрансформованими клітинами, використовувати додану сполуку як поживну речовину, фактор росту або джерело енергії. Селективна перевага, яку має трансформована клітина, може також бути обумовлена втратою гена, який був у неї раніше, в так званій "негативній селекції". При цьому додають сполуку, що є токсичною лише для клітин, які не втратили специфічний ген (негативний селективний маркерний ген), присутній у батьківській клітині (типово, трансген).
І076|Ї Вираз "трансформація" стосується перенесення фрагмента нуклеїнової кислоти в геном клітини-хазяїна, що приводить до генетично стабільного успадкування. "Тимчасово трансформованими" називають клітини, у які були введені трансгени й чужорідна ДНК (наприклад, за допомогою таких способів, як опосередкована Адгобасіегічт трансформація або біолістичне бомбардування), але які не відбирали для стабільного зберігання. "Стабільно трансформованими" називають клітини, які були відібрані й регенеровані на селекційному середовищі після трансформації.
І077| "Трансформованим/трансгенним/рекомбінантним" називають організм-хазяїн, такий як бактерія або рослина, у який була введена молекула гетерологічної нуклеїнової кислоти.
Молекула нуклеїнової кислоти може бути стабільно інтегрованою в геном хазяїна, або молекула нуклеїнової кислоти також може бути присутня у якості позахромосомної молекули. Така позахромосомна молекула може бути здатна до самореплікації. Передбачається, що трансформовані клітини, тканини або рослини охоплюють не лише кінцевий продукт процесу трансформації, але також їхнє трансгенне потомство. "Нетрансформованим", "нетрансгенним" або "нерекомбінантним" хазяїном називають організм дикого типу, наприклад, бактерію або рослину, яка не містить молекулу гетерологічної нуклеїнової кислоти. 078) Вираз "трансляційна енхансерна послідовність" стосується такої частини послідовності бо ДНК гена між промотором і кодуючою послідовністю, яка транскрибується в РНК ї наявна у повністю процесованій мРНК вище (5) трансляційного старт-кодону. Трансляційна енхансерна послідовність може впливати на процесінг первинного транскрипта в мРНК, стабільність МРНК або ефективність трансляції. "Візуально помітним маркером" називають ген, експресія якого не забезпечує перевагу трансформованій клітині, але може зробити так, що її можна виявляти або візуально помічати. Приклади візуально помітних маркерів включають без обмеження В- глюкуронідазу (55), люциферазу (ОС) і зелений флюоресцентний білок (СЕР).
І079| "Диким типом" називають нормальний ген, вірус або організм, які зустрічаються в природі без будь-якої мутації або модифікації.
ІО80) Як застосовується в даному документі, "рослинний матеріал", "частина рослини" або "рослинна тканина" означає рослинні клітини, протопласти рослин, тканинні культури рослинних клітин, з яких можна регенерувати рослини, калюси рослин, рослини, що мають спільну кореневу систему, і рослинні клітини, які є інтактними в рослинах або частинах рослин, таких як зародки, пилок, насінні зачатки, насіння, листки, квітки, гілки, плоди, зерна, качани, стрижні кукурудзяних качанів, оболонки, стебла, корені, кореневі кінчики, пиляки, бульби, ризоми й подібне.
ІО81)| Як застосовується в даному документі, "білковим екстрактом" називають частковий або загальний білок, екстрагований із частини рослини. Способи екстракції рослинного білка добре відомі в даній галузі техніки. (082) Як застосовується в даному документі, "зразком рослини" називають або інтактну, або неінтактну (наприклад, розмелену тканину насіння або рослини, порубану тканину рослини, ліофілізовану тканину) рослинну тканину. Це також може бути екстракт, що містить інтактну або неінтактну тканину насіння або рослини. 083) Наступні вирази застосовують для опису відношень послідовностей між двома або більшою кількістю нуклеїнових кислот, або полінуклеотидів, або поліпептидів: (а) "еталонна послідовність", (Б) "вікно порівняння", (с) "їдентичність послідовностей", (4) "процент ідентичності послідовностей" і (е) "істотна ідентичність". 084) Як застосовується в даному документі, "еталонна послідовність" являє собою задану послідовність, яку застосовують у якості основи для порівняння послідовностей. Еталонна послідовність може являти собою частину певної послідовності або певну послідовність повністю; наприклад, у вигляді сегмента послідовності КДНК або генної послідовності повної довжини або повної послідовності кКДНК або генної послідовності.
ІО85| Як застосовується в даному документі, "вікно порівняння" включає посилання на безперервний і визначений сегмент полінуклеотидної послідовності, у якому полінуклеотидна послідовність може порівнюватися з еталонною послідовністю, та де частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може містити додавання або делеції (тобто гепи) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить додавання або делеції) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Як правило, вікно порівняння становить щонайменше 20 суміжних нуклеотидів у довжину та необов'язково може мати 30, 40, 50 ї 100 або більше.
Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що для уникнення високої подібності з еталонною послідовністю внаслідок включення гепів у полінуклеотидну послідовність зазвичай вводиться штраф за введення гепа й віднімається від числа збігів.
ІО8б6| В даній галузі техніки добре відомі способи вирівнювання нуклеотидних і амінокислотних послідовностей для порівняння. Алгоритм локальної гомології (ВЕЗТРЕІТ) Зтійй апа УУагептап, (1981) Адм. Аррі. Май 2:482, може здійснювати оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння; за допомогою алгоритму гомологічного вирівнювання (АР)
Меєдієтап апа М/песи, (1970) 9). Мої. Віої. 48:443-53; за допомогою способу пошуку за подібністю (авіа апа Равзіа) Реагхоп апа Гіртап, (1988) Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 85:2444; за допомогою комп'ютеризованих реалізацій цих алгоритмів, включаючи, але без обмеження:
СГО5ТАГ. у програмі РС/Сепе від ІпіеїПдепеїіс5, Моипіаіїйп Міему, Саїйї., АР, ВЕЗТРЕЇТ, ВГА5Т,
ЕАЗТА і ТЕАЗТА у пакеті програмного забезпечення УМі5сопвіп Сепеїіс5, версія 8 (доступна від
Сепеїйіс5 Сотршиїег сгоир (програми СОСОФ (Ассеїгуз, Іпс., зап Ріедо, Саїї.)). Програма СГОЗТАЇ. добре описана Ніддіп апа Зпагр, (1988) Сепе 73:237-44; Ніддіпв апа Зпагр, (1989) САВІО5 5:151-3; Согреї, єї аї!., (1988) Мисієїс Асідб5 Нез. 16:10881-90; Ниапо, єї аї!., (1992) Сотриіег
Арріїсайопе іп Ше Віозсіеєпсе5 8:155-65; і Реагзоп, еї аї., (1994) Меїй. Мої. Віої. 24:307-31.
Кращою програмою для застосування у оптимальному глобальному вирівнюванні множинних послідовностей є РіеОр (Бепа апа ОооїїшШе, (1987) У. Мої. Емої., 25:351-60, яка аналогічна способу, описаному Ніддіп5 апа Зпагр, (1989) САВІО5 5:151-53, і включена в даний документ за допомогою посилання). Сімейство програм ВГА5Т, які можна застосовувати для пошуків за подібністю в базах даних, включає: ВГА5ТМ для нуклеотидних запитуваних послідовностей 60 відносно бази даних нуклеотидних послідовностей; В АЗТХ для нуклеотидних запитуваних послідовностей відносно бази даних білкових послідовностей; ВІАБТР для білкових запитуваних послідовностей відносно бази даних білкових послідовностей; ТВІА5ТМ для білкових запитуваних послідовностей відносно бази даних нуклеотидних послідовностей і
ТВГА5ТХ для нуклеотидних запитуваних послідовностей відносно бази даних нуклеотидних послідовностей. Див. Ситепі Ргоїосоїв5 іп МоїІесшіаг Віоіоаду, розділ 19, А!й5ибеї єї аї., єд5., Стеепе
Рибріїєпіпу апа У/Пеу-Іпіегвсієпсе, Мем ХоїК (1995).
І087| САР застосовує алгоритм Меєдіеєтап апа МУцпбсі, вище, для знаходження вирівнювання двох повних послідовностей, яке максимізує число збігів і мінімізує число гепів.
САР розглядає всі можливі вирівнювання й положення гепів і створює вирівнювання з найбільшим числом основ, що збіглися, і найменшою кількістю гепів. Вона дає змогу ввести штраф за введення гепа й штраф за продовження гепа в одиницях основ, що збіглися. САР повинен отримувати вигоду від числа штрафів за введення гепа за рахунок збігів для кожного гепа, який він уводить. Якщо вибирають штраф за продовження гепа більше ніж нуль, то САР повинен, крім того, отримувати вигоду від кожного введеного гепа у розмірі довжини гепа, помноженої на штраф за продовження гепа. Значення за замовчуванням штрафу за введення гепа й значення штрафу за продовження гепа у версії 10 пакета програмного забезпечення
УмМі5сопвіп Сепеїйс5 становлять 8 і 2, відповідно. Штрафи за введення гепа й продовження гепа можуть виражатися як ціле число, яке вибране з групи цілих чисел, що складається з 0-100.
Таким чином, наприклад, штрафи за введення гепа й продовження гепа можуть являти собою 0, 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10, 15, 20, 30, 40 і 50 або більше. (088) САР є одним членом сімейства найкращих вирівнювань. Може існувати багато членів цього сімейства, але жоден інший член не має кращої якості. АР відображає чотири показники оцінки вирівнювань: якість, співвідношення, ідентичність і подібність. Якість являє собою показник, максимізований для вирівнювання послідовностей. Співвідношення являє собою якість, поділену на число основ у коротшому сегменті. Відсоток ідентичності являє собою відсоток символів, які фактично збігаються. Відсоток подібності являє собою відсоток символів, які є подібними. Символи, які знаходяться навпроти гепів, не враховують. Подібність підраховують, коли значення у матриці замін для пари символів становить більше або дорівнює 0,50, граничному значенню подібності. Матрицею замін, яка застосовується у версії 10 пакета
Зо програмного забезпечення Умізсопвзіп Сепеїіс5, є В ОЗИОМБб2 (див., Непікої апа Непікоїї, (1989)
Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 89:10915).
ЇО89| Якщо не зазначене інше, значеннями ідентичності/подібності послідовностей, представленими в даному документі, називають значення, що отримані із застосуванням пакета програм ВГАБ5Т 2.0 із застосуванням параметрів за замовчуванням (Ай5спиї, еї аї., (1997)
Мисівїс Асіа5 Не. 25:3389-402). 090) Як буде зрозуміло фахівцям у даній галузі, пошуки за допомогою ВІ А5Т припускають, що білки можуть моделюватися як випадкові послідовності. Проте, більшість існуючих білків містять ділянки з невипадковими послідовностями, які можуть являти собою гомополімерні тракти, короткоперіодичні повтори або ділянки, доповнені однією або декількома амінокислотами. Такі ділянки низької складності можуть вирівнюватися між неспорідненими білками, навіть якщо інші ділянки білка є повністю несхожими. Ряд програм-фільтрів для ділянок низької складності можна застосовувати з метою зменшення таких вирівнювань низької складності. Наприклад, фільтри для низької складності ЗЕ (М/ооїеп апіа ЕРедетеп, (1993) ботриї. Спет. 17:149-63) ії ХМО (СіІамегіє апа 5іагез, (1993) Сотриї. Спет. 17:191-201) можна застосовувати окремо або в комбінації.
ЇО91| Як застосовується в даному документі, "ідентичність послідовностей" або "ідентичність" у контексті двох послідовностей нуклеїнової кислоти або поліпептидних послідовностей включає посилання на залишки у двох послідовностях, які є однаковими при вирівнюванні для максимальної відповідності на певному вікні порівняння. Коли відсоток ідентичності послідовностей застосовують по відношенню до білків, слід усвідомлювати, що положення залишків, які не є ідентичними, часто відрізняються консервативними амінокислотними замінами, де амінокислотні залишки заміщені на інші амінокислотні залишки з подібними хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю) і, внаслідок цього, не змінюють функціональні властивості молекули. Якщо послідовності відрізняються за консервативними замінами, то відсоток ідентичності послідовностей можна регулювати убік підвищення, зробивши поправку на консервативну природу заміни. Про послідовності, що відрізняються за такими консервативними замінами, говорять, що вони мають "подібність послідовностей" або "подібність". Засоби для здійснення такого регулювання добре відомі фахівцям у даній галузі Типово це включає виставлення балу консервативній заміні як 60 частковій, а не повній розбіжності, тим самим збільшуючи процент ідентичності послідовностей.
Таким чином, наприклад, якщо ідентичній амінокислоті виставляють бал 1, а неконсервативній заміні виставляють бал нуль, то консервативній заміні виставляють бал від нуля до 1.
Виставлення балів консервативним замінам розраховують, наприклад, згідно з алгоритмом
Меуєгз апа Міїїег, (1988) Сотршег Арріїс. ВіоЇ. сі. 4:11-17, наприклад, як реалізовано в програмі РС/БЕМЕ (ІпіеїПідепеїіс5, Маунтін Вью, Каліфорнія, США). 0921 Як застосовується в даному документі, "відсоток ідентичності послідовностей" означає значення, яке визначають за допомогою порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей у вікні порівняння, де частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може містити додавання або делеції (тобто гепи) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить додавань або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей.
Процент розраховують шляхом визначення числа положень, у яких ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок зустрічається в обох послідовностях з одержанням числа положень, що збіглися, ділення числа положень, що збіглися, на загальне число положень у вікні порівняння й множення результату на 100 з одержанням відсотка ідентичності послідовностей.
ІО93| Вираз "їстотна ідентичність" полінуклеотидних послідовностей означає, що полінуклеотид містить послідовність, яка має 50-100 95 ідентичність послідовностей, переважно щонайменше 50 95 ідентичність послідовностей, переважно щонайменше 60 95 ідентичність послідовностей, переважно щонайменше 70 95, більш переважно щонайменше 80 95, більш переважно щонайменше 9095 і найбільш переважно щонайменше 9595 у порівнянні з еталонною послідовністю, із застосуванням однієї з описаних програм вирівнювання із застосуванням стандартних параметрів. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що ці значення можуть бути відповідним чином скориговані для визначення відповідної ідентичності білків, які кодуються двома нуклеотидними послідовностями, із урахуванням виродженості кодонів, амінокислотної подібності, розташування рамки зчитування й подібного. Істотна ідентичність амінокислотних послідовностей для цих цілей зазвичай означає ідентичність послідовностей, що дорівнює 55-100 9565, переважно щонайменше 55 95, переважно щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 70 95, 80 95, 90 95 і найбільше переважно щонайменше 95 95.
Ї094| Іншою ознакою того, що нуклеотидні послідовності є суттєво ідентичними, є
Зо гіоридизація двох молекул одна з одною за жорстких умов. Виродженість генетичного коду забезпечує більшість амінокислотних замін, що ведуть до різноманітності в нуклеотидній послідовності, що кодує одну й ту саму амінокислоту, тому не виключено, що послідовність ДНК може кодувати такий самий поліпептид, але не гібридизуватися одна з одною за жорстких умов.
Це може відбуватися, наприклад, коли копія нуклеїнової кислоти створюється із застосуванням максимальної виродженості кодону, дозволеної генетичним кодом. Одна ознака того, що дві послідовності нуклеїнової кислоти є суттєво ідентичними, заключається в тому, що поліпептид, який кодує перша нуклеїнова кислота, є імунологічно перехресним з поліпептидом, який кодує друга нуклеїнова кислота. 095) Фраза "абіотичний стрес", як застосовується в даному документі, стосується будь-якого несприятливого ефекту на метаболізм, ріст, розмноження та/або життєздатність рослини з боку абіотичних факторів (тобто водозабезпеченості, теплового впливу, холоду і т.д.). Відповідно, абіотичний стрес може бути викликаний субоптимальними навколишніми умовами зростання, такими як, наприклад, засоленість, водне голодування, водний дефіцит, посуха, повінь, заморожування, низька або висока температура (наприклад, охолодження або надмірне нагрівання), забруднення токсичними хімічними речовинами, токсичність важких металів, анаеробіоз, недостатність поживних речовин, надлишок поживних речовин, атмосферне забруднення або УФ-опромінення.
ІЇ0О96| Фраза "стійкість до абіотичного стресу", як застосовується в даному документі, стосується здатності рослини витримувати абіотичний стрес, не зазнаючи істотної зміни в
БО метаболізмі, рості, продуктивності та/або життєздатності.
І097| Як застосовується в даному документі, "водний дефіцит" означає період, коли вода, що є доступною для рослини, не поповнюється зі швидкістю, з якою вона поглинається рослиною.
Тривалий період водного дефіциту в розмовній мові називається посухою. Відсутність дощу або зрошення миттєво може не призводити до стресу, викликаного нестачею води, якщо є доступний запас грунтових вод для підтримки швидкості росту рослин. Рослини, які вирощують в грунті з достатнім запасом грунтових вод, можуть переживати дні без дощу або зрошення без несприятливих впливів на врожайність. Рослини, які вирощують в сухому грунті, у випадку мінімальних періодів водного дефіциту, ймовірно, зазнають несприятливих впливів. Стрес, викликаний важким водним дефіцитом, може спричинити зів'янення й загибель рослин; помірна бо посуха може знижувати врожайність, заримувати ріст або стримувати розвиток. Рослини можуть відновлюватися після декількох періодів стресу, викликаного водним дефіцитом, без істотного впливу на врожайність. Однак водний дефіцит під час запилення може зменшувати або знижувати врожайність. Таким чином, корисним періодом у життєвому циклі кукурудзи, наприклад, для спостереження за реакцією або стійкістю до водного дефіциту, є пізня вегетативна стадія росту перед появою волоті або перехід до розвитку репродуктивних органів.
Стійкість до водного дефіциту визначають шляхом порівняння з контрольними рослинами.
Наприклад, рослини за даним винаходом можуть продукувати більш високий урожай, ніж контрольні рослини за умови впливу водного дефіциту. У лабораторії та у польових випробуваннях посуху можна імітувати шляхом надання рослинам за даним винаходом й контрольним рослинам меншої кількості води, ніж надають контрольним рослинам з достатнім рівнем поливу, й визначення відмінностей в ознаках. Наприклад, урожайність можна розділити на такі компоненти як рослин на акр, кількість рядів зерен на качан, кількість качанів на рослину, кількість зерен на рослину й вага на зерно. Безпліддя або зменшене утворення насіння може також підвищуватися за умов стресу, викликаного нестачею води. Один аспект даного винаходу передбачає рослини, які надекспресують гени, розкриті в даному документі, що забезпечують більш високу стійкість до водного дефіциту. 098) Як застосовується в даному документі, фраза "оптимізація води" стосується будь-якого показника рослини, його частин або його структури, який можна виміряти та/або кількісно визначати, щоб оцінити ступінь або швидкість росту й розвитку рослин за різних умов водозабезпеченості. У зв'язку із цим, "ознака оптимізації води" являє собою будь-яку ознаку, яка, як можна показати, впливає на врожайність рослини за різних поєднань умов росту, пов'язаних з водозабезпеченістю. Ілюстративні показники оптимізації води являють собою врожайність зерна за стандартного відсотка вологості (УЗ5ММ), вологість зерна при збиранні (СМ5ТР), вагу зерна на ділянку (СУУТРМ) і процентне відновлення врожаю (РУКЕС).
Ї099| Як застосовується в даному документі, фрази "посухостійкість" і "посухостійкий" стосуються здатності рослин витримувати та/або успішно розростатися за умов, коли водозабезпеченість є субоптимальною. Як правило, рослину відмічають як "посухостійку", якщо вона проявляє "посилену посухостійкість". Як застосовується в даному документі, фраза "посилена посухостійкість" стосується вимірюваного поліпшення, посилення або збільшення одного або декількох фенотипів оптимізації води в порівнянні з однією або декількома контрольними рослинами.
ІЇО100| Коефіцієнт використання води (М/ОЄЕ) являє собою параметр, який часто застосовують для оцінки співвідношення між поглинанням води й уловлюванням СОг/ростом (Ктатег", 1983, Уаїег Неїайоп5 ої Ріапі5, Асадетіс Ргев55 р. 405). МИШЕ визначали і вимірювали численними способами. Один підхід полягає в обчисленні відношення сухої ваги цілої рослини до ваги води, яку рослина поглинала протягом свого життя (Спи еї аї., 1992, ОесоїЇодіа 89:580).
Інший варіант полягає в застосуванні більш короткого часового інтервалу, коли вимірюються накопичення біомаси й використання води (Міап еї аїЇ., 1998, Стор 5сі. 38:390). Інший підхід полягає у використанні вимірювань від окремих частин рослини, наприклад, вимірювання росту і використання води лише надземних частин (Міеппиів еї а! 1994 Атег У Вої 81:943). МОЄ також був визначений як відношення уловлювання СО2 до втрати води листком або частиною листка за рахунок випаровування, що часто вимірюється протягом дуже короткого періоду часу (наприклад, секунди/хвилини) (Кгатег, 1983, р. 406). Відношення 13С/12С, зафіксованого в рослинній тканині та виміряного за допомогою мас-спектрометра для вимірювання співвідношення ізотопів, також застосовувалося для оцінки УМОЕ у рослин, які застосовують С-3 фотосинтез (Магпіп еї аї!., 1999, Стор сі. 1775). Як застосовується в даному документі, вираз "коефіцієнт використання води" стосується кількості органічних речовин, продукованих рослиною, поділеної на кількість води, використаної рослиною при їх продукуванні, тобто сухої ваги рослини по відношенню до використання рослиною води. Як застосовується в даному документі, вираз "суха вага" стосується будь-чого у рослині, за винятком води, і включає, наприклад, вуглеводи, білки, олії й мінеральні поживні речовини. Передбачається, що трансгенні рослини, отримані за допомогою способів, описаних у даному документі, будуть забезпечувати збільшення коефіцієнта використання води.
ІО101| Фраза "біотичний стрес", як застосовується в даному документі, стосується будь-якого несприятливого ефекту на метаболізм, ріст, розмноження та/або життєздатність рослини з боку біотичних факторів (тобто тиск з боку комах, захворювання тощо).
ІО102| Фраза "стійкість до біотичного стресу", як застосовується в даному документі, стосується здатності рослини витримувати біотичний стрес, не зазнаючи істотної зміни у метаболізмі, рості, розмноженні та/або життєздатності.
0103) Як застосовується в даному документі, фраза "рослинна біомаса" стосується кількості (яку вимірюють в грамах повітряно-сухої або сухої тканини) тканини, отриманої від рослини у вегетаційний період, яка може також визначати або впливати на врожайність рослин або врожайність на площу вирощування. (0104) Як застосовується в даному документі, фраза "міць рослин" стосується кількості (яку вимірюють за вагою) тканини, продукованої рослиною за визначений час. Отже, збільшена міць може визначати або впливати на врожайність рослин або врожайність за час вирощування або на площі вирощування. 0105) Вираз "рання міць" стосується активного здорового добре збалансованого росту особливо під час ранніх стадій росту рослини, і вона може бути результатом кращої пристосованості рослини внаслідок того, наприклад, що рослини є краще адаптованими до свого навколишнього середовища (оптимізують використання джерел енергії й розподіляють між пагоном й коренем). Рослини, що мають ранню міць, також демонструють підвищене виживання сходів і краще вкорінення сільськогосподарської культури, що часто приводить до вельми однорідних полів (наприклад, сільськогосподарські культури, що ростуть однаковим чином, а саме, сільськогосподарські культури, що досягають різних стадій розвитку в фактично один і той самий час) і часто до більш високих урожаїв. Отже, ранню міць можна визначати за допомогою вимірювання різних факторів, таких як вага тисячі зерен, відсоткове проростання, відсоток появи сходів, ріст сходів, висота сходів, довжина кореня, біомаса кореня й пагона та багато іншого.
І0106| Як застосовується в даному документі, "міць сходів" стосується характеристики рослини, згідно якої рослина з'являється з грунту швидше, має підвищену швидкість проростання (тобто, проростає швидше), має більш швидкий і більш масштабний ріст сходів іМабо проростає швидше в умовах холоду в порівнянні з диким типом або контролем за аналогічних умов. Міць сходів часто визначали як таку, що включає властивості насіння, які визначають "потенціал для швидкої, однорідної появи й розвитку нормальних сходів у широкому діапазоні польових умов".
Ї0107| Життєвий цикл квітучих рослин в цілому можна розділити на три фази росту: вегетативну фазу, фазу бутонізації й фазу цвітіння (пізня фаза бутонізації). У вегетативній фазі
Зо апікальна меристема пагона (ЗАМ) утворює листки, які пізніше будуть забезпечувати джерела, необхідні для створення фертильного потомства. Після одержання відповідних сигналів від навколишнього середовища й сигналів стадії розвитку рослина переходить до росту квітки, або до репродуктивного росту, і ЗАМ вступає у фазу бутонізації (І) ії дає початок суцвіттю з зачатками квіток. Під час цієї фази напрямок розвитку ЗАМ і вторинних пагонів, які виникають у пазухах листків, визначається набором генів ідентичності меристем, деякі з яких запобігають, а деякі з яких стимулюють розвиток квіткових меристем. Як тільки вони з'являються, рослина входить у пізню фазу бутонізації, коли формуються органи квітки. Якщо присутні відповідні сигнали навколишнього середовища й сигнали стадії розвитку, рослина переходить до росту квітки, або репродуктивного росту. Якщо такі сигнали порушуються, рослина не буде здатною розпочинати репродуктивний ріст, а отже, підтримуватиме вегетативний ріст.
ІО108) Термін "ідіоплазма" стосується генетичного матеріалу особини (наприклад, рослини), групи особин (наприклад, лінії, сорту або родини рослин), або клону, отриманого з лінії, сорту, виду або культури. Ідіоплазма може бути частиною організму або клітини, або може бути відділена від організму або клітини. Як правило, ідіоплазма забезпечує генетичний матеріал зі специфічним молекулярним складом, який забезпечує фізичну основу для деяких або всіх спадкових якостей організму або культури клітин. Як застосовується в даному документі, "ідіоплазма" включає клітини, насіння або тканини, з яких можуть вирости нові рослини або частини рослин, такі як листки, стебла, пилок або клітини, з яких можна виростити цілу рослину. (0109) Антитіла за даним винаходом включають поліклональні й моноклональні антитіла та їхні суміші, які можуть являти собою будь-які з до, ІА, ІМ, ЧЕ, ІдО і будь-який їхній ізотип, наприклад, Ідс1, Ідс2, ІдсЗ або ІдсС4. У випадку моноклонального антитіла ілюстративним класом антитіл є до. Підкласи (до включають, наприклад, Ідс1, Ідс2, ІдОЗ ії Ідс4. Антитіла включають інтактні й химерні молекули імуноглобулінів 3 двома важкими ланцюгами повної довжини й двома легкими ланцюгами повної довжини (наприклад, зріла частина послідовностей варіабельної ділянки важкого й легкого ланцюгів), а також підпослідовності/фрагменти важкого або легкого ланцюга, які зберігають щонайменше частково функцію (наприклад, специфічність зв'язування Т6РР або афінність зв'язування Т6РР) батьківського інтактного антитіла, що специфічно зв'язує ТЄРР і, зокрема, модифіковану ТЄРР. Підпослідовності можуть мати таку ж або практично таку саму специфічність зв'язування, афінність зв'язування, як і батьківські бо інтактні й химерні антитіла.
0110 Одержання моноклональних або поліклональних антитіл може здійснюватися за допомогою методик, які добре відомі у даній галузі техніки. "Поліклональні" антитіла являють собою антитіла, отримані з різних В-клітинних джерел. Вони є комбінацією молекул імуноглобулінів, які секретують специфічний антиген, кожний з яких ідентифікує окремий епітоп.
Поліклональні антитіла типово одержують за допомогою інокуляції придатного ссавця, такого як миша, кролик або коза. Наприклад, композицію, що містить білок ТбРР, який здатний продукувати антиген, ін'єкційно вводять ссавцю. Присутність нового білка індукує В-лімфоцити продукувати імуноглобуліни їдсС, специфічні до антигену ТЄРР. Поліклональні імуноглобуліни
Іо потім очищають з сироватки ссавця. 0111) Вираз "моноклональноєе антитіло", як застосовується в даному документі, стосується препарату з молекул антитіл з одним молекулярним складом. Моноклональне антитіло проявляє одну специфічність і афінність зв'язування до конкретного епітопу. Спосіб одержання моноклональних антитіл включає одержання імунних соматичних клітин з потенціалом до продукування антитіл, зокрема, В-лімфоцитів, які були попередньо імунізовані за допомогою антигену, що становить інтерес, іп мімо або іп міго і які є придатними для злиття з лінією В- клітинної мієломи. (0112) Лімфоцити ссавців типово імунізують шляхом іп мімо імунізації тварини (наприклад, миші) за допомогою необхідного білка або поліпептиду, наприклад, за допомогою Т6РР за даним винаходом. Такі імунізації повторюють при необхідності з інтервалами до декількох тижнів для одержання достатнього титру антитіл. Після імунізації тварини можна застосовувати в якості джерела лімфоцитів, що продукують антитіла. Після останньої бустер-ін'єкції антигену тварин умертвляють і видаляють клітини селезінки. Лімфоцити мишей забезпечують більш високий відсоток стабільного злиття з лініями мієломи миші, які описані в даному документі. З них миша ВАЇ В/с є переважною. Проте, інші лінії мишей, кролика, хом'яка, вівцю й жабу також можна застосовуватися в якості хазяїв для одержання клітин, що продукують антитіла. Див.;
Сюодіпу (в Мопосіопаї! Апііродієв: Ргіпсірієв апа Ргасіїсе, 24 єд., рр. 60-61, ОпПапао, Ніа., Асадетіс
Ргез5, 1986).
ІО113| Переважно зливаються такі клітини, що продукують антитіла, які перебувають на стадії плазмобласта, що ділиться. Соматичні клітини можна отримувати з лімфатичних вузлів,
Зо селезінок і периферичної крові тварин, які підлягали первинному впливу антигена, а переважні лімфатичні клітини залежать великою мірою від їхньої емпіричної ефективності в конкретній системі злиття. Лімфоцити, що секретують антитіла, потім піддають злиттю з (мишачими) клітинами В-клітинної мієломи або трансформованими клітинами, які здатні до необмеженого розмноження в культурі клітин, з одержанням, тим самим, безсмертної клітинної лінії, що секретує імуноглобулін. Отримані злиті клітини, або гібридоми, культивують і отримані колонії піддають скринінгу щодо продукування необхідних моноклональних антитіл. Колонії, що продукують такі антитіла, клонують і вирощують іп мімо або іп міго для одержання великих кількостей антитіла. Опис теоретичної основи й практичної методології злиття таких клітин викладений в Койпіег апа Міїсїеїп, Маїшге 256:495 (1975), яка включена в даний документ за допомогою посилання.
ІО114| Збільшена врожайність сільськогосподарської культури являє собою ознаку, що представляє значний економічний інтерес в усьому світі. Врожайність зазвичай визначають як вимірюваний підсумок економічної цінності сільськогосподарської культури. Вона може визначатися у формі кількості та/або якості. Врожайність безпосередньо залежить від декількох факторів, наприклад, числа й розміру органів, структури рослини (наприклад, числа гілок), утворення насіння, старіння листків та іншого. Розвиток кореня, поглинання поживних речовин, стресостійкість і рання міць також можуть бути важливими факторами при визначенні урожайності. Крім того, у сільському господарстві дуже бажаною є розробка сільськогосподарських культур, які можуть демонструвати збільшену врожайність за оптимальних умов росту, а також за неоптимальних умов росту (наприклад, при посусі, в умовах абіотичного стресу). Таким чином, оптимізація вищезгаданих факторів може вносити вклад у підвищення врожайності сільськогосподарських культур. 01151) Урожайність насіння є особливо важливою ознакою, оскільки насіння багатьох рослин важливе для харчування людей і тварин. Сільськогосподарські культури, такі як кукурудза, рис, пшениця, канола і соя, забезпечують більше половини загальної кількості калорій, які споживає людина, або через пряме споживання насіння як такого, або через споживання сільськогосподарських тварин, вигодуваних переробленим насінням. Насіння рослин також є джерелом цукрів, олій і багатьох видів метаболітів, які застосовуються у різних промислових процесах. Насіння складається з зародка (джерела нових пагонів і коренів) і ендосперму 60 (джерела поживних речовин для росту зародка під час проростання та під час раннього росту сходів). До розвитку насіння залучені багато генів, і він потребує перенесення метаболітів від кореня, листків і стебел до насіння, що розвивається. Ендосперм асимілює метаболічні попередники вуглеводів, олій і білків і синтезує з них запасні макромолекули для наливання зерна. 0116) Рання міць являє собою інший важливий аспект урожайності. Поліпшення ранньої міці являє собою важливу мету сучасних програм селекції рису в культиварів рису як помірного, так і тропічного пояса. Довгі корені важливі для надійного закріплення в грунті рису, що висаджується у воду. Рис, що висаджується у воду, висівають безпосередньо на затоплені поля, де рослини повинні швидко з'явитися з води, тому більш довгі пагони забезпечують збільшене виживання молодих сходів. Якщо практикують посів рядками, для задовільної появи сходів важливі більш довгі мезокотилі та колеоптилі. Можливість розробки у рослин ранньої міці матиме велике значення в сільському господарстві. Наприклад, слабка рання міць стала обмеженням для введення гібридів маїсу (7еа тау5 1.) які основані на ідіоплазмі з
Кукурудзяного пояса США в Атлантичній частині Європи. В іншому аспекті рання міць може також забезпечувати більш ранні періоди збирання деяких сільськогосподарських культур, що може служити перевагою в багатьох сільськогосподарських застосуваннях.
ІО117| Рослини, розроблені для поліпшеної врожайності за умов різних біотичних і абіотичних стресів, становлять особливий інтерес в галузі сільського господарства. Наприклад, абіотичний стрес є основною причиною втрати врожаю в усьому світі, знижуючи середні рівні врожайності найбільш важливих культурних рослин більш ніж на 50 95 (У/апа еї а!., Ріапіа (2003) 218: 1-14). Абіотичні стреси можуть спричинятися посухою, повенями, засоленістю, екстремальними значеннями температури, хімічною токсичністю й оокисним стресом.
Можливість поліпшення стійкості рослин до абіотичного стресу буде мати велику економічну перевагу для фермерів в усьому світі та буде забезпечувати культивування сільськогосподарських культур під час несприятливих умов, а також на територіях, де культивування сільськогосподарських культур іншим способом неможливе.
ІО118)| У деяких випадках урожайність рослини визначають відносно кількості рослинної біомаси, яку може продукувати конкретна рослина. Більша рослина з більшою площею листків, як правило, може поглинати більше світла, поживних речовин і вуглекислого газу, ніж менша
Зо рослина, а отже, ймовірно, буде прибавляти більшу вагу протягом такого самого періоду (Разошіа 4. ТоПепааг 2005 Мауаїса 50:39). Збільшена рослинна біомаса може також бути дуже бажаною в таких процесах, як перетворення біомаси (наприклад, кукурудзи, трав, сорго, очерету) на паливо, таке як, наприклад, етанол або бутанол.
І0119| Можливість збільшення врожайності рослин матиме багато застосувань у таких галузях, як сільське господарство, одержання декоративних рослин, деревництво, садівництво, одержання біопалива, фармацевтика, ферментна промисловість, де використовують рослини як фабрики для цих молекул, і лісівництво. Збільшення врожайності може також знаходити застосування в одержанні мікробів або водоростей для застосування в біореакторах (для біотехнологічного одержання речовин, таких як фармацевтичні препарати, антитіла, вакцини, паливо, або для біологічного перетворення органічних відходів) та інших подібних галузях.
ІО120| Селекціонери рослин часто зацікавлені у поліпшенні специфічних аспектів урожайності залежно від досліджуваної сільскогосподарської культури або рослини, а також частини цієї рослини або сільскогосподарської культури, які мають відносну економічну цінність.
Наприклад, селекціонер рослин може очікувати конкретно на поліпшення рослинної біомаси (ваги) однієї або декількох частин рослини, які можуть включати надземні (придатні для збирання) частини та/або придатні для збирання частини під землею. Це особливо доречно там, де споживче значення мають надземні частини або підземні частини рослини. Для багатьох сільськогосподарських культур, особливо злаків, дуже бажане поліпшення врожайності насіння. Збільшена врожайність насіння може проявлятися багатьма шляхами, причому кожний окремий аспект урожаності насіння має різну важливість для селекціонера рослин залежно від досліджуваної сільськогосподарської культури або рослини та її кінцевого застосування. 01211) Для селекціонера рослин була б великою перевагою можливість підібрати та вибрати аспекти врожайності, які підлягають зміні. Також може бути дуже бажаною можливість підібрати ген, що підходить для зміни конкретного аспекту врожайності (наприклад, урожайності насіння, ваги біомаси, коефіцієнта використання води, врожайності при стресових умовах). Наприклад, збільшення швидкості наливу у комбінації зі збільшеною вагою тисячі зерен буде дуже бажаною для сільськогосподарської культури, такої як кукурудза. Для рису й пшениці буде дуже бажаною комбінація збільшеної швидкості наливу, процентного відношення маси врожаю до загальної маси рослин і збільшеної ваги тисячі зерен.
01221) Трегалоза являє собою дуже стабільний дисахарид, що складається з двох молекул глюкози. Вона не розпадається при нагріванні до 100"С протягом 24 годин у широкому діапазоні рН. її низька реакційна здатність, фізіохімічні властивості й стабільність роблять її винятковим осмопротектором. За відсутності води вона стабілізує білки, мембрани та інші клітинні структури, заміщуючи воду шляхом утворення водневих зв'язків з полярними залишками. Після висушування трегалоза утворює сітчасту склоподібну структуру, яка обмежує рух молекул, що запобігає агрегації білків і дифузії вільних радикалів (Вгиптійеїй с (2004) Маїиге 428:14-15, Раці
МУ (2004) Ріапі Віоїеснпої .), 2 рр. 71-82).
ЇО123| Раніше вважалося, що лише певні рослини, такі як стійкі до висушування види, наприклад, рослини, що відроджуються, накопичують трегалозу, оскільки вони роблять це в значних кількостях, які легко виміряти. Проте, нещодавні генетичні й геномні дані показують, що всі рослини, досліджені до теперішнього часу, мають здатність синтезувати трегалозу, але, як правило, в дуже малих кількостях (Раці Му, еї аї. (2008) Аппи Кем Ріапі Віої 59:417 -441). Більше того, виявилося, що метаболізм трегалози є вкрай важливим, тому що позбавлення рослини здатності продукувати трегалозу, наприклад, за допомогою мутації, є летальним (Еазітопа Р), еї аї. (2002) Ріапі У 29:225-235). Більшість видів сільськогосподарських культур містять слідові кількості трегалози (які вимірюються на низькому мікромолярному або навіть наномолярному рівні), хоча характерне для маїсу накопичення є невідомим.
І0124| "Трегалозний шлях", як застосовується в даному документі, складається із двох біосинтетичних ферментів, трегалоза-6-фосфатсинтази (ТР) і трегалоза-6-фосфатфосфатази (Т6РР), та одного гідролізуючого ферменту, трегалази, залученого у розпад, див. Фіг. 3. На даний час невідомо, скільки ізоформ (ТР) або (ТЄРР) існує у маїсі. У модельній рослині
Агарідорзі5 загалом налічується 11 генів ТР5 (Раші єї аї. (2008) Аппи Нем Ріапі Віої! 59:417-441), проте, каталітична активність була показана лише для АЇТРБ1 (Мапаезіеепе І, еї аї. (2010) Мо!
Ріапі 3:406-419). Функція інших 10 гомологів ТР5 Агабрідорзіз залишається незрозумілою. В
Агарідорзібх існує 10 генів ТЄРР, і хоча більшість не були добре охарактеризовані, усі вони, ймовірно, мають Т6РР активність (5спІсертапп Н, еї аї. (2012) У Ехр Вої:1-12; Раші єї аї., (2008)
Аппи Нем Ріапі Віої! 59:417-441). Навпаки, Агарідорвіз містить лише один ген, що кодує трегалазу (МаПег у, еї аї. (2001) Ріапі Рпузіо! 125:1086-1093; Нгізоп М, еї аї. (2007) РЕВ5 І ейегз 581:4010-
Зо 4016; Раці єї а. 2008). Аналогічна ситуація спостерігається у рису (Зпіта 5, єї аї. (2007) РЕВ5 У 274:1192-1201; ап еї аї, (2011) Ріапі Мої Віо! 76:507-522). Дані визначення профілів експресії показують, що члени сімейства генів диференційно експресуються в ході розвитку рослини (Зспешртапп еї аї., (2004) Ріапі Рпузіої 135:879-890; 7апд еї аї., (2011) Ріапі Мої! Віо! 76:507- 522). Різноманітність тканиноспецифічної експресії й трансляції серед деяких членів сімейств генів ТЄРР ї ТРО представляє явний доказ того, що ці ферменти здійснюють важливі й, можливо, різні функції в рослині (Заїоп-Мадазауча еї аї., (2006) Маїшге 441:227-230; Мивзіторни єї а!.,, (2009) Ргос Маї! Асай Зсі ОБА 106:18843-18848; Натоп еї аї., (2009) Ріапі Сеї! Епмігоп 32:1015-1032). (0125) Ферменти трегалозного шляху також регулюються на посттрансляційному рівні. Білки
ТРБ являють собою субстрати для споріднених з неферментуючими сахарозу (5МЕ1) протеїнкіназами (ЗПпЕКТ) (2папо еї аї., (2009) РіІапі Рпузіо! 149:1860-1871). Деякі фосфопротеїни
ТРБ (АКРБ5, 6 й 7) зв'язують 14-3-3 білки (Напій еї аї., (2006) Ріапі 4 47:211-223).
Координаційне фосфорилювання й кепування сайту фосфорилювання за допомогою 14-3-3 білків можуть являти собою можливий механізм, за допомогою якого регулюється активність
ТРБ. Нітратредуктаза регулюється за допомогою аналогічного механізму, який базується на переході світлоиллемрява (Нибрег еї аї., (2002) Ріапі Мо! Віо! 50:1053-1063). Напнії! єї аї. припускають, що усі з нітратредуктази, 6-фосфофрукто-2-кіназа/фруктоза-2,6-бісфосфатази (Р2КР) ї ТР5 модифікуються за допомогою однієї кінази (імовірно, ЗпКК), зв'язують 14-3-3 білки та у деякій мері можуть регулюватися циклом світло/темрява (Нагіпйії! еї аї. (2006) Ріапі 00 47211-223). 0126) Складність в експресії й регуляції дає вагомі підстави припускати, що білки в шляху метаболізму трегалози мають бути згруповані з ферментами, важливими для метаболізму рослини, які виконують як каталітичні, так і регуляторні функції. Їхня точна роль повністю не зрозуміла, але перспективну модель можна асоціювати з трьома головними функціями: передача сигналу за участю цукрів, розвиток рослин і захист від стресу.
ЇО127| Грунтуючись на опублікованих повідомленнях стосовно мікробіологічних систем (МієткКеп, А. (1990) У Сеп Містобріо! 58:209-217), в яких стабілізація мембран та інші переваги корелюють із високими рівнями трегалози (1-10 95 сухої ваги, г/у), ранні роботи з генетичної модифікації фокусувались на застосуванні трегалози в якості осмопротектора. Деякі бо опубліковані дослідження припускали, що трегалоза захищає рослини від посухи та інших осмотичних стресів (саго еї аї., (2002) РМАБ5 99:15898-15903; Раші еї а!., (2008) Аппи Нем Ріапі
Віо! 59:417-441; Се еї аї., 2008; її еї аїІ.,, 2011). Проте, коли рівні трегалози вимірювали у трансгенних рослинах, розроблених для надмірного накопичення трегалози, було виявлено, що вони були дуже низькими, близько мікрограмів на грам сирої ваги. Філогенетична інформація також показує, що незважаючи на поширення в рослинах генів трегалозного шляху, лише невелике число рослин накопичує метаболіти трегалози на рівнях, необхідних для безпосередньої дії в якості осмопротектора або стабілізатора клітинних структур. 0128) Діяльність у середині 1990-их з одержання трегалози в рослинах (для харчової промисловості) відрізнялася від діяльності з одержання у рослинах молекул інших "чужорідних" цукрів (Еазітапа апа Сгапат, (2003) Сигтепі Оріп Ріапі Віо! 6:231-235; РеїІпу сеї а. (2004) Ріапі
Віотесппої У, 2 рр. 71-82; Раш! М.У. (2007) Ситепті Оріпюм п Рідпі Біюоду Успшнте 10, івеце З,
Уипе, Раде5 303-309). Зміна метаболізму трегалози в трансгенних рослинах часто призводила до неочікуваних плейотропних дефектів росту (І огдаспезси апа Ітаї, (2008) У Іпіедгаїйме Ріапі
Віої 501223-1229).
ІО1291| Р.). Еазітопа єї а. першими показали незаперечну потребу в активному гені ТР5 рослини, ТРОЇ Агабідорвзіх, для розвитку зародка (Еавзітопа Р... єї аї., (2002) Ріапі У 29:225- 235). Гомозиготні рі мутанти не розвивалися до зрілого насіння. 5спіІсертапт есеї аї. показали, що їре1 мутант може бути врятований завдяки експресії гена ої5А Е. соїї, що кодує трегалоза-6- фосфатсинтазу, що дозволяє припустити, що Т6Р є активним компонентом трегалозного шляху, який регулює метаболізм рослини. Концентрація Т6Р у рослинних клітинах є дуже низькою, що доволяє припустити, що вона функціонує в якості сигнальної молекули (Зспешртапп еї аї., (2004) Ріапі РНувзіої 135:879-890). Невелика зміна в її концентрації може мати істотний "гормоноподібний" ефект на регуляцію метаболічних процесів у рослині (Коїїапа еї аї. (2002)
Ріапі СеїІ:5185-5205).
ІЇО130| У нинішній час існує зростаюча кількість доказів для підтвердження залучення трегалозного шляху в передачу сигналів за участю цукрів, що є необхідним для всіх організмів.
Це забезпечує регуляцію рівнів цукрів між крайніми значеннями великої кількості й нестачі (Емеіапа апа даскзоп, (2012) У Ехр Вої:1-11). Наприклад, у ссавців регуляція рівнів цукру в крові за допомогою інсуліну є необхідною для підтримання оптимального стану здоров'я.
Зо ІО131| Концепція, згідно якої трегалозні цукри залучені в передачу сигналу цукрами й енергетичний статус, з'ясована у мікробів, зокрема дріжджів, і в цей час підтверджується у рослин (ЗсПпІсертапп еї аї., (2012) У Ехр Вої1-12). У рослин Т6Р синтезується з О6Р і ООРО, подальших продуктів розпаду сахарози. ОРОС одержують безпосередньо за допомогою сахарозосинтази; З6Р одержують з глюкози за допомогою інвертази й гексокінази або за допомогою фруктози й фруктоза-6-фосфату (ЕбР) за допомогою сахарозосинтази, фруктокінази та фосфоглюкозаізомерази. ОРОС і Об6Р також являють собою два головні активовані попередники, з яких, зрештою, можуть бути отримані багато клітинних функціональних сполук (фігура 4). ШОРО являється попередником для основних полісахаридів клітинної стінки та для гліколіпідів. ЗбР являється попередником для синтезу крохмалю, МАЮРН шляхом окисної частини пентозофосфатного шляху (МазакКараїї 5.К. еї а!., (2010) Ріапі Рпузіо! 152:602-6159), і
АТР шляхом гліколізу, циклу Кребса й окисного фосфорилювання. Крім того, О6Р може бути перетворений на фруктоза-б-фосфат і, разом з ООРО, може застосовуватися для синтезу сахароза-6-фосфату, а потім сахарози. Будучи зробленим з ПОРО і О6Р, Т6Р перебуває на перетинах основних вуглеводних потоків у рослинах. Таким чином, рівні ТбР у рослинних клітинах можуть відображати доступність гексозофосфатів, ШОР С і сахарози. 0132) Важливе відкриття показує, що Т6Р зв'язується з ЗПРКІ з інгібуванням її активності (/папуд сеї аї., 2009) Ріапі РНувіої 149:1860-1871), див. Фіг. 5. ЗПККІ! являє собою гетеротримерний білок та є рослинним гомологом протеїнкінази тварин, що активується АМР, та протеїнкінази дріжджів, що не ферментує сахарозу (Зп) (Раші єї (2008) Аппи Нем Ріапі Віо)! 59:417-441; 5спіпертапнп есеї аї., (2012) У Ехр Вої:1-12; Роде апа Тпотаз (2007) Тгепавз іп Ріапі
Зсіепсе Усште 12, І5вце 1, Удапиагу 2007, Радез 20-28). Глобальна генна експресія в рослинах, які надекспресують ген субодиниці ЗпПККІ, нагадує реакцію рослини на стрес, викликаний нестачею вуглецевої поживної речовини, або на енергетичний стрес, спричинені тривалим темновим періодом, інгібуванням фотосинтеза або зануренням у воду (Ваепа-Соп7аїе еї аї., (2007) Маїште 448:938-942). Таким чином, збільшений рівень ЗпЕКт опосередковує реакції на стрес, викликаний низькою енергією. У той же час інактивація ЗпККІ! стимулює процеси, необхідні для утилізації та анаболізму вуглецю (фігура 6).
ІО133) В Агабрідорзіх ТЄР був опосередковано асоційований МАЮОРН-залежними процесами (Коїре еї аї., (2005) РМАБ 102:11118-11123). Рівні ТЄР в Агабідорзіз мають тенденцію до бо обернено-пропорційної кореляції з рівнями О6Р (Зспіеиртапп еї аї!.(2003) Ргос Май! Асай Зсі
ИБА 100:6849-6854) і прямої кореляції з рівнями сахарози (Магііпе7-Вага|а5 еї аї., 2011). В
Агарідорзі5 сахароза або трегалоза, що застосовуються для живлення, збільшують рівні Т6Р і активують включення вуглецю в крохмаль, що являє собою використання вуглецю для запасання. Тб6Р залучений в окисно-відновну активацію АсСРази в гетеротрофних тканинах (Бспівюртапт еї аї., (2012) У Ехр Вої:1-12). Крім того, АСРаза істотно активується за допомогою опосередкованого тіоредоксином відновлення, якщо рівні ТЄР збільшені за допомогою експресії трансгена. Фермент МАРОН-тіоредоксинредуктаза С (МТКС) використовує МАОРН для окисно- відновної активації АСРази. Мутанти за МТКС не реагують на живлення трегалозою, що дозволяє припустити, що Т6Р діє на фермент МТКС або попередній елемент у шляху окисно- відновної активації АСбРази. Розглядаючи разом, ТбР функція у рослинах впливає на енергетичну передачу сигналу, а також окисно-відновну передачу сигналу за допомогою
МАОРН; Т6Р необхідний, оскільки він контролює доступність МАОРН - субстрату для відновного біосинтезу. Проте механізми, за допомогою яких ТЄР проявляє свій вплив на залежну від
МАОРН окисно-відновну передачу сигналу, у рослин невідомі. Природа залучення ЗПпПККІ1 в цьому випадку невідома (Зспіеиртапп еї аї., (2012) 9У Ехр Воїг1-12). ЗпКК1 необхідна для активації АсСРази (Коїре еї аї., (2005) РМАБЗ 102:11118-11123) і, очевидно, є активною як вище, так і нижче Т6Р в окисно-відновній активації АсСРази в гетеротрофних тканинах. (0134) Т6Р є необхідним метаболітом, тому що він контролює доступність субстрату для росту. Ріст сходів Агарідорвів5 інгібується, якщо їх вирощують на середовищах з трегалозою, і ефект послаблюється при живленні сахарозою та трегалозою. Було показано, що зупинка росту на трегалозі викликається накопиченням Т6Р; інгібування трегалози корелює з 10-кратним збільшенням Т6Р (Зспісертапгп еї аї!., (2004) Ріапі Рпузіо! 135:879-890). Інгібування росту сходів
Агабрідорзі5 пов'язане зі значним накопиченням крохмалю в сім'ядолях. Навпаки, у кореневих кінчиках не показане типове накопичення крохмалю. Живлення сходів трегалозою порушує розподіл вуглецю, при цьому весь вуглець залишається в його джерелі - сім'ядолях, та спостерігається помітне вуглецеве голодування у верхівках. Проте, активація за допомогою Т6Р
АСбрРази та включення вуглецю в крохмаль не є причиною інгібування росту. Навпаки, інгібування активності ЗПККІТза допомогою ТР, як було показано, викликає інгібування росту на трегалозі, оскільки сходи, які надекспресували каталітичну субодиницю (КІМ10) 5пАКт, росли на трегалозі (Оєіайце еї аї., (2011) Ріапі Рпузіої 157:160-174). Таким чином, очевидно, сходи перестають рости на трегалозі, оскільки накопичення ТР інгібує активність ЗПККІ.
І0135)| Це може здаватися парадоксальним, що як украй мала кількість Т6Р, як у їрз1 мутанта, так і вкрай велика кількість ТР за відсутності вуглецю, що надається екзогенно, зупиняє ріст рослини. Механізм, за допомогою якого Т6бР/ЗпПККІ здійснює контроль за метаболізмом у рослині, далекий від розуміння. Проте, не обмежуючись теорією, у гетеротрофних тканинах кількість ТР збільшується, коли доступна сахароза. Збільшення кількості Т6Р інгібує активність ЗПКК! таким чином, що клітини можуть переключатися на анаболічні процеси, необхідні для росту. Коли знижуються рівні сахарози або доступність вуглецю, то знижується рівень Т6Р, знімаючи контроль з активності ЗПККІ1; при цьому анаболічні процеси інгібуються. Також відомо, що активність ЗПЕКІ1 активується під час реакцій на вуглецевий і енергетичний стрес (фігура 6). БПКК1 сприймає сигнал про низький рівень енергії або вуглецю та опосередковує процеси, необхідні для того, щоб зробити вуглець доступним у клітинах-реципієнтах для росту. Активність 5пПЕКІ необхідна, доки вуглець не стане знову доступним у гетеротрофних тканинах. Потім синтезується сахароза, а рівень Т6Р збільшується достатньою мірою, щоб інгібувати активність 5ПЕКТ1.
ІО136| Даний шлях передачі сигналу за допомогою ТбР/ЗпКК! жодним чином не є універсальним. В Агарідорвзіх зв'язування ТЄР з 5пККІ1 потребує усе ще невловимої розчинної білкової молекули, фактора 1 (2папод еї аї., (2009) Ріапі Рпузіо! 149:1860-1871), яку не можна виявити в зрілому листку. Крім того, субодиниці комплексу 5пПЕК1 гетерогенно розподілені в рослинних тканинах (Віпіап еї аї., (2011) Ріапі У 65:829-842). Гетерогенність, таким чином, очікується при інгібуванні ЗПпПКК! за допомогою ТбР у гетеротрофних тканинах і фотоавтотрофних тканинах (Віїгіап еї аї., (2011) Ріапі 9 65:829-842). Також Т6Р є зарядженим метаболітом і, тому, навряд чи вільно експортується в інші клітини (5спіечиртапнп еї аї., (2012) 9
Ехр Вок:1-12).
ІО137| Генетичні та біохімічні дані показують, що трегалозний шлях є необхідним для розвитку рослин і контролює клітинний морфогенез. Втрата ферментативної активності ТРУ1 в
Агарідорзхіз є летальною для зародків (Еазітопа еї аї., (2002) Ріапі У 29:225-235; Раші еї аї., (2008) Аппи Нем Ріапі Віо! 59:417-441). Був встановлений зв'язок експресії АПРБІ1 зі специфічними характерними для стадії розвитку фенотипами, такими як уповільнений розвиток бо зародка, змінений ріст кореня і пагона і змінений перехід до цвітіння. Дані показують, що відсутність ТЄР послабляє здатність зародка до переходу у фазу розвитку з поділом клітин (Раці еї а!., (2008) Аппи Нем Ріапі Віої! 59:417-441).
ІО138) У маїсу КАМО5АЗ (КАЗ), який є важливим для розгалуження суцвіття, кодує білок
Тб6РР, що складається з одного домену (Заїоп-Мадазамжа єї а. (2006) Майте 441:227-230).
Уважається, що експресія ТбЄРР в ділянках, що оточують пазушні меристеми, може сприяти передачі рухливого сигналу, що має короткий діапазон, для регуляції ідентичності та детермінованості меристеми. Втрата КАЗ активності викликає важкі аномалії качанів, які включають довгі пазушні пагони в основі качана на ранньому розвитку (Емеїапа 8. даскзхоп (2012)
У Ехр Вої:1-11).
І0139| Спагу єї а). описує ідентифікацію мутанта з фенотипом-1ї форми клітини (с5р-1)
Агабрідорвзів Інаійапа. СОР-1 демонструє велику кількість дефектів у процесах розвитку рослини, наприклад, довжині стебла рослини, морфології листка, розвитку кореня, зменшеному розгалуженні пагонів і вповільненому цвітінні (Спагу еї аІ. (2008) Ріапі Рпузіо!146: 97-107).
Мутація була виявлена в гені АСЕТРБб. Це забезпечує істотний доказ, вказуючий на те, що ген
ТРБ5 є важливим модифікатором клітинної морфології та розвитку всієї рослини. Незрозуміло, який механізм дії лежить в основі цих серйозних впливів на розвиток. Можливо, що вони, щонайменше частково, опосередковані шляхом передачі сигналу за допомогою ТбР/ЗпЕКт. (0140) ТР у більшості зразків маїсу присутній у концентрації «10 мкг/зЕМУ, що ускладнює точне вимірювання Тб6Р. Крім того, сімейство генів ТЄРР маїсу подібне за розміром з таким для рису та Агабрідорзі5, а природнє накопичення Т6РР є високим у більшості тканин. Це дозволяє припустити, що трансгенна експресія ТбРР рису в маїсі, ймовірно, проявляє свій ефект просторовим і часовим способом.
ІО141| На даний час виявлено, що експресія деяких форм трегалоза-6-фосфатфосфатази (Т6РР) у рослинах забезпечує істотне збільшення врожайності, а також забезпечує витривалість до різних типів стресу (тобто абіотичного стресу). Під час проведення аналізів різних варіантів
Т6РР, які трансгенно експресуються в рослинах, було виявлено, що трансгенні рослини, які демонструють найвищу врожайність насіння, також містили Т6бРР з модифікаціями в амінокислотних залишках, що пов'язані зі зв'язуванням із субстратом. Не обмежуючись теорією, ці білки можуть мати знижену ферментативну активність при прямому порівнянні з ТЄРР, що не
Зо містить таких модифікацій. Більше того, не обмежуючись теорією, ймовірно, що експресія у рослині ТЄРР з модифікованою ферментативною активністю приводить до кращого фенотипу, який характеризується істотно збільшеною врожайністю як в польових стресових умовах (наприклад, при посусі), так і в польових безстресових умовах. До того ж, не обмежуючись теорією, це дозволяє припускати, що менш активна форма Т6бРР служить у якості молекулярного сигналу, тим самим забезпечуючи в рослині збільшення крохмалю, цукру та збільшену врожайність насіння. Теоретично, цей молекулярний сигнал може являти собою білок-білюову взаємодію із трегалоза-б6-фосфатсинтазою (ТР5) з утворенням комплексу, який потім може передавати сигнал рослині. Теоретично, цим сигналом можуть бути змінені рівні трегалоза-6-фосфату (ТР). Не обмежуючись теорією, одна можливість полягає в тому, що модифікована ТЄРР при експресії в рослині утворює білок-білюювий комплекс із ендогенними формами ТРБ5 і/або ТЄРР. Теоретично, це зв'язування змінює здатність Т6РР гідролізувати її субстрат Т6Р і активує або регулює ТР5 для одержання Т6Р. Ця взаємодія у подальшому забезпечує змінені рівні Т6Р, який потім подає сигнал рослині запасати більшу кількість цукрів у насінні та/або біомасі. Альтернативно, але не обмежуючись теорією, модифікована Т6РР, що має знижену активність, взаємодіє з деяким іншим компонентом, поки ще не з'ясованим, що приводить до ініціації каскаду, який подає сигнал рослині запасати більшу кількість цукрів у врожаї та/або біомасі. Грунтуючись на викладених вище теоріях, для одержання рослини зі збільшеною врожайністю за будь-яких умов можна застосовувати багато способів. Також передбачається, що для регуляції продукування цукрів у рослині можна застосовувати описані в даному документі способи та додатково застосовувати методики молекулярної інженерії для транспорту цукрів у різні частини рослин для збільшення, наприклад, таких показників, як рослинна біомаса, урожайність насіння, вміст цукру в надземному рослинному матеріалі (тобто такому як цукровий очерет), а також у придатні для споживання частини рослин. Додатково ці гени трегалоза-6-фосфатфосфатази можуть знайти застосування в забезпеченні багатьох більш бажаних ознак, таких як рання міць, стресостійкість, посухостійкість, збільшений коефіцієнт використання поживних речовин, збільшена маса коренів та збільшений коефіцієнт використання води.
І0142| Трегалоза являє собою нередукуючий дисахарид, що складається з двох молекул глюкозьї, з'єднаних за допомогою альфа-1,1 зв'язків. Цукор трегалозу можна виявити у багатьох бо різних організмах багатьох царств (наприклад, рослини, бактерії, комахи і т.д.). Було показано,
що трегалоза залучена у функцію запасання вуглеводів, і додатково була пов'язана з тим, що відіграє роль у стресостійкості бактерій, грибів і комах. У рослин, як уважалося спочатку, трегалоза містилася лише в екстремофілах, таких як рослина, що відроджується, ЗеїІадіпеПНа
ІерідфорпуПйа, проте в даний час загальновизнаним є те, що метаболізм трегалози широко розповсюджений у царстві рослин.
ІЇО143| Трегалоза синтезується з ОЮР-глюкози та глюкоза-6-фосфату в двох ферментативних реакціях. Спочатку ОЮОР-глюкоза та глюкоза-6-фосфат перетворюються на
ОООР (уридиндифосфат) і альфа, альфа-трегалоза-6-фосфат (Т6Р) за допомогою ферменту
ТРБ5 (трегалозафосфатсинтаза). На другому етапі, який каталізується ферментом ТбРР (трегалозафосфатфосфатаза), Тб6Р дефосфорилюється з одержанням трегалози та ортофосфату (див. Фіг. 3). (0144) У дріжджів дві ферментативні активності (ТР і ТЄРР активність) властиві великому білковому комплексу, що містить активні субодиниці, ТРУ і ТР52, і регуляторні субодиниці, при цьому ТРБ1 має ТРБ активність, а ТРБ5Б2 має Т6РР активність. В Е. соїї ці дві ферментативні активності виявляються в окремих білкових комплексах. У рослин білковий комплекс до теперішнього часу не був охарактеризований. (0145) В Агабрідорзів Ійаїійапа біосинтетичні ферменти трегалози були класифіковані на три класи: 0146) Клас І: містить чотири гени, АСЕТР5З1-АКТРБА4, що мають значну подібність із зБСТРО1;
ІО1471| Клас ІІ: має сім членів, АЕГРБОБ-АЇТРБ11, зі значною подібністю послідовностей до
ЗСТРБ2; і 0148) Клас ІІ: містить 10 членів, АЕТЄРРА-АЇТ6РРУ), що кодують білки з подібністю до ТР52
Е. сої ії С-кінцем білків БСТР52. 01491) Гени, що кодують білки в межах цих класів, також присутні в інших видах рослин. 0150) У межах Класу І і Класу Її ферментативна активність була однозначно визначена лише для АЇТРБО1, що проявляє ТРБ активність (Віагдие? еї а. Ріапі У. Магсп 1998;13(5):685-9.).
Цікаво, що до теперішнього часу не повідомлялося про будь-яку Т6РР активність для будь-якого з інших білків ТР5 Класу Ії. Навпаки, ТЄРР активність раніше була описана для АЇТбРРА і
АПОРРВ, двох членів Класу ІІ (Модеї еї а. Ріапі У. Магсп 1998;13(5):673-83). Рослинні ТбРР
Зо Класу ІП містять два мотиви консенсусної послідовності фосфатази, які виявлені у всіх ферментах Т6РР, описаних до теперішнього часу (Таїег еї аї. Ргоїеїп зЗсі. ОУшу 1998;7(7):1647- 52).
ІО151) Повідомлялося, що генетична маніпуляція з генами біосинтезу трегалози приводила до поліпшеної стресостійкості у рослин, а також, викликала чітко виражені зміни в розвитку.
Надекспресія генів ОЇї5А і ОЇ5В Е. сої (еквівалентів ТЄРР і ТРБ5) у трансгенних рослинах тютюну й картоплі, як повідомлялося, викликала аберації розвитку коренів і листків, а також пригнічувала ріст рослин. Менша кількість насіння продукувалась в трансгенних рослинах тютюну з ОЇ5А, а трансгенні рослини картоплі з ОЇ5В8 не утворювали бульби (сСодфді|п еї аї. Ріапі
Ріпузіої. дапиагу 1997:113(1)181-90). Аналогічні результати були описані іншими авторами (Ноїтвігот єї а. Майте, 379, 683-684; Вотего еї а!. Ріапіа, 201, 293-297; Ріопі-5тіїв еї аї. 1998;
У Ріапі РНузіої. 152:525-532; ЗсПІпертапп еї а. Ргос Маїй!. Асад. сі. ОО 5 А. 2003;100(11):6849- 54). Також повідомлялося, що мутанти з дефектом у генах ТРБ5 і ТЄРР демонструють дефекти розвитку. В Агарідорзі5 нокаутні за ТРОЇ мутанти демонстрували погіршений розвиток зародків (Еазітопоа еї аї. Ріапі У). дапиагу 2002; 29(2):225-35). Мееїгееєп еї аї. (Ріапі Сеї! 2006; 18; 518-522) відмічають, що внаслідок виділення й визначення характеристик гена КАМОЗАЗ (КАЗ) маїсу стало відомо, він відповідає за розвиток меристеми й розвиток суцвіть, включаючи розгалуження. Це дозволяє припускати, що ген, генний продукт й регуляторні ділянки можуть застосовуватися для управління розгалуженням, ростом меристеми, розвитком («і розташуванням суцвіть. Негативні фенотипи, пов'язані з експресією трансгена, можуть мати несприятливі впливи на відносну врожайність рослини. Наприклад, без зав'язування насіння, наливу насіння, фертильності рослини тощо, не буде збільшення врожайності насіння. Заявка на патент США 2007/0006344 є першим записом відомостей, що розкриваються у даному винаході, стосово способу, який описує експресію Т6РР у рослині із забезпеченням збільшення врожайності рослин без будь-яких негативних фенотипів і/або несприятливих впливів на біологічу функцію рослин. У заявці на патент США 2007/0006344 описується застосування трегалоза-6-фосфатфосфатази, функціонально пов'язаної з промотором О5МАЮОБ5, який націлює переважну експресію Т6РР на материнську репродуктивну тканину рослини, що приводить у результаті до істотного збільшення врожайності маїсу в умовах дефіциту води та умовах гарного зрошення. Нижченаведений винахід у цілому включає ідентифікацію ТЄРР, що бо має модифікації, які забезпечують поліпшену врожайність і польову продуктивність культурних рослин, і додатково описує способи, які можна застосовувати для збільшення врожайності рослини шляхом використання у рослині модифіукованих ТбРР. 0152) Даний винахід передбачає нуклеотидні послідовності, які при трансгенній експресії в рослині збільшують міць рослин, урожайність, використання азоту та/або біомасу в стресових і безстресових умовах. Було виявлено, що білки Т6РР, які містять модифікації, що змінюють активність білка ТЄРР, при цьому активність знижена при прямому порівнянні зі спорідненою
Т6РР, що не має модифікацій, забезпечують як істотне збільшення врожайності, так і/або підвищену стійкість до стресу, коли ці модифіковані ТЄРР трансгенно експресуються в рослині.
Не обмежуючись теорією, ці модифікації, ймовірно, зроблені в ключових положеннях в межах білка ТЄРР, що впливає на зв'язування ТЄРР з її субстратом Т6Р. Теоретично, ТЄРР, розкриті в даному документі, що мають знижену активність, служать у якості сигналу для рослини або ініціюють у рослині певні метаболічні каскади або метаболічні шляхи, які забезпечують у рослині збільшений транспорт цукрів до плодів, зерен, листків, коренів або інших частин, приводячи тим самим до збільшення врожайності насіння, біомаси та/або росту коренів. 0153) Не обмежуючись теорією, експресія ТЄРР, модифікованої для зниження активності та/або модифікованої таким чином, щоб вона мала збільшений потенціал зв'язування з ендогенним білком ТР5, може застосовуватися для ініціації комплексу ТЄРР/ТР5, причому у подальшому присутність зазначеного комплексу ТЄРР/ТР5 забезпечує в рослині збільшену врожайність і/або підвищену стійкість до стресу. В іншому варіанті здійснення, не обмежуючись теорією, комплекс Тб6РР/ТРЗ забезпечує в рослині змінені рівні ТЄР, які у подальшому забезпечують у рослини збільшену врожайність і/або підвищену стійкість до стресу. В одному аспекті даного винаходу трансгенний комплекс ТЄРР/Т5РБ5 може трансгенно експресуватися в рослині із забезпеченням в рослини збільшеної врожайності та/або підвищеної стресостійкості.
В іншому варіанті здійснення передбачається, що за допомогою способів, добре відомих у відповідній галузі техніки, можуть бути створені різні хімічні структури та/або молекулярні структури для імітації функції комплексу ТЄРР/Т5Р5Б, як описано в даному документі. В одному варіанті здійснення, не обмежуючись теорією, будь-яку ТЄРР можна модифікувати таким чином, щоб вона мала зменшене зв'язування із субстратом ТЄР, що у подальшому буде забезпечувати збільшену врожайність і польову продуктивність при трансгенній експресії в рослинах модифікованих ТЄРР. У деяких випадках нуклеотидні послідовності кодують білок, залучений у шлях біосинтезу трегалози, при цьому в одному варіанті здійснення білок кодує Т6РР. В іншому варіанті здійснення даного винаходу Т6РР виділяють із генома покритонасінної рослини, а потім модифікують, як описано в даному документі. У додатковому варіанті здійснення даного винаходу ген Т6РР виділяють з однодольної рослини. В одному аспекті гени Т6РР, розкриті в даному документі, виділяють із генома рослини рису. 0154) Гени ТеЄРР, описані в даному документі, є, головним чином, членами надсімейства
НАО фосфатаз або містять білкову консенсусну послідовність, зображену в ЗЕО ІЮ МО: 9.
Надсімейство НАЮ фосфатаз, яке також можна називати надсімейством Ю0ООЮО фосфатаз, включає консервативний альфа/бета-коровий домен, а також кеп-домен, функція яких може змінюватися (тобто зв'язування із субстратом тощо). В одному варіанті здійснення даного винаходу модифікація локалізована в будь-якому з кеп-"домену, фосфатазного домену, домену
А-фосфатазного боксу або домену В-фосфатазного боксу Т6РР, де зазначена модифікація змінює зв'язування з її субстратом (наприклад, Т6Р). В іншому варіанті здійснення модифікації можуть включати одне або декілька з заміни, делеції або додавання одного або декількох амінокислотних залишків до спорідненої консенсусної послідовності білка ТЄРР, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 9, де заміна, делеція або додавання одного або декількох амінокислотних залишків забезпечує змінену активність зазначеної Т6РР і/або збільшені рівні ТбР при трансгенній експресії в рослині ТЄРР. Не обмежуючись теорією, вважають, що створення варіантів білка ТЄРР, що мають знижену каталітичну активність (тобто зменшений гідроліз Т6Р), створює сигнал в межах рослини, який забезпечує збільшену врожайність і/або підвищену стійкість до стресу (наприклад, посухи, тепла, холоду). Теоретично можливо, що Т6РР, яка має знижену активність, взаємодіє з ТР з утворенням білок-білкового комплексу.
ІЇО155| Теоретично, ТбРР, модифікована таким чином, щоб вона мала знижену ферментативну активність, може служити в якості метаболічного сигналу рослині направляти цукри на утворення насіння та/або цукрів. Більш того, ці модифіковані ТЄРР можуть також служити в якості метаболічних сигналів для ініціації процесів, які забезпечують у рослині підвищену стійкість до абіотичних і/або біотичних стресів. Знову-таки, не обмежуючись теорією, вважається, що рослини, які експресують модифіковані ТЄРР, що мають знижену активність, будуть мати модифікований рівень трегалози в порівнянні з контрольною рослиною або в бо порівнянні з трансгенною рослиною, що надекспресує активну форму Т6РР.
ІО156)| Передбачається, що будь-яка ТЄРР або фермент, що має Т6РР активність, можна розробити таким чином, щоб вони мали знижену активність і, таким чином, їх можна було застосовувати для створення трансгенних рослин або організмів (наприклад, водоростей), що мають збільшену врожайність. В одному варіанті здійснення даного винаходу білки, що містять консенсусну послідовність, таку як представлена в 5ЕБО ІЮ МО: 9, можна застосовувати в способах, описаних у даному документі. Як застосовується в даному документі, вираз "знижена активність" стосується будь-якого зменшення активності Т6РР. Наприклад, фермент, модифікований таким чином, щоб мати 1 95, 5 95, 10 95, 20 95, З0 Зо, 40 95, 50 о, 60 о, 65 9, 7096, 75 90, 80 90, 85 95, 90 95, 95 9, 96 95, 97 Уо, 98 95, 99 95 або 100 95 зменшення активності
Т6РР у порівнянні з контрольним або нативним геном ТбРР, може знайти застосування в одержанні трансгенних рослин зі збільшеною врожайністю. В одному варіанті здійснення даного винаходу поліпептид Т6РР містить амінокислотну послідовність, що має 50 95, 60 95, 70 Фо, 80 Фо, 90 У», 95 95 або 99 95 ідентичність послідовності з консенсусною послідовністю, відображеною в
ЗБЕО ІЮО МО: 9. У додатковому варіанті здійснення ТЄРР містить консенсусну послідовність, відображену в ЗЕО ІЮ МО: 9, у якій зроблена щонайменше одна модифікація (в тому числі амінокислотна заміна, амінокислотна делеція, амінокислотне додавання), і зазначена модифікація знижує активність зазначеної ТЄРР і/або збільшує ймовірність для зазначеної ТбРР утворювати білок-білююовий комплекс з ТР5. В іншому варіанті здійснення рослини, які експресують варіант ТЄРР, що має знижену активність, і/або ТЄРР, що характеризується збільшеною ймовірністю утворення білок-білкового комплексу з ТР5, будуть мати модифіковані рівні ТЄР у порівнянні з контролем, який не екпресує варіант ТбРР, що не має зниженої активності, де модифікований рівень ТбР забезпечує в рослини збільшену врожайність (наприклад, урожайність насіння, біомасу, міць), клітинний ріст, вміст цукру, вміст крохмалю й підвищену стійкість до стресу (посухи, тепла, холоду, засоленості, затоплення, абіотичного та/або біотичного стресу). В іншому варіанті здійснення даного винаходу експресія варіанта
Т6РР, що має знижену активність в рослині, спрямована на репродуктивну тканину рослини. В іншому варіанті здійснення даного винаходу патерни генної експресії, ймовірно, є важливими для збільшення тривалості посухостійкості у рослини. Наприклад, можна сконструювати касети експресії для експресії модифікованої ТЄРР під час цвітіння рослини, тим самим забезпечуючи
Зо посухостійкість на цій стадії розвитку рослини. Аналогічно, можна також сконструювати касети експресії, які конститутивно експресують модифіковану ТбРР у рослині, тим самим забезпечуючи посухостійкість протягом усього життєвого циклу рослини. Передбачається, що
Т6РР можуть бути змодельовані, щоб вони мали знижену активність, за допомогою модифікацій поза межами консервативних амінокислотних залишків консенсусної послідовності, представленої в 5ХЕО ІЮ МО: 9, при цьому модифікація зменшує зв'язування Т6РР з ТбР і/або зазначені модифікації збільшують імовірність того, що ТбРР буде утворювати білок-білкову взаємодію з ТР5.
І0157| В одному варіанті здійснення можна знижувати активність ТЄРР шляхом опромінення
ДНК ії, таким чином, одержувати варіанти, що мають знижену активність при експресії в рослині.
Аналогічно передбачається, що для одержання варіантів ТЄРР, які мають знижену активність, можна застосовувати загальноприйняті методики, такі як перестановка генів. Передбачається, що можна створювати хімічні ортогональні структури, які можуть певною мірою імітувати структуру неактивного білка Т6РР і в одному варіанті здійснення утворювати комплекс із ТР5 рослини, тим самим забезпечуючи збільшену врожайність рослини. В іншому варіанті здійснення можна створити хімічну ортогональну структуру, яка зможе імітувати структуру комплексу ТЄРР/ТР5, що у подальному можна застосовувати щодо рослин (наприклад, застосуванням хімічного продукту) для забезпечення збільшеної врожайності й стресостійкості (тобто посухостійкості). Передбачається, що хімічні ортогональні структури можна застосовувати щодо рослини для регуляції транспорту цукрів на даній репродуктивній стадії або стадії розвитку рослини.
ІО158| Передбачається, що гени ТбРР з будь-якого класу або сімейства можна застосовувати в будь-якому зі способів і/або аспектів даного винаходу, розкритих у даному документі. Також передбачається, що гени Т6РР з аналогічною гомологією послідовностей (наприклад, що мають більшу або рівну 50 95 75 95, 80 95 або 85 95 ідентичності послідовностей з ЗЕО ІЮ МО: 1) і/або молекулярною структурою, виділені або синтезовані, можна застосовувати у варіантах здійснення, описаних у даному документі. Було показано, що Т6бРР широко розповсюджена серед членів царства рослин і в багатьох випадках, як було показано, має консервативну функцію серед численних родів і видів рослин. Отже передбачається, що синтетична нуклеїнова кислота, що кодує білок Т6РР, який забезпечує знижену активність, і/або бо зменшене зв'язування з Т6Р, і/або збільшене зв'язування з ТР5, може застосовуватися в способах, розкритих у даному документі, для забезпечення у рослин прийнятних характеристик (наприклад, збільшеної врожайності, збільшеної біомаси, збільшеної міці рослин), описаних в даному документі. 0159) Способи, розкриті в даному документі, додатково описують трансформацію рослин за допомогою полінуклеотидів, таких як розкриті в даному документі. Трансгенні рослини, що містять полінуклеотиди, розкриті в даному документі, можуть проявляти збільшений клітинний ріст, збільшену міць рослин і/або сходів, збільшену врожайність, збільшену вагу насіння і збільшену біомасу. Передбачається, що рослини, отримані за допомогою способів за даним документом, мають підвищену стійкість до абіотичного стресу. Передбачається, що трансгенні рослини за даним винаходом будуть забезпечувати збільшений ріст кореня, який може мати багато позитивних наслідків щодо використання води й коефіцієнта використання поживних речовин рослиною, а також зменшення частоти виникнення ерозії грунту на промислових сільськогосподарських угіддях. Також передбачається, що рослини, які містять полінуклеотиди, описані в даному документі, внаслідок збільшеного росту можуть також проявляти більш високу стійкість до поїдання комахами. У деяких випадках рослини, описані в даному винаході, будуть мати підвищену здатність до утворення травостою та/або знижений ризик вилягання культури, що тим самим забезпечує трансгенні рослини, які здатні до перенесення погодних умов, таких як сильні вітри або гради. Трансгенні рослини, описані в даному документі, можуть давати великий урожай як відносно врожайності біомаси, так і врожайності зерна рослини. Один аспект даного винаходу передбачає різні модифікації, які можна виконати з даною послідовністю гена
Т6РР, що можна застосовувати в трансгенних рослинах для забезпечення збільшеної врожайності. Трансгенні рослини за даним документом можуть забезпечувати збільшення врожайності як за оптимальних, так і/або за неоптимальних умов зростання.
ІО160) Будь-яке посилання в даному документі нижче на "білок, застосовний у способах за даним винаходом" використовується для позначення поліпептиду трегалозного шляху, як визначається в даному документі, включаючи без обмеження поліпептид Т6РР. Будь-яке посилання в даному документі нижче на "нуклеїнову кислоту, застосовну в способах за даним винаходом" використовується для позначення нуклеїнової кислоти, здатної кодувати поліпептид трегалозного шляху, такий як поліпептид Т6РР.
Зо І0161| Переважний спосіб регуляції експресії нуклеїнової кислоти, що кодує білок ТЄРР, застосовний у способах за даним винаходом, полягає у введенні й експресії в рослині нуклеїнової кислоти, що кодує білок, застосовний у способах за даним винаходом, як визначається нижче.
І0162| Нуклеїнова кислота, що підлягає введенню в рослину (а отже, застосовна в проведенні способів за даним винаходом), являє собою будь-яку нуклеїнову кислоту, що кодує фермент трегалозного шляху. "Поліпептид Т6РР", як визначається в даному документі, стосується будь-якого поліпептиду із трегалоза-6-фосфатфосфатазною активністю, що містить щонайменше один трегалоза-фосфатазний домен. Трегалоза-фосфатазні домени звичайно становлять від 200 до 250 амінокислот у довжину та, як правило, містять мотив консенсусної послідовності фосфатази, який виявляється у всіх ферментах Т6РР, описаних до теперішнього часу (ТВаМйег еї аїЇ. 1998). Амінокислотна послідовність трегалоза-фосфатазного домену представлена в 5ЕБО ІЮО МО: 10. Фахівець у даній галузі легсо зможе виявити наявність трегалоза-фосфатазного домену із застосуванням інструментів і методик, відомих у даній галузі. Цей мотив консенсусної послідовності фосфатази зазвичай містить два фосфатазних бокси, що називаються А і В-фосфатазним боксом. 5ЕО ІЮ МО: 11 представляє консенсусну послідовність для фосфатазного боксу А, а ЗЕО ІЮ МО: 12 представляє консенсусну послідовність для фосфатазного боксу В. 0163) Переважно, нуклеїнова кислота, яка підлягає введенню в рослину, кодує білок ТбРР, що має щонайменше 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 90, 97 У», 98 о, 99 95 або 100 95 ідентичність
БО послідовності з послідовністю, вибраною з 5ЕО ІЮ МО 1, 3, 5 і 7. Найбільш переважно, нуклеїнова кислота класу ТЄРР є такою, як представлена будь-якою з 5ЕО ІЮ МО 1, 3, 5 і 7. 0164) Приклади білків, застосовних у способах за даним винаходом, і нуклеїнових кислот, що їх кодують, представлені в даному документі в таблиці прикладу 5.
ІЇО165| Також застосовними в способах за даним винаходом є гомологи будь-якої з амінокислотних послідовностей, представлених у таблиці прикладу 5. "Гомологи" білка охоплюють пептиди, олігопептиди, поліпептиди, білюи й ферменти, що мають амінокислотні заміни, делеції та/або додавання в порівнянні з розглянутим немодифікованим білком та що мають біологічну й функціональну активність, аналогічну до немодифікованого білка, з якого вони отримані. 60 (0166) Делецією називають видалення з білка однієї або декількох амінокислот.
І0167| Вставкою називають один або декілька амінокислотних залишків, що вводяться в заданий сайт білка. Вставки можуть містити М-кінцеве та/або С-кінцеве злиття, а також вставки однієї або декількох амінокислот усередину послідовності.
ІО168) Як правило, вставки всередині амінокислотної послідовності будуть меншими, ніж М- або С-кінцеве злиття, приблизно з 1-10 залишків. Приклади М-або С-кінцевих злитих білків або пептидів включають домен зв'язування або домен активації активатора транскрипції, застосовуваного в дріжджовій двогібридній системі, білюи оболонки фага, мітку (гістидин)-6, мітку глутатіон-5-трансферази, білок А, білок, що зв'язує мальтозу, дигідрофолатредуктазу, епітоп Тад"100, епітоп с-тус, епітоп БІГ АС), Іас7, СМР (пептид, що зв'язує кальмодулін), епітоп
НА, епітоп білка С і епітоп М5М.
І0169| Заміна стосується заміщення амінокислот білка іншими амінокислотами, що мають аналогічні властивості (такі як аналогічна гідрофобність, гідрофільність, антигенність, схильність до утворення або руйнування а-спіральних структур або р-складчастих структур). Амінокислотні заміни зазвичай являють собой окремі залишки, але можуть бути об'єднані в кластери залежно від функціональних обмежень, накладених на поліпептид; вставки будуть становити, як правило, приблизно 1-10 амінокислотних залишків. Амінокислотні заміни переважно являють собою консервативні амінокислотні заміни. Таблиці консервативних замін добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, Стеідптоп (1984) Ргоївіп5. М.Н. Егеетап апа Сотрапу, і таблицю нижче).
Таблиця приклади консервативних амінокислотних замін
Ше ема,
ІО170| Амінокислотні заміни, делеції та/або вставки можна легко здійснювати із застосуванням методик пептидного синтезу, добре відомих у галузях техніки, таких як твердофазний пептидний синтез і подібні, або шляхом маніпуляції з рекомбінантною ДНК.
Способи маніпуляції з послідовностями ДНК для одержання варіантів білка з заміною, вставкою або делецію, добре відомі в даній галузі техніки. Наприклад, методики створення модифікацій із заміною у заданих сайтах ДНК добре відомі фахівцям у даній галузі й включають мутагенез
М13, іп мійго мутагенез Т7-беп (О5В, Клівленд, Огайо), сайт-спрямований мутагенез
ОціскСпапде (5ігаїадепе, Сан-Дієго, Каліфорнія), опосередкований ПЦР сайт-спрямований
Зо мутагенез або інші протоколи сайт-спрямованого мутагенезу.
ІЇО171| Також застосовними в способах за даним винаходом є похідні будь-якого з поліпептидів, представлених у таблиці прикладу 5, або ортологи або паралоги будь-якого з поліпептидів, представлених у таблиці прикладу 5, або похідні будь-яких ортологів або паралогів будь-якого з поліпептидів, представлених у таблиці прикладу 5. "Похідні" включають пептиди, олігопептиди, поліпептиди, які можуть містити заміни амінокислот на амінокислотні залишки, що не зустрічаються в природі, або додавання амінокислотних залишків, що не зустрічаються в природі, порівняно з амінокислотною послідовністю форми білка, що зустрічається в природі. Похідні поліпептидів, представлених у таблиці прикладу 5, являють собою додаткові приклади, які можуть бути придатними для застосування в способах за даним винаходом. Деякі аспекти даного винаходу включають модифікацію залишків, що впливає на активність молекули Т6РР. В одному варіанті здійснення модифікація зменшує активність молекули Т6РР при аналізі іп міго. В іншому аспекті модифікація знижує афінність зв'язування
Т6РР з її субстратом. В іншому аспекті модифікації можуть бути зроблені в активному сайті білка ТЄРР таким чином, що активність білка знижується в порівнянні з білююм ТЄРР без модифікації.
І0172| "Похідні" поліпептиду включають пептиди, олігопептиди, поліпептиди, які можуть містити заміни амінокислот на амінокислотні залишки, що не зустрічаються в природі, або додавання амінокислотних залишків, що не зустрічаються в природі, у порівнянні з амінокислотною послідовністю форми білка, що зустрічається в природі, наприклад білка, що становить інтерес. "Похідні" білюка також охоплюють пептиди, олігопептиди, поліпептиди, які містять змінені амінокислотні залишки, що зустрічаються в природі (глікозильовані, ацильовані, пренільовані, фосфорильовані, міристоїльовані, сульфатовані тощо), або змінені амінокислотні залишки, що не зустрічаються в природі, у порівнянні з амінокислотною послідовністю форми поліпептиду, що зустрічається в природі. Похідне може також містити один або декілька неамінокислотних замісників або додавань у порівнянні з амінокислотною послідовністю, з якої воно походить, наприклад, репортерну молекулу або інший ліганд, який ковалентно або нековалентно зв'язаний з амінокислотною послідовністю, такий як репортерна молекула, яка зв'язується для полегшення його виявлення, й амінокислотні залишки, що не зустрічаються в природі, у порівнянні з амінокислотною послідовністю білка, що зустрічається в природі. Крім того, "похідні" також включають злиття форми білка, що зустрічається в природі, з пептидами для мічення, такими як РАС, НІЗб або тіоредоксин (для огляду пептидів для мічення див.
Тегре, Аррі. Містобіо!. Віотесппої. 60, 523-533, 2003).
І0173| Винахід ілюструється шляхом експресії в рослині різних білків ТЄРР, що мають модифікації, які зменшують активність молекули ТбРР. Цікаво, що ці модифікації та/або
Зо зменшена активність молекул Т6РР, як описано в даному документі, демонструють збільшену врожайність, а також польову продуктивність, яка полягає в тому, що рослини є здоровими та не демонструють несприятливих фенотипічних ефектів. Виконання винаходу не обмежене цими послідовностями. Способи за даним винаходом можна переважно здійснювати із застосуванням будь-якої нуклеїнової кислоти, що кодує білок, застосовний у способах за даним винаходом, як визначається у даному документі, включаючи нуклеїнові кислоти, що кодують ортологи, паралоги й гомологи, такі як (без обмеження) будь-які послідовності нуклеїнових кислот, наведені в таблиці прикладу 5.
І0174| Ортологи й паралоги включають еволюційні поняття, що застосовуються для опису відносин спорідненності генів. Паралоги являють собою гени в межах одного виду, які утворені внаслідок дуплікації предкового гена, а ортологи являють собою гени різних організмів, які утворені внаслідок видоутворення й також походять від спільного предкового гена.
ІО175| Ортологи й паралоги можна легко знайти шляхом здійснення так званого взаємозворотного пошуку бБіазі. Як правило, він включає перший ВІ А5Т, що включає здійснення
ВГА5Т запитуваної послідовності (наприклад, із застосуванням будь-якої з послідовностей, перерахованих у таблиці прикладу 5) відносно будь-якої бази даних послідовностей, такої як загальнодоступна база даних МСВІ. ВІ АЗТМ або ТВІА5ТХ (із застосуванням стандартних значень за замовчуванням) звичайно застосовують, коли починають з нуклеотидної послідовності, а ВІАБТР або ТВІА5БТМ (із застосуванням стандартних значень за замовчуванням), коли починають з білкової послідовності. Необов'язково результати ВІ А5Т можна піддавати фільтрації. Потім здійснюють зворотний ВІГАБТ послідовностей повної довжини або з відфільтрованими результатами, або з невідфільтрованими результатами (другий ВІАБТ) відносно послідовностей з організму, з якого отримана запитувана послідовність. Потім результати першого й другого ВІ А5Т порівнюють. Паралог ідентифікують у тому випадку, якщо високоранговий збіг з першого Біабі походить від одного виду, з якого отримана запитувана послідовність, при цьому зворотний ВІА5Т в ідеальному випадку потім приводить до того, що запитувана послідовність має найбільший збіг; ортолог ідентифікують у тому випадку, якщо високоранговий збіг у першому ВІ А5Т походить не від того самого виду, з якого отримана запитувана послідовність, і при зворотному ВГАЗТ переважно приводить до того, що запитувана послідовність перебуває серед найбільших збігів.
Зо
І0176| Високоранговими збігами є такі що мають низьке Е-значення. Більш низьке Е- значення говорить про більш достовірний бал (або, інакше кажучи, нижча ймовірність, що збіг був виявлений випадково). Обчислення Е-значення добре відоме в даній галузі техніки. На додаток до Е-значень порівняння також оцінюють за процентною ідентичності. Процентна ідентичність стосується числа ідентичних нуклеотидів (або амінокислот) у двох порівнюваних послідовностях нуклеїнової кислоти (або поліпептиду) на конкретній довжині. У випадку великих сімейств для полегшення візуалізації утворення кластерів спорідненими генами та ідентифікації ортологів і паралогів можна застосовувати Сіивіаїму з наступною побудовою дерева методом приєднання найближчого сусіда.
ІО177| У таблиці прикладу 5 наведені приклади ортологов і паралогов білків Т6РР, представлених 5ЕБЕО ІО МО 2, 4, 6 і 8. Додаткові ортологи й паралоги можна легко ідентифікувати за допомогою процедури ВІ А5Т, описаної вище. 0178) Білки за даним винаходом можна ідентифікувати завдяки наявності консервативного трегалоза-фасфатазного доменац(ів). Вираз "домен" стосується набору амінокислот, що є консервативними у визначенних положеннях уздовж вирівнювання послідовностей у еволюційно споріднених білків. Незважаючи на те, що амінокислоти в інших положеннях у гомологів можуть відрізнятися, амінокислоти, які є високо консервативними у визначених положеннях, вказують на амінокислоти, які є необхідними для структури, стабільності або активності білка. Будучи ідентифікованими за їхнім високим ступенем консервативності у вирівняних послідовностях сімейства гомологів білків, їх можна застосовувати в якості ідентифікаторів для визначення того, чи належить будь-який запитуваний поліпептид до раніше ідентифікованого сімейства поліпептидів (у цьому випадку білки, застосовні в способах за даним винаходом, і нуклеїнові кислоти, що їх кодують, як визначається в даному документі). У переважному варіанті здійснення даного винаходу в ці висококонсервативні домени можуть вводитися одна або декілька модифікацій для зменшення активності конкретного білка ТЄРР, щоб тим самим, при експресії в рослині, забезпечити збільшення врожайності.
І0179| Вираз "мотив", або "консенсусна послідовність", або "сігнатура" стосується короткої консервативної ділянки в послідовності еволюційно споріднених білків. Мотиви найчастіше є висококонсервативними частинами доменів, але також можуть включати лише частину домену
Зо або бути розташованими поза межами консервативного домену (якщо всі амінокислоти мотиву виявляються поза межами певного домену).
ІО180| Для ідентифікації доменів також існують спеціалізовані бази даних, наприклад,
ЗМАНТ (спи єї а. (1998) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 95, 5857-5864; І емипіс єї а. (2002) Мисівіс
Асід5 Не5 30, 242-244), ІпіегРго (Миїдег еї аї., (2003) Мисі. Асід5. Нев. 31, 315-318), Ргозіїе (Виснег апа Ваїгосі (1994), А депегаїїгейд ргойе 5упіах їог ріотоїесціаг зедоепсев5 тоїїйїв апа йвб
Тпсіоп іп оашюотаїййс зедиєпсе іпіегргеїайоп. (іп) ІЗМВ-94; Ргосеєдіпдв 2па Іпіегпайіопаї!
Соп'іегепсе оп Іпівїїїдепі Зубзівт5 ог МоїІесціаг Віоіоду. Актап В., Вгийад 0., Кар Р., І аїпгор В.,
Зеагів О., Едв., рр 53-61, АААЇргев5, Мепіо Рак; Ниїо єї аї., Мисі. Асіад5. Вез. 32:0134-0137, (2004)), або Ріат (Ваїєетап єї аї., Мисівіс Асідв ВНезеагси 30(1): 276-280 (2002)). Набір інструментів для іп віїсо аналізу білкових послідовностей доступний на сервері для протеомікі
ЕХРАБЗУ (розміщеному Швейцарським інститутом біоінформатики (Савієїдег єї аї., Ехразу: Ше ргоїеотісв 5егмег ог іп-дерій ргоїєїп КпоуЛедде апа апаїуві5, Мисієїс Асід5 Нев5. 31:3784- 3788(2003)).
І0181| Домени можна також ідентифікувати за допомогою звичайних методик, таких як вирівнювання послідовностей. У даній галузі техніки добре відомі способи вирівнювання послідовностей для порівняння, такі способи включають САР, ВЕ5ТРЇІТ, ВІГА5Т, ЕГА5ТА і
ТЕА5БТА. В САР застосовується алгоритм МеєаІетап і Муцпзсп ((1970) У Мої! Віої! 48: 443-453) для виявлення глобального (тобто перекриття повних послідовностей) вирівнювання двох послідовностей, який максимізує число збігів і мінімізує число гепів. Алгоритм ВІ АЗТ (АйбспиЇ еї а!. (1990) У Мо! Віої! 215: 403-10) розраховує процентну ідентичність послідовності та здійснює статистичний аналіз подібності між двома послідовностями. Програмне забезпечення для здійснення аналізу ВІ А5Т є загальнодоступним завдяки Національному центру біотехнологічної інформації (МСВІ). Гомологи можна легко ідентифікувати за допомогою, наприклад, алгоритму множинного вирівнювання послідовностей СіивіаіМу (версія 1.83) з параметрами попарного вирівнювання за замовчуванням та способом оцінки у відсотках. Глобальні відсотки подібності та ідентичності можна також визначити за допомогою одного зі способів, доступних у пакеті програмного забезпечення МаїіСАТ (Сатрапегйа еї аІ.,, ВМС Віоіптогтаїйісе. шу 2003 10: 4-29.
МаїсСАТ: Ап арріїсайоп іНаї депегаїез вітіапу/депійу таїйгісе5 ивіпа ргоїєїп ог ОМА зедиєпсев).
Для оптимізації вирівнювання між консервативними мотивами можна здійснювати незначне бо редагування вручну, яке буде очевидним для фахівця в даній галузі. Крім того, для ідентифікації гомологів замість застосування послідовностей повної довжини також можна застосовувати визначені домени (такі як трегалоза-фосфатазний домен або один з мотивів, визначених вище). 01821 Крім того, білки ТЄРР (щонайменше в їх нативній формі) звичайно мають трегалоза-6- фосфатфосфатазну активність. Поліпептиди з трегалоза-6-фосфатфосфатазною активністю згідно з класифікацією Комісії з ферментів Комітету з номенклатури Міжнародного союзу з біохімії й молекулярної біології (МС-ІЮВМВ) належать до класу ферментів ЕС:3.1.3.12.
Ферменти класу ЕС:3.1.3.12 каталізують реакцію: трегалоза-6-фосфат
ЗН2О-трегалозанфосфат. Передбачається, що будь-яку ТбРР або білок, який має ТбРР активність, можна модифікувати для зменшення активності за допомогою способів, таких як точкова мутація(ї), опромінення та ін., з метою забезпечення позитивних ефектів, описаних у даному документі, при трансгенній експресії в рослині.
І0183| Активність трегалоза-6-фосфатфосфатазного білка можна вимірювати шляхом визначення рівнів субстрату, що підлягав обробці, та рівнів продукту, накопиченого при іп міго реакції а саме, шляхом визначення рівня використання трегалоза-б6-фосфату та/або накопичення трегалози в результаті реакції. Ферментні способи вимірювання трегалози можуть базуватися на гідролізі трегалози до глюкози, такі як описані Мап біЇ|сК еї аІ. Віоснет .). Айдиві 2002 15; З66(РІ 1):63-71, і 7епівїа єї а. Ріапі Рнузіої. Аргії 1999:119(4):1473-82. 01841 Рівні трегалоза-6-фосфату також можна вимірювати за допомогою способів НРІ С (високоефективна рідинна хроматографія), описаних Амопсе еї аї. Ріапі Рпузіої. Мометбег 2004; 136(3):3649-59; 5спІнертапп еї а. 2003. Також були описані альтернативні способи, основані на визначенні вивільнення неорганічного фосфату з трегалоза-б6-фосфату, в Кішнеє еї аї. / Віої!
Сет. (2003) 278(4):2093-100. Альтернативний спосіб визначення рівнів трегалоза-б-фосфату за допомогою рідинної хроматографії, поєднанної з М5-ОЗ (потрійна квадрупольна М5), був описаний І ипп сеї а). Віоспет .). (2006) 397(1):139-48. 0185) Приклади нуклеїнових кислот, придатних для застосування у здійсненні способів за даним винаходом, включають послідовності нуклеїнових кислот, наведені у таблиці прикладу 5, але не обмежені цими послідовностями. У здійсненні на практиці способів за даним винаходом також можуть бути застосовні варіанти нуклеїнових кислот. Приклади таких варіантів нуклеїнових кислот включають частини нуклеїнових кислот, що кодують білок, застосовний у способах за даним винаходом, нуклеїнові кислоти, які гібридизуються з нуклеїновими кислотами, що кодують білок, застосовний у способах за даним винаходом, сплайс-варіанти нуклеїнових кислот, що кодують білок, застосовний у способах за даним винаходом, алельні варіанти нуклеїнових кислот, що кодують білок, застосовний у способах за даним винаходом, і варіанти нуклеїнових кислот, що кодують білок, застосовний у способах за даним винаходом, які отримані перестановкою генів. Вирази частина, послідовність, що гібридизується, сплайс- варіант, алельний варіант і перестановка генів не будуть описуватися.
ІО186) Нуклеїнові кислоти, що кодують білки, застосовні в способах за даним винаходом, не повинні бути нуклеїновими кислотами повної довжини, оскільки виконання способів за даним винаходом не розраховане на застосування послідовностей нуклеїнових кислот повної довжини. Ділянки, застосовні в способах за даним винаходом, які кодують поліпептид, підпадають під визначення нуклеїнової кислоти, що кодує білок, застосовний у способах за даним винаходом, як визначено в даному документі. Переважно ділянка являє собою ділянку будь-якої з нуклеїнових кислот, наведених у таблиці прикладу 5. Ділянка звичайно становить щонайменше 625 послідовних нуклеотидів у довжину, переважно щонайменше 825 послідовних нуклеотидів у довжину, або щонайменше 1025 послідовних нуклеотидів у довжину, або щонайменше 1125 послідовних нуклеотидів у довжину, причому послідовні нуклеотиди, що належать будь-якій з послідовностей нуклеїнової кислоти, наведених у таблиці прикладу 5, у комбінації із запропонованою мутацією(ями), що розкрита в даному документі, будуть зменшувати активність спорідненого білка ТЄРР у порівнянні з такою самою Т6РР, що не має однієї або декількох модифікацій. В одному аспекті даного винаходу ділянка являє собою ділянку нуклеїнової кислоти 5ЕБО ІЮО МО: 1. Переважно, ділянка кодує амінокислотну послідовність, яка при застосуванні в побудові філогенетичного дерева ТЄРР/ТР5, такого як зображене на Фіг. 2, має тенденцію утворювати кластер із групою білків ТЄРР, що містять амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 2, а не з будь-якою іншою групою.
І0187| Ділянку нуклеїнової кислоти, що кодує білок ТЄРР, як визначається у даному документі, можна одержувати, наприклад, шляхом здійснення однієї або декількох делецій у нуклеїновій кислоті. Ділянки можна застосовувати у виділеній формі, або ж вони можуть бути злиті з іншими кодуючими (або некодуючими) послідовностями, наприклад, для отримання білка, який поєднує в собі декілька активностей. При злитті з іншими кодуючими бо послідовностями поліпептид, що утворюється в результаті трансляції, може бути більшим за поліпептид, прогнозований для частини білка ТЄРР. Також передбачається, що молекули Т6РР, які не мають Т6РР активності, при трансгенній експресії в рослині можуть забезпечувати збільшення врожайності.
ІЇО188| Згідно з даним винаходом передбачається спосіб поліпшення пов'язаних із урожайністю властивостей рослин, зокрема збільшення врожайності насіння, що включає введення й експресію в рослині частини будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти, наведених у таблиці прикладу 5, або частини нуклеїнової кислоти, що кодує ортолог, паралог або гомолог будь-якої з амінокислотних послідовностей, наведених у таблиці прикладу 5, де білки були модифіковані таким чином, щоб знизити ТЄРР активність білка.
І0189| Інший варіант нуклеїнової кислоти, застосовний у способах за даним винаходом, являє собою нуклеїнову кислоту, здатну до гібридизації за умов зменшеної жорсткості, переважно за жорстких умов, з нуклеїнової кислотою, що кодує білок ТЄРР, як визначається у даному документі, або із частиною, як визначається в даному документі. У переважному аспекті білок Т6РР будуть модифікувати, щоб він мав зменшену активність в порівнянні з немодифікованою версією такого самого білка ТЄРР, тим самим забезпечуючи у трансгенної рослини будь-що з наступного: збільшену врожайність, збільшену біомасу, підвищену стійкість до абіотичного й біотичного стресу, підвищену міць рослини, підвищений вміст цукру, підвищений вміст олії, збільшену вагу насіння, збільшений ріст кореня, підвищену ефективність використання води, підвищену посухостійкість, підвищену витривалість до полягання, підвищену ефективність використання поживних речовин (наприклад, азоту) і більш швидкий розвиток рослини. 0190) Послідовності, що гібридизуються, які застосовні в способах за даним винаходом, кодують поліпептид, який має трегалоза-фосфатазний домен та має практично таку саму біологічну активність, що й білки ТбРР, представлені будь-якою з амінокислотних послідовностей, наведених у таблиці прикладу 5. Послідовність, що гібридизується, зазвичай являє собою щонайменше 625 послідовних нуклеотидів у довжину, переважно щонайменше 825 послідовних нуклеотидів у довжину, більш переважно щонайменше 1025 послідовних нуклеотидів у довжину та найбільш переважно щонайменше 1125 послідовних нуклеотидів у довжину, причому послідовні нуклеотиди належать до будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти, наведених у таблиці прикладу 5. Переважно, послідовність, яка гібридизується, є такою, що здатна до гібридизації з будь-якою з нуклеїнових кислот, наведених у таблиці прикладу 5, або із частиною будь-якої з цих послідовностей, причому частина є такою, як визначається вище. Найбільш переважно, послідовність, що гібридизується, здатна до гібридизації з нуклеїнової кислотою, представленою ЗЕО ІЮО МО: 1, або з її частиною. В іншому переважному аспекті послідовність містить щонайменше одну модифікацію, яка знижує активність спорідненого білка ТбРР. 0191) Переважно, послідовність, що гібридизується, кодує амінокислотну послідовність, яка при застосуванні в побудові філогенетичного дерева ТЄРР/ТРБ, такого як зображене на Фіг. 2А, має тенденцію утворювати кластер із групою білків ТЄРР, що містять амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІЮ МО: 2, а не з будь-якою іншою групою.
І0192)| Найбільш переважно, виділена полінуклеотидна молекула здатна до гібридизації за жорстких умов з послідовністю, представленою однією з 5ЕО ІЮО МО 1, 3, 5 і 7.
ІЇО193| Згідно з даним винаходом передбачається спосіб поліпшення пов'язаних із урожайністю властивостей рослин, зокрема збільшення врожайності насіння, що включає введення й експресію в рослині нуклеїнової кислоти, здатної до гібридизації з будь-якою з нуклеїнових кислот, наведених у таблиці прикладу 5, або що включає введення й експресію в рослині нуклеїнової кислоти, здатної до гібридизації з нуклеїнової кислотою, що кодує ортолог, паралог або гомолог будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти, наведених у таблиці прикладу 5, де послідовність була модифікована таким чином, щоб знизити ТЄРР активність
БО закодованого білка.
І0194| Інший варіант нуклеїнової кислоти, застосовний у способах за даним винаходом, являє собою сплайс-варіант, що кодує білок Т6РР, як визначається у даному документі вище.
Вираз "сплайс-варіанту, як використовується в даному документі, охоплює варіанти послідовності нуклеїнової кислоти, у якій вибрані інтрони та/або екзони були відсічені, замінені, заміщені або додані, або в якій інтрони були вкорочені або подовжені. Такі варіанти будуть варіантами, за яких біологічна активність білка практично зберігається або знижується в багатьох аспектах даного винаходу; цього можна досягати шляхом селективного збереження або делеції функціональних сегментів білка. Такі сплайс-варіанти можуть зустрічатися в природі або можуть бути отримані людиною. Способи прогнозування й виділення таких сплайс-варіантів добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, Еоіїєзас апа Зспіех (2005) ВМС
Віоіптоптаїйсвь 6:25).
ІО195| Згідно з даним винаходом передбачається спосіб поліпшення пов'язаних із урожайністю властивостей рослин, зокрема збільшення врожайності насіння, що включає введення й експресію в рослині сплайс-варіанта будь-якої з послідовностей нуклеїнової кислоти, наведених у таблиці прикладу 5, або сплайс-варіанта нуклеїнової кислоти, що кодує ортолог, паралог або гомолог будь-якої з амінокислотних послідовностей, наведених у таблиці прикладу 5, причому ці молекули додатково модифікують, щоб вони мали знижену активність.
І0196| Переважними сплайс-варіаантами є сплайс-варіанти нуклеїнової кислоти, представленої ЗЕО ІЮ МО: 1, або сплайс-варіант нуклеїнової кислоти, що кодує ортолог або паралог ЗЕО ІЮО МО: 2. Переважно, амінокислотна послідовність, закодована сплайс-варіантом, містить будь-який один або декілька мотивів або доменів, як визначається у даному документі.
Переважно, амінокислотна послідовність, закодована сплайс-варіантом, при застосуванні в побудові філогенетичного дерева ТЄРР/ТР5, такого як зображене на Фіг. 2А, має тенденцію утворювати кластер із групою білків класу ТЄРР, що містять амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 2, а не з будь-якою іншою групою.
ІО197| Інший варіант нуклеїнової кислоти, застосовний у виконанні способів за даним винаходом, являє собою алельний варіант нуклеїнової кислоти, що кодує білок ТбРР, як визначається у даному документі вище. Алелі або алельні варіанти є альтернативними формами даного гена, розташованими в одному хромосомному положенні. Алельні варіанти існують у природі, і використання цих природних алелей охоплюється способами за даним винаходом. Алельні варіанти охоплюють поліморфізми окремих нуклеотидів (ЗМР), а також поліморфізми невеликої вставки/делеції (ІМОЕМ). Розмір ІМОЕЇГ. звичайно становить менше 100 п.о. 5МР їі ІМОЕГЇ. утворюють найбільший набір варіантів послідовностей у поліморфних лініях більшості організмів, що зустрічаються в природі. Алельні варіанти, застосовні в способах за даним винаходом, мають практично таку саму біологічну активність, що й білок ТЄРР з ЗЕО ІЮ
МО: 2, і можуть бути мутовані в положеннях у межах білка, які відповідають будь-чому зі зв'язування із субстратом, ферментативної активності, вторинної або третинної структури.
ІЇО198| Згідно з даним винаходом передбачається спосіб поліпшення пов'язаних із
Зо урожайністю властивостей рослин, зокрема збільшення врожайності насіння, що включає введення й експресію в рослині алельного варіанта будь-якої з нуклеїнових кислот, наведених у таблиці прикладу 5, або що включає введення й експресію в рослині алельного варіанта нуклеїнової кислоти, що кодує ортолог, паралог або гомолог будь-якої з амінокислотних послідовностей, наведених у таблиці прикладу 5.
І0199| Переважно, алельний варіант являє собою алельний варіант ЗЕО ІО МО: 1, 3, 4, 5 або алельний варіант нуклеїнової кислоти, що кодує ортолог або паралог 5ЕО ІЮ МО: 2.
Переважно, амінокислотна послідовність, закодована алельним варіантом, містить будь-який один або декілька мотивів або доменів, як визначається у даному документі. Переважно, амінокислотна послідовність, закодована алельним варіантом, при застосуванні в побудові філогенетичного дерева ТРБЗ/Т6РР, такого як зображене на Фіг. 2, має тенденцію утворювати кластер із групою білків класу ТЄРР, що містять амінокислотну послідовність, представлену
ЗЕО ІЮ МО: 2, а не з будь-якою іншою групою.
І0200| Додатковий варіант нуклеїнової кислоти, застосовний у способах за даним винаходом, являє собою варіант нуклеїнової кислоти, отриманий перестановкою генів.
Перестановку генів або спрямовану еволюцію можна також застосовувати для утворення варіантів нуклеїнових кислот, що кодують білки Т6РР зі зниженою активністю, як визначається вище. Вона складається з ітерацій з перестановкою ДНК із наступним відповідним скринінгом і/або відбором з утворенням варіантів нуклеїнових кислот або їх частин, що кодують білки ТЄРР, як визначається вище, що мають модифіковану (знижену) біологічну активність (СавйЦе еї аї., (2004) Зсієпсе 304(5674): 1151-4; патенти США МоМо 5811238 і 6395547).
ЇО2О1| Згідно з даним винаходом передбачається спосіб поліпшення пов'язаних із урожайністю властивостей рослин, що включає введення й експресію в рослині варіанта будь- якої з послідовностей нуклеїнової кислоти, наведених у таблиці прикладу 5, або що включає введення й експресію в рослині варіанта нуклеїнової кислоти, що кодує ортолог, паралог або гомолог будь-якої з амінокислотних послідовностей, наведених у таблиці прикладу 5, причому варіантну нуклеїнову кислоту одержують перестановкою генів. У переважному варіанті здійснення скринінг буде здійснюватися щодо ТбРР, що мають більш низький ступінь зв'язування з субстратом і/або активність.
І0202| Переважно, варіантна нуклеїнова кислота, отримана перестановкою генів, кодує 60 амінокислотну послідовність, що містить будь-який один або декілька мотивів або доменів, як визначається у даному документі. Переважно, амінокислотна послідовність, закодована варіантною нуклеїновою кислотою, отриманою за допомогою перестановки генів, при застосуванні в побудові філогенетичного дерева ТРБ/Т6РР, такого як зображене на Фіг. 2А, має тенденцію утворювати кластер із групою білків ТЄРР, що містять амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 2, а не з будь-якою іншою групою. 0203) Крім того, варіанти нуклеїнової кислоти можна також одержати за допомогою сайт- спрямованого мутагенезу. Для досягнення сайт-спрямованого мутагенезу доступні декілька способів, при цьому найбільш загальноприйнятими є способи, основані на РСК (Сшгтепі
Ргоїосої5 іп МоїІесшаг Віоіоду. Улеу Ед5.). Один аспект даного винаходу полягає у застосуванні сайт-спрямованого мутагенезу таким чином, щоб знизити здатність білка ТЄРР зв'язуватися з його субстратом.
І0204| Нуклеїнові кислоти, що кодують білки Т6РР, можна отримувати з будь-якого природного або штучного джерела. Нуклеїнова кислота може бути модифікована у порівнянні з її нативною формою в композиції та/"'або геномному середовищі за допомогою навмисної обробки людиною. Переважно нуклеїнову кислоту, що кодує ТЄРР, отримують з рослини, більш переважно з однодольної рослини, ще більш переважно з роду Огула; найбільш переважно нуклеїнову кислоту отримують з рису.
І0205| Даний винахід також охоплює рослини або їхні частини (включаючи насіння), які можна одержати за допомогою способів згідно з даним винаходом. Рослини або їхні частини містять трансген нуклеїнової кислоти, що кодує білок ТЄРР, який був навмисно або ненавмисно модифікований таким чином, щоб він мав знижену активність. (0206) Винахід також передбачає невідомі дотепер послідовності нуклеїнової кислоти Т6РР і білкові послідовності ТЄРР, які можна модифікувати, як описано в даному документі, для способів забезпечення в рослин збільшеної врожайності. Ці послідовності також можуть бути застосовними при виконанні способів за даним винаходом.
І0207| Згідно з наступним варіантом здійснення даного винаходу у даному документі, таким чином, передбачається виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить: (ї) нуклеїнову кислоту, представлену ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮ МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 7; (ії) комплементарну послідовність до будь-якої з БЕО ІО МО, наведених в (Її);
Зо (ії) нуклеїнову кислоту, яка кодує білок ТбРР, що має, у порядку зростання переваги, щонайменше 8095, 8595, 9095, 9595, 9695, 97965, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності з будь-якою з амінокислотних послідовностей, наведених в ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ
МО: 4, ЗЕО ІЮ МО: 6 або ЗЕО ІЮ МО: 8; (ім) нуклеїнову кислоту, здатну до гібридизації за жорстких умов з будь-якою з нуклеїнових кислот, наведених в (Її), (ії) або (ії) вище. 0208) Згідно з наступним варіантом здійснення даного винаходу також передбачається виділений поліпептид, що містить: () амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 4, ЗЕО
ІО МО: 6 або 5ЕО ІО МО: 8; (ії) амінокислотну послідовність, що має, у порядку зростання переваги, щонайменше 80 95, 85 95, 90 90, 95 9о, 96 90, 97 У, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з будь-якою з амінокислотних послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЗЕО ІЮ МО: 6 або
ЗЕО ІЮ МО: 8; (ії) похідні будь-якої з амінокислотних послідовностей, наведених в (ї) або (ії) вище.
І0209| Даний винахід також передбачає генні конструкти, касети експресії й вектори для полегшення введення та/або експресії в рослині послідовностей нуклеїнової кислоти, застосовних у способах згідно з даним винаходом. Генні конструкти можна вставляти у вектори, які можуть бути комерційно доступними, що придатні для трансформації в рослини й придатні для експресії гена, що становить інтерес, у трансформованих клітинах. Даний винахід також передбачає застосування генного конструкта, як визначається в даному документі, у способах за даним винаходом.
Даний винахід також передбачає конструкт, що містить: (ї) нуклеїнову кислоту, що кодує білок ТЄРР, як визначається вище; (і) одну або декілька контрольних послідовностей, здатних управляти експресією послідовності нуклеїнової кислоти (а); і необов'язково (ії) послідовність термінації транскрипції. (0210) Переважно нуклеїнова кислота в конструкті згідно з даним винаходом являє собою полінуклеотидну молекулу, що кодує білок Т6РР, з амінокислотною послідовністю, у порядку зростання переваги, щонайменше з 80 95, 85 95, 90 95, 95 Фо, 96 95, 97 Ус, 98 95, 99 95 або 100 95 60 ідентичністю послідовності з послідовністю, представленою будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО І
МО: 3, 5ЕО ІО МО: 5 і 5ЕО ІО МО: 7. Найбільш переважно, полінуклеотидна молекула ТбРР являє собою будь-яку з нуклеотидних послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 5і5ЕОІЮО МО: 7.
ІО211| Рослини трансформують за допомогою вектора, що містить послідовність, яка становить інтерес (тобто, нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид ТЄРР, який був навмисно або ненавмисно модифікований таким чином, щоб він мав знижену активність). Фахівцеві у даній галузі добре відомі генетичні елементи, які мають бути присутніми у векторі для успішної трансформації, відбору й розмноження клітин-хазяїв, що містять послідовність, яка становить інтерес. Послідовність, що становить інтерес, функціонально пов'язана з однією або декількома контрольними послідовностями (щонайменше із промотором). Вирази "регуляторний елемент", "контрольна послідовність" і "промотор" використовуються в даному документі взаємозамінно, та їх слід розглядати в широкому контексті для позначення регуляторних послідовностей нуклеїнової кислоти, що здатні впливати на експресію послідовностей, з якими вони ліговані.
Вираз "промотор" зазвичай стосується контрольної послідовності нуклеїнової кислоти, яка розташована вище відносно початку транскрипції гена і яка залучається в розпізнавання й зв'язування РНК-полімерази й інших білків, управляючи, тим самим, транскрипцією функціонально зв'язаної нуклеїнової кислоти. Вищевказані вирази охоплюють послідовності регуляції транскрипції, що походять з класичного еукаріотичного геномного гена (включаючи
ТАТА-бокс, який потрібний для правильної ініціації транскрипції, з послідовністю ССААТ-боксу або без неї), і додаткові регуляторні елементи (тобто, активуючі послідовності, що розташовані вище, енхансери й сайленсери), які змінюють генну експресію у відповідь на пов'язані з розвитком і/або зовнішні стимули або тканиноспецифічним способом. Також вираз включає послідовність регуляції транскрипції класичного прокаріотичного гена, у випадку чого вона може включати -35-боко-послідовність і/або -10-боксо-послідовність регуляції транскрипції. Вираз "регуляторний елемент" також охоплює синтетичну злиту молекулу або похідне, що забезпечує, активує або підсилює експресію молекули нуклеїнової кислоти в клітині, тканині або органі.
Вираз "функціонально пов'язаний", як використовується в даному документі, стосується функціонального зв'язку між промоторною послідовністю й геном, що становить інтерес, так що промоторна послідовність здатна ініціювати транскрипцію гена, що становить інтерес.
Зо І0212| Переважно, щоб управляти експресією послідовності нуклеїнової кислоти можна застосовувати будь-який тип промотора. Вираз "промотор" стосується контрольної послідовності нуклеїнової кислоти, яка розташована вище відносно початку транскрипції гена і яка залучається в розпізнавання й зв'язування РНК-полімерази й інших білків, управляючи, тим самим, транскрипцією функціонально пов'язаної нуклеїнової кислоти. "Рослинний промотор " містить регуляторні елементи, які опосередковують експресію сегмента кодуючої послідовності у рослинних клітинах. Відповідно, рослинний промотор може бути не рослинного походження, але може походити від вірусів або мікроорганізмів, наприклад від вірусів, які вражають клітини рослин. "Рослинний промотор" може також походити від рослинної клітини, наприклад від рослини, яка трансформується за допомогою послідовності нуклеїнової кислоти, що підлягає експресії. Це також поширюється на інші "рослинні" регуляторні сигнали, такі як "рослинні" термінатори. Промотори, що розташовані вище за нуклеотидні послідовності, застосовні у способах за даним винаходом, можна модифікувати за допомогою одного або декількох нуклеотидних заміщень, вставок та/або делецій без перешкоджання функціональності або активності будь-чого з промоторів, регуляторної ділянки відкритої рамки зчитування (ОКЕ), або
З'--регуляторної ділянки, такої як термінатори, або інших З'-регуляторних ділянок, які розташовані далеко від ОКЕ. Також можливо, що активність промоторів збільшується шляхом модифікації їхньої послідовності, або вони повністю заміщуються на більш активні промотори, навіть промотори від гетерологічних організмів. Щодо експресії в рослинах, то молекула нуклеїнової кислоти функціонально пов'язана з придатним промотором.
І0213| Промотор може бути конститутивним промотором, який називають промотором, що є транскрипційно активним під час більшості, але не обов'язково під час усіх, фаз росту й розвитку та за більшості умов навколишнього середовища щонайменше в одній клітині, тканині або одному органі. Альтернативно, промотор може являти собою промотор, який індукується, тобто він характеризується ініціацією транскрипцією, що індукується, або підвищеною ініціацією транскрипції у відповідь на хімічний стимул (для огляду див. бСаї 1997, Аппи. Кем. Ріапі Рпузіо|.
Ріапі Мої. Віо!., 48:89-108), стимул навколишнього середовища або фізичний стимул. Іншим прикладом промотора, який індукується, є промотор, що індукується стресом, тобто промотор, що активується, коли рослина зазнає різних стресових умов, або промотор, що індукується патогеном.
І0214| Додатково або альтернативно, промотор може бути органоспецифічним або тканиноспецифічним промотором, тобто таким, який здатний ініціювати транскрипцію переважно в конкретних органах або тканинах, таких як листки, корені, тканина насінини та ін.; або ж промотор може являти собою універсальний промотор, який є активним практично у всіх
Б тканинах або клітинах організму, або промотор може регулюватися стадіями розвитку, внаслідок чого він є активним під час конкретних стадій розвитку або у конкретних частинах рослини, які зазнають змін, пов'язаних з розвитком. Промотори, що здатні ініціювати транскрипцію лише в конкретних органах або тканинах, називають в даному документі "органоспецифічними" або "тканиноспецифічними", відповідно; аналогічним чином промотори, здатні ініціювати транскрипцію лише в конкретних клітинах, називають в даному документі "клітиноспецифічними".
ІО215| В одному аспекті даного винаходу нуклеїнова кислота Т6РР або її варіант функціонально пов'язані із промотором, який управляє експресією Т6РР у материнській репродуктивній тканині рослини, такій як тканина стрижня качана рослини, вузол качана, тканина колоска, тканина незапиленої квітки та тканина квітконіжки. Промотори, такі як промотори О5МАЮОЗ5, описані в публікації заявки на патент США 2007/0006344, включеній в даний документ за допомогою посилання, можна застосовувати в конкретних аспектах даного винаходу. (0216) Для ідентифікації функціонально еквівалентних промоторів ефективність промотора та/або патерн експресії кандидатного промотора можна аналізувати, наприклад, шляхом функціонального зв'язування промотора з репортерним геном і аналізу рівня й патерна експресії репортерного гена в різних тканинах рослини. Придатні добре відомі репортерні гени включають, наприклад, ген В-глюкуронідази або ген р-галактозидази. Активність промотора аналізують шляхом вимірювання ферментативної активності ДВ-глюкуронідази або в- галактозидази. Ефективність промотора та/або патерн експресії потім можна порівнювати з такими еталонного промотора (такого як промотор, що застосовується у способах за даним винаходом). Альтернативно, ефективність промотора можна аналізувати шляхом кількісного визначення рівнів мРНК або шляхом порівняння рівнів мРНК нуклеїнової кислоти, яку застосовують в способах за даним винаходом, з рівнями мРНК генів "домашнього господарства", наприклад 185 рРНК, за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки, таких як нозерн-блотинг із денситометричним аналізом авторадіограм, кількісна РОК у режимі реального часу або КТ-РСЕВ (Неїа єї аї., 1996 Сепоте Меїноде» 6: 986-994). Зазвичай вираз "слабкий промотор" стосується промотора, який управляє експресією кодуючої послідовності на низькому рівні, рівнях від приблизно 1/10000 транскриптів до приблизно 1/100000 транскриптів, до приблизно 1/5000000 транскриптів на клітину. Навпаки, "сильний промотор" управляє експресією кодуючої послідовності на високому рівні, або від приблизно 1/10 транскриптів до приблизно 1/100 транскриптів, до приблизно 1/1000 транскриптів на клітину.
І0217| Передбачається, що регуляторні елементи можна застосовувати для зміни тривалості, протягом якої задана властивість присутня. Наприклад, фахівець може сконструювати касети експресії для експресії модифікованої ТЄРР під час цвітіння рослини, таким чином забезпечуючи посухостійкість рослини на цій стадії розвитку. Подібним чином фахівець також може сконструювати касети експресії, які конститутивно експресують у рослині модифіковану Т6РР, таким чином, не обмежуючись теорією, надаючи рослині посухостійкість протягом усього життєвого циклу. (02181) Необов'язково, у конструкті, що вводиться в рослину, можна застосовувати одну або декілька термінаторних послідовностей. Вираз "термінатор" охоплює контрольну послідовність, що являє собою послідовність ДНК, яка міститься на кінці одиниці транскрипції після стоп- кодону, що дає сигнал для 3'-процесінгу і поліаденілювання первинного транскрипта й термінації транскрипції. Термінатор можна одержувати із природного гена, з багатьох інших рослинних генів або з Т-ДНК. Термінатор, який необхідно додати, можна одержати, наприклад, з генів нопалінсинтази або октопінсинтази, або, альтернативно, з іншого рослинного гена, або, менш переважно, з будь-якого іншого еукаріотичного гена. Додаткові регуляторні елементи можуть включати як енхансери транскрипції, так і енхансери трансляції. Фахівці в даній галузі будуть обізнані про послідовності термінатора й енхансера, які можуть бути придатні для використання при здійсненні даного винаходу. Такі послідовності будуть відомі або можуть бути легко отримані фахівцем у даній галузі.
І0219| До 5-нетрансльованої ділянки (ШТК) або в кодуючу послідовність можна також додавати інтронну послідовність для збільшення кількості зрілої мРНК, яка накопичується в цитозолі. Було показано, що введення інтрона, який піддається сплайсингу, в одиницю бо транскрипції в конструктах експресії як для рослин, так і для тварин збільшує генну експресію як на рівні мРНК, так і на рівні білка до 1000-кратної (Висптап апа Вего, Мої. Сеї| Віої. 8:4395-4405 (1988); Саїйв єї аі., Сепе5 ЮОєм. 1:1183-1200 (1987)). Таке посилення генної експресії за допомогою інтронів звичайно є найсильнішим при розміщенні їх поблизу 5'-кінця одиниці транскрипції. В даній галузі відоме застосування інтронів маїсу, інтронів 1, 2 і 6 Аанп1-5, інтрона
Вгоп2е-1. Для одержання загальних відомостей див. Пе Маїге Напароок, Спаріеєг 116, Егееїїпд апа УУаїрої, Едв»., Зргіпдег, М.М. (1994). У деяких аспектах даного винаходу фахівець може побажати збільшити у рослині експресію ТЄРР, модифікованої таким чином, щоб вона мала зменшену здатність до зв'язування із субстратом задля надання збільшеної врожайності.
І0220| Інші контрольні послідовності (окрім промоторних, енхансерних, сайленсерних, інтронних послідовностей, З'ЮТЕ і/або 5ШТЕ ділянок) можуть являти собою елементи, які стабілізують білок та/або РНК. Такі послідовності будуть відомі або можуть бути легко отримані фахівцем у даній галузі. (0221) Генетичні конструкти за даним винаходом можуть додатково включати послідовність точки початка реплікації, яка потрібна для утримання та/або реплікації в визначеному типі клітин. Одним із прикладів є ситуація, коли генетичний конструкт необхідно підтримувати в бактеріальній клітині в якості епісомального генетичного елемента (наприклад, молекули плазміди або косміди). Переважні точки початка реплікації включають без обмеження 11-огі та сОЇЕ1. (0222| Для виявлення успішного перенесення послідовностей нуклеїнової кислоти, як застосовується в способах за даним винаходом, і/або відбору трансгенних рослин, що містять ці нуклеїнові кислоти, переважним є застосування маркерних генів (або репортерних генів). Таким чином, генетичний конструкт може необов'язково містити селектовний маркерний ген. Як використовується в даному документі, вираз "селектовний маркер", "селектовний маркерний ген" або "репортерний ген" включає будь-який ген, що забезпечує фенотип клітини, у якій він експресується, що полегшує ідентифікацію та/або відбір клітин, які є трансфікованими або трансформованими за допомогою конструкта нуклеїнової кислоти за даним винаходом. Ці маркерні гени дозволяють ідентифікувати успішне перенесення молекул нуклеїнової кислоти за допомогою ряду різних принципів. Придатні маркери можна вибрати з маркерів, які забезпечують стійкість до антибіотиків або гербіцидів, які вводять нову метаболічну ознаку або
Зо які дозволяють проводити візуальний відбір. Приклади селектовних маркерних генів включають гени, що забезпечують стійкість до антибіотиків (такі як прі, який фосфорилює неоміцин і канаміцин, або Прі, який фосфорилює гігроміцин, або гени, що забезпечують стійкість, наприклад, до блеоміцину, стрептоміцину, тетрацикліну, хлорамфеніколу, ампіциліну, гентаміцину, генетицину (5418), спектиноміцину або бластицидину), до гербіцидів (наприклад, раг, який надає стійкість до Вазіаф); агоА або дох, які надають стійкість до гліфосату, або гени, що забезпечують стійкість, наприклад, до імідазолінону, фосфінотрицину або сульфонілсечовини), або гени, які забезпечують метаболічну ознаку (такі як тапА, який дозволяє рослинам використовувати манозу в якості єдиного джерела вуглецю або ксилозаізомеразу для використання ксилози, або антипоживні маркери, наприклад стійкості до 2-дезоксиглюкози). Експресія візуальних маркерних генів приводить до утворення кольору (наприклад, В-глюкуронідаза, 5ИО5 або В-галактозидаза з їх забарвленими субстратами, наприклад, Х-саї), люмінесценції (наприклад, система люциферин/люцифераза) або флуоресценції (зелений флуоресцентний білок, СЕР і його похідні). Цей перелік представляє лише невелику кількість можливих маркерів. Кваліфікований фахівець добре знайомий із такими маркерами. Залежно від організму й способу відбору переважними є різні маркери. (0223) Відомо, що при стабільній або тимчасовій інтеграції нуклеїнових кислот у рослинні клітини лише незначна кількість клітин поглинає чужорідну ДНК і, при необхідності, інтегрує її у свій геном залежно від вектора експресії, що застосовується, і техніки трансфекції, що застосовується. Для ідентифікації й відбору цих інтегрантів, ген, що кодує селектовний маркер (такий як описаний вище), звичайно вводять у клітини-хазяї разом з геном, що становить інтерес. Ці маркери можна, наприклад, застосовувати в мутантах, де ці гени є не функціональними, завдяки, наприклад, делеції шляхом звичайних способів. Крім того, молекули нуклеїнової кислоти, які кодують селектовний маркер, можна вводити в клітину-хазяїна у тому самому векторі, що містить послідовність, яка кодує поліпептиди за даним винаходом або яка застосовується в способах за даним винаходом, або ж в окремому векторі. Клітини, які були стабільно трансфіковані за допомогою введеної нуклеїнової кислоти, можна ідентифікувати, наприклад, шляхом відбору (наприклад, клітини, у які інтегрувався селектовний маркер, виживають, тоді як інші клітини гинуть). (0224) Оскільки маркерні гени, зокрема гени стійкості до антибіотиків і гербіцидів, після того 60 як нуклеїнові кислоти були успішно введені, більше не потрібні або небажані в трансгенній клітині-хазяїні, у способі згідно з даним винаходом для введення нуклеїнових кислот переважно використовуються методики, які дозволяють вилучати або вирізати ці маркерні гени. Один такий спосіб відомий як котрансформація. У способі котрансформації для трансформації використовують два вектори одночасно, при цьому один вектор несе нуклеїнову кислоту згідно з даним винаходом, а другий несе маркерний ген(и). Більша частка трансформантів одержує або, у випадку рослин, містить (до 40 95 або більше трансформантів) обидва вектори. У випадку трансформації за допомогою агробактерій трансформанти зазвичай одержують лише частину вектора, тобто послідовність яка фланкована Т-ДНК, що зазвичай представляє касету експресії. Маркерні гени у подальшому можна вилучити з трансформованої рослини шляхом проведення схрещування. В іншому способі маркерні гени, інтегровані в транспозон, застосовують для трансформації разом з необхідною нуклеїновою кислотою (він відомий як технологія Ас/05). Трансформанти можна схрещувати із джерелом транспозази, або ж трансформанти трансформують за допомогою конструкта нуклеїнової кислоти, що забезпечує експресію транспозази, тимчасово або постійно. У деяких випадках (приблиз. 10 95) відразу після того, як успішно відбулася трансформація, транспозон вискакує з генома клітини-хазяїна і втрачається. У наступному ряді випадків транспозон перескакує на інше положення. У цих випадках маркерний ген необхідно вилучати шляхом проведення схрещувань. У мікробіології розроблені методики, які роблять можливим або полегшують виявлення таких об'єктів.
Додатковий переважний спосіб оснований на так званих системах рекомбінації, при цьому його перевага полягає в тому, що можна обійтися без вилучення за допомогою схрещування.
Найбільш відома система цього типу відома як система Сте/Лох. Сте1 являє собою рекомбіназу, яка видаляє послідовності, що розташовані між послідовностями ХР. Якщо маркерний ген інтегрується між послідовностями ІохР, то за допомогою експресії рекомбінази він видаляється відразу після того, як успішно відбудеться трансформація. Додаткові системи рекомбінації являють собою системи НІМ/НІХ, РІГР/ЕКТ і КЕР/5ТВ (Ттірбріе еї аї.,У. Віої. Спет., 275, 2000: 22255-22267; МеІтигтидап еї аї., у. Сеї! ВіоІ., 149, 2000: 553-566). Можливою є сайт-специфічна інтеграція в геном рослини послідовностей нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом.
Звичайно ж, ці способи можна також застосовувати до мікроорганізмів, таких як дріжджі, гриби або бактерії.
Зо І0225| Винахід також передбачає спосіб одержання трансгенних рослин з поліпшеними ознаками, пов'язаними з урожайністю, зокрема збільшеною врожайністю насіння у порівнянні з контрольними рослинами, що включає введення й експресію в рослині будь-якої нуклеїнової кислоти, що кодує білок Т6РР, як визначається у даному документі вище. (0226) Один аспект даного винаходу передбачає касети експресії, що містять: (а) послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують білки, застосовні в способах за даним винаходом, або (Б) генетичну контрольну послідовність(і), яка функціонально пов'язана з послідовністю нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, наприклад промотор, або (са) і Б). (0227| Більш конкретно, даний винахід передбачає спосіб одержання трансгенних рослин зі збільшеною врожайністю, причому спосіб включає: () введення й експресію в рослині, частині рослини або рослинній клітині нуклеїнової кислоти Т6РР або її варіанта, де ТЄРР має зменшену активність щодо зв'язування з субстратом; і (ії) культивування рослинної клітини за умов, що прискорюють ріст і розвиток рослини. (0228) Нуклеїнову кислоту можна вводити безпосередньо в рослинну клітину або в рослину як таку (включаючи введення в тканину, орган або будь-яку іншу частину рослини). Згідно з переважною ознакою даного винаходу нуклеїнову кислоту переважно вводять в рослину за допомогою трансформації.
І0229| Перенесення чужорідних генів у геном рослини називається трансформацією. На даний час трансформація видів рослин є досить звичайною методикою. Переважно, для введення гена, що становить інтерес, у придатну клітину-попередник можна застосовувати будь-який з декількох способів трансформації. Способи, описані стосовно трансформації й регенерації рослин із рослинних тканин або рослинних клітин, можна застосовувати для тимчасової або постійної трансформації. Способи трансформації включають застосування ліпосом, електропорації, хімічних речовин, які підсилюють поглинання вільної ДНК, ін'єкцію ДНК безпосередньо в рослину, бомбардування генною гарматою, трансформацію із застосуванням вірусів або пилку й мікропроекцію. Способи можуть бути вибрані зі способу за допомогою кальцію/поліетиленгліколю для протопластів (Кгеп5, ЕЕ. А. еї аїЇ.,, (1982) Маїшге 296, 72-74; 60 Медгийи І еї аї. (1987) Ріапі Мої Віо! 8: 363-373); електропорації протопластів (ЗПЙШШНО К. 0. еї аї.
(1985) Віо/Тесппо! З, 1099-1102); мікроін'єкції в рослинний матеріал (Сто55мау А еї аї., (1986)
Мої. Сеп Сепеї 202: 179-185); бомбардування частинками, покритими ДНК або РНК (Кієїп Т М еї аі!., (1987) Маїшге 327: 70); зараження (неінтегрованими) вірусами й подібного. Трансгенні рослини, включаючи трансгенні сільськогосподарські культури, переважно одержують за допомогою опосередкованої Адгорасієгішт трансформації Переважним способом трансформації є трансформація іп ріапіа. Із цієї сторони, можна, наприклад, дозволити агробактеріям діяти на насіння рослин або інокулювати меристему рослин агробактеріями.
Особливо доцільним згідно з даним винаходом виявилося дозволити суспензії трансформованих агробактерій діяти на інтактну рослину або щонайменше на зачатки квіток.
Потім рослину вирощують, доки не буде отримане насіння обробленої рослини (Сіоцдп апа
Вепі, Ріапі 9. (1998) 16, 735-743). Способи для опосередкованої Адгорасіегічт трансформації рису включають добре відомі способи для трансформації рису, такі як описані в будь-чому з наступного: Європейська патентна заявка ЕР 1198985 А1, АІдетіа апа Ноддез (Ріапіа 199: 612- 617, 1996); СНнап еї аї. (Ріапі Мої Віої! 22 (3): 491-506, 1993), Нівї еї аї. (Ріапі У 6 (2): 271-282, 1994), розкриття яких включені в даний документ за допомогою посилання, немов вони повністю викладені. У випадку трансформації кукурудзи переважним способом є описаний або в Іхпіда єї аї. (Маї. Віоїесппо! 14(6): 745-50, 1996), або в Егате еї аї. (Ріапі Рпузіої 129(1): 13-22, 2002), розкриття яких включені в даний документ за допомогою посилання, немов вони повністю викладені. Зазначені способи також описані у якості приклада в В. Уепез єї аї., Тесппіднев ог
Сепе Тгапвієг, в Тгтапздепіс Ріапів, Мої. 1, Епдіпеегіпа апа Шігайоп, едв. 5. О. Кипд апа В. У/и,
Асадетіс Ргев55 (1993) 128-143, і в Роїгуких5 Аппи. Нем. Ріапі Рнузіої. Ріапі Моїес. Віої. 42 (1991) 205-225). Нуклеїнові кислоти або конструкт, що підлягають експресії, переважно клонують у вектор, який підходить для трансформації Адгобасієгішт Шштеїгасівеп5, наприклад рВіп19 (Вемап еї аї., Мисі. Асідб5 ВНев. 12 (1984) 8711). Агробактерії, трансформовані таким вектором, у подальшому можна застосовувати у відомому способі трансформації рослин, наприклад рослин, що застосовуються в якості моделі, такі як Агарідорзіх, або сільськогосподарських культур, таких як, наприклад рослини тютюну, наприклад, за допомогою занурення подрібнених листків або нарубаних листків у розчин агробактерій і подальшого культивування їх у придатному середовищі. Трансформація рослин за допомогою Аадгобасієгійт іштеїасівенп5 описана, наприклад, Ноїдеп апа УміШтйгег іп Мисі. Асій Кев. (1988) 16, 9877, або частково відома з Р. Р. М/піе, Месюгз ог Сепе Тгапевїег іп Ніднег Ріапів; в Тгапздепіс Ріапів, Мої. 1, Епдіпеегіпа апа Онігацйоп, єдв. 5. ОЮ. Кипу апа В. Ми, Асадетіс Ргезв, 1993, рр. 15-38.
ІО230І На додаток до трансформації соматичних клітин, які потім необхідно регенерувати в інтактні рослини, також можна трансформувати клітини рослинних меристем і, зокрема, такі клітини, які розвиваються в гамети. У цьому випадку трансформовані гамети дотримуються природного циклу розвитку рослини, приводячи до трансгенних рослин. Таким чином, наприклад, насіння Агабрідорзхі5 обробляють агробактеріями та одержують насіння від рослин, що розвиваються, при цьому визначена їх частка трансформується, а тому є трансгенною (Геідтап, К А апа Магкз5 М О (1987). Мої! Сеп Сепеї 208:274-289; Евідтапп К (1992). Іп: С Копсл,
М-Н Спа апа у 5Неї), ед5, Меїнодз іп Агарідорзів Незеагсй. Уога 5сієепійіс, Зіпдароге, рр. 274- 289|. Альтернативні способи основані на повторному видаленні суцвіть та інкубації вирізаної ділянки в центрі розетки із трансформованими агробактеріями, при цьому аналогічним чином можна отримувати трансформоване насіння в більш пізній момент часу (СНнапа (1994). Ріапі .). 5: 551-558; Каїаміс (1994). Мої Сеп Сепеї, 245: 363-370). Однак особливо ефективним способом є спосіб вакуумної інфільтрації з його модифікаціями, такими як спосіб "занурення квітки". У випадку вакуумної інфільтрації Агарідорвзіє інтактні рослини за умов зниженого тиску обробляють суспензією агробактерій (ВеспійпоїЯ, М (1993). С А Асад. 5сі. Рагів І йе 5сі., 316: 1194-1199), тоді як у випадку способу "занурення квітки" тканину квітки, що розвивається, інкубують протягом короткого періоду часу з обробленою поверхнево-активною речовиною суспензією агробактерій |Сіоцдн, 5 у ипа Вепі, А Е (1998). ТНе Ріапі у. 16, 735-743). В обох випадках збирають певну частку трансгенного насіння, і це насіння можна відрізнити від нетрансгенного насіння за допомогою вирощування за вищевказаних селективних умов. Крім того, стабільна трансформація пластид являє собою перевагу, оскільки пластиди в більшості сільськогосподарських культур успадковуються по материнській лінії, зменшуючи або усуваючи ризик потоку трансгена через пилок. Трансформацію генома хлоропластів звичайно здійснюють за допомогою процесу, який був схематично представлений в Кіа еї аїІ., 2004 (|Маїшге
Віотесппоіоду 22 (2), 225-229). Коротко кажучи, послідовності, що підлягають трансформації, клонують разом із селектовним маркерним геном між фланкуючими послідовностями, гомологічними геному хлоропласта. Ці гомологічні фланкуючі послідовності управляють сайт- бо специфічною інтеграцією у пластом. Трансформація пластид була описана для багатьох різних видів рослин, і огляд наведено в ВосК (2001) Тгапздепіс ріазіав іп Бразіс гезеагсп апа ріапі
Біоїесппоіоду. У Мої Віої. Зерієтрег 2001 21; 312 (3):425-38, або Маїїда, Р (2003) Ргодгев5
Тюулага5 сотітегсіаїї2айоп ої ріавіа Шшапвіоптайоп їесппоЇоду. Ттепа5 Віоїесппої. 21, 20-28.Щодо подальшого біотехнологічного прогресу нещодавно повідомили про трансформанти пластид без маркера, які можна одержати за допомогою тимчасового маркерного гена, що котрансформується (Кіацз єї а!., 2004, Маїшге Віоїтесппоіоду 22(2), 225-229).
І0231| Генетично модифіковані рослинні клітини можна регенерувати за допомогою всіх способів, які відомі кваліфікованому фахівцю. Придатні способи можна знайти у вищевказаних публікаціях 5. О. Кипод апа К. УМи, Роїгуки5 або Нбідеп апа УМіПШтйгег.
І0232| Зазвичай після трансформації рослинні клітини або групи клітин відбирають на наявність одного або декількох маркерів, закодованих генами, які можуть експресуватися рослинами та які були котрансформовані з геном, що становить інтерес, після чого трансформований матеріал регенерують в цілу рослину. Для відбору трансформованих рослин рослинний матеріал, отриманий при трансформації, як правило, піддають селективним умовам, щоб трансформовані рослини можна було відрізняти від нетрансформованих рослин.
Наприклад, отримане вищеописаним способом насіння можна висіяти та, після початкового періоду вегетації, піддати відповідному відбору шляхом обприскування. Додаткова можливість полягає у вирощуванні насіння, за необхідності після стерилізації, на чашках з агаровим середовищем із застосуванням відповідного засобу для відбору, щоб лише трансформоване насіння могло дорости до рослин. Альтернативно, трансформовані рослини піддають скринінгу на наявність селектовного маркера, такого як описані вище.
І0О233| Після перенесення ДНК і регенерації, ймовірно, трансформовані рослини також можна охарактеризувати, наприклад із застосуванням саузерн-аналізу, на наявність гена, що становить інтерес, число копій і/або організацію геному. Альтернативно або додатково, рівні експресії щойно введеної ДНК можна відстежувати із застосуванням нозерн- і/або вестерн- аналізу, при цьому обидві методики добре відомі фахівцям, що мають кваліфікацію у даній галузі. (0234) Отримані трансформовані рослини можна розмножувати різними способами, такими як клональне розмноження або класичні методики селекції. Наприклад, перше покоління (або
Зо Т1) трансформованої рослини може самозапилюватися, а гомозиготні трансформанти другого покоління (або 12) можна відібрати, щоб у подальшому рослини Т2 розмножувати за допомогою класичних методик селекції. 0235) Отримані трансформовані організми можуть приймати різні форми. Наприклад, вони можуть являти собою химерні організми з трансформованих клітин і нетрансформованих клітин; клональні трансформанти (наприклад, усі клітини, трансформовані так, щоб вони містили касети експресії); прищепи з трансформованих і нетрансформованих тканин (наприклад, у рослинах трансформована підщепа прищеплюється на нетрансформовану прищепу).
І0236| Даний винахід явно поширюється на будь-яку рослинну клітину або рослину, отриману за допомогою будь-якого зі способів, описаних у даному документі, і на всі частини рослин і їхні паростки. Даний винахід також поширюється для охоплення потомства первинно трансформованої або трансфікованої клітини, тканини, органа або цілої рослини, які були отримані за допомогою будь-якого з вищевказаних способів, причому єдиною вимогою є те, щоб потомство проявляло таку саму генотипічну та/або фенотипічну характеристику(ї), яка проявлялася в батьківського організму в способах згідно з даним винаходом.
І0237| Даний винахід також включає клітини-хазяїни, які містять виділену нуклеїнову кислоту, що кодує білок ТбРР, як визначається в даному документі вище. Переважними клітинами-хазяїнами згідно з даним винаходом є рослинні клітини. (0238) Рослини-хазяїни для нуклеїнових кислот або вектора, які застосовують в способах згідно з даним винаходом, касети експресії, або конструкт, або вектор являються, в принципі, переважними в усіх рослинах, які здатні синтезувати поліпептиди, застосовувані в способах за даним винаходом.
І0239| Таким чином, по відношенню до трансгенної рослини для цілей даного винаходу розуміють, згідно вищевказаного, що нуклеїнові кислоти, застосовувані в способі за даним винаходом, знаходяться не в їх природному локусі в геномі зазначеної рослини, причому стосовно нуклеїнових кислот імовірно, що вони експресуються гомологічно або гетерологічно.
Однак, як зазначається, трансгенний також означає, що хоча нуклеїнові кислоти згідно з даним винаходом або ті, що застосовуються в способі за даним винаходом, перебувають у їх природному положенні в геномі рослини, послідовність була модифікована відносно природної послідовності та/або були модифіковані регуляторні послідовності природних послідовностей. бо Мається на увазі, що трансгенний переважно означає експресію нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом в неприродному локусі в геномі, тобто відбувається гомологічна або, переважно, гетерологічна експресія нуклеїнових кислот. Переважні трансгенні рослини зазначені в даному документі. (0240) Винахід також поширюється на придатні для заготівлі частини рослини, такі як без обмеження насіння, листки, плоди, квітки, стебла, ризоми, бульби й цибулини. Даний винахід також стосується продуктів, отриманих, переважно безпосередньо отриманих, з придатних для заготівлі частин такої рослини, таких як сухі гранули або порошки, олія, жир і жирні кислоти, крохмаль або білки. (02411 Згідно з однією ознакою даного винаходу відрегульована експресія являє собою збільшену експресію. Способи збільшення експресії нуклеїнових кислот або генів, або генних продуктів, добре документально підтверджені в рівні техніки та включають, наприклад, надекспресію, що управляється відповідними промоторами, застосування енхансерів транскрипції або енхансерів трансляції. Виділені нуклеїнові кислоти, які служать промоторними або енхансерними елементами, можна вводити в відповідне положення (зазвичай вище) негетерологічної форми полінуклеотида, щоб таким чином активувати експресію. Наприклад, ендогенні промотори можна змінювати іп мімо шляхом мутації, делеції та/або заміщення (див.
Ктіес, патент США Ме5565350; 7агіпод еї аІ., РСТ/О593/03868) або ж виділені промотори можна вводити в рослинну клітину в належній орієнтації та відстані від гена за даним винаходом, щоб вони таким чином управляли експресією гена.
І0242| Якщо необхідна експресія поліпептиду, зазвичай бажаним є включення ділянки поліаденілювання на 3'-кінці полінуклеотидної кодуючої ділянки. Ділянку поліаденілювання можна одержати з природного гена, з багатьох інших рослинних генів або з Т-ДНК.
Послідовність З3'-кінця, яку необхідно додати, можна одержати, наприклад, з генів нопалінсинтази або октопінсинтази, або альтернативно з іншого рослинного гена, або менш переважно з будь-якого іншого еукаріотичного гена. (0243) Також можна додавати інтронну послідовність, як описується вище.
І0244| Інші контрольні послідовності (крім промоторних, енхансерних, сайленсерних, інтронних послідовностей, 3-ШТК і/або 5-ОТК ділянок, цільових сайтів мікро-РНК) можуть являти собою елементи, що стабілізують білок та/або РНК.
Зо (02451) Як зазначено вище, спосіб регуляції експресії нуклеїнової кислоти, яка кодує білок
Т6РР, модифікований таким чином, щоб він мав знижену активність, полягає у введенні й експресії в рослині нуклеїнової кислоти, яка кодує білок ТЄРР; однак ефектів від виконання способу, тобто поліпшення пов'язаних із урожайністю властивостей, можна також досягти за допомогою інших добре відомих методик. Опис деяких із цих методик подається далі. (0246) Однією з таких методик є активаційне мічення за допомогою Т-ДНК (Науазпі еї аї.
Зсіепсе (1992) 1350-1353), яке включає вставку Т-ДНК, що зазвичай містить промотор (також може містити енхансер трансляції або інтрон), у геномну ділянку гена, який становить інтерес, або на 10 т.п.о. вище або нижче від кодуючої ділянки гена в такій конфігурації, щоб промотор управляв експресією цільового гена. Як правило, регуляція експресії цільового гена за допомогою його природного промотора порушується, і ген підпадає під контроль щойно введеного промотора. Промотор, як правило, вбудований в Т-ДНК. Ця Т-ДНК довільно вставляється в геном рослини, наприклад завдяки зараженню Адгобрасіегішт, і приводить до модифікованої експресії генів поблизу вставленої Т-ДНК. Отримані в результаті трансгенні рослини проявляють домінантні фенотипи внаслідок модифікованої експресії генів поблизу введеного промотора. (0247| Ефекти даного винаходу можна також відтворити за допомогою методики ТІ Ма (націлені індуковані місцеві ураження в геномі (Тагдеїгей Іпдисей Госаї І евіоп5 Іп бепоте5)).
Вона являє собою техніку мутагенезу, застосовну для одержання та/або ідентифікації нуклеїнової кислоти, що кодує білок ТЄРР класу Ш з модифікованою експресією та/або активністю. ТІ ІМС також дозволяє проводити відбір рослин, що несуть такі мутантні варіанти.
Ці мутантні варіанти можуть проявляти модифіковану експресію, або за силою, або за локалізацією, або за часом (якщо, наприклад, мутації впливають на промотор). Ці мутантні варіанти можуть проявляти активність білка ТЄРР класу ІІЇ вищу за активність, яку проявляє ген у його природній формі. ТІ СІМС поєднує високочастотний мутагенез зі способами високопродуктивного скринінгу. Як правило, ТІ ГІМО включає наступні етапи: (а) мутагенез за допомогою ЕМ5 (Недеї Сі Р апа Копс: С (1992) Іп Меїпос іп Агабідорвзіх Незеагсі, Копса С,
Спа МН, 5сенеї! У), єдв. Зіпдароге, Мопа Зсієпійіс Рибіївпіпа Со, рр. 16-82; Геідтапп еї аї., (1994)
Іп Меуєгом/ї» Е М, ботегмШе С В, єдз, Агабідорзів. Соїд ріпу Натог І арогаїогу Ргевз5, Соїа
Зргіпд Нагбог, М.МУ., рр 137-172; Гідніпег / апа Сазраг Т (1998) Іп У Мапіпе2-7арагїег, у Заїїпав, 60 еа5, Меїйод5 оп Моіесшіаг Віоіоду, Мої. 82. Нитапа Р'гез5, Тоїома, М..)., рр 91-104); (б) одержання
ДНК ї об'єднання окремих об'єктів; (с) РОВ-ампліфікацію ділянки, що становить інтерес; (а) денатурацію й відпал з утворенням гетеродуплексів; (є) ОНРІС, у якій присутність гетеродуплекса в пулі визначається за додатковим піком на хроматограмі; (ї) ідентифікацію мутантного об'єкта та (4) секвенування мутантного продукту РСВ. У даній галузі техніки добре відомі способи ТІ ІМС (МеСаїшт еї аї., (2000) Маї Віоїесппої 18: 455-457; огляд 5іетріє (2004)
Маї Вем Сепеї 5(2): 145-50). (0248| Ефекти даного винаходу можна також відтворювати за допомогою гомологічної рекомбінації, яка дозволяє вводити в геном вибрану нуклеїнову кислоту в визначене вибране положення. Гомологічна рекомбінація являє собою стандартну техніку, яку звичайно застосовують в біологічних експериментах на нижчих організмах, таких як дріжджі або мох
РПпузсоптійгеПа. Способи здійснення гомологічної рекомбінації у рослин були описані не тільки для модельних рослин (Ойгіпда еї аІ. (1990) ЕМВО . 9(10): 3077-84), але й для культурних рослин, наприклад, рису (Тегада еї а. (2002) Маї Віоїесп 20(10): 1030-4; Іа апа Тегада (2004)
Ситт. Оріп. Віоїтесп 15(2): 132-8).
І0249| Посилання в даному документі на поліпшені пов'язані з урожайністю ознаки використовується для позначення збільшення біомаси (ваги) однієї або декількох частин рослини, які можуть включати надземні (придатні для заготівлі) частини та/або підземні (придатні для заготівлі) частини. Зокрема, такі придатні для заготівлі частини являють собою насіння, і виконання способів за даним винаходом приводить у результаті до того, що рослини характеризуються збільшеною врожайністю насіння у порівнянні з урожайністю насіння відповідних контрольних рослин. (02501) Вираз "підвищення", "поліпшення" або "поліпшувати" є взаємозамінними й будуть означати у контексті цієї заявки щонайменше на 5 95, 6 Об, 7 Уо, 8 95, 9 95 або 10 95, переважно щонайменше на 1595 або 2095, більш переважно на 25 95, 3095, 3595 або 40 95 більшу врожайність і/або приріст у порівнянні з рослиною дикого типу, як визначається у даному документі.
І0251| Збільшена врожайність насіння може проявлятися як така одним або декількома з наступного: а) збільшенням біомаси насіння (загальної ваги насіння), що може виражатися на основі окремої насінини, і/або на рослину, і/або на гектар або акр; 5) збільшеним числом квіток
Зо на рослину; с) збільшеним числом (налитих) насінин; 4) збільшеною нормою налитих насінин (яка виражається як відношення числа налитих насінин, діленого на загальне число насінин); е) збільшеним індексом урожайності, який виражається як відношення врожайності придатних для заготівлі частин, таких як насіння, поділеної на загальну біомасу; і 7) збільшеною масою тисячі зерен (ТКМУМ), яку екстраполюють на основі числа підрахованих налитих насінин і їх загальної ваги. Збільшена ТКУМ може бути наслідком збільшеного розміру насінини та/або ваги насінини, а також може бути наслідком збільшення розміру зародка та/або ендосперму.
І0252| Збільшення врожайності насіння може також проявлятися як збільшення розміру насінини і/або об'єму насінини. Крім того, збільшення врожайності насіння може також проявлятися як таке у якості збільшення площі насінини, і/або довжини насінини, і/або ширини насінини, і/або окружності насінини. 0253) Якщо у якості прикладу взяти кукурудзу, збільшення врожайності може проявлятися як одне або декілька з наступного: збільшення числа вкорінених рослин на гектар або акр, збільшення числа качанів на рослину, збільшення числа рядів, числа зерен на ряд, ваги зерна, ваги тисячі зерен, довжини/діаметра качана, збільшення норми налитих насінин (яка являє собою число налитих насінин, поділене на загальне число насінин і помножене на 100), серед іншого. Якщо у якості прикладу взяти рис, збільшення врожайності може проявлятися як збільшення одного або декількох з наступного: числа рослин на гектар або акр, числа волотей на рослину, числа колосків на волоть, числа квіток (окремих квіток) на волоть (яке виражається як відношення числа налитих насінин, поділеного на число основних волотей), збільшення норми налитих насінини (яка являє собою число налитих насінин, поділене на загальне число насінин і помножене на 100), збільшення ваги тисячі зерен, серед іншого.
І0254| Оскільки трансгенні рослини згідно з даним винаходом мають збільшену врожайність, цілком імовірно, що ці рослини проявляють підвищену швидкість росту (протягом щонайменше частини їх життєвого циклу) у порівнянні зі швидкістю росту контрольних рослин на відповідній стадії їх життєвого циклу. Підвищена швидкість росту може обмежуватися однією або декількома частинами рослини (включаючи насіння), або може стосуватися практично всієї рослини. Рослини, що характеризуються підвищеною швидкістю росту, можуть мати коротший життєвий цикл. Під життєвим циклом рослини можна розуміти час, необхідний для зростання від сухої зрілої насінини до стадії, коли рослина утворює сухе зріле насіння, аналогічне вихідному бо матеріалу. На цей життєвий цикл можуть впливати фактори, такі як рання міць, швидкість росту,
індекс незрілості, період цвітіння й швидкість дозрівання насіння. Підвищення швидкості росту може спостерігатися на одній або декількох стадіях життєвого циклу рослини або протягом практично всього життєвого циклу рослини. Підвищена швидкість росту під час ранніх стадій життєвого циклу рослини може свідчити про збільшену міць. Підвищення швидкості росту може змінювати цикл урожаїв рослини, що дозволяє сіяти рослини пізніше та/або збирати раніше, ніж це було б можливо в інших випадках (аналогічний ефект можна одержати у випадку більш раннього часу цвітіння). Якщо швидкість росту підвищена в достатньому ступені, це може створити можливість для додаткового посіву насіння того самого виду рослини (наприклад, посів і збирання рослин рису з наступним посівом і збиранням додаткових рослин рису протягом одного стандартного вегетаційного періоду). Аналогічно, якщо швидкість росту підвищена в достатньому ступені, це може створити можливість для додаткового посіву насіння інших видів рослин (наприклад, посів і збирання зернових рослин з наступним, наприклад, посівом і необов'язковим збиранням сої, картоплі або будь-якої іншої придатної рослини). У випадку деяких сільськогосподарських культур можливе багаторазове збирання врожаю з одного кореневища. Зміна циклу врожаїв рослини може приводити до збільшення річного виробництва біомаси на акр (завдяки збільшенню кількості разів (скажімо, протягом року) вирощування й збирання будь-якої конкретної рослини). Підвищення швидкості росту також може створити можливість для культивування трансгенних рослин в більш широкій географічній зоні, ніж їхніх аналогів дикого типу, оскільки територіальні обмеження у вирощуванні сільськогосподарської культури найчастіше визначаються несприятливими умовами навколишнього середовища або на момент посіву (на початку вегетаційного періоду), або на момент збирання (наприкінці вегетаційного періоду). Таких несприятливих умов можна уникнути, якщо цикл врожаїв скорочується. Швидкість росту можна визначати шляхом одержання різних параметрів на основі кривих росту, при цьому такими параметрами можуть бути серед іншого Т-Міа (час, необхідний для досягнення рослинами 50 95 від їхнього максимального розміру) і Т-90 (час, необхідний для досягнення рослинами 90 95 від їхнього максимального розміру). (0255) Виконання способів за даним винаходом дає рослини з підвищеною швидкістю росту у порівнянні з контрольними рослинами. Таким чином, згідно з даним винаходом пропонується спосіб підвищення швидкості росту рослин, причому спосіб включає регуляцію експресії,
Зо переважно збільшення експресії у рослині нуклеїнової кислоти, що кодує білок Т6РР, як визначається у даному документі.
І0256| Збільшення врожайності та/або швидкості росту відбувається або коли рослина перебуває в безстресових умовах, або коли рослина зазнає різних стресів у порівнянні з контрольними рослинами. Рослини, як правило, реагують на вплив стресу вповільненням росту.
В умовах сильного стресу рослина може повністю припинити ріст. З іншого боку, помірний стрес визначається в даному документі як будь-який стрес, при впливі якого рослина не повністю припиняє ріст без можливості поновлення росту. Помірний стрес у контексті даного винаходу приводить до зниження росту рослин, що підлягали стресу, менш ніж на 40 95, 35 95 або 30 9, переважно менш ніж на 25 95, 20 95 або 15 95, більш переважно менш ніж на 14 95, 13 Фо, 12 9, 11 95 або 10 95 або менше у порівнянні з контрольною рослиною, яку не піддавали стресовим умовам. Завдяки прогресу в агротехнічних заходах (зрошенні, внесенні добрив, обробки пестицидами) при культивуванні сільськогосподарських культур сильні стреси виникають нечасто. Відповідно, порушений ріст, викликаний помірним стресом, часто є небажаним явищем у сільському господарстві. Помірні стреси являють собою типові біотичні/абіотичні (пов'язані з навколишнім середовищем) стреси, яких може зазнавати рослина. Абіотичні стреси можуть виникати через посуху або надлишок води, анаеробний стрес, стрес, викликаний засоленням, хімічну токсичність, окисний стрес та високі, низькі температури або температури промерзання.
Абіотичний стрес може являти собою осмотичний стрес, викликаний стресом через нестачу води (зокрема через посуху), стрес, викликаний засоленням, окисний стрес або іонний стрес.
Біотичні стреси, як правило, являють собою стреси, викликані такими патогенами, як бактерії, віруси, гриби й комахи. Інший абіотичний стрес може відбуватися внаслідок дефіциту поживних речовин, наприклад, нестачі азоту, фосфору й калію.
І0257| Способи за даним винаходом можна здійснювати в безстресових умовах або в умовах помірної посухи, щоб забезпечити у рослин збільшену врожайність у порівнянні з контрольними рослинами. Як повідомлялося в У/апо еї аї. (Ріапіа (2003) 218: 1-14), абіотичний стрес призводить до ряду морфологічних, фізіологічних, біохімічних і молекулярних змін, які несприятливо впливають на ріст рослин і продуктивність. Як відомо, посуха, засоленість, екстремальні температури й окисний стрес є взаємозалежними, і вони можуть спричиняти порушення росту й ушкодження клітин за рахунок аналогічних механізмів. Карбапі еї аї. (Ріапі бо Рпузіо! (2003) 133: 1755-1767) описує дуже високий ступінь "взаємного впливу" між стресом,
викликаним посухою, і стресом, викликаним високою засоленістю. Наприклад, посуха та/або засоленість проявляються в першу чергу як осмотичний стрес, що призводить до порушення гомеостазу й розподілу іонів в клітині. Окисний стрес, який часто супроводжує стрес, викликаний високою або низькою температурою, засоленістю або посухою, може спричиняти денатурацію функціональних і структурних білків. Як наслідок, ці різноманітні стреси, пов'язані з навколишнім середовищем, часто активують аналогічні сигнальні шляхи клітини й клітинні відповіді, такі як продукування білків стресу, активація антиоксидантів, накопичення сумісних осмолітів і затримка росту. Вираз "умови без стресу", як використовується в даному документі, означає такі умови навколишнього середовища, які забезпечують оптимальний ріст рослин.
Фахівці в даній галузі інформовані про нормальні грунтові умови й кліматичні умови для даного місця розташування.
І0258| Виконання способів за даним винаходом надає рослинам, які вирощують в безстресових умовах або в умовах посухи, збільшену врожайність у порівнянні з відповідними контрольними рослинами, які вирощують у порівнюваних умовах. Таким чином, згідно з даним винаходом пропонується спосіб поліпшення пов'язаних із урожайністю ознак рослин, які вирощують в безстресових умовах або в умовах посухи, причому спосіб включає збільшення експресії в рослині нуклеїнової кислоти, яка кодує модифікований поліпептид Т6РР, що характеризується зменшеним зв'язуванням із субстратом і/або активністю. 0259) В одному варіанті здійснення даного винаходу поліпшена пов'язана із урожайністю ознака проявляється як збільшення одного або декількох з наступного: загального числа насінин на рослину, числа налитих насінин на рослину й ваги насіння на рослину. Переважно, ці поліпшення виявляють у рослин, які вирощують в безстресових умовах. (0260) Способи за даним винаходом переважно застосовні до будь-якої рослини.
І0261| Рослини, особливо застосовні в способах за даним винаходом, включають усі рослини, що належать до надсімейства Мігідіріапіає, зокрема, однодольні й дводольні рослини, що включають у себе кормові рослини або кормові бобові культури, декоративні рослини, продовольчі культури, дерева або чагарники, вибрані з переліку, що включає: Асег 5рр., Асіїіпіаіа 5рр., АбеІтозспив 5рр., Адгоругоп 5рр., АйПит 5рр., Атагапійпив 5рр., Апапаз сотовив, Аппопа 5рр., Аріит дгамеоіепв, Агаснпів 5рр, Апосагриз 5рр., Азрагадизв опПісіпаїї5, Амепа 5рр. (наприклад,
З0 Амепа заїїма, Амепа їаїша, Амепа Бугапііпа, Амепа їаїша маг. займа, Амепа Нубгіда), Аметптпоа сагатроїа, Вепіпсаза Пізріда, ВеппоПейа ехсеїб5єа, Веїа миїЇдагі5, Вгаззіса 5рр. (наприклад,
Вгаззіса парив, Вгазвзіса гара 55р. (канола, олійний рапс, турнепсі), Садаба Гагіпоза, Сатеїа зіпепзіз, Саппа іпаіса, Сарзісит 5рр., Сагех єїайа, Сагіса рарауа, Сагізза тастгосагра, Сагуа 5рр.,
Сапнатив (іпсіогій5, Савіапеа 5рр., Сіспопцт епаїміа, Сіппатотит 5рр., СпгиПив5 Іапайи5, Сіги5 5рр., Сосов5 5рр., Сойва 5рр., Соіосазіа езсцепіа, Соїа 5рр., Сопапагит заїїмит, Согуїши5 врр.,
Стаїаєдив 5рр., Стосив взаїйми5, Сисигріа в5рр., Сиситів 5рр., Супага 5рр., Юайси5 сагоїа,
Оевтодішт врр., Оітосагрив Іопдап, Оіозсогєеа 5рр., Юіозруго5 5рр., ЕсПпіпоспіса 5рр., ЕІаєї5 (наприклад, ЕЇІаєї5 диїпеепвів5, ЕЇіаєї5 оївїтега), ЕіІєибіпе согасапа, Епороїгуа |аропіса, Епдепіа ипйога, Радоругит 5рр., Радив врр., Рісиб5 сапйса, Бопипеїїа 5рр., Егадагіа врр., Сіпкдо Бііоба,
Спусіпе 5рр. (наприклад, Сіусіпе тах, 5одіа Пізріда або ода тах), Соз5зуріит ПпігзиШит, Неїїапіпив 5рр. (наприклад, НеЇйапіпи5 аппиц5), Нетегосаїїв тшіма, Нібізси5 5рр., Ногдеит 5рр. (наприклад,
Ногдеит мпїЇдагеє), Іротоєа бБаїаїах, дидіапе5 в5рр., І асіиса 5аїїма, Іаїйугив5 5рр., Гепв5 сиїпагів,
Мпит изіаїіввітит, І йспі спіпепвів, І оїи5 5рр., ша асшапдиіа, І иріпи5 5рр., І и2Мйіа зуїмаїїса,
І усорегвісоп 5рр. (наприклад, І усорегвісоп езсшцепіишт, І усорегвісоп Іусорегвісит, І усорегвісоп руптогте), Масгоїуіїота 5рр., МаЇши5 5рр., Маїірідпіа етагдіпаїа, Маттєа атегісапа, Маподітега іпаіїса, Мапіної 5рр., МапіїКага 2ароїа, Медісадо заїїма, МеїйПоїив5 5рр., Мепіпа 5рр., Мізсапіпив5 5рр., Мотогаїса 5рр., Могив підга, Миза 5рр., Місоїйапа 5рр., Оієа 5рр., Орипійа 5рр., Огпйпорив 5рр., Огуга 5рр. (наприклад, Огуга заїїма, Огуга Іашоїіа), Рапісит тіїйасейт, Развйога еєдиїв,
Равзііпаса заїїма, Регзеа 5рр., Реїозеїпит сгірит, Рпазеоїи5 5рр., Рпоеєпіх з5рр., Рпузаїї5 5рр.,
Ріпив з5рр., Різіасіа мега, Різит 5рр., Роа 5рр., Роршив 5рр., Ргозорів 5рр., Ргипив в5рр., Рвідіит 5рр., Рипіса дгапайт, Ругиб5 соттипів, Ойцегсив в5рр., Нарпапив заїїмив5, Впєит гНабагтагт,
Віре5 врр., Вісіпиє соттипіх, Нибив в5рр., Засспагпит врр., Затрисив 5рр., бесаїє сегеаїе,
Зезатит з5рр., 5іпарів 5р., Зоїапит 5рр. (наприклад, 5оїапит їшбрегозит, 5оїапит іпіеапої шт або боіапит Іусорегвісит), богуйит бБісоїог, бріпасіа 5рр., Зулудіит зрр., Тадеїе5 зрр., Татапйпадиз іпадіса, Ппеоргота сасао, Тит 5рр., Тийсозесаїе гітраці, Тийісит 5рр. (наприклад,
Тийсит аевіїмит, Гийсит дигит, Тийісит їШгдідит, Тиййсит Нпубетит, Тийсит тасна, Тийсит ваймит або Тиййсит миїдаге), Тгораеоїшт тіпив, Ттораеєоїшт та/)ив5, Массіпішт врр., Місіа 5рр.,
Мідпа 5рр., Міоїа одогаїа, Міїі5 5рр., ва таув, 2і2апіа раїшвігі5, 2іг2ірпив 5рр., серед інших. (02621) Згідно з переважним варіантом здійснення даного винаходу рослина являє собою 60 культурну рослину. Приклади культурних рослин включають сою, соняшник, канолу, люцерну,
ріпак, бавовник, томат, картоплю й тютюн. Також переважно, рослина являє собою однодольну рослину. Приклади однодольних рослин включають цукровий очерет. Більш переважно рослина є злаком. Приклади злаків включають рис, маїс, пшеницю, ячмінь, просо, жито, сорго й овес.
І0263| Даний винахід також охоплює застосування нуклеїнових кислот, що кодують білок
Т6РР, описаний у даному документі, і застосування цих білків ТЄРР у поліпшенні в рослин пов'язаних із урожайністю ознак. (0264) Нуклеїнові кислоти, що кодують білок Т6РР, описаний у даному документі, або білки
Т6РР як такі, можуть знайти застосування в програмах селекції, у яких визначають ДНК-маркер, що може бути генетично пов'язаним з геном, який кодує ТЄРР, де білок ТЄРР має зменшену активність або зв'язування із субстратом. Для визначення молекулярного маркера можна застосовувати нуклеїнові кислоти/гени або білки Т6РР як такі. Цей ДНК або білковий маркер у подальшому можна застосовувати в програмах селекції для відбору рослин, що характеризуються поліпшеними пов'язаними із урожайністю ознаками, як визначається в даному документі вище у способах за даним винаходом. (0265) Нуклеїнові кислоти, що кодують білюи ТЄРР, можна також застосовувати в якості зондів для генетичного й фізичного картування генів, частинами яких вони є, і в якості маркерів для ознак, пов'язаних із цими генами. Така інформація може бути застосовною в селекції рослин для розробки ліній з бажаними фенотипами. Таке застосування нуклеїнових кислот, що кодують білки ТЄРР, потребує лише послідовності нуклеїнової кислоти щонайменше з 15 нуклеотидами у довжину. Нуклеїнові кислоти, що кодують білки ТбРР класу І, можна застосовувати у якості маркерів поліморфізмів довжин рестрикційних фрагментів (КРЇ Р).
Саузерн-блоти (Затбгоок У, Егпйбсп Е Е апа Мапіаїіх Т (1989) МоїІесшаг Сіопіпд, А І абогаїогу
Мапиаї) геномної ДНК рослин, розщепленої за допомогою рестрикційних ферментів, можна досліджувати за допомогою нуклеїнових кислот, що кодують білок ТбРР. Отриманий у результаті патерн бендів можна потім піддавати генетичному аналізу за допомогою комп'ютерних програм, таких як МарМакКег (Гападег еї аІ. (1987) Сепотіс5 1: 174-181), для побудови генетичної карти. Крім того, нуклеїнові кислоти можна застосовувати для дослідження
Саузерн-блотів, які містять геномні ДНК, оброблені рестрикційною ендонуклеазою, із набору окремих об'єктів, що представляють батьківські особини і потомство визначеного генетичного
Зо схрещування. Відмічають сегрегацію поліморфізмів ДНК і застосовують її для розрахунків положення нуклеїнової кислоти, що кодує білок ТЄРР, на генетичній карті, отриманій раніше за допомогою цієї популяції (Воївіеїп еї аї. (1980) Ат. 9. Нит. Сепеї. 32:314-331).
І0266| Одержання й застосування зондів, отриманих з генів рослин, для застосування в генетичному картуванні описане в Вегпаї:7Ку апа ТапкКзієу (1986) Ріапі Мої. Віо!І. Керогієег 4: 37- 41. Численні публікації описують генетичне картування специфічних клонів кДНК із застосуванням методології, вказаної вище, або її варіантів. Наприклад, для картування можна застосовувати популяції перехресного запилення Е2, популяції беккросів, довільно схрещені популяції, майже ізогенні лінії та інші набори окремих об'єктів. Такі методології добре відомі фахівцям у даній галузі.
І0267| Зонди з нуклеїнових кислот можна також застосовувати для фізичного картування (тобто розміщення послідовностей на фізичних картах; див. Нопеїзвеї еї аї. І: Моп-таттаїїап
Сепотіс Апаїувзіє: А Ргасіїсаї Сиціде, Асадетіс ргезв 1996, рр. 319-346, і посилання, що цитуються у ньому). (0268) В іншому варіанті здійснення зонди з нуклеїнових кислот можна застосовувати в картуванні за допомогою прямої флюоресцентної гібридизації іп ви (РІЗН) (Ттгазк (1991) Ттепав
Сепеї. 7:149-154). Хоча для сучасних способів картування за допомогою РІЗН краще використовувати великі клони (від декількох т.п.о. до декількох сотень т.п.о.; див. ІГаап еї аї. (1995) Сепоте ев. 5:13-20), удосконалення в чутливості можуть дозволити проводити картування за допомогою РІЗН із застосуванням коротших зондів.
І0269| Ряд способів генетичного й фізичного картування, основаних на ампліфікації нуклеїнових кислот, можна проводити за допомогою нуклеїнових кислот. Приклади включають алельспецифічну ампліфікацію (Кааліап (1989) 9. гар. Сіїп. Меа 11:95-96), поліморфізм РСК- ампліфікованих фрагментів (САРБ5; ЗПпейівєїй еї а. (1993) Сепотіс5 16:325-332), алельспецифічне зшивання (Іапдедгеп ей а). (1988) Зсіепсе 241:1077-1080), реакції добудовування нуклеотидів (5оКоїом (1990) Мисіеіс Асій Кев5. 18:3671), радіаційне гібридне картування (Умайнег еї а. (1997) Маї. Сепеї. 7:22-28) і Нарру Марріпу (Оєаг апа Соок (1989)
Мисієїс Асій Вев. 17:6795-6807). Стосовно цих способів послідовність нуклеїнової кислоти застосовують з метою розробки й одержання пар праймерів для застосування в реакції ампліфікації або в реакціях добудовування праймера. Розробка таких праймерів добре відома бо фахівцям у даній галузі. У способах, в яких використовують генетичне картування на основі
РСВ, може бути необхідно ідентифікувати відмінності між послідовностями ДНК батьківських особин при схрещуванні для картування на ділянці, що відповідає поточній послідовності нуклеїнової кислоти. Проте, в цілому це не є необхідним для способів картування.
І0270| В одному аспекті даного винаходу, не обмежуючись теорією, Т6РР, що містить мутації як описано в даному документі, характеризується зниженою активністю, а також утворює білок-білюовий комплекс з ТР5. Не обмежуючись теорією, одним можливим аспектом даного винаходу є білок-білюювий комплекс Т6РР/ТР5, який можна застосовувати для забезпечення у рослини збільшеної врожайності та підвищеної стійкості до стресу. В іншому аспекті фахівець зможе модифікувати будь-який поліпептид Т6РР, що має консенсусну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9, щоб він мав більш низьку афінність зв'язування з Т6Р, тим самим збільшуючи частоту виникнення білкового комплексу ТЄРР/ТРБ5. Передбачається, що в одному аспекті можливе створення або застосування існуючої хімічної речовини, яка може імітувати комплекс або створювати ортогональні структури, що можна використовувати для імітації комплексу ТЄРР/ТРБ. В одному аспекті, не обмежуючись теорією, для забезпечення збільшеної врожайності рослини можна проводити одну або декілька мутацій в В-фосфатазному боксі будь-якого вказаного білка Т6РР. 02711) Результатом здійснення способів згідно з даним винаходом є рослини з поліпшеними пов'язаними із урожайністю ознаками, як описується в даному документі вище. Ці ознаки можна також поєднувати з іншими економічно вигідними ознаками, такими як ознаки, що додатково поліпшують урожайність, стійкість до інших абіотичних і біотичних стресів, ознаки, що модифікують різні структурні особливості та/або біохімічні та/або фізіологічні властивості.
Даний винахід далі буде описаний з посиланням на нижчепредставлені фігури.
Приклади
Приклад 1: Ідентифікація та клонування послідовності КДНК Т6РР рису в бінарний вектор
І0272| Спочатку гени трегалоза-6-фосфатфосфатази судинної рослини клонували з
Агарідорзі5 (пайапа шляхом комплементації делеційного мутанта ТРБ2 дріжджів (моде! еї аї. 1998). У той же час було показано, що гени, позначені АЇТ6РРА і АІТ6РРВ (номери доступу
Сепрапк АРБО07778 і АРГО07779), мали трегалоза-б6-фосфатфосфатазну активність. Білкові послідовності АСбРРА і АТТРВ застосовували в запитах ТВІА5БТМ у базах даних
Зо послідовностей маїсу й рису. Шляхом вирівнювання послідовностей установлювали збіги в окремих генах. Ідентифікували три гомологи Т6РР у маїсі та три гомологи у рисі. Послідовність
КДНК ТбРР рису (О5Т6РР), зазначену в 5ЕБО ІО МО. 1, ампліфікували із застосуванням високоточної РОК. 50 мкл реакційної суміші складалися з 1 мкл бібліотеки кКДНК рису (отриманої з МРНК калюсу в Гатраа Опігар Месіог від бігаїадепе, розмір первинної бібліотеки »1 х 106
БУО, титр ампліфікованої бібліотеки » 1 х 1012 БУО/мл), 200 мкм амМмтТР, 1 мкл 20 мкм олігонуклеотидного праймера Т6РР-ЕС-5 (5'-саддассаддашодадсааїадсісас-3) і 1 мкл 20 мкм олігонуклеотидного праймера Т6РР-ЕС-3 (5'-аїсдсададсісасасідадідсисіссо-3), 5 мкл ТїОоХ буфера СіІопеа РЕ і 2,5 одиниць Рішигро ДНК-полімерази. Програма термоциклування заключалася в 95 "С протягом 2 хвилин, а потім 40 циклах (94 "С протягом 15 секунд, 507 протягом 1 хвилини, 72 "С протягом 1 хвилини), а потім 72 "С протягом 10 хвилин. ТбРР- продукт рису клонували із застосуванням набору для РСК-клонування 2его Вішпі ТОРО. реск-
Вінп-П-ТОРО-О5Т6РР ідентифікували шляхом розщеплення 5 мкл ДНК-мініпрепа реК-Вішпі-І-
ТОРО-О5Т6РР за допомогою ЕсокіІ в 20 мкл реакційної суміші, що містила 2 мкг ВЗА і 2 мкл 1ОХ буфера рестрикційної ендонуклеази ЕсОоКіІ. Реакційну суміш інкубували при 37 "С протягом 2 годин і продукти рРСК-Вішпі-ПІ-ТОРО-О5Т6РР (Есокі) розділяли на 1 95 ТАЕ-агарозі. Потім клон рСОВ-Вінпі-П-ТОРО-О5Т6РР секвенували. кКДНК О5Т6РР фланкували сайтами для рестрикційних ендонуклеаз Мсо1/Засі. Потім О5Т6РР додатково клонували в бінарний вектор, як описано в прикладі 8 публікації заявки на патент США 2007/0006344 (яка в ній має назву О5Т6РР-3 і позначається нуклеотидною ЗЕО ІЮ МО: 531 і білюоовою ЗЕО ІО МО: 532).
Приклад 2. Початкова оцінка об'єктів маїсу з ТЄРР рису в теплиці
І0273| Об'єкти маїсу з ТЄРР рису, які містять ЗЕО ІЮ МО: 1, функціонально пов'язану із промотором, який характеризується переважною експресією в материнській репродуктивній тканині (тобто, промотором О5МАЮОЗ5), одержували й додатково оцінювали як у теплиці, такі в полі, як описано в прикладах 8-13 публікації заявки на патент США 2007/0006344. За допомогою початкової оцінки об'єктів маїсу в теплиці й у полі виявили деякі об'єкти, що мають збільшену врожайність як в умовах без посухи, так і в посушливих умовах (див. публікацію заявки на патент США 2007/0006344, включену в даний документ за допомогою посилання).
Приклад 3: Оцінка та ідентифікація об'єктів маїсу з ТЄРР, що забезпечує високу врожайність (0274) Об'єкти маїсу, для яких було показано у випробуваннях, описаних у прикладі 2 і більш бо конкретно в публікації заявки на патент США 2007/0006344, що їм надані властивості збільшеної врожайності, були додатково охарактеризовані щодо врожайності й польової продуктивності. Ці об'єкти містили один з бінарних конструктів 15777 або 15769, як це описано в публікації заявки на патент США 2007/0006344. Фактично, бінарний конструкт 15769 містить касету експресії, що має О5Т6РР (зазначену в 5ЕО ІЮО МО: 1 даної заявки), функціонально пов'язану з промотором О5МАЮО5Бб (ЗЕО ІЮ МО: 13). Бінарний конструкт 15777 містить таку саму касету експресії (промотор О5МАЮО5Б6 і послідовність, що кодує О5Т6РР), а також енхансери транскрипції, що розташовані вище за промотор О5МАЮ5б6. Докладний опис і специфічні особливості обох цих конструктів знов-таки можна знайти в публікації заявки на патент США 2007/0006344. У цілому з бінарним конструктом 15769 одержали 645 об'єктів ТО маїсу, а з бінарним конструктом 15777 одержали 587 об'єктів. Відбір стабільних об'єктів, які показують гарний ріст у теплиці й польових умовах, дав у результаті відносно невелику кількість об'єктів, які переводили до польових випробувань. Високий рівень відсіву призвів лише до 17 об'єктів, що показували польову продуктивність. Об'єкти, що отримані від рослин маїсу, трансформованих бінарним конструктом 15777, виявилися найбільш продуктивними при тестуванні в полі. Два об'єкти (у даному документі їх називають "об'єкт 1" і "об'єкт 2") відбирали на основі виживаності й продуктивності в регульованих умовах стресу (збереження врожайності за умови посухи під час цвітіння) і в агрономічних випробуваннях, під час яких вимірювали врожайність. У цілому, найбільш продуктивні об'єкти, трансформовані конструктом 15777, показали значну перевагу врожайності в бушелях на акр відносно контрольних перевірочних зразків.
Приклад 4: Аналіз послідовностей об'єктів 1 і 2 (02751 Об'єкт 1 і об'єкт 2 додатково аналізували за допомогою секвенування СОЗ Т6РР. РСК застосовували для ампліфікації інтегрованої послідовності, що кодує О5Т6РР, за допомогою праймерів, які гібридизувалися з 5- і З'-ділянкою кодуючої послідовності. Відповідні РСЕ- амплікони давали в результаті бенд з розміром приблизно 1,1 т.п.о., як і слід було очікувати виходячи з послідовності, що кодує О5Т6РР, показаної в ЗЕО ІЮО МО: 1, що у даному документі називається О5Т6РР-М/Т, яка являла собою послідовність, що містилася у відповідній касеті експресії. Амплікони додатково секвенували за допомогою загальноприйнятого у даній галузі способу. Дані секвенування свідчили про те, що обидва об'єкти (1 і 2) містили модифікації.
Зо Об'єкт 1, що містив точкову мутацію в нуклеотиді 730 відносно 5ЕО ІЮ МО: 1 (Т"САТТА, де "7 вказує на точку мутації), у даному документі називається О5Т6РР-Н2г440. Ця точкова мутація приводила до мутації амінокислоти в залишку 244 відносно 5ЕО ІЮ МО: 2, змінюючи залишок
Ні5 на залишок Азр, як представлено в 5ЕО ІО МО: 3, що у даному документі має рівноцінну назву "точкова модифікація ТЄРР". Об'єкт 2, як було виявлено, містив дві модифікації в нуклеотидах 305 (ТО"СТТСС, де " вказує на точку мутації) і 388 (СОСС"АТТ, де " вказує на точку мутації) відносно ЗЕО ІЮО МО: 1, що у даному документі називається О5Т6РР-І129БР.
Двохточкові мутації нуклеотидів, ідентифіковані в об'єкта 2, приводили до зміни АїЇа на Маї у положенні 102 і до зміни Пе на Рпе у положенні 129, або до поліпептиду ТЄРР, представленого
ЗЕО ІО МО 5, що у даному документі має рівноцінну назву "подвійна модифікація ТбРР". Цікаво, як показано в наступних прикладах, дві із цих мутацій розташовані у висококонсервативних доменах білка ТбРР. Заміна Аїа на Ма у положенні 102 перебуває за межами висококонсервативних ділянок. Висококонсервативні домени залучені у зв'язування з субстратом та/або білок-білкові взаємодії при утворенні комплексу.
Приклад 5: Ідентифікація ТбЄРР, що мають подібну гомологію та функцію, які можна поліпшувати шляхом уведення мутацій (0276) Послідовності (КДНК повної довжини, Е5Т або геномна), споріднені з БЕО ІЮО МО: 1, і або білкові послідовності, споріднені з 5ЕО ІЮО МО: 2, можна ідентифікувати серед тих, що містяться у базі даних Епіге7 Мисіеоїіде5 Національного центру біотехнологічної інформації (МОВІ), за допомогою інструментів для пошуку послідовностей у базах даних, таких як Вабіс
Ї оса! АІІдптенпі Тоої (ВІ АБ5Т) (Аїївспи! єї аї!. (1990) 9). Мої. Віо!. 215:403-410; ії Авспи! еї аї. (1997)
Мисівїс Асіа5 Нез. 25:3389-3402). Програму можна застосовувати для пошуку ділянок локальної подібності між послідовностями шляхом порівняння послідовностей нуклеїнової кислоти або поліпептидних послідовностей 3 базами даних послідовностей і шляхом розрахунків статистичної достовірності збігів. Поліпептид, закодований 5ЕО ІО МО: 1, можна застосовувати за допомогою алгоритму ТВІ А5ТМ зі значеннями за замовчуванням і програмою фільтрації, щоб відкинути послідовності з низькою складністю. Виведення даних аналізу можна спостерігати у вигляді попарного порівняння та розподіляти згідно оцінки ймовірності (Е- значення), де оцінка відображає ймовірність того, що конкретне вирівнювання відбувається випадково (чим нижче Е-значення, тим більш достовірний збіг). Крім Е-значень порівняння 60 можна також оцінювати за відсотковою ідентичністю. Відсоткова ідентичність відображає число ідентичних нуклеотидів (або амінокислот) у двох порівнюваних послідовностях нуклеїнової кислоти (або поліпептидних послідовностях) в межах конкретної довжини. У деяких випадках параметри за замовчуванням можна регулювати для модифікації точності пошуку.
І0277| В таблиці нижче представлений перелік послідовностей нуклеїнової кислоти й білкових послідовностей, які споріднені з послідовністю нуклеїнової кислоти, що представлена
ЗЕО ІЮО МО: 1, і білюювою послідовністю, що представлена 5ЕО ІЮ МО: 2, які можуть бути застосовні в різних аспектах даного винаходу. Послідовності ідентифікували шляхом пошуку за гомологією послідовностей, а також за допомогою молекул Т6РР, ідентифікованих у рівні техніки.
Назва Організм-джерело пурі мою Мо Доступу в базі даних
ЗБОЮ МО:6 0 Огулавайма.ї///// |рі |6 (МА СС
ЗЕОІЮМО:8 0 Огулавайма.ї////// |рг |8 (МА СС
Продовження пі - нуклеотидна рі - білкова
М/А - немає даних (0278) Після ідентифікації ТЄРР, перерахованих у таблиці вище, ці ТЄРР згодом вирівнювали з ЗЕО ІО МО: 1, З і 5 (за допомогою інструментів для вирівнювання Месіог МТІ від ІММІТВОСЕМ
Іпс) для визначення то, чи є мутації в консервативних ділянках білка. Під час вирівнювання серед різних білків ТЄРР ідентифікували велику кількість консервативних послідовностей і їх застосовували для розробки консенсусної послідовності, зображеної в 5ЕО ІЮ МО: 9. На фігурі 2 зображений взаємозв'язок ідентифікованих ТбРР за допомогою філогенетичного дерева.
Консенсусну послідовність можна застосовувати для модифікації будь-чого з нуклеотидних і/або білкових послідовностей ТЄРР, перерахованих у таблиці вище, щоб при використанні їх у трансгенній рослині вони приводили до збільшеної врожайності та/або підвищеної стійкості до стресу, а також демонструвати продуктивність у полі. Також припускають, що будь-який білок, який має консенсусну послідовність, що характеризується 50 Фо, 60 90, 70 бо, 80 90, 90 Фо, 95 Фо, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 9, також показаною на фігурі 10, можна модифікувати, як описано в даному документі, і експресувати в рослинах, як описано в даному документі.
І0279| Консенсусна послідовність показує висококонсервативні залишки, що наявні в багатьох поліпептидах Т6РР, перерахованих у таблиці вище. Також припускають, що ця консенсусна послідовність буде також відповідати іншим ТЄРР, не перерахованим у таблиці вище. Положення, позначені у консенсусній послідовності вище за допомогою "Х", указують на ділянки мінливості, де будь-яка інша окрема буква відповідає загальноприйнятому однобуквеному позначенню амінокислот, загальновживаному в даній галузі техніки. Підкреслені амінокислотні залишки вказують на ділянки, які можна модифікувати для конструювання поліпептидів ТЄРР, що забезпечують у трансгенної рослини збільшену врожайність і/або поліпшену витривалість до стресу. В одному аспекті будь-які із залишків ОМОСТІ ЗРІМ, що кодують В-фосфатазний бокс, можна модифікувати для забезпечення білків, які при експресії в рослині можуть забезпечувати збільшену врожайність і/або поліпшену стійкість до стресу. У варіанті здійснення даного винаходу І! (ізолейцин) в амінокислотній послідовності, що кодує В- фосфатазний бокс "МОСТІ 5РІМ" з консенсусної послідовності вище, змінюється на Е (фенілаланін) і кодує при цьому (МОСТІ 5РЕМ). В іншому варіанті здійснення "Х" у консенсусній послідовності вище являє собою М (валін), який є заміною аланіну у вихідній послідовності. Ця заміна перебуває за межами консервативного домену й може не впливати на ферментативну активність. Інший варіант здійснення буде включати заміну "Н" (гістидину) у
Зо консенсусній послідовності "СМ5МНЕКСМ" вище на О (аспарагінову кислоту), змінюючи консенсусну послідовність на послідовність "СМ5МОРКСМ". Припускають, що будь-яку модифікацію щонайменше одного консервативного амінокислотного залишку 5ЕО ІЮО МО: 9, якщо модифікація приводить у результаті до зниження ТЄРР активності, можна експресувати у рослині для забезпечення збільшеної врожайності в умовах стресу та безстресових умовах.
Альтернативно, усі три модифікації можна вводити в ген Т6РР, як описується у БЕО ІЮО МО: 7 (ДНЮ) і 8 (білою). (02801) Приклад 6: Способи розробки й тестування модифікованих білків ТЄРР (02811 Література, яку використовували для розробки варіантів ТЄРР:ТНе а/рВ Ппуагоїазе год.
Бамід Г. ОЇїїв еї аї. (1992) Ргоївїп Епдіпеегіпад. моІ.5 197-211. Ої рат омів5 апа рапкКегв: а Ів мапеїу ої а/В Нуагоїазез. НеїКкіпнеіїто Р., Соідтап, А., Уейгів, б. апа Ов, О.І. (1999) 5іписішге.
Мо! 6 141-146. Стувіа! вігисішге ої ігепаіозе-6-рпозрпаїе рпозрНаїазе-теїаївйд ргоївїп: Біоснпетісаї апа Біоіодіса! ітрііїсайопв. Вас, К.М., Китагап, О., Зеєїпагатанп, у., Вопаппо, У.В., Випеу, 9.К.,
Зматіпаїйап, 5. (2006) Ргоїєїп Зсі. 15: 1735-1744. |пвідніз оп Ше емоішіоп ої ігенаіозе ріозупіпевзів. Амопсе, М. Мепдога-Магодав, А., Могеїй, Е. апа Кипіада, с. (2006) ВМС ЕмоїІшіопагу
Віоіоду. 6, 109. А зіпдіє Асіїме Ттенаіозе-6Р. Зупіпазе (ТРБ) апа а Ратіу ої Риїайме Ведшайюгу
Трео-їїКе Ргоївїпз5 іп Агарідорзі5. Мапаезівепе, Г., Натоп, М., Ге Роу, К., Мап Оі)сК, Р. апа Ноїіапа,
Е. (2010) Моїіесшаг Ріапі. МоІЗ, Митбрег 2, 406-419. Те Х-гау сгувіайодгарніс вігисіиге апа зресіїсйну ргоїйе ої НАО зирепатіїу рпозрпопуагоїазе ВТ1666: Сотрагізоп ої рагаїодоизв Типсійп5 іп В. Інеїаіоїаотістоп. ГИ, 27., Випамау-Магіапо, О. апа АїПеп, К.М. (2011) Ргоївіп5: БігисіШге,
Еипсіоп апа Віоіпіоптаїйісв. 79 (11) 3099-3107. (02821 Спосіб
І0283| На основі літературних даних про кристалічну структуру білка, спорідненого з трегалоза-6-фосфатфосфатазою, від Тнепторіазта асідорніїшт, його ідентифікували як білок, що має найближчу гомологію структури з модельною трегалоза-б6-фосфатфосфатазою (Т6РР) рису. Кодом доступу цього білка в базі даних структури білка (РОВ) являється 1002. Див.,
Стузіа! вігисіште ої Менаіозе-6-рпозрнаїє рпозрпаїазе-геїіаїєйд ргоївїп: Біоспетіса! апа Біоіодіса! ітріїсайопв Вас, К.М., єї аї!. (2006) Ргоївїп 5сі. 15: 1735-1744, а код Опіргої: О9НІМ/7. (0284| Початкове вирівнювання послідовностей (0285) Для вирівнювання застосовували послідовності ТЄРР Агабрідорзів ІНаіїапа (19925; 5ЕО 60 10 МО: 14), Агарідорвзів Інаїйапа (19926; 5ЕО ІО МО: 15), Огуга заїїма (19924; 5ЕО ІО МО: 16) і
Огуга заїїма (15777; О5Т6РР-М/Т; ЗЕО ІЮ МО: 2), а також 5БЕО ІЮО МО: 4. Ці білкові послідовності разом з білком, спорідненим з Т6РР, від ТПпепторіазта асідорнішт (О9НІМ/7) вирівнювали за допомогою Месіог МТ! із застосуванням способу СіивіамуУ з одержанням початкового вирівнювання, див. фігури ТА-10. Початкове вирівнювання білкової послідовності спорідненого з ТбРР білка (О9НІМУ/7) і білкових послідовностей Агарідорвів ІНаійапа (19925, 5ЕО ІО МО: 14),
Агабідорвів ІНаіапа (19926; 5ЕО ІОЮ МО: 15), Огула заїїма (19924, 5ЕО ІО МО: 16) і Огуга заїїма (15777, 5ЕО ІО МО: 2). Залишки, виділені жирним шрифтом і курсивом у вирівнюванні білкових послідовностей нижче, являють собою важливі залишки з великого суперсімейства галогендегідрогеназ, які допомагають підтвердити якість вирівнювання.
І0286| Підкреслені залишки на фігурах Т1А-1С0б являють собою важливі залишки, які допомагають підтвердити якість вирівнювання. Більшість цих залишків являють собою каталітичні залишки (номери всіх залишків посилаються на номери залишків у білковій послідовності 15777 О5Т6РР-М/Т Огула заїїма): залишок аспарагінової кислоти 121 утворює фосфоаспартатну проміжну сполуку з субстратом. Треонін 318 (у великому суперсімействі цей залишок може являти собою серин) зв'язується за допомогою водневого зв'язку з фосфорилкиснем у субстраті. Аспарагінові кислоти 315 і 123 утворюють координаційний зв'язок з іоном Мд2 х за рахунок своїх бічних ланцюгів і карбонільної групи кістяка, відповідно. Лізин 289 стабілізує перехідний стан реакції.
І0287| Одержання структури білка 1002 для гомологічного моделювання (0288) Кристалічну структуру білка, спорідненого з ТЄРР (код за РОВ 1002), завантажували в
Маєзіго (Зспгбаїподег, Іпс.) і аналізували, а також готували для використання (додаючи протони, будуючи дисульфідні містки, установлюючи заряди металів, оптимізуючи водневі зв'язки).
І0О289| У той самий час одержували й аналізували експериментальну карту електронної густини для елемента 1002 з РОВ. Хоча більшість ознак у карті були змодельовані правильно у депонованій структурі, електронна густина у положенні молекули гліцерину поблизу активного сайту не відповідала очікуваним ознакам густини гліцерину. Замість цього, карта ясно вказувала на наявність в цьому положенні двох молекул води. Таким чином, молекулу гліцерину вилучали з моделі, а дві молекули води додавали в їх правильні положення. Перед початком процесу гомологічного моделювання зі структури вилучали всі молекули води, крім двох молекул води,
Зо безпосередньо зв'язаних координаційним зв'язком з іоном Мд2- в активному сайті.
І0290| Результат моделювання в роботі Као еї а мав важливі наслідки. Оскільки споріднений з ТЄРР білок був кристалізований лише як апофермент та не містив зв'язаного субстрату, автори використовували положення молекули гліцерину для спрямовування процедури докінгу, яку здійснювали вручну. Дійсно, автори зробили висновки, що субстрат буде зв'язуватися в сайті зв'язування гліцерину, оскільки гліцерин дещо подібний за своїми властивостями до піраноз. Однак, оскільки в активному сайті структури, що розробили Као еї а!., гліцерину не було, докінг субстрату ТЄР у апофермент змінювали в наступній моделі. (0291) Гомологічне моделювання
І0292| Початкове вирівнювання послідовностей зчитували за допомогою РЕКІМЕ (Зепгбаїпдег) разом зі структурою білка-шаблону. При більш докладному аналізі вирівнювання білкових послідовностей модифікували з метою оптимізації місць розташування вставки петель (вставок у напрямку зовнішньої поверхні ферменту) і важливих залишків на основі літературних даних. Див. вирівнювання (вище) щодо початкового вирівнювання білкових послідовностей та вирівнювання (нижче) щодо кінцевого вирівнювання білкових послідовностей.
І0293| Кінцеве вирівнювання використовували в РКІМЕ для одержання гомологічних моделей Огуа 5аїїма 15777 і Огу;а займа 19924. Ці моделі послаблювали із застосуванням мінімізації енергії в МасгоМодеї! (Зспгбаіїпдег), спочатку для атомів водню, потім враховуючи бічні ланцюги білків і насамкінець враховуючи кістяк білків. Кінцева модель показана на фігурі 7.
Фермент містить два домени: а/р-гідролазний домен і менший "домен І". Активний сайт розташований на верхівці а/В-гідролазного домену (пляма); щілина зв'язування з субстратом знаходиться на границі між двома доменами. Два домени з'єднані гнучким лінкером, що дозволяє домену Їй відкриватися й закриватися під час каталізу. Оскільки шаблон для гомологічного моделювання, бактеріальний білок, споріднений з Т6РР (код за РОВ 1002), являє собою апофермент із порожнім активним сайтом, імовірно, що відносна орієнтація Ії домену і гідролазного домену у фактичному фермент-субстратному комплексі дещо відрізняється. (0294) Кінцеве вирівнювання білкової послідовності спорідненого з ТЄРР білка (О9НІМУ7) і білкових послідовностей Агарідор5і5 (паіапа (19925), Агабідорзів ІНнаійапа (19926), Огула заїїма (19924) і Огуга заїїма (15777) можна побачити на фігурах 11А-11С. Вирівнювання оптимізували із застосуванням літературних даних та аналізу каркаса білкової структури. Залишки, виділені бо жирним шрифтом і курсивом, у вирівнюванні білкових послідовностей нижче являються важливими залишками з великого суперсімейства галогендегідрогеназ, які допомагають підтвердити якість вирівнювання. (0295) Як описано вище, положення ТЄР, про яке повідомляли Као еї а!., було основане на помилковому припущенні та не може використовуватися в якості відправної точки для раціональної розробки мутантів ТЄРР. Замість цього ми вирішили здійснювати вручну докінг
Т6Р у гомологічну модель поетапним способом, дотримуючись принципів механізму реакції та беручи до уваги біохімічні дані.
І0296| Початкова відправна точка базувалася на тому факті що один з негативно заряджених атомів кисню групи б6-фосфату повинен зв'язуватися за допомогою координаційного зв'язку з каталітичним іоном Мд2ж- в активному сайті. Це є необхідною умовою механізму каталізу та загальною властивістю сімейства фосфатаз НАО (див., "Пе Х-гау сгувіаНПоагарніс віписіцте апа в5ресіїйсну ргойе ої НАО 5,урепатіу рпозрпопуагоїазе ВТ1666: Сотрагізоп ої рагаюдоив Типсіп5 іп В. (Неїаіотаоптісгоп." ГИ, 27., Оипамжау-Маптапо, 0. апа АйПеп, К.М. (2011)
Ргоївіпв: Бігисіцге, Еипсіп апа Віоіпіоптаїісв. 79 (11): 3099-3107). Наряду з цим кисень фосфату повинен знаходитися в безпосередній близькості від А5р121, який акцептує фосфатну групу й утворює під час каталізу перехідну фосфор-аспартатну проміжну сполуку. Розміщення кисню фосфату в екваторіальному положенні октаеєдральної координаційної сфери Маг2-- задовольняє обидві вимоги. За допомогою цієї взаємодії молекула Т6Р прикріпляється до білка, і це використовували для спрямовування процесу докінгу.
І0297| Виходячи з початкового розташування кисню фосфату в координаційній сфері Ма, стає зрозумілим, що існувала лише одна орієнтація групи 6-фосфату, яка дозволила б кисню складного фосфоефіру направлятися убік щілини активного сайту, а не зіштовхуватися із залишками, що оточують активний сайт. У цій орієнтації один з інших атомів кисню фосфату утворює водневий зв'язок з І ух289, що дозволить лізину стабілізувати виникаючий негативний заряд на фосфатній групі під час каталізу (фігура 8). Один з атомів кисню групи б6-фосфату знаходиться в екваторіальному положенні координаційної сфери Мд2 ж. А5р121, який акцептує фосфатну групу під час каталізу з утворенням ковалентної проміжної сполуки, передбачається в осьовому положенні. І уб289 безпосередньо зв'язаний водневим зв'язком з фосфатною групою, а Нібз181 знаходиться в безпосередній близькості. Обидва залишки розташовані ідеально для
Зо стабілізації виникаючого негативного заряду на фосфатному фрагменті під час каталізу.
Гомологічна модель ТЄРР рису зображена зеленими паличками, а субстрат Т6Р - жовтими.
І0298| Коли точно визначили положення й орієнтацію групи б-фосфату, мінімізували субстрат в активному сайті за допомогою МасгоМоде! (Зспгбаіпдег), утримуючи білок нерухомим. Наприкінці два здатні до обертання зв'язки між піранозними кільцями сканували за допомогою Маевіго (Зспгбаіїпдег), а отримані конформери оцінювали візуально, щоб ідентифікувати можливі взаємодії з білком (фігура 9). Ідентифікували декілька конформацій, у яких друге піранозне кільце перебувало в досить прийнятному положенні для утворення контактів з білком. Зрештою, конформер, у якого друге кільце було приблизно рівновіддаленим від залишків домену Ід, вибрали в якості найбільш імовірного й використовували в наступних аналізах.
І0299| Хоча положення й орієнтацію найближчого до групи б-фосфату піранозного кільця точно визначили за допомогою закріпленої фосфатної групи, існує значна гнучкість між першим і другим кільцями через наявність двох здатних до обертання глікозидних зв'язків (сині стрілки).
Ряд можливих положень другого кільця одержували за рахунок обертання двох зв'язків.
Конформації, у яких друге кільце зіштовхується з білком, відкидали.
ІО30О0| Розробка варіантів О5Т6РР
ІО30О1| Розробляли точкові мутації, які знижували б або повністю усували каталітичну активність ТЄРР рису (О5Т6РР-МЛ). Загалом, заплановані мутанти належать до трьох класів, які охоплюють діапазон від активності, близької до дикого типу, до повністю неактивних:
І0302| Мутація ключових каталітичних залишків, основана на ферментативному механізмі.
Мутації цього класу, як очікується, мають сильний вплив на каталітичну активність ("важкі мутанти"). 0303) Мутація залишків, залучених у зв'язування з субстратом й розпізнавання субстрату.
Мутації цього класу, як очікується, будуть знижувати обіг і/або змінювати субстратну специфічність, але не повністю усувати каталітичну активність. Для ідентифікації цих залишків потрібна точна оцінка того, де субстрат розташовується в щілині активного сайту ("м'які мутанти"). (0304) Контрольні мутації. Мутації цього класу, як прогнозується, мають дуже помірний вплив на каталітичну активність, оскільки вони розташовуються далеко від сайту зв'язування з 60 субстратом та не впливають на стабільність білка ("дуже м'які мутанти").
0305) Для всіх трьох класів використовували наступні правила розробки, щоб переконатися, що спостережувана в мутантів активність була результатом визначених змін, зроблених у білку, а не була лише наслідком загальної дестабілізації:
ЇО3О6| Якщо залишок, про який іде мова, є гідрофобним і, як передбачається, утворює неполярну взаємодію з субстратом, то зберігає гідрофобний характер залишку й збільшує об'єм. Це має привести до просторового зіткнення з субстратом і знизити афінність зв'язування.
І0307| Якщо залишок має здатність до утворення водневих зв'язків (або виступати в якості донора, або в якості акцептора), що буде дозволяти йому взаємодіяти з однією з гідроксильних груп піранози, варто або вкоротити залишок, при цьому зберігаючи здатність до утворення водневих зв'язків, або зберегти довжину приблизно такою самою і усунути здатність до утворення водневих зв'язків. (0308) Жодна модифікація залишків не припускає утворення міждоменних сольових містків.
У спорідненого з ТЄРР білка існує ряд сольових містків, утворених позитивно зарядженим залишком у домені Їй і негативно зарядженим залишком в са/рВ-гідролазному домені, і місе мегза.
Здійснення мутацій цих залишків імовірно буде дестабілізувати білок без специфічної зміни субстратної афінності або каталітичної активності.
ІЇО309| Ніякого обернення заряду: позитивно заряджені залишки не варто мутувати в негативно заряджені (і місе мегза), а скоріше в нейтральний залишок. Мутанти з оберненням заряду, як відомо, викликають локальну дестабілізацію структури білка, і, внаслідок цього, їх слід уникати. (0310) Через невизначеність положення другого піранозного кільця і того факту, що відносна орієнтація домену Їїа і а/В-гідролазного домену може змінюватися при зв'язуванні з субстратом (див. Фіг. 4), вважалося, що залишки перебувають на відстані до 10 А від змодельованого субстрату ТЄР. Працюючи в концентричних оболонках зовні від субстрату, аналізували залишки, що оточували субстрат, і розглядали їх щодо мутації, дотримуючись правил, описаних вище.
ЇОЗ311| Список точкових мутацій ТЄРР, розроблених для зниження її трегалоза-6- фосфатфосфатазної активності 0312) Важкі мутанти
Зо (0313) О315М: Азр315 є одним із двох залишків Азр в активному сайті, які утворюють хелат з каталітичним іоном Мд2-- (Фіг. 5). Заміна його на ізостеричний аспарагін буде усувати його здатність до зв'язування Мода і приводити до повної втрати активності. (0314) К289А: ГГ уз289, імовірно, утворює водневий зв'язок із групою б6-фосфату Т6Р і служить для стабілізації виникаючого негативного заряду під час каталізу (Фіг. 5). Заміна його на Аа має значно сповільнювати реакцію, приводячи практично до відсутності активності. (0315) НІ1Т81А: Нізх181 знаходиться в безпосередній близькості від групи б-фосфату Т6Р і, ймовірно, служить у якості загальної кислоти під час каталізу. Мутація у АІа буде видаляти загальну кислоту й сповільнювати каталіз практично до відсутності активності. (0316) Т318У: Тпг318 є консервативним залишком у суперсімействі НАО (Ги еї аї. 2011) і утворює водневий зв'язок із групою б-фосфату. Заміна його на менший неполярний залишок валін усуває здатність до утворення водневих зв'язків і робить зв'язування із сильно зарядженою групою небажаним. Ця мутація, як очікується, приводить до практично повної втрати активності. (0317) М'які мутанти 03181) 51594: Бег159 знаходиться в 5,8 А від субстрату й може бути залучений у взаємодії із субстратом з утворенням водневих зв'язків, або в якості донора, або в якості акцептора. Заміна його на аланін буде припиняти утворення водневих зв'язків і знижувати субстратну афінність.
ІЇО319| Е2350: Сіц235 знаходиться в домені й і в 10,6 А від субстрату. Ймовірно, він функціонує в якості донора при утворенні водневого зв'язку; заміна його на аспартат буде зберігати властивості утворення водневих зв'язків, але збільшувати відстань до субстрату, приводячи до неідеальної геометрії утворення водневого зв'язку й зниженої субстратної афінності. 03201 52420, 5242Е: бБег242 знаходиться в домені й і в 8,2 А від субстрату. Він, як передбачається, утворює взаємодії у формі водневих зв'язків із субстратом, і заміщення його на аспартат або глутамат буде зберігати полярний характер і здатність до утворення водневих зв'язків, але приводити до просторового зіткнення з субстратом внаслідок того, що аспартат і глутамат мають більш довгі бічні ланцюги. 03211) Т273Е, Т273У: Типг273 знаходиться лише в 4 А від субстрату й може бути залучений у полярну взаємодію за допомогою гідроксильної групи або в неполярну взаємодію з бічною бо поверхнею піранозного залишку. Якщо взаємодія є полярною, тоді як мутація з глутаматом
(просторове перешкоджання), так і мутація з валіном (усунення полярної групи й втрата здатності до утворення водневих зв'язків) будуть приводити до зниженої активності. Якщо взаємодія є неполярною, тоді лише перша мутація буде приводити до втрати активності, тоді як друга буде мати нейтральний ефект. (03221 М278Е, М278М: Маії278 знаходиться в 3,4 А від субстрату та, ймовірно, утворює неполярну взаємодію із передньою поверхнею піранозного кільця. Мутація у фенілаланін або метіонін буде зберігати гідрофобний характер бічного ланцюга, але приводити до сильного просторового зіткнення з субстратом і зниженої активності. 0323) Е280А: СіІц280 знаходиться в домені Їїс і в 6,7 А від субстрату. Він, імовірно, служить у якості акцептора при утворенні водневого зв'язку, і здійснення його мутації в аланін буде усувати його здатність до утворення водневих зв'язків і знижувати зв'язування з субстратом. (0324) О316Н: Азр316 знаходиться в гідролазному домені та у безпосередній близькості від субстрату, але може бути залучений у сольовий місток з К276, а не у зв'язування з субстратом.
Заміщення на гістидин буде усувати його негативний заряд і руйнувати сольовий місток, що має здійснювати лише помірні ефекти. Однак, якщо Азр316 залучений у зв'язування з субстратом шляхом акцептування водневого зв'язка, тоді вплив на каталітичну активність буде сильним. (03251) І129А, 1129М: Пе129 перебуває в безпосередній близькості від першого піранозного кільця та, можливо, утворює неполярну взаємодію із субстратом. Обидві мутації, як передбачається, будуть приводити до зниженої активності, перша через усунення гідрофобних взаємодій, друга через уведення полярної функціональної групи. (0326) Н2445: Ніз244 знаходиться в домені й у приблизно 10 А від субстрату. Вже було відомо, що мутація Н2440 сильно знижує каталітичну активність, що може зумовлюватися припиненням зв'язування з субстратом через гістидин, або зумовлюватися непрямим ефектом від обертання заряду на суміжних залишках, що можуть бути залучені у зв'язування з субстратом як такі. Мутацію із серином проводили для тестування, чи дійсно Ніз244 безпосередньо залучений у зв'язування з субстратом. Якщо це так, тоді вкорочення бічного ланцюга, при збереженні його полярного характеру, має приводити до зменшення зв'язування з субстратом.
І0327| Дуже м'які/контрольні мутанти
Зо І0328| К276А: Агд276 розташований на домені їй і може бути залучений у зв'язування з субстратом, але він, можливо, спрямований від субстрату й також може бути залучений у сольовий місток з Азр316 на гідролазному домені. Заміщення на аланін, як очікується, приводить лише до помірних ефектів. 03291 М293А: Маї 293 знаходиться в 6 А від субстрату, але направлений в бік основної маси розчинника та, що малоймовірно, відіграє якусь роль у зв'язуванні з субстратом. Мутація з аланіном є дуже консервативною та, як очікується, не має будь-якого ефекту. 0330) Виходячи з вищеописаної стратегії, розробили 22 варіанта О5Т6РР та описали їх в таблиці нижче.
Ст Я НИ УНН й -- Я (А) мутації у о Зегял2 | 80 | Можливезв'язуваннязсубстратом | Авр. | стбРР-Ма о Зегял2 | 80 | Можливезв'язуваннязсубстратом | Сії | стбРР-Маб опет29 | | Можливезв'язуваннязсубстратом | Аа. | стбРР-мМай? (пет29 | | Можливезв'язуваннязсубстратом | Авп.// | стбРР-Мапв
Продовження
ЕСЕСЯ Я ИН ЗИ і -- Я (А) мутації у оНівгад | 0 | Інактивуєкатала./// | Зег/////////// | стбРР-Майо
Зовнішні каталітичні домени на лат | | онвімоделюванняєма М 000000 стомат би 0 Мокотаредютртть | нанитетя стор кінцевий сш 0 мектареуютентя | нанятоя стор кінцевий 0331) Що стосується нумерації залишків у цій таблиці, слід звертатися до номерів залишків у білковій послідовності 15777 О5Т6РР-М/Т Огула займа. Варіанти Д5Ьб М-кінцевої й Д110 М- кінцевої з М-кінцевим усіканням 56 і 110 амінокислот, відповідно, були розроблені для тестування можливої регуляторної ролі цієї частини молекули білка. Як очевидно з вищенаведених вирівнювань, ця 110 М-кінцева частина ТЄРР властива лише рослинним Т6РР і може не бути необхідною для фосфатазного каталізу, виходячи з моделювання залишків активного сайту. (0332) Конструювання вектора й трансформація Е. соїї 0333) Кодуючу послідовність варіантів ТЄРР синтезували й клонували у вектор експресії для Е. соїї рОЕХ-6Р З для експресії в якості 5Т-злитого білка: 55 знаходиться на М-кінці білка Тб6РР. Нуклеотидні послідовності ДНК, вставлених у вектор, секвенували й підтверджували.
ІЇО334| Плазміди для експресії варіантів О5Т6РР трансформували в клітини ВІ/21 (ОЕЗ) ріуз5 Е. соїї на основі протоколу Іпмігодеп?Ф для експресії рекомбінантних білків. Коротко, розморожували клітини Е. сої на льоді й по 10 нг (в 10 мкл) кожної плазмідної ДНК додавали до клітин і обережно перемішували за допомогою постукування. Пробірки тримали на льоді протягом 15 хв. і здійснювали тепловий шок протягом 30 с при 420С у водяній бані. Після теплового шоку пробірки тримали на льоді. У кожну пробірку додавали по 250 мкл 5ОС та інкубували зі струшуванням протягом 1 години при 370С. 50 мкл продуктів реакції трансформації вносили в чашки з ІВ, що містили ампіцилін (50 мкг/мл) і хлорамфенікол (34 мкг/мл). Чашки перевертали й інкубували протягом ночі при 370С. 0335) Експресія й часткове очищення рекомбінантних О5Т6РР та їх варіантів 03361 Клітини Е. соїї (ВІ 21(0ЕЗ3)рі уз5), що несуть вектор для експресії рекомбінантного варіанта ТЄРР, вирощували до АбООнм 0,6 у середовищі Гигіа Вгоїй, що містило 50 мкг/мл ампіциліну та 25 мкг/мл хлорамфеніколу. Експресію рекомбінантного білка індукували додаванням 0,5 мМ ІРТО протягом 2 год. при 370С. Клітини збирали при 6000Ха (ротор 9А) або 3000 об./хв. у центрифузі АїПедга 6. Дебрис повторно суспендували в буфері (20 мМ Ттгів-НОЇ,
Зо рН 7,5, 150 мМ Масі, інгібітор протеази (СЕ Неайрсагеф) 1 таблетка на 50 мл буфера, 2 мкл
ДНКази І/мл буфера). Клітини руйнували за допомогою обробки ультразвуком (10 циклів з 10 с включення - 30 с вимикання, встановлена потужність на виході 3,5 (18 Вт). Під час обробки ультразвуком пробірки тримали на льоді. Лізати центрифугували при 15000 Х 49 протягом 15 хв.
Супернатанти переносили в 15 мл пробірки їаісоп і витримували на льоді перед додаванням гранул Сішаїйіопе 5ерпагозеф 4В (Тпегто зсієпійісФ)).
ІО337| Гранули СіІшайшШіопе Зерпагохзе 48 попередньо врівноважували З рази промивним буфером (20 мМ Ттгі5-НОЇ, рН 7,5, 150 мМ Масі, 1 мм ОТ). 250 мкл попередньо врівноважених гранул додавали у кожну пробірку з лізатом (7 мл) та інкубували протягом 1:30 год. при 4 в умовах повільного погойдування. Гранули СіІшайшйіопе Зерпагозе 4В, що містили лізати, переносили в хроматографічні колонки роїу-ргер (10 мл ВіогадФф)) і бульйону дозволяли повністю витекти. Смолу, що зв'язала білок, промивали промивним буфером (З рази по 5 мл) з наступним промиванням (5 мл, ЗХ) буфером для розщеплення Ргезсіввіопф (20 мМ їгі5-НСЇІ, рН 7,0, 150 мМ масі ї 1 мм ОТТ).Фермент-протеазу Ргебсіввзіоп (10 мкл в 300 мкл буфера) додавали до гранул, що зв'язали білок, та інкубували протягом 16 год. при 40С з повільним погойдуванням.
Супернатант збирали та рециркулювали З рази через колонку, а останній збір тримали на льоді для витікання гелю й вимірювання концентрації. (0338) Концентрацію білка вимірювали за допомогою наборів ВСА (Ппепто ЗсіепійісФі. 20 мкл кожного вихідного розчину білка змішували з 4Х барвником 505 і проводили 505-РАСЕ (4- 12 95 градієнтний гель) із застосуванням буфера МОР5 при 200 В для оцінки збагачення й забезпечення однорідності очищеного білка. Кінцеву процентну чистоту частково очищеної
ТбРР та її варіантів визначали за допомогою автоматизованого електрофорезу Віо-Най
ЕхрегіопФ). (0339) Активність О5Т6РР та її мутантів
І0340| Активність О5Т6РР та її варіантів вимірювали на основі стандартного протоколу аналізу. Коротко, відповідну кількість білка одержували з вихідного розчину й поміщали в 96- лункові планшети. Реакційні суміші (буфер з 2 мМ кінцевою концентрацією ТЄР у реакційній суміші; склад буфера 10 мМ Ттгі, рН 6,7, 2 мМ Мосі?2 і 0,5 мг/мл ВЗА) одержували й тримали на льоді перед змішуванням із препаратом ферменту. Придатну кількість розведеного ферментного білка додавали до реакційних сумішей (застосовували концентрацію білка 0,05, 0,1 або 1 мкг у загальному реакційному об'ємі 100 мкл) в 9б6-лунковому планшеті. Реакційні суміші інкубували при 370С протягом різних інтервалів часу (5, 10 ї 20 хвилин) і фермент у реакційній суміші деактивували шляхом нагрівання при 950С протягом 5 хв. Інактивовані реакційні суміші в 96-лунковому планшеті центрифугували протягом 1 хвилини при 700 об./хв., потім 80 мкл кожного реакційного розчину переносили в лунки, що містили 80 мкл води. Суміші переносили в лунки планшета для фільтрації Місго5сгееп-НМ, а 96-лунковий планшет біопех застосовували для збору фільтрату для аналізу НРІ С. Специфічну активність розраховували на основі стандартної процедури. 03411 Оіопех НРІС
І0342| Систему для іонної хроматографії біопех ІСб5-3000 застосовували для виявлення трегалозного продукту, утвореного внаслідок дефосфорилування субстрату Т6Р в присутності ферменту Т6РР. Трегалозу відокремлювали за допомогою аналітичної колонки СагроРасфФ РА1 із градієнтом елюювання 15 хвилин при швидкості потоку 1 мл/хв. Зразки вводили в колонку
СагроРас РА, урівноважену 100 мМ Маон, при швидкості потоку 1 мл/хв, з наступним 0-200
ММ градієнтом ацетату натрію в 100 мМ Маон від З до 8 хв., потім 200 мМ-750 мМ градієнтом ацетату натрію в 100 мМ Маосн від 8 до 10 хв. і знову 100 мМ Маон від 10,5 до 15 хв. Трегалозу, відділену за допомогою хроматографії, кількісно визначали шляхом інтегрування області піків із застосуванням програмного забезпечення СпготеїеопФф). 03431 Графік даних і оцінка специфічних активностей варіантів ТЄРР
Зо І0344| Досліджувані реакційні суміші інкубували протягом трьох різних інтервалів часу, і кожна точка на графіку являє собою середнє трьох незалежних досліджуваних реакційних сумішей. Фонову кількість (утворення трегалози за відсутності ферменту, негативний контроль) відслідковували й віднімали від трегалози, отриманої в досліджуваній суміші з доданим ферментом. До нанесених на графік даних підбирали поліноміальне рівняння (У-АХ2БХ).
Швидкість реакції оцінювали на основі кута нахилу (2АХя5) вищевказаного рівняння в 1 хвилину. (0345) Швидкість реакції - отримана трегалоза (мкМ)/хв. і переведена у мкмоль/хв. (0346) Специфічна активність - швидкість утворення трегалози (мкмоль/хв.)/мг ТбРР.
ІО347| Порівняння трегалоза-6-фосфатфосфатазних активностей варіантів Т6РР, як визначається згідно аналітичної процедури, описаної вище. 00001111 |мкмольТте/хв/мгТбРР девідносноО5Т6РРМ/Т З
Ме17,О5Т6РР-МЛ2ЯА 7 |7777777777111158771Ї11111111111180111сСс21С
Продовження 00001111 | мкмольТге/хв/мгТбРР | ОбвідносноО5Т6РР-МУТО (
Мме10,О5ТбРР-МАТВЕ | 77777770 | 777777771717171171067ССсС21С
Мео5,О5Т6РР-Б2Я2Е | 7777777777/л000677777 7 Ї77771717171717171711103СсС21С
Меї2,О5Т6РР-К2ВЯА.//|77777777771000 7 Ї71171717171111111001сСс1С (Ме22, О5Т6РР-ДТ1О М-кінцевий |Невизначали.їд//-:/
ІО5ТбРР-02, Огула займа ТбРР-02; АЇбРР-А, Агарідорзіз ІНайапа ТбРР-А; АТбРР-В,
Агарідорзіє іНайапа ТбРР-А; ЕсТРО-Т6РР, злитий білок трегалоза-б6-фосфатсинтази й фосфатази ЕзсПегіспіа осоїї, і ЗСТ6РРІТР5-2)|, зЗасспагоптусев5 сегемізіає, трегалоза-6- фосфатфосфатаза)
Приклад 7: Іп міго оцінка можливих білок-білкових взаємодій між Т6РР і ТРБ і додаткова оцінка низхідних ефектів. (0348) Для оцінки того, чи може Т6РР з рису взаємодіяти з різними компонентами ТР5- комплексу дріжджів, буде розроблятися дріжджова модельна система. Мапдегсаттеп еї. аї. (ЕБиг. у. Віоспет. 182, 613-620 (1989)) внаслідок спільного очищення ТР5 і Т6РР з
Засспаготусез сегемізіає установили, що ці білки є частиною єдиного біфункціонального білка.
Веї! єї. а. (Тне доштпаї ої ВіоіодісаІ Спет. 273; Мо. 50, рр 33311 -33319 (1998)) додатково описали склад і провели функціональний аналіз комплексу ТЄРР/ТР5 в Засспаготусез сегемізіае. Також було показано, що ТР5 дріжджів може утворювати комплекс із ТЄРР, отриманою з Агабідорзіб (див. Модеї еї. аІ. Те Ріапі доигпаї! 13; Мо. 5, рр. 673-683). ТРО-комплекс дріжджів містить чотири елементи ТРУО1, ТРБ2, ТРБЗ і Т511. ТРО1 містить білковий домен з ТР5 активністю, а ТР52 містить білковий домен з Т6РР активністю. Функцією як ТРБЗ, так і Т511 є регуляція функції
ТРО-комплексу. Не обмежуючись теорією, припускають, що за допомогою розробки дріжджової моделі можна оцінити додаткові модифікації іп мйго, що можна застосовувати для розробки білків, пептидів, поліпептидів або хімічних речовин, які могли б підвищувати утворення Т6Р, тим самим регулюючи потік цукрів у репродуктивні тканини та/або запускаючи різні інші каскади, які забезпечують збільшену врожайність і/або стресостійкість при експресії в рослині або застосуванні щодо неї. Мета способу: (А) протестувати, чи може ТЄРР рису взаємодіяти з різними компонентами ТРебБ-комплексу дріжджів, і, крім того, визначити, як ці взаємодії впливають на каталітичні активності кожного компонента, шляхом вимірювання низхідних продуктів (тобто, трегалози, ТР); (В) розробити іп міїго аналіз для тестування того, чи взаємодіє
Т6РР рису з ТРБ рису; (С) експресувати модифіковану ТЄРР рису в маїсі для виділення й опису характеристик отриманого ТЄРР/ТР5-комплексу, (0) застосувати дані, отримані з (А), (В) і/або
Зо (С) для проведення біоінформатичного аналізу з метою ідентифікації додаткових модифікацій, які можна зробити в молекулі ТЄРР для подальшого полегшення одержання Т6Р. Також передбачається, що нуклеотиди, які кодують комплекс як такий, можна розробити з даних, які зібрані у ході зазначених експериментів. (03491) Оцінка взаємодії ТЄРР рису з компонентами ТР5-комплексу дріжджів, що мічені ТАР 0350 Вектори експресії будуть конструювати окремо для експресії або в дріжджах, або в Е. соїї, при цьому вони міститимуть полінуклеотидну послідовність, що кодує немодифікований білок ТЄРР, представлений в 5ЕО ІЮО МО: 2, і модифікований білок ТЄРР, представлений в ЗЕО
ІО МО: 6. Також можна розробити конструкт для інших модифікованих ТЄРР для оцінки різних ефектів мутацій, наприклад, нуклеотидної послідовності, що кодує ТЄРР, таку як показана у
ЗЕО ІЮО МО: 4, або будь-яку іншу Т6РР, яка була модифікована, щоб мати знижену активність.
Потім ці конструкти можна трансформувати як у бактерії, так і в дріжджі для подальшої оцінки.
ІОЗ351) У таблиці нижче розглянуті різні загальнодоступні штами дріжджів, що мають білки, мічені ТАР, які можна застосовувати для оцінки взаємодій між експресованими Т6РР рису та різними компонентами ТР5З-комплексу дріжджів. Штами дріжджів з міткою ТАР можна придбати від постачальника, такого як ТПпепто 5сіепійс. Білки, мічені ТАР, можна легко виявляти за допомогою добре відомого в даній галузі техніки вестерн-блотингу. Для визначення того, чи взаємодіють варіанти ТЄРР рису (дикого типу й модифіковані) з будь-яким компонентом ТР5- комплексу дріжджів, можна одержати екстракти, що містять як білок ТОРР рису, так і відповідні білкові компоненти ТРО-комплексу дріжджів, мічені ТАР. Потім білки можна виділити з цих екстрактів і провести вестерн-блотинг шляхом виявлення за допомогою антитіла до ТАР для визначення того, чи відбувається білок-білююова взаємодія між будь-якими модифікованими
Т6РР рису й компонентами ТРО-комплексу дріжджів (тобто на білок-білкову взаємодію буде вказувати більший, ніж очікувалося, розмір бенду). Наступна таблиця описує штами дріжджів, що містять білки, мічені ТАР, які можна виявляти шляхом аналізу вестерн-блотинг за допомогою антитіла до ТАР. 03521 Після ідентифікації білок-білюових взаємодій між ТЄРР рису й компонентами ТР5З- комплексу дріжджів будуть проводитися експерименти для визначення того, як різні модифіковані й немодифіковані ТЄРР впливають на функцію ТРУЗ-комплексу дріжджів. ТР52 компонент дріжджів (тобто частина, що має ТЄРР активність) ТРО-комплексу будуть заміщати або немодифікованим білком ТЄРР рису (ЗЕО ІЮ МО: 1), або модифікованими білками ТбРР рису (ЗЕО І МО: 3, 5, 7). Потім ці модифіковані комплекси можна експресувати у дріжджах для подальшої оцінки того, як ці заміщення впливають на загальну функцію ТРО-комплексу, шляхом вимірювання рівнів ТЄР і трегалози. Для визначення різних впливів кожного заміщення в екстрактах із дріжджів можна вимірювати рівні Т6Р і рівні трегалози за допомогою стандартних способів НРІ С, відомих у даній галузі техніки. Теоретично вважається, що комплекси, які містять модифіковану ТЄРР рису, будуть проявляти збільшення рівнів ТбР у порівнянні з комплексом, що містить немодифіковану ТЄРР рису.
ІО353| Приклад 8: Оцінка модифікованих білків ТЄРР у рослинній тканині за допомогою тимчасової експресії в рослині. 0354) Для додаткової оцінки впливів модифікованих ТЄРР (тобто, модифікованих Т6РР зі
Зо зниженою активністю) на утворення Т6Р і трегалози в рослинній тканині будуть застосовуватися аналізи тимчасової експресії в рослині. Спосіб аналізу тимчасової експресії в рослині, описаний у заявці на патент США 2010/0319089, включеній в даний документ за допомогою посилання, можна застосовувати для оцінки різних ТЄРР та їх впливу на утворення Т6Р і трегалози.
Загалом, бінарні конструкти, що містять модифіковані ТЄРР, такі як представлені в ЗЕО ІЮ МО 2, 4 або 6, будуть інфільтруватися й тимчасово експресуватися, фактично як описано в заявці на патент США 2010/0319089. Після тимчасової експресії модифікованих Т6РР рівні Т6Р і трегалози будуть відслідковувати протягом декількох днів (тобто, 1-10 днів) за допомогою
НРІС. Крім того, різні ТРБ/ТбРР-комплекси можна конструювати й оцінювати за допомогою тимчасової експресії кожного відповідного комплексу в рослинній тканині.
ІЇО355| Скринінг подвійних гібридів дріжджів: для ідентифікації поліпептидів або інших молекул, які взаємодіють або зв'язуються при спільній експресії в клітині, можна додатково застосовувати підходи з подвійними гібридами ссавців або дріжджів (див., наприклад, Вагієї,
Р.Г. еї. аІ. МеїШой5 Еплутої, 254:241 (1995)). Для додаткової ідентифікації та визначення характеристик будь-яких білок-білюових взаємодій, що виникають між модифікованими білками
Т6РР і ендогенними рослинними білками, можна проводити скринінг подвійних гібридів дріжджів.
Приклад 9: Компонентний аналіз урожайності рослин, які експресують модифіковані білки
Тб6РР 0356) Стрес, викликаний посухою при цвітінні, знижує врожайність внаслідок збільшення безпліддя, зменшення числа качанів на рослину та зерен на рослину. Таким чином, трансгенні рослини маїгсу, які експресують модифікований білок, показаний в ЗЕО ІЮО МО: 4, під контролем промотору О5МАЮО5б, тестували на двох польових ділянках в умовах обробки із чотирма різними варіантами стресу: 1) добре зволоження без втрати врожайності внаслідок стресу, викликаного посухою, 2) помірний стрес, 30-45 95 втрата запланованої врожайності контрольної рослини внаслідок стресу, викликаного посухою при цвітінні, 3) середній стрес, 60 до втрата запланованої врожайності контрольної рослини внаслідок стресу, викликаного посухою при цвітінні, і З) сильний стрес, 8095 втрата запланованої врожайності контрольної рослини внаслідок стресу, викликаного посухою при цвітінні. Дані збирали щодо числа рослин на акр, числа рядів зерен на качан, числа качанів на рослину, числа зерен на рослину й ваги на зерно.
Тестували вісім різних гібридів.
І0357| Усі трансгенні й контрольні рослини тестували на суміжних попарних дослідних ділянках у полі. Пари дослідних ділянок з густотою стояння менше 50 рослин виключали.
Відмінності обчислювали для кожної ознаки. Імовірності розраховували за допомогою парного 1- тесту для окремих гібридів у межах кожного випробування на кожній ділянці, а також для груп втрати врожайності для кожного різновиду. Чотири з восьми протестованих гібридів показали позитивну відповідь щодо врожайності за умов сильного стресу, викликаного посухою при цвітінні. Два гібриди показали негативну відповідь щодо врожайності. Збільшення врожайності в чотирьох гібридів було незмінно обумовлене збільшенням числа качанів на рослину й числа зерен на рослину. Два з чотирьох гібридів також показали зниження безплідності. Наявність модифікованого білка ТЄРР допомогла пом'якшити вплив стресу, викликаного посухою при цвітінні, шляхом зниження безплідності, збільшення числа качанів на рослину й збільшення числа зерен на рослину.
Приклад 10: Іп Міго активація О5Т6РР-ММТ у присутності О5Т6РР-Н2г440
Підвищена трегалоза-6-фосфатфосфатазна активність (іп міго) О5Т6РР-М/Т у присутності її каталітично неактивного варіанта, О5Т76РР-Н2г440 (5ЕО І МО: 4)
ІО358) Вплив доданої О5Т16РР-Н2440 на каталітичну властивість О5Т6РР-УЛ/ вимірювали за допомогою аналізу трегалоза-6-фосфатфосфатазної активності, описаного вище в прикладі 6.
Коротко, придатну кількість (як зазначено в надписах таблиці) білків (О5Т6РР-УМТ і О5Т6РР-
Н2г440), частково очищених з Е. соїї, що експресує рекомбінантні варіанти О5Т6РР, інкубували на льоді протягом 10 хвилин в 9б6-лункових планшетах. Субстрат трегалоза-6-фосфат (кінцева концентрація 2 мМ) змішували з реакційним буфером (склад буфера 10 мМ Тті5, рН 7,0,12 мМ
МОСІ2) і витримували на льоді перед змішуванням з ферментом. 85 мкл реакційних сумішей додавали до ферментативних сумішей (загальний об'єм реакції 100 мкл) в 96-лунковому планшеті. Реакційні суміші інкубували при 370С протягом різних інтервалів часу (як зазначено в
Зо надписах таблиці). Кожну реакцію проводили в трьох повторностях. Фермент у реакційній суміші деактивували нагріванням при 950С протягом 5 хвилин. Неактивні реакційні суміші в 96- лунковому планшеті центрифугували протягом 2 хвилин при 700 об./хв., потім по 80 мкл кожного реакційного розчину переносили в лунки, що містили по 80 мкл води. Суміші переносили в лунки планшета для фільтрації Місгобсгееп-НМ і фільтрат збирали для аналізу
НРГС і оцінки трегалози, що утворилася внаслідок реакції з фосфатазою.
ЇО359| Таблиця: Підвищену трегалоза-6-фосфатфосфатазну активність О5Т6РР-ЖШТ спостерігали в присутності варіанта О5Т6РР, О5Т6РР-Н2г440.
ІО360О| Кількість трегалози (мМ), що утворилася в реакційній суміші внаслідок дефосфорилювання трегалоза-6-фосфату при інкубації (час інкубації - колонка 1) з О5Т6РР-МТ (0 мкг/мл; колонка 2), О5Т6РР-Н2г440 (10 мкг/мл; колонка 3) або сумішшю (колонка 4) О5Т6РР-
М/Т (1 мкг/мл) і О5Т6РР-Н2гА40 (10 мкг/мл)
Таблиця 1111 | 7 Трегалоза щоутворилася(мїіМ).д/-:/ | | /|/ 01 0 1 0 1 0 1 0 10 1 0 20 | 2553 | 11 | 8955 | 16 | 06 | 19 60 | 368 | 59 | г2ггол 1 44 | 08 | 83 5ідм - стандартне відхилення, розраховане на основі набору даних від трьох повторностей для кожної реакції.
Таблиця: Вплив концентрації О5Т6РР-Н2440 на активацію трегалоза-6-фосфатфосфатазної активності О5Т6РР-МТ.
ІОЗ361) Кількість трегалози (мкМ, колонка 2), що утворилася в реакційній суміші внаслідок дефосфорилювання трегалоза б-фосфату при інкубації О5Т6РР-М/Т (1 мкг/мл) із вказаною концентрацією О5Т6РР-Н2440 (колонка 1). Кількість трегалози (мкМ, колонка 3), що утворилася бо при інкубації О5Т6РР-Н244О0 окремо у реакційній суміші за відсутності О5Т6РР-М/Т, при концентрації, що зазначена в колонці 1. Реакції здійснювали протягом 20 хвилин.
Таблиця 61112811 11111100
Т6РР активність усереднювали на основі набору даних від трьох повторностей для кожної реакції. па - не визначали
ІЇО362| Підвищену трегалоза-6-фосфатфосфатазну активність О5Т6РР-М/Т (іп міїго) спостерігали в присутності її каталітично неактивних варіантів, включаючи О5Т6РР-Н2г440,
О5ТбРР-Н2445 і О5Т16РР-5242Е. Спостережувана активація ТЄРР у присутності О5Т6РР-Н2гА440 залежить від концентрації О5Т6РР-Н2440 у реакційній суміші. Ступінь активації ТЄРР варіювала серед протестованих варіантів ТЄРР. Заряд на амінокислотних залишках поблизу 244-242 може буди залученим у цю алостеричну взаємодію. Приблизно 3-кратне збільшення Т6РР активності спостерігали, коли О5Т6РР-М/Л аналізували в присутності О5Т6РР-Н2г440. Для порівняння, 1,7- кратне збільшення Т6РР активності спостерігали, коли М-кінцеву усічену О5Т6РР-Ю56МТ змішували з О5Т6РР-Н2440. Це може вказувати на можливу роль М-кінцевої частини О5Т6РР в алостеричній взаємодії.
Приклад 11: Експресія модифікованої ТЄРР у пшениці
ІЇО363| П'ять конструктів (див. таблицю нижче) варіантів О5Т6РР трансформували в пшеницю, використовуючи протокол трансформації за допомогою Адгобасіегійт (М/011013764) із застосуванням системи селектовних маркерів РМІ (патент США Ме5767378; патент США
Мо5994629) для одержання стабільних трансгенних об'єктів для оцінки ознаки. Три варіанти
О5Т6РР: О5Т6РР, послідовність дикого типу; О5Т6РР-Н2440 (5БО ІЮО МО: 3) з однією модифікацією Н2г440 і О5Т6РР-І129Е (5ЕО ІО МО: 5) з двома модифікаціями АТО2М і І129БК.
Серед цих п'яти конструктів 20569 і 20833 розробляли із застосуванням - енхансерів, щоб спробувати змінити рівень експресії О5Т6РР і націлити на інші тканини в рослинах у порівнянні з 20571 і 20832 без енхансерів. 12194 слугував у якості контролю дикого типу для порівняння з варіантами Т6РР.
Таблиця
Конструкти Т6РР, які застосовували в трансформації пшениці рО5МАОБ6: еємММ е355:сТбРР: , ,
Зо егМу являє собою енхансер з промотора гена 355 вірусу мозаїки ранника е355 являє собою енхансер з промотора гена 355 вірусу мозаїки цвітної капусти
І0364| Трансформанти аналізували за допомогою первинних аналізів Тадтап для ідентифікації об'єктів з низькою кількістю копій і об'єктів, що не містять векторні кістяки.
Ідентифіковані об'єкти переносили в теплицю для висаджування. Усі інші позитивні об'єкти з великою кількістю копій і наявністю векторного кістяка виключали. Об'єкти з наявністю ознаки додатково аналізували за допомогою вторинного Тадтап для підтвердження однієї копії вставленого гена та за допомогою ЕГІЗА і ЗОДКТРСК стосовно експресії РМІ і ТЄРР для відбору об'єктів. ЕГІЗА і ДКТРСК стосовно РМІ і/або Т6РР застосовували з метою відбору трьох наборів об'єктів, які експресували білок або транскрипт (на низькому рівні, середньому і високому), для одержання покоління Т1. З конструктом 20571 одержали в цілому 154 об'єкти. З конструктом 20832 одержали в цілому 129 об'єктів. З конструктом 12194 одержали в цілому 84 об'єкти. З конструктом 20569 одержали в цілому 161 об'єкт. З конструктом 20833 одержали в цілому 89 об'єктів. 0365) Стрес, викликаний умовами навколишнього середовища, може відбутися в будь-який час життєвого циклу рослини в полі. Посуха під час раннього періоду циклу росту та на стадії цвітіння може викликати значні проблеми з урожайністю в багатьох регіонах вирощування пшениці. Молоді рослини пшениці не можуть протистояти обмеженому зволоженню, а слабке зав'язування насіння може бути зумовлене стресом, викликаним нестачею води, на стадії повного цвітіння. Під час раннього росту рослини та при повному цвітінні дуже бажана стійкість до посухи. Таким чином, на цих двох стадіях розвитку трансгенні рослини з Т6РР будуть піддаватися стресу.
І036б6| Відповідь рослини на нестачу води можна оцінити за допомогою вимірювання водного режиму в листках (відносного вмісту вологи), температури рослинного пологу, фотосинтезу, транспірації, провідності листків і використання грунтової вологи. Після обробок стресом у рослин вимірювали біомасу (висоту рослин) і кількість паростків, або при дозріванні визначали врожайність надземної сухої речовини, урожайність зерен і масу насіння для визначення компонентів урожайності, а також індекс урожайності в порівнянні з нетрансгенними контрольними або нульовими рослинами для оцінки збільшення врожайності та компонента врожайності за допомогою генів ознаки. За допомогою системи одержання зображень шляхом серійної зйомки з часовим інтервалом можна фіксувати відповідь на стрес, викликаний нестачею води, щоб показати відповідь популяції рослин на стрес, викликаний нестачею води, у сегрегуючій популяції Т1.
ІО367| У лабораторії та вегетаційній камері на стадіях проростання й сіянців можна застосовувати оцінку стійкості до стресу, викликаного нестачею води, для скринінгу культиварів пшениці й тритикале із застосуванням РЕС (Зарга, єї аї., 1991, Стор Зсієпсе 167, 23-28, Віит сеї а!., 1980, ЄирпНуїйса 29: 727-736). Насіння, що проростає, і сіянці, що вирощуються гідропонним способом, можна піддавати впливу розчину РЕС зі зростаючим градієнтом концентрацій, що
Ко) забезпечує осмотичний стрес від -0,3 до -0,6 МПа, або не забезпечувати водою для перевірки трансгенних організмів на стійкість до посухи. 0368) Наступні фенотипічні дані (1, 2 і 3) збирали за допомогою аналізу з відсутністю забезпечення сіянців водою. Для 30 рослин з кожного об'єкта записували й відслідковували генотипічні дані (зиготність). Записували фенотипічні дані вибраних рослин й установлювали їхню кореляцію із зиготністю. Будь-яку очевидну фенотипічну сегрегацію в умовах стресу тестували за допомогою критерію хі-квадрат стосовно окремої вставки з очікуваним співвідношенням 3:1. Можна очікувати, що об'єкти з очікуваним сегрегаційним співвідношенням мають поліпшену стійкість до стресу.
Висота рослини й підрахунок числа паростків:
Висота рослини: від кінчика пучка стебел до основи стебла.
Кількість паростків: підрахунок числа нових паростків 22 см.
Оцінки впливу посухи на фазі проростання: (ІККІ, 1996) 000 |Симптомивідсутні//////77777777777777777Дужевитривалі.7/:///Зе
Висихання кінчика у більшості листків поширилося на й . 4 ДОВЖИНИ (9 |Усірослиниявнозагинули.ї 0 ІДужечутлив//://Н-
Вимірювання відносного вмісту вологи: (КУМС)
ВМС (ов) - МЕМУ-ОМ У (ТМУ-ОМ х100
РМ (сира вага): 4-6 прапорцевих листків, що повністю розпустилися/листкових дисків - 10- 157 їі зважити.
ТУУ (вага у тургорі): гідратувати листок протягом 4 год. у чашці Петрі за допомогою да-води при кімнатній температурі й освітленні та зважити.
ММ (суха вага): висушувати в печі при 80 "С протягом 72 год. і зважити після охолодження в ексикаторах.
Зеспопіеїйса єї а. (1988) Стор Зсієпсе 28:526-531.
ІЇО369| Двадцять один об'єкт 20571 ТО відібрали для скринінгу сіянців за відсутності забезпечення водою й для одержання насіння 12. Сім об'єктів відібрали як об'єкти з низькою експресією трансгена, сім об'єктів відібрали як об'єкти з середньою експресією трансгена і сім об'єктів відібрали як об'єкти з сильною експресією трансгена. Аналогічне число об'єктів ТО буде відбиратися для всіх інших чотирьох конструктів (20832, 12194, 20833 і 20569) з метою скринінгу за відсутності забезпечення водою на стадії сіянця у Т1 і стадії повного цвітіння у 12.
ІЇО370| У п'яти об'єктів 20832 здійснювали аналіз експресії транскрипту за допомогою
ЯаКТРСК стосовно О5Т6РР-І129Е і РМІ, їі він показав, що Т6РР-І129Е експресувалася лише в репродуктивних тканинах 3 з 5 об'єктів, тоді як РМІ експресувався в усіх рослинах.
Ме Ме РМІ до Т6РР до рослини конструкта внутрішнього внутрішнього Тканина контролю (х1000) контролю (х1000) листка листка
З | 20832 | 1093895 | 000 | Прапорцевийлисток. зорове ізяяо | 0ою руду винне листка 73 | 20832 | 740,58. | 000 | Колосокзнасінням/ 73 | 20832 | 150465 | 000 | Колосокбезнасіння./ 74 | г2гов3а | 3368654 | 000 | Прапорцевийлисток: ера няно | ою руду винне листка 74 | 2гов3а | 44483 | 000 |Колосокзнасінням/ 74 | 20832 | 148028 | 000 | Колосокбезнасіння./ 75 | 20832 | 446378 | 000 | Прапорцевийлисток:/ листка
Рослина номер 4 є негативним контролем, що містить РМІ, а не ген ТбРР.
Приклад 12: Експресія модифікованої ТЄРР у сої (0371) Для поліпшення врожайності дводольних рослин можна використовувати трегалозний шлях. Наприклад, соя (Сіусіпе тах) реагує на посуху скиданням квіток, скиданням бобів, зменшенням кількості насінин на біб, недорозвиненням насінин всередині бобів та зменшенням розміру насінини (Гіи еї аї., 2003). Одержання стійкої до посухи рослини сої буде підвищувати врожайність внаслідок запобігання втраті квіток, бобів, насіння та/або збільшення розміру насіння. Цю технологію можна застосовувати до сільськогосподарської культури, такої як соя, шляхом ідентифікації регуляторної послідовності гена ознаки, що специфічно функціонує у квітках, які розвиваються, розробки касети експресії на основі одного або декількох кандидатних генів та зв'язування касети експресії з трегалоза-6-фосфатфосфатазою дикого типу або модифікованою. Сімейство генів МАЮОЗ є чудовим джерелом регуляторної послідовності гена ознаки, що функціонує у квітках, які розвиваються (аск Т (2001) Ріапі Мої Віо! 46:515-520).
Сімейство генів МАЮ5 є висококонсервативним у рослинах (Мипеїег еї аї., (2002) Мауаїса 47:287-301; Ое Во єї аї., (2003) Ттепа5 Ріапі бсіепсе 8:475-483). Первинну генетичну інформацію від модельних рослин можна застосовувати для ідентифікації ортологічних генів сої (Неснпі єї аї. (2005) Ріапі РНувіої 137:1420-1434). Комбінування інформації про білкову послідовність і послідовність ДНК із генетичними даними або даними експресії дозволяє
Зо фахівцям у даній галузі розробляти касети експресії, що строго регулюються, які функціонують у квітках сої, наприклад, з промоторами ОСТЕР (Ниапо еї аї. (2009) Сепе 438:40-48); АРЕТАГА
1-подібними промоторами (Сі еї а!., (2011) У Ріапі Рпузіої! 168:2251-2259); промотором О5МАО5 (патент США 8129588). Наприклад, касету експресії О5МАЮО5ЗБб або її варіант можна застосовувати безпосередньо в трансгенній сої для забезпечення можливості прояву ознаки. 0372) Після розробки придатного вектора експресії можна одержати трансгенну рослину сої, що містить касету експресії за допомогою добре відомих методик, таких як спосіб трансформації, опосередкований бомбардуванням часток (Наді еї аї. (1996) Різпт! Сей АВеропе 15:500-505), або опосередкована Адгобасіегішт трансформація із застосуванням зрілих або незрілих цільових насінин (заявка на патент США 20040034889; М/008112044). Наприклад, касети експресії, що містять О5Т6РР і варіантну кодуючу послідовність під контролем промотора АФАМОИШЗ5 Агабідорзвів, зв'язують із касетою селектовного маркерного гена ЕРБР5 з утворенням бінарного вектора для опосередкованої Адгобасіегішт трансформації. Регенеровані саджанці тестували на присутність як маркерного гена ЕРБР5, так і трансгенних послідовностей
Т6РР шляхом кількісного аналізу Тадмап РСК (Іпобат еї аї., (2001) Віотесппідне5 31(1) 132-4, 136-140). Трансгенні рослини вирощували у теплиці для зав'язування насіння. 0373) Потім трансгенні рослини сої можна піддавати скринінгу щодо відповіді на дефіцит води із застосуванням наступного аналізу: насіння 11, відібране як таке, що містить одну копію трансгена, вирощують до початку розвитку репродуктивних органів. У цей момент рослини розділяють на дві групи, першу групу не піддають стресу, а друга група одержує половину тієї кількості води, яка необхідна для підтримки росту у разі відсутності стресу. Кожна група складається з нульових, гемізиготних і гомозиготних сиблінгів. Рослини утримують за цих умов протягом трьох-чотирьох тижнів. Під час цього періоду щодня відстежують розвиток квіток і зав'язування бобів. Наприкінці періоду дослідження дані, отримані для кожного генотипу, порівнюють. Імовірно, між генотипами в групі, що не зазнала стресу, будуть незначні відмінності або відмінності будуть відсутні. Група з дефіцитом води буде демонструвати, що позитивні стосовно прояву ознаки рослини мають більше квіток і більше бобів на рослину в порівнянні з нульовими рослинами. Альтернативно, гомозиготні позитивні стосовно прояву ознаки й нульові сиблінги можна вирощувати на тестових дослідних ділянках із застосуванням стандартних процедур культивування. Дослідні ділянки розділяють на блоки, що не зазнають стресу, і блоки з дефіцитом води. Блоки з дефіцитом води будуть одержувати половину кількості води, необхідної під час періоду цвітіння. Дані щодо врожайності для кожної дослідної ділянки збирають наприкінці сезону вегетації та порівнюють. Дослідні ділянки, позитивні стосовно прояву ознаки, будуть проявляти поліпшену врожайність у порівнянні з дослідними ділянками з нульовими рослинами в групі з дефіцитом води.
Приклад 13: Визначення профілю експресії трансгенних рослин з О5Т6РР з високою врожайністю
Досліджені типи тканин та зразки
ІЇО374| Збирали сім типів тканин, а саме; листок, листок нижче качана, вузол, основне стебло, основний качан, вторинний качан і стебло. Досліджували три педігрі-лінії: контроль, що містить нетрансформований різновид, О5Т6РР-І12917 (ЗЕО ІО МО: 5) і О5Т16РР-Н2г440 (5ЕО Ір
МО: 3). Три педігрі-лінії або вирощували в умовах гарного поливу, або піддавали стресу, викликаного посухою. Для кожної тканини/стану відбирали по десять біологічних повторностей, що дало загалом 420 зразків. Однак, через різні технічні причини відбирали не всі зразки. В цілому були доступні 407 зразків для очищення й мічення РНК для гібридизації на мікроматрицях.
І0375| Для очищення, оцінки якості, мічення та гібридизації РНК застосовували стандартні протоколи. Не всі зразки характеризувалися достатньою якістю або кількістю РНК для гібридизації на мікрочіпах. Усього обробили й сканували 392 матриці. (0376) Стандартизація й попередня обробка даних:
ІО377| Для цього дослідження застосовували Маїіге АПутеїгіх СепеСпПір, зуз'уМОо0б07а.
Необроблені файли формату СЕЇ! для всіх експериментів аналізували із застосуванням спеціального протоколу, який аналізує якість мікроматриць на основі ряду критеріїв, експлуатаційних властивостей і виправлень на фон і стискає дані за допомогою алгоритму
Віосопдисіог КМА. Внаслідок цього аналізу б предметних стекол виявилися потенційно низької якості. Однак загальні зображення чіпів були достатніми для аналізу, а контрольні співвідношення зондів 5/3 були придатними, щоб дані цих експериментів не виключили. Для цього дослідження застосовували спеціальний СОЕ (Спір Оезосгіріоп Рйе), розроблений для картування зондів щодо генома маїсу. СОР також робить картування відносно Опідепе5 від
МСВІ ї кКДНК повної довжини від МаіїгесОВ. Для визначення фонового рівня шуму аналізували ряд наборів контрольних зондів. Імпульси контролів з генів Васійй5 не використовували під час бо гібридизації, тому ці набори зондів можна розглядати в якості фонового шуму. Фон визначали як два стандартні відхилення вище середнього значення всіх наборів зондів Васіїйй5. Визначений рівень фонового шуму використовували як граничне значення для даних. Граничні значення встановлювали для виключення будь-яких наборів зондів, які характеризувалися нижчою інтенсивністю сигналів, ніж фон в усіх експериментах. Набори зондів залишали для аналізу, якщо сигнал перевищував фоновий щонайменше в З експериментах. Для оцінки якості експериментів і визначення будь-яких можливих відхилень застосовували аналіз головних компонентів та ієрархічну кластеризацію. 0378) Аналіз шляхів
ІЇО379| У спробі забезпечити біологічний зміст результатам одновимірних статистичних тестів, проводили аналізи насичення із застосуванням подібних тестів. Існує багато способів проведення аналізу шляхів, однак для цих експериментів найбільш придатним способом був
Аналіз Насичення Генів (Сепе Зеї Епгісптепі Апаїузіб5) (О5ЕА) із застосуванням програмного забезпечення, доступного від Вгоай Іпбійше, що має назву О5ЕА. Алгоритм С5ЕА вимагає, щоб гени були кластеризовані в набори генів згідно з деякими біологічними критеріями. Для цього випробування використовували два такі набори генів. Спершу набори генних моделей з генома маїсу розподілили на набори генів згідно групуванню на шляхи, як пропонує Маї2еСус (на наступному свите раїпжау дтатапе ст МАЕ). Другий перелік наборів генів розробили за рахунок наборів зондів на виготовленому за замовленням СепесСпПір маїсу із застосуванням спеціального файлу СОЕ, який застосовували для стискання інформації про зонди для цього дослідження. Набори зондів, які представляли собою транскрипти від генних моделей з генома маїсу, групували в набори генів згідно з елементами Сепе ОпіоЇоду, які встановлювали для генних моделей від Маіїле СОВ (на наступному сайті: таіедар.ог9/) Алгоритм О5ЕА впорядковує гени з 2 різних зразків для створення ранжованого переліку генів, і ця інформація застосовується для визначення того, чи знаходяться гени в межах ранжованих переліків у загальнодоступних наборах генів. Р-значення розраховують на основі ймовірності того, що гени можуть бути знайдені в ранжованих переліках наборів генів внаслідок випадковості. Потім Р- значення коректують шляхом множинного тестування з метою одержання рівней хибнопозитивних результатів для всіх наборів генів. Для цього аналізу всі парні порівняння піддавали О5ЕА із застосуванням шляхів від МаїгеСус і елементів бСепе Опіоіоду (50) від
Зо Маїігес ОВ. Крім того, аналізували лише набори зондів, що представляли собою окремі гени.
Тобто, набори зондів, які, ймовірно, картують декілька генів, відбраковували для С5ЕА.
ІО380| Багатовимірна статистика
ІО381| Ряд багатовимірних аналізів проводили для визначення найбільших джерел дисперсії даних. Аналіз основних компонент (РСА) усіх даних показав, що найбільшим джерелом дисперсії був тип тканини. Листок і тканина листка під качаном (тканини-джерела) явно відокремлені від інших акцептуючих тканин.
І0382| Для додаткового визначення джерел дисперсії окремі типи тканин аналізували за допомогою РСА. Результати вказували на те, що посуха мала сильний вплив на зміну генної експресії у всіх досліджуваних тканинах, можливо, за винятком тканин вторинного качана. Слід зазначити, що для тканин вторинного качана була доступною менша кількість зразків. Внаслідок нерівномірного відбору зразків цього типу тканини генна експресія могла бути виміряною не точно. Систематична дисперсія, зумовлена не педігрі-лінією або стресом, а, наприклад, відбором зразків або розташуванням дослідної ділянки, могла мати значний вплив на генну експресію в тканині вторинного качана. Хоча педігрі-лінія не була основним джерелом дисперсії в межах окремих типів тканини, вона мала явний вплив і була очевидною в другій головній компоненті в більшості тканин. Цікаво, що більшу дисперсію, зумовлену педігрі-лінією, виявили в зразках, які піддавали стресу, викликаному посухою. Хоча не завжди була присутня явна компонента, пояснювана лише педігрі-лінією, з РСА було очевидно, що більша дисперсія між педігрі-лініями була у разі стресу, викликаного посухою, у порівнянні з умовами хорошого поливу. Наприклад, з РСА зрозуміло, що перша РС розділяла зразки, які вирощували в умовах гарного поливу, від таких, що піддавалися стресу, викликаному посухою. Друга головна компонента, що пояснює найбільше джерело дисперсії після видалення РС 1, показує поділ підданих дії посухи зразків за педігрі-лінією. Вона не є такою явною як поділ зразків на такі, що зазнали стресу, викликаного посухою, у порівнянні з рослинами, які добре поливали. Однак набагато більш щільне групування (тобто, з меншою дисперсією) спостерігається у досліджених контрольної та О5Т6РР-Н2440 педігрі-ліній від добре политих зразків у порівнянні зі зразками, що зазнали дії посухи. Тенденцію компоненти 2 можна головним чином пояснити поділом зразків від контрольних і О5Т16РР-Н2440 педігрі-ліній за умов стресу, викликаного посухою. Це можна інтерпретувати як те, що контрольні та О5Т6РР-Н2440 педігрі-лінії мають подібні бо патерни генної експресії за умов хорошого поливу, але відмінні профілі генної експресії за умов стресу, викликаного посухою. Це узгоджується із забезпеченням користі щодо врожайності за умов стресу, викликаного посухою. Подібне збільшення дисперсії за умов стресу, викликаного посухою, виявляли в інших протестованих тканинах і більшу частину дисперсії можна пояснити педігрі-лінією.
І0383| Загалом, за допомогою багатовимірних аналізів ідентифікували основні джерела дисперсії, такі як тип тканини та стрес, викликаний посухою, з меншим впливом на відмінності в генній експресії, зумовлені педігрі-лінією (тобто, наявністю трансгена). Вплив педігрі-лінії тестували шляхом порівняння О5Т6РР-Н2440 з контрольною гібридною лінією. У більшості протестованих тканин, як акцептуючих, так і тканин-джерел, дисперсія, яку можна було пояснити педігрі-лінією в зразках, зібраних від рослин, що зазнавали стресу, викликаного посухою, була більшою ніж в зразках добре политих рослин. Таким чином, відмінності в генній експресії між основним об'єктом і контрольною лінією були найбільш очевидними в рослинах, що зазнавали стресу, викликаного посухою. 0384) Експресія генів ТЄРР і ТРЗ
ЇО385| Оскільки охарактеризований об'єкт включав ген Т6ЄРР, який експресувався за допомогою промотора О5МАЮБ5Бб, цікаво було визначити рівень експресії трансгена та/або експресії ендогенних генів ТЄРР. Також на експресію Т6РР може впливати експресія трегалоза- б-фосфатсинтази. Обидва білки, як відомо, кодуються у маїсі декількома членами сімейства генів. Робилися спроби проаналізувати лише набори зондів, які картують або окремі ізоформи транскриптів, або множинні ізоформи в межах одного локуса, для визначення експресії окремих членів сімейства генів. Усього вісім наборів зондів, які представляли Т6РР, і чотирнадцять наборів зондів, які представляли ТР5, аналізували щодо рівня експресії в усіх тканинах, як тих, що зазнавали стресу, так і тих, що не зазнавали стресу, тих, що походили від контролю, та тих, що походили від О5Т6РР-Н2440. Виявили, що в будь-яких тканинах ні набори зондів для ТЄРР, ні набори зондів для ТРО не мали особливо сильної експресії у об'єкті О5Т6РР-Н2440, що дозволяє припускати, що трансген у об'єкті не має сильного впливу на гени трегалозного шляху, і що не спостерігається помітно вищий рівень експресії будь-якого ендогенного гена Т6РР.
Незрозумілим є те, чи в достатній мірі для виявлення надійного сигналу будь-який з наборів зондів гібридизується з трансгенною Т6РР в об'єкті. Можна очікувати більш високого рівня
Зо експресії ТЄРР у лінії трансгенного об'єкта. Ці результати підтверджували за допомогою прямих
ТТЕ5Т у кожній тканині, яку тестували відносно диференціальної експресії генів ТЄРР і ТР5 між контролем і О5Т6РР-Н2440. У жодному з тестів не було будь-якої ізоформи, що характеризувалася більш ніж 2-кратною різницею в експресії між 2 педігрі-лініями в будь-якій тканині з будь-яким ступенем статистичної достовірності (Р-значення « 0,1). Однак існував явний доказ того, що ізоформи обох генів у деяких тканинах реагували на стрес, викликаний посухою. Цікаво, що експресія однієї іоформи ТЄРР, ОКМ2АМ20347280 ТО1, репресувалася у відповідь на стрес, викликаний посухою, у тканині листків (джерело), однак, експресія збільшувалася у відповідь на стрес, викликаний посухою, у тканині основного качана й тканинах основного стебла. Також, існувала виражена тканинна специфічність у наборах зондів для представників ТЄРР. Наприклад, ген 5КМ2М205080354, що кодує Т6РР, найбільш сильно експресувався в тканині вторинного качана; ЗКМАМ20112830 ледве виявлявся у всіх тканинах за винятком стебла, при цьому один альтернативний транскрипт, СЕМ2М20112830 Т07, імовірно, також експресувався у вузлі; ОКМАМ2о174396 ТО01 найбільш сильно експресувався в тканині вузла, а ОКМ2М20178546 Т01 найбільш сильно експресувався в основному качані.
Існували подібні тканиноспецифічні й чутливі до посухи члени сімейства ТР5, які були представлені наборами зондів. Слід відмітити, що ген ЗКМАМ20019183, який характеризувався низьким рівнем експресії в усіх тканинах, включався у відповідь на стрес, викликаний посухою, у тканинах вузла, основного качана й основного стебла. Відносно високі рівні експресії декількох генів ТР5 виявили в тканині вторинного качана. Цікаво, що значної відмінності в експресії цих генів у відповідь на стрес, викликаний посухою, у вторинному качані не було, навіть для генів, які були чутливими до посухи в інших тканинах. Оскільки для конструкта, який застосовували для цього об'єкта, застосовували ген Т6РР з рису, імовірно, що жоден з наборів зондів не відповідав послідовності достатньою мірою, щоб гібридизуватися з наборами зондів маїсу на матриці. Таким чином ймовірно, що представлені результати відображають рівень експресії лише ендогенних генів.
ІО386) Одновимірний аналіз і попарні порівняння
І0387| Ряд попарних порівнянь проводили за допомогою Т-тесту Велча для визначення гена, що диференційно експресувався у 2 зразках (контроль і О5Т6РР-Н2440). Виконувані порівняння були зосереджені на вихідному проекті експерименту для тестування відмінностей в експресії в бо усіх тканинах між контрольною та О5Т6РР-Н2440 лініями за умов хорошого поливу або посухи
(7 тестів для кожного стану), і також тестували відмінності в генній експресії в рослинах, які вирощували в умовах хорошого поливу або посухи, в будь-якій педігрі-лінії у всіх тканинах (14 порівнянь). Результати тестів наведені в таблицях нижче. Для наборів зондів, про які повідомлялося, що вони диференційно експресувалися, у Т-тесті Велча Р-значення було меншим за 0,01, а кратність зміни (співвідношення середніх значень біологічних повторностей) була більше 2. Додатково, для визначення того, чи були наявні будь-які гени, що мали суттєво відмінну відповідь на посуху, як результат впливу педігрі-лінії, запускали лінійну модель для тестування ефектів взаємодії. Результати в таблиці 4 вказують на число наборів зондів, які мали достовірний ефект взаємодії "вода Х педігрі-лінія" з ЕОК меншим за 0,05. Загалом, результати повністю підтверджують результат багатовимірних аналізів для всіх тканин, за винятком вторинного качана, що показує великий вплив посухи на експресію генів. Цікаво, що у порівнянні з контрольною лінією у об'єкта О5Т6РР-Н2440 в усіх тканинах спостерігали більшу кількість генів, чутливих до посухи (таблиця 1). Ці результати можуть указувати на те, що об'єкт
О5ТбРР-Н2440 є більш чутливим до стресу, викликаного посухою, на рівні змін генної експресії.
Таблиця 1
Узагальнення результатів тесту Велча: хороший полив у порівнянні з посухою й диференційно
Тканина Умова Генотип Тест експресованих наборів зондів посуха посухою посуха посухою посуха посухою качана посуха посухою качана посуха посухою качана посуха посухою посуха посухою посуха посухою посуха посухою
Основний Хороший полив або Вода в порівнянні з качан посуха КОНТРОЛЬ посухою 1310 качан посуха посухою качан посуха посухою стебло посуха посухою
Основне Хороший полив або Й Вода в порівнянні з стебло посуха ОБТвРРАТ2ЗЕ посухою 3143 стебло посуха посухою качан посуха посухою качан посуха посухою качан посуха посухою
Продовження таблиці 1 й диференційно
Тканина Умова Генотип Тест експресованих наборів зондів посуха посухою посуха посухою посуха посухою
Диференційно експресовані набори зондів - набори зондів з Р-значенням з тесту Велча « 0,01 ї зміною кратності (співвідношення середніх значень зразків з 2 протестованих груп) » 2.
Таблиця 2
Узагальнення результатів тесту Велча: хороший полив: КОНТРОЛЬ у порівнянні з ОТО5Т6РР-
Нг440 й диференційно
Тканина Умова Генотип Тест експресованих наборів зондів
Контроль КОНТРОЛЬ
Листок Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! З об'єктом О5Т6РР-І129Е
Контроль КОНТРОЛЬ
Листок Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! 23 об'єктом О5Т6РР-Н2440 л Контроль КОНТРОЛЬ исток нижче . . . . . качана Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! 23 об'єктом О5Т6РР-І129Е
Контроль КОНТРОЛЬ
Листок нижче - й . . й качана Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! 15 об'єктом О5Т6РР-Н2440 - Контроль КОНТРОЛЬ
Основний - й . . й качан Хороший полив порівнянні з|порівнянні З об'єктом О5Т6РР-І129Е - Контроль КОНТРОЛЬ
Основний - й . . й качан Хороший полив порівнянні з|порівнянні З об'єктом О5Т6РР-Н2440
Контроль КОНТРОЛЬ
Вузол Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! 146 об'єктом О5Т6РР-І129Е
Контроль КОНТРОЛЬ
Вузол Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! 19 об'єктом О5Т6РР-Н2440
Контроль КОНТРОЛЬ
Основне - й . . й стебло Хороший полив порівнянні з|порівнянні З об'єктом О5Т6РР-І129Е
Контроль КОНТРОЛЬ
Основне - й . . й стебпо Хороший полив порівнянні зі порівнянні З 111 об'єктом О5Т6РР-Н2440 - Контроль КОНТРОЛЬ
Вторинний - й . . й качан Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! 4542 об'єктом О5Т6РР-І129Е - Контроль КОНТРОЛЬ
Вторинний - й . . й качан Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! 342 об'єктом О5Т6РР-Н2440
Продовження таблиці 2 й диференційно
Тканина Умова Генотип Тест експресованих наборів зондів
Контроль КОНТРОЛЬ
Стебло Хороший полив порівнянні зі порівнянні З 111 об'єктом О5Т6РР-І129Е
Контроль КОНТРОЛЬ
Стебло Хороший полив порівнянні зі порівнянні Кк! 196 об'єктом О5Т6РР-Н2г440
Таблиця З
Узагальнення результатів тесту Велча: Посуха: КОНТРОЛЬ у порівнянні з ОТО5Т6РР-Н2г440 й диференційно
Умова Генотип Тест експресованих наборів зондів
Контроль КОНТРОЛЬ
Листок Посуха порівнянні з|порівнянні Кк! 20 об'єктом О5Т6РР-І129Е
Контроль КОНТРОЛЬ
Листок Посуха порівнянні з|порівнянні Кк! 102 об'єктом О5Т6РР-Н2г440
Контроль КОНТРОЛЬ
Листок нижче й . . й об'єктом О5Т6РР-І129Е
Контроль КОНТРОЛЬ
Листок нижче й . . й об'єктом О5Т6РР-Н2г440 - Контроль КОНТРОЛЬ
Основний й . . й об'єктом О5Т6РР-І129Е - Контроль КОНТРОЛЬ
Основний й . . й об'єктом О5Т6РР-Н2г440
Контроль КОНТРОЛЬ
Вузол Посуха порівнянні з|порівнянні З 21 об'єктом О5Т6РР-І129Е
Контроль КОНТРОЛЬ
Вузол Посуха порівнянні з|порівнянні Кк! 188 об'єктом О5Т6РР-Н2г440
Контроль КОНТРОЛЬ
Основне й . . й об'єктом О5Т6РР-І129Е
Основне Контроль | КОНТРОЛЬ стебпо Посуха порівнянні з|порівнянні Кк! 218 об'єктом О5Т6РР-Н2г440 - Контроль КОНТРОЛЬ
Вторинний й . . й об'єктом О5Т6РР-І129Е - Контроль КОНТРОЛЬ
Вторинний й . . й об'єктом О5Т6РР-Н2г440
Контроль КОНТРОЛЬ
Стебло Посуха порівнянні з|порівнянні Кк! 30 об'єктом О5Т6РР-І129Е
Продовження таблиці З й диференційно
Умова Генотип Тест експресованих наборів зондів
Контроль КОНТРОЛЬ
Стебло Посуха порівнянні з|порівнянні Кк! 298 об'єктом О5Т6РР-Н2440
Таблиця 4
Узагальнення генів з ефектом взаємодії посухи й педігрі-лінії
ЕТНО ПН НН ее
Тканина й й . у «- генотип:вода наборів зондів (ЕОК » 0,05)
ГЕНИ Кін іі Бабій НИ ТИН
Листок 21
Нг440 качана нНг440
Нг440
Нг440
Нг440
БЕН Лі вабній ПИ ТИН
Нг440
Нг440 0388) Хоча багато генів, що є чутливими до посухи, були загальними для обох педігрі-ліній, існувало багато генів, які виявляли лише в якості диференційно експресованих під впливом стресу, викликаного посухою, в О5Т6РР-Н2440. Виявили, що багато генів є специфічними для
О5Т6РР-Н2440 у відповідь на стрес, викликаний посухою. Результати подібні результатам лінійної моделі для виявлення генів, які мали ефект взаємодії між двома експериментальними факторами, посухою і педігрі-лінією. Причиною відмінності в числах генів у 2 аналізах є, ймовірно, те, що відсікання, яке застосовувалося в ТТЕ5Т, мало Р-значення менше за 0,01, а статистичне відсікання для даних у таблиці 4 встановлювало рівень хибнопозитивних результатів менший за 0,05. Рівень хибнопозитивних результатів, розрахований із урахуванням виправлення для множинних порівнянь, є більш точним і більш надійним способом визначення генів, які диференційно експресуються. Лінійна модель є кращим тестом ефектів взаємодії, ніж перекриті результати генів, виявлених як диференційно експресованих на основі Т-тестів, оскільки модель поєднує всі дані у факторній схемі експерименту. Однак об'єднання результатів обох тестів може являти собою дієвий спосіб ідентифікації генів з диференційними відповідями на 2 фактори, як буде описано більш докладно. 03891) Основні відмінності між педігрі-лініями виявляли під час стресу, викликаного посухою, а також в акцептуючій тканині, включаючи тканину вузла. Лінійні моделі показували значні ефекти взаємодії у вузлі, основному стеблі, а також пагоні. Об'єднані результати дозволили припустити, що більшість ефектів взаємодії відбувалися внаслідок відмінностей у тому, які гени змінювалися при стресі, викликаному посухою, у двох протестованих педігрі-лініях. В умовах хорошого поливу було менше відмінностей у генній експресії між контролем і О5Т6РР-Н2г440. (0390) Аналіз шляхів
ІЇО391| У спробі забезпечити біологічний зміст результатам одновимірних статистичних тестів, проводили аналізи насичення із застосуванням аналогічних парних тестів. З5ЕА проводили з даними для тестування стосовно насичення шляхів від Маїі7еСус та елементів 5О від МаїгесОЮВ. Оскільки відзначалося, що тканина вузла становить особливий інтерес,
Зо результати О5ЕА легше інтерпретувати на основі цієї тканини. Слід зазначити, що аналізи шляхів, яким приділяється увага в даному документі, зосереджені на парних порівняннях із застосуванням усіх даних у моделі О5ЕА для збільшення потужності тесту на насичення в порівнянні із застосуванням заздалегідь обчислених переліків генів. Проведені парні порівняння були зосереджені на відмінностях контролю й О5Т6РР-Н2440, попередні тести Велча яких вказували на відносно небагато відмінностей у генній експресії. Таким чином, рівні хибнопозитивних результатів (РОК), розраховані для більшості порівнянь, були у цілому високими, хоча деякі розраховані Р-значення показали статистично достовірні результати. Слід зазначити, що хоча Р-значення є достовірними, у зазначеному наборі генів д-значення ЕОК можуть являти собою кращий показник статистичної імовірності шляхів або елементів СО, що є насиченими. Таблиці 5 і 6 указують на набори генів, насичені в О5Т6РР-Н2440, у порівнянні з контролем у тканині вузла при стресі, викликаному посухою.
Таблиця 5
Аналіз насичення наборів генів: Тканина вузла за умови посухи: КОНТРОЛЬ у порівнянні з
О5Т6РР-Н2г440
КОМПЛЕКС РОЗЩЕПЛЕННЯ ГЛІЦИНУЇ (77777111 10000 04
ПЕНТОЗОФОСФАТНИЙ ШЛЯХ (ОКИСНЮВАЛЬНА ГІЛКА): | 000 | 2
ПЕРЕТВОРЕННЯ ФОЛАТУ Іс 1000 1 из
ВІДНОВЛЕННЯ СУЛЬФАТУ ЇЇ (АСИМІЛЯЦІЙНЕ)
ПЕРЕНЕСЕННЯ ЕЛЕКТРОНІВ ВІД МАСН ДО ЦИТОХРОМ ВО ОКСИДАЗИ 0,01 1 0,24
Таблиця 6
Аналіз насичення наборів генів: Тканина вузла за умови посухи: КОНТРОЛЬ у порівнянні з
О5Т6РР-Н2г440 по
КИСЛОТУ "
ФОСФОГЛЮКОНАТДЕГІДРОГЕНАЗНА а по ПОД Я
АКТИВНІСТЬ "
НЕГАТИВНАРЕГУЛЯЦІЯ ТРАНСКРИПЦІЇ, ДНК-ЗАЛЕЖНА | 000 | 023
ПОЛІМЕРАЗИ ІЇ " "
ПЕНТОЗОФОСФАТНИЙШУНТЇГГ/::/777717171717171717111111111л11111000 | о4
ГЛЮКОЗА-б-ФОСФАТДЕГІДРОГЕНАЗНА АКТИВНІСТЬ. | 000 | 055 щ 0392) Тестували й інші тканини, однак у тканині вузла в умовах стресу виявили шлях, що представляє особливий інтерес, а саме пентозофосфатний шунтовий шлях. Він вартий уваги, тому що являє собою шлях, на якому виробляється енергію, та може змінюватися в рослинах
О5Т6РР-Н2440 лише в умовах стресу, викликаного посухою. Однак, не обмежуючись теорією, він може являти собою один з потенційних механізмів, які дозволяють об'єкту О5Т6РР-Н2г440 підтримувати вироблення енергії з одержанням більш високої врожайності в умовах посухи. Він явно вказує альтернативний шлях вироблення енергії, на який впливає стрес, викликаний посухою, лише у об'єкта та необов'язково у контрольної гібридної лінії. Ферменти в пентозофосфатному шляху кодуються багатьма генами, і було показано, що їхня транскрипція є чутливою до ряду різних впливів. Цей шлях, як відомо, залучений у продукування вторинних метаболітів. ІНШИМ шляхом, ідентифікованим у різних акцептуючих тканинах як такого, що диференційно регулюється в О5Т6РР-Н2440, була асиміляція нітратів або метаболізм азоту. Це було цікаво виявити у зв'язку з результатами попередніх досліджень, включаючи дослідження зміненого метаболізму ліній маїсу за умов стресу, викликаного посухою, які ідентифікували біосинтез амінокислот, зокрема амінокислот, що накопичують М, з більш високою концентрацію в рослинах, які піддавали дії посухи. Крім того, у останньому дослідженні виявили, що рослини, які зазнають постійного М-стресу, були менш чутливими до дефіциту води, ніж рослини, які вирощували за оптимальних М-умов. Однак, не обмежуючись теорією, рослини, які піддають стресу, викликаному посухою, можуть використовувати нормальні метаболічні шляхи для М, зокрема продукцію амінокислот, що запасають М, для асиміляції можливо токсичних концентрацій аміаку, який може накопичуватися в тканинах рослин, що зазнають стресу, викликаного посухою. Таким чином, ці дані дають підтвердження гіпотезі детоксикації аміаку й дозволяють припускати, що об'єкт О5Т6РР-Н2440, який експресує Т6РР, можливо, може бути краще пристосованим до використання механізму адаптації до дефіциту води з метаболізмом
М.
І0393| Ідентифікований транскрипт карбоангідрази з підвищеною експресією в О5Т6РР-
Нг440. (0394) Тестували дві гіпотези про те, як аналіз профілю генної експресії може виявляти відмінності між об'єктом О5Т6РР-Н2440) і контролем. Перша гіпотеза полягає в тому, що особливий набір генів за умов стресу, викликаного посухою, специфічно змінюється в О5Т6РР-
Н2г440р, та не змінюється в контролі. Такий набір генів за умов стресу, викликаного посухою, може відігравати більшу роль у збільшенні врожайності лінії О5Т6РР-Н2440 у порівнянні з контролем. Цю гіпотезу тестували за допомогою результатів парних порівнянь і лінійної моделі.
Результати Т-тестів з таблиці 1 порівнювали з генами, ідентифікованими в лінійній моделі (таблиця 4). Тестували два зразки тканин, оскільки вони мали істотне число генів, які мали ефект взаємодії 2 факторів: стресу, викликаного посухою, і педігрі-лінії. У тканині вузла в
О5Т6РР-Н2440 за умов стресу, викликаного посухою, загалом 1127 генів мали змінену експресію, але у контролі за умов стресу, викликаного посухою, вони суттєво не змінювалися.
Перекривання цього переліку генів і 152 генів з ефектом взаємодії "посуха Х педігрі-лінія" лінійної моделі тканин вузла (таблиця 4) визначило 22 набори зондів, на які специфічно впливає стрес, викликаний посухою, лише в об'єкті О5Т6РР-Н2440. Одним з ідентифікованих генів був ген карбоангідрази. Також включеними в перелік були декілька наборів зондів, анотованих як серинпептидази, а також ген аквапорину ТІР4. Окремий аналіз такої самої лінійної моделі ідентифікував карбоангідразу як таку, що має більш високу експресію в О5Т6РР-Н2г440, незалежно від типу тканини або забезпечення водою. Дійсно, карбоангідраза була представлена 2 наборами зондів у короткому списку наборів зондів з більш ніж 2-кратною або більшою експресією в О5Т6РР-Н2440 в усіх типах тканин. Більшість інших генів в цьому переліку являли собою невідомі гени. Ці дані дозволяють припускати, що щонайменше один член сімейства генів карбоангідраз експресується на вищому рівні в О5Т6РР-Н2440, ніж в контролі. Експресію цієї ж карбоангідрази аналізували у додаткового об'єкта, О5Т6РР-1129БЕ, і виявили, що вона є специфічною для О5Т6РР-Н2440. 0395) Результати аналізів для всіх тканин і умов виявили відносно короткий перелік наборів зондів (28), які значною мірою були присутні в лінії О5Т6РР-Н2440 у порівнянні з контрольною лінією. Щонайменше два набори зондів у цьому переліку були анотовані як карбоангідрази.
Карбоангідраза є активною у С4-фотосинтезі, допомагаючи рослині фіксувати діоксид вуглецю й асимілювати вуглець. У О5Т6РР-Н2440 виявили дуже суттєве збільшення експресії щонайменше однієї ізоформи одного члена сімейства СА.
ЇО396| Хоча викладений вище винахід для ясності й розуміння був досить докладно описаний у вигляді ілюстрації й прикладу, для фахівців у даній галузі буде зрозуміло, що на практиці в межах об'єму доданої формули винаходу можна здійснювати конкретні зміни й модифікації.
ПЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«05 Сичджента Інк. вашу, Щи кон, Джонатан Рендал
Нучето, Майкл л, «йОм СПОСОБИ ПІДВИШЕННЯ УРОЖАЙНОСТІ ТА СЄТРЕСОСТІЙКОСТЬ РОСЛИНИ «130 73248 МО РОСТ «1850ю 17 «1705 Расепжтт весія 3.5 «М 1 «кі» 6 «ки? ДАЕ «213 Огуга затісв «00 аціуаєттої дсаасаявстє асстутєсаєс вссовсссяв своасаассао ссвосаутгу 00 іїжодоаспасс ходссстсвааа сстовсасСад ттсесареса госссдахно єсастосаде 135 тсЄтоусасва Зевса: саутавастс заззесвабуо «ачессттає савтоазаєта 150 сттцуатуєса солватесіс агсасстсос вопасоасговз атукадсвніс таусоводас 240 авітсатста ааовадаайця ссстоєттає зосусєттуча тоссавазеу ссстстасх з00 клеуЄктссє тсаавоасазає сусадссау зсасвавоба азвазаєсоє таку еста збо
Ччасічсочсп ясасастоіс осстаттосо чЗакчатсстко асазазчсайс дасатссес 420 підатсовоао стостотаво азасоттося ааугасттсс єсастасват стаксвоспуях во авутессзсва асзавцаєссюв толатесоса адаасідааво жассттваєта воссодаво: за) сакчуктатов асатватодс веспесадеєва авссатоаус всадсастоа авададевиає БОЮ садцисавтс тсттссавсс тосасасоас Їбтстоссза гбассозтдв дустассавео бе їссбстексаоє австтЯссвЯ гЗаваєстдаз азсосаавсто їтЧадавсвла саавастстує 2
Ччистстуїас ассаєсосяй согсосивад адпяді вода аасіочесес асядессока во 7 засовлачусас тодачуастт: гостсассте азадсааеса всодасачає дассскадва 540
Чітсасссяд гбатсзаєто узасвазва аавастасує аяссесваст ссвассаско 08 аадосізацта ассстаЯзазла гоасоатсссс аїстасатто чадасвасва застачасова 560 спасасттіса аботастксо асадсуаває гусодітату оаатасталоє ттсасавдаєе 1050 сссавабваз стЗавуєссті стастсасса аозозіссат стазадетдат подоттеске ОВО апяттЕСЕТтоЯєЄ гоаовтЧодя дадодсасєтса асакодп 1456 «2105 2 «ів 374 «вїйх ВІЛОК І «13 Оруха «аїтуй «4005 мет джр іви зег дя Заг озЗег вка маф тів ТВг одер вк ма! Аїд тт стрпранинка 2
1 З 10 15
Бегобіп сів ен цем біу б1у гей рго бек лей цей мес бій РНе баг 725 30 аб меї РРО ау сіу Туг Зег Звг Заг сту Ммеї Аб5поуа! б1у Уа! Заг 33 40 45
Ага сви цу ї1їв сій бін ма? беу ма! Аєл о біу Се о їеб Ар АТа Меї
Бо іа ер Бак ек РКО АР Аг АК їви АЛей уаї АТа РОе С1у 10 Ав; пз г 5 о
АЗпояаг век бій СІЧ бі Аяровга Аа Туб чек АТ Тер Меї АТа губ 85 зо З5
Сув Ре бек Ата ей АТа ЗебоРне уч бій Іїе баї АТа 5егб АТа їй щюЮ 105 МВ су рух ух Ті АїЯ уд! РН Без деротує АБО Обіу тб осей бек вро
Мо 120 125 16 Ууаі АБр ярого Ар уз АВ Уа! Ме бе Рго Уа! Меж Аго Аа 130 135 140 діа уаії Аг Аяп ма! АТа був Туг ре Рко бве Афа ЇїЗ1е ба! зегосіу 175 159 155 і60 дга его АгО Ап обу5 Уа! Ре біб ейпе Уа! уз цер гу сіц їеу Ту т65 175 175
Тув Аїв бі бег Ні сіу Меб Азр т1іе Меб Аа бо бег о АТа АвпОНівї 150 185 цю сів нів его АТа бій вуз ЗБК бує бій А А5а еп РВЕ біп о рго лід 195 200 205
Ні АЮ РВЕ бен о Рго Мек гіє АВ сту ма! ТйР огуб 5ег їеш вен 5ІВ 710 215 220 чаї Уаї зег о сіу лів бів сту Аа о тне Ууаї сти Ачп ди Був орає бує
Ал 230 238 2 ущі заг омаії ні тує АРЯ Ай УйІ АТа бі ім о Авротво ув рей ма 245 50 252
АЇа Агд цен маї Азпобій Уа! Кекоій Аїд вве Бго дгя ен обу жа 250 255 то тн оАзп сіу АГО мес ма) вен бо ма) йедовка Уві ЇїЄ Ар тер Або страниха «и
275 280 285 цуз біу Бу5 Аїа Уді бій РБе бен оцей сій баг бер біу бео Аби лер 299 5 300 чек сій дай маї 16 о рго тіє Тус 116 СТУ АБр оАБр о Ако ТАг дбросім за» Зо 315 320
Ар о АЇВ РНе рух Уді Сед Аг біп Ага да Су бі тує бу Те. Сем 325 330 3355 маг Бек бій Уві Бко суб с ТВг осів Аа Ре Туг бек ев Аго АБ зчо0 345 350 го чес бій Уа! меж бій Ре Кеш А5п Рпе Кен Уві ду Ткрогуї Був 355 зо 365 ніз его Уа! зо «2105 3 «туї І1Т13 -й1и» ДНК Й «її» бРуха ваті хх З зсцазессда дсзасадсац сссратоате ассуаєсссоу кочсовстяа ссадсаоста 5 сідсосозсс сассавосад сстоатоєсво сттзасотог госсовосоє ставадсває ї30 «дспосатача асотодасЯє дазссеасстО ааваттовад ааотостооі двасачсско і1850 стсчасЯсда гозаайосад садсссосос соссудсстоа асутадсаєе говдсваачає 240 пцасвасвасі аадайдааца тссдвсугаї восасотевя тоазсадаато сссоадсаса зо ссцасовВосЄ ттавасноаї тогоосуває дсасвудаса азаава тує оса еста БО чЧаєтатчасо дсассстово сссдаткосо батозїссад атсвазосовс дакозассся 325 пасвдавостіо содсотсосСо сазсесуесЯ зайтсалітес совесоєдат тугавасаде 480 сннассрса асаваоїаЕЕ Боватєсота взастоваай вастатаєса зосоодсвоє 540 сакпосатсд аїастаєцас оссозоасосо аассатояває абаососода зайзвассада 500 сацосовасс са тсазчес досасаєояї гЕстоссдя їдавсчатоа заоєдвассвав бо засстаєтиас ачогоадссвю содсахвуай Зфосоассо тадаавнасай саватевкос 723 шілассотазЗз агтатсосяа ссесодсоЧах азапатсоча дастоскайс псасестаато 780 засовафкусє тедачосоге сссосодєста азастоуасса есоуссосає зусастдадаа 40 агасасесоо суаттоаста байтяаазоає азассуєФічо аахетстосе асададсста З00 аасстовасо атадссавая сасооаскссо акттагсатко зсватаатсо сассопеоая 960 датесогтта вафіустосо єсаусосває стеосоустато зсатестдає дашссаваєу 1920 седзйзуава ссдазасаєь стасадесту сусодакссба усавадтойє одвасьтсту 1080 страница а пасплтєтаєю хасостдоза заазсатвоє чо 1313 «ка а кві Ви жаїйз БІЛОЮ к?"1і5» Окуха заїіха «каз 4 меж два сви зе ден обеє Зевс ово Уа! Т1і6 Тк А5рорко Ма! Аза 11е 1 5 16 15 оет осіп бій беу Мен сб1у сіу гемовго бегойчп Гео мес си Ве 5ег 70 75 30 туаї Меї Рго б1у су туг яее 5ег Бей йіу меж аа Ууаі бу щі век 430 45 до їжу муз їТе бів біо ма? се) уаї а5а б1у ец ї ен АБроАТа меї 5 су ек оБес заеє рго Аг Аго АгЯ є аа маї АТа вне аіу бій Ар 55 70 25 дО)
БП обЗег о бег біц бів біб ар ого Аїа Тук обев АТа ткромеє дія Гу5 85 Зо 5
Се РГО Беє АТа Цей Аза чего РНЄ ув сів ті уаї АТВ бег Ата сти 109 1015 о с1у цу бух ЇТе Аз Ма! РкКе іеч дер тук 4б5р о д1у Таб орео бег го 115 129 125 16 чаї Авройзрорго дер 1/5 АТ а! Меї сег орво Уаі кек ака да 330 135 1450 лів ма! АкЯ Аба маї АТа бух Туг Ре Рго твгоАЇВд тІ1є Маії бек СТУ 145 150 155 160 дга Зв" Аг аяпобув Уа ве бій вве омаї куб сце бує ст ве тує 165 170 175 ту дій Оу 5ег Ні б1У Мех Ар Т16 Меї АТа РгО 5ег АТа АБпоОНіб 152 185 190
ЗТй нія 5ег діа сій губ дег був о1й Ата деп Кей РН бій го АїВ 195 по 205 нів Ар РЕ мб РКО Мет тів Ар сію ма! ТНК руб бег о кей цей с18 219 23 еВ
Уаї Уві б5ег Ту ті сіб сім Аїа ївйе ма! бір Ап дп рух Вп Су
Страница ї
725 230 235 240
УВІ Зек ма! Ар Тук Аго Ап о уаї АТа би бух дер терогув Ево Уві! й 750 255
Азїа вгоа генома! дей сін МЗї ев біу Афа вве рго аку ен бух ха 250 255 27 тТаг депо біу алго мех Уа! рен обі Уа! Аго вто аг Те Аротко АБр а7з «ва 285 руху сує Аа Уа біб рРБе іен о бей біп бер оБеч о біу бе) АЗп АБО 29в газ 00 зе іш двп ма! ІТ вго тіе тує тів сту Аве Ар оАгЯ Тгоавр бів 05 зій 51 320
АБр'оАТа вме уз маї цез АгЯ СТИ АКа дей був пі1у Туг бБІіу тів (ев 323 336 315 чаї заго сіп ма! Бко суб бю тв бід діа РНЄ тук 5еє ей Ага дер юЮ 345 350
Бга баг сім ма! Меї сій Ре рез Азп о РНє Сез Уаї Аго тер обу гув 155 650 355 ніз все мі 179 «105 5 «и. 1113 «їли» ДНК «а» огуха заїіча «НІХ 5 зкубрасесва осазсаусад сосочка зосвасєссоя гоосчаттао ссзусадесто БО сгфдчасоцєс тоссовусав сстуатосав сстассотоя гассучдєзЯ статадсвоє 128 заспосахтоца асусоуздоасас дадсечссто далаттазаз ваедтастоаві двасовдессо 180 ствадтасЗа соззаадсау сдосссоасос соассусстаз асогадсУєю пасок 240 засноасаосо вадудазуавоїх посоадсЯатас вусосоляда тадсоавата сссовосоасу зо спдатдаусєт тсааасадаї сусозсовос оєосводося азазааєтосє часу вету 350 чаттиссато ЧсассстеавЯ сосотетуса чатчасссоп асаваєтоечу часвшнесссу а2а0
Чесні асЯсу сядсуоєасо сайсусадсе ваза сс суассасає сусбаусоує о сусасссоса асаваосУєх їпайаіїсїдЕЗ авасєтоазад пасідстатта госодосаче о каіссясва зтаїтатоує оссдаоссесо вассаїозає яїадсоссда вавлазсаая 500 садусаяаєс сустсксадес дасосатоак гтІстоЄсцча срастбдакає аостдассава БО ачеєтастас вддтоуєано сеодсаттуаа Ядсосдаєсо годзаайасва сазатсткос тий
Страница К-
Зтеазоасзкоє аттатсосай соатезсоцдха пазазІтОоя азстодтаас дсасстоста ТВО засаласгас сосавосЯве кссасассто авадтдасся асооссвсвї датестоадад що пдечеосссооа аа заатбадаоск аачосвасос асжттскасе асан ссев. зай поссгтавасо атадесолада сасдастсся «берасассо бсуаесовссо сассдасодай ЗО чЧатососета авуєастосо ссадсчсває васовоєтаєця осатЕстцк оздссавута 1020 ссазалазада ссудацетиє гтажхаоссто сопсрчатесдя осазаясчає спдаасексто тово адстсЕстою іїпсаскоддза задасатазс дб ла «10 В «1 ЗІ «ії?» вІНОК І «23» Оруда заїіха «005 6 меж Авр ен вег деп 5ег Бек Рго Уаї ті тТигоАврорго Уа АТа пе 1 З 15 15 пет віп іп огез грец сіу 01у грец обго Зег Аклосїем Меї бів епе 5ег 2 25 30 мар меж вко біу Біу тук 5ег Бе бер сіу мМеб ап ма! сіу Маї 5ек ло 45 яка бен був Хіе бій сім маї бе оуаї Азпосіу беш бе) зро Ата мех а 55 5О іме ек бек зеб сб Ага Аг Агу сем Аби уві АтТа рве сіу бій Ар аз 7 25 80
АвпоБег Бессооіч віч біз А5рорго Аа Туг бек Аїд Тер Меж лід кух 85 90 95
Су Рко зей Аїа сей ма! 5ег вив Бу бій ї16 Ма! АТа Зеає АТа ати 105 105 мо в1у уз іме їі А1з маї Не вен ар Туг Ар БУ ТВг без бег бго 115 ї2и 125
Рве уні АБр Оля оБго АБО Сув діа ма! мес дес о рго Уаї меж аго АТЖ 130 135 КЕКВ;
АТа ма! Ак Ач маї Аа іїує тут РИБ РКО тТАгОАТа діа у Бай о1у 145 150 155 160
АгпобБегоАєУ Ап губ ма! Ре біб ейе ма? буз без рух їй Геу Туг 165 170 175 туг діа сіу зе нів Ф1у Меб дер шіє Меб Аїа Бго 5аг Аїа Ап ні страница ;
Б
156 то ТО сі ні 5ег Аїа сі рух его вух 61 Аїд Азп ес РНЕ с3п о вго Аа 95 юю 205 нів деровне (ес Рго мес Те Ар осСтц Ущі БК орув зег гей їец вій гла 215 22ха
Маі ма! Зек сіу тіє бій біу Ав тТВР Ма) бів Або Ави Був РАпЄ Сув 230 А 240
Уа! Бек Уаі нів тук Ага Ап о уаї АТа біц цу АБротер. Бу5 тен ха 245 250 55 лій алго ве маї Авт бій Маї пев біз АТа вве ргозАго ей Суб Уві 250 55 270
Ти» А5побіу йт Меє маї їеи б уаї го го маї Т1іє дер оТгроавр ди 28О 285 уз іх гу Аза мві с1ц РБЕ Ме) сво ст бек зер обту гей оАБл Ар 290) 255 за 5ег сій дей Уа! Хе го гіє тук тіе сїхЖ Ачр Ар АгКо Тис бер о 305 па 315 32а дер ові вве уз Уді Ген дго сій Аг АБп оси бфу тує біу їта сей 325 30 335 ча! Бек бій ха! рге був бію тв он Аа вве тук о зек іви аку дер 340 45 350
Рго век сію ма! мес ос1ш Ре Сей ав вве сем МВ Аг ТРВорує Куб 155 360 365
Птя зап уві 375 «ау «йТІМ Щ13 «Щи дик І «із» бкуга затіма
УЄШ атодатстоя ядсвасадсво сесоудтуакь ассовіссоу тоусааєсаю ссвасачесва во студасчасс тоассавддсав сстаатосва ттсаусопгсча тассодасуЗ ссаєвасвнас ло чгасчцсатов асегозасає чазссоєсто ваявткцадо аорта даасочсес бе 53 сібахсоєся Ідавайосад савсссоасує соссосстоаа асоатдсухо тачсодава 240 аасацсазсе чедаачаача тссоофутає аососотаса содсезавсо сссодазевес 300 ствосоаЯсІ стазасзаяс готуссодоєс асесауоуса йазаааттіцс аутактестоа ЗО страница й чаттасдата ясассстчао сссдїєсова патозсссоя стаааасдоає ядасдзасссо зай
ФсдасоснсЯ сдосоуєасо свасцєсшсо яааатаскттс сопскоспах сосоаусадє ВО сасаассуса асавазтаве єуааєссуєо задссуваза аастакаєся гософодсвос 80 сабсосатоз асвітвтоос дссоавососо аассасопас яіаусосвоя адвазУусадя 500 садосуавссо ватегсворює допгосатуає сістоуссдда праєтдаєЄоа зотдассава 5 жкретастос застостява судсастяза дососдассо содававсяа славткстос 720
Чівиасатаа астатсоєаа сосчасодя вадоаттдоа застдахаос дсасствокУ 755 часоавстос гопиаоса косососстУ ашаотаасса асудссосат загостодах во чівсвссод каасідактсо опдасавадчоє аайдсоасптУд дасвістоєт. всадазесто ОО зссстдавсо асассовчаа сагдаєстссо астівтассо бсдаєдатсе сассдаєоах збо чзаїссвсіта зазсостоса ссвососавє восдостико УсяТестООЕ вадесаЯу у 1020 ссвадвчава ссодвачсуї гкогтадесто сосоазкссовВ псдавотоат зуаатЕкегу 1080 засттІстЯо соасоуєтоюяа аавасаєсавс ка Та «105 8 «ал ЗУ хи1й» БІЛОК «й» ОгУа актуа «ап В мес дер ве БегоАдви зег ес вро Маї Ії твгРодяер вро уа1ї АТа тв 1 5 4 ї5 бег іп біп сем сцен б1у су вей Бго яве Ап о їен о Меб біп Ре Зег 250 25 30 чаї мес вро біу 5 тує бвг 5еб Бей сіу Мек Ахв ма! сту ма! бек
НІ 45
Ага їен о їу5 ті біш сій Уаї Сеш ма! АБб а!у гвеуо грец А5В оАТа мет за У 6
Гу бег о5ес Вес о РГО АКУ Аго Агу без дп уві АБ Ре бу 015 Авр би то 75 8о0 дей Берг бек сій бі бій дер рго Аа тує Бе АЇїа ТРромек АТа губ 85 Зо 35 суб Бра заг лів еп Аа зер оре Гу біп ЇТе У! Аа бек АТа Сп 109 105 а сіу вує 1у« Ті АТа уві Ра реу АБр о тук АБО СТУ ТК рей его РКО 115 123 125
Ре Уа) Ар дБровго дяр Гуз Аїя чаї Меї «ес Рго ші меж АгЯ АТа страница ; гра. Я
130 135 їю
Аїд ма! дк дБп ма! АТй рух туго РН РгО тик Аїд їі ма! чек с1у 15 150 155 160 ду веб Аго АБИ пуб уді Ре сін ейе уаї ув Кен бух Ти бу тує 155 170 171
Тут АЇв Ту баг ні біу Мег А5ротів мес сАТа Бго Бак Аа дай НІ 156 1855 199 біш нів чего АТа сід був бес вує СТ АТ АбБп ве) Ре бія го АїА 135 200 "05 ніш АЮ РНе Мен Рго меї тіе дб5робіц маї ТВгорув зек беб мем сій 715 215 220 маі мві бек оо1у сі бім О1у АїТа твсе Узі сіро Аой АБ гув РВе Су
ЗУ 230 233 2 маї 5екоуаї Ар отуг Ага Аяп ма! АТа бін осує Абротеробує бе ха 245 230 225
АТ Ага сеномаі дят бій маї Зец о біц АТЯ ве Рго Аго Ге бух Уді 750 255 о
Тйг од Біу Ага мех уаї їев с19 Ууа1 Акй о рго Уа! їТе дер тгр Бр
КО: 50 285 був біУу уз Аа мні Сімя о РНе меш зем бій бег бен б1іу Ге о двло др 290 295 300
Бек осі асп уві Те со ЖІ тук ХТє бТу Або дер дк тв" деросіу 305 ЯКО 315 320 дер ад овбе їв Уа! фрез Ага біб Або Ап" сув Ту Тук 1у тТе ви 330 335
Уа! зе бій Ууаї Рго буб сід твеб Бі Аїа с впе тук Бек ої Аго Аяр 343 345 850 го охес віз Уа! мет ери ви ген вет ре Сей УЗ Або тео кує СМ 335 ЗБ 365 нт бек Ма 370 «а З хаії» ОВ «812» БІЛОК «АЛ аж Штучна паспідовніст»
Страница ! 7
«Ох «й Кансвноуєна послідовність «киайх «їв їншай ознака «йййж СУ І й Й «Те3» Хай може являти собою будь-яку амінокислоту, що Зустрічається в привод «ие Ех «Її» Янвай ознака «айв еБ)..Щ283 Щ | , ше й «дй3У хца може являти собою будь-яку амінокислоту, що зустрічається я природі ких «2» о тТнівай ознака кар» 833,34) | Й й й й «вра» Хаа може являти собою будь-яку зиїтноекислоту, що аустрлічається в природи «беж хагїз тншай овнака «вв» 583. .С58) Й І , й Й «23» хаа може являти собою будь-яку амінокислоту, що зустрічається в природі «РІ І «йкіх їншацоознака «ей» (003. . СБ І ; : кйКкі» Хай може являти собою будь-яйу амінокислоту, Що зустрічається в природі «Й «йрїж інша ознака «рф БА): 65 й | й , й «їі» хХапа може являти собою будь-яку амінокислоту, що Зустрічається 8 прирокі
ВЕУ» хойї5 лнівай ознака «вка» 08035 090) | І ки235 Жай маже ввляти собою будь-яку амінокислоту, Ще зустрічається й природі ки вух чиї» інвапоознака сайй» ММ. 15 й й шо ше о «223» хва може являти собою будь-яку амінокислоту. що зустрічається в природі «РОЇ «лі» нив ознака «ли» 4й03. (1813 | І І й кий» хай може являти собою будь-яку амінокислоту: що Зустрічається в природі «ай» «вії» зни сознака хай» 18473..483) І | | | І І «аййх Ха може являти собою будь-яку амінокислоту, що Зустрічається в природі «аю «аж» іншайоезнака «аж 1573. .1573 Й й | | Ще «БйЗУ хна може являти собою будь-яку амінокислюту, що зуствічається в природі «ве «й» тншайо ознака сййе (1623. .51621 І І І ха?й3» Жад може являти собою будз-яку амінокислоту, що зустрічається я прираді «ре «ай» іншаслазнака «айй 163... С1903 . І . НИ «айИ3» Жва може являти собою будь-яку амінокислоту, що Зустрічається в. природі страница ле еко хийі» їшнай ознака «й Е1993..11995 М | І «23» Хпа може ядляти собою будисяку амінокиспоту, що зустрічається в природі хлгй» «йде інва ознака «б» 2033. (2033 Й . й І «253» хай може являти собою будь-яку амінокислоту, що зустрічається - природі «99 кий» тнщшайп олнава «рййв 2073. (2073 Й «па» Хай може авляти собою будь-яку амінокислоту, що зустрічається - природі «ЛО» З муз Хаа хаз Хай Хай Ха Хаа ха! Кеш оРНе сій РКО Аза Заг обію вне 1 5 но) І
Кеч о Вго Меї І1Є Авр єї Маї Тук Бу5 Хаа Гец ма! Біц вуз ТВг Гуз да 30 хая Хва ті Рго б1іу АТа цує ма! бій А5п Аа ух впе Сує уаії 5ет
Сх 4х
Уаї ні5 рве або суб Ууді Ар сім вуз Хаа тгрохаа хХваа іїер АТа хай
ЗО 35 50
Хай Уа)! Агоозег уві вец суб їм туго во губ Бей асо сво Те ост 05 70 7 80
ТУ ду бух УаТ гей іш тре Ага бро хХаа Те гує тор о АБр бух СТУ 5 25 їув АТа цец оіш Ре реи цей обіш беє вес й01у РМе дій Хаа Кай Хаа 100 105. о
Хаа хай Хаз хяа хХва Хна йдем хаз Ха аБр Ома! Ген вро ІТе Тук тів 115 125 1955 сіу язр дер Аго тик Авробіц дер від Ре с цує маї сечу Ага біш Аго 150 1535 140 шу Зі Хаа ха бу вне біу тів йеш уаї бек ух Хаа РТ бух Ти 345 150 їх 169
Тнеохва АТХ 5еготук Зек овен біпоязп вгОо 8аб ов маї Мет бін хай 165 17/80 175 хай хаа хай ха Хаз Хаа хяа хай хай Ха Хаа Хай хай хХза хай хай 156 155 150
Хаа Хва Ха Хаа РМе їец хча Ага бен ув! Хаа Тброгує уз хай ов 195 20 205
Странкца
«лаз «и В «ий БІЛОК «2135 штучна послідовність, «Й кг» консенсусна послідовніст «аю. хижа аанака «лай 2.0 І й . . «РАЗ» Хав може являти собою будь-яку зкжінокислоту, що зустрічається я природ «АЙ кб: най ознака «йййт 0163. «ййї» хай маже являти собою будь-яку амінокиспату, що зустрічається в привод «Об
Ага хай хаа зегоїгОо маї АБроЗаг Мет Ага дід зер ек бго тТНг Хав і З 10 15
Хав Ку ет «АТО» її 20 кй1й» БІЛОК І «йїі3» Штучна послідовність «ЕК ИЙх І «паї» Кансенсусєна послідавність «2265 «ей івайоознака явййх Сп: сб | , Й . «/йЗж Ххяйй Може являти собою будь-яку амінокислоту, що зуєтвічається я приредл «по» 3 сіу двроавроАго ТНг оХада бій Азр о АТа Рпе я З 10 «віх и «йиж БІЛОК «й1ї» штучна послідовна ст «йИЗ» консенсуєна послідовність «У їй сем ар Тут Ав с1у ТВе орец бек вго те Уаї Або і З 10 «ня» 13 «Бі ЯАЛу «ие ДНК. страница ж 7.
«А» бгула вас їча «4005 13 ж сподссоста позспатаої Чтоагоасодеа аасасоааца даасатовад ачааватн с БО авадтоваст тсссастваз вдасЯсвосца агададвааа сазадаййсу ассододаака 1570
Чаєсескасаве стостоавста сстідячосза асятєатату дісссткасх датосбесайа 180 їасахєдаса гоїсаєттса абсстотося Єсататосає дадсссстх остодаатате 240 аетсісцдацяа таїтстаєсвао тТоссаатста Хтосажчасє снпаттадссє асвуЯатсЕта 300 їсраєтасях тастаціаау сСтЕтоададса саадаастсчає частих дклаєсодоа 350 ассаєтокос автттестт Зссотасава огтазсстоє їікатвастя сто ча тааататаса вісстаттвра стттєодотся сатактеЕзас сатасаїстс вгртачатаа 480 тктдєсада таїатятаєє стсвагсовтв азектвдтта сзатозаайса затаася кс За зсопсаатоєт пссгасєтава сазосслсдя сзавотасстЯ садсазтата суда БОЮ шіасасотадя гсобздсстат стзсЯсчвава азасзавдадф ададааваало давача Бо засаїїаатс агтосатовос абтасосссо асвастосаа тІтаєсадзо атасодоюва ий сазазаїча сасавасаст асбаствост восістаєся Сесабзтвся сссвааодся то застодетта їсоадатаавя сасазвісск асааавсай Єсствааеєс тессежессх па
ЯсСттсерсвЕ ТЕКсоросай сссстаєсво ведоасоссЯЄ дасссаєтод ассадтавчх 900 часовсаєає агчасссЗдЯ тстазвоєстао паовосаатя таттосасо сосавовова зво зоачастасо адестсоубає тадссстосо ссстесстра дссабежесс ссасогатах 10720 дсатататос вісвісовсая сдатуєатає стугодкота деддасесав свеодчаєто т1ОБО сессссвтссо достсасосе сссадестад дотаадаєст одтвасаваст тостаасссс 1340 зсчссвайот Касосексию тастаксдЗаз аобоачарой засосокова тавра ува 1200
Чпдвозцяда зацалеуаєта даазойоєда теза єсай ачсадосаад задессаатЕх 1260 сасайвчвлос бастастаоє астастаксасє бастогоюта садкасссва заксстеее 1350 ссораскєца стссвстзає атістссвсЄ кстсосасоЯ стсостакає стос їз пгтловнасо сСтадсавуса адазозочоає саотаакваЄ осточевовео чдадавастай 140 стассетата стсостцаєс чатастопасс гоаоддаассо соспатсват савосоветє 1500 часозододча зазохквайс таадесосає сдвадайсаво ассзазсадос ачессасеєто 1550 скосавосос сосавсуасє тесксзадав дасстасвяо стакесоєе тстуєсовсає 1620 спас осга стсвпісассю тстссадесі спосазасто сгассаптей чсадсусесо ТО чага таа Басацасаса зсевсасаса савассзасва ассвосатссв асггтаваєсі 1740 чсацчеатетеє гоже Естст сассаяттоє БЕСЕЕСКЕВЄ ЕсЧБКСтКІ ТЕасБЕСТКЕ 1500 ташостас зассасаксс тостсстсто опе стео стежити сажа 1860
Твоасєзоавтасє спассаосса застаєтата стіасстдФос сатовтвате астссаежех. 820 дкстаднає зішееєстОс дсатастаєт атадоцасві: одсусоовас ссттасааве 1980 страница її садазсасся дакссставс теосатодаз сповтатсес ссабсодатєс габасааасс 200 стастсстяє водасетстт: стсссповлі сіІссСЯдстст жссттодаєе астаттассс 2160 аксткесуво гпотасасох оссвувуаса Ястсбвасоя тавасетстс аазассваса 24050 ствпозуауоЯ ТаКУстЗсог осоОаоваста азсудзоавї тадсабочад детасвавсх 2720 асдаазвцозав згас хссЕктетеаа гссабсаддо озЯсесстес сдотаттяай 2280 акстітсєсод сасастЗатєт тсагастк: уговтадасес тададозатє дасЯєзосау 340 гебасеассоа сессбаттота ореттаєсст сассісссса тостаїоває спвтсаасех 7400 сайїшитстс сатсвеспиЕ стсспавсве тесветтсст тсосвдістса тассатєє 7466 сісдосаєва яісвааттта аттсовакві жшстасттсся тахатастов вайзалкі та 2570 аЕсяЧатста сІсскостсо дадуть вас топу песвдакоєс ассаєссткат 2580 тссссоссєс сесітсшет ріс сітесксако КтасттЗає саттткуаус БО їоіснистає абйсасоавос атієссавії сдассогату хавортсаас содаваатато года тЕдаажадат Стсстатата Їсвасасста зхохсадасєс тдсаксваєє хсосстотоа 776о твесокоосс зазаїтассь атасттцатс тіідсестссє ЕтІстсстса тттсасуаєи 2825 агтсєстаста судсітаавс саттсії гаї тсїссастяа тсвтоцатує тосттдаєсто г8ла ствуІКаКІЕ сугастяост саасттоцло ажетстосає тастсцєста стостодех 2850 асесттокаа сасятстапа агдогосасу ааааоствет сетаксахтов заяаачоадаа 3009 сжЕтавсавус таазтттстст актсаттсус датовсатст тухессєдає засада 3о60 їсте тазтс кдсастсася тогітатата свпазаїстао стсстттає єсатЕсттов Уа сататвоссс остяастакта чбастіїтатах завтаасяст атаастокиє задакссдат ЗІ18О стясагєстеу застсотаовач аксахасаяї зпо9веватс пастоваЗая ссааокавах А чдетаїзсвса табататаєча сагтусаєй сасусесасс їававттаве багета са 3390 тссвасток Єсатсодаваа адаїтїоата кеЕкесСааІс тастстстев сбоабтатажа 3360 тттвататує тЕсватстудт жтсЗзассвії атадватлнад дсстатавтс ассаоеви 3420 іїсзодаєозІс тесссавоса сазаазадсї дітаселтса стієвасєтха ссадасовсс зав хтзаснтогає роса тазса аасачаєссти Заст сс тесалааіїса оса сатакх 3540 сеттттазає сададеЕсцдс всоасєтакує сссдассоте афзалавкст срестьєкесе а500 тазатадіса здадієтата єтсссртуаау саажтобдчає астазесайт каєтоствах 36550 асстедуаєс чЕсттттесе бсттсасаєс аставісвут статасссту овссаттяви 320 ато стосте зсазосттст састтатчоє гтасазацса тТсдсстадва Тео тогасо 3780 тстІстясаса ТсадвЕсастт ттадакастЕ пссостЕтсва Чібвеесвте саасоєитчя 380 тгатктатжек састтавчяаа васгассата статева секта є датскастть за пптатсадає дтаєкуєзав тасеасттак сЕКтсКстає йаотисаста асескусвай з950 тавбаталає одЕсСЯДатос тасвадазава аостададса ссаставЕк: садодсеюаа що страница ня огаіазайс стадітаєта гайссватаа сб сассаат стаїнаатує засасаваах 3080 сасітсцтца саїстсяасас аавоєсаєті сваєватуаа адстовскас асо сссевис 140 заавсасато їдаїсаЧсїї одссоатуга авайвстаєс татоксасва яссаваа 4500 атавтатаву сттестодстс басадоатаас атітстатає гіттстета сасесеваса 4250 тасствджотст тдссвиваза засатчатса гетгоатгаоа соввавдала гадсалатає аг даваковсст гтоатаєсві таївасатай ЯстестЯсст статааатєткна сажсстатуєса 4350
СТЕ Єтасах собастааик совізсвсЧа давастсаса табаасатте стотасауєа 4440 гаассаєс 1447 «2105 154 «й 85 хай». БІЛОК І І «213- вгавтдораетв га! тапа «005 4
Ммек Ар Мет гу зей су Ні Зег ваг Рро Уа! Ме тик Ар оБек еко 1 Б: | 16 13
Рго 1 зег дп 5еб оАкЯ Бей твгоріє ага бій АБИ АГО бен оРКО ТУуг 20 У Зо хек зе АТ А1їв о Аїа тв АТа ї1є 5еб бій Ав Аби Аз ем їй ме 15 50 «5
Те о уш1 Рг Агу бух руз ТК ОсСТу ті Цей АБ одер Уаї цу чего дей за 5 60 піу Ттросею Ар дта Мет ув бЗег Заг бек рго Рго Ра ТК тів Сей 55 70 75 о люп оку Ар оп тем об5ег Аа Ар АТа Тр оАБОо мес Тит Ту Ага БИ
У в 95
Тев ек їй фею пух Тує Рг Зак дта бешо оте ес Ра бі) ву Пе 100 145 40 мес зеровпе лід вуз бу ув дДРЯ її Аїа зец о рле: їв Авротує дер
Т5 1205 125 оіу тик іч зег о врко ті хаії сів сій Бгто АхроСув АтТа Луг меє б5ег 135 | 140
Бек діа Мет аг Бек дія маї бів дай ма! лій вубо тує РНе вгОо тат
Кам 150 155 150
Діва о тіє ті ек оіу аку 5ег Аг АЗровуз Уа! тук бін Не Уа! АВ 185 170 Т75 страница. 7 ем бек біо бен оТує Тук о Аїа с1у его нів сіу Має Ар їі Мет 5ег 180 185 180
Ро АТа сіу сім век вен АБ нів са нів его олга твг чаї Бак Уа! 193 200 Ох
Тут обіш сій сту Бу Азр Маї Ап о бец еве бій Рго Ала бек бТо вве
Іо 215 220 сен во Меї їте Ар зуб уаї сек сув зег рею Ті з чек тт рух
Ко 230 235 240 кв о хіе уз б1Уу ма! рує ма! сій А5р АБИ бух РЕ Суб ІТе Баг ма 245 250 255
Ні тУк ага Ап Уа біш сіб бух дей тро ТВбосец уаі Аза б сСух 250 2655 270
УВК АєроАБр уаії Ії Ага ТНгО тує РЕО рух гей дго ев тТвгОонНтя СТУ 275 280 8 дкчовув УВІ меч бій ті Ако РКб о Уаї т1есАБО ТрРр о АВ ру ау Ку 90 235 300:
АТй Маїс твк РНе Бей семи обі яв ген обіу се деп Ай Суб 010 АБО 305 БК 315 32) маї ей Бро тіе тег Ууді с1у А5родбр Агуо Тегодер об Ахо АТа вне 325 339 335 ув Уа! цен дга Ар обіУ Рго Ад5понія оТУу ту біу х1іе ін уд 5ег юю 345. ї5О
АІа ма! тго цуб5 Азрозек Ав Аіа РБЄ Туг Бек бец Агу дер о рго б5ег 335 300 365 біз уаї Мес біш РБе без гу бек оген о ма1ї ТК Отто му Ако Звк Мет ато 375 80 су
За «0» 5 жило ЗИ «йїй» БІЛОК крі3» дгайтЧоретв5 сраїтайд «Ох 1.5
Мебс тп ал біп дп о уаї 116 Уа! 5ег ар ага цуз Рго ЇТе (ву бу 1 5 10 15 страница 7 цей бує ТВ гі Твгоуа! ес Уаї 5ег АБИ бе ро ге РВЄ 5ег Ав 20 25 30. заг оРНе вро таб о тТуг ВПе деп овве РГО АгОо АкЯ Був ре вен вух ве
За о 45 зівев бої Аа Аза: АВ уз Аяподят бе ба ма! Аа рРго уз Те тве 5О 55 Бо
Бан мер Біг Азрожег Мет Ага дер ваг бег Бго ТВт ак без Агфобег 65 7а 75 50 зак очеготуг Ахроаек дер б5ег Ар Ап АвроАєроруз тТВгобеє тер її1е х5 0 95 уаї ка вне Рго зЗег дід рей ай меж РНЕ вер бін те ма! Ачп Аа ще ще ЛО
Аїа вух біу уз сій тіє Уа! ме вне бен дер тук Адяросім тик сво 115 120 125 бегонта сі Щі Бін АБр обро дер губ Аїа ба лів їТвгонітє бів мес 130 135 155 дга біз Уа! Уаї уз яр Уа! АЇш чего дей Рпє рго Тит АТа те уУді 145 ї150 135 160
ТвВг о1У Ага зек ї1е бі руя ма! Ага баг вне ат бій суа) дей Ти 385 178 ТУ
Хіе стук Тує Аа1а бу бек Ні сіу меб А5р ті бід Оу вко тиг деп 180 ї85 159 сіш Аа 5егоАви біу бій бек дБ січ Аго ма) іец Рпе сій рго Ав 155 200 205
Ако піц Вне ів о рго ме Т3іє біц ух Уа! Уді да 116 цец со бів 215 228
Був тн бух Тер тів Рго б1у АЇ)в мех уаї біш Ай АБа вуз РПЄ Суб 230 735 240
Бей бегоуві нія РпеоАго Аго УВІ Авробів суя йго тгровео діа ви 245 250 235
Аза спін Уаї МаїТ Був 5ес Ма! єр ті Абротує орто був рем вуз Бе 25 253 270 те обійп б1у Агб о вуб маї вен бів Ї1е де Рго Таб ОлІЄ ух тТгр дев а 2850 285
Странина 7 же муз аіу ств АТа без дис рнє сСез їез вуб 5ес оре) С1у тує Ту Акй 2-0 795 ЗО век Ар Ар ма ма! ргОо ма! тук 16 сту А5р оАЗродко стик др ои 305 310 315 зай
АЕроАЇа вне уз Маї ви Аг пів Ако сіу тя су Рйе ту Т1в кеш 325 339 335
МАК чес мух уві РКО у Аброзлг деп Аїа зек туго бег рец бій АБр зла 3453 330
Беб заг обій Уаї двпогрух РНе ей ото Ак без мі від Теровуз АгЯ 355 3050 365 вуз твгома! Б1у сів б 373 «10» 6 кі» 382 «ві2» БЮ й «її» бгуха зді їУуй «Ох 16
Ме дер бен суб ТИР Бек АБ, Заг РГО Ма ІТе Ай АБр овго Гей го ї 5 то 5 вує зай Аїа ген вро Зак АТа ма! Меж ТНК оту тйгс тве Рго те 5еє 2 у зо впе вко ек тв біу рвистуг грец одяп ТИгОРГО ув ву вуз рга іїец о Аз вга сту суб ті біб оц узі Аг із Аїд сіУ трробеУ Ар Бей мех | ОО зів діа 5ег бак о йго Рго АгФф ух Аго іп Твнгоїуб А5роОвпє дів Ази 55 7 75 Еб ази ма! 5зій АТа два бій Без дер обац сем тУуЄ Ага дя тре мі Ха!
З 90 а5 дев нія вго ев АТа сечо тб еко рве іч А5р Те ма! аби Кеш АТа що 105 цо дга зіу рух ага ієц АЇаД бен бе ву А5в тує Ар Ту ТВгР обец 5ег
ТЕ 125 ха
РгОо т12е Уві АБродляй Рго бі Аза АТа Уві Мес 5ег Ар ан Мей Аку що 135 140 бек Ай Уві бу нт Ма! Аа бесскєм Вйе Бгто Твг Аа уїе те 5есг страница 7 Ж
145 150 455 160 зі ага Бег Або ар руб маї впе ажр Ре ха! гу рев оте січ грец 165 170 175 тут ук діа діу бек Ні соіу мет йхр тів Меж с1у Рго Маї Агу цу 189 165 190 зе Аза 5ег овег біу ста мі Ууді с1й Суб 112 АКО Бек тбг АБО 5ег 195 200 2905 сім 'єїх мух біц уві яп овем Ре біп Рго дія Зегобію вве сей его 219 215 220 меї тів бегобін омаї Ту ух їує рев зер осі бег т1і6 уч дяр ТІ ау 230 235 | жо сбіш ув! ага вго уві лів деротгроАвй Був бТу суб Аїа ма! сім РпЄ 24 280 Хв меш без бін бек рез Ту рец був Ту Бу СТу АвроУуаї вен вго Те 2Б5о 865 270
Тут ак сіу Аяо Ар оцув ТВгГолер біо Ар о АТА вла рує ма! ред мух 275 го 285 «ла А5п о азр і Аіа Або Мет бій дер АБИ Був вне су ма) зе. уаї 90 295 о
Ніж Тук дко авт Уа! АВ РКО нія дер о Тук біу ву маї нія бів деко 305 зо 315 120 чат тв АЇВ Уві рей о бу5 АБИ тує вго Суб дев Ага Кеш ївг о нНтє Оу 3725 330 335 вгосвух уд! веб о 5ег дів сіу Ре біу ї1е їбу уді 5екобзер уаї рко зла 345 350
КУБ АБротТвт Ар о АТа РНе тує вегома! Аг лжр РКО дід сій Ущі мех 355 350 3655
СТИ Ре Кец цу5 Куб ен Аїа б5ег тгр о МСув аїм біц бек Тк зи 375 зво «ЙО Й «я У «ат БЕЛОК «гій» гпегторвтазта асіЯораі їни «5 її ек ТІВ РНе сем АЖ о тТугоАВО ім тк бен оуа! вро Ті Т16 меж деп 1 5 10 15
Страница й ра 7У вго сі чі бек тук дїа Ар о Аїа біу сечо Бей век обеч дів Беб ОА5р. 20 45 30 сер оїу5 сії АБ вне Аз отаг тує їЛе маї тт ос1у Ако Бас ргОо с сі тіє ек ага Ре ау обго цей А5р Те Аяп мес т1е Су тує НІВ 50 сі Ала Суз его цу І1е Аа сіу біп тів с уаї туг дБ АБИ біу 5ег 55 79 75 во
АхосАага Не бен бі ма! ре а5роАко Те Тук 015 др отпг Аго, бег я5 З) 5 тео та! бек ар вне Рго біу пес Ага Ті ту одго г ує дви змен АТа що 405 ло
Ммаї цен тує нія ен сіу Кей мес біу ліз Азр о Меб їуз РгОо гу цей 115 . 128 125 га 5ег вгу т1е 010 сі сів Аза Ага тів Рне Фу мат ти тн туг 1560 | 135 110 туп обіу бух Ме Міс 116 біз їец Аго ма бко б1іу УВК АвпоГух су 145 159 155 160 «ег АВ Хв лгу зак Узі Аго соту ів Аго Ргоа Аїа тів тіє Аїа бу 165 І70 175 авр дар Аза те Ар осо АТа аа Рене 610 АТа дяп Ароазо КАТЯ ем 150 155 90
Тек окІє гт5 ув бу дім бі сь тео міх Аа рух РНе Ні маї АТа 155 200 205 дер отут іє бів меж Ага вуз Же їво Бу ре тт бій меж ев сіу 230 235 220
Ууаї бій ув вм віп
З
Страница б

Claims (2)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу, який включає стадії, на яких: а) вводять в рослинну клітину касету експресії, причому касета експресії містить полінуклеотид, функціонально пов'язаний з промотором, який забезпечує транскрипцію зазначеного полінуклеотиду в рослині, де зазначений полінуклеотид кодує поліпептид, причому зазначений поліпептид має трегалоза-6-фосфатфосфатазну активність, де поліпептид був модифікований так, що він має знижену ферментативну активність у порівнянні з немодифікованим трегалоза- б-фосфатфосфатазою; б) регенерують рослину з рослинної клітини із стадії а), і, таким чином, в) одержують рослину з підвищеною стійкістю до абіотичного стресу, причому зазначений абіотичний стрес являє собою стрес, викликаний нестачею води, де рослиною є маїс; і де зазначена модифікації вибрана із групи, яка складається із: О5Т6РР-Н2г440, О5Т6РР-АТО2У та І129Б.
2. Спосіб за п. 1, в якому стрес, викликаний нестачею води, обумовлений посухою. 1 29 15737 о ваїіїуа МЕБЗМЕ..ЗЕ МІТБКУАІВО ПіТСсСсСІВОМЬ МОБЯУМРОСЯ ЗІВОММУС.. 12925 0 шасіча МОЦЕТЯМ.БР УІАОРЕОРВКЬА БРБАУМТУТТ РТБЕРБІСВУ ГИТРЕКК.., 13995 й ЕБаїів МОМКлоБавР УМТОЗВРІЗМ ЕНОТІВОМНІ РУБЗАААТАЇ ЗОМ 13925 5 сБаїів ...МЕМОМУЇ ТБОВКЕІССЇ КТІТУВУЄМВ РІБВМЗБЕТХ ВЕМЕРВВКІК совІя? уки зів ква жетую зт ніхухюті хіх 15777 О явжітв 0... УЗВІЖ ТЕЕУВБУЮВОІ. ПАМКБЛЯВ.В ВВІХИАРОЗЕО МаБЕЕКОВАХ 15924 с ваціха 5»... ВЕРШК ХЕБУВАЛСМІ. ПГІМІЛОЕРЕВ КВОТХОГАМО МОВОШІФЬЬУ 13325 Ж кМаїів ...РВККЕТОЇ БОБУКОМОНІ ОАМКВІЗВ.. ВРТІБНКОМІ: «ОСМОАТЕМТХ 13925 А сВаїіа БІЕЛАРКЕМІ УУАРКІТВМІ ОВМКОЗБВЕ.. ...ТКЦВАВЕ УрВОПЗОМЕШК пЗнНІМУ уклали зачаті жі яаінінях ялякіяания зятя 101 ї50 15777 б хатіува ВАЖМ.АКСВО АБАБЕКОТУА ВАООККІАУК ПБХОСТІСВРІ УПИКОКАЧУМЕ 13974 0 вапіча ОНМНУ.УМНЕЗ АБТОЗЕКОХІУМ БАБСКВЬАВК ОЮХООТІЗРІ УОМЕЕМАУМО 13225 А спаїмів ВЕХМОБКХРЕ АБТЕЕЖКІМО ЕАКСККІЛЬЕ БОТОСЖОВРЕ УКЕРОСАХМЕ 15975 А спазія ТВИК.УВКЕРУ АЛІММЕОВІУВЮ ААМСКОТУМУ БЕЖООТІВРІ УВОБОКАКІТ азЗнІЯ? фиюжя юю же ян МІК СЕЖОЄТЬСТІ ЇММРЕКЗУАО
Фіг. 1А 151 КАН і; ОО засіува РУМВАВТВМУ АКУКЕТАТОВ СЕБВМКУЖЕВЕ УКІКЕБТУАС ШНОМОІМАРЯ 13924 0 васієа ОЕМЕВАУКНМ АБІЕРТАТІЕ СЕБВОКУКОК УКІТЕБУЖАЄС ЗНОМОІВОРВУ ІЗ935 а Ерязів ЗАМВБАУСМНУ АКУБЕРТАЇТІВ ЗВОВОКУХЕК УКТЯЕБУУАО ЯНОМОІМОРА їізваБ А сразів ОНЕМАБУКОМ АЕМЕРТАТУТ СРЕХЕКУВОК УОУМЕКЖТАо ЗНСМОІЕОВТ соту АбЕБЕЬБІОТЕІМ. КЕВКОТХІУЖ БВИОРЕБТАКЕ СБРІСІНМІСТЯ ВОАСВКТНОЇ КЕНиЙ 25о 1777 О вакітв АМНЕНЯЛЕ.. ........К8 КОАМОЕОВАН ПЕБЖМІДЕМТ КаВОПУЧВОТ 19994 б вацсіча ВКОКЕІЗСДНМ ЕСІВЕТОБЖО КЕУМОБОКАЗ ЕРОРМІЗЖУХ ККІБЕБІКОХ 19995 Ж Еваїів ЗЕСІВНИНЮЕХ ТУ. 5УУКОС КОУМОТОБАЖ ЖРІТМІОКУЮ СОБІКЯТКОХ 13926 А 5раїів МЕМЯМООХ.. ...5...«. МЕБУБРОКАВ ЕБОРМІБКУУ МІБЖЕКТКМІЇ сонІЖУ ІМЯЖШКОВО.. гатляючккахяюняязхя ВРЕІСУКОВІХ КОТНБКУВОЕ зай 15777 З вабітв БОМТУЮЮМИР СУБУВУВНОА ЕКБИКОСАВІ УМЕУББАКРВ КУМ Х 19924 о вабісте ООАЕМЕОЕКЖ СУЗУВУКМУХ ВНОУСЕУВОВК УТАУВЕМУРО БВЕТНСВЕМІ 18325 Ж сваїів КСУКТЕТМКЕ СІБУБУВЕУЕ ЕКМИТЬУАОС УПИЧІВТУРК КВЕТНСВКУ 19996 А хпвіїд ОБОАМУКЕММК СІЛУНЕВЕУЮ ЕКЕИРАСАЕУ УКУСІВ КБТОСВЕМІ. вх Б РОБВІТВКМЕ ВТТНІСТМО ЗОМЖРЕБВЯА ТЕПІАЛВІКСУ ЕТЖУОКМІТЕ
Фіг. 18
13777 0 васіча ОБУВЕСІДЯНСК ОХАМЕКІТОВ ТОБКОБЕКНУЇ БІУТСППВАЛЕ БОЛЕКУБКОВ 15924 0 васлув ОБУБРУЇТОММК СКАтЕВББЕВ БІ ССКВЕрУ: РІУЧОВОКТО БПОАЕКУБКАМ іЗ585 А ББаз3а БІККУДІШИК СКАУТЕБЬЕ ПОБММСсЕСУО рБІЗУЄИОВТЕ БОАЕКУБКГ їз А сбшіїа ОБІЗЕТІКНОК соАОМЕСВко ТОЕБорУУ ВУХІТОЮОКТВ БСБАККУБЕЕК СВІ М ТЕУРОУМВО. хни АІКБУВСЬКЕ ІЛІЗАСООАЛО КАЛЕЕАКООА інн аЗі1 зз5 1395 б вагів МСС ЖОТОМО СУККЕТЕАКУ ЗІЯПРОЕУММЕ ВБІМЕІУВИКК БАХ... їча4 о взбіув «БІСЕЛІКУЮ ЗУБКОТОЛЕКК БУВОБАКУВЕ БОККЕТАБИКЕ ЕЗЖК. У, із в сБваіїа ВМНШХОЇГУМО АУЕКСЕМАКУ ПІКОЕОКУМЕ БОКБСУТИКА ЗМ», не 195924 5 єнвіїв ОБО ОЇІУш КУРКОТЕАдУ БОБРЕСУМК БІТЕВІНУЖККЕ КТ ЕнІК; з я хх 1 ТІК ШСЕСЕТНАКЕК НУАПЖІЕМЕК ТРКБІБМІЗУМ ОККО. -
Фіг. 10 пн в с пов В ВК т. тт Й няння хя ДКТВІДНКНЕ ХКТ. КД ТК еВ ке Ганю мкнтннниня ЗМУ ВЮККЮМ ТК, ДОМ. КК СХ. ТКУ Ро будяяяєнняиитнтейяя тя тини ВЕК В уд КВ ї о ПОН Жак і. ним пиитя тея тет ня тео ВУД ИЖЯМИ І ОВ і С пазом УМЦК МОНЕ ВУ Ка ММК Ії - 56 5 « «« (2 2 2 6 Єьє й 2 - ж ж Я 2 - Ж 2 ж ( - -- 5Хезоузсвацею жі ІЗ В. допити я Код ОМ СК ія дк мих а сш сюмкмане як нн В КИ ї чі нн и о В В ОК ЖКОЬКОВ не м о. ери пеекекиттюннн ек нтнжюінкевтню нет Мур, ДДЖІИ МОМ ЩО З КК і педтктили тн ння иа нки ииниктя ння р ЯНКЯК У ДИ и ДК З и в в о в в в В У СО І ї ши Ом і 4 Хонннняяняняе Ту ХОШУИІВ ТО ЗБЕ ї Винна ння -4 баки тненанннннн КУ ТЕ ТА І, КК Н нн нн о КОСИ НЕ ВЕНУ щі Не роми ио лисицю со Н нн нн ні п в п С В В У ИН фіонют юну куки тки яки ж тюткнистнк СК КЛККУЮИІВКК ЦК МЕМ У буки ДЮЖЕБЕИТИ СД ДЖМУХ ! З Бнннннх ЩО ТД Я ВЕК СК КК ї ві а в ТА У КОВО х ті рн Шеф шо «угат кВ хі СВМУКХ й фени урну ШК ДАЮ ОТО х ї її ЖК оон чити тя нят нятлттих лися мом ЕТ. ХО у ПД ЕВ зн в ИН С МНЕ : х Мехичнехажкехчтючкххчижинняннниня ДПТ ДК КеиМнеж пи. т ЩО КІ З пн Ан З Я дк тв оуХЕ ТЕ, КВ апп ттотттотототтотчтосттт. АЖКХКХ. ТЕЛ М. ВХ я по о о о ся и ВЕ В -
Фіг.2 Трегалоза-6-фосфат- - я «І ТПОР-глюкоза синтазач ГРО щ Трегалоза-б-фосфат «ке пн» шия (т бр) Глюкоза-6-фосфат г зх НУ Трегалоза-6-фосфат- їз фосфатаза" Тев РІ Зоо Трегалазат
З. . ск айфукннкнккнкк кн кН кКкнкКк Кк кКкнКякК т. Є г ХтТлюкоза З Трегалозая
Фіг. З
. п: Крохмаль Гліколіпіди Ї сх пуд, На ех ПОр-глюкоза КЗ Тлюкоза-б-фосфат хх е ди Уже Пентозофосфатний Сахароза «7 Н т й с У і то шлях май ро Гліколіз Н й . кош х ТСА : Полісахариди клітинної стінки М о х кисне Трегалоза-о-фосфат (Тер) вАваин Й фосфорилювання . х АТЕ Трегалоза
Фіг.4 СТРЕС, ВИКЛИКАННИ ПОСУХОЮ А Кн нн і (ПР. глюкоза зн нн нн нн нн нн с ахароза І ї Шо р. НІ І . РИШаи и" ; і ї це о : Н ї е й І ї Глюкоза: У еетеетестнсен ОК р: В : Н х «І нен ї Н ї їх ше Е з ї Е а ня ї : Н . В : Н ї ТВО фелнетттетненнноеннтенннеенннтенннтетнннку і І ОО оце : її і її І Окислювальний | ! Фактор 12. рення : Е ї пентозо- ; ! : з І ! з Роз у ТребР - донні і З фосфатний шлях Ки Її Е м Е х де Е пн . Н х ех К Гя ї ї їх Ка Е; о - ї ї ї ри ї З : ц і і; ї | -Х я ї і Є : : їі ї ЗАСВМ --зМТВ Н І : її Е МАСРН ШІ Н Трегалоза Н г: Ті х х ї 5: ї і Ї ї я ЕЕ і Активація АСОРази (|! Н рі ї Н І Рі ї (й хека ї х ЕН . я ро 2Х Глюкоза і Генна експресіядля (|і х : ї 5.1 ї . : : росту молодих їі х Е ЗК с ї ї я ІЗ Синтез крохмалю і ! акцепторів ЩЕ х х ї 5: ї і ї ЕН ї і ї ЕН ї і ї поз ЕН І п дп Н І ЯДРО їі ї ЛАСТИДА Н І ЩЕ ! " ї дитгОоЗОлЬь і З ї "М дюкююююююєююю юю юю юю юю Зекеютоєкосютоєкосютоєкосюоскосюсоскоскюккссннси З щ-
ФІГ. У х ФЕРТИЛЬНІСТЬ РОЗВИТОК х Х ОРГАНОГЕНЕЗ р кт х | Й старіння кт у 7 с Потреба у вуглеці У клітнн, ії у и в р . й що ростуть х ї Я и ра РЕАКЦІЯ НА СТРЕС ), -. Еш шк дет т и титостк хий хе х ї Я т ще стТІНКІСТЬ ДО ПОСУХИ Я а Ух у й ай ей СОДЕСТИКІСТЬ ик - пенні оса вея и РЕАКЦІЯ НА ПАТОГЕНИ Й ддннни в ї ши Дн, вослиноїдНиХ СТРЕС сю - щи Ши шини - Шо: в й и І Ж днну, т й дети й : Поєсттрансляційна регуляція теж ай Й Транскрипційна регуляція Кя Фосфорилювання Ши ее ще Й Є і т ж, пк, шин ни 7 я АСРаза х - Ше м. Ши Ей Б СІЙ : Сахароза- / Трегалоза- Сахароза- о-ямілаза Аспарагін- ; Нітрат- НМО-Сод- фосфат- ве й м синте амплаза й х редуктаза едуктаза сфат- 7 «уннтвза сипнтаза КЯ РУИТИ и синтаза синтаза синтез крохмалю РЕГУЛЯЦІЯ МЕТАБОЛІЗМУ
ФІГ. б фонова аб І ДОМЕН ІЛОЮ е Й я іх пан Кох ба У ща 5-8 й де а Я Кк и В КИ ск ЗО С з Ж МИ М пет но 3 ї и я) Кн х ЗТ В 8 и кю Е шо, Ж ие сте ХУ ДБ 00 /Б-ТІДРОЛАЗНИЙ вка 5 умі й Й ДОМЕН Кс МИКИИКОм жна
ФІГ. 7 у бай АВРІЗ б Ф НІВІВІ ШО у ДТ /й ) ді и ан их с, і КУТ» Ж т ше АВР Т/ А. й ! // 3) х МУ Фо щи. й І. Ї Ге) її ЕВ м зу52В ч ра ще А
ФІГ. 8 і ГУ і / ; Її «в, те І. - 0 Кт Й «у Тше її те ви нен й я й і ї р; Мч тя і шиття ж й Ман ит ту ; ТЬ. фея я Ех ше Х як Каву меч Ще те «фе Х ШЕ Ш у і дет Х АБРАІ5 ЩО ! ху нини у: - лиш гу Довиоя «і -ї тео ж ИН о т , І А ГИ. хе ря Ге,
І. 9
МОХУ УХА ЮА КОЛАХ КОХА КАХ КХХАКХХХКХХХКХХХХХих ХУХАКХХАНХАСТЧОЗМКАЗаИТ ВКА АКХХАЗЕХАВКАКЕХАКМХХАКХХХКАКАКХХАХ ХХХАХХХАХХХ КНРЕОАІ АХ ХК УХААКОКО М МЕ ЦОТВО ТП ЗВМОВРОКАЄМООПХМИХХХХХХХ ХК КК КХХХХАУВХУАКТЕР ТАМ ООВОКОКУУАКУКХЕ Я АСОНОМО КОРА ХАКУХАКХХАКККААКХХКАХХААК КОРАЗЕРРМЮВБУТКХУЄКТКАКТОСАКМУЕММККСУБУМ КНСУВЕКХИХК АХХУ КО КЕ КІ ТОБАККУМЕЕНКЕХІК УМО КОКАБЕР І СВІ ГАХХХХХХХХ ХМАКОМЬРІМ СОТ ОСОАКК ВЕ ВОСОХХОКОПУЗКАРКЕТХАВУ В ОРОС УМЕККХКЮЮХ ХХ ИКХХХЖХХгІ ХВ ХУ КАХО
ФІГ. 10 ї о 15773 ж вавхіза МО аМа..В УКТОКУЛІВО СББСЬКаМЬ МОЖВУМЕНУХ ЗБЗБИМКІ, я ізЗия Об звацізаз МІК ВОМО БВ ЗІАСРЬРКЕА БЕБАУМУЖТЕ БТБЕББТСІ МТК, Аза в сназївз МОМКВОоНВОБе УМОВ аМ КОТІВ ОМКО РУЗБАААТХ БОМММССОКУ 13336 Б сназіз ,,.МТНШКУХ чБЮВКВТТЬ КТІТУШоЕМІ РІЖБШБЕВТХ ЕМРЕКНКЦОК ПКТ? сееввизухх хуУхтуххтчя есе зу ХУххч т хжччсавввае Б 125 ТУТ Є затізав о 0....УБЖ ІКЕСЕУКОТІ. ПЕЩМКББВБ.В БТ МУОКОо МЕБЕШЖОВАХ 1304 С вав 0 осо БОШОК ТЕЖУВЛЛОКІ ПІІ АВВЕЖВ КВК АМЕ УПАВ СИХ іа А свзіха 000. КВЕКТОІ КОПУКЕМОМЕ ПОАМКІННШК.. БЕЖІТБВКИМ МБО АТЮМКХ 1 в сва1їів ОТО КААВЕММІ УМАБВКІТВМІ ПЕММОИЯК.. ...ТМБВАХЕ УПЕПЕПІМК ОЗКІК ухххххчахх ФФеФевюююто зУхуххххч ««хчечстежен фаюивьхикхх 15РБРР ОО шаціуе ОБАМА КСВВ АРАЗЕКОЇУА БАБІ К СМ ТЬИКІ УПИВОБАУМО їззи8 З жхасічя ДУ. МКК ТЕР ІУМ БАБКА ТЗІ ОКІ УМЕСЕМАУМУ 13525 х снаїїв ВЕЖМОБКеЕ ВІ шРЕКУМО ЕАКОоКВІЛЬЕ БОС ТЬаВІ ЗЕВС 198525 3 їВБаїіїа ТБЕЩ.УКЕВХ АБНМЕБПЕЇСМ ВАКСКОЇУМЕ ОХ ТЬШвІ ЗЕВЕОИВККЕ сан я? вежа юю юю хх ххх я МЖК СЮЖЕТУ ІМИРЕБОЖАЮ
ФІГ. ПА Б иа: ЗіБ вабіта ОРУМВАДУКМУ ДИЖЕВЕАЇМЕ пИБВМЕУЖЕК ЗКІЕКЕБОУХВО ВЕОМІМАВО із ОО ваїтітв ПЕКМЕОАУКЯУ ДЕБЕВТАТІ чКиВОКУОК УКБТЕБЖУВС НОВІ У їі В Ева Ма БАМяВАУСЄМУ АКЕУКРТАТІВ ЗВО УЖКК УМІВ ЖАСЇ ЗНОМОЇМВЕА іБз5 в 5ваіа ОНЕККЕУУКВУ АЕМЕЕТАТУХ СОБЗІЕКЕВЕ тУСУККІУЖАС ВНСМОІКОКУ сх спав? Ав КІЗВЕ ЕВ ІУЖ шва І МАК ТО ПІВМІС НАСК, ж х
ЕНН. З 1575 Ов закіча АМНЕКААК.. КД МКСАМІВОБАН КЕТІ МІВЕВУТ КІ ЛОМУВОИХ ізз-а б о вацуча ВКБОІщООНУ ЕСТЕЕТОВЕО КЕУМОКОВАВ ЖКБРМІШЕУХ ККЕСЗЕЗІКОІ їз А сБа1ї3з ЧНЕМВМОСЗ.. ск МЕВУБЕСОКАВ ВКЕБМІШЕЖМУХ МІВ ККІ еЗнІК? жк яжжжжж ххх кк» МОТУЄМНИОВИ КЕКОУКОВАУ БЕК Е жк зай КАК, ВА ік; ОО вакісв ОБСАТУЮКМКЕ СУБУМНЕНЕУК КИНУВ УМЕУБЕАКЕА ИЕУТМСВМУХ 18524 2 Еайхоа БОАЕМЕОВКЕ сСУудУумнУУа вНрсвУВОМх ЗТаУБКЕМХЕо КЕНЕ КАКМ 1905 доїБаїія ВОоВичЕММКЕ СтБ5чЕКНУЮЄ БЖКшКААКУ УК ІМЙЕЕ БКЕТОСШВКУЄ ІГОІВ
ЗБ щу ух чек хіх ут дю св тех у ху дух МІК СХ тех ФТУК ІІ У ІБ 0 васіїха ОБУВВУТІМОК ОКА ММ ОКЕМУЇ БІХІОБОВКІО КИЗЕКУБВИМ 15534 0 вакітва ОЕЗЕБВУТІНМИ СКАЖЕ В ші КЕСУЬ ВІХУСОСИТО ЕПУЕКУЬКАМ КЕ кв її ІЗ УІх УМ сім щіІКищх М тлу ех, зжУїгвІМУЗуМиМих: ХІМ шхУ І гХ ї--иЗ Б Казав БІК РІЮКоК СКАЖЕ БОКС БІС КОХ ЗТ Во ен во 1 сх тотем смт сети їмеуУ ТОМУ ТВ ВІТ УФ їжа в КвЗіїз БІВ ТІКШОК сСАБМЕБОКО МУХЕМЕОСОУМ ВУХ КОВО КОАЕЖУТКЕХ сем ха бу Ум жК сх т мех тУух ХО ж вх пика можмтм НОВ КОКО ЧРОУМК Є сю АТКБУНОВВР АТІВООСКФО КААЖЕАНОЮ.
жа дж ке ї35 ЖЕ Їх шу Мах пе УФУужхУЄ тгхУМВВвОсОТУ МУ сх пу УМІ МАХ ж ет ХУСТ У же їз? З шасача МОЗКУ СУККЕТЕВЕХ БЕВООБКУМЕ БЕБМЕКУКИВК КВУ... сан то о че су гУЄМ У Ж ку ТУЄтТУВ М пу ут В Іх АХ зе сх ку їайна ОЗ васіма БіЗЕСОКБУВ БУКККОТЮАКВХУ БУБОАКУМЕ БЕБІ ЖЕ. ск. хм ох Віа хУМціОуУтт ж пліт КВ У шли лІДІ Му жим ча в хваваа ЕМНОХОБУ ВУККОЕМАКУ ПЕКИ КУМЕ БОЕЗІМУТМИКИА ШО,» "виз ск КА тзучузуМ у ху ІЕС м ЧИТИ Х пут І му дО КУКИ іх Б й свзіїхв ОсООЕОТБМ БУБКОЕМАМУ ІСП УМКЕ ЖЕН КУЮИКК КРУТЕ сети ння утт шви ку и Кік іІИТіІнаК дет еЩщУТ М ух У щІх ОЗАТЕ «їх «ВЕЬТІ БУСЕОКТНАК ВЕЗАБУТЕМИ КІТККТЕМОО УСККО,
ги тИТЬВпИНиИШиІк ьіЬяюи и, ш шц Й ьжиитннтфдчц ти Бщ тати и ииВвВв нин Ш6ТИ КК
UAA201401195A 2011-07-15 2012-07-16 Спосіб підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу UA115768C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161508609P 2011-07-15 2011-07-15
US201161522588P 2011-08-11 2011-08-11
PCT/US2012/046888 WO2013012788A2 (en) 2011-07-15 2012-07-16 Methods of increasing yield and stress tolerance in a plant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA115768C2 true UA115768C2 (uk) 2017-12-26

Family

ID=46584380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201401195A UA115768C2 (uk) 2011-07-15 2012-07-16 Спосіб підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9556449B2 (uk)
CN (1) CN103717732B (uk)
AU (1) AU2012284205B2 (uk)
BR (1) BR112014000580A2 (uk)
CA (1) CA2841782A1 (uk)
MX (1) MX347810B (uk)
RU (1) RU2632569C2 (uk)
UA (1) UA115768C2 (uk)
WO (1) WO2013012788A2 (uk)
ZA (1) ZA201400194B (uk)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8361067B2 (en) 2002-09-30 2013-01-29 Relievant Medsystems, Inc. Methods of therapeutically heating a vertebral body to treat back pain
US10028753B2 (en) 2008-09-26 2018-07-24 Relievant Medsystems, Inc. Spine treatment kits
WO2013012643A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 Syngenta Participations Ag Polynucleotides encoding trehalose-6-phosphate phosphatase and methods of use thereof
US10390877B2 (en) 2011-12-30 2019-08-27 Relievant Medsystems, Inc. Systems and methods for treating back pain
US10588691B2 (en) 2012-09-12 2020-03-17 Relievant Medsystems, Inc. Radiofrequency ablation of tissue within a vertebral body
CA3093398C (en) 2012-11-05 2022-05-24 Relievant Medsystems, Inc. Systems and methods for creating curved paths through bone and modulating nerves within the bone
US9724151B2 (en) 2013-08-08 2017-08-08 Relievant Medsystems, Inc. Modulating nerves within bone using bone fasteners
US20150185196A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-02 Dow Agrosciences Llc Characterization of field sites for utility in agronomic stress trials
BR112018002068A2 (pt) 2015-08-03 2018-09-25 Monsanto Technology Llc métodos e composições para tolerância a herbicida em plantas
CN105954221B (zh) * 2016-05-10 2019-02-15 中国科学院地球化学研究所 一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法
AU2017301813B2 (en) 2016-07-29 2023-06-15 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for gene expression in plants
KR20200110816A (ko) * 2018-02-16 2020-09-25 서울대학교산학협력단 수확량이 증가된 형질전환 식물체
CN108977439B (zh) * 2018-09-03 2022-05-10 中国农业科学院作物科学研究所 一种辅助鉴定小麦冠层温度性状的方法及其专用引物组
CN109161537B (zh) * 2018-10-16 2021-09-14 福建农林大学 Tppi基因在调控植物气孔开度和提高植物抗旱性中的应用
AU2020346827A1 (en) 2019-09-12 2022-03-31 Relievant Medsystems, Inc. Systems and methods for tissue modulation
CN110804623A (zh) * 2019-11-28 2020-02-18 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaMADS6基因在调控植物穗和籽粒发育以及开花时间中的应用
WO2021138288A1 (en) * 2019-12-31 2021-07-08 Inari Agriculture, Inc. Delivery of biological molecules to plant cells
CN111567338B (zh) * 2020-05-25 2021-07-06 华东师范大学 一种提高玉米高温胁迫下光合碳同化能力的方法
US12082876B1 (en) 2020-09-28 2024-09-10 Relievant Medsystems, Inc. Introducer drill
CA3202650A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Relievant Medsystems, Inc. Prediction of candidates for spinal neuromodulation

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
ATE225853T1 (de) 1990-04-12 2002-10-15 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische promotoren
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5187267A (en) 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
US5604121A (en) 1991-08-27 1997-02-18 Agricultural Genetics Company Limited Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
KR100386337B1 (ko) 1993-12-09 2004-03-24 토마스 제퍼슨 대학교 진핵세포에서부위-특이적돌연변이를위한화합물과그방법
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
IN1997CH00924A (en) * 1996-05-03 2005-03-04 Syngenta Mogen Bv Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate
US7214858B2 (en) * 1999-03-31 2007-05-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant genes encoding trehalose metabolism enzymes
ATE480140T1 (de) 1999-07-22 2010-09-15 Nat Inst Of Agrobio Sciences Verfahren zur superschnellen transformation von monokotyledonen
US20060260012A1 (en) 2002-06-22 2006-11-16 Syngenta Participations Ag Method of transforming soybean
CA2519009C (en) 2003-03-12 2012-02-07 Evogene Ltd. Nucleotide sequences regulating gene expression and constructs and methods utilizing same
US8129588B2 (en) * 2004-04-20 2012-03-06 Syngenta Participations Ag Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue
US20080148432A1 (en) 2005-12-21 2008-06-19 Mark Scott Abad Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CA2671341A1 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Cropdesign N.V. Plants having enhanced seed yield and method of making the same comprising expressing a class iii tpp polypeptide
BRPI0720084A2 (pt) * 2006-12-15 2014-01-21 Cropdesign Nv Métodos para rendimento de semente aumentado em plantas em relação às plantas de controle, e para a produção de uma planta transgênica, planta, parte da planta ou célula da planta, molécula de ácido nucleico isolada, polipeptídeo isolado, construção, usos de uma construção e de um ácido nucleico, partes colhíveis de uma planta, e, produtos
US20080229447A1 (en) 2007-03-12 2008-09-18 Syngenta Participations Ag Transformation of immature soybean seeds through organogenesis
NL1033850C2 (nl) 2007-05-15 2008-11-18 3Force B V Brandersysteem met voorgemengde branders en vlam-overdrachtsmiddelen.
ES2624276T3 (es) 2009-06-11 2017-07-13 Syngenta Participations Ag Un método para la expresión transitoria de ácidos nucleicos en plantas
WO2011013764A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20140143908A1 (en) 2014-05-22
RU2632569C2 (ru) 2017-10-05
US9556449B2 (en) 2017-01-31
WO2013012788A3 (en) 2013-04-11
RU2014105505A (ru) 2015-08-27
CA2841782A1 (en) 2013-01-24
MX347810B (es) 2017-05-15
BR112014000580A2 (pt) 2017-03-01
ZA201400194B (en) 2014-09-25
AU2012284205A1 (en) 2014-01-23
CN103717732B (zh) 2017-02-15
CN103717732A (zh) 2014-04-09
AU2012284205B2 (en) 2016-11-17
WO2013012788A2 (en) 2013-01-24
MX2014000301A (es) 2014-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA115768C2 (uk) Спосіб підвищення стійкості рослини до абіотичного стресу
US9121033B2 (en) Polynucleotides encoding trehalose-6-phosphate phosphatase and methods of use thereof
EP2164959B1 (en) Method for improving stress resistance in plants and materials therefor
CA3008808A1 (en) Plant traits conferred by isolated polynucleotides and polypeptides
CN104093842B (zh) 改善植物耐旱性、氮利用效率和产量
EP3169785B1 (en) Methods of increasing crop yield under abiotic stress
EA031178B1 (ru) Гены резистентности
AU2017381762B2 (en) Methods of increasing specific plants traits by over-expressing polypeptides in a plant
JP2022531054A (ja) 植物病害に対する抵抗性の遺伝子
US7754945B2 (en) Generation of plants with improved drought tolerance
US20140068811A1 (en) Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding zinc-finger (c3hc4-type ring finger) family polypeptides
JP6191996B2 (ja) 単為結果制御遺伝子およびその利用
US7968768B2 (en) Generation of plants with improved drought tolerance
CN114805510A (zh) 调控抗铝毒转录因子stop1蛋白的基因及其应用
US6635811B1 (en) Pre-harvest sprouting
CN110241130B (zh) 控制植物粒数和粒重的gsn1基因、编码蛋白及其应用
AU2008255131B2 (en) Modification of plant responses to salt (2)
US20160369295A1 (en) Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding dtp4 polypeptides
US12139719B2 (en) Method for increasing cold or frost tolerance in a plant
JP2012024103A (ja) 植物体の着色制御遺伝子、およびその利用
US20230332170A1 (en) Method for increasing cold or frost tolerance in a plant
US20130217019A1 (en) Corn event mzdt09y