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TWI833690B - 低黏度、高濃度之依伏庫單抗調配物及其製備方法 - Google Patents

低黏度、高濃度之依伏庫單抗調配物及其製備方法 Download PDF

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TWI833690B
TWI833690B TW107105962A TW107105962A TWI833690B TW I833690 B TWI833690 B TW I833690B TW 107105962 A TW107105962 A TW 107105962A TW 107105962 A TW107105962 A TW 107105962A TW I833690 B TWI833690 B TW I833690B
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克里斯多福 J 斯洛伊
席克哈 卡納普瑞
伊拉赫 比那巴吉
歡俊 古
喬慕 詹
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美商安進公司
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Abstract

本文提供包含N-乙醯基精胺酸且當與缺乏N-乙醯基精胺酸之調配物相比時具有降低之黏度的PCSK9結合多肽調配物，諸如包含依伏庫單抗(evolocumab)之彼等調配物。本文亦提供調配該等組合物之方法，該等方法為有利的，因為其保存某些組分。該等包含PCSK9結合多肽之調配物可投與至患者以治療及/或預防PCSK9相關疾病、病狀及病症。

Description

低黏度、高濃度之依伏庫單抗調配物及其製備方法
所提出之標的物係關於依伏庫單抗(evolocumab)及其他PCSK9結合多肽之醫藥組合物的領域及降低該等組合物之黏度之方法。特定言之，所提出之標的物係關於包含N-乙醯基精胺酸之依伏庫單抗及其他PCSK9結合多肽的醫藥組合物，及N-乙醯基精胺酸減少高濃度依伏庫單抗及其他PCSK9結合多肽調配物之黏度之用途。此外，所揭示之標的物提出了關於製備該等醫藥組合物之方法。
治療抗體在用於諸如非經腸注射之投與之溶液中經調配。關於在自投與中經皮下投與之產品，需要大於1-2毫升之遞送體積的調配物耐受不良。為了解決此問題，抗體可以高濃度(諸如70 mg/mL至210 mg/mL或更大)經調配，由此降低劑量之大小。
然而，一些高度濃縮之抗體調配物可成為製造及投與之挑戰。例如，在結合PCSK9之單株抗體依伏庫單抗(REPATHA® )之調配中，超過約70 mg/mL之依伏庫單抗濃度具有增加的黏度。然而，依伏庫單抗之有效劑量為210 mg Q2W或420 mg Q4W。高黏度調配物不僅難以在製造期間(包括在堆積及填充階段)處置，而且其難以進入注射器中及注射，使得難以向患者投與且使人不愉快。
為了降低抗體調配物之黏度，未經修飾之精胺酸、甘胺酸、絲胺酸或脯胺酸胺基酸已添加至抗體組合物中。例如，含有80 mg/mL之抗體及75 mg/mL至約125 mg/mL之精胺酸的抗體調配物可經凍乾且復原至120-200 mg/mL；最終精胺酸濃度可為431 mM至718 mM (Morichika及Kameoka, 2007)。當與對照物相比時，精胺酸降低該等調配物之黏度(Morichika及Kameoka, 2007)。此外，精胺酸之效應不足以降低依伏庫單抗黏度至所需水準。
此項技術中需要用比精胺酸更有效之化合物降低含依伏庫單抗及其他PCSK9結合多肽之調配物的黏度。
在第一態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含 a. PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； 及 b. N-乙醯基精胺酸， 其中該醫藥組合物具有至少小於約80 cP之黏度。在該第一態樣中，該PCSK9結合多肽可為包含重鏈多肽之單株抗體，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)： a. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及 b. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。此外，在此第一態樣中，該醫藥組合物可具有至少小於約50 cP之黏度。該醫藥組合物可具有約250至約400 mOsm/kg，諸如約300 mOsm/kg之重量滲透濃度，或對人類血細胞等滲。該PCSK9結合多肽之濃度可為約140 mg/mL至約260 mg/mL，諸如210 mg/mL。該N-乙醯基精胺酸可以約25 mM至約230 mM，諸如140 mM至約170 mM或140 mM之濃度存在。此態樣之醫藥組合物可進一步包含緩衝液，諸如選自由乙酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸及磷酸鹽緩衝液或其組合組成之群之緩衝液。該緩衝液可以約5 mM至約30 mM之濃度存在。在一些情況下，該緩衝液為乙酸鈉且以約10 mM之濃度存在。該等醫藥組合物之pH可為約4.8至約6.9，諸如約5.4之pH。此態樣之醫藥組合物可進一步包含界面活性劑，諸如選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群之界面活性劑。該界面活性劑可以約0.0001% (w/v)至約1% (w/v)之濃度存在。在此態樣之一些醫藥組合物中，該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)且以約0.01% (w/v)之濃度存在。此外，此態樣之醫藥組合物可進一步包含脯胺酸，其可以約50 mM至約150 mM，諸如90至120 mM或約120 mM之濃度存在。在一些情況下，此第一態樣之醫藥組合物可進一步包含精胺酸鹽，其可以約25 mM至約150 mM，諸如約50 mM至約100 mM之濃度存在。該精胺酸鹽可為例如精胺酸-HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽。在一些情況下，該精胺酸鹽為精胺酸HCl且以約50 mM之濃度存在。當在約-30℃或更冷情況下儲存於此第一態樣之醫藥組合物中時，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少約兩年或甚至五年或更久。在5℃下，該PCSK9結合多肽可在該等醫藥組合物中穩定持續至少約六個月至約24個月或更久。在25℃下，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少約一個月或更久、三個月或更久或甚至六個月或更久。在40℃下，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少一個月或更久。此第一態樣之醫藥組合物可包含PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物，佔總的PCSK9結合多肽濃度之小於約3%，諸如2.5%或更少。
在第二態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含 a. PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. N-乙醯基精胺酸； c. 精胺酸鹽； d. 緩衝液；及 e. 界面活性劑 其中該醫藥組合物具有至少小於約80 cP之黏度。
在此第二態樣中，該PCSK9結合多肽為包含重鏈多肽之單株抗體，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)： a. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及 b. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
此第二態樣之醫藥組合物可具有至少小於約50 cP之黏度。該醫藥組合物可具有約250至約400 mOsm/kg，諸如約300 mOsm/kg之重量滲透濃度，或對人類血細胞等滲。該PCSK9結合多肽之濃度可為約140 mg/mL至約260 mg/mL，諸如210 mg/mL。該N-乙醯基精胺酸可以約25 mM至約230 mM，諸如140 mM至約170 mM或140 mM之濃度存在。此態樣之醫藥組合物可進一步包含緩衝液，諸如選自由乙酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸及磷酸鹽緩衝液或其組合組成之群之緩衝液。該緩衝液可以約5 mM至約30 mM之濃度存在。在一些情況下，該緩衝液為乙酸鈉且以約10 mM之濃度存在。該等醫藥組合物之pH可為約4.8至約6.9，諸如約5.4之pH。此態樣之醫藥組合物可進一步包含界面活性劑，諸如選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群之界面活性劑。該界面活性劑可以約0.0001% (w/v)至約1% (w/v)之濃度存在。在此態樣之一些醫藥組合物中，該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)且以約0.01% (w/v)之濃度存在。此外，此態樣之醫藥組合物可進一步包含脯胺酸；該脯胺酸可以約50 mM至約150 mM，諸如90至120 mM或約120 mM之濃度存在。在一些情況下，此第二態樣之醫藥組合物可進一步包含精胺酸鹽，其可以約25 mM至約150 mM，諸如約50 mM至約100 mM之濃度存在。該精胺酸鹽可為例如精胺酸-HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽。在一些情況下，該精胺酸鹽為精胺酸HCl且以約50 mM之濃度存在。當在約-30℃或更冷情況下儲存於此第二態樣之醫藥組合物中時，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少約兩年或甚至五年或更久。在5℃下，該PCSK9結合多肽可在該等醫藥組合物中穩定持續至少約六個月至約24個月或更久。在25℃下，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少約一個月或更久、三個月或更久或甚至六個月或更久。在40℃下，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少一個月或更久。此第二態樣之醫藥組合物可包含PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物，佔總的PCSK9結合多肽濃度之小於約3%，諸如2.5%或更少。
在第三態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. 以約140 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； c. 以約50 mM之濃度存在的精胺酸HCl； d. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015% (w/v)之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 e. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
在此第三態樣中，該醫藥組合物可具有約5.1至約5.7之pH，諸如約5.4之pH。該醫藥組合物可具有至少小於約50 cP之黏度。
在第四態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 b. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； c. 以約140 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； d. 以約63 mM之濃度存在的精胺酸HCl； e. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015%之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 f. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
在此第四態樣中，該醫藥組合物可具有約5.1至約5.7之pH，諸如約5.4之pH。該醫藥組合物可具有至少小於約80 cP之黏度。
在第五態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. 以約155 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； c. 以約70 mM之濃度存在的精胺酸HCl； d. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015% (w/v)之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 e. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
在此第五態樣中，該醫藥組合物可具有約5.1至約5.7之pH，諸如約5.4之pH。該醫藥組合物可具有至少小於約45 cP之黏度。
在第六態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. 以約170 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； c. 以約63 mM之濃度存在的精胺酸HCl； d. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015%之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 e. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
在此第六態樣中，該醫藥組合物可具有約5.1至約5.7之pH，諸如約5.4之pH。該醫藥組合物可具有至少小於約60 cP之黏度。
在第七態樣中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. 以約155 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； c. 以約120 mM之濃度存在的脯胺酸； d. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015% (w/v)之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 e. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
在此第七態樣中，該醫藥組合物可具有約5.1至約5.7之pH，諸如約5.4之pH。該醫藥組合物可具有至少小於約60 cP之黏度。
在此等第三至第七態樣中，當在約-30℃或更冷情況下儲存於此等態樣之醫藥組合物中時，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少約兩年或甚至五年或更久。在5℃下，該PCSK9結合多肽可在該等醫藥組合物中穩定持續至少約六個月至約24個月或更久。在25℃下，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少約一個月或更久、三個月或更久或甚至六個月或更久。在40℃下，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少一個月或更久。此等態樣之醫藥組合物可包含PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物，佔總的PCSK9結合多肽濃度之小於約3%，諸如2.5%或更少。
在前述態樣中之任一者中，該醫藥組合物可為液體。
在第八態樣中，本文揭示一種治療有需要之個體之方法，該方法包含投與前述七個態樣中的任一者之醫藥組合物。
在第九態樣中，本文揭示一種套組，其包含第一至第七態樣中之任一者的醫藥組合物及遞送装置。該遞送装置可選自由注射器、注射筆、主體注射器及自動注射器組成之群。該套組可進一步包含關於使用該遞送装置投與該醫藥組合物之說明書。
在第十態樣中，本文揭示一種製備包含至少140 mg/mL之PCSK9結合多肽的PCSK9結合多肽醫藥組合物之方法，該方法包含向包含該PCSK9結合多肽之醫藥組合物中添加有效量的N-乙醯基精胺酸，使得當與缺乏N-乙醯基精胺酸之該醫藥組合物相比時，該醫藥組合物之黏度降低，且其中該PCSK9結合多肽選自由以下組成之群： a. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； b. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； c. 單株抗體，其包含： i. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 ii. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； d. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238；及 e. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： i. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 ii. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 iii. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊。
在此第十態樣中，該醫藥組合物之黏度小於約80 cP，或小於約50 cP。此態樣之方法之醫藥組合物可具有約250至約400 mOsm/kg，諸如約300 mOsm/kg之重量滲透濃度，或對人類血細胞等滲。該PCSK9結合多肽之濃度可為約140 mg/mL至約260 mg/mL，諸如210 mg/mL。該N-乙醯基精胺酸可以約25 mM至約230 mM，諸如140 mM至約170 mM或140 mM之濃度存在。此態樣之醫藥組合物可進一步包含緩衝液，諸如選自由乙酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸及磷酸鹽緩衝液或其組合組成之群之緩衝液。該緩衝液可以約5 mM至約30 mM之濃度存在。在一些情況下，該緩衝液為乙酸鈉且以約10 mM之濃度存在。該等醫藥組合物之pH可為約4.8至約6.9，諸如約5.4之pH。此態樣之醫藥組合物可進一步包含界面活性劑，諸如選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群之界面活性劑。該界面活性劑可以約0.0001% (w/v)至約1% (w/v)之濃度存在。在此態樣之一些醫藥組合物中，該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)且以約0.01% (w/v)之濃度存在。此外，此態樣之醫藥組合物可進一步包含脯胺酸；該脯胺酸可以約50 mM至約150 mM，諸如90至120 mM或約120 mM之濃度存在。在一些情況下，此第十態樣之醫藥組合物可進一步包含精胺酸鹽，其可以約25 mM至約150 mM，諸如約50 mM至約100 mM之濃度存在。該精胺酸鹽可為例如精胺酸-HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽。在一些情況下，該精胺酸鹽為精胺酸HCl且以約50 mM之濃度存在。當在約-30℃或更冷情況下儲存於此第十態樣之醫藥組合物中時，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少約兩年或甚至五年或更久。在5℃下，該PCSK9結合多肽可在該等醫藥組合物中穩定持續至少約六個月至約24個月或更久。在25℃下，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少約一個月或更久、三個月或更久或甚至六個月或更久。在40℃下，該PCSK9結合多肽可穩定持續至少一個月或更久。此第十態樣之醫藥組合物可包含PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物，佔總的PCSK9結合多肽濃度之小於約3%，諸如2.5%或更少。
在第十一態樣中，本文揭示一種調配治療多肽之方法，該方法包含 a. 第一濃縮步驟，其中濃縮第一溶液中之該多肽； b. 第一溶液交換步驟，其中該第一溶液中之經濃縮多肽使用透濾經交換至包含N-乙醯基精胺酸之第二溶液中； c. 第二濃縮步驟，其中濃縮該第二溶液中之該多肽； d. 第二溶液交換步驟，其中該經濃縮第二溶液中之該多肽使用透濾經交換至包含N-乙醯基精胺酸之第三溶液中；及 e. 第三濃縮步驟，其中濃縮該第三溶液中之該多肽； 其中該治療多肽包含PCSK9結合多肽，該PCSK9結合多肽阻斷PCSK9結合於LDLR且選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGFa結構域的結合位點重疊。
在此第十一態樣之方法中，阻斷PCSK9結合於LDLR之該PCSK9結合多肽可為包含重鏈多肽之單株抗體，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)： a. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO: 7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及 b. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
此外，在此第十一態樣中，在第三濃縮步驟之前，該包含該多肽之溶液的溫度可增加至約25℃至約37℃。又，第一溶液交換步驟可使用至少三個置換體積之該第二溶液來實現。在此第十一態樣之一些子態樣中，第二溶液交換步驟使用至少四個置換體積之該第三溶液來實現。在其他子態樣中，該治療蛋白之初始濃度為約11 mg/mL或更少。另外，該治療多肽濃度可增加約3倍至約7倍，諸如其中該多肽之增加的濃度為約35 mg/mL至約70 mg/mL。在一些子態樣中，在第二濃縮步驟中，該治療多肽濃度自第一濃縮步驟增加約2倍至4倍，諸如至約140 mg/mL。在第三濃縮步驟中，該治療多肽濃度可自第二濃縮步驟增加約1.5倍至約2倍，諸如至約260 mg/mL。該治療多肽可因此具有與該治療多肽之初始濃度相比進一步濃縮至少約19-20倍之最終濃度，諸如約210 mg/mL。該等濃縮步驟可包含分批饋料超濾；此外，該第二溶液及該第三溶液可為一致的。例如，包含N-乙醯基精胺酸之第二或第三溶液可包含精胺酸鹽及緩衝液，其中例如，該N-乙醯基精胺酸以約25 mM至約230 mM之濃度存在；該精胺酸鹽為Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽且以約25 mM至約150 mM之濃度存在；且該緩衝液為濃度為約5 mM至約30 mM的乙酸鈉緩衝液。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約140至約170 mM之濃度存在；該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63至約70 mM之濃度存在且該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約140 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約155 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約70 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約170 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。此外，該等組合物可進一步包含脯胺酸，其中該脯胺酸以約50 mM至約150 mM之濃度存在。該第二或第三溶液可具有約4.8至約6.9之pH，諸如5.4。在第一及第二溶液交換步驟中，可使用透濾膜，其具有選自由以下組成之群之至少一種特徵： a. 大於約350 µm但小於或等於約500 µm之網眼； b. 大於膜面積之約32%但小於或等於約36%之開放面積； c. 小於約16.2 n/cm但大於或等於約12.2 n/cm之網目數； d. 大於約270 µm但小於或等於約340 µm之網線直徑； e. 大於約160 g/m2 但小於或等於180 g/m2 之基礎重量； f. 大於約515 µm但小於或等於約610 µm之厚度； g. 大於約1138.1 g/m2 但小於或等於約1919.3 g/m2 之膜負載；及 h. 約60 psi之最大饋料壓力。 此外，界面活性劑可在該第三溶液經濃縮之後添加至其中，諸如選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群之界面活性劑。該界面活性劑可以約0.0001% (w/v)至約1% (w/v)之濃度存在。在此態樣之一些醫藥組合物中，該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)且以約0.01% (w/v)之濃度存在。
在第十二態樣中，本文揭示一種調配治療多肽之方法，該方法包含 a. 第一濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾來濃縮第一溶液中之該多肽； b. 第一溶液交換步驟，其中該第一溶液中之經濃縮多肽使用透濾及三個置換體積之包含N-乙醯基精胺酸、精胺酸鹽及緩衝液之第二溶液經交換至該第二溶液中； c. 第二濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾來濃縮該第二溶液中之該多肽； d. 第二溶液交換步驟，其中該經濃縮第二溶液中之該多肽使用透濾及四個置換體積之包含N-乙醯基精胺酸、精胺酸鹽及緩衝液之第三溶液經交換至該第三溶液中； e. 在該第二溶液交換步驟之後，增加該包含該多肽之溶液的溫度至約25℃至約37℃；及 f. 第三濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾濃縮進一步濃縮該多肽； 其中在第一及第二溶液交換步驟中，使用透濾膜，其具有選自由以下組成之群之至少一種特徵： a. 大於約350 µm但小於或等於約500 µm之網眼； b. 大於膜面積之約32%但小於或等於約36%之開放面積； c. 小於約16.2 n/cm但大於或等於約12.2 n/cm之網目數； d. 大於約270 µm但小於或等於約340 µm之網線直徑； e. 大於約160 g/m2 但小於或等於180 g/m2 之基礎重量； f. 大於約515 µm但小於或等於約610 µm之厚度； g. 大於約1138.1 g/m2 但小於或等於約1919.3 g/m2 之膜負載；及 h. 約60 psi之最大饋料壓力； 且 其中該治療多肽包含PCSK9結合多肽，該PCSK9結合多肽阻斷PCSK9結合於LDLR且選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGFa結構域的結合位點重疊。
此外，在此第十二態樣中，第一溶液交換步驟可使用至少三個置換體積之該第二溶液來實現。在此第十二態樣之一些子態樣中，第二溶液交換步驟使用至少四個置換體積之該第三溶液來實現。在其他子態樣中，該治療蛋白之初始濃度為約11 mg/mL或更少。另外，該治療多肽濃度可增加約3倍至約7倍，諸如其中該多肽之增加的濃度為約35 mg/mL至約70 mg/mL。在一些子態樣中，在第二濃縮步驟中，該治療多肽濃度自第一濃縮步驟增加約2倍至4倍，諸如至約140 mg/mL。在第三濃縮步驟中，該治療多肽濃度可自第二濃縮步驟增加約1.5倍至約2倍，諸如至約260 mg/mL。該治療多肽可因此具有與該治療多肽之初始濃度相比進一步濃縮至少約19-20倍之最終濃度，諸如約210 mg/mL。該等濃縮步驟可包含分批饋料超濾；此外，該第二溶液及該第三溶液可為一致的。該N-乙醯基精胺酸以約25 mM至約230 mM之濃度存在；該精胺酸鹽可為Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽，其中該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約25 mM至約150 mM之濃度存在；且該緩衝液為濃度為約5 mM至約30 mM的乙酸鈉緩衝液。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約140至約170 mM之濃度存在；該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63至約70 mM之濃度存在且該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約140 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約155 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約70 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約170 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。此外，該等組合物可進一步包含脯胺酸，其中該脯胺酸以約50 mM至約150 mM之濃度存在。該第二或第三溶液可具有約4.8至約6.9之pH，諸如5.4。此外，界面活性劑可在該第三溶液經濃縮之後添加至其中，諸如選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群之界面活性劑。該界面活性劑可以約0.0001% (w/v)至約1% (w/v)之濃度存在。在此態樣之一些醫藥組合物中，該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)且以約0.01% (w/v)之濃度存在。
在第十三態樣中，本文揭示一種調配治療多肽之方法，該方法包含 a. 第一濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾來濃縮第一溶液中之該多肽； b. 第一溶液交換步驟，其中該第一溶液中之經濃縮多肽使用透濾及三個置換體積之第二溶液經交換至該第二溶液中； c. 第二濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾來濃縮該第二溶液中之該多肽； d. 第二溶液交換步驟，其中該經濃縮第二溶液中之該多肽使用透濾及四個置換體積之第三溶液經交換至該第三溶液中； e. 在該第二溶液交換步驟之後，增加該包含該多肽之溶液的溫度至約25℃至約37℃；及 f. 第三濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾濃縮進一步濃縮該多肽； g. 或者，添加濃度為約0.01% (w/v)之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)至該第三濃縮步驟之所得溶液中的步驟， 其中該等第二及第三溶液包含選自由以下組成之群之溶液：包含約140 mM N-乙醯基精胺酸、約50 mM Arg HCl及約10 mM乙酸鈉的溶液，該溶液具有約5.2之pH；包含約155 mM N-乙醯基精胺酸、約70 mM Arg HCl及約10 mM乙酸鈉的溶液，該溶液具有約5.4之pH；及包含約170 mM N-乙醯基精胺酸、約10 mM乙酸鈉的溶液，該溶液具有約5.6之pH； 其中在第一及第二溶液交換步驟中，使用透濾膜，其具有選自由以下組成之群之至少一種特徵： a. 大於約350 µm但小於或等於約500 µm之網眼； b. 大於膜面積之約32%但小於或等於約36%之開放面積； c. 小於約16.2 n/cm但大於或等於約12.2 n/cm之網目數； d. 大於約270 µm但小於或等於約340 µm之網線直徑； e. 大於約160 g/m2 但小於或等於180 g/m2 之基礎重量； f. 大於約515 µm但小於或等於約610 µm之厚度； g. 大於約1138.1 g/m2 但小於或等於約1919.3 g/m2 之膜負載；及 h. 約60 psi之最大饋料壓力； 且 其中該治療多肽包含PCSK9結合多肽，該PCSK9結合多肽阻斷PCSK9結合於LDLR且選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGFa結構域的結合位點重疊。
相關申請案
本申請案主張2017年2月22日申請之美國臨時專利申請案第62/462,266號的權益，該美國臨時專利申請案以引用之方式整體倂入本文。 序列表
本申請案與呈電子格式之序列表一起申請。該序列表以2018年1月31日創建之標題為「A-2112-WO-PCT_sequence_listing_ST25.txt」的文件之形式提供並且大小為21 KB。該序列表之電子格式中的資訊以引用之方式整體倂入本文。
本發明人已意外地發現，與未乙醯化精胺酸相比，精胺酸衍生物N-乙醯基精胺酸(NAR)更加有效地降低包含高濃度(大於100 mg/mL，諸如140 mg/mL及更大)依伏庫單抗之醫藥組合物的黏度。具有50 cP或更低黏度之醫藥組合物經得起製造及患者投與而無顯著複雜化，而較高黏度製劑難以處置(諸如當注射器經填充時)及投與。雖然已知未經修飾之精胺酸會降低高蛋白濃度調配物之黏度，但精胺酸麩胺酸鹽僅降低可相當之含脯胺酸依伏庫單抗(210 mg/mL)調配物之黏度達50 cP (自159 cP至109 cP)，實質上高於50 cP或更低之靶標。此外，單獨精胺酸單鹽酸鹽(精胺酸HCl)添加不會實現此目的，使該含脯胺酸調配物之黏度自159 cP降低至70 cP。然而，NAR實現進一步降低黏度至58 cP之意外效應—相對於脯胺酸調配物超過101 cP之降低，且當與Arg HCl組合(以增加NAR之溶解度且實現等滲調配物)時，實現低於50 cP之黏度；實際上，該目的經超出7 cP，該調配物具有43 cP之黏度。參見圖2。由於NAR溶解度局限於低於230 mM，必需另一賦形劑來實現用於皮下投與之等滲調配物。精胺酸之鹽酸鹽比諸如麩胺酸鹽之其他精胺酸鹽更有效降低依伏庫單抗黏度的意外發現對於使調配物黏度降至最低至關重要。
另一意外發現在於在NAR及精胺酸HCl存在下可見之pH依賴性依伏庫單抗穩定性及黏度效應。在高溫下在低於5.0之pH下可見依伏庫單抗聚集速率之顯著增加。又，隨著pH自pH 5.1增加至6.9，觀察到黏度之pH依賴性減少。
本發明人進一步發現，兩步驟超濾/透濾(UF/DF)過程可製備該等含NAR、高依伏庫單抗濃度醫藥調配物，與傳統一步驟傳統過程相比NAR材料具有顯著節省。該等方法允許顯著成本節省，因為NAR比Arg HCl貴約十倍。定義
前述一般描述及以下詳細描述均僅為例示性及解釋性的且不具限制性。除非另外特定地規定，否則單數之使用包括複數。除非另外規定，否則「或」之使用意謂「和/或」。術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)之使用不具限制性。除非另外特定地規定，否則諸如「元素」或「組分」之術語涵蓋包含一個單元之元素及組分與包含超過一個子單元之元素及組分。術語「部分(portion)」之使用可包括一種部分(moiety)之部分或整個部分。當提及數值範圍(例如，1-5)時，明確地包括所有介於中間之值，諸如1、2、3、4及5，以及其分數，諸如1.5、2.2、3.4及4.1。
「約(About)」或「約(~)」意謂當修飾一個量時(例如，「約」3 mM)，圍繞該經修飾之量之變化可發生。此等變化可藉由多種方式，諸如典型量測及處置程序、因疏忽所致的錯誤、成分純度及其類似方式而發生。
「N-乙醯基精胺酸」 (NAR)意謂式1之分子。
「添加劑」在醫藥組合物之情況下意謂天然地並非材料(例如，原料藥)之部分而是故意地添加以實現一些特定目的(例如，保藏、黏度降低、穩定化)之物質。
「類似物」係指相對於親本序列具有插入、缺失或取代，同時如使用生物分析所測定仍實質上維持親本序列之生物活性之胺基酸序列。類似物包括具有經修飾糖基化之多肽、無糖基化之多肽。調配物亦可包括天然地存在或類似物多肽之衍生物，該等衍生物已經化學修飾，例如以附接水溶性聚合物(例如，PEG化)、放射性核素或其他診斷或靶向或治療部分。
「抗體」係指任何同型之完整免疫球蛋白，且包括例如嵌合、人類化、人類及雙特異性抗體。完整抗體一般將包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈。抗體序列可單獨地來源於單一物質，或可為「嵌合的」，亦即，該抗體之不同部分可來源於兩種不同物質。「抗體」亦包括包含兩條實質上全長重鏈及兩條實質上全長輕鏈之抗體，其限制條件在於該等抗體保持與包含兩條全長輕鏈及重鏈之抗體相同或相似的結合及/或功能。例如，在重鏈及/或輕鏈之N端及/或C端處具有1、2、3、4或5個胺基酸殘基取代、插入或缺失之抗體包括於該定義中，其限制條件在於該等抗體保持與包含兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈之抗體相同或相似的結合及/或功能。抗體包括例如單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、雙特異性抗體及合成抗體。
典型抗體結構單元包含四聚體。各該四聚體典型地由兩對一致多肽鏈構成，各對具有一條全長「輕」鏈(約25 kDa)及一條全長「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈之胺基端部分典型地包括約100或110個或更多個胺基酸之可變區，該可變區典型地負責抗原識別。各鏈之羧基端部分典型地界定可負責效應子功能之恆定區。輕鏈典型地分類為κ及λ輕鏈。重鏈典型地分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG抗體具有數種亞類，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有包括IgM1及IgM2之亞類。IgA同樣再分為包括IgA1及IgA2之亞類。在全長輕鏈及重鏈內，典型地，該等可變及恆定區由約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約十個或更多個胺基酸之「D」區。各輕/重鏈對之可變區典型地形成抗原接合位點。
該等可變區典型地展現由三個高變區(亦稱作互補決定區或CDR)接合之相對保守構架區(FR)之相同的一般結構。來自各對之兩條鏈之CDR典型地藉由該等構架區比對，其可實現結合至特定抗原決定基。自N端至C端，輕鏈可變區及重鏈可變區均典型地包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸指派給各結構域典型地係根據Kabat (Kabat, Wu, Perry, Gottesman及Foeller, 1991；Kabat, Wu, Reid-Miller, Perry及Gottesman, 1987)或Chothia (Chothia及Lesk, 1987；Chothia等人, 1989)之定義。
代替全長抗體，亦可使用抗體之「片段」或「抗原結合片段」。「抗體片段」係指含有免疫球蛋白之至少一個CDR之Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段，該CDR足以賦予特異性抗原結合於靶標蛋白，諸如PCSK9。
抗體重鏈可在抗體輕鏈不存在下結合於抗原。抗體輕鏈可在抗體重鏈不存在下結合於抗原。抗體結合區可在抗體輕鏈不存在下結合於抗原。抗體結合區可在抗體重鏈不存在下結合於抗原。個別可變區可在其他可變區不存在下特異性結合於抗原。
重鏈中之CDR區典型地稱作H1、H2及H3且依自胺基端至羧基端之方向依序編號。輕鏈中之CDR區稱作L1、L2及L3且依自胺基端至羧基端之方向依序編號。
術語「輕鏈」包括全長輕鏈及具有足以賦予結合特異性之可變區序列之其片段。全長輕鏈包括可變區結構域VL及恆定區結構域CL。該輕鏈之可變區結構域處於該多肽之胺基端處。輕鏈包括κ鏈及λ鏈。
術語「重鏈」包括全長重鏈及具有足以賦予結合特異性之可變區序列之其片段。全長重鏈包括可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。該VH結構域處於該多肽之胺基端處，且該CH結構域處於羧基端處，其中CH3最接近該多肽之羧基端。重鏈可具有任何同型，包括IgG (包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA (包括IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。
各個別免疫球蛋白鏈典型地由數個「免疫球蛋白結構域」構成，各免疫球蛋白結構域由大約90至110個胺基酸組成且具有特徵折疊模式。此等結構域為抗體多肽之基礎單元。在人類中，IgA及IgD同型含有四條重鏈及四條輕鏈；IgG及IgE同型含有兩條重鏈及兩條輕鏈；且IgM同型含有五條重鏈及五條輕鏈。重鏈C區典型地包含一或多個可負責效應子功能之結構域。重鏈恆定區結構域之數目取決於同型。IgG重鏈例如含有三個C區結構域，稱作CH1、CH2及CH3。在某些情況下，抗PCSK9抗體為IgG1或IgG2或IgG4亞型。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體之輕及/或重鏈之一部分，典型地在重鏈中包括大約胺基端120至130個胺基酸且在輕鏈中包括約100至110個胺基端胺基酸。抗體之可變區典型地決定特定抗體對其靶標之特異性。
「抗原」意謂能夠由諸如PCSK9結合多肽(包括例如抗體或其結合片段)之選擇性結合劑結合的分子或分子之一部分。在一些情況下，抗原能夠用於動物中以產生能夠結合於彼抗原之抗體。抗原可具有一或多種能夠與不同PCSK9結合多肽相互作用之抗原決定基。
「精胺酸鹽」意謂精胺酸之鹽。實例包括精胺酸單鹽酸鹽(Arg HCl)、精胺酸乙酸鹽(Arg乙酸鹽)及精胺酸麩胺酸鹽(Arg麩胺酸鹽)。
「緩衝液」意謂任何醫藥學上可接受之緩衝液，包括乙酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸及磷酸鹽緩衝液，及其鹽。
「競爭」當用於競爭相同抗原決定基之抗體的情況下時意謂抗體之間之競爭，如藉由如下分析所測定，其中正在測試之抗體預防或抑制(例如，降低)參考抗體(例如，配位體或參考抗體)特異性結合於共同抗原(例如，PCSK9或其片段)。數種類型之競爭性結合分析可用於確定一種抗體是否與另一抗體競爭，例如：使用多種或技術認可之試劑及標記之固相直接或間接免疫分析。競爭性抑制藉由在測試抗體存在下測定結合於固體表面或細胞之標記之量來量測。測試抗體通常過量存在。藉由競爭分析鑒別之抗體包括與參考抗體結合於相同抗原決定基之抗體及就發生位阻而言結合於足夠接近由參考抗體結合的抗原決定基之相鄰抗原決定基之抗體。通常，當競爭抗體過量存在時，其將抑制(例如，降低)參考抗體與共同抗原之特異性結合達至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更高。在一些情況下，結合經抑制達至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更高。
「透濾」、「DF」及類似術語意謂使用超濾膜(亦即，可區別具有不同形狀及大小之分子的半透膜)自含有例如多肽或其他生物分子之溶液或混合物移除、置換鹽或溶劑或降低鹽或溶劑之濃度。
「置換體積(DV)」在過濾之情況下意謂與滯留物體積相比經引入至單元操作中之透濾緩衝液之體積。
「抗原決定基」包括能夠由諸如抗體之PCSK9結合多肽結合的任何決定子。抗原決定基為抗原中由靶向彼抗原之PCSK9結合多肽結合的區，且當該抗原為蛋白質時，包括直接地接觸該PCSK9結合多肽之特定胺基酸。抗原決定基決定子可包括諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基及磺醯基之分子的化學活性表面分組且可具有特定三維結構特徵及特定電荷特徵。一般而言，對特定靶標抗原具特異性之抗體在蛋白質或其他巨分子之複雜混合物中優先地識別靶標抗原上的抗原決定基。
「賦形劑」意謂在處方中作為稀釋劑或媒劑或當藥物以丸劑形式給予時為了產生形式或一致性添加之或多或少惰性物質；例如，簡單糖漿、植物膠、芳族粉末、蜂蜜及多種酏劑。
「饋料交叉流」意謂饋料流動速率(L/h)除以膜面積(m2 )。
「通量(LMH)」在過濾之情況下意謂公升每小時每平方公尺膜面積(L/h/m2 )。
「高分子量物質」或「HMW物質」在含有治療多肽之醫藥調配物的情況下意謂大於原始治療多肽之治療蛋白，如藉由技術認可之分析所測定。HMW物質包括治療多肽之寡聚物及治療多肽之聚集體。
「滯留體積(HUV)」在過濾之情況下意謂TFF系統之線路體積，包括濾筒之線路體積。
「一致性」係指兩種或兩種以上多肽分子或兩種或兩種以上核酸分子之序列之間的關係，如藉由比對及比較該等序列所測定。「一致性百分比」意謂在經比較之分子中胺基酸或核苷酸之間之一致殘基的百分比且係基於正在比較之分子中的最小分子之大小來計算。關於此等計算，比對之間隙(若存在)較佳地藉由特定數學模型或算法來尋址。此等技術為此項技術中熟知的。
在計算一致性百分比時，典型地比對正在比較之序列以使該等序列之間的最大匹配升至最高。
用於比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可導致僅使該兩個序列之短區匹配，且此小比對區可具有極高序列一致性，即使在兩個全長序列之間無顯著關係。因此，所選擇之比對方法可在必要時經調節以引起跨靶標多肽之所需數目之相鄰胺基酸(例如，50個胺基酸)的比對。
二十種習知胺基酸、非天然胺基酸(諸如a-, a-二取代胺基酸)、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習知胺基酸之立體異構體(例如，D-胺基酸)亦可為用於PCSK9結合多肽之合適組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、g-羧基麩胺酸、e-N,N,N-三甲基離胺酸、e-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、s-N-甲基精胺酸及其他相似胺基酸及亞胺基酸(例如，4-羥基脯胺酸)。
保守胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其典型地藉由化學肽合成而非藉由生物系統中之合成來倂入。其包括擬肽物及其他逆轉或反向形式之胺基酸部分。
在對抗原結合蛋白或PCSK9蛋白作出改變時，可考慮胺基酸之親水指數。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵經指派親水指數。此項技術中瞭解親水胺基酸指數在對蛋白質賦予交互性生物功能中之重要性。某些胺基酸可由具有相似親水指數或評分之其他胺基酸取代且仍保持相似生物活性。
相似胺基酸之取代可基於親水性有效地進行。吾人亦可基於親水性自一級胺基酸序列鑒別抗原決定基。此等區亦稱作「抗原決定基核心區」。
「低分子量物質」或「LMW物質」在含有治療多肽之醫藥調配物的情況下意謂小於原始治療多肽之多肽，如藉由技術認可之分析所測定。LMW物質包括該治療多肽之片段。
如「抗PCSK9中和抗體」中所用之「中和抗體」或「中和靶標之抗體」係指結合於靶標且預防或降低彼靶標的生物活性之抗體。此可例如藉由直接地阻斷靶標上之結合位點或藉由結合於靶標且改變靶標經由間接方式(諸如靶標中的結構或能量改變)結合之能力來進行。在分析抗體或其免疫功能片段之結合及/或特異性時，當過量抗體降低結合於配位體之結合搭配物的量達至少約1-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-98%、98-99%或更高(如在活體外競爭性結合分析中所量測)時，抗體或片段可實質上抑制靶標結合於其結合搭配物。在PCSK9抗體之情況下，該中和分子可削弱PCSK9結合LDLR之能力。在一些情況下，中和能力經由競爭分析來表徵或描述。在一些情況下，中和能力以IC50或EC50值描述。在一些情況下，該等抗體藉由結合於PCSK9且預防PCSK9結合於LDLR，或降低PCSK9結合於LDLR之能力來中和PCSK9。在一些情況下，該等抗體藉由結合於PCSK9，同時仍允許PCSK9結合於LDLR，從而預防或降低PCSK9介導之LDLR降解來進行中和。因此，在一些情況下，中和抗體可仍允許PCSK9/LDLR結合，但預防或降低後續PCSK9牽涉之LDLR降解。中和導致降低LDL-C (及/或其他脂質，諸如ApoB、Lp(a)等)。除抗體外之PCSK9結合多肽，包括該等PCSK結合多肽之變異體可具有此等相同活性。
「PCSK9結合多肽」意謂結合9型蛋白原轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin (PCSK9)蛋白之多肽。在一些情況下，PCSK9結合多肽阻斷PCSK9結合於低密度脂質受體(LDLR)。該等阻斷性PCSK9結合多肽可為單株抗體(mAb)且可為以下之一： a. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的mAb (依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； b. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之mAb； c. 如下mAb，其包含： i. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 ii. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； d. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之mAb，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； e. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之mAb，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： i. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 ii. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 iii. 其中該mAb之該抗原決定基進一步與LDLR之表皮生長因子樣重複序列A (EGF-A)結構域的結合位點重疊；或 f. 包含重鏈多肽之mAb，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)： i. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及 ii. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
所指示之胺基酸序列在表1中提供，表1亦提供了依伏庫單抗之重鏈可變區及輕鏈可變區。依伏庫單抗重鏈及輕鏈全長核苷酸序列在表2中給出，亦給出用於依伏庫單抗HCVR及LCVR之核苷酸序列。
依伏庫單抗為CAS登錄號1256937-27-5。
不影響其PCSK9結合及抑制特性之依伏庫單抗變異體顯示於表3中。
「醫藥組合物」或「醫藥調配物」及其類似術語意謂諸如生物活性蛋白(例如，PCSK9結合多肽)之醫藥活性藥物的組合物，通常無菌，該組合物適用於投與，諸如非經腸投與(包括靜脈內、肌肉內、皮下、煙霧化、肺內、鼻內或鞘內)至有需要之個體且僅包括醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及由美國聯邦藥物管理局或其他外國國家機關認為安全的其他添加劑。醫藥調配物包括液體，例如可直接地投與之水溶液，及凍乾粉末，該等粉末可藉由在投與之前添加稀釋劑而復原成溶液。
「多肽」或「蛋白質」意謂具有原生蛋白之胺基酸序列的巨分子，亦即由天然存在及非重組細胞產生之蛋白質；或藉由經遺傳工程改造之或重組細胞產生，且包含具有原生蛋白之胺基酸序列的分子，或具有原生序列之一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代的分子。該術語亦涵蓋如下胺基酸聚合物，其中一或多種胺基酸為相應天然存在之胺基酸及聚合物之化學類似物。「多肽片段」係指如與全長原生蛋白相比具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。如與原生蛋白相比，該等片段亦可含有經修飾胺基酸。片段可為約5至500個胺基酸長。例如，片段可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸長。適用之多肽片段包括抗體之免疫功能片段，包括結合結構域。在PCSK9結合抗體之情況下，適用片段包括但不限於CDR區、重鏈及/或輕鏈之可變結構域、抗體鏈之一部分或僅其可變區(包括兩個CDR)。
「預防」(諸如症狀、疾病或病症之發作)不需要消除事件之可能性。更確切地，其表示事件發生之可能性在化合物或方法存在下已降低。在治療意義上之預防包括預防性治療及應用，其中預防會降低個體將發展病症或其他風險因素之風險。
「穩定醫藥調配物」、「穩定調配物」或「醫藥調配物穩定」係指當與對照調配物樣品相比時，當在約-30℃(或更冷)至約5℃或至約40℃下儲存至少1個月或2個月或三個月或6個月或1年或2年或5年或更久時，展現增加有限之聚集及/或降低不超過5%的生物活性損失的PCSK9結合多肽之醫藥調配物。調配物穩定性可由熟習此項技術者使用多種標準分析來測定，包括尺寸排阻HPLC (SEC-HPLC)、陽離子交換HPLC (CEX-HPLC)、藉由光阻偵測不可見粒子(「HIAC」)及/或視覺檢查。典型地，儲存溫度愈溫暖，該調配物之儲存壽命愈短。
用於分析降解之技術視醫藥調配物中之蛋白質的身份而變化。例示性技術包括尺寸排阻層析(SEC)-HPLC以偵測例如聚集；逆相(RP)-HPLC以偵測例如蛋白質片段化；離子交換-HPLC以偵測例如蛋白質之電荷改變；質譜分析；螢光光譜法；圓偏光二色性(CD)光譜法；傅立葉轉換紅外光譜法(FT-IR)；及拉曼光譜法以偵測蛋白質構形改變。所有此等技術可單獨地或組合使用以分析醫藥調配物中之蛋白質降解且測定彼調配物之儲存壽命。當在2-8℃下儲存時，本文所揭示之醫藥調配物典型地展現兩年內增加不超過約2%至約3%之降解(例如，片段化、聚集或解折疊)。
「個體」或「患者」可互換使用且包括人類及非人類動物個體，以及具有經正式診斷之病症者、無正式識別之病症者、接受醫療照顧者及處於發展病症之風險中者。
「界面活性劑」意謂表面活性劑，包括通常稱作濕潤劑、表面張力降低劑、清潔劑、分散劑、乳化劑及四級銨防腐劑之物質。界面活性劑在下文中進一步論述。
「切向流過濾」或「TFF」意謂如下過程，其中溶液切向地穿越跨過超濾膜(亦即，可區別不同大小及形狀之分子的半透膜)，其中較低分子量鹽及/或溶質在壓力下穿越通過。
「治療有效量」係指經測定在個體中產生治療反應之PCSK9抗原結合多肽之量。該等治療有效量容易由一般技術者確定。
「跨膜壓力(TMP)」在過濾之情況下意謂自該膜之饋料至濾液側的平均差壓且可藉由等式(1)表述：(等式(1))
「治療」及提供「治療」包括提供治療性治療。治療不需要病症之完全治癒且涵蓋其中治療會降低症狀或潛在風險因素之情況。
「超濾(Ultrafiltration)」、「超濾(ultrafiltering)」、「UF」及相似術語意謂使用區別不同形狀及大小之分子的半透膜來分離分子與不同分子，或濃縮相似或實質上相同分子。
PCSK9結合之「變異體」意謂如下胺基酸序列，其中相對於另一多肽序列，一或多個胺基酸殘基經插入至該胺基酸序列中、自該胺基酸序列缺失及/或經取代至該胺基酸序列中。變異體包括融合蛋白。
「黏度」意謂流體流動之阻力，且可在既定剪切速率下以厘泊(cP)或毫帕· 秒(mPa· s)之單位經量測，其中1 cP=1 mPa· s。黏度可藉由使用黏度計，例如Brookfield Engineering (Middleboro, MA)刻度盤讀數黏度計，或流變儀，諸如m -VROCTM 流變儀或TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀來量測。黏度可使用任何其他方法及以此項技術中已知之任何其他單位(例如，絕對、運動或動態黏度)量測。無論用於測定黏度之方法如何，賦形劑調配物對對照調配物中之黏度降低百分比在既定剪切速率下降保持大致相同。組合物及方法之組分 PCSK9結合多肽
包括依伏庫單抗在內之PCSK9結合多肽之描述已經充分描述(Chan等人, 2012)。
9型蛋白原轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin (PCSK9)為調節低密度脂蛋白受體(LDLR)蛋白之水準時所牽涉的絲胺酸蛋白酶(Horton, Cohen及Hobbs, 2007；Seidah及Prat, 2007)。PCSK9為絲胺酸蛋白酶之枯草桿菌蛋白酶(S8)家族中的激素原-蛋白原轉化酶(Seidah等人, 2003)。例示性人類PCSK9胺基酸序列在表1中顯示為SEQ ID NO:3，其為PCSK9之前蛋白形式(未經加工)。PCSK9蛋白亦可包括全長PCSK9蛋白之片段。PCSK9蛋白之結構已得到解決(Cunningham等人, 2007；Piper等人, 2007)。PCSK9包括信號序列、N端原結構域、枯草桿菌蛋白酶樣催化結構域及C端結構域。
PCSK9結合多肽為包含一或多個互補決定區(CDR)之多肽。在一些PCSK9結合多肽中，該等CDR經嵌入至構架區中，該構架區使CDR定向，以致實現CDR之適當PCSK9結合特性。PCSK9結合多肽可干擾、阻斷、降低或調節PCSK9與LDLR之間的相互作用。該等PCSK9結合多肽經表示為「中和性」。PCSK9與LDLR之間的結合可仍發生，即使PCSK9結合多肽為中和性的且結合於PCSK9。例如，PCSK9結合多肽預防或降低PCSK9對LDLR之不利影響而不阻斷PCSK9上之LDLR結合位點。因此，PCSK9結合多肽可調節或改變PCSK9使LDLR降解之能力，而不會預防PCSK9與LDLR之間的結合。該等PCSK9結合多肽可經描述為「非競爭性中和」。中和性PCSK9結合多肽可以預防PCSK9結合於LDLR之位置或方式結合於PCSK9。該等PCSK9結合多肽可經描述為「競爭性中和」。PCSK9中和劑可導致更大量之游離LDLR存在於個體中，引起更多LDLR結合於LDL，且由此降低個體中之LDL的量。此又導致存在於個體中之血清膽固醇的量降低。
一些PCSK9結合多肽可抑制PCSK9介導之活性(包括結合)。PCSK9結合多肽亦可抑制PCSK9與LDLR之間的相互作用及由PCSK9介導之其他生理效應。PCSK9結合多肽可為人類的，諸如全人類PCSK9抗體。
一些PCSK9結合多肽可結合於PCSK9之催化結構域。PCSK9結合多肽亦可結合PCSK9之成熟形式。在其他情況下，PCSK9結合多肽可結合PCSK9之原結構域。PCSK9結合多肽在一些情況下可選擇性地結合於PCSK9之成熟形式。在一些情況下，PCSK9結合蛋白結合於該催化結構域，以致PCSK9無法結合或有效地結合於LDLR。一些PCSK9結合多肽不會結合於該催化結構域之C端。在其他情況下，PCSK9結合多肽不會結合於該催化結構域之N端。在其他情況下，PCSK9結合多肽不會結合於PCSK9蛋白之N或C端。在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於由抗PCSK9抗體結合的抗原決定基中之任一者。在一些情況下，此可藉由候選抗體與參考抗體(諸如依伏庫單抗)之間的競爭分析來測定。在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於PCSK9之特定構形狀態以便預防PCSK9與LDLR相互作用。在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於PCSK9之V結構域。在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於PCSK9之V結構域且預防(或降低)PCSK9結合於LDLR。在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於PCSK9之V結構域，且雖然其不會預防(或降低)PCSK9結合於LDLR，但PCSK9結合多肽預防或降低經由PCSK9對LDLR介導之不利活性。
在一些情況下，PCSK9結合多肽包含一或多個CDR (例如，1、2、3、4、5或6個CDR)。在一些情況下，PCSK9結合多肽包含(a)多肽結構及(b)一或多個插入及/或接合於該多肽結構之CDR。該多肽結構可採取多種不同形式。例如，其可為或包含天然存在之抗體或其片段或變異體的構架，或可為合成的。
PCSK9結合多肽之多肽結構可為抗體或來源於抗體，包括單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(抗體模擬物)、嵌合抗體、人類化抗體、抗體融合物(有時稱作「抗體結合物」)，及每一者分別之部分或片段。在一些情況下，PCSK9結合多肽為抗體之片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2 或scFv)。
某些PCSK9結合多肽特異性地或選擇性地結合於人類PCSK9。在一些情況下，PCSK9結合多肽特異性地或選擇性地結合於具有SEQ ID NO:3之殘基153-692或由該等殘基組成之人類PCSK9蛋白。在一些情況下，PCSK9結合多肽特異性地結合於PCSK9蛋白之至少一個片段及/或全長PCSK9蛋白(具有或不具有信號序列)。
在一些情況下，該等抗體包括至少一條可變重鏈及一條可變輕鏈。在其他情況下，該等抗體含有兩條一致輕鏈接兩條一致重鏈。例如，抗體或PCSK9結合多肽可包括一條重鏈及一條輕鏈、兩條重鏈或兩條輕鏈。在一些情況下，PCSK9結合多肽包含來自表1中列出之序列(SEQ ID NO:4-9)中的至少一者之1、2及/或3個重鏈及/或輕鏈CDR (或由該等CDR組成)。在一些情況下，所有六個CDR (來自輕鏈之CDR1-3 (CDRL1、CDRL2、CDRL3)及來自重鏈之CDR1-3 (CDRH1、CDRH2及CDRH3))均為PCSK9結合多肽之部分。在一些情況下，1、2、3、4、5個或更多個CDR包括於PCSK9結合多肽中。在一些情況下，來自表1中之序列中的CDR之一個重鏈及一個輕鏈CDR包括於PCSK9結合多肽中。在一些情況下，額外區段包括於PCSK9結合多肽中。
PCSK9結合多肽可由如表2中關於依伏庫單抗所示之核酸序列編碼。
在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於(但不會阻斷)與SEQ ID NO:3之PCSK9至少50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-95、95-99%一致或具有更大一致性百分比之PCSK9變異體。在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於(但不會阻斷)該等變異體。在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於PCSK9之該等變異體且預防其與LDLR相互作用。在一些情況下，PCSK9結合多肽結合於PCSK9之變異體且預防其與LDLR相互作用。在一些情況下，PCSK9之變異體為人類變異體，諸如在位置474處之變異體、E620G及/或E670G。在一些情況下，在位置474處之胺基酸為纈胺酸。 人類化PCSK9結合多肽(例如，抗體)
PCSK9結合多肽可包含人類化抗體及/或其部分。
人類化抗體在人類中實質上為非免疫原性的且具有與來自產生該人類化抗體之另一物種的抗體實質上相同之對靶標之親和力。
抗體修飾可經設計以實現增加之對靶標之結合親和力及/或降低該抗體在接受者中之免疫原性。在某些情況下，人類化抗體經修飾以消除糖基化位點以便增加該抗體對其同源抗原之親和力。諸如「再成形」、「超嵌合」或「鑲面/表面重建」之技術可用於產生人類化抗體。該等技術典型地藉由降低外來殘基之數目而降低抗體免疫原性，但不會預防在重複投與該等抗體之後的抗遺傳型及抗異型反應。此項技術中已知降低免疫原性之其他方法。
PCSK9抗體之輕鏈及重鏈可變區的CDR可經移植至來自相同或另一物種之構架區(FR)。該等輕鏈及重鏈可變區之CDR可經移植至共有人類FR。在一些情況下，PCSK9抗體重鏈或輕鏈之FR可經來自不同重鏈或輕鏈之FR置換。經移植之抗體可變區可與不同於PCSK9抗體之恆定區的恆定區一起使用。經移植之可變區可為單鏈Fv抗體之部分。 PCSK9結合多肽變異體
適用之其他抗體為藉由表1中所示之可變重鏈及可變輕鏈的組合或子部分形成之上文所列出之PCSK9結合多肽的變異體且包含各自與表1中之序列(整個序列或該序列之子部分，例如一或多個CDR)的胺基酸序列具有至少50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-99%或99%以上一致性之可變輕鏈及/或可變重鏈。在一些情況下，該等抗體包括至少一條重鏈及一條輕鏈，而在其他情況下，該等變異體形式含有兩條一致輕鏈及兩條一致重鏈(或其子部分)。
在某些情況下，PCSK9結合多肽包含包含如下可變區之重鏈，該可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO:1至少90%、至少95%或至少99%一致之胺基酸序列。
在一些情況下，PCSK9結合多肽包含與來自序列SEQ ID NO:4-9中之至少一者中的CDR之一或多個CDR至少90%、90-95%及/或95-99%一致之序列。在一些情況下，存在1、2、3、4、5或6個CDR (各自與以上序列至少90%、90-95%及/或95-99%一致)。
在某些情況下，PCSK9結合多肽包含包含如下可變區之輕鏈，該可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO:11或15至少90%、至少95%或至少99%一致之胺基酸序列。
在其他情況下，PCSK9結合多肽包含包含如下可變區之重鏈，該可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO:10或14至少90%、至少95%或至少99%一致之胺基酸序列。
熟練技術人員能夠使用熟知技術確定PCSK9結合多肽之合適變異體。在某些情況下，熟習此項技術者可鑒別該分子中可藉由靶向咸信對於活性不重要之區進行改變而不破壞活性之合適區域。在某些情況下，吾人可鑒別該等分子中在相似多肽之間保守的殘基及部分。在某些情況下，即使對於生物活性或對於結構重要之區域亦可經受保守性胺基酸取代而不破壞該生物活性或不會不利地影響多肽結構。
另外，熟習此項技術者可回顧鑒別相似多肽中對於活性或結構重要之殘基的結構-功能研究。鑒於該比較，吾人可預測蛋白質中對應於相似蛋白質中對於活性或結構重要之胺基酸殘基的胺基酸殘基之重要性。熟習此項技術者可對該等經預測重要之胺基酸殘基選擇化學上相似之胺基酸取代。
熟習此項技術者亦可關於相似的PCSK9結合多肽中之三維結構分析彼結構及胺基酸序列。鑒於該資訊，熟習此項技術者可關於抗體之三維結構預測其胺基酸殘基之比對。在某些情況下，熟習此項技術者可選擇不對經預測在該蛋白質之表面上的胺基酸殘基進行基團改變，因為該等殘基可牽涉於與其他分子之重要相互作用中。此外，熟習此項技術者可產生在各所需胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。該等變異體可接著使用此項技術中已知之活性分析進行篩選。該等變異體可用於收集關於合適變異體之資訊。例如，若吾人觀察到特定胺基酸殘基之改變導致受破壞、不合需要地降低或不合適之活性，則可避免具有該改變之變異體。換言之，基於自該等常規實驗收集之資訊，熟習此項技術者可容易地確定其中應避免單獨或與其他突變組合之進一步取代的胺基酸。
在某些情況下，PCSK9結合多肽變異體包括如下糖基化變異體，其中與親本多肽之胺基酸序列相比，糖基化位點之數目及/或類型已發生改變。在某些情況下，蛋白變異體包含比原生蛋白多或少之數目的N連接糖基化位點。額外之較佳抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中如與親本胺基酸序列相比，一或多個半胱胺酸殘基缺失或由另一胺基酸(例如，絲胺酸)取代。當抗體必須再折疊成生物活性構形時，諸如在不溶性包涵體之分離之後，半胱胺酸變異體可為適用的。半胱胺酸變異體一般具有比原生蛋白少之半胱胺酸殘基，且典型地具有偶數以使由未配對半胱胺酸引起之相互作用降至最低。 競爭性PCSK9結合多肽
可使用與依伏庫單抗或功能片段競爭結合於由特異性結合於PCSK9之依伏庫單抗結合的抗原決定基之PCSK9結合多肽。該等PCSK9結合多肽亦可結合於相同抗原決定基PCSK9結合多肽或重疊抗原決定基。與依伏庫單抗競爭或結合於相同抗原決定基之PCSK9結合多肽及片段顯示相似的功能特性。因此，作為特定實例，所提供之PCSK9結合多肽包括與具有依伏庫單抗之所有六個CDR (SEQ ID NO:4-9)或分別地SEQ ID NO:2及1之兩條輕鏈及兩條重鏈的抗體或PCSK9結合多肽競爭者。 例示性抗原決定基
提供抗PCSK9抗體所結合之SEQ ID NO:3 (人類PCSK9多肽)之抗原決定基。在依伏庫單抗(及依伏庫單抗變異體，具有SEQ ID NO:14之HCVR及SEQ ID NO:15之LCVR)的情況下，其為S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238。 PCSK9結合多肽(例如，抗體)之製備
可使用某些策略來操縱抗體之固有特性，諸如抗體對其靶標之親和力。該等策略包括使用編碼抗體之聚核苷酸分子的位點特異性或隨機突變誘發以產生抗體變異體。在某些情況下，在該產生之後篩選展現所需改變(例如，增加或減少之親和力)之抗體變異體。
突變誘發策略中靶向之胺基酸殘基可為在CDR或FR中者。
在某些情況下，抗體變異體之較小且更有效地經篩選之文庫係藉由將隨機或定點突變誘發限制於CDR中之超突變位點而產生，該等超突變位點為對應於在體細胞親和力成熟過程期間傾向於突變之區域的位點。
抗體可在細胞株中表現。編碼特定抗體之序列(諸如編碼SEQ ID NO:1及2之多肽的聚核苷酸，諸如SEQ ID NO:12及13之聚核苷酸)可用於使合適之哺乳動物宿主細胞轉型。轉型可藉由任何已知之用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之方法進行。所用之轉型程序取決於欲轉型之宿主。用於將異源聚核苷酸引入至哺乳動物細胞中之方法為此項技術中熟知的且包括葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將聚核苷酸囊封於脂質體中及將DNA直接微注射至細胞核中。
可用作用於表現之宿主的哺乳動物細胞株為此項技術中熟知的且包括可獲自American Type Culture Collection (ATCC)之多種永生化細胞株，包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、人類上皮腎293細胞及多種其他細胞株。
在某些情況下，抗體藉由21B12融合瘤細胞株產生(Jackson等人, 2009)。在某些情況下，PCSK9結合多肽以小於大約1 nM之解離常數(KD )結合於PCSK9，例如1000 pM至100 pM、100 pM至10 pM、10 pM至1 pM及/或1 pM至0.1 pM或更低。
PCSK9結合多肽可包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD及IgM同型中之至少一者的免疫球蛋白分子。在某些情況下，PCSK9結合多肽包含人類κ輕鏈及/或人類重鏈。在某些情況下，該重鏈具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同型。在某些情況下，PCSK9結合多肽已經選殖用於哺乳動物細胞中之表現。在某些情況下，PCSK9結合多肽包含除IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD及IgM同型之恆定區中的任一者外之恆定區。
在某些情況下，PCSK9結合多肽包含人類λ輕鏈及人類IgG2重鏈。在某些情況下，PCSK9結合多肽包含人類λ輕鏈及人類IgG4重鏈。在某些情況下，PCSK9結合多肽包含人類λ輕鏈及人類IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重鏈。在其他實施例中，PCSK9結合多肽包含人類κ輕鏈及人類IgG2重鏈。在某些情況下，PCSK9結合多肽包含人類κ輕鏈及人類IgG4重鏈。在某些情況下，PCSK9結合多肽包含人類κ輕鏈及人類IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重鏈。在某些情況下，PCSK9結合多肽包含接合至既非IgG2同型之恆定區亦非IgG4同型之恆定區的恆定區之抗體可變區。在某些情況下，PCSK9結合多肽已經選殖用於哺乳動物細胞中之表現。
在依伏庫單抗之情況下，該抗體為IgG2-λ人類單株抗體；具有λ輕鏈肆二硫化物之γ2重鏈-二硫化物。依伏庫單抗在Asn-291及Asn-291"處經糖基化且在殘基22'-90'、22"-90"、22'-96'、22"-96"、129-214'、129"-214"、137'-196'、137"-196"、142-198、142"-198"、217-217'、218-218'、221-221"、224-224"、255-315、255"-315"、361-419及361"-419"之間具有二硫橋。
在某些情況下，依伏庫單抗之重鏈及輕鏈或具有SEQ ID NO:14及15之HCVR及LCVR的抗體之彼等重鏈及輕鏈的保守性修飾可產生具有類似於來自融合瘤株21B12之抗體的彼等特徵之功能及化學特徵的PCSK9抗體。相反，PCSK9抗體之功能或化學特徵的實質性修飾可藉由選擇重鏈及輕鏈之胺基酸序列中的取代來實現，該等取代在其對維持(a)取代區域中分子骨架之結構，例如，呈薄片或螺旋構形，(b)該分子在靶標位點處的電荷或疏水性，或(c)側鏈之大小的影響方面顯著不同。
例如，保守性胺基酸取代可涉及用非原生殘基取代原生胺基酸殘基，以致對彼位置處之胺基酸殘基的極性或電荷具有少量影響或無影響。
PCSK9結合多肽通常包含一或多種多肽。多種表現載體/宿主系統中之任一者均可用於表現編碼包含一或多種PCSK9結合多肽組分或PCSK9結合多肽本身之多肽的聚核苷酸分子。該等系統包括微生物，諸如用重組噬菌體、質體或黏接質體DNA表現載體轉型之細菌；用酵母表現載體轉型之酵母；用病毒表現載體(例如，桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；用病毒表現載體(例如，花椰菜嵌紋病毒CaMV、煙草嵌紋病毒TMV)轉染或用細菌表現載體(例如，Ti或pBR322質體)轉型之植物細胞系統；或動物細胞系統。
包含一或多種PCSK9結合多肽組分或PCSK9結合多肽本身之多肽可自多種表現系統純化；該等技術為熟習此項技術者所熟知。 醫藥調配物組分
在一些實施例中，包含PCSK9結合多肽之醫藥調配物包含超過一種不同之PCSK9結合多肽。在某些實施例中，醫藥調配物包含超過一種PCSK9結合多肽，其中PCSK9之抗原結合蛋白結合超過一種抗原決定基。在一些實施例中，多種抗原結合蛋白將不會彼此競爭結合於PCSK9。在一些實施例中，該醫藥調配物包含依伏庫單抗。
PCSK9結合多肽可連接至半衰期延長性媒劑。該等媒劑包括聚乙二醇(PEG)、肝醣(例如，PCSK9結合多肽之糖基化)及葡聚糖。
可接受之調配物組分較佳地在所用之劑量及濃度下對接受者無毒。醫藥調配物可包含用於修飾、維持或保持該組合物之例如pH、容積滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透之試劑。
例如，合適之調配物材料包括胺基酸(諸如脯胺酸、精胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、牛磺酸、甘胺酸、谷醯胺或天冬醯胺)；抗微生物；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝液(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鈉、乙酸鈉(「NaOAC」)、Tris-HCl、Tris緩衝液、檸檬酸鹽、磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝之生理食鹽水(亦即，PBS緩衝液)或其他有機酸)；增積劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；複合劑(諸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥基丙基β-環糊精)；填充劑；單醣；二醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖、海藻糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色、調味及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苄烷銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如普朗尼克、PEG、山梨聚糖酯、諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80之聚山梨醇酯、曲拉通、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊)；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物，較佳地氯化鈉或氯化鉀；甘露糖醇山梨糖醇)；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。
在一態樣中，該醫藥調配物包含高濃度之PCSK9結合多肽。在某些實施例中，PCSK9結合多肽濃度介於約70 mg/mL至約260 mg/mL範圍內，例如約70 mg/mL、約80 mg/mL、約90 mg/mL、約100 mg/mL、約110 mg/mL、約120 mg/mL、約130 mg/mL、約140 mg/mL、約150 mg/mL、約160 mg/mL、約170 mg/mL、約180 mg/mL、約190 mg/mL、約200 mg/mL、約210 mg/mL、約220 mg/mL、約230 mg/mL、約240 mg/mL、約250 mg/mL或約260 mg/mL。在一些實施例中，依伏庫單抗之濃度介於約140 mg/mL至約210 mg/mL範圍內，例如約140 mg/mL、約150 mg/mL、約160 mg/mL、約170 mg/mL、約180 mg/mL、約190 mg/mL、約200 mg/mL、約210 mg/mL、約220 mg/mL、約230 mg/mL、約240 mg/mL、約250 mg/mL或約260 mg/mL。
在另一態樣中，該醫藥調配物包含至少一種具有約pH 7.0-8.5之緩衝劑，諸如乙酸鈉、磷酸鹽、磷酸鹽緩衝之生理食鹽水(「PBS」)、組胺酸及/或Tris緩衝液。該緩衝液用於維持生理學上合適之pH。另外，該緩衝液可增強該醫藥調配物之等滲性及化學穩定性。在某些實施例中，該緩衝劑介於約5 mM至約100 mM範圍內，例如約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM或約100 nM緩衝劑。在某些實施例中，該緩衝劑為NaOAC。在某些實施例中，該緩衝劑為NaOAC且以約10 mM之濃度存在。在其他實施例中，該緩衝液為麩胺酸鈉。在某些實施例中，該緩衝劑為麩胺酸鈉且以約10 mM之濃度存在。在其他實施例中，該緩衝劑為磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，該磷酸鹽緩衝液以約10 mM之濃度存在。在進一步實施例中，該緩衝劑為組胺酸。在此等實施例中之一些中，該組胺酸緩衝液以約10 mM之濃度存在。該醫藥調配物之適用pH值包括約4至約7，或約4.8至約6.9，或約5.0至約5.5，或約5，或約5.4。
在某些實施例中，該醫藥調配物為等滲的，其中重量滲透濃度介於約250至約400 mOsm/kg之間範圍內，例如約250 mOsm/kg、約260 mOsm/kg、約270 mOsm/kg、約280 mOsm/kg、約290 mOsm/kg、約300 mOsm/kg、約310 mOsm/kg、約320 mOsm/kg、約330 mOsm/kg、約340 mOsm/kg、約350 mOsm/kg、約360 mOsm/kg、約370 mOsm/kg、約380 mOsm/kg、約390 mOsm/kg或約400 mOsm/kg。重量滲透濃度為溶質與體積流體之比率的量度。換言之，其為每公斤溶液中分子及離子(或分子)之數目。在某些實施例中，重量滲透濃度為300 mOsm/kg。重量滲透濃度可藉由滲壓計，諸如Advanced Instruments 2020多樣品滲壓計, Norwood, MA來量測。該Advanced Instruments 2020多樣品滲壓計藉由使用凝固點降低法來量測重量滲透濃度。溶液中之滲壓劑濃度愈高，其將凝固時所處之溫度降低愈多。重量滲透濃度亦可使用任何其他方法及以此項技術中已知之任何其他單位(諸如線性外推)量測。在其他實施例中，該醫藥調配物對人類血細胞(諸如紅血球)等滲。
在另一態樣中，該醫藥調配物包含至少一種界面活性劑聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)。在某些實施例中，該醫藥調配物包含界面活性劑，其濃度介於約0.0001重量%至約10重量%每體積(w/v)該調配物範圍內，例如約0.0001%、約0.005%、約0.006%、約0.007%、約0.008%、約0.009%、約0.01%、約0.05%、約0.1%、約0.5%、約1%、約5%或約10%界面活性劑(w/v)該調配物。在某些實施例中，該醫藥調配物包含聚山梨醇酯80，其濃度介於約0.0001%至約1% w/v該調配物範圍內。在某些實施例中，該醫藥調配物包含聚山梨醇酯80，其濃度為約0.01% w/v該調配物。在其他實施例中，該調配物包含Pluronic® F-68，其濃度介於約0.0001%至約1% w/v該調配物範圍內。在某些實施例中，該醫藥調配物包含Pluronic® F-68，其濃度為約0.01% w/v該調配物。在其他實施例中，該調配物包含維他命E TPGS，其濃度介於約0.0001%至約1% w/v該調配物範圍內。在某些實施例中，該醫藥調配物包含維他命E TPGS，其濃度為約0.01% w/v該調配物。
該醫藥調配物可包含至少一種穩定劑，諸如聚羥基烴(包括山梨糖醇、甘露糖醇、甘油及衛矛醇)及/或二醣(包括蔗糖、乳糖、甘露糖基海藻糖)及/或胺基酸(除包括精胺酸鹽(諸如精胺酸單鹽酸鹽)及精胺酸之乙醯基衍生物(諸如N-乙醯基精胺酸)之彼等調配物以外且可包括例如脯胺酸、離胺酸、甲硫胺酸及牛磺酸)及或苯甲醇；該聚羥基烴及/或二醣及/或胺基酸及/或苯甲醇總計為約0.5%至約10% w/v該調配物。該醫藥調配物可包含脯胺酸，例如約10 mM至約200 mM，諸如約50 mM至約150 mM，諸如約90 mM至約120 mM，諸如約120 mM。
在一態樣中，該醫藥調配物具有如在室溫(亦即，25℃)下所量測小於約80厘泊(cP)之黏度水準。在某些實施例中，該醫藥調配物具有小於約70 cP、約60 cP、約50 cP、約40 cP、約30 cP、約25 cP、約20 cP、約18 cP、約15 cP、約12 cP、約10 cP；約8 cP、約6 cP、約4 cP；約2 cP；或約1 cP之黏度水準。
在一態樣中，該醫藥調配物如藉由至少一種穩定性分析所量測為穩定的，諸如檢查PCSK9結合多肽隨時間之生物物理或生物化學特徵之分析。醫藥調配物穩定性可使用SEC-HPLC量測。SEC-HPLC基於其流體動力學體積之差異分離蛋白質。具有較大流體動力學蛋白質體積之分子比具有較小體積之分子更早溶離。在SEC-HPLC之情況下，如與對照樣品相比，穩定醫藥調配物展現HMW物質之僅約5%增加，諸如如與對照樣品相比HMW物質之僅約4%、僅約3%、僅約2%、僅約1%、僅約0.5%增加。
或者或另外，穩定性可使用陽離子交換HPLC (CEX-HPLC)來量測。CEX-HPLC基於其表面電荷之差異分離蛋白質。在設定pH下，抗PCSK9 ABP之帶電同型在陽離子交換管柱上經分離且使用鹽梯度溶離。溶離劑藉由紫外光(UV)吸光度來監測。帶電同型分佈藉由以總的峰面積之百分比形式測定各同型之峰面積來評估。在CEX-HPLC之情況下，如與對照樣品相比，穩定醫藥調配物展現主同型峰之僅約5%減少，諸如如與對照樣品相比主同型峰之僅約3%至約5%減少；如與對照樣品相比主同型峰之僅約4%減少、僅約3%減少、僅約2%減少、僅約1%減少、僅約0.5%減少。
又或者，或另外，調配物穩定性可使用藉由光阻偵測不可見粒子(HIAC)來量測。含有光阻感測器(HIAC/Royco HRLD-150或相等物)及液體取樣器之電子、液載粒子計數系統(HIAC/Royco 9703 (Hach Company; Loveland, CO)或相等物)定量既定測試樣品中之粒子的數目及其大小範圍。當液體中之粒子在光源與該偵測器之間傳遞時，其削弱或「遮掩」落在該偵測器上之光束。當粒子之濃度位於該感測器之正常範圍內時，此等粒子逐個經偵測。各粒子傳遞通過偵測區會降低光偵測器上之入射光且該光偵測器之電壓輸出即刻降低。電壓之改變作為電脈衝記錄，該等電脈衝由該儀器轉化為所存在之粒子之數目。該方法為非特異性的且量測粒子(無論其起源如何)所監測之粒子大小一般為10 µm，及25 µm。在HIAC之情況下，如與對照樣品相比，穩定醫藥調配物展現每個容器(或單元)中僅6000個10 µm粒子，諸如如與對照樣品相比每個容器(或單元)中僅5000個、僅4000個、僅3000個、僅2000個、僅1000個10 µm粒子。在其他情況下，如與對照樣品相比，穩定醫藥調配物展現每個容器(或單元)中僅600個25 µm粒子，諸如如與對照樣品相比每個容器(或單元)中僅500個、僅400個、僅300個、僅200個、僅100個、僅50個25 µm粒子。
醫藥調配物穩定性亦可使用視覺評估來評估。視覺評估為定性方法，其用於描述樣品之可見物理特徵。該樣品針對檢查室之黑色及/或白色背景來觀察，視所評估之特徵(例如，顏色、澄清度、粒子或外來物質之存在)而定。樣品亦針對乳白色參考標準及顏色參考標準來觀察。在視覺評估之情況下，如與對照樣品相比，穩定醫藥調配物不展現顏色、澄清度、粒子或外來物質之存在的顯著改變。 例示性醫藥調配物
表4顯示PCSK9結合多肽之例示性醫藥調配物。在一些調配物中，給出範圍，且在子實例(例如，1.1)中，給出特定實例。 *觀察到濃度量測值、調配過程及黏度量測值之預期變化治療應用
諸如依伏庫單抗之PCSK9結合多肽可用於多種治療應用。例如，PCSK9結合多肽適用於治療與PCSK9相關之病狀，諸如膽固醇相關病症(血清膽固醇相關病症)，諸如高膽固醇血症。PCSK9結合多肽可適用於治療與PCSK9活性相關之後果、症狀及/或病理。
與分子或分子組之升高水準(包括膽固醇(包括血清膽固醇)、LDL、LDLR、PCSK9、VLDL-C、脫輔基蛋白B (「ApoB」)、脂蛋白A (「Lp(a)」)、三酸甘油酯、HDL-C、非HDL-C及總膽固醇水準)相關、涉及該等升高水準或可受該等升高水準影響之病症可藉由使用本文所揭示之依伏庫單抗醫藥組合物來治療及/或預防及/或降低該等病症在個體中之風險的方法來解決。所揭示之依伏庫單抗組合物可用於調節此等分子或分子組之水準，諸如降低此等分子或分子組之量。例如，所揭示之依伏庫單抗組合物可用於自異常高水準或自甚至正常水準減少此等分子或此等分子之組的量之方法中，亦即膽固醇(包括血清膽固醇)、LDL、LDLR、PCSK9、VLDL-C、ApoB、Lp(a)、三酸甘油酯、HDL-C、非HDL-C及總膽固醇水準之量可降低。
「膽固醇相關病症」(其包括「血清膽固醇相關病症」)包括以下任一者或多者：家族性高膽固醇血症、非家族性高膽固醇血症、高脂血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠心病、中風、心血管疾病、阿爾茲海默氏病及一般異常血脂症，該等異常血脂症可例如藉由升高之總血清膽固醇、升高之LDL、升高之三酸甘油酯、升高之VLDL及/或低HDL顯示。原發性及繼發性異常血脂症之一些非限制性實例包括代謝症候群、糖尿病、家族性組合高脂血症、家族性高三酸甘油脂血症、家族性高膽固醇血症(包括雜合高膽固醇血症、純合高膽固醇血症)、家族缺陷性載脂蛋白B-100；多基因高膽固醇血症；殘粒移去障礙病、肝脂肪酶缺乏；以下任一者繼發的異常血脂症：飲食不慎重、甲狀腺功能減退、藥物(包括雌激素及助孕素療法、β-阻斷劑及噻嗪化物利尿劑)；腎病症候群、慢性腎衰竭、庫欣氏症候群、原發性膽汁性肝硬化、肝醣貯積病、肝瘤、膽汁鬱積、肢端肥大症、胰島素瘤、單一性生長激素缺乏及酒精誘導之高三酸甘油脂血症。所揭示之依伏庫單抗組合物亦可用於治療及/或預防及/或降低動脈粥樣硬化疾病之風險，諸如心血管死亡、非心血管或全因死亡、冠心病、冠狀動脈疾病、外周動脈疾病、中風(缺血性及出血性)、心絞痛或腦血管疾病及急性冠狀動脈症候群、心肌梗塞及不穩定心絞痛。所揭示之依伏庫單抗組合物亦可用於降低致命及非致命心臟病發作、致命及非致命中風、某些類型之心臟手術、用於心臟衰竭之住院、患有心臟病的患者中之胸痛及/或由於已確立之心臟病(諸如先前心臟病發作、先前心臟手術)而引起的心血管事件及/或具有動脈堵塞之跡象之胸痛及/或移植相關血管疾病。在一些情況下，所揭示之依伏庫單抗組合物可用於預防或降低歸因於升高之CRP或hsCRP的心血管風險之方法中。在一些實施例中，該等ABP及方法可用於降低復發性心血管事件之風險。
一般可經由使用斯他汀解決(可治療或可預防)之疾病或病症亦可受益於所揭示之依伏庫單抗組合物的應用。此外，可受益於膽固醇合成或增加之LDLR表現之預防的病症或疾病亦可使用所揭示之依伏庫單抗組合物治療。另外，所揭示之依伏庫單抗組合物之使用可尤其適用於治療糖尿病。不僅糖尿病為冠心病之風險因素，而且胰島素增加PCSK9之表現。亦即，患有糖尿病之人具有升高之血漿脂質水準(其可與高PCSK9水準相關)且可受益於降低彼等水準。
在PCSK9結合多肽用於治療性應用之情況下，PCSK9結合多肽可抑制、干擾或調節PCSK9之一或多種生物活性。例如，PCSK9結合多肽可特異性結合於人類PCSK9及/或實質上抑制人類PCSK9結合於LDLR達至少約20%-40%、40-60%、60-80%、80-85%或更多(例如，藉由在活體外競爭性結合分析中量測結合)。在一些情況下，PCSK9結合多肽具有小(更緊密地結合)於10-7 、10-8 、10-9 、10-10 、10-11 、10-12 、10-13 M之Kd 。在一些情況下，PCSK9結合多肽具有小於1 µM、1000 nM至100 nM、100 nM至10 nM、10 nM至1 nM、1000 pM至500 pM、500 pM至200 pM、小於200 pM、200 pM至150 pM、200 pM至100 pM、100 pM至10 pM、10 pM至1 pM之關於阻斷LDLR結合於PCSK9之IC50。
醫藥調配物可以組合療法，亦即與其他試劑組合投與。該組合療法可包含與至少一種抗膽固醇劑組合之PCSK9結合多肽。試劑包括活體外合成製備之化學調配物、抗體、抗原結合區及其組合及結合物。在某些實施例中，試劑可充當激動劑、拮抗劑、異位調節劑或毒素。在某些實施例中，試劑可用於抑制或刺激其靶標(例如，受體或酶活化或抑制)，且由此促進增加之LDLR表現或減少血清膽固醇水準。
PCSK9結合多肽可在用膽固醇降低(血清及/或總膽固醇)劑治療之前、與該治療並行及在該治療之後投與。例如，PCSK9結合多肽可經預防性投與以預防或減輕高膽固醇血症、心臟病、糖尿病及/或任何膽固醇相關病症之發作。此外，PCSK9結合多肽可經投與用於現有高膽固醇血症病狀之治療。在一些情況下，PCSK9結合多肽之投與可延遲該病症及/或與該病症相關之症狀的發作。在一些情況下，向缺乏膽固醇相關病症或其子集中之任一者的任何症狀之個體提供PCSK9結合多肽。
PCSK9結合多肽可與特定治療劑一起使用以治療多種膽固醇相關病症，諸如高膽固醇血症。鑒於該病狀及所需治療程度，可投與兩種、三種或三種以上試劑。該等試劑可藉由包括於同一調配物中而一起提供。或者，該等試劑可獨立地經調配且必要時，藉由包括於治療套組中而一起提供。在另一實例中，該等試劑可獨立地提供。劑量及給藥方案
投與至患者之PCSK9結合多肽(諸如mAb，諸如依伏庫單抗)之量為治療有效量。PCSK9結合蛋白之典型劑量可介於約0.1 mg/kg至高達約100 mg/kg或更高範圍內。在某些情況下，該劑量可介於0.1 mg/kg直至約100 mg/kg；或1 mg/kg直至約100 mg/kg；或5 mg/kg直至約100 mg/kg；或1 mg/kg至約50 mg/kg；或2 mg/kg至約20 mg/kg；或2 mg/kg至約10 mg/kg之PCSK9結合多肽範圍內。
PCSK9結合多肽之量(或劑量)可介於至少約10 mg至約1400 mg；或約14 mg至約1200 mg；或約14 mg至約1000 mg；或約14 mg至約800 mg；或約14 mg至約700 mg；或約14 mg至約480 mg；或約20 mg直至約480 mg；或約70 mg直至約480 mg；或約80 mg至約480 mg；或約90 mg至約480 mg；或約100 mg至約480 mg，或約105 mg至約480 mg；或約110 mg至約480 mg；或約115 mg至約480 mg；或約120 mg至約480 mg；或約125 mg至約480 mg；或約130 mg至約480 mg；或約135 mg至約480 mg；或約140 mg至約480 mg；或約145 mg至約480 mg；或約150 mg至約480 mg；或約160 mg至約480 mg；或約170 mg至約480 mg；或約180 mg至約480 mg或約190 mg至約480 mg或約200 mg至約480 mg；或約210 mg至約480 mg；或約220 mg至約480 mg；或約230 mg至約480 mg；或約240 mg至約480 mg；或約250 mg至約480 mg；或約260 mg至約480 mg；或約270 mg至約480 mg；或約280 mg至約480 mg；或約290 mg至約480 mg；或約300 mg至約480 mg；或約310 mg至約480 mg；或約320 mg至約480 mg；或約330 mg至約480 mg；或約340 mg至約480 mg；或約350 mg至約480 mg；或約360 mg至約480 mg；或約370 mg至約480 mg；或約380 mg至約480 mg；或約390 mg至約480 mg；或約400 mg至約480 mg；或約410 mg至約480 mg；或約420 mg至約480 mg；或約430 mg至約480 mg；或約440 mg至約480 mg；或約450 mg至約480 mg；或約460 mg至約480 mg；或約470 mg至約480 mg之PCSK9結合多肽範圍內。
給藥之頻率將考慮PCSK9結合多肽及/或在該調配物中之任何額外治療劑之藥物動力學參數。臨床醫師可投與該調配物直至達到實現所需效應之劑量。該調配物可以單一劑量，或隨時間以兩個、三個、四個或四個以上劑量(其可或可不含有等量之PCSK9結合多肽)，或經由植入装置或導管以連續輸注液投與。該調配物亦可用針及注射器經皮下或經靜脈內遞送。關於皮下遞送，筆遞送装置以及主體注射器及自動注射器遞送装置可遞送包含PCSK9結合多肽之醫藥調配物。
在某些情況下，至少約10 mg；或高達約14 mg；或高達約20 mg；或高達約35 mg；或高達約40 mg，或高達約45 mg，或高達約50 mg；或高達約70 mg之PCSK9結合多肽的劑量一週一次(QW)經投與至有需要之患者。
在其他情況下，至少約70 mg，或高達約100 mg；或高達約105 mg，或高達約110 mg；或高達約115 mg，或高達約120 mg；或高達約140 mg；或高達約160 mg；或高達約200 mg；或高達約250 mg；或高達280 mg；或高達300 mg；或高達350 mg；或高達400 mg；或高達420 mg之PCSK9結合多肽的劑量每隔一週一次(或每兩週；「Q2W:」)經投與至有需要之患者。
在某些其他情況下，至少約250 mg；或高達約280 mg；或高達約300 mg；或高達約350 mg；或高達約400 mg；或高達約420 mg；或高達約450 mg；或高達480 mg之PCSK9結合多肽的劑量每四週一次(「Q4W」) (或一個曆月一次)經投與至有需要之患者。
例如，依伏庫單抗可以210 mg劑量Q2W投與。或者，依伏庫單抗可以420 mg劑量Q4W投與。視所治療之病狀的情況而定，此等藥物劑量均可每週投與。
在一些情況下，如與給藥前血清LDL膽固醇水準相比，血清LDL膽固醇水準降低達至少約15%。在一些實施例中，血清LDL膽固醇水準降低達至少約20%，或達至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或甚至更高。儲存及套組
包含PCSK9結合多肽且具有或不具有至少一種額外治療劑之調配物可藉由混合具有所需純度程度之所選擇調配物與視情況選用之調配劑而經製備用於以經凍乾之餅或水溶液形式儲存。此外，包含PCSK9結合多肽且具有或不具有至少一種額外治療劑之調配物可使用適當賦形劑經調配為凍乾物。
一旦該醫藥調配物已經調配，其可作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或作為脫水或經凍乾粉末儲存於無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或以在投與之前復原之形式(例如，經凍乾)儲存。在一些情況下，該等PCSK9結合多肽調配物可儲存於諸如合適儲存袋(例如，如藉由Sartorius (Gottingen, DE)製造)之容器中或聚碳酸酯大玻璃瓶中。一旦該醫藥調配物已經調配，其亦可作為呈即用形式之溶液或懸浮液儲存於經預填充注射器(PFS；諸如2.25 mL PFS)中，以及儲存於玻璃小瓶(諸如5 cc玻璃小瓶)中。
在某些實施例中，提供用於產生單一劑量投與單元之套組。在某些實施例中，該套組可含有具有經乾燥蛋白質之第一容器及具有水性調配物之第二容器。在某些實施例中，包括含有單一及多腔室之經預填充注射器(例如，液體注射器及凍乾製劑注射器)之套組。包含 N- 乙醯基精胺酸之 PCSK9 結合多肽調配物之超濾 / 透濾
PCSK9結合多肽可在所揭示之UF/DF方法中經調配至約210 g/L。例如，在所揭示之方法中，70 g/L (或35 g/L) 之第一透濾(DF1)濃縮物經透濾三次且濃縮至140 g/L。接著，140 g/L之第二透濾(DF2)濃縮物經透濾四次且濃縮至260 g/L之濃度。經濃縮之池接著用調配物沖洗自系統回收至210 g/L之最終濃度。
在所揭示之方法中，約70 mg/mL及約35 mg/mL之第一超濾(UF1)濃度在實例中顯示出對最終原料藥(DS)中之HWM (%)不具有顯著影響。此外，在所揭示之方法中，在DF階段僅必需七個置換體積之DF來確保透濾完成。
所揭示之UF/DF過程概述於表5及6中。
因此，本文揭示一種調配PCSK9結合多肽，諸如阻斷PCSK9結合於LDLR之PCSK9結合多肽之方法，該方法包含 a. 第一濃縮步驟，其中濃縮第一溶液中之該多肽； b. 第一溶液交換步驟，其中該第一溶液中之經濃縮多肽使用透濾經交換至包含N-乙醯基精胺酸之第二溶液中； c. 第二濃縮步驟，其中濃縮該第二溶液中之該多肽； d. 第二溶液交換步驟，其中該經濃縮第二溶液中之該多肽使用透濾經交換至包含N-乙醯基精胺酸之第三溶液中；及 e. 第三濃縮步驟，其中濃縮該第三溶液中之該多肽；
在第三濃縮步驟之前，包含該多肽之溶液之溫度可增加至約25℃至約37℃，諸如約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36及約37℃。又，第一溶液交換步驟可使用至少三個置換體積之該第二溶液實現；在一些情況下，可使用額外置換體積，諸如四個、五個或六個置換體積。第二溶液交換步驟可使用至少四個置換體積之該第三溶液實現；然而，可使用額外置換體積，包括五個、六個或七個置換體積。PCSK9結合多肽之初始濃度可為約11 mg/mL或更低，諸如低於1 mg，或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或約11 mg/mL。另外，PCSK9結合多肽濃度可增加約3倍至約7倍，諸如約3倍、4倍、5倍、6倍或約7倍。例如，該多肽之增加的濃度為約35 mg/mL至約70 mg/mL或更高，諸如約35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或約70 mg/mL或更高。在第二濃縮步驟中，PCSK9結合多肽濃度自第一濃縮步驟增加約2倍至4倍(諸如約2倍、3倍或約4倍)，諸如至約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、250或約300 mg/mL。在第三濃縮步驟中，PCSK9結合多肽濃度可自第二濃縮步驟增加約1.5倍至約2倍，諸如至約140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、200、250或約300 mg/mL，諸如約260 mg/mL。PCSK9結合多肽可因此具有與該治療多肽之初始濃度相比進一步濃縮至少約19-20倍之最終濃度，諸如約210 mg/mL。該等濃縮步驟可包含分批饋料超濾；此外，該第二溶液及該第三溶液可為一致的。
包含N-乙醯基精胺酸之第二或第三溶液(例如，「NAR溶液」)可包含精胺酸鹽及緩衝液，其中例如該N-乙醯基精胺酸以約25 mM至約230 mM，諸如約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225或約230 mM之濃度存在；該精胺酸鹽為Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽且以約25 mM至約150 mM，諸如約25、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或約150 mM之濃度存在；且該緩衝液為乙酸鈉緩衝液，其濃度為約5 mM至約30 mM，諸如約5、10、15、20、25或約30 mM。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約140至約170 mM之濃度存在；該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63至約70 mM (諸如約63、64、65、66、67、68、69或約70 mM)之濃度存在且該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。例如，該N-乙醯基精胺酸可以約140 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。在其他子態樣中，該N-乙醯基精胺酸以約155 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約70 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。在另一實例中，該N-乙醯基精胺酸以約170 mM之濃度存在，該Arg HCl、Arg乙酸鹽或Arg麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
此外，該等組合物(包括NAR溶液)可進一步包含脯胺酸，其中該脯胺酸以約50 mM至約150 mM，諸如約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或約150 mM之濃度存在。該第二或第三溶液可具有約4.8至約6.9，諸如約4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8或約6.9，諸如5.3、5.4或5.5之pH。在第一及第二溶液交換步驟中，可使用透濾膜，其具有選自由以下組成之群之至少一種特徵： a. 大於約350 µm但小於或等於約500 µm，諸如約350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或約500 µm之網眼； b. 大於膜面積之約32%但小於或等於約36% (諸如約32、33、34、35或約36%)之開放面積； c. 小於約16.2 n/cm但大於或等於約12.2 n/cm，諸如約16.2、16、15.8、15.6、15.4、15.2、15、14.8、14.6、14.4、14.2、14、13.8、13.6、13.4、13.2、13、12.8、12.6、12.4或約12.2 n/cm之網目數； d. 大於約270 µm但小於或等於約340 µm，諸如約270、280、290、300、310、320、330或340 µm之網線直徑； e. 大於約160 g/m2 但小於或等於180 g/m2 ，諸如約160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180 g/m2 之基礎重量； f. 大於約515 µm但小於或等於約610 µm之厚度； g. 大於約1138.1 g/m2 但小於或等於約1919.3 g/m2 之膜負載；及 h. 約60 psi之最大饋料壓力。
此外，界面活性劑可在該第三溶液經濃縮之後添加至其中，諸如聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)。在一些情況下，該界面活性劑為聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic® F-68)或D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)。該界面活性劑可介於約0.0001重量%至約10重量%每體積(「w/v」)該調配物之濃度範圍內，例如約0.0001%、約0.005%、約0.006%、約0.007%、約0.008%、約0.009%、約0.01%、約0.05%、約0.1%、約0.5%、約1%、約5%或約10%界面活性劑(w/v)該調配物。在某些實施例中，該醫藥調配物包含聚山梨醇酯80，其濃度介於約0.0001%至約1% w/v該調配物範圍內。在某些實施例中，該醫藥調配物包含聚山梨醇酯80，其濃度為約0.01% w/v該調配物。在其他實施例中，該調配物包含Pluronic® F-68，其濃度介於約0.0001%至約1% w/v該調配物範圍內。在某些實施例中，該醫藥調配物包含Pluronic® F-68，其濃度為約0.01% w/v該調配物。在其他實施例中，該調配物包含維他命E TPGS，其濃度介於約0.0001%至約1% w/v該調配物範圍內。在某些實施例中，該醫藥調配物包含維他命E TPGS，其濃度為約0.01% w/v該調配物。
以下實例部分僅舉例給出且並非為了以任何方式限制本發明或申請專利範圍而陳述。實例
除非另外注明，否則黏度量測使用TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀來進行。實例 1- 實驗設計 (DOE) 研究；最佳化含有 N- 乙醯基精胺酸之依伏庫單抗調配物
起始實驗設計(DOE)研究以最佳化含有N-乙醯基精胺酸之依伏庫單抗調配物。針對黏度、經預填充注射器擠壓力、穩定性、pH及重量滲透濃度測試十一種調配物。關於初始調配物參數之資料顯示於表7中。
基於圖1所示之一個月40℃資料使乙酸鹽濃度降至最低以降低聚集速率。使脯胺酸濃度增加至120 mM以使該調配物等滲。選擇N-乙醯基精胺酸(155 mM)以在黏度降低與在4℃下在170 mM下可見之N-乙醯基精胺酸的結晶之間實現平衡。資料亦指示了在聚山梨醇酯-80 (TWEEN® 80；聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)、Pluronic® F-68 (聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)及維他命E TPGS (D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽)之間變化的界面活性劑不會引起黏度或穩定性之顯著差異。
基於此等資料，發現10 mM乙酸鹽、155 mM N-乙醯基精胺酸、120 mM脯胺酸、0.01%聚山梨醇酯-80 (pH 5.4)之調配物適用於高濃度(例如，190-210 mg/mL)依伏庫單抗之黏度降低調配物。表8中提供之資料指示了此調配物等滲且具有低黏度。 實例 2- DOE 研究以評估賦形劑濃度、 pH 及緩衝液之影響
實例2-4針對經過最佳化以盡可能多地降低黏度同時使對聚集、去醯胺化及其他穩定性指示因素之任何影響降至最低的調配物。
N-乙醯基精胺酸(NAR)基於其在賦形劑篩選研究(參見例如實例1)中降低黏度之卓越效應加以選擇。NAR之濃度受其在2-8℃下之溶解度限制。基於穩定性研究選擇在透濾(DF)緩衝液中155 mM之NAR濃度，該等穩定性研究顯示在高達175 mM之濃度下NAR未結晶。精胺酸HCl (70 Mm)添加至該DF緩衝液中以實現具有最低黏度之等滲藥物產品調配物且改良NAR之溶解度。選擇調配物pH為5.4以使依伏庫單抗之聚集及去醯胺化降至最低。緩衝液及界面活性劑(乙酸鹽/聚山梨醇酯-80)顯示對依伏庫單抗調配物黏度及穩定性之最低影響。
執行三種主要研究以研究依伏庫單抗在NAR/精胺酸HCl調配物中之穩定性。其為： 1. DOE研究以評估賦形劑濃度、pH及緩衝液(乙酸鹽對)麩胺酸鹽之影響(實例2)。 2. 設計寬pH研究以評估pH (5.1 - 6.9)對黏度/穩定性之影響(實例3)。 3. 按比例縮小研究以評估頂部調配物候選物之穩定性，包括藥物產品製造單元操作之影響(實例4)。 結果
確立≤ 50 cP之黏度靶標作為靶標。調配物黏度篩選指示了NAR為降低黏度之最有效賦形劑。然而，歸因於有限NAR溶解度，使用NAR及精胺酸HCl之組合來實現等滲調配物且滿足具有小於或等於50 cP之黏度的210 mg/mL依伏庫單抗調配物目標。在篩選期間經評估之所選擇調配物的概述顯示於圖2中。
設計DOE研究以評估NAR/精胺酸HCl濃度、pH及緩衝液物質對210 mg/mL依伏庫單抗穩定性及黏度之影響。針對各樣品之調配物變數顯示於表9中。該研究設計包括155-175 mM之NAR濃度、50-100 mM之精胺酸HCl濃度及4.8至5.4之pH。該研究亦包括在10 mM下之乙酸鹽與麩胺酸鹽緩衝液之間的比較。該研究包括140 mg/mL之脯胺酸調配物對照物，其由同一批作為NAR/精胺酸HCl樣品之起始材料製備且填充於PFS中。樣品使用0.2 µm PVDF過濾器經無菌過濾且以約2.0 mL之填充體積人工填充於玻璃PFS中。
針對pH、濃度、重量滲透濃度及黏度之資料列表於表10中。觀察到就所有樣品而言，pH值接近靶標。該研究中之重量滲透濃度覆蓋256-392 mOsm/kg之範圍。黏度看來顯示在較高pH下朝向較低黏度之不一致趨勢。
使用JMP統計學分析軟件(SAS；Cary, NC；圖3A及3B)對尺寸排阻高壓液相層析(SE-HPLC)資料之分析披露了在40℃下持續1個月，pH及精胺酸HCl濃度對主峰百分比之損失的顯著影響(圖3A)。較低pH及較高精胺酸HCl濃度引起主峰之較大損失，這主要歸因於聚集體峰及在較小程度上寡聚物峰之增加。組合之兩個峰經分類為高分子量(HMW)物質。圖4顯示了針對1個月、40℃時間點，pH及精胺酸HCl對HMW物質之百分比的影響。與pH 5.4樣品相比，在pH 4.8樣品中可見顯著較高水準之HMW物質之百分比。又，與pH 5.4相比，引起較高百分比之HMW物質的較高精胺酸HCl濃度之效應在pH 4.8下顯著更加增強。
圖5A-5C顯示分別與在5℃下持續6個月、在25℃下持續三個月及在40℃下持續1個月之140 mg/mL脯胺酸對照物相比，所選擇之pH 4.8及pH 5.4樣品的SE-HPLC層析圖。該等層析圖顯示相對於pH 5.4，在pH 4.8下增加之聚集體水準的趨勢。該等層析圖亦指示了與140 mg/mL脯胺酸對照物相比，關於210 mg/mL NAR/精胺酸HCl樣品之降解型態不相上下，不過關於210 mg/mL NAR/精胺酸HCl樣品觀察到較快聚集速率。
儘管在40℃下可見pH及精胺酸HCl濃度依賴性差異，在此實驗中研究之所有調配物均顯示在5℃下持續長達6個月及在25℃下持續長達1個月時不相上下之HMW物質百分比(圖6A、6B)。
對所選擇之樣品執行使用液相層析-質譜(LC-MS)分析之胰蛋白酶肽定位。肽圖HPLC-紫外光(UV)層析圖在視覺上與脯胺酸依伏庫單抗調配物對照物及依伏庫單抗參考標準相比。相對於對照物在NAR/精胺酸HCl樣品中未觀察到新峰(圖8)。另外，藉由質譜法偵測之化學修飾的分析顯示在NAR/精胺酸HCl樣品與對照物之間無顯著改變。執行相對定量且N55及N33去醯胺化以及M246及M422氧化之百分率顯示於表11中。相對於pH 5.1 NAR/精胺酸HCl及pH 5.0脯胺酸樣品，在pH 5.4 NAR/精胺酸HCl樣品中可見略微較高水準之N55去醯胺化，與藉由CEX可見之酸性峰的增加一致。N33 (互補決定區(CDR)中之潛在去醯胺化位點)看來不在所評估之pH範圍及條件下顯示去醯胺化之顯著增加。在ASC處培育之後，與210 mg/mL NAR/精胺酸HCl樣品相比，140 mg/mL脯胺酸對照物樣品之M246及M422氧化速率較高。
不可見粒子藉由光阻液載粒子計數及微流成像(MFI)未顯示與所研究之調配物變數相關之顯著趨勢(圖9A-9C及圖10)。不可見粒子計數在210 mg/mL NAR/精胺酸HCl樣品與140 mg/mL脯胺酸對照物之間不相上下。
圖11編輯了在零時、三個月及六個月時間點來自此研究之黏度資料。資料指示對於所有調配物，黏度在5℃及25℃下保持穩定長達六個月。40℃樣品顯示黏度之pH依賴性增加，其與在40℃下藉由SE-HPLC可見之HMW物質百分比的增加相關(圖4)。 觀察結果
在研究中點調配(10 mM緩衝液、165 mM NAR、75 mM精胺酸HCl)處實現大致等滲調配物(約300mOsm/kg)
增加之pH導致在加速儲存之後聚集體百分比之減少，如使用尺寸排阻層析(SEC)所觀察；以及去醯胺化之增加及較高百分比之酸性物質，如藉由陽離子交換所偵測。
精胺酸HCl濃度在pH 4.8下對穩定性具有較大影響(在25℃及40℃下導致增加之聚集)且在pH 5.4下其影響降至最低。
乙酸鹽及麩胺酸鹽在其對穩定性及黏度之影響方面不相上下。
對於5℃及25℃下長達三個月及40℃下一個月之時間點，關於NAR/精胺酸HCl對脯胺酸對照物，藉由所選擇之樣品的肽定位未觀察到新峰。
黏度在5℃及25℃下保持穩定長達六個月。
NAR在5℃下保持可溶於調配物中，其中DF緩衝液濃度高達175 mM且精胺酸HCl濃度在50-100 mM之間。實例 3– pH 研究
設計pH研究以進一步調查在較寬範圍內之pH的影響。該研究包括具有5.1-6.9之靶標pH範圍之調配物。用於各樣品之pH及緩衝液列於表12中。所有樣品均用10 mM緩衝液、165 mM NAR、75 mM精胺酸HCl、0.01%聚山梨醇酯-80以210 mg/mL調配。樣品使用0.2 µm PVDF過濾器經無菌過濾且以2.0 mL之填充體積人工填充於玻璃PFS中。 結果
在40℃下在零時及經三個月各樣品之pH值顯示於圖12中。
圖13A-13C分別顯示在4℃、25℃及40℃下持續長達三個月藉由SE-HPLC發現之pH對HMW物質百分比(寡聚物百分比+聚集體百分比)之影響。5℃及25℃資料顯示在具有變化之pH之調配物之間的最小差異化。關於pH 6.6及pH 6.9調配物，與pH相關之最顯著差異為自零時起較高水準之HMW物質百分比。圖14顯示零時寡聚物水準對pH之曲線。隨著增加之pH觀察到寡聚物之略微向上趨勢，其中在pH 6.3以上觀察到較尖銳增加。寡聚物水準在較低pH下降至最低。
如先前在DOE研究(實例2)中所見，HMW物質百分比關於所研究之各pH在40℃下隨時間增加，其中較低pH與較高初始增加速率相關。
根據在40℃、三個月時間點處之SE-HPLC層析圖的比較，在減少之pH下出現增加之聚集體峰水準(圖15)。
圖16A-16C顯示在5℃ (圖16A)、25℃ (圖16B)及40℃ (圖16C)下持續長達六個月藉由CEX-HPLC發現的pH對主峰百分比之影響。在5℃、六個月時間點處，關於pH ≤ 6.0之樣品不存在主峰百分比之顯著改變，而關於pH ≥ 6.3之樣品觀察到主峰百分比之減少(圖16A)。圖16B及圖16C中在ASC處之CEX-HPLC資料指示了主峰百分比隨增加之pH而減少且減少速率在pH ＞ 6.0下顯著地加速。
圖17顯示在40℃下CEX主峰百分比之pH依賴性減少係歸因於酸性物質百分比之增加。
在25℃、三個月時間點處之CEX-HPLC層析圖的比較可見於圖18中。酸性峰百分比隨增加之pH增高且具有大於6.3之pH的樣品之層析型態存在顯著改變。
在40℃下儲存持續1個月之後對樣品執行使用液相層析-質譜(LC-MS)分析之胰蛋白酶肽定位。肽圖HPLC-UV層析圖(圖19)在視覺上與參考標準跨pH範圍相比。另外，藉由質譜法進行之化學修飾分析未顯示與pH相關之顯著改變，除了N55及N33去醯胺化。N55及N33去醯胺化以及M246及M422氧化之相對定量水準顯示於表13中。在增加之pH下，N55去醯胺化百分比及N33去醯胺化百分比之水準的增加與CEX-HPLC資料中可見之增加之酸性峰百分比水準相關。看來pH對M246或M422之氧化水準並無顯著影響。
一個月40℃樣品之生物分析結果連同初始主峰百分比(CEX-HPLC)及N55百分比及N33百分比(未去醯胺化)在圖20中作圖。
不可見粒子藉由光阻液載粒子計數(圖21A-21C)及MFI (圖22)未顯示與pH相關之顯著趨勢。
圖23中之資料顯示在25℃下持續長達六個月，pH對片段化或其他降解具有最小影響，如藉由降低之毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(rCE-SDS)分析所量測。圖23中之輕鏈前加輕鏈+重鏈百分比(pre LC + LC + HC)顯示在pH範圍之邊緣處的略微減少。較低pH樣品含有略微較高百分比之中間分子量(MMW)物質，而較高pH樣品含有略微較高百分比之HMW物質。低分子量(LMW)物質百分比在pH範圍內不相上下。
最後，如圖24所示，在黏度與pH之間存在良好線性關係，其中每個pH單位具有6.6 cP之減少。 觀察結果
增加之pH導致(1)在40℃下減少之聚集速率，(2)較高初始寡聚物水準，(3)在25℃及40℃下增加之去醯胺化速率，及(4)較低黏度。pH看來對可見或不可見粒子不具有顯著影響，pH看來對片段化或其他降解亦不具有顯著影響，如藉由rCE-SDS所量測。實例 4– 按比例縮小研究
三種調配物經受商業可製造性及穩定性評估。調配物候選物經受多種單元操作，在穩定置放之前模擬商業製造。 結果
測定各調配物原料藥之物理特性。
pH經測定比用於各調配物之DF緩衝液pH高約0.17。用於調配物3之DF緩衝液比靶標高0.14，其導致DS pH比靶標高0.31。
在5℃、25℃及40℃下關於藥物產品穩定性之SE-HPLC (HMW物質百分比)結果顯示於圖25A-25C中。在5℃及25℃下關於所有三種樣品之HMW物質百分比之增加速率不相上下，而在40℃下關於樣品1 (具有較低pH)之聚集速率略微較高。
CEX-HPLC資料顯示於圖26A-26C中且顯示在先前研究中觀察到之酸性峰百分比之預期pH及溫度依賴性增加(參見先前實例)。
圖27中所示之rCE-SDS資料顯示在所測試之所有溫度及時間點處關於按比例縮小調配物中之每一者的PreLC + HC + LC百分比之可相當水準。
在5℃及25℃下持續長達四個月，濁度水準並未顯著改變，但在40℃下4個月之後卻增加。
關於各調配物，按比例縮小樣品濃度經調節至200、210及220 mg/mL。樣品藉由m -VROCTM 流變儀(RheoSense；San Ramon, CA)在高達90,000 sec-1 之剪切速率下且在18℃至28℃之溫度下進行測試。圖28中之資料跨22- 52 cP之黏度範圍且說明了蛋白質濃度、溫度及調配物變化對黏度之影響。 觀察結果
藉由SE-HPLC發現之HMW物質百分比水準及聚集速率與在先前研究(例如，參見先前實例)中所觀察到者一致。
藉由CEX-HPLC發現之主峰、酸性峰及鹼性峰百分比水準及改變速率與在先前研究中所觀察到者一致。
rCE-SDS資料顯示在RSC及ASC處長達三個月無顯著片段化或其他降解實例 5- 包含 N- 乙醯基精胺酸之調配物中的依伏庫單抗之超濾 / 透濾 材料及方法
小規模超濾/透濾(UF/DF)開發實驗使用具有Ultracel PLCTK膜、30 kD分子量截止值之Pellicon® 3卡匣(D篩網，0.11 m2 ；EMD Millipore; Billerica, MA)。該等實驗在切向流過濾(TFF)過程系統(PendoTECH; Princeton, NJ)上執行。該等實驗在室溫(22.2±2℃)下執行。
該等UF/DF開發實驗以小規模執行以評估具有不同pH值之三種NAR調配物緩衝液且比較其在濃縮期間之滲透通量資料。使用兩個DF步驟以便關於減少NAR之消耗節省成本。在UF1/DF1步驟中執行額外實驗以關於在UF/DF過程期間之高分子量形成上評估兩種靶標濃度(35 mg/mL及70 mg/mL)。未評估其他UF/DF操作參數。UF/DF實驗之一般程序描述於表14中。
使用具有1.5 (cm)-1 (g/L)-1 之消光係數之可變路徑長度分光光度計(SoloVPE system; SoloVPE; Bridgewater, NJ)執行A280 量測。
用於評估產品池品質之分析方法包括SE-HPLC、rCE-SDS及CEX-HPLC。
NAR：Ac-Arg-OH，Biochem目錄號- E-1025 NAR調配物緩衝液研究結果
此實驗在UF/DF過程中評估了三種NAR調配物緩衝液。該UF/DF過程遵循一般指導方針：(1)依伏庫單抗經由分批饋料濃縮(UF1)經濃縮至70 mg/mL且用3個置換體積透濾至NAR調配物緩衝液中(DF1)；(2)該蛋白質進一步濃縮至140 mg/mL (UF2)且用4個置換體積透濾至NAR調配物緩衝液中(DF2)；(3)該蛋白質經過量濃縮至靶標約260 mg/mL且在37℃下自該系統回收。蛋白質裝載/膜面積關於NAR pH 5.4為1468 g/m2 且關於NAR pH 5.2及5.6為800 g/m2 。
該通量資料相對於濃度作圖且在所有NAR調配物緩衝液中進行比較。另外，藉由自各透濾步驟取樣來分析賦形劑水準一研究透濾效能且測定最小置換體積。 結果及觀察結果
使用來自該UF/DF研究之通量資料以產生在圖29中顯示之濾液通量對濃度曲線。通量型態在該三種NAR調配物緩衝液中不相上下。通量隨著用緩衝液交換至NAR調配物緩衝液中(DF1及DF2)之蛋白質增加，但隨著蛋白質濃度之增加顯著減少(UF1、UF2及OC)。歸因於不同膜面積，用於UF/DF之總過程時間在NAR pH 5.4中為約20小時且在NAR pH 5.2及5.6中為10小時。相似的通量型態結果顯示了NAR調配物緩衝液對過程通量無顯著影響。依伏庫單抗原料藥(DS)小規模UF/DF研究之概述顯示於表15中。
在透濾步驟(DF1及DF2)處以各置換體積(1至7 DV)取樣以測試透濾效能且測定最小置換體積。表16中之代表性樣品分析來自依伏庫單抗NAR pH 5.4 UF/DF研究。結果顯示了在五個置換體積之後，透濾至NAR pH 5.4中基本上完成。 實例 6- 監測在依伏庫單抗調配物之 UF/DF 期間的 DS 濃度及 HMW 形成
該實驗之目的在於評估在分批饋料濃縮/透濾(UF1/DF1)中之靶標濃度，且測定該靶標濃度以使UF/DF操作期間之HMW形成降至最低。該UF/DF過程遵循表17中列出之一般指導方針。依伏庫單抗(11-mg/mL)經由分批饋料濃縮(UF1)經濃縮至35 mg/mL或70 mg/mL。蛋白質裝載/膜面積為800 g/m2 且NAR調配物緩衝液包括10 mM乙酸鹽、155 mM N-乙醯基精胺酸、70 mM精胺酸HCl (pH 5.3)。
另外，自各UF/DF步驟取得蛋白質樣品用於產品池品質分析以便評估該UF/DF操作。使用產品池品質資料來研究不同UF1/DF1產品濃度對HMW形成之影響。 材料及方法
參考實例5。 結果及觀察結果
圖30顯示了比較在UF1/DF1 (UF/DF-70及UF/DF-35)中在具有35 mg/mL及70 mg/mL之依伏庫單抗UF/DF過程中的HMW (%)形成之圖。最初，UF/DF-70-UF1中之HMW物質(%)比UF/DF-35-UF1高0.2%，但在UF1之後HMW (%)不相上下且在最終DS中相同。結果指示了HWM物質為可逆的且UF1中之靶標濃度不會對最終DS中之HWM物質形成具有顯著影響。據推薦，70 mg/mL為靶標濃度以降低池體積。實例 7- 對來自小規模 UF/DF 之三種 NAR DS 進行的池保持研究
在此實例中，監測經調配至三種NAR調配物緩衝液中之三個批次的依伏庫單抗之穩定性。10 mL之各DS樣品保持於2-8℃下。在圖31-A-31F中所示之各時間點，取出約1 mL樣品且裝運至2-8℃下用於分析測試。 結果及觀察結果
在2-8℃下依伏庫單抗NAR依伏庫單抗之SE-HPLC及CEX結果顯示於圖36及37中。CEX及rCE-SDS結果產生了可相當結構。與饋料材料中之1.1%相比，自NAR pH 5.2、5.4及pH 5.6產生之DS批次在UF/DF操作期間分別具有1.4%、1.5%及1.7% HMW物質。在圖32中對% HMW物質作圖以持續11週比較依伏庫單抗饋料材料及NAR DS。所有三個調配物批次均具有0.4%- 0.5%之HMW (%)物質增加。此等DS批次在2-8℃下穩定至少7天。實例 8- 在 37 ℃ 、 39 ℃ 、 42 ℃ 及 45 ℃ 下對依伏庫單抗 HMP CPD1 NAR 過量濃縮 (260 g/L) 進行之過程中池保持研究
評估在37℃、39℃、42℃及45℃下過程中依伏庫單抗過量濃縮(260 g/L)之穩定性。30 mL OC樣品在具有設定控制溫度之室中在水浴中培育。在圖33及34中所示之各時間點，取出約1 mL樣品，冷凍，且在乾冰上裝運用於分析。在較高溫度下在該等OC樣品上量測黏度值且與在23℃及25℃下所保持者相比。 結果及觀察結果
SE-HPLC結果顯示了依伏庫單抗NAR OC在37℃、39℃及42℃下穩定三個小時，但在45℃下不穩定，如圖33所示。CEX及rCE-SDS結果不相上下。圖34顯示了當溫度增加時，OC之黏度減少且當溫度自37℃增加至42℃時，黏度降低達19% (達14.7 cP)。
本文所用之部分標題僅出於組織目的且不應解釋為限制所描述之標的物。此申請書中引用之所有文獻或文獻之部分(包括專利、專利申請案、文章、書籍及論文)由此明確地以引用之方式整體倂入來達成任何目的。實例 9- 調配物穩固性 DOE 研究
設計調配物穩固性實驗設計(DOE)研究來調查在規定設計空間內之調配物變數對依伏庫單抗穩定性之影響。研究變數包括依伏庫單抗濃度、NAR濃度、精胺酸HCl 濃度及pH。表17中列出之十八種調配物使用0.2 µm PVDF過濾器經無菌過濾且經填充於2.0 mL玻璃經預填充注射器中。在多種溫度下培育之後，藉由指示穩定性之分析方法的陣列測試樣品。除表17中列出之組分以外，所有調配物均亦包括10 mM乙酸鈉及0.01% (w/v)聚山梨醇酯-80。
表18顯示了針對研究調配物中之每一者所量測的依伏庫單抗濃度、pH值及賦形劑濃度。均接近表17中列出之靶標水準。 結果及觀察結果
為了評估聚集，在4℃ (圖35A)、25℃ (圖35B)及40℃ (圖35C及35D)下培育0-6個月之後對表18中所示之調配物進行SE-HPLC分析。資料指示了關於4℃及25℃條件下之所有調配物，% HMW物質之增加速率相似，但在加速40℃脅迫條件下觀察到對聚集之pH依賴性影響。觀察到在pH 5.1下之較低pH樣品在40℃下具有最快聚集速率，而具有pH 5.7之樣品經觀察具有最慢聚集速率(圖35C及35D)。觀察到在40℃下在pH 5.4下之樣品具有在pH 5.1及5.7之彼等樣品之間的中間聚集速率，但此等速率更類似於關於pH 5.7之樣品所觀察到的較低聚集速率(圖35C及35D)。
使用CEX-HPLC檢查pH隨時間(長達三個月)對%酸性峰及%鹼性峰之影響，關於4℃之資料顯示於圖36A (酸性峰)及36B (鹼性峰)中；關於25℃之資料顯示於圖36C (酸性峰)及36D (鹼性峰)中；且關於40℃之資料顯示於圖36E (酸性峰)及36F (鹼性峰)中。如關於25℃及40℃樣品之資料所示(圖36C-36F)，觀察到pH影響該等調配物中之%酸性峰及鹼性峰。關於具有pH 5.7之樣品的資料以%酸性峰之較高增加速率緊密地類集，而關於具有pH 5.1之樣品的資料顯示最低增加速率。觀察到兩種具有pH 5.4之樣品具有直接地在具有pH 5.1及pH 5.7之彼等樣品之所觀察到的速率之間之降解速率。%鹼性峰改變之趨勢看來不太明顯，但由在40℃下培育之樣品觀察到在較低pH下朝向較高%鹼性峰水準之趨勢。
使用rCE-SDS及SE-HPLC分析來分析在30℃或40℃下持續長達三個月該等調配物中之依伏庫單抗的片段化或其他降解；圖37A-37B提供關於在30℃下培育之樣品的資料，且圖37C-37D顯示關於在40℃下培育之樣品的資料。未觀察到與此研究之設計空間內之調配物組成相關的rCE-SDS資料之顯著趨勢。
在4℃及40℃下培育之後，藉由使用HIAC之光阻粒子計數隨時間對該等調配物測定不可見粒子之存在及量持續長達三個月；此等資料顯示於圖38A-38D中。(圖38A (大於或等於10 µm)及38B (大於或等於25 µm之粒子)顯示了關於保持於4℃下之樣品的結果；圖38C (大於或等於10 µm)及38D (大於或等於25 µm之粒子)顯示了關於保持於40℃下之樣品的結果)。由此等資料，未觀察到與所研究之調配物變數相關的不可見粒子計數之顯著趨勢。
根據此實例，資料證明了在所研究之狹窄調配物設計空間內，未觀察到在4℃或25℃下儲存期間對穩定性之顯著影響。在40℃與pH相關之資料表明pH影響聚集速率，如藉由SE-HPLC所偵測；以及酸性物質百分比及在較小程度上鹼性物質百分比，如藉由CEX-HPLC所偵測。例示性實施例
本文揭示包含依伏庫單抗之醫藥組合物的例示性實施例，其中該等組合物包含N-乙醯基精胺酸且該醫藥組合物具有至少小於約80 cP之黏度(例如藉由流變儀，諸如TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀所量測)。此外，本文揭示調配諸如依伏庫單抗之治療多肽之方法，其中該等組合物包含NAR。
實施例 1 ： 一種醫藥組合物，其包含 a. PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； 及 b. N-乙醯基精胺酸， 其中該醫藥組合物具有至少小於約80 cP之黏度。
實施例 2 ： 實施例1之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽為包含重鏈多肽之單株抗體，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)： a. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及 b. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
實施例 3 ： 實施例2或3之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有至少小於約50 cP之黏度。
實施例 4 ： 實施例2或3之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約250至約400 mOsm/kg之重量滲透濃度。
實施例 5 ： 實施例4之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約300 mOsm/kg之重量滲透濃度。
實施例 6 ： 實施例5之醫藥組合物，其中該醫藥組合物對人類血細胞等滲。
實施例 7 ： 實施例1之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽以約140 mg/mL至約260 mg/mL之濃度存在。
實施例 8 ： 實施例2之醫藥組合物，其中PCSK9結合多肽濃度為約210 mg/mL。
實施例 9 ： 實施例1-8中任一者之醫藥組合物，其中該N-乙醯基精胺酸以約25 mM至約230 mM之濃度存在。
實施例 10 ： 實施例9之醫藥組合物，其中該N-乙醯基精胺酸以約140 mM至約170 mM之濃度存在。
實施例 11 ： 實施例10之醫藥組合物，其中該N-乙醯基精胺酸以約140 mM之濃度存在。
實施例 12 ： 實施例1-11中任一者之醫藥組合物，其進一步包含緩衝液。
實施例 13 ： 實施例13之醫藥組合物，其中該緩衝液係選自由乙酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸及磷酸鹽緩衝液或其組合組成之群。
實施例 14 ： 實施例13之醫藥組合物，其中該緩衝液以約5 mM至約30 mM之濃度存在。
實施例 15 ： 實施例14之醫藥組合物，其中該緩衝液為乙酸鈉且以約10 mM之濃度存在。
實施例 16 ： 實施例1-15中任一者之醫藥組合物，其中該pH為約4.8至約6.9。
實施例 17 ： 實施例11之醫藥組合物，其中該pH為約5.4。
實施例 18 ： 實施例1-17中任一者之醫藥組合物，其進一步包含界面活性劑。
實施例 19 ： 實施例18之醫藥組合物，其中該界面活性劑係選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群。
實施例 20 ： 實施例19之醫藥組合物，其中該界面活性劑以約0.0001% (w/v)至約1% (w/v)之濃度存在。
實施例 21 ： 實施例20之醫藥組合物，其中該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯且以約0.01% (w/v)之濃度存在。
實施例 22 ： 實施例1-21中任一者之醫藥組合物，其進一步包含脯胺酸。
實施例 23 ： 實施例22之醫藥組合物，其中該脯胺酸以約50 mM至約150 mM之濃度存在。
實施例 24 ： 實施例23之醫藥組合物，其中該脯胺酸以約90 mM至約120 mM之濃度存在。
實施例 25 ： 實施例22或23之醫藥組合物，其中該脯胺酸以約120 mM之濃度存在。
實施例 26 ： 實施例1-25中任一者之醫藥組合物，其進一步包含精胺酸鹽。
實施例 27 ： 實施例26之醫藥組合物，其中該精胺酸鹽以約25 mM至約150 mM之濃度存在。
實施例 28 ： 實施例27之醫藥組合物，其中該精胺酸鹽以約50 mM至約100 mM之濃度存在。
實施例 29 ： 實施例26之醫藥組合物，其中該精胺酸鹽為精胺酸-HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽。
實施例 30 ： 實施例29之醫藥組合物，其中該精胺酸HCl以約50 mM之濃度存在。
實施例 31 ： 實施例1-30中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約-30℃或更冷情況下時穩定持續至少約2年。
實施例 32 ： 實施例31之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約5年。
實施例 33 ： 實施例1-30中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約5℃下時穩定持續至少約6個月。
實施例 34 ： 實施例33之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約24個月。
實施例 35 ： 實施例1-30中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約25℃下時穩定持續至少約1個月。
實施例 36 ： 實施例35之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約三個月。
實施例 37 ： 實施例35之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約6個月。
實施例 38 ： 實施例1-30中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約40℃下時穩定持續至少約1個月。
實施例 39 ： 實施例1-38中任一者之醫藥組合物，其中該組合物在小於約3%之PCSK9結合多肽濃度下包含該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物。
實施例 40 ： 實施例39之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物以小於約2.5%之該PCSK9結合多肽濃度存在。
實施例 41 ： 一種醫藥組合物，其包含 a. PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； 及 b. N-乙醯基精胺酸； c. 精胺酸鹽； d. 緩衝液；及 e. 界面活性劑 其中該醫藥組合物具有至少小於約80 Cp之黏度(例如藉由流變儀，諸如TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀所量測)。
實施例 42 ： 實施例41之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽為包含重鏈多肽之單株抗體，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)： a. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及 b. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
實施例 43 ： 實施例41或42之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有至少小於約50 cP之黏度。
實施例 44 ： 實施例41或42之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約250至約400 mOsm/kg之重量滲透濃度。
實施例 45 ： 實施例44之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約300 mOsm/kg之重量滲透濃度。
實施例 46 ： 實施例45之醫藥組合物，其中該醫藥組合物對人類血細胞等滲。
實施例 47 ： 實施例41或42之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽以約140 mg/mL至約260 mg/mL之濃度存在。
實施例 48 ： 實施例47之醫藥組合物，其中PCSK9結合多肽濃度為約210 mg/mL。
實施例 49 ： 實施例41-48中任一者之醫藥組合物，其中該N-乙醯基精胺酸以約25 mM至約230 mM之濃度存在。
實施例 50 ： 實施例49之醫藥組合物，其中該N-乙醯基精胺酸以約140 mM至約170 mM之濃度存在。
實施例 51 ： 實施例50之醫藥組合物，其中該N-乙醯基精胺酸以約140 mM之濃度存在。
實施例 52 ： 實施例41或42之醫藥組合物，其中該緩衝液係選自由乙酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸及磷酸鹽緩衝液或其組合組成之群。
實施例 53 ： 實施例52之醫藥組合物，其中該緩衝液以約5 mM至約30 mM之濃度存在。
實施例 54 ： 實施例53之醫藥組合物，其中該緩衝液為乙酸鈉且以約10 mM之濃度存在。
實施例 55 ： 實施例41或42中任一者之醫藥組合物，其中該pH為約4.8至約6.9。
實施例 56 ： 實施例55之醫藥組合物，其中該pH為約5.4。
實施例 57 ： 實施例41或42之醫藥組合物，其中該界面活性劑係選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群。
實施例 58 ： 實施例57之醫藥組合物，其中該界面活性劑以約0.0001% (w/v)至約1% (w/v)之濃度存在。
實施例 59 ： 實施例57之醫藥組合物，其中該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯且以約0.01% (w/v)之濃度存在。
實施例 60 ： 實施例41或42之醫藥組合物，其進一步包含脯胺酸。
實施例 61 ： 實施例60之醫藥組合物，其中該脯胺酸以約50 mM至約150 mM之濃度存在。
實施例 62 ： 實施例61之醫藥組合物，其中該脯胺酸以約90 mM至約120 mM之濃度存在。
實施例 63 ： 實施例62之醫藥組合物，其中該脯胺酸以約120 mM之濃度存在。
實施例 64 ： 實施例41或42之醫藥組合物，其中該精胺酸鹽以約25 mM至約150 mM之濃度存在。
實施例 65 ： 實施例64之醫藥組合物，其中該精胺酸鹽以約50 mM至約100 mM之濃度存在。
實施例 66 ： 實施例64之醫藥組合物，其中該精胺酸鹽為精胺酸-HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽。
實施例 67 ： 實施例66之醫藥組合物，其中該精胺酸HCl以約50 mM之濃度存在。
實施例 68 ： 實施例41-67中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約-30℃或更冷情況下時穩定持續至少約2年。
實施例 69 ： 實施例68之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約5年。
實施例 70 ： 實施例41-67中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約5℃下時穩定持續至少約6個月。
實施例 71 ： 實施例70之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約24個月。
實施例 72 ： 實施例41-67中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約25℃下時穩定持續至少約1個月。
實施例 73 ： 實施例72之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約三個月。
實施例 74 ： 實施例73之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約6個月。
實施例 75 ： 實施例41-67中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約40℃下時穩定持續至少約1個月。
實施例 76 ： 實施例41-75中任一者之醫藥組合物，其中該組合物在小於約3%之PCSK9結合多肽濃度下包含該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物。
實施例 77 ： 實施例76之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物以小於約2.5%之該PCSK9結合多肽濃度存在。
實施例 78 ： 一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. 以約140 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； c. 以約50 mM之濃度存在的精胺酸HCl； d. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015% (w/v)之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 e. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
實施例 79 ： 實施例78之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約5.1至約5.7之pH。
實施例 80 ： 實施例78或79之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有至少小於約50 Cp之黏度(例如藉由流變儀，諸如TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀所量測)。
實施例 81 ： 一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 b. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； c. 以約140 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； d. 以約63 mM之濃度存在的精胺酸HCl； e. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015%之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 f. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
實施例 82 ： 實施例81之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約5.1至約5.7之pH。
實施例 83 ： 實施例81或82之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有至少小於約80 Cp之黏度(例如藉由流變儀，諸如TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀所量測)。
實施例 84 ： 一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. 以約155 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； c. 以約70 mM之濃度存在的精胺酸HCl； d. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015% (w/v)之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 e. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
實施例 85 ： 實施例84之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約5.1至約5.7之pH。
實施例 86 ： 實施例84或85之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有至少小於約45 Cp之黏度(例如藉由流變儀，諸如TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀所量測)。
實施例 87： 一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. 以約170 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； c. 以約63 mM之濃度存在的精胺酸HCl； d. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015%之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 e. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
實施例 88 ： 實施例87之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約5.1至約5.7之pH。
實施例 89 ： 實施例87或88之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有至少小於約60 Cp之黏度(例如藉由流變儀，諸如TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀所量測)。
實施例 90 ： 一種醫藥組合物，其包含 a. 濃度為約195-225 mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊； b. 以約155 mM之濃度存在的N-乙醯基精胺酸； c. 以約120 mM之濃度存在的脯胺酸； d. 濃度為約0.005% (w/v)至約0.015% (w/v)之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)；及 e. 濃度為約10 mM之乙酸鈉。
實施例 91 ： 實施例90之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有約5.1至約5.7之pH。
實施例 92 ： 實施例90或91之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有至少小於約60 Cp之黏度(例如藉由流變儀，諸如TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀所量測)。
實施例 93 ： 實施例78-92中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約-30℃或更冷情況下時穩定持續至少約2年。
實施例 94 ： 實施例93之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約5年。
實施例 95 ： 實施例78-92中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約5℃下時穩定持續至少約6個月。
實施例 96 ： 實施例95之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約24個月。
實施例 97 ： 實施例78-92中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約25℃下時穩定持續至少約1個月。
實施例 98 ： 實施例97之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約三個月。
實施例 99 ： 實施例98之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約6個月。
實施例 100 ： 實施例78-92中任一者之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約40℃下時穩定持續至少約1個月。
實施例 101 ： 實施例78-92中任一者之醫藥組合物，其中該組合物在小於約3%之PCSK9結合多肽濃度下包含該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物。
實施例 102 ： 實施例101之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物以小於約2.5%之該PCSK9結合多肽濃度存在。
實施例 103 ： 實施例1-102中任一者之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為液體。
實施例 104 ： 一種治療有需要之個體之方法，該方法包含投與實施例1-103中任一者之醫藥組合物。
實施例 105 ： 一種套組，其包含實施例1-103中任一者之醫藥組合物及選自由注射器、注射筆、主體注射器及自動注射器組成之群之遞送装置。
實施例 106 ： 實施例105之套組，其進一步包含關於使用該遞送装置投與該醫藥組合物之說明書。
實施例 107 ： 一種製備包含至少140 mg/mL之PCSK9結合多肽之醫藥組合物中的PCSK9結合多肽之方法，該方法包含向包含該PCSK9結合多肽之醫藥組合物中添加有效量的N-乙醯基精胺酸，使得當與缺乏該N-乙醯基精胺酸之該醫藥組合物相比時，該醫藥組合物之黏度降低，且其中該PCSK9結合多肽係選自由以下組成之群： a. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； b. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； c. 單株抗體，其包含： i. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 ii. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； d. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237及D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237及D238；及 e. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： iii. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 iv. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 v. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGF-A結構域的結合位點重疊。
實施例 108 ： 實施例107之方法，其中該醫藥組合物之黏度小於80 Cp (例如藉由流變儀，諸如TA儀器(New Castle, DE) AESR-G2錐板流變儀所量測)。
實施例 109 ： 實施例108之方法，其中該醫藥組合物之黏度小於50 cP。
實施例 110 ： 實施例107-109中任一者之方法，其中該醫藥組合物具有約250至約400 mOsm/kg之重量滲透濃度。
實施例 111 ： 實施例110之方法，其中該醫藥組合物具有約300 mOsm/kg之重量滲透濃度。
實施例 112 ： 實施例111之方法，其中該醫藥組合物對人類血細胞等滲。
實施例 113 ： 實施例107之方法，其中該PCSK9結合多肽以約180 mg/mL至約260 mg/mL之濃度存在。
實施例 114 ： 實施例113之方法，其中PCSK9結合多肽濃度為約210 mg/mL。
實施例 115 ： 實施例107-114中任一者之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約25 mM至約230 mM之濃度存在。
實施例 116 ： 實施例115之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約140 mM至約170 mM之濃度存在。
實施例 117 ： 實施例115之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約140 mM之濃度存在。
實施例 118 ： 實施例107-117中任一者之方法，其進一步包含緩衝液。
實施例 119 ： 實施例118之方法，其中該緩衝液係選自由乙酸鹽、麩胺酸鹽、組胺酸及磷酸鹽緩衝液或其組合組成之群。
實施例 120 ： 實施例119之方法，其中該緩衝液以約5 mM至約30 mM之濃度存在。
實施例 121 ： 實施例120之方法，其中該緩衝液為乙酸鈉且以約10 mM之濃度存在。
實施例 122 ： 實施例107-121中任一者之方法，其中該pH為約4.8至約6.9。
實施例 123 ： 實施例122之方法，其中該pH為約5.4。
實施例 124 ： 實施例107-123中任一者之方法，其進一步包含界面活性劑。
實施例 125 ： 實施例124之方法，其中該界面活性劑係選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群。
實施例 126 ： 實施例125之方法，其中該界面活性劑以約0.0001% (w/v)至約1.0% (w/v)之濃度存在。
實施例 127 ： 實施例126之方法，其中該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯且以約0.01% (w/v)之濃度存在。
實施例 128 ： 實施例107-127中任一者之方法，其進一步包含脯胺酸。
實施例 129 ： 實施例128之方法，其中該脯胺酸以約50 mM至約150 mM之濃度存在。
實施例 130 ： 實施例129之方法，其中該脯胺酸以約90 mM至約120 mM之濃度存在。
實施例 131 ： 實施例130之方法，其中該脯胺酸以約120 mM之濃度存在。
實施例 132 ： 實施例107-131中任一者之方法，其進一步包含精胺酸鹽。
實施例 133 ： 實施例132之方法，其中該精胺酸鹽以約25 mM至約150 mM之濃度存在。
實施例 134 ： 實施例133之方法，其中該精胺酸鹽以約50 mM至約100 mM之濃度存在。
實施例 135 ： 實施例133之方法，其中該精胺酸鹽為精胺酸-HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽。
實施例 136 ： 實施例135之方法，其中該精胺酸HCl以約50 mM之濃度存在。
實施例 137 ： 實施例107-136中任一者之方法，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約-30℃或更冷情況下時穩定持續至少約2年。
實施例 138 ： 實施例137之方法，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約5年。
實施例 139 ： 實施例107-136中任一者之方法，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約5℃下時穩定持續至少約6個月。
實施例 140 ： 實施例139之方法，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約24個月。
實施例 141 ： 實施例107-136中任一者之方法，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約25℃下時穩定持續至少約1個月。
實施例 142 ： 實施例141之方法，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約三個月。
實施例 143 ： 實施例142之方法，其中該PCSK9結合多肽穩定持續至少約6個月。
實施例 144 ： 實施例107-136中任一者之方法，其中該PCSK9結合多肽當儲存於約40℃下時穩定持續至少約1個月。
實施例 145 ： 實施例107-136中任一者之方法，其中該組合物在小於約3%之PCSK9結合多肽濃度下包含該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物。
實施例 146 ： 實施例145之方法，其中該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚物以小於約2.5%之該PCSK9結合多肽濃度存在。
實施例 147 ： 一種調配治療多肽之方法，其包含 a. 第一濃縮步驟，其中濃縮第一溶液中之該多肽； b. 第一溶液交換步驟，其中該第一溶液中之經濃縮多肽使用透濾經交換至包含N-乙醯基精胺酸之第二溶液中； c. 第二濃縮步驟，其中濃縮該第二溶液中之該多肽； d. 第二溶液交換步驟，其中該經濃縮第二溶液中之該多肽使用透濾經交換至包含N-乙醯基精胺酸之第三溶液中；及 e. 第三濃縮步驟，其中濃縮該第三溶液中之該多肽； 其中該治療多肽包含PCSK9結合多肽，該PCSK9結合多肽阻斷PCSK9結合於LDLR且選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； i. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、 D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238； ii. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 3. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 4. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 5. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGFa結構域的結合位點重疊。
實施例 148 ： 實施例147之方法，其中阻斷PCSK9結合於LDLR之該PCSK9結合多肽為包含重鏈多肽之單株抗體，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)： a. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及 b. 分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
實施例 149 ： 實施例147之方法，其中在該第三濃縮步驟之前，該包含該多肽之溶液的溫度增加至約25℃至約37℃。
實施例 150 ： 實施例147之方法，其中該第一溶液交換步驟使用至少三個置換體積之該第二溶液來實現。
實施例 151 ： 實施例147之方法，其中該第二溶液交換步驟使用至少四個置換體積之該第三溶液來實現。
實施例 152 ： 實施例147之方法，其中該治療蛋白之初始濃度為約11 mg/mL或更少。
實施例 153 ： 實施例147之方法，其中在該第一濃縮步驟中，治療多肽濃度增加約3倍至約7倍。
實施例 154 ： 實施例153之方法，其中該多肽之增加的濃度為約35 mg/mL至約70 mg/mL。
實施例 155 ： 實施例147之方法，其中在該第二濃縮步驟中，治療多肽濃度自該第一濃縮步驟增加約2倍至4倍。
實施例 156 ： 實施例155之方法，其中該增加之多肽濃度為約140 mg/mL。
實施例 157 ： 實施例147之方法，其中在該第三濃縮步驟中，治療多肽濃度自該第二濃縮步驟增加約1.5倍至約2倍。
實施例 158 ： 實施例157之方法，其中該增加之多肽濃度為約260 mg/mL。
實施例 159 ： 實施例147之方法，其中該治療多肽具有與該治療多肽之初始濃度相比進一步濃縮至少約19-20倍之最終濃度。
實施例 160 ： 實施例159之方法，其中該治療多肽之最終濃度為約210 mg/mL。
實施例 161 ： 實施例147之方法，其中該等濃縮步驟包含分批饋料超濾。
實施例 162 ： 實施例147之方法，其中該第二溶液及該第三溶液為一致的。
實施例 163 ： 實施例147之方法，其中該包含N-乙醯基精胺酸之第二或第三溶液包含精胺酸鹽及緩衝液。
實施例 164 ： 實施例163之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約25 mM至約230 mM之濃度存在；該精胺酸鹽為精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽且以約25 mM至約150 mM之濃度存在；且該緩衝液為濃度為約5 mM至約30 mM的乙酸鈉緩衝液。
實施例 165 ： 實施例164之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約140至約170 mM之濃度存在；該精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽以約63至約70 mM之濃度存在且該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
實施例 166 ： 實施例164之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約140 mM之濃度存在，該精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
實施例 167 ： 實施例164之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約155 mM之濃度存在，該精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽以約70 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
實施例 168 ： 實施例164之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約170 mM之濃度存在，該精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
實施例 169 ： 實施例165或166之方法，其進一步包含脯胺酸，其中該脯胺酸以約50 mM至約150 mM之濃度存在。
實施例 170 ： 實施例163-169中任一者之方法，其中該第二或第三溶液具有約4.8至約6.9之pH。
實施例 171 ： 實施例170之方法，其中該pH為約5.4。
實施例 172 ： 實施例147之方法，其中在該等第一及第二溶液交換步驟中，使用透濾膜，其具有選自由以下組成之群之至少一種特徵： a. 大於約350 µm但小於或等於約500 µm之網眼； b. 大於膜面積之約32%但小於或等於約36%之開放面積； c. 小於約16.2 n/cm但大於或等於約12.2 n/cm之網目數； d. 大於約270 µm但小於或等於約340 µm之網線直徑； e. 大於約160 g/m2 但小於或等於180 g/m2 之基礎重量； f. 大於約515 µm但小於或等於約610 µm之厚度； g. 大於約1138.1 g/m2 但小於或等於約1919.3 g/m2 之膜負載；及 h. 約60 psi之最大饋料壓力。
實施例 173 ： 實施例147-172中任一者之方法，其中界面活性劑在該第三溶液經濃縮之後添加至其中。
實施例 174 ： 實施例173之方法，其中該界面活性劑係選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群且以約0.0001%至約1%之濃度存在。
實施例 175 ： 實施例175之方法，其中該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)且以約0.01% (w/v)之濃度存在。
實施例 176 ： 一種調配治療多肽之方法，其包含 a. 第一濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾來濃縮第一溶液中之該多肽； b. 第一溶液交換步驟，其中該第一溶液中之經濃縮多肽使用透濾及三個置換體積之包含N-乙醯基精胺酸、精胺酸鹽及緩衝液之第二溶液經交換至該第二溶液中； c. 第二濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾來濃縮該第二溶液中之該多肽； d. 第二溶液交換步驟，其中該經濃縮第二溶液中之該多肽使用透濾及四個置換體積之包含N-乙醯基精胺酸、精胺酸鹽及緩衝液之第三溶液經交換至該第三溶液中； e. 在該第二溶液交換步驟之後，增加該包含該多肽之溶液的溫度至約25℃至約37℃；及 f. 第三濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾濃縮進一步濃縮該多肽； 其中在第一及第二溶液交換步驟中，使用透濾膜，其具有選自由以下組成之群之至少一種特徵： g. 大於約350 µm但小於或等於約500 µm之網眼； h. 大於膜面積之約32%但小於或等於約36%之開放面積； i. 小於約16.2 n/cm但大於或等於約12.2 n/cm之網目數； j. 大於約270 µm但小於或等於約340 µm之網線直徑； k. 大於約160 g/m2 但小於或等於180 g/m2 之基礎重量； l. 大於約515 µm但小於或等於約610 µm之厚度； m. 大於約1138.1 g/m2 但小於或等於約1919.3 g/m2 之膜負載；及 n. 約60 psi之最大饋料壓力； 且 其中該治療多肽包含PCSK9結合多肽，該PCSK9結合多肽阻斷PCSK9結合於LDLR且選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、 D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 3. 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGFa結構域的結合位點重疊。
實施例 177 ： 實施例176之方法，其中在該第三濃縮步驟之前，該包含該多肽之溶液的溫度增加至約25℃至約37℃。
實施例 178 ： 實施例176之方法，其中該治療蛋白之初始濃度為11 mg/mL或更少。
實施例 179 ： 實施例176之方法，其中在該第一濃縮步驟中，治療多肽濃度增加約3倍至約7倍。
實施例 180 ： 實施例179之方法，其中該多肽之增加的濃度為約35 mg/mL至約70 mg/mL。
實施例 181 ： 實施例176之方法，其中在該第二濃縮步驟中，治療多肽濃度自該第一濃縮步驟增加約2倍至4倍。
實施例 182 ： 實施例181之方法，其中該增加之多肽濃度為約140 mg/mL。
實施例 183 ： 實施例176之方法，其中在該第三濃縮步驟中，治療多肽濃度自該第二濃縮步驟增加約1.5倍至約2倍。
實施例 184 ： 實施例183之方法，其中該增加之多肽濃度為約260 mg/mL。
實施例 185 ： 實施例176之方法，其中該治療多肽具有與該治療多肽之初始濃度相比進一步濃縮至少約19-20倍之最終濃度。
實施例 186 ： 實施例185之方法，其中該治療多肽之最終濃度為約210 mg/mL。
實施例 187 ： 實施例176之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約25 mM至約230 mM之濃度存在；該精胺酸鹽為精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽且以約25 mM至約150 mM之濃度存在，且該緩衝液為濃度為約5 mM至約30 mM的乙酸鈉緩衝液。
實施例 188 ： 實施例188之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約140至約170 mM之濃度存在；該精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽以約63至約70 mM之濃度存在且該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
實施例 189 ： 實施例188之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約140 mM之濃度存在，該精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
實施例 190 ： 實施例188之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約155 mM之濃度存在，該精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽以約70 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
實施例 191 ： 實施例188之方法，其中該N-乙醯基精胺酸以約170 mM之濃度存在，該精胺酸HCl、精胺酸乙酸鹽或精胺酸麩胺酸鹽以約63 mM之濃度存在，該乙酸鈉緩衝液以約10 mM的濃度存在。
實施例 192 ： 實施例176之方法，其進一步包含脯胺酸，其中該脯胺酸以約50 mM至約150 mM之濃度存在。
實施例 193 ： 實施例176-192中任一者之方法，其中該第二或第三溶液具有約4.8至約6.9之pH。
實施例 194 ： 實施例193之方法，其中該pH為約5.4。
實施例 195 ： 實施例176-194中任一者之方法，其中界面活性劑在該第三溶液經濃縮之後添加至其中。
實施例 196 ： 實施例195之方法，其中該界面活性劑係選自由聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆，諸如Pluronic® F-68及其他Pluronics® )、山梨聚糖烷基酯(Spans® )、聚乙二醇辛基苯醚(Triton X-100)、聚乙二醇烷基醚(Brij)、聚丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚及D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸鹽(維他命E TPGS)組成之群且以約0.0001%至約1%之濃度存在。
實施例 197 ： 實施例196之方法，其中該界面活性劑為聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(聚山梨醇酯80)且以約0.01% (w/v)之濃度存在。
實施例 198 ： 一種調配治療多肽之方法，其包含 a. 第一濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾來濃縮第一溶液中之該多肽； b. 第一溶液交換步驟，其中該第一溶液中之經濃縮多肽使用透濾及三個置換體積之第二溶液經交換至該第二溶液中； c. 第二濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾來濃縮該第二溶液中之該多肽； d. 第二溶液交換步驟，其中該經濃縮第二溶液中之該多肽使用透濾及四個置換體積之第三溶液經交換至該第三溶液中； e. 在該第二溶液交換步驟之後，增加該包含該多肽之溶液的溫度至約25℃至約37℃；及 f. 第三濃縮步驟，其中使用分批饋料超濾濃縮進一步濃縮該多肽； g. 或者，添加濃度為約0.01% (w/v)之聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯至該第三濃縮步驟之所得溶液中的步驟， 其中該等第二及第三溶液包含選自由以下組成之群之溶液：包含約140 mM N-乙醯基精胺酸、約50 mM精胺酸HCl及約10 mM乙酸鈉的溶液，該溶液具有約5.2之pH；包含約155 mM N-乙醯基精胺酸、約70 mM精胺酸HCl及約10 mM乙酸鈉的溶液，該溶液具有約5.4之pH；及包含約170 mM N-乙醯基精胺酸、約10 mM乙酸鈉的溶液，該溶液具有約5.6之pH； 其中在第一及第二溶液交換步驟中，使用透濾膜，其具有選自由以下組成之群之至少一種特徵： h. 大於約350 µm但小於或等於約500 µm之網眼； i. 大於膜面積之約32%但小於或等於約36%之開放面積； j. 小於約16.2 n/cm但大於或等於約12.2 n/cm之網目數； k. 大於約270 µm但小於或等於約340 µm之網線直徑； l. 大於約160 g/m2 但小於或等於180 g/m2 之基礎重量； m. 大於約515 µm但小於或等於約610 µm之厚度； n. 大於約1138.1 g/m2 但小於或等於約1919.3 g/m2 之膜負載；及 o. 約60 psi之最大饋料壓力； 且 其中該治療多肽包含PCSK9結合多肽，該PCSK9結合多肽阻斷PCSK9結合於LDLR且選自由以下組成之群： i. 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段； ii. 與依伏庫單抗競爭結合於PCSK9之單株抗體； iii. 單株抗體，其包含： 1. 包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO:14或16中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO:14或16中之CDR3的重鏈CDR3，及 2. 包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO:15或17中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO:15或17中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO:15或17中之CDR3的輕鏈CDR3； iv. 結合於PCSK9之以下殘基中的至少一者之單株抗體，該PCSK9包含胺基酸序列SEQ ID NO:3：S153、D188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、 D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375、C378、R237、D238； v. 在PCSK9上之抗原決定基處結合於PCSK9之單株抗體，該抗原決定基與由包含以下之抗體結合的抗原決定基重疊： 1. 胺基酸序列SEQ ID NO:1之重鏈可變區；及 2. 胺基酸序列SEQ ID NO:2之輕鏈可變區，且 其中該單株抗體之該抗原決定基進一步與LDLR之EGFa結構域的結合位點重疊。
實施例 199 ： 實施例104之方法，其中該個體具有選自由以下組成之群之疾病或病症： 膽固醇相關疾病或病症，其選自由以下組成之群：家族性高膽固醇血症(包括包括雜合高膽固醇血症、純合高膽固醇血症、家族缺陷性載脂蛋白B-100；多基因高膽固醇血症)、非家族性高膽固醇血症、高脂血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠心病、中風、心血管疾病、阿爾茲海默氏病及異常血脂症(包括原發性及繼發性異常血脂症，諸如代謝症候群、糖尿病、家族性組合高脂血症、家族性高三酸甘油脂血症；殘粒移去障礙病、肝脂肪酶缺乏；飲食不慎重、甲狀腺功能減退、藥物(包括雌激素及助孕素療法、β-阻斷劑及噻嗪化物利尿劑)繼發的異常血脂症；腎病症候群、慢性腎衰竭、庫欣氏症候群、原發性膽汁性肝硬化、肝醣貯積病、肝瘤、膽汁鬱積、肢端肥大症、胰島素瘤、單一性生長激素缺乏或酒精誘導之高三酸甘油脂血症。 動脈粥樣硬化疾病，其選自由以下組成之群：心血管死亡、非心血管或全因死亡、冠心病、冠狀動脈疾病、外周動脈疾病、中風(缺血性及出血性)、心絞痛、腦血管疾病及急性冠狀動脈症候群、心肌梗塞及不穩定心絞痛；及 可使用斯他汀解決之疾病或病症。
實施例 200 ： 實施例104之方法，其中該治療該個體包含降低選自由以下組成之群之病狀的風險：致命及非致命心臟病發作、致命及非致命中風、心臟手術、用於心臟衰竭之住院、患有心臟病的個體中之胸痛及/或由於已確立之心臟病而引起的心血管事件、歸因於升高之CRP或hsCRP的心血管病狀及復發性心血管事件。
實施例 201 ： 實施例1-103中任一者之醫藥組合物，其用作藥劑。
實施例 202 ： 實施例201之醫藥組合物，其中該藥劑用於治療選自由以下組成之群之疾病或病症： 膽固醇相關疾病或病症，其選自由以下組成之群：家族性高膽固醇血症(包括包括雜合高膽固醇血症、純合高膽固醇血症、家族缺陷性載脂蛋白B-100；多基因高膽固醇血症)、非家族性高膽固醇血症、高脂血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠心病、中風、心血管疾病、阿爾茲海默氏病及異常血脂症(包括原發性及繼發性異常血脂症，諸如代謝症候群、糖尿病、家族性組合高脂血症、家族性高三酸甘油脂血症；殘粒移去障礙病、肝脂肪酶缺乏；飲食不慎重、甲狀腺功能減退、藥物(包括雌激素及助孕素療法、β-阻斷劑及噻嗪化物利尿劑)繼發的異常血脂症；腎病症候群、慢性腎衰竭、庫欣氏症候群、原發性膽汁性肝硬化、肝醣貯積病、肝瘤、膽汁鬱積、肢端肥大症、胰島素瘤、單一性生長激素缺乏或酒精誘導之高三酸甘油脂血症。 動脈粥樣硬化疾病，其選自由以下組成之群：心血管死亡、非心血管或全因死亡、冠心病、冠狀動脈疾病、外周動脈疾病、中風(缺血性及出血性)、心絞痛、腦血管疾病及急性冠狀動脈症候群、心肌梗塞及不穩定心絞痛；及 可使用斯他汀解決之疾病或病症。
實施例 203 ： 實施例202之方法，其中該藥劑用於降低選自由以下組成之群之病狀的風險：致命及非致命心臟病發作、致命及非致命中風、心臟手術、用於心臟衰竭之住院、患有心臟病的個體中之胸痛及/或由於已確立之心臟病而引起的心血管事件、歸因於升高之CRP或hsCRP的心血管病狀及復發性心血管事件。縮寫 參考文獻
圖 1 顯示在40℃下培育1個月之後在含有N-乙醯基精胺酸之多種調配物中的高濃度依伏庫單抗樣品之尺寸排阻層析-高壓液相層析(SE-HPLC)之資料圖。調配物之關鍵在x 軸上指示：[乙酸鹽(mM)]/[N-乙醯基精胺酸(mM)]/[脯胺酸(mM)]。Y 軸指示作為高分子量(HMW)物質(依伏庫單抗之聚集體及寡聚物)之樣品的百分率。
圖 2 顯示在25℃下在210 mg/mL – 1000 sec-1 剪切速率下依伏庫單抗之調配物黏度比較圖。
圖 3A 顯示由JMP Prediction Profiler軟體產生之在40℃下保持一個月的依伏庫單抗調配物之SE-HPLC資料圖。圖 3B 顯示相似資料，除了樣品在25℃下保持三個月。
圖 4 顯示由在40℃下保持一個月之210 mg/mL依伏庫單抗調配物之SE-HPLC產生的HMW物質百分比之條線圖。調配物隨N-乙醯基精胺酸之濃度及精胺酸HCl濃度變化，處於變化之pH下。圖 5A-5C 顯示所選擇之pH 4.8及pH 5.4依伏庫單抗樣品之SE-HPLC層析圖，該等樣品在所指示之溫度及時間下(5℃持續六個月(圖5A)；25℃持續三個月(圖5B)；及40℃持續一個月(圖5C))保持且與依伏庫單抗脯胺酸調配對照物相比。調配物之關鍵：[乙酸鹽(mM)]/[N-乙醯基精胺酸(mM)]/[精胺酸HCl (mM)]。
圖 6A 及 6B 顯示針對在所指示之溫度下(5℃(圖6A)；25℃(圖6B))保持之所指示的依伏庫單抗調配物隨時間產生之HMW物質的百分比圖。所測試之210 mg/mL之依伏庫單抗N-乙醯基精胺酸調配物與140 mg/mL之依伏庫單抗脯胺酸調配對照物相比。調配物之關鍵：[乙酸鹽(mM)]/[N-乙醯基精胺酸(mM)]/[精胺酸HCl (mM)]。
圖 7A 顯示由JMP Prediction Profiler軟體產生之在40℃下保持一個月的依伏庫單抗調配物之陽離子交換層析-高壓液相層析(CEX-HPLC)資料圖。圖 7B 顯示相似資料，除了樣品在25℃下保持三個月。關於進一步詳情，參見實例。
圖 8 顯示由在40℃下保持一個月之210 mg/mL依伏庫單抗調配物之CEX-HPLC產生的酸性峰百分比之圖。
圖 9A-9B 顯示如藉由光阻液載粒子計數(等於或大於10 µM，圖9A；或等於或大於25 µM，圖9B)所測定，每毫升在5℃、25℃及40℃下保持三個月之多種依伏庫單抗調配物的不可見粒子之圖。圖 9C 顯示如藉由光阻液載粒子計數(大於或等於10 µM或25 µM)所測定，在5℃或25℃下保持六個月之多種依伏庫單抗調配物的不可見粒子之圖。
圖 10 顯示如藉由微流成像(MFI)分析所測定，藉由小於0.70之縱橫比(AR)過濾之多種依伏庫單抗調配物的不可見粒子之圖。
圖 11 顯示保持規定之時間及溫度之多種依伏庫單抗調配物的黏度之概略圖，如其中T0表示初始黏度值所指示。
圖 12 顯示圖及表格，其顯示了pH及緩衝液彼此不同之依伏庫單抗調配物隨時間(長達三個月)之pH值。樣品保持在40℃下。
圖 13A-13C 顯示SE-HPLC資料圖，其證明了在4℃(圖13A)、25℃(圖13B)及40℃(圖13C)下持續長達三個月，pH對pH及緩衝液不同之210 mg/mL依伏庫單抗調配物的HMW物質百分比之影響。除了10 mM各列出之緩衝液以外，樣品均亦含有165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 14 顯示在調配之後即刻在變化pH下之依伏庫單抗調配物的寡聚物水準圖。
圖 15 顯示層析圖，該等層析圖顯示了pH及緩衝液不同之依伏庫單抗調配物在40℃下保持三個月之後的蛋白分子的多種大小。(LMW =低分子量物質)。
圖 16A-16C 顯示pH及緩衝液不同之210 mg/mL依伏庫單抗調配物隨時間之CEX-HPLC分析(%主峰)的資料圖。圖16A顯示在5℃下保持之樣品隨時間的主峰百分比，而圖16B顯示在25℃下保持之樣品的相同類型資料且圖16C顯示在40℃下保持之樣品的相同類型資料。除了10 mM各列出之緩衝液以外，樣品均亦含有165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 17 顯示在40℃下保持之pH及緩衝液不同之210 mg/mL依伏庫單抗調配物隨時間的CEX-HPLC分析之資料圖，量測了酸性物質在該等調配物中之百分比。除了10 mM各列出之緩衝液以外，樣品均亦含有165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 18 顯示在25℃下保持三個月之pH及緩衝液不同之210 mg/mL依伏庫單抗調配物的CEX-HPLC分析之層析圖，顯示了酸性及鹼性及主峰物質。除了10 mM各列出之緩衝液以外，樣品均亦含有165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 19 顯示pH及緩衝液不同之多種依伏庫單抗調配物的肽定位資料之層析圖，該等樣品已在40℃下保持一個月。除了10 mM各列出之緩衝液以外，樣品均亦含有165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 20 顯示概述了數項實驗之結果之圖，該等實驗分析了在40℃下1個月之後在pH及緩衝液不同的調配物中之依伏庫單抗。所有樣品均含有10 mM緩衝液、165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。關於進一步詳情，參考該圖及實例。
圖 21A-21B 顯示如藉由光阻液載粒子計數(等於或大於10 µM，圖21A；或等於或大於25 µM，圖21B)所測定，每毫升在5℃、25℃及40℃下保持兩個月之pH及緩衝液不同之多種依伏庫單抗調配物的不可見粒子之圖。圖 21C-21D 顯示在5℃或25℃下保持六個月之pH及緩衝液不同之依伏庫單抗調配物的不可見粒子(大於或等於10 µM，圖21C；大於或等於25 µM，圖21D)之圖。除了10 mM各列出之緩衝液以外，樣品均亦含有165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 22 顯示如藉由微流成像(MFI)所確定，pH及緩衝液不同之依伏庫單抗調配物的不可見粒子之圖。除了10 mM各列出之緩衝液以外，樣品均亦含有165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 23 顯示對在25℃下保持6個月之pH及緩衝液變化之210 mg/mL依伏庫單抗調配物進行的降低之毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(rCE-SDS)分析之結果圖。除了10 mM各列出之緩衝液以外，樣品均亦含有165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 24 顯示pH及緩衝液不同之依伏庫單抗調配物之黏度與pH之間的關係之圖。所有樣品均含有10 mM緩衝液、165 mM N-乙醯基精胺酸、75 mM精胺酸HCl及0.01%聚山梨醇酯-80。
圖 25A-25C 顯示如藉由在5℃(圖25A)、25℃(圖25B)及40℃(圖25C)下保持所指示之時期之不同依伏庫單抗調配物的SE-HPLC所量測之HMW物質百分比之圖。調配物之關鍵：[乙酸鹽(mM)]/[N-乙醯基精胺酸(mM)]/[精胺酸HCl (mM)]。
圖 26A-26C 顯示如藉由在5℃(圖26A)、25℃(圖26B)及40℃(圖26C)下保持所指示之時期之不同依伏庫單抗調配物的CEX-HPLC所量測之酸性峰百分比之圖。調配物之關鍵：[乙酸鹽(mM)]/[N-乙醯基精胺酸(mM)]/[精胺酸HCl (mM)]。
圖 27 顯示與初始水準(T0)相比，藉由在5℃、25℃及40℃下保持三個月之不同依伏庫單抗調配物的降低之毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(rCE-SDS)獲得的Pre –LC + LC + HC (LC =輕鏈，HC =重鏈)百分比之圖。調配物之關鍵：[乙酸鹽(mM)]/[N-乙醯基精胺酸(mM)]/[精胺酸HCl (mM)]。
圖 28 顯示三種不同濃度之依伏庫單抗的不同依伏庫單抗調配物之黏度圖；黏度資料在所指示之溫度下使用流變儀在高達90,000 sec-1 之剪切速率下測定。調配物之關鍵：[乙酸鹽(mM)]/[N-乙醯基精胺酸(mM)]/[精胺酸HCl (mM)]。
圖 29 顯示三種NAR調配物緩衝液中之依伏庫單抗UF/DF通量資料的圖。
圖 30 顯示在UF1/DF1 (UF/DF-70及UF/DF-35)中在具有35 mg/mL及70 mg/mL之依伏庫單抗的依伏庫單抗UF/DF過程中HMW物質形成百分率之圖。該圖亦顯示在針對該兩種初始濃度之依伏庫單抗的過程之各步驟中以mg/mL計之依伏庫單抗濃度。
圖 31A-31F 顯示在pH 5.2 (圖31A及31B)、pH 5.4 (圖31C及31D)及pH 5.6 (圖31E及31F)下含NAR調配物中之依伏庫單抗之SE-HPLC (圖31A、31C及31E)及CEX-HPLC (圖31B、31D及31F)的圖。該圖亦顯示在UF/DF過程期間在多個步驟處之HMW物質百分比、LMW物質百分比及依伏庫單抗百分比。
圖 32 顯示來自在2-8℃及室溫下之池保持研究的依伏庫單抗NAR DS樣品之HMW物質形成百分比。
圖 33 顯示來自在高溫下之池保持研究的依伏庫單抗NAR OC樣品之HMW物質形成百分比的圖
圖 34 顯示在不同溫度下依伏庫單抗NAR調配物之黏度量測值之圖。
圖 35A-35C 顯示用於實例9之所有研究調配物在4℃(圖35A)、25℃(圖35B)及40℃(圖35C)下培育長達6個月之後的SE-HPLC資料圖。圖 35D 展示呈條線圖之40℃ SE-HPLC資料(在圖35C中顯示為線圖)，使得調配物之間的聚集水準之比較更加可辨識。
圖 36A-36F 顯示用於實例9之研究調配物的CEX-HPLC資料圖，顯示了在4℃(圖36A (%酸性)、圖36B (%鹼性))、25℃(圖36C (%酸性)、圖36D (%鹼性))及40℃(圖36E (%酸性)、圖36F (%鹼性))下培育長達三個月之後%酸性及%鹼性峰隨時間之改變。
圖 37A-37D 顯示在30℃(圖37A (%主峰)、圖37B (% LMW物質))及40℃(圖37C (%主峰)、圖37D (% LMW物質))下培育長達三個月之後用於實例9之研究調配物隨時間之%主峰及% LMW物質的rCE-SDS資料圖。
圖 38A-38D 顯示在4℃及40℃下培育長達三個月之後用於實例9之研究調配物藉由使用HIAC之光阻粒子計數獲得的不可見粒子資料圖。圖38A：HIAC - ≥ 10 µm - 4℃；圖38B：HIAC - ≥ 25 µm - 4℃；圖38C：HIAC - ≥ 10 µm - 40℃；及HIAC - ≥ 25 µm - 40℃。
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Claims (25)

  1. 一種醫藥組合物，其包含a.約140mg/mL至約260mg/mL之PCSK9結合多肽，其選自由以下組成之群：i.包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗(evolocumab))，或其抗原結合片段；及ii.單株抗體，其包含：1.包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO：14中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO：14中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO：14中之CDR3的重鏈CDR3，及2.包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO：15中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO：15中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO：15中之CDR3的輕鏈CDR3；及b.約25mM至約230mM之N-乙醯基精胺酸；及約25mM至約150mM之精胺酸鹽或約50mM至約150M之脯胺酸，其中該醫藥組合物具有至少小於80cP之黏度。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽為包含重鏈多肽之單株抗體，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)：a.分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、 CDR2及CDR3；及b.分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
  3. 如請求項1之醫藥組合物，其中該PCSK9結合多肽以190mg/mL至210mg/mL之濃度存在。
  4. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中PCSK9結合多肽濃度為約210mg/mL。
  5. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中該N-乙醯基精胺酸以140mM至170mM之濃度存在。
  6. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其進一步包含緩衝液。
  7. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其進一步包含界面活性劑。
  8. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其包含該脯胺酸。
  9. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其包含該精胺酸鹽。
  10. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中該組合物在小於3%之該PCSK9結合多肽濃度下包含該PCSK9結合多肽之高分子量聚集體或寡聚 物。
  11. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為液體。
  12. 一種如請求項1至11中任一項之醫藥組合物之用途，其係用於製造用以治療個體中與PCSK9活性相關之後果、症狀及/或病理之藥劑。
  13. 一種套組，其包含如請求項1至11中任一項之醫藥組合物及選自由注射器、注射筆、主體注射器及自動注射器組成之群之遞送裝置。
  14. 一種製備包含至少140mg/mL之PCSK9結合多肽之醫藥組合物中的PCSK9結合多肽之方法，其包含添加N-乙醯基精胺酸(NAR)及至少一種精胺酸鹽或脯胺酸至包含約140mg/mL至約260mg/mL之該PCSK9結合多肽之醫藥組合物，使得NAR之濃度為約25mM至約230mM，精胺酸鹽之濃度為約25mM至約150mM或脯胺酸之濃度為約50mM至約150mM，且其中該PCSK9結合多肽係選自由以下組成之群：a.包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈多肽及具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之輕鏈多肽的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段；及b.單株抗體，其包含：i.包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO：14中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO：14中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO：14中之CDR3的重鏈CDR3，及 ii.包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO：15中之CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO：15中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO：15中之CDR3的輕鏈CDR3。
  15. 一種調配於醫藥組合物中之治療多肽之方法，該醫藥組合物包含N-乙醯基精胺酸及至少一種精胺酸鹽或脯胺酸，該方法包含a.第一濃縮步驟，其中濃縮第一溶液中之該多肽；b.第一溶液交換步驟，其中該第一溶液中之該經濃縮多肽使用透濾經交換至包含N-乙醯基精胺酸之第二溶液中；c.第二濃縮步驟，其中濃縮該第二溶液中之該多肽；d.第二溶液交換步驟，其中該經濃縮第二溶液中之該多肽使用透濾經交換至包含N-乙醯基精胺酸之第三溶液中；及e.第三濃縮步驟，其中濃縮該第三溶液中之該多肽；其中該治療多肽包含PCSK9結合多肽，該PCSK9結合多肽阻斷PCSK9結合於LDLR且選自由以下組成之群：i.包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之輕鏈的單株抗體(依伏庫單抗)，或其抗原結合片段；及ii.單株抗體，其包含：1.包含以下互補決定區(CDR)之重鏈多肽：作為SEQ ID NO：14中之CDR1的重鏈CDR1；作為SEQ ID NO：14中之CDR2的重鏈CDR2；作為SEQ ID NO：14中之CDR3的重鏈CDR3，及2.包含以下CDR之輕鏈多肽：作為SEQ ID NO：15中之 CDR1的輕鏈CDR1；作為SEQ ID NO：15中之CDR2的輕鏈CDR2；及作為SEQ ID NO：15中之CDR3的輕鏈CDR3；其中：該醫藥組合物中PCSK9結合多肽之濃度為約140mg/mL至約260mg/mL，及該醫藥組合物中NAR之濃度為約25mg/mL至約230mg/mL，及該精胺酸鹽之濃度為約25mg/mL至約150mg/mL，或該脯胺酸之濃度為約50mg/mL至約150mg/mL。
  16. 如請求項15之方法，其中該多肽為包含重鏈多肽之單株抗體，該重鏈多肽包含以下互補決定區(CDR)：a.分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：7、8及9之重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及b.分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：4、5及6之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
  17. 如請求項15之方法，其中在該第三濃縮步驟之前，該包含該多肽之溶液的溫度增加至25℃至37℃。
  18. 如請求項15之方法，其中在該第一濃縮步驟中，該治療多肽濃度增加3倍至7倍。
  19. 如請求項15之方法，其中在該第二濃縮步驟中，該治療多肽濃度自該第一濃縮步驟增加2倍至4倍。
  20. 如請求項15之方法，其中在該第三濃縮步驟中，治療多肽濃度自該第二濃縮步驟增加1.5倍至2倍。
  21. 如請求項15之方法，其中該治療多肽具有與該治療多肽之初始濃度相比進一步濃縮至少19-20倍之最終濃度。
  22. 如請求項15之方法，其中該等濃縮步驟包含分批饋料超濾。
  23. 如請求項15至22中任一項之方法，其中該第二或第三溶液具有4.8至6.9之pH。
  24. 如請求項15之方法，其中在該等第一及第二溶液交換步驟中，使用透濾膜，其具有選自由以下組成之群之至少一種特徵：a.大於350μm但小於或等於500μm之網眼；b.大於膜面積之32%但小於或等於36%之開放面積；c.小於16.2n/cm但大於或等於12.2n/cm之網目數；d.大於270μm但小於或等於340μm之網線直徑；e.大於160g/m2但小於或等於180g/m2之基礎重量；f.大於515μm但小於或等於610μm之厚度； g.大於1138.1g/m2但小於或等於1919.3g/m2之膜負載；及h.約60psi之最大饋料壓力。
  25. 如請求項15至22及24中任一項之方法，其中界面活性劑在該第三溶液經濃縮之後添加至其中。
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