TWI809286B - 以pd-1/cd3雙特異性蛋白質所進行之血液性癌症治療 - Google Patents

Abstract

本發明之課題係提供對於血液性癌症之預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療用之新穎藥劑。本發明之發明者們致力研究的結果，著眼於特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3的第二臂之雙特異性蛋白質(較佳為PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段)作為可解決相關問題的物質，發現該等雙特異性蛋白質對於血液性癌症對於預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療為有用者。

Description

以PD-1/CD3雙特異性蛋白質所進行之血液性癌症治療

本發明係關於可各別特異性地結合於PD-1及CD3的雙特異性蛋白質(下文中，有簡稱為「PD-1/CD3雙特異性蛋白質」的情況)的醫藥治療用途。

PD-1係屬於免疫球蛋白家族的免疫抑制受體，為具有抑制因來自抗原受體的刺激而經活化之T細胞的免疫活化信號的功能的分子。由PD-1剔除小鼠的解析等，已知PD-1信號於自體免疫性擴張型心肌症、類狼瘡症候群、自體免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑性狼瘡、移植片對宿主病、I型糖尿病及風濕性關節炎等自體免疫疾患的抑制扮演重要角色。因此，增強PD-1信號的物質被指稱可成為自體免疫疾患等的預防劑或治療劑。

截至目前，作為增強PD-1信號的物質，已知有辨識PD-1的雙特異性抗體(專利文獻1至3)。此雙特異性抗體係將辨識T細胞受體複合體的成員之CD3的抗體的抗原辨識部位與辨識PD-1抗體的抗原辨識 部位經基因工程性地連結者，藉由使PD-1位於T細胞受體複合體附近的頻率提升，具有增強對於T細胞受體複合體之PD-1的抑制信號的作用。進一步地，同專利文獻中，亦記載PD-1雙特異性抗體可使用於自體免疫疾患等之預防或治療。

然而，未有PD-1/CD3雙特異性蛋白質有效於血液性癌症的預防或治療的報告。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2003/011911號小冊

[專利文獻2]國際公開第2004/072286號小冊

[專利文獻3]國際公開第2013/022091號小冊

本發明的目的係提供對於血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療用之新穎藥劑。

本發明的發明者們致力研究的結果，作為可解決相關課題的物質，著眼於本發明之PD-1/CD3雙特異性蛋白質，確認該等可期待有效於血液性癌症的預防或治療，完成本發明。

亦即，本發明係如下述者。

[1]一種血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療的劑，係包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性蛋白質(本說明書中，與「可各別特異性地結合於PD-1及CD3的雙特異性蛋白質」同義，關於此，亦有簡稱為「PD-1/CD3雙特異性蛋白質」)作為有效成分。

[2]如前項[1]記載的劑，其中，該雙特異性蛋白質為具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂的雙特異性抗體(下文中，亦簡稱為「PD-1/CD3雙特異性抗體」)或其抗體片段(下文中，亦將該等合併簡稱為「PD-1/CD3雙特異性抗體等」)。

[3]如前項[2]記載的劑，其中，該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂係具有選自下列(A)至(E)之任一VH，

(A)具有(a)由序列編號6的胺基酸序列所構成之重鏈可變區的互補決定區1(下文中，「重鏈可變區的互補決定區1」亦簡稱為VH-CDR1)、

(b)由序列編號7的胺基酸序列所構成之重鏈可變區的互補決定區2(下文中，「重鏈可變區的互補決定區2」亦簡稱為VH-CDR2)及

(c)由序列編號8的胺基酸序列所構成之重鏈可變區的互補決定區3(下文中，「重鏈可變區的互補決定區3」亦簡稱為VH-CDR3)之重鏈可變區(下文中，「重鏈可變區」亦簡稱為VH)，

(B)具有(a)由序列編號9的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號10的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號11的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

(C)具有(a)由序列編號12的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號13的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號14的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

(D)具有(a)由序列編號15的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號16的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號17的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，以及

(E)具有(a)由序列編號18的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號19的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號20的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

此處，特異性地結合於PD-1之第一臂中，VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之任一者或複數個VH-CDR中，其各別的任意的1至5個胺基酸殘基亦可以其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)置換。

[4]如前項[2]或[3]之任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體等之特異性地結合於CD3之第二臂係具有：

具有(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

此處，特異性地結合於CD3之第二臂中，VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之任一者或複數個VH-CDR中，其各別的任意的1至5個胺基酸殘基亦可以其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)置換。

[5]如前項[2]至[4]之任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂係具有選自下列(A)至(E)之任一VH，

(A)具有(a)由序列編號6的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號7的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號8的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

(B)具有(a)由序列編號9的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號10的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號11的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

(C)具有(a)由序列編號12的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號13的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號14的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

(D)具有(a)由序列編號15的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號16的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號17的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，以及

(E)具有(a)由序列編號18的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號19的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號20的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH。

[6]如前項[2]至[5]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體等的特異性地結合於CD3之第二臂係具有：

具有(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH。

[7]如前項[2]記載的劑，其中，(i)該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號6的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號7的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號8的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)該雙特異性抗體等的特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[8]如前項[2]記載的劑，其中，(i)該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號9的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號10的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號11的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)該雙特異性抗體等之特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[9]如前項[2]記載的劑，其中，(i)該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號12的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號13的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號14的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)該雙特異性抗體等之特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[10]如前項[2]記載的劑，其中，(i)該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號15的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號16的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號17的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)該雙特異性抗體等之特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[11]如前項[2]記載的劑，其中，(i)該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號18的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號19的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號20的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)該雙特異性抗體等之特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[12]一種血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療的劑，係包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二 臂的雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂係具有：

具有(a)HYJ¹LH表示之胺基酸序列[序列中，J¹表示G(甘胺酸)或A(丙胺酸)，此處，J¹所表示的字母或其他的字母，係表示各別胺基酸之一字母縮寫]所構成之VH-CDR1，

(b)WJ²NTNTU²NPTX²AQGFTG表示之胺基酸序列[序列中，J²表示L(白胺酸)或I(異白胺酸)，U²表示E(麩胺酸)或G(甘胺酸)，X²表示F(苯丙胺酸)或Y(酪胺酸)，此處，J²、U²及X²各自所表示的字母或其他的字母，係表示與上述各別為相同意義。]所構成之VH-CDR2、及

(c)GDJ³VVPTTIWNYYU³X³MZ³V表示之胺基酸序列[序列中，J³表示M(甲硫胺酸)或L(白胺酸)，U³表示H(組胺酸)或Y(酪胺酸)，X³表示F(苯丙胺酸)或Y(酪胺酸)，Z³表示D(天冬胺酸)或E(麩胺酸)，此處，J³、U³、X³及Z³各自所表示的字母或其他的字母，係表示與上述各別為相同意義。]所構成之VH-CDR3的VH，以及

特異性地結合於CD3之第二臂係具有：

具有(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH。

[13]如前項[12]記載的劑，其中，(a)J¹表示G(甘胺酸)，J²表示L(白胺酸)，U²表示E(麩胺酸)，X²表示F(苯丙胺酸)，J³表示M(甲硫胺酸)，U³表示H(組胺酸)，X³表示F(苯丙胺酸)，及Z³表示D(天冬胺酸)，

(b)J¹表示G(甘胺酸)，J²表示I(異白胺酸)，U²表示G(甘胺酸)，X²表示Y(酪胺酸)，J³表示L(白胺酸)，U³表示H(組胺酸)，X³表示Y(酪胺酸)，及Z³表示E(麩胺酸)，

(c)J¹表示A(丙胺酸)，J²表示L(白胺酸)，U²表示E(麩胺酸)，X²表示Y(酪胺酸)，J³表示M(甲硫胺酸)，U³表示Y(酪胺酸)，X³表示Y(酪胺酸)，及Z³表示D(天冬胺酸)，或

(d)J¹表示A(丙胺酸)，J²表示L(白胺酸)，U²表示E(麩胺酸)，X²表示F(苯丙胺酸)，J³表示M(甲硫胺酸)，U³表示H(組胺酸)，X³表示F(苯丙胺酸)，及Z³表示D(天冬胺酸)。

[14]如前項[2]至[13]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的框架(下文中，「框架」亦有簡稱為FR)區中，框架1(下文中，亦有簡稱為FR1)、框架2(下文中，亦有簡稱為FR2)及框架3(下文中，亦簡稱為FR3)區，係各自對應於生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1或有其體細胞突變之該基因所編碼的胺基酸序列。

[15]如前項[14]記載的劑，其中，該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的框架4(下文中，「框架4」亦有簡稱為FR4)區，係由生殖細胞系列型J基因JH6c或接受其體細胞突變之該基因所編碼的胺基酸序列(惟，VH-CDR3區域所包含的胺基酸序列除外)所構成。

[16]如前項[14]或[15]記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的FR區係包含：由可接受生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1之體細胞突變之該基因所編碼，藉由該體細胞突變，序列編號21的胺基酸序列中，位置13的離胺酸被置換為麩胺醯胺、位置16的丙胺酸被置換為纈 胺酸、或位置19的離胺酸被置換為甲硫胺酸，或經該等之任意複數個組合置換或未置換的FR1區。

[17]如前項[14]~[16]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的FR區係包含：由可接受生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1的體細胞突變的該基因所編碼，藉由該體細胞突變，序列編號21的胺基酸序列中的位置37的纈胺酸被置換為白胺酸或未置換之FR2區。

[18]如前項[14]~[17]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的FR區係包含：由可接受生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1的體細胞突變的該基因所編碼，藉由該體細胞突變，序列編號21的胺基酸序列中的位置77的絲胺酸被置換為蘇胺酸、或位置84的半胱胺酸各別地被置換為絲胺酸或天冬醯胺，或經該等之任意複數個組合所置換或未置換之FR3區。

[19]如前項[14]~[18]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的FR4區係由可接受生殖細胞系列型J基因JH6c的體細胞突變之該基因(惟，編碼VH-CDR3區的基因區除外)所編碼，此FR4區的胺基酸序列(Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser)(序列編號41)中的離胺酸(Lys)亦可置換為麩胺醯胺或天冬醯胺，及/或有＊記號的蘇胺酸(Thr)置換為白胺酸或未置換。

[20]如前項[2]~[19]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列、或與該VH的胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列所構成。

[21]如前項[2]~[11]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列所構成。

[22]如前項[2]~[21]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於CD3之第二臂的VH係由選自序列編號36的胺基酸序列、或與該VH的胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列所構成。

[23]如前項[2]~[21]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於CD3之第二臂的VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[24]如前項[2]~[6]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂的VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[25]一種血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療的劑，係包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，

特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列、或與該VH的胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列所構成，

特異性地結合於CD3之第二臂的VH係由序列編號36的胺基酸序列、或與該VH的胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列所構成。

[26]如前項[2]~[7]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中VH係由序列編號1的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[27]如前項[2]~[6]及[8]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中VH係由序列編號2的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[28]如前項[2]~[6]及[9]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中VH係由序列編號3的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[29]如前項[2]~[6]及[10]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中VH係由序列編號4的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[30]如前項[2]~[6]及[11]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中VH係由序列編號5的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[31]如前項[2]~[30]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂及/或特異性地結合於CD3之第二臂各別地具有：

具有(a)由序列編號26的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區的互補決定區1(下文中，「輕鏈可變區的互補決定區1」亦簡稱為VL-CDR1)、

(b)由序列編號27的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區的互補決定區2(下文中，「輕鏈可變區的互補決定區2」亦簡稱為VL-CDR2)、及

(c)由序列編號28的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區的互補決定區3(下文中，「輕鏈可變區的互補決定區3」亦簡稱為VL-CDR3)的輕鏈可變區(下文中，「輕鏈可變區」亦簡稱為「VL」)。

[32]如前項[2]~[30]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體等的特異性地結合於PD-1之第一臂及/或特異性地結合於CD3之第二臂各別地具有由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL。

[33]一種血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療的劑，係包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，

(A)特異性地結合於PD-1之第一臂係具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL，以及

(B)特異性地結合於CD3之第二臂係具有由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH以及序列編號25的胺基酸序列所構成之VL。

[34]一種血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療的劑，係包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，該特異性地結合於PD-1之第一臂係與下述者為交叉競爭：(1)具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL，且特異性地結合於PD-1的第一臂對於PD-1的結合，或(2)由該VH及VL所構成之特異性地結合PD-1之單株抗體的可變區對於PD-1的結合。

[35]一種血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療的劑，係包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，經由該特異性地結合於PD-1之第一臂對於PD-1的結合係藉由下述者而交叉競爭：(1)具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL之特異性地結合於PD-1之第一臂，或(2)由該VH及VL所構成之特異性地結合於PD-1之單株抗體的可變區。

[36]如前項[34]或[35]記載的劑，其中，該特異性地結合於CD3之第二臂更與下述者為交叉競爭：(1)具有由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL之特異性地結合於CD3之第二臂對於CD3的結合，或(2)由該VH及VL所構成之特異性地結合於CD3之單株抗體的可變區對於CD3的結合。

[37]如前項[34]或[35]記載的劑，其中，特異性地結合於CD3之第二臂具有：

具有(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH。

[38]如前項[34]或[35]記載的劑，其中，特異性地結合於CD3之第二臂的VH係由序列編號36的胺基酸序列、或與該VH的胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列所構成。

[39]如前項[34]或[35]記載的劑，其中，特異性地結合於CD3之第二臂的VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[40]如前項[34]、[35]及[37]~[39]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於CD3之第二臂係具有：

具有(a)由序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、

(b)由序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及

(c)由序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3之VL。

[41]如前項[34]、[35]及[37]~[39]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於CD3之第二臂係具有序列編號25的胺基酸序列所構成之VL。

[42]如前項[2]~[41]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體係IgG抗體。

[43]如前項[42]記載的劑，其中，前項[42]記載的IgG抗體係IgG₁抗體或IgG₄抗體。

[44]如前項[42]記載的劑，其中，前項[42]記載的IgG抗體係IgG₁抗體。

[45]如前項[42]記載的劑，其中，前項[42]記載的IgG抗體係IgG₄抗體。

[46]如前項[44]記載的劑，其中，該IgG₁抗體對於Fc受體的結合係消失或減弱。

[47]如前項[44]記載的劑，其中，前項[44]記載的IgG₁抗體中2個重鏈恆定區中的EU編號系統之第235號的白胺酸各別地被置換為甘胺酸，及/或第236號的甘胺酸各別地被置換為精胺酸。

[48]如前項[44]、[46]或[47]記載的劑，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈恆定區中依據EU編號系統之第351號的白胺酸及第366號的蘇胺酸均置換為離胺酸，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈恆定區中的第351號的白胺酸被置換為天冬胺酸，且第368號的白胺酸被置換為麩胺酸。

[49]如前項[44]、[46]或[47]記載的劑，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的重鏈恆定區中依據EU編號系統之第351號的白胺酸被置換為天冬胺酸，且第368號的白胺酸被置換為麩胺酸，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH的重鏈恆定區中第351號的白胺酸及第366號的蘇胺酸均置換為離胺酸。

[50]如前項[44]及[46]~[49]中任一項記載的劑，其中，前項[44]及[46]~[49]中任一項記載的IgG₁抗體的2個重鏈恆定區中依據EU編號系統之第447號的離胺酸係各別地缺失。

[51]如前項[42]~[50]中任一項記載的劑，其中，該IgG抗體對於新生兒Fc受體(下文中亦簡稱為「FcRn」)的結合係消失或減弱。

[52]如前項[44]、[46]~[51]中任一項記載的劑，其中，該IgG₁抗體中2個重鏈恆定區中各別地(1)EU編號系統之第252號的甲硫胺酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸，(2)依據EU編號系統之第434號的天冬醯胺被置換為白胺酸、及/或(3)依據EU編號系統之第438號的麩胺醯胺被置換為麩胺酸。

[53]如前項[44]、[46]~[52]中任一項記載的劑，其中，該IgG₁抗體中2個重鏈恆定區中的EU編號系統中第252號的甲硫胺酸各別地被置換為天冬胺酸。

[54]如前項[52]或[53]記載的劑，其中，前項[52]或[53]記載的IgG₁抗體於血液中的半衰期，相比於該胺基酸未置換的抗體係縮短。

[55]如前項[52]或[53]記載的劑，其中，前項[52]或[53]記載的IgG₁抗體於血液中的半衰期、相比於該胺基酸未置換的抗體係縮短至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。

[56]如前項[45]記載的劑，其中，前項[45]記載的IgG₄抗體中2個重鏈恆定區中依據EU編號系統之第228號的絲胺酸各別地被置換為脯胺酸。

[57]如前項[2]~[42]、[44]、[46]、[47]及[49]~[55]中任一項記載的劑，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的重鏈係包含由選自序列編號23、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號46及序列編號47之任一者的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區。

[58]如前項[2]~[42]、[44]、[46]、[47]、[49]~[55]及[57]中任一項記載的劑，其中，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈係包含由選自序列編號24、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52及序列編號53之任一者的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區。

[59]如前項[2]~[58]中任一項記載的劑，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VL的輕鏈及/或具有特異性地結合於CD3之第二臂的VL的輕鏈係包含序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。

[60]一種血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療的劑，係包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，

(A)具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH的重鏈係包含由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5任一者的胺基酸序列所構成之VH，以及由選自序列編號23、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號46及序列編號47之任一者的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區，

(B)具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VL的輕鏈係包含由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL及由序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區，

(C)具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH的重鏈係包含由選自序列編號36的胺基酸序列所構成之VH以及序列編號24、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52及序列編號53之任一者的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區，及

(D)具有特異性地結合於CD3之第二臂的VL的輕鏈係包含由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL及由序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。

[61]如前項[2]記載的劑，其中，該雙特異性抗體等之特異性地結合於PD-1之第一臂係包含抗PD-1抗體的VH及VL，該雙特異性抗體等之特異性地結合於CD3之第二臂係包含抗CD3抗體的VH及VL。

[62]如前項[61]記載的劑，其中，該抗PD-1抗體選自納武單抗(Nivolumab)、西米普利單抗(Cemiplimab)、匹博利珠單抗(Pembrolizumab)、斯帕塔利單抗(Spartalizumab)、替雷利珠單抗(Tislelizumab)、多斯塔利單抗(Dostarlimab)、特瑞普利單抗(Toripalimab)、卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)、杰諾單抗(Genolimzumab)、信替利單抗(Sintilimab)、洛達普利單抗(Lodapolimab)、瑞替弗利單抗(Retifanlimab)、巴斯替利單抗(Balstilimab)、斯普魯利單抗(Serplulimab)、布迪格利單抗(Budigalimab)、普洛格利單抗(Prolgolimab)、薩山利單抗(Sasanlimab)、西曲利單抗(Cetrelimab)、吉柏利單抗(Zimberelimab)、AMP-514、STI-A1110、ENUM 388D4、ENUM 244C8、GLS010、CS1003、BAT-1306、AK105、AK103、BI 754091、LZM009、CMAB819、Sym021、GB226、SSI-361、JY034、HX008、ISU106及CX-188之任一者。

[63]如前項[61]或[62]記載的劑，其中，該抗CD3抗體係選自佛拉魯單抗(Foralumab)、莫羅莫納單抗(Muromonab)-CD3、奧昔珠單抗(Otelixizumab)、替利珠單抗(Teplizumab)及維西珠單抗(Visilizumab)之任一者。

[64]如前項[1]~[63]中任一項記載的劑，其中，PD-1及CD3各別地為人PD-1及人CD3。

[65]如前項[1]~[64]中任一項記載的劑，其中，CD3係CD3ε。

[66]如前項[2]~[65]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體係單株抗體。

[67]如前項[2]~[66]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性抗體係單離抗體。

[68]如前項[1]記載的劑，其中，該雙特異性蛋白質係支架蛋白分子或修飾型肽。

[69]如前項[68]記載的劑，其中，該支架蛋白分子係呈Adnectin、Affibody(註冊商標)、Anticalin(註冊商標)、Avimer、DARPin、LRRP、Affilin(註冊商標)、Affitin或Fynomer的形態，該修飾型肽係呈特殊環狀肽、Addbody(註冊商標)或Mirabody(註冊商標)的形態。

[70]如前項[1]~[69]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性蛋白質或該雙特異性抗體或其抗體片段係各別特異性地結合於表現於標的細胞之血液性癌症的癌細胞之PD-1及表現於起效子細胞之淋巴球(例如，T細胞淋巴球)之CD3。

[71]如前項[1]~[69]中任一項記載的劑，其中，該雙特異性蛋白質或該雙特異性抗體或其抗體片段係各別特異性地結合於表現於源自標的細胞之T細胞的癌細胞之PD-1及CD3。

[72]如前項[1]~[70]中任一項記載的劑，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂係容許PD-1及PD-L1之間的相互作用。

[73]如前項[1]~[72]中任一項記載的劑，其中，該血液性癌症係選自多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、白血病、中樞神經系原發惡性淋巴瘤及骨髓增生症候群之1種以上的癌。

[74]如前項[73]記載的劑，其中，該血液性癌症係惡性淋巴瘤，惡性淋巴瘤係非何金杰氏淋巴瘤或何金杰氏淋巴瘤。

[75]如前項[74]記載的劑，其中，惡性淋巴瘤係非何金杰氏淋巴瘤，非何金杰氏淋巴瘤係B細胞性非何金杰氏淋巴瘤或T/NK細胞性非何金杰氏淋巴瘤。

[76]如前項[75]記載的劑，其中，非何金杰氏淋巴瘤係B細胞性非何金杰氏淋巴瘤，B細胞性非何金杰氏淋巴瘤係前驅B細胞淋巴母細胞淋巴瘤、前驅B細胞急性淋巴母細胞性白血病、慢性B淋巴性白血病、B細胞幼淋巴球性白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、結節邊緣區型B-細胞淋巴瘤、結節外邊緣區型B-細胞淋巴瘤、脾原發邊緣區B細胞性淋巴瘤、毛細胞白血病、毛細胞白血病-變體型、濾泡性淋巴瘤、兒童型濾泡性淋巴瘤、瀰漫性大細胞型B細胞性淋巴瘤、瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤-非特定型、脾瀰漫性紅髓小B細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、原發性縱隔大細胞型B細胞性淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、套膜細胞淋巴瘤、單株B細胞淋巴球增多症、脾B細胞淋巴瘤/白血病-不能分類型、意義不明的單株珈瑪球蛋白血症-IgM型、μ重鏈病、λ重鏈病、α重鏈病、漿細胞骨髓瘤、骨孤立性漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、單株免疫球蛋白沉積症、伴隨IRF4重排之大細胞型B細胞淋巴瘤、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、富於T細胞/組織球之大細胞型B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤-下肢型、EBV陽性瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤-非特定型、EBV陽性黏膜皮膚潰瘍、慢性炎症相關瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤、類淋巴瘤肉芽腫症、血管內大細胞型B細胞淋巴瘤、ALK陽性大細胞型B細胞淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、原發性滲出液淋巴瘤、HHV8陽性瀰漫性大細胞型B細胞淋巴 瘤-非特異型、伴隨11q異常的類伯奇氏淋巴瘤、伴隨MYC及BCL2與BCL6之二者或一者的重排的高度惡性B細胞淋巴瘤、伴隨高度惡性B細胞淋巴瘤-非特異型、或伴隨瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤與典型何金杰氏淋巴瘤的中間特徵之B細胞淋巴瘤-不能分類型。

[77]如前項[75]記載的劑，其中，非何金杰氏淋巴瘤係T/NK細胞性非何金杰氏淋巴瘤，T/NK細胞性非何金杰氏淋巴瘤係前驅T細胞淋巴母細胞淋巴瘤、慢性T淋巴球性白血病、T細胞急性淋巴性白血病(T細胞淋巴母細胞白血病)、T細胞型大顆粒淋巴球性白血病、大顆粒NK細胞性白血病、快速進行性NK細胞白血病、末梢性T細胞淋巴瘤、末梢性T細胞淋巴瘤-非特定型、不能分類末梢性T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞性淋巴瘤、未分化大細胞(CD30陽性)淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、腸管T細胞性淋巴瘤、腸症型T細胞淋巴瘤、肝脾型γ-δT細胞淋巴瘤、類皮下脂肪組織炎細胞淋巴瘤、蕈狀肉芽腫、塞札來(Sezary)症候群、類何金杰氏/何金杰氏相關未分化大細胞淋巴瘤、結節外NK/T細胞淋巴瘤、成人T細胞性淋巴瘤、T細胞前淋巴球性白血病、慢性NK細胞淋巴增生異常症、兒童全身性EBV陽性T細胞淋巴瘤、類種痘類水疱症淋巴增生異常症、結節外NK/T細胞淋巴瘤/鼻型、腸症相關T細胞淋巴瘤、單形性趨上皮性腸管T細胞淋巴瘤、胃腸管和緩進行性T細胞淋巴增生異常症、肝脾T細胞淋巴瘤、原發性皮膚CD30陽性T細胞淋巴增生異常症、類淋巴瘤丘疹症、原發性皮膚未分化大細胞型淋巴瘤、原發性皮膚γδT細胞淋巴瘤、原發性皮膚CD8陽性快速進行性趨表皮性細胞傷害性T細胞淋巴瘤、原發性肢端皮膚型CD8陽性T細胞淋巴瘤、原發性皮膚CD4陽性小型/中型T細胞淋 巴增生性症、濾泡T細胞淋巴瘤、伴隨濾泡助手T細胞表現型的結節外周T細胞淋巴瘤、未分化大細胞淋巴瘤-ALK陽性型、未分化大細胞淋巴瘤/ALK陰性型、或乳房植入物相關間變性大細胞淋巴瘤。

[78]如前項[74]記載的劑，其中，惡性淋巴瘤係何金杰氏淋巴瘤，何金杰氏淋巴瘤係典型何金杰氏淋巴瘤(例如，結節硬化型、混合細胞型、富於淋巴球型及淋巴球減少型)或結節性淋巴球優位型何金杰氏淋巴瘤。

[79]如前項[73]記載的劑，其中，該血液性癌症係白血病，白血病係急性骨髓性白血病、急性前骨髓球性白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴性白血病、骨髓發育不良症候群或慢性骨髓性白血病。

[80]如前項[1]~[79]中任一項記載的劑，其中，該血液性癌症係兒童的血液性癌症。

[81]如前項[75]記載的劑，其中，非何金杰氏淋巴瘤係T/NK細胞性非何金杰氏淋巴瘤，T/NK細胞性非何金杰氏淋巴瘤係末梢性T細胞淋巴瘤或成人T細胞性淋巴瘤。

[82]如前項[1]~[81]中任一項記載的劑，其中，該血液性癌症係經由其他抗癌藥的治療效果不充分或不充足的血液性癌症。

[83]如前項[1]~[82]中任一項記載的劑，其中，該血液性癌症係經由其他抗癌藥治療後惡化之血液性癌症。

[84]如前項[1]~[81]中任一項記載的劑，其中，血液性癌症患者係無經由其他抗癌藥之治療病歴。

[85]如前項[1]~[84]中任一項記載的劑，其中，該血液性癌症係復發性及/或難治性。

[86]如前項[1]~[85]中任一項記載的劑，其進一步地與其他抗癌藥併用。

[87]如前項[82]、[83]或[86]記載的劑，其中，該其他抗癌藥係自烷化劑、鉑製劑、代謝拮抗劑(例如，葉酸代謝拮抗藥、吡啶代謝阻礙藥、嘌呤代謝阻礙藥)、核糖核苷酸還原酶阻礙藥、核苷酸類似物、拓樸異構酶阻礙藥、微管聚合阻礙藥、微管脫聚合阻礙藥、抗腫瘤性抗生物質、細胞介素製劑、分子標的藥及癌免疫治療藥所選擇之一種以上之藥劑。

[88]如前項[86]或[87]記載的劑，其係於前項[87]記載的其他抗癌藥之任何一種以上之藥劑投藥時投藥至患者。

[89]如前項[86]或[87]記載的劑，其係於前項[87]記載的其他抗癌藥之任何一種以上之藥劑投藥後投藥至患者。

[90]如前項[86]或[87]記載的劑，其係於前項[87]記載的其他抗癌藥之任何一種以上之藥劑投藥前投藥至患者。

[91]如前項[1]~[85]中任一項記載的劑，其係與類固醇藥同時投藥。

[92]如前項[1]~[85]中任一項記載的劑，其係於類固醇藥投藥後投藥。

[93]靜脈內注射用之前項[1]~[85]中任一項記載的劑。

[94]包含前項[1]~[72]之任一項所記載的雙特異性蛋白質或雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分之血液性癌症細胞增殖抑制劑。

[1-1]包含將前項[1]~[72]之任一項所記載的雙特異性蛋白質或雙特異性抗體或其抗體片段的有效量投藥至患者之步驟之血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療方法。

[2-1]於血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療中所使用之前項[1]~[72]之任一項所記載的雙特異性蛋白質或雙特異性抗體或其抗體片段。

[3-1]於血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療用之醫藥的製造中之前項[1]~[72]之任一項所記載的雙特異性蛋白質或雙特異性抗體或其抗體片段的使用。

[4-1]包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分之醫藥組成物，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂係包含：

選自下列(A)至(E)的任一VH，

(A)具有(a)由序列編號6的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號7的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號8的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

(B)具有(a)由序列編號9的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號10的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號11的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH、

(C)具有(a)由序列編號12的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號13的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號14的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，

(D)具有(a)由序列編號15的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號16的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號17的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，以及

(E)具有(a)由序列編號18的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號19的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號20的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，以及

(F)具有(a)由序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、

(b)由序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及

(c)由序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3之VL；

特異性地結合於CD3之第二臂係包含：

(A)具有(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH，以及

(B)具有(a)由序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、

(b)由序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及

(c)由序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3之VL。

[4-2]如前項[4-1]記載的醫藥組成物，其中，(i)特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號6的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號7的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號8的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[4-3]如前項[4-1]記載的醫藥組成物，其中，(i)特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號9的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號10的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號11的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[4-4]如前項[4-1]記載的醫藥組成物，其中，(i)特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號12的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號13的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號14的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[4-5]如前項[4-1]記載的醫藥組成物，其中，(i)特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號15的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號16的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號17的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[4-6]如前項[4-1]記載的醫藥組成物，其中，(i)特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係具有

(a)由序列編號18的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號19的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號20的胺基酸序列所構成之VH-CDR3，

(ii)特異性地結合於CD3之第二臂的VH係具有

(a)由序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、

(b)由序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及

(c)由序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3。

[4-7]如前項[4-1]記載的醫藥組成物，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂的VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂的VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[4-8]如前項[4-1]或[4-2]記載的醫藥組成物，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中之VH係由序列編號1的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中之VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[4-9]如前項[4-1]或[4-3]記載的醫藥組成物，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中之VH係由序列編號2的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中之VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[4-10]如前項[4-1]或[4-4]記載的醫藥組成物，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中之VH係由序列編號3的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中之VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[4-11]如前項[4-1]或[4-5]記載的醫藥組成物，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中之VH係由序列編號4的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中之VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[4-12]如前項[4-1]或[4-6]記載的醫藥組成物，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂中之VH係由序列編號5的胺基酸序列所構成，特異性地結合於CD3之第二臂中之VH係由序列編號36的胺基酸序列所構成。

[4-13]如前項[4-1]~[4-12]中任一項記載的醫藥組成物，其中，特異性地結合於PD-1之第一臂及/或特異性地結合於CD3之第二臂係各別地具有由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL。

[4-14]包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分之醫藥組成物為：

(A)具有特異性地結合於PD-1之第一臂係具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL，以及

(B)具有特異性地結合於CD3之第二臂係具有由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL。

[4-15]如前項[4-1]~[4-14]中任一項記載的醫藥組成物，其中，該雙特異性抗體係IgG抗體。

[4-16]如前項[4-15]記載的醫藥組成物，其中，該IgG抗體係IgG₁抗體。

[4-17]如前項[4-16]記載的醫藥組成物，其中，該IgG₁抗體對Fc受體的結合消失或經減弱。

[4-18]如前項[4-16]記載的醫藥組成物，其中，該IgG₁抗體的2個重鏈恆定區中的EU編號系統之第235號的白胺酸各別地被置換為甘胺酸，及/或第236號的甘胺酸告別地置換為精胺酸。

[4-19]如前項[4-16]~[4-18]中任一項記載的醫藥組成物，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈的恆定區中依據EU編號系統之第351號的白胺酸被置換為離胺酸，且第366號的蘇胺酸被置換為離胺酸，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈的恆定區中第351號的白胺酸被置換為天冬胺酸，且第368號的白胺酸被置換為麩胺酸。

[4-20]如前項[4-16]~[4-18]中任一項記載的醫藥組成物，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈的恆定區中依據EU編號系統之第351號的白胺酸被置換為天冬胺酸，且第368號的白胺酸被置換為麩胺酸，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈的恆定區中第351號的白胺酸被置換為離胺酸，且第366號的蘇胺酸被置換為離胺酸。

[4-21]如前項[4-16]~[4-20]中任一項記載的醫藥組成物，其中，該IgG₁抗體的2個重鏈恆定區中依據EU編號系統之第447號的離胺酸係各別地缺失。

[4-22]如前項[4-1]~[4-16]中任一項記載的醫藥組成物，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈係包含序列編號23的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區。

[4-23]如前項[4-1]~[4-16]及[4-22]中任一項記載的醫藥組成物，其中，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈係包含序列編號24的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區。

[4-24]如前項[4-1]~[4-23]中任一項記載的醫藥組成物，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VL之輕鏈及/或具有特異性地結合於CD3之第二臂的VL之輕鏈係包含序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。

[4-25]包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分之醫藥組成物，其中，

(A)具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈係包含由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一者的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號23的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區，

(B)具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VL之輕鏈係包含由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL及由序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區，

(C)具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈係包含由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號24的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區，及

(D)具有特異性地結合於CD3之第二臂的VL之輕鏈係包含由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL及由序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。

[4-26]如前項[4-1]~[4-25]中任一項記載的醫藥組成物，其進一步地包含藥學上容許之載體。

本發明之PD-1/CD3雙特異性蛋白質(較佳為PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段)可期待血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療的功效。

圖1係顯示共通輕鏈的VL及恆定區的胺基酸序列。

圖2係顯示共通輕鏈的VL之各CDR的胺基酸序列。

圖3係顯示由生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1及IGHV3-33各別所編碼的胺基酸序列。

圖4係顯示特異性地結合於PD-1之抗體(下文中亦簡稱為抗PD-1抗體)各純株的VH、生殖細胞系列型基因IGHV7-4-1及.JH6c的序列對準。圖中，各純株的胺基酸序列中的“-”表示與對應的生殖細胞系列型基因IGHV7-4-1或者JH6c的胺基酸序列為相同的胺基酸，胺基酸的簡稱所記載的部份表示與同生殖細胞系列型基因的胺基酸序列為相異的胺基酸。

圖5係顯示抗PD-1抗體各純株的VH的胺基酸序列。

圖6係顯示抗PD-1抗體各純株的VH中的各CDR的胺基酸序列。

圖7係顯示特異性地結合於CD3之抗體(下文中，亦簡稱為抗CD3抗體)純株CD3-2的VH的胺基酸序列。

圖8係顯示抗CD3抗體純株CD3-2的VH中的各CDR的胺基酸序列。

圖9係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體的各重鏈恆定區的胺基酸序列。

圖10係顯示WO2005/118635所記載之抗CD3抗體純株15C3的VH的胺基酸序列。又，以下底線標示的胺基酸係表示純株CD3-1的製作中經變換為丙胺酸之第55號的甘胺酸。

圖11係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體各純株對於PD-1及CD3之結合活性之各別地經確認的Biacore(註冊商標)測定結果。

圖12係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體各純株對於PD-1及CD3的同時結合性之經確認的流式細胞分析術。

圖13係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體各純株對於PD-1/PD-L1相互作用影響經確認之流式細胞分析術。

圖14係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體各純株對PD-1的結合之PD1-5(Bi)的交叉競爭性。

圖15係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)(0.01~1000ng/mL)對於B細胞淋巴瘤細胞株EB-1(圖中A)及人PD-1強制表現SU-DHL-4(圖中B)之細胞增殖抑制作用。

圖16係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)(0.01~1000ng/mL)對於多發性骨髓腫細胞株RPMI8226之細胞增殖抑制作用。

圖17係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)(0.1~1000ng/mL)對於成人T細胞性淋巴瘤細胞株ILT-Mat之細胞增殖抑制作用。

圖18係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)(0.1~1000ng/mL)對於人PD-1強制表現Jurkat(急性T細胞性白血病細胞株)之細胞增殖抑制作用。

圖19係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)及Mut1~Mut3之人FcRn結合性，進行Biacore(註冊商標)評價的結果。

圖20係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株Mut4~Mut6之人FcRn結合性，進行Biacore(註冊商標)評價的結果。

圖21係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)、Mut1及Mut4之小鼠FcRn結合性，進行Biacore(註冊商標)評價的結果。

圖22係顯示PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)(0.1~1000ng/mL)對於T細胞急性淋巴性白血病細胞株HPB-ALL之細胞增殖抑制作用。

圖23係顯示標的細胞的PD-1分子數，與PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)存在下之對於來自人末梢血T細胞之標的細胞(人PD-1強制表現SU-DHL-4、EB-1及RPMI8226)之細胞傷害活性(EC50(ng/mL))的關係。

PD-1(Programmed Cell Death-1)，於人類中，係由GenBank登記編號NP_005009表示之胺基酸序列所構成之膜型蛋白質。本說明書中記載為「PD-1」的情況，並無特別限定，亦有包含作為其全部同功型、及本發明之「特異性地結合於PD-1之第一臂」的抗原決定基受到保存之其等之變異體者而使用的情況。本發明中，作為PD-1，較佳地為人PD-1。

CD3係與T細胞受體會合而形成T細胞受體複合體的膜型蛋白質。本說明書中記載為「CD3」的情況，並無特別限定，亦有包含其亞型(ε、δ、γ及ζ亞型)、及本發明之「特異性地結合於CD3之第二臂」的抗原決定基受到保存之其等之變異體者而使用的情況。本發明中，作為CD3，較佳為CD3ε，再者，人CD3，更佳為人CD3ε。

本說明書中「單離」意指由宿主細胞所抽取，由複數至無數的成分所包含的夾雜物中經由鑑定、分離及/或精製，成為實質上單一的純粹成分。

本說明書中，「雙特異性蛋白質」意指一分子中對於二種不同的抗原分子或者抗原決定基具備持有結合特異性的蛋白質，以具有該結合特異性為限，其形態可為任一者，例如，可列舉雙特異性抗體及其抗體 片段、支架蛋白分子(參照Current Opinion in Biotechnology(2006),Vol.17,No.6,p.653-658、Current Opinion in Biotechnology(2007),Vol.18,p.1-10、Current Opinion in Structural Biology(1997),Vol.7,p.463-469或Protein Science(2006),Vol.15,p.14-27)及修飾型肽(例如，特殊環狀肽(J.Synth.Org.Chem.,Jpn.(2017),Vol.75,No.11,p.1171-1178)、Addbody(註冊商標)及Mirabody(註冊商標)等)等，但不限定為該等。再者，作為此種支架蛋白分子的例，例如，可列舉Adnectin(參照WO2001/64942)、Affibody(註冊商標)(參照WO95/19374及WO2000/63243)、Anticalin(註冊商標)(參照WO99/16873)、Avimer(參照Nature Biotechnology(2005),Vol.23,p.1556-1561)、DARPin(參照Nature Biotechnology(2004),Vol.22,p.575-582)、LRRP(Nature(參照2004),Vol.430,No.6996,p.174-180)、Affilin(註冊商標)(參照WO2001/04144及WO2004/106368)、Affitin參照(Journal of molecular biology(2008),Vol.383,No.5,p.1058-1068)及Fynomer(WO2011/023685)等，但不限定為該等。

本說明書中「單株抗體」意指由對於相同的特定抗原結合，實質上均一的抗體集團所獲得之抗體。

本說明書中「雙特異性抗體」意指一分子中對於二種不同的抗原分子或者抗原決定基具備持有結合特異性的抗體，「雙特異性單株抗體」意指進一步地由實質上均一的抗體集團所獲得之雙特異性抗體。

本發明係關於可各別地特異性地結合於於PD-1及CD3的雙特異性蛋白質(本說明書中，亦簡稱為PD-1/CD3雙特異性蛋白質)。本 發明中，作為PD-1/CD3雙特異性蛋白質，較佳地為PD-1/CD3雙特異性抗體及其抗體片段，再者，作為PD-1/CD3雙特異性抗體，較佳地為PD-1/CD3雙特異性單株抗體，更佳地為單離PD-1/CD3雙特異性單株抗體，進一步較佳地為單離人PD-1/人CD3雙特異性單株抗體。此處，「單離人PD-1/人CD3雙特異性單株抗體」意指對於人PD-1與人CD3，為經單離的雙特異性單株抗體。

此處，雙特異性抗體的型態，例如有二價抗體、雙特異性sc(Fv)₂、雙特異性迷你抗體、雙特異性F(ab’)₂、雙特異性雜合抗體、共有結合型二價抗體(雙特異性DART)、雙特異性(FvCys)₂、雙特異性F(ab’-拉鍊)₂、雙特異性(Fv-拉鍊)₂、雙特異性三鏈抗體及雙特異性mAb²等。

二價抗體為辨識不同抗原的VH、VL彼此以肽連接子連結之單鏈肽的二聚體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993),Vol.90,No.14：p.6444-6448)。

雙特異性sc(Fv)₂為以辨識不同抗原的2種抗體的2組VH/VL經由肽連接子接續之單鏈型態所產生之經改變的低分子化抗體(參照J.Biological Chemistry(1994),Vol.269：p.199-206)。

雙特異性F(ab’)₂係辨識不同2種抗原的抗體的Fab’片段，藉由雙硫鍵等共價結合之低分子化抗體。

雙特異性迷你抗體為辨識各別不同的抗原之scFv中，抗體的恆定區CH3域所連結之經改變的低分子抗體片段，藉由其CH3域上的雙硫鍵等共價結合的低分子化抗體(參照Biochemistry(1992),Vo.31,No.6,p.1579-1584)。

雙特異性雜合抗體為辨識不同的2種抗原的抗體的重鏈/輕鏈複合體係藉由雙硫鍵等共價結合之完整抗體。

本發明中，作為較佳的雙特異性抗體的形態為雙特異性雜合抗體。

雙特異性雜合抗體，例如，可由以雜合融合瘤法(參照US4474893)所製作的融合瘤產生。再者，可將各別地編碼辨識不同抗原的抗體的重鏈及輕鏈之合計4種類的cDNA於哺乳動物細胞使其共表現及分泌而製造。

本發明中所使用的單株抗體可以融合瘤法(例如，參照Kohler及Milstein等人，Natur(1975)，Vol.256,p.495-97；Hongo等人，Hybridoma(1995),Vol.14,No.3,p.253-260；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988),Vol.2)及Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,p.563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA法(例如，參照US4816567)、噬菌體展示方法(例如，參照Ladner等人之US5223409、US5403484及US5571698、Dower等人之US5427908及US5580717、McCafferty等人之US5969108及US6172197及Griffiths等人之US5885793、US6521404、US6544731、US6555313、US6582915及US6593081)製作。

抗體或者單株抗體，投藥至人的情況，為了使其抗原性減低或者消失，可以嵌合抗體、人源化抗體或者完全人型抗體的型態製作。

「嵌合抗體」意指可變區序列與恆定區序列係源自各別的哺乳動物的抗體，例如，可變區序列係源自小鼠抗體、恆定區序列係源自人抗體者。嵌合抗體可由以上述的融合瘤法、重組DNA法或者噬菌體展方法所單離的單離抗體產生融合瘤，將經由習知的手法所單離之編碼抗體可變區的基因，與使用習知方法，連結於編碼源自人的抗體恆定區的基因而製作(例如，參照Cabilly等人之US4816567)。

「人源化抗體」意指將源自於小鼠方式之別的哺乳動物的生殖細胞型的互補決定區(CDR)序列，移植至人框架序列上的抗體。人源化抗體的情況，可由以上述方法所單離之抗體產生融合瘤，將經由習知手法所單離的編碼抗體CDR區的基因，使用習知方法，連結於編碼源自人的抗體框架區的基因而製作(例如，參照Winter之US5225539及US5530101、Queen等人之US5585089號及US6180370)。

「人抗體」或「完全人型抗體」意指由框架區及CDR區所構成之可變區以及恆定區二者皆為源自人生殖細胞型免疫球蛋白序列的抗體。本發明中所使用之人抗體，可將產生人抗體之經形質轉化的小鼠、例如，使用Humab小鼠(例如，參照Lonberg及Kay等人之US5545806、US5569825、US5625126、US5633425、US5789650、US5877397、US5661016、US5814318、US5874299及US5770429)、KM小鼠(例如，參照Ishida等人之WO2002/43478)、Xeno小鼠(例如，參照US5939598、US6075181、US6114598、US6150584及US6162963)或Tc小鼠(例如，參照Tomizuka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000),p.722-727)的方法製作。再者，如同因免疫所引起的人抗體應答，亦可使用人免疫細胞經 再構築的SCID小鼠(例如，參照Wilson等人之US5476996及US5698767)調製。再者，本發明中所使用之人抗體，亦可以上述噬菌體展示方法製作。

本說明書中，PD-1/CD3雙特異性抗體的「抗體片段」為全長抗體的一部分，具有對於PD-1的抗原結合部分及對於CD3的抗原結合部分的抗體，例如，可列舉F(ab’)₂等。此處，抗原結合部分意指抗體可結合於其抗原的最少單位，例如，經由VH及VL之每種各別3種CDR及該等之CDR組合而配置可辨識目的抗原的CDR的框架區所構成。

本說明書中，「共通輕鏈」意指與不同的2種以上的重鏈會合，獲得顯示對於各別抗原的結合能力的輕鏈(De Wildt RM等人，J.Mol.Biol.(1999),Vol.285,p.895-901、De Kruif等人，J.Mol.Biol.(2009),Vol.387,p.548-58、WO2004/009618、WO2009/157771及WO2014/051433)。作為此種輕鏈，較佳地，例如，為人κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(根據IMGT數據庫的命名法)生殖細胞系列型基因所編碼的輕鏈(下文中，亦簡稱為IGVK1-39/JK1共通輕鏈)，更佳地，例如，具有包含序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3的VL之該輕鏈，再較佳地，例如，具有序列編號25的胺基酸序列所構成之VL之該輕鏈。再者，作為共通輕鏈的恆定區，較佳地，可列舉序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。本發明中所使用之共通輕鏈的VL及恆定區之各別的胺基酸序列示於圖1，其可變區之各CDR的胺基酸序列示於圖2。

本說明書中「同功型」，係使用於作為指稱由重鏈恆定區基因所編碼的抗體類別(例如，IgM或IgG)者。作為本發明之PD-1/CD3雙特 異性抗體的較佳同功型為IgG，更佳為IgG₁或IgG₄。此處，作為IgG₁，較佳為對Fc受體(例如，Fcγ受體)的結合消失或者經減弱者。具體而言，為藉由其重鏈恆定區的任意胺基酸予以置換、缺失或者插入，可獲得對Fc受體的結合消失或者經減弱的IgG₁抗體。例如，可列舉雙特異性抗體之各別的2種重鏈恆定區或者絞鍊區上，依據EU編號系統之第235號的白胺酸被置換為甘胺酸、及/或第236號的甘胺酸被置換為精胺酸的抗體。再者，為了使抗體的不均一性減低，較佳於C末端的胺基酸、例如，依據EU編號系統之第447號的離胺酸經缺失的抗體。再者，為了使血液中的半衰期縮短，特佳為對FcRn受體的結合消失或者經減弱者。具體地，經由重鏈恆定區中屬於FcRn受體結合部位的胺基酸的置換或缺失可使對於相同受體的結合消失或減弱，但於IgG₁抗體的情況，作為此種抗體，可列舉(1)依據EU編號系統之第252號的甲硫胺酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸、(2)依據EU編號系統之第434號的天冬醯胺被置換為白胺酸、及/或(3)依據EU編號系統之第438號的麩胺醯胺被置換為麩胺酸之各別地經置患者。另一方面，雙特異性抗體為IgG₄的情況，於抗體分子內以抑制交換的方式，其重鏈恆定區的任意胺基酸置換、缺失或者插入之變異體為更佳。例如，較佳為位於絞鍊區，依據EU編號系統之第228號的絲胺酸被置換為脯胺酸的抗體。又，本說明書中，於抗體的可變區的CDR與框架所指定的胺基酸位置有遵循Kabat規定的情況(參照Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,(1987)及(1991))。再者，恆定區的胺基酸係表示以Kabat的胺基酸位置為 準之EU編號系統(參照Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242)。

本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體的Fc區，亦可使該區的任意胺基酸置換，使得二種不同的重鏈容易會合。作為較佳態樣，例如，可列舉具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈上的恆定區依據EU編號系統之第351號的白胺酸被置換為離胺酸、且第366號的蘇胺酸被置換為離胺酸，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈的恆定區中的第351號的白胺酸被置換為天冬胺酸、且第368號的白胺酸被置換為麩胺酸之PD-1/CD3雙特異性抗體。再者，亦可列舉具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈的恆定區中依據EU編號系統之第351號的白胺酸被置換為天冬胺酸、且第368號的白胺酸被置換為麩胺酸、具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈的恆定區中的第351號的白胺酸被置換為離胺酸、且第366號的蘇胺酸被置換為離胺酸之PD-1/CD3雙特異性抗體。

特異性地結合於PD-1之第一臂

本說明書中，「特異性地結合於PD-1之第一臂」(下文中，亦簡稱為「第一臂」)意指，無論是本發明之雙特異性蛋白質的一部分，或者作為自體單體存在，為特異性地結合於PD-1之蛋白質，該雙特異性蛋白質為雙特異性抗體的情況，則該第一臂無論是否包含於抗體或者抗體片段的一部分，或者不為一部分而作為自體單體存在，係至少包含特異性地結合於PD-1之抗體(下文中，亦簡稱為抗PD-1抗體)的VH及VL，而可特異性地結合於PD-1之抗體部分。例如，於此種第一臂，亦包含由構成抗PD-1抗體的抗 原結合部位之VH及VL所構成之抗體的Fv部、包含該VH及VL之抗體的Fab’部及Fab部。此處，「特異性地結合於PD-1」，可為對於PD-1具有至少1x10^-5M，較佳1x10^-7M，更佳1x10^-9M為更高的親和性(解離定數(Kd值))的結合活性直接結合，至少，使用作為實質上不結合於CD28、CTLA-4及ICOS等之所謂屬於CD28家族受體以外的受體成員的特徵。再者，「特異性地結合於PD-1之抗體」或者「抗PD-1抗體」中之「抗體」雖意指全長抗體，亦即以雙硫鍵連結的2種重鏈及2種輕鏈所構成之完全長抗體，較佳地為其單株抗體。

此處，「特異性地結合於PD-1之第一臂」係構成抗體部分的情況，作為其較佳態樣，例如，可列舉具有下述VH者，

(a)HYJ¹LH表示之胺基酸序列[序列中，J¹表示G(甘胺酸)或A(丙胺酸)，此處，J¹表示的字母或其他的字母表示的為各別胺基酸的單一字母簡稱]所構成之VH-CDR1、

(b)WJ²NTNTU²NPTX²AQGFTG表示之胺基酸序列[序列中，J²表示L(白胺酸)或I(異白胺酸)、U²表示E(麩胺酸)或G(甘胺酸)，X²表示F(苯丙胺酸)或Y(酪胺酸)，此處，J²、U²及X²各自所表示的字母或其他的字母，係表示與上述各別為相同意義。]所構成之VH-CDR2、以及

(c)GDJ³VVPTTIWNYYU³X³MZ³V表示之胺基酸序列[序列中，J³表示M(甲硫胺酸)或L(白胺酸)，U³表示H(組胺酸)或Y(酪胺酸)，X³表示F(苯丙胺酸)或Y(酪胺酸)，Z³表示D(天冬胺酸)或E(麩胺酸)，此處，J³、U³、X³及Z³各自所表示的字母或其他的字母，係表示與上述各別為相同 意義。]所構成之VH-CDR3。此處，作為較佳的「特異性地結合於PD-1之第一臂」的態樣例如，可列舉具有下述VH者，

(1a)具有其VH-CDR1之HYJ¹LH序列中的J¹表示G(甘胺酸)，其VH-CDR2之WJ²NTNTU²NPTX²AQGFTG序列中各別地J²表示L(白胺酸)、U²表示E(麩胺酸)、X²表示F(苯丙胺酸)，其VH-CDR3之GDJ³VVPTTIWNYYU³X³MZ³V序列中各別地J³表示M(甲硫胺酸)、U³表示H(組胺酸)、X³表示F(苯丙胺酸)、Z³表示D(天冬胺酸)之各別VH-CDR的VH，

(2a)具有其VH-CDR1之HYJ¹LH序列中的J¹表示G(甘胺酸)，其VH-CDR2之WJ²NTNTU²NPTX²AQGFTG序列中各別地J²表示I(異白胺酸)、U²表示G(甘胺酸)、X²表示Y(酪胺酸)，其VH-CDR3之GDJ³VVPTTIWNYYU³X³MZ³V序列中各別地J³表示L(白胺酸)、U³表示H(組胺酸)、X³表示Y(酪胺酸)、Z³表示E(麩胺酸)之各別VH-CDR的VH，

(3a)具有其VH-CDR1之HYJ¹LH序列中的J¹表示A(丙胺酸)，其VH-CDR2之WJ²NTNTU²NPTX²AQGFTG序列中各別地J²表示L(白胺酸)、U²表示E(麩胺酸)、X²表示Y(酪胺酸)，其VH-CDR3之GDJ³VVPTTIWNYYU³X³MZ³V序列中各別地J³表示M(甲硫胺酸)、U³表示Y(酪胺酸)、X³表示Y(酪胺酸)、Z³表示D(天冬胺酸)之各別VH-CDR的VH，或

(4a)具有其VH-CDR1之HYJ¹LH序列中的J¹表示A(丙胺酸)，其VH-CDR2之WJ²NTNTU²NPTX²AQGFTG序列中各別地J²表示L(白胺酸)、U²表示E(麩胺酸)、X²表示F(苯丙胺酸)，其VH-CDR3之 GDJ³VVPTTIWNYYU³X³MZ³V序列中各別地J³表示M(甲硫胺酸)、U³表示H(組胺酸)、X³表示F(苯丙胺酸)、Z³表示D(天冬胺酸)之各別VH-CDR的VH。

再者，「特異性地結合於PD-1之第一臂」係構成抗體部分的情況，作為其另外的態樣，較佳地，例如，可列舉具有選自下述任一VH者，

(1b)包含序列編號6的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、序列編號7的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及序列編號8的胺基酸序列所構成之VH-CDR3的VH，

(2b)包含序列編號9的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、序列編號10的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及序列編號11的胺基酸序列所構成之VH-CDR3的VH，

(3b)包含序列編號12的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、序列編號13的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及序列編號14的胺基酸序列所構成之VH-CDR3的VH，

(4b)包含序列編號15的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、序列編號16的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及序列編號17的胺基酸序列所構成之VH-CDR3的VH，以及

(5b)包含序列編號18的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、序列編號19的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及序列編號20的胺基酸序列所構成之VH-CDR3的VH。

再者，本發明中，「特異性地結合於PD-1之第一臂」係構成抗體部分的情況，其等之中，亦包含於選自上述(1a)~(4a)或(1b)~(5b)之任一VH之各別的VH-CDR中，其任意的1~5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)，且與該胺基酸未置換之原本的第一臂對於PD-1的結合活性具有同等的結合活性者。例如，VH-CDR1的情況，1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)，VH-CDR2或VH-CDR3的情況，各別的1~5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)者。再者，如圖4所示方式，各別對應於特異性地結合於PD-1之第一臂之抗PD-1抗體純株的各CDR中，各純株間相異的各胺基酸或其等之任意複數個組合於該純株間可相互地置換。此處，經由保留性胺基酸的置換，意指具有類似側鏈的殘基的可換性，例如，具有脂肪族側鏈的胺基酸群中為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸，具有脂肪族羥基側鏈的胺基酸群中為絲胺酸及蘇胺酸，具有含醯胺基側鏈的胺基酸群中為天冬醯胺及麩胺醯胺，具有芳香族側鏈的胺基酸群中為苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸，具有鹼性側鏈的胺基酸群中為離胺酸、精胺酸及組胺酸，具有含硫側鏈的胺基酸群中為半胱胺酸及甲硫胺酸。作為較佳的經由保留性胺基酸置換的例，可列舉纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之間的置換，苯丙胺酸及酪胺酸之間的置換，離胺酸及精胺酸之間的置換，丙胺酸及纈胺酸之間的置換以及天冬醯胺及麩胺醯胺之間的置換。再者，此處，上述之「與該胺基酸未置換之原本的第一臂對於PD-1的結合活性具有實質同等的結合活性」意指，該胺基酸置換之第一臂對於PD-1的結合活性，為該胺基酸 未置換之原本的第一臂的結合活性的95%以上，較佳98%以上，更佳99%以上。

再者，本發明中之「特異性地結合於PD-1之第一臂」係構成抗體部分的情況，其等之中，其VH包含具有上述特定的胺基酸序列之各VH-CDR，其VH的框架的胺基酸序列亦包含具有特定的生殖細胞系列型基因或有其體細胞突變之該基因所編碼的VH者。例如，選自上述(1a)~(4a)或(1b)~(5b)之任一者所示之VH，可係生殖細胞系列型V基因為IGHV7-4-1，生殖細胞系列型J基因為JH6c之VDJ重組基因或有其體細胞突變之該基因所編碼。此處，藉由生殖細胞系列型的V基因IGHV7-4-1所各別編碼之胺基酸序列，係對應於序列編號21的胺基酸序列(圖3)。

本發明之特異性地結合於PD-1之第一臂係構成抗體部分的情況，其VH的框架亦有藉由生殖細胞系列型的VDJ重組基因有體細胞突變之該基因編碼的情況。例如，生殖細胞系列型V基因為IGHV7-4-1，選自上述(1a)~(4a)或(1b)~(5b)之任一者所示VH的FR1、FR2、FR3，於圖4所示胺基酸位置，由於與IGHV7-4-1基因編碼的胺基酸序列相異，於該各位置具有體細胞突變。例如，FR1區中，序列編號21的胺基酸序列中各別地位置13的離胺酸被置換為麩胺醯胺、位置16的丙胺酸被置換為纈胺酸、或位置19的離胺酸被置換為甲硫胺酸，或者亦可為該等之任意的複數組合予以置換。FR2區中，序列編號21的胺基酸序列中位置37的纈胺酸亦可置換為白胺酸。FR3區中，序列編號21的胺基酸序列中各別地位置77的絲胺酸被置換為蘇胺酸、位置84的半胱胺酸被置換為絲胺酸或天冬醯胺，或者該等之任意的複數組合予以置換。再者，選自上述(1a)~(4a)或 (1b)~(5b之任一者所示VH的FR4區中，源自J基因JH6c的FR4區胺基酸序列(Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser)(序列編號41)中的離胺酸(Lys)亦可置換為麩胺醯胺或天冬醯胺，及/或＊印的蘇胺酸(Thr)置換為白胺酸。具有上述任一者的胺基酸置換組合之各別的FR1、FR2、FR3及FR4，對於特異性地結合於PD-1之第一臂的功能不賦予實質的影響，亦可使用作為框架。

再者，本發明之「特異性地結合於PD-1之第一臂」係構成抗體部分的情況，其等之中，包含具有上述特定的胺基酸序列之各CDR，且亦包含其VH的FR的胺基酸序列係為特定的生殖細胞系列型基因或有其體細胞突變之該基因所編碼者。例如，作為該等之第一臂，可列舉具有自序列編號1~5選擇之胺基酸序列所構成之VH者。

再者，該等「特異性地結合於PD-1之第一臂」中，例如，亦包含與自序列編號1~5選擇之任一者的胺基酸序列為至少80%相同，較佳為至少90%相同，更佳為至少95%相同，進一步較佳為至少98%相同，進一步更佳為為至少99%相同的胺基酸序列所構成之VH，且與原先的第一臂的VH的胺基酸序列的不同為實質上不影響對PD-1的結合活性者(下文中，亦簡稱為相同第一臂)。此處，關於胺基酸序列之相同性(同一性)比較中所使用的「%相同」，定義為將2種序列對準，與對照胺基酸序列(此處，為了達成最大百分比的相同性的必要情況，為導入間隙後的對照胺基酸序列)為相同的胺基酸序列的百分率。再者，此處，「與原先的第一臂的VH的胺基酸序列的差異實質上不影響對PD-1的結合活性」意指，相同第 一臂對PD-1的結合活性為原先的第一臂之該結合活性的95%以上，較佳為98%以上，更佳為99%以上。

進一步別的態樣中，本發明之「特異性地結合於PD-1之第一臂」係構成抗體部分的情況，其等之中，亦包含於(1)具有自上述(1a)~(4a)或(1b)~(5b)選擇之任一者所示之VH或者自序列編號1~5選擇之胺基酸序列所構成之VH及共通輕鏈的VL之第一臂對於PD-1結合，或於(2)由該VH及VL所構成之特異性地結合於PD-1之單株抗體的可變區對於PD-1的結合為交叉競爭的抗PD-1抗體的可變區(此處，該可變區包含構成其VH及VL)者，再者，對於PD-1的結合亦包含具有經由(3)具有自上述(1a)~(4a)或(1b)~(5b)選擇之任一者所示之VH或者自序列編號1~5選擇之胺基酸序列所構成之VH及共通輕鏈的VL之第一臂或(4)由該VH及VL所構成之特異性地結合於PD-1之單株抗體的可變區之交叉競爭的抗PD-1抗體的可變區者。此處，「對PD-1的結合為交叉競爭」意指，藉由本說明書中例示之第一臂與相同或者一部重複的抗原決定基結合，無論其程度而阻礙第一臂對於PD-1的結合，或者與該例示之第一臂為相同或者一部重複的抗原決定基結合的抗體之對於PD-1的結合，無論其程度而藉由該例示之第一臂予以阻礙，是否為交叉競爭可藉由競爭結合測試進行評價。例如，可使用Biacore分析、流式細胞分析術、酵素結合免疫吸附檢定法(ELISA)、螢光能量轉移測定法(FRET)或螢光微量測定技術(FMAT(註冊商標))判斷。

例如，作為經由具有上述(5b)所示之VH及共通輕鏈的VL之第一臂之對於PD-1的結合為交叉競爭者，例如，可列舉具有自上述(1b)~(4b)選擇之任一者所示之VH及共通輕鏈的VL(較佳為具有序列編號 26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3L)之第一臂，再者，具有自序列編號1~4選擇之胺基酸序列所構成之VH及共通輕鏈的VL(較佳為序列編號25的胺基酸序列所構成之VL)之第一臂。

再者，例如，作為經由具有自上述(1b)~(4b)選擇之任一者所示之VH或者自序列編號1~4選擇之胺基酸序列所構成之VH及共通輕鏈的VL之第一臂對於PD-1的結合為交叉競爭者，例如，可列舉具有上述(5b)所示之VH及共通輕鏈的VL(較佳為具有序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3的VL)之第一臂，再者，具有序列編號5的胺基酸序列所構成之VH及共通輕鏈的VL(較佳為序列編號25的胺基酸序列所構成之VL)之第一臂。

此處，本發明之「特異性地結合於PD-1之第一臂」係構成抗體部分的情況，作為其等，較佳地，可列舉具有自上述(1b)~(5b)選擇之任一者所示之VH之第一臂，再者，該較佳第一臂係如上述方式，亦包含於其VH之各CDR中，其任意的1~5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)，且此胺基酸置換實質上不影響對於PD-1的結合活性者，再者，再者，如上述方式，VH的框架的胺基酸序列，亦包含具有生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1或同J基因JH6c或具有其體細胞突變之該基因所編碼的VH者。因此，作為該第一臂，更佳地，可列舉具有自序列編號1~5選擇之任一者的胺基酸序列所構成之VH者。

再者，本發明之「特異性地結合於PD-1之第一臂」係構成抗體部分的情況，其VL較佳地為共通輕鏈的VL，作為此種共通輕鏈，較佳地，例如，IGVK1-39/JK1共通輕鏈，更佳地，例如，具有含序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3的VL之輕鏈，進一步較佳地，例如，具有序列編號25的胺基酸序列所構成之VL的輕鏈。再者，作為共通輕鏈的恆定區，較佳地，可列舉序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。

本發明之「特異性地結合於PD-1之第一臂」，作為一種實施態樣，容許PD-1及PD-L1的相互作用、PD-1及PD-L2的相互作用、或該二者的相互作用。此處，「容許PD-1及PD-L1的相互作用、PD-1及PD-L2的相互作用、或該二者的相互作用」意指，即使於本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體為可溶型PD-L1或PD-L2的濃度的20倍過剩存在的狀況下，該PD-L1及PD-1的相互作用、該PD-L2及PD-1的相互作用、或該二者的相互作用，與本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體不存在時之該相互作用相比係維持50%以上，較佳係維持70%以上，更佳係維持80%以上。再者，「容許PD-1及PD-L1的相互作用、PD-1及PD-L2的相互作用、或該二者的相互作用」之定義，係與「實質上不阻礙PD-1及PD-L1的相互作用、PD-1及PD-L2的相互作用、或該二者的相互作用」之意義以相同意義予以使用。

本發明之「特異性地結合於PD-1之第一臂」，作為別的實施態樣，亦有阻礙PD-1及PD-L1的相互作用、PD-1及PD-L2的相互作用、或該二者的相互作用的情況。

為了構築本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體所取得之抗PD-1單株抗體的各純株，以及其等之VH的胺基酸序列及與其序列編號的對應關係示於圖5，以及該抗PD-1單株抗體之各純株的VH中之各CDR的胺基酸序列與其序列編號的對應關係示於圖6。

再者，作為其他之「特異性地結合於PD-1之第一臂」，例如，可列舉習知的抗PD-1抗體之VH及VL的組合，作為該等習知的抗PD-1抗體，例如，可列舉納武單抗(Nivolumab)、西米普利單抗(Cemiplimab)、匹博利珠單抗(Pembrolizumab)、斯帕塔利單抗(Spartalizumab)、替雷利珠單抗(Tislelizumab)、多斯塔利單抗(Dostarlimab)、特瑞普利單抗(Toripalimab)、卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)、杰諾單抗(Genolimzumab)、信替利單抗(Sintilimab)、洛達普利單抗(Lodapolimab)、瑞替弗利單抗(Retifanlimab)、巴斯替利單抗(Balstilimab)、斯普魯利單抗(Serplulimab)、布迪格利單抗(Budigalimab)、普洛格利單抗(Prolgolimab)、薩山利單抗(Sasanlimab)、西曲利單抗(Cetrelimab)、吉柏利單抗(Zimberelimab)、AMP-514、STI-A1110、ENUM 388D4、ENUM 244C8、GLS010、CS1003、BAT-1306、AK105、AK103、BI 754091、LZM009、CMAB819、Sym021、GB226、SSI-361、JY034、HX008、ISU106及CX-188等，再者，下文中的公開專利申請案：US20180222982、US20180312564、WO2004/056875、WO2006/121168、 WO2008/156712、WO2010/029434、WO2010/029435、WO2010/036959、WO2011/110604、WO2011/110621、WO2014/179664、WO2014/194302、WO2014/206107、WO2015/035606、WO2015/036394、WO2015/085847、WO2015/112800、WO2016/014688、WO2016/015685、WO2016/068801、WO2016/077397、WO2016/092419、WO2016/106159、WO2016/127179、WO2016/197497、WO2016/210129、WO2017/011580、WO2017/016497、WO2017/019846、WO2017/024465、WO2017/024515、WO2017/025016、WO2017/025051、WO2017/040790、WO2017/055443、WO2017/055547、WO2017/058115、WO2017/058859、WO2017/079112、WO2017/079116、WO2017/087599、WO2017/096026、WO2017/106656、WO2017/107885、WO2017/124050、WO2017/125815、WO2017/132827、WO2017/133540、WO2017/166804、WO2017/198741、WO2017/201766、WO2017/214182、WO2018/020476、WO2018/026248、WO2018/034226、WO2018/036472、WO2018/052818、WO2018/053106、WO2018/068336、WO2018/085358、WO2018/085468、WO2018/087143、WO2018/091661、WO2018/113258、WO2018/119474、WO2018/162944、WO2018/192089、WO2018/210230、WO2018/217227、WO2018/226580、WO2019/005635或WO2019/051164所特定之專利申請明書中各別記載的抗PD-1抗體的VH及VL的組合，亦可列舉作為特異性地結合於PD-1之第一臂之例。再者，上述抗PD-1抗體的VH與共通輕鏈的組合，亦可列舉作為特異性地結合於PD-1之第一臂之例。

特異性地結合於CD3之第二臂

本說明書中，「特異性地結合於CD3之第二臂」(下文中，亦簡稱為「第二臂」)意指，本發明相關之雙特異性蛋白質的一部分，或者無關作為其自體單體存在，為特異性地結合於CD3之蛋白質，該雙特異性蛋白質為雙特異性抗體的情況，該第二臂包含於抗體或者抗體片段的一部分，或者不為一部分，與作為其自體單體存在與否無關，至少，包含特異性地結合於CD3之抗體(下文中，亦簡稱為抗CD3抗體)的VH及VL，可特異性地結合於CD3之抗體部分。例如，此種第二臂，亦包含由構成抗CD3抗體的抗原結合部位之VH及VL所構成之抗體的Fv部、包含該VH及VL之抗體的Fab’部及Fab部。此處，「特異性地結合於CD3」，可作為以具有至少1x10^-5M、較佳為1x10^-7M、更佳為1x10^-9M更高之親和性(解離定數(Kd值))的結合活性對CD3直接結合，實質上不結合其他蛋白質為特徵予以使用。再者，「特異性地結合於CD3之抗體」或者「抗CD3抗體」之「抗體」意指全長抗體，亦即，由以雙硫鍵結合之2種重鏈及2種輕鏈所構成之完全長的抗體，較佳地，其單株抗體。

此處，「特異性地結合於CD3之第二臂」係構成抗體部分的情況，作為其等之較佳態樣，例如，可列舉具有含(1c)序列編號37的胺基酸序列所構成之VH-CDR1、序列編號38的胺基酸序列所構成之VH-CDR2及序列編號39的胺基酸序列所構成之VH-CDR3之VH者。

再者，本發明中，「特異性地結合於CD3之第二臂」係構成抗體部分的情況，其等之中，亦包含上述(1c)的VH中各別的CDR中，其任意的1~5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)，且與經由該胺基酸未置換之原先的第二臂對於CD3的結合活性具有實質 上同等的結合活性者。例如，於CDR1的情況，可列舉1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)，於CDR2或CDR3的情況，可列舉各別的1~5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)者。此處，「與經由該胺基酸未置換之原先的第二臂對於CD3的結合活性具有實質上同等的結合活性」意指，該胺基酸置換之第二臂對於CD3的結合活性，係該胺基酸未置換之原先的第二臂的結合活性的95%以上，較佳為98%以上，更佳為99%以上。又，第二臂之各VH-CDR之「經由保留性胺基酸置換」，例如，可列舉上述第一臂之胺基酸置換之例。

再者，本發明中，「特異性地結合於CD3之第二臂」係構成抗體部分的情況，其等之中，亦包含其VH中，包含具有上述特定的胺基酸序列之各CDR，其VH的FR的胺基酸序列具有特定的生殖細胞系列型基因或有其體細胞突變之該基因所編碼的VH者。例如，上述(1c)的VH，係生殖細胞系列型V基因為IGHV3-33之VDJ重組基因或有其體細胞突變之該基因所編碼。此處，藉由生殖細胞系列型的V基因IGHV3-33所編碼之胺基酸序列(序列編號22)示於圖3。再者，作為此種第二臂，可列舉具有序列編號36的胺基酸序列所構成之VH者。再者，此種第二臂，例如，亦包含具有與序列編號36的胺基酸序列為至少80%相同，較佳為至少90%相同，更佳為至少95%相同，進一步較佳為至少98%相同，進一步更佳為至少99%相同之胺基酸序列所構成之VH，且與原先之第二臂的VH的胺基酸序列的相異實質上不影響對於CD3的結合活性者(下文中，亦簡稱為相同第二臂)。此處，「與原先之第二臂的VH的胺基酸序列的相異實質上不影響對於CD3的結合活性」意指，相同第二臂對於CD3的結合活 性為原先之第二臂之該結合活性的95%以上，較佳為98%以上，更佳為99%以上。

進一步別的態樣中，本發明之「特異性地結合於CD3之第二臂」係構成抗體部分的情況，其等之中，亦包含具有於(1)具有上述(1c)所示之VH或序列編號36的胺基酸序列所構成之VH及共有輕鏈的VL之第二臂對於CD3的結合或於(2)由該VH及VL所構成之特異性地結合於CD3之單株抗體的可變區對於CD3的結合為交叉競爭之抗CD3抗體的可變區(此處，該可變區包含構成其VH及VL)者。此處，「對於CD3的結合為交叉競爭」意指，藉由與本說明書中例示之第二臂為相同或者一部分重複之抗原決定基結合，無關其程度而阻礙該第二臂對於CD3的結合。此處，是否交叉競爭，可根據「特異性地結合於PD-1之第一臂」相關說明中所記載的方法，同樣地測定。

此處，本發明之「特異性地結合於CD3之第二臂」係構成抗體部分的情況，作為該等較佳地，可列舉具有上述(1c)所示之VH的第二臂，再者，該較佳第二臂，如上述方式，亦包含其VH之各CDR中，其任意的1~5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)，且其胺基酸置換實質上不影響對於CD的結合活性者，再者，如上述方式，VH的框架的胺基酸序列，亦包含生殖細胞系列型基因IGHV3-33或有其體細胞突變之該基因所編碼的VH者。因此，作為該第二臂更佳地，可列舉具有序列編號36的胺基酸序列所構成之VH者。

用於構築本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體之抗CD3抗體的各純株，於該等之VH的胺基酸序列及其序列編號的對應關係示於 圖7，以及該抗CD3抗體之各純株的VH中之各CDR的胺基酸序列與其序列編號的對應關係示於圖8。

本發明之「特異性地結合於CD3之第二臂」係構成抗體部分的情況，其VL較佳為共通輕鏈的VL，作為該方式之共通輕鏈較佳地，例如，IGVK1-39/JK1共通輕鏈，更佳地，例如，具有含序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3的VL之輕鏈，進一步較佳地，例如，具有序列編號25的胺基酸序列所構成之VL的輕鏈。再者，作為共通輕鏈的恆定區較佳地，可列舉序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。

作為本發明之「特異性地結合於CD3之第二臂」較佳地，可列舉特異性地結合於CD3ε者。

再者，作為其他的「特異性地結合於CD3之第二臂」，例如，可列舉習知的抗CD3抗體的VH及VL的組合，作為該方式之抗CD3抗體，例如，可列舉佛拉魯單抗(Foralumab)、莫羅莫納單抗(Muromonab)-CD3、奧昔珠單抗(Otelixizumab)、替利珠單抗(Teplizumab)及維西珠單抗(Visilizumab)等，再者，伯納吐單抗(Blinatumomab)、卡妥索單抗(Catumaxomab)、西比撒單抗(Cibisatamab)、度伐吐西珠單抗(Duvortuxizumab)、厄吐索單抗(Ertumaxomab)、氟妥珠單抗(Flotetuzumab)、帕索吐西珠單抗(Pasotuxizumab)、索利托單抗(Solitomab)、替班塔芙(Tebentafusp)、替波迪他單抗(Tepoditamab)、AMG-596、MOR209、REGN1979、XmAb13676及XmAb14045之任一者之構 成雙特異性抗體的CD3結合部位知VH及VL的組合，亦可列舉作為特異性地結合於CD3之第二臂之例。再者，下文中的公開專利申請案：US20190016823、WO2018/223004、WO2018/223002、US2018/0291114、WO2018/114754、CN107501412、CN106810611、US20170218079、US20170174779、CN106349391、WO2017/070943、WO2017/053856、WO2017/021349、CN106084049、WO2017/021354、WO2016/179003、US20160176980、WO2016/014974、WO2016/016859、US20150266966、CN104098698、WO2014/151438、WO2013/186613、CN102219856、WO2010/052013、WO2010/037836、WO2007/042261、WO2007/033230、WO2003/026692、WO2000/005268、CN106084046、CN106146661或WO2010/037835所特定之專利申請明書中各別記載的抗CD3抗體或雙特異性抗體的CD3結合部位之VH及VL的組合，亦可列舉作為特異性地結合於CD3之第二臂之例。再者，上述抗CD3抗體的VH與共通輕鏈的組合，亦可列舉作為特異性地結合於CD3之第二臂之例。

作為本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體之較佳同功型為IgG抗體，進一步較佳地，為IgG₁或IgG₄抗體，進一步更佳為IgG₁抗體。

作為本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體之較佳態樣，例如，可列舉如下特徵之PD-1/CD3雙特異性抗體，特異性地結合於PD-1之第一臂係

(A)自上述(1a)~(4a)或(1b)~(5b)選擇之任一者所示之VH中，於自VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3選擇之任一者或複數個CDR中，其 各別的任意的1至5個胺基酸殘基亦可以其他胺基酸(較佳為其保留性胺基酸)置換的VH，及

(B)包含序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3的共通輕鏈之VL；以及

特異性地結合於CD3之第二臂係

(C)上述(1c)所示之VH中，於自VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3選擇之任一者或複數個CDR中，各別其任意的1~5個胺基酸殘基可置換為其他胺基酸(較佳為保留性胺基酸)之VH，及

(D)具有含序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3的共通輕鏈之VL。

更佳地，例如，可列舉如下特徵之PD-1/CD3雙特異性抗體，特異性地結合於PD-1之第一臂係

(A)自上述(1a)~(4a)或(1b)~(5b)選擇之任一者的VH，及

(B)具有含序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3之共通輕鏈的VL；以及

特異性地結合於CD3之第二臂係

(C)上述(1c)所示之VH，及

(D)具有含序列編號26的胺基酸序列所構成之VL-CDR1、序列編號27的胺基酸序列所構成之VL-CDR2及序列編號28的胺基酸序列所構成之VL-CDR3之共通輕鏈的VL。

再者，作為本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體之較佳別的態樣，例如，可列舉如下特徵之PD-1/CD3雙特異性抗體，特異性地結合於PD-1之第一臂係

(A)自序列編號1~5選擇之任一者的胺基酸序列所構成之VH、或與該VH的胺基酸序列為至少80%相同之胺基酸序列所構成之VH，及

(B)具有序列編號25的胺基酸序列所構成之共通輕鏈的VL；以及，

特異性地結合於CD3之第二臂係

(C)由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH、或與該VH的胺基酸序列為至少80%相同之胺基酸序列所構成之VH，及

(D)具有序列編號25的胺基酸序列所構成之共通輕鏈的VL。

作為別的態樣更佳地，例如，可列舉如下特徵之PD-1/CD3雙特異性抗體，特異性地結合於PD-1之第一臂係

(A)自序列編號1~5選擇之任一者的胺基酸序列所構成之VH，及

(B)具有序列編號25的胺基酸序列所構成之共通輕鏈的VL；以及，

特異性地結合於CD3之第二臂係

(C)由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH，及

(D)具有序列編號25的胺基酸序列所構成之共通輕鏈的VL。

本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體之中，同抗體為IgG₁抗體的情況，於各別二種的重鏈恆定區或者絞鍊區上，較佳為依據EU編 號系統之第235號的白胺酸被置換為甘胺酸、及/或第236號的甘胺酸被置換為精胺酸的IgG₁抗體。再者，更佳為該等雙特異性抗體的重鏈C末端的胺基酸、例如，依據EU編號系統之第447號的離胺酸為缺失的抗體。再者，PD-1/CD3雙特異性抗體為IgG₄抗體的情況，位於其絞鍊區之依據EU編號系統之第228號的絲胺酸被置換為脯胺酸的抗體為較佳。

再者，該等PD-1/CD3雙特異性抗體為IgG₁抗體的情況，作為較佳態樣，可列舉具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈的恆定區中依據EU編號系統之第351號的白胺酸被置換為離胺酸，且第366號的蘇胺酸被置換為離胺酸，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈的恆定區中的第351號的白胺酸被置換為天冬胺酸，且第368號的白胺酸被置換為麩胺酸的IgG₁抗體。再者，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈的恆定區中依據EU編號系統之第351號的白胺酸被置換為天冬胺酸，且第368號的白胺酸被置換為麩胺酸、具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈的恆定區中的第351號的白胺酸被置換為離胺酸，且第366號的蘇胺酸被置換為離胺酸的IgG₁抗體亦同樣的較佳。

再者，該等PD-1/CD3雙特異性抗體為IgG₁抗體的情況，作為較佳態樣，可列舉各別的二種重鏈之恆定區中的(1)依據EU編號系統之第252號的甲硫胺酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸，(2)依據EU編號系統之第434號的天冬醯胺被置換為白胺酸，及/或(3)依據EU編號系統之第438號的麩胺醯胺被置換為麩胺酸之各別經置換的IgG₁抗體。藉由該等胺基酸置換，該PD-1/CD3雙特異性抗體於血液中的半衰 期，與同胺基酸未置換之同抗體相比，可期待縮短至少50%、較佳為至少60%、更佳為至少70%、進一步較佳為至少80%、最較佳為至少90%。

作為重鏈恆定區取入上述之全部胺基酸置換的PD-1/CD3雙特異性IgG₁抗體的較佳態樣，例如，可列舉具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈係具有自序列編號23、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號46及序列編號47選擇之任一者的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈係具有自序列編號24、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52及序列編號53選擇之任一者的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區的抗體。一些該等的胺基酸序列示於圖9。

作為本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體態樣，最佳地，於本明細書實施例8所製作的純株PD1-1(Bi)、純株PD1-2(Bi)、純株PD1-3(Bi)、純株PD1-4(Bi)及純株PD1-5(Bi)以及實施例17所製作的純株Mut1、純株Mut2、純株Mut3、純株Mut4、純株Mut5及純株Mut6。

作為本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質之較佳特徵，可列舉(1)容許PD-1及PD-L1的相互作用、PD-1及PD-L2的相互作用、或該二者的相互作用者，(2)細胞介素產生充分減低者，及/或(3)各別特異性地結合於表現於標的細胞之血液性癌症的癌細胞之PD-1及表現於起效子細胞之淋巴球(例如，傷害性淋巴球)之CD3者。此處，「容許PD-1及PD-L1的相互作用、PD-1及PD-L2的相互作用、或該二者的相互作用」表示，與「特異性地結合於PD-1之第一臂」相關說明所記載的定亦為相同意義。另一方面，「細胞介素產生充分減低」意指，例如，本發明相關之 PD-1/CD3雙特異性抗體經由點滴等之靜脈內投藥中、或者自投藥的24小時內，例如，血中或者組織中之包含IL-2、IFN-γ及/或TNF-α的細胞介素的濃度不增加，或即使增加亦可經由類固醇投藥而可抑制的程度。再者，「標的細胞」意指接受起效子細胞之淋巴球的細胞傷害作用的細胞，「起效子細胞」意指對標的細胞展現細胞傷害作用的細胞。

PD-1/CD3雙特異性抗體的製造及精製方法

本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質之中，特別是，雙特異性抗體及其抗體片段亦可以WO2014/051433、WO2013/157953或者WO2013/157954所揭示的方法製造。

具體地，可將各別已插入(1)編碼具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈的多核苷酸、(2)編碼具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈的多核苷酸、及(3)編碼共通輕鏈的多核苷酸的表現載體，基因導入至哺乳動物細胞使其形質轉換，同時使其分泌以及表現二重鏈及共有輕鏈進行製造。

此處，表現本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體的宿主細胞為可基因導入表現載體，亦可為可表現已導入的表現載體的任何宿主細胞。較佳地，如SF-9及SF-21細胞等昆蟲細胞，更佳地，可列舉包含CHO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞及NS-0骨髓瘤細胞的小鼠細胞，如COS及Vero細胞等靈長類細胞，如MDCK細胞、BRL 3A細胞、融合瘤、腫瘤細胞、不死化的初代細胞、W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080或PER.C6等胚性的網膜細胞等哺乳類細胞。又，表現系統的選擇中，以抗體係經適當地糖基化的方式，可使用哺乳類細胞的表現載體及宿主。人細胞株，較 佳為PER.C6，由於可獲得與人之糖基化的型式一致的抗體，而有利地使用。

藉由表現載體的基因導入之經形質轉換的宿主細胞中的蛋白質產生，例如，可參考Current Protocols in Protein Science(1995),Coligan JE,Dunn BM,Ploegh HL,Speicher DW,Wingfield PT,ISBN 0-471-11184-8，Bendig,1988進行實施，再者，用於最大化宿主細胞的培養的生產性的一般性指針、順序及實用的方法，可參考Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach(M.Butler,ed.,IRL Press,1991)進行實施。宿主細胞中的抗體表現，例如，記載於EP0120694、EP0314161、EP0481790、EP0523949、US4816567及WO2000/63403等公開公報。

此處，經由習知的方法，可最適化宿主細胞的培養條件，可最適化蛋白質的生產量。培養，例如，可實施培養皿、旋轉瓶或於反應槽之中的批次培養、流加培養、連續培養、經由中空纖維的培養。經由細胞培養，為了大規模且連續地進行重組蛋白質的生產，較佳將細胞於懸濁液之中使其增殖。再者，較佳為於無源自動物或人的血清或無源自動物或人的血清的構成要素的條件下，進行細胞的培養。

以宿主細胞表現，由該細胞或細胞培養基經由習知的方法所回收的抗體，可使用習知的方法精製。精製方法包含免疫沈降法、離心分離法、過濾、尺寸排除層析、親和性層析、陽離子及/或陰離子交換層析、疏水性相互作用層析等。再者，有較佳使用蛋白質A或蛋白質G親和性層析的情況(例如，參照US4801687及US5151504)。

[醫藥的用途]

本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質，對於血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療為有用者。

作為本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質可預防、症狀進展抑制及/或治療之血液性癌症，例如，可列舉多發性骨髓腫、惡性淋巴瘤(例如，非何金杰氏淋巴瘤(例如，B細胞性非何金杰氏淋巴瘤(例如，前驅B細胞淋巴母細胞淋巴瘤、前驅B細胞急性淋巴球芽性白血病、慢性B淋巴性白血病(小淋巴球性淋巴瘤或者前驅細胞性白血病)、B細胞幼淋巴球性白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、結節邊緣區型B-細胞淋巴瘤、結節外邊緣區型B-細胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、脾原發邊緣帶B細胞性淋巴瘤、毛細胞白血病、毛細胞白血病/變體型、濾泡性淋巴瘤、兒童型濾泡性淋巴瘤、瀰漫性大細胞型B細胞性淋巴瘤、瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤/非特定型、脾瀰漫性紅髓小B細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、原發性縱隔大細胞型B細胞性淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、套膜細胞淋巴瘤、單株B細胞淋巴球增多症、脾B細胞淋巴瘤/白血病/不能分類型、意義不明的單株珈瑪球蛋白血症/IgM型、μ重鏈病、λ重鏈病、α重鏈病、漿細胞骨髓腫、骨孤立性漿細胞瘤、骨外漿細胞腫、單株免疫球蛋白沉積症、伴隨IRF4重排之大細胞型B細胞淋巴瘤、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、富於T細胞/組織球之大細胞型B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤/下肢型、EBV陽性瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤/非特定型、EBV陽性黏膜皮膚潰瘍、慢性炎症相關瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤、類淋巴瘤肉芽腫症、血管內大細胞型B細胞淋巴瘤、ALK陽性大細胞型B細胞淋巴瘤、 漿母細胞淋巴瘤、原發性滲出液淋巴瘤、HHV8陽性瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤/非特異型、伴隨11q異常的類伯奇氏淋巴瘤、伴隨MYC及BCL2與BCL6之二者或一者的重排的高度惡性B細胞淋巴瘤、伴隨高度惡性B細胞淋巴瘤-非特異型及瀰漫性大細胞型B細胞淋巴瘤與典型何金杰氏淋巴瘤的中間特徵之B細胞淋巴瘤-不能分類型)、T/NK細胞性非何金杰氏淋巴瘤(例如，前驅T細胞淋巴母細胞淋巴瘤、慢性T淋巴球性白血病、T細胞急性淋巴性白血病(T細胞淋巴母細胞白血病)、T細胞型大顆粒淋巴球性白血病、大顆粒NK細胞性白血病、快速進行性NK細胞白血病、末梢性T細胞淋巴瘤、末梢性T細胞淋巴瘤/非特定型、不能分類末梢性T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞性淋巴瘤、未分化大細胞(CD30陽性)淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、腸管T細胞性淋巴瘤、腸症型T細胞淋巴瘤、肝脾型γ-δT細胞淋巴瘤、類皮下脂肪組織炎T細胞淋巴瘤、蕈狀肉芽腫、塞札來(Sezary)症候群、類何金杰氏/何金杰氏相關未分化大細胞淋巴瘤、結節外NK/T細胞淋巴瘤、成人T細胞性淋巴瘤、T細胞前淋巴球性白血病、慢性NK細胞淋巴增生異常症、兒童全身性EBV陽性T細胞淋巴瘤、類種痘類水疱症淋巴增生異常症、結節外NK/T細胞淋巴瘤/鼻型、腸症相關T細胞淋巴瘤、單形性趨上皮性腸管T細胞淋巴瘤、胃腸管和緩進行性T細胞淋巴增生異常症、肝脾T細胞淋巴瘤、原發性皮膚CD30陽性T細胞淋巴增生異常症、類淋巴瘤丘疹症、原發性皮膚未分化大細胞型淋巴瘤、原發性皮膚γδT細胞淋巴瘤、原發性皮膚CD8陽性快速進行性趨表皮性細胞傷害性T細胞淋巴瘤、原發性肢端皮膚型CD8陽性T細胞淋巴瘤、原發性皮膚CD4陽性小型/中型T細胞淋巴增殖性症、濾泡T細胞淋巴瘤、伴隨 濾泡助手T細胞表現型的結節外周T細胞淋巴瘤、未分化大細胞淋巴瘤/ALK陽性型、未分化大細胞淋巴瘤/ALK陰性型及乳房植入物相關間變性大細胞淋巴瘤))及何金杰氏淋巴瘤(例如，典型何金杰氏淋巴瘤(例如，結節硬化型、混合細胞型、富於淋巴球型及淋巴球減少型)或結節性淋巴球優位型何金杰氏淋巴瘤))、白血病(例如，急性骨髓性白血病、急性前骨髓球性白血病、急性淋巴母細胞白血病(淋巴母細胞淋巴瘤)、慢性淋巴性白血病(小淋巴球性淋巴瘤)、骨髓發育不良症候群及慢性骨髓性白血病)、中樞神經系原發惡性淋巴瘤、及骨髓增生症候群等。

本發明中之「治療」意指，例如，某疾患或其症狀受到治癒或改善，「預防」意指某疾患或症狀的發現之未然的防止或者一定期間使其延遲，「症狀進展抑制」意指抑制症狀的進展或惡化而停止病態的進展。又，「預防」的意義也包含復發抑制。「復發抑制」意指防止某疾患或症狀的復發或減低復發的可能性。

本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質，通常以全身的或局部的非經口的形式投藥。作為相關的投藥方法，具體地，可列舉注射投藥、經鼻投藥、經肺投藥、經皮投藥等。作為注射投藥，例如，可列舉靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射等，靜脈內注射的情況，較佳經由點滴投藥。其投藥量雖根據年齡、體重、症狀、治療功效、投藥方法、處理時間等而不同，通常成人每一人，每一次0.1μg/kg至300mg/kg的範圍，特別較佳地，0.1mg/kg至10mg/kg的範圍，一日一次至數次非經口投藥，或一日30分至24小時的範圍靜脈內持續投藥。當然如同前述方式，投藥 量係根據各種條件而變動，有比上述投藥量更少的量為充分的情況，而亦有超過範圍的投藥為必要的情況。

製劑

本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質，作為注射劑或點滴用的輸液而使其製劑化使用的情況，該注射劑或輸液可為水溶液、懸濁液或乳濁液之任一形態，再者，經由於使用時添加溶劑，進行溶解、懸濁或乳濁而使用，亦可與藥學可容許的載體一起作成固形劑使其製劑化。作為注射劑或點滴用的輸液所使用的溶劑，例如，可使用注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖溶液及等張液(例如，氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、硼酸、硼砂、丙二醇等的溶液)等。

此處，做為藥學上可容許的載體，例如，可列舉安定劑、溶解輔助劑、懸濁化劑、乳化劑、無痛化劑、緩衝劑、保存劑、防腐劑、pH調整劑及抗氧化劑等。作為安定劑，例如，可使用各種胺基酸、白蛋白、球蛋白、膠原蛋白、甘露糖醇、葡萄糖、聚葡萄糖、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、依地酸鈉、檸檬酸鈉、二丁基羥基甲苯等。作為溶解輔助劑，例如，可使用醇(例如，乙醇等)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(例如，聚山梨醇酯20(註冊商標)、聚山梨醇酯80(註冊商標)、HCO-50等)等。作為懸濁化劑，例如，可使用單硬脂酸甘油、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為乳化劑，例如，可使用阿拉伯膠、海藻酸鈉、西黃耆膠等。作為無痛化劑，例如，可使用苯甲基醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作為緩衝劑，例如，可使用磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸 緩衝液、碳酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、Tris緩衝液、麩胺酸緩衝液、ε-胺基己酸緩衝液等。作為保存劑，例如，可使用對羥基安息香酸甲酯、對羥基安息香酸乙酯、對羥基安息香酸丙酯、對羥基安息香酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、苯札氯銨、脫氫乙酸鈉、依地酸鈉、硼酸、硼砂等。作為防腐劑，例如，可使用苯札氯銨、對羥基安息香酸、氯丁醇等。作為pH調整劑，例如，可使用鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等。作為抗氧化劑，例如，可使用(1)抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等方式之水溶性抗氧化劑、(2)抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等方式之油溶性抗氧化劑及(3)檸檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等方式之金屬螯合劑等。

注射劑或點滴用的輸液，其最終步驟中可藉由滅菌或者無菌操作法，例如，以過濾器等過濾滅菌，其次填充於無菌的容器而可製造。再者，注射劑或點滴用的輸液，亦可將經由真空乾燥及凍結乾燥之無菌粉末(亦可包含藥學上可容許載體的粉末)，於使用時溶解於適當溶劑而使用。

併用或配合劑

再者，本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質亦可與使用於血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療之其他藥劑一起組合使用。本發明中，與其他藥劑一起組合使用的情況(併用)的投藥形態，可為1個製劑中調配兩成分之調配劑的形態，或者可為作為個別的製劑的投藥形態。經由此併用，可補足其他藥劑之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療功效，維持至減低投藥量或者投藥次數。本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質與其他藥劑分別地投藥的情況，亦可一定期間同時投藥之後，僅 投藥PD-1/CD3雙特異性蛋白質或者僅投藥其他藥劑。再者，亦可先投藥本發明相關之PD-1/CD3雙特異性抗體等，於該投藥結束後投藥其他藥劑，亦可先投藥其他藥劑，於該投藥結束後投藥本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質，各別的投藥方法可相同亦可不同。可提供作為包含本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質之製劑與包含其他藥劑之製劑的套組。此處，其他藥劑的投藥量，可以臨床上使用的用量作為基準適宜選擇。再者，其他藥劑亦可將任意的2種以上以適宜的比例組合投藥。再者，前述其他藥劑，不只目前為止已發現者，亦包含今後發現者。

例如，亦可與選自烷化劑(例如，達卡巴嗪(Dacarbazine)、尼莫司汀(Nimustine)、替莫唑胺(Temozolomide)、福莫司汀(Fotemustine)、苯達莫司汀(Bendamustine)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、異環磷醯胺(Ifosfamide)、卡莫司汀(Carmustine)、丁苯丁酸(Chlorambucil)及丙卡巴嗪(Procarbazine)等)、鉑製劑(例如，順鉑(Cisplatin)、卡鉑(Carboplatin)、奈達鉑(Nedaplatin)及奧沙利鉑(Oxaliplatin)等)、代謝拮抗劑(例如，葉酸代謝拮抗藥(例如，培美曲塞(Pemetrexed)、白葉素(Leucovorin)及甲胺蝶呤(Methotrexate)等)、吡啶代謝阻礙藥(例如，TS-1(註冊商標)、5-氟尿嘧啶、UFT、卡莫夫(Carmofur)、多西氟定(Doxifluridine)、FdUrd、阿糖胞苷(Cytarabine)及卡培他濱(Capecitabine)等)、嘌呤代謝阻礙藥(例如，氟達拉濱(Fludarabine)、克拉曲濱(Cladribine)及奈拉濱(Nelarabine)等)、核糖核苷酸還原酶阻礙藥、核苷酸類似物(例如，吉西他殯(Gemcitabine)等))、拓樸異構酶阻礙藥(例如，依立替康(Irinotecan)、諾吉替康(Nogitecan)及依托泊苷(Etoposide)等)、微管聚合阻礙藥(例如，長春花鹼(Vinblastine)、長春 新鹼(Vincristine)、長春地辛(Vindesine)、長春瑞濱(Vinorelbine)及依瑞布林(Eribulin)等)、微管脫聚合阻礙藥(例如，多西紫杉醇(Docetaxel)及太平洋紫杉醇(Paclitaxel)等)、抗腫瘤性抗生物質(例如，博來黴素(Bleomycin)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、多柔比星(Doxorubicin)、柔紅黴素(Daunorubicin)、伊柔比星(Idarubicin)、依托泊苷(Etoposide)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、長春花鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)、派來黴素(Peplomycin)、安氯黴素(Amrubicin)、阿克拉黴素(Aclarubicin)及表柔比星(Epirubicin)等)、細胞介素製劑(例如，IFN-α2a、IFN-α2b、PEG-IFN-α2b、天然型IFN-β及介白素-2等)、分子標的藥、癌免疫治療藥及其他抗體醫藥等之任何一種以上的藥劑組合使用。

此處，作為分子標的藥，例如，可列舉ALK阻礙劑(例如，克唑替尼(Crizotinib)、昔立替尼(Ceritinib)、恩薩替尼(Ensartinib)、阿勒替尼(Alectinib)及羅拉替尼(Lorlatinib)等)、BCR-ABL阻礙劑(例如，伊瑪替尼(Imatinib)及達薩替尼((Dasatinib)等)、AXL阻礙劑(例如，ONO-7475及貝申替尼(Bemcentinib)等)、CDK阻礙劑(例如，迪納西林(Dinaciclib)、玻馬西林(Abemaciclib)、帕柏西林(Palbociclib)及曲拉西林(trilaciclib)等)、BTK阻礙劑(例如，伊魯替尼(Ibrutinib)及阿卡替尼(Acalabrutinib)等)、PI3K-δ/γ阻礙劑(例如，屋拉立昔(Umbralisib)、帕薩立昔(Parsaclisib)及IPI-549等)、JAK-1/2阻礙劑(例如，伊塔替尼(Itacitinib)及魯索替尼(Ruxolitinib)等)、FAK阻礙劑(例如，狄非替尼(Defactinib)等)、Syk/FLT3雙阻礙劑(例如，咪伐替尼(Mivavotinib)等)、ATR阻礙劑(例如，克拉替布(Ceralasertib)等)、WEE1激酶阻礙劑(例如，阿伐替布(Adavosertib)等)、 mTOR阻礙劑(例如，替莫羅莫司(Temsirolimus)、依維莫司(Everolimus)、維斯替布(Vistusertib)及伊立替康(Irinotecan)等)、HDAC阻礙劑(例如，伏立諾他(Vorinostat)、羅米地辛(Romidepsin)、恩替諾他(Entinostat)、西達苯胺(Chidamide)、莫西他汀(Mocetinostat)、西他諾司他(Citarinostat)、泛美司他(Panobinostat)、及丙戊酸鹽(Valproate)等)、EZH2阻礙劑(例如，他則司他(Tazemetostat)等)、STAT3阻礙劑(例如，那布卡辛(Napabucasin)等)、DNMT阻礙劑(例如，阿札胞苷(Azacitidine)等)、BCL-2阻礙劑(例如，那維托克(Navitoclax)及凡尼托克(Venetoclax)等)、SMO阻礙劑(例如，維莫德吉(Vismodegib)等)、抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗(Rituximab)、貝妥莫單抗(Blontuvetmab)、依匹莫單抗(Epitumomab)、替依莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)、奧卡拉單抗(Ocaratuzumab)、奧瑞珠單抗(Ocrelizumab)、諾莫非諾單抗鎝(Technetium(^99mTc)nofetumomab merpentan)、托西莫單抗(Tositumomab)、維妥珠單抗(Veltuzumab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、烏布妥昔單抗(Ublituximab)、奧比妥珠單抗(Obinutuzumab)及諾莫非諾單抗(Nofetumomab)等)、抗CD30抗體(例如，本妥昔單抗(Brentuximab Vedotin)及依妥木單抗(Iratumumab)等)、抗CD38抗體(例如，達拉他單抗(Daratumumab)、依沙妥昔單抗(Isatuximab)、美紮格達單抗(Mezagitamab)、(AT13/5及MOR202等)、抗TNFRSF10B抗體(例如，貝努妥單抗(Benufutamab)、柯那吐木單抗(Conatumumab)、德羅圖單抗(Drozitumab)、來沙木單抗(Lexatumumab)、替加珠單抗(Tigatuzumab)、依法酯α(Eftozanermin alfa)及DS-8273a等)、抗CD40抗體(例如，巴利昔單抗(Bleselumab)、達西珠單抗(Dacetuzumab)、依卡利 單抗(Iscalimab)、魯卡木單抗(Lucatumumab)、咪塔札單抗(Mitazalimab)、拉伐加單抗(Ravagalimab)、昔利克單抗((Selicrelumab)、替奈昔單抗(Teneliximab)、(ABBV-428及APX005M等)、抗CD70抗體(例如，庫沙妥珠單抗(Cusatuzumab)、伏妥珠單抗(Vorsetuzumab)、伏妥珠單抗馬佛多坦(Vorsetuzumab mafodotin)及ARGX-110等)、抗TNFRSF10A抗體(例如，馬他妥單抗(Mapatumumab)等)、抗CD79b抗體(例如，依拉達珠單抗(Iladatuzumab)、依拉達珠單抗維多汀(Iladatuzumab vedotin)及波拉珠單抗維多汀(Polatuzumab vedotin)等)、抗TNFSF11抗體(例如，地諾單抗(Denosumab)等)、抗NCAM1抗體(例如，洛妥珠單抗美登素(Lorvotuzumab mertansine)等)、抗CD37抗體(例如，利洛他單抗(Lilotomab)、利洛他單抗鎦(Lutetium(¹⁷⁷lu)lilotomab satetraxetan)、那拉妥昔單抗(Naratuximab)、那拉妥昔單抗恩單辛(Naratuximab emtansine)及歐勒妥珠單抗(Otlertuzumab)等)、抗CD200抗體(例如，薩瑪利珠單抗(Samalizumab)等)、抗CD30-CD16A雙特異性抗體(例如，AFM13等)、抗IL3RA-CD3雙特異性抗體(氟妥珠單抗(Flotetuzumab)及維貝可他單抗(Vibecotamab)、抗GPRC5D-CD3雙特異性抗體(他奎達單抗(Talquetamab))、抗CD3-CD19雙特異性抗體(例如，度伐吐西單抗(Duvortuxizumab)及伯納吐單抗(Blinatumomab))、抗TNFRSF17-CD3雙特異性抗體(替利他單抗(Teclistamab))、抗CLEC12A-CD3雙特異性抗體(替波迪他單抗(Tepoditamab))、及抗CD20-CD3雙特異性抗體(例如，普拉莫他單抗(Plamotamab)、歐隆尼單抗(Odronextamab)、莫桑尼珠單抗 (Mosunetuzumab)、格羅非單抗(Glofitamab)、依普利他單抗(Epcoritamab)及REGN1979等)等。

再者，作為癌免疫治療藥，例如，可列舉抗PD-1抗體(例如，納武單抗(Nivolumab)、西米普利單抗(Cemiplimab)、匹博利珠單抗(Pembrolizumab)、斯帕塔利單抗(Spartalizumab)、替雷利珠單抗(Tislelizumab)、多斯塔利單抗(Dostarlimab)、特瑞普利單抗(Toripalimab)、卡瑞利珠單抗(Camrelizumab)、杰諾單抗(Genolimzumab)、信替利單抗(Sintilimab)、洛達普利單抗(Lodapolimab)、瑞替弗利單抗(Retifanlimab)、巴斯替利單抗(Balstilimab)、斯普魯利單抗(Serplulimab)、布迪格利單抗(Budigalimab)、普洛格利單抗(Prolgolimab)、薩山利單抗(Sasanlimab)、西曲利單抗(Cetrelimab)、吉柏利單抗(Zimberelimab)、AMP-514、STI-A1110、ENUM 388D4、ENUM 244C8、GLS010、CS1003、BAT-1306、AK105、AK103、BI 754091、LZM009、CMAB819、Sym021、GB226、SSI-361、JY034、ISU106、HX008及CX-188等)、抗PD-L1抗體(例如，阿特利珠單抗(Atezolizumab)、阿維魯單抗(Avelumab)、度伐魯單抗(Durvalumab)、曼尼利單抗(Manelimab)、帕米利單抗(Pacmilimab)、恩伐利單抗(Envafolimab)、科西貝利單抗(Cosibelimab)、BMS-936559、STI-1010、STI-1011、STI-1014、SHR-1316、CS1001、MSB2311、BGB-A333、KL-A167、AK106、AK104、ZKAB001、FAZ053、CBT-502及JS003等)、PD-1拮抗劑(例如，AUNP-12、BMS-M1~BMS-M10之各化合物、BMS-1、BMS-2、BMS-3、BMS-8、BMS-37、BMS-200、BMS-202、BMS-230、BMS-242、BMS-1001、BMS-1166、Incyte-1~Incyte-6之各化合物、CAMC- 1~CAMC-4之各化合物、RG_1及DPPA-1等)、PD-L1/VISTA拮抗劑(例如，CA-170)、PD-L1/TIM3拮抗劑(例如，CA-327)、抗PD-L2抗體、PD-L1雜合蛋白質、PD-L2雜合蛋白質(例如，AMP-224等)、抗CTLA-4抗體(例如，依匹利珠單抗(Ipilimumab)、札利夫列單抗(Zalifrelimab)、努魯利單抗(Nurulimab)及曲美利姆單抗(Tremelimumab)等)、抗LAG-3抗體(例如，雷拉利單抗(Relatlimab)、依拉米利單抗(Ieramilimab)、菲安利單抗(Fianlimab)、恩昔利單抗(Encelimab)及馬維則利單抗(Mavezelimab)等)、抗TIM3抗體(例如，MBG453、可波利單抗(Cobolimab)等)、抗KIR抗體(例如，利立魯單抗(Lirilumab)、IPH2101、LY3321367及MK-4280等)、抗BTLA抗體、抗TIGIT抗體(例如，替拉格魯單抗(Tiragolumab)、愛替吉單抗(Etigilimab)、威柏托利單抗單抗(Vibostolimab)及BMS-986207等)、抗VISTA抗體(例如，奧瓦替利單抗(Onvatilimab)等)、抗CD137抗體(例如，烏瑞魯單抗(Urelumab)及烏托米魯單抗(Utomilumab)等)、抗CSF-1R抗體/CSF-1R阻礙劑(例如，卡畢拉利單抗(Cabiralizumab)、恩瑪妥珠單抗(Emactuzumab)、單抗LY3022855、阿沙替林單抗(Axatilimab)、單抗MCS-110、IMC-CS4、AMG820、培西達替尼(Pexidartinib)、BLZ945及ARRY-382等)、抗OX40抗體(例如，MEDI6469、依武索單抗(Ivuxolimab)、MEDI0562、MEDI6383、恩菲佐利摩(Efizonerimod)、GSK3174998、BMS-986178及MOXR0916等)、抗HVEM抗體、抗CD27抗體(例如，瓦利魯單抗(Varlilumab)等)、抗GITR抗體/GITR雜合蛋白質(例如，依法普林α(Efaprinermin alfa)、依伏吉法林α(Efgivanermin alfa)、MK-4166、INCAGN01876、GWN323及TRX-518等)、抗CD28抗體、 抗CCR4抗體(例如，莫加木利珠單抗(Mogamulizumab)等)、抗B7-H3抗體(例如，恩諾利妥珠單抗(Enoblituzumab)、米佐他單抗(Mirzotamab)、米佐他單抗克如托克(Mirzotamab clezutoclax)及奧姆巴他單抗(Omburtamab)等)、抗ICOS激動劑抗體(例如，伏拉特利單抗(Vopratelimab)及GSK3359609等)、抗CD4抗體(例如，紮諾利木單抗(Zanolimumab)及IT1208等)、抗DEC-205抗體/NY-ESO-1雜合蛋白質(例如，CDX-1401)、抗SLAMF7抗體(例如，阿欽妥昔單抗(Azintuxizumab)、阿欽妥昔單抗維多汀(Azintuxizumab vedotin)及依洛妥珠單抗(Elotuzumab)等)、抗CD73抗體(例如，奧勒魯單抗(Oleclumab)及BMS-986179等)、PEG化IL-2(Bempegaldesleukin)、抗CD40激動劑抗體(例如，ABBV-428、APX005M及RO7009789等)、IDO阻礙劑(例如，依帕卡斯他(Epacadostat)、因度昔莫(Indoximod)及林洛斯他(Linrodostat)等)、TLR激動劑(例如，莫托利莫(Motolimod)、CMP-001、G100、替索托利莫(Tilsotolimod)、SD-101及MEDI9197等)、腺苷A2A受體拮抗劑(例如，普瑞德南特(Preladenant)、AZD4635、他米那南特(Taminadenant)及西佛拉南特(Ciforadenant)等)、抗NKG2A抗體(例如，莫那利珠單抗(Monalizumab)等)、抗CSF-1抗體(例如，PD0360324等)、免疫增強劑(例如，PV-10等)、IL-15超級激動劑(例如，ALT-803)、可溶性LAG3(例如，IMP321等)、抗CD47抗體/CD47拮抗劑(例如，ALX148等)及IL-12拮抗劑(例如，M9241等)等。

再者，作為其他的抗體醫藥，例如，可列舉抗IL-1β抗體(例如，康那其努單抗(Canakinumab)等)及抗CCR2抗體(例如，波洛紮利珠單抗(Plozalizumab)等)等。

再者，本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質，亦可與類固醇藥(例如，可體松、可體松乙酸酯、氫化可體松、磷酸氫可體松磷酸酯鈉、氫化可體松琥珀酸酯鈉、氟可體松乙酸酯、潑尼松龍、潑尼松龍乙酸酯、潑尼松龍琥珀酸酯鈉、丁基乙酸酯潑尼松龍、潑尼松龍磷酸酯鈉、氟哌啶醇乙酸酯、甲基潑尼松龍、甲基潑尼松龍乙酸酯、甲基潑尼松龍琥珀酸酯鈉、曲安西龍、乙酸曲安西龍、曲安西龍丙酮酸酯、地塞米松、地塞米松乙酸酯、地塞米松戊酸酯、地塞米松21-環己烷羧酸酯、地塞米松丙酸酯、地塞米松磷酸酯鈉、地塞米松棕櫚酸酯、地塞米松偏磺基苯甲酸酯鈉、帕拉米松、帕拉米松乙酸酯、倍他米松、倍他米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松乙酸酯、倍他米松丁酸酯丙酸酯及倍他米松磷酸酯鈉等)組合使用。

本發明雖藉由如下的實施例進一步詳細地說明，但本發明的範圍不限定於該等。基於本發明的記載，所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種變更、修飾，該等變更、修飾亦包含於本發明。

[實施例]

實施例1：使用重組人PD-1-Fc雜合蛋白質對MeMo(註冊商標)小鼠的免疫

作為本發明相關之特異性地結合於PD-1之第一臂係構成抗體部分的情況之取得該等的方法，選擇於MeMo(註冊商標)小鼠(WO2009/157771參 照)進行重組人PD-1蛋白質免疫的方法。MeMo(註冊商標)小鼠係將包含非重組人重鏈V基因區、D基因區及J基因區以及重組人κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖細胞系列型基因的基因片段，使其連結於小鼠恆定區基因之受到基因改變的小鼠，藉由抗體的標的蛋白質的直接免疫，可產生具有多樣性之由重鏈與共通輕鏈所構成之抗體。

於12~16週齡的12隻MeMo(註冊商標)MS5B/MS9小鼠，使用Gerbu adjuvant MM(Gerbu Biotechnik、型號#3001)乳化之重組人PD-1-Fc雜合蛋白質(R&D Systems、型號1086-PD)以14日間隔各別進行免疫。於免疫第0日、第14日及第28日皮下投藥相同的重組人PD-1-Fc雜合蛋白質，於以後的時間點，皮下投藥經溶解於PBS的相同的重組人PD-1-Fc雜合蛋白質。於免疫第21日、第35日、第56日、第77日及第98日，經由使用人PD-1強制表現HEK293T細胞株的流式細胞分析術，評價血清中抗體價。於1000倍稀釋的血清中，人PD-1強制表現HEK293T細胞株經染色的情況，與成為對照之人PD-1非表現HEK293T細胞株比較，MFI值為3倍以上增加的小鼠的淋巴組織，使用於噬菌體展示庫的構築。滿足進行庫的構築的小鼠，自抗體價的評價日起3日，以重組PD-1-Fc雜合蛋白質追加免疫，回收脾臟及腹股溝淋巴結。對於人PD-1及食蟹猴PD-1之血清中抗體價為1/100以上，且藉由追加免疫之抗體價不上昇的小鼠，亦回收脾臟及腹股溝淋巴結。由該等淋巴組織抽出RNA後，進行cDNA合成。

實施例2：具有特異性地結合於PD-1之第一臂之抗PD-1抗體取得用之噬菌體展示庫的構築(蛋白質免疫)

使用實施例1所調製的DNA，使用免疫球蛋白重鏈可變區家族為特異性的引子進行PCR反應。相同的PCR產物以限制酵素SfiI吉XhoI切斷後，插入於使用相同限制酵素切斷的MV1473噬菌粒載體[包含編碼共通輕鏈的基因(人κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖細胞系列型基因)]，構築相同的庫。

實施例3：具有特異性地結合於PD-1之第一臂的抗PD-1抗體的篩選

使用以人PD-1-Fc雜合蛋白質、人PD-1-His Tag雜合蛋白質、食蟹猴PD-1-His Tag雜合蛋白質或小鼠PD-1-His Tag雜合蛋白質被覆的盤，基於對PD-1的結合性實施噬菌體選擇。使用人PD-1-Fc雜合蛋白質的情況，與噬菌體培養間，藉由添加人IgG(SIGMA，型號I4506)，吸收Fc反應性純株。將與人PD-1、食蟹猴PD-1及小鼠PD-1結合之結合噬菌體濃縮。經由以食蟹猴PD-1表現HEK293T細胞株的選擇，將與食蟹猴PD-1結合之噬菌體濃縮。取得以藉由選擇獲得得噬菌體進行形質轉換的大腸菌株TG1的純株，製作母盤。

再者，基於已吸附人PD-1-Fc雜合蛋白質之盤上對於PD-1的結合性，由上述選擇所獲得的純株的周質抽出物，實施噬菌體選擇。又，作為選擇基準，對於陰性對照孔(PBS)所獲得的信號(OD₄₅₀值)，得到3倍以上的信號者作為陽性純株。

實施例4：具有特異性地結合於PD-1之第一臂之抗PD-1抗體的候補純株的DNA定序

實施藉由實施例3的篩選所取得的陽性純株的重鏈可變區基因的DNA定序。所解析的DNA序列分類為超級集簇(CDR3為相同長度、CDR3的胺基酸序列為70%以上相同的一群)與集簇(重鏈CDR3的胺基酸序列為相同的一群)。所取得的924個純株，該等分類為146種的超級集簇及194種的集簇。

實施例5：對於PD-1表現細胞經由結合性評價的篩選

由以分類的各超級集簇，選別滿足如下條件的抗PD-1單株抗體純株，進行單離。

(1)於CDR區以高頻度的導入體細胞突變，

(2)具有使用頻率高的VH生殖細胞系列型基因，及

(3)於對於人PD-1-Fc雜合蛋白質之結合性篩選中獲得高的信號。

使用包含於該等周質抽出物之Fab片段，以抗小鼠IgG多株抗體檢測對於人PD-1表現CHO-S細胞株、食蟹猴PD-1表現CHO-S細胞株之結合性予以評價。所評價的117個純株(105種集簇)中，於包含抗PD-1單株抗體純株PD1-1、PD1-2、PD1-3及PD1-4之22個純株確認對於人PD-1表現CHO-S細胞株的結合性。

實施例6：具有特異性地結合於PD-1之第一臂之抗PD-1單株抗體的胺基酸置換體的製作

純株PD1-1及PD1-4，於其重鏈可變區的框架4包含脫醯胺化模體(Asn-Gly)。以脫醯胺化的風險精簡低的第一臂的取得為目的，製作該脫醯胺化模體經變化的變異體。該純株PD1-4依據EU編號系統之119第號的天冬醯胺(Asn)，係經由習知的部位特異性變異法，成為麩胺醯胺而製作精 改變的純株PD1-5，進行單離。相同純株對於人PD-1表現CHO-S細胞之結合性亦與純株PD1-4為同等。

實施例7：具有特異性地結合於CD3之第二臂之抗CD3單株抗體的篩選

基於WO2005/118635所記載之抗CD3抗體純株15C3的VH及IGVK1-39/JK1共通輕鏈所構成之抗CD3抗體純株，為了進一步地取得電荷不均一性已減低的安定的CD3結合Fab，實施下述方法，取得本發明相關之具有「特異性地結合於CD3之第二臂」之抗CD3抗體。

示於圖10之15C3的VH的胺基酸序列中，經由底線所示之第55號甘胺酸變換為丙胺酸，取得具有與前記抗CD3抗體純株為同等的人CD3結合性，且電荷不均一性已改善的抗CD3抗體純株CD3-1。

再者，為了取得與共通輕鏈(IgVκ1-39*01/IGJκ1*01)之VH/VL相互作用有改善的複數個CD3結合Fab，基於純株CD3-1的VH，構築其胺基酸殘基已置換的純株CD3-1的VH變異體所構成之Fab為複數表現之噬菌體展示庫。使用HBP-ALL細胞或重組人CD3ε-Fc蛋白質進行篩選該噬菌體庫。與重組人CD3ε-Fc蛋白質結合之噬菌體化學性地使其溶出，使用於細菌的再感染。摘出複數個殘存的細菌菌落後，抽出噬菌體，藉由流式細胞分析術篩選對於細胞表面表現CD3的結合。關於顯示CD3結合的噬菌體，進行菌落PCR使編碼VH的cDNA擴增，決定其DNA序列。

其結果所取得之具有由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH的抗CD3抗體純株CD3-2，顯示與純株CD3-1為同等的CD3結合性及電荷均一性。

實施例8：PD-1/CD3雙特異性單株抗體的調製

特異性地結合於PD-1之第一臂係構成抗體部分的情況，表現該抗體之各別的重鏈的表現載體，係將實施例5所選擇之編碼抗PD-1單株抗體純株PD1-1~PD1-5及PD1-6之各別的重鏈可變區的DNA，與編碼IgG₁重鏈恆定區的DNA各別地連結而製作。另一方面，表現特異性地結合於CD3之第二臂的重鏈的表現載體，係將實施例7所選擇之於抗CD3單株抗體純株編碼CD3-2的重鏈可變區的DNA，與編碼IgG₁重鏈恆定區的DNA連結而製作。此處，表現該等重鏈恆定區的基因，於特異性地結合於PD-1之第一臂的情況係使用表現具有L351D/L368E變異(DE變異)之Fc區者，於特異性地結合於CD3之第二臂的情況亦使用表現具有L351K/T366K變異(KK變異)之Fc區者。該等表現載體中，以與IGVK1-39/JK1共通輕鏈同時表現的方式，以包含編碼該等之基因的方式構築。再者，表現該等重鏈恆定區的基因中，為了各別地使Fc起效子活性消失，以表現重鏈恆定區的第235號白胺酸被置換為甘胺酸，第236號甘胺酸被置換為精胺酸的方式改變，再者，為了迴避轉譯後的修飾(processing)，使用重鏈恆定區C末端第447號的離胺酸經缺失之以改變者。該等表現載體同時於Free Style 293F細胞進行基因導入，使抗體產生於培養上清中。回收培養上清，應由蛋白質A親和層析進行處理，各別精製本發明相關之PD-1/CD3雙特異性單株抗體之純株PD1-1(Bi)、純株PD1-2(Bi)、純株PD1- 3(Bi)、純株PD1-4(Bi)及純株PD1-5(Bi)。再者，關於純株PD1-6(Bi)，亦進行同樣的方法製作。又，該等PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株，係源自於其製作中所使用之抗PD-1單株抗體純株PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5以及PD1-6，於具有特異性地結合於PD-1之第一臂之點，各別地對應於該等抗PD-1單株抗體純株。

實施例9：PD-1/CD3雙特異性單株抗體的結合性評價

使用人IgG1-Fc雜合人PD-1細胞外區重組蛋白質或6×His Tag雜合食蟹猴PD-1細胞外區重組蛋白質進行Biacore(註冊商標)測定，評價實施例8中所取得之PD-1/CD3雙特異性單株抗體之第一臂對於各PD-1重組蛋白質的結合親和性。又，該重組蛋白質的固定化，係使用Series S Sensor Chip CM5感應晶片(GE Healthcare，型號29-1049-88)。同樣地，使用人IgG1-Fc雜合CD3δ/CD3ε細胞外區重組蛋白質進行Biacore(註冊商標)測定，評價同抗體之第二臂的CD3結合親和性。各純株之第一臂對於PD-1的結合親和性(Kd值)以及第二臂對於CD3δ/CD3ε的結合親和性示於圖11。

實施例10：PD-1/CD3雙特異性單株抗體的結合性確認

實施例8中所取得之PD-1/CD3雙特異性單株抗體係確認與PD-1及CD3同時地各別地特異性結合。

首先，對於表現人CD3之人PD-1缺失Jurkat細胞株(人T細胞株)，各別添加純株PD1-1(Bi)~PD1-6(Bi)，於冰上培育15分鐘。洗淨細胞後，添加3倍量之經生物素標識的可溶性PD-1重組蛋白質(R&D systems，型號1086-PD-050)，於冰上培育15分鐘。洗淨細胞後，添加100μL的Alexa Fluor 488標識的鏈黴親和素(BioLegend、型號405235)1.25μg/mL，於冰上培育15分鐘。洗淨細胞後，進行流式細胞分析術評價可溶性PD-1重組蛋白質的結合量。該分析的結果示於圖12。

任一純株皆同時與PD-1及CD3結合。又，未檢出於該實驗系統之非特異性結合。

實施例11：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之第一臂的結合特性評價

為了評價實施例8中所取得之PD-1/CD3雙特異性單株抗體之第一臂對PD-1/PD-L1結合的影響，關於同雙特異性單株抗體純株與可溶性PD-L1重組蛋白質對PD-1的結合進行競爭結合分析。首先，對於人PD-1表現CHO-S細胞株各別地添加純株PD1-1(Bi)~PD1-6(Bi)，於冰上培育30分鐘。再者，添加1/20量的經生物素標識的可溶性PD-L1重組蛋白質(R&D systems，型號156-B7-100)，於冰上培育30分鐘。洗淨細胞後，添加PE標識鏈黴親和素(BD Pharmingen，型號554061)於冰上培育30分鐘。洗淨細胞後，進行流式細胞分析術評價可溶性PD-L1重組蛋白質的結合量。其結果示於圖13。

純株PD1-1(Bi)~PD1-5(Bi)，不論對於可溶性PD-L1重組蛋白質是否20倍量存在，容許對於PD-1之可溶性PD-L1重組蛋白質的結合。另一方面，PD1-6(Bi)係於相同條件完全地阻礙對於PD-1之可溶性PD-L1重組蛋白質的結合。

實施例12：PD-1/CD3雙特異性單株抗體各純株對於PD-1的結合之PD1-5(Bi)的交叉競爭性的評價

為了評價實施例8中所取得之PD-1/CD3雙特異性單株抗體各純株PD1-1(Bi)~PD1-5(Bi)之對於PD-1的結合之PD1-5(Bi)的交叉競爭性，進行競爭結合分析。

首先，對於人PD-1表現CHO-S細胞株添加純株PD1-5(Bi)，於冰上培育20分鐘。再者，對於已添加的純株PD1-5(Bi)各別地添加1/100量的經生物素標識的純株PD1-1(Bi)~PD1-5(Bi)，於冰上培育20分鐘。洗淨細胞後，添加PE標識鏈黴素親和素(BD Pharmingen，型號554061)於冰上培育20分鐘。洗淨細胞後，進行流式細胞分析術評價經生物素標識的純株PD1-1(Bi)~PD1-5(Bi)的結合量。其結果示於圖14。

PD1-5(Bi)係顯示阻礙純株PD1-1(Bi)~PD1-4(Bi)對於PD-1的結合，相同純株係顯示該等之對於PD-1的結合之交叉競爭。

實施例13：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之對於B細胞淋巴瘤細胞株的細胞增殖抑制作用

使用源自健康人末梢血之pan-T細胞(STEMCELL，型號ST-70024)(人T細胞)，評價對於B細胞淋巴瘤細胞株之細胞增殖抑制作用。於U底96孔盤，播種人T細胞與經Vybrant DiD Cell-Labeling Solution(Thermo Fisher，型號V22887)標識的B細胞淋巴瘤細胞株EB-1或人PD-1強制表現SU-DHL-4，添加PD-1/CD3雙特異性單株抗體之純株PD1-5(Bi)，共培養48小時。由各孔回收細胞，利用Cell Viability Solution染色，於流式細胞術計數DiD陽性活細胞數。不添加抗體的樣品之DiD陽性活細胞作為100%，算出添加PD1-5(Bi)的樣品的DiD陽性活細胞的減少率作為細 胞增殖抑制率。其結果各別地示於圖15(A)及(B)。經由PD1-5(Bi)添加之任一者的B細胞淋巴瘤細胞株皆為增殖抑制。

實施例14：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之對於多發性骨髓腫細胞株的細胞增殖抑制作用

使用源自健康人末梢血之pan-T細胞(STEMCELL，型號ST-70024)(人T細胞)，評價對於多發性骨髓腫細胞株之細胞增殖抑制作用。於U底96孔盤，播種人T細胞與經Vybrant DiD Cell-Labeling Solution(Thermo Fisher，型號V22887)標識的多發性骨髓腫細胞株RPMI8226，添加PD-1/CD3雙特異性單株抗體之純株PD1-5(Bi)，共培養48小時。由各孔回收細胞，利用Cell Viability Solution染色，於流式細胞術計數DiD陽性活細胞數。不添加抗體的樣品之DiD陽性活細胞作為100%，算出添加PD1-5(Bi)的樣品的DiD陽性活細胞的減少率作為細胞增殖抑制率。其結果示於圖16。經由PD1-5(Bi)添加RPMI8226為增殖抑制。

實施例15：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之對於成人T細胞性淋巴瘤細胞株的細胞增殖抑制作用

使用源自健康人末梢血之pan-T細胞(STEMCELL，型號ST-70024)(人T細胞)，評價對於成人T細胞性淋巴瘤細胞株之細胞增殖抑制作用。於U底96孔盤，播種人T細胞與經Vybrant DiD Cell-Labeling Solution(Thermo Fisher，型號V22887)標識的成人T細胞性淋巴瘤細胞株ILT-Ma，添加PD-1/CD3雙特異性單株抗體之純株PD1-5(Bi)，共培養48小時。由各孔回收細胞，利用Cell Viability Solution染色，於流式細胞術計數DiD陽性活細胞數。不添加抗體的樣品之DiD陽性活細胞作為100%，算出添 加PD1-5(Bi)的樣品的DiD陽性活細胞的減少率作為細胞增殖抑制率。其結果示於圖17。經由PD1-5(Bi)添加之ILT-Mat為增殖抑制。

實施例16：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之對於急性T細胞性白血病細胞株的細胞增殖抑制作用

使用源自健康人末梢血之pan-T細胞(STEMCELL，型號ST-70024)(人T細胞)，評價對於急性T細胞性白血病細胞株的細胞增殖抑制作用。於U底96孔盤，播種人T細胞與經Vybrant DiD Cell-Labeling Solution(Thermo Fisher，型號V22887)標識的人PD-1強制表現Jurkat(急性T細胞性白血病細胞株)，添加PD-1/CD3雙特異性單株抗體之純株PD1-5(Bi)，共培養48小時。由各孔回收細胞，利用Cell Viability Solution染色，於流式細胞術計數DiD陽性活細胞數。不添加抗體的樣品之DiD陽性活細胞作為100%，算出添加PD1-5(Bi)的樣品的DiD陽性活細胞的減少率作為細胞增殖抑制率。其結果示於圖18。經由PD1-5(Bi)添加之人PD-1強制表現Jurkat為增殖抑制。

實施例17：於人FcRn結合部位的胺基酸導入變異之PD-1/CD3雙特異性單株抗體的製作與FcRn結合性評價

PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)的重鏈恆定區中依據EU編號系統之第252號的甲硫胺酸各別地經置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸及天冬胺酸之抗體純株Mutl、Mut2、Mut3及Mut4，各別地根據關於胺基酸置換的習知技術的方法製作。再者，進行同樣的方法各別地製作相同純株PD1-5(Bi)的重鏈恆定區中依據EU編號系統知第434號的天冬醯胺 經置換為白胺酸的抗體純株Mut5，第438號的麩胺醯胺經置換為麩胺酸的抗體純株Mut6。

其次，該等抗體各別地，對於人FcRn或小鼠FcRn之結合親和性，使用表面電漿共振評價。於Biacore T200(GE Healthcare)組裝Biotin CAPture Kit(GE Healthcare，型號28-9202-34)的Series S Sensor Chip CAP，各別地固定、Human FcRn-human B2M(Immunitrack，型號ITF01)及Murine FcRn-murine B2M(Immunitrack，型號ITF07)。於pH6.0的條件各別地評價PD1-5(Bi)及Mut1~Mut6的結合性。各別地，對人FcRn的結合性實驗結果示於圖19及20，對小鼠FcRn的結合性實驗結果示於圖21。

Mut1~Mut6之對人FcRn的各親和性，與PD1-5(Bi)(解離定數(K_D值)：2.75×10^-8M)相比較為降低，特別是，Mut4及Mut2為顯著降低者。Mut1及Mut4之對小鼠FcRn的各親和性比PD1-5(Bi)(K_D值：1.61×10^-8M)更為降低(Mut1之K_D值：4.67×10^-8M)，特別是，Mut4為顯著降低者。

實施例18：PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株Mut4之血中動態

其次，使用人CD3ε/人PD-1敲入C57BL/6小鼠，評價純株Mut4之活體中(in vivo)血中動態。又，人CD3ε/人PD-1敲入C57BL/6小鼠，係將根據Genesis.2009 Jun；47(6)：414-22所記載的方法製作之人CD3ε敲入小鼠及人PD-1敲入小鼠，經由習知的方法藉由使其交配而製作。

將相同純株於該C57BL/6小鼠的尾部靜脈內投藥後30分以及1、2、4、8、24及288小時的時間點，以剪刀剪傷小鼠尾靜脈的一部分，於經肝素處理的管採取約40μL的血液。採血液進行離心分離調製血漿，使用電化學發光(ECL)法測定相同純株的血漿中濃度。由血漿中濃度的推移，算出其血中半衰期。

測定的結果，相同純株的血中半衰期為8.0小時，比原本的PD1-5(Bi)的血中半衰期更為縮短約160小時。

實施例19：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之對於T細胞急性淋巴性白血病細胞株的細胞增殖抑制作用

使用源自健康人末梢血脂單核細胞(HemaCare，型號PB009C-1)(人PBMC)，評價對於T細胞急性淋巴性白血病細胞株之細胞增殖抑制作用。於U底96孔盤播種人PBMC及經Vybrant DiD Cell-Labeling Solution(Thermo Fisher，型號V22887)標識的T細胞急性淋巴性白血病細胞株HPB-ALL，添加PD-1/CD3雙特異性單株抗體之純株PD1-5(Bi)，共培養72小時。由各孔回收細胞，利用Cell Viability Solution染色，於流式細胞術計數DiD陽性活細胞數。不添加抗體的樣品之DiD陽性活細胞作為100%，算出添加PD1-5(Bi)的樣品的DiD陽性活細胞的減少率作為細胞增殖抑制率。其結果示於圖22。經由PD1-5(Bi)添加之HPB-ALL為增殖抑制。

實施例20：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之對於皮膚T細胞淋巴瘤細胞株的細胞增殖抑制作用

使用源自健康人末梢血脂單核細胞(Precision for Medicine，型號93000-10M)(人PBMC)，評價對於皮膚T細胞淋巴瘤細胞株之細胞增殖抑制作用。於U底96孔盤播種人PBMC及經Vybrant DiD Cell-Labeling Solution(Thermo Fisher，型號V22887)標識的皮膚T細胞淋巴瘤(蕈狀肉芽腫)細胞株MJ，添加PD-1/CD3雙特異性單株抗體之純株PD1-5(Bi)，共培養72小時。由各孔回收細胞，利用SYTOX Green Dead Cell Stain(Thermo Fisher Scientific，型號S34860)染色，於流式細胞術計數DiD陽性活細胞數。不添加抗體的樣品之DiD陽性活細胞作為100%，算出添加PD1-5(Bi)的樣品的DiD陽性活細胞的減少率作為細胞增殖抑制率。經由PD1-5(Bi)添加，皮膚T細胞淋巴瘤細胞株MJ為增殖抑制。

實施例21：標的細胞上之PD-1表現量愈PD-1/CD3雙特異性單株抗體之細胞傷害活性的評價

對於人PD-1強制表現SU-DHL-4、EB-1及RPMI8226之各標的細胞，根據實施例13及14所記載的方法各別測定PD-1/CD3雙特異性單株抗體純株PD1-5(Bi)的細胞傷害活性，算出其EC50(ng/mL)。另一方面，以流體細胞術測定表現於該等標的細胞表面之每1細胞的PD-1分子數。各標的細胞的PD-1分子數與細胞傷害活性的EC50之關係作成散布圖示於圖23。又，圖中的虛線係基於非線性回歸分析(兩對數模式：Y=10^(斜率×logX+Y節距)，Y：EC50(ng/mL)，X：PD-1分子數，斜率：直線的傾斜，Y節距：Y切點)算出者，圖中的數式係對應於該兩對數模式的數式。再者，R²表示決定係數。

根據標的細胞之PD-1表現量的增加，可確認PD1-5(Bi)存在下之對於人末梢血T細胞的標的細胞之細胞傷害活性為增強。

[產業上可利用性]

本發明相關之PD-1/CD3雙特異性蛋白質對於血液性癌症的預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療為有用者。

<110> 日商小野藥品工業股份有限公司(ONO PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)

<120> 以PD-1/CD3雙特異性蛋白質所進行之血液性癌症治療(Treatment of hematological cancer with PD-1/CD3 bispecific protein)

<130> P20-109WO

<150> JP 2019-126503

<151> 2019-07-05

<150> JP 2019-139752

<151> 2019-07-30

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims (6)

1. 一種用以製造血液性癌症的治療劑之醫藥組成物的用途，該醫藥組成物包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，其中(A)特異性地結合於PD-1之第一臂具有由序列編號5的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL；並且(B)特異性地結合於CD3之第二臂具有由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL。
2. 如請求項1所述的用途，其中，前述雙特異性抗體為IgG₁抗體。
3. 如請求項1或2所述的用途，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈係具有由序列編號23的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區。
4. 如請求項1或2所述的用途，其中，具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈係具有由序列編號24的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區。
5. 如請求項1或2所述的用途，其中，具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VL之輕鏈及具有特異性地結合於CD3之第二臂的VL之輕鏈係各自具有由序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。
6. 一種用以製造血液性癌症的治療劑之醫藥組成物的用途，該醫藥組成物包含具有特異性地結合於PD-1之第一臂及特異性地結合於CD3之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，其中 該雙特異性抗體係由下列(A)至(D)所構成，(A)具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈，(B)具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VL之輕鏈，(C)具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈，及(D)具有特異性地結合於CD3之第二臂的VL之輕鏈；(a)具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VH之重鏈係具有由序列編號5的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號23的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區；(b)具有特異性地結合於PD-1之第一臂的VL之輕鏈係具有由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL以及由序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區；(c)具有特異性地結合於CD3之第二臂的VH之重鏈係具有由序列編號36的胺基酸序列所構成之VH以及由序列編號24的胺基酸序列所構成之重鏈恆定區；並且(d)具有特異性地結合於CD3之第二臂的VL之輕鏈係具有由序列編號25的胺基酸序列所構成之VL以及由序列編號29的胺基酸序列所構成之輕鏈恆定區。

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