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TWI803001B - 生物感測器的製造方法及以該製造方法所製得的生物感測器 - Google Patents

生物感測器的製造方法及以該製造方法所製得的生物感測器 Download PDF

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TWI803001B
TWI803001B TW110135553A TW110135553A TWI803001B TW I803001 B TWI803001 B TW I803001B TW 110135553 A TW110135553 A TW 110135553A TW 110135553 A TW110135553 A TW 110135553A TW I803001 B TWI803001 B TW I803001B
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TW110135553A
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TW202232082A (zh
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楊閎蔚
李南熺
許盈培
龎浩翰
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國立中山大學
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Abstract

一種生物感測器的製造方法，用以解決習知玻璃基底生物感測器的製造方法使用一強酸溶液或一強鹼溶液，或進行一氧電漿處理的問題。該製造方法包含：以濃度為60~99.8%的一乙醇水溶液處理一含矽基材，使該含矽基材的至少一表面帶有負電荷；於該含矽基材的該至少一表面上形成帶有正電荷的至少一活性高分子層，各該至少一活性高分子層具有一結合表面及一活性表面，該至少一活性高分子層以該結合表面結合該含矽基材的該至少一表面；及使數個捕捉生物分子結合該活性表面。本發明另關於以該製造方法所製得的生物感測器，該生物感測器包含一含矽基材，具有至少一表面；至少一活性高分子層，分別具有相對之一結合表面及一活性表面，該至少一活性高分子層分別以該結合表面結合該含矽基材的該至少一表面；及數個捕捉生物分子，結合該活性表面。

Description

生物感測器的製造方法及以該製造方法所製得的生物 感測器
本發明係關於一種生物感測器的製造方法，尤其是一種減少廢液產生的生物感測器的製造方法。本發明另關於由前述製造方法所製得的生物感測器。
為了檢測一疑似患者是否遭受病毒感染，一般而言可以利用定量即時聚合酶連鎖反應法(quantitative real-time polymerase chain reactive，RT-qPCR)，搭配特定的引子對來進行病毒的檢測，定量即時聚合酶連鎖反應法(RT-qPCR)雖然特異性高且具有高敏感度，惟卻需要複雜的檢體前處理流程、昂貴的實驗室儀器設備，且工者亦需要經過完整的訓練才能夠執行此一方法，對於特定病毒的即時檢測(point-of-care，POC)仍有所不便。
為了要進行即時檢測，已有開發出可以搭配智慧型手機來檢測體液中的分子或癌症生物標記的習知光學生物感測器(optical biosensor)，若是一檢體中包含特定病毒的抗原，且該抗原能夠與該習知光學生物感測器的表面所設有的抗體特異性結合時，該抗體與該抗原的特異性結合所產生的光學訊號即可以被智慧型手機檢測到，進而確認該檢體已被特定病毒所感染。
然而，習知光學生物感測器的製造方法中，係藉由一強酸溶液 或一強鹼溶液(如，氫氧化鈉溶液)使一含矽基材表面形成負電荷，再使帶正電荷的活性高分子層吸附於該含矽基材的表面，而帶負電荷的抗體即可以吸附在該活性高分子層的表面，進而獲得該習知光學生物感測器。然而，習知光學生物感測器的製造方法所使用的強酸溶液或強鹼溶液，不僅提升了工者的操作風險，且所產生的包含該強酸溶液或該強鹼溶液的大量廢液亦會對環境造成汙染。
此外，習知光學生物感測器的製造方法另可以藉由氧電漿(oxygen plasma)使該含矽基材表面形成負電荷，惟工者需要使用如氧氣電漿清洗機(oxygen plasma cleaner)等特殊儀器於高溫、高壓等特殊條件下來進行氧電漿處理，會大幅提升該習知光學生物感測器的製造成本。
有鑑於此，習知生物感測器的製造方法仍有改善的必要。
為解決上述問題，本發明的目的是提供一種生物感測器的製造方法，係可以無須使用一強酸溶液或一強鹼溶液者。
本發明的次一目的是提供一種生物感測器的製造方法，係可以降低生物感測器的製造成本者。
本發明的再一目的是提供一種生物感測器，係以前述之生物感測器的製造方法所製得者。
本發明全文所述方向性或其近似用語，例如「前」、「後」、「左」、「右」、「上(頂)」、「下(底)」、「內」、「外」、「側面」等，主要係參考附加圖式的方向，各方向性或其近似用語僅用以輔助說明及理解本發明的各實施例，非用以限制本發明。
本發明全文所記載的元件及構件使用「一」或「一個」之量詞， 僅是為了方便使用且提供本發明範圍的通常意義；於本發明中應被解讀為包括一個或至少一個，且單一的概念也包括複數的情況，除非其明顯意指其他意思。
本發明全文所述「結合」、「組合」或「組裝」等近似用語，主要包含連接後仍可不破壞構件地分離，或是連接後使構件不可分離等型態，係本領域中具有通常知識者可以依據欲相連之構件材質或組裝需求予以選擇者。
一種生物感測器的製造方法，包含：提供一含矽基材，該含矽基材具有至少一表面；以濃度為60~99.8%的一乙醇水溶液處理該含矽基材，使該含矽基材的該至少一表面帶有負電荷；於該含矽基材的該至少一表面上形成帶有正電荷的至少一活性高分子層，各該至少一活性高分子層具有一結合表面及一活性表面，該至少一活性高分子層以該結合表面結合該含矽基材；數個捕捉生物分子結合該至少一活性高分子層的該活性表面。
據此，本發明的生物感測器的製造方法中，藉由該乙醇溶液的使用，即可以使該含矽基材的該至少一表面帶有負電荷，而毋須使用一強酸溶液或一強鹼溶液，不僅可以提升工者的工作環境安全，亦可以降低包含該強酸溶液、該強鹼溶液的廢液的處理成本，更可以防止包含該強酸溶液、該強鹼溶液的廢液的排出對環境生物或建築物等所產生的不良影響，為本發明之功效。
再且，本發明的生物感測器的製造方法中，藉由該乙醇溶液的使用，即可以使該含矽基材的該至少一表面帶有負電荷，並使該含矽基材的該至少一表面帶有足量的負電荷，而毋須使用如氧氣電漿清洗機等特殊儀器，亦可以免除進行氧氣電漿處理所需要的高溫、高壓環境，不僅有助於達成降低該生物感測器的製造成本之功效，更可以使該含矽基材的該至少一表面帶 有足量的負電荷，達成使該含矽基材的該至少一表面可以與帶有正電荷的該至少一活性高分子層能夠穩定結合之功效。
本發明的生物感測器的製造方法，其中，各該數個捕捉生物分子分別帶有負電荷，使該數個捕捉生物分子分別靜電結合該至少一活性高分子層的該活性表面。如此，相較於藉由一交聯劑(cross-linker)來使該數個捕捉生物分子結合該至少一活性高分子層，可以大幅減少繁瑣的步驟。
本發明的生物感測器的製造方法，其中，該數個捕捉生物分子結合該至少一活性高分子層的該活性表面的一覆蓋區，且該至少一活性高分子層的該活性表面另包含一裸露區，較佳地，該製造方法另包含使一阻斷層覆蓋該至少一活性高分子層的該活性表面的該裸露區。如此，藉由以該阻斷層覆蓋該活性表面的該裸露區，可以避免一檢體中的雜質非特異性地結合該活性表面，進而可以達成提升該生物感測器的檢測特異性之功效。
本發明的生物感測器的製造方法，其中，各該數個捕捉生物分子分別藉由數個貴金屬奈米粒子結合該至少一活性高分子層的該活性表面；舉例而言各該數個貴金屬奈米粒子分別帶有負電荷，使該數個貴金屬奈米粒子分別靜電結合該至少一活性高分子層的該活性表面，且各該數個捕捉生物分子分別共價結合該數個貴金屬奈米粒子。如此，藉由該貴金屬奈米粒子的存在，能夠形成較大的立體障礙(steric hindrance)，使該數個捕捉生物分子更容易露出，進而可以達成提升該生物感測器的檢測靈敏度之功效。
本發明的生物感測器的製造方法，其中，該數個貴金屬奈米粒子結合該至少一活性高分子層的該活性表面的一覆蓋區，且該至少一活性高分子層的該活性表面另包含一裸露區，較佳地，該製造方法另包含使一阻斷層覆蓋該至少一活性高分子層的該活性表面的該裸露區。如此，藉由以該阻斷層覆蓋該活性表面的該裸露區，可以避免一檢體中的雜質非特異性地結合 該活性表面，進而可以達成提升該生物感測器的檢測特異性之功效。
本發明的生物感測器的製造方法，其中，該至少一活性高分子層的該活性表面具有一官能基，且該官能基係選自由胺基及銨根所組成之群組。如此，藉由前述官能基，使該至少一活性高分子層的該活性表面帶有強正電荷，因而能夠與該捕捉生物分子快速結合。
本發明的生物感測器的製造方法，其中，各該至少一活性高分子層係由一高分子所形成，且該高分子係選自由聚乙烯亞胺(如線性聚乙烯亞胺或分枝狀聚乙烯亞胺)、聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚β-胺基酯(如線性聚β-胺基酯或分枝狀聚β-胺基酯)、聚二烯二甲基氯化銨及聚丙烯醯胺所組成之群組。如此，藉由該至少一活性高分子層由前述高分子所形成，使該至少一活性高分子層的該活性表面帶有強正電荷，因而能夠與該捕捉生物分子快速結合。
依據前述之生物感測器的製造方法，可以製成本發明的生物感測器，該生物感測器包含一含矽基材，具有至少一表面；至少一活性高分子層，分別具有一結合表面及一活性表面，該至少一活性高分子層分別以該結合表面結合該含矽基材的該至少一表面；及數個捕捉生物分子，結合該至少一活性高分子層的該活性表面。
據此，本發明的生物感測器，由於係藉由前述生物感測器的製造方法所製得，且所選用的基材為該含矽基材〔如，一二氧化矽基基材(SiO2-based substrate)〕，換言之，該生物感測器非屬於塑膠製品，且可以經熔融後回收再利用；又，於製造該生物感測器的過程無使用該強酸溶液或該強鹼溶液，使該生物感測器屬於環境友善性商品(environmentally friendly good)，為本發明之功效。
本發明的生物感測器，其中，該至少一活性高分子層的該活性 表面包含一覆蓋區及一裸露區，且該數個捕捉生物分子結合該至少一活性高分子層的該活性表面的該覆蓋區，且較佳地，一阻斷層覆蓋該裸露區。如此，藉由以該阻斷層覆蓋該活性表面的裸露區，可以避免一檢體中的雜質非特異性地結合該活性表面，進而可以達成提升該生物感測器的檢測特異性之功效。
本發明的生物感測器，其中，各該數個捕捉生物分子分別藉由數個貴金屬奈米粒子結合該至少一活性高分子層的該活性表面。如此，藉由該貴金屬奈米粒子的存在，能夠形成較大的立體障礙(steric hindrance)，使該數個捕捉生物分子更容易露出，進而可以達成提升該生物感測器的檢測靈敏度之功效。
本發明的生物感測器，其中，該至少一活性高分子層的該活性表面包含一覆蓋區及一裸露區，且該數個貴金屬奈米粒子結合該至少一活性高分子層的該活性表面的該覆蓋區，且較佳地，一阻斷層覆蓋該裸露區。如此，藉由以該阻斷層覆蓋該活性表面的裸露區，可以避免一檢體中的雜質非特異性地結合該活性表面，進而可以達成提升該生物感測器的檢測特異性之功效。
〔本發明〕
1:含矽基材
11:表面
2:活性高分子層
21:結合表面
22:活性表面
22a:覆蓋區
22b:裸露區
3:捕捉生物分子
4:阻斷層
5:貴金屬奈米粒子
B1:塑膠瓶身
B2:塑膠瓶身
B3:玻璃瓶身
C:瓶蓋
S:生物感測器
〔第1圖〕依本發明之第一實施例的生物感測器的製造方法所製得的生物感測器的側視剖面圖。
〔第2圖〕第1圖之生物感測器的A區域的局部放大圖。
〔第3圖〕在第2圖之生物感測器上形成阻斷層之後的示意圖。
〔第4圖〕試驗(A)中，未經一乙醇水溶液進行前處理的第A1組玻璃試片，及在經該乙醇水溶液進行前處理之後，再分別經0.1wt%、1.0wt%及2.5 wt%的分枝狀聚乙烯亞胺水溶液處理所得的第A2~A4組玻璃試片於300~500nm之間的波長下的光譜圖。
〔第5圖〕試驗(B)中，對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白M對混合溶液的灰度的校正曲線(●)及SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白G的濃度對混合溶液的灰度的校正曲線(▲)。
〔第6圖〕試驗(C)中，對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白M的濃度對混合溶液的吸光值的校正曲線。
〔第7圖〕試驗(D)中，來自健康個體的血液檢體(第D1組)、來自罹患其他疾病的患者的血液檢體(第D2組)、來自遭受SARS-CoV-2新型冠狀病毒感染，且處於感染早期的患者的血液檢體(第D3組)，及來自遭受SARS-CoV-2新型冠狀病毒感染，且處於感染中晚期的患者的血液檢體(第D4組)中的對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白M及免疫球蛋白G的吸光值。
〔第8圖〕依本發明之第二實施例的生物感測器的製造方法所製得的生物感測器的示意圖。
〔第9圖〕在第8圖之生物感測器上形成阻斷層之後的示意圖。
〔第10圖〕依本發明之第二實施例的生物感測器的製造方法所製得的生物感測器的使用狀態流程圖。
〔第11圖〕試驗(E)中，在該數個貴金屬奈米粒子結合該活性高分子層的活性表面之前或之後的第E1、E2組玻璃試片於400~650nm之間的波長下的光譜圖。
〔第12圖〕試驗(F)中，在該數個捕捉生物分子分別結合該數個貴金屬奈米粒子之前的第F1組玻璃試片的螢光影像。
〔第13圖〕試驗(F)中，在該數個捕捉生物分子分別結合該數個貴金屬奈 米粒子之後的第F2組玻璃試片的螢光影像。
〔第14圖〕試驗(G)中，未經處理的玻璃試片(第G1組)、結合有該活性高分子層的玻璃試片(第G2組)、結合有該數個貴金屬奈米粒子的玻璃試片(第G3組)、結合有該數個捕捉生物分子的玻璃試片(第G4組)及結合有該阻斷層的玻璃試片(第G5組)的表面粗糙度柱狀圖。
〔第15圖〕試驗(H)中，包含不同濃度的FXYD3蛋白質的尿液檢體於350~550nm之間的波長下的光譜圖。
〔第16圖〕試驗(I)中，來自健康個體的尿液檢體(第I1組)、來自罹患低惡性下泌尿道上皮細胞癌期的個體的尿液檢體(第I2組)、來自罹患低惡性上泌尿道上皮細胞癌的個體的尿液檢體(第I3組)、來自罹患高惡性下泌尿道上皮細胞癌的個體的尿液檢體(第I4組)、來自罹患高惡性上泌尿道上皮細胞癌的個體的尿液檢體(第I5組)中的FXYD3蛋白質含量。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
請參照第1、2圖所示，本發明之第一實施例的製造方法，係可以先提供一含矽基材1，接著於該含矽基材1上形成一活性高分子層2，再使數個捕捉生物分子3結合該活性高分子層2上。
詳而言之，該含矽基材1可以為一二氧化矽基基材(SiO2-based substrate)等，且型態可以為片狀、瓶狀等各種立體型態，此為本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以依據需求而自行調整，於此不加以限制。
該含矽基材1可以經一乙醇溶液的處理，使該含矽基材1的至少一表面11帶有負電荷，舉例而言，該乙醇溶液可以為60~99.8%的乙醇水 溶液(乙醇濃度為60~99.8%)。值得注意的是，若是該乙醇水溶液的乙醇濃度不足60%時，將無法有效清洗附著於該含矽基材1的至少一表面11上的雜質或油脂，導致該含矽基材1的至少一表面11無法形成足量的負電荷，或導致該含矽基材1的至少一表面11上的負電荷分佈不均勻，使該活性高分子層2無法穩定結合於該含矽基材的至少一表面11上。工者能夠以如第1圖所示之玻璃瓶(容積約為2mL)作為該含矽基材1，在於該玻璃瓶中加入該乙醇水溶液(體積為1mL)，並於室溫(22~28℃的溫度)下震盪約10分鐘之後，即可以使該玻璃瓶的一內表面形成帶有負電荷的數個氫氧根離子(hydroxide ion，OH-)，換言之，該玻璃瓶即為該含矽基材1，該玻璃瓶的該內表面即為該含矽基材1的該表面11。
此外，工者亦能夠以一玻璃片(glass chip)作為該含矽基材1，在將該玻璃片浸泡於該乙醇水溶液之後，即可以於該玻璃片的相對二表面均形成帶有負電荷的數個氫氧根離子，換言之，該玻璃片即為該含矽基材1，且該玻璃瓶的該相對二表面均為該含矽基材1的該表面11。
又，在以該乙醇溶液處理之前，該含矽基材1亦可以經過一前處理，以去除附著於該含矽基材1的該表面11上的灰塵、油脂(grease)或雜質(impurity)，舉例而言，工者能夠以含0.1%聚山梨醇酯20(polysorbate 20，Tween 20)的三羥甲基胺基甲烷(tri(hydroxymethyl)aminomethane，Tris)緩衝液來清洗該含矽基材1的該表面11，亦能夠以丙酮(acetone)或去離子水(deionized water)來清洗該含矽基材1的該表面11。
續請參照第1、2圖所示，在獲得帶有負電荷的該表面11之後，工者即可以於該表面11上形成帶有正電荷的該活性高分子層2，該活性高分子層2具有相對的一結合表面21及一活性表面22，該活性高分子層2能夠以該結合表面21靜電結合該含矽基材1的該表面11。值得注意的是，該活 性高分子層2較佳可以具有帶有正電荷的一官能基，該官能基係可以選自由胺基(amine group，-NH2)及銨根(ammonium，-NH4 +)所組成之群組，使該活性高分子層2可以藉由該官能基與該數個捕捉生物分子3結合。舉例而言，該活性高分子層2可以由一高分子所形成，且該高分子係選自由聚乙烯亞胺(polyethylenime，PEI)、聚烯丙基胺鹽酸鹽(poly(allylamine hydrochloride)，PAH)、聚β-胺基酯(poly(β-amino ester)，PAE)、聚二烯二甲基氯化銨(polydiallyldimethylammonium chloride，PDDA)及聚丙烯醯胺(polyacrylamide)所組成之群組，其中，聚乙烯亞胺可以為線性聚乙烯亞胺(linear PEI)或分枝狀聚乙烯亞胺(branched PEI)，且聚β-胺基酯可以為線性聚β-胺基酯(linear PAE)或分枝狀聚β-胺基酯(branched PAE)。
於本實施例中，工者係可以配製濃度為0.1wt%的分枝狀聚乙烯亞胺(branched PEI，Co#408727，購自Sigma-Aldrich)水溶液，於如第1圖所示的玻璃瓶中加入0.1mL的分枝狀聚乙烯亞胺水溶液，於室溫下反應2小時，使分枝狀聚乙烯亞胺可以形成帶有胺基所形成的正電荷的活性高分子層2，並以該結合表面21靜電結合該玻璃瓶的內表面(即，該含矽基材1的表面11)。工者可以另藉由去離子水來清洗掉未結合該玻璃瓶的內表面的分枝狀聚乙烯亞胺，且能夠將該玻璃瓶加熱至80℃，並持溫15分鐘以上，再緩緩降溫至室溫，以強化該活性高分子層2與該含矽基材1之間的結合力。
接著，再請參照第1、2圖所示，工者可以使該數個捕捉生物分子3結合該活性高分子層2的該活性表面22(即，該活性高分子層2未結合該含矽基材1的表面)，使該活性高分子層2能夠位於該數個捕捉生物分子3及該含矽基材1之間。工者可以依據該生物感測器S所要特異性地檢測的一目標生物分子來選用該捕捉生物分子3，舉例而言，該捕捉生物分子3可以為對該目標生物分子具有特異性的抗體(antibody)、抗原(antigen)、酵 素(enzyme)、受體(substrate)、適體(aptamer)等，進而使該生物感測器S能夠特異性地檢測對應的抗原、抗體、受體、酵素、核酸及細胞等目標生物分子。
工者係可以使該捕捉生物分子3與帶有正電荷的活性高分子層2的活性表面22靜電結合，例如選用本身帶有負電荷的捕捉生物分子3，或者，藉由調整包含該捕捉生物分子3的溶液的pH值，使包含該捕捉生物分子3的溶液的pH值高於該捕捉生物分子3之等電點(isoelectric point)，使該捕捉生物分子3帶有負電荷，或者，以硫醇基(thiol group，-SH)來修飾該捕捉生物分子3，使該捕捉生物分子3帶有負電荷，進而能夠靜電結合該活性高分子層2的活性表面22。
於本實施例中，係選用帶有負電荷的SARS-CoV-2新型冠狀病毒核殼蛋白(nucleocapsid protein)作為該捕捉生物分子3，該SARS-CoV-2新型冠狀病毒核殼蛋白可以特異性地結合對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)，亦可以特異性地結核對對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，換言之，包含該SARS-CoV-2新型冠狀病毒核殼蛋白的生物檢測器即可以應用於檢測一檢體中是否包含對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白M(IgM)及/或對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白G(IgG)。工者係可以將該SARS-CoV-2新型冠狀病毒核殼蛋白溶於一磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)中，以形成濃度為100ng/mL的SARS-CoV-2新型冠狀病毒核殼蛋白溶液，接著將0.1mL的SARS-CoV-2新型冠狀病毒核殼蛋白溶液加入該玻璃瓶中，於室溫下反應1小時，使帶有負電荷的SARS-CoV-2新型冠狀病毒核殼蛋白可以靜電結合位於該玻璃瓶的內表面的活性高分子層2的活性表面22上。
又，該捕捉生物分子3可能無法形成完全覆蓋該活性表面22的捕捉生物分子層，換言之，該活性表面22仍有部分區域未結合有該捕捉生物分子3，故可以將該活性表面22區分為結合有該捕捉生物分子3的覆蓋區22a及未結合有該捕捉生物分子3的裸露區22b，且由於來自生物體的檢體中通常包含大量的雜質〔例如，血漿蛋白(serum albumin)、膽紅素(bilirubin)、脂質(lipid)及血紅素(hemoglobin)等〕，為了避免前述雜質非特異性地結合該活性高分子層2的裸露區22b，而影響該生物感測器S的判讀，工者較佳可以再於該玻璃瓶中加入如牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液或酪蛋白(casein)溶液等阻斷溶液(blocking solution)，使該阻斷溶液可以於該活性高分子層2的活性表面22的裸露區22b可以覆蓋有一阻斷層4。於本實施例中，該阻斷溶液為一牛血清白蛋白水溶液(含2wt%的牛血清白蛋白)，將1mL的牛血清白蛋白水溶液加入該玻璃瓶中，於室溫下反應1小時，即可以在位於該玻璃瓶的內表面的活性高分子層2的活性表面22的裸露區22b上形成該阻斷層4，再以三羥甲基胺基甲烷緩衝液清洗，進而獲得如第3圖所示的生物感測器S。
依據前述第一實施例的製造方法所製得的生物感測器S的使用方法如下：
探針(probe)溶液的配製：該探針溶液包含濃度為250ng/mL的標記有辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗人類免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)的二級抗體及/或濃度為250ng/mL的標記有辣根過氧化酶(HRP)的抗人類免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的二級抗體，溶於含0.001%聚山梨醇酯20(polysorbate 20，Tween 20)的三羥甲基胺基甲烷(tri(hydroxymethyl)aminomethane，Tris)緩衝液中。
色素原(chromogen)溶液的配製：該色素原溶液包含濃度為 0.5mg/mL的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)及濃度為0.5%過氧化氫(hydrogen peroxide，H 2 O 2)，溶於濃度為0.1M、pH值為5.5的醋酸鈉(sodium acetate，NaOAc)水溶液中。
終止試劑(terminating reagent)的配製：該終止試劑為濃度為1M的鹽酸水溶液。
檢體的採樣：為了要以該生物感測器S確認一疑似患者是否遭受SARS-CoV-2新型冠狀病毒的感染，所使用的檢體可以為來自該疑似患者的全血檢體(如靜脈全血檢體或指尖全血檢體)、血清檢體、血漿檢體、尿液檢體及唾液檢體等各種檢體，於本實施例中，為便於SARS-CoV-2新型冠狀病毒的即時檢測，係選用採自指尖的該血液檢體。
該生物感測器S的操作流程如下：
將1mL的探針溶液加入該玻璃瓶中，再加入5μL的血液檢體，在均勻混合之後，於室溫下靜置15分鐘，使該探針溶液中的包含標記有辣根過氧化酶(HRP)的抗人類免疫球蛋白M(IgM)的二級抗體及/或標記有辣根過氧化酶(HRP)的抗人類免疫球蛋白G(IgG)的二級抗體能夠與該檢體中的對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白M(IgM)及/或對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白G(IgG)特異性結合，進而與該玻璃瓶的內表面上的捕捉生物分子3(SARS-CoV-2的核殼蛋白)特異性結合。
在清洗該玻璃瓶之後，再將0.5mL的色素原溶液加入該玻璃瓶中，靜置2分鐘以觀察該玻璃瓶中的混合溶液的顏色變化，此時，在辣根過氧化酶(HRP)的作用下，該玻璃瓶中的混合溶液會逐漸呈現深藍色。
最後，於呈現深藍色的混合溶液中加入該終止試劑，此時深藍色的混合溶液會在該終止試劑的作用下轉變為黃色，如此，工者即可以用肉 眼觀察該混合溶液的顏色變化，或者以光譜儀(spectrometer)測定於特定波長(如450nm)下的吸光值(absorbance)的變化。
在使用依據前述第一實施例的製造方法所製得的生物感測器S的狀況下，若是該疑似患者確實遭受SARS-CoV-2新型冠狀病毒的感染，該捕捉生物分子3(SARS-CoV-2的核殼蛋白)即可以捕捉該疑似患者的檢體中的對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白M(IgM)及/或對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白G(IgG)，並進一步結合該探針溶液中的標記有辣根過氧化酶(HRP)的抗人類免疫球蛋白M(IgM)的二級抗體及/或標記有辣根過氧化酶(HRP)的抗人類免疫球蛋白G(IgG)的二級抗體，因而當加入該色素原溶液時，該色素原溶液即會受到辣根過氧化酶(HRP)的作用而發生顏色的變化，換言之，該玻璃瓶中的混合溶液的顏色如最終轉變為藍色，則顯示該疑似患者已遭受SARS-CoV-2新型冠狀病毒的感染。
為了測試依據前述第一實施例的製造方法所製得的生物感測器S對SARS-CoV-2新型冠狀病毒的檢測特異性，遂進行以下試驗：
(A)分枝狀聚乙烯亞胺水溶液的濃度調整
本試驗係如第1表所示，先以濃度為95%的乙醇水溶液浸泡一玻璃試片，接著配製濃度為0.1wt%的分枝狀聚乙烯亞胺水溶液，以該分枝狀聚乙烯亞胺水溶液浸泡該玻璃試片，並於室溫下反應1小時之後清洗，將該玻璃試片再浸泡於2,4,6-三硝基芳基氧化酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)水溶液中，使2,4,6-三硝基芳基氧化酸與該玻璃試片表面的胺基反應，進而形成一發色基團(chromophore)，該發色基團在340nm的波長下具有最大吸光值。最終分析該玻璃試片(第A2組)於300~500nm之間的波長下的吸光值。
本試驗另以濃度為1.0wt%的分枝狀聚乙烯亞胺水溶液及濃度為2.5wt%的分枝狀聚乙烯亞胺水溶液取代前述之濃度為0.1wt%的分枝狀聚乙烯亞胺水溶液，以分別得到第A3、A4組的玻璃試片。
此外，本試驗另取未先以該乙醇水溶液浸泡處理的玻璃試片，直接將該玻璃試片浸泡於濃度為0.1wt%的分枝狀聚乙烯亞胺水溶液處理的玻璃試片作為第A1組的玻璃試片。
Figure 110135553-A0305-02-0018-1
請參照第4圖所示，未經該乙醇水溶液進行前處理的第A1組玻璃試片，由於該玻璃試片的表面未形成帶有負電荷之氫氧根離子，使分枝狀聚乙烯亞胺所形成的活性高分子層2無法結合於該玻璃試片的表面，因而在340nm的波長處未觀察到一特徵波峰(characteristic peak)，而先以該乙醇水溶液進行前處理的第A2~A4組玻璃試片在340nm的波長下均具有一波峰，顯示以濃度為0.1~2.5wt%的分枝狀聚乙烯亞胺水溶液均可以於該玻璃試片的表面形成帶有正電荷的胺基，即已於該玻璃試片的表面形成該活性 高分子層2。
(B)校正曲線的測試結果(一)
本試驗係分別取針對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白M(IgM)的標準品及針對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白G(IgG)的標準品，將前述二標準品稀釋成濃度分別為10-1、100、101、102及103ng/mL，接著以前述的方法進行檢測，以智慧型手機(iPhone 7 plus)拍攝所獲得的混合溶液的顏色，並依如下列式(一)的公式計算各混合溶液的灰度(grayscale)，再進行線性迴歸(linear regression)分析。其中，式一中的R、G、B分別指紅色值、綠色值及藍色值。
灰度=0.299×R+0.587×G+0.114×B 式(一)。
請參照第5圖所示，無論是使用針對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白M(IgM)，或使用SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白G(IgG)，均可以繪示出線性的校正曲線(calibration curve)，顯示以前述第一實施例的製造方法所製得的生物感測器S進行血液檢體的檢測，確實具有良好的線性度(linearity)。
(C)校正曲線的測試結果(二)
本試驗係分別取針對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白M(IgM)的標準品及針對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的人類免疫球蛋白G(IgG)標準品，將前述二標準品稀釋成濃度分別為101.0、101.5、102.0、102.5、103.0、103.5、104.0及104.5pg/mL，接著以前述的方法進行檢測，以光譜儀(SpectraMax M2)測定於450nm之波長下的吸光值，並進行線性迴歸(linear regression)分析。
請參照第6圖所示，繪示出的校正曲線的迴歸方程式 (regression equation)如下列式(二)所示，且該迴歸方程式的決定係數(coefficient of determination，R 2)為0.98838。
y=-2.69779+0.44698x 式(二)。
(D)血液檢體的測試結果
本試驗係取來自健康個體的血液檢體作為第D1組(共10個案例)、來自罹患其他疾病(如，A/B型流行性感冒、肺炎、肺結核、肺癌、肝癌等患者，該些患者具有發燒、咳嗽、喉嚨痛、流鼻水等疑似遭受SARS-CoV-2新型冠狀病毒感染的的感染症狀)的患者的血液檢體作為第D2組(共109個案例)及來自已確認遭受SARS-CoV-2新型冠狀病毒感染的患者的血液檢體作為第D3、D4組(共29個案例)。其中，第D3、D4組的血液檢體再同時以酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)及定量即時聚合酶連鎖反應法(RT-qPCR)確認該血液檢體中的免疫球蛋白M(IgM)及免疫球蛋白G(IgG)含量及病毒含量之後，區分為感染早期的第D3組(共8個案例)及感染中後期的第D4組(共21個案例)，接著以前述的方法進行檢測，以光譜儀(SpectraMax M2)測定於450nm之波長下的吸光值。
請參照第7圖所示，無論是來自健康個體的血液檢體(第D1組)或來自罹患其他疾病的患者的血液檢體(第D2組)，均難以測得對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白M(IgM)及對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白G(IgG)的存在，而在來自已確認遭受SARS-CoV-2新型冠狀病毒感染的患者的血液檢體(第D3、D4組)則可以測得對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白M(IgM)及對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白G(IgG)的存在，其中來自感染早期的患者的血液檢體(第D3組)的對SARS-CoV-2新型冠狀病 毒具有特異性的免疫球蛋白M(IgM)含量較高，且來自感染中後期的患者的血液檢體(第D4組)的對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白G(IgG)含量較高。
基於相同的技術概念之下，請參照第8圖所示，本發明之第二實施例的製造方法，同樣可以先提供該含矽基材1，接著於該含矽基材1上形成該活性高分子層2，再使數個捕捉生物分子3結合該活性高分子層2上。
於本實施例中，係以該玻璃片作為該含矽基材1，並且於室溫下，將該玻璃片浸泡於60~99.8%的乙醇水溶液(乙醇濃度為60~99.8%)中1小時，使該玻璃片的相對二表面均形成氫氧根離子，換言之，於本實施例中，該玻璃片之形成帶有負電荷的氫氧根離子的相對二表面均對應該含矽基材1的表面11。接著，再於室溫下，將該玻璃片浸泡於該分枝狀聚乙烯亞胺水溶液(0.1wt%)中2小時，使分枝狀聚乙烯亞胺形成帶有胺基所形成的正電荷的二活性高分子層2，並分別以該結合表面21靜電結合該玻璃片的相對二表面(即，該含矽基材1的二表面11)。
值得注意的是，該第二實施例的製造方法中，各該捕捉生物分子3並非直接結合該活性高分子層2的活性表面22，而是分別藉由一貴金屬奈米粒子5間接地結合該活性高分子層2的活性表面22。
詳而言之，工者可以選用帶有負電荷的貴金屬奈米粒子5，使該貴金屬奈米粒子5能夠靜電結合帶有正電荷的活性高分子層2的活性表面22，且由於該貴金屬奈米粒子5能夠與該捕捉生物分子3之間形成共價鍵結(covalent bond)，即能夠藉由該貴金屬奈米粒子5使該數個捕捉生物分子3結合該活性高分子層2的活性表面22。舉例而言，該貴金屬奈米粒子5可以選自由金奈米粒子、鉑奈米粒子、銀奈米粒子及鈀奈米粒子所組成的群組。
又，工者可以先使該貴金屬奈米粒子5靜電結合該活性高分子 層2的活性表面22，續使該捕捉生物分子3共價結合該貴金屬奈米粒子5；或可以使該貴金屬奈米粒子5與該捕捉生物分子3共價結合而形成一複合物(complex)之後，再使該複合物中的貴金屬奈米粒子5靜電結合該活性高分子層2的活性表面22，進而使該捕捉生物分子3可以經由該貴金屬奈米粒子5而間接地結合該活性高分子層2的活性表面22，此為本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以依據需求而自行調整，於此不加以限制。
於本實施例中，係將一檸檬酸鈉(sodium citrate，Na3C6H5O7)水溶液(10mL，38.8M)加入沸騰的四氯金酸(chloroauric acid，H[AuCl4])水溶液中(溫度約為100℃)，在混合溶液的顏色自淺黃色變為酒紅色之後，將該混合溶液緩緩冷卻至室溫，即可以形成尺寸介於10~50nm之間的數個金奈米粒子，最終工者可以清洗該數個金核，並且重新將該數個金奈米粒子懸浮於去離子水中備用，以得一金奈米粒子懸浮液。
接著，於室溫下，將前述之玻璃片浸泡於0.5mL的金奈米粒子懸浮液中，使該數個金奈米粒子可以靜電結合該活性高分子層2的活性表面22，在以去離子水清洗之後，再將該玻璃片浸泡於0.5mL的抗體溶液(含濃度為500ng/mL的硫醇化兔子抗FXYD3多株抗體，溶於磷酸鹽緩衝液中)中，於室溫下反應2小時，使該兔子抗FXYD3多株抗體可以與該數個金奈米粒子之間形成共價鍵結，並藉由該數個金奈米粒子而結合該活性高分子層2的活性表面22，即可以獲得如第8圖所示的生物感測器S。
此外，工者同樣可以再以該阻斷溶液處理該玻璃片，以於該活性表面22的裸露區22b(即，未結合有該貴金屬奈米粒子5的區域)覆蓋該阻斷層4。於本實施例中，係於室溫下，以1mL的牛血清白蛋白水溶液(含2wt%的牛血清白蛋白)浸泡該玻璃片1小時，即可以在位於該玻璃片的相對二表面的二活性高分子層2的活性表面22的裸露區22b上分別形成該阻斷層 4，再以三羥甲基胺基甲烷緩衝液清洗，即獲得如第9圖所示的生物感測器S。
依據前述第二實施例的製造方法所製得的生物感測器S的使用方法如下：
探針溶液的配製：工者先將10μL的硫醇化兔子抗FXYD3多株抗體(10ng/μL)及10μL的辣根過氧化酶(HRP，20mg/mL)加入前述的金奈米粒子懸浮液中，於室溫下避光反應2小時，使該硫醇化兔子抗FXYD3多株抗體及該辣根過氧化酶(HRP)結合該金奈米粒子之後，以12,000rpm的轉速下離心10分鐘，並且去除上清液，最後加入200μL的牛血清白蛋白水溶液(含2wt%的牛血清白蛋白)，反應30分鐘後，再次以12,000rpm的轉速下離心10分鐘，並且去除上清液，最終以200μL的三羥甲基胺基甲烷緩衝液(含0.1%聚山梨醇酯20)清洗，去除上清液之後，將所得的探針顆粒重新懸浮於200μL的磷酸鹽緩衝液中，即獲得該探針溶液。
清洗溶液的配製：含0.001%聚山梨醇酯20(polysorbate 20，Tween 20)的三羥甲基胺基甲烷(tri(hydroxymethyl)aminomethane，Tris)緩衝液。
色素原(chromogen)溶液的配製：該色素原溶液包含濃度為0.5mg/mL的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)及濃度為0.5%的過氧化氫(hydrogen peroxide，H 2 O 2)，溶於濃度為0.1M、pH值為5.5的醋酸鈉水溶液中。
終止試劑的配製：該終止試劑為濃度為1M的鹽酸水溶液。
檢體的採樣：為了要以該生物感測器S確認一疑似患者是否罹患泌尿道上皮細胞癌(urothelial carcinoma，UC)，所使用的檢體可以為來自該疑似患者的全血檢體、血清檢體、血漿檢體、尿液檢體等各種檢體，於本實施例中，為便於泌尿道上皮細胞癌的即時檢測，係選用清潔獲取的尿液檢 體(clean-catch urine sample)，取得該尿液檢體後，需於4℃之溫度下，以5,000rpm的轉速離心10分鐘，取得的沉澱物(precipitate)再以蛋白質萃取溶液(PROPREP protein extraction solution，購自iNtRON Biotechnology,Inc.，Cat.No.17081)處理15分鐘，以裂解細胞之後，立刻再於4℃之溫度下，以13,000rpm的轉速離心10分鐘，取得的上清液即可以貯存於-80℃備用。
請參照第10圖所示，該生物感測器S的操作流程如下：
將如第9圖所示的生物感測器S黏在一瓶蓋C的內側，使當該瓶蓋C結合一瓶身時，該捕捉生物分子3可以朝向該瓶身。
接著，將0.15mL的探針溶液加入一塑膠瓶身B1中，再加入0.05mL的尿液檢體之後，以該瓶蓋C結合該塑膠瓶身B1。在上下倒置之後，於室溫下靜置15分鐘，使該探針溶液中的探針顆粒能夠與該檢體中的FXYD3蛋白質特異性結合，進而與該玻璃瓶的內表面上的捕捉生物分子3(兔子抗FXYD3多株抗體)特異性結合。
開啟該瓶蓋C之後，使該瓶蓋C結合另一塑膠瓶身B2(該塑膠瓶身B2中裝填有1mL的清洗溶液)，再次上下倒置，以清洗黏在該瓶蓋C內側的生物感測器S。
接著再使該瓶蓋C結合一玻璃瓶身B3(該玻璃瓶身B3中裝填有有0.2mL的色素原溶液)，再次上下倒置，靜置2分鐘以觀察該玻璃瓶身B3中的混合溶液的顏色變化，此時，在辣根過氧化酶(HRP)的作用下，該玻璃瓶身B3中的混合溶液會逐漸呈現深藍色。
最後，於呈現深藍色的混合溶液中加入該終止試劑，此時深藍色的混合溶液會在該終止試劑的作用下轉變為黃色，如此，工者即可以用肉眼觀察該混合溶液的顏色變化，或者以光譜儀測定於特定波長(如450nm)下的吸光值的變化。
在使用依據前述第二實施例的製造方法所製得的生物感測器S的狀況下，若是該疑似患者確實罹患泌尿道上皮細胞癌，該捕捉生物分子3(兔子抗FXYD3多株抗體)即可以捕捉該疑似患者的檢體中的FXYD3蛋白質，並進一步與辣根過氧化酶(HRP)反應，因而當加入該色素原溶液時，該色素原溶液即會受到辣根過氧化酶(HRP)的作用而發生顏色的變化，換言之，該玻璃瓶中的混合溶液的顏色如最終轉變為藍色，則顯示該疑似患者的檢體中確實包含FXYD3蛋白質，即代表該疑似患者確實罹患泌尿道上皮細胞癌。
為了測試依據前述第二實施例的製造方法所製得的生物感測器S對泌尿道上皮細胞癌的生物標記(FXYD3蛋白質)的檢測特異性，遂進行以下試驗：
(E)貴金屬奈米粒子的結合
本試驗係如第2表所示，將該活性高分子層2(由分枝狀聚乙烯亞胺所形成)形成於該含矽基材1(玻璃片)上，以得到第E1組玻璃試片，及在將該活性高分子層2(由分枝狀聚乙烯亞胺所形成)形成於該含矽基材1(玻璃片)上之後，再使該貴金屬奈米粒子5(前述之金奈米粒子)靜電結合該活性高分子層2的活性表面22，以得到第E2組玻璃試片。
Figure 110135553-A0305-02-0025-2
接著，由於該金奈米粒子的區域表面電漿共振(localized surface plasmon resonance，LSPR)特性，能夠產生位於520nm位置之特徵 吸收峰(characteristic absorption peak)(如Huang等人於2020年發表之《Rapid Detection of IgM Antibodies against the SARS-CoV-2 Virus via Colloidal Gold Nanoparticle-Based Lateral-Flow Assay》期刊論文所載)，故分析各組玻璃試片於400~650nm之間的波長下的吸光值。
請參照第11圖所示，第E2組玻璃試片在520nm的波長下具有一波峰，顯示該貴金屬奈米粒子5(該金奈米粒子)確實已靜電結合該活性高分子層2的活性表面22。
(F)捕捉生物分子的結合
本試驗係如第3表所示，在將該活性高分子層2(由分枝狀聚乙烯亞胺所形成)形成於該含矽基材1(玻璃片)上之後，再使該貴金屬奈米粒子5(前述之金奈米粒子)靜電結合該活性高分子層2的活性表面22之後，以該阻斷溶液(牛血清白蛋白水溶液)形成該阻斷層4，以得到第F1組玻璃試片，及在使該貴金屬奈米粒子5(前述之金奈米粒子)靜電結合該活性高分子層2的活性表面22之後，另使該捕捉生物分子3(兔子抗FXYD3多株抗體)共價結合該貴金屬奈米粒子5之後，以該阻斷溶液(牛血清白蛋白水溶液)形成該阻斷層4，以得到第F2組玻璃試片。
Figure 110135553-A0305-02-0026-3
接著，以標記有綠色螢光標籤的山羊抗兔二級抗體(goat anti-rabbit iFluor 488 secondary antibody)分別處理各組玻璃試片，以使該綠色螢光標籤標記該捕捉生物分子3，最終拍攝各組玻璃試片的螢光影像。
請參照第12、13圖所示，第F1組玻璃試片上幾乎無法觀察到綠色螢光訊號，而第F2組玻璃試片上則可以觀察到均勻的綠色螢光訊號，顯示該捕捉生物分子3(兔子抗FXYD3多株抗體)已藉由該貴金屬奈米粒子5均勻地分布在該玻璃試片上，而在F1組別並無顯現明顯的二抗綠色螢光，證實本生物感測器具有良好的抗干擾減少非特異性分子結合之能力。
(G)表面粗糙度的變化
本試驗係如第4表所示，取未經處理的含矽基材1(玻璃片)作為第G1組玻璃試片，將該活性高分子層2(由分枝狀聚乙烯亞胺所形成)形成於該含矽基材1(玻璃片)上，以形成第G2組玻璃試片，在將該活性高分子層2(由分枝狀聚乙烯亞胺所形成)形成於該含矽基材1(玻璃片)上之後，再使該貴金屬奈米粒子5(前述之金奈米粒子)靜電結合該活性高分子層2的活性表面22，以得到第G3組玻璃試片，在使該貴金屬奈米粒子5(前述之金奈米粒子)靜電結合該活性高分子層2的活性表面22之後，另使該捕捉生物分子3(兔子抗FXYD3多株抗體)共價結合該貴金屬奈米粒子5，以得到第G4組玻璃試片，及在使該捕捉生物分子3(兔子抗FXYD3多株抗體)共價結合該貴金屬奈米粒子5之後，以該阻斷溶液(牛血清白蛋白水溶液)形成該阻斷層4，以得到第G5組玻璃試片。
Figure 110135553-A0305-02-0028-4
接著，以原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)分析各組玻璃試片的表面粗糙度(surface roughness)。
請參照第14圖所示，第G1組玻璃試片的中心線平均粗糙度(roughness average，Ra)為0.149nm，第G2組玻璃試片的中心線平均粗糙度為0.252nm，第G3組玻璃試片的中心線平均粗糙度為2.662nm，第G4組玻璃試片的中心線平均粗糙度為2.786nm，且第G5組玻璃試片的中心線平均粗糙度為2.539nm，顯示在大量的貴金屬奈米粒子5及捕捉生物分子3位於該玻璃試片的表面時，會大幅提升該玻璃試片的表面粗糙度，而該阻斷層4的形成則會表面該玻璃試片的粗糙度減少。
(H)校正曲線的測試結果
本試驗係取FXYD3蛋白質(即，泌尿道上皮細胞癌的生物標記)的標準品，並將該標準品加入來自一健康個體，且不含的FXYD3蛋白質一尿液檢體中，使該標準品的濃度分別為1、2.5、10、100、500及1,000pg/mL，接著以前述的方法進行檢測，以光譜儀測定於450nm之波長下的吸光值，並進行線性迴歸(linear regression)分析。
請參照第15圖所示，隨著該尿液仿檢體中的FXYD3蛋白質濃度增加，所測得的於450nm之波長下的吸光值亦有所增加，且線型迴歸分析所得的校正曲線的迴歸方程式如下列式(三)所示，該迴歸方程式的決定係數(R2)為0.9960。
y=-0.01265+0.24182x 式(三)。
(I)尿液檢體的測試結果
本試驗係收集標準臨床治療(standard clinical practice)前經由臨床膀胱鏡(cystoscopy)檢查和組織切片(biopsy)診斷為泌尿道上皮細胞癌的患者。其中，以來自健康個體的尿液檢體作為第I1組(共4個案例)、來自罹患低惡性泌尿道上皮細胞癌(low-grade UC)的個體的尿液檢體作為第I2、I3組(共6個案例，其中包含第I2組的罹患的下泌尿道膀胱癌的4個案例及第I3組的罹患上泌尿道上皮癌的2個案例)及來自罹患高惡性泌尿道上皮細胞癌(high-grade UC)的個體的尿液檢體作為第I4、I5組(共30個案例，其中包含第I4組的罹患的下泌尿道膀胱癌的19個案例及第I5組的罹患上泌尿道上皮癌的11個案例)。
接著，以前述的方法進行檢測，以光譜儀測定於450nm之波長下的吸光值，並計算各尿液檢體中的FXYD3蛋白質的濃度；另以酶聯免疫 吸附試驗法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)所測得之於450nm之波長下的吸光值作為對照，並計算各尿液檢體中的FXYD3蛋白質的濃度。
請參照第16圖所示，無論是來自健康個體的尿液檢體(第I1組)或來自罹患泌尿道上皮細胞癌T4期的個體的尿液檢體(第I2~I7組)，各尿液檢體以前述的方法進行檢測，或以酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)進行檢測，所測得的FXYD3蛋白質的濃度均為相似。
依據上述試驗數據可以得知，本發明的製造方法所製得的生物感測器S確實具有良好的靈敏度(sensitivity)，因此僅需要5~50μL的血液檢體(或尿液檢體)即可以檢測其中的目標生物分子〔對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白M(IgM)、對SARS-CoV-2新型冠狀病毒具有特異性的免疫球蛋白G(IgG)或FXYD3蛋白質〕，相較於傳統的定量即時聚合酶連鎖反應法(RT-qPCR)，藉由使用本發明的製造方法所製得的生物感測器S的檢測方法，不僅操作簡單、反應時間亦較短，更無須使操作者暴露於感染的風險下；且相較於傳統的酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)，藉由使用本發明的製造方法所製得的生物感測器S的檢測方法，檢測的成本較低，且更可以大幅縮減反應時間至15分鐘以內，且檢測結果僅需要以肉眼即可以直接判斷。
綜上所述，本發明的生物感測器的製造方法中，藉由該乙醇溶液的使用，即可以使該含矽基材的至少一表面帶有負電荷，而毋須使用強酸或強鹼，不僅可以提升工者的工作環境安全，亦可以降低強酸、強鹼廢液的處理成本，更可以防止強酸、強鹼廢液的排出對環境生物或建築物等所產生的不良影響，為本發明之功效。
再且，本發明的生物感測器的製造方法中，藉由該乙醇溶液的 使用，即可以使該含矽基材的該至少一表面帶有負電荷，而毋須使用如氧氣電漿清洗機等特殊儀器，亦可以免除進行氧氣電漿處理所需要的高溫、高壓環境，有助於達成降低該生物感測器的製造成本之功效。
此外，本發明的生物感測器，由於係藉由前述生物感測器的製造方法所製得，且所選用的基材為該含矽基材(如，一玻璃基材、一二氧化矽基材、一石英基材或一矽氧烷基材)，換言之，該生物感測器非屬於塑膠製品，且可以經熔融後回收再利用；又，於製造該生物感測器的過程無使用該強酸溶液或該強鹼溶液，使該生物感測器屬於環境友善性商品(environmentally friendly good)，為本發明之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
1:含矽基材
11:表面
2:活性高分子層
21:結合表面
22:活性表面
22a:覆蓋區
22b:裸露區
3:捕捉生物分子
S:生物感測器

Claims (19)

  1. 一種生物感測器的製造方法，包含：提供一含矽基材，該含矽基材具有至少一表面；以濃度為60~99.8%的一乙醇水溶液處理該含矽基材，使該含矽基材的該至少一表面帶有負電荷；於該含矽基材的該至少一表面上形成帶有正電荷的至少一活性高分子層，各該至少一活性高分子層具有相對之一結合表面及一活性表面，該至少一活性高分子層以該結合表面結合該含矽基材；及使數個捕捉生物分子結合該至少一活性高分子層的該活性表面。
  2. 如請求項1之生物感測器的製造方法，其中，各該數個捕捉生物分子分別帶有負電荷，使該數個捕捉生物分子分別靜電結合該至少一活性高分子層的該活性表面。
  3. 如請求項2之生物感測器的製造方法，其中，該數個捕捉生物分子結合該至少一活性高分子層的該活性表面的一覆蓋區，且該至少一活性高分子層的該活性表面另包含一裸露區。
  4. 如請求項3之生物感測器的製造方法，另包含使一阻斷層覆蓋該至少一活性高分子層的該活性表面的該裸露區。
  5. 如請求項1之生物感測器的製造方法，其中，各該數個捕捉生物分子分別藉由數個貴金屬奈米粒子結合該至少一活性高分子層的該活性表面。
  6. 如請求項5之生物感測器的製造方法，其中，各該數個貴金屬奈米粒子分別帶有負電荷，使該數個貴金屬奈米粒子分別靜電結合該至少一活性高分子層的該活性表面。
  7. 如請求項6之生物感測器的製造方法，其中，各該數個捕捉 生物分子分別共價結合該數個貴金屬奈米粒子。
  8. 如請求項5之生物感測器的製造方法，其中，該數個貴金屬奈米粒子結合該至少一活性高分子層的該活性表面的一覆蓋區，且該至少一活性高分子層的該活性表面另包含一裸露區。
  9. 如請求項8之生物感測器的製造方法，另包含使一阻斷層覆蓋該至少一活性高分子層的該活性表面的該裸露區。
  10. 如請求項1~9中任一項之生物感測器的製造方法，其中，該至少一活性高分子層的該活性表面具有一官能基，且該官能基係選自由胺基及銨根所組成之群組。
  11. 如請求項10之生物感測器的製造方法，其中，各該至少一活性高分子層係由一高分子所形成，且該高分子係選自由聚乙烯亞胺、聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚β-胺基酯、聚二烯二甲基氯化銨及聚丙烯醯胺所組成之群組。
  12. 如請求項11之生物感測器的製造方法，其中，該聚乙烯亞胺為線性聚乙烯亞胺或分枝狀聚乙烯亞胺。
  13. 如請求項11之生物感測器的製造方法，其中，該聚β-胺基酯為線性聚β-胺基酯或分枝狀聚β-胺基酯。
  14. 一種由如請求項1~13中任一項之生物感測器的製造方法所製成的生物感測器，包含：一含矽基材，具有至少一表面；至少一活性高分子層，分別具有相對之一結合表面及一活性表面，該至少一活性高分子層分別以該結合表面結合該含矽基材的該至少一表面；及數個捕捉生物分子，結合該至少一活性高分子層的該活性表面。
  15. 如請求項14之生物感測器，其中，該至少一活性高分子層的該活性表面包含一覆蓋區及一裸露區，且該數個捕捉生物分子結合該至少一 活性高分子層的該活性表面的該覆蓋區。
  16. 如請求項15之生物感測器，其中，一阻斷層覆蓋該裸露區。
  17. 如請求項14之生物感測器，其中，各該數個捕捉生物分子分別藉由數個貴金屬奈米粒子結合該至少一活性高分子層的該活性表面。
  18. 如請求項17之生物感測器，其中，該至少一活性高分子層的該活性表面包含一覆蓋區及一裸露區，且該數個貴金屬奈米粒子結合該至少一活性高分子層的該活性表面的該覆蓋區。
  19. 如請求項18之生物感測器，其中，一阻斷層覆蓋該裸露區。
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