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TWI736911B - 新穎顆粒丙酸桿菌菌株，及用於預防或治療包含該菌株或其培養物的痤瘡之成分 - Google Patents

新穎顆粒丙酸桿菌菌株，及用於預防或治療包含該菌株或其培養物的痤瘡之成分 Download PDF

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TWI736911B
TWI736911B TW108120894A TW108120894A TWI736911B TW I736911 B TWI736911 B TW I736911B TW 108120894 A TW108120894 A TW 108120894A TW 108120894 A TW108120894 A TW 108120894A TW I736911 B TWI736911 B TW I736911B
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朴漢洙
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南韓商韓國億諾生物有限公司
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Abstract

本發明係關於顆粒丙酸桿菌(Cutibacterium granulosum) GENSC02菌株(KCTC 13597BP)。本發明亦係關於包含該菌株或其培養物之組合物，及其用途。本發明可有效地改善、預防或治療痤瘡、異位性皮膚炎或由細粉塵導致之皮膚發炎。

Description

新穎顆粒丙酸桿菌菌株，及用於預防或治療包含該菌株或其培養物的痤瘡之成分
本申請案主張基於2018年8月23日提交之韓國專利申請案第10-2018-0098880號之優先權益，並且該申請案中揭示之全部內容以引用方式併入本文。本發明係關於新分離、鑑別並且針對其功效來進行評價之新菌株及其培養物。另外，本發明係關於包含此新菌株或其培養物的組合物。更具體而言，本發明係關於具有各種效應諸如皮膚改善效應包括痤瘡改善效應及其類似效應之化妝品組合物，該組合物包含新穎菌株或其培養物。
當皮膚中之發炎反應由物理刺激或化學品、細菌及其類似物引起時，該發炎反應作為抗禦皮膚破壞的作用而開始，並且牽涉到各種免疫細胞及發炎誘導細胞介素。IL-6(介白素-6)、IL-8(介白素-8)、IL-1β(介白素-β)及類似物質為代表性發炎誘導細胞介素。IL-1β係由活化單核吞噬細胞、上皮細胞、或血管內皮細胞產生並且介導發炎反應之典型細胞介素，並且IL-6係由T細胞及巨噬細胞釋放並且刺激免疫反應並且控制發炎反應之細胞介素。另外，活化巨噬細胞過量地產生氧化氮(NO)或前列腺素E2(PGE2)以及發炎誘導細胞介素，由此進一步激活發炎過程。例如，對於發炎細胞介素之刺激作出反應，在各種細胞諸如末梢血液單核球、組織巨噬細胞、NK細胞、纖維母細胞、血管內皮細胞、及其類似細胞中誘導IL-8表現。
與增加之(例如，過度)IL-8水準相關之發炎疾病包括發炎疾病諸如痤瘡、發炎性角化病(例如，牛皮癬)、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎、及其類似疾病。
異位性皮膚炎(atopic dermatitis; AD)為伴隨有發癢之發炎皮膚病，並且其為慢性的並且其通常在嬰兒期開始。AD具有不斷發癢作為主要症狀，並且具有沒有特定原因的反覆康復及惡化之性質。儘管最近對於AD進行了許多研究，但是直到現在AD之病因還不清楚。
痤瘡係指皮膚之皮脂腺之發炎疾病。痤瘡或其痤瘡痘印可由生活在皮膚中之細菌引起，並且與腸道細菌一樣，當平衡被破壞時，可導致皮膚炎。
已知金黃色葡萄球菌作用於上皮細胞以破壞皮膚屏障功能或充當T細胞上之超抗原來誘導發炎反應。
已經報道金黃色葡萄球菌之移生及發炎代表性地誘導異位性皮膚炎及濕疹性皮膚炎之惡化並且在作為長期慢性發炎而進展時引起哮喘及食物過敏的研究。另外，已報道在針對患有皮膚疾病諸如毛囊炎、癤病、膿皰瘡、甲溝炎、臁瘡及其類似疾病之患者來培養之微生物中大量地偵測到金黃色葡萄球菌。已知金黃色葡萄球菌在臨床上與除了異位性疾病以外之各種發炎性皮膚疾病相關(1. Atopic dermatitis and the atopic march. J. Allergy Clin. Immunol.2003, 2. Antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus strains responsible for community-acquired skin infections. Ann Dermatol Venereol. 2008)。
另一方面，眾所周知絲聚蛋白之缺少及絲聚蛋白基因之修飾與異位性皮膚炎之發生及進展密切相關。
絲聚蛋白係包含在構成皮膚屏障之角質細胞中之保濕成分，並且係在與蛋白質諸如角蛋白、苞蛋白、兜甲蛋白、及其類似蛋白質一起形成角質層中起重要作用之蛋白質。絲聚蛋白表現量之減少引起皮膚屏障之功能及保濕之變化並且導致各種病變。具體而言，正常皮膚屏障之形成在針對外部刺激之防禦中起重要作用，並且當此功能喪失時，此情況在異位病之進展中起關鍵作用。絲聚蛋白係有效改善異位性皮膚炎之靶標，因為抗原經由皮膚之吸收係異位性皮膚炎增加中之重要因素。
此外，在一項最近研究中，已報道密連蛋白1基因(密連蛋白1，CDN1 )之表現異常以及異位性皮膚炎患者之絲聚蛋白之效應與異位性皮膚炎密切相關。
另一方面，已知顆粒丙酸桿菌(Cutibacterium granulosum) 為源自皮膚菌群之細菌中之一者，並且直到現在，被認為係許多感染之致病細菌(病原體)。
本發明之發明人尤其在各種皮膚疾病之中進行減輕痤瘡之研究，由此達成本發明。
[技術問題]
因此，為了解決以上問題，本發明使用在過去僅被認為係病原體之顆粒丙酸桿菌及新穎顆粒丙酸桿菌菌株來提供用於改善皮膚病狀之組合物。
本發明提供使用顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物作為活性成分來改善、治療或減輕痤瘡或發炎性皮膚疾病之用途，或用於改善異位性皮膚炎症狀之用途。本發明提供包含顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株或其培養物的用於改善、治療或減輕異位性皮膚炎症狀、痤瘡及發炎性皮膚疾病之組合物。具體而言，提供用於改善、治療或減輕由細粉塵造成之發炎性皮膚疾病的組合物。
本發明提供顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株或其培養物，及包含其之化妝品組合物，並且提供顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株或其培養物之新穎用途。
本發明提供使用顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株或其培養物作為活性成分來抑制、改善、治療或減輕發炎性皮膚疾病諸如異位性皮膚炎症狀、痤瘡或毛囊炎、及其類似疾病之用途。本發明提供用於改善、治療或減輕痤瘡、毛囊炎及發炎性疾病之組合物，該組合物包含顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株或其培養物。
本發明提供經由皮膚屏障增強而具有皮膚保濕效應之組合物，該組合物包含顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株或其培養物。 [技術解決方案]
本發明之一實施例提供顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(登錄號KCTC 13597BP)。
本發明之一實施例提供顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(登錄號KCTC 13597BP)之培養物。
直到現在，顆粒丙酸桿菌被認為係導致感染性疾病之病原體。然而，引起關注地，已經確認本發明之GENSC02菌株或其培養物不僅不具有皮膚毒性，而且實情為適用於皮膚病狀改善，由此完成本發明。
菌株具有對由微生物產生之生物膜進行移除或抑制形成之效應，並且具有抗細菌活性。
具體而言，菌株或菌株之培養物具有痤瘡抑制活性並且可預防痤瘡致病細菌之生長。
根據本發明之一實施例，本發明之顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株為駐留在皮膚中之微生物，並且已經由16S rDNA序列分析及API測試來確認其為屬於顆粒丙酸桿菌之新穎菌株。菌株在2018年7月24日寄存在韓國生物科學及生物技術研究所韓國菌種保存中心(KCTC)並且獲得登錄號KCTC 13597BP。
根據一實施例，本發明之一實施例之顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物可顯示針對金黃色葡萄球菌或痤瘡桿菌之抗細菌活性。
金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌之移生及感染可導致痤瘡及各種皮膚炎症。金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌之移生及感染可導致痤瘡、毛囊炎或狐臭或足臭、及其類似疾病或使該等疾病惡化，但是本發明之顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物可抑制金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌之生長，並且具有針對金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌之抗細菌活性。
在一個實施例中，本發明之顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物可不僅展現微生物之生長之抑制效應，而且展現對由微生物產生之生物膜進行移除或抑制形成之效應。
在一個實施例中，顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物可具有抑制、改善或治療異位性皮膚炎、痤瘡或發炎性皮膚疾病之活性。具體而言，提供改善、治療或減輕由細粉塵導致之發炎性皮膚疾病的組合物。
在一個實施例中，顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物具有皮膚保濕活性。在一個實施例中，可提供包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物作為活性成分之皮膚保濕組合物。
在一個實施例中，本發明提供包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物作為活性成分之抗細菌組合物。
在一個實施例中，本發明提供治療、預防或改善異位性皮膚炎、痤瘡或發炎性皮膚疾病之組合物，其包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物。具體而言， 提供改善、治療或減輕由細粉塵導致之發炎性皮膚疾病的組合物。
在一個實施例中，本發明提供包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物作為活性成分之皮膚保濕組合物。
本發明之術語「培養物」意謂藉由在一段時間內、在能夠供應營養素以使得顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株可生長並存活之培養基中培養菌株來獲得之包含菌株、菌株提取物、其代謝物、額外營養素及類似物質之總培養基，但是包括在培養菌株之後將菌株消除之培養液。
培養液可僅意謂除了藉由將其留置一段時間而導致下沉的底層以外，所收集之上層液體，或微生物細胞經由過濾來移除之培養液，或僅意謂經離心以移除下部沉澱物之上部液體。培養液可藉由以常見方法來濃縮而用作濃縮物。
培養液或培養液之濃縮物可藉由以常見方法來乾燥而作為乾燥材料來提供。
除非另外提及，否則本文提及之「培養物」可包括微生物細胞之培養液、培養液之濃縮物、培養液或濃縮物之乾燥材料。在一些情況下，培養物可包含微生物細胞，並且可不包含它，並且是否包含微生物細胞不特別造成問題。
「微生物細胞」意謂本發明之菌株本身，並且包括經分離及選擇之菌株本身或藉由培養菌株而自培養液中分離之菌株。微生物細胞可藉由藉助於離心來收集底部沉下部分而獲得，或可藉由將其留置一段時間並且移除上部液體來獲得，因為由於重力而導致該細胞沉下至培養液之底層。
根據一實施例，本發明之顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株之培養物可在用於微生物培養之培養基之中使用容易由熟習此項技術者根據目的來選擇之培養基，並且較佳地，可使用用於丙酸桿菌 培養之培養基，並且更佳地，可使用RCM(增強梭菌培養基)培養基、TSB(胰蛋白酶大豆肉湯)或BHI(腦心浸液)培養基，但是不限於此。
根據本發明之一特定實施例，本發明之顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株之培養物可藉由藉助於在此項技術中已知之微生物培養方法(例如，靜置培養等)將本發明之菌株接種在微生物培養基中來製備。
顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株之培養物可包括培養液或培養液之濃縮物、及其乾燥材料，並且濃縮物或乾燥材料可藉由在此項技術中已知之微生物或培養液之濃縮或乾燥方法來容易地製備。
根據本發明之一實施例，提供包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物之組合物，並且較佳地提供化妝品組合物、食品組合物或醫藥組合物。
化妝品組合物或醫藥組合物可用作皮膚外用製劑，並且可直接塗佈至患病區域。例如，可製備成各種形式諸如軟膏、乳劑、乳狀液及其類似形式。
在其他實施例中，醫藥組合物可藉由經口或非經腸投與來吸收至體內，並且例如，可以非限制性形式諸如散劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑及其類似形式來投與。化妝品組合物或醫藥組合物之形式不特別受到限制。
化妝品組合物可抑制或改善異位性皮膚炎或發炎性皮膚疾病，並且可有效地移除或減少體臭(例如，足臭、狐臭)。
發炎性皮膚疾病之實例包括發炎性角化病(例如，牛皮癬)、毛囊炎、細菌性皮膚炎、膿皰病、毛囊炎性脫髮及其類似疾病。
根據本發明之一實施例之化妝品組合物可強化皮膚屏障並且增強皮膚保濕。換言之，本發明之一實施例提供包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(KCTC 13597BP)或菌株之培養物的皮膚保濕組合物。
化妝品組合物可具有針對金黃色葡萄球菌或痤瘡桿菌之抗細菌活性。因此，本發明之一實施例提供包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(KCTC 13597BP)或菌株之培養物之抗細菌組合物。 [有利效應]
本發明提供極好用於痤瘡改善之新穎顆粒丙酸桿菌菌株。另外，該菌株具有改善異位性症狀之極好效應。
本發明確認新穎顆粒丙酸桿菌菌株，並且發現使用該菌株或其培養物來改善皮膚症狀的效應。因此，本發明可提供具有皮膚改善功能之新穎顆粒丙酸桿菌菌株。另外，本發明提供用於改善異位性皮膚炎及痤瘡，改善發炎性皮膚疾病諸如發炎性角化病、毛囊炎、細菌性皮膚炎、膿皰病、毛囊炎性脫髮、及其類似疾病，及抑制性治療或減輕足臭或狐臭的組合物，該組合物包含新穎顆粒丙酸桿菌菌株或其培養物。此外，本發明提供用於皮膚保濕之化妝品組合物，該組合物包含新穎顆粒丙酸桿菌菌株或其培養物。本發明提供用於減輕由細粉塵導致之皮膚發炎的化妝品組合物，該組合物包含新穎顆粒丙酸桿菌菌株或其培養物。
在下文，本發明藉由以下實例及其類似實例來描述以便更具體地對本發明進行描述。然而，根據本發明之實例可修改成各種其他形式，並且本發明之範圍不應被視為限於以下描述之實例。示例性地提供本發明之實例以便促進本發明之具體理解。[ 實例 1] 分離及 鑑別顆粒丙酸桿菌 GENSC02 1-1. 分離菌株
源自皮膚之細菌分離自從未患有皮膚疾病諸如異位病、牛皮癬或痤瘡及其類似疾病，或在過去6個月中不具有與該等疾病相關之治療史的成人來執行。為了收集皮膚樣品，未洗滌的臉頰及鼻翼藉由以滅菌水來濕潤之無菌拭子用力擦試。將拭子直接密封在含有增強梭菌培養基(RCM)之試管中，並且試管用氮氣填充並且在37℃下培育48至72小時。藉由用白金環來採集含有培養拭子之試管之培養基，將該培養基塗抹在RCM瓊脂板上，並且此操作重複3至4次以分離純的菌落。 1-2. 鑑別菌株 1) 使用API套組之生物鑑別
作為生化鑑別經分離之菌株之方法，使用厭氧細菌API 20A套組(biomerieux Co., France)。在37℃下在10ml之RCM液體培養基中培養24小時、然後離心之後，將培養基移除。用PBS洗滌2至3次，然後使用包含在套組中之培養基、根據製造商提供之協定OD600 =3重懸之後，以合適量分裝至API 20A套組之每個孔並且在37℃下厭氧培養24小時，然後讀取。
最終結果在鑑別程式、API網路中鑑別，並且結果展示於下表1中。作為API 20A之鑑別結果，該菌株顯示與顆粒丙酸桿菌(Propionibacterium (=Cutibacterium) granulosum) 相同生化性質。
API 20A讀取結果展示於下表1中。 [表1]
編號 碳水化合物 利用
0 L-色胺酸 -
1 脲 -
2 D-葡萄糖 +
3 D-甘露糖醇 -
4 D-乳糖(牛來源) -
5 D-甘蔗糖 (蔗糖) +
6 D-麥芽糖 +
7 柳苷 -
8 D-木糖 -
9 L-阿拉伯糖 -
10 明膠(牛來源) -
11 七葉苷檸檬酸鐵 -
12 甘油 +
13 D-纖維二糖 -
14 D-甘露糖 +
15 D-松三糖 -
16 D-棉子糖 -
17 D-山梨醇 -
18 L-鼠李糖 -
19 D-海藻糖 +
2) 藉由經由16s rRNA基因序列來收集經鑑別及分離之菌株之1ml之純培養液並且請求Macrogen，確定16s RNA基因序列。PCR引子為16s rRNA基因之通用引子，27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')及1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')，並且785F(5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3')及907R(5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3')用於測序。經分離之菌株之16s rRNA序列展示在第1圖中。基於以上結果，菌株被命名為「顆粒丙酸桿菌GENSC02」菌株，並且在2018年7月24日寄存在韓國生物科學及生物技術研究所韓國菌種保存中心(Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology Korean Collection for Type Cultures; KCTC)並且獲得登錄號KCTC 13597BP。 1-3. 按照甘油使用來將菌株分類
為了確認寄存菌株與同一種類之其他菌株之差異，確認甘油使用。
為了確認甘油使用，藉由將2%甘油添加至富培養基(10 g/L酵母提取物、5g/L TSB培養基、2.5g/L K2 HPO4 及1.5 g/l KH2 PO4 )來製備培養基。另外，當所接種之培養基使用甘油時，培養基之顏色自紅色改變為黃色，並且因此，添加0.001%(w/v)酚紅以便明顯地確定使用。細菌中之每一者經由活化狀態以105 CFU/ml接種在RCM培養基中並且在37℃下厭氧培養，並且沒有接種任一者之培養基在相同條件下儲存以便清楚地檢查變色。持續6天同時觀察變化之態樣。
因此，在NSM13-4、CSM1-3及CSM5-1中，自培養第3天，顏色開始變化，並且隨著時間過去，紅色消失，在4至5天之後指示完全黃色。另一方面，與培育之前相比，GENSCO2為微紅的，但是與對照相比，色差較低。因此，確認GENSCO2具有在富培養基下幾乎不使用甘油之特性，並且此意味著使用甘油之能力視培養基諸如富培養基、API 20A培養基及其類似培養基而不同。
表2示出按照每一種菌株劃分之甘油使用結果。當菌株變成黃色時，將其標記為-/+/++/+++。另外，在第2圖中展示每一種顆粒丙酸桿菌菌株之視甘油使用而定之變色。(第1天、第3天及第6天之變色)。因此，確認GENSCO2在使用甘油之能力方面與其他菌株存在差異。 [表2]
   菌株 物種 第0 天 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5 天 第6 天
a 對照    - - - - - - -
b GENSC02 顆粒丙酸桿菌 - - - - - - -
c NSM13-4 顆粒丙酸桿菌 - - - + ++ ++ ++
d CSM1-3 顆粒丙酸桿菌 - - - ++ ++ +++ +++
e CSM5-1 顆粒丙酸桿菌 - - - + ++ ++ ++
[ 實例 2] 顆粒丙酸桿菌 GENSC02 之溶血測試
相當多的顆粒丙酸桿菌菌株具有溶血毒性並且視菌株而定對人體係有害的。為了確認顆粒丙酸桿菌GENSC02之安全性，確認溶血毒性之存在或不存在。 將在液體培養基中純態培養之顆粒丙酸桿菌GENSC02藉由白金環來收集並且塗抹在綿羊血液瓊脂上並且在37℃下厭氧培養48小時。溶血藉由微生物細胞周圍存在透明圈來確定，並且確定顆粒丙酸桿菌GENSC02對於綿羊血液不具有溶血並且因此對於人體係無害的，如可在第2圖中發現。[ 實例 3] 對於 金黃色葡萄球菌 KCTC 1621 及 痤瘡桿菌 ATCC 6919 之生長抑制 ( 重疊透明區測試 )
金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌之生長抑制效應藉由觀察透明區之形成來確認。當此等細菌接種在瓊脂培養基上時，細菌以淺色來生長，並且因此培養基之顏色變得渾濁，並且若細菌不生長，則培養基看似透明。在實驗進行時，預期若顆粒丙酸桿菌GENSC02具有抑制細菌生長之效應，則在顆粒丙酸桿菌GENSC02周圍，金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌可不生長並且培養基變得透明。顆粒丙酸桿菌GENSC02培養肉湯使用白金環來收集並且藉由繪製約2.5 cm之線，在薄RCM瓊脂板中在37℃下厭氧培養72小時。確認顆粒丙酸桿菌GENSC02充分生長之後，將調整至104 cfu/ml之金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌菌株接種在約45℃下尚未固化之10ml RCM瓊脂中，並且在培養基硬化之前將該等菌株完全懸浮，並且藉由將該等菌株傾倒至顆粒丙酸桿菌GENSC02生長之瓊脂板上，使該瓊脂均勻地固化。在固化瓊脂板中，金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌分別在37℃下進一步培養厭氧約40小時及約72小時，以便觀察出現在顆粒丙酸桿菌GENSC02周圍之透明區之尺寸。作為陰性對照組，使用磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate-buffered saline; PBS)，並且作為陽性對照組，使用三氯生，並且金黃色葡萄球菌及痤瘡桿菌分別以10mg/ml及200mg/ml之量來處理。因此，如第4圖，觀察到顆粒丙酸桿菌GENSC02周圍之透明區，並且透明性隨著與顆粒丙酸桿菌GENSC02之距離而降低，由此確認顆粒丙酸桿菌GENSC02具有抑制金黃色葡萄球菌之生長之能力。可發現在處理陰性對照組PBS時，未觀察到透明區，並且在處理作為陽性對照組之殺細菌劑三氯生時，觀察到透明區，但是與GENSC02處理相比，該透明區具有小得多的面積。結果展示在第4圖中。
另外，如可在第5圖中發現，由於接種痤瘡桿菌，觀察到顆粒丙酸桿菌GENSC02周圍之透明區，並且透明性隨著與顆粒丙酸桿菌GENSC02之距離而降低，由此確認顆粒丙酸桿菌GENSC02具有抑制痤瘡桿菌之生長之能力。另外，可發現在處理陰性對照組PBS時，未觀察到透明區，並且在處理作為陽性對照組之殺菌劑三氯生時，觀察到透明區，但是與GENSC02處理相比，該透明區具有小得多的面積。
經由此等結果，確認本發明之顆粒丙酸桿菌GENSC02可藉由抑制導致痤瘡之細菌痤瘡桿菌來提供改善、預防或治療痤瘡之效應。[ 實例 4] 製備本發明之菌株之發酵濾液
顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株在RCM瓊脂板上在37℃下厭氧培養72小時。將在固體培養基中展示之單一菌落在10ml之RCM液體培養基中繼代培養並且在相同條件下培養。72小時後，將0.1%接種至相同液體培養基，並且在相同條件下培養72小時，並且將上清液離心並且用0.22um孔徑濾器來過濾。[ 實例 5] 抗發炎功效評估 ( 經選擇之有益細菌 )
首先，將顆粒丙酸桿菌菌株之發酵濾液預處理細胞1小時，其中藉由在37℃及5% CO2 恆溫箱中培養24小時，將2ｘ105 之HaCaT人類角化細胞株分別添加至6-孔板。然後，對熱處理的痤瘡桿菌(100MOI)進行處理並且反應4小時。然後，在提取每個樣品之RNA之後，發炎反應細胞介素因子中之一者IL-6之RNA表現藉由即時PCR來確認。
在第6圖之結果中，可發現發炎由痤瘡桿菌引起IL-6表現增加所導致。在與各種菌株之比較實驗中，展示藉由GENSCO2發酵濾液降低IL-6之表現，並且確認與其他菌株相比，GENSCO2具有更好抗發炎功效。第6圖示出確認按照菌株來區分的IL-6之表現之結果，並且觀察到GENSCO2之IL-6表現為最低的。
經由第6圖之結果，為了研究視GENSCO2之發酵濾液含量而定之抗發炎功效，進行與以上實驗相同之實驗操作，並且藉由處理GENSCO2發酵濾液以便分別0.01、0.1、及1%之濃度預處理，抗發炎功效得以再次重現。
在第7圖至第9圖之結果中，可發現痤瘡桿菌之發炎由IL-6、IL-8、及TNF-a之表現增加所導致。確認視GENSCO2發酵濾液而定，IL-6之表現逐漸地減少，並且在GENSCO2發酵濾液之低含量中，IL-8及TNF-α之表現具有極好抗發炎功效。[ 實例 6] 細胞毒性確認
為了評估在實例4中製備之發酵濾液之細胞毒性，進行以下實驗。將HaCaT細胞以各自5x103 細胞/孔添加至96-孔細胞培養板上持續24小時，然後在濃縮狀態下添加測試組樣品以將該樣品在5% CO2 及37℃之條件下培養48小時。48小時後，將培養細胞培養基移除，並且用0.5 mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2-5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)甲臢溶液處理細胞，並且使其反應4小時，並且在時間過去之後，將所有細胞培養基移除並且甲臢溶液藉由DMSO溶解，然後在570nm下使用SpectraMax M2來量測吸收率。然後，HaCaT細胞株之存活率藉由用O.D樣品 /O.D對照 X 100之方程式進行轉化來計算。
發酵濾液之細胞毒性測試結果展示在第10圖中。如可在第10圖中發現，GENSCO2之處理不顯著影響HaCaT細胞株之存活率。因此，可以看出GENSCO2不具有細胞毒性。[ 實例 7] 確認皮膚屏障功能增強功效
為了研究GENSCO2發酵濾液除了發炎反應以外，對於HaCaT細胞株具有皮膚屏障增強之功能，將GENSCO2之發酵濾液以細胞培養物溶液之%來處理HaCaT細胞株，然後反應24小時以確認作為RNA上之皮膚屏障功能之標記物之絲聚蛋白及密連蛋白-1之表現。
在第11圖及第12圖之結果中，確認表現絲聚蛋白及密連蛋白-1增加至陽性對照組維生素A酸(RA'，1 μM)之1.5倍，但是另一方面，密連蛋白之表現自0.1%之GENSCO2發酵濾液增加2倍或更多，並且絲聚蛋白之表現自0.01%之GENSCO2發酵濾液增加。
具體而言，如第11圖可以看出，可以看出與已知具有極好絲聚蛋白表現效應之維生素A酸(陽性對照組)相比，GENSCO2具有極好絲聚蛋白表現效應。經由此舉，GENSCO2可提供異位性皮膚炎改善效應、痤瘡改善效應、皮膚屏障增強效應、及皮膚含水量保持或藉由增加絲聚蛋白表現來增加效應。
如第12圖可以看出，可以看出與已知具有極好絲聚蛋白表現效應之維生素A酸(陽性對照組)相比，GENSCO2具有極好密連蛋白表現效應。經由此舉，GENSCO2可提供異位性皮膚炎改善效應、痤瘡改善效應、皮膚屏障增強效應、及皮膚含水量保持或藉由增加絲聚蛋白表現來增加效應。[ 實例 8] 皮膚保濕功能增強功效確認
為了研究GENSCO2發酵濾液之皮膚保濕效應之功能，確認將GENSCO2之發酵濾液以細胞培養物溶液之%來處理HaCaT細胞株，然後反應24小時以確認作為RNA上之皮膚保濕功能之標記物之HAS3(透明質酸合成酶)及水通道蛋白之表現。
在第13圖及第14圖之結果中，確認HAS3(透明質酸合成酶)及水通道蛋白之表現增加至陽性對照組維生素A酸(RA'，1 μM)之2至4倍，並且與發酵濾液之陰性對照組(-組)相比，HAS3(透明質酸合成酶)及水通道蛋白之表現增加2倍或更多。基於第13圖及第14圖之結果，確認GENSCO2增強皮膚保濕功能。[ 實例 9] 量測形成生物膜之抑制效應
將金黃色葡萄球菌菌株(金黃色葡萄球菌KCTC 1621)在滴定培養基(TSB+0.2%葡萄糖)中液體培養16至24小時。將具有0.2%葡萄糖之TSB添加在6-孔板(聚苯乙烯)上之後，將測試組以大約5~10%體積添加至每個孔。然後，將培養細菌溶液接種至每個孔以使得最終菌株濃度為2ｘ106 CFU/孔。然後，在37℃恆溫箱中靜置培養24小時。培養之後，消除培養液並且每個孔使用1~2 ml之無菌PBS洗滌兩次。洗滌之後，添加2 ml之PBS並且生物膜用刮刀刮落並且懸浮，然後量測600 nm下之吸收率。吸收率量測使用BioPhotometer D30來進行。未處理的孔用作陰性對照組並且用黃芩素(25 μm/ml)接種之孔用作陽性對照組以計算生物膜形成抑制能力。
如第15圖，可以看出GENSCO2菌株具有比陽性對照組更好生物膜形成抑制能力。[ 實例 10] 確認發癢減輕功效
藉由將GENSCO2之發酵濾液以%處理HaCaT細胞株，然後反應4小時，在RNA上確認作為異位性皮膚炎之病因之一之細胞介素TSLP之表現。如第9圖中示出，確認發酵濾液之TSLP表現度得以降低。因此，確認本發明之GENSCO2培養物抑制TSLP表現並且解決皮膚發癢，由此具有改善異位性皮膚炎之效應。[ 實例 11] 痤瘡桿菌ATCC 6919 脂肪酶抑制活性 (4- 甲基傘形基油酸酯 (MUO) 檢定 )
脂肪酶抑制活性使用4-甲基傘形基油酸酯作為受質來評估。換言之，將陽性對照組、酮康唑(2.5 μg/ml)、陰性組、及發酵濾液分別以1:1來處理RCM肉湯中之痤瘡桿菌(OD600 =1)，並且將其在37℃下厭氧培養。藉由將該等物質離心來獲得之100 ul上清液及100 ul之4-MU油酸酯(DMSO中之0.2 mg/ml)在黑色96-孔微量滴定板中混合，並且其在37℃下反應24小時。由脂肪酶釋放之4-甲基傘形酮使用螢光酶標儀來量測。
在第17圖之結果中，確認獲得在處理1%發酵濾液時與陽性對照組類似之效應，並且痤瘡桿菌ATCC 6919脂肪酶抑制活性以濃度有關的方式來展示。[ 實例 12] 評估針對細粉塵之抗發炎功效
首先，藉由用細粉塵(Aldrich) 50 ug/ml處理細胞2小時來誘導發炎，其中藉由在37℃及5% CO2 恆溫箱中培養24小時，然後沖洗3次，分別將6.5ｘ105 個HaCaT人類角化細胞株添加至6-孔板。然後，在處理GENSCO2發酵濾液1小時及2小時，然後提取每個樣品之RNA之後，發炎反應細胞介素因子IL-6之RNA表現藉由即時PCR來確認。結果展示在第18圖中。確認IL-6之表現藉由GENSCO2培養物濾液來顯著降低並且在處理2小時的情況下進一步降低。 [工業適用性]
本發明提供可用作化妝品組合物之新的顆粒丙酸桿菌菌株或其培養物。
本發明之菌株或培養物可用作化妝品組合物。 [登錄號] 寄存機構：韓國生物科學及生物技術研究所 登錄號：KCTC13597BP 寄存日期：20180724
無
第1圖示出本發明之顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(登錄號：KCTC 13597BP)之16s rRNA序列。
第2圖示出每一種顆粒丙酸桿菌菌株之根據甘油使用之變色(在第0天、第3天及第6天之變色)。
第3圖示出將本發明之顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株塗抹在綿羊血液瓊脂上並且進行培養的結果。在微生物細胞周圍未發現透明圈，並且由此可發現其對於人體係無害的，因為沒有發生溶血。
第4圖示出藉由顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株來抑制金黃色葡萄球菌KCTC 1621之生長的結果。
第5圖示出藉由顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株來抑制痤瘡桿菌ATCC 6919之生長的結果。
第6圖示出確認按照菌株來區分的IL-6之表現之結果，並且觀察到GENSCO2之IL-6表現為最低的。
第7圖係展示按照濃度來區分的GENSCO2菌株之發酵濾液對IL-6表現之抑制活性的結果。
第8圖係展示按照濃度來區分的GENSCO2菌株之發酵濾液對IL-8表現之抑制活性的結果。
第9圖係展示按照濃度來區分的GENSCO2菌株之發酵濾液對TNF-α表現之抑制活性的結果。
第10圖示出本發明之GENSCO2菌株之發酵濾液之細胞毒性測試之結果。
第11圖示出藉由GENSCO2菌株之發酵濾液之處理來增強絲聚蛋白表現之結果。
第12圖示出藉由GENSCO2菌株之發酵濾液之處理來增強密連蛋白1表現之結果。
第13圖示出藉由GENSCO2菌株之發酵濾液之處理來增強HAS3(透明質酸合成酶)表現之結果。
第14圖示出藉由GENSCO2菌株之發酵濾液之處理來增強水通道蛋白表現之結果。
第15圖係展示藉由GENSCO2菌株之發酵濾液之處理來獲得極好生物膜形成抑制效應的結果。
第16圖係展示藉由顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株之發酵濾液來減少TSLP表現之結果。
第17圖示出藉由顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株之發酵濾液對痤瘡桿菌ATCC 6919脂肪酶之抑制活性。
第18圖係確認顆粒丙酸桿菌GENSCO2菌株之發酵濾液可有效地減少由細粉塵導致之發炎的結果。
國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 顆粒丙酸桿菌Cutibacterium granulosum GENSC02： 財團法人食品工業發展研究所、108年9月12日、BCRC 910935
國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 顆粒丙酸桿菌Cutibacterium granulosum GENSC02： 韓國、Korean Collection for Type Cultures (KCTC)、2018年7月24日、KCTC 13597BP
<110> 南韓商韓國億諾生物有限公司(Genome and Company)
<120> 新穎顆粒丙酸桿菌菌株，及用於預防或治療包含該菌株或其培養物的痤瘡之成分
<150> KR 10-2018-0098880
<151> 2018-08-23
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 顆粒丙酸桿菌GENSC02的16s rRNA
<400> 1
Figure 108120894-A0305-02-0026-1
Figure 108120894-A0305-02-0027-2

Claims (10)

  1. 一種顆粒丙酸桿菌(Cutibacterium granulosum)GENSC02菌株(韓國寄存編號：KCTC 13597BP；財團法人食品工業發展研究所寄存編號：BCRC 910935)。
  2. 如請求項1所述之菌株，其中該顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株或其培養物具有針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或痤瘡桿菌(Cutibacterium acnes)之抗細菌活性。
  3. 如請求項1所述之菌株，其中該顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株具有抑制、改善或治療痤瘡、異位性皮膚炎或發炎性皮膚疾病之活性，或具有皮膚保濕活性。
  4. 如請求項3所述之菌株，其中該發炎性皮膚疾病包括由細粉塵導致之發炎性皮膚疾病。
  5. 一種用於體味移除、或抑制或改善異位性皮膚炎、痤瘡或發炎性皮膚疾病之組合物，其包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(韓國寄存編號：KCTC 13597BP；財團法人食品工業發展研究所寄存編號：BCRC 910935)或其培養物。
  6. 如請求項5所述之組合物，其中該發炎性皮膚疾病包括由細粉塵導致之發炎性皮膚疾病。
  7. 如請求項5所述之組合物，其中該組合物具有針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或痤瘡桿菌(Cutibacterium acnes)之抗細菌活性。
  8. 一種用於皮膚保濕之化妝品組合物，其包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(韓國寄存編號：KCTC 13597BP；財團法人食品工業發展研究所寄存編號：BCRC 910935)或其培養物。
  9. 一種具有針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或痤瘡桿菌(Cutibacterium acnes)之抗細菌活性之抗微生物組合物，其包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(韓國寄存編號：KCTC 13597BP；財團法人食品工業發展研究所寄存編號：BCRC 910935)或其培養物。
  10. 一種用於抑制、改善或治療異位性皮膚炎、痤瘡、或發炎性皮膚疾病之醫藥組合物，其包含顆粒丙酸桿菌GENSC02菌株(韓國寄存編號：KCTC 13597BP；財團法人食品工業發展研究所寄存編號：BCRC 910935)或其培養物。
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KR10-2018-0098880 2018-08-23

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