TWI711629B

TWI711629B - 靶向IL-23A與TNF-α之化合物及其用途

Info

Publication number: TWI711629B
Application number: TW104129171A
Authority: TW
Inventors: 貝瑞特里查瑞貝卡; 強森雷斯里Ｓ; 辛珊加雅; 拉斯特巴尼凱瑟琳; 施道存; 吉布林帕翠西亞; 布羅德史考特; 納葛拉賈內拉曼格拉
Original assignee: 德商包林格因蓋爾漢國際股份有限公司; 美商總體遺傳因子公司
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2020-12-01
Also published as: US20160060338A1; EA202193002A2; PH12017500370A1; AU2015311913B2; CA2959629C; AP2017009776A0; KR102523914B1; SG10201912591RA; AR101753A1; EA039598B9; JP7072600B2; CN107109456A; EP3189153A4; CA2959629A1; MX2017002765A; UA123624C2; CN107109456B; KR20170044751A; ZA201701384B; US10059763B2

Abstract

本揭示內容係關於對IL23A及TNF-α具特異性之化合物、包含該等化合物之組成物，以及其使用方法。亦揭示與化合物及組成物相關的核酸、細胞及產生方法。

Description

靶向IL-23A與TNF-α之化合物及其用途

本發明係關於靶向IL-23與TNF-α之化合物及其用途。

相關申請案

本申請案根據專利法主張2014年9月3日申請的且名稱為Compound Targeting IL-23A and TNF-ALPHA and Uses Thereof的美國臨時申請案序列號第62/045,498號之申請日權益，該案之整體內容以引用方式併入本文。

炎症涉及對抗感染所需的先天及適應性免疫反應。然而，當炎症變成未查出自體免疫或自體炎性疾病時，會發展成神經退化性疾病及甚至癌症。完全確認的是，抑制諸如IL1、TNF-α、IL6、IL12、IL17、IL18或IL23之促炎性細胞激素之活性減少炎症，且抑止活化免疫細胞之特定路徑。

介白素23(interleukin 23；IL23)為由兩個次單元p40及p19組成之異源二聚細胞激素。p19次單元亦稱為IL-23A。雖然p19次單元對IL23為獨特的，但p40次單元係與細胞激素IL12共用。IL23成為驅使 IL17、IL22及導致局部組織炎症及破壞的其他細胞激素之產生的病原性Th17、γδ T及先天淋巴樣細胞(innate lymphoid cell；ILC)之關鍵調節物。IL23促進基質金屬蛋白酶MMP9上調、增加血管生成、減少CD8+T細胞浸潤，且已牽涉於癌性腫瘤之發展中。另外，與IL6及TGF-β1相結合，IL23刺激初始CD4+ T細胞分化成Th17細胞。繼而，Th17細胞產生IL17，該IL17為一種促炎性細胞激素，其增強T細胞促發並刺激諸如IL1、IL6、TNF-α、NOS-2之促炎性細胞激素之產生，且亦誘導趨化因子之表現，從而造成炎症及疾病發病機制。IL23經由細胞表面受體發揮其作用，該細胞表面受體由IL12受體之IL12β1次單元搭配獨特IL23R次單元而構成。IL23R之表現限於免疫細胞之特定群體，且主要在T細胞之子集(αβ及γδ TCR+)及NK細胞中被發現。

在小鼠中，IL23p19基因之遺傳消融造成IL23功能之選擇性損失，伴隨有嚴重地折衷型T依賴性免疫反應，包括抗原特異免疫球蛋白之產生減少及受損延遲型過敏性反應(Ghilardi N等人，(2004)J.Immunol.172(5)：2827-33)。缺少IL23p40或IL23p19或缺少IL23受體之任一次單元(IL23R及IL12-β1)之敲除小鼠在多發性硬化症、關節炎及炎性腸疾病之動物模型中較少發展出嚴重症狀。已在EAE中使用對IL23p19具特異性之抗體獲得類似的結果，且T細胞介導結腸炎模型進一步確證IL23在此等疾病情況中之作用(Chen Y.等人(2006)J.Clin.Invet.116(5)：1317-26；Elson CO.等人(2007)Gastroenterology 132(7)：2359-70)。此突顯IL23在慢性炎症中之重要性(Langowski等人(2006)Nature 442(7101)：461-5；Kikly K等人(2006)Curr.Opin.Immunol.18(6)：670-5)。另外，升高的IL23產量已成為牽涉炎性關節炎及炎性自體免疫疾病中之主要因素(Adamopoulos等人(2011)J.Immunol.187：593-594；以及Langris等人(2005)J.Exp.Med.201：233-240)。IL23、其下游細胞激素IL22與骨形成之間的聯繫已在過度表現IL23之小鼠模型系統中公開(Sherlock等人(2012)Nat.Med.18：1069-76)。

同源三聚TNF-α細胞激素係主要藉由巨噬細胞、淋巴球、內皮細胞及纖維母細胞表現，且結合兩種相異受體：TNFRI及TNFRII，該TNFRI係表現於幾乎所有細胞類型上，而該TNFRII在免疫細胞(CD4+ T細胞、NK細胞)上之表現較為有限。如同許多TNF超家族成員一樣，TNF-α作為膜及可溶性形式而存在，該可溶性形式由膜形式藉由ADAM12金屬蛋白酶(TACE，TNFα轉化酶)之裂解而產生。細胞激素之膜結合形式及可溶性形式兩者皆為生物活性的。

腫瘤壞死因子(TNF-α/TNF-α)為刺激急性期炎症之促炎性細胞激素。腫瘤壞死因子經由IL8之誘導而增加血管滲透性，進而將巨噬細胞及嗜中性球募集至感染位點。一旦存在，活化巨噬細胞即持續產生TNF-α，進而維持並擴增炎性反應。TNF-α之主要作用為調節免疫細胞；然而，TNF-α亦涉及調節廣泛範圍之生物過程，包括細胞增殖、分化、細胞凋亡、脂質代謝及凝結。TNF-α能夠誘導炎症，誘導凋亡細胞死亡，抑制腫瘤形成並抑制病毒複製。

TNF-α產生之調節障礙已牽涉於各種人類疾病，包括自體免疫疾病(例如，類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis；RA)、克隆氏病、多發性硬化症)，炎性腸疾病(inflammatory bowel disease；IBD)，潰瘍性結腸炎，牛皮癬，毒性休克，移植物抗宿主病，胰島素抵抗力，阿重度抑鬱症茲海默症，癌症及重度抑鬱症(Swardfager W等人，(2010)Biol Psychiatry 68(10)：930-941；Locksley RM等人，(2001)Cell 104(4)：487-501；Dowlati等人，(2010)Biol Psychiatry 67(5)：446-457；Brynskov J.等人(2002)Gut 51(1)：37-43)。

抗體已用作用於抑制TNF-α及IL23以便治療各種炎性疾病之生物療法。描述於美國專利第6,277,969號、第6,284,471號及第6,790,444號中之英利昔單抗(Centocor，Malvern，Pa.)為帶有人類IgG4恆定區及小鼠可變區之嵌合抗TNF-α單株IgG抗體，且在臨床上用於治療類風溼性關節炎、牛皮癬性關節炎、關節黏連性脊椎炎、克隆氏病、潰瘍性結腸炎及斑塊性牛皮癬。描述於美國專利第6,090,382號中之單株抗體阿達木單抗(純系D2E7；Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois)為抗TNF-α療法，其在臨床上用於治療類風溼性關節炎、克隆氏病、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、關節黏連性脊椎炎及幼年型特發性關節炎。戈利木單抗為TNF-α阻斷劑，其用於治療類風溼性關節炎、牛皮癬性關節炎、關節黏連性脊椎炎及潰瘍性結腸炎。另外，描述於美國專利第6,902,734號及美國專利第7,166,285號中之人類單株抗體優特克單抗(Centocor，Inc，Malvern，Pa.)係針對介白素12及介白素23(確切言之p40次單元)，在臨床上用於治療嚴重斑塊性牛皮癬，且正在針對牛皮癬性關節炎、多發性硬化症及類肉瘤病之治療進一步研究。然而，據報導，抗TNF-α療法具有副作用[參見，例如：Keane J等人(2001)]。結核病與英利昔單抗相關聯，其為腫瘤壞死因子α-中和劑。N Engl J Med 345(15)：1098-1104；Scheinfeld N.(2005)A dalimumab：a review of side effects.Expert Opin Drug Saf.4(4)：637-41；Chovel-Sella A等人(2012)Clinical efficacy and adverse effects of golimumab in the treatment of rheumatoid arthritis.Isr Med Assoc J.14(6)：390-4]。更有效治療之鑑定應允許投與減少的劑量，以及與治療相關聯的較低成本。

仍然對用於治療及預防自體免疫疾病或炎性疾病的具有增加功效之組成物存在需要。

本文提供對TNF-α及IL23A具特異性之化合物、包含此等化合物之組成物，以及其使用及產生方法。

本揭示內容之態樣係關於包含第一多肽及第二多肽之化合物，其中：(A)該第一多肽包含：(i)對第一標靶蛋白質具特異性之第一免疫球蛋白之輕鏈可變域(VL1)；(ii)對第二標靶蛋白質具特異性之第二免疫球蛋白之重鏈可變域(VH2)；以及(iii)鉸鏈區、重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)；且(B)該第二多肽包含：(i)對該第二標靶蛋白質具特異性之第二免疫球蛋白之輕鏈可變域(VL2)；(ii)對該第一標靶蛋白質具特異性之第一免疫球蛋白之重鏈可變域(VH1)；其中：(i)該VL1及VH1締合以形成結合該第一標靶蛋白質之結合位點； (ii)該VL2及VH2締合以形成結合該第二標靶蛋白質之結合位點；(iii)該重鏈恆定區2(CH2)包含位置252處之酪胺酸、位置254處之蘇胺酸及位置256處之麩胺酸，該等位置係根據如用於習知抗體之Kabat中之EU索引來編號；且(iv)該第一標靶蛋白質為TNF-α且該第二標靶蛋白質為IL-23A，或該第一標靶蛋白質為IL-23A且該第二標靶蛋白質為TNF-α，其中：(i)該VL1包含SEQ ID NO：2，該VH1包含SEQ ID NO：1，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7；或(ii)該VL1包含SEQ ID NO：4或6，該VH1包含SEQ ID NO：3或5，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7；或(iii)該VL1包含SEQ ID NO：8，該VH1包含SEQ ID NO：7，該VL2包含SEQ ID NO：2，且該VH2包含SEQ ID NO：1；或(iv)該VL1包含SEQ ID NO：8，該VH1包含SEQ ID NO：7，該VL2包含SEQ ID NO：4或6，且該VH2包含SEQ ID NO：3或5。

在一些實施例中，在(ii)中，該VL1包含SEQ ID NO：4，該VH1包含SEQ ID NO：3，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7。在一些實施例中，在(ii)中，該VL1包含SEQ ID NO：6，該VH1包含SEQ ID NO：5，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7。在一些實施例中，在(iv)中，該VL2包含SEQ ID NO：4，該VH2包含SEQ ID NO：3，該VL1包含SEQ ID NO：8，且該VH1包含SEQ ID NO：7。在一些實施例中，在(iv)中，該VL2包含SEQ ID NO：6，該VH2包含SEQ ID NO：5，該VL1包含SEQ ID NO：8，且該VH1包含SEQ ID NO：7。

在一些實施例中，該第一多肽進一步包含該VL1與該VH2之間的第一連接子，且該第二多肽進一步包含該VL2與該VH1之間的第二連接子。在一些實施例中，該第一連接子或該第二連接子包含胺基酸序列GGGSGGG(SEQ ID NO：9)。在一些實施例中，該第一連接子及該第二連接子包含胺基酸序列GGGSGGG(SEQ ID NO：9)。

在一些實施例中，該第一多肽進一步包含重鏈恆定區1域(CH1)，且該第二多肽進一步包含輕鏈恆定區域(CL)，其中該CL及該CH1經由二硫鍵締合在一起以形成C1域。

在一些實施例中，該第一多肽進一步包含該VH2與該CH1之間的第三連接子，且該第二多肽進一步包含該VH1與該CL之間的第四連接子。在一些實施例中，該第三連接子包含胺基酸序列FNRGES(SEQ ID NO：11)。在一些實施例中，該第四連接子包含胺基酸序列VEPKSS(SEQ ID NO：12)。在一些實施例中，該第三連接子包含胺基酸序列FNRGES(SEQ ID NO：11)，且該第四連接子包含胺基酸序列VEPKSS(SEQ ID NO：12)。在一些實施例中，第三連接子或該第四連接子包含胺基酸序列LGGGSG(SEQ ID NO：10)。在一些實施例中，該第三連接子及該第四連接子包含胺基酸序列LGGGSG(SEQ ID NO：10)。

在一些實施例中，該重鏈恆定區2(CH2)包含位置234處之丙胺酸及位置235處之丙胺酸，該等位置係根據如用於習知抗體之Kabat中之EU索引來編號。

在一些實施例中，該鉸鏈區、該重鏈恆定區2(CH2)或該重鏈恆定區3(CH3)之胺基酸序列來源於IgG1或來源於IgG4。在一些實施例中，該鉸鏈區包含胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：40)。

在一些實施例中，該化合物包含兩個該等第一多肽及兩個該等第二多肽，其中該兩個第一多肽經由至少一個二硫鍵締合在一起。在一些實施例中，該化合物包含兩個該等第一多肽及兩個該等第二多肽，其中該兩個第一多肽經由至少一個二硫鍵締合在一起，且其中該等第一多肽中之每一者經由至少一個二硫鍵締合至一個該第二多肽。

在一些實施例中， (i)該第一多肽包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(ii)該第一多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(iii)該第一多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(iv)該第一多肽包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(v)該第一多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(vi)該第一多肽包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(vii)該第一多肽包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；(viii)該第一多肽包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；(ix)該第一多肽包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列；(x)該第一多肽包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列；(xi)該第一多肽包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；或(xi)該第一多肽包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。

在一些實施例中，其中該化合物包含兩個該等第一多肽及兩個該等第二多肽，其中該兩個第一多肽經由至少一個二硫鍵締合在一起。

在一些實施例中，該化合物包含兩個該等第一多肽及兩個該等第二多肽，且其中第一多肽之一者的CH2及CH3以及CH1(若存在)與第一多肽之另一者的CH2及CH3以及CH1(若存在)締合以形成四價分子。在一些實施例中，該化合物包含兩個該等第一多肽及兩個該等第二多肽，其中該等第一多肽中之每一者包含CH1、CH2及CH3，且該等第二多肽中之每一者包含CL，且其中第一多肽之一者的CH2及CH3與第一多肽之另一者的CH2及CH3締合且每一個該等第一多肽之CH1與一個該等第二多肽之CL締合以形成四價分子。

本揭示內容之其他態樣係關於第一化合物，該第一化合物與第二化合物競爭與IL-23A及與TNF-α之結合，其中該第一化合物包含第三多肽及第四多肽，其中：(A)該第三多肽包含：(i)對第一標靶蛋白質具特異性之第一免疫球蛋白之輕鏈可變域(VL1)；(ii)對第二標靶蛋白質具特異性之第二免疫球蛋白之重鏈可變域(VH2)；以及(iii)鉸鏈區、重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)；且(B)該第四多肽包含： (i)對該第二標靶蛋白質具特異性之第二免疫球蛋白之輕鏈可變域(VL2)；(ii)對該第一標靶蛋白質具特異性之第一免疫球蛋白之重鏈可變域(VH1)；且其中(i)該VL1及VH1締合以形成結合該第一標靶蛋白質之結合位點；(ii)該VL2及VH2締合以形成結合該第二標靶蛋白質之結合位點；且(iii)該第一標靶蛋白質為TNF-α且該第二標靶蛋白質為IL-23A，或該第一標靶蛋白質為IL-23A且該第二標靶蛋白質為TNF-α，且其中該第二化合物包含第一多肽及第二多肽，其中：(i)該第一多肽包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(ii)該第一多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(iii)該第一多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(iv)該第一多肽包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(v)該第一多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列； (vi)該第一多肽包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(vii)該第一多肽包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；(viii)該第一多肽包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；(ix)該第一多肽包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列；(x)該第一多肽包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列；(xi)該第一多肽包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；或(xii)該第一多肽包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。

本揭示內容之其他態樣係關於醫藥組成物，其包含本文所述的化合物，諸如以上所述的化合物。

本揭示內容之其他態樣係關於治療自體免疫疾病或炎性疾病之方法，該方法包含向受試者投與本文所述的化合物，諸如以上所述的化合物，或包含該化合物之醫藥組成物。

本揭示內容之其他態樣係關於適用於藥物的本文所述的化合物，諸如以上所述的化合物。在一些實施例中，該用途為自體免疫疾病或炎性疾病之治療。

本揭示內容之其他態樣係關於適用於藥物的醫藥組成物，其包含本文所述的化合物，諸如以上所述的化合物。在一些實施例中，該用途為自體免疫疾病或炎性疾病之治療。

本揭示內容之其他態樣係關於本文所述的化合物，諸如以上所述的化合物在製造適用於藥物之藥劑中的用途。在一些實施例中，該用途為自體免疫疾病或炎性疾病之治療。

本揭示內容之其他態樣係關於本文所述的醫藥組成物，諸如以上所述的醫藥組成物在製造適用於藥物之藥劑中的用途。在一些實施例中，該用途為自體免疫疾病或炎性疾病之治療。

本揭示內容之其他態樣係關於核酸，該核酸包含編碼本文所述的多肽，諸如以上所述的多肽之核苷酸序列。本揭示內容之其他態樣係關於載體，其包含該核酸。在一些實施例中，載體包含可操作連接至該核酸之啟動子。本揭示內容之其他態樣係關於細胞，其包含該核酸或該載體。

本揭示內容之其他態樣係關於產生如本文所述的化合物或多肽，諸如以上所述的多肽之方法，該產生包含獲得本文所述的細胞，諸如以上所述的細胞，且在該細胞中表現如本文所述的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含分離並純化該多肽或化合物。

本揭示內容之一或多個實施例之細節在以下描述中闡述。本揭示內容之其他特徵或優點將自以下圖式及若干實施例之詳述以及自隨附發明申請專利範圍而明顯。

以下圖式形成本說明書之部分且納入來進一步示範本揭示內容之某些態樣，藉由參考此等圖式中之一或多者結合本文中提出的特定實施例之詳述可較好地理解該等態樣。

第1A圖為對TNF-α及IL23A具特異性之示範性化合物之圖解。第一多肽鏈含有CH3、CH2、VH₂(VH_II)及VL₁(VL_I)域。第二多肽鏈含有VH₁(VH_I)及VL₂(VL_II)域。VL₁及VH₁對第一標靶蛋白質(TNF-α或IL23A)具特異性，且VL₂及VH₂對第二標靶蛋白質(IL23A或TNF-α)具特異性。上圖面單獨地展示每一個多肽鏈。下圖面展示四價化合物，其經由一個第一多肽之CH2及CH3域與另一第一多肽之CH2及CH3域之締合而形成。第一標靶蛋白質及第二標靶蛋白質之結合域分別經由VH₁及VL₁之締合併經由VH₂及VL₂之締合而形成。

第1B圖為對TNF-α及IL23A具特異性之另一示範性化合物之圖解。第一多肽鏈含有CH3、CH2、CH1、VH₂(VH_II)及VL₁(VL_I)域。第二多肽鏈含有CL、VH₁(VH_I)及VL₂(VL_II)域。VL₁及VH₁對第一標靶蛋白質(TNF-α或IL23A)具特異性，且VL₂及VH₂對第二標靶蛋白質(IL23A或TNF-α)具特異性。上圖面單獨地展示每一個多肽鏈。下圖面展示四價化合物，其經由一個第一多肽之CH2及CH3域與另一第一多肽之CH2及CH3域之締合而形成。第一標靶蛋白質及第二標靶蛋白質之結合域分別經由VH₁及VL₁之締合併經由VH₂及VL₂之締合而形成。化合物進一步經由CL域與CH1域之間的相互作用締合。

第2圖為展示在1mg/kg IV 10分鐘輸注之後化合物M及其YTE突變體化合物A於雄性石蟹獼猴中之血清濃度(平均值±SD；N=3)的圖表。

第3圖為展示在1mg/kg IV 10分鐘輸注之後化合物O及其相應YTS突變體化合物E於雄性石蟹獼猴中之血清濃度(平均值±SD；N=3)的圖表。

第4圖為展示在活體內化合物E維持的功能效力對比IL23之一系列圖表及表。利用對照抗體3(IL23A單株抗體)或化合物E對小鼠等莫耳給藥，且利用人類IL23攻毒兩次以誘導耳炎症。在最終注射之後二十四小時，將耳收集並針對作為IL23之功能阻斷之量度的小鼠IL17A及小鼠IL22加以分析。基於終點暴露量及功效程度的在活體內化合物E維持的功能效力對比對照抗體3(IL23A單株抗體)。對照抗體3：空心正方形、三角形及菱形。化合物E：實心正方形、三角形及菱形。MW：分子量。

第5圖為展示在活體內化合物E維持的功能效力對比TNF之一系列圖表及表。利用對照抗體2(TNFa單株抗體)或化合物E對小鼠等莫耳給藥，且利用人類TNF攻毒。在攻毒之後兩小時，收集全血並針對作為TNF之功能阻斷之量度的小鼠KC及小鼠IL-6加以分析。基於終點暴露量及功效程度的在活體內化合物E維持的功能效力對比抗TNF。對照抗體3：空心正方形、三角形及菱形。化合物E：實心正方形、三角形及菱形。MW：分子量。

本文描述的是結合至TNF-α(本文中亦稱為TNF-α或TNFa)及IL23A(亦稱為IL23p19或IL-23A)之化合物。迄今為止，尚未核准靶向TNF-α及IL23A兩者的化合物。使用生物治療劑方法同時中和兩種/更多種關鍵炎性仲介體之研究很有限。雖然此等研究未能證實針對類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis；RA)量測的臨床結果之改良，但迄今為止尚未描述靶向同一組合的雙功能治療劑。另外，此等組合可能增加副作用，諸如感染之風險(參見，例如，Genovese，M.C.，Cohen，S.，Moreland，L.，Lium，D.，Robbins，S.等人，(2004).Arth.Rheum.50，1412-9；Genovese，M.C.，Cohen，S.，Moreland，L.，Lium，D.，Robbins，S.等人，(2004).Arth.Rheum.50，1412-9；以及Weinblatt，M.， Schiff，M.，Goldman，A.Kremer，J.，Luggen，M.等人，(2007).Ann.Rheum.Dis.66，228-34)。另外，此等雙特異性化合物仍難以設計，此係歸因於與溶解度(例如，聚集)及穩定性(例如，不良藥物動力學)相關的問題。

驚人地是，已發現本文所述的結合至TNF-α及IL23A兩者的化合物相較於靶向IL23A或TNF-α之個別抗體而言具有類似或改良的性質。亦發現此等化合物具有適合的藥物動力學，且在用於給藥目的的適合範圍內為可溶的。另外，在一些實施例中，自個別療法之副作用及較低劑量之觀點而言，經由多次個別劑量投藥的單一投藥存在優點。另外，在一些實施例中，化合物之CMC性質證實：化合物具有低聚集度。在一個態樣中，示範性化合物展示尤其低的聚集度。亦展示的是：連接子經最佳化以改良穩定性且防止裂解，且YTE突變改良Fc Rn親和力。咸信，本文所述的化合物具有一或多種有利性質，例如，相較於標準抗體分子(例如，IgG分子或抗原結合片段(Fab))而言減小的副作用、增加的投藥便利性及安全性、增加的半衰期、增加的結合親和力或增加的抑制活性。

因此，本揭示內容之態樣係關於對TNF-α及IL23A兩者具特異性之化合物，以及使用及產生此等化合物之方法。

化合物

本揭示內容之態樣係關於對TNF-α及IL23A兩者具特異性之化合物。TNF-α之示範性蛋白質序列及IL23A之示範性蛋白質序列在以下展示。

>NP_000585.2-TNF-alpha[智人]

(SEQ ID NO：144)

>NP_057668.1-IL23A[智人]

(胺基酸1-19為預測信號序列)(SEQ ID NO：145)

在一些實施例中，化合物包含第一多肽及第二多肽。在一些實施例中，第一多肽包含(i)對第一標靶蛋白質具特異性之第一免疫球蛋白之輕鏈可變域(VL1)； (ii)對第二標靶蛋白質具特異性之第二免疫球蛋白之重鏈可變域(VH2)；以及(iii)鉸鏈區、重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)。在一些實施例中，第一多肽進一步包含重鏈恆定區1(CH1)。在一些實施例中，第二多肽包含：(i)對第二標靶蛋白質具特異性之第二免疫球蛋白之輕鏈可變域(VL2)；(ii)對第一標靶蛋白質具特異性之第一免疫球蛋白之重鏈可變域(VH1)。在一些實施例中，第一多肽進一步包含輕鏈恆定區(CL)。

應理解：第一多肽之可變域及恆定域/區可呈任何次序，且第二多肽之可變域及恆定域/區(若存在)可呈任何次序。第一多肽及第二多肽上之域/區的自N末端至C末端之多種示範性組態在以下展示。

第一多肽組態1：N-VL1-VH2-鉸鏈-CH2-CH3-C

第一多肽組態2：N-VH2-VL1-鉸鏈-CH2-CH3-C

第一多肽組態3：N-VL1-VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-C

第一多肽組態4：N-VH2-VL1-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-C

第二多肽組態1：N-VL2-VH1-C

第二多肽組態2：N-VH1-VL2-C

第二多肽組態3：N-VL2-VH1-CL-C

第二多肽組態4：N-VH1-VL2-CL-C

化合物之示範性組態展示於第1A圖及第1B圖中。在一些實施例中，化合物包含呈組態1之第一多肽及呈組態1之第二多肽。在一些實施例中，化合物包含呈組態3之第一多肽及呈組態3之第二多肽。

在一些實施例中，第一多肽及第二多肽之可變區彼此締合以形成用於第一標靶蛋白質之結合位點及用於第二標靶蛋白質之結合位點。在一些實施例中，第一多肽之VL1及第二多肽之VH1締合以形成結合第一標靶蛋白質之結合位點，且第二多肽之VL2及第一多肽之VH2締合以形成結合第二標靶蛋白質之結合位點。在一些實施例中，第一標靶蛋白質為TNF-α，且第二標靶蛋白質為IL23A。在其他實施例中，第一標靶蛋白質為IL23A，且第二標靶蛋白質為TNF-α。應理解，術語「第一」及「第二」並不意欲暗示對任一標靶蛋白質之重要性程度。

VL1、VH1、VL2及VH2中之每一者的序列之示範性組合在以下表1且亦在實例1中之表2A中提供。

在一些實施例中，化合物包含：VL1序列，其包含第一輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；以及VH1序列，其包含第一重鏈CDR1、CDR2及CDR3；VL2序列，其包含第二輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；以及VH2序列，其包含第二重鏈CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，CDR為表1或表2A中提供的一或多個VL1、VH1、VL2及VH2序列中之CDR。表1中提供的VL1、VH1、VL2及VH2序列之示範性輕鏈及重鏈CDR序列在以下展示：

SEQ ID NO：1 CDR：DYAMH(SEQ ID NO：146)(CDR1)、AITWNSGHIDYADSVEG(SEQ ID NO：147)(CDR2)、VSYLSTASSLDY(SEQ ID NO：148)(CDR3)

SEQ ID NO：2 CDR：RASQGIRNYLA(SEQ ID NO：149)(CDR1)、AASTLQS(SEQ ID NO：150)(CDR2)、QRYNRAPYT(SEQ ID NO：151)(CDR3)

SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5 CDR：SYAMH(SEQ ID NO：152)(CDR1)、FMSYDGSNKKYADSVKG(SEQ ID NO：153)(CDR2)、NYYYYGMDV(SEQ ID NO：154)(CDR3)

SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6 CDR：RASQSVYSYLA(SEQ ID NO：155)(CDR1)、DASNRAT(SEQ ID NO：156)(CDR2)、QQRSNWPPFT(SEQ ID NO：157)(CDR3)

SEQ ID NO：7 CDR：DQTIH(SEQ ID NO：158)(CDR1)、YIYPRDDSPKYNENFKG(SEQ ID NO：159)(CDR2)、PDRSGYAWFIY(SEQ ID NO：160)(CDR3)

SEQ ID NO：8 CDR：KASRDVAIAVA(SEQ ID NO：161)(CDR1)、WASTRHT(SEQ ID NO：162)(CDR2)、HQYSSYPFT(SEQ ID NO：163)(CDR3)

在一些實施例中，化合物包含VH1、VL1、VH2及/或VL2，其包含與表1中所述序列至少80%(例如，85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)一致的序列。兩個胺基酸序列之「一致性百分比」係使用Karlin及Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，1990之演算法，如Karlin及Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77，1993修改來測定。此種演算法係併入Altschul，等人J.Mol.Biol.215：403-10，1990之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)中。BLAST蛋白質搜索可利用XBLAST程式、記分=50、字長=3來執行，以獲得與所關注蛋白質分子同源的胺基酸序列。在兩個序列之間存在空隙的情況下，空隙化BLAST可如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997中所述來利用。當利用BLAST及空隙化BLAST程式時，可使用相應程式(例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數。

在一些實施例中，化合物包含VH1、VL1、VH2及/或VL2，其包含在表1中所述的序列中包含一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)突變之序列。此等突變可為保守胺基酸取代。如本文所使用，「保守胺基酸取代」係指不改變其中進行胺基酸取代的蛋白質之相對電荷或大小特性之胺基酸取代。胺基酸之保守取代包括例如在以下群組內的胺基酸中進行的取代：(a)M、C、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)S、D。

化合物之鉸鏈區、CH2及CH3(及視情況CH1及CL，若化合物含有此等區)之胺基酸序列可來源於任何適當來源，例如，抗體之恆定區，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。抗體重鏈及輕鏈恆定區胺基酸序列在此項技術中為熟知的，例如，在IMGT資料庫(www.imgt.org)或在www.vbase2.org/vbstat.php.處提供的彼等序列，兩者皆以引用方式併入本文。在一些實施例中，CH2及CH3之胺基酸序列來源於IgG1或IgG4(例如，SEQ ID NO：39或37)。在一些實施例中，CL包含κ CL或λ CL之胺基酸序列。在一些實施例中，鉸鏈區包含胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：40)。

在一些實施例中，化合物之CH2及/或CH3(及視情況CH1及CL，若化合物含有此等區)可包含一或多個胺基酸取代，該或該等胺基酸取代不同於野生型CH2或CH3，例如，野生型IgG1 CH2或CH3中之一或多個胺基酸取代或野生型IgG4 CH2或CH3中之一或多個胺基酸取代(SEQ ID NO：39提供示範性野生型IgG1)。此等取代在此項技術中為已知的(參見，例如，US7704497、US7083784、US6821505、US8323962、US6737056及US7416727)。

在一些實施例中，CH2包含在234、235、252、254及/或256處之胺基酸取代，該等編號係根據如用於習知抗體之Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Cmmunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1991，其以全文引用方式併入本文)中之EU索引來編號。應理解，本文所述的所有胺基酸位置係指如用於習知抗體之Kabat中之EU索引的編號。在一些實施例中，CH2包含在位置252、254及/或256處之胺基酸取代。在一些實施例中，位置252處之胺基酸為酪胺酸、苯基丙胺酸、絲胺酸、色胺酸或蘇胺酸。在一些實施例中，位置254處之胺基酸為蘇胺酸。在一些實施例中，位置254處之胺基酸為絲胺酸、精胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸或天冬胺酸。在一些實施例中，CH2包含在位置252處之酪胺酸、在位置254處之蘇胺酸及在位置256處之麩胺酸(本文中稱為YTE突變體)。在一些實施例中，CH2包含在位置234及/或235處之胺基酸取代。在一些實施例中，CH2包含在位置234處之丙胺酸及在位置235處之丙胺酸，本文中亦稱為KO突變體。在一些實施例中，CH2包含在位置252處之酪胺酸、在位置254處之蘇胺酸、在位置256 處之麩胺酸、在位置234處之丙胺酸及在位置235處之丙胺酸，本文中亦稱為KO-YTE突變體。

在一些實施例中，一或多個連接子可用於將域/區一起連接在第一多肽及/或第二多肽上。例如，第一多肽可包含VL1與VH2之間的連接子。若第一多肽包含CH1，則第一多肽可包含處於VL1或VH2(取決於以上論述的組態)與CH1之間的連接子(例如，VL1-連接子-CH1或VH2-連接子-CH1)。在另一實例中，第二多肽可包含處於VL2與VH1之間的連接子。若第二多肽進一步包含CL，則第二多肽可進一步包含處於VL2或VH1(取決於以上論述的組態)與CL之間的連接子(例如，VL2-連接子-CL或VH1-連接子-CL)。應理解，任何數目之連接子可用於將任何域或區連接至第一多肽上之任何其他另一域或區，及/或任何數目之連接子可用於將任何域或區連接至第二多肽上之任何其他另一域或區。

預期此項技術中已知的任何適合的連接子適於在本文中使用。在一些實施例中，連接子為肽連接子。在一些實施例中，肽連接子包含至少兩個胺基酸，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子之長度不超過50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子之長度在2個胺基酸與50個胺基酸之間、在2個胺基酸與40個胺基酸之間、在2個胺基酸與30個胺基酸之間、在2個胺基酸與20個胺基酸之間、在2個胺基酸與10個胺基酸之間、在2個胺基酸與9個胺基酸之間、在2個胺基酸與8個胺基酸之間、在2個胺基酸與7個胺基酸之間或在2個胺基酸與6個胺基酸之間。在一些實施例中，肽連接子包含胺基酸序列GGGSGGG(SEQ ID NO：9)、LGGGSG(SEQ ID NO：10)、FNRGES(SEQ ID NO：11)、VEPKSS(SEQ ID NO：12)或其組合。在一些實施例中，肽連接子可包含連接子序列之多個複本，例如，序列GGGSGGG(SEQ ID NO：9)、LGGGSG(SEQ ID NO：10)、FNRGES(SEQ ID NO：11)、VEPKSS(SEQ ID NO：12)或其組合之多個複本。

在一些實施例中，化合物包含兩個第一多肽及兩個第二多肽。在一些實施例中，第一多肽之一者的CH2及CH3與第一多肽之另一者的CH2及CH3締合以形成四價分子(例如，兩個第一多肽經由其相應CH2及CH3域之間的締合二聚化以形成四價分子，其包含對第一標靶蛋白質具特異性之兩個結合位點及對第二標靶蛋白質具特異性之兩個結合位點)。若第一多肽進一步包含CH1域，則CH1域亦可參與四價分子之形成(例如，兩個第一多肽經由其相應CH1、CH2及CH3域之間的締合二聚化以形成四價分子，其包含用於第一標靶蛋白質之兩個結合位點及用於第二標靶蛋白質之兩個結合位點)。在一些實施例中，兩個第一多肽經由至少一個二硫鍵締合在一起。

本文中亦預期與如本文所述的化合物競爭結合之其他化合物，例如與如本文所述的化合物競爭與TNF-α及IL23A結合的試驗化合物。在一些實施例中，試驗化合物可具有與如本文所述的化合物至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性。可使用此項技術中已知的任何測定來測定競爭性結合，例如，平衡結合、ELISA、表面電漿子共振或光譜學。

在一些實施例中，本文所述的化合物特異地結合至TNF-α及IL23A。「特異地結合」至抗原或抗原決定基之化合物為此項技術中熟知的術語，且測定此種特異結合之方法亦為此項技術中熟知的。若相比於分子與替代標靶反應或締合，該分子更頻繁地、更快速地、以更大持續時間及/或以更大親和力與特定標靶抗原反應或締合，則稱該分子展現「特異結合」。若與化合物結合至其他物質相比，該化合物以更大親和力、親合力更為容易地及/或以更大持續時間結合標靶抗原或抗原決定基，則該化合物「特異地結合」至該標靶抗原或抗原決定基。例如，特異地(或優先地)結合至抗原(例如，TNF-α或IL23A)或其中的抗原決定基的化合物為一化合物，與其結合至同一抗原中之其他抗原或其他抗原決定基相比，該化合物以更大親和力、親合力更為容易地及/或以更大持續時間結合此標靶抗原。亦應藉由解讀此定義理解的是，例如，特異地結合至第一標靶抗原之化合物可或可不特異地或優先地結合至第二標靶抗原。因而，「特異結合」或「優先結合」未必需要(儘管其可包括)唯一結合。通常但並非必要地，對結合之提及意指優先結合。在一些實例中，「特異地結合」至標靶抗原或其抗原決定基之化合物可不結合至同一抗原中之其他抗原或其他抗原決定基。

在一些實施例中，如本文所述的化合物具有對TNF-α及IL23或其抗原決定基之適合結合親和力。如本文所使用，「結合親和力」係指表觀締合常數或K_A。K_A為解離常數(K_D)之倒數。本文所述的化合物可具有對標靶抗原或抗原決定基中之一或兩者的至少10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12M或更低之結合親和力(K_D)。增加的結合親和力相應於減小的K_D。在一些實施例中，本文所述的化合物具有對標靶抗原或抗原決定基中之一或兩者的至少10^-11M或更低之結合親和力(K_D)。化合物對第一抗原及第二抗原相對於第三抗原之更高親和力結合可藉由與結合第三抗原之K_A(或數值K_D)相比結合第一抗原及第二抗原之更高K_A(或更小數值K_D)來指示。在此等狀況下，化合物具有對第一抗原及第二抗原(例如，呈第一構形之第一蛋白質或其模擬物及呈第一構形之第二蛋白質或其模擬物)相對於第三抗原(例如，呈第二構形之同一第一蛋白質或第二蛋白質或其模擬物；或第三蛋白質)而言的特異性。結合親和力之差異(例如，針對特異性或其他比較而言)可為至少1.5、2、 3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000倍或10⁵倍。

結合親和力(或結合特異性)可藉由各種方法來測定，該等方法包括平衡結合、ELISA、表面電漿子共振或光譜學(例如，使用螢光測定)。用於評估結合親和力之示範性條件係處於HBS-P緩衝液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005%(v/v)界面活性劑P20)中。此等技術可用於量測所結合的結合蛋白質之濃度隨標靶蛋白質濃度的變化。所結合的結合蛋白質之濃度([所結合])係根據以下方程式與游離標靶蛋白質之濃度([游離])及標靶上用於結合蛋白質之結合位點之濃度相關，其中(N)為每個標靶分子之結合位點數目：[所結合]=[N][游離]/(Kd+[游離])

然而，未必總是需要進行K_A之確切測定，因為有時足以獲得對親和力之定量量測結果，例如，使用諸如ELISA或FACS分析之方法進行測定，與K_A成比例且因此可用於比較，諸如判定較高親和力是否為例如2倍高，以便獲得親和力之定性量測結果，或獲得親和力之推論結果，例如，藉由功能測定(例如，活體外或活體內測定)中之活性來獲得。

在一些實施例中，化合物包含如表2A中所定義的第一多肽及第二多肽。在一些實施例中，化合物包含：(i)第一多肽包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列； (ii)第一多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(iii)第一多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(iv)第一多肽包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(v)第一多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(vi)第一多肽包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(vii)第一多肽包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；(viii)第一多肽包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；(ix)第一多肽包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列；(x)第一多肽包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列；(xi)第一多肽包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；(xii)第一多肽包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列；(xiii)第一多肽包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列； (xiv)第一多肽包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列；(xv)第一多肽包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列；(xvi)第一多肽包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列；(xvii)第一多肽包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列；(xviii)第一多肽包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；(xix)第一多肽包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列；(xx)第一多肽包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列；(xxi)第一多肽包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列；(xxii)第一多肽包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列；(xxiii)第一多肽包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列；(xxiv)第一多肽包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列；(xxv)第一多肽包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列； (xxvi)第一多肽包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列；(xxvii)第一多肽包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；(xxviii)第一多肽包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列；(xxix)第一多肽包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(xxx)第一多肽包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(xxxi)第一多肽包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列；(xxxii)第一多肽包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列；(xxxiii)第一多肽包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列；(xxxiv)第一多肽包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列；(xxxv)第一多肽包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列；(xxxvi)第一多肽包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列；(xxxvii)第一多肽包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列； (xxxviii)第一多肽包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列；(xxxix)第一多肽包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列；(xl)第一多肽包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列；(xli)第一多肽包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列；(xlii)第一多肽包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列；(xliii)第一多肽包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列；(xliv)第一多肽包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列；(xlv)第一多肽包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列；(xlvi)第一多肽包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列；(xlvii)第一多肽包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列；(xlviii)第一多肽包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列；(xlix)第一多肽包含SEQ ID NO：116之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：117之胺基酸序列； (l)第一多肽包含SEQ ID NO：118之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列；(li)第一多肽包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列；(lii)第一多肽包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列；(liii)第一多肽包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列；(liv)第一多肽包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列；(lv)第一多肽包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列；(lvi)第一多肽包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列；(lvii)第一多肽包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列；(lviii)第一多肽包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列；(lix)第一多肽包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列；(lx)第一多肽包含SEQ ID NO：138之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列；(lxi)第一多肽包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：141之胺基酸序列；或 (lxii)第一多肽包含SEQ ID NO：142之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：143之胺基酸序列。

在一些實施例中，化合物包含：(i)第一多肽包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(ii)第一多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(iii)第一多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(iv)第一多肽包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(v)第一多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(vi)第一多肽包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(vii)第一多肽包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；(viii)第一多肽包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；(ix)第一多肽包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列；(x)第一多肽包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列； (xi)第一多肽包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；或(xii)第一多肽包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。

產生化合物、核酸、載體及細胞之方法

本揭示內容之態樣亦包括核酸，其編碼本文所述的化合物或本文所述的多肽(例如，本文所述的第一多肽或第二多肽)，可共同或單獨地編碼。編碼本文所述的化合物或本文所述的多肽之多核苷酸可藉由此項技術中已知的任何方法獲得，且可藉由此項技術中已知的任何方法測定該等多核苷酸之核苷酸序列。

在一些實施例中，核酸包含在載體內，諸如包含在表現載體內。在一些實施例中，載體包含可操作連接至核酸之啟動子。

各種啟動子可用於本文所述的化合物或本文所述的多肽之表現，該等啟動子包括但不限於巨細胞病毒(cytomegalovirus；CMV)立即早期啟動子，諸如勞斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1 LTR之病毒LTR，猿猴病毒40(simian virus 40；SV40)早期啟動子，大腸桿菌lac UV5啟動子及單純皰疹tk病毒啟動子。

亦可使用可調節啟動子。此等可調節啟動子包括使用來自大腸桿菌之lac阻遏因子作為轉錄調控因子以調節自帶有lac操縱子之哺乳動物細胞啟動子之轉錄的彼等啟動子[Brown，M.等人，Cell，49：603-612(1987)]；使用四環素阻遏因子(tetracycline repressor；tetR)之彼等啟動子[Gossen，M.及Bujard，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992)；Yao，F.等人，Human Gene Therapy，9：1939-1950(1998)；Shockelt，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995)]。其他系統包括FK506二聚物、使用雌二醇之VP16或p65、RU486、二酚米勒留酮或雷帕黴素。可誘導系統可購自Invitrogen、Clontech及Ariad。

可使用包括具有操縱組之阻遏因子之可調節啟動子。在一個實施例中，來自大腸桿菌之lac阻遏因子可用作轉錄調控因子以調節自帶有lac操縱子之哺乳動物細胞啟動子之轉錄[M.Brown等人，Cell，49：603-612(1987)]；Gossen及Bujard(1992)；[M.Gossen等人，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)]將四環素阻遏因子(tetracycline repressor；tetR)與轉錄活化子(VP 16)組合以產生tetR-哺乳動物細胞轉錄活化子融合蛋白質tTa(tetR-VP 16)，與來源於人類巨細胞病毒(hCMV)主要立即早期啟動子之帶有tetO之最小啟動子組合以產生tetR-tet操縱子系統，從而控制在哺乳動物細胞中之基因表現。在一個實施例中，使用四環素可誘導交換(Yao等人，Human Gene Therapy；Gossen等人，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)；Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995))。

另外，載體可含有例如以下一些或所有：可選擇標記基因，諸如用於在哺乳動物細胞中選擇穩定或暫態轉染物之新黴素基因；來自人類CMV之立即早期基因的用於高程度轉錄之強化子/啟動子序列；來自SV40的用於mRNA穩定性之轉錄終止及RNA加工信號；用於適當游離基因複製之SV40多瘤複製起點及ColE1；內部核糖體結合位點(IRESes)，即多功能多選殖位點；以及用於有義RNA及反義RNA之活體外轉錄的T7及SP6 RNA啟動子。適合的載體及用於產生含有轉殖基因之載體的方法在此項技術中為熟知及可利用的。

包含核酸之表現載體可藉由習知技術(例如，電穿孔、脂質體轉染及磷酸鈣沉澱)轉移至宿主細胞，且隨後藉由習知技術培養轉染細胞以產生本文所述的化合物。在一些實施例中，本文所述的化合物之表現係藉由組成性、可誘導或組織特異性啟動子來調節。

用於表現本文所述的化合物或本文所述的多肽之宿主細胞可為諸如大腸桿菌之細菌細胞，或較佳為真核細胞。詳言之，與諸如來自人類巨細胞病毒之主要立即期基因啟動子元件之載體結合的諸如中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell；CHO)之哺乳動物細胞為用於免疫球蛋白之有效表現系統(Foecking等人 (1986)「Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors」,Gene 45：101-106；Cockett等人(1990)「High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification」,Biotechnology 8：662-667)。

各種宿主-表現載體系統可用於表現本文所述的化合物或本文所述的多肽。此等宿主-表現系統表示可藉以產生並隨後純化本文所述的化合物或本文所述的多肽之編碼序列的媒劑，而且表示可在利用適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時原位表現本文所述的化合物之細胞。此等系統包括但不限於：利用含有用於本文所述的化合物之編碼序列的重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型的微生物，諸如細菌(例如，大腸桿菌及枯草桿菌)；利用含有編碼本文所述的化合物之序列的重組酵母表現載體轉型之酵母(例如，畢赤酵母菌(Saccharomyces pichia))利用含有編碼本文所述的化合物之序列的重組病毒表現載體(例如，桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；利用重組病毒表現載體(例如，花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus；CaMV)及煙草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus；TMV)感染或利用重組質體表現載體(例如，Ti質體)轉型之植物細胞系統，該等表現載體含有編碼本文所述的分子化合物之序列；或哺乳動物細胞系統(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、淋巴細胞(參見美國專利第5,807,715號)、Per C.6細胞(藉由Crucell開發的人類視黃醛細胞)，其藏有重組表現構築體，該等重組表現構築體含有來源於哺乳動物細胞之基因組之啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；痘瘡病毒7.5K啟動子)。

在細菌系統中，許多表現載體可取決於所表現化合物之所欲用途來有利地選擇。例如，當將產生大數量之此種蛋白質時，對本文所述的化合物之醫藥組成物之產生而言，引導容易純化的融合蛋白質產物之高程度表現之載體可為合乎需要的。此等載體包括但不限於大腸桿菌表現載體pUR278(Ruther等人(1983)「Easy Identification Of cDNA Clones」,EMBO J.2：1791-1794)，其中編碼序列可個別地與lac Z編碼區同框接合於載體中以便產生融合蛋白質；pIN載體(Inouye等人(1985)「Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli」,Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke等人(1989)「Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli」,J.Biol.Chem.24：5503-5509)；及類似物。pGEX載體亦可用於將外來多肽表現為與麩胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase；GST)之融合蛋白質。一般而言，此等融合蛋白質為可溶性的且可容易藉由吸附並結合至基質麩胱甘肽-瓊脂糖珠粒繼之以於游離麩胱甘肽存在下溶離而自溶解細胞純化。pGSX載體係設計來包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點，以便經選殖標靶基因產物可自GST部分釋放。

在昆蟲系統中，加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus；AcNPV)係用作載體來表現外來基因。病毒在草地黏蟲細胞中生長。編碼序列可個別地選殖至病毒之非必需區(例如，多角體蛋白基因)中，且置於AcNPV啟動子(例如，多角體蛋白啟動子)之控制之下。

在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多基於病毒之表現系統。在其中腺病毒用作表現載體之狀況下，所關注編碼序列可接合至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子及三連前導序列。此嵌合基因可隨後藉由活體外或活體內重組而插入腺病毒基因組中。在病毒基因組之非必需區(例如，E1區或E3區)中之插入將產生重組病毒，其在感染宿主中有效並能夠表現免疫球蛋白分子(例如，參見，Logan等人(1984)「Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。亦可需要特定起始信號用於所插入抗體編碼序列之有效轉譯。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外，起始密碼子必須與所欲編碼序列之讀取框架同相(in phase)，以確保整體插入物之轉譯。此等外源轉譯控制信號及起始密碼子可具有各種起源，即天然起源及合成起源。表現之效率可藉由包涵適當轉錄強化子元件、轉錄終止子等等而強化(參見，Bitter等人(1987)「Expression And Secretion Vectors For Yeast」,Methods in Enzymol.153：516-544)。

另外，可選擇宿主細胞菌株，該菌株調控插入序列之表現或以所欲特定方式修飾並加工基因產物。蛋白質產物之此等修飾(例如，醣基化)及加工(例如，裂解)可對蛋白質之功能而言為重要的。例如，在某些實施例中，本文所述的化合物可表現為單一基因產物(例如，表現為單一多肽鏈，亦即，表現為多蛋白質前驅物)，其需要藉由天然或重組細胞機制而蛋白解裂解以形成本文所述的化合物之單獨多肽。本揭示內容因此涵蓋工程改造核酸序列以編碼包含本文所述的化合物之多肽的多蛋白質前驅物分子，該核酸序列包括能夠引導多蛋白質前驅物之轉譯後裂解的編碼序列。多蛋白質前驅物之轉譯後裂解產生本文所述的化合物之多肽。包含本文所述的化合物之多肽的前驅物分子之轉譯後裂解可活體內發生(亦即，在宿主細胞內藉由天然或重組細胞系統/機制發生，例如，藉由在適當位點處之弗林蛋白裂解而發生)，或可活體外發生(例如，在包含具有已知活性之蛋白酶或肽酶之組成物中孵育該多肽鏈，及/或在包含已知促成所欲蛋白解動作之條件或試劑的組成物中孵育該多肽鏈)。重組蛋白質之純化及修飾在此項技術中為熟知的，以使得多蛋白質前驅物之設計可包括藉由熟練技藝者容易瞭解的許多實施例。此項技術中已知的任何已知蛋白酶或肽酶可用於前驅物分子之所述修飾，例如凝血酶或因子Xa(Nagai等人(1985)「Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli」,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：7252-7255，且綜述於Jenny等人(2003)「A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa」,Protein Sxpr.Purif.31：1-11中，其每一者以全文引用方式併入本文))；腸激酶(Collins-Racie等人(1995)「Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA」,Biotechnology 13：982-987，其據此以全文引用方式併入本文中))；弗林蛋白；以及AcTEV(Parks等人(1994)「Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase」,Anal.Biochem.216：413-417，其據此以全文引用方式併入本文中))及口蹄疫病毒蛋白酶C3。

不同宿主細胞具有用於蛋白質及基因產物之轉譯後加工及修飾的特性及特定機制。適當細胞系或宿主系統可經選擇以確保所表現的外來蛋白質之正確修飾及加工。為此，可使用擁有用於主要轉錄物之適當加工、基因產物之醣基化及磷酸化之細胞機器的真核宿主細胞。此等哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20及T47D、CRL7030及Hs578Bst。

對重組蛋白質之長期、高產率生產而言，穩定表現較佳。例如，穩定表現本文所述的化合物之細胞系可經工程改造。並非是使用含有病毒複製起點之表現載體，而是可利用藉由適當表現控制元件(例如，啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等等)控制之DNA及可選擇標誌物將宿主細胞轉型。在引入外來DNA之後，可使工程改造細胞在富集培養基中生長約1-2天，且隨後將培養基交換為選擇性培養基。重組質體中之可選擇標誌物賦予對選擇之抵抗力，且允許細胞穩定地將質體整合至其染色體中且生長以形成聚點(foci)，該聚點可繼而選殖並擴展至細胞系中。此方法可有利地用於工程改造表現本文所述的化合物之細胞系。此等工程改造細胞系可尤其適用於篩選及評估直接或間接與本文所述的化合物相互作用之化合物。

可使用許多選擇系統，該等選擇系統包括但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人(1977)「Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells」,Cell 11：223-232)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska等人(1992)「Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy」,Bioessays 14：495-500)，且腺嘌昤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人(1980)「Isolation Of Transforming DNA：Cloning The Hamster aprt Gene」,Cell 22：817-823)基因可分別用於tk細胞、hgprt細胞或aprt細胞中。此外，抗代謝物質抵抗力可用作以下基因之選擇基礎：dhfr，其賦予對胺甲喋呤之抵抗力(Wigler等人(1980)「Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567-3570；O'Hare等人(1981)「Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase」,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 78：1527-1531)；gpt，其賦予對黴酚酸之抵抗力(Mulligan等人(1981)「Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076)；neo，其賦予對胺基苷類G-418之抵抗力(Tolstoshev(1993)「Gene Therapy，Concepts，Current Trials And Future Directions」,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)「The Basic Science Of Gene Therapy」,Science 260：926-932；以及Morgan等人(1993)「Human Gene Therapy」,Ann.Rev.Biochem.62：191-217)以及hygro，其賦予對濕黴素之抵抗力(Santerre等人(1984)「Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells」,Gene 30：147-156)。可使用的在重組DNA技術領域中通常已知的方法描述於Ausubel等人(編)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；以及Dracopoli等人(編)，1994， Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY.，第12及13章；Colberre-Garapin等人(1981)「A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells」,J.Mol.Biol.150：1-14。

本文所述的化合物或本文所述的多肽之表現程度可藉由載體擴增來增加(為回顧，參見Bebbington及Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，New York，1987)。當表現本文所述的化合物之載體系統中之標誌物為可擴增時，宿主細胞之培養物中存在的抑制劑含量之增加將增加標記基因之複本數目。因為所擴增區與本文所述的化合物或本文所述的多肽之核苷酸序列相關聯，所以多肽之產生亦將增加(Crouse等人(1983)「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes」,Mol.Cell.Biol.3：257-266)。

宿主細胞可與兩個表現載體共轉染，第一載體編碼本文所述的化合物之第一多肽，且第二載體編碼本文所述的化合物之第二多肽。兩個載體可含有一致的可選擇標記物，從而允許兩種多肽之相等表現。替代地，可使用編碼兩種多肽之單一載體。用於本文所述的化合物之多肽的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。

一旦本文所述的化合物或本文所述的多肽已獲重組表現，即可藉由此項技術中已知的用於多肽、多蛋白質或抗體之純化的任何方法來純化(例如，與基於抗原選擇性之抗體純化方案類似)，例如，藉由層析(例如，離子交換、親和力，尤其藉由針對特定抗原之親和力(視情況在蛋白質A選擇之後，其中化合物包含Fc域(或其部分))，以及尺寸分級管柱層析)、離心作用、差分溶解度或藉由用於多肽或抗體之純化的任何其他標準技術來純化。

本揭示內容之其他態樣係關於包含本文所述的核酸或本文所述的載體之細胞。細胞可為原核細胞或真核細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。本文描述示範性細胞類型。

本揭示內容之其他態樣係關於產生本文所述的化合物或本文所述的多肽(例如，第一多肽或第二多肽)之方法，該產生包含獲得本文所述的細胞，且在該細胞中表現如本文所述的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含分離及純化本文所述的化合物或本文所述的多肽。

治療方法及適用於醫藥之組成物

本揭示內容之其他態樣係關於治療方法及適用於醫藥之組成物。適用於此等方法及組成物之化合物之非限制性實例為包含以下者之彼等化合物： (i)第一多肽包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(ii)第一多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(iii)第一多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(iv)第一多肽包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(v)第一多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(vi)第一多肽包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(vii)第一多肽包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；(viii)第一多肽包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；(ix)第一多肽包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列；(x)第一多肽包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列；(xi)第一多肽包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；或(xii)第一多肽包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。

在一些實施例中，治療或使用方法為治療自體免疫疾病或炎性疾病之方法或用於此種方法之用途。在一些實施例中，該方法包含向受試者投與本文所述的化合物或包含該化合物之醫藥組成物，該受試者例如患有自體免疫疾病或炎性疾病或冒有患上該疾病風險之受試者。

待藉由本文所述的方法治療的受試者可為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括但不限於農場動物、賽場動物、寵物、靈長類動物、馬、犬、貓、小鼠及大鼠。需要治療之人類受試者可為患有疾病、冒有患上疾病風險或疑似患有疾病之人類受試者。患有疾病之受試者可藉由例行醫療檢查來鑑定，該例行醫療檢查例如身體檢查、實驗室試驗、器官功能試驗、CT掃描或超音波。疑似患有任何此種疾病之受試者可展示該疾病之一或多種症狀。例如自體免疫及炎性疾病之疾病之徵象及症狀為一般技藝人士所熟知。冒有疾病風險之受試者可為具有針對彼疾病而言的風險因子中之一或多者的受試者。

自體免疫疾病之非限制性實例包括類風溼性關節炎、牛皮癬、1型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、移植物排斥、自體免疫甲狀腺疾病(橋本氏病)、類肉瘤病、硬皮症、肉芽腫性血管炎、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、休格倫氏病、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、多發性肌炎、皮肌炎、結節性多動脈炎、免疫介導水泡皮膚病、貝塞特氏症候群、多發性硬化症、全身性硬化、古巴士德氏病或免疫介導腎小球性腎炎。

炎性疾病之非限制性實例包括：類風溼性關節炎、全身性紅斑狼瘡、斑禿、僵直性脊椎炎、抗磷脂質症候群、自體免疫愛迪生氏病、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫內耳病、自體免疫淋巴增生性症候群(autoimmune lymphoproliferative syndrome；ALPS)、自體免疫血小板減少症紫癜症(autoimmune thrombocytopenic purpura；ATP)、貝塞特氏病、大皰性類天皰瘡、心肌病變、乳糜灣性皮炎、慢性疲勞症候群免疫缺乏症候群(chronic fatigue syndrome immune deficiency syndrome；CFIDS)、慢性炎性脫髓鞘性多發性神經病變、疤痕性類天皰瘡、冷凝集素病、克雷斯特症候群、克隆氏病、德哥氏病、皮肌炎、幼年皮肌炎、盤狀紅斑、原發性冷凝球蛋白症、纖維肌痛-纖維肌炎、葛瑞夫茲氏病、格巴二氏症、橋本氏甲狀腺炎、特發性肺纖維化、特發性血小板缺乏紫斑症(idiopathic thrombocytopenia purpura；ITP)、Iga腎病變、胰島素依賴性糖尿病(I型)、幼年型關節炎、梅尼爾氏症、混合結締組織疾病、多發性硬化症、重症肌無力、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多發性軟骨炎、多腺體症候群、多發性風濕肌痛、多發性肌炎及皮肌炎、原發性無伽瑪球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、雷諾氏現象、賴特氏症候群、風濕性熱、類肉瘤病、硬皮症、休格倫氏症候群、僵硬人症候群、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸炎、素層炎、脈管炎、白斑病及魏格納氏肉芽腫。在一些實施例中，自體免疫疾病或炎性疾病為克隆氏病、關節黏連性脊椎炎或牛皮癬性關節炎。

為實踐本文揭示的方法，可向需要治療之受試者(例如，人類)投與有效量之本文所述的化合物或醫藥組成物。各種遞送系統為已知的且可用於投與本發明之化合物。投藥之方法包括但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上及經口路線。本發明之化合物可例如藉由輸注、推注或注射來投與，且可連同諸如消炎劑之其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身的或局部的。在較佳實施例中，投藥係藉由皮下注射投與。用於此等注射之調配物可在例如預填充注射器中製備，該等注射器可每隔一週投與一次。

如本文所使用的「有效量」係指對受試者賦予治療效應所需的每一化合物(單獨或與一或多種其他化合物組合)之量。如熟習此項技術者所認識到的，有效量取決於以下者而變化：受治療的特定病狀，病狀之嚴重性，包括年齡、身體狀況、體型、性別及重量之個別受試者參數，治療之持續時間，並用療法(若存在)之性質，特定投藥路線及健康從業者之知識及專長範圍內之類似因素。此等因素為一般技藝人士所熟知，且可只需在例行實驗情況下予以確認。通常較佳的是，使用個別組分或其組合之最大劑量，亦即，根據完善醫療判斷之最高安全劑量。然而，一般技藝人士應理解的是，受試者可能出於醫療原因、心理原因或出於實際上任何其他原因而堅持較低劑量或可耐受劑量。

諸如半衰期之經驗性考慮因素通常將有助於劑量之判定。例如，與人類免疫系統相容的化合物，諸如包含來自人類化抗體或完全人類抗體之區的化合物可用於延長化合物之半衰期，且防止化合物受宿主之免疫系統攻擊。投藥之頻率可做測定且在療法之過程中加以調整，且通常而非必需基於疾病之治療及/或抑止及/或改善及/或延遲。替代地，化合物之持續連續釋放調配物可為適當的。用於達成持續釋放之各種調配物及裝置在此項技術中為已知的。

在一些實施例中，劑量為每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天或每六天。在一些實施例中，劑量頻率為每週一次、每2週一次、每4週一次、每5週一次、每6週一次、每7週一次、每8週一次、每9週一次或每10週一次；或每月一次、每2個月或每3個月一次，或較長頻率。此療法之進程容易藉由習知技術及測定來監視。劑量方案(包括所使用化合物)可隨時間推移而變化。

在一些實施例中，對正常重量之成人受試者而言，可投與在約0.01mg/kg至1000mg/kg範圍變化之劑量。在一些實施例中，劑量在1mg至200mg之間。特定劑量方案(亦即，劑量、定時及重複率)將取決於特定受試者及彼受試者之醫療史，以及化合物之性質(諸如化合物之半衰期，及此項技術中熟知的其他考慮因素)。

出於本揭示內容之目的，如本文所述的化合物之適當劑量將取決於所使用的特定化合物(或其組成物)、調配物及投藥路線、疾病之類型及嚴重性、化合物係投與用於預防目的還是治療目的、先前療法、受試者之臨床病史及對拮抗劑之反應，以及主治醫師之裁量。典型地，臨床醫師將投與化合物直至達到達成所欲結果之劑量。一或多種化合物之投藥可為連續或間歇的，此例如取決於受體之生理狀況、投藥之目的為治療還是預防，以及熟練從業者所知的其他因素。化合物之投藥可在預選時段內為基本上連續的，可在例如發展出疾病之前、期間或之後呈一系列間隔劑量。

如本文所使用，術語「治療」係指向患有疾病、具有疾病之症狀或具有患病傾向之受試者應用或投與化合物或包括化合物之組成物，以達醫治、治癒、減輕、緩解、改變、救治、改善、改良或影響疾病、疾病之症狀或患病傾向的目的。

減輕疾病包括延遲疾病之發展或進展或減少疾病嚴重性。減輕疾病未必需要治癒結果。如本文所使用，「延遲」疾病之發展意指推遲、阻礙、減緩、阻滯、穩定及/或延緩疾病之發展。此延遲可為變化的時間長度，其取決於疾病史及/或所治療之個體。「延遲」或減輕疾病之發展或延遲疾病之發作的方法為一種方法，當與不使用該方法相比時，其減少在給定時間框架內發展出疾病之一或多種症狀之機率及/或減少症狀在給定時間框架內之程度。此等比較係典型地基於臨床研究，該等臨床研究使用足以得出統計顯著結果的受試者數目。

疾病之「發展」或「進展」意指疾病之初始表現及/或繼起進展。疾病之發展可為可偵測的，且亦使用此項技術中已知的標準臨床技術來評估。然而，發展亦係指可能不可偵測的進展。對本揭示內容之目的而言，發展或進展係指症狀之生物過程。「發展」包括發生、再發及發作。如本文所使用，疾病之「發作」或「發生」包括初始發作及/或再發。

在一些實施例中，本文所述的化合物係以足以將TNF-α或IL23A之一或兩者之活性活體內或活體外抑制至少20%(例如，30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大)之量投與至需要治療之受試者。用於判定化合物之抑制能力的方法在此項技術中為已知。示範性TNF-α及IL23A抑制測定提供在實例中。

為醫藥領域之一般技藝人士所知的習知方法可用於取決於待治療之疾病之類型或疾病位點來向受試者投與化合物或醫藥組成物。此組成物亦可經由其他習知路線來投與，例如經口、非經腸、藉由吸入噴霧、局部地、經直腸、經鼻、經頰、經陰道或經由植入儲器來投與。如本文所使用的術語「非經腸」包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、膜鞘內、病灶內及顱內注射或輸注技術。另外，可經由可注射積存式投藥路線來向受試者投與組成物，諸如使用1個月、3個月或6個月積存式可注射或可生物降解材料及方法來投與。

醫藥組成物

本揭示內容之其他態樣係關於醫藥組成物，其包含本文所述的化合物。包含本發明之化合物(例如，對TNF-α及IL23A兩者具特異性之化合物)的組成物可投與至患有自體免疫疾病或炎性疾病或冒有患上該疾病風險之受試者。本發明進一步提供本發明之化合物在製造用於治療自體免疫疾病或炎性疾病之藥劑中的用途。化合物可單獨投與或與其他組成物組合投與，以預防或治療自體免疫疾病或炎性疾病。適用於此等醫藥組成物的本發明之化合物之非限制性實例為包含以下者之彼等化合物：(i)第一多肽包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(ii)第一多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(iii)第一多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(iv)第一多肽包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(v)第一多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(vi)第一多肽包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列； (vii)第一多肽包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；(viii)第一多肽包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；(ix)第一多肽包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列；(x)第一多肽包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列；(xi)第一多肽包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；或(xii)第一多肽包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。

如本文所使用，術語「醫藥組成物」係指本文所述的化合物與醫藥學上可接受之載劑組合的調配物。醫藥組成物可進一步包含另外的藥劑(例如，用於特定遞送，增加半衰期或其他治療化合物)。

如此處所使用，術語「醫藥學上可接受之載劑」意指醫藥學上可接受之材料、組成物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如，潤滑劑、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅或硬脂酸)或溶劑囊封材料，該等載劑涉及將化合物自身體之一個位點(例如，遞送位點)運載或輸送至另一位點(例如，身體之器官、組織或部分)。醫藥學上可接受之載劑在以下意義上為「可接受的」：與調配物之其他成分相容且不損傷受試者之組織(例如，生理上相容的、無菌的、生理pH的，等等)。可充當醫藥學上可接受之載劑的材料之一些實例包括：(1)糖類，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；(3)纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素及乙酸纖維素；(4)粉末黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石；(8)賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；(9)油類，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；(10)乙二醇，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)；(12)酯類，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等張鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH緩衝溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯及/或聚酸酐；(22)增積劑，諸如多肽及胺基酸；(23)血清組分，諸如血清白蛋白、HDL及LDL；(22)C2-C12醇，諸如乙醇；以及(23)用於醫藥調配物中之其他無毒相容性物質。潤濕劑、著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調味劑、香化劑、防腐劑及抗氧化劑亦可存在於調配物中。諸如「賦形劑」、「載劑」、「醫藥學上可接受之載劑」或類似物之術語在本文中可互換使用。

在一些實施例中，組成物中的本發明之化合物係藉由注射、藉助於導管、藉助於栓劑或藉助於植入物投與，該植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括諸如矽橡膠膜之膜或纖維。典型地，當投與組成物時，使用不吸收本發明之化合物之材料。

在其他實施例中，本發明之化合物係於受控釋放系統中遞送。在一個實施例中，可使用泵(參見，例如，Langer，1990，Science 249：1527-1533；Sefton，1989，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507；Saudek等人，1989，N.Sngl.J.Med.321：574)。在另一實施例中，可使用聚合物材料。(參見，例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer及Wise編，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance(Smolen及Ball編，Wiley，New York，1984)；Ranger及Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61。亦參見，Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：105。)其他受控釋放系統例如論述於如上Langer中。

本發明之化合物可作為醫藥組成物來投與，該等醫藥組成物包含治療有效量之黏合劑及一或多種醫藥學上相容之成分。

在典型實施例中，醫藥組成物係根據例行程序調配為適合於向例如人類之受試者靜脈內或皮下投藥之醫藥組成物。典型地，用於藉由注射投藥之組成物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。在必要時，醫藥劑亦可包括助溶劑及諸如利諾卡因(lignocaine)之局部麻醉劑以減輕注射位點處之疼痛。通常，成分單獨地供應或一起混合在單位劑型中，例如，作為於氣密密封容器中之乾燥凍乾粉末或無水濃縮物，該容器諸如指示活性劑數量之安瓿或包囊。在醫藥劑將藉由輸注投與時，該醫藥劑可利用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶來分配。在醫藥劑藉由注射投與的情況下，可提供無菌注射用水或鹽水之安瓿以便成分可在投藥之前混合。

用於全身投藥之醫藥組成物可為液體，例如，無菌鹽水、乳酸化林格氏溶液或漢克氏溶液。另外，醫藥組成物可呈固體形式，且在使用之前立即再溶解或懸浮。亦涵蓋凍乾形式。

醫藥組成物可含於脂質粒子或囊泡內，諸如脂質體或微晶體，其亦適用於非經腸投藥。粒子可具有任何適合的結構，諸如單層狀或多層狀，只要組成物含在該等粒子中即可。化合物可截留在『穩定質體-脂質粒子』(stabilized plasmid-lipid particle；SPLP)中，該等粒子含有融合脂質二油醯基磷脂醯基乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine；DOPE)、低含量(5-10mol%)之陽離子脂質，且該等化合物藉由聚乙二醇(polyethyleneglycol；PEG)包衣來穩定(Zhang Y.P.等人，Gene Ther.1999，6：1438-47)。諸如N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨甲基硫酸酯或「DOTAP」之帶正電脂質對此等粒子及囊泡而言尤其較佳。此等脂質粒子之製備為熟知的。參見，例如，美國專利第4,880,635號；第4,906,477號；第4,911,928號；第4,917,951號；第4,920,016號；以及第4,921,757號。

本揭示內容之醫藥組成物可作為例如單位劑量來投與或包裝。當提及本揭示內容之醫藥組成物來使用時，術語「單位劑量」係指實體上分立的單位，其適合作為用於受試者之單一劑量，每一單位含有預定數量之活性材料，該預定數量經計算以產生與所需稀釋劑(亦即，載劑或媒劑)相關聯的所欲治療效應。

在一些實施例中，本文所述的化合物可接合至治療部分，例如消炎劑。用於將此等治療部分接合至多肽(包括例如Fc域)之技術為熟知的；參見，例如，Amon等人，「Monoclonal Antibodies For Cmmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(編)，1985，第243-56頁， Alan R.Liss，Cnc.)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編)，1987，第623-53頁，Marcel Dekker，Cnc.)；Thorpe，「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」，Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(編)，1985，第475-506頁)；「Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(編)，1985，第303-16頁，Academic Press；以及Thorpe等人(1982)「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」,Cmmunol.Rev.，62：119-158。

另外，醫藥組成物可提供為醫藥套組，其包含(a)容器，該容器含有呈凍乾形式的本發明之化合物；以及(b)第二容器，該第二容器含有用於注射的醫藥學上可接受之稀釋劑(例如，無菌水)。醫藥學上可接受之稀釋劑可用於本發明之凍乾化合物之復水或稀釋。視情況與此容器相關聯的為呈藉由管制醫藥劑或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構規定之形式的注意事項，該注意事項反映出製造、使用或銷售機構針對人類投藥之批准。

在另一態樣中，包括含有適用於以上所述疾病之治療的材料之製品。在一些實施例中，製品包含容器及標籤。適合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器及試管。容器可由諸如玻璃或塑膠之各種材料形成。在一些實施例中，容器容納有效用於治療本文所述的疾病之組成物且可具有無菌出入埠。例如，容器可為靜脈內溶液袋或小瓶，其具有可藉由皮下注射針穿透之塞子。組成物中之活性劑為本發明之化合物。在一些實施例中，容器上或與容器相關聯之標籤指示：組成物用於治療目標疾病。製品可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液。該第二容器可進一步包括自商業及使用者立場而言為合乎需要的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及帶有使用說明書之包裝插頁。

無需進一步詳盡闡述，咸信，熟習此項技術者可基於以上描述利用本揭示內容以達其最完全程度。以下特定實施例因此欲解釋成僅僅為說明性的，而不以任何方式來限制本揭示內容之其餘部分。本文中引述的所有公開案係以引用方式併入來達到在本文中引用之目的或用於本文中提及之標的。

實例 實例1.靶向IL23A及TNF-α之示範性化合物之構造。

以下表2A提供結合至IL23A及TNF-α兩者的用於以下實例中之示範性化合物。此等化合物藉由此項技術中已知的重組方法產生(參見，例如，PCT公開案WO 2006/113665、WO 2008/157379及WO 2010/080538，其全部以引用方式併入本文)。簡言之，編碼每一化合物之第一多肽及第二多肽的質體係使用FreeStyle MAX試劑(CHO)來共同轉染至CHO-S細胞中。將細胞培養13-14天，且藉由細胞產生的化合物係使用Protein-A層析來純化。化合物進一步使用粒徑排阻層析來進一步純化。

TNFa=TNF-α，VL=可變域輕鏈，VH=可變域重鏈，GS=GGGSGGGG(SEQ ID NO：9)，LGGGSG(SEQ ID NO：10)或兩者，VF=FNRGES(SEQ ID NO：11)，VEPKSS(SEQ ID NO：12)或兩者，IgG1Wn=IgG1野生型；IgG1KO-YTS=在Fc區中具有M252Y/S254T/T256a三重突變且亦包含L234A/L235A突變之IgG1，IgG4Pro-YTE=在Fc區中具有M252Y/S254T/T256E三重突變且亦包含S241P突變之IgG4，IgG1KO=包含L234A/L235A突變之截斷Fc區，IgG4Pro=包含S241P突變。1^st=第一多肽，2^nd=第二多肽。突變之編號為用於習知抗體之Kabat編號，其係以CH1處的抗體慣例開始。

以下對照抗體亦用於比較目的。對照物為靶向TNFa或IL23之單株抗體。

實例2. 示範性化合物之表面電漿子共振(Surface Plasmon Resonance；SPR)親和力

藉由SPR分析試驗化合物來測定對TNF-α及IL23A之親和力。

材料及方法

SPR實驗係於ProteOn XPR36儀器(Bio Rad)上執行。利用0.5% SDS、50mM NaOH及100mM HCl之60sec連續注射，在30μl/min之流率下於垂直方向及水平方向上預調節GLM晶片。隨後藉由在6個水平通道中注射比率為1：1之EDC(76.7mg/ml)及磺酸基-NHS(21.7mg/ml)混合物來活化預調節GLM晶片。將於10mM、pH 5.0乙酸鈉緩衝液中濃度為30μg/ml之山羊抗人類IgG(GAHA)Fc γ(Invitrogen)固定至活化GLM晶片上於6個水平通道中之8,000個共振單元。最終利用1M乙醇胺HCl於6個水平通道中停用晶片。將所製備GAHA晶片旋轉至垂直方向以在5個垂直通道上俘獲試驗化合物，且將最後一個通道用作管柱參考。所俘獲晶片隨後再次旋轉至水平方向以用於結合。將五種濃度(即，10.0nM、5.00nM、2.50nM、1.25nM及0.625nM)之經連接人類IL-23(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals，Inc)在以下運作緩衝液(Bio Rad) 中以40μl/min之流率水平地注射在試驗化合物表面上歷時10分鐘：磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)、0.005% Tween 20。允許解離2小時。在10min締合及2hr解離之後，使用0.85%磷酸(Bio Rad)之短脈衝注射(18秒)，以100μl/min之流率在水平方向及垂直方向上再生GAHA表面。所再生GAHA準備用於另一結合循環。以類似方式進行化合物與人類TNF-α或石蟹獼猴TNF-α之結合。

結果

表3中之結果展示：受測試的兩種化合物能夠以在皮莫耳範圍內之解離常數(KD)來結合TNF-α及IL23。

實例3. 與膜結合的TNF-α之結合的流式細胞術評估

評估試驗化合物的劑量依賴地結合至經轉染以表現膜結合TNF-α之細胞系的能力。

材料及方法

在流式細胞術染色緩衝液(BioLegend)中製備所有試劑。自組織培養容器收穫膜表現的TNF-α轉染之細胞系(Jurkat及CHO)及親本細胞系，洗滌，計數且於流式細胞術染色緩衝液中再懸浮達到1X10^6個細胞/ml。將一百微升之細胞懸浮液添加至96孔微量滴定板，且置放於冰上。製備試驗化合物之滴定液且將50uL添加至細胞。在冰上六十分鐘孵育之後，洗滌細胞+試驗化合物，且添加50uL之二級抗體(Jackson CmmunoResearch)。在4℃下，於黑暗中孵育樣本60分鐘，繼之以洗滌。在最終洗滌之後，將細胞再懸浮於60uL之固定劑(BD Bioscience)中。在流式細胞儀中測定每一樣本之中值螢光，且對比試驗樣本之濃度來繪圖。使用藉由Excel附加XLfit(Activity Base software，ID Business Solutions，Ltd.)啟用的4參數Logistic來計算EC₅₀值。以下展示的EC₅₀值為跨於針對每一試驗樣本之多個實驗計算的幾何平均值(Geomean)，且展示於表4中。

結果

以下表4中展示之結果證明：受測試化合物以劑量依賴性方式結合至膜結合TNF-α。

實例4.活體外L929細胞毒性測定

測試化合物的抑制TNF-α誘導的細胞毒性之能力。

方法及材料

此實驗規程使用PrestoBlue^TM0細胞活力試劑來測定重組人類TNF-α之細胞毒性。用於PrestoBlue細胞活力規程之更詳細規程可自Invitrogen網站(Invitrogen.com)下載。使L929細胞生長且對其收穫。將1.5x10⁴個細胞轉移至96孔板之每一孔中以供在37℃下孵育隔夜。製備化合物之連續稀釋液，以在含有10μg/ml之放線菌素D及1000pg/ml之rhTNF-α的完全測定培養基中之5nM開始。正對照含有20ng/ml rhTNF-α及1μg/ml放線菌素D。負對照不含TNF-α。將10μL之稀釋液添加至相應孔中，且在37℃下於5% CO2中孵育隔夜。將PrestoBlue^TM試劑添加至孔，且將板在37℃下於5% CO2中孵育2小時。使用Victor^TMx2板閱讀器(激發：560nm，發射：590nm)量測每一孔之相對螢光單位。將螢光單位(Y軸)對比試驗化合物之濃度(X軸)繪圖，且藉由使用Graphpad軟體計算試驗化合物之IC₅₀及IC₉₀值。

結果

表5中之結果展示：試驗化合物能夠以劑量依賴性方式抑制TNF-α誘導的細胞毒性。

表5.

實例5.對HeLa細胞TNF-α依賴性IL-8釋放之抑制。

評估抗TNF試驗樣本的抑制IL8自人類細胞系HeLa之TNF依賴性釋放的能力。針對高濃度及低濃度之重組人類TNF-α及單一(高)濃度之重組石蟹獼猴TNF-α測試樣本。

材料及方法

簡言之，收穫HeLa細胞(ATCC)，洗滌，計數且於(v/v)10%胎牛血清與1%青黴素及鏈黴素(CM)之標準完全培養基中再懸浮達4x10^5個細胞/ml。將一百微升之HeLa細胞懸浮液添加至96孔微量滴定板。將處於兩種濃度(147nM或4.4nM)下之重組人類TNF-α(R&D Systems)以及所產生的重組石蟹獼猴TNF-α(Boehringer Cngelheim Pharmaceuticals，Cnc.)(147nM)在37℃下利用單獨的CM或利用試驗樣本之滴定液預孵育30分鐘。在試驗樣本+TNF-α之預孵育之後，將100ul之混合物添加至細胞，且將試驗板在37℃下利用5% CO₂帶濕氣空氣孵育20小時。對照樣本接收CM(未受刺激對照物)或稀釋於CM中之重組TNF-α(受刺激對照物)。在孵育之後，在ELISA套組(MesoScale Discovery)中遵照製造商之說明書來測定上清液之IL8。測定每一樣本之內插IL8 pg/ml值，且轉換成對照百分比(percent of control；POC)。將POC對比試驗樣本之濃度繪圖，且使用藉由Excel附加XLfit(Activity Base software，ID Business Solutions，Ltd.)啟用的4參數Logistic模型來計算IC₅₀及IC₉₀值。

如上所述就IC₅₀/IC₉₀來分析試驗化合物，且跨於針對每一試驗樣本之多個實驗計算的幾何平均值且展示於表6中。

結果

表6中之結果展示：試驗化合物之IC₅₀及IC₉₀幾何平均值類似於對照抗體1及對照抗體2之IC₅₀及IC₉₀幾何平均值。資料證明：試驗化合物劑量依賴地抑制由人類(處於兩種受測試濃度下)或cyno重組TNF-α進行的TNF-α誘導IL-8分泌。

實例6. 對全血中TNF-α依賴性IL8之抑制

TNF為IL8自人類細胞釋放之有效誘導劑。測試化合物的抑制全血樣本中TNF-α誘導的IL-8釋放之能力。

方法及材料

簡言之，將120uL之肝素化人類全血添加至96孔微量滴定板中之每一孔。在標準T細胞培養基(T cell media；TCM)中製備測定試劑。以10X濃度製備試驗樣本之滴定液，且利用10X濃度之人類重組TNF(100ng/ml，R&D Systems)在37℃下預孵育1小時。在此預孵育之後，將30ul之細胞激素/試驗化合物混合物連同於TCM中之30uL適當對照物一起添加至全血，且在37℃下利用5% CO₂帶濕氣空氣孵育48小時。對照樣本接收TCM(未受刺激對照物)或稀釋於TCM中之重組人類TNF-α(受刺激對照物)。在孵育之後，在ELISA套組(MesoScale Discovery)中遵照製造商之說明書來測定上清液之IL8。測定每一樣本之內插IL8 pg/ml值，且轉換成對照百分比(percent of control；POC)。將POC對比試驗樣本之濃度繪圖，且使用藉由Excel附加XLfit(Activity Base software，ID Business Solutions，Ltd.)啟用的4參數Logistic模型來計算IC₅₀及IC₉₀值。

如上所述就IC₅₀/IC₉₀來分析試驗化合物，且跨於針對每一試驗樣本之多個實驗計算的幾何平均值且展示於表7中。

結果

表7中之結果展示：試驗化合物之IC₅₀及IC₉₀幾何平均值類似於對照抗體1及對照抗體2之IC₅₀ 及IC₉₀幾何平均值。資料證明：試驗化合物劑量依賴地抑制人類全血中TNF-α誘導的IL8釋放。

實例7. NF-κB及STAT3磷酸化測定

IL23與其異源二聚受體複合物(IL12Rβ1-IL23R)之銜接產生信號轉導及轉錄活化子3(Signal transducer and activator of transcription 3；STAT3)之下游磷酸化。TNF與其受體(TNFR1/TNFR2)之銜接產生B細胞中κ輕鏈多肽基因強化子之核因子(NF-κB)之下游磷酸化。評估化合物的抑制Jurkat細胞中NF-κB之TNF-依賴性磷酸化及DB細胞中STAT3之IL23依賴性磷酸化的能力。

方法及材料：

簡言之，收穫對數期生長的Jurkat細胞(ATCC)及DB細胞(ATCC)之培養物，洗滌，計數且於標準完全培養基(CM；具有(v/v)10% FCS及1X青黴素-鏈黴素(Invitrogen)之RPMI1640)中再懸浮達2x10^7個細胞/mL。以4X濃度製備試驗樣本之滴定液，且利用4X人類重組IL23(Boehringer Cngelheim Pharmaceuticals，Inc.)及重組人類TNF(R&D Systems)在37℃下預孵育1小時。在試驗試劑+細胞激素混合物之預孵育之後，將100μL之混合物在平行測定中(in duplicate)添加至含有100μL之細胞的孔。對照物設置如下：100μL之稀釋TNF/IL23+100μL組合細胞(受刺激對照物)，或100μL之CM+100μL組合細胞(未受刺激對照物)。將測定板在37℃下利用5% CO₂帶濕氣空氣孵育恰好10分鐘。在孵育之後，製備細胞溶解產物，且遵照製造商之說明書(MesoScale Discovery)評估p-NF-κB及p-STAT3。測定每一樣本之p-NF-κB及p-STAT-3原始值，且轉換成對照百分比(percent of control；POC)。將POC(Y軸)對比試驗劑之濃度(X軸)繪圖。使用藉由Excel附加XLfit(Activity Base software，ID Business Solutions，Ltd.)啟用的4參數Logistic模型來計算IC₅₀及IC₉₀值。

如上所述就IC₅₀/IC₉₀來分析試驗化合物，且跨於針對每一試驗樣本之多個實驗計算的幾何平均值且展示於表10中。注意：此測定提供雙重分子能夠中和兩種下游信號傳遞事件之置信度。針對p-NF-κB信號而言，測定時間點最佳，且因此所計算IC₅₀/IC₉₀不反映呈定量方式之總體效力。

結果

表8中之結果展示：試驗化合物能夠抑制TNF-α誘導的NF-kB磷酸化以及DB細胞中STAT3之IL23誘導磷酸化。

實例8.對DB細胞中IL23誘導的STAT3磷酸化之抑制

IL23與其異源二聚受體複合物(IL12Rβ1-IL23R)之銜接產生信號轉導及轉錄活化子3(Signal transducer and activator of transcription 3；STAT3)之下游磷酸化。評估抗IL23試驗樣本的抑制人類DB細胞系中之IL23依賴性磷酸化的能力。

材料及方法：

簡言之，將100uL之對數期生長的人類DB細胞系(ATCC)以1x10^7個細胞/ml之濃度添加至96孔微量滴定板中之每一孔。在完全培養基(CM；具有(v/v)10%胎牛血清及1X青黴素-鏈黴素(Invitrogen)之RPMI1640)中製備測定試劑。以4X濃度製備試驗樣本之滴定液，且利用4X濃度之人類重組IL23(Boehringer Cngelheim Pharmaceuticals，Inc.)在37℃下預孵育1小時。在此預孵育之後，將100ul 之細胞激素/試驗化合物混合物添加至100uL之DB細胞，且在37℃下利用5% CO₂帶濕氣空氣孵育30分鐘。對照樣本接收CM(未受刺激對照物)或稀釋於CM中之重組人類IL23(受刺激對照物)。在孵育之後，製備細胞溶解產物，且遵照製造商之說明書(MesoScale Discovery)評估pSTAT3。測定每一樣本之原始pSTAT3值，且轉換成對照百分比(percent of control；POC)。將POC對比試驗樣本之濃度繪圖，且使用藉由Excel附加XLfit(Activity Base software，ID Business Solutions，Ltd.)啟用的4參數Logistic模型來計算IC₅₀及IC₉₀值。如上所述就IC₅₀/IC₉₀來分析試驗化合物，且跨於針對每一試驗樣本之多個實驗計算的幾何平均值且展示於表9中。

結果

表9中之結果展示：試驗化合物之IC₅₀及IC₉₀幾何平均值類似於抗IL23Ap19對照抗體之IC₅₀及IC₉₀幾何平均值。資料證明：試驗化合物劑量依賴地抑制DB細胞中STAT3之IL23誘導磷酸化。

實例9.人類IL-23依賴性小鼠脾細胞測定(Mouse Splenocyte Assay；MSA)

基於小鼠脾細胞之測定係用於評估抗人類IL23試驗樣本抑制小鼠脾細胞培養物中小鼠IL17藉由人類重組IL23及重組石蟹獼猴IL23之誘導的能力。

材料及方法：

簡言之，將來自小鼠脾臟(小於13週齡之雌性C57BL/6；JAX)之單核細胞分離，洗滌，計數且於標準T細胞培養基(T cell media；TCM)中達4X10^6個細胞/ml。將一百微升之mIL2/脾細胞懸浮液添加至96孔微量滴定板。在TCM中稀釋重組人類IL23(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals，Inc.)或重組石蟹獼猴IL23(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals，Inc.)，且在37℃下利用單獨的TCM或利用試驗樣本之滴定液來預孵育2小時。在試驗樣本+IL23之預孵育之後，將100ul之混合物添加至細胞，且將試驗板在37℃下利用5% CO₂帶濕氣空氣孵育48hr。對照樣本接收TCM(未受刺激對照物)或稀釋於TCM中之重組人類IL23(受刺激對照物)。在孵育之後，使用Quantikine®小鼠IL-17免疫測定，根據製造商之說明書(R&D Systems)自上清液測定小鼠IL17含量。測定每一樣本之內插mIL17pg/ml值，且轉換成對照百分比(percent of control；POC)。將POC對比試驗樣本之濃度繪圖，且使用藉由Excel附加XLfit(Activity Base software，ID Business Solutions，Ltd.)啟用的4參數Logistic模型來計算IC₅₀及IC₉₀值。如上所述就IC₅₀/IC₉₀來分析抗IL23試驗化合物，且跨於針對每一試驗樣本之多個實驗計算的幾何平均值且展示於表10中。

結果

表10中之結果展示：試驗化合物能夠抑制IL17之人類及石蟹獼猴-IL23誘導的小鼠脾細胞釋放。

實例10. 對STAT3之IL23誘導磷酸化之抑制

IL23與其異源二聚受體複合物(IL12Rβ1-IL23R)之銜接產生信號轉導及轉錄活化子3(Signal transducer and activator of transcription 3；STAT3)之下游磷酸化。測試化合物的抑制DB穩定轉染細胞中之IL23誘導STAT3活化

材料及方法

利用15ng/ml IL23蛋白質之最終濃度刺激細胞。根據先前實驗，估計此劑量為EC60，同時允許利用試驗化合物之抑制。將細胞塗板、給予化合物並添加IL-23(以彼次序)且孵育隔夜。若化合物抑制細胞刺激，則STAT3受下調，從而導致較小螢光素酶活性。

結果

表11中之結果展示：試驗化合物能夠抑制STAT3之IL23誘導磷酸化。

實例11.其他IL23-A Stat3測定

類似於實例8來運作其他實驗以測試對STAT3之IL23誘導活化之抑制。

方法及材料

使DB-STAT3Luc10純系10懸浮液細胞在RPMI1640+10% FBS中生長。對在80ul/孔之細胞懸浮液下的96孔板之每個孔添加20,000個細胞。將10ul的連續稀釋試驗化合物之一者添加至每一孔。將15ng/mL之重組人類IL-23添加至每一孔，為做比較，某些孔僅含有試驗化合物且不含IL-23。在37℃/5% CO2下將板孵育隔夜。使用Steady-Glo(Promega)以及One-Glo(Promega)測定螢光素酶活性，且在Envision閱讀器上讀取結果。

結果

試驗化合物之IC₅₀及IC₉₀展示於表12及表13中。此等表展示：化合物以劑量依賴性方式抑制IL-23依賴性STAT3活化。

實例12.對藉由人類重組IL23誘導的IL23抑制小鼠IL17A及IL22釋放之抑制

評估試驗化合物的抑制C57/B16小鼠中人類IL23誘導的細胞激素釋放之能力。在IL23之皮內注射之後量測IL17A及IL22分泌。

材料及方法

簡言之，將C57BL/6雌性小鼠(7-10週大，Charles River)隨機分成8個群組，每個群組8只動物，且分別以1.3mg/kg、0.4mg/kg及0.13mg/kg對比1mg/kg、3mg/kg及0.1mg/kg之等莫耳劑量給予檸檬酸鹽緩衝液(20mM NaCitrate、115mM NaCl，pH 6.0)或試驗化合物之100μl腹膜內注射。

在試驗化合物給藥之後一小時，經由異氟烷(Butler Schein)將小鼠麻醉，且向兩個耳朵給予0.1%BSA(Sigma)對照物或15μg/ml(0.3μg)rhIL23(室內產生)稀釋於鹽水(Invitrogen)中之20μl皮內注射。每天重複皮內攻毒歷時連續2天。在第二次攻毒之後二十四小時，經由頸椎脫臼法犧牲小鼠且將每一個耳朵移除。在1ml之均質化緩衝液(HBSS(Gibco)；0.4% Triton X-100(Sigma)；1X SigmaFast蛋白酶抑制劑(Sigma))中使用MP Biomedicals Fast-Prep 24均質化器將耳朵組織均質化。在4℃下將均質化樣本離心10min，且收集上清液。使用Quantikine®小鼠IL-17及小鼠IL-22免疫測定，根據製造商之說明書(R&D Systems)針對小鼠IL17A及IL22之存在來測定上清液中。測定每一樣本之內插細胞激素pg/ml值。測定每一治療群組之平均μg/ml含量，且使用單向ANOVA繼之以鄧奈特氏多重比較試驗來計算相較於對照物之顯著性。結果展示於第4圖中。

結果

第4圖中之結果展示：利用單一腹膜內劑量之試驗化合物的治療能夠顯著地抑制皮膚中藉由重組人類IL23之連續兩天皮內注射所誘導的小鼠IL17及IL22之釋放。

實例13.對C57/B16小鼠中外源人類TNF-α依賴性細胞激素釋放之抑制

評估試驗化合物的抑制C57/B16小鼠中於人類TNF之外源暴露之後的人類TNF誘導細胞激素釋放之能力。在人類TNF之腹膜內投藥後量測血清KC及IL-6分泌。

材料及方法

簡言之，將C57BL/6雌性小鼠(8-9週大，Jackson Labs)隨機分成8個群組，每個群組8只動物，且分別以13.3mg/kg、4mg/kg及1.3mg/kg對比10mg/kg、3mg/kg及1mg/kg之等莫耳劑量給予磷酸鹽緩衝鹽水(Sigma)或試驗化合物之200μl腹膜內注射。

在試驗化合物給藥之後兩小時，經由異氟烷(Butler Schein)將小鼠麻醉，且給予0.1%BSA對照物或15μg/ml(3μg)rhIL23(R&D Systems)稀釋於鹽水(Sigma)中之20μl腹膜內注射。在TNF攻毒之後兩小時，經由異氟烷將小鼠麻醉，收集全血且隨後經由頸椎脫臼法犧牲小鼠。將全血在12,000rpm下離心10分鐘，且收集血漿。使用MultiPlex®小鼠KC及小鼠IL-6免疫測定，根據製造商之說明書(MSD)針對小鼠KC及IL-6之存在測定血漿。測定每一樣本之內插細胞激素pg/ml值。測定每一治療群組之平均μg/ml含量，且使用單向ANOVA繼之以鄧奈特氏多重比較試驗來計算相較於對照物之顯著性。結果展示於第5圖中。

結果

第5圖中之結果展示：利用單一腹膜內劑量之試驗化合物的治療能夠顯著地抑制血清中藉由重組人類TNF之腹膜內注射引起的小鼠KC及IL-6之釋放。

實例14.化合物於石蟹獼猴中之藥物動力學 材料及方法

在對生物製劑為原態的雄性石蟹獼猴(N=3，每個群組)中進行針對兩對化合物(化合物M及化合物A；以及化合物O與化合物E)之單一靜脈內(intravenous；IV)劑量PK研究，且該等研究係根據實驗動物照護及使用委員會之準則來進行。IV劑量係在1mg/kg下以10min IV輸注來投與。對化合物M及化合物A而言，在給藥前，在給藥當天1、4、8hr以及在給藥後1、2、3、4、5、7、10、14、21、28、35及42(1008hr)收集血清樣本；且對化合物O及化合物E而言，僅在至多第14天收集血清樣本。藉由配位體結合測定(ELCSA)量測所給藥分子之血清濃度。

針對每一分析物，在100%血清中製備校準標準曲線及質量控制(quality control；QC)樣本。每一標準曲線由七個非零點組成，該等點以10240ng/mL開始，隨後連續稀釋3x。亦包括空白樣本(無分析物之基質)。以2560ng/mL開始，隨後連續稀釋四倍來製備處於低、中及高範圍內之四個QC樣本。將標準曲線及QC樣本冷凍儲存直至樣本分析，在樣本分析時，將該等樣本稀釋20倍以模擬研究樣本。在每一分析運作期間，在平行測試中納入標準曲線及QC樣本。定量之下限及上線係定義為可再生地獲得反計算濃度之最低標準曲線點及最高標準曲線點，該反計算濃度不超過標稱濃度之25%。標準曲線點及QC樣本之接受標準為標稱濃度之25%。

將Nunc ELISA板以1μL之猴吸附山羊抗人類IgG(Southern Biotech)作為俘獲試劑來塗覆，且在2-8℃下孵育隔夜。在利用洗滌緩衝液(於磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline；PBS)中之0.05%(v/v)Tween 20)及阻斷緩衝液(於PBS中之5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA))洗滌並阻斷板之後，將以5%猴血清(來自Innovative Research之猴血清)1：20、1：400及1：8000稀釋的標準、QC及未知樣本添加至板孔，且在室溫下孵育1小時。將板孔用洗滌緩衝液洗滌，且添加猴吸附生物素化山羊抗人類IgG(Southern Biotech)作為二級試劑，且在室溫下孵育1小時。將板洗滌3次，且在室溫下添加100μL之1μg/mL過氧化酶-接合抗生蛋白鏈菌素歷時15min，繼之以另外3次洗滌及在室溫下歷時3-4min的100μL之3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine；TMB，BioFX)底質之添加。藉由添加100μL之終止溶液(BioFX)來終止反應，且使用帶有SoftmaxPro軟體5.4.1版之Molecular Devices板閱讀器來量測吸光度。

結果

在對生物製劑為原態的雄性石蟹獼猴(N=3，每個群組)中進行針對兩對試驗化合物(化合物M及化合物A；以及化合物O與化合物E)之單一IV劑量PK研究。試驗化合物係在1mg/kg下以10min IV輸注來給藥。對化合物M及化合物A而言，在給藥前，在給藥當天1、4、8hr以及在給藥後1、2、3、4、5、7、10、14、21、28、35及42(1008hr)收集血清樣本；且對化合物O及化合物E而言，僅在至多第14天收集血清樣本。藉由配位體結合測定(ELCSA)量測所給藥分子之血清濃度。

每一分子之血清濃度(平均值與SD)匯總於表14中。

BQL：在定量極限以下

NC：未計算，N=1

使用軟體Phoenix WinNonlin 6.1(Certara，MD，USA)，使用用於IV輸注劑量之非分室方法來計算此等試驗化合物之藥物動力學(pharmacokinetic；PK)參數。將在給藥之後的任何時間點及在彼特定動物中之所有後續樣本中展示濃度之陡然下降的血清樣本自PK參數估計中排除。另外的分析展示：在前幾天之後濃度之突然下降係歸因於針對猴中的人類化生物分子之抗化合物抗體的生成。PK分析中僅納入來自個別動物之前七天資料。針對兩對試驗化合物之濃度-時間繪圖展示於第2及3圖中。兩對試驗化合物之關鍵PK參數(平均值±SD)匯總於表15中。

相較於不含有YTE突變之相應試驗化合物(化合物M)而言，化合物A，即具有YTE突變之試驗化合物展示清除率(clearance；CL)之3.3倍減少及終點半衰期(T1/2)之3.9倍增加。相較於不含有YTE突變之相應試驗化合物(化合物O)而言，化合物E，即具有YTE突變之試驗化合物展示CL之2.4倍減少。

實例15.預測示範性化合物之人類PK及人類劑量 預測人類PK：

藉由在人類中使用相較於猴的2倍清除率減少因子自於石蟹獼猴中獲得的PK參數進行異速定標(allometric scaling)同時維持相同分佈體積來進行化合物E之人類PK預測。因此，人類中所預測的清除率為12.1mL/天/kg，而終點半衰期為7.4天。

預測人類劑量：

基於可獲自戈利木單抗於多樣患者群體中之臨床試驗的廣泛暴露功效資料來進行人類劑量預測。戈利木單抗(Simponi®)經核準以50mg每月皮下 (subcutaneous；SC)劑量來治療類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis；RA)、關節黏連性脊椎炎(ankylosing spondylitis；AS)及牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis；PsA)患者，且以100mg每月SC劑量來治療潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis；UC)患者。Simponi®在RA患者(50mg每月SC劑量)中達成大致3.2nM之濃度谷值(Ctrough)，且在UC患者中達成9.7nM(100mg每月SC劑量)之濃度谷值(Simponi® BLA，2009；Sandborn，2013)。此等值係分別用作針對AS及CD之治療濃度谷值的基準。在Stelara之臨床核准劑量下的濃度谷值位準為約6nM。基於相較於優特克單抗(Stelara®)而言對化合物E的高3倍效力之觀察結果，對化合物E而言需要約2nM之濃度谷值來涵蓋IL23。當用於涵蓋TNF之濃度谷值濃度大於用於涵蓋IL23之濃度谷值濃度時，使用針對Simponi®的9.7nM濃度谷值以供劑量投影(dose projection)。

石蟹獼猴中之PK資料之分室模型化(2分室模型)繼之以使用IL之2倍減少定標、73%生物可用性並同時利用標稱30% CV及log常態分佈來改變清除率及分佈速率常數的蒙特卡羅模擬證實：每2週投與54mg(90%置信區間，31-90mg)SC劑量將維持9.7nM之濃度谷值。

實例16.化合物之純化 方法

使用Mab Select SuRe作為親和力純化步驟來純化化合物。避免高鹽洗滌以便防止聚集。使用乙酸鈉緩衝液pH 3.5來執行溶離。在Mab Select SuRE純化後，將樣本中和並且用於羥磷灰石C型樹脂，且使用各種濃度之磷酸鹽緩衝液來溶離。在約140mM NaPhosphate 100mM NaCl pH 7.0下溶離出單體峰，且在約200mM NaPhosphate 100mM NaCl pH 7.0下溶離出聚集峰。在羥磷灰石之後，樣本一致地為>95%單體。

使用經由分析超離心(Analytical ultracentrifugation；AUC)進行的沉降速度(sedimentation velocity；SV)實驗來提供關於樣本純度及聚集狀態之資訊。在20℃下，使用在40,000rpm下運轉的An60Ti四孔轉子，在optima XL-C(Beckman Coulter，Fullerton，CA)中離心樣本。使用相應稀釋緩衝液作為參考緩衝液，藉由280nm處之紫外線吸光度來監視沉降過程。使用XL-I作業軟體收集超離心細胞中濃度分佈隨時間之變化，且使用連續c(S)分佈模型於SEDFIT軟體(14.1版)中加以分析，以得出沉降係數分佈。基於積分峰面積來計算單體百分比。

結果

化合物之純化結果展示於表16中。資料展示：化合物具有高純度及均質性，從而指示良好穩定性。

實例17：化合物之質譜測定概況 方法 天然樣本

此程序產生化合物或蛋白質之完整質量。將2ul之樣本注射至5umAgilent PoroShell 300SB-C8管柱(75x1.0mm)中。管柱溫度為80℃且流率為50ul/min。以在0分鐘20%B至10分鐘85%B之梯度將化合物或蛋白質溶離出管柱。移動相A為水/乙腈/甲酸(99/1/0.1)，且移動相B為乙腈/水/甲酸(95/5/0.1)。將流出物導向至Agilent 6210 TOF質譜儀，該質譜儀自質量600掃描至質量3200。利用程式MassHunter將原始資料反摺積。

簡化樣本

此程序產生蛋白質或輕鏈之質量及重鏈之質量。將2ul之50mM TCEP添加至10ul之樣本及10ul之8M胍，且在37℃下孵育15分鐘。利用以下差異如上注射2ul之此樣本：管柱溫度為60℃，且質量範圍為600-2000。

去醣基化樣本

此程序產生蛋白質或輕鏈及重鏈之去醣基化質量。在37℃下，將10ul之樣本、10ul之200mM NH₄HCO₃、2ul 50mM TCEP及1ul(1：10) PNGase F(或若存在O連接醣基化，則1uL QA去醣基化混合物)孵育3小時。針對重度醣基化樣本而言，令孵育增加隔夜。隨後，添加25ul 8M胍及4ul之50mM TCEP，且在37℃下孵育15分鐘。如以上針對簡化樣本之方式來注射此樣本。

藉由質譜測定法之蛋白質肽圖譜分析(Mapping)

將25ul之樣本添加至於400mM碳酸氫銨中之25ul之8M尿素。隨後添加5ul之50mM TCEP，且在60℃下將樣本孵育15分鐘。在將樣本冷卻至室溫之後，添加5ul之150mM碘乙醯胺，且在室溫下將樣本孵育15分鐘。在添加40ul之水之後，添加1mM HCl中之5ul之胰蛋白酶以得到1：50之最終酶：底質比率。在37℃下將樣本孵育隔夜。隨後將5ul注射至100x1.0mm Thermo Hypurity C18管柱上。流率為80ul/min。以在0分鐘0%B至33分鐘40%B之梯度將蛋白質溶離出管柱。移動相A為水/乙腈/甲酸(99/1/0.1)，且移動相B為乙腈/水/甲酸(95/5/0.1)。將流出物導向至Thermo Orbitrap Velos質譜儀。第一掃描事件係以FT進行，且自質量300掃描至質量2000，其中解析度為30,000。第二至第七掃描事件係以IT(離子捕集)來進行，且將來自第一掃描事件之6種最強烈離子分段。含有醣基化之肽藉由手動提取來進行特性分析，且基於峰高度來計算百分比。

結果

結果展示於表17中。資料指示：所欲胺基酸序列及結構已獲表現及回收而無意外的異質性。醣基化型式為在CHO細胞中表現的習知抗體之典型醣基化，且不展示任何非典型結構。

實例18：化合物之熱穩定性 方法

在60℃/hr之掃描速率下，經由自動化毛細管DSC(MicroCal，LLC，Boston)監視自20℃至110℃的化合物之2mg/ml溶液於磷酸鹽緩衝液中之熱展開及聚集。執行利用相應緩衝液之兩次掃描，以建立儀器熱歷程且獲得每一樣本之儀器基線，其中自後續蛋白質熱譜圖減去此等掃描之平均值即獲得表現熱容量。隨後利用Origin 7.0來分析正規化掃描。自每一所得熱容量熱譜圖減去轉變前基線，以得到隨溫度而變的所得過量熱容量(Cp,ex)。轉移溫度(Tm)之報導值表示藉由對實驗熱譜圖之目視檢查判定的峰最大值之位置。

結果

結果展示於表18中。資料展示：化合物為穩定的且將預測具有長庫存壽命之能力。

實例19：化合物之溶解度 方法

將化合物樣本逐步濃縮至盡可能高但使用截止分子量為50,000道爾頓之Amicon超離心過濾器觀察不到沉澱之濃度。隨後在SV實驗中經由AUC分析濃縮蛋白質溶液，以提供關於樣本純度及聚集狀態之資訊(參考關於純化之實例16以獲得方法細節)。

結果

結果展示於表19中。資料展示：化合物為可溶及穩定的，從而保持高百分比之單體而無需調配或添加的賦形劑。

實例20：化合物之原子價 方法

在配備工作波長為214nm之紫外線(ultraviolet；UV)吸光度偵測器之Beckman Coulter(Fullerton，California)ProteomeLab PA800^TM設備上執行對50mM KCl及10mM乙酸鈉緩衝液(pH 5.0)中之化合物樣本的原子價量測。將系統維持於20℃下，且使用內徑為50μm之eCap胺毛細管(Beckman Coulter，部件號477431)。在每一樣本注射之前，利用100mM NaOH、胺再生溶液 (Beckman Coulter，部件號#477433)及運作緩衝液清洗毛細管。在10kV、14kV及18kV之電壓下量測樣本之遷移時間。二甲基甲醯胺(dimethylformamide；DMF)(0.005%)(Pierce)係用作電滲流(electroosmotic flow；EOF)標誌物。使用32Karat^TM軟體(v7.0)獲取資料。自SV實驗經由AUC測定擴散係數。

結果

原子價資料(參見表20)指示化合物於溶液中之膠態穩定性，亦即，溶液中蛋白質與蛋白質之淨相互作用。原子價大於15之化合物具有強的淨排斥相互作用及待以高濃度調配之高潛力。

實例21：預測的In Silico免疫原性 方法

藉由利用EpiVax，Inc.(Providence，RI)開發的計算工具EpiMatrix來in silico預測蛋白質治療劑之免疫原性。EpiMatrix併入對T-輔助抗原決定基以及T-regitope之預測，其中前者將激發免疫反應而後者為抑制性的。簡言之，首先將蛋白質序列剖析成重疊的9元肽框架，該等框架已證明為II類HLA結合之核心。基於實驗資料或計算預測來評估9元肽與八種常見II類HLA對偶基因中之每一者之結合潛力。產生記分來反映9元肽與每一HLA對偶基因之結合潛力，且執行正規化來使得可能跨於多種HLA對偶基因來比較任何9元肽且允許對總規模之免疫原性預測。最後，程式產生總體『免疫原性記分』，即tReg調整的Epx記分，其連同其他免疫原性決定因素一起來輔助做出對化合物將激發活體內免疫反應之可能性的明達決定。

結果

結果展示於表21中。此等化合物之總體免疫原性記分為低的，且預測出：此等化合物不可能活體內引出強的免疫反應。

對偶基因特定記分之正規化 實例22：化合物之全血穩定性 方法

在Octet RED96上進行全血干擾測定以偵測於全血(whole blood；WB)存在下對化合物之非特異結合或離靶(off-target)結合之效應。在37℃之溫度下將全血及1x動力學運作緩衝液(1xkb)中之化合物溶液孵育48小時。在27℃下，利用配備抗生蛋白鏈菌素(streptavidin；SA)生物感測器頭之Octet RED96(ForteBio，Menlo Park，CA)執行對所孵育化合物樣本之動力學量測。報導緩衝液及全血中締合速率/結合信號之比率。比率<2視為不展示干擾。

結果

結果展示於表22中。

實例23：受測試參數之匯總

某些化合物之參數資料之匯總展示於以下表23中。

序列

其他實施例

在本說明書中揭示的所有特徵可以任何組合方式來組合。在本說明書中揭示的每一特徵可由用於相同、等效或類似目的的替代特徵置換。因此，除非另外明確說明，否則所揭示的每一特徵僅為一系列通用等效或類似特徵之實例。

自以上描述，熟習此項技術者可易於斷定本揭示內容之基本特性，且在不脫離本揭示內容之精神及範疇的情況下，可對本揭示內容進行各種改變及修改以使其適於各種用途及條件。因此，其他實施例亦處於發明申請專利範圍之內。

<110> 德商．包林格因蓋爾漢國際股份有限公司美商．總體遺傳因子公司

<120> 靶向IL-23A與TNF-α之化合物及其用途

<140> 104129171

<141> 104年9月3日

<150> US 62/045,498

<151> 2014-09-03

<160> 163

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

<210> 3

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

<210> 5

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成多肽

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 128

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<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<223> 合成多肽

<400> 130

<210> 131

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 131

<210> 132

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 132

<210> 133

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 133

<210> 134

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 134

<210> 135

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 135

<210> 136

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 136

<210> 137

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 137

<210> 138

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 138

<210> 139

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 139

<210> 140

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 140

<210> 141

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 141

<210> 142

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 142

<210> 143

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 143

<210> 144

<211> 233

<212> PRT

<213> 智人

<400> 144

<210> 145

<211> 189

<212> PRT

<213> 智人

<400> 145

<210> 146

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 146

<210> 147

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 147

<210> 148

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 148

<210> 149

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 149

<210> 150

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 150

<210> 151

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 151

<210> 152

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 152

<210> 153

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 153

<210> 154

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 154

<210> 155

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 155

<210> 156

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 156

<210> 157

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 157

<210> 158

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 158

<210> 159

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 159

<210> 160

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 160

<210> 161

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 161

<210> 162

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 162

<210> 163

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 163

Claims

一種包含一第一多肽及一第二多肽之化合物，其中：(A)該第一多肽包含：(i)對一第一標靶蛋白質具特異性之一第一免疫球蛋白之一輕鏈可變域(VL1)；(ii)對一第二標靶蛋白質具特異性之一第二免疫球蛋白之一重鏈可變域(VH2)；以及(iii)一鉸鏈區、一重鏈恆定區2(CH2)及一重鏈恆定區3(CH3)；且(B)該第二多肽包含：(i)對該第二標靶蛋白質具特異性之該第二免疫球蛋白之一輕鏈可變域(VL2)；(ii)對該第一標靶蛋白質具特異性之該第一免疫球蛋白之一重鏈可變域(VH1)；其中：(i)該VL1及VH1締合以形成結合該第一標靶蛋白質之一結合位點；(ii)該VL2及VH2締合以形成結合該第二標靶蛋白質之一結合位點；(iii)該重鏈恆定區2(CH2)包含位置252處之一酪胺酸、位置254處之一蘇胺酸及位置256 處之一麩胺酸，該等位置係根據如Kabat中之EU索引來編號；且(iv)該第一標靶蛋白質為TNF-α且該第二標靶蛋白質為IL-23A，或該第一標靶蛋白質為IL-23A且該第二標靶蛋白質為TNF-α，其中：(i)該VL1包含SEQ ID NO：2，該VH1包含SEQ ID NO：1，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7；或(ii)該VL1包含SEQ ID NO：4或6，該VH1包含SEQ ID NO：3或5，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7；或(iii)該VL1包含SEQ ID NO：8，該VH1包含SEQ ID NO：7，該VL2包含SEQ ID NO：2，且該VH2包含SEQ ID NO：1；或(iv)該VL1包含SEQ ID NO：8，該VH1包含SEQ ID NO：7，該VL2包含SEQ ID NO：4或6，且該VH2包含SEQ ID NO：3或5。
如請求項1所述之化合物，其中該VL1包含SEQ ID NO：4，該VH1包含SEQ ID NO：3，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7。
如請求項1所述之化合物，其中該VL1包含SEQ ID NO：6，該VH1包含SEQ ID NO：5，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7。
如請求項1所述之化合物，其中該VL2包含SEQ ID NO：4，該VH2包含SEQ ID NO：3，該VL1包含SEQ ID NO：8，且該VH1包含SEQ ID NO：7。
如請求項1所述之化合物，其中該VL2包含SEQ ID NO：6，該VH2包含SEQ ID NO：5，該VL1包含SEQ ID NO：8，且該VH1包含SEQ ID NO：7。
如請求項1所述之化合物，其中該VL1包含SEQ ID NO：8，該VH1包含SEQ ID NO：7，該VL2包含SEQ ID NO：2，且該VH2包含SEQ ID NO：1。
如請求項1所述之化合物，其中該VL1包含SEQ ID NO：2，該VH1包含SEQ ID NO：1，該VL2包含SEQ ID NO：8，且該VH2包含SEQ ID NO：7。
如請求項1所述之化合物，其中該第一多肽進一步包含該VL1與該VH2之間的一第一連接子，且該第二多肽進一步包含該VL2與該VH1之間的一第二連接子。
如請求項8所述之化合物，其中該第一連接子或該第二連接子包含胺基酸序列GGGSGGG(SEQ ID NO：9)。
如請求項8所述之化合物，其中該第一連接子及該第二連接子包含胺基酸序列GGGSGGG(SEQ ID NO：9)。
如請求項1所述之化合物，其中該第一多肽進一步包含一重鏈恆定區1域(CH1)，且該第二多肽進一步包含一輕鏈恆定區域(CL)，其中該CL及該CH1經由一二硫鍵締合在一起以形成一C1域。
如請求項11所述之化合物，其中該第一多肽進一步包含該VH2與該CH1之間的一第三連接子，且該第二多肽進一步包含該VH1與該CL之間的一第四連接子。
如請求項12所述之化合物，其中該第三連接子包含胺基酸序列FNRGES(SEQ ID NO：11)。
如請求項12所述之化合物，其中該第四連接子包含胺基酸序列VEPKSS(SEQ ID NO：12)。
如請求項12所述之化合物，其中該第三連接子包含胺基酸序列FNRGES(SEQ ID NO：11)，且該第四連接子包含胺基酸序列VEPKSS(SEQ ID NO：12)。
如請求項12所述之化合物，其中該第三連接子或該第四連接子包含胺基酸序列LGGGSG(SEQ ID NO：10)。
如請求項12所述之化合物，其中該第三連接子及該第四連接子包含胺基酸序列LGGGSG(SEQ ID NO：10)。
如請求項1至17中任一項所述之化合物，其中該重鏈恆定區2(CH2)包含位置234處之一丙胺酸及位置235處之一丙胺酸，該等位置係根據如Kabat中之該EU索引來編號。
如請求項1至17中任一項所述之化合物，其中該鉸鏈區、該重鏈恆定區2(CH2)或該重鏈恆定區3(CH3)之胺基酸序列來源於一IgG1或來源於一IgG4。
如請求項1至17中任一項所述之化合物，其中該鉸鏈區包含胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：40)。
如請求項1至17中任一項所述之化合物，其中該化合物包含兩個該第一多肽及兩個該第二多肽，其中該兩個第一多肽經由至少一個二硫鍵締合在一起。
如請求項1所述之化合物，其中：(i)該第一多肽包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；(ii)該第一多肽包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；(iii)該第一多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(iv)該第一多肽包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(v)該第一多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(vi)該第一多肽包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列； (vii)該第一多肽包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；(viii)該第一多肽包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；(ix)該第一多肽包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列；(x)該第一多肽包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列；(xi)該第一多肽包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；(xii)該第一多肽包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列；(xiii)該第一多肽包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列； (xiv)該第一多肽包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列；(xv)該第一多肽包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列；或(vxi)該第一多肽包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列。
如請求項1所述之化合物，其中該第一多肽包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。
如請求項1所述之化合物，其中該第一多肽包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，且該第二多肽包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
如請求項22至24中任一項所述之化合物，其中該化合物包含兩個該第一多肽及兩個該第二多肽，其中該兩個第一多肽經由至少一個二硫鍵締合在一起，且其中該等第一多肽中之每一者經由至少一個二硫鍵締合至一個該第二多肽。
如請求項22至24中任一項所述之化合物，其中該化合物包含兩個該第一多肽及兩個該第二多肽，其中該等第一多肽中之每一者包含一CH1、一CH2及一CH3，且該等第二多肽中之每一者包含一CL，且其中該等第一多肽之一者的該CH2及CH3與該等第一多肽之另一者的該CH2及CH3締合，且每一個該等第一多肽之該CH1與一個該等第二多肽之該CL締合以形成一四價分子。
一種包含如請求項1至26中任一項所述之化合物的醫藥組成物。
一種如請求項1至26中任一項所述之化合物在製造一藥物之用途，該藥物用於治療一自體免疫疾病。
一種如請求項1至26中任一項所述之化合物在製造一藥物之用途，該藥物用於治療一炎性疾病。
一種包含編碼如請求項1至26中任一項中所記載之多肽的一核苷酸序列的核酸。
一種包含如請求項30所述之核酸的載體。
如請求項31所述之載體，其進一步包含可操作連接至該核酸之一啟動子。
一種包含如請求項30所述之核酸或如請求項31或請求項32所述之載體的細胞。
一種產生如請求項1至24中任一項中所記載之多肽的方法，該方法包含以下步驟：獲得如請求項33所述之細胞，以及在該細胞中表現該核酸。
如請求項34所述之方法，其進一步包含以下步驟：分離並純化該多肽。