TWI754853B - 生物可分解的封合膠與生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途 - Google Patents

Abstract

一種生物可分解的封合膠，包括：一聚乙二醇衍生物：一光起始劑：以及一溶劑，其中於該生物可分解的封合膠中，該聚乙二醇衍生物的含量為約10-75 wt%。而此聚乙二醇衍生物係藉由一取代反應所獲得，而於該取代反應中，將聚乙二醇以甲基丙烯酸酐進行修飾。

Description

生物可分解的封合膠與生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途

本揭露係關於一種封合膠，且特別關於一種生物可分解的封合膠與生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途。

現今可用於手術之重新連接與縫合組織的技術具有縫合線、縫合釘等，然而，在臨床上針對微創手術使用上仍有一些限制。例如，使用手術縫線進行傷口閉合需要耗費時間，同時可能造成周圍組織的傷害或是感染，並且無法立即防止傷口處體液之滲漏及阻隔傷口與空氣之接觸。

黏合劑之應用提供了一種閉合傷口的簡便替代方法。其提供了簡單的植入程序、更短的癒合時間、減輕患者的痛苦、以及不需要二次手術去除等優點。

然而，黏合膠在軟組織中欲達到強的貼附強度仍其挑戰性，並且需同時減少材料之毒性、周邊組織之損傷、以及密封材料引起之副作用。

黏合將之另一個限制為，大多數市售黏合膠在充滿體液與身體高度動態區域之潮濕環境中，提供很低之黏合強度。大多數臨床可用之膠水或密封劑皆無提供彈性和良好的附著力。

因此，目前亟需一種新穎之封合膠，其可生物降解，且不具細胞毒性，並可在潮濕環境中有效黏合生物組織。

本揭露提供一種生物可分解的封合膠，包括：一聚乙二醇衍生物；一光起始劑；以及一溶劑，其中於該生物可分解的封合膠中，該聚乙二醇衍生物的含量為約10-75 wt%。而此聚乙二醇衍生物係藉由一取代反應所獲得，而於此取代反應中，將聚乙二醇以甲基丙烯酸酐進行修飾。

本揭露也提供一種生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該生物可分解的封合膠為上述之生物可分解的封合膠。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：

本揭露提供一種生物可分解的封合膠，其可應用於生物組織之黏合或修復。

上述本揭露之生物可分解的封合膠為黏滯液態，且因此可容易地施用於待黏合或修復之生物組織，並可經由光照而於短時間固化，而有效地黏合或修復生物組織。且上述本揭露之生物可分解的封合膠即便於潮濕環境下仍可有效地黏合或修復生物組織。又，上述本揭露之生物可分解的封合膠由於不具無細胞毒性，因此具有良好之生物相容性，且不會引起免疫反應。

此外，上述本揭露之生物可分解的封合膠生物體內可自然地被分解代謝，而不會影響組織之修復，且可作為細胞與組織修復時之生長模板，加速傷口癒合。

上述本揭露之生物可分解的封合膠，可包括，但不限於，一聚乙二醇衍生物、一光起始劑與一溶劑。於上述本揭露之生物可分解的封合膠中，各成分之含量並不具有特別限制，其可依據其他成分的含量來調整，及/或可依據需求來調整。

在一實施例中，於本揭露之生物可分解的封合膠中，聚乙二醇衍生物的含量可為約10-75 wt%，例如，15-75 wt%、20-75 wt%、10-70 wt%、35-70 wt%、35-50 wt%、40-65  wt%、40-60 wt%、40-75 wt%等，但不限於此。

於本揭露之生物可分解的封合膠中的聚乙二醇衍生物，係可藉由一取代反應所獲得，而於此取代反應中，將聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)以甲基丙烯酸酐(methacrylic anhydride, MA)進行修飾。

在一實施例中，於上述取代反應中，所使用之聚乙二醇的分子量可為約1500-35000，例如，約1500、約8000、約35000等，但不限於此。

又，在一實施例中，於上述取代反應中，所使用之聚乙二醇與甲基丙烯酸酐的重量比可為約1:0.01-10，例如，約1:0.05-2、約1:0.05-1.5、約1:0.05-1、約1:0.05-0.5、約1:1-2、約1:1-1.5、約1:0.5-1、約1:0.5-2、約1:0.2-2、約1:0.2-1.5、約1:0.2-1、約1:0.1-5、約1:0.1-4、約1:0.1-3、約1:0.1-2、約1:0.1-1.5、約1:0.1-1等，但不限於此。

在一特定實施例中，於上述取代反應中，所使用之聚乙二醇之分子量可為約1500，而所使用之聚乙二醇與甲基丙烯酸酐的重量比可為約1:1-10，例如，約1:1、1:2、1:3、1:4等，但不限於此。在另一實施例中，於上述取代反應中，所使用之聚乙二醇之分子量可為約8000，而所使用之聚乙二醇與甲基丙烯酸酐的重量比可為約1:0.05-1.5，例如，約1:0.2(5:1)、約1:0.384(2.6:1)、約1:0.588(1.7:1)、約1:0.769(1.3:1)、約1:1等，但不限於此。在又另一實施例中，於上述取代反應中，所使用之聚乙二醇之分子量可為約35000，而所使用之聚乙二醇與甲基丙烯酸酐的重量比可為約1:0.05-0.8，例如，約1:0.091(11:1)、約1:0.176(5.68:1)、約1:0.265(3.78:1)、約1:0.342(2.92:1)、約1:0.429(2.33:1)等，但不限於此。

又，於本揭露之生物可分解的封合膠之聚乙二醇衍生物中，甲基丙烯酸酐的取代度可為約60-100%，例如，約60-70%、約70-80%、約80-90%、約90-100%，但不限於此。

於本揭露之生物可分解的封合膠中之光起始劑的含量與種類並無特殊限制，只要在對本揭露之生物可分解的封合膠進行一光照程序後，本揭露之生物可分解的封合膠中之光起始劑可加速本揭露之生物可分解的封合膠的固化即可。對本揭露之生物可分解的封合膠所進行之光照程序所採用之光的波長，可依據所採用之光起始劑而定，而進行上述光照程序的時間，則可依據所採用之光起始劑及/或操作狀況而定。而光起始劑的例子，可包括，但不限於一UV光起始劑。

在一實施例中，於本揭露之生物可分解的封合膠中，聚乙二醇衍生物與光起始劑之重量比可為約1:0.001-0.01，例如約1:0.001-0.005、約1:0.0025-0.01、約1:0.003-0.006、約1:0.005-0.01，但不限於此。

又，在一實施例中，上述光起始劑可為一UV光起始劑，而對本揭露之生物可分解的封合膠所進行之光照程序所採用之光的波長，則可依據所採用之UV光起始劑而定，例如可為約200-450 nm，但不限於此。UV光起始劑的例子可包括，但不限於，核黃素(riboflavin)（適用照射UV光之波長為220 nm、261 nm、376 nm或439 nm）、2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-4’-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) （適用照射UV光之波長為276 nm或331 nm）或苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦(phenylbis(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphine oxide)（適用照射UV光之波長為360 nm、365 nm或405 nm）等。而進行上述光照程序的時間，則可依據所採用之UV光起始劑及/或操作狀況而定。

於本揭露之生物可分解的封合膠中之溶劑也無特別限定，只要其不對封合膠的其他成分產生不良影響以及不具細胞毒性即可。本揭露之生物可分解的封合膠中之溶劑的例子，可包括水等，但不限於此。

本揭露之生物可分解的封合膠的滲透壓可為約300-450 mOsm/kg，例如約350-450 mOsm/kg、約300-400 mOsm/kg、約350-400 mOsm/kg，但不限於此。

本揭露之生物可分解的封合膠的體外降解時間可為約70-90小時，例如約70-85小時、約75-90小時、約75-85小時、約75-80小時等，但不限於此。

另外，本揭露之生物可分解的封合膠的的pH可為約6.0-7.5，例如約6.0-7.0、約6.5-7.5、約6.5-7.2等，但不限於此。

本揭露也提供一種生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，而於此所述之生物可分解的封合膠可為任何前述之本揭露之生物可分解的封合膠。

於上述本揭露生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途中，用於生物組織黏合或修復之試劑的使用方法可包括下列步驟，但不限於此。生物組織黏合之試劑的使用方法，可於體外(in vitro )實施，或實施於活體上。

首先，將上述用於生物組織黏合或修復之試劑塗覆於一待黏合或修復之生物組織。上述待黏合或修復之生物組織，可為一離體之生物組織或於活體上之生物組織。上述待黏合或修復之生物組織可列舉為一個體之傷口或組織缺損，但不限於此。

上述個體可包括一動物或一植物。動物的例子可包括魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類或哺乳類，但不限於此。哺乳類的例子可包括，但不限於，人類、猩猩、猴子、馬、驢、狗、貓、兔子、天竺鼠、大鼠與小鼠。

而上述個體之傷口或組織缺損的例子，可包括，但不限於，皮膚之傷口、手術傷口、眼睛之傷口（如，角膜缺損）等。

接著，對上述待黏合或修復之生物組織進行一光照程序以使上述用於生物組織黏合之試劑固化以黏合或修復該待黏合或修復之生物組織。

上述光照程序所採用之光的波長，可依據上述本揭露封合膠中所採用之光起始劑而定，而進行上述光照程序的時間，則可依據上述本揭露封合膠中所採用之光起始劑及/或操作狀況而定。在一實施例中，進行上述光照程序的時間可為約10-60秒，但不限於此。

在一實施例中，上述本揭露封合膠中所採用之光起始劑可為一UV光起始劑，而上述光照程序所採用之光的波長，可依據所採用之UV光起始劑而定，例如可為約200-450 nm，但不限於此。而進行上述光照程序的時間則可依據上述本揭露封合膠中所採用之UV光起始劑及/或操作狀況而定，例如可為10-60秒，但不限於此。UV光起始劑的例子可包括，但不限於，核黃素（適用照射UV光之波長為220 nm、261 nm、376 nm或439 nm）、2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮（適用照射UV光之波長為276 nm或331 nm）或苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦（適用照射UV光之波長為360 nm、365 nm或405 nm）等。

在一特定實施例中，上述待黏合或修復之生物組織為一個體之皮膚傷口，而在前述形成所採用之本揭露封膠中之聚乙二醇衍生物之取代反應中所採用之聚乙二醇的分子量為約35000。

在另一特定實施例中，上述待黏合或修復之生物組織為一個體之眼睛傷口，而在前述形成所採用之本揭露封膠中之聚乙二醇衍生物之取代反應中所採用之聚乙二醇的分子量為約8000。

實施例

實施例 1 ：聚乙二醇衍生物之製備

實施例1-1：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇1500的製備

依據以下步驟藉由第1圖所顯示之迴流滴加反應裝置100（具磁力攪拌器S），來進行經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇1500的合成

1. 將10 g聚乙二醇（分子量1500）（以下稱為聚乙二醇1500）加入單獨未經組裝之250 mL的燒瓶C中，並加熱到120℃，且藉由燒瓶C連接之抽氣幫浦抽氣除水8小時。之後將經上述處理之聚乙二醇1500備用。

2. 將迴流滴加反應裝置100組裝完成，並通入經乾燥劑除水之氮氣，以使氮氣充滿整個裝置。

3. 將步驟1之於燒瓶C中的聚乙二醇1500以100 mL四氫呋喃溶解。

4. 將10.3 g甲基丙烯酸酐以50 mL四氫呋喃溶解以形成一溶液，並將此加到燒瓶A中。

5. 將燒瓶C加熱到80℃，並開啟冷凝迴流裝置B。

6. 將燒瓶A中之溶液緩慢滴入燒瓶C中反應8小時。

7. 於反應結束後，將產物到入1000 mL乙醚中以進行沉澱析出。

8. 將步驟7之產物進行用抽氣過濾。之後，取上部固體，並以50 mL四氫呋喃加熱溶解，接著再以乙醚沉澱。重覆此步驟3次。

9. 最後將步驟8之產物抽氣乾燥1小時以上。之後，將經乾燥之產物置於化學抽器櫃隔夜風乾，以獲得經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇1500 (PEGMA1500)。

實施例1-2：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇8000的製備

實施例1-2-1：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇8000的製備（採用之聚乙二醇8000與甲基丙烯酸酐的莫耳比為1:5）

依據以下步驟藉由第1圖所顯示之迴流滴加反應裝置100（具磁力攪拌器S），來進行經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇8000的合成

1. 將10 g聚乙二醇（分子量8000）（以下稱為聚乙二醇8000）加入單獨未經組裝之250 mL的燒瓶C中，並加熱到120℃，且藉由燒瓶C連接之抽氣幫浦抽氣除水8小時。之後將經上述處理之聚乙二醇8000備用。

2. 將迴流滴加反應裝置100組裝完成，並通入經乾燥劑除水之氮氣，以使氮氣充滿整個裝置。

3. 將步驟1之於燒瓶C中的聚乙二醇8000以100 mL四氫呋喃溶解。

4. 將1.9 g甲基丙烯酸酐以20 mL四氫呋喃溶解以形成一溶液，並將此加到燒瓶A中。

5. 將燒瓶C加熱到80℃，並開啟冷凝迴流裝置B。

6. 將燒瓶A中之溶液緩慢滴入燒瓶C中反應8小時。

7. 於反應結束後，將產物到入1000 mL乙醚中以進行沉澱析出。

8. 將步驟7之產物進行用抽氣過濾。之後，取上部固體，並以50 mL四氫呋喃加熱溶解，接著再以乙醚沉澱。重覆此步驟3次。

9. 最後將步驟8之產物抽氣乾燥1小時以上。之後，將經乾燥之產物置於化學抽器櫃隔夜風乾，以獲得經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇8000 (PEGMA8000)。

實施例1-2-2：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇8000的製備（採用之聚乙二醇8000與甲基丙烯酸酐的莫耳比為1:2）

除了採用10 g之聚乙二醇8000與0.77 g之甲基丙烯酸酐與實施例1-2-1不同以外，其他步驟與實施例1-2-1相同。

實施例1-2-3：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇8000的製備（採用之聚乙二醇8000與甲基丙烯酸酐的莫耳比為1:10）

除了採用10 g之聚乙二醇8000與3.85 g之甲基丙烯酸酐與實施例1-2-1不同以外，其他步驟與實施例1-2-1相同。

實施例1-3：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000的製備

實施例1-3：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000的製備（採用之聚乙二醇35000與甲基丙烯酸酐的莫耳比為1:10）

依據以下步驟藉由第1圖所顯示之迴流滴加反應裝置100（具磁力攪拌器S），來進行經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000的合成

1. 將10 g聚乙二醇（分子量35000）（以下稱為聚乙二醇35000）加入單獨未經組裝之250 mL的燒瓶C中，並加熱到120℃，且藉由燒瓶C連接之抽氣幫浦抽氣除水8小時。之後將經上述處理之聚乙二醇35000備用。

2. 將迴流滴加反應裝置100組裝完成，並通入經乾燥劑除水之氮氣，以使氮氣充滿整個裝置。

3. 將步驟1之於燒瓶C中的聚乙二醇35000以100 mL四氫呋喃溶解。

4. 將0.88 g甲基丙烯酸酐以10 mL四氫呋喃溶解以形成一溶液，並將此加到燒瓶A中。

5. 將燒瓶C加熱到80℃，並開啟冷凝迴流裝置B。

6. 將燒瓶A中之溶液緩慢滴入燒瓶C中反應8小時。

7. 於反應結束後，將產物到入1000 mL乙醚中以進行沉澱析出。

8. 將步驟7之產物進行用抽氣過濾。之後，取上部固體，並以50 mL四氫呋喃加熱溶解，接著再以乙醚沉澱。重覆此步驟3次。

9. 最後將步驟8之產物抽氣乾燥1小時以上。之後，將經乾燥之產物置於化學抽器櫃隔夜風乾，以獲得經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000 (PEGMA35000)。

比較例1-3-1：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000的製備（採用之聚乙二醇35000與甲基丙烯酸酐的莫耳比為1:2）

除了採用10 g之聚乙二醇35000與0.088 g之甲基丙烯酸酐與實施例1-3不同以外，其他步驟與實施例1-3相同。

比較例1-3-2：經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000的製備（採用之聚乙二醇35000與甲基丙烯酸酐的莫耳比為1:5）

除了採用10 g之聚乙二醇35000與0.44 g之甲基丙烯酸酐與實施例1-3不同以外，其他步驟與實施例1-3相同。

實施例 2 ：是否成功合成經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇的確認

實施例2-1：是否成功合成經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇8000的確認

將實施例1-2-1、實施例1-2-2與實施例1-2-3之產物進行NMR圖譜分析，結果分別如第2A、2B與2C圖所示。

依據第2A、2B與2C圖所示之NMR圖譜可知，實施例1-2-1、實施例1-2-2與實施例1-2-3之產物皆具有以箭號所指出之波峰(peak)。此波峰代表甲基丙烯酸酐成功地接枝於聚乙二醇8000，即，經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇8000成功地被合成。

由上述結果可知，當於合成中所使用之聚乙二醇分子量為8000時，聚乙二醇與甲基丙烯酸酐的莫耳比對於合成成功的影響並不顯著。

又，進行實施例1-2-1、實施例1-2-2與實施例1-2-3之產物的甲基丙烯酸酐的取代度確認，結果顯示實施例1-2-1、實施例1-2-2與實施例1-2-3之產物的甲基丙烯酸酐的取代度為約60-70%。

實施例2-2：是否成功合成經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000的確認

將比較例1-3-1、比較例1-3-2與實施例1-3之產物進行NMR圖譜分析，結果分別如第3A、3B與3C圖所示。

依據第3A、3B與3C圖所示之NMR圖譜可知，僅有實施例1-3之產物具有以箭號所指出之波峰。此波峰代表甲基丙烯酸酐成功地接枝於聚乙二醇35000，即，經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000成功地被合成。

由上述結果可知，當於合成中所使用之聚乙二醇分子量為35000時，聚乙二醇與甲基丙烯酸酐的莫耳比對於合成成功的影響較為顯著，僅有甲基丙烯酸酐之莫耳量為聚乙二醇10倍時，經甲基丙烯酸酐修飾之聚乙二醇35000才成功地被合成。

又，進行實施例1-3之產物的甲基丙烯酸酐的取代度確認，結果顯示實施例1-3之產物的甲基丙烯酸酐的取代度可達約100%。

實施例 3 ：封合膠之製備

依據以下表1所示之不同配方將各成分直接混合，以分別製備具不同配方的封合膠。

表1

起始劑：2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮；溶劑：水； -：無添加

實施例 4 ：封合膠之初步外觀與性質評估

將實施例3中所製備之具不同配方之封合膠以UV燈照射60秒，以使其固化。之後，將經固化之具不同配方的封合膠進行初步外觀與性質評估，結果如表2與第4圖所示。

表2

依據表2可知，封合膠2具有較佳之操作性。

實施例 5 ：封合膠之物理與化學性質評估

將實施例3所製備之本揭露封合膠4與市售商品(Resure)進行各種物理與化學性質評估。評估方式與結果如表3所示。

表3

實施例 6 ：膨潤度研究與降解分析

A. 方法

將樣本（實施例3所製備之封合膠4置於37℃的真空烘箱中24小時，然後測量其表觀乾重(dry weight, Wd)。之後，將樣本置於蒸餾水中以確定其於37℃乾燥後的吸水率(water uptake, Ws)。

使用天平測量質量損失。在每個時間點，將樣本於乾燥後稱重，並通過比較初始質量與給定時間點的質量來計算質量損失。在將樣本保持在3個溫度，37℃，50℃與65℃，同時進行測量，結果以平均值表示。

B.結果

第5A圖顯示貼附至一1.5 mL微量離心管之線狀(line-shaped)本揭露封合膠的黏附(adhesion)與拉伸(stretching)的結果。經拉伸之封合膠即便其一部分被移除，仍可輕易黏附至皮膚。第5B顯示了浸入水中之前與之後的本揭露封合膠。在最初的2小時內，本揭露封合膠膨脹至其初始重量的11倍（第5B圖）。

在37℃、50℃和65℃溫度下降解的本揭露封合膠的質量損失數據總結於第5C圖。在前3天期間，觀察到保持在37℃和50℃之溫度下的本揭露封合膠具類似的質量損失。在第7天，保持在65℃溫度的樣本表現出更快的質量損失率，總共損失了其原始質量的20%。在第14天，保持在65℃的樣本顯示比在降解第12天更快的質量損失率，損失超過其原始重量的95%。保持在65℃之本揭露封合膠的質量損失率高於保持在37℃和50℃的本揭露封合膠的質量損失率。

實施例 7 ：本揭露封合膠之生物特性測試

A.方法

1. 細胞毒性分析和3-（4,5-二甲基-噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑(3-(4,5-Dimethyl-Thiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium, MTT)測定

於本測定中，係採用實施例3所製備之封合膠4。

細胞毒性分析係依據ISO 10993-5:2009來執行。使用小鼠成纖維細胞系(L929; Bioresources Collection and Research Center, Hsin Chu, Taiwan)，在顯微鏡下對細胞形態(cell morphology)和單層匯合(monolayer confluency)的定性測量進行評分。

將冷凍保存的L929細胞解凍，並於37±1℃，5%CO₂ 氣氛中培養於最低必需培養基(minimum essential media)/α修飾培養基(alpha modification medium)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培養。當用顯微鏡評估細胞單層達到80%匯合時，將細胞繼代培養直至在使用前到達第2或第3代。培養基一週置換兩次。根據ISO 10993-12，測試化合物/培養基的表面比(surface ratio)為0.2 g/mL。因此，將3.6 g之各測試樣本(S)以18 mL培養基於1,000 g的轉速在37±1℃下提取24±2小時。將使用培養基製備的10%(v/v)二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO; Sigma-Aldrich)溶液用作正對照(positive control, PC)。基於ISO 10993-12，提取率為0.2 g/mL，並且1.0 g高密度聚乙烯(high-density polyethylene)(Sigma-Aldrich)用作負對照(negative control, NC)。將各樣本浸入5 mL培養基中，並以1,000 g的轉速在37±1℃下提取24±2小時。另外，使用5 mL培養基作為空白組(blank, B)，然後以100 rpm的轉速在37±1℃下培養24±2小時。

進行MTT (Sigma-Aldrich)測定以定量評估測試樣本提取物的細胞毒性。對於此測定，將5×10⁴ 個L929小鼠成纖維細胞接種在24孔培養盤中，然後在37±1℃，5%CO₂ 氣氛中培養24±2小時，以獲得匯合的細胞單層。細胞附著後，移除各孔中的原始培養基，並用0.5mL之各自的測試培養基（B、PC、NC與S）代替。然後，將測試盤在37±1℃，5%CO₂ 氣氛中培養24±2小時。將培養盤培養24小時。於24小時之後，將每孔中的細胞用中性紅溶液(neutral red solution)(Sigma-Aldrich)染色，並依據表4中標準，在倒置顯微鏡(Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Germany)下根據細胞形態與存活率(viability)的變化評分。在培養期結束時，將10 mL MTT試劑加入含有100 mL培養基的各個孔中。反應在37℃，5%CO₂ 氣氛中在黑暗中進行2小時。然後，將0.1 mL去污劑試劑(Sigma-Aldrich)加入每個孔洞中加入，接著在黑暗中培養2小時，之後測量吸光度。用微孔盤讀取儀(Molecular Devices, Silicon Valley, CA, USA)在570 nm（參考波長：630 nm）下測量測試樣本的吸光度。

表4、使用中性紅溶液之細胞毒性評估

2. 皮膚過敏研究

於本測定中，係採用實施例3所製備之封合膠4。

為了使研究符合“非臨床實驗室研究的良好實驗室規範(Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Study)”，品質保證部門定期審核設施、設備、人員、測試方法、原始數據與記錄。所有動物實驗均根據瑞德生物科技有限公司核可的方案進行（IACUC No.: MS20160706，新竹縣，台灣，中華民國）。依據ISO 10993-10:2010在天竺鼠上測試本揭露封合膠之極性與非極性提取物（極性提取物係以60% 2,4-二硝基氯苯(2,4-Dinitrochlorobenzene, DNCB)萃取，而非極性提取物係以棉籽油進行萃取）的皮膚致敏潛力（體重[性別]：300-500 g[雄性]；年齡約85天，來自國家實驗動物中心，台灣）。以試驗化合物（本揭露封合膠之極性與非極性提取物）處理後，在誘導期(induction phase)施用提取物兩次，在挑戰期(challenge phase)施用一次。然後，在挑戰期後24小時與48小時，根據Magnusson和Kligman量表(ISO 10993-10)的標準來評估處理區域的可見變化。

3. 皮內刺激(Intracutaneous Irritation)研究

於本研究中，係採用實施例3所製備之封合膠4。

以紐西蘭白兔評估對於本揭露封合膠提取物的皮內刺激（體重 [性別]：>2 kg [雄性]；年齡約65天，來自國家實驗動物中心，台灣）。依照ISO 10993-10測試進行。將兔子剃毛以在5個位置去除軟毛，隨後在每個位置注射測試化合物的提取物。將對照溶液（0.9%生理食鹽水（極性對照）與棉籽油[Sigma-Aldrich]（非極性對照））注射到每隻兔子的同一側，並在24、48與72小時的時間點評估皮膚反應。

4. 於白兔中之熱原(pyrogen)研究

於本研究中，係採用實施例3所製備之封合膠4。

遵循USP39/NF34(151)的指導原則，以確認試驗樣本提取物在耳靜脈中單劑量注射（10 mL/kg）是否通過紐西蘭白兔的熱原評估（Hui Jun，體重 [性別]：> 2 kg [雄性]；年齡約65歲天）。在試驗前5天，測量兔子的體溫。選擇用於熱原研究的兔子的標準是體溫在4個測量時間內不超過39.8℃並且在最高和最低體溫之間不超過1℃的差異。在研究期間，僅提供逆滲透水。使用直腸溫度計(rectal thermometer)（精確度±0.1℃）測定每隻動物的控制溫度(control temperature)。研究中使用的每個器具也都是無熱原的。在初步試驗中，確定了3隻動物的控制溫度。將測試樣本（溫熱至37℃±2℃）注入動物的耳靜脈。

給藥時間不超過10分鐘。以30分鐘的間隔在給藥後1、1.5、2、2.5與3小時測量體溫5次。經由從5個測量時間中的最高溫度中減去控制溫度來計算動物體溫的升高。當初步測試的結果指出發燒（高溫）時，則以另外5隻動物來進行主要測試。

5. 急性系統注射研究

於本研究中，係採用實施例3所製備之封合膠4。

根據ISO 10993-11：2006指南進行系統毒性研究，以評估小鼠（ICR小鼠，BioLASCO Taiwan Co., Ltd, 台北，台灣；體重 [性別]：17至23 g [雄性]）對本揭露封合膠提取物的毒性反應。將測試化合物提取物以每公斤體重50 mL測試化合物提取物的劑量注射到小鼠中。用於靜脈內注射的0.9%生理食鹽水和用於腹膜內註射的棉籽油的對照溶液以50 mL/kg體重的劑量水平給予。極性提取物用於靜脈內注射，而非極性提取物用於腹膜內注射。

6. 傷口閉合(Wound Closure)動物研究

於本測定中，係採用實施例3所製備之封合膠6。

為了評價本揭露封合膠的生物粘附性和生物相容性，使用Zoletil（Virbac，台灣，台北）麻醉大鼠（正常SpragueDawley [SD]大鼠，100至150 g，4週大，雄性；BioLASCO Taiwan Co., Ltd），並將其背部剃毛。在大鼠背部的兩側製造具1.5 cm長且全皮膚厚度深的皮膚切口。使用Coloskin或本揭露封合膠使皮膚切口快速閉合。本揭露封合膠係藉由使用200-nm注射過濾器(syringe filters)經由過濾來進行滅菌，並以雙注射器套件(dual syringe kit)來進行製備。將50 μL等分試樣(aliquot)的Coloskin或本揭露封合膠施用於傷口區域。而針對以本揭露封合膠處理之大鼠，於本揭露封合膠施用於傷口區域後，以UV光（波長365 nm）照射傷口區域60秒，以使封合膠固化。分別在傷口閉合後即刻與處理後第1與4天對傷口區域照像。又，於處理後第7天量測傷口面積，且於處理後第14天將動物犧牲，收取閉合的皮膚，並在多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)溶液(3.7 wt.%)中固定以用於蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin, H＆E)染色與馬森三色染色(Masson's trichrome stain)後的組織學分析(Sigma-Aldrich)。藉由使用Image J軟體(National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA)來計算膠原蛋白的生長。

7. 角膜修復研究

於本研究中，係採用實施例3所製備之封合膠5。

將紐西蘭白兔分成縫線縫合組、Coloskin處理組與本揭露封合膠處理三組。於第0天，在各組白兔之眼睛的角膜上製造3 mm長之切口，並將其分別以9-0、以Coloskin處理與以本揭露封合膠處理（於切口施用本揭露封合膠後，對其照射UV光（波長365 nm）10秒，以使封合膠固化）（縫線縫合組：n=3；Coloskin處理組：n=3與本揭露封合膠處理：n=4。n：眼睛數目）。於第3天，將各組白兔之眼睛進行螢光抗體(Fluoro Touch (Fluorescein Sodium Ophthalmic Strips), Madhu Instruments Pvt. Ltd)染色以觀察傷口是否有潰瘍發生。

之後，於將白兔犧牲後，將眼球組織取下並以Davison固定液保存。接著，將角膜切片並進行染色以觀察角膜狀態。

8. 統計分析

所有數據均以平均值（標準差）表示。通過單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)評估結果之間差異的顯著性(EXCEL，Microsoft，Seattle，WA，USA)。對於所有測試，P 值>0.05被認為具有統計學意義。

B. 結果

1. 體外細胞存活與MTT測定

為了評估本揭露封合膠的細胞毒性，評價了樣本對細胞生長、形態與存活的影響。將細胞暴露於提取物24小時後，評估以下項目：

定性測定

在以空白(B)、負對照(NC)、正對照(PC)或測試樣本(S)處理L929細胞3小時並用中性紅染色後，使用倒置顯微鏡（100x）進行L929細胞的形態學評估。經空白(B)與負對照(NC)處理之細胞的形態顯示為具有明顯的片狀偽足(lamellipodia)與絲狀偽足(filopodia)的長紡錘形(long spindle shape)，而不是裂解的圓形形狀與抑制生長。然而，經正對照處理的細胞顯示出幾乎完全圓形的裂解形態；細胞層幾乎完全被破壞，觀察到生長抑制。用測試樣本處理的細胞顯示出與用空白(B)與負對照(NC)處理的細胞相同的長紡錘形。根據顯微鏡檢測的結果，空白(B)、負對照(NC)、正對照(PC)與測試樣本(S)組中圓形或裂解細胞的百分比分別為0%，1%，100%和5%。因此，空白(B)、負對照(NC)、正對照(PC)與測試樣本(S)組的細胞毒性分別被分級在0、0、4與0（表4與第6圖）。

定量測定

以空白(B)、負對照(NC)、正對照(PC)與測試樣本(S)處理L929細胞24小時，藉由MTT細胞增殖/存活測定來評估細胞存活。空白(B)、負對照(NC)、正對照(PC)與測試樣本(S)組在570 nm的吸光度值分別為1.065±0.071、1.051±0.056、0.294±0.038與0.861±0.053；各別之細胞存活率值分別為100%、99%、28%與81%，而各別之死亡率值為0%、1%、72%與19%（表5）。

表5

定性和定量測定結果（表4與表5）顯示零反應性。因此，本揭露封合膠的提取物溶液被認為不具體外細胞毒性。

2. 皮膚過敏研究

於天竺鼠上測試本揭露封合膠的皮膚致敏潛力。在提取測試樣本後，將提取物在誘導期施用兩次，在挑戰期施用一次。然後，在攻擊階段後24小時和48小時，對照組和處理組均未顯示在處理區上之皮膚反應的可見變化（表5與第7A-C圖）。結果顯示，測試樣本（極性或非極性）不會對所測試之天竺鼠的皮膚造成延遲性過敏反應(delayed hypersensitivity)。

表5、在天竺鼠中之皮膚反應

n/n：具有異常臨床症狀的天竺鼠數目/各組之天竺鼠數目

3. 皮內刺激研究

皮內刺激結果顯示對照組或處理組無明顯臨床症狀或嚴重發現，且任何試驗組均無死亡率。因此，在紐西蘭白兔中單次局部施用0.2 mL試驗化合物提取物並不會引起皮內刺激。皮內刺激結果顯示，在任何時間點，單次施用測試化合物提取物在紐西蘭白兔中並誘導可觀察到的臨床症狀與皮膚明顯變化。因此，本揭露封合膠的單次局部應用不會在紐西蘭白兔中引起可觀察到的刺激（第8圖）。

4. 於白兔中之熱原研究

3隻紐西蘭白兔的體重皆超過1.5 kg，而符合研究資格。3隻動物的控制溫度分別為39.42℃、39.37℃與39.25℃。3隻兔子隻任何體溫升高皆低於0.5℃（表6；動物編號79-1001：-0.46℃；動物編號79-1002：-0.10℃；動物編號79-1003：-0.05℃）。在耳靜脈注射單劑量(10 mL/kg)之化合物後，測量3隻合格白兔的體溫5次。所有樣本的熱原反應均為陰性；因此，認定樣本通過了熱原研究。

表6、於白兔中之熱原研究

溫度升高：最高溫（於5次測量中）減去控制溫度

5. 急性系統注射研究

在注射測試樣本和對照溶液後，在小鼠中評估對本揭露合膠的毒性反應。結果顯示在對照組或處理組中沒有明顯的臨床症狀或總體發現。因此，測試樣本在注射後不會引起毒性反應或死亡（表7）。研究結果顯示，在任何時間點，單次應用本揭露封合膠或對照均未在小鼠中誘導可觀察到的臨床症狀或嚴重發現。因此，本揭露封合膠在注射後不會引起毒性反應或死亡（表7）。

表7、急性系統注射研究

n/n：具有顯著症狀之小鼠數目/各群組之小鼠數目

6. 傷口閉合動物研究

在施用本揭露封合膠之後， SD大鼠背部切口的出血立即被停止，且傷口在幾分鐘內即閉合。在施用Coloskin之後，傷口並未閉合。又，在不同時間點進行視覺檢查以比較本揭露封合膠處理的切口與Coloskin（市售商品）處理的切口。結果顯示，本揭露封合膠增強了傷口閉合過程（第9A圖之A與B部分）。組織學評價（H＆E染色）顯示，處理後第14天，本揭露封合膠處理組中之傷口部位的膠原蛋白多於Coloskin處理組（第9A圖之C部分）。Coloskin處理組與本揭露封合膠處理組中的平均膠原蛋白分別為65.2%與77.2%(Image J) （第9B圖）。也計算了兩組之間的傷口面積，而在處理7天後，Coloskin處理組與本揭露封合膠處理組中的平均傷口面積分別為0.4 cm² 與0.2 cm² （第9C圖）。

7. 角膜修復研究

於0天在各組白兔之眼睛的角膜上製造3 mm長之切口，並將其分別以9-0縫線縫合、以Coloskin處理與以本揭露封合膠處理（於切口施用本揭露封合膠後，對其照射UV光（波長 365 nm）10秒，以使封合膠固化。之後，於第3天，將各組白兔之眼睛進行螢光抗體染色以觀察傷口是否有潰瘍發生。

結果如第10A圖與表8所示。

表8

n/n：被螢光染色之眼睛（或有發炎情況之眼睛）的數目/各群組之眼睛數目 Mann等人2012 Toxicicogic Pathology

第10A圖與表8顯示，除了Coloskin處理組發現角膜之傷口具有潰瘍與大面積染色之外，其他組別角膜皆未被螢光染色。因此可知，針對角膜修補，本揭露封合膠效果可與手術縫合相同。又，所有組別皆未發現水晶體與虹膜異常。

又，於實驗完成後，將白兔犧牲，並獲得角膜切片並對其進行觀察，並測量同一角膜之傷口區域與非傷口區域的厚度。觀察結果如第10B圖所示。

依據第10B圖可知，Coloskin處理組之白兔的角膜劇有缺損，而本揭露封合膠處理組與對照組則無此現象。

又，本揭露封合膠處理組與對照組之角膜為在第三或四期角膜癒合階段，然而Coloskin處理組之角膜則在第一或二期角膜癒合階段。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

100:迴流滴加反應裝置 A:燒瓶 B:冷凝迴流裝置 C:燒瓶 S:磁力攪拌器

第1圖顯示，於一實施例中於合成本揭露聚乙二醇衍生物時所使用之一迴流滴加反應裝置100。 第2A圖顯示，本揭露實施例1-2-1之產物之NMR圖譜分析結果。 第2B圖顯示，本揭露實施例1-2-2之產物之NMR圖譜分析結果。 第2C圖顯示，本揭露實施例1-2-3之產物之NMR圖譜分析結果。 第3A圖顯示，本揭露比較例1-3-1之產物之NMR圖譜分析結果。 第3B圖顯示，本揭露比較例1-3-2之產物之NMR圖譜分析結果。 第3C圖顯示，本揭露實施例1-3之產物之NMR圖譜分析結果。 第4圖顯示，本揭露之具不同配方之封合膠與試片（片狀豬腸膜）黏合後固化的照片。 第5A圖顯示，本揭露封合膠之彈性的照片。封合膠可以容易地拉伸至其初始長度的約10倍而沒有可見或永久性形變。 第5B圖顯示，本揭露封合膠在不同時間點的膨潤比(swelling ratios)。 第5C圖顯示，由於差異溫度的降低，本揭露封合膠的相對質量隨時間降低。 第6圖顯示，本揭露封合膠之細胞毒性分析和3-（4,5-二甲基-噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑(3-(4,5-Dimethyl-Thiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium, MTT)測定的結果。處理24小時後在100X倒置顯微鏡下觀察L929細胞（小鼠成纖維細胞系）的細胞形態。(A) 空白 (B)：培養液；(B) 負對照(negative control NC)：高密度聚乙烯(high-density polyethylene)；(C) 正對照(positive control, PC)：10%(v/v)二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)；(D) 測試樣本(S)：本揭露之封合膠。 第7A圖顯示，於本揭露封合膠（極性提取物）之皮膚過敏試驗中，皮膚反應之觀察的照片（對照組：0.9%生理食鹽水）。 第7B圖顯示，於本揭露封合膠（非極性提取物）之皮膚過敏試驗中，皮膚反應之觀察的照片（對照組：棉籽油）。 第7C圖顯示，於本揭露封合膠之皮膚過敏試驗中，皮膚反應之觀察的照片（正對照：Coloskin）。 第8圖顯示，本揭露封合膠之皮內刺激研究的結果。(A) 於給藥後第24小時的觀察； (B) 於給藥後第48小時的觀察；(C) 於給藥後第72小時的觀察。 第9A圖顯示，傷口閉合之動物試驗的照片。以Coloskin與本揭露封合膠處理大鼠背部的皮膚切口。(A) 處理後第1天、(B)處理後第4天；與（C）在處理後第14天收取閉合之皮膚並固定在對甲醛溶液（3.7重量％）中以用於經由蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin, H＆E)染色和馬森三色染色(Masson's trichrome stain)之組織學分析。 第9B圖顯示，於傷口閉合之動物試驗中，在以Coloskin與本揭露封合膠處理後第14天膠原蛋白測定的統計結果(P > 0.01)。 第9C圖顯示，於傷口閉合之動物試驗中，以Coloskin與本揭露封合膠處理後第7天各種處理之傷口面積(P >0.01)。 第10A圖顯示，紐西蘭白兔之角膜切口經以9-0縫線縫合、Coloskin處理與本揭露封合膠處理後第0天、第1天與第3天之照片。 第10B圖顯示，在紐西蘭白兔之角膜切口經以9-0縫線縫合、Coloskin處理與本揭露封合膠處理後第7天，將角膜切片觀察結果。

無。

Claims (28)

1. 一種生物可分解的封合膠，包括：一聚乙二醇衍生物，其中該聚乙二醇衍生物係藉由一取代反應所獲得，而於該取代反應中，將聚乙二醇以甲基丙烯酸酐進行修飾；一光起始劑；以及一溶劑，其中於該生物可分解的封合膠中，該聚乙二醇衍生物的含量為10-75wt%。
2. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中於該取代反應中，所使用之該聚乙二醇之分子量為1500-35000。
3. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中於該取代反應中，所使用之該聚乙二醇之分子量為1500、8000或35000。
4. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中於該取代反應中，所使用之該聚乙二醇與該甲基丙烯酸酐的重量比為1：0.01-10。
5. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中於該取代反應中，所使用之該聚乙二醇之分子量為1500，而所使用之該聚乙二醇與該甲基丙烯酸酐的重量比為1：1-10。
6. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中於該取代反應中，所使用之該聚乙二醇之分子量為8000，而所使用之該聚乙二醇與該甲基丙烯酸酐的重量比為1：0.05-1.5。
7. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中於該取代反應中，所使用之該聚乙二醇之分子量為35000，而所使用之該聚乙二醇與該甲基丙烯酸酐的重量比為1：0.05-0.8。
8. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中於該聚乙二醇衍生物中，該甲基丙烯酸酐的取代度為60-100%。
9. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中該聚乙二醇衍生物與該光起始劑之重量比為1：0.001-0.01。
10. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中該光起始劑包括一UV光起始劑。
11. 如申請專利範圍第10項所述之生物可分解的封合膠，其中該UV光起始劑包括核黃素(riboflavin)、2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-4’-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)或苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦(phenylbis(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphine oxide)。
12. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中該溶劑包括水。
13. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中該生物可分解的封合膠的滲透壓為300-450mOsm/kg。
14. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中該生物可分解的封合膠的體外降解時間為70-90小時。
15. 如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠，其中該生物可分解的封合膠的pH為6.0-7.5。
16. 一種生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該生物可分解的封合膠為如申請專利範圍第1項所述之生物可分解的封合膠。
17. 如申請專利範圍第16項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該用於生物組織黏合或修復之試劑的使用方法包括：(a)將該用於生物組織黏合或修復之試劑塗覆於一待黏合或修復之生物組織；以及(b)對該待黏合或修復之生物組織進行一光照程序以使該用於生物組織黏合之試劑固化以黏合或修復該待黏合或修復之生物組織。
18. 如申請專利範圍第16項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該聚乙二醇之分子量為1500-35000。
19. 如申請專利範圍第16項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中於該取代反 應中，所使用之該聚乙二醇與該甲基丙烯酸酐的重量比為1：0.01-10。
20. 如申請專利範圍第16項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中於該聚乙二醇衍生物中，該甲基丙烯酸酐的取代度為60-100%。
21. 如申請專利範圍第16項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該聚乙二醇衍生物與該光起始劑之重量比為1：0.001-0.01。
22. 如申請專利範圍第17項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中進行該光照程序的時間為10-60秒。
23. 如申請專利範圍第17項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該光照程序係藉由一UV光來執行，而該UV光的波長為200-450nm。
24. 如申請專利範圍第17項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該光起始劑為一UV光起始劑，而該UV光起始劑包括核黃素、2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮或苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦。
25. 如申請專利範圍第17項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該待黏合或修復之生物組織為一個體之傷口。
26. 如申請專利範圍第25項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該傷口為一皮膚之傷口或眼睛之傷口。
27. 如申請專利範圍第25項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該傷口為一皮膚之傷口，且其中於該取代反應中，所使用之該聚乙二醇之分子量為35000。
28. 如申請專利範圍第25項所述之生物可分解的封合膠在製備用於生物組織黏合或修復之試劑中的用途，其中該傷口為一眼睛之傷口，且其中於該取代反應中，所使用之該聚乙二醇之分子量為8000。

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