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TWI746420B - 抗ｎｍｅ抗體 - Google Patents

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TWI746420B
TWI746420B TW104111213A TW104111213A TWI746420B TW I746420 B TWI746420 B TW I746420B TW 104111213 A TW104111213 A TW 104111213A TW 104111213 A TW104111213 A TW 104111213A TW I746420 B TWI746420 B TW I746420B
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TW
Taiwan
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nme7
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human
cancer
antibody
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TW104111213A
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Inventor
辛席亞 班姆達德
比諾依 施馬姬
Original Assignee
美商密內瓦生物技術公司
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Publication date
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Abstract

本申請案揭示抗NME抗體及其在治療或預防疾病中之用途。

Description

抗NME抗體
本申請案係關於NME蛋白質、來源於NME蛋白質之肽及由其肽產生之抗體或藉助於其結合於該等肽之能力而選擇之抗體或抗體片段。本申請案亦係關於治療或預防患者與NME之表現有關之疾病。
NDPK(核苷二磷酸蛋白激酶)蛋白質為集合之蛋白質家族，因為其皆含有NDPK結構域。最早發現之NME蛋白質(先前稱為NM23蛋白質)為NM23-H1及NM23-H2。數十年來，尚不明確其是否誘導分化或阻止造血細胞分化。本發明人先前發現NM23-H1在其為二聚體時阻止分化，其結合於MUC1*生長因子受體，但在較高濃度下，NM23-H1變成六聚體，其不結合於MUC1*，且其誘導分化。當發現NM23在一些侵襲性極高之癌症中表現不足時，其過去被稱為轉移抑制因子。本發明人先前揭示NM23-H1二聚體結合於在絕大部分癌症中過表現之MUC1*生長因子受體之細胞外結構域且使其二聚化，且此類結合促進癌細胞之生長。相反，在較高濃度下，NM23形成不結合於MUC1*且不促進腫瘤發生之四聚體及六聚體。最近，已發現更多的NME家族蛋白質(NME 1-10)，但迄今尚未明確其功能。NME7為新發現的NME家族蛋白質，但其NDPK結構域不具有酶活性，與其他NME家族成員不同。NME7在成年組織中完全不表現或以極 低含量表現。
本申請案係關於治療或預防個體之癌症的方法，其包含投予個體針對NME家族中之成員所產生的抗體。NME家族可為NME7家族。抗體可結合於NME7。抗體可結合於NME7-AB或NME-AB樣蛋白質。抗體可結合於NME7-X1。抗體可抑制NME7與其同源結合搭配物之間的結合。同源結合搭配物可為MUC1*。同源結合搭配物可為MUC1*細胞外結構域之PSMGFR部分。在一個態樣中，可針對抗體結合於選自圖16-19中所列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)之能力產生或選擇抗體。肽較佳可選自圖19中列舉之肽(SEQ ID NO：141至145)。
肽可與圖16-19中列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)高度同源或與其相比在N端或C端添加或減去至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個胺基酸殘基。在一個態樣中，可針對抗體結合於NME7-AB或NME7-X1但不結合於NME1之能力來選擇抗體。抗體可為多株、單株、二價、單價、雙特異性、含有可變區之抗體片段或抗體模擬物。抗體可為人類或人類化抗體。抗體可為單鏈scFv。
在另一態樣中，本發明係關於治療或預防個體之癌症的方法，其包含投予個體與NME7-AB之結構區高度同源或一致的肽。肽可與圖16中列舉之肽中之一或多者至少80%同源。肽可與圖17中列舉之肽中之一或多者至少80%同源。肽可與圖18中列舉之肽中之一或多者至少80%同源。肽可與圖19中列舉之肽中之一或多者至少80%同源。肽可選自圖16-19中列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)。肽可選自圖19中列舉之肽(SEQ ID NO：141 至145)。或者，肽可與圖16-19中列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)高度同源或與其相比在N端或C端添加或減去至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個胺基酸殘基。肽可經由間隔子或連接子連接至另一個肽。
在另一態樣中，本發明係關於嵌合抗原受體(CAR)，其係用於治療或預防癌症，其中CAR之靶向細胞外部分至少包含NME家族中之成員之肽片段。NME家族可為NME7家族。NME7家族之成員可為NME7。或者，NME7家族之成員可為NME7-AB或NME-AB樣蛋白質。NME7家族之成員亦可為NME7-X1。CAR之靶向細胞外部分可包括圖16-19中列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)中之肽。肽可選自圖19中列舉之肽(SEQ ID NO：141至145)。肽可包括與圖16-19中列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)高度同源或與其相比在N端或C端添加或減去至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個胺基酸殘基之肽。肽可經由間隔子或連接子連接至另一個肽。
在另一態樣中，本發明係關於治療或預防癌症或癌症轉移之方法，其包含將如技術方案3之嵌合抗原受體工程改造成免疫系統細胞及向有需要之個體投予該細胞。
在另一態樣中，本發明係關於嵌合抗原受體(CAR)，其係用於治療或預防癌症，其中嵌合抗原受體之靶向細胞外部分包含結合於NME7-AB、NME-AB樣蛋白質或NME7-X1之抗體之一部分。該抗體部分可為單鏈或可為人類或人類化抗體。
在另一態樣中，本發明係關於針對癌症或轉移性癌症對個人 進行接種之方法，其包含用NME家族中之成員之肽片段使個人免疫。NME家族可為NME7家族。NME7家族之成員可為NME7或NME7b。NME7家族之成員可為NME7-AB或NME7-AB樣蛋白質。NME7家族可為NME7-X1。免疫肽可為來自圖16-19中列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)的肽。肽較佳可選自圖19中列舉之肽(SEQ ID NO：141至145)。免疫肽可包括與圖16-19中列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)高度同源或與其相比在N端或C端添加或減去至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個胺基酸殘基之肽。免疫肽可經由間隔子或連接子連接至另一個肽。
在另一態樣中，本發明係關於治療或預防個體之癌症的方法，其包含投予個體可抑制NME7、NME7b、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1之表現的核酸。核酸可為抑制NME7、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1之表現的反義核酸。核酸可為抑制NME7、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1之表現的抑制性RNA、siRNA、RNAi或shRNA。
在另一態樣中，本發明係關於治療或預防個體之癌症的方法，其包含投予個體可抑制NME7、NME7b、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1之表現的基因編輯核酸。可將抑制NME7、NME7b、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1之表現的基因編輯核酸插入可隨後投予患者之細胞中。可使用病毒載體將抑制NME7、NME7b、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1之表現的基因編輯核酸插入細胞中。病毒載體可為慢病毒系統。
在另一態樣中，本發明係關於使癌細胞生長之方法，其包含使細胞與NME7-AB、NME7b、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1、2i或5i接 觸。該方法可包括在含有NME7-AB、NME7b、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1、2i或5i之培養基中培養細胞，或在表現人類NME7-AB、NME7b、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1之動物中或在接受NME7-AB、NME7b、NME7-AB樣蛋白質或NME7-X1投予之動物中使細胞生長。癌細胞可為乳房、前列腺、卵巢、結腸直腸、胰腺、肝、黑素瘤或腦癌細胞。可在細胞上測試藥物候選物。可藉由以下手段來評估藥物之功效：與無藥物對照比較癌症生長，或與無藥物對照比較轉移性標記物或幹細胞標記物之表現量，或比較所得細胞在動物中自低細胞複本數(與無藥物對照比相比)形成腫瘤之能力且測定候選藥物治療癌症或轉移之功效。細胞可自接受癌症治療評估之患者獲得且使用上述方法基於結果選擇對患者有效之藥物。可不自接受癌症治療評估之患者獲得細胞，但使用上述方法基於結果選擇對患者有效之藥物。
在另一態樣中，本發明係關於自具有來源於NME之序列之序列的肽或肽模擬物產生抗體或抗體樣分子之方法。NME可為NME7。可使用肽作為免疫原以產生抗體或抗體樣分子。可將肽投予動物以產生抗NME7抗體。可將肽投予人類以產生抗NME7抗體。肽可具有圖16至19中列舉之序列(SEQ ID NO：88至145)。肽較佳可選自圖19中列舉之肽(SEQ ID NO：141至145)。肽可包括與圖16-19中列舉之肽(SEQ ID NO：88至145)高度同源或與其相比在N端或C端添加或減去至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個胺基酸殘基之肽。
在另一態樣中，本發明係關於偵測癌症之存在或癌症之進展狀態的方法，其包含以下步驟： 1)自患有癌症或具有發展癌症之風險的患者獲得樣品；2)對樣品進行能夠偵測或量測NME7家族中之成員之含量或編碼NME7家族中之成員之核酸之含量的分析法；3)比較測試樣品中所量測之NME7家族之成員或編碼NME7家族之成員之核酸的含量與對照患者或對照細胞中之含量；4)確定與對照相比，NME7家族之成員或編碼NME7家族之成員之核酸的含量升高；及5)若測試中所比較之對照來自先前診斷患有癌症之供體，則推斷測試樣品之供體患有癌症或具有癌症之進展狀態。在此方法中，循環中或組織中NME7家族之成員之偵測可為患者中癌症之標記物。NME7家族之成員可為NME7、NME7b、NME7-X1或NME7-AB樣蛋白質。
在另一態樣中，本發明係關於一種方法，其包含：偵測患者中NME7家族之成員或MUC1*之存在；及向展現NME7家族之成員或MUC1*表現之患者投予抗NME7或抗MUC1*抗體。NME7家族之成員可為NME7、NME7b、NME7-X1或NME7-AB樣蛋白質。
在另一態樣中，本發明係關於用於治療或預防癌症之方法，其包含：1)自疑似患有癌症或具有發展癌症之風險或具有發展轉移性癌症之風險的患者獲得樣品；2)量測NME7家族之成員或編碼NME7家族中之成員之核酸的量，其中所量測之含量顯著高於對照樣品中所量測之含量； 3)確定患者患有癌症或發展侵襲性更高或轉移性的癌症；4)投予患者有效量之可抑制NME7家族之成員之表現、抑制NME7之裂解或抑制NME7結合於其目標之治療劑。NME7家族之成員之目標可為MUC1*。NME7家族之成員之目標可為MUC1*細胞外結構域之PSMGFR部分。NME7家族之成員可為NME7、NME7b、NME7-X1或NME7-AB樣蛋白質。
在以上關於癌症之方法中之任一者中，癌症可包括乳房、前列腺、卵巢、結腸直腸、胰腺、肝、黑素瘤或腦癌。
自下文中給出之實施方式及僅以說明方式給出且因此不限制本發明之隨附圖式，本發明將變得更充分理解，且其中：圖1A-1D.西方墨點法凝膠之照片展示以下各者之細胞溶解物中NME1或NME7之表現：1)在塗有MUC1*抗體表面(MN-C3 mab)之表面上，於NM23-H1二聚體中培養之BGO1V人類胚胎幹細胞；2)在小鼠飼養細胞(MEF)之層上，根據bFGF中之標準協定培養之BGO1V人類胚胎幹細胞；3)在RPMI培養基中藉由標準方法培養之T47D乳癌細胞；及4)重組型人類NM23-H1野生型，「wt」(A，B)。最下一列(C，D)展示「下拉(pull-down)」或免疫沈澱分析法之結果，其中細胞溶解物分別與添加有針對MUC1細胞質尾區之抗體的珠粒一起培育，「Ab-5」。藉由SDS-PAGE分離由結合於MUC1*肽採集之物質且用針對每一各別NM23蛋白質之抗體進行點漬。用NME6進行相同實驗，但資料未展示。
圖2A-2E展示西方墨點之照片，其中針對NME1、NME6或 NME7之存在來探測來自T47D乳癌細胞、BGO1V及HES-3人類ES細胞及人類SC101-A1 iPS細胞之細胞溶解物。所有細胞株中之NME1以約17KDa(A)之表觀分子量操作。在所有細胞株中，可在除HES-3細胞株(在FGF中培養)以外的所有細胞株中偵測到NME7之約33KDa物質及42KDa物質(C、E)。當使用超級信號增強觀測時，在除HES-3細胞株以外的所有細胞株中偵測到與NME6特異性抗體反應之物質。
圖3A-3C展示用於探測NME7之存在之人類胚胎幹(ES)細胞(A)及所誘導之多能幹(iPS)細胞(B、C)之西方墨點之照片的圖。西方墨點展示細胞溶解物中存在三種形式之NME7。一種具有約42KDa(全長)、約33KDa(不含N端DH結構域之NME7-AB結構域)及小型25KDa物質之表觀分子量。然而，改良性培養基(B)中僅存在低分子量物質。
圖4A-4C.(A)為NME7-AB之尺寸排阻層析純化之溶離概況；(B)為來自NME7-AB峰部分之非還原SDS-PAGE凝膠；(C)為經純化之NME7-AB之尺寸排阻層析之溶離概況。
圖5展示來自展示NME7-AB使MUC1*細胞外結構域肽二聚化的ELISA夾心分析法之HRP信號之圖。
圖6A-6G展示未經處理(A列)、經紫杉醇(B列)或抗NME7抗體(C-E列)處理之MUC1*陽性癌細胞之照片；展示回應於48小時(F)處理之細胞計數之圖，及用於評估癌細胞抑制實驗(G)中所使用之抗體濃度的點漬墨點。
圖7A-7K展示使用抗NME7抗體抑制癌細胞生長之實驗之48小時結果。在單獨的培養基(A)、紫杉醇(B)或抗NME7中以所指示 之濃度(C-J)培養之細胞之照片；展示使用鈣黃綠素AMassay獲得之細胞數目之圖(K)。
圖8A-8K展示使用抗NME7抗體抑制癌細胞生長之實驗之96小時結果。在單獨的培養基(A)、紫杉醇(B)或抗NME7中以所指示之濃度(C-J)培養之細胞之照片；展示使用鈣黃綠素AMassay獲得之細胞數目之圖(K)。圖式及照片展示抗NME7抗體在低至奈莫耳範圍內之濃度下抑制癌細胞生長。
圖9為西方墨點法之照片，其中針對NME7之存在探測幹細胞溶解物(奇數編號泳道)或細胞改良性培養基(偶數編號泳道)。iPS(經誘導之多能幹)細胞在MEF上之FGF(泳道1、2)、抗MUC1*抗體(C3)上之NM23-H1二聚體(泳道3、4)或抗MUC1*抗體(C3)表面上之NME7(泳道5-8)中培養。HES-3(人類胚胎幹)細胞在MEF上之FGF(泳道9、10)、抗MUC1*抗體(C3)表面上之NM23-H1二聚體(泳道11、12)或抗MUC1*抗體(C3)表面上之NME7(泳道13、14)中培養。亦探測小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)(泳道15、16)。西方墨點法展示細胞溶解物含有分子量為約42KDa之NME7物質，其對應於全長蛋白質。然而，所分泌之物質以約33KDa之表觀MW操作，其對應於不含N端前導子序列之NME7物質。
圖10A-10B展示使用小鼠單株抗體(A)或另一種僅識別N端DM10序列之單株抗體(B)針對NME7之存在進行探測之不同細胞溶解物及相應改良性培養基之西方墨點的照片。DM10特異性抗體與來自細胞之改良性培養基之樣品中之約33KDa NME7物質之結合不足表明所分泌之 NME7之形式不含大部分(若非全部)N端DM10前導子序列。
圖11為在傳統培養基或含有NME7之培養基中培養之後，T47D癌細胞之幹細胞標記物及癌症幹細胞標記物之基因表現之RT-PCR量測的圖，其中與保持黏著性之細胞分開地分析變成非黏著性之細胞(漂浮物)。
圖12為T47D癌細胞之幹細胞標記物SOX2及癌症幹細胞標記物CXCR4之基因表現之RT-PCR量測的圖。細胞在傳統培養基或含有NME1二聚體或NME7(NME7-AB)之培養基中培養。分開地分析之細胞類型為漂浮細胞、細胞加ρ激酶抑制劑(+Ri)，其使所有細胞黏著，或在不存在rho激酶抑制劑(-Ri)之情況下移除漂浮物之後保持黏著性之細胞。
圖13為DU145前列腺癌細胞之多種幹細胞及假設癌症幹細胞標記物之基因表現之RT-PCR量測的圖。細胞在傳統培養基或含有NME1二聚體(「NM23」)或NME7(NME7-AB)之培養基中培養。未使用Rho激酶抑制劑，因為在第2代時，細胞保持黏著性。
圖14A-14B為轉移性標記物及多能幹細胞標記物之RT-PCR量測之圖，該等標記物展示2i抑制劑(GSK3-β及MEK抑制劑)(A)(先前證實其使幹細胞恢復至原生度更高的狀態)或細菌NME(B)(其與人類NME1或人類NME7具有高序列同源性，亦將癌細胞轉型成轉移性更高的狀態)。
圖15為人類NME1與人類NME7-A或人類NME7-B結構域之間的序列比對。
圖16列舉人類NME7之免疫原性肽，其與NME1具有低序 列一致性且針對其產生用於治療或預防癌症之治療性抗NME7抗體之能力而經選擇。
圖17列舉來自人類NME7之免疫原性肽，其可對結構完整性或結合於MUC1*而言為重要的，其針對其產生用於治療或預防癌症之治療性抗NME7抗體之能力而經選擇。
圖18列舉人類NME1之免疫原性肽，其可對結構完整性或結合於MUC1*而言為重要的且針對其產生用於治療或預防癌症之治療性抗NME7抗體之能力而經選擇。
圖19列舉來自人類NME7之免疫原性肽，其針對其與NME1之低序列一致性及其與癌症中所涉及之細菌NME1蛋白質之同源性而經選擇。此等肽在其產生用於治療或預防癌症之治療性抗NME7抗體方面為較佳。此圖中展示之肽包括且添加有C端末端處共價結合之半胱胺酸。
圖20展示24隻中之兩隻雌性無胸腺nu/nu小鼠之相片，該等小鼠用僅50個人類乳癌細胞異種移植，該等乳癌細胞首先在NME7-AB中生長7天且展示顯著增加之CXCR4、CHD1及幹細胞標記物之表現。此外，亦每天向一半的小鼠注射人類重組型NME7-AB。82%的亦每天注射NME7-AB之小鼠在注射部位發展遠端癌轉移以及腫瘤。
圖21展示實驗之結果之表格，其中小鼠用癌細胞異種移植，該等癌細胞藉由在含有人類NME7-AB之培養基中預先培養而轉型成轉移性更高的狀態。
圖22A顯示在側腹中皮下植入50、100、1,000或10,000個細胞之四(4)組免疫缺陷nu/nu雌性小鼠之腫瘤體積量測值之圖，其中植 入之細胞為在重組型人類NME7-AB中培養七(7)天之人類MUC1陽性乳癌細胞，其中收集『漂浮物』且驗證過表現癌轉移受體CXCR4 100倍以上。各組中之一半小鼠每日注射人類重組型NME7-AB。圖內的編號係指小鼠追蹤編號。『M』表示具有多發性腫瘤之小鼠。
圖22B顯示在側腹中皮下植入50、100、1,000或10,000個細胞之四(4)組免疫缺陷nu/nu雌性小鼠之腫瘤體積量測值之圖，其中植入之細胞為在重組型人類NME7-AB中培養七(7)天之人類MUC1陽性乳癌細胞，其中收集『漂浮物』且驗證過表現癌轉移受體CXCR4 100倍以上。各組中之一半小鼠每日注射人類重組型NME7-AB。在接受NME7-AB之每日注射的小鼠中，80%產生多發性腫瘤。此圖展示相同小鼠中之多發性腫瘤之合併體積。圖內的編號係指小鼠追蹤編號。『M』表示具有多發性腫瘤之小鼠。
圖23展示經人類乳癌細胞異種移植之小鼠上之原發性腫瘤以及遠端凸塊之西方墨點，該等乳癌細胞藉由在含有人類NME7-AB之培養基中預先培養而轉型成轉移性更高的狀態。西方墨點展示遠端凸塊為人類乳房腫瘤，因為VU4H5抗體僅染色人類MUC1而非鼠類MUC1。
圖24展示經人類乳癌細胞異種移植之小鼠上原發性腫瘤之西方墨點，該等乳癌細胞藉由在含有人類NME7-AB之培養基中預先培養而轉型成轉移性更高的狀態。西方墨點展示可見凸塊為人類乳房腫瘤，因為VU4H5抗體僅染色人類MUC1而非鼠類MUC1。
圖25展示來自經人類乳癌細胞異種移植之小鼠收集之器官之西方墨點，該等乳癌細胞藉由在含有人類NME7-AB之培養基中預先培養 而轉型成轉移性更高的狀態。西方墨點展示一些看起來不具有遠端腫瘤之小鼠在其一些器官中具有人類MUC1陽性癌症。
圖26A-26B展示ELISA分析法之圖，其中NME7-AB(A)或NME1(B)吸附至板且測試由NME7肽A1、A2、B1、B2及B3產生之抗NME7抗體結合於NME7而非NME1之能力。C20為抗NME1抗體。
圖27展示ELISA分析法之圖，其中測試所產生之抗NME7抗體抑制NME7-AB與表面固定MUC1*肽之結合但不抑制NME1之結合的能力。
圖28展示癌細胞生長實驗之圖，其中乳癌細胞在存在或不存在NME7抗體或來源於NME7之短肽(其用於產生或選擇抗體)的情況下生長。此外，證實藉由用幾乎完整的NME7-AB肽、胺基酸100-376免疫接種而產生之抗體可抑制癌細胞生長。
圖29展示癌細胞生長實驗之圖，其中乳癌細胞在存在或不存在NME7抗體之組合或來源於NME7之短肽之組合(其用於產生或選擇抗體)的情況下生長。抗體以及其免疫型NME7-AB肽皆抑制癌細胞之生長。
圖30展示癌細胞在NME7-AB或2i抑制劑(其皆能夠將癌細胞轉型成轉移性更高的狀態)中及在存在或不存在NME7衍生肽a1、A2、B1、B2及B3情況下生長時科學觀測之表格。NME7-AB肽抑制黏著性癌細胞轉化成漂浮細胞，RT-PCR量測值證實轉移性標記物(尤其CXCR4)之表現增加。
圖31A-31C展示在NME7-AB或2i抑制劑(其中每一者將癌細胞轉型成轉移性更高的狀態)中生長之T47D乳癌細胞中之CXCR4表現 之RT-PCR量測值的圖，及抗NME7抗體對轉移性轉型作用(A)之抑制作用。在2i抑制劑中生長72小時或144小時之T47D乳癌細胞中CXCR4、CHD1及SOX2表現之RT-PCR量測值之圖表明NME7-AB免疫型肽本身對轉移性轉型作用具有抑制性。部分(A)中用於抑制性Combo 2及3之肽A1、A2及B1亦與肽相同地具有抑制性。肽B3之抑制性最高且為針對抗體61之免疫型肽，抗體61為部分(A)中所測試之抑制性最高的抗體。在部分(C)中，部分(B)之圖之Y軸之比例降低。
圖32展示用於圖31中CXCR4之RT-PCR量測之樣品中所記錄之RNA含量以及CXCR4表現及對照管家基因之臨限循環數目之表格。
圖33展示人類幹細胞及癌細胞面板中NME7-X1之表現之RT-PCR量測之圖。
圖34展示人類幹細胞及癌細胞面板中NME7、NME7a、NME7b及NME7-X1之表現之RT-PCR量測之圖。NME7a為全長NME7，NME7b缺少DM10結構域之一個小部分，NME7-X1缺少全部DM10結構域及第一NDPK A結構域之N端之一個小部分。條柱標記之NME7意謂使用可偵測NME7a及NME7b之引子。
圖35A-35C展示西方墨點之照片，其中使用藉由NME7衍生之短肽之免疫接種而產生之抗體探測不同癌細胞株中NME7物質之表現。
圖36A-36B展示西方墨點之照片，其中使用市售抗體探測不同癌細胞株中NME7物質之表現。
圖37A-37C展示與標準培養基相比，在含有NME7-AB之無血清培養基中培養之後，癌細胞中轉移性標記物之RT-PCR量測之圖。A) SK-OV3，轉移性標記物CXCR4、CDH1(亦稱為E-鈣黏素)、SOX2及NME7-X1之表現提高之MUC1陽性卵巢癌細胞株；B)OV-90，轉移性標記物CXCR4及NME7-X1之表現提高之MUC1陰性卵巢癌細胞株；C)MDA-MB，表現最小量之MUC1提高之轉移性標記物CDH1(亦稱為E-鈣黏素)及SOX2之表現的乳癌細胞株。
圖38A-38F展示西方墨點之照片及癌症生長圖。A)使用抗串聯重複抗體VU4H5探測不同癌細胞株中全長MUC1之表現。B)使用抗PSMGFR抗體探測不同癌細胞株中裂解形式MUC1*之表現。C)使用市售抗NME7抗體B9探測不同癌細胞株中NME7物質之表現，展示全長NME7以及33KDa及30KDa物質，與天然存在之NME7-AB樣物質以及NME7-X1一致。D)HER2陽性BT-474乳癌細胞表現極少至不表現MUC1或MUC1*，直至其獲得對化學療法藥物之抗性及轉移。藉由在次致死量之藥物中培養細胞使親本細胞對赫賽汀(Herceptin)、紫杉醇、多柔比星(Doxorubicin)及環磷醯胺(cyclophosphamide)具有抗性。部分(D)表明HER2之表現量未變化，但MUC1*之表現顯著增加。E)展示回應於在存在或不存在抗MUC1* Fab情況下用赫賽汀進行之處理，與抗藥性轉移性細胞相比，親本BT-474細胞之生長之圖。F)展示回應於在存在或不存在抗MUC1* Fab情況下用紫杉醇進行之處理，與抗藥性轉移性細胞相比，親本BT-474細胞之生長之圖。
圖39A-39E展示共免疫沈澱實驗之西方墨點之照片。T47D乳癌細胞提取物與針對MUC1細胞質尾區之抗體Ab-5或對照抗體IgG一起培育，且共免疫沈澱。凝膠用兩種不同市售抗NME7抗體B9(A)及CF7 (B)點漬。兩種凝膠皆展示約33KDa及約30KDa處之獨特NME7帶。剝離凝膠且用針對MUC1*之細胞外結構域之抗體抗PSMGFR(C)及(D)再次探測，其展示NME7物質及MUC1*相互作用。將重組型NME7-AB及重組型NME7-X1混合在一起且在凝膠上操作，接著用抗NME7抗體探測，表明乳癌細胞中天然存在且與MUC1*相互作用之兩種獨特NME7物質為NME7-AB樣物質及NME7-X1(E)。
圖40A-40C展示共免疫沈澱實驗之西方墨點之照片。人類經誘導之多能幹iPS7或胚胎幹HES3細胞提取物與針對MUC1細胞質尾區之抗體Ab-5或對照抗體IgG一起培育，且共免疫沈澱。凝膠用市售抗NME7抗體B9(A)點漬。兩種細胞類型皆展示約33KDa及約30KDa處之獨特NME7帶。剝離凝膠且用針對MUC1*之細胞外結構域之抗體抗PSMGFR(B)再次探測，其展示NME7物質及MUC1*相互作用。將重組型NME7-AB及重組型NME7-X1混合在一起且在凝膠上操作，接著用抗NME7抗體探測，表明乳癌細胞中天然存在且與MUC1*相互作用之兩種獨特NME7物質為NME7-AB樣物質及NME7-X1(C)。
定義
在本申請案中，「一(a/an)」用於指單個及複數個目標。
如本文所使用，「約」或「實質上」通常提供受限於準確數字之可允許的誤差。舉例而言，如在多肽序列之長度之情形中所使用，「約」或「實質上」指示多肽不限於所述數目之胺基酸。可包括自N端或C端添加或減去幾個胺基酸，只要功能活性(諸如其結合活性)存在即可。
如本文所使用，與一或多種其他治療劑「組合」投藥包括同時(並行)及以任何次序依序投藥。
如本文所使用，「胺基酸」係指所有天然存在之L-α-胺基酸。此定義意謂包括正白胺酸、鳥胺酸及高半胱胺酸。
如本文所使用，通常，術語「胺基酸序列變異體」係指與參考(例如原生序列)多肽相比，在其胺基酸序列中具有一些差異之分子。胺基酸變化可為原生胺基酸序列中之取代、插入、缺失或此類變化之任何所需組合。
取代型變異體為在原生序列中移除至少一個胺基酸殘基且在與該至少一個經移除之胺基酸殘基之位置相同的位置處插入不同胺基酸之變異體。取代可為單取代，其中分子中僅一個胺基酸經取代，或其可為多取代，其中同一個分子中兩個或兩個以上胺基酸經取代。
序列內之胺基酸之取代物可選自該胺基酸所屬類別之其他成員。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸。帶正電荷(鹼性)之胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶負電荷(酸性)之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。本發明之範疇內亦包括蛋白質或其展現相同或類似生物活性之片段或衍生物，及在轉譯期間或在轉譯之後經不同修飾(例如藉由糖基化、蛋白水解分裂、連接至抗體分子或其他細胞配位體等)之衍生物。
插入型變異體為在原生胺基酸序列中之特定位置處緊鄰一 個胺基酸插入一或多個胺基酸之變異體。緊鄰一個胺基酸意謂連接至胺基酸之α-羧基或α-胺基官能基。
缺失型變異體為在原生胺基酸序列中移除一或多個胺基酸之變異體。通常，缺失型變異體將在分子之特定區域中具有一個或兩個胺基酸缺失。
如本文所使用，「片段」或「功能衍生物」係指本發明之多肽之生物活性胺基酸序列變異體及片段，以及共價修飾，包括藉由與有機衍生劑反應獲得之衍生物、轉譯後修飾、具有非蛋白性聚合物之衍生物及免疫黏附素。
如本文所使用，「載劑」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所使用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒性。通常醫藥學上可接受之載劑為水性pH值緩衝溶液。醫藥學上可接受之載劑之實例包括(不限於)緩衝劑，諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEEN®、聚乙二醇(PEG)，及PLURONICS®。
如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑」包括任何及所有溶劑、分散培養基、塗佈型抗菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及其類似物。此類培養基及試劑用於醫藥學活性物質之用途在此項技術 中熟知。除非任何習知培養基或試劑與活性成分不相容，否則考慮將其用於治療性組成物中。補充活性成份亦可併入組成物中。
就投藥之簡便性及劑量之均一性而言，將非經腸組成物調配成單位劑型尤其有利。如本文所使用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於所治療之個體的實體上離散之單元；各單元含有與所需醫藥載劑結合，經計算以產生所需治療作用之預定量活性物質。本發明之單位劑型之說明由以下因素指定及直接決定：(a)活性物質之獨特特徵及所獲得之特定治療作用，及(b)在身體健康衰弱之具有患病病狀之活個體中混合此類用於治療疾病之活性物質之技術中的固有侷限性。
出於便利及有效投藥，將有效量之主要活性成分與適合的醫藥學上可接受之載劑以單位劑型形式複合。單位劑型可例如含有0.5μg至約2000mg範圍內之量的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物通常以每毫升載劑約0.5μg存在。在含有補充活性成分之組成物之情況下，參考常見劑量及該等成分之投藥方式決定劑量。
如本文所使用，「載體」、「多核苷酸載體」、「構築體」及「多核苷酸構築體」在本文中可互換使用。本發明之多核苷酸載體可呈若干形式中之任一種，包括(但不限於)RNA、DNA、經反轉錄病毒包衣包覆之RNA、經腺病毒包衣包覆之DNA、經另一種病毒或病毒樣形式(諸如單純疱疹)包覆之DNA，及腺結構，諸如聚醯胺。
如本文所使用，「宿主細胞」包括可為或已成為本發明之載體之受體的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單個宿主細胞之子代，且子代可歸因於天然、偶發或故意突變及/或變化而未必與初始親本細胞完 全一致(在形態或全部DNA補體方面)。
如本文所使用，「個體」為脊椎動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類。
如本文所使用，出於治療之目的，「哺乳動物」係指任何歸類為哺乳動物之動物，包括人類、家養及農業動物，及動物園、體育運動或寵物動物，諸如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬等。哺乳動物較佳為人類。
如本文中所使用，「治療」為用於獲得有益或所要臨床結果之方法。出於本發明之目的，有益或所需臨床結果包括(但不限於)症狀緩解、疾病程度減輕、疾病病況穩定(亦即不惡化)、疾病進展狀態延緩或減緩、疾病病況改善或減輕以及緩解(部分或完全)，該等結果為可偵測或不可偵測的。「治療」亦可意謂與在未接受治療之情況下的預計存活期相比延長存活期。「治療」係指治療性治療及預防性或防治性措施。需要治療者包括已患有病症者以及待預防病症者。「減輕」疾病意謂與不進行治療之情況相比，減少疾病病況之嚴重度及/或不合需要的臨床表現，及/或減緩或延長進展狀態之時程。
如本文所使用，「A1」肽、「A2」肽、「B1」肽、「B2」肽及「B3」肽係指結合於人類NME7-AB但不(或顯著較低)結合於人類NME1之肽。用於產生此等抗體之肽係與NME7-AB及NME7-X1共有，且闡述如下。
A1為NME7A肽1(A結構域)：MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO：141)
A2為NME7A肽2(A結構域)：SGVARTDASES(SEQ ID NO：142)
B1為NME7B肽1(B結構域)：DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO：143)
B2為NME7B肽2(B結構域)：EVYKGVVTEYHDMVTE(SEQ ID NO：144)
B3為NME7B肽3(B結構域)：AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO：145)
此外，為清楚起見，NME7A(具有大寫字母「A」)係指NME7之子單元A部分。NME7a(具有小寫字母「a」)係指在本申請案中其他地方描述之全長NME7。且，NME7B(具有大寫字母「B」)係指NME7之子單元B部分。NME7b(具有小寫字母「b」)係指部分不含DM10區域之NME7之物質，其在本申請案中其他地方描述。
如本文所使用，術語「抗體樣」意謂可經工程改造以使其含有抗體之部分但不為將天然地存在於自然界中之抗體之分子。實例包括(但不限於)CAR(嵌合抗原受體)T細胞技術及Ylanthia®技術。CAR技術使用與T細胞的一部分融合以使得身體之免疫系統經引導以攻擊特異性目標蛋白或細胞之抗體抗原決定基。Ylanthia®技術由作為合成人類fab之集合之「抗體樣」文庫組成，該等fab隨後經篩選以結合於來自目標蛋白質之肽抗原決定基。所選擇之Fab區域可隨後經工程改造為骨架或框架以使其類似於抗體。
如本文所用，「抑制NME家族成員蛋白質之試劑之有效量」係指阻礙NME家族成員蛋白質與其同源受體(諸如)之間的活化相互作用 之試劑的有效量。
如本文所使用，「NME衍生片段」係指肽序列，其為NME之片段或與作為NME之片段之肽序列高度同源。
如本文所用，「MUC1*」細胞外結構域主要藉由PSMGFR序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6))定義。由於MUC1裂解之精確位點取決於夾持其之酶，且裂解酶視細胞類型、組織類型或細胞演化時間而變化，因此MUC1*細胞外結構域之精確序列可在N端變化。
如本文所使用，術語「PSMGFR」為闡述為GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6))之MUC1生長因子受體之一級序列的縮寫字。在此方面，如「N-10 PSMGFR」、「N-15 PSMGFR」或「N-20 PSMGFR」中之「N-數目」係指已於PSMGFR之N端缺失之胺基酸殘基之數目。類似地，如「C-10 PSMGFR」、「C-15 PSMGFR」或「C-20 PSMGFR」中之「C-數目」係指已於PSMGFR之C端缺失之胺基酸殘基之數目。
如本文所使用，「MUC1*之細胞外結構域」係指不含串聯重複結構域之MUC1蛋白質之細胞外部分。在大多數情況下，MUC1*為一種裂解產物，其中MUC1*部分由不含串聯重複之短細胞外結構域、跨膜結構域及細胞質尾區組成。MUC1裂解之精確位置尚未知曉，可能由於其似乎可藉由一種以上的酶裂解。MUC1*之細胞外結構域將包括大部分PSMGFR序列，但可具有額外10-20個N端胺基酸。
如本文所使用，將「高同源性」視為在任何兩個多肽之間的 指示重疊區域中之至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%一致性。
如本文所使用，編號為1-10之「NME家族蛋白質」或「NME家族成員蛋白質」為由於其全部具有至少一個NDPK(核苷酸二磷酸激酶)結構域而分組在一起的蛋白質。在一些情況下，就能夠催化ATP轉化為ADP而言，NDPK結構域不為功能性的。NME蛋白先前被稱為NM23蛋白質，編號為H1及H2。最近，已鑑別多達十(10)個NME家族成員。在本文中，術語NM23及NME為可互換的。在本文中，術語NME1、NME2、NME5、NME6、NME7、NME8及NME9用於指原生蛋白質以及NME變異體。在一些情況下，此等變異體在大腸桿菌(E.coli)中更可溶、表現更佳或比原生序列蛋白質更可溶。舉例而言，用於本說明書中之NME7可意謂原生蛋白質或變異體，諸如NME7-AB，其由於變化允許在大腸桿菌中可溶、恰當摺疊之蛋白質之高產表現而具有優良商業適用性。NME7-AB主要由NME7 A及B結構域組成，但不含大部分DM10結構域(SEQ ID NO：39)，該結構域位於原生蛋白質之N端處。如本文中所提及之「NME1」可與「NM23-H1」互換。亦預期本發明不受限於NME蛋白質之精確序列。突變體NME1-S120G，亦稱為NM23-S120G，在整個本申請案中可互換使用。S120G突變體及該P96S突變體由於其對於二聚體形成之偏好而為較佳的，但可在本文中被稱為NM23二聚體、NME1二聚體或二聚NME1或二聚NM23。
如本文中所提及之NME7欲意謂具有約42KDa之分子量之原生NME7。
「NME7之家族」係指全長NME7以及天然存在之或人工創 造之裂解形式，其具有約30KDa、33KDa之分子量，或具有約25KDa之分子量之裂解形式，不含或部分不含DM10前導子序列(SEQ ID NO：162)之變異體，其為由SEQ ID NO：82或147表示之NME7之NME7胺基酸1-91，諸如NME7b、NME7-X1、NME7-AB或重組型NME7蛋白質，或其變異體，其序列可經改變以允許有效表現或增加產率、可溶性或其他特徵以使NME7更有效或在商業上更可行。「NME7之家族」亦可包括「NME7-AB樣蛋白質」，其為在癌細胞中表現之30至33KDa範圍內之蛋白質。
如本文所使用，「將幹細胞維持於未經處理狀態或將預致敏幹細胞恢復至未經處理狀態下之試劑」係指單獨或以組合形式將幹細胞維持於未經處理狀態之蛋白質、小分子或核酸，類似於胚胎之內細胞塊之細胞。實例包括(但不限於)與人類NME蛋白質，尤其NME1、NME7、NME7-X1、NME7-AB、NME6、2i(Silva J等人，2008；Hanna等人，2010)、5i(Theunissen TW等人，2014)具有高序列一致性之人類NME1二聚體、細菌、真菌、酵母、病毒或寄生NME蛋白質，抑制MBD3、CHD4(Rais Y1等人，2013)、BRD4或JMJD6(Liu W等人2013)之表現之核酸，諸如siRNA。
如本文所使用，「促進多能性之試劑」或「將體細胞恢復至幹樣或癌樣狀態」係指單獨或以組合形式誘發某些基因之表現或抑制其表現以使基因簽名轉移至更密切地類似於幹細胞或癌細胞之基因簽名之蛋白質、小分子或核酸。實例包括(但不限於)NME1二聚體；NME7；NME7-X1；NME7-AB；2i；5i；抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現之核酸，諸如siRNA；與人類NME1、NME2、NME5、NME6、NME7、NME8或NME9具有高序列同源性之微生物NME蛋白質，較佳具有容納NDPK域之區域。
如本文所使用，關於稱為「小分子」之試劑，其可為具有50Da與2000Da之間，更佳150Da與1000Da之間，更佳200Da與750Da之間的分子量之合成化學物質或基於化學之分子。
如本文所使用，關於稱為「天然產物」之試劑，其可為化學分子或生物分子，只要該分子在自然界中存在即可。
如本文所使用，FGF、FGF-2或bFGF係指纖維母細胞生長因子(Xu RH等人，2005；Xu C等人，2005)。
如本文所使用，「Rho相關激酶抑制劑」可為小分子、肽或蛋白質(Rath N等人，2012)。Rho激酶抑制劑在本文中及其他地方縮寫為ROCi或ROCKi或Ri。使用特定rho激酶抑制劑意欲為例示性的且可以任何其他rho激酶抑制劑取代。
如本文所使用，術語「癌症幹細胞」或「腫瘤引發細胞」係指表現已與轉移性更高之狀態或侵襲性更高之癌症有關之基因之含量的癌細胞。術語「癌症幹細胞」或「腫瘤引發細胞」亦可指當移植至動物中時，需要少得多的細胞以產生腫瘤之癌細胞。癌症幹細胞及腫瘤引發細胞通常對化學療法藥物具有抗性。
如本文所使用，術語「幹細胞/癌症」、「癌樣」、「幹樣」係指細胞獲得幹細胞或癌細胞之特徵、共用幹細胞、癌細胞或癌症幹細胞之基因表現概況之重要要素的狀態。幹樣細胞可為經歷誘導至較不成熟狀態(諸如增加多能性基因之表現)之體細胞。幹樣細胞亦指已經歷一些去分化或處於介穩定狀態下之細胞，該等細胞可自該狀態改變其最終分化。癌樣細胞可為尚未完全表徵但顯示癌細胞之形態及特徵，諸如能夠錨定非依 賴性生長或能夠於動物中產生腫瘤之癌細胞。
如本文所使用，可將不同長度之「間隔子」或「連接子」併入肽中之任何地方。間隔子連接通常經由醯胺鍵進行，但亦可經由其他官能基進行。
NME、NME7及NME7之蛋白質家族
本發明人發現NME7在早期人類幹細胞以及大部分癌細胞中大量表現(圖1、2、3、35、36、38、39及40以及實施例2、3及4)。此外，吾人證明與NM23-H1類似，NME7結合於幹細胞及癌細胞上之MUC1*生長因子受體且使其二聚化。圖15展示NME1及NME7 A及B結構域之序列比對。
本發明人最近發現NME7為NME1(NM23-H1)之原始形式，其表現於極早期胚胎幹細胞中。NME7在成年組織中完全不表現，或以極低含量表現。然而，本發明人發現NME7在癌細胞及組織中以高含量表現，且在轉移性癌細胞及組織中以甚至更高含量表現。NME7之裂解形式可為允許其結合於細胞外受體且使其活化之分泌形式。吾人偵測到全長NME7，MW 42KDa，以及NME7物質，其為約33KDa及30KDa。33KDa及30KDa物質係自癌細胞分泌。西方墨點在細胞溶解物中偵測到全長NME7，但在其條件培養基中偵測到較小的30-33KDa NME7物質(圖9及10)。用識別NME7之抗體或僅識別DM10結構域之抗體進行探測之西方墨點表明分泌至改良性培養基中之低分子量NME7物質不含DM10結構域(圖10)。此等資料符合天然存在之NME7物質與吾人產生之重組型NME7-AB類似之想法，因為其具有幾乎相同的分子量、皆為分泌型且皆不含DM10結構域之91個胺基 酸(其可保持蛋白質留存於細胞內)。
吾人發現新的NME7同功異構物NME7-X1，且亦發現其在癌症中過表現且尤其在前列腺癌中過表現(圖33、34)。NME7-X1，分子量為約30KDa，包含NME7胺基酸125-376，而吾人產生之重組型NME7-AB(分子量為約33KDa)跨越胺基酸92-376，因此包括更多的33個N端胺基酸。跨越胺基酸37-376且僅不含DM10結構域之37個胺基酸之NME7b亦在前列腺癌中過表現(圖34)。吾人產生人類重組型NME7-X1且證實其為癌細胞中之分泌型30KDa NME7物質，其僅低於天然存在之約33KDaNME7物質操作，該天然存在之約33KDa NME7物質似乎為天然存在之「NME7-AB樣」蛋白質，其為裂解產物或替代性同功異構物。
吾人測試癌細胞株之面板且發現其表現大量NME7及低分子量物質，該低分子量物質可為與NME7-AB類似的截斷物，諸如NME7-AB樣蛋白質，或替代性同功異型物，諸如NME7-X1。
儘管NM23-H1(亦稱為NME1)必須為二聚體，但NME7為具有兩個用於MUC1*細胞外結構域之結合位點的單體。吾人產生不含DM10結構域之重組型人類NME7，吾人將其稱為NME7-AB。圖4A-4C展示NME7-AB之尺寸排阻層析純化之溶離概況、來自NME7-AB波部分之非還原型SDS-PAGE凝膠及經純化之NME7-AB之尺寸排阻層析之溶離概況。夾心ELISA結合分析展示重組型NME7，即NME7-AB，同時結合於兩個PSMGFR肽，其中MUC1*之細胞外結構域包含大部分或所有PSMGFR序列(圖5，實施例6)。在奈米粒子結合分析中，亦證實NME7能夠結合於MUC1*細胞外結構域之PSMGFR部分且使其二聚化。
使NME7失能(阻斷其與其結合搭配物之相互相用或抑制其表現)之藥劑為強效抗癌療法。此類藥劑可為抗體、小分子或核酸。其可直接對NME7起作用、對調節NME7表現之分子起作用或對使NME7裂解成促進癌症形式之酶起作用。
吾人發現與NM23-H1二聚體相同，重組型NME7-AB單體完全能夠在不存在任何其他生長因子、細胞激素或血清之情況下支持多能人類幹細胞生長。競爭性抑制NME7與MUC1*細胞外結構域(實質上包含PSMGFR序列)之間的相互相用可誘導幹細胞分化，表明NME7與MUC1*之相互相用可促進幹細胞生長及抑制分化。
接著，吾人證實單獨的NME7-AB亦能夠充分支持人類癌細胞生長。當添加至常規癌細胞生長培養基中時，NME7-AB刺激癌細胞生長且尤其MUC1陽性及MUC1*陽性癌細胞之生長。抑制NME7與MUC1*之相互相用可抑制癌細胞生長。用抗MUC1*Fab阻斷MUC1*生長因子受體可有效抑制癌細胞生長。類似地，結合於NME7之抗體可抑制癌細胞生長。一個由抗NME7抗體抑制癌症生長之實例展示於圖6-8及實施例10中。在此情況下，藉由用NME7之跨越胺基酸100-376之部分使動物免疫來產生多株抗體。然而，吾人發現藉由用來自NME7-AB或NME7-X1之更短的肽進行免疫而產生的抗體亦抑制癌症生長。特定言之，其抑制MUC1及MUC1*陽性癌症之生長。
NME7引起癌症轉移
本發明人進一步發現在含有NME7-AB之基本培養基中培養癌細胞可誘導廣泛多種癌細胞變得轉型成轉移性更高的狀態。誘導誘導之 轉移性狀態之證據包括自黏著性細胞生長變成非黏著性細胞生長，亦稱為「漂浮物」細胞且伴隨特異性轉移性標記物之上調，該等標記物尤其在漂浮細胞中上調。此等在NME7-AB中培養之後上調之轉移性標記物包括(但不限於)CXCR4、CHD1(亦稱為E-鈣黏素)、CD44及多能幹細胞標記物，諸如OCT4、SOX2、NANOG及KLF2/4。當異種移植至測試動物中時，在NME7-AB中培養之癌細胞具有顯著較高移植率，其超過90%。此外，極少數植入之癌細胞在測試動物中形成腫瘤，其證實NME7-AB將其轉型成癌症幹細胞，亦稱為轉移性癌細胞。因為癌細胞產生NME7裂解產物或與NME7-AB實質上等效之替代性同功異構物，因此本文所述之方法不限於使用NME7-AB；其他NME7物質亦可起作用。舉例而言，吾人發現另一種NME7同功異構物NME7-X1由癌細胞表現。除了X1同功異構物在N端缺失33個胺基酸以外，其與吾人之重組型NME7-AB相同。預期NME7-X1與NME7-AB發揮相同功能。亦在癌細胞中偵測到「NME7-AB樣」蛋白質，其所約33Da物質。
吾人注意到，本發明人之先前工作證實單獨的NME7-AB能夠使人類幹細胞恢復至較早原生狀態。吾人發現在其他使幹細胞恢復至原生性更高之狀態之試劑存在下培養癌細胞可使癌細胞轉型成轉移性更高的狀態。吾人證明與人類NME1或人類NME7(圖14B)具有高序列同源性之NME7-AB(圖11及12)、「2i」抑制劑(圖14A)、人類NME1二聚體或細菌性NME1二聚體各自能夠使常規癌細胞轉型成轉移性癌細胞，其亦稱為癌症幹細胞「CSC」或腫瘤引發細胞「TIC」(圖11-14)。
2i為給予兩種生物化學抑制劑之名稱，研究人員發現該兩種 生物化學抑制劑使人類幹細胞恢復至原生性更高的狀態。2i為MEK及GSK3-β抑制劑PD0325901及CHIR99021，其分別以約1mM及3mM之最終濃度添加至培養基中。當添加至分開的批次之基本培養基中以使癌細胞轉型成轉移性細胞時，NME7-AB及NME7-X1為約4nM之最終濃度，但約1nM至16nM範圍內之較低及較高濃度亦可良好起作用。人類或細菌性NME1二聚體以4nM至32nM之最終濃度使用，此等實驗中典型地使用16nM，其中人類NME具有S120G突變。若使用野生型，則可能需要較低濃度。此等精確濃度不意欲為重要的。重要的是，NME1蛋白質為二聚體且此情況發生之濃度範圍為低奈莫耳範圍，但某些突變允許較高濃度保持為二聚體。類似地，NME7蛋白質之濃度可變化。NME7-AB及NME7-X1為單體且用於使癌細胞轉型成轉移性細胞之濃度應允許蛋白質保持為單體。
除NME7、NME7-AB、NME7-X1以及2i抑制劑MEKi及GSK3i以外，其他研究人員已證實其他試劑及抑制劑可引起幹細胞恢復至原生性更高的狀態。此等抑制劑「i」包括JNKi、p38i、PKCi、ROCKi、BMPi、BRAFi、SRCi以及生長因子activing及LIF(Gafni等人，2013；Chan等人，2013；Valamehr等人，2014；Ware等人，2014；Theunissen等人，2014)。此等試劑亦可用於使癌細胞發展成轉移性更高的狀態。使用任何單因子或使幹細胞恢復至原生性更高的狀態之抑制劑或生長因子之組合誘導轉型成轉移性更高之狀態的細胞可接著用作發現工具以鑑別或測試藥物治療或預防癌症轉移。
已提議將多種分子標記物作為轉移性癌細胞之指標。不同癌症類型可具有不同的上調分子。舉例而言，受體CXCR4在轉移性乳房癌中上調，而E-鈣黏素(亦稱為CHD1)在轉移性前列腺癌中上調得更多。除此 等特異性轉移標記物以外，多能性之典型標記物(諸如OCT4、SOX2、NANOG及KLF4)隨癌症變得轉移性而上調。藉由PCR分析起始癌細胞及隨後的轉移性癌細胞以量測此等基因之表現量。吾人證明此等癌細胞(在諸如NME7-AB之試劑中培養，該等試劑引起其轉型成轉移性更高的狀態，如由轉移性標記物及多能性幹細胞標記物之表現增加證明)充當轉移性癌細胞。
關於癌細胞群體是否為轉移性之功能性測試為在免疫缺陷小鼠中植入極少數(例如200個)細胞且觀察其是否發展成腫瘤。典型地需要5-6百萬個癌細胞以在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤。吾人證實僅極少的50個NME誘導之轉移性癌細胞便可在小鼠中形成腫瘤。此外，在整個測試期間向小鼠注射人類NME7-AB、NME1或NME7-X1發育之遠端癌轉移。
在一個特定實驗中，T47D人類乳癌細胞在標準RPMI培養基中培養14天，其中每48小時更換培養基且在約75%匯合時藉由胰蛋白酶消化來繼代。接著將細胞塗於6孔培養盤中且在補充有4nM NME7-AB之基本幹細胞培養基(參見實施例1)中培養。每48小時更換培養基。至約第4天時，一些細胞變得自表面分離且漂浮。小心地更換培養基以保留「漂浮物」，因為此等漂浮物為具有最高轉移性潛力之細胞，如由轉移性標記物之RT-PCR量測證明。在第7天或第8天，收集漂浮物且計數。保留樣品以用於RT-PCR量測。所量測之關鍵標記物為CXCR4，其在於NME7-AB中短暫培養之後上調40-200倍。
將新收集之漂浮物轉移性細胞異種移植至已植入90天緩慢釋放雌激素顆粒之雌性nu/nu無胸腺小鼠之側腹中。漂浮細胞各自以10,000、1,000、100或50個細胞異種移植。亦每天向各組(6隻)中之一半 小鼠在初始植入部位附近注射32nM NME7-AB。在無NME7-AB之RPMI培養基中培養之親本T47D細胞亦以6百萬、10,000或100個植入小鼠中作為對照。即使當僅植入僅少至50個細胞時，植入NME7誘導之漂浮細胞之小鼠發展腫瘤。植入漂浮細胞且每天接受NME7-AB注射之小鼠亦在不同器官中發展遠端腫瘤或遠端癌轉移(圖20-25)。在植入NME7-AB培養之癌細胞之後注射人類NME7-AB之12隻小鼠中的11隻(或92%)在注射部位處發展腫瘤。在植入之後未注射人類NME7-AB之12隻小鼠中的僅7隻(或58%)發展腫瘤。呈現腫瘤且注射人類NME7-AB之11隻小鼠中的9隻(或82%)發展遠離注射部位之多發性腫瘤。未注射NME7-AB之小鼠皆未發展多發性、可見腫瘤。
在處死之後，RT-PCR及西方墨點表明注射NME7-AB之小鼠上之遠端凸塊實際上為人類乳房腫瘤。其器官之類似分析表明除遠端凸塊以外，小鼠中植入之人類乳癌細胞之人類乳癌特徵隨機轉移至肝及肺。如所預期，僅植入6百萬個細胞之小鼠生長腫瘤。
吾人證明人類重組型NME7-AB在尺寸和序列方面與NME7-X1及30-33KDa NME7裂解產物類似。吾人證實NME7-AB促進癌生長且引起癌細胞加速成為常轉移性癌症幹細胞(CSC)狀態，亦稱為腫瘤引發細胞(TIC)。因此，吾人得出以下結論：移除DM10結構域之NME7-X1及NME7裂解產物亦促進癌生長且引起癌細胞加速成為常轉移性癌症幹細胞(CSC)狀態，亦稱為腫瘤引發細胞(TIC)。在一個實施例中，在無血清培養基中且在不存在任何其他生長因子或細胞激素之情況下將NME7-AB添加至癌細胞中。在7-10天內，癌細胞恢復至常轉移性CSC/TIC，如由分 子標記物(諸如CXCR4，其為轉移性癌細胞之指標)之表現增加超過100倍證明。在一個實施例中，T47D乳癌細胞在標準RPMI培養基或基本幹細胞培養基(實施例1)中培養，該培養基添加有重組型NME7-AB達到16nM之最終濃度。在10天之後，收集細胞且藉由RT-PCR分析CSC之分子標記物之表現，其升高10-200倍(圖11，12)。此為如何將一種癌細胞類型轉型成轉移性更高的狀態之特定、具體實例。本發明不意欲受此等細節限制，因為存在一系列以此方式轉型之癌細胞、一系列使幹細胞恢復至原生性更高的狀態且亦使癌細胞發展至轉移性更高的狀態之試劑及一系列使所添加之試劑轉型癌細胞之濃度。其他類型之癌細胞需要在NME7-AB中較長之培養期以實現轉移性標記物之顯著上調及自極少數植入之癌細胞形成腫瘤之能力。舉例而言，在NME7-AB、2i、人類NME1或與人類NME1或人類NME7具有高同源性之細菌性NME1中培養之前列腺癌細胞在2-3次繼代之後展示轉移性標記物之顯著增加。
轉移標記CXCR4在轉移性乳癌細胞中尤其升高，而CHD1在轉移性前列腺癌中尤其升高。此處吾人證實在癌細胞轉型成轉移性更高之細胞時，多能幹細胞標記物(諸如OCT4、SOX2、NANOG、KLF2/4及TBX3)亦上調。
類似地培養DU145前列腺癌細胞且此等在NME7-AB中培養之細胞亦展示CSC標記物之表現的顯著增加(圖13)。在前列腺癌細胞中，CHD1(亦稱為E-鈣黏素)及CXCR4與對照癌細胞(其未在NME7-AB中生長)以及其他多能幹細胞標記物相比上調。亦在NME7-AB中培養卵巢癌細胞、胰臟癌細胞及黑素瘤細胞且僅在培養物中3天之後便轉型成轉移性更 高的狀態。圖37A-C展示卵巢癌細胞株SK-OV3、OV-90及乳癌細胞株MDA-MB皆自黏著性轉變成非黏著性細胞且在與NME7-AB一起處於培養物中72或144小時之後提高轉移性標記物之表現。
此處吾人證實NME7-AB使許多癌細胞轉化成轉移性更高的狀態。吾人亦證實癌細胞表現與重組型NME7-AB 33KDa之分子量大致相同的天然存在之物質(圖33-36及圖38)且亦不含DM10結構域(圖10)樣NME7-AB且亦表現替代性同功異構物NME7-X1 30KDa，NME7-X1 30KDa除自N端缺失33個胺基酸以外為與NME7-AB相同的序列。對T47D乳癌細胞進行共免疫沈澱實驗，其中細胞提取物與針對MUC1細胞質尾區、Ab-5或對照抗體IgG一起培育且共免疫沈澱。藉由凝膠電泳分離免疫沈澱物質。用兩種不同市售抗NME7抗體點漬凝膠。兩種凝膠在約33KDa及約30KDa處皆展示獨特NME7帶(圖39A、39 B)。剝離凝膠且用針對MUC1*之細胞外結構域之抗體抗PSMGFR(圖39C、39D)再次探測，其展示NME7物質及MUC1*相互作用。將吾人製備之重組型NME7-AB及重組型NME7-X1混合在一起且在凝膠上操作，接著用抗NME7抗體探測，表明乳癌細胞中天然存在且與MUC1*相互作用之兩種獨特NME7物質為NME7-AB樣物質及NME7-X1(圖39E)。在人類幹細胞中進行類似實驗。圖40A-C展示共免疫沈澱實驗之西方墨點之照片。人類經誘導之多能幹iPS7或胚胎幹HES3細胞提取物與針對MUC1細胞質尾區之抗體Ab-5或對照抗體IgG一起培育，且共免疫沈澱。凝膠用市售抗NME7抗體B9(A)點漬。兩種細胞類型在約33KDa及約30KDa處皆展示獨特NME7帶。剝離凝膠且用針對MUC1*之細胞外域之抗體抗PSMGFR(B)再次探測，其展示NME7物質及 MUC1*相互作用。將吾人製備之重組型NME7-AB及重組型NME7-X1混合在一起且在凝膠上操作，接著用抗NME7抗體探測，表明乳癌細胞中天然存在且與MUC1*相互作用之兩種獨特NME7物質為NME7-AB樣物質及NME7-X1(C)。因為NME7-AB為重組型蛋白質，吾人不知曉天然存在之物質與重組型NME7-AB相比是否可含有附加的1-15個額外胺基酸或不含1-15個額外胺基酸，但以相同表觀分子量操作。關於「NME7-AB樣」，吾人意謂以約33KDa之表觀分子量操作之NME7物質，其能夠以與重組型NME7-AB相同的方式發揮功能，在於其能夠刺激癌細胞生長、誘導癌細胞轉化成轉移性更高的狀態及能夠完全支持人類幹細胞之多能生長。
吾人得出以下結論：表現NME7及低分子量NME7物質之癌細胞株及癌細胞群體含有一些CSC癌細胞或轉移性癌細胞。藉由在NME7-AB、NME7-X1或較低分子量NME7物質中培養細胞，此等癌症可變得轉移性更高或增加轉移性細胞之群體。圖35展示癌細胞之板之西方墨點，該等癌細胞皆表現NME7以及低分子量物質NME7-AB樣(33KDa)及NME7-X1(30KDa)。圖38展示癌細胞株T47D乳癌、PC3及DU145前列腺癌、BT-474乳癌、CHL-1及A2058黑素瘤細胞株以及CAPAN-2及PANC-1胰腺細胞株皆表現MUC1、MUC1*及NME7-AB樣物質及NME7-X1。在圖38A中，BT0474細胞似乎不表現MUC1或MUC1*，然而，吾人先前證實(Fessler等人2009)當此等HER2陽性乳癌細胞變得對化學療法藥物具有抗性(亦即轉移性)時，其藉由增加MUC1*之表現來表現MUC1或MUC1*(圖38D)。用抗MUC1* Fab阻斷MUC1*受體可逆轉其對赫賽汀(圖38E)、紫杉醇(圖38F)以及其他化學藥劑之抗性。藉由在NME7-AB、NME7-X1 或低分子量NME7物質中培養細胞，表現NME7及低分子量NME7物質(諸如33KDa、30KDa)之此等癌症類型及其他癌症類型可變得轉移性更高或增加轉移性細胞之群體。
相反，可藉由用抗NME7抗體處理細胞來逆轉此等及其他表現NME7及低分子量NME7物質(諸如33KDa或30KDa)之癌症類型的轉移可能性。投予患者抗NME7抗體或結合於NME7-AB或NME7-X1之抗體以用於治療或預防癌症，包括乳房、前列腺、卵巢、胰腺及肝癌症。因為吾人證實NME7-AB藉由結合於MUC1*生長因子受體且使其活化來發揮其致瘤作用，因此抗NME7抗體將有效針對任何MUC1*陽性癌症，包括(但不限於)乳房、肺、肝、胰腺、胃、結腸直腸、前列腺、大腦、黑素瘤、腎臟等。投予患者抗NME7、抗NME7-AB或抗NME7-X1抗體以用於治療或預防NME7-AB、NME7-AB樣或NME7-X1陽性或MUC1*陽性之癌症。
關於有效療法測試患者癌細胞
NME7-AB、NME7-X1以及2i及其他使幹細胞恢復至原生性更高的狀態之試劑亦誘導癌細胞轉型成轉移性更高的狀態。在用此等試劑中之任一者或其組合處理之後，癌細胞具有較高移植率且引起在測試動物中形成腫瘤所需的細胞降低高達100,000倍。因此，本發明中描述之方法可用於使患者之原發性腫瘤細胞能夠移植至測試動物中。
接著可在受體動物上測試候選治療劑。以此方式鑑別之有效治療劑可用於治療供體患者或其他患有類似癌症之患者。在一個具體實例中，鑑別用於特定患者或特定類型之癌症之有效療法的方法包含以下步驟：1)自細胞株、患者或將接受測試治療劑投藥之患者獲得癌細胞；2) 在NME7-AB、NME7-X1、人類NME1、與人類NME1或NME7高度同源之細菌性NME1、2i或其他展示使幹細胞恢復至原生性更高的狀態之試劑中培養癌細胞；3)將所得癌細胞植入測試動物中，亦可向該測試動物投予人類NME7-AB、NME7-X、人類NME1、與人類NME1或NME7高度同源之細菌性NME1、2i或其他展示使幹細胞恢復至原生性更高的狀態之試劑，或針對人類NME7-AB或NME7-X1為轉殖基因性之動物；4)投予動物候選抗癌治療劑；5)評估治療劑之功效；及6)投予供體患者或另一名患有類似癌症之患者有效治療劑。
抗NME7抗體
抗NME7抗體為強效抗癌劑。NME7為促進癌細胞生長且亦促進其發展成轉移性更高的狀態或侵襲性更高的狀態之生長因子。已證實NME7及NME7之截短形式(其為約33KDa或30KDa)即使在不含任何其他生長因子或細胞激素之無血清培養基中亦完全支持癌症生長。在下拉分析、ELISA及奈米粒子結合實驗中，吾人證實生長因子受體MUC1*為NME7及NME7-AB之結合搭配物。藉由消除所有其他生長因子或細胞激素來促進此相互相用可提高癌症幹細胞標記物之表現。即使在血清存在下使用特異性結合於NME7之多株抗體阻斷此相互相用亦可有效地殺死癌細胞。因此，抗NME7或抗NME7-AB抗體為可投予患者以用於治療或預防癌症之強效抗癌劑。超過75%的所有癌症為MUC1*陽性。MUC1*為MUC1之跨膜裂解產物，其中大部分細胞外結構域已脫落，留下細胞外結構域之含有大部分PSMGFR序列且可含有位於PSMGFR序列之邊界之N端的9-20個額外胺基酸的部分。
本發明之一個態樣為治療或預防個體之癌症的方法，其包含投予個體有效量之抗NME7抗體。在一個實施例中，抗NME7抗體能夠結合於NME7-AB。在另一實施例中，抗NME7抗體能夠結合於NME7-X1。在另一實施例中，投予患者之抗NME7抗體可抑制或阻止NME7結合於其可促進癌症之目標。在一種情況下，目標為裂解MUC1之細胞外結構域。更特定言之，促進癌症之NME7目標為MUC1*細胞外結構域之PSMGFR區域。在一個態樣中，有效治療劑為干擾或阻止NME7物質與MUC1*細胞外結構域之間的相互相用的治療劑，其主要由MUC1*之PSMGFR部分或PSMGFR肽組成。用於治療或預防癌症之藥劑直接或間接抑制NME7、NME7-AB樣裂解產物或替代性同功異構物(包括NME7-X1)之表現或功能的藥劑。在一種情況下，有效抗癌治療劑為結合於NME7物質或使其致瘤活性失活的治療劑。用於治療或預防癌症之有效治療劑為結合於NME7、NME7-AB樣裂解產物或替代性同功異構物或NME7-X1或使其失活的藥劑。在一個態樣中，結合於NME7物質的治療劑為抗體。抗體可為多株、單株、雙特異性、二價、單價、單鏈、scFv或抗體模擬物，其可為動物來源、人類-動物嵌合體、人類化抗體或人類抗體。抗體可藉由用NME7物質或其片段接種或免疫接種而產生，或例如自抗體之文庫或集合體針對其結合於NME7物質(包括NME7、NME7-AB樣裂解產物或替代性同功異構物，包括NME7-X1)之能力選擇。
產生抗NME7抗體
可在患者體外(諸如在宿主動物中)或在患者中產生抗NME7抗體。抗體可藉由NME7或NME7片段之免疫接種產生，或自抗體 (其可為天然、合成、完全或抗體片段)之文庫或集合體基於其結合於所需NME7物質(諸如NME7-AB或NME7-X1)之能力選擇。在一個態樣中，抗體係由選自圖16-19中列舉之肽的肽之免疫接種產生，或針對其結合於該肽之能力選擇。在另一態樣中，由序列不與人類NME1之序列相同的肽產生抗體，或針對其結合於NME7物質之能力及其不能結合於人類NME1來選擇抗體。
一種用於鑑別產生可抑制癌症生長及抑制轉化成轉移之抗體的NME7或NME7-X1衍生肽或本身具有抑制性之肽的方法如下：1)將人類NME1、人類NME7、人類NME7-X1及若干與人類NME1或人類NME7具有高序列同源性之細菌或真菌性NME蛋白質之蛋白質序列比對；2)鑑別所有NME中之高序列同源性之區域；3)鑑別NME7或NME7-X1所獨有但側接高序列同源性之區域的肽序列。接著合成肽且用於在人類或宿主動物中產生抗體。測試所得抗體抑制癌症生長或抑制轉化成轉移性癌細胞之能力。
使用抗NME7抗體治療癌症
選擇此等抑制癌症生長或轉化成轉移性更高的狀態之抗體用作抗癌療法且可投予患者以用於治療或預防癌症。所選擇之抗體可進一步經優化，例如藉由工程改造或製備人類嵌合抗體或完全人類抗體。為了說明此方法之功效，吾人自疑似對NME7之癌性功能至關重要的區域選擇NME7肽。接著，吾人使用此等肽產生抗體且接著測試所得抗體以及免疫肽之以下能力：a)抑制癌生長；及b)抑制癌細胞經誘導轉化成轉移性癌細胞。選擇NME7肽作為免疫劑用於抗體產生且本身作為抑制性藥劑(圖19 及實施例11)。肽A1(SEQ ID NO：141)、A2(SEQ ID NO：142)、B1(SEQ ID NO：143)、B2(SEQ ID NO：144)及B3(SEQ ID NO：145)，其中A係指衍生肽之結構域，亦即NDPK A結構域，且B表示肽來源於NDPK B結構域(圖15)。各肽用作免疫原且注射至2隻各自用於製備多株抗體之兔子中。在用免疫肽衍生之管柱上純化自經免疫之兔子之血液收集之抗體。接著測試經純化之抗體結合於人類NME7之能力。所有所得抗體視需要結合於人類NME7但不結合於人類NME1(圖26A-B，實施例12)。此等結果表明藉由選擇序列可在NME7中發現但不與NME1精確相同的肽，產生特異性結合於NME7但不結合於NME1的抗體。因為NME1具有健康功能，在大多數情況下需要產生不干擾NME1之抗體。亦測試抗體抑制NME7與MUC1*細胞外結構域肽之結合的能力。圖27中展示之ELISA實驗表明與抗體抑制NME1之結合相比，其顯著更大程度地抑制NME7-AB與MUC1*細胞外結構域肽之結合。
此僅為選擇產生可抑制NME7及NME7物質之癌性功能之抗體的肽的一個實例。與人類NME1或NME7具有高序列同源性之人類NME1、人類NME7、人類NME7-X1及細菌性NME蛋白質中之序列比對發現五個同源區域。肽A1、A2、B1、B2及B3皆產生可抑制癌症生長之抗體或其轉化成轉移性狀態之事實意謂衍生此等肽之五個區域為NME7中對其促進癌症之功能而言為重要的區域。其他來自此等區域之肽亦將產生將抑制癌症生長及轉移之抗NME7抗體且因此為強效抗癌療法。已證實由肽A1、A2、B1、B2及B3產生之抗體可抑制癌症生長且抑制轉化成轉移性更高的狀態。藉由相同或類似肽之免疫接種產生之單株抗體且隨後單株抗體 之測試將鑑別在人類化或熟習此項技術者已知之其他工程改造之後將投予患者以用於治療或預防癌症之抗體。
在特定實驗中，向培養物中之癌細胞中添加由肽A1、A2、B1、B2、及B3之免疫接種產生之抗體以及免疫型肽本身以觀測添加抗體或免疫型肽是否將抑制癌細胞生長。在低濃度及單獨添加情況下，抗體以及免疫型肽抑制癌細胞生長(關於一個實施例，參見圖28)。然而，當以較高濃度或組合添加時，抗體以及免疫型肽強效抑制癌細胞生長(圖29)。免疫型肽A1、A2、B1、B2及B3之相應人類NME7胺基酸編號分別為來自具有SEQ ID NO：82或147之人類全長NME7之127-142、181-191、263-282、287-301、343-371。
為清楚起見，當論述NME7之殘基編號時，其係指如SEQ ID NO：82或147中所闡述之NME7之殘基編號。
藉由用對應於NME7(SEQ ID NO：82或147)之胺基酸100-376之NME7肽進行免疫來產生圖6-8中所展示之用於癌症生長抑制實驗之抗體及圖28中所展示之抗體中之一者。為了產生較高親和力及特異性抗NME7抗體，遵循以下步驟：用含有人類NME7胺基酸100-376之肽使動物免疫，接著：1)排除結合於人類NME1之抗體；2)選擇可抑制NME7-AB、2i或其他誘導癌細胞轉化成轉移性更高的狀態之NME的抗體；3)選擇可抑制癌細胞生長之抗體；4)選擇可抑制MUC1*陽性癌細胞生長之抗體；5)選擇可抑制NME7-AB或NME7-X1與MUC1*細胞外結構域之結合、實質上抑制結合於PSMGFR肽之抗體；及/或6)選擇可結合於圖19中列舉之肽中之一或多者(A1、A2、B1、B2或B3肽)之抗體。
較高親和力單株抗體或由較長的肽產生之單株抗體可為更有效的抗體療法。或者，投予患者抗NME7、抗NME7-AB或抗NME7-X1抗體之組合以增加功效。
抗NME7抗體抑制癌細胞轉化成轉移性癌細胞
抗NME7抗體抑制癌細胞轉化成轉移性癌細胞(亦稱為癌症幹細胞(CSC)或腫瘤引發細胞(TIC))。前已述及，吾人證明在NME7-AB存在下培養廣泛多種癌細胞可引起其自常規癌細胞轉化成轉移性CSC或TIC。因此，結合於NME7、NME7-AB或NME7-X1之抗體將抑制癌細胞發展成轉移性更高的狀態。
癌細胞當在使幹細胞恢復至原生性更高的狀態之試劑存在下培養時轉型成轉移性更高的狀態。吾人證明在NME7-AB、人類NME1二聚體、細菌性NME1二聚體或MEK及GSK3-β抑制劑(稱為「2i」)中培養癌細胞可引起細胞變得轉移性更高。隨著細胞轉化成轉移性更高的狀態，其變得非黏著性或黏著性較低且自培養盤浮起。與黏著性細胞分開地收集此等漂浮細胞「漂浮物」且證實：a)表現顯著較高量之轉移性基因；及b)以極低複本數異種移植至小鼠中時產生腫瘤。特異性轉移性標記物(諸如乳癌之CXCR4、前列腺癌之CHD1及其他多能幹細胞標記物，諸如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4及其他標記物)之RT-PCR量測在於NME7-AB中培養之癌細胞中顯著過表現且大部分在變成非黏著性(本文及圖式中稱為「漂浮物」)之細胞中過表現。
在一個實施例中，將由NME7衍生肽A1、A2、B1、B2及B3之免疫接種產生之NME7-AB特異性抗體以及免疫型肽本身與NME7-AB 或2i一起添加至培養基中以測定其是否抑制常規癌細胞轉型成轉移性癌症幹細胞。抗體及肽分別與引起轉移性轉型作用之試劑一起添加；在此情況下，NME7-AB或2i抑制劑PD0325901及CHIR99021。分別使用NME7-AB及2i誘導癌細胞轉型成侵襲性轉移性更高的狀態。使用2i，由此可無需爭論添加至培養基中之抗體僅吸收所有NME7-AB，使得此處不存在有效病原體(實施例14)。
隨著實驗進行，由兩位科學家獨立地記錄目視觀測結果(圖30)。最驚人的觀測結果為抗體及肽顯著降低細胞數目，其為抗體及肽抑制轉型成轉移性癌細胞之第一指示。特定言之，由B3肽之免疫接種產生之抗體所針對之細胞幾乎不產生任何漂浮細胞。自漂浮細胞、黏附細胞及對照癌細胞提取mRNA。量測mRNA之量，其指示細胞活力及生長。經抗體處理之細胞具有顯著較少mRNA，表明較少的活分裂細胞(圖32)，其證實抗NME7-AB抗體抑制癌細胞生長以及其轉化成轉移性更高的狀態。使用RT-PCR量測轉移性標記物(包括CXCR4)之表現量。用抗NME7抗體處理可顯著降低轉移性標記物(諸如CXCR4)之量，表明抗NME7抗體或肽抑制轉化成轉移性癌症(圖31A-C)。此等結果表明可投予患者結合於NME7-AB之抗體以用於治療或預防轉移性癌症。
來源於NME7-AB或NME7-X1之肽競爭性抑制完整NME7-AB及NME7-X1之結合且為抗癌劑
在本發明之另一態樣中，用於治療或預防癌症之治療劑為來源於NME7序列之肽，將其投予患者以用於治療或預防癌症。在一個態樣中，投予患者NME7衍生肽使得肽(其應比完整NME7更短且不能賦予NME7 之致癌活性)結合於NME7之目標且競爭性抑制完整NME7與其目標之相互相用，其中此類相互作用促進癌症。因為NME7-AB完全能夠賦予致癌活性，NME7-AB之序列較佳作為較短肽之來源，其中必須確認肽本身不能促進癌生長或其他致瘤或致癌活性。在較佳具體實例中，投予患者一或多種具有NME7-AB之部分之序列且較佳長度為約12-56個胺基酸之肽。為了增加半衰期，肽可肽模擬物，諸如具有非天然主鏈或L之D-形式胺基酸之肽。在另一種情況中，抗癌治療劑為肽或肽模擬物，其中肽具有與NME7、NME7-AB或NME7-X1或其目標MUC1*細胞外結構域之至少一部分高度同源之序列，包含PSMGFR肽，在一些情況下在本文中亦稱為「FLR」。
圖16-19提供較佳胺基酸序列之清單，預測其可抑制NME7結合於其同源目標。在更佳具體實例中，經選擇用於投予患有癌症或具有發展癌症之風險的患者之肽係因為其結合於NME7結合搭配物且其本身不賦予致瘤活性而被選擇。在更佳具體實例中，NME7結合搭配物為MUC1*之細胞外結構域。在更佳具體實例中，NME7結合搭配物為PSMGFR肽。
術語「賦予致瘤活性或致癌活性」意謂肽本身無法支持或促進癌症生長。另一種測試來源於NME7之肽是否可促進腫瘤發生之方式為測試肽是否可支持人類幹細胞之多能生長。支持多能人類幹細胞生長之NME蛋白質及肽亦支持癌症生長。在另一種方法中，若肽可引起體細胞恢復至成熟性較低的狀態，則將其排除。
NME7-AB之片段抑制癌細胞生長及癌細胞轉化成轉移性更高的狀態。作為說明，單獨(圖28)或以組合(圖29)添加之NME7肽A1、A2、B1、B2及B3抑制癌細胞生長。此外，NME7肽A1、A2、B1、B2及 B3抑制癌細胞轉化成轉移性更高的狀態(圖31B-C)。
因此，由用對NME7具有特異性及對NME7-AB或NME7-X1具有特異性之肽進行免疫而產生之抗體將阻斷NME7物質之癌性作用且將為強效抗癌劑。類似地，此等結果表明對NME7具有特異性及對NME7-AB或NME7-X1具有特異性之肽將阻斷NME7物質之癌性作用。在本發明之一個態樣中，肽係選自圖16中所展示之清單。在本發明之一個態樣中，肽係選自圖17中所展示之清單。在本發明之一個態樣中，肽係選自圖18中所展示之清單。在本發明之另一態樣中，肽係選自圖19中所展示之清單。
用於治療或預防癌症之抗NME7抗體可由熟習此項技術者已知之標準方法產生，其中此等用於產生可識別NME7、NME7-AB或NME7-AB之較短形式(其中形成N端之額外10-25個胺基酸不存在)之抗體或抗體樣分子。
在本發明之另一態樣中，小分子為針對其抑制NME7、NME7-AB或NME7-X1之致瘤作用的能力而選擇之抗癌劑。舉例而言，高輸貫量篩檢可標識將治療癌症之小分子。在多孔板中，將小分子單獨添加至其中癌細胞在含有NME7-AB之培養基中培養之孔中。若小分子降低變成漂浮物之細胞之量及/或降低轉移性標記物(諸如CXCR4、CHD1或多能幹細胞標記物)之表現，則小分子為候選抗癌藥物。另一種鑑別可作為抗癌劑之小分子之方法為選擇可結合於NME7、NME7-AB或NME7-X1或抑制NME7物質之表現的小分子。另一種高輸貫量篩檢為選擇可抑制NME7-AB與MUC1*細胞外結構域之PSMGFR肽之結合的小分子且此等小分子將為抗癌劑。
NME7-AB與NME7 X1之序列之不同之處僅在於NME7-X1缺失NME7-AB所具有的一些N端序列。實驗表明存在與NME7-AB幾乎相同之天然存在之NME7物質，吾人將其稱為NME-AB樣物質。結合於NME7-X1之抗體亦可結合於模擬NME7-AB之天然存在之物質，除非存在抗體可區分之構形差異。因此，若需要抑制NME7-X1但非NME7-AB樣物質或反之亦然，則可使用siRNA、反義核酸或基因編輯技術抑制一者但非另一者之表現。
在一種情況下，抗癌治療劑為直接或間接抑制NME7、NME7-X1或NME7-AB樣物質之特異性表現的核酸。此類核酸可為siRNA、RNAi、反義核酸及其類似物，其直接抑制NME7物質。在本發明之另一態樣中，核酸可間接抑制NME7物質，例如藉由改變調節其之分子之表現。舉例而言，超級強化子BRD4抑制NME7之表現。因此，用於治療或預防癌症之有效治療劑為增加BRD4之表現之藥劑。有效治療劑可為增加BRD4之輔因子JMJD6之表現的藥劑。
來源於NME7-AB或NME7-X1之肽或整個蛋白質用於在動物中產生抗NME7或抗NME7-X1抗體，吾人已表明該等抗體抑制癌症生長及抑制癌細胞轉化成轉移性癌細胞。類似地，可投予人類NME7衍生肽使得其產生可治療或預防癌症或抑制癌細胞轉化成轉移性癌細胞之抗體。以疫苗類型投予個人NME7肽或蛋白質以刺激受體中抗NME7、抗NME7-AB或抗NME7-X1抗體之產生。圖28及29中所展示之結果表明用來源於NME7(尤其NME7-X1或NME7-AB序列中)之肽之集合使個體免疫可為比用單一肽進行免疫更有效的疫苗。該等肽或蛋白質可進一步與載體蛋白質或熟 習此項技術者已知可輔助刺激免疫反應之其他佐劑共軛。
位於DM10結構域外部之NME7肽在產生用於治療或預防癌症之抗體方面為較佳的。可投予患者用於預防癌症或轉移之肽含有圖16-19中列舉之肽之序列。A1、A2、B1、B2及B3為產生可結合於NME7-AB及NME7-X1之抗體之肽之實例且被投予患者用於治療或預防癌症。本發明不限於如在NME7或NME7-X1中天然存在之精確序列之肽。如熟習此項技術者已知，肽序列之若干胺基酸之取代仍可產生特異性識別天然蛋白質序列之抗體。本發明不意欲限於本文中說明可抑制癌症生長或抑制常規癌細胞轉化成轉移性癌細胞之肽。本文中用於鑑別肽A1、A2、B1、B2及B3之方法亦可用於鑑別與本文中說明之肽相比同樣有效或更有效之其他肽序列。
包含人類NME7-AB或NME7-X1之部分或包含可結合於NME7-AB或NME7-X1之抗體片段的嵌合抗原受體分子為抗癌療法且被投予患者以用於治療或預防癌症
在一個實施例中，使用稱為CAR(嵌合抗原受體)技術或CAR T技術之技術使抗NME7抗體之識別單元或可變區與T細胞之分子融合。治療學上可用於治療或預防癌症之抗體或其片段之顯著特徵為鑑別可識別NME7且預防其與促進癌症之目標之相互相用的抗體樣可變區。在一種情況下，該目標為MUC1*之PSMGFR區域。
抗體、抗體片段或單鏈抗體可工程改造成嵌合分子，包括嵌合抗原受體，亦稱為CAR，該等分子接著經轉染或轉導成免疫系統細胞，諸如T細胞，且投予患者。人類化抗體或抗體片段(典型地，scFv)包含CAR之大部分細胞外結構域。抗體片段以生物化學方式與免疫系統信號傳 導分子融合，諸如作為跨膜結構域之CD8及細胞質信號傳導基元，諸如T細胞受體信號傳導分子，亦稱為活化結構域，或共刺激結構域，包括(但不限於)CD3-ξ、CD28、41bb、OX40。汽可經轉染成T細胞或其他細胞，較佳免疫系統細胞且投予患者。此處吾人描述CAR，其中細胞外部分含有抗NME7、抗NME7-AB或抗NME7-X1抗體、抗體片段或單鏈、scFv抗體片段。在較佳具體實例中，抗體或抗體片段為人類或人類化抗體。
有效抗NME7或抗NME7-X1抗體或片段將具有結合於原生NME7、NME7-AB或NME7-X1之能力。在實踐中，親本抗體(CAR之細胞外結構域係由其工程改造)係藉由用NME7、NME7-AB或NME7-X1衍生肽使動物免疫而產生。在本發明之一個態樣中，免疫型肽包含NME7胺基酸1-376。在本發明之一個態樣中，免疫型肽包含NME7胺基酸92-376。在本發明之另一態樣中，免疫型肽包含NME7胺基酸125-376。在本發明之另一態樣中，免疫型肽由圖16-18中列舉之序列組成。在本發明之另一態樣中，免疫型肽由圖19中列舉之序列組成。或者，親本抗體或抗體片段係選自抗體之文庫或集合，其可為天然、合成或其中任一種之片段，其中其係針對其結合於NME7、NME7-AB或NME7-X1、圖16-18中列舉之肽或圖19中列舉之肽的能力而經選擇。
CAR之靶向部分無需為抗體或抗體片段。本文中吾人描述CAR，其中細胞外結構域含有NME7片段。NME7衍生肽工程改造成不同類別之CAR，其中細胞外結構域之靶向部分為蛋白質片段或肽而非抗體或抗體片段。肽汽經轉染或轉導成免疫系統細胞，典型地為T細胞。NME7片段或NME7衍生肽係針對其結合於其同源結合搭配物但不應能夠充當完整 NME7、NME7-AB或NME7-X1且賦予致瘤活性之能力而經選擇。NME7片段或NME7衍生肽以生物化學方式與免疫系統信號傳導分子融合，諸如作為跨膜結構域之CD8及細胞質信號傳導基元，諸如T細胞受體信號傳導分子，亦稱為活化結構域，或共刺激結構域，包括(但不限於)CD3-ξ、CD28、41bb、OX40。
在本發明之一個態樣中，NME7片段為大部分或全部NME7 NDPK B結構域。在本發明之另一態樣中，NME7片段為含有圖16-19中列舉之肽序列中之一或多者的NME7肽。實驗表明，對於使用NME7或NME7之片段、NME7-AB或NME7-X1作為用於工程改造免疫細胞療法之嵌合抗原受體(CAR)之靶向部分的策略，NME7-AB或NME7-X1之極大型片段與較短肽(例如長度小於15個胺基酸之肽)相比將更有效。或者，各自具有不同NME7-AB衍生肽之CAR之集合可共同經轉染或轉導成免疫系統細胞且投予患者以用於治療或預防癌症。圖28及29中所展示之實驗支持此方法之有效性。
在細胞外結構域中含有NME7片段之CAR經轉染或轉導成免疫系統細胞，典型地T細胞，且投予患者以用於治療或預防癌症。在一個態樣中，癌症為MUC1*陽性癌症。在另一態樣中，癌症為轉移性癌症。
抑制使NME7裂解之酶的藥劑可用於治療或預防癌症。NME7之一些形式在細胞內螯合且因此並非自細胞分泌，由此其可充當生長因子以促進癌症。全長NME7為42KDa。然而，吾人發現自癌細胞及幹細胞分泌不含DM10結構域且似乎與吾人所產生之重組型NME7-AB實質上一致的約33KDa NME7物質。此約33KDa NME7物質及另一種約25KDa NME7物質可使將由抑制NME7之裂解之藥劑消除之產物裂解。
患者樣品中NME7或約33KDa NME7物質(吾人將其稱為NME7-AB樣物質)或NME7-X1之升高之含量之偵測為存在癌症或其發展成侵襲性更高或轉移性的狀態之診斷。本發明人發現早期、原生幹細胞及癌細胞(尤其MUC1*陽性癌細胞)皆表現大量不含DM10結構域之約33KDa NME7及NME7-X1。
NME7-X1最近列舉於aprotein資料庫中作為NME7之理論替代性同功異構物，然而，其從未在組織或細胞中被偵測到。吾人設計藉由PCR來區分NME7-X1與NME7之引子。在細胞板中藉由PCR量測人類NME7、NME7a、NME7b及NME7-X1之表現量，該細胞板包括纖維母細胞、人類胚胎幹細胞、人類iPS細胞、T47D人類乳癌細胞、DU145人類前列腺癌細胞、PC3人類前列腺癌細胞、HEK295人類胎兒肝細胞及其他人類幹細胞株。與幹細胞中相比，NME7在癌細胞中以較高量表現。特定言之，與在纖維母細胞或幹細胞中相比，NME7-X1之表現在前列腺癌細胞中高10倍且在乳癌細胞中高3倍。與在纖維母細胞或幹細胞中相比，NME7-X1在HEK293胎兒肝細胞中之表現高5倍且因此預測NME7-X1在肝癌中升高。與在幹細胞中相比，NME7b在前列腺癌細胞中之表現高17-25倍。
患者樣品中NME7物質之升高之含量之偵測表明患者患有癌症或具有發展癌症之風險。NME7物質含量之程度可藉由PCR、雜交方案、循環探針技術、FISH、免疫細胞化學、IHC、西方墨點法、免疫沈澱、夾心分析、EIISA分析及其類似方法量測或評估。患者樣品可為體液樣品、血液樣品、乳汁、尿液、細胞、液體活檢、活檢及其類似物。在診斷患有 癌症之患者中，NME7物質之升高之含量為轉移性潛力提高之指標。NME7-X1之升高之含量為前列腺癌之指標。本發明之抗體用於偵測及區分NME7物質且用作診斷工具。
因為成年細胞及組織不表現大量NME7或分泌NME7，診斷癌症或診斷侵襲性更高或轉移性的形式或轉化成侵襲性更高的形式之有效方式為量測來自患者、來自細胞或組織之集合或來自培養細胞之樣品中NME7之含量，與健康樣品中之NME7含量相比較或與已知存在於健康成年細胞或組織中之NME7之含量相比較。增加之NME7含量表明存在癌症、存在轉移性癌症或轉移發作。增加之NME7含量亦指示MUC1*陽性癌症。針對NME7之存在分析之樣品可為細胞之集合，其可為來自患者之培養細胞株或細胞、體液、血液樣品、組織樣品或活檢樣品。因此，偵測癌症之存在或癌症之進展狀態的診斷分析法包含以下步驟：1)自患有癌症或具有發展癌症之風險的患者獲得樣品；2)對樣品進行能夠偵測或量測NME7之含量或編碼NME7之核酸之含量的分析法；3)比較測試樣品中所量測之NME7蛋白質或NME7編碼核酸之含量與對照患者或對照細胞中之含量；4)確定與對照相比，NME7或編碼NME7之核酸之含量升高；及5)若測試中所比較之對照來自先前診斷患有癌症之供體，則推斷測試樣品之供體患有癌症或具有癌症之進展狀態。
在此分析法中，與測試樣品進行比較之對照樣品可為非癌性細胞、培養細胞、來自健康供體之樣品、來自供體之非癌性樣品或來自測試樣品之供體的樣品，其中對照樣品係在預先時間點自供體獲得。此類樣品之來源可為任何自針對癌症之存在或進展狀態接受測試之患者獲得之樣 品，包括體液、腦脊髓液、骨髓樣品、血液、組織、細胞、活檢組織或細胞、來源於患者細胞之培養細胞及其類似物。與測試樣品進行比較之樣品之來源可為體液、腦脊髓液、骨髓樣品、血液、組織、細胞、活檢組織或細胞或可來源於健康供體或測試患者之培養細胞，其中樣品係在預先時間點獲得。與測試樣品進行比較之所量測之含量可來自先前記錄之資料且編輯成清單以用於與測試樣品進行比較。
治療診斷學
經診斷具有升高之NME7蛋白質或編碼NME7之核酸之含量的患者接著用抑制NME7之表現、抑制NME7之裂解或抑制NME7結合於其目標(其中此類相互相用促進癌症)之治療劑治療。NME7或NME7之裂解產物之重要目標為MUC1*。NME7結合於MUC1*之細胞外結構域且使其二聚化。因此，診斷具有升高之NME7含量之患者將受益於用抑制NME7之治療劑及/或抑制MUC1之裂解形式之二聚之治療劑進行的治療，該MUC1之裂解形式之細胞外結構域包含一些或全部PSMGFR序列。因此，評估癌症治療及有效量之用於治療或預防癌症之治療劑之投藥的適合性將由以下步驟組成：1)自懷疑患有癌症或具有發展癌症之風險或具有發展轉移性癌症之風險的患者獲得樣品；2)量測NME7或其裂解產物或NME7編碼核酸之量，其中所量測之含量顯著高於對照樣品中所量測之此等含量；3)確定患者患有癌症或發展侵襲性更高或轉移性的癌症；4)向患者投予有效量之抑制NME7之表現、抑制NME7之裂解或抑制NME7結合於其目標之治療劑及/或向患者投予有效量之抑制MUC1之表現、抑制MUC1裂解成MUC1*或抑制MUC1*結合於其目標之治療劑。在較佳具體實例中，抑制 NME7結合於其目標之治療劑抑制其與MUC1*之相互相用。在更佳具體實例中，其抑制NME7與MUC1*之實質上包含PSMGFR序列之細胞外結構域的相互相用。在較佳具體實例中，抑制MUC1*結合於其目標之治療劑抑制MUC1*與NME7之間的相互相用。在更佳具體實例中，抑制MUC1*與NME7之間的相互相用之治療劑抑制MUC1*與NME7之實質上包含NME7-AB之序列之部分的結合。
經化學修飾之肽
多肽或抗體治療可遭受短循環半衰期及蛋白水解分裂及低溶解度。為改良本發明生物製藥之藥物動力學及藥效動力學特性，可進行諸如操縱胺基酸序列之方法以減少或增加免疫原性及降低蛋白水解分裂；可進行肽與免疫球蛋白及血清蛋白(諸如白蛋白)之融合或共軛；亦可併入用於諸如本發明肽及抗體之生物製藥之藥物傳遞媒劑以用於保護及緩釋；且亦涵蓋與天然或合成聚合物共軛。特定言之，就合成聚合物共軛而言，亦涵蓋聚乙二醇化或醯化，諸如N-醯化、S-醯化等。
核酸構築體
亦提供包含如本文所描述之本發明之核酸分子之表現載體，其中核酸分子可操作地連接於表現控制序列。亦提供用於製備多肽之宿主-載體系統，其包含本發明之表現載體，其已引入適用於多肽之表現的宿主細胞中。適合的宿主細胞可為細菌細胞，諸如(大腸桿菌(E.coli))、酵母細胞(諸如甲醇酵母(Pichia pastoris))、昆蟲細胞(諸如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda))或哺乳動物細胞(諸如COS、HEK或CHO細胞)。
本發明亦提供在允許製備多肽及回收所製備之多肽的條件 下藉由生長本文中所描述之宿主-載體系統之細胞來製備本發明之多肽的方法。適用於實踐本發明之多肽可藉由在原核或真核表現系統中表現來製備。
重組型基因可經表現且使用多種方法純化多肽。基因可次選殖成細菌表現載體，諸如(但不限於)pZErO。
可藉由任何允許隨後形成穩定、生物活性蛋白質之技術純化多肽。舉例而言且不限於，可自呈可溶性蛋白質或包涵體形式之細胞回收因子，可藉由8M鹽酸胍及透析自細胞定量提取因子。為了進一步純化因子，可使用多種純化方法，包括(但不限於)習知離子交換層析、親和層析、不同糖層析、疏水性相互作用層析、逆相層析或凝膠過濾。
當在本文中使用時，多肽包括功能上等效分子，其中胺基酸殘基經序列內殘基取代，產生沉默或保守性變化。舉例而言，序列內之一或多個胺基酸殘基可經具有類似極性之另一胺基酸取代，該胺基酸充當功能等效物，產生沉默或保守性變化。序列內之胺基酸之取代物可選自該胺基酸所屬類別之其他成員。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸。帶正電荷(鹼性)之胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶負電荷(酸性)之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。潛在糖基化胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸及天冬醯胺。本發明之範疇內亦包括蛋白質或其展現相同或類似生物活性之片段或衍生物，及在轉譯期間或在轉譯之後經不同修飾(例如藉由糖基化、蛋白水解分裂、連接至抗體分子或其他細胞配位體等)之衍生物。
可使用熟習此項技術者已知的任何用於將DNA片段插入載體之方法，使用適合的轉錄/轉譯控制信號及蛋白質編碼序列構築編碼本發明之多肽的表現載體。此等方法可包括活體外重組型DNA及合成技術及活體內重組(基因重組)。編碼本發明之多肽之核酸序列之表現可由第二核酸序列調節，使得多肽在經重組型DNA分子轉型之宿主中表現。舉例而言，本文中所描述之多肽之表現可由此項技術中已知的任何啟動子/強化子元素控制。可用於控制多肽之表現的啟動子包括(但不限於)如Squinto等人(1991,Cell 65：1-20)中所描述之長末端重複序列；SV40早期啟動子區域(Bernoist及Chambon,1981,Nature 290：304-310)；CMV啟動子；勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中所含之M-MuLV 5'末端啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell 22：787-797)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：144-1445)；金屬硫蛋白基因之調節序列(Brinster等人，1982,Nature 296：39-42)；原核表現載體，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)，亦參見「Useful proteins from recombinant bacteria」,Scientific American,1980,242：74-94；來自酵母或其他真菌之啟動子元素，諸如Gal 4啟動子、ADH(醇去氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、鹼磷酸酶啟動子及以下動物轉錄控制區域，其展現組織特異性且已用於轉殖基因動物中：彈性蛋白酶I基因控制區域，其在胰腺腺泡細胞中具有活性(Swift等人，1984,Cell 38：639-646；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7：425-515)；胰島素基因控制區域， 其在胰腺β細胞中具有活性(Hanahan,1985,Nature 315：115-122)；免疫球蛋白基因控制區域，其在淋巴細胞中具有活性(Grosschedl等人，1984,Cell 38：647-658；Adames等人，1985,Nature 318：533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；小鼠乳房腫瘤病毒控制區域，其在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具有活性(Leder等人，1986,Cell 45：485-495)；仙台病毒(Sendai virus)；慢病毒(lenti virus)；白蛋白基因控制區域，其在肝中具有活性(Pinkert等人，1987,Genes and Devel.1：268-276)；α-胎蛋白基因控制區域，其在肝中具有活性(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987,Science 235：53-58)；α 1-抗胰蛋白酶基因控制區域，其在肝中具有活性(Kelsey等人，1987,Genes and Devel.1：161-171)；β-血球蛋白基因控制區域，其在骨髓細胞中具有活性(Mogram等人，1985,Nature 315：338-340；Kollias等人，1986,Cell 46：89-94)；髓鞘鹼性蛋白質基因控制區域，其在大腦中之寡樹突神經膠質細胞中具有活性(Readhead等人，1987,Cell 48：703-712)；肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區域，其在骨胳肌肉中具有活性(Shani,1985,Nature 314：283-286)及促性腺釋放荷爾蒙基因控制區域，其在丘腦下部中具有活性(Mason等人，1986,Science 234：1372-1378)。
因此，根據本發明，能夠在包含如本文所描述之編碼多肽之核酸的細菌或真核宿主中複寫之表現載體用於轉染宿主且從而直接表現此類核酸以產生多肽，接著可以生物活性形式回收該等多肽。如本文所使用，生物活性形式包括能夠結合於相關受體且引起分化功能及/或影響表現受體之細胞之表現型的形式。
含有核酸插入物之表現載體可藉由(但不限於)至少三種常 用方法鑑別：(a)DNA-DNA雜交，(b)存在或不存在「標記」基因功能，及(c)插入序列之表現。在第一方法中，可使用包含與插入之核酸序列同源之序列的探針藉由DNA-DNA雜交來偵測插入表現載體中之外來核酸之存在。在第二方法中，可基於存在或不存在由載體中外來核酸序列之插入引起之某些「標記」基因功能(例如胸苷激酶活性、對抗生素之抗性、轉型作用表現型、桿狀病毒中之栓塞體形成等)來鑑別及選擇重組型載體/宿主系統。舉例而言，若efl核酸序列插入載體之標記基因序列內，則可藉由不存在標記基因功能來鑑別含有插入物之重組物。在第三方法中，可藉由分析由重組型構築體表現之外來核酸產物鑑別重組型表現載體。此類分析可基於例如相關核酸產物之生理或功能特性，例如藉由配位體與可由例如可偵測抗體或其部分標記之受體或其部分之結合或結合於針對相關蛋白質或其部分產生之抗體。
多肽，尤其本發明之經修飾之多肽，可暫時、組成性或永久地表現於宿主細胞中。
適用於治療本申請案中指示之疾病或病症的有效劑量可使用熟習此項技術者已知的方法測定(參見例如Fingl等人，The Pharmacological Basis of Therapeutics,Goodman及Gilman編，Macmillan Publishing公司，New York，第1-46頁(1975))。根據本發明使用之醫藥組成物包括含上述多肽之藥理學上可接受之液體、固體或半固體載劑，其連接於載劑或靶向分子(例如抗體、荷爾蒙、生長因子等)及/或在活體內投藥之前併入脂質體、微膠囊及控制釋放製劑中。舉例而言，醫藥組成物可包含水性溶液(諸如無菌水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝液或右旋糖溶液)中之多肽。或者，活性劑 可包含於可植入需要此治療之患者之固體(例如蠟)或半固體(例如膠狀)調配物中。投藥途徑可為此項技術中已知的任何投藥模式，包括(但不限於)靜脈內、鞘內、皮下、子宮內、藉由注射至相關組織中、動脈內、鼻內、經口或經由植入裝置。
投藥可引起本發明之活性劑分散於整個身體或局部區域中。舉例而言，在一些涉及神經系統該遠端區域之病狀中，可能需要藥劑之靜脈內或鞘內投藥。在一些情況下，可將含有活性劑之植入劑置放於病灶區域中或其附近。適合的植入劑包括(但不限於)基於明膠海綿、蠟、噴霧或微粒之植入劑。
本發明亦提供醫藥組成物，其包含有含本文中所描述之多肽之藥理學上可接受之媒劑。組成物可全身性或局部投予。可使用此項技術中已知的任何適合的投藥模式，包括(但不限於)靜脈內、鞘內、動脈內、鼻內、經口、皮下、腹膜內或藉由局部注射或手術植入。亦提供持續釋放調配物。
基因療法
基因療法係指藉由向個體投予表現或可表現核酸來進行之療法。在本發明之此具體實例中，核酸產生其介導治療作用之編碼蛋白質。
可根據本發明使用在此項技術中任何可用於基因療法之方法。例示性方法描述於下文中。
關於基因療法之方法之一般綜述，參見Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 12：488-505(1993)；Wu及Wu,Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan,Science 260：926-932(1993)；及Morgan及Anderson,Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May,TIBTECH 11(5)：155-215(1993)。可使用的此項技術中通常已知的重組型DNA技術之方法描述於Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993)；及Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)。
核酸可直接(在此情況下，患者直接暴露於核酸或攜帶核酸之載體)或間接(在此情況下，細胞首先活體外經核酸轉型，接著移植至患者中)傳遞至患者。此等兩種方法分別稱為活體內或活體外基因療法。
在特定具體實例中，活體內直接投予核酸序列，核酸序列在活體內經表現以產生編碼產物。此可由此項技術中已知之多種方法中之任一種實現，例如藉由將其構造成適合的核酸表現載體之一部分且投予其使得其變成細胞內，例如藉由使用缺陷或滅毒型反轉錄病毒或其他病毒載體感染，或藉由直接注射裸DNA，或用脂質或細胞表面受體或轉染劑塗佈，封裝於脂質體、微米粒子或微膠囊中，或藉由將其與已知可進入細胞核之肽結合投予，藉由將其與經歷受體介導之內飲作用之配位體結合投予(參見例如Wu及Wu,J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))(其可用於靶向特定表現受體之細胞類型)等。在另一具體實例中，可形成核酸-配位體複合物，其中配位體包含膜融合病毒肽以破壞內體，允許核酸避免溶酶體降解。在另一具體實例中，可藉由靶向特異性受體來活體內靶向核酸以用於細胞特異性捕捉及表現。或者，藉由同源重組，可細胞內引入核酸且併入宿主細胞DNA內以用於表現(Koller及Smithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342：435-438(1989))。
在特定具體實例中，使用含有編碼多肽之核酸序列之病毒載體。可將編碼基因療法中所使用之多肽的核酸序列選殖入一或多種載體中，該一或多種載體促進基因傳遞至患者中。慢病毒載體(諸如反轉錄病毒載體)及其他載體(諸如腺病毒載體及腺相關病毒)為可使用之病毒載體之實例。反轉錄病毒載體含有病毒基因組之正確封裝及整合至宿主細胞DNA中必須的組分。
腺病毒為尤其受關注的用於傳遞基因至呼吸道上皮細胞之媒劑，因為其天然感染呼吸道上皮細胞，其在呼吸道上皮細胞中引起輕度疾病。基於腺病毒之傳遞系統的其他目標為肝臟、中樞神經系統、內皮細胞及肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞之優勢。此外，亦提議將腺相關病毒(AAV)用於基因療法。
基因療法之另一種方法涉及藉由諸如電致孔、脂質體轉染、磷酸鈣介導之轉染或病毒感染之方法將基因轉移至組織培養物中之細胞中。通常，轉移方法包括可選標記轉移至細胞。接著在選擇下置放細胞以分離此等溶解且表現轉移基因之細胞。接著將此等細胞傳遞至患者。
在此具體實例中，將核酸引入細胞中，隨後活體內投予所得重組型細胞。此類引入可藉由此項技術中已知之任何方法進行，包括(但不限於)轉染、電致孔、顯微注射、用含有核酸序列之病毒或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導之基因轉移、微細胞介導之基因轉移、球形質體融合等。此項技術中已知許多用於將外源基因引入細胞中之技術且可根據本發明使用，其限制條件為不破壞受體細胞之必需發育及生理學功能。該技術應提供核酸至細胞之穩定轉移，使得核酸可由細胞表現且較佳 可由其細胞後代遺傳及表現。
可引入核酸以用於基因療法之目的之細胞涵蓋任何所需、可 用細胞類型，且包括(但不限於)上皮細胞、內皮細胞、角質細胞、纖維母細胞、肌肉細胞、肝細胞；血細胞，諸如T-淋巴細胞、B-淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜伊紅血球、巨核細胞、粒細胞；不同幹細胞或祖細胞，尤其造血幹細胞或祖細胞，例如自骨髓、臍帶血、周邊血液、胎兒肝臟等獲得。
在較佳具體實例中，用於基因療法之細胞對患者為自體性。
在其中將重組型細胞用於基因療法之具體實例中，將編碼多肽之核酸序列引入細胞，使得其可由細胞或其後代表現，且接著活體內投予重組型細胞以用於治療作用。在特定具體實例中，使用幹細胞或祖細胞。任何可活體外分離及保持之幹細胞及/或祖細胞皆可根據本發明之具體實例使用。
在特定具體實例中，所引入之用於基因療法之目的之核酸包含可操作地連接於編碼區之誘導性啟動子，使得核酸之表現可藉由控制存在或不存在適合的轉錄誘導劑來控制。
治療組成物
治療化合物之調配通常為此項技術中已知且可便利地參考Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing公司，Easton,Pa.,USA。舉例而言，可投予每天每公斤體重約0.05ng至約20mg。可調節給藥方案以提供最優治療反應。舉例而言，每天可投予若干分次劑量或可如由治療情形之緊急狀態所指示按比例降低劑量。活性化合物可以便利的方式 投予，諸如藉由經口、靜脈內(在水可容時)、肌內、皮下、鼻內、眼內、皮內或栓劑途徑或植入(例如藉由腹膜內途徑使用緩慢釋放分子，或藉由使用細胞，例如活體外敏化之單核細胞或枝晶細胞，且接受性轉移至受體)。視投藥途徑而定，肽可能需要在材料中塗佈以保護其免於酶、酸及其他可使該等成分失活之天然條件之作用。
舉例而言，肽之低親脂性將使其在胃腸道中由能夠使肽鍵裂解之酶破壞且在胃中由酸水解破壞。為了藉由除非經腸投藥以外的手段投予肽，其將塗有防止其失活之材料或與其一起投予。舉例而言，肽可在佐劑中投予、與酶抑制劑共同投予或在脂質體中投予。本文中涵蓋之佐劑包括間苯二酚、非離子性界面活性劑，諸如聚氧化乙烯油醇醚及正十六基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸酯(DEP)及抑肽酶。脂質體包括水包油包水CGF乳液以及習知脂質體。
活性化合物亦可非經腸或腹膜內投予。亦可於甘油液體聚乙二醇及其混合物及油中製備分散液。在普通的儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
適於可注射使用之醫藥學形式通常包括無菌水溶液(其中水可溶)或分散液及用於無菌可注射溶液或分散液之即用型製備之無菌散劑。在所有情況下，形式必須為無菌的且必須為流體，達到存在可容易注射性之程度。其必須在製造及儲存條件下穩定，且必須保護其免遭微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)、其適合的混合物及植物油之溶劑或分散介質。舉例而言，可藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持在 分散液情況下所需之粒徑及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。可藉由各種抗微生物或抗真菌試劑(例如氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物)來防止微生物之作用。在多種情況下，將較佳包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可藉由將延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)用於組成物中來達成可注射組成物之延長吸收。
無菌可注射溶液係如下製備：將所需量之活性化合物視需要與上文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。通常，藉由將各種滅菌活性成分併入含有鹼性分散介質及來自上文列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其自其預先無菌過濾溶液產生活性成分粉末加任何額外所需成分之粉末。
當肽如上文所描述經適當保護時，活性化合物可經口投予，例如與惰性稀釋劑一起或與可吸收可食用載劑一起投予，或其可包裹於硬殼或軟殼明膠膠囊中，或其可壓縮成錠劑，或其可直接與膳食食物合併。對於經口治療性投藥，可將活性化合物與賦形劑合併且以可攝取錠劑、經頰錠劑、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片及其類似物之形式使用。此類組成物及製劑應含有至少1重量%活性化合物。組成物及製劑之百分比當然可變化且宜在單元之重量之約5%至約80%之間。此類治療學上適用之組成物中之活性化合物之量為使得將獲得適合劑量之量。製備根據本發明之較佳組成物或製劑使得經口單位劑型含有約0.1μg與2000mg之間的活性化合物。
錠劑、丸劑、膠囊及其類似物亦可含有以下：黏合劑，諸如 黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩解劑，諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、褐藻酸及其類似物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；及甜味劑，諸如可添加蔗糖、乳糖或糖精，或調味劑，諸如胡椒薄荷、冬青油或櫻桃調味劑。當單位劑型為膠囊時，除以上類型之物質以外，其亦可含有液體載劑。各種其他材料可以包衣形式存在或以其他方式改變劑量單位之物理形式。舉例而言，錠劑、丸劑或膠囊可塗有蟲膠、糖或其兩者。糖漿或酏劑可含有活性化合物、作為甜味劑之蔗糖、作為防腐劑之對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、染料及調味劑，諸如櫻桃或橙味香料。當然，任何用於預備任何單位劑型之物質應為醫藥學上純且在所使用之量下實質上無毒性。此外，活性化合物可併入持續釋放製劑及調配物中。
傳遞系統
已知多種傳遞系統且可用於投予本發明化合物，例如囊封於脂質體、微米粒子、微膠囊中；能夠表現化合物之重組型細胞；受體介導之內飲作用；構築核酸作為反轉錄病毒或其他載體之一部分等。引入方法包括(但不限於)皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、眼內、硬膜外及經口途徑。化合物或組成物可藉由任何便利途徑投予，例如藉由輸注或快速注射、藉由經由上皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸黏膜及腸黏膜等)吸收且可與其他生物學活性劑一起投予。投藥可為全身性或局部性。此外，可能需要藉由任何適合的途徑(包括室內及鞘內注射)將本發明之醫藥學化合物或組成物引入中樞神經系統；室內注射可由室內導管(例如連接至儲集器，諸如Ommaya儲集器)促進。亦可使用經肺投藥，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及具有氣霧劑之調配物。
在特定具體實例中，可能需要向需要治療之區域局部投予本發明之醫藥學化合物或組成物；此可藉由例如(但不限於)手術期間之局部輸注、局部應用(例如與術後傷口敷料結合)、藉由注射、借助於導管、借助於栓劑或借助於植入物，該植入物為多孔、無孔或膠狀材料，包括膜，諸如矽橡膠膜，或纖維。較佳當投予蛋白質(包括本發明之抗體或肽)時，必須使用蛋白質不吸收之材料進行護理。在另一具體實例中，化合物或組成物可在囊泡，特定言之脂質體中傳遞。在另一具體實例中，化合物或組成物可在控制釋放系統中傳遞。在一個具體實例中，可使用泵。在另一具體實例中，可使用聚合材料。在另一具體實例中，可將控制釋放系統置放在治療目標附近，因此僅需要全身劑量之一部分。
獨立文本的序列表
關於使用除a、g、c、t以外的核苷酸符號，其遵循WIPO標準ST.25，附錄2，表1中闡述之慣例，其中k表示t或g；n表示a、c、t或g；m表示a或c；r表示a或g；s表示c或g；w表示a或t且y表示c或t。
Figure 104111213-A0202-12-0065-2
Figure 104111213-A0202-12-0066-4
Figure 104111213-A0202-12-0066-520
(SEQ ID NO：1)描述全長MUC1受體(黏蛋白1前驅體，Genbank寄存編號：P15941)。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO：2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA(SEQ ID NO：3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG(SEQ ID NO：4)
SEQ ID NO：2、3及4描述用於將MUC1受體及截短型同功異型物引導至細胞膜表面之N端MUC-1信號傳導序列。如SEQ ID NO：2、3及4中之變異體所指示，可在C端缺失至多3個胺基酸殘基。
Figure 104111213-A0202-12-0067-5
(SEQ ID NO：5)描述一種在其N端具有nat-PSMGFR且包括全長MUC1受體之跨膜及細胞質序列之截短型MUC1受體同功異構物。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6)描述MUC1生長因子受體之天然一級序列(nat-PSMGFR-「PSMGFR」之實例)之細胞外結構域。
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：7)描述在SEQ ID NO：6之N端具有單一胺基酸缺失的MUC1生長因子受體之天然一級序列(nat-PSMGFR-「PSMGFR」之實例)之細胞外結構域。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：8)描述具有增強的穩定性之MUC1生長因子受體之天然一級序列之「SPY」功能變異體(var-PSMGFR-「PSMGFR」之實例)之細胞外結構域。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQS GA(SEQ ID NO：9)描述在SEQ ID NO：8之C端具有單一胺基酸缺失的具有增強的穩定性之MUC1生長因子受體之天然一級序列之「SPY」功能變異體(var-PSMGFR-「PSMGFR」之實例)之細胞外結構域。
Figure 104111213-A0202-12-0068-6
Figure 104111213-A0202-12-0068-7
(SEQ ID NO：10)描述MUC1細胞質結構域核苷酸序列。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO：11)描述MUC1細胞質結構域胺基酸序列。
Figure 104111213-A0202-12-0068-9
Figure 104111213-A0202-12-0068-10
(SEQ ID NO：12)描述NME7核苷酸序列(NME7：GENBANK寄存編號AB209049)。
Figure 104111213-A0202-12-0069-517
Figure 104111213-A0202-12-0069-12
(SEQ ID NO：13)描述NME7胺基酸序列(NME7：GENBANK寄存編號AB209049)。
Figure 104111213-A0202-12-0069-13
Figure 104111213-A0202-12-0069-14
(SEQ ID NO：14)描述NM23-H1核苷酸序列(NM23-H1：GENBANK寄存編號AF487339)。
Figure 104111213-A0202-12-0069-15
Figure 104111213-A0202-12-0069-16
(SEQ ID NO：15)NM23-H1描述胺基酸序列(NM23-H1：GENBANK寄存編號AF487339)。
Figure 104111213-A0202-12-0069-17
Figure 104111213-A0202-12-0070-18
Figure 104111213-A0202-12-0070-19
(SEQ ID NO：16)描述NM23-H1 S120G突變型核苷酸序列(NM23-H1：GENBANK寄存編號AF487339)。
Figure 104111213-A0202-12-0070-20
Figure 104111213-A0202-12-0070-21
(SEQ ID NO：17)描述NM23-H1 S120G突變型胺基酸序列(NM23-H1：GENBANK寄存編號AF487339)。
Figure 104111213-A0202-12-0070-22
Figure 104111213-A0202-12-0070-23
(SEQ ID NO：18)描述NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2：GENBANK寄存編號AK313448)。
Figure 104111213-A0202-12-0070-24
Figure 104111213-A0202-12-0071-25
Figure 104111213-A0202-12-0071-26
(SEQ ID NO：19)描述NM23-H2胺基酸序列(NM23-H2：GENBANK寄存編號AK313448)。
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NM23-H7-2序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0071-27
Figure 104111213-A0202-12-0071-28
(SEQ ID NO：20)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0071-29
Figure 104111213-A0202-12-0072-30
Figure 104111213-A0202-12-0072-32
(SEQ ID NO：21)
人類NME7-A：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0072-33
Figure 104111213-A0202-12-0072-34
(SEQ ID NO：22)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0072-35
Figure 104111213-A0202-12-0072-36
(SEQ ID NO：23)
人類NME7-A1：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0072-37
Figure 104111213-A0202-12-0073-38
Figure 104111213-A0202-12-0073-39
(SEQ ID NO：24)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0073-40
Figure 104111213-A0202-12-0073-41
(SEQ ID NO：25)
人類NME7-A2：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0073-42
Figure 104111213-A0202-12-0073-518
(SEQ ID NO：26)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0073-45
Figure 104111213-A0202-12-0074-46
Figure 104111213-A0202-12-0074-47
(SEQ ID NO：27)
人類NME7-A3；
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0074-48
Figure 104111213-A0202-12-0074-49
(SEQ ID NO：28)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0074-50
Figure 104111213-A0202-12-0074-51
(SEQ ID NO：29)
人類NME7-B：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0075-52
Figure 104111213-A0202-12-0075-53
(SEQ ID NO：30)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0075-54
Figure 104111213-A0202-12-0075-55
(SEQ ID NO：31)
人類NME7-B1：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0075-56
Figure 104111213-A0202-12-0075-57
(SEQ ID NO：32)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0075-58
Figure 104111213-A0202-12-0075-59
(SEQ ID NO：33)
人類NME7-B2：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0076-60
Figure 104111213-A0202-12-0076-61
(SEQ ID NO：34)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0076-62
(SEQ ID NO：35)
人類NME7-B3：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0076-63
Figure 104111213-A0202-12-0076-64
(SEQ ID NO：36)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0077-65
Figure 104111213-A0202-12-0077-66
(SEQ ID NO：37)
人類NME7-AB：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0077-67
Figure 104111213-A0202-12-0077-68
(SEQ ID NO：38)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0077-69
Figure 104111213-A0202-12-0078-70
Figure 104111213-A0202-12-0078-71
(SEQ ID NO：39)
人類NME7-AB1：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0078-72
Figure 104111213-A0202-12-0078-73
(SEQ ID NO：40)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0078-74
Figure 104111213-A0202-12-0079-75
(SEQ ID NO：41)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0079-76
Figure 104111213-A0202-12-0079-77
(SEQ ID NO：42)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0079-78
Figure 104111213-A0202-12-0079-79
(SEQ ID NO：43)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A1序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0079-80
Figure 104111213-A0202-12-0079-81
(SEQ ID NO：44)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0080-82
Figure 104111213-A0202-12-0080-83
(SEQ ID NO：45)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A2序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0080-84
Figure 104111213-A0202-12-0080-85
(SEQ ID NO：46)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0080-86
Figure 104111213-A0202-12-0080-87
(SEQ ID NO：47)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A3序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0081-88
Figure 104111213-A0202-12-0081-89
(SEQ ID NO：48)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0081-90
Figure 104111213-A0202-12-0081-91
(SEQ ID NO：49)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0081-92
Figure 104111213-A0202-12-0082-94
Figure 104111213-A0202-12-0082-95
(SEQ ID NO：50)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0082-96
Figure 104111213-A0202-12-0082-97
(SEQ ID NO：51)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B1序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0082-98
Figure 104111213-A0202-12-0082-99
(SEQ ID NO：52)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0082-100
Figure 104111213-A0202-12-0082-101
(SEQ ID NO：53)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B2序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0082-102
Figure 104111213-A0202-12-0083-103
Figure 104111213-A0202-12-0083-104
(SEQ ID NO：54)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0083-105
(SEQ ID NO：55)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B3序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0083-106
Figure 104111213-A0202-12-0083-107
(SEQ ID NO：56)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0083-108
Figure 104111213-A0202-12-0083-109
(SEQ ID NO：57)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-AB序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0084-110
Figure 104111213-A0202-12-0084-511
(SEQ ID NO：58)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0084-112
Figure 104111213-A0202-12-0084-113
(SEQ ID NO：59)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-AB1序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0085-114
Figure 104111213-A0202-12-0085-115
(SEQ ID NO：60)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0085-116
Figure 104111213-A0202-12-0085-117
(SEQ ID NO：61)
小鼠NME6
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0085-119
Figure 104111213-A0202-12-0086-120
Figure 104111213-A0202-12-0086-121
(SEQ ID NO：62)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0086-122
Figure 104111213-A0202-12-0086-123
(SEQ ID NO：63)
人類NME6：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0086-124
Figure 104111213-A0202-12-0086-125
(SEQ ID NO：64)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0087-126
Figure 104111213-A0202-12-0087-127
(SEQ ID NO：65)
人類NME6 1：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0087-128
Figure 104111213-A0202-12-0087-129
(SEQ ID NO：66)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0087-130
Figure 104111213-A0202-12-0087-131
(SEQ ID NO：67)
人類NME6 2：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0088-132
Figure 104111213-A0202-12-0088-133
(SEQ ID NO：68)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0088-134
Figure 104111213-A0202-12-0088-135
(SEQ ID NO：69)
人類NME6 3：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0088-136
Figure 104111213-A0202-12-0088-137
(SEQ ID NO：70)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0089-138
Figure 104111213-A0202-12-0089-139
(SEQ ID NO：71)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME6序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0089-140
Figure 104111213-A0202-12-0089-141
(SEQ ID NO：72)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0089-142
Figure 104111213-A0202-12-0089-143
(SEQ ID NO：73)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 1序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0090-144
Figure 104111213-A0202-12-0090-145
(SEQ ID NO：74)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0090-146
Figure 104111213-A0202-12-0090-147
(SEQ ID NO：75)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 2序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0090-148
Figure 104111213-A0202-12-0090-149
(SEQ ID NO：76)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0091-150
Figure 104111213-A0202-12-0091-151
(SEQ ID NO：77)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 3序列：
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0091-152
Figure 104111213-A0202-12-0091-153
(SEQ ID NO：78)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0091-154
Figure 104111213-A0202-12-0091-155
(SEQ ID NO：79)
OriGene-NME7-1全長
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0091-156
Figure 104111213-A0202-12-0092-157
Figure 104111213-A0202-12-0092-158
(SEQ ID NO：80)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0092-159
Figure 104111213-A0202-12-0093-160
Figure 104111213-A0202-12-0093-161
(SEQ ID NO：81)
Abnova NME7-1全長
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0093-162
Figure 104111213-A0202-12-0093-163
(SEQ ID NO：82)
Abnova Partial NME7-B
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0093-164
(SEQ ID NO：83)
組胺酸標籤
(ctcgag)caccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO：84)
Strept II標籤
(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(SEQ ID NO：85)
N-10肽
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：86)
C-10肽
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO：87)
LALIKPDA(SEQ ID NO：88)
MMMLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO：89)
ALDFHVDHQS(SEQ ID NO：90)
EILRDDAICEWKRL(SEQ ID NO：91)
FNELIQFITTGP(SEQ ID NO：92)
RDDAICEW(SEQ ID NO：93)
SGVARTDASESIRALFGTDGIRNAA(SEQ ID NO：94)
ELFFPSSGG(SEQ ID NO：95)
KFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMA(SEQ ID NO：96)
LMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVT(SEQ ID NO：97)
EFYEVYKGVVTEYHD(SEQ ID NO：98)
EIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNA(SEQ ID NO：99)
YSGPCVAM(SEQ ID NO：100)
FREFCGP(SEQ ID NO：101)
VHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：102)
IQNAVHCTD(SEQ ID NO：103)
TDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：104)
PEDGLLEVQYFFK(SEQ ID NO：105)
EIINKAGFTITK(SEQ ID NO：106)
MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO：107)
NELIQFITT(SEQ ID NO：108)
EILRDDAICEWKRL(SEQ ID NO：109)
SGVARTDASESIRALFGTDGI(SEQ ID NO：110)
SGVARTDASES(SEQ ID NO：111)
ALFGTDGI(SEQ ID NO：112)
NCTCCIVKPHAVSE(SEQ ID NO：113)
LGKILMAIRDA(SEQ ID NO：114)
EISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO：115)
EVYKGVVT(SEQ ID NO：116)
EYHDMVTE(SEQ ID NO：117)
EFCGPADPEIARHLR(SEQ ID NO：118)
AIFGKTKIQNAV(SEQ ID NO：119)
LPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：120)
GPDSFASAAREMELFFP(SEQ ID NO：121)
來源於人類NME7之免疫型肽
ICEWKRL(SEQ ID NO：122)
LGKILMAIRDA(SEQ ID NO：123)
HAVSEGLLGK(SEQ ID NO：124)
VTEMYSGP(SEQ ID NO：125)
NATKTFREF(SEQ ID NO：126)
AIRDAGFEI(SEQ ID NO：127)
AICEWKRLLGPAN(SEQ ID NO：128)
DHQSRPFF(SEQ ID NO：129)
AICEWKRLLGPAN(SEQ ID NO：130)
VDHQSRPF(SEQ ID NO：131)
PDSFAS(SEQ ID NO：132)
KAGEIIEIINKAGFTITK(SEQ ID NO：133)
來源於人類NME1之免疫型肽
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(SEQ ID NO：134)
VDLKDRPF(SEQ ID NO：135)
HGSDSVESAEKEIGLWF(SEQ ID NO：136)
ERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(SEQ ID NO：137)
VDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLN(SEQ ID NO：138)
NIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELV(SEQ ID NO：139)
KPDGVQRGLVGEII(SEQ ID NO：140)
來源於人類NME7之免疫型肽，但其不結合NME1
MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO：141)肽A1
SGVARTDASES(SEQ ID NO：142)肽A2
DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO：143)肽B1
EVYKGVVTEYHDMVTE(SEQ ID NO：144)肽B2
AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO：145)肽B3
人類NME7 a
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0097-165
Figure 104111213-A0202-12-0097-166
(SEQ ID NO：146)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0097-519
Figure 104111213-A0202-12-0098-167
Figure 104111213-A0202-12-0098-168
(SEQ ID NO：147)
人類NME7 b
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0098-169
Figure 104111213-A0202-12-0098-171
(SEQ ID NO：148)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0098-172
Figure 104111213-A0202-12-0099-173
Figure 104111213-A0202-12-0099-174
(SEQ ID NO：149)
人類NME7-AB
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0099-175
Figure 104111213-A0202-12-0099-176
(SEQ ID NO：150)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0099-177
Figure 104111213-A0202-12-0100-178
Figure 104111213-A0202-12-0100-179
(SEQ ID NO：151)
人類NME7-X1
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0100-180
Figure 104111213-A0202-12-0100-181
(SEQ ID NO：152)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0100-182
Figure 104111213-A0202-12-0100-183
(SEQ ID NO：153)
人類NME7 a(關於大腸桿菌表現最佳化)
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0101-184
Figure 104111213-A0202-12-0101-185
(SEQ ID NO：154)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0101-186
Figure 104111213-A0202-12-0102-187
Figure 104111213-A0202-12-0102-188
(SEQ ID NO：155)
人類NME7 b(關於大腸桿菌表現最佳化)
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0102-189
Figure 104111213-A0202-12-0102-190
(SEQ ID NO：156)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0102-191
Figure 104111213-A0202-12-0103-192
Figure 104111213-A0202-12-0103-193
(SEQ ID NO：157)
人類NME7-AB(關於大腸桿菌表現最佳化)
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0103-194
Figure 104111213-A0202-12-0103-195
(SEQ ID NO：158)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0103-196
Figure 104111213-A0202-12-0104-197
(SEQ ID NO：159)
人類NME7-X1(關於大腸桿菌表現最佳化)
(DNA)
Figure 104111213-A0202-12-0104-198
Figure 104111213-A0202-12-0104-199
(SEQ ID NO：160)
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0104-200
Figure 104111213-A0202-12-0104-521
(SEQ ID NO：161)
NME7之DM10結構域
(胺基酸)
Figure 104111213-A0202-12-0105-515
Figure 104111213-A0202-12-0105-516
(SEQ ID NO：162)
實施例
實施例1-基本血清之組分-自由鹼(「MM」)(500ml)
400ml DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen目錄號10565-018)
100ml基因剔除血清替代物(KO-SR，Invitrogen目錄號10828-028)
5ml 100x MEM非必需胺基酸溶液(Invitrogen目錄號11140-050)
0.9ml(0.1mM)β-巰基乙醇(55mM儲備溶液，Invitrogen目錄號21985-023)
實施例2-針對NME1、NME6及NME7之存在探測癌症及幹細胞
在此系列實驗中，吾人探測幹細胞及癌細胞中NME6及NME7之表現。此外，吾人鑑別MUC1*作為NME7之目標。吾人首先對細胞溶解物進行西方墨點分析以測定存在或不存在NME1、NME6及NME7。在圖1A中，藉由SDS-PAGE分離來自BGO1v人類胚胎幹細胞之溶解物，該等幹細胞在塗有抗MUC1*抗體(泳道1)之表面上之NME1二聚體中培養，或在作為陽性對照之MEF(泳道2)或T47D人類乳癌細胞溶解物(泳道3)或NME1-wt上之bFGF中培養，接著用抗NME1特異性抗體進行探測。結果表明無論在NME1二聚體或bFGF中培養，NME1在人類ES細胞中且在T47D癌細胞中強烈表現。藉由SDS-PAGE分離相同細胞溶解物且接著用 抗NME6特異性抗體(來自Abnova之抗NME6)進行探測。未偵測到NME6(資料未圖示)，然而稍後在更濃的樣品中偵測到(參見圖2)。
在圖1B中，藉由SDS-PAGE分離相同細胞溶解物且接著用抗NME7特異性抗體(來自Santa Cruz Biotechnology公司之nm23-H7 B9)進行探測。結果表明NME7在於抗MUC1*抗體表面上之NME1二聚體中培養之人類ES細胞中強烈表現(泳道1)，在於MEF上之bFGF中培養之相同ES細胞中弱表現(泳道2)且在乳癌細胞中強烈表現(泳道3)。添加NME1之泳道4為空白，表明NME7抗體不與NME1交叉反應。NME7在於NME1二聚體中培養之幹細胞(吾人證實其表現標記物)中以較大量表現之事實表明其與在bFGF中培養之細胞相比處於原生性更高的狀態，意謂NME7與其在預致敏細胞中之表現相比以較高量表現於原生細胞中。
為了測定NME7是否亦充當生長因子且MUC1*作為其目標受體，吾人進行下拉分析。在此等實驗中，將合成MUC1*細胞外結構域肽(經His標記之PSMGFR序列)固定在NTA-Ni磁性珠粒上。此等珠粒與BGO1v人類胚胎幹細胞之細胞溶解物一起培育，該等幹細胞在塗有抗MUC1*抗體之表面上之NME1二聚體(泳道1)中培養，或在MEF上之bFGF(泳道2)或T47D人類乳癌細胞溶解物(泳道3)中培養。沖洗珠粒且藉由添加咪唑來釋放所捕獲之蛋白質。藉由SDS-PAGE分離蛋白質且接著用抗NME1抗體(圖1C)或NME7抗體(圖1D)進行探測。結果表明NME7結合於MUC1*細胞外結構域肽。此意謂在幹細胞及癌細胞中，NME7經由其兩個NDPK結構域之某些部分，藉由使MUC1*細胞外結構域二聚化來活化多能性路徑。
實施例3-MUC1下拉分析法表明NME1、NME6及NME7結合於MUC1物質蛋白質
在細胞板上進行使用針對MUC1*細胞質尾區(Ab-5)之抗體的下拉分析法。結果展示於圖2A-2F中。藉由SDS-PAGE分離由MUC1抗體下拉之蛋白質，接著使用西方墨點技術用對NME1、NME6及NME7具有特異性之抗體進行探測。MUC1*陽性乳癌細胞株T47D細胞(ATCC)、人類胚胎幹細胞株BGO1v(LifeTechnologies)、人類ES細胞(HES-3，BioTime公司)、人類iPS細胞(SC101A-1，System Biosciences公司)及T47D癌細胞根據ATCC協定在RPMI-1640(ATCC)加10% FBS(VWR)中生長。所有幹細胞在具有8nM NM23-RS(重組型NME1 S120G二聚體)之基本幹細胞培養基「MM」中培養。幹細胞在塗有12.5μg/mL抗MUC1* C3 mab之塑膠器皿上生長。細胞在冰上用200μL RIPA緩衝液溶解10分鐘。在藉由離心移除細胞殘渣之後，上清液用於共免疫沈澱分析法中。使用Ab-5抗體(抗MUC-1 Ab-5，Thermo Scientific)下拉MUC1*，該抗體識別與戴諾珠粒(Dynabeads)蛋白質G(Life Technologies)偶合之MUC1細胞質尾區。珠粒用RIPA緩衝液洗滌兩次且再懸浮於還原緩衝液中。上清液之樣品經歷還原型SDS-PAGE，接著將蛋白質轉移至PVDF膜。在圖2中，接著用以下物質探測膜：A)抗NM23-H1(NME1)抗體(C-20，Santa Cruz Biotechnology)；B)抗NME6(Abnova)；或C)抗NM23-H7抗體(B-9，Santa Cruz Biotechnology)；D)使用Supersignal(Pierce)增強NME6之染色；及E)使用Supersignal增強NME7之染色。
在與其各別與HRP偶合之二級抗體一起培育之後，藉由化 學發光偵測蛋白質。照片表明原生NME1、NME6及NME7存在於MUC1*陽性乳癌細胞、人類ES細胞及人類iPS細胞中且其結合於MUC1*。應注意，存在於HES-3離心塊中之細胞之數目小於存在於其他樣品中之數目。
實施例4-偵測胚胎幹細胞及iPS細胞中之NME7
結果展示於圖3中。人類ES細胞(BGO1v及HES-3)在基於NME之培養基中培養，其中細胞塗在抗MUC1*抗體之層上。為了鑑別NME7物質，收集細胞且用補充有蛋白酶抑制劑(Pierce)之RIPA緩衝液(Pierce)溶解。藉由在12%SDS-PAGE還原型凝膠上電泳來分離細胞溶解物(20μL)且轉移至PVDF膜(GE Healthcare)。墨點用含有3%牛奶之PBS-T阻斷且接著與初級抗體(抗NM23-H7純系(clone)B-9，Santa Cruz Biotechnology)一起在4℃下培育隔夜。在用PBS-T沖洗之後，膜與辣根過氧化酶(HRP)結合之二級抗體(山羊抗小鼠，Pierce)一起在室溫下培育1小時。用Immun-Star化學發光套組(Bio-Rad)偵測信號。圖3A展示來自人類幹細胞之溶解物含有三種NME7物質：42KDa處之全長以及約33KDa及約30KDa處之兩種低分子量NME7物質。圖3B及3C展示分泌(B)及保留在細胞內(C)之NME7物質之間的差異。圖3B展示僅30-33KDa NME7物質係自細胞分泌。圖3C展示此等相同細胞之溶解物具有全長形式及低分子量物質(其可為裂解產物)或其兩者之替代性同功異構物。關於部分(B)，藉由在任一種12% SDS-PAGE還原型凝膠上電泳來分離iPS改良性培養基(20μL)且轉移至PVDF膜(GE Healthcare)。墨點用含有3%牛奶之PBS-T阻斷且接著與初級抗體(抗NM23-H7純系B-9，Santa Cruz Biotechnology)一起在4℃下培育隔夜。在用PBS-T沖洗之後，膜與辣根過氧化酶(HRP) 結合之二級抗體(山羊抗小鼠，Pierce)一起在室溫下培育1小時。用Immun-Star化學發光套組(Bio-Rad)偵測信號。關於部分(C)，除了使用細胞溶解物代替改良性培養基以外，類似地進行實驗。
實施例5-產生蛋白質構築體
關於產生重組型NME7，首先，製備構築體以產生可被有效表現且呈可溶形式之重組型NME7。第一方法旨在製備將編碼原生NME7(a)或具有N端缺失之替代性剪接變異體NME7(b)的構築體。在一些情況下，構築體攜帶組胺酸標籤或鏈黴素標籤以輔助純化。NME7-a、在大腸桿菌中弱表現之全長NME7及NME7-b在大腸桿菌中完全不表現。然而，製備新穎構築體，其中刪除DM10序列且NME7實質上包含具有33KDa之計算分子量之NDPK A及B結構域。
此新穎NME7-AB在大腸桿菌中極良好表現且以可溶性蛋白質形式存在。NME7-AB首先在NTA-Ni管柱上純化，且接著在Sephadex 200管柱上藉由尺寸排阻層析(FPLC)進一步純化(圖4A)。收集溶離份且藉由SDS-PAGE進行測試以鑑別具有NME7-AB之最高及最純表現之溶離份(圖4B)。圖4C展示用於合併最純溶離份之FPLC痕跡。接著測試經純化之NME7-AB蛋白質且證實可完全支持人類幹細胞之生長且將其進一步恢復至原生性最高、pre-X失活狀態。亦證實經純化之NME7-AB可加快癌細胞生長。
實施例6-展示NME7-AB同時結合於兩個MUC1*細胞外結構域肽之ELISA分析法
結果展示於圖5中。使用Imject Maleimide活化之BSA套組 (Thermo Fisher)使具有C端半胱胺酸之PSMGFR肽(PSMGFR-Cys)與BSA共價偶合。PSMGFR-Cys偶合之BSA在0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液pH 9.6中稀釋至10μg/mL且將50μL添加至96孔板之各孔中。在4℃下培育隔夜之後，板用PBS-T洗滌兩次且添加3% BSA溶液以阻斷孔上之剩餘結合位點。在室溫下1小時之後，板用PBS-T洗滌兩次且以不同濃度添加在PBS-T+1% BSA中稀釋之NME7。在室溫下1小時之後，板用PBS-T洗滌3次且以1/500稀釋度添加在PBS-T+1% BSA中稀釋之抗NM23-H7(B-9，Santa Cruz Biotechnology)。在室溫下1小時之後，板用PBS-T洗滌3次且以1/3333稀釋度添加在PBS-T+1% BSA中稀釋之山羊抗小鼠-HRP。在室溫下1小時之後，板用PBS-T洗滌3次且使用ABTS溶液(Pierce)在415nm下量測NME7之結合。
ELISA MUC1*二聚化：使用NME7結合之協定，且NME7係以11.6μg/mL使用。
在室溫下1小時之後，板用PBS-T洗滌3次且以不同濃度添加在PBS-T+1% BSA中稀釋之HisTagged PSMGFR肽(PSMGFR-His)或生物素化PSMGFR肽(PSMGFR-生物素)。在室溫下1小時之後，板用PBS-T洗滌3次且以1/5000之濃度添加在PBS-T+1% BSA中稀釋之抗Histag-HRP(Abcam)或抗生蛋白鏈菌素-HRP(Pierce)。在室溫下1小時之後，板用PBS-T洗滌3次且使用ABTS溶液(Pierce)在415nm下量測PSMGFR肽與NME7之結合，該NME7已結合於另一PSMGFR肽(其可不由抗His抗體或抗生蛋白鏈菌素信號傳導)偶合之BSA。
實施例7-人類重組型NME7-AB之功能性測試
關於測試重組型NME7-AB維持多能性及抑制分化之能力，產生NME7之可溶變異體NME7-AB且純化。人類幹細胞(iPS目錄號SC101a-1，System Biosciences)根據製造商指導在小鼠纖維母細胞飼養細胞之層上的4ng/ml bFGF中生長四代。接著將此等源幹細胞塗在每孔已塗有12.5μg單株抗MUC1*抗體MN-C3之6孔細胞培養板(VitaTM，Thermo Fisher)中。細胞以300,000個細胞/孔之密度塗佈。基本培養基為由以下組成之基本幹細胞培養基：400ml DME/F12/GlutaMAX(Invitrogen目錄號10565-018)、100mL基因剔除血清替代物(KO-SR，Invitrogen目錄號10828-028)、5ml 100x MEM非必需胺基酸溶液(Invitrogen目錄號11140-050)及0.9ml(0.1mM)β-巰基乙醇(55mM儲備溶液，Invitrogen目錄號21985-023)。基本培養基可為任何培養基。在較佳具體實例中，基本培養基不含其他生長因子及細胞激素。向基本培養基中添加以穩定二聚體形式再摺疊及純化之8nM NME7-AB或8nM NM23-H1。每48小時更換培養基且歸因於加速生長，必須在塗佈後第3天收集及繼代。當幹細胞在NM23-H1二聚體或NME7單體中生長時，實現可比較的多能幹細胞生長。
NME7及NM23-H1(NME1)二聚體皆以多能方式生長且即使在100%匯合時亦不具有分化。如在照片中可見，與在NM23-H1二聚體中生長之細胞相比，NME7細胞更快地生長。第一批收集之細胞計數表明NME7中之培養物產生之細胞比NM23-H1二聚體中之培養物多1.4倍。典型多能標記物之ICC染色證實NME7-AB完全支持人類幹細胞生長、多能性且抵抗分化。
約30-33KDa之NME7物質可為替代性剪接同功異構物或轉 譯後修飾，諸如裂解，其可使得能夠自細胞分泌。
實施例8-藉由在使幹細胞恢復至原生性更高的狀態之條件下培養細胞來誘導癌細胞轉化成轉移性癌細胞
通常在含血清之培養基(諸如RPMI)中培養癌細胞。吾人發現在使幹細胞恢復至原生性更高的狀態之試劑存在下培養癌細胞可使癌細胞轉型成轉移性更高的狀態。
吾人證明NME7-AB、人類NME1二聚體、細菌性NME1二聚體、NME7-X1及「2i」抑制劑各自能夠使常規癌細胞轉型成轉移性癌細胞，其亦稱為癌症幹細胞「CSC」或腫瘤引發細胞「TIC」。2i為賦予兩種生物化學抑制劑之名稱，研究人員發現該兩種生物化學抑制劑使人類幹細胞恢復至原生性更高的狀態。2i為MEK及GSK3-β抑制劑PD0325901及CHIR99021，其分別以約1mM及3mM之最終濃度添加至培養基中。
當添加至分開的批次之基本培養基中以使癌細胞轉型成轉移性細胞時，NME7-AB及NME7-X1為約4nM之最終濃度，但約1nM至16nM範圍內之較低及較高濃度亦可良好起作用。人類或細菌性NME1二聚體以4nM至32nM之最終濃度使用，此等實驗中典型地使用16nM，其中人類NME具有S120G突變。若使用野生型，則可能需要較低濃度。此等精確濃度不意欲為重要的。重要的是，NME1蛋白質為二聚體且此情況發生之濃度範圍為低奈莫耳範圍，但某些突變允許較高濃度保持為二聚體。
類似地，NME7蛋白質之濃度可變化。NME7-AB及NME7-X1為單體且用於使癌細胞轉型成轉移性細胞之濃度應允許蛋白質保持為單體。已提議將多種分子標記物作為轉移性癌細胞之指標。不同癌症類型可 具有不同的上調分子。舉例而言，受體CXCR4在轉移性乳房癌中上調，而E-鈣黏素(亦稱為CHD1)在轉移性前列腺癌中上調得更多。
除此等特異性轉移標記物以外，多能性之典型標記物(諸如OCT4、SOX2、NANOG及KLF4)隨癌症變得轉移性而上調。藉由PCR分析起始癌細胞及隨後的轉移性癌細胞以量測此等基因之表現量。
圖11展示在含有NME7-AB之培養基中培養之T47D乳癌細胞之RT-PCR量測之圖。添加rho I激酶抑制劑ROCi、ROCKi或Ri以防止經轉型之細胞自板浮起。量測親本細胞及NME7-AB培養細胞之不同轉移性標記物以及多能幹細胞標記物之表現量。結果表明漂浮細胞與接受ROCi之細胞相比表現較高量之轉移性及多能性標記物。吾人推論其係因為此等量測值為未轉型之細胞及轉型但ROCi使其保持黏著性之細胞的平均值。此可顯見於圖12中，其中「-Ri」意謂不接受ROCi且因此不與漂浮之高轉移性細胞混合之黏附細胞。
當在含有NM23(亦稱為NME1)或NME7-AB之培養基中培養時，前列腺癌細胞亦轉化成轉移性更高的狀態。此處吾人證實對於迄今為止所測試之每一細胞株，與人類具有高序列同源性之NME7-AB、人類NME1二聚體或細菌性NME中之培養物誘導轉化成轉移性更高的狀態。
圖14A展示在含有2i抑制劑、NME7-AB或其兩者之培養基中培養之乳癌細胞之轉移性及多能性標記物之表現量之RT-PCR量測的圖。如可見，2i抑制劑亦能夠誘導癌細胞轉化成轉移性更高的狀態。圖14B展示在含有來自細菌性HSP593之NME1(其序列與人類NME1及NME7-AB高度同源)之培養基中培養之乳癌細胞之轉移性及多能性標記物之表現量 之RT-PCR量測的圖，表明具有高序列同源性之細菌性NME可模擬人類NME1及NME7-AB之作用，因為其誘導轉化成轉移性更高的狀態。當在NME7-AB及/或2i抑制劑中培養時，卵巢癌細胞株SK-OV3、OV-90、胰臟癌細胞株CAPAN-2及PANC-1、乳癌細胞株MDA-MB皆顯示子黏著性至非黏著性之形態轉變。
圖37展示在NME7-AB中培養72或144小時之不同癌細胞株之轉移性或多能性標記物之RT-PCR量測的圖。圖37A展示當在NME7-AB中培養時，SK-OV3細胞增加轉移性標記物CHD1、SOX2及NME7-X1之表現。圖37B展示在NME7-AB中培養之後，OV-90細胞增加轉移性標記物CXCR4及NME7-X1之表現。
實施例9-證明在NME7中培養之癌細胞變得轉移性
關於癌細胞群體是否為轉移性之功能性測試為在免疫缺陷小鼠中植入極少數(例如200個)細胞且觀察其是否發展成腫瘤。典型地需要5-6百萬個癌細胞以在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤。吾人證實僅極少的50個NME誘導之轉移性癌細胞便可在小鼠中形成腫瘤。此外，在整個測試期間向小鼠注射人類NME7-AB、NME1或NME7-X1發育之遠端癌轉移。
T47D人類乳癌細胞在標準RPMI培養基中培養14天(每48小時更換培養基)且在約75%匯合時藉由胰蛋白酶消化繼代。接著將細胞塗於6孔培養盤中且在補充有4nM NME7-AB之基本幹細胞培養基(參見實施例1)中培養。每48小時更換培養基。至約第4天時，一些細胞變得自表面分離且漂浮。小心地更換培養基以保留「漂浮物」，因為此等漂浮物為具有最高轉移性潛力之細胞，如由轉移性標記物之RT-PCR量測證明。在 第7天或第8天，收集漂浮物且計數。保留樣品以用於RT-PCR量測。所量測之關鍵標記物為CXCR4，其在於NME7-AB中短暫培養之後上調40-200倍。
將新收集之漂浮物轉移性細胞異種移植至已植入90天緩慢釋放雌激素顆粒之雌性nu/nu無胸腺小鼠之側腹中。漂浮細胞各自以10,000、1,000、100或50個細胞異種移植。亦每天向各組(6隻)中之一半小鼠在初始植入部位附近注射32nM NME7-AB。在無NME7-AB之RPMI培養基中培養之親本T47D細胞亦以6百萬、10,000或100個植入小鼠中作為對照。即使當僅植入少至50個細胞時，植入NME7誘導之漂浮細胞之小鼠發展腫瘤。植入漂浮細胞且每天接受NME7-AB注射之小鼠亦在不同器官中發展遠端腫瘤或遠端癌轉移(圖20-25)。在植入NME7-AB培養之癌細胞之後注射人類NME7-AB之12隻小鼠中的11隻(或92%)在注射部位處發展腫瘤。在植入之後未注射人類NME7-AB之12隻小鼠中的僅7隻(或58%)發展腫瘤。發展腫瘤且注射人類NME7-AB之11隻小鼠中的9隻(或82%)發展遠離注射部位之多發性腫瘤。未注射NME7-AB之小鼠皆未發展多發性、可見腫瘤。
在處死之後，RT-PCR及西方墨點表明注射NME7-AB之小鼠上之遠端凸塊實際上為人類乳房腫瘤。其器官之類似分析表明除遠端凸塊以外，小鼠中植入之人類乳癌細胞之人類乳癌特徵隨機轉移至肝及肺。如所預期，僅植入6百萬個細胞之小鼠生長腫瘤。
進行若干與上述類似之實驗，得到實質上相同結果。在各實驗中，存在24或52隻小鼠，包括所有合適對照。
實施例10-抗NME7抗體抑制癌細胞生長
根據ATCC建議之方案培養T47D乳癌細胞及DU145前列腺癌細胞。細胞生長至約30%匯合。產生針對涵蓋幾乎全部蛋白質：胺基酸100至376之NME7之片段的抗NME7多株兔抗體。將此多株抗體以2.7至375ng/mL之間的濃度添加至癌細胞中。使用紫杉醇作為陽性對照。在第48小時(圖6及7)及在96小時之後(圖8)對細胞進行拍照及計數。照片及細胞計數表明抗體有效抑制乳房及前列腺癌細胞之生長。然而，因為未試圖選擇僅針對NME7之免疫型肽，此抗體可藉由結合於NME7-AB樣物質及NME1且抑制其兩者而發揮細胞毒性作用。
實施例11-由於序列對NME7、A1、A2、B1、B2及B3之獨特性而選擇之肽抑制NME7物質與MUC1*細胞外結構域肽之結合
選擇NME7肽作為免疫劑用於抗體產生。在人類NME1、人類NME7及若干與人類NME1或人類NME7同源之細菌性NME中使用序列比對方法選擇NME7肽A1、A2、B1、B2及B3(圖19)。自所有區域鑑別五個具有高序列同源性之區域。然而，為了防止產生抗體之選擇肽將抑制人類NME1以及人類NME7，吾人選擇靠近同源區域之NME7序列，其中此等肽具有與人類NME1不同之序列。吾人進行ELISA分析以觀察肽是否可獨立地結合於表面上之合成MUC1*肽及抑制人類NME7或人類NME1與固定肽之結合(圖27)。圖27展示肽抑制NME7及NME1與固定肽之結合。此表明此等衍生肽之區域為與MUC1*相互作用之區域且將產生抗體，該等抗體將結合於NME7之此等區域且抑制其與MUC1*受體之結合。
在另一實驗中，將自由肽A1、A2、B1、B2及B3添加至培 養物中之癌細胞中，該等癌細胞正藉由在NME7-AB或2i中培養而經歷至轉移性更高的狀態之轉化。圖30展示當癌細胞在NME7-AB或2i抑制劑中生長時，科學家觀測結果之表，且展示自由肽抑制自黏附細胞至漂浮物之形態變化，對於乳癌細胞，該形態變化與轉移性標記物，尤其CXCR4之表現提高直接相關。RT-PCR量測證實NME7-AB肽抑制轉移標記CXCR4之表現之增加。
圖31展示在NME7-AB或2i抑制劑(其中每一者使癌細胞轉型成轉移性更高的狀態)中生長之T47D乳癌細胞中CXCR4表現之RT-PCR量測以及NME7衍生肽、A1、A2、B1、B2及B3對轉移性轉型作用之抑制作用的圖。圖32展示用於圖31中CXCR4之RT-PCR量測之樣品中所記錄之RNA含量以及CXCR4表現及對照管家基因之臨限循環數目之表格。
實施例12-抗NME7抗體特異性結合於人類NME7但不結合於人類NME1
進行標準ELISA分析法以測定吾人藉由用NME7-AB肽A1、A2、B1、B2及B3進行免疫接種而產生之NME7抗體是否將特異性結合於NME7-AB，但不結合於人類NME1，因為人類NME1具有健康功能且用抗體阻斷人類NME1可能對人類為有害的。圖26之ELISA表明吾人自肽A1、A2、B1、B2及B3產生之所有NME7抗體皆結合於人類NME7-AB(A)，但不結合於人類NME1(B)。用於產生此等抗體之肽為NME7-AB及NME7-X1所共有的。此分析表明自肽a1、A2、B1、B2及B3產生之抗體特異性結合於NME7-AB且相關地將結合於NME7-X1。
NME7A肽1(A結構域)：MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO：141)
NME7A肽2(A結構域)：SGVARTDASES(SEQ ID NO：142)
NME7B肽1(B結構域)：DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO：143)
NME7B肽2(B結構域)：EVYKGVVTEYHDMVTE(SEQ ID NO：144)
NME7B肽3(B結構域)：AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO：145)
實施例13-抗NME7特異性抗體及產生其之肽可抑制癌細胞生長
用NME7肽A1、A2、B1、B2及B3使兔子免疫且在與免疫型肽共軛之管柱上產生、收集及純化抗體。根據ATCC方案在補充有血清之RPMI培養基中塗佈及培養T47D乳癌細胞。以圖28中指示之濃度添加藉由用肽A1、A2、B1、B2及B3進行免疫接種而產生之抗體。亦將免疫型肽A1、A2、B1、B2及B3以及MUC1*之PSMGFR細胞外結構域(本文中「FLR」)單獨地添加至生長T47D乳癌細胞中。添加紫杉醇及E6抗MUC1*Fab作為對照。圖28中之圖表明所產生之抗體以及自由肽有效抑制癌細胞之生長。使用紫杉醇(其為類似地殺死健康及癌細胞之化學療法藥劑)對比抑制作用。又，作為對比，展示使用來自胺基酸100至376之NME7之大型延伸部分產生之多株抗體。儘管此抗體為癌症生長之強效抑制劑，但其可具有非特異性作用，其可結合於NME1以及NME7。
在類似實驗中，以所指示之濃度將藉由用肽A1、A2、B1、 B2及B3進行免疫接種而產生之抗體之組合以及肽本身添加至生長癌細胞中。圖29中所展示之細胞生長之圖表明抗體及肽之組合有效抑制癌細胞之生長。在此等兩個實驗中，細胞為MUC1*陽性乳癌細胞。
實施例14-抗NME7抗體抑制癌細胞轉化成轉移性癌細胞
癌細胞當在使幹細胞恢復至原生性更高的狀態之試劑存在下培養時轉型成轉移性更高的狀態。吾人證明在NME7-AB、人類NME1二聚體、細菌性NME1二聚體或MEK及GSK3-β抑制劑(稱為「2i」)中培養癌細胞可引起細胞變得轉移性更高。隨著細胞轉化成轉移性更高的狀態，其變得非黏著性且自培養板浮起。與黏著性細胞分開地收集此等漂浮細胞「漂浮物」且證實：a)表現顯著較高量之轉移性基因；及b)當異種移植至小鼠中時，漂浮細胞能夠在以極小數目植入時產生腫瘤。特異性轉移性標記物(諸如乳癌之CXCR4、前列腺癌之CHD1及其他多能幹細胞標記物，諸如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、c-Myc及其他標記物)之RT-PCR量測在於NME7-AB中培養之癌細胞中顯著過表現且大部分在變成非黏著性(本文及圖式中稱為「漂浮物」)之細胞中過表現。
此處吾人證實藉由用NME7衍生肽A1、A2、B1、B2及B3進行免疫接種而產生之NME7特異性抗體以及肽本身可抑制癌細胞轉化成轉移性癌細胞。在此等實驗中之第一實驗中，測試藉由用A1、A2、B1、B2及B3進行免疫接種而產生之抗體抑制藉由在NME7-AB或2i抑制劑中培養T47D乳癌細胞而誘導之轉移性轉化之能力。最驚人的觀測結果為抗體及肽顯著降低細胞數目，其為抗體及肽抑制轉型成轉移性癌細胞之第一指示。特定言之，由B3肽之免疫接種產生之抗體所針對之細胞幾乎不產生任何漂 浮細胞。
圖30展示與不接受任何抗體處理之對照孔相比，各抗體之可見漂浮細胞之百分比的記錄觀測結果。自漂浮細胞及黏附細胞提取mRNA。使用RT-PCR量測轉移性標記物(包括CXCR4)之表現量。用抗NME7抗體處理可顯著降低轉移性標記物(諸如CXCR4)之量，表明抗體抑制轉化成轉移性癌症(參見圖31)。值得注意的是，藉由用肽B3進行免疫接種而產生之抗體(亦稱為61號抗體)實質上完全抑制轉化成轉移性更高的狀態。圖31B展示經單獨的NME7-AB肽A1、A2、B1、B2及B3處理之乳癌細胞能夠有效抑制藉由在含有2i抑制劑之培養基中培養細胞而誘導之轉化成轉移性更高的狀態。肽B3及由其產生之61號抗體尤其有效。圖31C展示相同圖，但具有延長之Y軸以展示轉移性標記物之肽抑制。量測mRNA之量，其指示細胞活力及生長。經抗體處理之細胞具有顯著較少mRNA，表明除抑制轉化成轉移性更高的狀態以外，抗NME7-AB抗體亦抑制癌細胞之生長。圖32展示圖31A中所展示之抑制實驗中回收之RNA之量的表格。
實施例15-用NME7衍生肽A1、A2、B1、B2及B3產生之抗NME7抗體可鑑別使用任何市售抗體皆無法偵測的新穎NME7物質
如熟習此項技術者已知，一些抗體識別目標蛋白質之線性部分且可用於西方墨點分析，而其他抗體識別非線性構形主結構且可用於下拉或免疫沈澱分析。在本申請案之前，尚未知曉存在裂解之NME7或同功異構物NME7-X1。使用在申請時可商購之抗體表明現有抗體不可特異性偵測此等重要的NME7物質。B9(Santa Cruz Biotechnology)為針對NME7胺 基酸100-376產生之單株抗體。圖36A展示其僅偵測全長42KDa NME7。另一種市售抗體H278為針對NME7胺基酸100-376產生之兔多株抗體，其包括並非NME7所獨有的胺基酸序列。圖36B展示此抗體亦染色NME1(其為17KDa)以及全長NME7及其他似乎對NME7-AB不具有特異性之帶。
藉由用NME7-AB肽A1、A2、B1、B2或B3進行免疫接種而產生之NME7抗體鑑別新的NME7物質，其包括全長42KDa蛋白質；約33KDa NME7物質，其可為裂解產物或替代性同功異構物；約30KDa NME7物質，其可為裂解產物或替代性同功異構物，其中約30KDa物質似乎為NME7-X1。圖35A-C展示由肽A1、B1及B3產生之抗體鑑別許多癌細胞株中NME7、NME7-AB及NME7-X1之分泌形式，包括T47D乳癌細胞、PC3及DU145前列腺癌細胞、HEK293胎兒肝細胞以及白血病細胞IM-9、K562及MV411。
所有引用之參考文獻以全文引用的方式併入本文中。
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Figure 104111213-A0305-02-0132-3
Figure 104111213-A0305-02-0133-4
Figure 104111213-A0305-02-0134-5
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<220>
<223> N端MUC-1信號傳導序列
<400> 2
Figure 104111213-A0305-02-0136-37
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端MUC-1信號傳導序列
<400> 3
Figure 104111213-A0305-02-0136-38
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端MUC-1信號傳導序列
<400> 4
Figure 104111213-A0305-02-0137-39
<210> 5
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在N端具有nat-PSMGFR之截短型MUC1受體同功異構物
<400> 5
Figure 104111213-A0305-02-0137-40
Figure 104111213-A0305-02-0138-41
<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1生長因子受體之原生一級序列
<400> 6
Figure 104111213-A0305-02-0138-42
<210> 7
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1生長因子受體之原生一級序列
<400> 7
Figure 104111213-A0305-02-0138-43
Figure 104111213-A0305-02-0139-45
<210> 8
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1生長因子受體之原生一級序列之「SPY」功能性變異體
<400> 8
Figure 104111213-A0305-02-0139-46
<210> 9
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1生長因子受體之原生一級序列之「SPY」功能性變異體
<400> 9
Figure 104111213-A0305-02-0139-47
<210> 10
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1細胞質結構域核苷酸序列
<400> 10
Figure 104111213-A0305-02-0140-48
<210> 11
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1細胞質結構域胺基酸序列
<400> 11
Figure 104111213-A0305-02-0140-49
<210> 12
<211> 854
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NME7核苷酸序列
<400> 12
Figure 104111213-A0305-02-0141-50
<210> 13
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NME7胺基酸序列
<400> 13
Figure 104111213-A0305-02-0141-51
Figure 104111213-A0305-02-0142-8
Figure 104111213-A0305-02-0143-52
<210> 14
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NM23-H1核苷酸序列
<400> 14
Figure 104111213-A0305-02-0143-53
<210> 15
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NM23-H1描述胺基酸序列
<400> 15
Figure 104111213-A0305-02-0144-54
Figure 104111213-A0305-02-0145-9
<210> 16
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NM23-H1 S120G突變型核苷酸序列
<400> 16
Figure 104111213-A0305-02-0145-56
<210> 17
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NM23-H1 S120G突變型胺基酸序列
<400> 17
Figure 104111213-A0305-02-0145-57
Figure 104111213-A0305-02-0146-58
<210> 18
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NM23-H2核苷酸序列
<400> 18
Figure 104111213-A0305-02-0146-59
Figure 104111213-A0305-02-0147-60
<210> 19
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NM23-H2胺基酸序列
<400> 19
Figure 104111213-A0305-02-0147-61
Figure 104111213-A0305-02-0148-62
<210> 20
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類M23-H7-2序列
<400> 20
Figure 104111213-A0305-02-0148-63
Figure 104111213-A0305-02-0149-64
<210> 21
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類M23-H7-2序列
<400> 21
Figure 104111213-A0305-02-0149-65
Figure 104111213-A0305-02-0150-66
Figure 104111213-A0305-02-0151-68
<210> 22
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-A
<400> 22
Figure 104111213-A0305-02-0151-69
<210> 23
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-A
<400> 23
Figure 104111213-A0305-02-0151-70
Figure 104111213-A0305-02-0152-71
<210> 24
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-A1
<400> 24
Figure 104111213-A0305-02-0152-72
Figure 104111213-A0305-02-0153-73
<210> 25
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-A1
<400> 25
Figure 104111213-A0305-02-0153-75
Figure 104111213-A0305-02-0154-76
<210> 26
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-A2
<400> 26
Figure 104111213-A0305-02-0154-77
<210> 27
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-A2
<400> 27
Figure 104111213-A0305-02-0155-272
Figure 104111213-A0305-02-0156-79
<210> 28
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-A3
<400> 28
Figure 104111213-A0305-02-0156-80
<210> 29
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-A3
<400> 29
Figure 104111213-A0305-02-0157-81
Figure 104111213-A0305-02-0158-82
<210> 30
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-B
<400> 30
Figure 104111213-A0305-02-0158-83
<210> 31
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-B
<400> 31
Figure 104111213-A0305-02-0158-84
Figure 104111213-A0305-02-0159-85
<210> 32
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-B1
<400> 32
Figure 104111213-A0305-02-0159-87
Figure 104111213-A0305-02-0160-88
<210> 33
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-B1
<400> 33
Figure 104111213-A0305-02-0160-89
<210> 34
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-B2
<400> 34
Figure 104111213-A0305-02-0161-90
<210> 35
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-B2
<400> 35
Figure 104111213-A0305-02-0161-91
Figure 104111213-A0305-02-0162-93
<210> 36
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-B3
<400> 36
Figure 104111213-A0305-02-0162-94
Figure 104111213-A0305-02-0163-95
<210> 37
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-B3
<400> 37
Figure 104111213-A0305-02-0163-96
Figure 104111213-A0305-02-0164-98
<210> 38
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-AB
<400> 38
Figure 104111213-A0305-02-0164-99
<210> 39
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-AB
<400> 39
Figure 104111213-A0305-02-0165-100
Figure 104111213-A0305-02-0166-101
<210> 40
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-AB1
<400> 40
Figure 104111213-A0305-02-0166-102
Figure 104111213-A0305-02-0167-103
<210> 41
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-AB1
<400> 41
Figure 104111213-A0305-02-0167-104
Figure 104111213-A0305-02-0168-106
<210> 42
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A序列
<400> 42
Figure 104111213-A0305-02-0169-107
<210> 43
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A序列
<400> 43
Figure 104111213-A0305-02-0169-108
Figure 104111213-A0305-02-0170-109
<210> 44
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A1序列
<400> 44
Figure 104111213-A0305-02-0170-110
<210> 45
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A1序列
<400> 45
Figure 104111213-A0305-02-0171-112
<210> 46
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A2序列
<400> 46
Figure 104111213-A0305-02-0172-114
<210> 47
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A2序列
<400> 47
Figure 104111213-A0305-02-0172-115
Figure 104111213-A0305-02-0173-116
<210> 48
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A3序列
<400> 48
Figure 104111213-A0305-02-0174-117
<210> 49
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A3序列
<400> 49
Figure 104111213-A0305-02-0174-118
Figure 104111213-A0305-02-0175-119
<210> 50
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B序列
<400> 50
Figure 104111213-A0305-02-0176-120
<210> 51
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B序列
<400> 51
Figure 104111213-A0305-02-0176-121
Figure 104111213-A0305-02-0177-122
<210> 52
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B1序列
<400> 52
Figure 104111213-A0305-02-0177-124
<210> 53
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B1序列
<400> 53
Figure 104111213-A0305-02-0178-125
<210> 54
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B2序列
<400> 54
Figure 104111213-A0305-02-0178-126
Figure 104111213-A0305-02-0179-127
<210> 55
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B2序列
<400> 55
Figure 104111213-A0305-02-0179-128
Figure 104111213-A0305-02-0180-129
<210> 56
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B3序列
<400> 56
Figure 104111213-A0305-02-0180-130
<210> 57
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B3序列
<400> 57
Figure 104111213-A0305-02-0181-131
<210> 58
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-AB序列
<400> 58
Figure 104111213-A0305-02-0182-133
<210> 59
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-AB序列
<400> 59
Figure 104111213-A0305-02-0182-134
Figure 104111213-A0305-02-0183-16
Figure 104111213-A0305-02-0184-135
<210> 60
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-AB1序列
<400> 60
Figure 104111213-A0305-02-0184-136
Figure 104111213-A0305-02-0185-137
<210> 61
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-AB1序列
<400> 61
Figure 104111213-A0305-02-0185-138
Figure 104111213-A0305-02-0186-139
<210> 62
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼小鼠NME6之DNA
<400> 62
Figure 104111213-A0305-02-0186-140
Figure 104111213-A0305-02-0187-141
<210> 63
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠NME6
<400> 63
Figure 104111213-A0305-02-0187-142
Figure 104111213-A0305-02-0188-143
<210> 64
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼人類NME6之DNA
<400> 64
Figure 104111213-A0305-02-0188-144
Figure 104111213-A0305-02-0189-145
<210> 65
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME6
<400> 65
Figure 104111213-A0305-02-0189-146
Figure 104111213-A0305-02-0190-147
<210> 66
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼人類NME6 1之DNA
<400> 66
Figure 104111213-A0305-02-0190-148
<210> 67
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME6 1
<400> 67
Figure 104111213-A0305-02-0191-149
<210> 68
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼人類NME6 2之DNA
<400> 68
Figure 104111213-A0305-02-0192-150
<210> 69
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME6 2
<400> 69
Figure 104111213-A0305-02-0192-151
Figure 104111213-A0305-02-0193-152
<210> 70
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼人類NME6 3之DNA
<400> 70
Figure 104111213-A0305-02-0193-153
<210> 71
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME6 3
<400> 71
Figure 104111213-A0305-02-0194-154
Figure 104111213-A0305-02-0195-155
<210> 72
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME6序列
<400> 72
Figure 104111213-A0305-02-0195-156
<210> 73
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME6序列
<400> 73
Figure 104111213-A0305-02-0195-157
Figure 104111213-A0305-02-0196-158
<210> 74
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 1序列
<400> 74
Figure 104111213-A0305-02-0197-159
<210> 75
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 1序列
<400> 75
Figure 104111213-A0305-02-0197-160
Figure 104111213-A0305-02-0198-161
<210> 76
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 2序列
<400> 76
Figure 104111213-A0305-02-0198-162
Figure 104111213-A0305-02-0199-163
<210> 77
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 2序列
<400> 77
Figure 104111213-A0305-02-0199-164
Figure 104111213-A0305-02-0200-165
<210> 78
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 3序列
<400> 78
Figure 104111213-A0305-02-0201-166
<210> 79
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 針對大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 3序列
<400> 79
Figure 104111213-A0305-02-0201-167
Figure 104111213-A0305-02-0202-168
<210> 80
<211> 1306
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OriGene-NME7-1全長
<400> 80
Figure 104111213-A0305-02-0202-170
Figure 104111213-A0305-02-0203-171
<210> 81
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OriGene-NME7-1全長
<400> 81
Figure 104111213-A0305-02-0203-173
Figure 104111213-A0305-02-0204-17
Figure 104111213-A0305-02-0205-18
<210> 82
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Abnova NME7-1全長
<400> 82
Figure 104111213-A0305-02-0206-174
Figure 104111213-A0305-02-0207-19
<210> 83
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Abnova部分NME7-B
<400> 83
Figure 104111213-A0305-02-0208-175
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼組胺酸標籤之DNA
<400> 84
Figure 104111213-A0305-02-0208-176
<210> 85
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼Strept II標籤之DNA
<400> 85
Figure 104111213-A0305-02-0209-177
<210> 86
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-10肽
<400> 86
Figure 104111213-A0305-02-0209-178
<210> 87
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-10肽
<400> 87
Figure 104111213-A0305-02-0209-179
Figure 104111213-A0305-02-0210-180
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 88
Figure 104111213-A0305-02-0210-181
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 89
Figure 104111213-A0305-02-0210-182
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 90
Figure 104111213-A0305-02-0211-183
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 91
Figure 104111213-A0305-02-0211-184
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 92
Figure 104111213-A0305-02-0211-185
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 93
Figure 104111213-A0305-02-0211-186
<210> 94
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 94
Figure 104111213-A0305-02-0212-187
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 95
Figure 104111213-A0305-02-0212-188
<210> 96
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 96
Figure 104111213-A0305-02-0212-189
<210> 97
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 97
Figure 104111213-A0305-02-0213-190
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 98
Figure 104111213-A0305-02-0213-191
<210> 99
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 99
Figure 104111213-A0305-02-0213-192
Figure 104111213-A0305-02-0214-193
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 100
Figure 104111213-A0305-02-0214-194
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 101
Figure 104111213-A0305-02-0214-195
<210> 102
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 102
Figure 104111213-A0305-02-0214-196
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 103
Figure 104111213-A0305-02-0215-197
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 104
Figure 104111213-A0305-02-0215-198
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 105
Figure 104111213-A0305-02-0215-199
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 106
Figure 104111213-A0305-02-0216-200
<210> 107
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 107
Figure 104111213-A0305-02-0216-201
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 108
Figure 104111213-A0305-02-0216-202
<210> 109
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 109
Figure 104111213-A0305-02-0216-203
<210> 110
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 110
Figure 104111213-A0305-02-0217-204
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 111
Figure 104111213-A0305-02-0217-205
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 112
Figure 104111213-A0305-02-0217-206
<210> 113
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 113
Figure 104111213-A0305-02-0218-207
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 114
Figure 104111213-A0305-02-0218-208
<210> 115
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 115
Figure 104111213-A0305-02-0218-209
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 116
Figure 104111213-A0305-02-0219-210
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 117
Figure 104111213-A0305-02-0219-211
<210> 118
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 118
Figure 104111213-A0305-02-0219-212
<210> 119
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 119
Figure 104111213-A0305-02-0219-213
<210> 120
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 120
Figure 104111213-A0305-02-0220-214
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 121
Figure 104111213-A0305-02-0220-215
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 122
Figure 104111213-A0305-02-0220-216
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 123
Figure 104111213-A0305-02-0221-217
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 124
Figure 104111213-A0305-02-0221-218
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 125
Figure 104111213-A0305-02-0221-219
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 126
Figure 104111213-A0305-02-0221-220
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 127
Figure 104111213-A0305-02-0222-221
<210> 128
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 128
Figure 104111213-A0305-02-0222-222
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 129
Figure 104111213-A0305-02-0222-223
<210> 130
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 130
Figure 104111213-A0305-02-0223-224
<210> 131
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 131
Figure 104111213-A0305-02-0223-225
<210> 132
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 132
Figure 104111213-A0305-02-0223-226
<210> 133
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME7之免疫型肽
<400> 133
Figure 104111213-A0305-02-0223-227
Figure 104111213-A0305-02-0224-228
<210> 134
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME1之免疫型肽
<400> 134
Figure 104111213-A0305-02-0224-229
<210> 135
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME1之免疫型肽
<400> 135
Figure 104111213-A0305-02-0224-230
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME1之免疫型肽
<400> 136
Figure 104111213-A0305-02-0224-231
Figure 104111213-A0305-02-0225-232
<210> 137
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME1之免疫型肽
<400> 137
Figure 104111213-A0305-02-0225-233
<210> 138
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME1之免疫型肽
<400> 138
Figure 104111213-A0305-02-0225-234
<210> 139
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME1之免疫型肽
<400> 139
Figure 104111213-A0305-02-0226-235
<210> 140
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來源於人類NME1之免疫型肽
<400> 140
Figure 104111213-A0305-02-0226-236
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽A1
<400> 141
Figure 104111213-A0305-02-0226-237
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽A2
<400> 142
Figure 104111213-A0305-02-0226-238
<210> 143
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽B1
<400> 143
Figure 104111213-A0305-02-0227-239
<210> 144
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽B2
<400> 144
Figure 104111213-A0305-02-0227-241
<210> 145
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽B3
<400> 145
Figure 104111213-A0305-02-0227-242
<210> 146
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 a
<400> 146
Figure 104111213-A0305-02-0228-243
<210> 147
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 a
<400> 147
Figure 104111213-A0305-02-0229-244
Figure 104111213-A0305-02-0230-20
Figure 104111213-A0305-02-0231-245
<210> 148
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 b
<400> 148
Figure 104111213-A0305-02-0231-248
<210> 149
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 b
<400> 149
Figure 104111213-A0305-02-0232-249
Figure 104111213-A0305-02-0233-250
<210> 150
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-AB
<400> 150
Figure 104111213-A0305-02-0234-251
<210> 151
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-AB
<400> 151
Figure 104111213-A0305-02-0234-252
Figure 104111213-A0305-02-0235-21
Figure 104111213-A0305-02-0236-23
<210> 152
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 x1
<400> 152
Figure 104111213-A0305-02-0236-253
Figure 104111213-A0305-02-0237-254
<210> 153
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 x1
<400> 153
Figure 104111213-A0305-02-0237-255
Figure 104111213-A0305-02-0238-257
<210> 154
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 a(針對大腸桿菌表現最佳化)
<400> 154
Figure 104111213-A0305-02-0238-259
Figure 104111213-A0305-02-0239-260
<210> 155
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 a(針對大腸桿菌表現最佳化)
<400> 155
Figure 104111213-A0305-02-0239-261
Figure 104111213-A0305-02-0240-24
Figure 104111213-A0305-02-0241-25
<210> 156
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 b(針對大腸桿菌表現最佳化)
<400> 156
Figure 104111213-A0305-02-0241-262
Figure 104111213-A0305-02-0242-263
<210> 157
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 b(針對大腸桿菌表現最佳化)
<400> 157
Figure 104111213-A0305-02-0242-264
Figure 104111213-A0305-02-0243-27
Figure 104111213-A0305-02-0244-28
<210> 158
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-AB(針對大腸桿菌表現最佳化)
<400> 158
Figure 104111213-A0305-02-0244-265
Figure 104111213-A0305-02-0245-29
<210> 159
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7-AB(針對大腸桿菌表現最佳化)
<400> 159
Figure 104111213-A0305-02-0245-266
Figure 104111213-A0305-02-0246-30
<210> 160
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 X1(針對大腸桿菌表現最佳化)
<400> 160
Figure 104111213-A0305-02-0247-267
<210> 161
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類NME7 X1(針對大腸桿菌表現最佳化)
<400> 161
Figure 104111213-A0305-02-0247-268
Figure 104111213-A0305-02-0248-270
Figure 104111213-A0305-02-0249-35
<210> 162
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NME7之DM10結構域
<400> 162
Figure 104111213-A0305-02-0249-271

Claims (12)

  1. 一種針對NME7家族中之成員所產生之抗體的用途，其係用於製造用於治療或預防個體之癌症的醫藥品，其中該抗體係由於其結合至選自SEQ ID NO：141至145中列舉者之肽的能力而產生或選擇。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體結合於NME7。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體結合於NME7-AB或NME-AB樣(NME-AB-like)蛋白質。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體結合於NME7-X1。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體抑制NME7與其同源結合搭配物(cognate binding partner)之間的結合。
  6. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該同源結合搭配物為MUC1*。
  7. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該同源結合搭配物為該MUC1*細胞外結構域之PSMGFR部分。
  8. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該肽包含與SEQ ID NO：141至145中列舉之該等肽高度同源或在該等肽之N端或C端添加或減去至多7個胺基酸殘基之肽。
  9. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體係由於其結合至NME7-AB或NME7-X1但不結合至NME1之能力而選擇。
  10. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體為多株、單株、二價、單價、雙特異性、含有可變區之抗體片段或抗體模擬物(antibody mimic)。
  11. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體為人類的或經人類化。
  12. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抗體為單鏈scFv。
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