TWI620574B - 口蹄疫合成胜肽緊急疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種合成FMD胜肽免疫原與其組成物，以及使用FMD胜肽免疫原偵測、治療與抑制FMD感染的方法。在一特定實施例中，本發明提供一種口蹄疫的胜肽緊急疫苗及其配方。本發明疫苗配方含有FMDV VP1蛋白胜肽混合物，各個含B細胞FMDV中和/受體結合抗原決定位序列的胜肽連接至一人工Th抗原決定位，以促進各胜肽的免疫原。本發明之疫苗配方含有病毒免疫原，可選擇性地輔以具有FMDV內源性Th抗原決定位的混合物、同源物及其功能類似物。本發明病毒胜肽組成物可與可接受之傳遞系統製成一疫苗配方，此在僅接種1次的情況下可保護豬、牛抵抗FMDV攻毒。
Description
本發明係有關於控制口蹄疫之口蹄疫病毒(FMDV)胜肽緊急疫苗及其配方。
口蹄疫(FMD)是最具感染性的動物疾病。引發疾病的口蹄疫病毒(FMDV)屬於小核糖核酸病毒家族的口蹄疫屬，其具有編碼4個衣殼蛋白(VP1-VP4)與非結構胜肽(2A-2C與3A-3D)的正股RNA基因(參照Carrillo,C.et al,2005)。
FMDV可快速地複製，且在被感染與未接觸感受性動物(包括偶蹄類動物，例如，牛、豬、山羊、綿羊)的情況下經由空氣(氣霧傳播)傳播。FMD被世界動物衛生組織(OIE)列為A表的動物傳染性疾病，且被認定是影響動物與動物產品在國際貿易上最重要的疾病。目前，FMD以隔離檢疫及撲殺被感染與暴露的動物來控制；且在大部分的國家接種化學去活化病毒疫苗。由於疫苗接種會不利於經濟發展，因此各國皆運用各種手段以維持在不接種疫苗而保持無病毒的狀態下。
目前已知7種不同的FMDV血清型，每種血清型包括多種亞型。這些血清型包括：A、O、C、亞洲(Asia)與南非型(South African)SAT-1、2與3，其中A、O與Asia型最為常見。再加上病毒基因的複雜性與多變性，FMDV具隨機性的高度變異。
製備FMDV疫苗的困難在於病毒抗原顯著的變異性與在各亞型間無交叉保護。亦言之，即使接種疫苗的動
物，仍容易感染其它6種血清型的病毒。此外，侷限於血清型內的抗原變異，導致疫苗僅可抵抗一種亞型，而無法抵抗相同血清型中的其它亞型。
目前FMD疫苗含有各種相關血清型或亞型的去
活化病毒標準病毒株，其係利用監測當地流行的病毒株來確定。為了避免FMD變異株的擴散，必須定期監測田間分離株並與目前使用的疫苗進行比較。因此，為確保疫苗為符合目前流行的病毒且具有效果，去活化FMD病毒的生產需要：(1)培養並去活化多種病毒株，(2)監測每個去活化病毒株的力價及效力，以及(3)定期更新疫苗組成來包含目前流行的病毒株，以避免因新變異株導致保護力的消失。
有鑑於在FMDV血清型主要抗原的變異，生產與
維持一有效的去活化病毒疫苗非常費力且複雜。幾種已知FMDV去活化疫苗的問題和缺點包括：生物危害和生物安全風險，產品的不穩定性和多變性，以及對治療動物之意外、有害的副作用。
例如，由於病毒必須在高圍堵設施內進行培養以
避免污染環境，因此製備去活化病毒疫苗會產生生物危害和生物安全風險。事實上，追溯幾個最近在歐洲發生的FMDV案例即是來自於病毒的不完全去活化。這些潛在的生物危害和生物安全風險限制了合格疫苗廠的數量。此限制也阻礙一個地區對疫情爆發有效且立即性的回應。
目前的FMD疫苗也不穩定且每批具有差異。如
上所述，必須定期監測且重新配製疫苗以包含目前與新的FMDV病毒株。此外，世界上每個地區在任何時間都需要保護抵抗目前/新的、不同的FMDV病毒株。因此，複雜且未定義的去活化病毒疫苗在世界各地生產。這些複雜的去活化病毒疫苗必須持續地定期檢查以確保免疫力價。
此外，目前FMDV疫苗已顯示會導致接種動物產
生意想不到、有害的副作用。例如，已有動物在接種目前的
疫苗後產生過敏反應、過敏性休克、自發死亡的報導。
現有去活化病毒疫苗的缺點，促使進一步研究開
發更安全且更好的次單位疫苗(Brown,F.1992)。然而，為取代去活化疫苗，次單位疫苗必須具有與去活化病毒疫苗相同的免疫原性以提供寬廣的保護力以抵抗抗原變異。更重要的是，為了作為FMD緊急疫苗，次單位疫苗需要符合OIE對於田間試驗的規範，疫苗僅注射1次。
為了克服現存商品化之FMD病毒疫苗的問題，
發明人及其團隊研究超過15年開發FMDV合成肽疫苗以保護豬抵抗FMDV攻毒。特別是，發明人成功地開發一有效地FMDV疫苗，其利用含有優化VP1環狀B細胞抗原決定位胜肽的配方，誘發寬廣的中和抗體以抵抗FMDV。利用共價連接胜肽與人工T輔助細胞抗原決定位，以進一步誘發VP1環狀B細胞抗原決定位胜肽的免疫原性(Wang,CY and Shen,M,2000；Wang,CY et al,2001；Wang,CY,et al,2002)。此疫苗已顯示在接種數次後可有效地保護豬隻抵抗FMDV的攻毒(Wang,CY,et al.2002)。VP1環狀B細胞抗原決定位胜肽已證實在保護傳統FMDV病毒上是一重要的疫苗。
為符合OIE規範的“緊急”FMD疫苗，必須在
接種一次後，即可促進可覆蓋FMD血清型之寬廣的快速保護性免疫。雖然接種多次VP1環狀B細胞抗原決定位胜肽可提供有效的保護效果以抵抗傳統的FMDV病毒株，但在緊急情況下，單一接種仍無法保護豬隻抵抗FMDV。再者，VP1環狀B細胞抗原決定位胜肽並未顯示在接種1或數次後，可保護牛隻抵抗FMDV的攻毒(Rodriguez,LL.et al.2003)。
因此有必要大量探討公共衛生領域的文獻，辨識
及驗證FMD緊急疫苗所需之保護性免疫反應，以開發出可用於FMDV的緊急以及一般保護之安全且有效的FMD胜肽疫苗及其配方。
有鑑於現存FMD疫苗的的缺點與限制，業界仍
亟需接種1次即可保護豬、牛抵抗口蹄疫病毒的急疫苗配方。
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本發明係有關於用於檢測、治療及/或預防動物口蹄疫的合成胜肽。此合成胜肽包括胜肽抗原，其可靈敏且專一性地偵測動物的FMD感染。此合成胜肽更包括具有B細胞(B)與T輔助細胞(Th)抗原決定位的胜肽免疫原，其可一起作用以刺激產生針對FMD感染的保護性免疫反應。在特定實施例中，合成胜肽為胜肽抗原與胜肽免疫原。在某些實施例中，合成胜肽可用於偵測動物體內FMD病毒(FMDV)抗體的存在。在其它實施例中，合成胜肽可用於治療FMDV陽性動物及/或暴露於FMDV陽性動物中的動物。在本發明其它實施例中，合成胜肽可用於防止動物感染FMD。
本發明更揭露有關於含此合成胜肽的組成物。此組成物可用於偵測、治療及/或預防FMD。在特定實施例中，含合成胜肽之組成物可用於偵測樣本中FMDV抗體的存在。在其它實施例中，合成胜肽之組成物用於治療及/或預防動物感染FMD的藥學組成物。在一特定實施例中，此藥學組成物可刺激動物體內的FMDV免疫反應。在一特定實施例中，此藥學組成物為疫苗組成物，其可預防動物暴露於病毒而感染FMD。
本發明更揭露偵測、治療及/或預防動物感染FMD的方法。此方法利用本發明之合成胜肽與含此合成胜肽的組成物。
在特定實施例中，本發明有關於一胜肽藥學組成
物，其為一符合OIE規範的緊急疫苗，在單一接種後，可提供動物充足且足夠的保護以抵抗FMD感染。在某些實施例中，本發明之藥學組成可用作緊急疫苗，其含有類似於天然FMD蛋白的抗原位胜肽免疫原與源自於內源性T細胞抗原決定位的病原體蛋白。此組成可有效地刺激針對目標FMD蛋白的功能性抗體以保護動物。
在各種實施例中，合成胜肽免疫原可含有具B
細胞抗原決定位之VP1環狀胜肽，其可刺激針對FMDV(SEQ ID NOs：1與2)、其同源序列(如SEQ ID NOs：3-23、96-99)及其組合的中和抗體。
此VP1環狀胜肽也含有T輔助細胞抗原決定位
(SEQ ID NO：24)，其共價連接至胜肽抗原的胺基(N-端)或羧基(C-端)以促進B細胞抗原胜肽的免疫原性(如SEQ ID NOs：25-33、100-102)。在特定變化中，胜肽免疫原輔以具T輔助細胞抗原決定位的胜肽混合物以提供宿主細胞性免疫。此胜肽包括源自於FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B與3D蛋白的T輔助細胞抗原決定位(如SEQ ID NOs：34-63)，其同源胜肽及功能類似物，以及組合序列衍生之胜肽資料庫(combinatorial sequences derived library peptides)(如SEQ ID NOs：64-87)與UBITh®增強卡匣(UBITh® enhanced cassette form)設計之FMDV Th抗原決定位胜肽(如SEQ ID NOs：88-95)。
本發明更提供刺激抗體與細胞性免疫以抵抗
FMDV的方法。此方法提供不含FMDV抗體之動物對FMDV攻毒的交叉保護。在特定實施例中，此方法包括給予動物一含有FMDV B與T輔助細胞抗原決定位叢胜肽的藥學組成物。
本發明另提供一種FMDV免疫原胜肽、含此胜肽
之緊急疫苗之低製造成本且品質控管的方法，以及於緊急情況下僅接種一次疫苗配方即可保護動物抵抗FMDV攻毒的傳輸系統。
第1圖顯示本發明B與Th抗原決定位在FMDV蛋白上的分佈與位置。圖中的胺基酸為FMDV OTaiwan 99基因序列。各基因產物的名稱(VP4、VP2、VP3、VP1+2A、2B+2C、3A+3B1+B2、B3、3C與3D)依據其編碼蛋白的大小以空白條狀表示。B與T細胞抗原決定位也依據其大小(胺基酸的數目)與位置(蛋白質中的抗原決定位胺基酸)，以其第1、最後胺基酸及其編號表示(例如，VP4：S221-M235，表示T細胞抗原決定位的長度為15個胺基酸，為VP4蛋白中第221位的絲胺酸(Serine)至第235位的蛋胺酸(Methionine))。
第2圖為本發明疫苗開發由疫苗研究至商業化的流程圖。
第3A圖顯示牛在接種2劑UBITh®® VP1疫苗(SEQ ID NO：25)的中和抗體(NA)力價。15頭無FMDV的牛，6-12個月，在第0、3週進行免疫。於免疫後第0、6週採集血清以分析NA。
第3B圖顯示豬在接種2劑UBITh®® VP1疫苗(SEQ ID NO：25)的中和抗體(NA)力價。15頭無FMDV的豬，3-5週齡，在第0、3週進行免疫。於免疫後第0、6週採集血清以分析NA。
第4A圖顯示豬在接種1次含10：1重量比之VP1 B抗原決定位(OConsensus SEQ ID NO：25)與UBITh®增強內源性FMDV Th卡匣叢胜肽(SEQ ID NO：90)的疫苗後，豬體內PBMCs刺激的細胞性免疫反應(IFN-α的產生)，疫苗為ISA50V2油
包水(w/o 50/50)乳化物，每劑量27.5μg/mL。每週採集動物血液，並分析PBMCs回應疫苗胜肽抗原與IFN-γ反應的能力，如實施例3所述。
第4B圖顯示豬在接種1次含10：1重量比之VP1 B抗原決定位(OConsensus SEQ ID NO：25)與UBITh®增強內源性FMDV Th卡匣叢胜肽(SEQ ID NO：90)的疫苗後，豬體內PBMCs刺激細胞性免疫反應(IFN-γ的產生)，疫苗為ISA50V2油包水(w/o 50/50)乳化物，每劑量27.5μg/mL(填滿方塊■)，未接種之負對照組動物(空白方塊O)。在攻毒前第28天採血，且將最終值減去第0天的基準值進行校正。
本發明揭露可用於偵測、治療及/或抑制動物口蹄疫(FMD)的合成胜肽。本發明之合成胜肽包括可靈敏及專一性地偵測動物體內FMD病毒抗體的胜肽抗原。此胜肽也包括具有B細胞(B)及T輔助細胞(Th)抗原決定位的胜肽，其可共同誘發針對FMD感染的保護性免疫。在特定實施例中，合成胜肽同時為胜肽抗原與胜肽免疫原。在某些實施例中，合成胜肽可用於偵測動物體內FMD病毒(FMDV)的存在。在其他實施例中，合成胜肽用於治療經檢測為FMDV陽性及/或曝露於呈FMDV陽性動物的動物。在其他實施例中，合成胜肽用於抑制動物的FMD感染。
本發明更有關於含合成胜肽的組成物。此組成物可用於偵測、治療及/或抑制動物的FMD。在特定實施例中，含合成胜肽的組成物用於偵測樣本中FMDV的存在。在其他實施例中，含合成胜肽的組成物可用於治療及/或防止FMD感染的藥學組成物。在一特定實施例中，此藥學組成物可用於刺激動物體內的FMDV免疫反應。在一特定實施例中，此藥
學組成物為一疫苗組成物，其可防止動物因曝露於FMD病毒而感染FMD。
本發明更揭露偵測、治療及/或防止動物感染FMD的方法。此方法用於使用合成胜肽及含此合成胜肽的組成物。
a. B細胞抗原決定位-FMDV合成胜肽免疫原
利用比對與評估B細胞抗原位於多種、同源FMDV O血清型的VP1結構蛋白以獲得合成胜肽免疫原的胺基酸序列。如表二所示之比對結果，獲得25個胺基酸的抗原共有序而(consensus sequence)，對應於全長FMDV VP1結構蛋白的第134至158位的胺基酸(SEQ ID NO：1)。(全長的VP1序列可參照Genbank Accession No.NP_740460)。對應於第134至158位的胺基酸可以半胱胺酸取代，使胜肽形成內雙硫環結構(intra-disulfide loop structure)。另亦由比對結果獲得含41個胺基酸的較長FMDV抗原共有胜肽(SEQ ID NO：2)。此第二共有序列包括SEQ ID NO：1與包含額外的N端及C端側序列。第二個共有序列對應於全長FMDV VP1結構蛋白的第129至168位殘基，且第134與158位經半胱胺酸取代。此二種共有序列如表一所示。
利用類似的同源比對，同樣也可獲得源自O、Asia 1、A血清型之VP1 B細胞抗原決定位的共有序列，如表二中的SEQ ID NOs：2、12、16所示。各共有序列中可變位置的胺基酸是根據各血清型在這些位置上最常出現的胺基酸。
合成胜肽免疫原SEQ ID NO：1、2有效且可接受的變異包括免疫性功能同源物，其具有源自FMDV突變與變異株相對應的序列與結構。同源FMDV抗原胜肽具有與原變異FMDV OTaiwan病毒株第129至168位的VP1結構蛋白及源自各FMDV O血清型病毒株共有序列密切相關的胺基酸(Mason,PW et al,2003)。此同源物可輕易地藉由序列比對軟體，如
ClustalW(Julie D.Thompson,Toby Gibson of European Molecular Biology Laboratory,Germany and Desmond Higgins of European Bioinformatics Institute,Cambridge,UK.Algorithmic)確定。表二顯示FMDV OConsensus序列(2570a，SEQ ID NO：2)與多個血清型及衍生病毒株(OCampos,OTaiwan,OMyanmar,OOzk,OLanzou,Asia 1Yunnan,Asia 1Jiansu,A24,AGansu,AXinjiang,CIndaial,C3Belgium,C3Argentina,etc)之FMDV VP1結構蛋白的22個抗原序列(SEQ ID NOs：3至23)。
本發明更包括額外的VP1同源物，其包括含有“RGD”(Arg-Gly-Asp)細胞受器結合序列的胜肽與蛋白，其不變地存在於所有FMDV病毒株VP1序列的環狀結構中。RGD序列對應至VP1蛋白的第145至147位胺基酸。
如表二所示，“RGD”序列下游(朝向C端)的胺基酸數目在各VP1序列中彼此相同。然而，RGD序列的上游(朝向N端)胺基酸數目會因特定的血清型(如O、Asia 1、A或C)而有所不同。在各血清型中，末端序列與特定血清型之共有序列具有至少75%的相似性(如，SEQ ID NOs：13至15與Asia 1血清型的SEQ ID NO：12相比；SEQ ID NOs：17至19與A血清型的SEQ ID NO：16相比)。在一實施例中，變異的OMyanmar/7/02株同源物(SEQ ID NO：7)與SEQ ID NO：2(共有序列中不同的殘基以陰影顯示)具有超過85%相似性。在另一實施例，變異株OOzk/93同源物(SEQ ID NO：8)與SEQ ID NO：2(共有序列中不同的殘基以陰影顯示)具有約90%的相似性。
如表2所示，同源VP1胜肽可以一適當的比例合併並給予至一動物中，以有效地刺激針對特定FMDV病毒株的中和抗體。因此，含有同源VP1胜肽的藥學組成物是有效的FMD疫苗。例如，含有同源VP1胜肽胜肽，以油包水(w/o)乳化(如與ISA50V2)或水包油包水(w/o/w)乳化的配方(乳化劑)可有效地抑制FMD感染。
如以下各種實施例所示，其揭露含有多種VP1
序列胜肽的組成物。例如，實施例6、7、9、及10揭露一多價FMDV豬及/或牛疫苗組成物，包括3種對應於OConsensus、Oswine/cattle/O/Mya/7/02(簡稱OMyanmar)與OOzk/93(簡稱OOzk)序列之FMDV O型VP1胜肽的組合。此組成物含有此胜肽組合物，其可產生一種強大的三價豬疫苗以抵抗多種不同O型病毒株的感染。同樣地，一種使用具OConsensus(2570a)、Asia 1JiangSu/China/2005(簡稱Asia 1JiangSu)、與AGansu/China/60Y(簡稱AGansu)之VP1胜肽組合的多血清型疫苗，可經混合以形成三價牛疫苗以抵抗中國多種不同O型病毒株的感染。此外，一種含有OCanpos/Brazil/58Y(簡稱OCampos)、A24 Cruzeiro California(簡稱A24)、與CIndaial/Brazil/84Y(簡稱CIndaial)VP1序列胜肽組合，其為適合使用於南美洲之有效的多血清型牛疫苗，可有效地抵抗南美洲多種流行之FMD病毒株的感染。
本發明之合成胜肽可包括擇自於FMDV VP1蛋
白上的B細胞抗原決定位，第1圖顯示其相對於FMDV其它位置與蛋白。此蛋白序列為FMDV OTaiwan 99基因體/編碼胺基酸序列的序列(GenBank登錄號AJ539137)。
合成胜肽免疫原的免疫功能類似物同樣可有效
地刺激動物的免疫反應，且也為本發明的一部分。免疫功能類似物包括SEQ ID NOs：1、2、12與16的共有序列及/或SEQ ID NOs：3-11、13-15與17-23同源物的變異物，其可實質上保存與原胜肽相同的抗原性及免疫原性。例如，變異物其屬於功能類似物，其在一胺基酸位置上有一保守取代、整體電荷中有一個改變、共價連接至另一部分、或胺基酸的增加、插入或刪除、及/或其任何組合。
保守取代是一胺基酸殘基被取代為其它具類似
化學特性的胺基酸殘基。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸與蛋胺酸；極性中性酸基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇
胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺與谷氨醯胺；正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、賴胺酸與組胺酸；以及負電荷(酸性)胺基酸包括天門冬胺酸與谷胺酸。
在一實施例中，特定胜肽的免疫功能性類似物含
有與原胜肽相同的胺基酸序列，且在胜肽的胺基端更包括3個賴胺酸(Lys-Lys-Lys)。在此實施例中，原胜肽包含3個賴胺酸會改變原胜肽的整體電荷，但不會改變原胜肽的功能。
在一特定實施例中，此功能類似物與原胺基酸序
列具有至少50%的相似性。在另一實施例中，此功能類似物與原胺基酸序列具有至少80%的相似性。在另一實施例中，此功能類似物與原胺基酸序列具有至少85%的相似性。在其它實施例中，此功能類似物與原胺基酸序列具有至少90%的相似性。
b. FMDV內源性T輔助(Th)抗原決定位
含有合成免疫原胜肽的組成物包括FMDV內源性Th抗原決定位胜肽。藥學/疫苗配方含有Th抗原決定位可驅使抗原特異性的T細胞活化，以提供經免疫動物的免疫反應，此為產生FMDV保護作用的重要因素。此外，此配方含有刻意選擇FMDV蛋白上具免疫優勢的Th抗原決定位，可產生寬廣的細胞性免疫，其使得本發明之配方可有效地治療及保護具不同遺傳特性的動物，如牛。
以單次接種合併B細胞抗原決定位與T輔助抗原決定位胜肽配方以免疫動物後，因自然感染或FMDV攻毒試驗而暴露FMDV時，可驅使淋巴細胞的增生反應。此增生反應可促使細胞因子的生成，如IFN-γ的產生，其可促進動物對不同細胞病變病毒感染的細胞性免疫。
在經含Th抗原決定位之FMD配方/疫苗免疫的宿主動物中，以in vitro T細胞增生分析、in vivo與in vitro細胞因子IFN-γ生成評估可確定SEQ ID NOs：34-63的抗原決
定位胜肽。此外，分析含有(a)FMDV B抗原決定位叢與(b)FMDV內源性Th抗原決定位大型組合庫的配方，以確定適當的藥學組成物，其可在具不同遺傳背景的不同宿主動物(如，牛)中，有效及持續地產生必需的細胞性免疫。除了監測經免疫/接種宿主中的in vitro IFN-γ生成，也可監測僅單次接種配方之宿主中可抵抗FMDV的中和抗體。
在各種實施例中，FMDV內源性Th抗原決定位
胜肽擇自於FMDV蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、3A、3B與3D的抗原片段。表4顯示當FMDV內源性Th胜肽(SEQ ID NOs：34-63)使用於本發明之配方時，這些胜肽是有效的。
特別是，表4所示之FMDV內源性Th胜肽可由經(a)FMDV病毒溶解(viral lysate)配方/疫苗，與(b)含有FMDV候選Th胜肽的胜肽配方免疫之宿主所獲得的豬與牛T細胞所辨識。FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B與3D蛋白中的Th抗原決定位(如表4所示)，第1圖顯示其相對於其它FMDV的區域與蛋白的分佈與位置，如第1圖所示。
此蛋白序列為FMDV OTaiwan 99基因體/編碼胺基酸序列的序列(GenBank登錄號AJ539137)。
本發明更包括表4所示Th抗原決定位的同源
物。例如，SEQ ID NOs：64-78為FMDV OTAW/2/99(Genbank登錄號AJ539137)之Th抗原決定位序列的同源物。表5提供FMDV OTaiwan/99與FMDV OTAW/2/99同源Th抗原決定位的序列比對。特別是，表5比對FMDV 3D蛋白(SEQ ID NOs：61 vs 64；62 vs 65；63 vs 66；60 vs 71與72)、FMDV 2B蛋白(SEQ ID NOs：48 vs 67與68)、FMDV 3A蛋白(SEQ ID NOs：53 vs 69與70),FMDV VP4蛋白(SEQ ID NOs：34 vs 73與74)、FMDV VP2蛋白(SEQ ID NOs：36 vs 75與76)、FMDV VP3蛋白(SEQ ID NOs：37 vs 77與78)的同源Th抗原決定位。
本發明更包括FMDV內源性Th抗原決定位胜肽
的免疫功能類似物。免疫功能類似物包括SEQ ID NOs：34-63
的變異體及/或SEQ ID NOs：64-78的同源物，其保有實質上與原胜肽相同的免疫原性。例如，變異物屬於功能類似物，其在一胺基酸位置上有一保守取代、整體電荷中有一個改變、共價連接至另一部分、或胺基酸的增加、插入或刪除、及/或其任何組合。
保守取代是一胺基酸殘基被取代為其它具類似
化學特性的胺基酸殘基。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸與蛋胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺與谷氨醯胺；正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、賴胺酸與組胺酸；以及負電荷(酸性)胺基酸包括天門冬胺酸與谷胺酸。
在一特定實施例中，此功能類似物與原胺基酸序
列具有至少50%的相似性。在另一實施例中，此功能類似物與原胺基酸序列具有至少80%的相似性。在另一實施例中，此功能類似物與原胺基酸序列具有至少85%的相似性。在其它實施例中，此功能類似物與原胺基酸序列具有至少90%的相似性。
在一實施例中，特定胜肽的免疫功能類似物含有
與原胜肽相同的胺基酸序列，且在胜肽的胺基端更包括3個賴胺酸(Lys-Lys-Lys)。在此實施例中，原胜肽包含3個賴胺酸會改變原胜肽的整體電荷，但不會改變原胜肽的功能。
表6顯示Th抗原決定位胜肽的其它功能類似物
變異體。特別是，SEQ ID NOs：39與40為其它的功能類似物，其在C-端有4個胺基酸刪除(SEQ ID NO：39)或增加(SEQ ID NO：40)。此兩種類似物序列的差異不會影響含這些序列之Th抗原決定位的功能。
在其它變異體中，FMDV內源性Th抗原決定位
可為一組合序列(combinaterial sequence)，其含有特定胜肽同源物骨架中特定位置之胺基酸殘基的組合。在合成程序中，
可利用添加特定的保護胺基酸來取代一特定位置的胺基酸以合成組合胜肽集合。此組合FMDV內源性Th抗原決定位集合可獲得寬廣的Th抗原決定位以覆蓋不同遺傳背景的動物。FMDV內源性Th抗原決定的代表組合序列包括SEQ ID NOs：79-87，如表7所示。這些組合序列源自於SEQ ID NOs：34-63(如表4所示)，為代表性的FMDV內源性Th抗原決定位。
在各種實施例中，可在單一胜肽中利用共同連接多個FMDV內源性Th抗原決定位以促進T細胞免疫原性。共同連接的Th抗原決定位序列可為相同的Th抗原決定位(以產生一具重覆Th抗原決定位序列的胜肽)、不同的Th抗原決定位(以產生一具不同Th抗原決定位序列的胜肽)、或其組合。此外，Th抗原決定位序列可共同連接或不連接一間隔子。在一特定實施例中，間隔子可促進一含多個FMDV Th抗原決定位之胜肽於細胞內適當的位置斷裂成單一序列。在某些實施例中，間隔子包括一胺基酸。在一較佳實施例中，間隔子為賴胺酸。
本發明之抗原決定位胜肽提供不同基因族群動物寬廣的反應性與免疫原性。在本發明配方中較佳之胜肽包括含有多個FMDV Th抗原決定位叢的胜肽，如SEQ ID NOs：34-78；以及含Th抗原決定位序列組合序列的胜肽，如SEQ ID NOs：79-87。在特定實施例中，FMDV內源性Th抗原決定位叢胜肽可連接Th抗原決定位與人工Th(UBITh®)(SEQ ID NO：24)以進一步促進T細胞免疫原性，如表7所示(SEQ ID NOs：88-95)。
c.間隔子
合成FMDV胜肽免疫原、其同源物及類似物可利用、或不利用一間隔子，共價連接至一含已知Th抗原決定位的胜肽。此連接的胜肽可提供比未連接Th抗原決定位胜肽之相同免疫原更強的免疫原性。
在某些實施例中，含一人工Th抗原決定位的胜
肽共價連接至一合成FMDV胜肽免疫原的N-端。在其它實施例中，一間隔子介於二個序列之間。間隔子較佳為單一胺基酸ε NLys。在一特定實施例，人工Th抗原決定位SEQ ID NO：24透過一ε NLys間隔子(如表3所示之SEQ ID NO：25)共價連接至合成FMDV胜肽免疫原SEQ ID NO：2。額外含一Th抗原決定位序列的胜肽可共價連接至一合成FMD胜肽免疫原的胺基端，如表3所示。特別是，抗原決定位胜肽SEQ ID NO：24透過一ε NLys間隔子(SEQ ID NOs：25至33)連接至不同之合成FMD胜肽免疫原的胺基端。
d.組成物
以下內容有關於含有合成胜肽的組成物。本發明組成物可用於偵測、治療及/或防止動物的FMD。在特定實施例中，含有FMDV B細胞抗原決定位合成胜肽的組成物可用於偵測樣本中FMDV抗體的存在。在其它實施例中，含有FMDV B細胞抗原決定位之合成胜肽的組成物為治療及/或防止動物感染FMD的藥學組成物。在特定實施例中，含FMDV B細胞抗原決定位胜肽的藥學組成物可刺激動物體內針對FMDV的免疫反應。含FMDV B細胞抗原決定位合成胜肽的藥學組成物可作為FMDV疫苗。
含有合成FMDV胜肽免疫原的藥學組成物可有
效地刺激針對FMD蛋白的功能性抗體以保護動抵抗FMD攻毒。事實上，接種單一劑量藥學組成物之動物可充份且適當地抵抗FMD感染。因此，不需要多次接種或加強劑量(booster doses)來提供動物對FMD感染完整的保護。所以，含合成FMDV胜肽免疫原的藥學組成物足以作為符合OIE規範的緊急疫苗。
本發明組成物可含有一或多個合成FMDV胜肽
免疫原。例如，組成物可含有表1所示之共有序列(SEQ ID NOs：
1或2)、及/或表2所示之其同源物或類似物、及/或其組合之合成FMDV胜肽免疫原。此外，組成物中的FMDV胜肽免疫原可連接至一人工組合T輔助抗原決定位，以促進組成物的B細胞免疫原性。在一較佳實施例中，合成FMDV胜肽免疫原可連接至一人工組合T輔助抗原決定位SEQ ID NO：24。表3顯示源自各種血清型之代表性的FMDV VP1胜肽免疫原。
含FMDV胜肽免疫原的組成物更含有一或多個
FMDV內源性Th抗原決定位胜肽。例如，此組成物可包括源自FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B與3D蛋白的Th抗原決定位胜肽。組成物中較佳之抗原決定位胜肽包括表4、5、6、7所示之胜肽(SEQ ID NOs：34-95)及實施例9、10中表18、19、25及26所示之胜肽。藥學組成物、疫苗配方在單一接種下，即可刺激FMDV-特異性抗體反應與驅使胜肽抗原特異性-T細胞反應的開始，可保護豬與牛抵抗FMDV的感染。
此外，在一藥學上可接受之傳遞系統中，組成物
可含有載體及/或其它添加物。因此，含有合成FMDV胜肽免疫原的組成物可利用佐劑、藥學上可接受之載體或其他常用於疫苗中的成分製成一藥學疫苗配方。可用於本發明之成分為佐劑或乳化劑，包括明礬、不完全Freund's佐劑、liposyn、皂素、角鯊烯、L121、Emulsigen、單磷醯脂A(MPL)、QS21、ISA 35、ISA 206、ISA50V2、ISA 720及其它有效的佐劑與乳化劑。在一特定實施例中，傳遞載體及佐劑為MontanideTM ISA 50V2(一種含植物油與二縮甘露醇油酸的油性疫苗佐劑組成物以產生油包水乳化物)、Tween® 80(為聚氧乙烯80或聚氧乙烯(20)山梨醇單油酸酯)、CpG寡核酸、及/或其任意組合。
在其它實施例中，本發明藥學組成物為以Emulsigen或Emulsigen D(實施例9，表19的第27、28、31與32組)作為佐劑的水包油包水(w/o/w)乳化物。本發明更提供疫苗配方其它常用的成分，與劑量(實施例9、10)的使用說明，以
致於在單一接種後可提供平衡的B與T細胞免疫反應以及抵抗病毒的攻毒。
藥學組成物可製成速釋或緩釋劑型。此外，藥學
組成物可利用免疫原包埋及共給予微脂粒，以用於系統性誘發、或局部黏膜的免疫性。此技術領域人士可輕易地完成此傳遞系統。
含本發明胜肽的各種疫苗配方可有效地保護有蹄動物抵抗FMDV。例如，藥學組成物為一有效的FMDV疫苗配方，其含有合成FMDV胜肽免疫原及獸藥可接受之傳遞系統或佐劑，其中合成FMDV胜肽免疫原具有一胺基酸序列，其擇自於下所組成之族群：a)SEQ ID NOs：1-2；b)一(a)之同源物；c)一(a)或(b)的抗原性及免疫原性功能類似物；d)具有至少一保守胺基酸取代、胺基酸增加及/或胺基酸刪除的(a)、(b)或(c)；以及e)(a)-(d)的任意組合。
在一特定組成中，合成FMD胜肽免疫原擇自於SEQ ID NOs：2、7與8。
在其一配方中，此組成物包括一透過一間隔子連接一人工組合合成Th胜肽的FMD胜肽免疫原，其具有SEQ ID NO：25的序列。
其它配方更含有等重量比之SEQ ID NOs：34至63的30種FMDV Th抗原決定位，每劑量的含量介於約0.1μg至約1mg。在一特定配方中，等重量比之SEQ ID NOs：34至63的含量為每劑量介於約1μg至約100μg。
在其它配方中，於獸藥可接受之載體或佐劑中，此組成物包括一SEQ ID NOs：25、27、28之合成FMDV胜肽抗原的混合物與一等重量比SEQ ID NOs：34至63之FMDV內源性Th抗原決定位胜肽庫，其中每劑量胜肽抗原的含量介於
約10μg至約1mg。
e.給予
藥學組成物與疫苗配方可利用任可方便的途徑，包括皮下、口服、肌肉、或其它腸外或腸內途徑給予。同樣地，疫苗可單次給予或多次給予。免疫時程為此技術領域人士可輕易得知。
此藥學組成物被製備成含有一有效量之合成胜
肽與一藥學上可接受之載體。此藥學組成物更包括一適當的劑量，一般含有約0.5μg至約1mg的免疫原/體重kg。當給予多個劑量時，此藥學組成物可容易地分成一適當的每單位劑量。給予的劑量可依據個體的年齡、體重與健康情形來決定，此為疫苗與治療技術領域人士所習知。
含有合成FMDV胜肽免疫原之藥學組成物，如疫
苗配方，即使是單一給予(接種)，也可產生一有效反應。這些藥學組成物的單一接種可足夠地保護具不同T輔助細胞族群的動物，如豬、牛、綿羊、山羊及其它感受性野生物種。
特別是，合併含有合成FMDV胜肽免疫原與Th抗原決定位胜肽之藥學組成物可刺激均衡的B(中和抗體)與T細胞(細胞因子的釋放等)免疫反應，以保護動物抵抗後續的攻毒。
依據OIE、台灣與中國的規範，對合併含有合成
FMDV胜肽免疫原與Th抗原決定位胜肽之藥學組成物的單次給予(接種)進行評估(如實施例9、10所示)。經重覆與可再現的試驗結果證實此配方可有效地保護經免疫的宿主抵抗FMD感染。因此，這些試驗證實了FMDV配方的設計，且此FMDV配方可作為一動物FMDV緊急疫苗。
f.製備方法
本發明更有關於製造此合成FMDV胜肽免疫原、Th抗原決定位胜肽、組成物與藥學組成物的方法，以刺激免疫反應
及保護動物抵抗FMDV的感染。
合成FMDV胜肽免疫原可提供許多比傳統不活
化病毒疫苗更佳的優點。例如，傳統不活化病毒疫苗避必須有昂貴的生物防護設備、對實驗室工作人員有嚴重的生物危害性風險、以及設備污染/程序失敗的公共事件。相較之下，在胜肽抗原的製造中不使用危險的生物材料，大幅地降低健康和安全風險，且不需要昂貴的生物防護設備。此外，特異性位點免疫原(site-specific immunogen)呈現高莫耳濃度的抗原決定位，其有助於確保使用FMDV抗原胜肽之疫苗的安全性與免疫原性。
此外，在使用具有B細胞與Th抗原決定位之特
定合成胜肽作為疫苗的免疫原物質時，可消除因源自經FMDV感染、經重組病毒感染宿主細胞、或共純化FMDV及/或重組蛋白之重組蛋白表現系統所誘發之非FMDV特異性免疫反應。例如，豬血清會含有宿主細胞或重組大腸桿菌、酵母菌或桿狀病毒的抗體，在生物衍生抗原的診斷試驗中，會與抗原物質交叉反應。由含有這些外來免疫原之疫苗所產生的免疫反應不具保護性。相較之下，接種合成FMDV胜肽疫苗的豬或牛可產生集中的(focused)免疫反應，而不具有針對宿主細胞或表現載體蛋白的不良抗體或其它免疫反應。
另外，在去活化疫苗的製造中，會有不一致或錯
誤，而抑制接種動物產生適當及/或所欲的免疫反應。然而，雖然長片斷FMDV胜肽免疫原的合成可能會產生不同及/或錯誤，但其幾乎不會防礙或抑制接種動物的免疫反應。事實上，在胜肽合成中的不同及/或錯誤會伴隨目標胜肽產生各種胜肽類似物。這些類似物包括胺基酸的插入、刪除、置換及提前終止(premature termination)。如上所述，在胜肽製備中所產生的胜肽類似物，於免疫應用上為適合的抗原性及免疫原性提供者，可作為用於免疫診斷的固相抗原，或疫苗的免疫原。
在合成胜肽長達25年的免疫性應用中，已發現
可保留免疫活性的結構變異範圍，比起可保留小分子之特定藥理特性，或生物性藥物共同產生之大分子活性或毒性的結構變異範圍更具包容性。因此，胜肽類似物，不論是刻意設計或因合成程序錯誤而無法避免的結果，即刪除序列的副產物混合物，其層析特性與免疫性相似於所欲獲得的胜肽，其與經純化之目標胜肽具有相同的效果。只要建立嚴格的QC程序，以控制製造與產品檢測過程，確保胜肽終產物的再現性與有效性，則經設計之類似物與非預期之類似物的混合物也具有相同效果。
如上述優點，本發明之胜肽可輕易地利用標準製
程合成，例如固相合成法，且在合成程序中具有無數的優點(Moore,V,1992)。此胜肽也可利用重組DNA技術合成，例如核酸分子、載體、及/或宿主細胞。因此，編碼FMDV B細胞抗原決定位叢抗原胜肽的核酸分子與FMDV B細胞抗原決定位叢抗原胜肽的免疫原性功能類似物也皆屬於本發明之範疇。同樣地，載體，包括含有核酸的表現載體以及含有載體的宿主細胞也皆屬於本發明之範疇。
在各實施例中亦包括FMDV抗原胜肽與FMDV
抗原胜肽免疫功能類似物的製造方法。例如，本發明之方法可包括培養含有一具有編碼FMDV抗原胜肽及/或其免疫功能類似物核酸之表現載體的宿主細胞，於此條件下表現胜肽及/或類似物。
此外，可以固相合成法製備胜肽。以此化學法所
製備之胜肽的品質可受控制，因此可確保抗原性、免疫原性的再現以及產量。
g.特定實施例
本發明特定實施例包括，但不限於：(1)一種口蹄疫(FMD)疫苗，包括：a)一合成FMDV VP1胜肽抗原；
b)一合成FMDV T輔助抗原決定位胜肽；以及c)一獸藥上可接受之傳遞載體或佐劑，其中(a)中的FMDV VP1胜肽抗原包括一胺基酸序列，其擇自於下列所組成之族群：
i)SEQ ID NOs：1或2
ii)(a)的同源物；以及
iii)(a)或(b)的任何組成，且其中(b)的合成FMDV T輔助抗原決定位胜肽未共價連接至(a)中的胜肽抗原。
(2)如(1)所述之FMD疫苗，其中(a)胜肽抗原包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
(3)如(1)所述之FMD疫苗，其中(a)胜肽抗原包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
(4)如(1)所述之FMD疫苗，其中(b)同源物為含有擇自SEQ ID NOs：3至23胺基酸序列之SEQ ID NO：2的同源物。
(5)如(1)所述之FMD疫苗，其中(a)胜肽抗原共價連接至一含有一Th抗原決定位序列胜肽的N端或C端。
(6)如(5)所述之FMD疫苗，其中Th抗原決定位序列為SEQ ID NO：24。
(7)如(5)所述之FMD疫苗，其中Th抗原決定位藉由一含有ε-賴胺酸殘基的間隔子共價連接至胜肽抗原。
(8)如(1)所述之FMD疫苗，其中(b)FMDV T輔助抗原決定位胜肽擇自於SEQ ID NOs：34至95及其組合。
(9)如(1)所述之FMD疫苗，其中(a)胜肽抗原的總含量介於每劑量約10μg至約1mg。
(10)如(1)所述之FMD疫苗，其中傳遞載體或佐劑擇自於下列所組成之族群：Montanide ISA 50V、聚氧乙烯(20)山梨醇單油酸酯、Emulsigen、Emulsigen D、與CpG寡
核酸。
(11)一種口蹄疫(FMD)疫苗組成物，包括：a)一合成FMDV VP1胜肽抗原，其擇自於SEQ ID NOs：25-33及其組合；b)一合成FMDV T輔助抗原決定位胜肽，其擇自於SEQ ID NOs：34-95；以及c)一獸藥上可接受之傳遞載體或佐劑。
(12)如(11)所述之FMD疫苗，其中(a)胜肽抗原為SEQ ID NOs：25、27、28、29及/或其組合。
(13)如(11)所述之FMD疫苗，其中(b)FMDV T輔助抗原決定位胜肽為SEQ ID NOs：34-63、90及/或其組合。
(14)如(11)所述之FMD疫苗，其中(a)胜肽為SEQ ID NOs：25、27、28、29及/或其組合，且(b)FMDV T輔助抗原決定位胜肽為SEQ ID NOs：34-63、90及其組合。
(15)一種刺激動物免疫的方法，包括給予動物一次一藥學上有效量之(14)疫苗。
(16)如(15)所述之方法，其中此動物為豬。
(17)一種保護動物抵抗FMD感染的方法，包括給予動物一次一藥學上有效量之(14)疫苗。
(18)如(17)所述之方法，其中此動物為豬。
(19)如(11)所述之FMDV疫苗，其中(a)胜肽為SEQ ID NOs：25、27、28、29、31及/或其組合。
(20)一種刺激動物免疫的方法，包括給予動物單一劑量一藥學上有效量之(19)疫苗。
(21)如(20)所述之方法，其中此動物為牛。
(22)一種保護動物抵抗FMD感染的方法，包括給予動物單一劑量一藥學上有效量之(19)疫苗。
(23)如(22)所述之方法，其中此動物為牛。
(24)如(11)所述之FMD疫苗，其中(a)胜肽抗原為SEQ ID NOs：26、30、32、33及/或其組合。
(25)如(11)所述之FMD疫苗，其中(b)FMDV T輔助抗原決定位胜肽為SEQ ID NOs：91-95及其組合。
(26)如(11)所述之FMD疫苗，其中(a)胜肽抗原為SEQ ID NOs：26、30、32、33及/或其組合，且其中(b)FMDV T輔助抗原決定位胜肽為SEQ ID NOs：91-95及其組合。
(27)一種刺激動物免疫的方法，包括給予動物單一劑量一藥學上有效量之(26)疫苗。
(28)如(27)所述之方法，其中此動物為牛。
(29)一種保護動物抵抗FMD感染的方法，包括給予動物單一劑量一藥學上有效量之(26)疫苗。
(30)如(29)所述之方法，其中此動物為牛。
以下對本發明實施例進行說明，但不可用於限制本發明之範圍。
1. FMDV胜肽的合成
本實施例揭露藥學組成物之FMDV胜肽的合成方法。此胜肽可小量合成，其用於實驗室與田間試驗；以及大量(公斤級)合成，其用於疫苗的工業/商業化產品及配方分析。
FMDV抗原胜肽的系列組合具有源自FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B與3D蛋白之FMDV B與T細胞抗原決定位叢位，其長度約為10至70個胺基酸。對於某些胜肽，可在一適當的位置上進行一胺基酸置換，形成環狀胜肽，可保持其局部結構，以最大化地與天然蛋白交叉反應(例如，置換成半胱胺酸)。代表的FMDV抗原胜肽如表二所示(SEQ ID NOs：1-23)。
此外，抗原胜肽更連接一人工組合Th抗原決定位以促進各胜肽的免疫原性。連接SEQ ID NOs：24(UBITh®)
的組合Th抗原決定位之FMDV抗原胜肽如表三(SEQ ID NOs：24-33)、表七及表八(SEQ ID NOs：89-102)所示。
所有用於免疫原性試驗的胜肽皆利用Fmoc化學法以Applied BioSystems Models 430A、431與433進行合成。在一固相支持物上，於三官能基胺基酸的N-端及支鏈有Fmoc保護，以獨立地合成各個胜肽。完成的胜肽由固相支持物上分離並以90%三氟乙酸去除支鏈保護基。合成胜肽的製備可利用Matrix-Assisted Laser Desorption Time-Of-Flight(MALDTOF)質譜儀進行評估，以確保胺基酸組成正確。合成胜肽也可以逆相HPLC評估以確認合成特徵及濃度。
儘管嚴格控制合成程序(包括監測耦合效率)，在延長程序中仍會發生意料外的事件，包括胺基酸的插入、刪除、置換及提前終止，而產生胜肽類似物。因此，合成胜肽通常包括目標胜肽並伴隨多種胜肽。儘管包括非目標的胜肽類似物，但所合成的胜肽仍適合使用於免疫應用，包括免疫檢測(如抗體捕捉抗原)與疫苗(如胜肽抗原)。一般來說，胜肽類似物，包括刻意設計或在合成程序中所產的副產物混合物，經常與所欲胜肽的純化製品同樣有效，只要經嚴格的QC程序檢測製程及品保過程，即可產生具再現性且有效之使用這些胜肽的終產物。
花費大量時間與勞力對所有胜肽進行血清或in vitro IFN-γ篩選程序(包括胜肽合成的反覆流程、疫苗配方、與動物免疫)，以及血清與in vitro IFN-γ分析，以產生候選胜肽，進一步分析目標動物體內的診斷與疫苗應用。各實施例中所使用之特定配方如下所示。
2.分析與試劑
本發明合成胜肽與配方的分析及所使用的試劑如下所示。
a. FMDV VP1(aa134-168)或VP1(aa129-168)胜肽ELISAs
各實施例中的各種樣本的ELISA分析如下所述。
將100μL，濃度2μg/mL(除非另有說明)的各目標胜肽於37℃，pH 9.5(除非另有說明)，以10mM NaHCO3緩衝液，塗佈於96孔盤上1小時。
塗佈胜肽的孔盤以250μL之3wt%溶於PBS的明膠於37℃下反應1小時，以封阻非特異性蛋白接合位，接著，以含0.05v/v%TWEEN® 20的PBS清洗並乾燥。將血清利用含20v/v%正常山羊血清、1wt%明膠及0.05v/v% TWEEN® 20的PBS，以1：20比例稀釋。將100μL的稀釋血清加至各個孔洞中並於37℃下反應60分鐘。
將孔洞以0.05v/v% TWEEN® 20之PBS清洗6次
以去除未結合的抗體。使用辣根過氧化物酶標記之山羊抗豬IgG結合孔洞中的抗體/胜肽抗原複合物。將100μL之過氧化酶標記的山羊抗豬IgG與1v/v%正常山羊血清以0.05v/v% TWEEN® 20之PBS稀釋後加至各孔洞中，並於37℃下再反30分鐘。利用含0.05v/v% TWEEN® 20之PBS清洗6次以去除未結合的抗體，並與100μL含0.04wt% 3’,3’,5’,5’-四甲基聯苯胺(TMB)與0.2v/v%過氧化氫之檸檬酸鈉緩衝液反應15分鐘。利用此混合物形成有色物質以偵測過氧化酶。
加入100μL的1.0M H2SO4停止反應並偵測波長450nm(A450)的吸光值。
依據目的所稀釋的血清可偵測動物血清中的
FMDV抗體：(a)用於檢測潛在的天然感染，以1：20的稀釋比例，偵測A450吸光值，並以陰性對照組作為臨界值(cutoff)進行計算，或(b)用於檢測接種胜肽FMDV疫苗配方豬隻的抗體力價，利用10倍連續稀釋至1：10至1：10000進行檢測，且經檢測之力價以Log10表示，並以A450的線性回歸分析計算，A450的臨界值(cutoff)設為0.5。若有需要，使用專一性針對這些同源抗體的單株抗體(Serotec提供)，檢測血清中同型-特異性抗-FMDV抗體(如，IgG1、IgG2與IgA)。抗體力
價以相同方式進行檢測，如上所示。
在各VP1 ELISAs分析中，使用FMDV VP1 B細胞抗原決定位叢胜肽(SEQ ID NOs：1-23)作為塗佈抗原，濃度2g/mL，每孔洞有100μL，以及10mL NaHCO3緩衝液，pH 9.5。
b.非結構蛋白3B胜肽ELISAs
用於檢測FMDV非結構(NS)蛋白3B與血清抗體反應的ELISAs如先前文獻所述(Wang,CY et al 2001)，稀釋比例為1：21。在各試驗中包括接種胜肽與負對照組的血清。結果以減去OD臨界值(一般為0.220 OD)的OD值表示。
FMDV NS 3B胜肽ELISA分析可分辨接種動物與被感染動物的不同。特別是，可藉由動物血清與非結構FMDV蛋白的反應與否，來辨別接種動物與感染動物。尤其是，由於疫苗配方僅含有結構蛋白VP1的抗原決定位，因此接種本發明疫苗配方的動物血清不會與非結構FMDV蛋白發生反應。因此，僅有被感染動物的血清樣本會與非結構FMDV蛋白反應。
c.接種動物血清學區別(Differentiation of Infected from Vaccinated Animals,DIVA)檢測系統
使用FMDV NS 3B胜肽ELISAs結合血清特異性FMDV VP1胜肽ELISAs可提供一種有效且方便的工具，以(1)辨別接種動物與被感染動物，以及(2)確定感染或接種動物的特定FMDV血清型。因此，此ELISA分析組合可藉由攻毒與外科方式提供一種方便且有效之評估FMDV疫苗效力的方法。
d.免疫原性的評估
動物以下述方法進行免疫。在給予疫苗配方後，採取血液樣本，並評估其免疫原性。
特別是，分別在初次免疫(wpi)後的第0、3、5
wpi採取免疫牛隻的樣本，並在初次免疫(wpi)後的第0、4、6 wpi採取免疫豬隻的樣本。將這些樣本以56℃加熱30分鐘以去活化血清中和補體。如上所述，含合成肽配方的免疫原性可以將對應之FMDV VP1抗原作為胜肽ELISA的固相抗原來進行評估。動物血清以連續稀釋實驗進行檢測，且陽性力價以稀釋倍數倒數的Log10來表示。
依據組別收集血清樣本，並檢測其對分離病毒株
的中和活性，如下所述。
e.
FMDV病毒
用於進行動物攻毒試驗(如下列實施例所述)的病毒包括A型病毒株的FMDV A12與A24；O型病毒株的FMDV O1、O2、OTaiwan、OOzk、OMyanmar；Asia 1XJ病毒株等。實施例中所使用的FMDV病毒株於梅島動物疾病中心(USDA，Greenport，NY)及/或台灣國家動物衛生研究所(NIAHT)以幼倉鼠腎臟(BHK)細胞培養並純化。此外，病毒也可來自於中國農業部實驗室、中國農業科學院蘭州獸醫研究所，如上所述(Brown 1963)，在透過15-45%蔗糖梯度離心前，先以1% SDS或1% Nonidet P-40處理病毒顆粒。
抽取各離心管中的分離病毒，並透過分光光度計
偵測260nm的吸光值以偵測經純化的病毒波峰。
f.以FMDV中和活性的血清評估作為中和指數
由動物血液樣本所獲得之血清樣本在使用前先儲存於-20℃。使用上述等份(10,000 MPD50)的各血清型，在一系列增加的病毒量中，對被1：100稀釋之血清樣本進行病毒的中和分析。
血清樣本可使用上述方法(Morgan 1990)進行
分析。樣本在1：100稀釋下，2.5 Log10個FMDV微斑
(microplaques)的減少結果可高度預期保護性免疫可抵抗FMDV感染。
g. FMDV-特異性中和抗體分析：標準β中和試驗
在96孔盤中加入連續2倍稀釋之100或200 TCID50(50%組織感染劑量)的FMDV血清，於37℃下反應30分鐘，以進行標準β的中和試驗。剩餘的病毒活性可利用含新鮮單層BHK-21細胞的96孔盤進行分析。血清中和力價為可中和50%接種病毒的Log10稀釋血清。
例如，微孔盤中利用等量200μl的血清利用BHK-21細胞來定量分析中和FMDV O1Taiwan的抗體。由各實驗動物收集50μl免疫前、後的稀釋血清。將這些血清與50μl之200 TCID50的FMDV O1Taiwan混合，並於37℃下反應1小時。接著，加入100μl含有2.5 x 105 BHK-21細胞的培養基(含10.0%胎牛血清的MEM(Gibco))進行分析。在48小時的細胞病變影響(cytopathic effect，CE)後，以顯微鏡進行觀察。以抑制50%之200 TCID50病毒誘導CE的最終稀釋血清的倒數作為力價。
h.免疫原性試驗中所使用的動物
天竺鼠：以成熟、naïve、成年雄性及雌性Duncan-Hartley天竺鼠(300-350g/BW)進行免疫原性試驗。試驗中每組使用3隻天竺鼠。
天竺鼠約4至12週齡，無特定病源(SPF)，於耳部進行標示以依據試驗流程分類成每組3至5隻。
牛：以來自於本地牧場，2至6個月大的健康肉牛，進行免疫原性試驗，依據試驗流程分成每組3至5隻。攻毒試驗的動物皆安置於生物安全性3級的農業圍阻設施中，且在試驗開始前1週先適應新的環境。
山羊：以來自於本地牧場的健康山羊進行免疫原
性試驗。
在免疫前，先分析各動物的血清樣本FMDV-特異性中和抗體的存在，以證實試驗動物先前未接種或感染FMDV。利用NS 3B與FMDV VP1的ELISA分析各動物的血清，以確定認這些動物不具有這些蛋白的抗體。
根據物種與實驗流程，以每劑量25至300g的免疫各動物。
i.組成物
各試驗中所使用的詳細藥學組成物與疫苗配方進一步如下列實施例所述。易言之，針對各個試驗組的配方包括：(1)擇自於SEQ ID NOs：1-23、25-32之單一VP1 B細胞抗原決定位叢胜肽免疫原；(2)含有擇自SEQ ID NOs：1-23與25-32之VP1 B細胞抗原決定位叢胜肽免疫原同源物的混合物；或(3)擇自SEQ ID NOs：1-23與25-32之VP1 B細胞抗原決定位叢胜肽免疫原的混合物輔以擇自SEQ ID NOs：33-92之FMDV內源性T抗原決定叢胜肽的混合物。將胜肽以特定佐劑配方進行乳化。疫苗通常包含溶有約25至300g/mL合成FMDV胜肽的水溶液與Seppic Montanide ISA 50V2佐劑以製成油包水(w/o)乳化物(體積比1：1)。在免疫前，將疫苗置於室溫30分鐘，並震盪10至15分鐘。
某些動物接種疫苗2次，其分別在第0(初始)與3wpi(增強)肌肉注射(IMO)。接著，分析這些免疫動物以評估疫苗配方中合成FMDV抗原決定位免疫原的免疫原性。其它的動物接種1次疫苗配方，評估配方中所使用之胜肽是否可有效地誘發中和抗體反應，以作為FMDV的緊急疫苗。
實施例3
利用T細胞功能性分析篩選與分辨FMDV內源性Th抗原
決定位叢胜肽
T細胞功能試驗的實驗步驟如下所示。
a.人類周邊單核細胞(PBMCs)的分離、冷凍與解凍
收集肝素化血液，並利用Ficoll-Hypaque以密度梯度離心分離PBMC。以磷酸緩衝液(PBS)清洗2次後，將PBMC懸浮於於含有10% FCS之RPMI 1640的細胞培養基。在試驗中，將分離的PBMC冷凍，儲存於液態氮中，解凍後進行in vitro培養。
b.血清IFN-γ定量
使用三明治ELISA進行豬或牛血清樣本中的IFN-γ定量。在免疫前，以及在第21或28天對動物攻毒FMDV前，進行IFN-γ的定量。首先，於Maxisorb ELISA盤(Nunc)的孔洞中塗佈捕捉抗體(購買自PBL Biomedical Laboratories，USA)，每孔洞0.5g。未被抗體所覆蓋的部分則利用添加200μl的ELISA封阻緩衝液至個孔洞中進行封阻。以200μl含0.025% Tween 20(PBS-T20)的PBS清洗ELISA盤4次後，將以ELISA稀釋緩衝液(1：10、25與75)稀釋的血清樣本加入孔盤中。將孔盤於37℃下反應1小時使細胞激素結合至固相抗-IFN-γ捕捉抗體。接著，以PBS清洗孔盤4次，並將抗-IFN-γ抗體加至各孔洞中，每孔0.25g。在37℃下反應1小時後，清洗孔盤，並添加100μl的蛋白A共軛物至各孔洞中。1小時後，清洗過量的共軛物(以PBS清洗6次)。在反應期間，加入100μl之特定物質溶液以進行偵測。孔盤呈色30分鐘後，加入50μl的1N H2SO4停止反應，偵測波長A450的吸光值作為色度。偵測結果以各血清之A450吸光值的校正曲線計算，此校正曲線是在相同的試驗條件下以稀釋的重組IFN-γ(PBL Biomedical Laboratories，USA)建立。在免疫後28天，將各動物血清中的IFN-γ反應值減去動物接種前的數值。最終結
果以血清的pg/ml表示。
c. PBMC之IFN-γ的分析
將源自於免疫種動物之PBMCs培養於24孔盤中(Nunc)，每孔2.5 x 106 cells/mL，孔洞中含有10.0g的疫苗免疫苗組成物。陰性對照組僅含有PBMC，不含有刺激抗原。所有的細胞在37℃下，5.0% CO2培養3天。培養後3天，收集上清液，並利用上述定量分析偵測IFN-γ的含量。
實施例4
豬與牛的FMDV攻毒程序
一般來說，攻毒程序是參照口蹄疫世界動物衛生組織(OIE)標準作業手冊進行。攻毒中所使用的FMDV病毒株包括：O-1Taiwan(99)、O-1Myanmar(02)、O-1Ozk(China，93)、O-1Campos與Asia 1(XJ或Jiansu、China，05)。在中國，豬的攻毒試驗過程則依據農業部的規範，修改為藉由肌肉注射給予FMDV病毒。
a.豬
計算動物的標準保護感染劑量(PD50)(即，可使50%試驗動物被保護的劑量)。在功效試驗中，利用15隻體重約40kg(隨機分成3組，每組5隻豬)的豬隻進行試驗以獲得豬的PD50。分別給予這三組1、1/3、與1/9劑量的疫苗配方。劑量的改變也可用於進行特定配方效力的評估，例如，含2 X、1X、0.5X與0.25X的劑量。通常是使用1X劑量的配方進行快速的篩選。
為進行疫苗配方的效力評估，根據實驗設計與當時可使用的動物將豬隻分組，每組3隻(而非5隻)以進行試驗。於這3組每隻豬耳後以肌肉注射(IM)接種疫苗。在接種一劑量後28天，15隻經免疫的豬隻與2隻對照組豬隻以
接受1,000 ID50的豬FMD O型病毒株進行攻毒。
在理想的試驗中，於觀察後10天，對照組必須
有豬隻至少一豬蹄上發現水皰。此外，應注意經免疫豬隻必須沒有FMD病狀或體徵，否則就算疫苗保護失敗。利用Reed-Muench法計算攻毒試驗結果以獲得疫苗的PD50。疫苗的目標劑量必須至少含有3 PD50，以通過品質釋放檢驗。
在台灣，於國家動物衛生研究所(National
Institute for Animal Health，淡水，台灣)，依照農委會的規定，於P3實驗室中接種組織培養力價為1 x 105 TCID50的FMDV O1Taiwan病毒(比中國規範的病毒量高約至少10倍)至豬前肢的蹄球(heel bulbs)中以進行攻毒。監視實驗動物的FMD臨床病徵超過14天。此觀察包括：(1)每天記錄體溫，(2)監視任何動物的跛腳行為，以及(3)監視任何在動物腿部蹄冠與口鼻部的水皰。利用Reed-Muench法計算攻毒試驗結果以獲得疫苗的PD50。疫苗的目標劑量必須至少含有3 PD50，以通過品質釋放檢驗。
b.牛
在牛的試驗中，以舌皮內(IDL)接種1mL(在舌上10個位置，每個位置100μL)進行攻毒，攻毒量總量為1 x 104 TCID50的FMDV(Bovine Infectious Unit or BIU)。每天監測記錄動物體溫，並依據水皰出現的時間與數目來確定其保護程度(protection score)。
完全保護表示完全沒有水皰(分數0)，若分數小於8表示為部分保護。臨床分數的計算如下所示：i)體溫達40℃(1分)，>40.5℃(2分)，或>41(3分)；ii)食慾降低(1分)，或沒有攝取食物，且前一天的食物仍有剩餘(2分)；iii)跛行(1分)或不願站立(2分)；iv)在觸碰蹄冠後呈現熱與疼痛(1分)或受影響的腳無法
站力(2分)；v)腳有水皰，依據受影響腳的數目，最多得4分；且vi)舌頭上的可見口腔病變(1分)，牙齦和嘴唇(1分)或口鼻部(1分)，最多得3分。
所有的動物實驗皆依據OIE標準手冊，中國農業部或台灣農委會的規範進行。劑量的改變也可用於評估特定配方的效力，如2X、1X、0.5X與0.25X的劑量。此外，也經常使用1X的劑量來快速篩選配方。
實施例5
口蹄疫病毒分離株完整基因組序列的比較分析，以FMDV O
TAIWAN 99
分離序列作為FMDV B與內源性Th抗原決定位的胺基酸骨架結構及位置來進行胜肽免疫原設計
在徹底了解FMDV基因結構後，以FMDV OTaiwan 99血清型的多蛋白胺基酸序列來辨識及設計FMDV抗原性胜肽。一旦確定此胜肽的骨架，則可調整胜肽以呈現多個序列，藉此應用於區域中的多個血清型。FMDV OTaiwan 99序列與代表7個亞血清型的103個FMDV分離株完整基因體序列進行比對，通過上述對應的GenBank登錄號(Carrillo 2005)，確定具高度保守的FMDV蛋白質區域，其顯示出變異上的功能限制，以及新病毒病毒結構(motif)的潛在生物相關性。特別是，利用圍繞FMDV VP1蛋白“RGD”受體結合位的序列及其相關共有序列(consensus sequences)(即比較特定血清型FMDV分離株在各個位置上最頻繁出現的胺基酸)為藍圖，設計B細胞抗原決定位叢胜肽免疫原，而高度保守的FMDV蛋白質區域為FMDV內源性Th抗原決定位叢胜肽免疫原設計上的目標位置。在經過實施例3中血清與細胞分析的篩選後，可獲得一系列的B與T輔助細胞抗原決定位叢胜肽(SEQ ID NOs.：1至102)，以應用於代表不同病毒株及血清型的FMDV疫苗配方中，如第1圖及表1至8。
實施例6
作為FMDV胜肽疫苗關鍵組成之FMDV B細胞抗原決定位叢胜肽免疫原的分析
a.設計歷程
各個疫苗或免疫治療產物需要依據特定疾病機制與目標蛋白來進行設計。仿照疾病傳染途徑或感染物質中所含有的多個細胞蛋白。
先前對於B與T細胞抗原決定位辨識及分佈的
了解也有助於分子設計。一旦選定目標分子，則需要大量的血清學驗證。接著，藉由持續在小型動物中進行先導免疫原的試驗，以評估可被設計胜肽疫苗配方誘發之抗體的功能特性。將血清學應用至目標動物上，以進一步驗證疫苗誘發抗體的免疫原性與功能性。由免疫宿主收集多個平行組別的血清進行所有試驗以進行評估。在目標動物族群中進行的早期攻毒試驗也可進一步證實設計的方向。將目標胜肽製備為不同的混合物，以評估合併使用各配方時，各胜肽結構間反應在功能性上細微的差異。在額外的評估之後，最終胜肽結構、胜肽組成物及其配方可伴隨配方的物理參數建立出領先的最終產物開發程序。
利用大量的設計實驗可開發出下個世代的疫苗
產物，快速地由研發推展至商業化，如第2圖所示。
在特定FMDV胜肽與組成物的開發時程上，後續
的開發目標為(1)確認足以刺激廣泛中和抗體的VP1環狀結構目標位，(2)設計胜肽位以優化對於免疫系統的呈現，(3)選擇針對豬與反芻動物的UBITh®位，(4)合併這些基本組成至胜肽免疫原設計中，以降低成本，以及(5)開發疫苗配方、劑量、以及初始免疫的免疫程序。為了分析與評估FMDV胜肽免疫原，需要對FMDV序列庫與分子模式進行密集的實地調查，接著合成大量的疫苗配方候選免疫原以免疫動物。在
免疫原及中和抗體試驗中，在總共831隻豬與860頭牛中發現，組成物與配方可有效地保護豬與羊在經單一接種後可抵抗攻毒。整體來說，本發明包括25隻豬的試驗與32頭牛的試驗，以及早期的天竺鼠與山羊試驗。
b.最佳VP1環狀結構目標的辨識
一個有效之FMDV胜肽疫苗的重要因子為選擇VP1之G-H環狀結構的序列，其呈現最佳的B細胞抗原決定位，以刺激中和抗體產生。胜肽免疫原結構骨架的優化會受到小至一個胺基酸改變的影響。分析VP1衣殼蛋白構象結構的可用分子模型，並比較高變異區的序列，以確認對VP1具良好交叉反應之合成免疫原應包括環狀結構的延伸區域。
依據FMDV A血清型A12的序列(如表8所示)，
製備包含aa134-159或aa134-169具有VP1目標位的胜肽免疫原。確認僅含有胜肽或含有FMDV內源性Th抗原決定位或外源Th抗原決定位以輔助T細胞的組成物的胜肽免疫原性。並且，對具有或不具有環化控制(cyclic constraints)以穩定環狀結構胜肽的免疫原分析。胜肽的環化可藉由在特定位置上半胱氨酸殘基之胺基酸置換形成雙硫鍵(如，利用VP1位置134(N->C)與158(Q->C))的方式來達成。
評估含有各種胜肽之組成物在天竺鼠中的免疫
原性。表9提供各種胜肽的實驗結果。表9顯示：
i.較長的胜肽結構提供更佳的中和反應。例如，相較於SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：97提供較佳的中和反應。此外，目標位置的進一步延伸至129殘基(SEQ ID NO：99)也提供有效的應用。
ii.相較於不含環化結構的胜肽，環化胜肽提供更高的中和活性。例如，相較於SEQ ID NO：97，環化胜肽SEQ ID NO：98提供更高的中和活性。
iii.相較於不含抗原決定位的胜肽結構，連結人工Th抗原
決定位UBITh®(SEQ ID NO：24)之外源Th的FMDV VP1結構具有較高的中和效力。例如，相較於SEQ ID NOs：99、98、97與96，SEQ ID NO：100提供更佳的中和活性。
iv.組成物中額外的Th抗原決定位可進一步促進免疫原性。
由這些結果可知，含有由第129至169位胺基酸
之延長的VP1目標位置環化胜肽最為重要(例如，SEQ ID NO：99)。
c.血清型-特定VP1目標位置的設計
分析英國Pirbright世界參考實驗室所提供之FMDV序列資料庫，以獲得O、A、Asia、C、與其它血清型等有價值的VP1環狀結構(第129-169位的胺基酸)。接著，設計每個位置的共有胺基酸，如表2所示。如表8所示(SEQ ID NOs：101與102)，組合資料庫目標序列在單一的位置上具有多種胺基酸，且形成VP1環狀結構更廣泛的抗原變異性。
使用單一共有序列(表11，SEQ ID NO：25)與
組合資料庫目標序列(表10，SEQ ID NO：98與99)進行免疫原性試驗的比較，利用VP1 ELISA力價的免疫原性以及各血清型FMDV病毒株的中和指標二種方式，顯示共有序列提供涵蓋各血清型廣度的同等效力(表10與11)。因此，為了便於製造與QC，單一共有序列的環化目標VP1位置與基於區域需要之某些擇自於特定血清型的VP1序列如SEQ ID NOs：2-23與25-33所示。
d.刺激VP1免疫原性之最佳Th抗原決定位的選擇
在先前的研究中，由FMDV抗原中確定了Th位置，如VP1 21-40抗原決定位，並併入合成VP1免疫原的設計中。然而，在豬與牛的免疫原性試驗中已顯示，由於目標動物有限的混雜與基因限制，這些FMDV內源性Th位置無法完全有效地刺
激目標動物的VP1免疫原性。因此，不使用僅部分有效的FMDV Th抗原決定位，而以更有效的UBITh®人工Th抗原決定位取代以刺激FMDV VP1環狀胜肽免疫原。人工UBITh®位置合併含有組合資料庫Th位置的Th結構(motifs)，可容納不同基因族群的不同T細胞反應。此Th抗原決定位中的改變會導致潛在同源抗-FMDV記憶反應的失去(在暴露的情況下)，但提供更寬廣且更強的免疫反應。人工UBITh®序列(SEQ ID NO：24)已證實在多個族群，包括豬的免疫原性。
如表10所示，試驗中所使用的結構包括人工
UBITh®位置(SEQ ID NO：24)，以ε K(epsilon Lysine(賴胺酸))作為間隔子，以及O或Asia血清型組合資料庫(SEQ ID NOs：101與102)第134至169位胺基酸的環化VP1目標位置。
由經免疫天竺鼠之抗體與中和反應(以中和指數表示)顯示，此兩種結構具有免疫原性。
表11顯示天竺鼠對具有透過ε K間隔子連接第
129至169位胺基酸之環化VP1目標位置(SEQ ID NO：25)與UBITh®位置(SEQ ID NO：24)之類似O血清型免疫原的反應。在初始免疫後3週的強大寬廣中和抗體反應證實，具有O共有序列的VP1結構同樣具有強大的免疫原性(表11)。
e.中和反應不可預期的廣度
在表10、11中，以天竺鼠免疫血清分析中和活性的結果顯示出不可預期的寬廣中和反應。特別是，SEQ ID NOs：101與25的O血清型免疫原刺激對抗二種O血清型亞型的中和抗體，且同時對A、Asia血清型的亞型具有中和反應。此結果顯示一種可能的UBITh® FMDV免疫原，其以個別免疫原對多種血清型具有寬廣的效力。
當經免疫血清與攻毒豬隻證明OTaiwan、OManisa、
OCampos與OMyanmar中和指數的廣度時，合併多種免疫原，如表12所示(含有SEQ ID NOs：25、27與28等3種胜肽的UBI FMDV
O疫苗)至單一疫苗中，同樣也可提供上述血清中和活性的廣度。
f.豬的免疫/攻毒試驗
在3頭個別的豬(目標動物)免疫/攻毒試驗中，第1個聯合醫學(UBI)FMDV合成胜肽疫苗“UBITh® FMDV-O疫苗”已被證實可保護性抵抗FMDV O1Taiwan病毒株的攻毒。此試驗分別在3個不同的機構中完成，包括台灣動物科技研究所(National Institute of Animal Health Taiwan，NIAHT)與美國農業部梅島動物疾病中心(USDA Plum Island Animal Disease Center，PIADC)。
實驗結果如表13所示。第1-4組為2劑的UBITh®
FMDV-OConsensus(SEQ ID NO：25，胜肽2570)疫苗。劑量為25、50、100至300μg(第1-4組)。第5-7組為安慰劑對照組。
所有豬隻注射104.5 TCID50的FMDV O1Taiwan病毒
(病毒培養於幼倉鼠腎細胞或豬中)至蹄球(heel bulbs)中進行攻毒。豬隻在最後一次免疫後，以間隔2至10週進行攻毒。所有經免疫的豬隻可被保護，包括經15 UBITh®-免疫的豬。經UBITh®-免疫的豬隻在經過10週後仍具有保護性免疫。
如免疫實驗中未攻毒豬隻的中和抗體力價顯示，在最終免疫後20週仍具有保護性免疫。
所有的接種動物具有大量的血清中和抗體，且可
抵抗攻毒。安慰劑豬隻的100%感染證實3次不同攻毒試驗中所使用病毒的病毒傳染性。因此，3次試驗的所有結果皆可被驗證。由結果可知，僅免疫2次，劑量為25μg(第1組)的UBITh® FMDV OConsensus(SEQ ID NO：25，胜肽2570)疫苗即可提供完全的保護性免疫。
g.攻毒豬隻的寬廣保護性免疫
使用含3種等量VP1 O結構(含分別以SEQ ID NOs：25、
27與28顯示的2570a共有、OOzk/93、OMyanmar序列)之UBITh® FMDV O疫苗，劑量25μg，在第0與3週免疫的兩劑量方式進行其它攻毒試驗。同樣地，所有的6隻豬以FMDV O1Taiwan攻毒，並且皆被保護。收集6隻經免疫且攻毒豬隻的血清，發現具有針對流行的FMDV O亞型、O1Taiwan、OManisa、OMyanmar與OCampos的中和抗體(表12)。所有豬隻產生具穩固免疫力的O1Taiwan中和抗體量，其也含有針對OManisa、OMyanmar與OCampos更強的中和反應，顯示對O血清型亞型更可靠的交叉保護性免疫。
h.反芻動物的免疫原性
在12隻山羊的免疫原性試驗中顯示，反芻動物對UBITh® FMDV-Oconsensus共有(SEQ ID NO：25，胜肽2570)疫苗的免疫原性。山羊分別在第0、8週免疫2次，或於第0、4、8週免疫3次。劑量為30μg、100μg或300μg。利用偵測針對FMDV O1Taiwan的中和抗體來評估效力。在第8週最後免疫後12週(即經過20週的試驗)可獲得預期保護的中和抗體量。兩次劑量或三次劑量的免疫方式皆同樣有效，且30μg與300μg劑量一樣有效。因此，UBITh®FMDV-O疫苗在目標反芻動物中具有免疫原性，當接種2或3次時，劑量大小與疫苗配方在山羊中具有同樣的保護性免疫。
i.結論與說明
上述實驗結果總結如下：於3個國際單位的4個實驗組中，在接種2次，劑量為25μg、50μg、100μg與300μg的UBITh® FMDV VP1疫苗(SEQ ID NO：25)後，可有效地保護所有(15/15)經接種的豬隻抵抗FMDV OTaiwan的攻毒。所有(10/10)對照動物在攻毒後2天皆被感染。
含有VP1 O結構(等量的SEQ ID NOs：25、27
與28，初始免疫後第0、3週(wpi)給予2劑量的25μg)混
合物的UBITh® FMDV O疫苗可在豬隻中刺激抵抗多種FMDV O型分離株，包括OTaiwan、OCampos、OMyanmar與OManisa的寬廣保護性中和抗體。
UBITh® FMDV O疫苗在反芻動物、山羊發現與與豬同樣的免疫原性。此結果可預期單一劑量的UBI配方在牛隻中具有可媲美豬隻的免疫劑量。
確認的UBITh®合成FMDV免疫原在天竺鼠中可同時刺激抵抗A、O與Asia 1血清型的中和抗體，顯示對多種血清型具交叉保護之不可預期的寬廣效力。
測量中和指數可知，使用O共有序列的UBITh® FMDV O胜肽可刺激中和抗體，抵抗多種血清型，包括A、Asia 1與O血清型的亞型。
UBITh® FMDV疫苗免疫原屬“功能性位置”為應用，且可自然合成。配方疫苗具安全、有效、寬廣的中和活性、重複性、與穩定性，因此可克服傳統死毒疫苗中生產與品質控制的困難與缺點。
藉由接種，甚至在幾乎無FMD狀態地區接種完全安全的化學疫苗，可預期將FMDV根除。
實施例7
以合成FMDV胜肽免疫原的同源胜肽作為地區性客製化FMDV胜肽多價疫苗的主要組成
傳統口蹄疫疫苗在全球動物疫苗市場中佔有最大的比例，為全球整體畜牧生物產業的26.4%。由於FMDV血清型與亞型的高度變異，傳統病毒瓦解物之抗原組成的FMD疫苗必須針對特定區域量身定做，在許多情況下，是針對特定國家或區域。目前，在FMD-地區性中疫苗的使用需要深入研究流行病學與疫苗一致性(vaccine harmonization)以(1)確定疫苗是否可有效地抵抗目標地區內流行的病毒，與(2)確保疫苗實際上適合用於控制與移除病毒。
隨著分子病毒學的來臨，可容易地以反轉錄酶鏈
聚合反應(RT-PCR)由國家監測行動中FMD病例的組織樣本以及由FMDV疫情收集的多個組織與食道探針(probang)，所獲得的病毒分離株，得佑口蹄疫病毒大部分的衣殼蛋白VP1序列。比對確定的VP1序列。此比對包括具遺傳相關血清型之其它分離株的序列。目標地區中流行病毒株的VP1序列可輕易地由代表地區性FMDV疫情的本發明胺基酸骨架(VP1 129-168)與此骨架胜肽同源物(表2，SEQ ID NOs：2-23)獲得，且疫苗配方中包括VP1胜肽同源物(表3，SEQ ID NOs：25-33)以針對確定地區的需求量身定做，可適當地控制與移除病毒。
在接種2次或更多劑量時，含有合成FMDV胜肽免疫原(具有VP1 aa129至aa168)之胜肽同源物的特定配方為主要成分進行試驗，如表14所示：(a)具有胜肽同源物(SEQ ID NO：25)的單價豬FMDV O血清型疫苗；(b)具有二種等重量比之胜肽同源物(SEQ ID NO：25與28)混合物的二價豬FMDV O血清型疫苗；(c)具有三種等重量比之胜肽同源物(SEQ ID NO：25、27與28)混合物的三價豬FMDV O血清型疫苗；(d)用於亞洲，具有二種等重量比之胜肽同源物(SEQ ID NOs：25與29)混合物的二價牛/反芻FMDV O與Asia 1血清型疫苗；(e)用於中國，具等比例的三價牛/反芻FMDV O與Asia 1Jiansu與AGansu血清型疫苗(SEQ ID NOs：25、29與31)；(f)用於巴西，具等比例的三價牛/反芻FMDV OCampos、A24與CIndaial疫苗(SEQ ID NOs：26、30與32)；(g)用於阿根廷，具等比例的三價牛/反芻FMDV OCampos、A24/Argentina 2001與CIndaial疫苗(SEQ ID NOs：26、30、33與32)；最終疫苗配方中所使用之設計胜肽同源物的適
當性，可利用其對於不同分離株特定FMDV VP1序列胜肽ELISAs中FMDV VP1抗原的相對免疫原性與交叉反應進行評估，如實施例1所示。
如表15至17所示，VP1同源疫苗配方(a)至(g)(含有SEQ ID NOs：25-33同源物)可符合特定地區的需要(如，中國、東南亞、巴西與阿根廷)。特別是，這些配方對於目標血清型VP1序列(如，OTaiwan、OCampos、OOzk、OMyanmar、Asia 1、AGansu、A24、AArgentina 2001、CIndaial)提供另人滿意的免疫性。此外，這些FMDV疫苗配方亦可藉由其針對目標血清型，包括，但不限於OTaiwan99血清型刺激中和抗體的能力來證明其功能性免疫原性(如實施例，表12所示)。在接種2次時，刺激FMDV中和抗體之疫苗配方VP1 B細胞成分可低至每劑量25μg。
實施例8
以僅含VP1蛋白衍生B細胞抗原決定位叢胜肽的FMDV疫苗配方接種1次，無法作為緊急疫苗來抵抗FMDV攻毒
參照實施例7製備包含合成FMD胜肽同源物的特定配方。在接種2次或更多後，這些配方可刺激豬與牛/反芻動物的FMDV中和免疫反應。然而，若依據OIE攻毒程序的要求僅接種1次，這些配方無法持續地保護豬與牛抵抗FMDV的攻毒。由於無法使用單一接種提供動物完全保護，造成了VP1胜肽同源FMDV疫苗配方商業化的困難。
在仔細研究所有VP1同源物疫苗配方之中和抗體動力學發現在單一接種後4週，中和抗體力價仍低或接近於背景值(≦3)(第3A與3B圖)。豬與牛的中和抗體力價僅在第4週的第2次接種後，第6週才有顯著的提升(第3A與3B圖；表15-17)。此高力價中和抗體的延遲產生，顯示出VP1胜肽疫苗中缺少確實的免疫反應物質，或其含量很低。表示此缺乏/低含量的物質存在於FMDV病毒瓦解物(lysate)
疫苗中，可達到作為緊急疫苗的保護。
在暴露於病毒時，初始與快速的恢復(recall)
反應可顯著地抑制病毒的複製，此為單一接種VP1同源物疫苗配方達到完全保護免疫反應所缺少的物質。當UBITh®連接至VP1胜肽同源物時，在接種二次或更多次後，可產生強大的T輔助反應，第3A與3B圖與表15至17顯示顯此著提升的中和抗體力價。然而，緊急疫苗必須在接種1次疫苗配方後可快速且顯著地誘發動物的免疫反應，在受病毒感染時可有效地產生快速的恢復反應。
以下實施例的試驗顯示評估使用含有多成分
FMDV B與T抗原決定位疫苗配方之快速反應(fast-acting)的T細胞反應。
實施例9
單一接種緊急疫苗之多成分B與T抗原決定位FMDV疫苗配方的原理、篩選、辨識與優化
如實施例8所述，不斷地嘗試僅使用合併FMDV VP1衍生的B細胞抗原決定位叢胜肽作為緊急FMD疫苗配方，但僅單一接種，在初始免疫後第3至4週(wpi)時，仍無法持續地產生高力價的中和抗體。因此，這些配方無法保護動物抵抗FMDV的攻毒。故花費大量的努力以確定開發一個成功高效力FMD緊急疫苗所需的免疫物質。
商業化的FMD病毒瓦解物緊急疫苗包括naïve
豬γ δ T細胞增生，且此naïve豬γ δ T細胞在暴露於FMD疫苗病毒抗原後，會表現各種細胞激素/趨化因子mRNA。在動物中觀察到接種高效力緊急FMD疫苗顯著的變化之一為產生大量全身性的細胞激素，包括IFN-γ(Cox 2003)。在FMD攻毒與恢復後，當FMD免疫豬(接種並攻毒)的PBL(周邊血液淋巴球細胞)被FMDV抗原立即地in vitro誘發時，主要為增生γ δ T細胞，表示γ δ T細胞的增生是病毒感染的特
徵。由於具有突觸的細胞叢，單株抗體可結合至MHC class II與CD4以阻止T細胞增生，表示透過MHC class II與γ δ T細胞的抗原呈現能力，並發現γ δ T細胞與MHC class II+ CD4+ T細胞之間樹狀細胞對細胞的反應(Takamatsu 2002)。
γ δ T細胞參與發炎的抑制與不同細胞激素的產生，顯示γ δ T細胞在免疫調控，包括先天與後天免疫反應上，控制扮演重要的角色。這些細胞可能具有與抗原呈現細胞(APC)有關的特性。在高效價緊急FMDV疫苗下γ δ T細胞於針對口蹄疫病毒抗原產生快速的免疫反應，可讓我們透過in vitro IFN-γ的生成作為T細胞活化的指標，來廣泛地評估設計、篩選、選擇一或多個FMDV內源性T抗原決定位叢胜肽。
如實施例3所述，利用特定T細胞功能分析以篩
選及確定源自於FMDV蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、3A、3B與3D的抗原片段的FMDV內源性Th抗原決定位叢胜肽，其可利用源自於以(a)FMDV病毒瓦解物疫苗與(b)含FMDV候選Th胜肽的胜肽配方免疫宿主之豬與牛T細胞進行辨識。
a.以偵測in vitro IFN-γ量作為發生免疫T細胞活化的指標，來辨識豬與牛體內FMDV內源性Th叢胜肽
經in vitro刺激，以含有FMDV內源性Th抗原決定位胜肽配方免疫動物所誘發的T細胞會釋放IFN-γ，且持續地促進FMDV中和抗體的產生。由於此分析有很高的再現性，因此被用於大量篩選分析以評估效力，並確定可使用於最終FMDV疫苗配方中的FMDV內源性Th抗原決定位叢。
首先分析具MHC class II結合結構序列胜肽對促
進經FMDV OTaiwan99病毒瓦解物疫苗免疫、攻毒且恢復之豬或牛周邊血液單核球細胞(PBMCs)的IFN-γ反應能力，藉此進行T細胞抗原決定位叢胜肽免疫原的設計。進一步篩選可誘發低、中與高量IFN-γ的胜肽分類，並計疫苗配方。第1
圖顯示FMDV VP4、VP2、VP3、VP1、2B、2C、3A、3B、3C與3D蛋白上經選擇的B與內源性T細胞抗原決定位，以實施例1與3的方法確定，並使用於之後的應用。
源自FDMV OTaiwan99病毒株各T細胞抗原決定位
叢胜肽序列如表4(SEQ ID NOs：34-63)所示。對FMDV Th胜肽與其它FMDV病毒株同源FMDV T輔助抗原決定位序列進行比對，如表5所示(SEQ ID NOs：64-78)。為了增加疏水性胜肽抗原的容解度，可在T輔助胜肽免疫原的N端連接上3個賴胺酸(KKK)。將含一些或所有等重量比Th胜肽免疫原(SEQ ID NOs：34-87)的T細胞叢庫作為補充物，加至疫苗配方中的VP1胜肽同源物混合物，以進一步促進豬與牛FMDV B細胞叢胜肽免疫原的免疫原性。將這些疫苗配方進行大量的試驗，在接種1次後偵測/評估in vitro第0與3週的中和抗體力價，與in vivo保護效力(表18、19)。這些FMDV Th胜肽也可作為細胞性免疫的FMDV T細胞胜肽免疫原。
為進一步擴大T細胞抗原決定位對不同遺傳背
景動物的覆蓋度，根據9種不同的T抗原決定位特定同源序列而位設計合併胜肽(表19，第7組，SEQ ID NOs：79-87)。
同樣地，3個賴胺酸(KKK)可加至各組合T抗原決定位叢胜肽免疫原的N端，增加其水溶性以供配方使用。這些T細胞抗原決定位叢組合胜肽免疫原庫也可作為疫苗配方的一輔助，以進一步促進FMDV VP1 B細胞抗原決定位叢胜肽免疫原的免疫原性，其本身為可促進細胞性免疫的FMDV T細胞胜肽免疫原(表19)。
經過大量的分析，較佳的豬FMDV內源性Th叢胜肽為SEQ ID NOs：61至63；且牛的為SEQ ID NOs：34至60。在Th抗原決定位叢胜肽的N-端加上額外的賴胺酸殘基(如，KKK)使這些短胜肽具可溶性。這些胜肽可依據組合資料庫序列設計(如，O、Asia1、A、C等)使用各Th抗原決定位製備一種組合胜肽序列以促進這些胜肽的免疫原性，且進一
步連接卡匣中的各FMDV Th叢胜肽(為單一序列或一組合序列)以形成UBITh®抗原決定位(SEQ ID NO：24)，此為結合FMDV Th結構(combo FMDV Th constructs)。具有這些特徵的典型序列如表7所示之SEQ ID NOs：88至95。
由於牛不同的遺傳背景，由一可誘導接種含優化
FMDV B抗原決定位叢VP1胜肽疫苗配方動物體內抗原特異性T細胞反應的胜肽庫中，預選FMDV內源性Th胜肽的多種組合，測試其在動物體內的廣泛免疫原性(表19)。僅接種1次疫苗配方的動物，其誘導抗原特異性T細胞反應的能力可以很高的中和抗體力價為例子。此疫苗可用於豬與牛(表18與19)。若各疫苗配方僅含有VP1胜肽免疫同源物，沒有這些FMDV內源性Th抗原決定位叢胜肽，在單一接種此疫苗(第3A與3B圖)後，於初始免疫後第0、3週(wpi)，僅可產生微小(即≦3)的中和抗體力價。
一種簡單的FMDV疫苗配方，含有(1)FMDV O
血清型VP1 B免疫原(SEQ ID NO：25)；(2)10%(重量比)的FMDV Th抗原決定位胜肽構(SEQ ID NO：90)；以及(3)以UBITh®(SEQ ID NO：24)連接的三種豬FMDV Th抗原決定位。豬單一接種此配方，並持續偵測in vitro PBMCs中的IFN-γ量，以定量ELISA分析in vivo血清中的IFN-γ量(如實施例3所示)，持續偵測超過4個星期。在此試驗中發現，接種後可提升IFN-γ的產量，如第4A與4B圖所示。
此發現更證實，在免疫後，預選的FMDV內源性
Th抗原決定位叢可立即誘發經免疫宿主的T細胞。以天然感染或攻毒試驗暴露於FMDV，此病毒抗原可藉由先前FMDV疫苗T輔助胜肽抗原所誘發的記憶T細胞，開啟抗原特異性T細胞反應。在單一接種各疫苗配方後，這些刻意選擇之FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B與3D蛋白的免疫優勢(immunodominant)Th抗原決定位可提供FMDV相關Th細胞的預先誘發，且在暴露於FMDV後，驅使免疫宿
主體內顯著的淋巴球增生反應，導致細胞激素的產生，包括IFN-γ。細胞激素已知在抵抗動物體內細胞病變病毒感染的細胞性免疫反應中扮演重要的角色。
b.以中和分析確定可作為豬與牛緊急疫苗的最佳疫苗配方
經接種與攻毒的動物中，具有FMDV內源性Th抗原決定位叢胜肽，比起沒有這些胜肽，通常可發現更高的FMDV淋巴組織增生反應。含有特定T細胞抗原決定位的胜肽配方可誘發T細胞，在之後的病毒感染，可更有效地辨識病毒抗原決定位。
IFN-γ是巨噬細胞的主要活化因子，可促進其抗
菌的活性，以及處理與呈現抗原給T淋巴細胞的能力。已知IFN-γ可刺激抗原呈現細胞中的MHC表現，且有效地抑制FMDV的複製。因此，此早期機制的活化可促進單一接種緊急疫苗所需抵抗FMDV的保護性免疫反應。在FMDV內源性Th抗原決定位叢胜肽存在下，可活化與FMDV VP1反應之B細胞，快速地造成B細胞增生與抗原產生。這些FMDV內源性Th抗原決定位叢胜肽也可活化T輔助細胞，促使細胞激素分泌，以形成一種適合B記憶細胞增生的環境。此發現表示，相較於只有VP1 B胜肽，合併VP1 B胜肽與內源性Th胜肽，可提供較佳的臨床保護，較佳的臨床保護主要是歸因於更有效的淋巴反應與IFN γ釋放所促進的更佳誘導，因此更高的中和抗體力價為此早期機制的一部分。
使用標準中和分析進行疫苗配方的篩選，疫苗配
方最好可誘發此緊急疫苗所需的早期in vivo保護性免疫反應。收集免疫豬(表18)與牛(表19)初始免疫後3週的血清進行分析。由於中和抗體分析可作為一種替代試驗，以取代符合國家單位對緊急疫苗規範之昂貴且繁複的攻毒實驗，因此可使用這種替代的抗體分析對含有各種FMDV VP1 B與
內源性Th抗原決定位叢胜肽組合與比例的FMDV疫苗配方進行全身性的試驗，並評估其保護力，如實施例2所示。
特別是，分別對每組3至5個無FMDV的8-12週齡豬與6-12週齡牛，於第0週接種1次含有各種多成分B與T抗原決定位胜肽的FMDV疫苗配方，並分析其血清中和抗體力價。
1.豬
13組豬隻試驗的結果如表18所示。試驗中所使用的配方以下列方式製備。所有豬隻以1mL的乳化疫苗配方進行免疫。
第1組-僅含有標準FMDV VP1 O共有胜肽(SEQ ID NO：25)。
第2至4組-合併標準FMDV VP1 O共有胜肽(SEQ ID NO：25)與等重量比的內源性FMDV Th胜肽(如，SEQ ID NOs：34-63、SEQ ID NOs：61-63或SEQ ID NO：90)，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的25+2.5μg/mL油包水乳化物。
第5至7組-以總量25μg/mL，等重量比的FMDV VP1 OConsensus(SEQ ID NO：25)與OOzk(SEQ ID NO：28)作為FMDV疫苗B細胞成分，分別輔以等重量比內源性FMDV Th胜肽(如，SEQ ID NOs：34-63、SEQ ID NOs：61-63或SEQ ID NO：90)混合物，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的25+2.5μg/mL油包水乳化物。
第8至10組-以總量25μg/mL，等重量比的FMDV VP1 OConsensus(SEQ ID NO：25)與OOzk(SEQ ID NO：28)與OMyanmar(SEQ ID NO：27)作為FMDV疫苗B細胞成分，分別輔以等重量比內源性FMDV Th胜肽SEQ ID NOs：34-63,SEQ ID NOs：61-63、與SEQ ID NO：90，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80
的25+2.5μg/mL油包水乳化物。
第11至13組-以總量25μg/mL，等重量比的FMDV VP1 OConsensus(SEQ ID NO：25)與OOzk(SEQ ID NO：28)與OMyanmar(SEQ ID NO：27)與Asia 1Jiangsu(SEQ ID NO：29)作為FMDV疫苗B細胞成分，分別輔以等重量比內源性FMDV Th胜肽(如，SEQ ID NOs：34-63、SEQ ID NOs：61-63與SEQ ID NO：90)混合物，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的25+2.5μg/mL油包水乳化物。
綜上所述，各試驗在不同時間點開始時，所有豬隻在第0週不具有FMDV抗體。接種1次含各種FMDV VP1之B與內源性Th抗原決定位叢胜肽的多成分FMDV疫苗配方，可刺激大量抵抗目標胜肽OConsensus(SEQ ID NO：25)的抗體，經ELSIA分析，Log10力價為2至3(即，10E2 to 10E3)。
2.牛
32組，每組3頭牛的試驗結果如表19所示。試驗中所使用的配方如下所述。所有的牛以2mL的乳化疫苗配方進行免疫。
第1至8組-分別合併標準FMDV VP1 OConsensus胜肽(SEQ ID NO：25)與等重量比的內源性FMDV Th，包括SEQ ID NOs：34-63(30Ths)；SEQ ID NOs：34-39、44、46-51、53-63(24Ths)；SEQ ID NO：34-39、44、46-51、53-60(21 Ths)；SEQ ID NOs：34、36、37、40-43、45、48、52、53、60-63(15Ths)；SEQ ID NOs：34、36、37、48、50、53(6 Ths)；SEQ ID NOs：62-78(17Th同源物)；SEQ ID NOs：79-87(9 Ths短胜肽資料庫)；以及SEQ ID NO：88、89(2 UBITh®增強Th匣)，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物。
第9至11組-分別合併作為FMDV疫苗B細胞成
分之50μg/mL FMDV VP1 OConsensus胜肽(SEQ ID NO：25)、OOzk(SEQ ID NO：28)、OMyanmar(SEQ ID NO：27)，輔以等重量比之內源性FMDV Th胜肽混合物SEQ ID NOs：88、89(2 UBITh®增強Th卡匣)；SEQ ID NOs：91、92(2 UBITh®增強Th卡匣)；SEQ ID NOs：91、93-95(4 UBITh®增強Th卡匣)、與SEQ ID NOs：34、36、37、40-43、45、48、52、53、60-63(15Ths)，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物。所有的牛以2mL的乳化疫苗配方進行免疫。
第12至16組-分別合併作為FMDV疫苗B細胞
成分之50μg/mL等重量比FMDV VP1 OConsensus胜肽(SEQ ID NO：25)、OOzk(SEQ ID NO：28)、OMyanmar(SEQ ID NO：27)，輔以等重量比之內源性FMDV Th胜肽混合物SEQ ID NOs：34、36、37、40-43、45、48、52、53、60-63(15Ths)，其中B：Th的重量比為1：1、5：1、10：1、50：1與100：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物。所有的牛以2mL的乳化疫苗配方進行免疫。
第17至19組-分別合併作為FMDV疫苗B細胞
成分之50μg/mL等重量比FMDV VP1 OConsensus胜肽(SEQ ID NO：25)、OOzk(SEQ ID NO：28)、OMyanmar(SEQ ID NO：27)、Asia 1Jiangsu(SEQ ID NO：29)，輔以等重量比之內源性FMDV Th胜肽混合物SEQ ID NOs：SEQ ID NOs：34、36、37、40-43、45、48、52、53、60-63(15Ths)；SEQ ID NOs：88、89(2 UBITh®增強Th卡匣)；SEQ ID NOs：91、92(2 UBITh®增強Th卡匣)；SEQ ID NOs：91、93-95(4 UBITh®增強Th卡匣)，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物。所有的牛以2mL的乳化疫苗配方進行免疫。
第25與26組-分別合併作為FMDV疫苗B細胞
成分之50μg/mL等重量比FMDV VP1 OConsensus胜肽(SEQ ID NO：
26)、A24(SEQ ID NO：30)與CIndaial(SEQ ID NO：32)，輔以等重量比之內源性FMDV Th胜肽混合物SEQ ID NOs：91、92(2 UBITh®增強Th卡匣)；SEQ ID NOs：91、93-95(4 UBITh®增強Th卡匣)，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物。所有的牛以2mL的乳化疫苗配方進行免疫。
第27與28組-分別合併作為FMDV疫苗B細胞
成分之50μg/mL等重量比FMDV VP1 OConsensus胜肽(SEQ ID NO：26)、A24(SEQ ID NO：30)與CIndaial(SEQ ID NO：32)，輔以等重量比之內源性FMDV Th胜肽混合物SEQ ID NOs：91、92(2 UBITh®增強Th卡匣)；SEQ ID NOs：91、93-95(4 UBITh®增強Th卡匣)，其中B：Th的重量比為10：1，以Emulsigen D(12%)為佐劑，為含12% Emulsigen D的50+5μg/mL油包水乳化物。所有的牛以2mL的乳化疫苗配方進行免疫。
第29與30組-分別合併作為FMDV疫苗B細胞
成分之50μg/mL等重量比FMDV VP1 OCampos(SEQ ID NO：26)、AArgentina2001(SEQ ID NO：33)、CIndaial(SEQ ID NO：32)，輔以等重量比之內源性FMDV Th胜肽混合物SEQ ID NOs：91、92(2 UBITh®增強Th匣)；SEQ ID NOs：91、93-95(4 UBITh®增強Th匣)，其中B：Th的重量比為10：1，以ISA50V2(Seppics，France)為佐劑，為含0.1% Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物。所有的牛以2mL的乳化疫苗配方進行免疫。
第31與32組-分別合併作為FMDV疫苗B細胞成分之50μg/mL等重量比FMDV VP1 OCampos(SEQ ID NO：26)、AArgentina2001(SEQ ID NO：33)、CIndaial(SEQ ID NO：32)，輔以等重量比之內源性FMDV Th胜肽混合物SEQ ID NOs：91、92(2 UBITh®增強Th匣)；SEQ ID NOs：91、93-95(4 UBITh®增強Th匣)，其中B：Th的重量比為10：1，以Emulsigen D(12%)為佐劑，為含0.1% Tween 80的50+5μg/mL油包水乳化物。所有的牛以2mL的乳化疫苗配方進行免疫。
綜上所述，各試驗在不同時間點開始時，所有牛
在第0週不具有FMDV抗體。接種1次含各種FMDV VP1之B與內源性Th抗原決定位叢胜肽的多成分FMDV疫苗配方，可刺激大量抵抗目標胜肽OConsensus(SEQ ID NO：25)的抗體，即使目標胜肽為B成分片段，但由於具有其它不同血清型相關的VP1 B免疫原(主要是這些VP1胜肽免疫原的高交叉反應)，因此Log 10力價通常仍可達2至3(即，10E2至10E3)。
另人驚訝地，含大範圍B：Th胜肽比例的配方可
有效地刺激受試動物的免疫反應。此FMDV內源性Th叢胜肽的%範圍可低至1%(即Th：B比為1：100)，高至50%(即Th：B比為1：1)(參照第12至16組的牛免疫試驗)，這些配方皆為有效配方，可在初始免疫後3週顯著刺激提升動物血清的中和抗體。
一般來說，最終胜肽FMDV疫苗配方中選擇10%
至20%FMDV Th叢胜肽對FMDV VP1 B抗原決定位叢胜肽的比例(即1：5或1：10)可平衡以肌肉注射單一劑量FMDV疫苗配方之動物體內的B與T免疫反應。
實施例10
接種作為緊急疫苗之多成分B與T抗原決定位FMDV疫苗配方，以保護豬與牛抵抗FMDV攻毒
a.豬的攻毒試驗：以優化之多成分B與T抗原決定位FMDV疫苗配方，設計為可在初始免疫後3週顯著提升血清中和抗體的單一接種緊急疫苗，在台中(台灣)進行6次額外的攻毒以評估並確定實施例9中各配方的保護效力。
特別是，使用FMDV OTaiwan病毒株對接種動物進行FMDV攻毒試驗。依照類似的程序/方法進行攻毒試驗。本實施例揭示一種代表性/典型攻毒試驗(以下內容)。特別是，表20(對應於試驗II的第5、6及7組；試驗IV的第12、13
與14組；以及試驗V的第15、16、17、18與19組，如表25所示)的攻毒試驗詳細揭示及評估於表20至24。豬與牛攻毒試驗的其它組別如表25、26所示。
動物：以32隻，8週齡(0 wpi)的SPF雜交豬進行攻毒試驗。豬不具有FMD，且先前未接種FMD疫苗(即naïve)。豬飼養於行政院農業委員會家畜衛生試驗所(Animal Health Research Institute(AHRI)，Council of Agriculture，Executive Yuan)。此攻毒試驗在AHRI進行，從初始免疫至攻毒完成。
特別飼養條件：依據不同的情況，將不同組別的動物飼養於公用籠子中。對照組則獨立飼養於其它的房間。將出現感染病徵的動物移至隔離的房間。
病毒：FMDV OTAW/97 K病毒株。
套組：FMDV非結構蛋白ELISA套組與FMD胜肽2570a EIA力價套組，如實施例1所述。
分組：將32頭豬隨機分成11組。動物編號、劑量、注射途徑、注射位置如表20所示。
採血時程：接種後(WPV)0、2、4週與攻毒後14天(DPC)。
接種：在0 WPV接種預先設計的劑量。
攻毒時程：在免疫後4週，對接種與控制的豬隻進行攻毒，透過SC途徑將FMDV O-Taiwan(pig-passaged virus)給予至右前腳的蹄球。病毒量為0.5ml(105 TCID50)。
監測分析：攻毒後，持續監測豬的FMD臨床病徵與症狀14天，且每天記錄體溫。
攻毒後，豬的體溫如表21所示。在攻毒後(DPC)14天的監測期間，豬的體溫稍微提升，但大都低於40℃。
中和力價：在接種後(WPV)0、2與4週採血。將每個動物的凝固樣本離心以獲得血清，以進行病毒中和分析。計算中和力價與幾合平均，如表22所示。在劑量依賴方
式下(dose dependent fashion)，所有的配方皆具有顯著的中和抗體(NA)力價。儘管某些組別的NA力價幾合平均值在4 WPV時低於16，而所有實驗組別(100%)在14 DPC時皆受到疫苗保護，但安慰劑控制組或陰性對照組的2頭動物早在第2天即受到感染。試驗V的第19組為陽性對照組，其接種FMDV病毒瓦解物之O血清型疫苗(俄羅斯)，所有的3頭動物在接種1次後皆受到保護。
FMDV NS ELISA：在AHRI利用FMDV非結構蛋
白ELISA分析血清樣本，結果如表23所示。在攻毒前，所有的實驗組別皆為naïve，對FMDV NS蛋白沒有反應。僅安慰劑陰性對照組的動物在14 DPC對NS蛋白產生陽性反應，顯示其感染特性。抗-VP1(胜肽2570a)ELISA滴定套組：利用VP1胜肽2570a的ELISA進行檢測(如實施例1所示)以獲得抗-VP1抗體力價，結果如表24所示。所有的豬隻在免疫後2週都具有顯著的免疫反應。
除了安慰劑陰性對照組，當FMDV胜肽疫苗配方
含有內源性FMDV Th胜肽時，無論其NA力價為何，所有實驗組的動物皆可受到保護。
即使某些實驗組在4 WPV時的中和抗體力價的
幾何平均低於16，這些所有豬隻仍受到保護。這清楚表示除了中和抗體之外，在保護動物抵抗攻毒上還包括其它因素。
說明不論含有內源性FMDV Th胜肽短或長卡匣中皆在單一接種胜肽疫苗配方以刺激細胞性免疫上扮演關鍵性的角色。在與VP1環狀胜肽合併時，含有多達30個FMDV Ths(SEQ ID NOs：34-63)或少至3個先前精製與選擇的Ths(SEQ ID NOs：61-63)可在豬隻產生細胞性免疫以提供保護。合併FMDV VP1 O同源物的疫苗具有相同的效果，如果不是更好的效果，也可保護豬隻抵抗FMDV OTaiwan的攻毒。在整個監測的時程中，接受各疫苗配方的實驗組中沒有FMDV NS蛋白抗體的產生顯示即使在給予高劑量的FMDV攻毒(高於10倍OIE所需的病
毒劑量)也可完全保護這些動物。在所有的測試配方中，相較於2mL劑量，僅接受0.5mL劑量的豬隻也可達到相同的保護效果。
13組(第1-3、5-7、8-10與12-15)使用FMDV
OConsensus(SEQ ID NO：25)作為FMDV VP1 B抗原決定位免疫原。第16組使用FMDV OConsensus、OOzk、OMyanmar(SEQ ID NOs：25,28,and 27)與第17組使用FMDV OConsensus、OOzk、OMyanmar與Asia 1Jiangsu(SEQ ID NOs：25、28、27、與29)分別作為FMDV VP1 B抗原決定位免疫原(相同重量比)。剩餘的組別為安慰劑對照組。
在所有配方中，除了安慰劑對照組之外，所有的
組別將內源性FMDV Th抗原決定位叢胜肽加至FMDV VP1 B抗原決定位組成中，如表25所示。試驗II與IV的各組為給予2mL、1mL、0.5mL劑量以測試各疫苗配方的效力(PD50)。
對所有實驗動物的FMD臨床病徵監測超過14天。在試驗III的第8-10組中，針對不同比例(1：1、5：1與10：1)的FMDV VP1 OConsensus(SEQ ID NO：25)與UBITh®增強FMDV Th卡匣胜肽(SEQ ID NO：90)進行測試。試驗V中也進行不同比例之FMDV VP1組合胜肽免疫原與UBITh®增強FMDV Th卡匣胜肽(SEQ ID NO：90)的類似試驗，分別為第15組與第16組的5：1與10：1。
綜上所述，所有安慰劑的所有動物或陰性對照組
(無注射)早到以FMDV OTaiwan攻毒後第2天皆受到FMDV的
感染，表示所有的攻毒是有效的。僅管在給予高於10倍OIE所需病毒劑量的FMDV攻毒下，也可完全保護這些動物，所有試驗組中所有豬隻在監測期間沒有臨床上的病徵，且FMDV NS ELISA為陰性反應。利用劑量試驗計算PD50，在試驗II與IV中PD50>11.23。
除了30個FMDV Th抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：
34-63)，也選擇3個FMDV Th胜肽(SEQ ID NOs：61-63)來
保護豬隻抵抗FMDV攻毒。可利用賴胺酸間隔子連接此3個胜肽至UBITh®(SEQ ID NO：24)的N端，以促進這3個FMDV豬Th抗原決定位胜肽，如SEQ ID NO：90。FMDV Th抗原決定位胜肽可輔以FMDV VP1 B抗原決定位胜肽免疫原，利用與B抗原決定位胜肽免疫原不同的比例，藉此抵抗FMDV的攻毒。在試驗V的攻毒中，當B抗原決定位胜肽組成為單價O血清型胜肽(SEQ ID NO：25，2570kb)、或O血清型組合(combo)配方(SEQ ID NOs：25、28與27)，或多價O與Asia 1血清型組合配方(SEQ ID NOs：25、28、27與29)時，若含有10%的內源性Th抗原決定位胜肽，則可達到完全的保護。
b.牛攻毒試驗：
在牛的試驗中，利用改良的肌肉注射於牛的後頸背部給予1 x 104 TCID50的FMDV(Bovine Infectious Uni,BIU)進行攻毒。
使用OS/99病毒株進行O血清型攻毒，且使用Asia 1高病原株進行Asia 1血清型的攻毒。每天檢查動物，在接種各FMDV疫苗配方28天後，進行攻毒，監測直腸溫度，且由病變出現的時間與數目來判斷保護分數(protection score)。所有實驗依據中國農業部的規範進行。對劑量進行修改，如使用2X、1X與0.5X的疫苗劑量來評估特定配方的效力。為快速地篩選具保護效力的配方，使用1X的劑量。為了評估疫苗配方效力，依據實驗設計與試驗期間可使用的動物，將動物分成每組3-5隻動物。
在試驗I中，第1至4組中的動物(表26所示)
接種含有作為疫苗配方主成分的優化FMDV VP1 B細胞抗原決定位叢胜肽免疫原(SEQ ID NO：25)，不含任何內源性FMDV Th抗原決定位胜肽，或含10%源自DT、TT、PT類毒素蛋白的外源性Th抗原決定位胜肽，以保護動物抵抗FMDV OOS/99血清型的攻毒。優化的多成分B與T抗原決定位FMDV疫苗配方可作為單一接種的緊急疫苗，給予4次額外的攻毒試驗
以評估實施例9(如表26所示)中所選擇配方的保護效力。
8組(試驗II與III的第6-8組)使用FMDV OConsensus(SEQ ID NO：25)作為FMDV VP1 B抗原決定位免疫原(等重量比)。試驗IV(第16組)使用FMDV OConsensus、OOzk、OMyanmar(SEQ ID NOs：25,28,and 27)作為FMDV VP1 B抗原決定位免疫原(等重量比)。試驗V(第18組)使用FMDV OConsensus、OOzk、OMyanmar、Asia1Jiangsu與AGansu(SEQ ID NOs：25、28、27、29與31)作為FMDV VP1 B抗原決定位免疫原(等重量比)。
在所有的配方中，除了安慰劑對照組與試驗I中的實驗組之外，試驗III的第10組使用內源性FMDV Th抗原決定位叢胜肽(SEQ ID NOs：34-63，30 Ths)；試驗III的第11組使用SEQ ID NOs：34-39、44、46-51與53-60(21 Ths)胜肽；試驗II的第6至8組使用UBITh®增強FMDV Th卡匣胜肽的混合物(SEQ ID NO：88與89)，且試驗IV的第16組與試驗V的第18組使用其它4個卡匣FMDV Th胜肽(SEQ ID NOs：91、93、94與95)混合物，加至FMDV VP1 B抗原決定位組成中，詳細內容如表26所示。
試驗II的第6、7、8組分別在各組給予動物2mL、1mL、0.5mL的疫苗配方以檢測疫苗配方效力，各組動物的保護效力為4/5、4/5、3/5，表示疫苗配方顯著的效力。
綜上所述，安慰劑對照組中所有的動物，早在攻毒後第2天就受到FMDV OOS/99或Asia 1病毒的感染，表示所有攻毒試驗是有效的。在監測期間受保護動物沒有臨床上的病徵，表示所有試驗組具有顯著(4/5或3/5)或完全的保護效果。我們選擇超過30個FMDV Th抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：34-63)、等重量比之21個胜肽(SEQ ID NOs：34-39、44、46-51、53-60)(21 Ths)、等重量比之15個胜肽(SEQ ID NOs：34、36、37、40-43、45、48、52、53、60-63)(15 Ths)，與等重量比之6個FMDV Th胜肽(SEQ ID NOs：34、36、37、48、50、53)(6 Ths)，可對不同遺傳背景的牛產生有效的保護。
這15個與進行一步減少至6個的FMDV牛Th抗原決定位胜肽，可透過賴胺酸間隔子連接3個Th胜肽，形成類卡匣設計(cassette like design)，再進一步連接至UBITh®(SEQ ID NO：24)的N-端，作為FMDV Th卡匣胜肽(SEQ ID NOs：88、89、91、92、93、94、95)，以增強其效力。10%或20%的FMDV Th抗原決定位卡匣胜肽可輔以FMDV VP1 B抗原決定位胜肽免疫原，以誘發所需的FMDV T細胞性免疫。在試驗IV與V中，10%擇自於12個FMDV Th抗原決定位的內源性Th抗原決定位胜肽，在FMDV OOS/99血清型(試驗IV)或高病原性FMDV Asia 1血清型(試驗V)攻毒下，可達成第16、18組的4/5保護力，其在4種UBITh®增加胜肽(SEQ ID NOs：91、93、94、95)中呈卡匣形式，B抗原決定位胜肽為組合O血清型配方(SEQ ID NOs：25,28,and 27)或，多價血清型O、Asia 1與AGansu配方(SEQ ID NOs：25、28、27、29、與31)，顯示VP1 B抗原決定位胜肽的免疫原性。
實施例11
抑制牛感染FMD巴西O型病毒/A24/ CINDAIAL病毒的FMDV三價UBITH®合成胜肽疫苗(巴西)
以下為用於巴西與中國口啼疫病毒(FMDV)之多價UBITH®®
a.巴西
油包水(STERILEWATER-IN-OIL)乳化注射劑
注意：僅用於動物。
說明：UBITh®口蹄疫(FMD)合成胜肽三價疫苗(巴西)為含有三種UBITh® FMD VP1合成胜肽結構的油包水乳化三價疫苗。各胜肽結構由一具有一Brazil O、A24與CIndaial血清型口蹄疫(FMDV)免疫優勢的VP1抗原決定位之合成胜肽所構成，其作為一抗原與一人工T輔助(Th)細胞胜肽UBITh®抗原決定位連接，特別用於南美地區。另外包括四種額外的Th
胜肽，以進一步促進此三種FMDV血清型的細胞性免疫。此三種UBITh® FMD VP1結構與此四種Th結構混合物以一等比例混合。接著，將FMDV B與T抗原決定位相關的合成結構與一油性佐劑混合，以形成油包水乳化物。
適應症：UBITh®口蹄疫(FMD)合成胜肽三價疫苗(巴西)為用於抑制牛對口蹄疫病毒Brazil O、A 24與CIndaial血清型的感染。
劑量與給予：UBITh®口蹄疫(FMD)合成胜肽三價疫苗(巴西)。疫苗配方為經由肌肉注射至前肩的頸部區域。針頭與皮膚表面盡量保持45度角以避免當針頭拔出時，疫苗由針孔漏出。緊急使用時建議使用單一接種劑量。對於先前未接種FMD的牛，必須間隔4-5週給予2mL的免疫劑量，以增加免疫性與延長免疫反應，提供更佳的保護力。之後每6週可給予一額外的免疫。在一個地區感染FMDV的動物中，建議每6個月重複接種。此劑量為2.0mL。
使用說明
˙使用前，將疫苗回溫至室溫。
˙使用前，混合疫苗配方。
˙移除疫苗與消毒的針筒與針頭。
˙經開瓶，立即使用所有成分與裝置。
˙依據政府規範銷毀所有未使用的成分或裝置。
b.中國
抑制FMD中國O型/Asia 1/A
Gansu
病毒感染的牛UBITh®口蹄疫合成胜肽三價疫苗(中國)
注射用的油包水乳化物
注意：僅用於動物。
說明：UBITh®口蹄疫(FMD)合成胜肽三價疫苗(中國)為含有三種UBITh® FMD VP1合成胜肽結構的油包水乳化物三價疫苗。各胜肽結構由一具有一中國O型、Asia 1與AGansu
血清型口蹄疫(FMDV)免疫優勢的VP1抗原決定位之合成胜肽所構成，其作為一抗原與一人工T輔助(Th)細胞胜肽UBITh®抗原決定位連接。另外包括四種額外的Th胜肽，以進一步促進此三種FMDV血清型的細胞性免疫。此三種UBITh®FMD VP1結構與此四種Th結構混合物以一等比例混合。接著，將FMDV B與T抗原決定位相關的合成結構與一油性佐劑混合，以形成油包水乳化物。
適應症：UBITh®口蹄疫(FMD)合成胜肽三價疫苗(中國)為用於抑制牛對口蹄疫病毒中國O血清型/Asia 1/AGansu病毒的感染。
劑量與給予：UBITh®口蹄疫(FMD)合成胜肽三價疫苗(中國)為經由肌肉注射至前肩的頸部區域。針頭與皮膚表面盡量保持45度角以避免當針頭拔出時，疫苗由針孔漏出。緊急使用時建議使用單一接種劑量。對於先前未接種FMD的牛，必須間隔4-5週給予2mL的免疫劑量，以增加免疫性與延長免疫反應，提供更佳的保護力。之後每6週可給予一額外的免疫。在一個地區感染FMDV的動物中，建議每6個月重複接種。此劑量為2.0mL。
使用說明
˙使用前，將疫苗回溫至室溫。
˙使用前，混合疫苗配方。
˙移除疫苗與消毒的針筒與針頭。
˙經開瓶，立即使用所有成分與裝置。
˙依據政府規範銷毀所有未使用的成分或裝置。
<110> 美國聯合醫學公司(United Biomedical,Inc.)
<120> 口蹄疫合成胜肽緊急疫苗
<130> 1004263.209WO
<150> PCT/US12/65386
<151> 2012-11-16
<160> 108
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UBI Foot-and-mouth disease virus(FMDV)O Consensus sequence VP1 134-158,cyclized.
<400> 1
<210> 2
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Foot-and-mouth disease virus(FMDV)O Consensus VP1 129-168,(2570A),Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 2
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(41)
<223> Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)O Consensus VP1 129-168,(2570A),Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 3
<210> 4
<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(41)
<223> UBI FMDV Taiwan 2956a VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 4
<210> 5
<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(41)
<223> UBI FMDV O O1K/O1BFS,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 5
<210> 6
<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(41)
<223> UBI FMDV China(Gd/86)VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 6
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<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(41)
<223> UBI FMDV O Swine/Cattle/O/MYA/7/02 VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 7
<210> 8
<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(41)
<223> UBI FMDV O/Ozk/93,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 8
<210> 9
<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> UBI Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)O/A/58,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<222> (1)..(41)
<223> UBI FMDV O/A/58,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 9
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(41)
<223> UBI FMDV O/OZK/93,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 10
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(41)
<223> UBI FMDV O Lanzhou,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UBI Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)Asia 1 Consensus,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positionssubstituted by Cys and cyclized.
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<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> UBI FMDV Asia 1 Yunnan PRC,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<210> 14
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<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(39)
<223> UBI FMDV Asia 1 KZC-2/10 PRC,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 14
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<211> 39
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(39)
<223> UBI FMDV Asia 1 JiangSu/China/2005,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UBI Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)A consensus,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> UBI FMDV A consensus,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<211> 40
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> UBI FMDV A24 Cruzeiro California,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<211> 40
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> UBI FMDV A Gansu/China/60Y,VP1.Peptide with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<211> 40
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> UBI FMDV A XinJiang/China/58Y,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 19
<210> 20
<211> 40
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> UBI FMDV A22 A Mahmatli/Tur/65Y,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 20
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<211> 40
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> UBI FMDV A Argentina 2001Y,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(38)
<223> UBI FMDV C3 Indaial/Brazil/84Y,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<211> 38
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(38)
<223> UBI FMDV C3 Argentina/83c,VP1.Peptides with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Combinatorial modified T helper peptide from Measles virus
<220>
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<222> (7)..(7)
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
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<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> linked spacer,K(20)is epsilon K.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(61)
<223> UBI FMDV VP1 2570a,with both 134 and 158 AA positions
substituted by Cys and cyclized.
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<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
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<223> Combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> K or R
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<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(61)
<223> UBI FMDV VP1 O Campos/Brazil/58Y,with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 26
<210> 27
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
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<221> MISC_FEATURE
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<223> UBI FMDV VP1 O swine/Cattle/O/MYA/7/02,with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> UBI FMDV VP1 O/Ozk/93,with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Linked spacer,K(20)is epsilon K.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(59)
<223> UBI FMDV VP1 Asia 1 JiangSu/China/2005,with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 29
<210> 30
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Linked spacer,K(20)is epsilon k.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(60)
<223> UBI FMDV VP1 A24 Cruzeiro California,with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
<400> 30
<210> 31
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> S or T
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<221> MISC_FEATURE
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<223> K or R
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<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> H or T
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<221> MISC_FEATURE
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<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Linked spacer,K(20)is epsilon K.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(60)
<223> UBI FMDV VP1 A Gansu/China/60Y,with both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
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<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
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<221> MISC_FEATURE
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<223> UBI FMDV VP1 C3 Indaial/Brazil/84Y,with VP1 both 134 and 158 AA positions substituted by Cys and cyclized.
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<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitope from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Artificial combinatorial modified T helper peptide sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Linked spacer,K(20)is epsilon K.
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<211> 19
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(I759-L777)[FMDV VP1 35-53].
<400> 40
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(V786-L800)[FMDV VP1 62-76].
<400> 41
<210> 42
<211> 21
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(21)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(G808-P828)[FMDV VP1 84-104].
<400> 42
<210> 43
<211> 22
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(22)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P835-G856)[FMDV VP1 111-132].
<400> 43
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(T895-C911)[FMDV VP1 167-183].
<400> 44
<210> 45
<211> 22
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(22)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P912-V933)[FMDV VP1 188-209].
<400> 45
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(R924-L937)[FMDV VP1 200-213].
<400> 46
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P954-V968)[FMDV 2B 1-15].
<400> 47
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(F1093-K1106)[FMDV 2B 140-153].
<400> 48
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(L1108-N1122)[FMDV 2C 1-15].
<400> 49
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(S1143-I1157)[FMDV 2C 36-50].
<400> 50
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(V1148-R1162)[FMDV 2C 41-55].
<400> 51
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(A1446-K1450)[FMDV 3A 21-35].
<400> 52
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(N1516-K1529)[FMDV 3A 91-104].
<400> 53
<210> 54
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(T1551-L1564)[FMDV 3A 101-114].
<400> 54
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(E1551-N1564)[FMDV 3A 126-139].
<400> 55
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(G1579-K1592)[FMDV 3B1 1-14].
<400> 56
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P1584-L1597)[FMDV 3B1 6-19].
<400> 57
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P1607-A1620)[FMDV 3B2 6-19].
<400> 58
<210> 59
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P1631-N1644)[FMDV 3B3 6-19].
<400> 59
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(M1878-F1892)[FMDV 3D 16-30].
<400> 60
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(I1918-D1932)[FMDV 3D 56-70].
<400> 61
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(A2108-V2122)[FMDV 3D 246-260].
<400> 62
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(L2248-K2262)[FMDV 3D 386-400].
<400> 63
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(I1918-D1932)as homologue of[FMDV 3D 56-70].
<400> 64
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(A2108-V2122)as homologue of[FMDV 3D 246-260].
<400> 65
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(L2248-K2262)as homologue of[FMDV 3D386-400].
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<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(F1093-K1106)as homologue of[FMDV 2B 140-153].
<400> 67
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(F1093-K1106)as homologue of
[FMDV 2B 140-153].
<400> 68
<210> 69
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(N1516-K1529)as homologue of[FMDV 3A 91-104].
<400> 69
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(N1516-K1529)as homologue of[FMDV 3A 91-104].
<400> 70
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(M1878-F1892)as homologue of[FMDV 3D 16-30].
<400> 71
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(M1878-F1892)as homologue of[FMDV 3D 16-30].
<400> 72
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(S221-M235)as homologue of[FMDV VP4 20-34].
<400> 73
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(S221-M235)as homologue of[FMDV VP4 20-34].
<400> 74
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
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<400> 75
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P360-K374)as homologue of[FMDV VP2 74-88].
<400> 76
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
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<400> 77
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<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(D582-A596)as homologue of[FMDV VP3 78-92].
<400> 78
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(I1918-D1932)[FMDV 3D 56-70].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> K or R
<400> 79
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O strain TAW/2/99(A2108-V2122)[FMDV 3D 246-260].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> I or L
<400> 80
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(L2248-K2262)[FMDV 3D386-400].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> K or R
<400> 81
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(F1093-K1106)[FMDV 2B 140-153].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> K or R
<400> 82
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(N1516-K1529)(FMDV 3A 91-104)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> D or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> K or R
<400> 83
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(M1878-F1892)[FMDV 3D 16-30].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> V or L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> V or I or L
<400> 84
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(S221-M235)[FMDV VP4 20-34].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> I or L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> I or L or V
<400> 85
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P360-K374)[FMDV VP2 74-88].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> K or R
<400> 86
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(D582-A596)[FMDV VP3 78-92].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> A or S or V
<400> 87
<210> 88
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial modified T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(65)
<223> UBITh(R)3-K-[FMDV 2B 140-153]-K-[FMDV 3A 91-104]-K-[FMDV 3D 16-30]from AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> K is linked spacer.
<400> 88
<210> 89
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> Combinatorial modified T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(67)
<223> UBITh(R)3-K-[FMDV VP4 20-34]-K-[FMDV VP2 74-88]-K-[FMDV VP378-92]from AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> k is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> k is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> K is linked spacer.
<400> 89
<210> 90
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial modified T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(67)
<223> UBITh(R)3-K-[FMDV 3D 56-70]-K-[FMDV 3D 248-260]-K-[FMDV 3D 386-400]AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is linked spacer sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> K or R
<400> 90
<210> 91
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial modified T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(65)
<223> UBITh(R)3-K-[FMDV 2B 140-153]-K-[FMDV 3A 91-104]-K-[FMDV 3D 16-30]from AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> D or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> V or L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> V or I or L
<400> 91
<210> 92
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(67)
<223> UBITh(R)3-K-[FMDV VP420-34]-K-[FMDV VP2 74-88]-K-[FMDV VP3 78-92]from AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> I or L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> I or L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> H or R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> L or C or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> E or H or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> T or A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> H or K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> K or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> A or S or V
<400> 92
<210> 93
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(67)
<223> UBITh(R)3-K-FMDV Th library from polyprotein type O,A,C and Asia-1 and type O-1(ABR19839)sequence based construct[S221-M235]-K-[P360-K374]-K-[D582-A596].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> I or L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> I or L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> P or N or S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> R or H or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C or M or I or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> Y or H or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> T or S or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> H or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> K or R or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> A or S
<400> 93
<210> 94
<211> 84
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial T helper Sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(84)
<223> UBITh(R)3-K-FMDV Th library from polyprotein type O,A,C and Asia-1 and type O-1(ABR19839)sequence based construct[I759-L777]-K-[G808-P828]-K-[P912-V933].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> K or Q or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> V or L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> T or Q or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> P or V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> K or S or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> D or S or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> Q or N or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> I or T or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> N or H or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> V or T or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> D or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> L or V or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> N or K or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> L or V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> P or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> E or V or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> D or E or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> T or Q or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (68)..(68)
<223> A or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (69)..(69)
<223> I or L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (70)..(70)
<223> H or D or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (71)..(71)
<223> P or T or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (72)..(72)
<223> S or T or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> K or Q or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (74)..(74)
<223> A or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> H or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> K or E or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> V or E or A
<400> 94
<210> 95
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide containing artificial T helper epitope from measles virus and B cell epitopes from foot-and-mouth disease virus(FMDV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(74)
<223> UBITh(R)3-K-FMDV Th library from polyprotein type O,A,C and Asia-1 and type O-1(ABR19839)sequence based construct[V786-L800]-K-[P835-G856]-K-[A1446-K1460].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> T or A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> K is linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> L or V or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> N or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> K is lined spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> I or V
<400> 95
<210> 96
<211> 24
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(24)
<223> A12(134-159)from FMDV VP1.
<400> 96
<210> 97
<211> 35
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(35)
<223> A12(134-169)from FMDV VP1.
<400> 97
<210> 98
<211> 35
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(35)
<223> A12[134(N-C)-158(Q-C)-169]from FMDV VP1,cyclized.
<400> 98
<210> 99
<211> 40
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> A12[129-134(N-C)-158(Q-C)-169]from FMDV VP1,cyclized.
<400> 99
<210> 100
<211> 60
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is epsilon K as a linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(60)
<223> A12[129-134(N-C)-158(Q-C)-169]from FMDV VP1,cyclized.
<400> 100
<210> 101
<211> 56
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(56)
<223> UBITh-K-O library[134-158(T-C)-169],cyclized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is epsilon K as a linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> G or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Q or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> A or E
<400> 101
<210> 102
<211> 59
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> Combinatorial T helper sequence.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> K is epsilon K as a linked spacer.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(59)
<223> Asia library[129-134(T-C)-158(R-C)-169]from FMDV VP1,cyclized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> R or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> R or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Q or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> T or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> F or N
<400> 102
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P360-K374)as homologue of[FMDV VP2 74-88].
<400> 103
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-month disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P360-K374)as homologue of[FMDV VP2 74-88].
<400> 104
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> AJ539137 FMDV O,strain TAW/2/99(P360-K374)[FMDV VP2 74-88].
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> R or K
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> S or C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> L or I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> K or R
<400> 105
<210> 106
<211> 211
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(211)
<223> NCBI Reference Sequence：NP_740460.1
<400> 106
<210> 107
<211> 2332
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2332)
<223> GenBank：AJ539137.1
<400> 107
<210> 108
<211> 2332
<212> PRT
<213> Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2332)
<223> GenBank：ABR19839.1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (268)..(268)
<223> Xaa may be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (360)..(360)
<223> Xaa may be any amino acid
<400> 108
Claims (16)
- 一種口蹄疫疫苗，包括，a)一合成免疫原胜肽，其包括一FMDV VP1環狀B細胞抗原決定位序列與一人工Th抗原決定位序列；b)一分離胜肽，其包括一合成的FMDV內源性T輔助抗原決定位序列；以及c)獸藥上可接受之載體或佐劑，其中，該(a)FMDV VP1環狀B細胞抗原決定位序列包括擇自SEQ ID NO：1至23、98及99的胺基酸序列；該(b)FMDV內源性T輔助抗原決定位序列擇自於下列所組成之族群：SEQ ID NO：34至95及其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗，其中該(a)FMDV VP1環狀B細胞抗原決定位序列共價連接至該人工Th抗原決定位序列的C端。
- 如申請專利範圍第2項所述之口蹄疫疫苗，其中該人工Th抗原決定位序列為SEQ ID NO：24。
- 如申請專利範圍第2項所述之口蹄疫疫苗，其中該人工Th抗原決定位序列透過一間隔子連接至該FMDV VP1環狀B細胞抗原決定位序列，該間隔子包括ε K(ε賴胺酸)。
- 如申請專利範圍第2項所述之口蹄疫疫苗，其中該(a)合成免疫原胜肽擇自於下列所組成之族群：SEQ ID NO：25至33及其組合。
- 如申請專利範圍第5項所述之口蹄疫疫苗，其中該(a)合成免疫原胜肽為SEQ ID NO：25、27、28、29及/或其組合。
- 如申請專利範圍第5項所述之口蹄疫疫苗，其中該(a)合成免疫原胜肽為SEQ ID NO：25、27、28、29、31及/或其組合。
- 如申請專利範圍第5項所述之口蹄疫疫苗，其中該(a)合成免疫原胜肽為SEQ ID NO：26、30、32、33及/或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗，其中該(a)合成免疫原胜肽的總含量為每劑介於約10μg至約1mg之間。
- 如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗，其中該載體或佐劑擇自於下列所組成之族群：Montanide ISA 50V、聚氧乙烯(20)山梨醇酐單油酸、Emulsigen、Emulsigen D及CpG寡核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗，其中該(b)FMDV內源性T輔助抗原決定位序列為SEQ ID NO：34-63、90及/或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗’其中該(a)合成免疫原胜肽為SEQ ID NO：25、27、28、29及/或其組合，且該(b)FMDV內源性T輔助抗原決定位序列為SEQ ID NO：34-63、90及/或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗，其中該(b)FMDV內源性T輔助抗原決定位序列為SEQ ID NO：91-95及/或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗，其中該(a)合成免疫原胜肽為SEQ ID NO：26、30、32、33及/或其組合，且該(b)FMDV內源性T輔助抗原決定位序列為SEQ ID NO：91-95及/或其組合。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗的用途，其用於製造引發豬隻抵禦口蹄疫之保護性免疫反應的藥劑。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之口蹄疫疫苗的用途，其用於製造引發牛隻抵禦口蹄疫之保護性免疫反應的藥劑。
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