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TWI615172B - 低強度脈衝式超音波裝置用於治療及／或預防神經退化性疾病的用途 - Google Patents

低強度脈衝式超音波裝置用於治療及／或預防神經退化性疾病的用途 Download PDF

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TWI615172B
TWI615172B TW103130608A TW103130608A TWI615172B TW I615172 B TWI615172 B TW I615172B TW 103130608 A TW103130608 A TW 103130608A TW 103130608 A TW103130608 A TW 103130608A TW I615172 B TWI615172 B TW I615172B
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low
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楊逢羿
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國立陽明大學
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Priority to US14/663,152 priority patent/US20160067526A1/en
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Abstract

本發明揭露藉由西方墨點法分析可測得，低強度脈衝超音波(LIPUS)的刺激可增加BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白在大鼠腦星狀膠細胞的表現量，而整合蛋白抑制劑(RGD胜肽)減弱LIPUS誘導神經滋養因子表達的能力，因此，LIPUS可通過活化整合蛋白受體訊號傳導促進神經滋養因子的蛋白質表現量。此外，LIPUS刺激可保護細胞對抗鋁毒，氯化鋁的半致死劑量可從3.77增加至6.25mM。在活體行為實驗，LIPUS能顯著改善鋁誘導的記憶障礙並減少腦損傷。本發明揭露，一種穿顱脈衝超音波能夠增加所有可能對神經退化性疾病的有益作用的神經滋養因子的蛋白表現量。

Description

低強度脈衝式超音波裝置用於治療及/或預防神經退化性疾病的用途
本發明總體上涉及一種低強度脈衝式超音波裝置的新穎醫療用途，更具體而言，本發明涉及一種低強度脈衝式超音波裝置用於製造治療神經退化性疾病醫療器具的用途。
超音波(Ultrasound，US)可以傳送至標的組織，並通過熱或非熱效應產生生理性改變。低強度脈衝式超音波(Low-intensity pulsed US，LIPUS)已知受損傷後可加速骨及組織再生(Tempany等人，Radiology,226：897-905,2003)，先前研究同樣表示，LIPUS對在受損的神經中軸突再生具有正向效應(Lu等人，The American journal of sports medicine,34：1287-1296,2006；Crisci及Ferreira,Ultrasound in medicine & biology,28：1335-1341,2002)。穿顱脈衝式超音波(transcranial pulsed US)可刺激完整腦部電路及腦源性神經滋養因子(BDNF)，一種調節長期記憶的重要分子，並促進其表現量。這些結果廣泛應用於神經科學，包括經由LIPUS增強神經滋養因子的蛋白表現量，具有益於治療腦部退化性疾病的潛力。
鋁暴露已知為具有神經毒性，並且誘發認知功能缺陷及老年癡呆症，雖然AD及鋁的關聯性仍存在爭議，經由實驗證實長期暴露鋁造 成神經生理上的改變及認知障礙，該些症狀類似於AD。鋁暴露更加速beta-澱粉狀蛋白(Aβ)及其寡聚物的生成，亦有文獻指出大鼠長期暴露於鋁，其腦部乙醯膽鹼酯酶(AChE)活性與對照組大鼠比較明顯地增加，於細胞分子層次而言，AD特徵在於神經傳導物乙醯膽鹼的缺乏，胞外Aβ沉澱，神經纖維纏繞及損失神經元。
血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)保護免受外來物質進入，是一種高度特化的腦內皮結構。然而，一個完整BBB亦是與某些藥物治療腦部疾病的主要障礙，因為它阻止具神經治療性的大分子進入腦部。近年來，神經退化性疾病，如阿茲海默氏症(AD)及帕金森氏症(PD)，對於全球老化族群的健康儼然為一巨大的挑戰。然而，各種研究顯示，BDNF具有治療AD的潛力。同時，膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)，另一種神經滋養因子，已被確定為最適合治療PD的候選。此外，越來越多的證據認為聚焦式超音波(focused US，FUS)所誘發的血腦屏障干擾為一個有效的工具，可用於直接遞送此類神經滋養因子進入中樞神經系統，並且增加BDNF及GDNF表現量，分別導致神經元再生及對多巴胺系統產生強烈的的滋養效應。在神經退化性疾病(例如AD)微血管長度會開始減少，並導致能量受質跨越血腦屏障的運送，大腦內神經毒素的清除也隨之減少。最近FDG(18-fludeoxyglucose，18-氟去氧葡萄糖)-PET(正電子發射斷層掃描)成像研究已經證明，輕度認知障礙的個體在神經退化之前對葡萄糖的利用率會降低。此外，在AD患者中，葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)在腦部微血管亦降低其表現量。這些結果表明，由於GLUT1不足導致BBB代謝活動持續短缺的發生。本發明於此 說明書所揭露，LIPUS的刺激可增加培養的星狀細胞內神經滋養因子及GLUT1的蛋白質表現量。此外，結果顯示LIPUS在動物模式中鋁所引發的細胞毒性及記憶損傷具有保護作用。此機制提出了一種新穎的治療策略用於治療神經退化性疾病。
具有微氣泡FUS可能是用於遞送神經滋養因子或抗體直接進入腦的一種有效方法，因為一個FUS超音波導致微血管中的微氣泡膨脹及收縮，造成緊密連接的開放。這樣的機械效應可能是造成血腦屏障破壞，並且慣性孔洞化導致組織損傷。該FUS-誘導的血腦屏障破壞的事實是造成出血，此技術不能被認為是完全無害的。因此，採用這種方法時該安全問題必須小心地考量在治療應用中。
於是，本發明係關於一種低強度脈衝超音波用於製造用於治療神經退化性疾病之醫療器具的用途，其係藉由以穿顱低強度脈衝式超音波刺激患者腦部，增強在星狀細胞神經滋養因子的蛋白表現量並提高記憶力與降低腦組織損傷。本發明是首次揭露LIPUS在無微氣泡情況下可以用來增強在星狀細胞神經滋養因子的蛋白表現量並提高記憶力與降低腦組織損傷。單獨LIPUS提高能夠在治療腦部疾病不引起血腦屏障破壞或造成的任何組織損傷的可能性。
實際應用中，超音波是一個已經被用在共同治療許多軟組織損傷的物理療法。以往的研究表明，與LIPUS適當模擬可加速成骨細胞增殖及分化，促進骨折癒合。然而，由LIPUS改變細胞的蛋白質代謝功能目前還不清楚。
於是，本發明描述一種低強度脈衝超音波裝置用於治療神經退化性疾病的用途。該用途包括：提供一種低強度脈衝超音波裝置；以低強度脈衝超音波震盪的條件下，可增加腦部星狀細胞BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白的表現量。
以臨床施用而言，施予外生性的BDNF及GDNF亦可能具有副作用，例如分別為前癲癇效應及小腦受損。此外，在部分AD患者，血腦屏障的破壞會使病情加重。
於是，本發明之另一方面係提供一種穿顱，低強度脈衝超音波可應用於治療神經退化性疾病醫療器材的用途，其由於不需要外生性因子或手術，故能維持大腦BBB完整性，有益於保護神經，並且藉由調控神經滋養因子及運輸蛋白的表現量，而提供一種用於治療腦部疾病的新穎治療策略。
於本發明之具體實施態樣，係提供一種用於治療神經退化性疾病之醫療器具，其包含：一低強度脈衝超音波裝置，包含：一聚焦壓電式傳感器，其超音波空間峰值時間平均(spatial peak temporal average,Ispta)強度(intensity)範圍係介於1mW/cm2~1W/cm2；操作頻率(operation frequency)範圍係介於20K~5MHz；一函數產生器；一功率放大器；及一功率感測器組件。
於本發明之某些具體實施態樣，所述之聚焦壓電式傳感器之操作頻率為1百萬赫茲。於本發明之又一些具體實施態樣，所述之低強度脈衝超音波裝置係用於超音波震盪受試者頭部3次，每一次震盪時間為持續5分鐘，間隔時間為5分鐘，總共接受超音波施打時間為15分鐘。
於本發明之其他具體實施態樣，該低強度脈衝超音波裝置係在超音波施打後8小時，增加腦部星狀細胞BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白的表現量。於本發明之另一具體實施態樣，該低強度脈衝超音波係透過整合蛋白增加神經滋養因子。於本發明之又一具體實施態樣，該低強度脈衝超音波係用於改善氯化鋁誘導的記憶障礙並降低腦組織損傷。
圖1為本發明一項較佳具體實施例提出用於治療神經退化性疾病之醫療器具之示意圖。
圖2為說明超音波參數對於細胞生長的影響。(A)以LIPUS超音波震盪，工作週期範圍從0(對照組)至100%星狀細胞的生長情形。(B)以50%工作週期，單一及多重LIPUS刺激處理，星狀細胞不同時程生長的情形。*及#分別表示於0時對照組及LIPUS刺激處理相同時間點的顯著差異。(*，#,p<0.05；**,p<0.01,n=4)。
圖3為說明LIPUS刺激處理培養的星狀細胞其蛋白表現量增加。大鼠星狀細胞以多重LIPUS刺激處理，超音波震盪時間為15分。細胞以西方墨點法於0，2，4及8小時測量該蛋白質表現量(A)BDNF(B)GDNF(C)VEGF(D)GLUT1。*表示比較LIPUS刺激後的處理組與0小時的顯著差異。(*,p<0.05；**,p<0.01,n=4)。
圖4為說明整合蛋白參與LIPUS誘發神經滋養因子表現量的增加。星狀細胞以整合蛋白抑制劑(RDG胜肽)前處理30分鐘，再以多重LIPUS刺激震盪 15分鐘。該蛋白相對表現量(A)BDNF(B)GDNF及(C)VEGF以西方墨點法測量。與對照組比較(n=4)，**,p<0.01。
圖5為說明有無LIPUS刺激的情況下，氯化鋁濃度依賴細胞存活率減少的影響。有無存在LIPUS刺激的情況下，細胞以不同濃度的氯化鋁處理24小時。**及#分別表示與對照組細胞比較，無氯化鋁處理及以相同濃度氯化鋁處理的顯著差異(#，p<0.05；**，p<0.01，n=4)。
圖6為說明由於LIPUS處理造成大鼠腦部蛋白表現量的增加。每一大腦半球以多重LIPUS刺激震盪15分鐘。該震盪的區域以西方墨點法量測該蛋白(A)BDNF(B)GDNF(C)VEGF(D)GLUT1在刺激後4小時的表現量。*表示比較處理後的大腦半球及同側大腦半球對照組的顯著差異(*，p<0.05；**，p<0.01，n=4)。
圖7為說明以水迷宮試驗超音波對於記憶保留的影響。觀察氯化鋁處理之後的大鼠，有無LIPUS刺激存在的情況下於第20天的獲得潛伏期(acquisition latency，AL)，及於第21天與第42保留潛伏期(retention latency，RL)。*及#分別表示比較於第20天AL群組及於第21天RL群組的顯著差異，†及‡分別表示比較以LIPUS刺激及無LIPUS刺激的氯化鋁處理群組的顯著差異(*，#，†，‡，p<0.05，n=6)。
圖8為透過舉臂式十字迷宮試驗超音波對於大鼠記憶表現的影響。觀察氯化鋁處理之後的大鼠，有無LIPUS刺激存在的情況下於第20，21及42天的轉移潛伏期(transfer latency，TL)，*及#分別表示比較於第20天及第21天轉移潛伏期的顯著差異，†及‡分別表示比較氯化鋁處理之後的大鼠，有無LIPUS刺激存在的情況下於第21及第42天的顯著差異(*，#，†，‡，p<0.05，n=6)。
圖9為LIPUS對於AlCl3處理大鼠(A)鋁濃度及(B)乙醯膽鹼酯酶活性的影響。*，#及†分別表示與對照組，LIPUS及AlCl3比較的顯著差異(*,#,†,p<0.05,n=4)
圖10為LIPUS對於AlCl3處理大鼠的海馬迴及海馬齒狀迴，其腦部損傷的影響，如圖所示，對照大鼠，LIPUS處理大鼠，AlCl3處理大鼠及投予AlCl3後再以LIPUS處理的大鼠，其H&E染色的腦部切片，比例尺在放大區域為100μm。
圖11為LIPUS對於AlCl3處理大鼠的海馬迴及海馬齒狀迴，其細胞凋亡的影響，如圖所示，對照大鼠，LIPUS處理大鼠，AlCl3處理大鼠及投予AlCl3後再以LIPUS處理的大鼠，其H&E染色的腦部切片。與AlCl3組比較，再以LIPUS處理的大鼠中其發現細胞凋亡的細胞較少，比例尺在放大區域為100μm。
本發明係描述一種低強度脈衝式超音波裝置應用於治療神經退化性疾病的用途。由以下之描述及對應之圖式所表示的實驗數據可證明，以本發明之低強度脈衝式超音波穿透細胞或大鼠腦部星狀膠細胞，可以增加內生性神經滋養因子BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白的表現量，並顯著改善氯化鋁誘導的記憶障礙並減少腦損傷。
脈衝式超音波裝置
本發明之特徵係提供一種用於治療神經退化性疾病之醫療器具，其包含：一低強度脈衝超音波裝置，包含：一聚焦壓電式傳感器，其超音波空間峰值時間平均(spatial peak temporal average,Ispta)強度 (intensity)範圍係介於1mW/cm2~1W/cm2；操作頻率(operation frequency)範圍係介於20K~5MHz；一函數產生器；一功率放大器；及一功率感測器組件。參見圖1，於較佳的一種具體實施例，所述之低強度脈衝超音波係指一種多重刺激，操作頻率為1百萬赫茲的一種低強度脈衝式超音波。
可由此低強度脈衝式超音波刺激的條件下，且經由該所屬技術領域習知的方法，例如以抗BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白抗體進行西方墨點法(western blotting)，來確認該些蛋白在星狀膠細胞或腦部的表現量。
於以下之活體外實驗中，本發明之醫療器具所施予的LIPUS係以1-M赫茲平面壓電式傳感器(A394S-SU；Panametrics,Waltham,MA,USA)，產生於50%工作週期的50毫秒突發長度，及一10赫茲的重複頻率。而於活體內實驗中，所施予的LIPUS係以1-M赫茲聚焦壓電式傳感器(A392S；Panametrics,Waltham,MA,USA)，產生於5%工作週期的50毫秒突發長度，及1赫茲的重複頻率。
所述之聚焦式傳感器，係安裝在一充滿去離子及脫氣水的可動式錐體，其頂端由聚氨酯膜覆蓋，離錐體頂端約5.0mm放置聚焦區中心。為了導引該聲波束至大腦指定的區域(於前囟後端2.3mm及側端2.5mm)，使用立體定位儀以定位聚焦式傳感器。
本發明之醫療器具亦包含一函數產生器(33220A,Agilent Inc.,Palo Alto,USA)，連接至功率放大器(500-009,Advanced Surgical Systems,Tucson,AZ)以產生超音波穿透訊號。所述之功率計/傳感器組件(Bird 4421,Ohio,USA)，係用以測量輸入電功率。該空間峰值時間平均強 度(ISPTA)在脫氣水中以一輻射力平衡(RFB,Precision Acoustics,Dorset,UK)測量在平板及聚焦式傳感器頭分別為110mW/cm2及760mW/cm2。
在活體外實驗中，LIPUS從平面傳感器穿透至細胞培養板的底部，在活體內實驗中，LIPUS從大鼠的大腦頂部開始穿透，超音波穿透凝膠(Pharmaceutical Innovation,Newark,NJ,USA)覆蓋於傳感器與平板或大腦之間的區域，將超音波穿透作最大限度。於本發明之一具體實施態樣中，施予LIPUS處理時，係將星狀膠細胞及每一大鼠的大腦半球以三次超音波震盪，每個超音波震盪的持續時間為5分鐘，超音波震盪處理的時間間隔為5分鐘。
星狀膠細胞的培養
一RBACs(CTX TNA2)獲得自細胞株生物資源保存及研究中心(新竹，台灣)。該細胞生長在95%空氣，5%CO 2於6孔盤，以Dulbecco modified Eagle medium培養(DMEM；Gibco,New York,USA)，並補充10%fetal bovine serum(FBS；Biological industries,Kibbutz Beit Haemek,Israel)，盤尼西林(100U/ml)，鏈黴素(100μg/ml)(Gibco,New York,USA)，調整pH至7.6。後續兩個實驗中製備不同的細胞密度：細胞密度為1×105用於細胞存活率分析(MTT)，及細胞密度為1×106進行西方墨點法分析。
動物製備
所有程序皆按照由國立陽明大學動物護理和使用委員會批准的準則。本研究中使用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠體重從280至300g。LIPUS刺激之前，每個動物以俯臥位麻醉，吸入含2%異氟烷的氧氣(2l/min)，並使用加熱墊使體溫維持在37℃。大鼠頭固定在立體定位儀 (Stoelting,Wood Dale,IL,USA)，並且修剪顱骨頂部以接受LIPUS刺激。一個實驗流程中，首先使用正常大鼠評估在LIPUS刺激4小時後，神經滋養因子的蛋白表現量。另一個實驗流程中，LIPUS對於AlCl3處理(100mg/kg，口服給藥)大鼠的影響，在第21及42天藉由行為試驗進行評估。
細胞生長分析
細胞生長由MTT分析評估。此方法是基於MTT進展形成一相應的甲臢(Formazan)產物。將細胞以200μl，濃度為5mg/ml的MTT於37℃，95%空氣-5%CO2下培養4小時，將細胞溶解在1ml DMSO，並使用分光光度計進行定量於波長570nm的吸光值。
細胞存活率測量
每個細胞開始培養後的15小時以LIPUS處理，AlCl3(Acros Organics,New Jersey,USA)溶解於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，並在每一實驗開始時新鮮製備。鋁含量由製備鋁標準溶液所繪製的標準曲線測定。LIPUS刺激後4小時，加入不同劑量(0，2，4，6及8mM)AlCl3至RBACs，然後AlCl3處理24小時後進行MTT分析以測定細胞存活率。
西方墨點法分析
RGD胜肽購自Santa Cruz Biotechnology(Paso Robles,CA)，在活體外實驗中，經多重LIPUS刺激的RBACs在培養0，2，4及8小時後，該RBACs以冷PBS洗滌並在冰上以T-Per萃取劑裂解(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL)30分鐘。在活體內實驗中，在多重LIPUS刺激後4小時犧牲動物。在焦點區的新鮮腦組織以含有Halt蛋白酶抑制劑(Pierce Biotechnology,Inc.)的T-Per萃取劑均質化。裂解物經由離心，收集 上清液，蛋白質濃度以蛋白分析試劑(Bio-Rad,CA,USA)進行測定。含有30μg蛋白的樣品在12%聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)上進行解析，並轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad,CA,USA)。之後將膜以阻斷緩衝液(Hycell,Taipei,Taiwan)阻斷至少1小時，再將PVDF膜與含有兔抗BDNF(1：250,sc-546,Santa Cruz,CA,USA)，GDNF(1：250,sc-328,Santa Cruz,CA,USA)，VEGF(1：250,sc-152,Santa Cruz,CA,USA)抗體的溶液在4℃反應過夜，及GLUT1(1：200,NB110-39113,Novus Biologicals,CO,USA)。用PBST緩衝液洗滌後，將膜與二級抗體在室溫下反應1小時。再以PBST緩衝液洗滌後，以Western Lightning reagent Pro(Bio-Rad,California,USA)產生訊號，並由ImageQuantTM LAS 4000生物分子成像儀(GE Heathcare Bio-Sciences AB,Sweden)進行分析。
行為評估
在活體內的行為實驗中，24隻SD大鼠隨機分為4組，每組6隻動物。該動物以媒介物處理作為對照組，第二組中動物接受LIPUS處理達49天，第三組動物為AlCl3處理組，僅接受AlCl3(100mg/kg)達42天。第四組動物先以LIPUS處理49天，再持續以AlCl3(100mg/kg)攻毒42天，誘發學習障礙及失憶。
空間巡航任務的獲取及保留是由Morris水迷宮進行評估。該池子為特製黑色(200cm×60cm)並裝滿水(23±2℃)。不透明的窗簾包覆迷宮，並貼有高對比度的視覺線索(X，三角形，圓形及正方形)。池子被分成任意地分成四個相等大小的象限(稱為區域I，II，III及IV)。逃生平台是一個特製透明，直徑20厘米的圓形頂部的塑料支架。在獲取階段 時位於水面約2厘米以上，大鼠從AlCl3給藥開始的第20天接受具有四個試驗的訓練課程。每一試驗的起始位置皆不同，試驗中大鼠被輕輕地放置在面向池壁的水中。獲取試驗中游泳時間的最大值為90秒，之後，大鼠被導引至平台，逃脫後並在平台停留20秒，記錄大鼠到達平台的時間並稱為AL。完成訓練試驗後，將大鼠放回到籠子並計時5分鐘時間的間隔再進行後續試驗。然後，在保留階段中，平台被放置在2厘米水位以下的迷宮，記錄AL一天之後，大鼠被隨機放置在面向池壁的邊緣之一，並測試其保留的反應。從AlCl3開始給藥之後第21及42天，記錄大鼠到達平台所耗費的時間，並表示為RL。
舉臂式十字迷宮包含兩個開放臂(50cm×12cm)，橫跨兩個封閉，高66cm的牆壁。將每隻大鼠放置面向遠離迷宮中心的開放臂一端。從AlCl3給藥開始第20天測量大鼠從開放臂移動到閉合臂所耗費的時間，即為TL。90秒內停留在開放臂而無進入閉合臂的大鼠，推其背面進入封閉臂中，而TL記錄為90秒。同樣在第21天及42天評估TL。
超音波對細胞生長的影響
LIPUS刺激對於星狀膠細胞生長的影響進行評估(圖2)，證實經由LIPUS刺激的星狀膠細胞於50%工作週期時，細胞生長增加(圖2A)。在單一超音波震盪工作週期值高於50%時，細胞生長迅速下降如工作週期的函數所示。與單一超音波震盪處理比較，以多重超音波震盪處理後8小時內，細胞生長更顯著地增加(圖2B)。因此，以多重超音波，於50%工作週期，持續15分鐘處理時間處理的星狀膠細胞，定量其神經滋養因子的蛋白表現量。
超音波增強星狀膠細胞中BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1的表現量
暴露在LIPUS的大鼠腦星狀膠細胞(RBACs)顯示出BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白表現量的增加為時間依賴性(圖3)。該BDNF及GDNF在LIPUS刺激後8小時(圖3A及B)後表現量達到最大值。另一方面，VEGF蛋白表現量的分布與GLUT1相似，在4小時表現量達到最大值(圖3C及D)。
超音波藉由整合蛋白增加神經滋養因子表現量
短暫的LIPUS刺激增加整合蛋白在細胞膜的表達。某些研究已經表明，整合蛋白可能作為LIPUS-敏感受體並涉及下游訊息傳導路徑中幾個蛋白激酶的活化，在此，我們檢測去整合蛋白，RGD胜肽對LIPUS所誘導BDNF，GDNF及VEGF蛋白表現量增加的影響，發現細胞以RGD胜肽預前處理30分鐘，明顯抑制這些LIPUS所誘導蛋白表現量的增加(圖4A-C)。這些數據表明，可以通過活化整合蛋白受體訊號傳遞影響LIPUS誘導神經滋養因子表現。
超音波對細胞存活率的影響
通過四唑(tetrazolium，MTT)分析中活性的下降，以量測氯化鋁(AlCl3)對於星狀細胞的毒殺性(圖5)。不存在或存在多重LIPUS刺激之下的細胞，以不同濃度的AlCl3(0-8mM)處理，在對照組中，對鋁毒性的劑量-反應曲線為陡峭的。在實驗組中，由多重LIPUS刺激後，AlCl3的半致死劑量從3.77增至6.25mM。較低劑量的AlCl3(2及4mM)情況下，藉由MTT活性可觀察到LIPUS對AlCl3所誘導的細胞退化具有保護效應。同 樣在LIPUS，高劑量AlCl3(6及8mM)處理過的細胞，其存活率略微地增加(10-12%)，但統計學上無顯著差異。
超音波對大鼠腦部BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白表現量的影響
為了進一步證實LIPUS對於大腦神經滋養因子蛋白表現量的作用，大鼠雙側半球暴露於多重LIPUS刺激，15分鐘的超音波處理時間。
以西方墨點法分析檢測LIPUS刺激後4小時，其內生性蛋白的表現量。無論施加LIPUS刺激於右側或左側半球，與對照組同側大腦半球進行比較，在該受刺激的大腦半球，其BDNF及GDNF蛋白表現量顯著的增加(圖6A及B)。然而，VEGF及GLUT1在超音波處理過的大腦半球與對照組同側大腦半球相比，其蛋白表現量並無顯著差異(圖6C及D)。
超音波對AlCl 3 處理過的大鼠其記憶性能的影響
與對照組比較，單獨以AlCl3處理的大鼠在Morris水迷宮任務表現出學習及記憶障礙(圖7)。與對照組第20天比較，AlCl3處理組的獲取潛伏期(AL)的平均值顯著地增加。相較之下，與僅AlCl3處理過的大鼠在第20天時相比，LIPUS及AlCl3的組合處理導致AL輕度下降。訓練之後，平均保留潛伏期(RL)分別與在第21及42天對照組相比顯著下降，與單獨以AlCl3處理的大鼠比較，AlCl3處理的大鼠在LIPUS處理之後，RL在第21及42天顯著地下降，這些結果表明，對於空間巡航任務的保留性能藉由LIPUS刺激改善。
在舉臂式十字迷宮試驗評估記憶並以轉移潛伏期(transfer latency，TL)表示，在第20天各組TL平均值相對穩定並無顯著差 異(圖8)。訓練之後，大鼠對照組的TL平均值分別在第21及42天與第20天相比顯著地下降。相反地，比較AlCl3處理組第21及42天的平均TL與前訓練TL第20天時，發現顯著沒有差異。與對照組第21及42天相比，AlCl3處理組在第21及42天的平均TL顯著增加。然而，在LIPUS及AlCl3的組合處理在第21及42天與對照組相比，統計量並無變化。此外，經AlCl3處理過，再以LIPUS處理的大鼠分別在第21及42天與僅AlCl3處理的大鼠比較，TL顯著下降，LIPUS的刺激確實緩解AlCl3所誘導的學習及記憶障礙。
評估鋁濃度及乙醯膽鹼酯酶活性
AlCl3處理的大鼠與對照組相比，其鋁的濃度及AChE活性明顯地增加，而長期施予LIPUS刺激後，可顯著緩解其鋁濃度及AChE活性的增加(圖9)，然而，對照組與經由LIPUS刺激的正常大鼠其鋁濃度及AChE活性並無顯著差異。
組織切片觀察
如圖10所示，LIPUS刺激有無的情況下，可觀察到AlCl3處理大鼠的海馬迴(CA1)及海馬齒狀迴(DG)具有核濃縮(karyopyknosis)的現象，此外，與AlCl3組比較，LIPUS刺激後，發現較少具有核濃縮現象的細胞，該LIPUS治療可改善AlCl3處理大鼠其腦部的損傷。
LIPUS處理對於細胞凋亡的影響
如圖11所示，在有無存在LIPUS刺激，AlCl3處理大鼠的海馬迴及海馬齒狀迴可觀察到TUNEL陽性反應的細胞，此外，與AlCl3組比較，再以LIPUS處理的大鼠中其發現細胞凋亡的細胞較少，LIPUS刺激正常大鼠的腦部中並無發現細胞凋亡的細胞。
綜合以上之實驗結果，本發明包含低強度脈衝超音波(LIPUS)裝置之醫療器具，確實具有刺激大鼠腦星狀膠細胞增加BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白的表現量。於整合蛋白抑制劑(RGD胜肽)減弱LIPUS誘導神經滋養因子表達的實驗結果，顯示LIPUS可通過活化整合蛋白受體訊號傳導促進神經滋養因子的蛋白質表現量。此外，LIPUS刺激可保護細胞對抗鋁毒，氯化鋁的半致死劑量可從3.77增加至6.25mM，而在活體行為實驗亦顯示，LIPUS能顯著改善氯化鋁誘導的記憶障礙並保留記憶。因此，本發明利用低強度脈衝超音波(LIPUS)裝置確實具有製造用於治療神經退化性疾病之醫療器具的產業利用性，與相較於先前技術以具有微氣泡FUS超音波刺激的顯著進步性，極具有可專利性。
本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。
從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。

Claims (4)

  1. 一種於神經退化性疾病患者頭部產生低強度脈衝超音波之器具，該器具包含：一低強度脈衝超音波裝置，包含：一聚焦壓電式傳感器，其超音波空間峰值時間平均(spatial peak temporal average,Ispta)強度(intensity)範圍係介於1mW/cm2~1W/cm2；操作頻率(operation frequency)範圍係介於20K~5MHz以發射低強度脈衝超音波；一功率放大器；一與功率增大器連接的函數產生器，用以產生超音波激發的訊號；及一功率感測器組件，用以測量輸入電功率，其中該低強度脈衝超音波裝置係於該神經退化性疾病患者頭部產生低強度脈衝超音波，因而透過整合蛋白介導以增加星狀細胞神經滋養因子的表現量，並且減緩由氯化鋁誘導之記憶障礙。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該聚焦壓電式傳感器之使用操作頻率為1百萬赫茲。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該低強度脈衝超音波裝置係在超音波震盪後增加腦部星狀細胞BDNF，GDNF，VEGF及GLUT1蛋白的表現量。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該低強度脈衝超音波係減少腦損傷。
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