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TWI609880B - 對於ｔｈ１細胞之ｌｙ６ｋ抗原決定位胜肽及含此之疫苗 - Google Patents

對於ｔｈ１細胞之ｌｙ６ｋ抗原決定位胜肽及含此之疫苗 Download PDF

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Abstract

本發明揭示具有Th1細胞誘導能力之單離的的自LY6K衍生的抗原決定位胜肽。此種胜肽可由MHC第II類分子辨識並誘導Th1細胞。於較佳具體例，此種本發明之胜肽可混雜地(promiscuously)結合於MHC第II類分子並且除了誘導Th1細胞更誘導LY6K專一性細胞毒性T淋巴球(CTL)。因此此種胜肽適用於增強一對象中之免疫反應，因而於癌免疫療法中，特別作為癌疫苗有用。本發明也揭示編碼為任意上述胜肽的聚核苷酸、由此種胜肽誘導的APC與Th1細胞，及與其相關的誘導方法。包含任意上述成分作為有效成分的醫藥組合物，有用於治療及/或預防癌症或腫瘤，此癌症或腫瘤包括例如膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)。

Description

對於TH1細胞之LY6K抗原決定位胜肽及含此之疫苗
本發明係關於生物科學領域，更具體而言，係關於癌症治療的領域。尤其，本發明係關於新穎的胜肽，其作為癌症疫苗與治療或預防腫瘤、或治療及預防腫瘤的藥物極為有效。
優先權
本申請案基於2012年7月10日提申的美國臨時申請案號61/669,995主張優惠，其完整內容引入於此作為參考。
已有人證明CD8陽性細胞毒性T淋巴球(CTL)會辨識在主要組織相容性複合體(MHC)第I類分子上發現之衍生自腫瘤關聯抗原(TAA)衍生的抗原決定基胜肽，且之後殺死該腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原(MAGE)家族為TAA的第一例以來，已主要利用免疫學方法發現了許多其他的TAA(非專利文獻1、2)。此等TAA當中有些正當做免疫療法的標靶進行臨床開發當中。
對於癌細胞的增殖與存活不可欠缺之TAA對於做為免疫療法之標靶是有利的，由於使用此種TAA能降低在治 療所驅使的免疫選擇當中由於TAA的刪除、突變或下調所造成的癌細胞的免疫逃脫的風險到最小。因此，能夠誘導有效及專一性抗腫瘤免疫反應的新TAA之鑑別確保進一步的發展。所以對於許多類型癌症的胜肽疫苗策略的臨床應用正在進行著(非專利文獻3~10)。到目前，已有數個使用這些TAA相關抗原衍生胜肽的臨床試驗的報告。不幸地，到目前為止，這些癌症疫苗試驗僅產生目前已於這些癌症疫苗試驗被觀察到的低目標反應率(非專利文獻11至13)。因此，於本技術領域中，仍需要適合作為免疫治療的標靶之新的TAA。
LY6K起初由數個群組鑑別(存取編號NM_017527；序列識別號：7所編碼之序列識別號：8)係作為無註解的轉錄物。最近藉由生物資訊學的分析將其分類為屬於與低分子量GPI錨定(anchore)分子有高同系性的LY6家族的成員(非專利文獻14)。如同其他的LY6家族的成員，LY6K在保守的位置有10個半胱胺酸殘基，且帶有理論上決定GPI錨定的序列結構。雖然LY6K在肺癌致病或其於正常細胞的生理功能目前尚為未知，但據認為LY6家族的成員有相關於細胞信息及/或細胞黏著的功能(非專利文獻15)。由於LY6K基因位在染色體8q24，係多於半數的肺癌有對偶性增益(allelic gain)的部位(非專利文獻16)，其過度表現可能會造成此基因座之放大或染色體性異常。
此外，經由基因表現分佈分析使用包含23,040基因之基因組寬cDNA微陣列，也確認LY6K為一在膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、 骨肉瘤、胰臟癌及軟組織腫瘤中被向上調控之新分子(專利文獻1，專利文獻2，專利文獻3)。
綜上所述，此資料建議LY6K為一新、潛在普遍的致癌抗原(oncoantigen)。因此衍生自LY6K之抗原決定位胜肽可應用於對於癌症寬組合(wide-array)治療之癌症免疫治療。最近，已鑑別出能夠從健康自願者的PBMC誘導腫瘤反應性及HLA-A2(A*02：01)-限制CTL的高免疫原性LY6K衍生細胞毒性T淋巴球(CTL)-抗原決定位(專利文獻1)。又，也已鑑別出LY6K衍生之HLA-A24-限制CTL-抗原決定位(非專利文獻17、專利文獻4)。所以，LY6K仍然是可應用於癌症免疫療法的一具吸引力的標靶分子。
腫瘤專一性CD4+輔助T(Th)細胞，特別是T-輔助1型(Th1)細胞，在有效率地誘導CTL媒介之抗腫瘤免疫性方面扮演關鍵性角色(非專利文獻18)。主要由Th1細胞產生的IFN-γ，對於誘導及維持長期CTL反應係關鍵性的，其介由多重交互作用提供幫助，對於保持免疫記憶有關鍵性(非專利文獻19,20)。Th1細胞所分泌的IFN-γ，也媒介直接的抗腫瘤或抗血管生成作用(非專利文獻21)。又，據顯示Th細胞必須鋪路以供CTL進入腫瘤部位(非專利文獻22)。所以，鑑別能夠活化專一性Th1細胞的腫瘤關連抗原(TAA)-衍生的Th細胞抗原決定位，對於在罹患腫瘤的主體誘導有效的腫瘤免疫係為重要；理想上，設計有效的疫苗應包括多個抗原決定位，以刺激CTL與Th1細胞兩者(非專利文獻23)。但是，目前尚未鑑別出由LY6K而來的此種抗原決定位。
[引用列表]
[專利文獻]
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於本發明之上下文，本案發明人考慮一種理想的供癌免疫療法的胜肽疫苗係包括針對CTL與Th1細胞兩者的抗原決定位的單一胜肽，此兩者的抗原決定位在天然上係彼此靠近(Kenter GG et al.N Engl J Med 2009；361：1838-47.)。
為此，本案發明人設計一策略以鑑別一新穎的LY6K衍生的Th1細胞的抗原決定位，其係由混雜的HLA第II類分子之背景中辨識且含有CTL抗原決定位，並假設所辨識之抗原決定位會誘導更有效率之經T細胞媒介之腫瘤免疫性。使用了預測HLA第II類結合胜肽與已知由經HLA-A24(A*24：02)或A2限制之CTL辨識之CTL抗原決定位序列的電腦演算法，來選擇候選的含有CTL抗原決定位之混雜的HLA-第II類限制Th1細胞抗原決定位。
本發明至少部分係基於發現作為誘導Th1細胞反應之免疫療法的標靶的適合抗原決定位胜肽。體認到LY6K基因在一些癌症類型中係向上調控，包括膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌及軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)，本發明目標為 進一步分析此淋巴球抗原6複合體，基因座K(LY6K)基因之基因產物，特別是由GenBank存取編號NM_017527(序列識別號：7)之基因編碼陳列於之序列識別號：8中的多胜肽。在進一步的研究中特別選擇含有會誘導專一於對應分子之Th1細胞的抗原決定位胜肽的LY6K基因產物。例如，將從健康捐贈者獲得之周邊血液單核細胞(PBMC)使用衍生自人類LY6K的混雜的HLA-DR及/或DP及/DQ或結合胜肽予以刺激。建立辨識經以各別的候選胜肽脈衝的HLA-DR、DP及/或DQ陽性目標細胞的Th1細胞，並且鑑別可誘導對抗LY6K之有效及專一性免疫反應之經HLA-DR、DP及/或DQ限制之抗原決定位胜肽。此等結果證明LY6K有強力的免疫原性，且其抗原決定位對於經由Th1細胞反應媒介的腫瘤免疫療法有效。更進一步的研究顯示含有至少一種CTL抗原決定位之混雜的HLA-DR、DP及/或DQ結合胜肽也會在同一捐贈者以LY6K專一性的方式刺激CTL反應。此等結果確認LY6K係強力免疫原性，且含有Th1細胞與CTL抗原決定位兩者之其抗原決定位，對於經由Th1細胞與CTL反應媒介之腫瘤免疫療法係有效。
因此本發明之一目的係提供具有Th1細胞誘導能力及選自序列識別號：1與2之胺基酸序列的胜肽。本發明思考修飾之胜肽，即具有Th1誘導能力且長度至多30個胺基酸且具有選自序列識別號：8(LY6K)之胺基酸序列之連續胺基酸序列的胜肽，及其功能上均等物。或者，本發明提供一具有Th1細胞CTL兩者的誘導能力的胜肽。於一些具體例，本發明之胜肽回應於序列識別號：1或2之胺基酸序列或其經修飾的版 本，其中，有2個或更多的胺基酸被取代、刪除、插入及/或加成而仍維持誘導Th1細胞的能力。
當本胜肽對於一對象投予時，本發明胜肽較佳係呈現在一或多種抗原呈現細胞的表面上，而誘導Th1細胞。當本發明之胜肽更含有至少一CTL抗原決定位，此APC也會處理此胜肽以呈現從此胜肽產生之CTL抗原決定位，因而靶導導向於各胜肽之CTL。因此，本發明之另一目的為提供呈現任一本發明之胜肽或其片段的抗原呈現細胞，並提供誘導抗原呈現細胞之方法。
投予一或更多本發明之胜肽或編碼為此種胜肽之聚核苷酸，或呈現此種胜肽或其片段之抗原呈現細胞，會因而誘導強力的抗腫瘤免疫反應。因此本發明之又另一目的為提供一種醫藥試劑或組合物，其包含作為有效成分如以下成分中之一或更多種：(a)一或多種本發明之胜肽、(b)一或多種編碼為此種胜肽之聚核苷酸，及(c)一或多種本發明之抗原呈現細胞。如此之本發明之醫藥試劑或組合物，特別作為疫苗有用。
本發明另一目的為提供癌症(即腫瘤)之治療及/或預防(亦即(避免)及/或避免其術後再復發之方法。也考慮供誘導Th1細胞或供誘導抗腫瘤免疫性之方法，包括投予一或多種本發明之胜肽、聚核苷酸、抗原呈現細胞、或醫藥試劑或組合物的步驟。再者，本發明之Th1細胞，也發現有用於作為對抗癌症之疫苗，例子包括但不限於膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)。
本發明特別考慮之目的的例子包括以下各項：
[1]一種單離的胜肽，其長度為10-30個胺基酸且包含序列識別號：8的一部分胺基酸序列，其中該胜肽包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)一連續的胺基酸序列，其具有選自於序列識別號：1或2之胺基酸序列中的長於9個胺基酸；及(b)一胺基酸序列，其中於(a)之胺基酸序列中有一個、二個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加，該胜肽有誘導T輔助1型(Th1)細胞的能力。
[2]如[1]之單離的胜肽，其中，該胜肽或其片段有結合於至少兩種MHC第II類分子的能力。
[3]如[2]之單離的胜肽，其中，該MHC第II類分子選自於由HLA-DP5、HLA-DR15、HLA-DR8及一種HLA-DQ構成之群組。
[4]如[1]至[3]中任一項之單離的胜肽，其中，該胜肽包含具有LY6K專一性細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力之胜肽的胺基酸序列。
[5]如[4]之單離的胜肽，其中，該胜肽包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)一胺基酸序列，其選自於序列識別號：1及2構成之群組；及(b)一胺基酸序列，其中於(a)之胺基酸序列中有一個、二個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加。
[6]如[5]之單離的胜肽，其中，該胜肽包含序列識別號：6 之胺基酸序列。
[7]一種單離的聚核苷酸，其編碼為如[1]至[6]中任一項之胜肽。
[8]一種組合物，係用於誘導選自於由以下構成之群組中至少一種細胞：
(i)Th1細胞
(ii)CTL
(iii)有能力誘導Th1細胞之抗原呈現細胞(APC)，及
(iv)有能力誘導CTL之APC；其中該組合物包含一或多種如[1]至[6]中任一項之胜肽，或一或多種編碼為此等胜肽的聚核苷酸。
[9]一種醫藥組合物，包含選自於由以下構成之群組中之至少一種有效成分：(a)一或多種如[1]至[6]中任一項之胜肽；(b)一或多種如[7]之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合；且此組合物被配製為供選自於由下列構成之群組中之用途：
(i)癌治療
(ii)癌預防
(iii)預防癌之術後再復發，及
(iv)上述(i)至(iii)中任意兩或更多種的組合。
[10]如[9]之醫藥組合物，其中該組合物被配製為供對於具有選自於由HLA-DP5、HLA-DR15及HLA-DR8構成之群組中至少一種作為MHC第II類分子之對象投予。
[11]如[9]或[10]之醫藥組合物，其中該組合物更包含有CTL誘導能力之一或多種胜肽。
[12]一種組合物，係供增強由MHC第II類分子媒介之免疫反應，該組合物包含選自於由以下構成之群組中之至少一種有效成分：(a)一或多種如[1]至[6]中任一項之胜肽；(b)一或多種如[7]之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
[13]一種誘導APC之方法，該APC有能力誘導Th1細胞，該方法包含使APC於體外、生物體外或體內與如[1]至[6]中任一項之胜肽接觸的步驟。
[14]一種誘導APC之方法，該APC有能力誘導CTL，該方法包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)使APC於體外、生物體外或體內與如[1]至[6]中任一項之胜肽接觸；及 (b)將編碼為如[1]至[6]中任一項之胜肽的聚核苷酸導入APC。
[15]一種誘導Th1細胞之方法，包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)共同培養CD4陽性T細胞，及在表面呈現MHC第II類分子與如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段之複合體的APC；及(b)將編碼為兩種T細胞受體(TCR)次單元之聚核苷酸、或編碼為各TCR次單元之聚核苷酸導入CD4陽性T細胞內，該TCR能結合於在細胞表面上呈現的MHC第II類分子與如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段之複合體。
[16]一種誘導CTL細胞之方法，該方法包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)共同培養CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞兩者，及已接觸如申請專利範圍第4至6項中任一項之胜肽的APC；及(b)共同培養CD8陽性T細胞，及已接觸如[4]至[6]中任一項之胜肽的APC。
[17]一種增強由MHC第II類分子媒介之免疫反應的方法，該方法包含對於對象投予選自於由以下構成之群組中之至少一種有效成分的步驟：(a)一或多種如[1]至[6]中任一項之胜肽；(b)一或多種如[7]之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如[1]至[6]中任一項 之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
[18]一種單離的APC，其在表面上呈現MHC第II類分子與如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段之複合體。
[19]一種APC，係由如[13]或[14]之方法所誘導。
[20]一種單離的Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段之APC。
[21]一種Th1細胞，係由如[15]之方法所誘導。
[22]一種誘導在有須要的對象中對抗癌之免疫反應的方法，該方法包含對於該對象投予包含選自於由以下構成之群組中至少一種有效成分的組合物的步驟：(a)一或多種如[1]至[6]中任一項之胜肽；(b)一或多種如[7]之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如[1]至[6]中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
[23]一種抗體或其在免疫上有活性的片段，係對抗如[1]至[6]中任一項之胜肽。
[24]一種載體，包含編碼為如[1]至[6]中任一項之胜肽的核苷酸序列。
[25]一種寄主細胞，其經過以如[24]之表現載體轉形或轉染。
[26]一種診斷套組，包含如[1]至[6]中任一項之胜肽、如[7]之聚核苷酸或如[23]之抗體。
如上述之外，當閱讀下列詳細敘述並結合伴隨之圖式與實施例時，本發明之其他目標或特徵將變得更全然明顯。然而，需要瞭解的是，本發明之前述發明內容與下列詳細敘述為做為例子之實施例，並不限制本發明或本發明之其他替代實施例。特別是，當以一些特定實施例敘述本發明於此處，可以瞭解的是，敘述為說明本發明，並不被構築為本發明之限制。熟悉此技藝人士可想到各種修飾與應用，而不違反本發明之精神與範圍，如附上之申請專利為所描述。同樣地，從此發明內容與下述特定實施例，本發明之其他目標、特徵、優勢與優點為明顯的，且對熟悉此技藝人士而言為無困難地明白無誤。自上述結合伴隨之例子、資料、圖式與由其而來被描寫之所有合理的推論，單獨或考慮此處引入之參考文獻，上述的目標、特徵、優勢與優點為明顯。
本發明之各種態樣及應用將會於該技術領域中具有通常知識者在考慮圖式之簡單說明以及本發明之詳細敘述及上述較佳實施例後顯明。
圖1顯示混雜的HLA第II類結合LY6K衍生胜肽，其包括由電腦演算法預測的CTL抗原決定位(一致性方法)。A部分繪示使用電腦演算法(IEBD analysis resource，一致性方法， http：//tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html)實施之人類LY6K蛋白質之胺基酸序列的分析結果。水平軸之數字代表衍生自LY6K之15員胜肽之N末端的胺基酸殘基位置。越高的一致性百分等級(percentile rank)代表對於HLA第II類分子的結合親合性越強。B部分繪示兩個重疊的24員及20員的長胜肽(LY6K(119-142)與LY6K(172-191))，其對於多種HLA-第II類對偶基因產物(DPB1*05：01、DRB1*08：03、DRB1*9：01及DRB1*15：02)具有重疊的高一致性百分等級，在分格A中以黑條標記數字1及2，其被選擇並合成以鑑別混雜之HLA第II類限制之Th細胞抗原決定位。LY6K(172-191)包括CTL在HLA-A24之背景辨識之10員胜肽。
圖2顯示藉由以LY6K(119-142)胜肽之周邊CD4+ T細胞之刺激的以LY6K(119-142)專一性CD4+ T細胞株的誘導，及抗原呈現HLA第II類分子之鑑別。CD4+ T細胞株係由對於帶有各種HLA-第II類基因型之3名健康捐贈者至少經過3回合以帶有LY6K(119-142)之周邊CD4+ T細胞刺激而產生，且IFN-γ產生CD4+ T細胞之數目係以ELISPOT分析法分析。於A部分，顯示針對3名健康捐贈者對抗LY6K(119-142)之反應。此等CD4+ T細胞被以單獨的自體PBMC(無胜肽)、經LY6K(119-142)(10micro-g/ml)脈衝之PBMC，或經LY6K(119-142)脈衝之PBMC在專一於HLA-DR、-DP或-DQ之5micro-g/ml mAb存在下進行刺激。B部分中，顯示利用各種HLA第II類分子限制之Th細胞辨識LY6K(119-142)胜肽。將從3名健康捐贈者建立的LY6K(119-142)專一性CD4+ T細胞株，和經或 未經LY6K(119-142)脈衝之表現指明的HLA第II類分子(DP5、DR4、DR8或DR15)的L細胞、經LY6K(119-142)脈衝之L細胞於抗HLA-DR、抗HLA-DP或抗HLA第I類阻斷mAb存在下、或經EBNA-DP5脈衝之L-DP5共同培養。IFN-γ生產之Th細胞數目以ELISPOT分析決定。此等捐贈者的HLA類型顯示在各分格的頂端。資料以二重複或三重複分析之平均值+/- SD代表。顯示有類似結果的至少3次獨立實驗的代表性資料。
圖3顯示藉由以LY6K(172-191)胜肽之周邊CD4+ T細胞的刺激以誘導LY6K(172-191)專一性CD4+ T細胞株，及抗原呈現HLA第II類分子之鑑別。CD4+ T細胞株係由對於帶有各種HLA-第II類基因型之3名健康捐贈者至少經過3回合以帶有LY6K(172-191)之周邊CD4+ T細胞刺激而產生，且IFN-γ產生CD4+ T細胞之數目係以ELISPOT分析法分析。於A部分，上部；左分隔；顯示針對HLA-DR8與-DR15陽性健康捐贈者對抗LY6K(172-191)之反應。此等CD4+ T細胞被以單獨的自體PBMC(-)、經LY6K(172-191)(10micro-g/ml)脈衝之PBMC，或經LY6K(172-191)脈衝之PBMC在專一於HLA-DR、-DP或-DQ之5micro-g/ml mAb存在下進行刺激。右分隔；係由HLA-DR15分子限制之Th細胞對LY6K(172-191)胜肽之辨識。將從3名健康捐贈者建立的LY6K(172-191)專一性CD4+ T細胞株，和經或未經LY6K(172-191)脈衝之L-DR8或-DR15、經LY6K(172-191)脈衝之L-DR15細胞於抗HLA-DR或抗HLA第I類阻斷mAb存在下共同培養。於A部分，左部分； 從HDL2產生了受HLA-DR15限制之LY6K(172-191)LP專一性Th細胞。於B部分，顯示健康捐贈者-HDL4針對LY6K(172-191)之反應。CD4+ T細胞係以自體PBMC單獨(無胜肽)、經LY6K(172-191)(10micro-g/ml)脈衝之PBMC、或經LY6K(172-191)脈衝之PBMC於5micro-g/ml專一於HLA-DR、-DP或-DQ之mAb存在下進行刺激。IFN-γ產生Th細胞之數目以ELISPOT分析決定。此等捐贈者的HLA類型顯示在各分格的頂端。資料以二重複或三重複分析之平均值+/- SD代表。顯示有類似結果的至少3次獨立實驗的代表性資料。
圖4顯示藉由以LY6K(168-192)胜肽周邊CD4+ T細胞之刺激LY6K(168-192)專一性CD4+ T細胞株的誘導，及抗原呈現HLA第II類分子之鑑別。CD4+ T細胞株係從健康捐贈者-HDL4產生。於至少3回合以LY6K(168-192)刺激周邊CD4+ T細胞，IFN-γ產生CD4+ T細胞之數目以ELISPOT分析法分析。對於LY6K(168-192)之硬答係針對HLA-DR8(DRB1*08：03)與-DR14(DRB1*14：05)陽性健康捐贈者顯示。CD4+ T細胞被以自體PBMC單獨(無胜肽)、經LY6K(168-192)(10micro-g/ml)脈衝之PBMC、或經LY6K(168-192)脈衝之PBMC於專一於HLA-DR、DP或DQ之5micro-g/ml of mAb存在下來刺激以進行誘導。
圖5顯示散裝LY6K(119-142)專一性CD4+ Th細胞株或LY6K(172-191)LP專一性Th選殖體之功能特性。於A部分，於經過20小時將T細胞與(1×104)經LY6K(119-142)脈衝之L-DP5(5×104)共同培養後，將細胞懸浮層收集起來，並使用 Bio-Plex分析系統測量細胞激素濃度(IFN-γ、TNF-alpha、GM-CSF、MIP1beta、IL-2、IL-4及IL-7)。資料以三重複分析的平均+/- SD表示。於B部分，經24小時將自體PBMC(針對經HLA-DQ限制之LY6K(172-191)LP專一性Th選殖體)於存在同源胜肽下溫育後，將細胞懸浮層收集起來，並使用Bio-Plex分析系統測量細胞激素濃度(IFN-γ、TNF-alpha、IL-2、GM-CSF及MIP1beta)。資料以三重複分析的平均+/- SD表示)。C部分繪示在抗原刺激後，CD4+ T細胞的細胞表面上暴露的CD107a的偵測。於上部分隔，細胞被以LY6K(119-142)LP或無關胜肽再度刺激。在圖中的數字代表有此象限特性的細胞群體的百分比(CD4+ CD107a+ T細胞)。在下部分隔，細胞被以LY6K(172-191)LP或無關胜肽再度刺激。在圖中的數字代表有此象限特性的細胞群體的百分比(CD4+ CD107a+ T細胞)。
圖6顯示LY6K(172-191)LP於體外及體內誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞的擴增。於A部分，PBMC(2×106/井)與LY6K(172-191)LP(7micro-M)一起溫育2週，而不添加任何細胞激素。於第0及7天，添加LY6K(172-191)LP，然後於以LP胜肽體外刺激的第14天，收集細胞，以經PE標定之HLA-A24(A*24：02)/LY6K-A24(177-186)胜肽複合體的四元體與經FITC標定之抗人類CD8 mAb之組合染色，並以細胞流式計數計分析。在右上象限的點代表CD8+四元體+ T細胞。顯示之事件針對CD8+ T細胞閘控(gated on)。在圖中的數字代表此有右上象限特性的細胞群體的百分比(CD8+四元 體+ T細胞)。資料代表來自HLA-A24陽性健康捐贈者之2次有類似結果的獨立實驗的代表。LY6K(172-191)LP誘導了來自接種LY6K-A24(177-186)SP之頭頸癌病患的體外抗原專一性CD8+ T細胞的擴增。從已主動以LY6K-A24(177-186)SP進行免疫之病患分離之PBMC的LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL，藉由HLA-A24(A*24：02)/LY6K-A24(177-186)複合體之經PE標定之四元體於生物體外被偵測到。於經過短期間(1週)以LY6K(172-191)LP刺激PBMC，收集PBMC然後也由四元體偵測到LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL。C部分繪示在以LY6K(172-191)LP免疫之HLA-A24 Tgm中，LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之擴增。對於HLA-A24 Tgm從其尾根部以乳化於IFA之LY6K(172-191)LP進行免疫。第2次以LY6K(172-191)LP接種7天後，於鼠蹊部附近淋巴結陽性地分離到CD8+ T細胞，並且與經LY6K-A24(177-186)SP或無關胜肽脈衝之C1R-A2402細胞一起共同培養，並且以生物體外ELISPOT分析來分析IFN-γ產生CD8+ T細胞的數目。顯示有類似結果的3次獨立實驗的代表性資料。
圖7顯示從已接種LY6K-A24(177-186)短胜肽之頭頸癌病患分離的PBMC之LY6K長胜肽專一性T細胞之存在。於A部分，對於6名已接種LY6K-A24(177-186)短胜肽之頭頸癌病患評估LY6K專一性T細胞反應，以未接種之病患及3名健康捐贈者作為對照。於經過短時間以LY6K(119-142)LP與LY6K(172-191)LP之混合物刺激後(1週)，使用IFN-γ ELISPOT分析偵測各LY6K專一性T細胞的頻率。顯示之結果係減去背 景後的專一性IFN-γ點。當計數的IFN-γ點的平均數超過10且超過背景2倍時，評定反應為陽性。各組圖中的線代表中值。B部分證明了IFN-γ產生T細胞之HLA限制性。將已經以LP刺激1週的PBMC，再度以各胜肽(10micro-g/ml)，於專一於HLA-DR、-DP或HLA第I類之5micro-g/ml of mAb存在下刺激。IFN-γ產生Th細胞之數目以ELISPOT分析來分析。顯示之結果係減去背景後的專一性IFN-γ點。顯示有類似結果的3次獨立實驗的代表性資料。
圖8從HNMT病患獲得PBMC之LY6K-LPs專一性Th細胞之存在。於A部分，於以LY6K(119-142)LP與LY6K(172-191)LP之混合物體外刺激PBMC達1週後，以IFN-γ ELISPOT分析偵測LY6K-LP專一性T細胞的頻率。B部分顯示LY6K-LP專一性Th細胞之HLA第II類限制性。將已用LY6K-LP刺激1週的新鮮PBMC再度以各LY6K-LP，於專一於HLA-DR、-DP、-DQ，或HLA第I類之mAb存在下進行刺激。於7名HNMT病患中，Th細胞所為之LY6K-LP專一性IFN-γ生產顯著受添加抗HLA第II類mAb抑制，而非抗HLA第I類mAb(LY6K(119-142)LP，HNMT31、41、107；LY6K(172-191)LP，HNMT26、31、41、42、103、107、108)。於C部分，相較於正常的健康個體，證明了HNMT病患有較高的LY6K-LP專一性Th細胞免疫性。柱狀圖顯示病患與健康捐贈者(對照)回應於LY6K(119-142)LP或LY6K(172-191)LP的比例。p值係使用費雪正確性機率檢定(Fisher’s exact probability test)計算。於D部分，於23名HNMT病患評估LY6K-LP專一性Th 細胞反應。檢測已接種LY6K-A24(177-186)SP(接種後)之20名HNMT病患、11名HNMT病患(接種前)及9名健康捐贈者(對照)。結果代表減去背景後的專一性IFN-γ點。每個點代表一個別的捐贈者。水平線代表中值，p值代表由無參數曼-惠特尼(Mann-Whitney)U檢定獲得的統計結果；n.s：不顯著。E-G部分顯示於接種前後從HNMT病患獲得之PBMC中之LY6K-LP專一性Th細胞之存在。於體外以LY6K(119-142)LP與LY6K(172-191)LP之混合物刺激PBMC 1週後，以IFN-γ ELISPOT偵測LY6K-LP專一性T細胞之頻率。於E部分，相較於正常的健康個體，證明了HNMT病患有較高的LY6K-LP專一性Th細胞免疫性。於接種後HNMT病患之LY6K(172-191)LP專一性免疫反應之頻率，顯著高於接種前之HNMT病患之此頻率。柱狀圖顯示病患與健康捐贈者(對照)回應於LY6K(119-142)LP或LY6K(172-191)LP的比例。p值係使用費雪正確性機率檢定(Fisher’s exact probability test)計算。於F部分，重複接種CTL抗原決定位胜肽會增強或引出LY6K(119-142)LP(黑色棒)及LY6K(172-191)LP(白色棒)專一性Th細胞反應。G部分繪示已接種之罹患晚期癌之HNMT病患(CTR-8379，晚期，n=13)與已接種之已接受術後輔助免疫療法之HNMT病患(CTR-8380，術後，n=8)間之LY6K-LP專一性IFN-γ點之比較。於經過1週以LY6K(119-142)LP與LY6K(172-191)LP之混合物進行體外刺激PBMC後，以IFN-γ ELISPOT分析偵測個別的LY6K-LP專一性Th細胞的頻率。顯示的結果係減去背景的專一性LFN-γ 點。各點代表一名個別的捐贈者。水平線繪示中值，p值代表從無參數曼-惠特尼U檢定得到的統計結果，n.s：不顯著。
圖9顯示擁有天然處理的Th細胞抗原決定位的LY6K-LP。A部分證明由HDL1建立的受HLA-DP5限制的LY6K(119-142)LP專一性散裝Th細胞，專一性地辨識載有重組LY6K蛋白質的自體DC。顯示有類似結果的3次獨立實驗的代表性資料。B部分證明受HLA-DR15(左，HDL2)或HLA-DQ(右，HDL4)限制之LY6K(172-191)LP專一性Th選殖體辨識載有重組LY6K蛋白質之自體DC。顯示有類似結果的5次獨立實驗的代表性資料。使用同源LY6K-LP作為IFN-γ ELISPOT分析中之正對照。
圖10顯示LY6K(172-191)LP於體外及體內誘導有效率的LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞的擴增。A部分繪示DC攝入並且交叉呈現LY6K(172-191)LP。將未固定或或固定DC以LY6K(172-191)LP或LY6K-A24(177-186)SP脈衝3小時。將從HDL3產生的散裝LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL共同培養6小時，並以IFN-γ標定測量反應。顯示有類似結果的3次獨立實驗的代表性資料。B部分證明LY6K(172-191)LP於體外誘導有效率的LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞擴增。將從HDL3(HLA-A24+與DR15+)建立的LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CTL，以經LY6K(172-191)LP(中間分格)或無關LP(右分格)脈衝的自體DC刺激。於LP刺激前(第0天；左分格)及LP刺激後第7天，將一小部分細胞(1×105細胞)以LY6K-A24(177-186)SP專一性 四元體組合抗人類CD8 mAb進行染色。顯示第0及7天有類似結果的3次獨立實驗的代表性資料。事件針對CD8+ T細胞閘控。C部分證明LY6K(172-191)LP在HNMT病患中誘導體外表現LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL。將從已接種LY6K-A24(177-186)SP之HNMT病患(HNMT108)得到的新鮮PBMC，與LY6K(172-191)LP一起培養。於第0天(生物體外)及第7天，將PBMC以HLA-A*24：02/LY6K-A24(177-186)複合體之四元體或對照四元體染色(閘控於CD8+ T細胞；點圖)。於第7天，也用IFN-γ ELISPOT分析偵測LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之頻率(棒圖)。顯示從4名已接種的HNMT病患(表1、HNMT43、105、108及110)的到的類似結果。D部分中，顯示CD8+四元體+細胞比例的增加(增加倍)。E-G部分證明LY6K-LP誘導HNMT病患中之LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之體外擴增。於E部分，將已接種LY6K-A24(177-186)SP之HNMT病患(HNMT29)得到的新鮮PBMC，與LY6K(119-142)LP與LY6K(172-191)LP之混合物一起培養。於第0天(生物體外)及第7天(於以體外用LY6K-LP刺激後)，將PBMC以四元體HLA-A*24：02/LY6K-A24(177-186)複合體(閘控於CD8+ T細胞)染色。於第7天，也以IFN-γ ELISPOT分析偵測LY6K-A24(177-186)專一性CTL(棒圖)。詳細方法已提供於補充材料與方法的項目。顯示從9名已接種之HNMT病患(HNMT20、26、29、31、34、39、41、102及108)得到的類似結果。於F部分，顯示CD8+四元體+細胞增加的比例(增加倍)。於G部分，將接種前的HNMT病患(HNMT42)獲得的新鮮 PBMC，以LY6K-LP之混合物刺激。H部分證明LY6K(172-191)LP誘導有效的體外的CTL交叉起動。將來自HDL3之PBMC與LY6K(172-191)LP一起溫育2週。於第0及7天，添加LY6K(172-191)LP，然後於第14天，收集細胞並以LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色。顯示有類似結果的3次獨立實驗的代表性資料。也從HDL1與HDL4獲得類似結果。I部分顯示於經LY6K(172-191)LP免疫的小鼠誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL。HLA-A24 Tgm被以LY6K(172-191)LP免疫。於第3次接種LY6K(172-191)LP後，將鼠蹊部附近之淋巴結中的鼠CD8+ T細胞以經過LY6K-A24(177-186)SP脈衝之BM-DC(骨髓來源的DC)刺激。IFN-γ產生之鼠CD8+ T細胞數，以生物體外ELISPOT分析。顯示有類似結果的8次獨立實驗的代表性資料。
圖11顯示LY6K-LP在誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之相乘效果。A部分證明藉由活化的散裝LY6K-LP專一性CD4+ T細胞LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之增加的誘導。將來自HLA-A24+/DR15+ HDL3之LY6K(119-142)LP專一性或LY6K(172-191)LP專一性散裝CD4+ T細胞與LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CD8+ T細胞，和自體DC一起於LY6K-A24(177-186)SP(SP)單獨、LY6K-A24(177-186)SP+對照LP(對照LP+SP)或LY6K-A24(177-186)SP+LY6K-LP(LY6K-LP+SP)存在下培養，不添加任何細胞激素。經過1週於體外和胜肽一起培養，將培養的細胞以經PE標定之HLA-A*24：02/LY6K-A24(177-186)複合體的四元體及 經FITC標定的抗人類CD8 mAb染色。也顯示於沒有胜肽下培養的細胞的結果(無胜肽)。預刺激的欄指明在本實驗中使用之LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CD8+ T細胞株的四元體+ CD8+ T細胞絕對數目/井。資料以3重複分析之平均值±SD代表(棒圖)。顯示有類似結果的3次獨立實驗的代表性資料。B部分證明LY6K-LP在誘導LY6K專一性CTL之相乘效果。將由已接種LY6K-A24(177-186)SP之HNMT43獲得之新鮮PBMC播種於96井圓底培養板(1×105細胞/井)，再添加LY6K-A24(177-186)SP單獨(10micro-g/mL)、LY6K-A24(177-186)SP+對照LP(10micro-g/mL)、LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(119-142)LP(10micro-g/mL)、或LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(172-191)LP(10micro-g/mL)，不添加細胞激素。於第7天，將細胞以LY6K-A24(177-186)專一性四元體染色。顯示LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色的結果(閘控於CD8+ T細胞，點圖)。C部分繪示柱狀圖，顯示四元體+ CD8+細胞之絕對數目/井。資料以3重複分析之平均值±SD代表(棒圖)。顯示有類似結果的3次獨立實驗的代表性資料。於D部分，將從2名已接種之HNMT病患(上分格，HMNT42；下分格，HNMT31)得到的新鮮PBMC，與LY6K-A24(177-186)SP(SP)或SP+LY6K-LP(SP+LP)一起培養7天。顯示有類似結果從2重複井得到之代表性LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色(閘控於CD8+ T細胞)。
圖12顯示HNMT病患之臨床特性。由IFN-γ ELISPOT分析測量之LY6K專一性T細胞反應，詳述於材料與方法項目。 正及負反應以(+)及(-)分別代表。No.,：數目；CTR，臨床實驗註冊；vac.，接種；HNMT，頭頸惡性腫瘤；M/F，男/女；LP，長胜肽；n.t.，未檢測。
[實施例]
雖然任何類似於或均等於在此所述的方法或材料可用於實施或測試本發明具體例，以下仍敘述較佳的材料、方法及裝置。然而，敘述該材料及方法前，應瞭解此等敘述僅為供理解而非意欲限制。應瞭解本發明不限於在此敘述的特定大小、形狀、方向、尺寸、材料、方法學、試驗步驟等，因為此等會由於例行的實驗及/或最適化而改變。再者，在敘述中使用的用語僅係用敘述特定版本或具體例，不意欲限制本發明的範圍，本發明範圍僅由附帶的申請專利範圍限制。
在本說明書中提到的各出版物、專利或專利申請案的揭示係特別完整納入於此作為參考。但是，不理解為承認本發明不早於此揭示或早先的發明。
I. 定義
除非特別指明，在此使用的所有技術及科學用語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般瞭解的含意相同。然而，若有抵觸，依本說明書，包括定義為準。
除非特別指明，此處使用的單字「一」(“a”or“an”)及「該」意指「至少一」。
與物質(例如，胜肽、抗體、聚核苷酸等)關連使用的用語「經單離」及「經純化」，係指該物質實質上不含有可 能會包括在天然來源的至少一種物質。因此，一經單離或經純化的胜肽係指實質上不含細胞材料例如碳水化合物、脂質或來自該胜肽從其衍生出之細胞或組織來源的其他污染蛋白質，或當係化學合成時實質上不含化學前驅體或其他化學物質。用語「實質上不含細胞材料」，包括製備一胜肽，其中該胜肽係從其單離的細胞的細胞成分分離，或重組產生。因此，實質上不含細胞材料的胜肽，包括多胜肽之製備物其具有少於約30%、20%、10%或5%(以乾重計)的異質蛋白質(在此也稱為「污染蛋白質」)。當該胜肽係以重組產生時，其亦較佳為實質上不含培養基，其包括胜肽之製備物且具有少於約該胜肽製備物的20%、10%、或5%體積的培養基。當該胜肽係以化學合成生產時，較佳為實質上不含化學前驅體或其他化學物質，其包括胜肽之製備物且少於約該胜肽製備物的30%、20%、10%、5%(以乾重計)之涉及合成該胜肽的化學前驅體或其他化學物質。含有經單離的或經純化的胜肽的特定胜肽，例如可藉由將該在蛋白質製備物進行之十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳與考馬西亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色或類似之膠體後之單一譜帶的出現而顯示。於一較佳具體例，本發明之胜肽及聚核苷酸係經單離的或經純化。
用語「多胜肽」、「胜肽」及「蛋白質」在此係可互換地指胺基酸殘基的聚合物。此用語適用於胺基酸聚合物，於其中一個或更多胺基酸殘基為經修飾的殘基，或非天然發生的殘基，例如對應的天然發生的胺基酸及對應的天然發生的胺基酸聚合物的人造化學擬似物。
用語「胺基酸」在此意指天然發生的及合成的胺基酸，及胺基酸類似物及與天然發生的胺基酸的作用類似的胺基酸擬似物。天然發生的胺基酸係由遺傳碼編碼者，以及於細胞中轉譯後經過修飾者(例如經基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸，及O-磷絲胺酸)。用詞「胺基酸類似物」意指與天然發生胺基酸具有相同基本化學結構(鍵結於氫的alpha碳、羧基、胺基及R基)但是具有經過修飾的R基或經過修飾的骨架(例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸、亞碸、甲硫胺酸甲基鋶鹽)。用詞「胺基酸擬似物」意指與一般胺基酸具有不同結構但有類似功能的化學化合物。
胺基酸在此可使用其通用的三字母符號或由IUPAC-IUB生化命名協會建議的單字母符號指明。
用語「基因」、「聚核苷酸」及「核酸」在此可互換使用，且如無特別指明，係以其通用可接受的單字母碼所指明者。
用語「劑」、及「組合物」在此可互換使用，意指以特定量含有特定成分的產品，以及將該特定成分以特定量直接或間接組合得到的任意產品。關於醫藥組合物之此種用語係意欲包含含該有效成分及成為擔體的任意鈍性成分的產品，及由直接或間接組合、複合或聚集該等成分中任意2種或更多而獲得的任意產品，或由該等成分中2種或更多解離而得到的任意產品，或由該等成分中2種或更多的其他類型的反應或交互作用而得到的任意產品。因此本發明之醫藥組合物」包括藉由混合本發明化合物或物質及醫藥上或生理上可接受擔體而製作的 任意組合物。
用詞「有效成分」意指在組合物當中有生物學活性或生理活性的物質。尤其，於一醫藥組合物的背景中，「有效成分」係指顯示目標的藥理作用的物質。例如，當醫藥組合物使用在癌症治療或預防時，組合物中的有效成分可直接或間接引導至少一種作用在癌細胞及/或組織的生物學或生理學作用。較佳者，該作用包括減少或抑制癌細胞生長，損害或殺死癌細胞及/或組織等。通常，有效成分的間接作用係誘導MHC Class II分子媒介的免疫反應。在配方前，「有效成分」也稱為「散裝物質(bulk)」、「藥物物質」或「技術品」。此處使用之用語「醫藥上可接受之擔體」或「生理上可接受之擔體」，係指醫藥上或生理上可接受之材料、組合物、物質、化合物或載體，包括但不限於液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或膠囊化材料。
除非另外定義，用語「癌症」意指過度表現LY6K基因的癌症，例如包括膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)。除非特別指明，用語「頭頸惡性腫瘤(HNMT)」與「頭頸癌」在此可互換使用。
除非另外定義，用語「T淋巴球」及「T細胞」在此可以互換使用。
除非另外定義，用語「細胞毒性T淋巴球」、「細胞毒性T細胞」及「CTL」，在此可互換使用，且除非特別指明，意指T淋巴球的次群組，其能辨識非己細胞(例如腫瘤細 胞、受病毒感染的細胞)，並誘導此種細胞的死亡。CTL係從CD8+ T淋巴球分化，且能辨識由MHC第I類分子呈現的胜肽。
除非另外定義，用語「HLA-A24」在此意指包含亞型HLA-A24的型，亞型的例子包括但不限於HLA-A*2401、HLA-A*2402、HLA-A*2403、HLA-A*2404、HLA-A*2407、HLA-A*2408、HLA-A*2420、HLA-A*2425及HLA-A*2488。
除非另外定義，用語「HLA-A2」在此代表性意指亞型，亞型的例子包括但不限於HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0204、HLA-A*0205、HLA-A*0206、HLA-A*0207、HLA-A*0210、HLA-A*0211、HLA-A*0213、HLA-A*0216、HLA-A*0218、HLA-A*0219、HLA-A*0228及HLA-A*0250。
除非另外定義，用語「T輔助1型細胞」及「Th1細胞」，在此係可互換使用，且除非特別指明，係指能夠辨識由MHC第II類分子呈現的胜肽且關連於細胞免疫的CD4+ T淋巴球次群組。除非另有定義，用語「Th細胞」、「CD4+ T細胞」及「CD4+輔助T細胞」，在此亦可互換使用。Th1細胞分泌多種細胞激素(例如IFN-γ、IL-2、TNF-beta、GM-CSF、TNF-alpha等)來幫忙活化及/或刺激其他關於細胞免疫的免疫細胞(例如CTL、巨噬體)。
除非另有定義，用語「HLA-DR4」係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DRB1*04：01、HLA-DRB1*04：02、HLA-DRB1*04：03,LA-DRB1*04：04、HLA-DRB1*04：05、HLA-DRB1*04：06、HLA-DRB1*04：07、HLA-DRB1*04：08、 HLA-DRB1*04：09、HLA-DRB1*04：10及HLA-DRB1*04：11。
除非另有定義，用語「HLA-DR8」，係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DRB1*08：01、HLA-DRB1*08：02、HLA-DRB1*08：03、LA-DRB1*08：04、HLA-DRB1*08：05、HLA-DRB1*08：06、HLA-DRB1*08：07、HLA-DRB1*08：10、HLA-DRB1*08：11及HLA-DRB1*08：12。
除非另有定義，用語「HLA-DR9」，係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DRB1*09：01、HLA-DRB1*09：02、HLA-DRB1*09：03,LA-DRB1*09：04、HLA-DRB1*09：05、HLA-DRB1*09：06、HLA-DRB1*09：07、HLA-DRB1*09：08及HLA-DRB1*09：09。
除非另有定義，用語「HLA-DR15」係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DRB1*15：01、HLA-DRB1*15：02、HLA-DRB1*15：03、LA-DRB1*15：04、HLA-DRB1*15：05、HLA-DRB1*15：06、HLA-DRB1*15：07、HLA-DRB1*15：08、HLA-DRB1*15：09、HLA-DRB1*15：10及HLA-DRB1*15：11。
除非另有定義，用語「HLA-DP2」係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DPB1*0201及HLA-DPB1*02：02。
除非另有定義，用語「HLA-DP5」係指亞型，其例子包括但不限於HLA-DPB1*0501。
除非另有定義，詞語「經由MHC第II類分子媒介的免疫反應」，係指由於MHC第II類分子呈現胜肽所誘導之免疫反應。在此「由MHC第II類抗原媒介之免疫反應」，包括由CD4+ T細胞，特別是Th1細胞誘導的免疫反應。此種免 疫反應的例子包括但不限於生產細胞激素(例如IFN-γ、IL-2、TNF-beta、GM-CSF、TNF-alpha等)，及活化及/或刺激其他免疫細胞(例如CTL、巨噬體等)。
除非另有定義，詞語「專一於LY6K之Th1細胞」，係指由呈現衍生自LY6K之胜肽的抗原呈現細胞所專一性活化，而不被其他抗原呈現細胞活化的Th1細胞。
除非另有定義，詞語「LY6K專一性CTL」，係指對抗表現LY6K之目標細胞專一性顯示細胞毒殺性的CTL。
除非另有定義，當使用在胜肽上下文，詞語「CTL誘導能力」，係指一胜肽當被呈現於抗原呈現細胞上時，誘導CTL的能力。
除非另有定義，在此使用之用語「套組」，係參照試劑及其他材料的組合來使用。在此考慮到此套組可包括微陣列、晶片、標記等。此用語「套組」不意欲限制在特定的試劑及/或材料的組合。
本發明上下文中，用語「抗體」意指專一性地對於指定蛋白質或其胜肽反應的免疫球蛋白及其片段。抗體可包括人類抗體、靈長源抗體、嵌合抗體、雙專一抗體、人類化抗體、融合於其他蛋白質或放射性標記的抗體，及抗體片段。再者，抗體在此係以最廣的含意使用，且具體而言含蓋完整無缺的單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整無缺的抗體形成的多專一性抗體(例如雙專一性抗體)，及抗體片段，該抗體片段只要能顯現所望的生物學活性即可。「抗體」代表所有類型者(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。
除非另外定義，在此使用的所有技術及科學用語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般了解的含意相同。
II.胜肽
以下詳述之本發明之胜肽，可指稱為「LY6K胜肽」或「LY6K多胜肽」。
為了證明衍生自LY6K之胜肽作用如一被T輔助1型(Th1)細胞所辨認之抗原，分析衍生自LY6K之胜肽(序列識別號：8)以確定是否其為由一MHC第II類分子混雜地限制之抗原決定位。
衍生自LY6K之混雜的MHC第II類結合胜肽的候選物，基於其對HLA-DP5、HLA-DR15、HLA-DR8及1或數種HLA-DQ之結合親和力確認。在藉由載有這些胜肽之樹突細胞(dendritic cell,DC)以體外刺激CD 4+ T細胞後，使用下列各個胜肽成功建立Th1細胞：LY6K(119-142)/KWTEPYCVIAAVKIFPRFFMVAKQ(序列識別號：1)及LY6K(172-191)/KCCKIRYCNLEGPPINSSVF(序列識別號：2)。
此等上述提及的已建立的Th1細胞，顯示回應於經各別的胜肽脈衝之抗原呈現細胞的刺激，顯示強的專一性的Th1細胞活性。再者，上述胜肽可以刺激由數種日本群體常見的HLA-DR、HLA-DP及HLA-DQ分子(例如HLA-DP5、HL-DR15、HLA-DR8)限制的Th1細胞。此等結果證明LY6K係由Th1細胞辨識的抗原，且此胜肽係受數種HLA-第II類分 子(例如HLA-DP5、HLA-DR15、HLA-DR8及1或數種HLA-DQ)混雜的限制的LY6K的抗原決定位胜肽；因此，此種胜肽作為CTL的細胞毒性的標靶抗原為有效。
上述鑑別的胜肽更包括一CTL抗原決定位之胺基酸序列，其有誘導專一於LY6K之CTL的能力，且如同此處證明，此胜肽可誘導專一於LY6K之CTL及Th1細胞。因此此等胜肽作可用於誘導對抗表現CDCA1之癌的免疫反應之適合的胜肽。因為LY6K基因在大多數癌組織係過度表現，包括例如膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)，代表其係免疫療法的一個良好標的。
因此本發明提供有誘導專一於LY6K之Th1細胞之能力的胜肽。本發明之胜肽可結合於至少一MHC第II類分子，並被呈現在抗原呈現細胞上。或本發明之胜肽之片段可結合於至少一MHC第II類分子，並被呈現在抗原呈現細胞上。此胜肽之片段，可藉由在抗原呈現細胞處理而產生。於較佳具體例，本發明之胜肽或其片段有能力結合2或更多種MHC第II類分子(例如HLA-DP5及HLA-DR15、HLA-DR8及HLA-DR15、HLA-DP5及HLA-DR8、HLA-DR15及1種HLA-DQ，或HLA-DP5、HLA-DR15及HLA-DR8)。換言之，本發明之胜肽有能力誘導受2或更多種MHC第II類分子限制之Th1細胞。於另一具體例，本發明之胜肽包括有LY6K專一性CTL誘導能力之胜肽之胺基酸序列。此種具LY6K專一性CTL誘導能力的胜肽的典型例，包括有序列識別號3之胺基酸 序列的胜肽。
由於MHC第II類分子中之結合溝係在兩端開放，所以可容MHC第II類結合胜肽於長度有靈活性。MHC第II類分子的核心模體由9個胺基酸殘基組成，且MHC第II類結合胜肽一般在此核心結合模體的側面有其他的胺基酸殘基。側面胺基酸殘基之數目不限。因此，並非序列識別號1或2之所有胺基酸殘基對結合MHC第II類分子為必要。
因此本發明之胜肽可為有能力誘導Th1細胞之胜肽，此種胜肽包括選自於由以下構成之群組之胺基酸序列：(a)一連續的胺基酸序列，其具有選自於序列識別號：1或2之胺基酸序列中的長於9個胺基酸；及(b)如(a)之胺基酸序列，其中胺基酸序列有1個、2個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加。
MHC第II類結合胜肽通常為10-30個胺基酸。當序列識別號1與2之胺基酸序列係由LY6K(序列識別號8)之部分胺基酸序列構成，本發明之胜肽可為以下[1]至[6]之胜肽：
[1]一種單離的胜肽，其長度為10-30個胺基酸且包含序列識別號：8的一部分胺基酸序列，其中該胜肽包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)一連續的胺基酸序列，其具有選自於序列識別號：1或2之胺基酸序列中的長於9個胺基酸；及(b)一胺基酸序列，其中(a)之胺基酸序列有1個、2個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加，該胜肽有誘導T輔助1型(Th1)細胞的能力。
[2]如[1]之單離的胜肽，其中，該胜肽或其片段有結合於至少2種MHC第II類分子的能力。
[3]如[2]之單離的胜肽，其中，該MHC第II類分子選自於由HLA-DP5、DR15、DR8及1種HLA-DQ構成之群組。
[4]如[1]至[3]中任一項之單離的胜肽，其中，該胜肽包含具有LY6K專一性細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力之胜肽的胺基酸序列。
[5]如[4]之單離的胜肽，其中，該胜肽包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)一胺基酸序列，其選自於序列識別號：1及2構成之群組；及(b)一胺基酸序列，其中(a)之胺基酸序列有1個、2個或數個胺基酸係經取代、刪除、插入及/或附加。
[6]如[5]之單離的胜肽，其中，該胜肽包含序列識別號：6之胺基酸序列。
本發明之胜肽誘導之Th1細胞對於LY6K係專一。
因此於一些具體例，本發明提供長度少於30個胺基酸之胜肽，其由序列識別號：8的胺基酸序列的一部分胺基酸序列所構成，其中該胜肽包含序列識別號1或2之胺基酸序列。
一般而言，現在例如在網際網路上已有軟體程式例如Wang P et al.2008.PLoS Comput Biol.4(4)：e1000048.11：568；及Wang P et al.2010.BMC Bioinformatics所述者可用於以電腦模擬計算各種胜肽與HLA抗原的結合親和性。與HLA抗原的結合親和性可例如以於例如Nielsen M and Lund O. 2009.BMC Bioinformatics.10：296.；Nielsen M et al.2007.BMC Bioinformatics.8：238.Bui HH,et al.2005.Immunogenetics.57：304-314.Sturniolo T et al.1999.Nat Biotechnol.17(6)：555-561 and Nielsen M et al.2008.PLoS Comput Biol.4(7)e1000107敘述者測量。因此本發明包含LY6K的胜肽，其係以此種已知程式決定會與鑑別的HLA抗原結合。
如上述，MHC第II類結合胜肽在其長度有靈活性，序列識別號1或2之胺基酸序列可選擇性地有額外的胺基酸殘基位在側面，條件是獲得之胜肽保留必要的Th1細胞誘導能力即可。此種有Th1細胞誘導能力的胜肽一般少約於30個胺基酸，常少於約29個胺基酸，經常少於約28或27個胺基酸。位在選自序列識別號：1與2中之胺基酸序列側面的特定胺基酸序列，不特別限制，且可包括任意種類胺基酸，條件是只要此側面胺基酸序列不要減弱原始胜肽之Th1細胞誘導能力即可。於典型的具體例，此種側面胺基酸序列可選自於鄰近於序列識別號：1或2之胺基酸序列的序列識別號8之胺基酸序列；但本發明不限於此。如上，本發明也包括有Th1細胞誘導能力的胜肽，及選自序列識別號：1與2之胺基酸序列。
另一方面，由於MHC第II類分子之核心結合模體由9個胺基酸殘基組成，所以序列識別號：1或2之胺基酸序列全長對於結合MHC第II類分子及誘導Th1細胞並非為必要。因此，本發明胜肽之形式可為有超過序列識別號1或2之9個連續胺基酸的胺基酸，前提是此胜肽保留必要的Th1細胞誘導能力。有Th1細胞誘導能力之胜肽，一般長於約10個胺基酸，時常 超過11或12個胺基酸，經常長於13或14個胺基酸。因此本發明之胜肽可為有Th1細胞誘導能力之胜肽，且為有來自序列識別號：1或2之胺基酸序列之長於9、10、11、12、13或14個連續胺基酸之胺基酸序列。
一般而言，已知在蛋白質中修飾一個或更多胺基酸不會影響該蛋白質的功能，或有時甚至會增強原始蛋白質的所望功能。事實上，經修飾的胜肽(即，相較於原始參考序列，由在其中一、二或數個胺基酸殘基已被修飾(即，取代、刪除、插入或加成)之胺酸序列所構成的胜肽)已知會保留原始胜肽的生物學活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81：5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10：6487-500；Dalbadie-McFarland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79：6409-13)。因此，於本發明一具體例中，本發明之胜肽可具有Th1細胞誘導能力與其中一、二或更多胺基酸經加成、插入、刪除及/或取代之選自序列識別號：1及2中的胺基酸序列兩者。
或者，本發明之胜肽可具有Th1細胞誘導能力，及具有一胺基酸序列於其中一、二或更多胺基酸加成、插入、刪除及/或取代於序列識別號：1或2中。
熟悉此技藝人士會認定改變單一胺基酸或一小百分比之胺基酸之對於一胺基酸序列的個別的添加或取代傾向產生保存原始胺基酸支鏈的特性。因此它們常被意指為「保守取代(conservative substitutions)」或「保守修飾(conservative modifications)」，其中一蛋白質之改變導致對原始蛋白質而言 一具有功能相似的蛋白質。提供功能相似胺基酸之保守取代表已為本技術領域所熟知。胺基酸支鏈的特徵的例子為疏水胺基酸(A,I,L,M,F,P,W,Y,V)、親水胺基酸(R,D,N,C,E,Q,G、H,K,S,T)與具有下列共同官能基或特徵之支鏈：一脂肪族支鏈(G,A,V,L,I,P)；一含羥基支鏈(S,T,Y)；含硫原子支鏈(C,M)；含羧酸與胺基支鏈(D,N,E,Q)；含鹼支鏈(R,K、H)；以及含芳香族支鏈(H,F,Y,W)。此外，下列八個群體各包含為彼此保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見，例如Creighton,Proteins 1984)。
此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而，本發明之胜肽並不限於此，且可包括非保守修飾，只要經修飾之胜肽維持原始胜肽之的Th1細胞誘導能力。更進一步而言，經修飾之胜肽不排除源自多形變體(polymorphic variants)、種間同質體(interspecies homologues)與LY6K對偶基因(alleles)可誘導Th1細胞的胜肽。
為了維持Th1細胞誘導能力，可修飾(插入、加 入、刪除/或取代)一小數目(例如一、二或數個)或小百分比之胺基酸。此處用語「數個」指5或更少個胺基酸，例如4個或3個或更少。被修飾之胺基酸之百分比可為，較佳20%或更少，更較佳為，15%或更少，甚至更佳為為，10%或8%，少或1至5%。
本發明之較佳胜肽，即序列識別號：1與2(LY6K 119-142,172-191)之同源性分析結果確認此等胜肽與其他任何已知人類基因產物所衍生的胜肽不具顯著同源性。所以，當使用於免疫療法時，可顯著降低這些胜肽產生未知或不欲的免疫反應的可能性。因此，此等胜肽被預期對在癌症病患中誘出對抗LY6K的免疫性高度有用。
當使用於免疫療法之背景中，本發明之胜肽或其片段應呈現在抗原呈現細胞的表面，較佳為以與HLA第II類抗原之複合體的形式呈現。因此宜選擇不僅會誘導Th1細胞，而且對於HLA第II類抗原擁有高結合親和性的胜肽。為此，可將胜肽利用取代、插入、刪除及/或加成胺基酸殘基進行修飾，以產生結合親和性有所改善的修飾胜肽。
本發明也考量附加一、二或數個胺基酸到該胜肽的N及/或C端。此種經修飾的具有高度HLA抗原結合親和性的胜肽並保留Th1細胞誘導能力者，也包括於本發明。
例如本發明提供長度短於31、30、29、28、27或26個胺基酸的單離的胜肽，其結合於HLA第II類抗原且具有Th1細胞誘導能力，且包含選自於序列識別號：1與2構成的群組中的胺基酸序列中有1、2或數個胺基酸經修飾的胺基酸序列。
當此等胜肽與APC接觸，或被導入APC，會在APC中被處理而在APC上以經處理的片段呈現。例如，本發明之胜肽可被處理成通常由11-26個(普通為15-25個)胺基酸殘基構成的片段，以呈現在APC表面。
但，當該胜肽序列與具有不同功能的內生或外生蛋白質的胺基酸序列有一部分相同時，可能會引起副作用，例如自體免疫病症或對於特定物質之過敏症狀。因此，可使用可得的資料庫一開始進行同源性檢索，以避免該胜肽的序列符合其他蛋白質的胺基酸序列的情況。當與目標胜肽相較，同源性檢索顯示沒有相同或與目標胜肽有1或2個胺基酸差異的胜肽時，可將該自然存在之目標胜肽修飾以增強與HLA抗原的結合親和性，及/或增強其Th1細胞及/或CTL誘導能力而不會有此種副作用的危險。
雖然上述對於該HLA第II類抗原具有高度結合親和性的胜肽，預期為高度有效，但是依照存在高度結合親和性當做指標的候選胜肽，仍然進一步要檢驗其Th1細胞誘導能力的存在性。在此，用詞「Th1細胞誘導能力」代表當與抗原呈現細胞(APC)接觸時，胜肽經由抗原呈現細胞(APC)授予，誘導Th1細胞的能力。又，「Th1細胞誘導能力」包括胜肽誘導Th1細胞活化及/或Th1細胞增殖、促進Th1細胞媒介細胞激素產生，其包括IFN-γ產生，以幫助及/或刺激其他的細胞(例如CTL、巨噬體)。
Th1細胞誘導能力的確認係由以下方式達成：誘導攜帶人類MHC抗原的APC(例如B-淋巴球、巨噬體、及樹狀 細胞(DC))，或更具體而言，由人類周邊血液單核白血球衍生的DC，以該胜肽刺激後，與CD4-陽性T細胞混合，然後測量該CD4+ T細胞生產與釋出的IFN-γ。或者，該胜肽的Th1細胞誘導能力，可藉由Th1細胞對於CTL之活化來評估。比如，將CD4+ T細胞與由測試胜肽刺激的DC一起培養，然後跟CTL及針對CTL之標靶細胞混合。可將目標細胞以51Cr等放射性標定，從該Th1細胞釋出的細胞激素所活化的CTL的細胞毒殺活性，可藉由計算從該標靶細胞釋出的放射性活性計算。或者，Th1細胞誘導活性，可藉由測量於經測試胜肽刺激的抗原呈現細胞(APC)存在下，Th1細胞所生產及釋出的IFN-γ，並使用抗IFN-γ單株抗體使培養基上的抑制區可見化來評估。
除了上述修飾，本發明之胜肽可進一步連結於其他物質，只要所產生之經連結的胜肽保留原始胜肽的Th1細胞誘導能力即可。適當物質的例子包括，例如：胜肽、脂質、糖類及糖鏈、乙醯基、天然及合成的聚合物等。本發明之胜肽可包含修飾，例如糖化、側鏈氧化或磷酸化等，所提供之修飾不會損害該原始胜肽的生物學活性可。此等種類修飾可實施以用於提供額外的功能(例如標靶功能，及傳遞功能)，或使該胜肽穩定化。
例如，為了增加一胜肽的體內穩定性，該技術領域中已知導入D-胺基酸、胺基酸擬似物或非天然胺基酸；此概念也可採用於本發明之胜肽。一胜肽的穩定性，可以用多種方式分析。例如可使用胜肽酶及各種生物學介質，例如人類血漿及血清，以測試穩定性(參見例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11：291-302)。
本發明之胜肽，可以與HLA第II類抗原一起以複合體形式呈現於APC之表面，然後誘導Th1細胞。因此本發明也包括與HLA第II類抗原形成複合體在APC表面上的胜肽。呈現本發明胜肽之APC，可作為疫苗接種。
包括在上述複合體中之HLA抗原之形式必須匹配於須治療及/或預防之對象之HLA抗原之形式。例如，日本群體中，HLA-DP5、DR8及DR15係盛行，故適於治療日本病患。一般而言，臨床上會預先檢查須治療之病患的HLA抗原類型，以能夠適當選擇具有對於特定HLA第II類抗原結合之能力的胜肽。於較佳具體例，本發明之胜肽可以混雜的方式誘導Th1細胞。在此，當胜肽可誘導由至少2種不同的MHC第II類分子限制之Th1細胞時，則此胜肽之Th1細胞誘導能力係「混雜的(promiscuous)」。換言之當一胜肽被至少2種不同的MHC第II類分子辨識，則此抗原辨識被視為「混雜的」。當使用於胜肽之上下文，詞彙「由至少2種不同之MHC第II類分子辨識」，係指此胜肽或其片段可結合於至少2種不同的MHC第II類分子。例如，LY6K(119-142)(序列識別號：1)及LY6K(172-191)(序列識別號：2)分別被HLA-DP5、DR15及DR8及HLA-DR15及1或數種HLA-DQ辨識。因此此等胜肽係「混雜的」抗原決定位的典型例。
當使用HLA-DP5、HLA-DR15或HLA-DR8陽性APC，宜使用具有序列識別號1之胺基酸序列的胜肽。另一方面，當使用HLA-DR15陽性APC，較佳胜肽係具有序列識別 號：2之胺基酸序列的胜肽。
因此於較佳具體例，可使用具有胜肽的序列識別號：1之胺基酸序列，於在誘導前已鑑別具有HLA-DP5、HLA-DR15或HLA-DR8之對象中誘導Th1細胞。同樣地可使用具有胜肽的序列識別號：2之胺基酸序列，於在誘導前已鑑別具有HLA-DR15之對象中誘導Th1細胞。
III. 製備LY6K胜肽
本發明之胜肽可使用周知的技術製備。例如本發明胜肽可藉由使用重組DNA技術或化學合成被合成製備。本發明之胜肽可個別合成，或製成包括兩個或更多胜肽的較長的多胜肽。本發明胜肽可之後單離成亦即經精製或單離成實質上不含其他天然發生的寄主蛋白質及其片段，或其他任意的化學物質。本發明之胜肽可包含修飾，例如糖化、側鏈氧化或磷酸化；所提供之修飾不損害原始參考胜肽的生物學活性。可使用其他說明性的修飾，例如包括引入D-胺基酸或其他胺基酸擬似物，以增加該胜肽的血清半衰期。
本發明之胜肽可依據選擇的胺基酸序列由化學合成獲得。例如可採用於合成的習知胜肽合成方法包括：(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976；(iii)Peptide Synthesis(in Japanese),Maruzen Co.,1975；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(in Japanese),Maruzen Co.,1985；(v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(in Japanese),Vol.14(peptide synthesis)、Hirokawa,1991；(vi)WO99/67288；及(vii)Barany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,"Solid Phase Peptide Synthesis",Academic Press,New York,1980,100-118.
或者，本發明之胜肽可採用任何已知用於生產胜肽的的遺傳工程方法獲得(例如MorrisonJ,J Bacteriology 1977,132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983,101：347-62)。例如，先製備庇護有編碼為可表現形式(例如對應於啟動子序列的調節序列的下游)的目標胜肽的聚核苷酸的適當載體，並轉形到適當的寄主細胞中。然後將該寄主細胞培養以生產關注的胜肽。本發明之胜肽也可採用體外轉譯系統於體外生產。
IV. 聚核苷酸
本發明提供聚核苷酸，其編碼為前述本發明胜肽當中任意者。包括從天然發生的LY6K基因(GenBank存取號NM_017527，(序列識別號：7))衍生的聚核苷酸，及其具有經保守性修飾的核苷酸序列的那些。在此用詞「經保守性修飾的核苷酸序列」係指編碼為相同或基本上相同的胺基酸序列的序列。因為遺傳密碼的退化性，有大量的功能上相同的核酸會編碼為任意給定的蛋白質。比如，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU都編碼為胺基酸丙胺酸。因此，當密碼子在每個位置指明丙胺酸時，該密碼子可改變成任意對應的所述密碼子，而不會改變所編碼的多胜肽。此種核酸變異為「靜默變異」，其為一 種經保守性修飾的變異。每個在此敘述的編碼為一胜肽的核酸，也敘述所有該核酸的可能的靜默變異。該技術領域中具有通常知識者將體認到一核酸中的各密碼子(除了AUG以外，AUG通常為甲硫胺酸的唯一密碼子，而TGG通常為色胺酸的唯一密碼子)可經修飾以產生功能上同一的分子。因此，編碼為一胜肽的核酸的各靜默變異係暗示敘述在各揭露的序列中。
本發明之聚核苷酸可由DNA、RNA及其衍生物構成。如該技術領域中為人所知者，DNA分子係適當的由鹼基例如A、T、C及G構成，而在RNA中T係置換為U。該技術領域中具有通常知識者將體認非天然發生的鹼基也會包括在聚核苷酸中。
本發明之聚核苷酸可編碼為有或沒有中介(intervening)胺基酸序列的多種本發明之胜肽。例如，該中介胺基酸序列可提供該聚核苷酸或該經轉譯的胜肽的切斷部位(例如，酵素辨識序列)。再者該聚核苷酸可包括對於編碼為本發明胜肽的編碼序列的任何額外的序列。例如該聚核苷酸可為一重組聚核苷酸，其包括對表現該胜肽所需的調節序列，或可為具有標記基因的表現載體(質體)等。一般而言，此種重組聚核苷酸可利用習知的重組技術，使用例如聚合酶及內切核酸酶操作聚核苷酸而製備。
重組及化學合成技術均可使用於生產本發明之聚核苷酸。例如聚核苷酸可藉由插到適當載體中而生產，該載體當轉染到勝任細胞內時可表現。或者，聚核苷酸可使用PCR技術放大，或在適當寄主中表現(參見例如Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，聚核苷酸可使用固相技術合成，如Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron 1992,48：2223-311；Matthes et al.,EMBO J 1984,3：801-5所敘述。
V.抗原呈現細胞(APC)
本發明也提供抗原呈現細胞(APC)，其在表面上呈現於HLA第II類抗原與本發明之胜肽或其片段之間形成的複合體。藉由與本發明胜肽接觸而獲得之該APC可由受治療及/或預防的病患獲得，且本身可當做疫苗投予，或與其他包括本發明之胜肽、Th1細胞或CTL的藥物組合投予。
該APC不限於特定種類的細胞，且包括但不限於樹狀細胞(DC)、蘭氏(Langerhans)細胞、巨噬體、B細胞及經活化的T細胞，此等已知會在表面上呈現蛋白質性抗原，而會被淋巴球所辨識。因為DC係代表性的APC，其在APC中具有最強的Th1細胞誘導活性，故DC當成本發明的APC有用。
再者，於較佳具體例，本發明之胜肽也會誘導經由MHC第I類抗原調節之CTL反應及Th1(第II類)。一般，已周知MHC第I類抗原辨識的抗原決定位的長度較短(例如8-10個胺基酸殘基)於MHC第II類(15或更長)。因此，本發明之胜肽之經處理產物造成誘導CTL。事實上，由LY6K(172-191)(序列識別號：2)誘導的CTL會辨識已鑑別為CTL辨識抗原決定位之此片段(RYCNLEGPPI：序列識別號3)。因此本發明之胜肽不僅會誘導Th1，也會在APC中將其處理後誘導CTL。換言之，與本發明之胜肽接觸過的APC會將此等處 理以將此等片段與MHC第I類抗原一起呈現，且同時將此等的整體與MHC-第II類抗原一起呈現。結果，使用本發明之胜肽，可以誘導Th1，其辨識與MHC第II類抗原一起呈現於APC之本發明胜肽，並誘導經由該胜肽之已處理片段誘導的CTL。
例如APC可藉由從周邊血液單核球誘導DC，然後使其與本發明之胜肽在體外、生物體外或體內接觸(刺激)而獲得。當本發明之胜肽對於該對象投予時，在該對象的體內會誘導呈現本發明之胜肽或其片段的APC。用語「誘導一APC」，包括以本發明之胜肽接觸(刺激)一細胞將於HLA第II類抗原與本發明之或其片段之間胜肽形成的複合體呈現於細胞表面上。或者，於將本發明之胜肽導入於APC使APC呈現此胜肽或其片段後，此等APC可以作為疫苗對於該對象投予。例如生物體外投予可包括以下步驟：a：從第一對象收集APC，b：使步驟a的APC接觸本發明之胜肽，c：對於第二對象投予該已載入胜肽的APC。
該第一對象及第二對象可為同一個體或不同個體。或者，依本發明，提供使用本發明之胜肽製造用於誘導抗原呈現細胞的醫藥組合物的用途。此外，本發明提供製造用於誘導抗原呈現細胞的醫藥組合物的方法或處理，其中此方法包括將本發明之胜肽與醫藥上可接受的擔體混合或配製的步驟。又，本發明也提供用以誘導抗原呈現細胞的本發明之胜肽。由步驟(b)獲得的APC可作為疫苗對於該對象投予。
本發明一態樣中，本發明之APC有高水平的Th1 細胞誘導能力。在此，用語「高水平的Th1細胞誘導能力」中，高水平係相對於APC沒有與非胜肽或與不會誘導Th1細胞的胜肽接觸時的水平。在此，使用於APC的上下文時，用語「Th1細胞誘導能力」，係指APC當與CD4+ T細胞接觸時誘導Th1細胞的能力。如此之具有高水平之Th1細胞誘導能力的APC可藉由包括於體外將含有編碼為本發明胜肽的聚核苷酸的基因轉移到APC的步驟的方法來製備。該導入的基因可為DNA或RNA形式。導入的方法的例子包括，而無特別限制，可使用各種在該領域中實施的習知方法，例如脂染、電穿孔或磷酸鈣法。更具體而言，可依照Cancer Res 1996,56：5672-7；J Immunol 1998,161：5607-13；J Exp Med 1996,184：465-72；國際公開號2000-509281的已公開的日文翻譯所述實施。藉由將該基因傳遞到APC中，該基因會在細胞中進行轉錄、轉譯等，然後獲得的蛋白質會由MHC第I類或第II類處理，並經一呈現路徑進行以呈現本發明之該胜肽。或者，本發明之APC可藉由以包括使APC接觸本發明胜肽之步驟的方法製備。
於較佳具體例，本發明之APC，可為呈現選自於由HLA-DP5、HLA-DR15及HLA-DR8構成之群組中之MHC第II類分子與本發明之胜肽(包括序列識別號：1之胺基酸序列)之複合體於其表面上的APC。於另一具體例，本發明之APC可為呈現選自於由HLA-DR15及1種HLA-DQ構成之群組中之MHC第II類分子與本發明之胜肽(包括序列識別號2之胺基酸序列)之複合體於其表面上的APC。較佳者，HLA-DP5、HLA-DR15及HLA-DR8可各為HLA-DPB1*05：01、 HLA-DRB1*15：02及HLA-DRB1*08：03。
VI. T輔助1型細胞(Th1細胞)
對抗任意本發明之胜肽所誘導之Th1細胞，會強化任意效應子細胞之免疫反應，此任意效應子細胞包括於體內標靶於癌細胞之CTL，且可以與此胜肽本身以類似方式作為疫苗。因此本發明也提供單離的Th1細胞，其係由任意本發明之胜肽所專一性誘導或活化。
此種Th1細胞，可藉由(1)對於一對象投予一或多種本發明之胜肽，從此對象收集Th1細胞，(2)於體外以本發明之胜肽接觸(刺激)APC及CD4+ T細胞或周邊血液單核白血球，然後單離的Th1細胞，(3)於體外使CD4+ T細胞或周邊血液單核白血球與本發明之APC接觸，或(4)導入編碼為T細胞受體(TCR)次單元兩者之聚核苷酸或編碼為各TCR次單元之聚核苷酸到CD4+ T細胞中，其中此TCR可結合於MHC第II類分子與本發明之胜肽之複合體。如(3)之方法之APC，可藉由上述方法製備。方法(4)的細節將於以下於項目「VII.T細胞受體(TCR)」詳述。
藉由以本發明APC刺激而誘導之Th1細胞，可衍生自待治療及/或預防之病患，且其本身可供投予，或與包括本發明胜肽之其他藥物組合投予，以調節效應之用途。此獲得之Th1細胞可活化及/或刺激負責細胞免疫之免疫細胞(例如CTL、巨噬體)。可由本發明之Th1細胞活化的此種免疫細胞，包括：對於標的細胞例如癌細胞顯示細胞毒性的CTL。例如針對此CTL之標的細胞，可為內源性表現LY6K之細胞(例如癌 細胞)，或經以LY6K基因轉染的細胞。於較佳具體例，本發明之胜肽可包括至少一CTL抗原決定位胜肽之胺基酸序列，且除了誘導Th1細胞，也誘導對抗表現LY6K之細胞例如癌細胞之CTL。於此情形本發明之胜肽，可於體外同時或依序誘導Th1細胞及CTL，且此誘導的Th1細胞可有效活化已誘導的CTL。因此此包括至少一CTL抗原決定位胜肽之胺基酸序列的胜肽，為適於癌症免疫療法的胜肽。
再者，本發明之Th1細胞分泌各種細胞激素(例如IFN-γ)，其能以抗原獨立的方式，活化及/或刺激對抗其他標的細胞的CTL。因此本發明之Th1細胞，也有助於增強標靶於表現腫瘤關連抗原(TAA)而非LY6K之細胞的CTL活性。因此，本發明之Th1細胞不僅對於表現LY6K之腫瘤的免疫療法有效，對於表現其他TAA，及本發明之胜肽與APC之腫瘤也有效。
於一些具體例，本發明之Th1細胞辨識呈現HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ抗原與本發明之胜肽之複合體的細胞。於Th1細胞之上下文，詞彙「辨識一細胞」，係指經由其TCR結合於細胞表面上的MHC第II類分子與本發明之胜肽的複合體，及被以抗原專一性方式活化。在此，詞彙「被以抗原專一性方式活化」，係指回應於特定MHC第II類分子及胜肽而活化，且誘導從此活化的Th1細胞的細胞激素生產。於較佳具體例，HLA-DR可選自於HLA-DR8及HLA-DR15構成之群組。較佳者，HLA-DR8及HLA-DR15可為HLA-DRB1*08：03及HLA-DRB1*15：02。另一方面，HLA-DP5 為HLA-DP抗原之較佳例。又更佳者，HLA-DP5可為HLA-DPB1*05：01。
VII. T細胞受體(TCR)
本發明也提供一種組合物，其包含編碼一或多個為多胜肽的一或多個聚核苷酸，該多胜肽能形成T細胞受體(TCR)的次單元；並提供使用其之方法。該TCR次單元具有形成TCR的能力，其對於CD4+ T細胞提供對抗呈現LY6K胜肽的APC的專一性。藉由使用該技術領域中的已知方法，可鑑別以本發明之胜肽誘導的Th1細胞的TCR次單元的alpha-與beta-鏈的核酸(WO2007/032255與Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。衍生物TCR可能以高親和力結合於呈現該LY6K胜肽的APC，且視情形媒介有效率的細胞激素生產。
編碼為TCR次單元的一聚核苷酸/多個聚核苷酸(亦即，編碼為TCR次單元兩者的單一聚核苷酸，或編碼為分開之TCR次單元的多個聚核苷酸)可以包含到適當載體內，例如反轉錄病毒載體。此等載體在該技術領域為人所熟知。該聚核苷酸或包含該聚核苷酸的載體，通常可傳送到CD4+T細胞內，例如來自病患的CD4+ T細胞。有利地，本發明提供一種現成(off-the-shelf)的組合物，能夠快速修飾病患所擁有的T細胞(或另一哺乳動物的T細胞)，而快速及簡單產生具有優異的癌細胞殺死性質的經修飾的T細胞。
本發明更提供Th1細胞，其係藉由將編碼為TCR次單元兩者的聚核苷酸，或編碼為各TCR次單元的聚核苷酸進行性狀引入(transduction)而製備，其中此種TCR次單元能結 合於LY6K胜肽(例如(例如序列識別號：1，於HLA-DP5、HLA-DR15或HLA-DR8背景；及或序列識別號：2，於HLA-DR15或1種HLA-DQ背景)。該經性狀引入的Th1細胞能夠在體內自導引到癌細胞，且能使用周知的培養方法於體外擴增(例如，Kawakami et al.,J Immunol.,142,3452-3461(1989))。上述製備之Th1細胞，可使用於形成免疫原性組合物，而有用於需要治療或保護的病患中之癌症的治療或避免。
VIII. 醫藥試劑或組合物
當本發明的方法與組合物在上下文中指出「治療」癌症有用，若其造成臨床上的益處，例如在該對象中的LY6K基因表現減低、癌症的大小減小、流行程度或轉移潛力減低，則治療係視為「有效」。當該治療係以預防性使用時，「有效」意指其延遲或防止癌症形成或防止或減輕癌症的臨床症狀。有效係利用任何已知相關用於診斷或治療特定腫瘤形式的方法決定。
若本發明的方法與組合物在上下文中指出「防止」及「預防」癌症有用，此等用語係在此可互換地意指任何減低由於疾病所致之死亡率或發病率之負擔的活性。防止及預防可發生於「初級、次級及三級防止水平」。初級防止及預防避免發展出疾病，次級及三級防止及預防水平包含目標為防止及預防疾病進展及展現出症狀及藉由回復功能及減少疾病相關併發症以減少已建立的疾病的影響的活性。或者，防止及預防可包括廣泛的療法，其目標係減輕特定病症的嚴重度，例如減少腫瘤的增殖及轉移、減少血管新生。
本發明上下文中，治療及/或預防癌症及/或防止其 術後再發，包括以下任何步驟，例如以外科手術移除癌細胞、抑制癌化細胞的生長、腫瘤退化或回復、誘導緩解及抑制腫瘤發生、腫瘤回復，及減少或抑制轉移。有效的治療及/或預防癌症減少死亡率並改善患癌的個體的預後，減少腫瘤標記物在血液中的水平，並減輕伴隨癌症的可偵測的症狀。例如，減少或改善症狀構成有效治療及/或預防，包括10%、20%、30%或以上減少，或穩定的疾病。
如上所述，本發明胜肽誘導的Th1細胞能幫助負責細胞免疫之免疫細胞。此種免疫細胞不僅包括對抗表現LY6K之癌細胞的CTL，也包括對抗表現其他TAA之癌細胞的CTL，由於由Th1細胞分泌的細胞激素能以抗原獨立的方式影響CTL。因此本發明提供一種醫藥試劑或組合物，其包含本發明之胜肽中至少一種。於此醫藥試劑或組合物，此胜肽之量係存在治療上或醫藥上有效量。本發明之醫藥試劑或組合物在幫助、刺激及/或增強任何負責細胞免疫之免疫細胞(例如CTL、巨噬體)為有用，由於本發明之試劑或組合物誘導的Th1細胞能分泌影響任何負責細胞免疫之免疫細胞的細胞激素。因此，本發明之試劑或組合物對於任何將由包括CTL之此種免疫細胞媒介的免疫反應予以增強或促進的用途有用。例如因為本發明之試劑或組合物能增強或促進對抗由此等免疫細胞媒介的癌或腫瘤的免疫反應，本發明提供包含至少一種本發明之胜肽的試劑或組合物，以用治療及/或預防癌。此種試劑或組合物中的此胜肽量，可為對於罹有表現LY6K之癌的對象中顯著增強或刺激免疫反應為有效的量。
又，如於圖6中所示，在本發明內容中鑑別的LY6K衍生之胜肽，已確認會比起僅以CTL抗原決定位刺激，更增強CTL誘導。因此本發明也提供一種試劑或組合物，供增強或刺激由MHC第I類抗原，例如HLA-A24媒介的免疫反應。於另一具體例，本發明更提供本發明胜肽之用途，以供製造用於增強或刺激由MHC第I類抗原媒介的免疫反應的試劑或組合物。
於較佳具體例，在本發明內容中鑑別的LY6K衍生之胜肽可誘導Th1細胞，及對抗LY6K表現細胞之CTL。因此本發明也提供包含至少一種本發明胜肽之試劑或組合物，以供用於誘導對抗表現LY6K之癌或腫瘤的CTL。
又，包含至少一種本發明胜肽之試劑或組合物，可用於增強或促進由MHC第II類分子媒介的免疫反應。因為LY6K表現在一些癌類型中，包括膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌及軟組織腫瘤，相較於在正常組織中係專一性的提高(WO2008/102557、WO2009/016691及WO2004/031413)，本發明之胜肽或編碼為此胜肽之聚核苷酸，可用於癌或腫瘤之治療及/或預防，及/或用於防止其術後再復發。因此，本發明提供一種醫藥試劑或組合物，供癌或腫瘤之治療及/或供預防，及/或防止其術後再復發，其包含一或多種本發明之胜肽、或編碼為此胜肽之聚核苷酸，作為有效成分。或者，本發明之胜肽可以被表現在任意前述細胞的表面上，例如APC，以用於作為醫藥試劑或組合物。此外上述Th1細胞也可用於作為本發明 之醫藥試劑或組合物的有效成分。
於另一具體例，本發明也提供使用有效成分製造供治療癌症或腫瘤的醫藥組合物或試劑的用途，該有效成分選自以下：(a)本發明之胜肽；(b)以可表現形式編碼為此處揭示的此種胜肽的聚核核酸；(c)在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段的APC；及(d)本發明之Th1細胞。
或者本發明更提供一種有效成分，使用於治療癌症或腫瘤，該有效成分選自以下：(a)本發明之胜肽；(b)以可表現形式編碼為此處揭示的此種胜肽的聚核核酸；(c)在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段的APC；及(d)本發明之Th1細胞。
或者本發明更提供製造用於治療癌症或腫瘤的醫藥組合物或試劑的方法或處理，其中該方法或處理包括將醫藥上或生理上可接受的擔體與選自以下的有效成分配製的步驟：(a)本發明之胜肽；(b)以可表現形式編碼為此處揭示的此種胜肽的聚核核酸；(c)在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段的APC；及(d)本發明之Th1細胞。
於另一具體例，本發明也提供製造用於治療癌症或腫瘤的醫藥組合物或試劑的方法或處理，其中該方法或處理包括將有效成分與醫藥上或生理上可接受的擔體混合的步驟，其中該有效成分選自以下：(a)本發明之胜肽；(b)以可表現形式編碼為此處揭示的此種胜肽的聚核核酸；(c)在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段的APC；及(d)本發明之Th1細胞。
或者，本發明之醫藥組合物或試劑可用於預防癌症或腫瘤及預防其術後再發中之一者或兩者。
本發明之醫藥試劑或組合物作為疫苗有用。本發明上下文中，詞彙「疫苗」(也稱為免疫原性組合物)，係指經由對動物接種，有誘導抗腫瘤免疫性的功能的組合物。
本發明之醫藥試劑或組合物可用於治療及/或預防癌症或腫瘤，及/或預防其在對象或病患中之術後復發或轉移復發。此等對象的例子包括人及其他哺乳動物，包括但不限於小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒及黑猩猩，尤其是商業上為重要的動物或家畜。
本發明中，具有選自序列識別號：1與2中之胺基酸序列的胜肽，已發現係由數種HLA-DR1、HLA-DP及/或HLA-DQ分子(即HLA-DP5、HLA-DR8、HLA-DR15、1或數種HLA-DQ)限制的混雜的Th1細胞抗原決定位，且可作為能誘導有效且專一性的對抗由於MHC第II類分子媒介的免疫反 應之癌症的免疫反應的候選者。因此包括具有序列識別號：1或2之胺基酸序列的此等胜肽中的任一者的本發明的醫藥試劑或組合物，特別適於對於至少具有選自HLA-DP5、HLA-DR15、HLA-DR8中作為MHC第II類分子的對象來投予。再者，此處已證明具有序列識別號2之胺基酸序列的胜肽(包括有序列識別號：6之胺基酸序列之胜肽)確認會結合於未知的HLA-DQ分子(圖3)。因此包含有序列識別號：2之胺基酸序列的胜肽的醫藥試劑或組合物，可適於投予不具有HLA-DR15之對象。對於包含編碼為此等胜肽中任一者的聚核苷酸的醫藥試劑或組合物也同樣適用。
或者於較佳具體例，本發明鑑別之胜肽，當施用到具有HLA-A24之對象時，也可誘導對於LY6K專一之CTL。因此藉由投予本發明之胜肽，可更預期除了Th1細胞誘導外，可誘導對抗表現LY6K之癌的CTL反應。又，本發明之胜肽不僅經由將其處理而誘導對抗LY6K表現細胞之CTL反應，也藉由因其為媒介之Th1細胞誘導而增強之。因此為了達成在同一對象中誘導Th1細胞及LY6K專一性CTL兩者，當投予具有序列識別號：2之胺基酸序列之胜肽時，例如欲治療的對象宜具有HLA-DR15作為MHC第II類分子及HLA-A24作為MHC第I類分子。再者，因為有序列識別號：2之胺基酸序列的胜肽(包括有序列識別號：6之胺基酸序列之胜肽)會結合於一或多種HLA-DQ分子，所以此種胜肽可於具有HLA-A24作為MHC第I類分子且不具HLA-DR15作為MHC第II類分子之對象中誘導Th1細胞及CTL。
於另一具體例，本發明提供依存於Th1細胞誘導之癌免疫療法。本發明提供之此治療策略可應用且有用於任何獨立於LY6K表現之癌，只要由Th1細胞分泌的細胞激素所活化的免疫細胞係以對象癌細胞為目標。
本發明之醫藥試劑或組合物欲治療的癌或腫瘤包括但不限於，且此等癌之較佳例包括表現LY6K之任何種種類之癌症或腫瘤，包括，例如膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)。
本發明之醫藥試劑或組合物，除了含有上述有效成分，也可含有其他有能力誘導Th1細胞或CTL之胜肽、其他編碼為其他胜肽之聚核苷酸、呈現其他胜肽或其片段之其他細胞等。此種具有誘導Th1細胞或CTL之能力的「其他」胜肽的例子]，包括但不限於源自癌專一性抗原(例如已鑑別之TAA)的胜肽，但不限於此。
弱需要，本發明之醫藥試劑或組合物可視情形包括其他治療物質當作額外之有效成分，只要該物質不會抑制該有效成分例如本發明胜肽中任一者的抗腫瘤作用即可，。例如，配方可包括抗發炎試劑、止痛劑、化學療劑等。除了在試劑本身當中的其他治療物質，本發明的藥劑也可依序或同時投予一種或更多其他藥理試劑。藥劑及藥理組合物的量，取決於例如使用的藥理物試劑的形式、欲治的疾病及投予的時程及路徑。
該技術領域中具有通常知識者應瞭解除了此處特 別提及的成分以外，本發明之醫藥試劑或組合物可包括在該技術領域中常見關於配方形式使用的其他試劑(例如，填料、黏結劑、稀釋劑、賦形劑者)。
本發明之一具體例中，該醫藥試劑或組合物可包裝在製造品與套組中，該套組含有治療欲治療的疾病例如癌症的致病情形的有用的物質。製造品可包括附有標記的任意該醫藥試劑或組合物的容器。適當的容器包括瓶、小玻璃瓶及試管。該容器可由各種材料形成，例如玻璃或塑膠。容器上的標記必需指示該試劑係用於治療或預防該疾病的一種以上的病況。該標記也可顯示投予指示等。
除了上述容器以外，包含本發明的醫藥試劑或組合物的套組可以視情形更包括第二容器，其盛裝醫藥上可容許的稀釋劑。從商業及使用者所需角度，可更包括其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾器、針、針筒及使用指示之包裝插入物。
該醫藥組合物視需要，可放在包裝或分配裝置中，其可包含一種或更多含有該有效成分的單位的劑量。該包裝例如包括金屬或塑膠箔，例如泡殼包裝。該包裝或分配裝置可以隨附投予指示。
(1)含有該胜肽當做有效成分之醫藥試劑或組合物
本發明之胜肽可直接當做醫藥試劑或組合物投予，或若需要以習知配製方法配製。於後者，除了本發明之胜肽，可適當使用通常使用於藥物的擔體、賦形劑等而無特殊限制。此等擔 體的例子包括，但不限於無菌水、生理鹽液、磷酸鹽緩衝液、培養液等。再者該醫藥試劑或組合物視需要可包含安定劑、懸浮劑、保存劑、界面活性劑等。本發明之醫藥藥劑或組合物可用於抗癌症用途。
本發明之胜肽可組合製備成包括兩種或更多本發明之胜肽，以在體內誘導Th1細胞。該胜肽組合可採為混合(雞尾酒)形式或使用標準技術彼此接合。例如，該胜肽可以化學連結或表現成單一融合的多胜肽序列。該組合中的胜肽可相同或不同。
藉由投予本發明之胜肽，該胜肽或其片段藉由該HLA第II類抗原在APC以高密度呈現，然後誘導對於由該呈現的胜肽與該HLA第II類抗原之間形成的複合體為專一性反應的Th1細胞。或者從對象移出APC(例如DC)然後以本發明之胜肽刺激以獲得在其細胞表面呈現任何本發明之胜肽或其片段的APC。此等APC再度對該對象投予以在該對象中誘導Th1細胞，結果可增加對於腫瘤關聯內皮的侵犯。
包括本發明之胜肽當做有效成分之該用於癌症或腫瘤之治療及/或預防的醫藥試劑或組合物，也可包括已知使細胞免疫有效建立之佐劑。或此醫藥試劑或組合物可以與其他有效成分一起投予，且可藉由配製為顆粒投予。佐劑意指當與具有免疫學活性的蛋白質一起(或連續)投予時，會增強對於蛋白質的免疫反應的一化合物。於此考慮的佐劑包括文獻中敘述者(Clin Microbiol Rev 1994,7：277-89)。適合之佐劑的例子包括但不限於磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門毒素、 不完全的佛氏佐劑(Incomplete Freund's adjuvant,IFA)、完全的佛氏佐劑(Complete Freund's adjuvant,CFA)、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG、O/W乳劑等。
再者，可便利地使用微脂體配方、顆粒配方其中該胜肽結合於數微米直徑的珠粒、及脂質結合於該胜肽的配方。
於本發明另一具體例，本發明之胜肽也可以於醫藥上可接受的鹽的形式投予。較佳的鹽的例子包括與鹼金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機鹼的鹽、與有機酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲烷磺酸等)的鹽及與無機酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸等)的鹽。在此使用之用語「醫藥上可接受之鹽」係指保留該化合物之生物學效力以及性質且可藉由與無機酸或鹼例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等反應而獲得之鹽。
於有些具體例，本發明之醫藥試劑或組合物可更包括會啟動Th1細胞，且選擇性啟動CTL的成分。脂質已鑑別係能夠於體內啟動對抗病毒抗原的Th1細胞，選擇性啟動CTL的試劑。例如可將棕櫚酸殘基附著在離胺酸殘基的epsilon-及alpha-胺基然後連結到本發明之胜肽。然後可將該脂質化的胜肽直接以微胞或微粒投予、包入微脂體或於佐劑中乳化而投予。另一例的脂質啟動Th1細胞且選擇性地啟動CTL反應，當共價附著於一適當胜肽時，可使用E.coli脂蛋白，例如三棕櫚醯基-S-甘胺醯基半胱胺醯基-絲胺醯基-絲胺酸 (P3CSS)可啟動Th1細胞且選擇性起動CTL(參見例如Deres et al.,Nature 1989,342：561-4)。
適當的投予方法的例子可包括，但不限於口服、皮內、真皮下、肌肉內、髓內、腹膜、靜脈內注射等，及全身性投予或對於目標部位的鄰近處局部投予(即直接注射)。該投予可藉由單一投予或以多次投予追加實施。可將醫藥上或治療上有效量之此胜肽對於須要治療表現LY6K之癌症的對象投予。或者可將足以增強或刺激由Th1細胞媒介之免疫反應及/或誘導對抗表達LY6K之癌症或腫瘤之CTL的本發明胜肽，對於罹患表現LY6K之癌症的對象投予。本發明之胜肽的劑量可依照欲治療的疾病、病患年紀、體重、投予方法等適當調整，且通常為0.001mg至1,000mg，例如0.01mg至100mg，例如0.1mg至10mg，例如0.5mg至5mg，且可數天至數月投予一次。該技術領域中具有通常知識者可容易地選擇適當且最適的劑量。
(2)含有聚核苷酸當做有效成分的醫藥試劑或組合物
本發明之醫藥試劑或組合物也可以可表現形式包括編碼為在此揭露的胜肽的聚核核酸。在此用詞「於可表現的形式」意指當聚核苷酸導入細胞中時，會在體內表現為誘導抗腫瘤免疫性的多胜肽。於說明的具體例中，關注的聚核苷酸的核酸序列包括表現該聚核苷酸需要的調節要素。該聚核苷酸可裝備為可達到在標的細胞的基因體中穩定插入(參見例如Thomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51：503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors。亦參見例如Wolff et al.,Science 1990,247：1465-8；美國專利號碼5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；and WO 98/04720)，DNA-為主的運送技術的例子包括「裸DNA」、經促進的(普寧卡因(bupivacaine)、聚合物、胜肽-媒介的)運送、陽離子性脂質複合體及微粒媒介的(「基因槍」)或壓力媒介的運送(參見例如美國專利號碼5,922,687)。
本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體表現。表現載體的例子包括減毒病毒寄主，例如牛痘或禽痘。此方法涉及使用牛痘病毒，例如當作載體以表現編碼為該胜肽的核苷酸序列。當導入寄主中，該重組牛痘病毒會表現該免疫產生性胜肽，且因而引起免疫反應。有用於免疫實驗步驟的牛痘載體與方法敘述於例如美國專利號碼4,722,848。另一載體為BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG載體敘述於Stover et al.,Nature 1991,351：456-60。廣泛種類之其他有用於治療性投予或免疫的載體例如腺病毒及腺病毒相關的病毒載體、反轉錄病毒載體、傷寒載體、去毒炭疽毒素載體等是顯而易見。參見例如Shata et al.,Mol Med Today 2000,6：66-71；Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68：793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14：571-85。
將聚核苷酸運送到病患可為直接進行，於此情形使病患直接暴露於攜帶聚核苷酸的載體，或間接進行，於此情形先使細胞以關注的聚核苷酸於體外轉形，然後將該細胞移殖到對象中。此兩種方法各已知為體內及生物體外基因療法。
針對基因治療的方法的一般評論，參見Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 1993,12：488-505；Wu and Wu,Biotherapy 1991,3：87-95；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33：573-96；Mulligan,Science 1993,260：926-32；Morgan & Anderson,Ann Rev Biochem 1993,62：191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5)：155-215)。可適用於本發明該技術領域中普通已知的的重組DNA技術的方法，敘述於Ausubel et al.,in Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY,1993；及Krieger,in Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990。
如同胜肽的投予，聚核苷酸的投予方法可為口服、皮內、真皮下、髓內、腹腔的及/或靜脈內注射等，且全身性投予或對於標的部位的鄰近處局部投予係有用。該投予可藉由單一投予或以多次投予追加實施。可將醫藥上或治療上有效量之此聚核苷酸對於須要治療表現LY6K之癌症的對象投予。或者可將足以增強或刺激由Th1細胞中介之免疫反應及/或誘導對抗表達LY6K之癌症或腫瘤之CTL的本發明聚核苷酸，對於罹患表現LY6K之癌症的對象投予。於適合擔體或經編碼為本發明胜肽的聚核苷酸轉形的細胞中的聚核苷酸的劑量可依照欲治療的疾病、病患年紀、體重、投予方法等適當調整，且通常為0.001mg至1,000mg，例如0.01mg至100mg，例如0.1mg至10mg，例如，0.5mg至5mg，且可數天至數月投予一次。該技術領域中具有通常知識者可輕易選擇適當及最適的劑量。
IX. 使用該胜肽、APC或Th1細胞的方法
本發明之胜肽及編碼為此胜肽之聚核苷酸可用於誘導本發明之APC及Th1細胞。本發明之APC也可用於誘導本發明之Th1細胞。該胜肽、聚核苷酸及APC可與其他任何化合物組合使用，只要該額外的化合物不會抑制Th1細胞誘導能力即可。因此任意上述本發明之醫藥試劑或組合物可用於誘導Th1細胞，此外，可用於誘導APC的包括該胜肽及聚核苷酸說明如下。
(1)誘導抗原呈現細胞(APC)的方法
本發明提供使用本發明之胜肽或編碼為此胜肽之聚核苷酸誘導APC的方法。誘導APC可如上述項目「V.抗原呈現細胞」般實施。本發明也提供一種誘導具有Th1細胞誘導能力之APC之方法，此誘導也已在上述項目「V.抗原呈現細胞」中提及過。
或者本發明提供提供製備具有誘導Th1細胞之能力的抗原呈現細胞(APC)之方法，其中此方法可包括以下步驟之一：(a)使本發明胜肽於體外、生物體外或體內與APC接觸；及(b)將編碼為本發明胜肽之聚核苷酸導入到APC中。
或者本發明提供誘導具有Th1細胞誘導能力之APC之方法，其此方法包括選自以下群組中之步驟：(a)使本發明之胜肽與一APC接觸，(b)將編碼為本發明胜肽之聚核苷酸導入一APC中。
本發明之方法可於體外、生物體外或體內實施。較佳為， 本發明之方法可於體外或生物體外實施。在較佳具體例中，用於誘導具有Th1細胞誘導能力之APC的APC，較佳為表現擇自HLA-DP5、HLA-DR15、HLA-DR8及1種HLA-DQ中之至少1種作為MHC第II類分子之APC。此種APC可藉由該技術領域中周知的技術，從具有HLA-DP5、HLA-DR15、HLA-DR8及1種HLA-DQ中之至少1種作為MHC第II類分子的對象所獲得之周邊血液單核細胞(PBMC)製備。本發明之方法所誘導之APC可為在其表面上呈現本發明之胜肽或其片段與HLA第II類抗原(例如HLA-DP5、HLA-DR15、HLA-DR8、1種HLA-DQ)之複合體的APC。當投予本發明之方法所誘導之APC到一對象以誘導於該對象中對抗癌症之免疫反應時，該對象較佳為與APC的來源為同一者。然而，該對象也可與APC捐贈者為不同者，只要該對象與APC捐贈者具有相同HLA類型即可。
於另一具體例，本發明提供用於誘導具有Th1細胞誘導能力的APC的試劑或組合物，且此種試劑或組合物包括本發明之胜肽或聚核苷酸中1或更多種。
於另一具體例，本發明提供本發明之胜肽或編碼為該胜肽的聚核苷酸之用途，其係用於製造試劑或組合物以供誘導APC。
或者，本發明更提供本發明之胜肽或編碼為該胜肽的聚核苷酸之用途，係用於誘導具有Th1細胞誘導能力之APC。
於較佳具體例，本發明之胜肽不僅可誘導Th1反應，還可於將其處理後誘導CTL反應。因此於較佳具體例，本發明之 方法製備的APC對於誘導對抗表現LY6K之細胞的CTL，包括誘導對抗癌細胞之CTL亦有用。例如當由含有序列識別號：3之胺基酸序列的胜肽誘導時，表現HLA-A24之APC係適於誘導LY6K專一性CTL。
(2)誘導Th1細胞的方法
此外，本發明也提供使用本發明之胜肽、編碼為此胜肽之聚核苷酸、或呈現本發明之胜肽或其片段之APC誘導Th1細胞的方法。本發明也提供使用編碼為多胜肽(即，TCR次單元)的一聚核苷酸誘導Th1細胞的方法，該多胜肽能形成辨識本發明之胜肽與HLA第II類抗原的複合體的T細胞受體(TCR)。較佳者，誘導Th1細胞的方法包括選自以下步驟至少其中之一：a：使CD4+ T細胞與抗原呈現細胞接觸，該抗原呈現細胞在其表面呈現HLA第II類抗原與本發明胜肽或其片段的複合體；b：導入編碼TCR次單元兩者之聚核苷酸或編碼TCR次單元之各個的聚核苷酸到CD4+細胞內，其中TCR能夠辨識或結合本發明之胜肽或其片段與HLA第II類抗原的複合體。
當投予本發明之胜肽到對象中時，會在該對象體內誘導Th1細胞，且由MHC第II類分子媒介的(例如以該癌細胞為目標的之免疫反應)免疫反應強度增強。或者，該胜肽及編碼為該胜肽之聚核苷酸可用於一生物體外的治療法，其中，該對象來源的APC、CD4陽性細胞或周邊血液單核白血球和本發明胜肽在體外接觸(刺激)，誘導出Th1細胞後，已活化的Th1細胞回到該對象。例如該方法可包括以下步驟： a：從該對象收集APC；b：使步驟a的APC接觸本發明之該胜肽；c：將步驟b之APC與CD4+ T細胞混合並共同培養，以誘導Th1細胞，及d：從步驟c之共同培養物收集CD4+ T細胞。
再者，可藉由導入編碼為TCR次單元兩者之一聚核苷酸或編碼為各TCR次單元之多個聚核苷酸到CD4陽性T細胞內來誘導Th1細胞，其中，該TCR能夠結合於本發明之胜肽或其片段與HLA第II類抗原的複合體。此種的轉導可如項目「VII.T細胞受體(TCR)」所述般實施。
本發明之方法可於體外、生物體外或體內實施。較佳者，本發明之方法可於體外或生物體外實施。用於誘導Th1細胞的CD4陽性T細胞可藉由該技術領域周知的方法從對象獲得之PBMC製備。於較佳具體例，CD4+ T細胞的捐贈者可為具有至少一選自HLA-DP5、HLA-DR15及HLA-DR8作為MHC第II類分子的對象。因為具有序列識別號：2之胺基酸序列的胜肽能結合於一或數種HLA-DQ，當使用具有序列識別號：2之胺基酸序列的胜肽時，CD4陽性T細胞之捐贈者不一定要具有上述MHC第II類分子。由本發明之方法誘導的Th1細胞，可為能辨識在其表面呈現本發明胜肽或其片段與HLA第II類抗原之複合體的APC者。當本發明方法所誘導之Th1細胞對於一對象投予以誘導該對象中對抗癌症之免疫反應(或由MHC第I類分子媒介之免疫反應)時，該對象較佳為與CD4陽性T細胞之來源為同一對象。但，該對象也可與CD4陽性T 細胞之來源為不同對象，只要該對象與CD4陽性T細胞之捐贈者有相同HLA類型即可。
於較佳具體例，本發明之胜肽可誘導對抗表現LY6K之細胞的CTL，及誘導Th1細胞。因此本發明更提供用於誘導CTL之方法，其包含選自以下構成之群組的至少一步驟：a：將CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞兩者與已接觸本發明胜肽之APC共同培養；及b：將CD8陽性T細胞與與已接觸本發明胜肽之APC共同培養。
於此種誘導CTL之方法，本發明之胜肽在APC中被處理以產生CTL抗原決定位胜肽，且產生之CTL抗原決定位胜肽被呈現在APC的表面。
或者依本發明，提供本發明之胜肽之用途，係供製造誘導Th1細胞之醫藥試劑或組合物。此外本發明提供一種用於製造誘導Th1細胞之醫藥試劑或組合物之方法或處理，其中此方法包含將本發明之胜肽與醫藥上可接受之擔體混合或配製之步驟。又，本發明也提供用於誘導Th1細胞之本發明之胜肽。
由本發明方法誘導之CD4+ T細胞，可對於一對象投予以作為疫苗。
本發明上下文中，過度表現LY6K之癌症可以此等有效成分治療。此種癌的例子，包括但不限於：膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉 瘤、胰臟癌，軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)。因此在投予包含此有效成分之疫苗或醫藥組合物前，宜先確認是否在欲治療之癌細胞或組織中，比起相同器官的正常細胞，LY6K的表現水平有所增加。因此於一具體例，本發明提供一種用於治療(過度)表現CDCA1之癌症之方法，此方法可包括以下步驟：i)測定在欲治療癌症的對象獲得的癌細胞或組織當中的LY6K表現水平；ii)將此LY6K表現水平與正常的對照組比較；及iii)投予由上述(a)至(d)構成之群組中至少一成分至患有比起正常對照組而言有過度表現LY6K之癌症的對象。或者本發明可提供疫苗或醫藥組合物以供對罹患過度表現LY6K之癌的對象投予，其包括選自由上述(a)至(d)構成之群組中至少一種成分。換言之本發明更提供鑑別欲以本發明LY6K多胜肽治療之對象的方法，此方法包括決定衍生自對象之癌細胞或組織中的LY6K表現水平的步驟，其中，相較於該基因之正常對照為增加的水平代表此對象具有可用本發明之LY6K多胜肽治療的癌症。本發明之癌症治療方法將於以下更詳細敘述。
再者，於較佳具體例，可於投予本發明胜肽前先鑑別一對象之HLA型。例如宜對於鑑別為具有HLA-DP5、HLA-DR15或HLA-DR8之對象投予具有序列識別號1之胺基酸序列的胜肽。或者，宜對於鑑別為具有HLA-DR15之對象投予具有序列識別號2之胺基酸序列的胜肽。
可使用任何由對象而來的細胞或組織決定LY6K表現，只要其包括LY6K的目標轉錄或轉譯產物即可。適合的樣本的例 子包括但不限於體組織及體液，例如血、唾液及尿。較佳者，由對象而來的細胞或組織樣本含有包括上皮細胞的細胞群體，更佳為癌上皮細胞或由懷疑為癌的組織所衍生的上皮細胞。又，視需要可從獲得的體組織及體液純化該細胞然後使用當做對象衍生的樣本。
以本發明方法治療的對象較佳為哺乳動物。哺乳動物例如包括但不限於例如人、非人類靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬及牛。
依照本發明，可決定由一對象獲得的癌細胞或組織中的LY6K表現水平。該表現水平可於轉錄(核酸)產物層級，使用該技術領域已知的方法決定。例如LY6K的mRNA可以藉由雜交法使用探針定量(例如北方雜交法)。該檢測可於晶片上、陣列上等實施。使用陣列對於偵測LY6K的表現水平為較佳。該技術領域中具有通常知識者可利用LY6K的序列資訊製備此種探針。例如可使用LY6K的cDNA當做探針。視需要，可將該探針以適合的標記例如染料、螢光物質及同位素標記，且該基因的表現水平可以該雜交的標記的強度檢測。
再者，LY6K的轉錄產物(例如序列識別號：7)，可藉由擴增為主的檢測方法(例如RT-PCR)使用引子定量。此種引子可依照該基因可得的序列資訊製備。
具體而言，將供本發明使用的探針或引子於嚴苛、中度嚴苛或低嚴苛條件下，雜交於LY6K之mRNA。此處使用的用詞「嚴苛(雜交)條件」係指在此條件下，探針或引子會雜交於其目標序列但不會與其他序列雜交。嚴苛條件為序列依存性，且 在不同狀況下會不同。較長序列的特定雜交比起較短的序列會在較高溫觀察到。一般而言，嚴苛條件的溫度係選自比起特定序列在一定義的離子強度及pH時的熱熔點(Tm)低約攝氏5度的溫度。該Tm係指50%互補於其目標序列的探針與該目標序列之雜交達到平衡的溫度(於一定義的離子強度、pH及核酸濃度)。由於該目標序列一般係過量呈現，於Tm，50%的探針會以平衡佔據。通常嚴苛條件為鹽濃度少於約1.0M鈉離子，通常約0.01至1.0M鈉離子(或其他鹽)、pH 7.0至8.3，且對於短的探針或引子(例如10至50個核苷酸)，溫度至少約攝氏30度，對於較長的探針或引子，至少約攝氏60度。嚴苛條件也可藉由添加去安定物質例如甲醯胺而達到。
或者可偵測轉譯產物以診斷本發明。例如可決定LY6K蛋白質(序列識別號：8)的量。確認為轉譯產物的蛋白質量的方法，包括使用專一性辨識該蛋白質的抗體的免疫分析方法。該抗體可為單株抗體或多株抗體。再者可使用抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)以供偵測，只要該片段或修飾抗體保留對於該LY6K蛋白質的結合能力即可。製備此種用於偵測蛋白質的抗體的方法在該技術領域中為周知，且可採用任意方法於本發明中以製備此種抗體及其均等物。
就基於轉譯產物偵測LY6K基因的表現水平的另一方法而言，染色強度可使用對抗該LY6K蛋白質的抗體，利用免疫組織化學分析測定。亦即，於該測量中，強染色代表該蛋白質的存在/水平增加，且同時，LY6K基因表現水平高。
目標基因例如LY6K基因於癌細胞中的表現水平，若水平比起該標的基因的對照組水平(例如於正常細胞中的水平細胞)增加例如10%、25%或50%；或增加超過1.1倍、高於1.5倍、高於2.0倍、高於5.0倍、高於10.0倍或更多，則決定為增加。
該對照水平可與癌細胞同時決定，係藉由使用預先從對象收集並保存的樣本實施，該對象的疾病狀態(有罹癌或未罹癌)為已知。此外，從具有欲治療的癌的一器官的非癌化區獲得的細胞可當做正常對照。或者該對照水平可依據先前對於從疾病狀態已知的對象得到的樣本中LY6K基因的表現水平決定的結果分析的統計方法決定。再者，該對照水平可從衍生自先前測試的細胞的表現樣式的資料庫衍生。又，依照本發明一態樣，於一生物學樣本中的LY6K基因表現水平可以與從多個參考樣本決定的多個對照水平比較。較佳為使用從衍生自與該對象得到的生物學樣本類似的組織類型的參考樣本所決定的對照水平。再者，較佳為使用疾病狀態已知的群體當中的LY6K基因的表現水平的標準值。該標準值可由該技術領域中已知的任意方法獲得。例如，平均值+/- 2 S.D.或平均值+/- 3 S.D.的範圍可當作該標準值。
本發明文中，由已知非癌化的生物學樣本決定的對照水平，稱為「正常對照水平」。另一方面，若該對照水平係從癌化的生物學樣本決定，其稱為「癌化的對照水平」。樣本表現水平與對照水平之間的差異可常態化為對照核酸例如管家基因的表現水平，其表現水平已知不會取決於細胞的癌化 或非癌化而不同。示例之對照基因包括但不限於beta-肌動蛋白、甘油醛3磷酸去氫酶及核糖體蛋白質P1。
當LY6K基因的表現水平比起正常對照水平為增加時，或者相近/均等於癌化對照水平時，該對象可診斷為患有欲治療的癌症。
更具體而言，本發明提供一種方法，係(i)診斷是否一對象患有欲治療的癌症及/或(ii)選擇供癌症治療的對象，該方法包括以下步驟：a)測定由懷疑患有欲治療的癌症的對象獲得的癌細胞或組織中的LY6K表現水平；b)比較其LY6K表現水平與正常對照水平；c)若LY6K的表現水平比起正常對照水平為增加，則診斷該對象是患有欲治療的癌症；d)若步驟c)中診斷該對象患有欲治療的癌症時，則選擇供癌症治療的對象。
或者該方法可包括以下步驟：a)測定由懷疑患有欲治療的癌症的對象獲得的癌細胞或組織樣本中的LY6K表現水平；b)比較其LY6K表現水平與癌化對照水平；c)若LY6K的表現水平相似於或等同於癌化對照水平，則診斷該對象是患有欲治療的癌症；及d)若步驟c)中診斷該對象患有欲治療的癌症時，則選擇供癌症治療的對象
於一些具體例，此方法在上述定義的a)-d)步驟 後，可更包含鑑別具有由選自於HLA-DP5、HLA-DR15及HLA-DR8構成之群組之HLA的對象的步驟。依本發明之癌症療法較佳係針對罹患過度表現LY6K之癌且具有HLA-DP5、HLA-DR15及HLA-DR8中之任一者的對象。HLA分型的方法係該技術領域中為人熟知者。例如針對將HLA對偶基因分型的以PCR為主的方法係為人熟知。專一於各HLA分子的抗體，在鑑別一對象之HLA型時亦為適當的工具。
本發明也提供一種套組，係用於確認患有可利用本發明之LY6K多胜肽治療的癌症的對象，其也對於評估及/或特定癌症療法，更特別是監控癌症免疫療法的效力或適用性是有用的。適合之癌症的說明性例子包括但不限於膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)。尤其，該套組較佳為包括偵測對象衍生的癌細胞中的該LY6K基因的表現的至少一種試劑，該試劑可選自以下群組：(a)偵測該LY6K基因之mRNA的試劑；(b)偵測該LY6K蛋白質的試劑；及(c)偵測該LY6K蛋白質的生物學活性的試劑。
適合偵測該LY6K基因之mRNA的試劑的例子，可包括專一性結合於該LY6K mRNA或鑑別該LY6K mRNA的核酸，例如具有互補於該LY6K mRNA的序列的寡核苷酸。此等種類的寡核苷酸例如專一於該LY6K mRNA的引子及探針。此等種類的寡核苷酸可依照該技術領域周知的方法製備。視需要，可將偵測該LY6K mRNA的試劑固定化在固體基質上。又， 該套組中可包括多於一種偵測該LY6K mRNA的試劑。
另一方面，適合偵測該LY6K蛋白質的試劑的例子，包括對於該LY6K蛋白質的抗體。該抗體可為單株抗體或多株抗體。再者，可使用抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)當做該試劑，只要該片段或修飾抗體保留對於該LY6K蛋白質的結合能力即可。製備此等種類的偵測蛋白質的抗體的方法，在該技術領域為人周知，且可在本發明中採用任意方法以製備此種抗體及其均等物。再者，該抗體可經由直接連結或間接標定技術而以訊號產生分子標記。標記抗體及偵測該抗體結合於其目標的標記及方法，在該技術領域係為人周知，且在本發明可使用任意標記及方法。又，該套組中可包括多於一種偵測該LY6K蛋白質的試劑。
該套組可含有多於一種的上述試劑。例如由沒有癌症或患有癌症的對象獲得的組織樣本，可當做有用的對照試劑。本發明的套組從商業及使用者角度所需，可更包括其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾器、針、針筒及有使用指示的包裝插入物(例如紙、錄音帶、CD-ROM等)。此等試劑保留在有標籤的容器中。適合的容器包括瓶、小玻璃瓶及試管。此等容器可由各種材料形成，例如玻璃或塑膠。
本發明之一具體例中，當該試劑為對抗該LY6K mRNA的探針時，該試劑可固定化在固體基質上，例如多孔條，以形成至少一個偵測部位。該多孔條的測量或偵測區可包括多個部位，各含有核酸(探針)。試條也可含有供陰性及/或陽性對照的部位。或者對照部位可位在與試條分開的條片上。視 情形，該不同的偵測部位可含有不同量的固定化核酸，亦即在第一偵測部位為較高量，而在接續的部位為較低量。藉由加測試樣本，顯示可偵測訊號的部位的數目提供存在於該樣本中的LY6K mRNA量的定量指示。該偵測部位可為任何適於偵測的形狀，通常為或跨越試條寬度方向的桿狀或點狀。
本發明的套組可更包含陽性對照樣本或LY6K標準樣本。本發明的陽性對照樣本可藉由收集LY6K陽性樣本，然後分析其LY6K水平而製備。或者可對不表現LY6K的細胞添加純化的LY6K蛋白質或聚核苷酸，以形成該陽性樣本或該LY6K標準樣本。本發明中，純化的LY6K可為重組蛋白質。該陽性對照樣本的LY6K水平例如高於截止值。
X. 抗體
本發明更提供結合於本發明之胜肽的抗體。較佳的抗體係專一性結合於本發明之胜肽的抗體且不會(或微弱結合於)非本發明之胜肽。或者結合於本發明的胜肽的抗體，以及其同系物。對抗本發明胜肽的抗體於癌症診斷及預後分析法、及造影方法中有用。同樣地，此種抗體在其他癌症治療、診斷及/或預後方面有用，只要LY6K在癌症病患中也有表現或過度表現。又，細胞內表現的抗體(例如單鏈抗體)在治療上用於治療涉及LY6K表現的癌症為有用，癌症的例子包括但不限於膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)。
本發明也提供偵測及/或定量包括由選自序列識別 號：1與2中之胺基酸序列構成之多胜肽之LY6K蛋白質(序列識別號：8)或其片段的各種免疫分析法。此種分析法可包括一種或更多抗LY6K抗體，其能適當辨識及結合於LY6K蛋白質或片段。本發明中，結合於LY6K多胜肽的抗LY6K抗體較佳為辨識由選自序列識別號：1與2之胺基酸序列構成之多胜肽者，更佳為排除其他的胜肽。抗體的結合專一性，可利用抑制試驗確認。即，當欲分析的抗體與全長之LY6K多胜肽間的結合在存在具有選自序列識別號：1與2中之胺基酸序列之多胜肽時受抑制，則視為該抗體」專一性地結合」於該片段。本發明中，此種免疫分析法係以該技術領域中周知的各種免疫分析法格式實施，包括但不限於各種放射免疫分析法、免疫層析技術、酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、酵素連結免疫螢光分析法(ELIFA)等。
相關的本發明的免疫學但非抗體分析法可包括T細胞免疫產生性分析法(抑制性或刺激性)，及MHC結合分析法。此外，本發明也提供能偵測表現LY6K的癌症的免疫造影法，包括但不限於使用本發明經標記抗體的放射閃爍攝影造影法。此種分析法可在臨床上於偵測、監控及預測LY6K表現的癌症為提供效用，癌症包括但不限於膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤(HNMT)。
本發明也提供結合於本發明胜肽的抗體。本發明的抗體可以任意形式使用，例如單株抗體或多株抗體，且包括藉由以本發明胜肽將動物例如兔子免疫所得的抗血清、所有類 型的多株及及單株抗體、人類抗體與由基因重組產生的人類化抗體。
本發明的胜肽當做抗原以獲得的抗體，可由任意動物種衍生，但較佳為衍生自哺乳動物例如人、小鼠、大鼠，更佳為人。人類來源的胜肽可由此處所揭露的核苷酸或胺基酸序列獲得。
依照本發明，作為免疫抗原的該胜肽，可為本發明多胜肽之完整胜肽或胜肽。適合之部分胜肽的例子可包括例如本發明胜肽的胺基(N)末端或羧基(C)末端片段。
在此，抗體定義為與LY6K胜肽的全長或片段反應的蛋白質。於一較佳具體例，本發明抗體可辨識具有選自序列識別號：1及2中之胺基酸序列的LY6K片段胜肽。用於合成寡胜肽的方法在該技術領域為周知。合成後，在使用為免疫原之前可視情形將胜肽純化。本發明中，該寡胜肽(例如24員或26員)可以與擔體接合或連結以增強免疫產生性。鑰孔血藍蛋白(Keyhole-limpet hemocyanin，KLH)為周知的擔體。結合KLH與胜肽的方法，也是該技術領域中周知的。
或者可將編碼為本發明胜肽或其片段的基因插入已知的表現載體，然後用於轉形在此敘述的寄主細胞。可從該寄主細胞的外面或裡面以標準方法回收所望的胜肽或其片段，且接著可當做抗原。或者可將表現該胜肽的整個細胞或其溶解物或化學合成的胜肽當做抗原。
可將任何哺乳動物以該抗原免疫，但較佳為考量與用在細胞融合的母細胞的相容性。一般而言，可使用囓齒科 動物、兔或靈長科動物。囓齒科的動物包括例如小鼠、大鼠、倉鼠。兔科動物包括例如兔子。靈長科動物例如狹鼻小目(Catarrhini)猴(舊世界猴)，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)、瀰猴，狒狒、黑猩猩。
以抗原免疫動物的方法為該技術領域中已知。腹膜內注射或皮下注射抗原為免疫動物的標準方法。更具體而言，可將抗原稀釋及懸浮於適當量的磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)、生理鹽液等。若需要，可將抗原懸浮液與適量的標準佐劑混合，標準佐劑例如佛洛依德(Freund)完全佐劑，而形成乳劑後對於哺乳動物投予。較佳者，每4至21天數次投予與適量佛洛依德(Freund)不完全佐劑混合的抗原。適當的擔體也可用於進行免疫。如上免疫進行後，可藉由標準方法檢驗血清中所望抗體量的增加。
對抗本發明胜肽的多株抗體可藉由從檢查血清中所望抗體增加的受免疫哺乳動物收集血液，並從血液以習知方法分離血清而製備。多株抗體包括含有該多株抗體的血清且可從該血清分離含有該多株抗體的級分(fraction)。免疫球蛋白G或M從來製備，藉由使用例如偶聯於本發明胜肽的親和管柱，與進一步使用蛋白質A或蛋白質G管柱純化該級分。
為了製備單株抗體用於本發明之內容，從以該抗原免疫的哺乳動物收集免疫細胞，並如上述檢查血清中所望抗體的水平是否增加，之後進行細胞融合。用於細胞融合的免疫細胞較佳為從脾臟取得。其他較佳的與上述免疫細胞融合的母細胞，包括例如哺乳動物的骨髓瘤細胞，更佳為具有以藥物選 擇融合細胞的所需性質的骨髓瘤細胞。
上述免疫細胞及骨髓瘤細胞可依照已知方法融合，該方法例如Milstein等人的方法(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73：3-46(1981))。
由細胞融合得到的融合瘤可藉由將其在標準選擇培養基例如HAT培養基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養基)中培養而選擇。通常該細胞培養物係在該HAT培養基中繼續培養數天至數週，時間足以使除了所望融合瘤以外的其他細胞(非融合細胞)死亡。然後，可實施標準極限稀釋以篩選並選殖生產所望抗體的融合瘤細胞。
除了上述方法，其中非人類動物係以抗原免疫以製備融合瘤，可將人類淋巴球例如受EB病毒感染者以胜肽、胜肽表現細胞或其溶解物於體外免疫。然後，將經免疫的淋巴球與能無限分裂的人類來源的骨髓瘤細胞例如U266融合，以得到生產能結合於該胜肽的所望人類抗體的融合瘤(未審查的日本公開專利申請案號昭63-17688)。
接著將獲得的融合瘤移殖到小鼠的腹腔，並抽取腹水。獲得的單株抗體可利用例如硫酸銨沉澱、蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換層析或偶聯有本發明胜肽的親和性管柱純化。本發明抗體不僅可用於純化及偵測本發明胜肽，也可當成本發明胜肽的增效劑及拮抗劑的候選者。
或者可將免疫細胞例如經免疫的淋巴球、生產抗體利用致癌基因使不死化並用於製備單株抗體。
獲得的單株抗體也可使用遺傳工程技術以重組方 式製備(參見例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies，於英國由MacMillan Publishers LTD(1990)出版)。例如可從免疫細胞例如融合瘤或經免疫的生產該抗體的淋巴球選殖編碼為抗體的DNA，插入適當載體，並導入寄主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如上述製備的重組抗體。
再者本發明抗體可為抗體片段或經修飾的抗體，只要其結合於一個或更多本發明的胜肽即可。例如，該抗體片段可為Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv)，其中來自H及L鏈的Fv片段以適當連結子連接(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更具體而言，可利用以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體而產生抗體片段。或者可構建編碼為該抗體片段的基因，插入表現載體並於適當的寄主中表現(參見例如，Co et al.,J Immunol 152：2968-76(1994)；Better與Horwitz,Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi,Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al.,Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker,Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。
抗體可藉由與各種分子例如聚乙二醇(PEG)接合而修飾。本發明提供此種經修飾的抗體。該經修飾的抗體可藉由將抗體化學修飾而獲得。此等修飾方法在該領域為習知。
或者本發明抗體可獲得為衍生自非人類抗體的可變區與衍生自人類抗體的不變區的嵌合抗體，或人類化抗體， 其包括衍生自非人類抗體的互補決定區(CDR)、框架區(FR)及衍生自人類抗體的不變區。此種抗體可依照已知技術製備。人類化可藉由取代囓齒類CDR或CDR序列為人類抗體的對應序列而實施(參見例如Verhoeyen et al.,Science 239：1534-1536(1988))。因此此種人類化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整的人類可變區域已取代成衍生自非人類種的對應序列。
也可使用除了人類框架及不變區外包括人類可變區的完全人類抗體。此種抗體可使用該技術領域已知的各種技術製造。例如體外方法涉及使用呈現在噬菌體的人類抗體片段的重組庫(例如Hoogenboom & Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991)。同樣地，可藉由將人類免疫球蛋白基因位導入基因轉殖動物例如內生免疫球蛋白已部分或全部失活的小鼠中，而製備人類抗體。此方法敘述於例如美國專利號6,150,584、5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。
如上獲得的抗體可純化成同質。例如可依照一般蛋白質使用的分離及純化方法將抗體分離及純化。例如可利用適當選擇及合併使用的管柱層析分離及單離抗體，管柱層析例如親和性層析、過濾、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳及等電點集中法(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限於此等。可使用蛋白質A管柱及蛋白質G管柱當做該親和性管柱。示例之可使用的蛋白質A 管柱包括例如Hyper D、POROS及Sepharose F.F.(Pharmacia)。
親和層析以外適合之的層析技術的例子，包括例如離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。該等層析程序可利用液相層析，例如HPLC與FPLC實施。
例如可使用測量吸光度、酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、酵素免疫分析法(EIA)、放射免疫分析法(RIA)及/或免疫螢光以測量本發明抗體的抗原結合活性。ELISA中，係將本發明抗體固定化在一平板上，塗佈本發明胜肽於該平板，然後塗佈含有所望抗體的樣本，例如抗體產生細胞的培養上清或純化的抗體。然後，將辨識該初級抗體的二次抗體以酵素例如鹼性磷解酶標記，然後溫育該平板。清洗後，添加酵素受質例如對硝基苯基磷酸酯到該平板，測量吸光度以評估該樣本的抗原結合活性。可使用該胜肽的片段例如C末端或N端片段當做抗原以評估該抗體的結合活性。可使用BIAcore(Pharmacia)來評估本發明抗體的活性。
上述方法，藉由使本發明抗體暴露於假定含有本發明胜肽的樣本，並偵測或測量該抗體與該胜肽形成的免疫複合體，能偵測或測量本發明的胜肽。
由於根據本發明之偵測或測量本發明胜肽的方法能夠專一性偵測或測量一胜肽，故該方法有用於使用該胜肽的許多實驗中。
XI. 載體與寄主細胞
本發明也提供導入有編碼為本發明胜肽的核苷酸的載體與寄主細胞。本發明的載體在攜帶核苷酸尤其是本發明DNA到寄主細胞以表現本發明之胜肽，或投予本發明核苷酸供基因治療為有用。
當選用寄主細胞為E.coli且載體在E.coli(例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1Blue)中大量放大及生產時，該載體應具有欲在E.coli中放大的「ori」以及用於選擇經轉形的E.coli的標誌基因(例如由安皮西林、四環黴素、嘉那黴素、氯黴素等藥物選擇的抗藥性基因)。例如，可使用M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，也可使用pGEM-T、pDIRECT及pT7次選殖及萃取cDNA及上述載體。當使用載體產生本發明蛋白質時，表現載體為有用。例如欲在E.coli中表現的載體應具有上述欲在E.coli中擴增需要的特性。當使用E.coli例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1 Blue當做寄主細胞，該載體應具有啟動子例如lacZ啟動子(Ward et al.,Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992))、araB啟動子(Better et al.,Science 240：1041-3(1988))、T7啟動子等。其能有效率地在E.coli中表現所望的基因。於此方面，可使用pGEX-5X-1(Pharmacia)、「QIAexpress system」(Qiagen)、pEGFP及pET(於此情形，寄主較佳為表現T7 RNA聚合酶的BL21)取代上述載體。此外，該載體也可含有訊號序列以供胜肽分泌。引導該胜肽分泌到E.coli胞間質之示例的訊號序列，為pelB訊號序列(Lei et al.,J Bacteriol 169：4379(1987))。將該等載體導入目標寄主細胞的方法包括例如氯化鈣法及電穿孔法。
除了E.coli，例如可使用衍生自哺乳動物的表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen)及pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990))、pEF、pCDM8)、衍生自昆蟲細胞的表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表現載體(例如pMH1、pMH2)、衍生自動物病毒的表現載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自反轉錄病毒的表現載體(例如pZIpneo)、衍生自酵母菌的表現載體(例如「Pichia Expression Kit」(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)，及衍生自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的表現載體(例如pPL608、pKTH50)，用於生產本發明之多胜肽。
為了於動物細胞例如CHO、COS或NIH3T3細胞中表現載體，該載體應具有對於在此種細胞中表現所需要的啟動子例如SV40啟動子(Mulligan et al.,Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EF1 alpha啟動子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV啟動子等，較佳為具有用於選擇轉形體的標記基因(例如由藥物(例如新黴素、G418)選擇的抗藥性基因)。具有此等特性的已知載體的例子包括，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV及pOP13。
以下參考具體的實施例對於本發明更詳細敘述。然而，以下材料、方法及實施例係可協助該技術領域中具有通 常知識者製造及使用本發明特定具體例，此等僅是意欲來解說本發明態樣，因此並不限制本發明的範圍。該技術領域中具有通常知識者當可輕易理解到，與在此所述者類似或等同之方法及材料可用於實施或測試本發明。
[實施例]
材料與方法
病患及臨床研究
2件胜肽為基礎的癌免疫療法的第I期臨床實驗已經過日本熊本的熊本大學人體試驗委員會(Institutional Review Board of Kumamoto University,Kumamoto,Japan)的審核及核可(核准編號841及1124)。所有罹患頭頸癌之病患係於提供知情同意書(written informed consents)後依據HLA-A24擁有性來選擇。腫瘤階段及分級係根據對抗癌症之國際聯合會(UICC)分級決定。罹患無法手術的帶有再復發或轉移性腫瘤且對於標準療法有抗藥性的晚期的頭頸癌的病患報名於一實驗(841)。經過放射性切除的晚期頭頸癌病患報名另一實驗(1124)。於此實驗(1124)，病患已接受術後胜肽疫苗免疫療法。罹患無法手術的帶有再復發或轉移性腫瘤且對於標準療法有抗藥性的晚期的HNMT的病患；報名University Hospital Medical Information Network Clinical Trials Registry(UMIN-CTR)000008379號(CTR-8379)實驗。經過放射性切除的HNMT病患報名UMIN-CTR 000008380號(CTR-8380)的實驗。在後者的實驗中，將HNMT病患以術後胜肽疫苗免疫療法，其係組合S-1、異環磷醯胺(ifosfamide)或阿黴素(doxorubicin)進行治療。此疫 苗雞尾酒由3種合成的短胜肽(SP)組成，其係由受HLA-A24限制之CTL辨識且衍生自CDCA1(CDCA1-A24(56-64))、KOC1(KOC1-A24(508-516))及LY6K(LY6K-A24(177-186)(Suda T,et al.Cancer Sci 2007.)。胜肽(各1mg)係乳化於500micro-L Montanide ISA51並於第0、7、14、28、42、56、63及70天以皮下注射(s.c.)，之後每月投予直到觀察到腫瘤進展或毒性。此等臨床實驗及研究分析仍在進行。從參與這些實驗的23名病患收集血液樣本，並且檢查Th細胞對於LY6K來源胜肽的免應反應。
細胞株及抗體
C1R-A2402細胞，係表現微量固有HLA第I類分子之人類B類淋巴母細胞株C1R之HLA-A24轉染體(Karaki S,et al.Immunogenetics 1993；37：139-42.)，係受贈於Masafumi Takiguchi(Kumamoto University,Kumamoto,Japan)。作為抗原呈現細胞(APC)，係使用小鼠纖維母細胞株、L-細胞，其已經過基因改造以表現DR4(DRB1*04：05)；L-DR4、DR8(DRB1*08：03)；L-DR8、DR15(DRB1*15：02)；L-DR15或DP5(DPB1*05：01)；L-DP5中之一。
以演算法預測HLA第II類結合胜肽
為了預測有潛力的混雜的HLA-DR或-DP結合人類LY6K衍生的胜肽，將該人類LY6K蛋白質之胺基酸序列使用電腦演算法(IEBD analysis resource,consensus method,http：//tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html)(Wang P et al.BMC Bioinformatics；11：568.,Wang P et al. PLoS Comput Biol 2008；4：e1000048.)分析。該程式分析對完成完整之蛋白質的15個胺基酸長的序列偏移量(offset)進行分析。選擇並合成20個胺基酸長的胜肽，其對於由DRB1*09：01或DRB1*15：02對偶基因編碼之多個HLA-第II類分子具有重疊的高一致性百分等級而且係天然地包括LY6K衍生之10員CTL抗原決定位，以鑑別含有CTL抗原決定位之混雜之輔助T細胞抗原決定位(Harao M,et al.Int J Cancer 2008；123：2616-25.)。也合成另外一個24個胺基酸長的LY6K衍生之LP，其對於由DPB1*05：01、DRB1*08：03、DRB1*09：01或DRB1*15：02編碼的多個HLA第II類分子有重疊的高一致性百分等級，但不包括CTL抗原決定位。
合成胜肽及重組蛋白質
合成人類LY6K來源短胜肽(SP)，此等係結合於HLA-A24、LY6K-A24(177-186)、RYCNLEGPPI(純度>95%,Biomatik,Canada)。合成2種長胜肽(LP)，即LY6K(119-142),KWTEPYCVIAAVKIFPRFFMVAKQ(序列識別號：1)；LY6K(172-191)KCCKIRYCNLEGPPINSSVF(序列識別號：2)，(純度>90%)，並檢驗其刺激LY6K專一性人類CD4+ T細胞的能力。使用結合於HLA-A24(HIV-A24,RYLRDQQLL(序列識別號：4))之HIV胜肽，作為負對照SP(Tomita Y,et al.Cancer Sci；102：697-705.,Tomita Y et al.Cancer Sci；102：71-8.)。使用結合於DP5之EBNA(Epstein-Barr virus nuclear antigen)衍生之LP即EBNA-DP5(FLQTHIFAEVLKDAIKDL)(序列識別號：5))，及混雜的HIV來源LP作為負對照LP(Fujiki F et al.J Immunother 2007；30：282-93.)。將胜肽以10micro g/microL的濃度溶於二甲基亞碸，並保存在攝氏-80度。將該重組的完整LY6K與CDCA1蛋白質由帶有pET28a載體(Novagen)的大腸桿菌E.coli BL21品系表現。使用該CDCA1蛋白質作為對照蛋白質。將各蛋白質使用SDS-PAGE純化及評估。
從健康捐贈者TAA專一性CD4+ T細胞株的產生
收集與使用衍生自健康捐贈者之周邊血液單核細胞(PBMC)的研究計畫經過熊本大學人體試驗委員會(Institutional Review Board of Kumamoto University)核可。從9名健康的捐贈者在收到他們的知情同意書(written informed consents)後獲得血液樣本。本研究中調查的健康捐贈者的HLA-A、DRB1及DPB1對偶基因，係以聚合酶連鎖反應及對偶基因專一性探針雜交之HLA基因變異的DNA分型(DNA TYPING)來決定，且如表1。PBMC從健康自願者與病患如前述般單離(Inoue M,et al.Int J Cancer；127：1393-403.)。藉由使用偶聯了抗CD4單株抗體的磁性微珠以陽性篩選來從PBMC純化CD4+ T細胞(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)。經由如前述方式於體外培養從CD14+細胞生產單核球來源的樹狀細胞(DC)(Harao M,et al.Int J Cancer 2008；123：2616-25.)，並將其作為抗原呈現細胞(APC)以誘導TAA專一性CD4+ T細胞。將DC(1×104/井)以10micro g/ml LP施以脈衝(pulse)3小時並照射輻射(45Gy)，然後與自體CD4+ T細胞(3×104/井)，在96井平底培養盤之各井中混合，各井有200micro 1之補充5%人類無補體血漿(decomplemented plasma)的AIM-V。7天 後，從各培養物移除半數培養基，然後培養物被添加新鮮培養基(100micro l/井)，其含有以胜肽(10micro g/ml)脈衝的經放射照射的(50Gy)的自體PBMC(1×105)及5ng/ml人類重組(hr)IL-7。於第2次以胜肽刺激後2天，對於各井添加hr IL-2，使終濃度為10IU/ml。一週後，將各井中的經刺激的CD4+ T細胞在酵素連結之免疫點(ELISPOT)分析中分析干擾素專一性。將顯示對於同源(cognate)胜肽有專一性反應的T細胞移到24井盤，並且以週的間隔，對其使用於補充10IU/ml hr IL-2與5ng/ml hr IL-7之培養基中以該胜肽(10micro g/ml)脈衝的經放射照射的自體PBMC(1×106/井)進行再刺激。
Figure TWI609880BD00001
HLA：人類白血球抗原
T細胞對於胜肽的反應的評估
使用IFN-γ ELISPOT(Human IFN-γ ELISPOT kit,BD Biosciences)，如前述(Tomita Y et al.Cancer Sci；102：697-705.)評估Th細胞對於經過胜肽脈衝的APC的反應。簡言之，係分析每3×104個散裝CD4+ T細胞在以有經過胜肽脈衝之PBMC(3×104細胞/井)刺激時，或每1×104個散裝CD4+ T細胞在以有經過胜肽脈衝之HLA-DR或DP表現L細胞(5×104/井)刺激時，產生干擾素(IFN)-γ之胜肽專一性CD4+ T細胞的頻率。為了決定涉及抗原呈現的限制HLA分子，藉由添加抗HLA-DR mAb(L243,Biolegend)、抗HLA-DP mAb,(B7/21,abcam)、抗人類HLA-DQ mAb(SPV-L3,abcam)或抗HLA第I類mAb,(W6/32,abcam)，來檢查抗原誘導之IFN-γ生產之阻斷性。所有的mAb以最終濃度為5micro g/ml來使用。將與HIV來源之胜肽一起培養的細胞使用為負對照。將與PMA(100ng/ml；Sigma-Aldrich)及離子黴素(ionomycin)(500ng/ml；Sigma-Aldrich)一起培養的細胞使用為正對照。所有的IFN-γ ELISPOT分析中的評估實驗均實施兩重複或三重複，且結果係平均值。
細胞激素分析
將T細胞(1×104/井)與L-DP5(5×104/井)一起在LY6K(119-142)存在下，於96井培養盤培養。20小時後，收集培養懸浮層，並使用Bio-Plex系統(Bio-Rad)依廠商指示測量細胞激素的水平(IFN-γ、GM-CSF、TNF-alpha、MIP1beta、IL-2、IL-4、IL-17)。
將LY6K(119-142)LP專一性散裝Th細胞(3×104細胞/井)與LY6K(172-191)LP專一性Th細胞選殖體(Th選 殖體，1×104細胞/井)，和自體PBMC(3×104細胞/井)一起在同源胜肽存在下，於96井培養盤培養。24小時之後，收集培養懸浮層並且並使用Bio-Plex系統(Bio-Rad)依廠商指示測量細胞激素的水平(IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-alpha及MIP1beta)。
CD107a移動性分析
為了鑑別經LP刺激的脫顆粒CD4+ T淋巴球，使用細胞流式計數儀分析暴露於細胞表面的CD107a(Rubio V et al.Nat Med 2003；9：1377-82.,Betts MR,et al.J Immunol Methods 2003；281：65-78.)。簡言之，以如前述方式實施CD107a移動性分析(Tomita Y et al.Cancer Sci。2011 Jan；102(1)：71-8.)。添加LY6K衍生的胜肽或對照胜肽(1micro g/ml)作為刺激物，並且對各井加入經FITC標定的抗人類CD107a mAb或經FITC標定的構造同型(isotype)對照鼠IgG1及monensin。將細胞於攝氏37度培養5小時。培養後，將此經胜肽刺激的Th細胞或CTL，用有PE結合的抗人類CD4抗體(eBioscience,San Diego,CA)染色，並以細胞流式計數儀分析(FACScan；BD Biosciences)。
以LY6K(172-191)長胜肽刺激PBMC為了評估藉由於體外以LY6K(172-191)LP刺激之來自HLA-A24陽性捐贈者之LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL的誘導，將PBMC(2×106/井，24井盤)與LY6K(172-191)LP(7microM)一起培養2週而不添加任何的細胞激素。於第0及7天，添加LY6K(172-191)LP(7microM)，然後於以LY6K(172-191)LP體外刺激的第14天，收集細胞並以經PE標定之 HLA-A24(A*24：02)/LY6K-A24(177-186)複合體之四元體組合經FITC標定之抗人類CD8 mAb組合染色，以細胞流式計數儀分析。
於HNMT病患利用以LY6K-LP刺激所致之LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL的增殖
將來自經接種LY6K-A24(177-186)SP之11名HNMT病患而來的PBMC，與LY6K(119-142)LP及LY6K(172-191)LP(各10micro-g/mL)的混合物一起於24井盤(2×106/井)培養；於第0及2天加入rhIL-2(20IU/mL)及rhIL-7(5ng/mL)。於第0天(生物體外)及第7天，將PBMC以經PE標定之HLA-A*24：02/LY6K-A24(177-186)複合體的四元體(MBL,Nagoya,Japan)與經FITC標定之抗人類CD8 mAb染色。
體內交叉起動(cross priming)分析
HLA-A24基因轉殖小鼠係由F.A.Lemonnier博士好心提供(Jung KO,et al.J Virol；86：7616-24)。以7天為間隔，對於小鼠尾根部以真皮內注射(intradermally)在不完全佛洛依德佐劑(IFA)中乳化之LY6K(172-191)LP(100micro-g/每隻小鼠)。第2次接種LY6K(172-191)LP的7天後，將小鼠犧牲以獲得鼠蹊部附近的淋巴球，且利用以磁性小珠以陽性篩選單離CD8+ T細胞。以ELISPOT分析法計數回應於經LY6K-A24(177-186)SP或經HIV-A24 SP脈衝之C1R-A2402細胞(2×104/井)刺激的IFN-γ產生之CD8+ T細胞。
HLA-A24(HHH)基因轉殖小鼠係由F.A.Lemonnier博士好心提供(Jung KO,et al.J Virol；86： 7616-24)。以7天為間隔，對於小鼠尾根部以真皮內注射(intradermally)在不完全佛洛依德佐劑(IFA)中乳化之LY6K(172-191)LP(100micro-g/每隻小鼠)3次。第3次接種LY6K(172-191)LP的7天後，利用以磁性小珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)進行陽性篩選，從鼠蹊部附近的淋巴結單離CD8+ T細胞。以生物體外ELISPOT分析法計數回應於經LY6K-A24(177-186)脈衝之BM-DC(2×104細胞/井)刺激的IFN-γ產生CD8+ T細胞(1×105細胞/井)(Inoue M,et al.Immunol Lett 2009；126：67-72.；Harao M,et al.Int J Cancer 2008；123：2616-25.)。
經以LY6K來源SP主動免疫的頭頸癌病患中的LY6K專一性CD4+ T細胞反應的評估
將來自癌病患或健康捐贈者的PBMC，與10micro-g/ml的LY6K衍生的LP的混合物，一起於補充5%人類去補體血漿之AIM-V中，於24井培養盤(2×106/井)培養，並於第0及2天添加IL-7及IL-2。培養1週後，收集PBMC，並以IFN-γ ELISPOT分析來測量LY6K專一性T細胞的存在。將此短時間培養的PBMC(1×105/井)洗滌並培養於已預塗覆抗人類IFN-γ單株抗體且培養基中存在LY6K(172-191)或LY6K(119-142)LP的ELISPOT培養盤共18小時。將與HIV-A24一起培養的細胞使用為負對照。以點形成細胞/105細胞的樣態呈現的專一性T細胞的數目，於減去負對照值(背景)後計算。為了確認HLA第II類限制性，於ELISPOT分析時加入以下的專一於HLA-DR、HLA-DP或HLA第I類的阻斷抗體。當IFN-γ多於10且多於背景值 2倍，則評估反應為陽性。所有於癌病患的實驗係於單一井或二井實施。病患之細胞的ELISPOT分析，由於可得細胞數目有限，以單一、二、或三個井實施。當IFN-γ平均數超過15且超過背景2倍時，評定反應為陽性。此研究係在依循探索性研究原則(exploratory research principles)下操作的實驗室進行，並係使用調查性的實驗步驟實施。本案發明人感謝報告針對人類T細胞分析框架的Minimal Information About T-cell Assay(MIATA)的建議(Britten CM et al.,Immunity 2012；37：1-2.)。
四元體染色
LY6K-A24(177-186)SP專一性T細胞受體(TCR)之表現，係使用經PE標定之HLA-A*24：02/LY6K-A24(177-186)SP複合體的四元體(MBL,Nagoya,Japan)，依廠商指示於FACSCalibur(BD Biosciences)上檢驗。使用經PE標定之HLA-A*24：02/HIV-A24(RYLRDQQLL)複合體的四元體作為負對照。
體外交叉呈現分析
以前述方式實施藉由以LY6K-A24(177-186)SP刺激之來自HLA-A24+與HLA-DR15+ HDL3之LY6K-A24(177-186)SP反應性CTL的誘導(Tomita Y,et al,Cancer Sci 2011；102：71-8.,Imai K,et al.,Clin Cancer Res 2008；14：6487-95.)。單核球衍生的DC係依前述，從CD14+細胞於體外培養產生(Harao M,et al.Int J Cancer 2008；123：2616-25.)。將自體不成熟DC保持存活或在0.1%戊二醛(Sigma-Aldrich)中固定3分鐘，以LY6K-A24(177-186)SP、LY6K(172-191)-LP、或對照LP(各 16micro-M)脈衝3小時，並洗滌3次。於此胜肽脈衝期間及之後加入OK432(0.1KE/mL)以誘導DC成熟。使用不包括已知CTL抗原決定位的LY6K(119-142)LP作為對照LP。對於含10micro g/mL brefeldin A(Sigma-Aldrich)之培養基，以2：1的比例加入LY6K-A24(177-186)SP反應性散裝CTL，持續6小時。利用胞內標定，來測量LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之IFN-γ生產。將此細胞，以組合經FITC標定之抗人類IFN-γ mAb(BioLegend)、經PerCP標定之抗人類CD8 mAb(BioLegend)及經PE標定之LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色。
於HNMT病患藉由以LY6K(172-191)-LP刺激之LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL的增殖
將來自經接種LY6K-A24(177-186)SP之5名HNMT病患的PBMC，與LY6K(172-191)LP(各10micro-g/mL)的混合物一起於96井培養盤(1×105/井)培養；於第0及2天加入rhIL-2(20IU/mL)及rhIL-7(5ng/mL)。於第0天(生物體外)及第7天，將PBMC以經PE標定之HLA-A*24：02/LY6K-A24(177-186)複合體的四元體(MBL,Nagoya,Japan)與經FITC標定之抗人類CD8 mAb染色。
藉由於體外以LY6K(172-191)-LP刺激PBMC之LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL的誘導
為了評量於體外藉由以LY6K(172-191)LP之刺激之來自HLA-A24+捐贈者(HDL1、HDL3及HDL4)之LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL的誘導，將PBMC(2×106細胞/井，24井平盤)與LY6K(172-191)LP(7microM)一起溫育 2週，不添加任何細胞激素。於第7天，加入LY6K(172-191)LP(7microM)，並於體外以LY6K(172-191)LP刺激的第14天，收集細胞，並以經PE標定之LY6K-A24(177-186)SP專一性的四元體及經FITC標定之抗人類CD8 mAb染色。
LY6K-LP在誘導LY6K專一性CTL之相乘效果(synergistic effect)
為了檢測是否LY6K-LP能增強LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之誘導。將來自HDL3之LY6K(119-142)LP專一性或LY6K(172-191)LP專一性散裝CD4+ T細胞(1×105細胞/井，48井平盤)及LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CD8+ T細胞(1×105細胞/井)，與自體DC(2×104細胞/井)一起在LY6K-A24(177-186)SP(10micro-g/mL)、LY6K-A24(177-186)SP+對照LP(10micro-g/mL)或LY6K-A24(177-186)SP+LY6K-LP(10micro-g/mL)存在下培養。於體外和胜肽一起培養1週後，將培養的細胞以LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色。
將獲自已接種LY6K-A24(177-186)SP之HNMT病患的新鮮PBMC置於在96井圓底培養盤(1×105細胞/井)，再添加LY6K-A24(177-186)SP單獨(10micro-g/mL)、LY6K-A24(177-186)SP+對照LP(10micro-g/mL)、LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(119-142)LP(10micro-g/mL)或LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(172-191)LP(10micro-g/mL)，於最終體積200micro-L之補充5%人類去補體血漿之AIM-V，不添加細胞激素。培養第7天時，將細胞以 LY6K-A24(177-186)專一性四元體染色。
統計分析
將資料以雙尾學生t(Student t)檢定(條狀圖)、費雪正確性(Fisher’s exact)檢定或無參數曼-惠特尼(Mann-Whitney)U檢定(散點圖)比較。在所有檢測中，P值小於0.05，被認為是統計上顯著。
結果
有潛力之混雜的HLA第II類結合胜肽的預測及選擇為了鑑別LY6K之有潛力之混雜的HLA-第II類結合之Th細胞抗原決定位，本案發明人首先使用如圖1A及表2的電腦演算法檢驗LY6K的胺基酸序列(Wang P,et al.BMC Bioinformatics；11：568.,Wang P,et al.PLoS Comput Biol 2008；4：e1000048.)。有趣地，發明人發現以此電腦演算法預測為有潛力的混雜的HLA第II類結合胜肽的LY6K來源胜肽，即LY6K(172-191)，非常接近該CTL抗原決定位，LY6K-A24(177-186)(圖1B)。因此，發明人選擇並且合成候選LP LY6K(172-191)，其係與多個HLA-第II類分子HLA-DR9(DRB1*09：01)及HLA-DR15有高一致性百分等級重疊且包括由經HLA-A2-或-A24限制之CTL辨識的天然10員胜肽以用於後續之分析(圖1A及表2)。也合成不包括CTL抗原決定位但針對多種HLA第II類分子有重疊的高一致性百分等級之另一LP，即LY6K(119-142)，並評估此LP是否能產生LY6K專一性Th細胞。
表2，衍生自LY6K之長胜肽的演算法分數
Figure TWI609880BD00002
針對指出之HLA-第II類分子的胜肽結合演算法分數，係針對LY6K(119-142)與LY6K(172-192)胜肽之各15個胺基酸序列表示。
鑑別天然上包括CTL抗原決定位之衍生自LY6K且為混雜之HLA第II類結合Th細胞抗原決定位
本案發明人評估是否此兩個選出的合成LP能產生LY6K專一性Th細胞。將衍生自3名健康捐贈者的PBMC的CD4+ T細胞，以每週為間隔以自體DC及經LY6K(119-142)胜肽脈衝的PBMC進行刺激。於至少3次刺激後，以IFN-γ ELISPOT檢驗此 培養的CD4+ Th細胞的LY6K(119-142)專一性反應。在1名HLA-DP5陽性及HLA-DR4陽性健康捐贈者中，所產生的Th細胞株回應LY6K(119-142)產生顯著量的IFN-γ(圖2A)。為了闡發此Th細胞株之HLA-限制性，使用對抗HLA-DR或HLA-DP的mAb。當添加HLA-DP專一性mAb時，Th細胞株回應LY6K(119-142)之IFN-γ產製顯著減少，而HLA-DR專一性mAb未顯示效果(圖2A)。
為了進一步分析HLA限制性，發明人測試Th細胞對於經胜肽脈衝的L-DP5或L-DR4細胞的反應性。從1名DP5陽性健康捐贈者產生的散裝LY6K(119-142)專一性Th細胞株，會專一性辨識經LY6K(119-142)脈衝的L-DP5細胞，但不是L-DR4細胞、經無關的胜肽(EBNA-DP5)脈衝的L-DP5細胞、經LY6K(119-142)胜肽脈衝的L-DR4細胞。辨識經LY6K(119-142)脈衝之L-DP5細胞的Th細胞株的IFN-γ產生，顯著受添加抗HLA-DP mAb抑制，但未受添加抗HLA第I類mAb抑制(圖2B)。此等結果明顯指出在此等Th細胞株中，由HLA-DP5呈現LY6K(119-142)。
為了調查是否LY6K(119-142)能結合其他HLA第II類分子並且誘導Th細胞反應，將得自其他2名健康捐贈者的CD4+ T細胞以經LY6K(119-142)脈衝之自體DC與PBMC進行刺激。從HLA-DR8陽性捐贈者HDL2產生的Th細胞株，回應於經LY6K(119-142)脈衝之PBMC與L-DR8細胞而專一性地生產顯著量的IFN-γ，但非回應經LY6K(119-142)脈衝之L-DR15細胞。回應於經LY6K(119-142)脈衝之PBMC或L-DR8 細胞的Th細胞株的IFN-γ產生，顯著受添加抗HLA-DR mAb抑制，但未受添加HLA-DP或HLA第I類專一性mAb抑制(圖2A與B)。此等結果明顯指出在此T細胞株中，LY6K(119-142)由HLA-DR8HLA-DR8所呈現。
自藉由以LY6K(119-142)刺激之HLA-DR15陽性捐贈者HDL3產生的該Th細胞株回應於經LY6K(119-142)脈衝之PBMC與L-DR15細胞也專一性的生產顯著量的IFN-γ，而不是經LY6K(119-142)脈衝之或未經脈衝之L-DR8細胞。Th細胞株對抗經LY6K(119-142)脈衝之PBMC或L-DR15細胞之IFN-γ產生顯著受添加抗HLA-DR mAb所抑制，但非HLA-DP、-DQ或HLA第I類專一性mAb(圖2A與B)。這些結果明顯指出在此T細胞株，LY6K(119-142)係由HLA-DR15呈現。因此，LY6K(119-142)有能力結合於HLA-DP5、HLA-DR8及HLA-DR15分子指出LY6K(119-142)係於日本族群中由混雜且常見的HLA第II類分子呈現的Th細胞抗原決定位。
接著，本案發明人評估是否含有由受HLA-A24限制之CTL辨識之抗原決定位的另一胜肽LY6K(172-191)能產生專一性Th1細胞。將從2名健康捐贈者之PBMC得到的CD4+ T細胞，以自體DC及以LY6K(172-191)脈衝過的PBMC刺激。
自藉由以LY6K(172-191)刺激的HLA-DR15陽性捐贈者HDL3產生的Th細胞株，回應於LY6K(172-191)脈衝過的PBMC及L-DR15細胞專一性地產生顯著量的IFN-γ，而不是LY6K(172-191)脈衝過的或未經脈衝的L-DR8細胞。Th細胞 株對抗LY6K(172-191)脈衝過的PBMC或L-DR15細胞之IFN-γ生產藉由添加抗HLA-DR mAb被顯著抑制，而非HLA-DP、-DQ或HLA第I類專一性mAb(圖3A上方分格)。從HLA-DR15+捐贈者(HDL2)產生之Th細胞，回應於LY6K(172-191)LP脈衝過的PBMC，以HLA-DR依存的方式生產顯著量的IFN-γ。散裝Th細胞以HLA-DR-依存性方式專一性地辨識經LY6K(172-191)LP脈衝過的L-DR15細胞(圖3A下方分格)。這些結果明確指出LY6K(172-191)在此T細胞中由HLA-DR15呈現。
為了調查LY6K(172-191)是否能與其他的HLA第II類分子結合並誘導Th細胞反應，將來自HLA-DR15陰性之健康捐贈者之CD4+ T細胞，以LY6K(172-191)脈衝過的自體DC與PBMC刺激。產生的Th細胞回應於LY6K(172-191)脈衝過的自體PBMC生產了顯著量的IFN-γ，但非未經脈衝的PBMC(圖3B)。此Th細胞株之IFN-γ生產由於添加抗HLA-DQ mAb被顯著抑制，而非抗HLA-DR或抗HLA-DP。這些結果指出此Th細胞受HLA-DQ分子限制。
合成於天然對應蛋白質的N及C兩末端延伸的25個胺基酸(aa)長的合成胜肽，LY6K(168-192)，FFYLKCCKIRYCNLEGPPINSSVFK(序列識別號NO：6)，並且檢測其刺激LY6K專一性人類CD4+ T細胞的能力。有趣地，此延伸的LP不僅誘導受胜肽專一性DQ限制之Th細胞，也會誘導同一捐贈者的受DR限制的Th細胞(圖4)。因此比起劑量(dose)(LY6K(172-191)，較長的胜肽LY6K(168-192)能更雜 亂地誘導。
綜上，此等結果明確證明兩個胜肽即LY6K(119-142)及LY6K(172-191)有能力刺激受HLA-DP5、-DR8、-DR15及-DQ限制之Th細胞，啟示這些胜肽能藉由雜亂的HLA第II類分子對Th細胞呈現，且能供許多病患在癌免疫療法使用。
LY6K(119-142)胜肽刺激Th1型CD4+ T細胞
為了進一步將LY6K胜肽誘導之Th細胞定性，本案發明人以Bio-Plex系統測量回應於以同源胜肽刺激LY6K專一性散裝CD4+ Th細胞株所產生的數種細胞激素。藉由以同源胜肽脈衝過的L-DP5再刺激，產生自捐贈者HDL之LY6K專一性散裝Th細胞株產生大量的IFN-γ、TNF-alpha、GM-CSF及MIP-1beta，及顯著產生IL-2，但較少IL-4及IL-17，指出由LY6K胜肽誘導Th細胞，Th1有偏向的特性(圖5A)。
如圖5B，來自HDL4之LY6K(172-191)LP專一性Th選殖體於刺激後產生了大量的細胞激素，啟示LY6K(172-191)LP可誘導多功能的Th1細胞。類似結果也從由HDL3建立的LY6K(172-191)LP專一性Th細胞獲得(資料未顯示)。
有趣地，細胞毒性標記CD107a也能於經同源胜肽(圖5C上部分格)刺激的LY6K(119-142)專一性散裝Th細胞株上檢測到，如同針對抗病毒CD4+效應子及腫瘤浸潤淋巴球所顯示(Casazza JP,et al.J Exp Med 2006；203：2865-77.Attig S,et al.Cancer Res 2009；69：8412-9.Widenmeyer M,et al.Int J Cancer；131：140-9.)。關於LY6K(172-191)LP，CD107a也能於經同源胜肽(圖5C下部分格，且資料未顯示)刺激的 LY6K(172-191)LP專一性散裝Th細胞株上檢測到，如同先前針對抗病毒CD4+效應子及腫瘤浸潤淋巴球所證明。(Casazza JP,et al.,J Exp Med 2006；203：2865-77.；Attig S,et al.,Cancer Res 2009；69：8412-9.；Widenmeyer M,et al.,Int J Cancer 2012；131：140-9.；Martorelli D,et al.,Int Rev Immunol 2010；29：371-402.)。綜上，此等資料啟示LY6K專一性Th1細胞能發揮輔助功能及直接細胞毒性活性，兩者均對於癌免疫療法有利。
LY6K(172-191)LP於體外及體內刺激LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞的擴增
檢驗LY6K(172-191)LP刺激LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞擴增的能力。將兩次以7micro-M的LY6K(172-191)LP之PBMC的刺激誘導出的受HLA-A24限制及LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞之擴增，與以無關胜肽刺激之PBMC比較(圖6A)。
本案發明人也檢測是否LY6K(172-191)LP能於體外刺激由於以體內對於頭頸癌病患以LY6K-A24(177-186)SP進行了主動免疫而得的LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞擴增。從此病患分離之生物體外於PBMC之LY6K-A24(177-186)SP專一性及受HLA-A24限制之CTL之存在，係利用以經PE標定之HLA-A24(A*24：02)/LY6K-A24(177-186)複合體的四元體染色來偵測(圖6B，左)。將此等PBMC和LY6K(172-191)LP一起培養一段短時間(1週)，並以四元體偵測LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞。如圖6B右圖中 所示，LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL藉由於短時間體外以LY6K(172-191)LP的刺激而顯著擴增。
接著，於體外檢驗LY6K(172-191)LP刺激LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞的能力。將HLA-A24 Tgm的尾根部以乳化於IFA之LY6K(172-191)LP以7天間隔免疫2次。第2次接種LP後7天，以生物體外ELISPOT分析來決定鼠蹊部附近之LN中的IFN-γ分泌CD8+ T細胞。如圖6C中所示，經以LY6K(172-191)LP對HLA-A24 Tgm免疫2次的所刺激出的CD8+ T細胞，專一性地反應於以經LY6K-A24(177-186)SP脈衝之C1R2402之再度刺激而生產IFN-γ，而非經無關HIV-A24胜肽脈衝之C1R2402，啟示LY6K(172-191)LP可能藉由於HLA-A24 Tgm體內利用交叉呈現而誘導顯著比例的IFN-γ產生LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL。
綜上，此等結果啟示LY6K(172-191)LP於體外及體內均能交叉啟動LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL。
於經接種LY6K-A24(177-186)短胜肽之頭頸癌病患中之LY6K專一性T細胞之存在
最近Godet Y等人報告於肺癌病患存在自發性腫瘤專一性Th細胞反應，且此天然發生之TAA專一性Th免疫反應對臨床結果產生影響(Godet Y,et al.Clin Cancer Res；18：2943-53.)，而本發明考慮到LY6K專一性Th細胞可能藉由對於癌病患以LY6K來源的CTL抗原決定位疫苗進行主動免疫而有效率地誘導。為了偵測病患中的抗原專一性應，收集從7名 頭頸癌病患分離的PBMC，並以IFN-γ ELISPOT分析偵測LY6K(119-142)LP專一性Th細胞。使用從3名健康自願者分離的PBMC作為對照。當IFN-γ-分泌細胞的數目為至少是負對照的2倍以上，則視為陽性。此實驗設計能測量LY6K專一性Th細胞記憶反應。如圖7A中所示，6名病患中5名(83%)觀察到LY6K(119-142)LP專一性記憶免疫反應，於所有病患(100%)觀察到LY6K(172-191)LP專一性記憶免疫反應，但於連續3名健康捐贈者及1名未接種疫苗的癌病患針對LY6K無專一性IFN-γ反應(圖7A)。此等Th細胞株之IFN-γ生產，受添加抗HLA-DR mAb顯著抑制，但非抗HLA-DP、HLA-DQ或抗HLA第I類(圖7B)。此等結果明確指出此等抗原專一性IFN-γ生產係來自受HLA-DR分子限制之CD4+細胞。此觀察結果也顯示此兩種LY6K來源的LP係天然地被處理且於癌病患體內對CD4+ T細胞呈現。
於接種LY6K-A24(177-186)SP前及後在HNMT病患中之LY6K專一性Th細胞之存在
本案發明人利用LY6K-A24(177-186)SP評估從21名參加兩個胜肽疫苗試驗的HNMT病患獲得之周邊血疫中，針對LY6K-LP之Th細胞反應。捐贈者特性整理於圖12。在經過1週以LY6K-LP體外刺激PBMC後，以IFN-γ ELISPOT分析偵測各LY6K-LP專一性Th細胞的頻率(圖8A)。若IFN-γ-分泌細胞的數目為至少是負對照的2倍以上，則視為陽性。發現LY6K專一性CD4+ T細胞反應存在於HNMT病患。如於圖8B中所示，7名HNMT病患中，Th細胞之LY6K-LP專一性IFN-γ生產，由於添加 抗HLA第II類mAb被顯著抑制，但非抗HLA第I類mAb。有趣地，3名HNMT病患之LY6K(119-142)LP專一性之受HLA-DR或DQ限制之Th細胞的HLA第II類對偶基因並未被HLA-DR8或-DR15共享(圖8B；LY6K(119-142)LP；HNMT31、41及107)。5名HNMT病患之LY6K(172-191)LP專一性之受HLA-DR限制之Th細胞的HLA第II類對偶基因並未被HLA-DR15共享(圖8B；LY6K(172-191)LP；HNMT31、41、42、107及108)。此等結果啟示LY6K(119-142)LP and LY6K(172-191)LP可能擁有一些尚未在本研究中之體外實驗鑑別出的受HLA第II類限制之Th細胞抗原決定位，且可涵蓋許多癌病患。
短期間於體外以LY6K-LP刺激後，於HNMT病患偵測到顯著高頻率(LY6K(119-142)LP,23中之10,44%；LY6K(172-191)LP,23中之16,70%)的LY6K-LP專一性免疫反應，但於9名健康捐贈者對於LY6K-LP無專一性IFN-γ反應(圖8C及圖12)。於已接種之病患中，對抗LY6K(119-142)LP與LY6K(172-191)LP之專一性的點的數目，也比起健康捐贈者顯著較大(圖8D)。於已接種之病患中，LY6K(172-191)LP之專一性的點的數目比起接種前之HNMT病患者顯著較大(圖8D，右分格)，儘管與接種前之HNMT病患者比較，於已接種之病患中，LY6K(119-142)LP之專一性的點的數目並非顯著(圖8D，左分格)。於接種後的HNMT病患之LY6K(172-191)LP專一性免疫反應頻率，顯著大於在接種前的HNMT病患(圖8E)。在有些接種前的病患偵測到LY6L-LP專一性反應，但頻 率低(圖12；LY6K(119-142)LP,11中之2,18%；LY6K(172-191)LP,11中之1,9%)。有趣地，藉由重複接種會引起或增強對LY6K-LP之專一性反應(圖8F)。比較於患有晚期癌之已接種之HNMT病患(CTR-8379,n=13)及已接受術受輔助免疫療法之已接種之HNMT病患(CTR-8380,n=8)中的LY6K-LP專一性IFN-γ點的數目，發現已接受術受輔助免疫療法之已接種之HNMT病患(CTR-8380,n=8)中的LY6K-LP專一性IFN-γ點的數目顯著多於於患有晚期癌之已接種之HNMT病患中者(圖8G)。綜上，此等觀察啟示患有HNMT之病患能發動LY6K專一性CD4+ T細胞反應。
LY6K-LP擁有經天然處理的Th細胞抗原決定位
本案發明人進行評估是否DC會攝入並處理LY6K蛋白質以刺激LY6K-LP專一性Th細胞。製備載有重組LY6K蛋白質之自體DC，並於IFN-γ ELISPOT分析中使用為APC(Tomita Y et al.,C ancer Sci 2011；102：71-8；Harao M et al.,Int J Cancer 2008；123：2616-25)。受HLA-DP5限制之LY6K(119-142)LP反應性散裝Th細胞有效率地以HLA-DP依存性方式辨識載有LY6K蛋白質之DC，但不辨識載有對照蛋白質之DC，指出LY6K(119-142)LP包含被天然地處理且由HLA-DP5分子呈現之一抗原決定位(圖9A)。受HLA-DR15或HLA-DQ-限制之LY6K(172-191)LP專一性Th選殖體也會辨識載有LY6K蛋白質之自體DC，指出LY6K(172-191)LP包含被天然地處理且由HLA-DR15及HLA-DQ分子呈現之抗原決定位(圖9B)。
LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL藉由於體外之 LY6K(172-191)LP交叉呈現而刺激
接著，本案發明人檢測是否LY6K(172-191)LP脈衝過的DC會經由LY6K(172-191)LP之交叉呈現而刺激LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CTL。
以細胞外標定來測量由LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL所為之IFN-γ生產。已固定的DC，其無法交叉呈現但如同活DC有效呈現LY6K-A24(177-186)SP(圖10A，固定的DC+SP)，被使用於排除或評估T細胞反應中LP降解產物之外來性呈現的貢獻。LY6K(172-191)LP僅當未固定的DC(DC+LP)交叉呈現時才誘導顯著比例的IFN-γ分泌性四元體+ CD8+ T細胞。經LY6K(172-191)LP脈衝的固定DC不能刺激LY6K-A24(177-186)專一性CTL，經無關之LP脈衝之未固定DC(固定DC+LP及DC+對照LP)亦是如此。
本案發明人評估是否LY6K(172-191)LP能誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CTL擴增。將從HLA-A24+ HDL3之已純化CD8+ T細胞產生的LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CTL，以LY6K(172-191)LP脈衝過的自體DC再度刺激。如於圖10B中所示，於第7天，藉由以LY6K(172-191)LP脈衝過的DC刺激的LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體+ CD8+細胞的群體顯著擴增，但當LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CTL係以對照LP脈衝過的DC刺激時，則減少。此等結果啟示LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之擴增由於以DC之LY6K(172-191)LP的交叉呈現而誘導。
LY6K(172-191)LP於HNMT病患誘導有效率的 LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL擴增
本案發明人評估是否LY6K(172-191)LP能於體外在6名HNMT病患中之PBMC誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL擴增。將來自5名經接種LY6K-A24(177-186)SP之HNMT病患的新鮮PBMC，與LY6K(172-191)LP(10micro-g/mL)一起培養。於第0及2天添加rhIL-2(20IU/mL)及rhIL-7(5ng/mL)。於第0天(生物體外)及第7天，將PBMC以LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色。如於圖10C中，當從HNMT108分離的PBMC於體外培養(生物體外)前以LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色，四元體+細胞之頻率僅有0.05% CD8+ T細胞。四元體+細胞於體外經以LY6K(172-191)LP刺激PBMC 1週而不添加LY6K-A24(177-186)SP後顯著擴增。LY6K-A24(177-186)專一性CTL的頻率顯著增加至0.35% CD8+ T細胞。於第7天以LY6K-A24(177-186)SP刺激細胞，也偵測到抗原專一性IFN-γ生產。於接種後，5名中之4名HNMT病患觀測到四元體+ CD8+細胞比例增加超過2倍(圖10D；HNMT43、105、108及110)。此等結果啟示HNMT病患之LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL誘導，可能藉由DC之LY6K(172-191)LP的交叉呈現而誘導。當PBMC與LY6K(119-142)LP和LY6K(172-191)LP(各10micro-g/mL；圖10E-F)之混合物一起培養，於11名中之9名HNMT病患觀測到類似結果。有趣地，於接種LY6K-A24(177-186)SP前的HNMT42中，LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體+細胞也會由於以LY6K(119-142)LP及LY6K (172-191)LP之混合物刺激而顯著擴增(圖10G)。
LY6K(172-191)LP的交叉呈現有效率地於體外及體內起動LY6K專一性CD8+ T細胞
接著，利用四元體標定檢驗LY6K(172-191)LP誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL的能力。於3名HLA-A24+健康捐贈者(HDL1、HDL3、HDL4；圖10H且資料未顯示)，於和LY6K(172-191)LP一起培養2週的PBMC，顯著誘導出受HLA-A24限制之LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL。
LY6K(172-191)LP於生物體外起動LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL的能力利用IFN-γ ELISPOT分析檢驗。將HLA-A24 Tgm以LY6K(172-191)LP免疫3次。經接種LY6K(172-191)LP之HLA-A24 Tgm之CD8+ T細胞，回應於經LY6K-A24(177-186)SP脈衝之BM-DC刺激生產IFN-γ(圖10I)。此等結果證明攝入LY6K(172-191)LP後，APC能於體外及體內交叉起動LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL。
藉由LY6K-LP專一性Th細胞之LY6K-A24(177-186)專一性CTL之增強的誘導
本案發明人檢測是否LY6K-LP能增強誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL。將來自HDL3之LY6K-LP專一性散裝CD4+ T細胞與LY6K-A24(177-186)SP專一性散裝CD8+ T細胞，和自體DC一起於存在LY6K-A24(177-186)SP、LY6K-A24(177-186)SP+對照LP、或LY6K-A24(177-186)SP+LY6K-LP存在下培養。於體外和胜肽一起培養1週後，將培養的細胞以LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色。如圖11A 中所示，添加LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(119-142)LP或LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(172-191)LP比起單獨添加LY6K-A24(177-186)SP或添加LY6K-A24(177-186)SP+對照LP，顯著增加了LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞數目的絕對值。觀察到於HLA-A24+ HDL4中由於活化的LY6K(172-191)LP專一性Th細胞而增強誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體+ T細胞(資料未顯示)。
接著，評估LY6K-LP對於從已接種之HNMT病患(HNMT31、42及43)而來之PBMC誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之相乘效果。將免疫後2個月的HNMT43收集的PBMC，單獨與LY6K-A24(177-186)SP、與LY6K-A24(177-186)SP+對照LP、LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(119-142)LP、或LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(172-191)LP一起培養7天。於體外和胜肽一起培養1週後，將細胞以LY6K-A24(177-186)SP專一性四元體染色(圖11B)。當PBMC與LY6K-A24(177-186)SP+LY6K(172-191)LP一起培養，LY6K-A24(177-186)SP專一性CD8+ T細胞的絕對數目，比起與單獨的LY6K-A24(177-186)SP或與LY6K-A24(177-186)SP+對照LP(圖11C)培養時顯著擴增。於HNMT43，LY6K(119-142)LP對於誘導LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL無相乘作用。當發明評估免疫後1個月，也觀察到類似結果(資料未顯示)。於HNMT31及HNMT 42，藉由添加LY6K(119-142)LP或LY6K(172-191)LP to LY6K-A24(177-186)SP觀察到類似結果(圖11D)。此等結果啟示LY6K-LP可產生 LY6K-A24(177-186)SP專一性CTL之相乘的誘導。
討論
據認為最有吸引力的疫苗化合物，係反應於能誘導治療性CD4+T細胞與CD8+T細胞反應之TAA序列的合成LP(Kenter GG,et al.N Engl J Med 2009；361：1838-47.Melief CJ and van der Burg SH.Nat Rev Cancer 2008；8：351-60.)。在注射此等LP後，病患的DC會攝入LP，對其處理並在各種HLA第I類與HLA第II類分子分別呈現所有可能的CTL-抗原決定位及Th抗原決定位。因此，本案發明人認為癌免疫療法的理想胜肽疫苗應為能誘導由最常見HLA限制之CTL與Th1細胞兩者的單一多胜肽。於本研究，本案發明人鑑別包括被受雜亂的HLA-第II類限制的Th1細胞辨識的CTL-抗原決定位的LY6K衍生LP。且本案發明人觀察到對抗2種LY6K來源的LP的此T細胞反應，可於以LY6K來源的CTL抗原決定位胜肽進行了主動接種的晚期頭頸癌病患中發現。此等結果啟示由於接種而活化的CTL誘導的腫瘤溶解會加速由抗原呈現細胞攝取及處理LY6K蛋白質以將LY6K來源的LP對CD4+ T細胞呈現，且於體內發生LY6K專一性CTL-反應與Th-反應之相乘效果。
結論為本案發明人首先鑑別出2種衍生自LY6K之胜肽，其係由受混雜的HLA第II類限制之CD4+ Th細胞辨識，且其中之一包括CTL抗原決定基，啟示其不僅為增殖LY6K專一性Th1細胞的良好工具，而且可由交叉呈現增殖LY6K專一性CTL之良好工具。這些發現有助於未來對於各種類型的癌症進行LY6K胜肽為主的免疫療法的臨床試驗。
[產業利用性]
本發明敘述能誘導有效抗腫瘤免疫反應的從LY6K而來的Th1細胞抗原決定位胜肽，故對於廣範圍的癌症類型有用。此種胜肽擔保作為對於癌之胜肽疫苗的進一步發展，尤其對抗表現LY6K之癌症。本發明之胜肽可誘導Th1細胞反應，且因而由Th1細胞分泌的細胞激素可幫助或活化以抗原獨立方式擔任細胞免疫的免疫細胞。因此本發明提供的免疫治療策略可適用於包括癌的任意疾病，只要此疾病可藉由由MHC第II類分子媒介之免疫反應而改善。具體而言，本發明之Th1細胞能改善由CTL引起的免疫反應。因此本發明之胜肽對於增強對象中包括癌之疾病的CTL反應有助益。
又，於較佳具體例，本發明之胜肽也誘導對抗表現LY6K之細胞的CTL及Th1細胞。本發明之如此的胜肽，對於治療相關於LY6K之疾病，例如癌症，具體而言，膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰臟癌、軟組織腫瘤及頭頸惡性腫瘤亦為有效。
雖已對於本發明參照特定具體例詳盡敘述，但應了解上述敘述的本質係示範性及解說性，係用來供理解本發明及其較佳具體例。該技術領域中具有通常知識者可輕易理解經由例行實驗可在不偏離本發明精神及範圍之下進行各種改變及潤飾，本發明的邊界和界限由附帶的申請專利範圍界定。
<110> 腫瘤療法．科學股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE,INC.)
<120> 對於TH1細胞之LY6K抗原決定位胜肽及含此之疫苗
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Claims (18)

  1. 一種單離的胜肽，其由長度小於26個的胺基酸所組成且包含選自由以下構成之群組的胺基酸序列：(a)序列識別號：2之胺基酸序列；及(b)一胺基酸序列，其中於(a)之胺基酸序列中有一個或二個胺基酸係經附加，該胜肽有誘導T輔助1型(Th1)細胞的能力。
  2. 如申請專利範圍第1項之單離的胜肽，其中，該胜肽或其片段有結合於至少兩種MHC第II類分子的能力。
  3. 如申請專利範圍第2項之單離的胜肽，其中，該MHC第II類分子選自於由HLA-DR15及一種HLA-DQ構成之群組。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之單離的胜肽，其中，該胜肽包含具有LY6K專一性細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力之胜肽的胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第4項之單離的胜肽，其中，該胜肽包含序列識別號：6之胺基酸序列。
  6. 一種單離的聚核苷酸，其編碼為如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽。
  7. 一種組合物，包含一或多種如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽，或一或多種編碼該胜肽的聚核苷酸。
  8. 一種用於癌症治療之醫藥組合物，其中該組合物包含選自於由以下構成之群組中之至少一種有效成分：(a)一或多種如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽；(b)一或多種如申請專利範圍第6項之聚核苷酸； (c)一或多種APC，其在表面上呈現如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
  9. 如申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該組合物被配製為供對於具有選自於由HLA-DR15及一種HLA-DQ構成之群組中至少一種作為MHC第II類分子之對象投予。
  10. 如申請專利範圍第8或9項之醫藥組合物，其中該組合物更包含有CTL誘導能力之一或多種胜肽。
  11. 一種in vitro誘導APC之方法，該APC有能力誘導Th1細胞或CTL，該方法包含使APC與如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽接觸的步驟。
  12. 一種in vitro誘導Th1細胞之方法，包含選自於由以下構成之群組中之步驟：(a)共同培養CD4陽性T細胞，及在表面呈現MHC第II類分子與如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽或其片段之複合體的APC；及(b)將編碼為兩種T細胞受體(TCR)次單元之聚核苷酸、或編碼為各TCR次單元之聚核苷酸導入CD4陽性T細胞內，該TCR能結合於在細胞表面上呈現的MHC第II類分子與如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽或其片段之複合體。
  13. 一種in vitro誘導CTL細胞之方法，該方法包含選自於由以 下構成之群組中之步驟：(a)共同培養CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞兩者，及已接觸如申請專利範圍第4及5項中任一項之胜肽的APC；及(b)共同培養CD8陽性T細胞，及已接觸如申請專利範圍第4及5項中任一項之胜肽的APC。
  14. 一種單離的APC，其在表面上呈現MHC第II類分子與如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽或其片段之複合體。
  15. 一種APC，係由如申請專利範圍第11項之方法所誘導。
  16. 一種單離的Th1細胞，其辨識在表面上呈現如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽或其片段之APC。
  17. 一種Th1細胞，係由如申請專利範圍第12項之方法所誘導。
  18. 一種選自於由以下構成之群組中至少一種有效成分用於製造誘導在對象中對抗癌之免疫反應的組合物的用途：(a)一或多種如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽；(b)一或多種如申請專利範圍第6項之聚核苷酸；(c)一或多種APC，其在表面上呈現如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽或其片段；(d)一或多種Th1細胞，其辨識在表面上呈現如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽或其片段之APC；及(e)以上(a)至(d)中任意兩或更多種的組合。
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