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TWI607752B - 含4-乙醯基-安卓奎諾-b之組合物用於製備抑制卵巢癌細胞生長之藥物的用 途 - Google Patents

含4-乙醯基-安卓奎諾-b之組合物用於製備抑制卵巢癌細胞生長之藥物的用 途 Download PDF

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TWI607752B
TWI607752B TW105126636A TW105126636A TWI607752B TW I607752 B TWI607752 B TW I607752B TW 105126636 A TW105126636 A TW 105126636A TW 105126636 A TW105126636 A TW 105126636A TW I607752 B TWI607752 B TW I607752B
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Description

含4-乙醯基-安卓奎諾-B之組合物用於製備抑制卵巢癌細胞生長之藥物的用 途
本發明關於一種組合物用於製備抑制卵巢癌細胞生長之藥物的用途，其中該組合物主要包含式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)。
癌症一般可以視為惡性腫瘤，是一種疾病。其特徵為惡性組織的不正常團塊，起因於過度地細胞分裂。癌症細胞不具有正常細胞生長之限制，會侵入與佔領正常留給其他細胞的範圍。癌症治療的種類包括化學治療、手術、放射線以及這些治療的結合。化學治療通常包括使用一個或多個抑制癌細胞生長的化合物。
卵巢癌是女性婦科癌症中第二大死因，卵巢癌的可用治療包含減積手術(debulking surgery)或再加上化學治療，依照病程的階段而不同，然而這些可用的治療選項對末期的病人仍然沒有治療成效，超過70%的卵巢癌患者在化學治療後會復發且預後不佳，同時五年的存活率低於20%，因此發展對有阻抗性的卵巢癌細胞的有效治療策略是相當重要的。
本發明是基於發現式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)或其醫藥上可接受鹽，其可用於抑制癌細胞生長，甚至治療或預防癌症，特別是卵巢癌。特定言之，本發明係提供一種用於抑制卵巢癌細胞生長，甚至治療或預防卵巢癌之醫藥組合物，包括有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體。
本發明係提供一種用於抑制癌細胞生長之醫藥組合物為主，經實驗證實式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對四種卵巢癌症細胞株分別具有特殊意義。ES-2細胞株是源自於對包含順鉑治療在內等化療藥物有高抵抗性且預後較差的亮細胞癌細胞株，SKOV-3和OV-2008則是細胞株，而OV-2008是一種對含鉑化療藥物反應明顯的細胞株。本發明顯示使用的所有種類卵巢癌細胞株都對式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B有反應。有趣的是ES-2這株對順鉑抗性最高的細胞株對式I化合物-4-以醯基-安卓奎諾-B反應也最明顯，這指出式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B可能與腫瘤增生及對藥物的抵抗性有某種程度的關聯性。更重要的是，本發明之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對細胞自噬的抑制效果非常顯著，可減少細胞自噬蛋白質Atg-7的表現量進而使得下游的Atg-5表現量也受到抑制。Atg-5在細胞自噬體延長階段扮演重要的角色，所以Atg-5表現量降低也讓成熟的細胞自噬體數量變少。本發明的結果說明式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B能藉由抑制細胞自噬體的成熟而達到抑制細胞自噬的作用。此外，因為降低了細胞自噬的表現也同時降低了細胞存活力，所以在式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B處理後也降低了細胞群落的生成效率。本發明進一 步以組合指數(combinational index，CI)探討式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及順鉑的藥物協同效應。CI是一個測定兩種以上之藥物之協同(CI<1)、加成(CI=1)以及拮抗(CI>1)效應的數值。結果顯示，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B和順鉑的合併使用呈現更佳的抗癌效應。綜合上述，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B應為潛力標靶卵巢癌細胞特性之化學治療物質。
克服卵巢癌化學治療抵抗性的關鍵是鎖定那些對化學治療有抵抗性的細胞，這些細胞的特性為衰老快速、有高代謝需求及細胞自噬高度活化(autophagic-flux)，因此透過調控細胞自噬(autophagy)的路徑或許有助於卵巢癌的治療，在研究中我們現式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B這個新興的化合物可以透過調控細胞自噬相關的基因(Atg-5)，而對卵巢癌中有化學治療抵抗性的細胞發揮抗腫瘤作用，且可以單藥治療或與順鉑協同治療。
此外，本發明利用惡性卵巢癌細胞株ES-2誘導NOD-SCID小鼠產生腫瘤，建立惡性卵巢癌動物模式，評估口服及腹腔式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對於卵巢癌治療之功效。在卵巢癌動物模式中，以皮下注射方式植入惡性卵巢癌ES-2，模擬臨床上惡性卵巢癌的症狀，並同時開始每天餵食不同濃度式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B，持續六週，並分別在一到六週犧牲動物。每週游標量尺量測腫瘤大小，以腫瘤大小變化之倍率表示。單獨投予式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B、cisplatin(CIS)及共同投予式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及cisplatin(CIS)的小鼠之腫瘤皆小於對照組小鼠。其中以同時投予高劑量式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾 -B及cisplatin(CIS)抑制腫瘤生長的效果最佳。兩實驗組之腫瘤體積僅增長約3倍大，而對照組之腫瘤則可增長到約9倍的體積。至於在安全性上，每週監測各組小鼠之體重變化。單獨投予cisplatin之小鼠體重呈現持續下降，由原本接近26克下降到約21克，但當同時投予式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及cisplatin，小鼠體重與對照組間並無顯著差異。對照其腫瘤生長狀況，同時投予式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及cisplatin皆可有效的抑制惡性卵巢癌細胞株-ES-2細胞的生長，但投予cisplatin時，輔以式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B卻可防止小鼠體重過度下降，降低cisplatin對個體造成的傷害。最後，不論是口服或腹腔注射之卵巢癌動物模式，餵食式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B的實驗組之腫瘤嚴重程度都較控制組來的低，顯示式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B不但可抑制腫瘤生長，更有與化療藥物Cisplatin及FOLFOX(亞葉酸+5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑)對卵巢癌的加乘抑制能力。因此，在大腸癌及卵巢癌治療過程中，I化合物-4-以醯基-安卓奎諾-B具有相當潛力可以應用為一輔助治療劑。
另外，本發明以Atg-5為標記的卵巢癌病患(n=60)的組織陣列切片(Tissue Array)之免疫組織染色來研究Atg-5和卵巢癌病程發展的關連性。結果顯示式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對部分類型的卵巢癌有顯著的細胞毒性，有趣的是那些對順鉑有較高抵抗性的細胞對式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B反應更明顯，這是因為這些細胞有較高的代謝需求，細胞自噬也大量進行，本發明之組織免疫染色結果也與之相應。Atg-5以往被認為會促進卵巢癌(OR：5.133；p=0.027)，而式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B則能夠成功抑制Atg-7及Atg-5的表現，進而減少細胞自噬 的發生，這效果和一個正在進行臨床試驗的細胞自噬抑制劑hydroxychloroquin類似，然後式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B除了具有單藥治療的潛力之外，還能與順鉑協同治療。
式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B可擁有一或多個對掌中心，因此具有各種立體異構物形式。本發明中提及之式I化合物包括所有此等異構物。式I化合物具有選擇性抑制癌症細胞生長的功效。由於其分子量極小，因此，可使用較低劑量的式I化合物及其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體，即可得到渴望的治療效果。本發明為一抑制癌細胞生長，甚至治療或預防癌症的藥物，係將一有效量之式I化合物及其醫藥上可接受鹽，用於抑制癌細胞、或投予所需之病患(此病患具有癌症、癌症的症狀或傾向於癌症的體質)以治癒、恢復、減輕、緩和、改變、治療、改善、改進或影響疾病、疾病的症狀或傾向於疾病的體質為目的。此處使用的「有效量(an effective amount)」指有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及其醫藥上可接受鹽，具有抑制或治療功效的量。有效量的改變是根據給藥的途徑、輔藥使用(excipient usage)以及與其他共同使用(co-usage)的活性藥劑。
本發明提供一種組合物用於製備抑制卵巢癌細胞生長之醫藥組合物之用途，其中該組合物包含有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B) 或其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體。
本發明之組合物另可包含一抗癌藥物，該抗癌藥物包含5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)或5-氟尿嘧啶與奧沙利鉑之組合。
本發明亦提供一種組合物用於製備抑制卵巢癌細胞生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B)或其醫藥上可接受鹽、一抗癌藥物及一醫藥上可接受載體，其中該抗癌藥物包含5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)或5-氟尿嘧啶與奧沙利鉑之組合。本發明之組合物可防止個體因服用抗癌藥物造成之體重降低。
在一實施例中，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.01μM至1000μM。5-氟尿嘧啶的濃度為每毫升5毫克至每毫升300毫克；奧沙利鉑的濃度為每毫升0.5毫克至每毫升50毫克。
在另一實施例中，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.5μM至50μM。
式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B可擁有一或多個對掌中心，因此具有各種立體異構物形式。本發明中提及之式I化合物包括所有此 等異構物。式I化合物具有選擇性抑制癌症細胞生長的功效。由於其分子量極小，因此，可使用較低劑量的式I化合物及其醫藥上可接受鹽，與醫藥上可接受載體，即可得到所欲的治療效果。本發明為一抑制卵巢癌細胞生長，甚至治療或預防該癌症的醫藥組合物，係將一有效量之式I化合物及其醫藥上可接受鹽，用於抑制癌細胞、或投予所需之病患(此病患具有癌症、癌症的症狀或傾向於癌症的體質)以治癒、恢復、減輕、緩和、改變、治療、改善、改進或影響疾病、疾病的症狀或傾向於疾病的體質為目的。此處使用的「有效量(an effective amount)」指有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及其醫藥上可接受鹽，具有抑制或治療功效的量。有效量的改變是根據給藥的途徑、輔藥使用(excipient usage)以及與其他共同使用(co-usage)的活性藥劑。
此處之「癌症」意指細胞腫瘤。癌症細胞具有自主生長(autonomous growth)的能力，即在不正常的狀態或條件下迅速增殖細胞生長。此處所指之癌症係包含所有種類之細胞不當增生(cancerous growth)或致癌過程(oncogenic processes)、轉移性的組織或惡性轉換之細胞、組織或器官(與組織病理學型態無關)或侵入階段。癌症的例子包括，但不限定於：癌症(carcinoma)與惡性肉瘤(sarcoma)，例如乳癌(breast cancer)、血癌(leukemia)、惡性肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤(lymphomas)、惡性骨肉瘤(osteosarcoma)、神經膠質瘤(glioma)、嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma)、肝惡性腫瘤(hepatoma)、黑色素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、皮膚癌(skin cancer)、大腸癌(colorectal cancer)、胃癌(gastric cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、腎臟癌(renal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、睪丸癌(testicular cancer)、頭部與頸部的癌症(Head and neck cancer)、腦癌(brain cancer)、食道癌(esophageal cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、腎上腺皮質癌(adrenal cortical cancer)、肺癌(lung cancer)、支氣管癌(bronchus cancer)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、子宮頸癌(cervical cancer)、肝癌(cervical or liver cancer)或未知起始位置的癌症。
式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B是以有機溶劑萃取牛樟芝菌絲體(一真菌類)，並經矽膠管柱分離純化製備而得；或另以化學合成方法製備而得。例如：由「牛樟芝菌絲體萃取」指自較適成長程度之牛樟芝菌絲體所萃取出的牛樟芝菌絲體萃取物。為取得該牛樟芝菌絲體萃取物，可使用本技術領域中眾所周知的萃取技術，例如可將經乾燥與研磨之該牛樟芝菌絲體懸浮在一溶劑或者兩種或多種溶劑之混合液於一足夠長的時間；適合的溶劑的例子包括，但不限定為：水、甲醇、乙醇、二氯甲烷(methylene chloride)、三氯甲烷(chloroform)、丙酮(acetone)、醚類(ether)(例如乙醚(diethyl ether))與乙酸乙酯酯類(ethyl acetate)與己烷(hexane)。之後移除固體殘餘物(例如藉由過濾)得到該牛樟芝菌絲體萃取物溶液，其可經矽膠管柱純化製備得式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B。基本上，全世界近二十餘年在牛樟芝所含天然化合物的研究，除多醣體等大分子外，總共發表了七十八個小分子化合物，其中包括三十一個三萜類化合物且大都有相關藥理活性研究報告，尤其著重在該等之抗癌活性，惟三萜類化合物各別分子仍須在較高使用量，才能達到癌症臨床化學治療藥物的效果【Geethangili M and Tzeng YM,Review of pharmacological effects of Antrodia camphorata and its bioactive compounds，Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，Aug.17,2009；doi：10.1093/ecam/nep 108】。同時，本發明發現式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對不同卵巢癌症細胞株(ES-2細胞株是源自於對包含順鉑治療在內等化療藥物有高抵抗性且預後較差的卵巢癌細胞株，SKOV-3和OV-2008則是漿液性囊腺卵巢癌細胞株)具高度抑制性。在此必須再強調的是：式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B乃是牛樟芝所含各種天然化合物中，經實驗證實抑制卵巢癌症細胞株效果較優之少數牛樟芝所含天然化合物之一。
在使用本發明之組合物治療時，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類可同時給藥或分開給藥，以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。此處所使用之「非口服」係指皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈內(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔內(intrathecal)、疾病部位內(intraleaional)與頭顱內(intracranial)注射以及灌注技術。
本發明所使用式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及/或其醫藥上可接受鹽類可與至少一種固體、液體或半液體狀之賦形劑或輔助劑一同形成適當的藥劑形式。其形式包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。藥錠一般所使用的載體(carrier)包括乳糖與玉米澱粉。一般也將潤滑劑(lubricating agent)，例如硬脂酸鎂(magnesium stearate)加至藥錠中。 用於膠囊形式的稀釋劑(diluents)包括乳糖與經乾燥的玉米澱粉。當口服給藥為水性懸浮液或乳劑時，可懸浮或溶解有效成分(active ingredient)於與乳化或懸浮劑結合的油相(oily phase)。如果需要，可加入特定甜味、調味與著色劑。
本發明所使用式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類亦可配製成無菌注射成分(例如，水或油的懸浮液)，例如利用本技術領域中已知的技術使用適合的分散或增溼劑(例如Tween 80)與懸浮劑。無菌注射調劑也可以將無菌注射溶液或懸浮液加入無毒性非口服之稀釋劑或溶劑，例如1,3丁二醇(1,3-Butanediol)中。可使用的載具(vehicles)與溶劑包括甘露醣醇(mannitol)、水、林格氏液(Ringer’s solution)與等滲透壓氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油常作為溶劑或懸浮媒介(例如合成的單-或雙-甘油酯(glycerides))。脂肪酸，例如油酸(oleic acid)與其甘油酯衍生物亦可用在注射劑的調製，其為天然藥學上可接受的油，例如橄欄油、蓖麻油(castor oil)，特別是於其聚氧乙基化的(polyoxyethylated)變化形式。這些油溶液或懸浮液也可包含一長鏈醇類稀釋劑或分散劑，或者羧基甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)或類似的分散劑。
本發明所使用式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B或其醫藥上可接受鹽類亦可根據此技術領域中所熟知的技術來配製成吸入成分。例如可製成鹽類溶液，利用苯甲醇(benzyl alcohol)或其他適合的防腐劑、增強生物可利用性(bioavailability)的吸附促進劑、碳氟化合物(fluorocarbon)或其他本技術領域中熟知的助溶或分散劑來配製。
用於醫藥組合物的載體必須是「可接受的」，其與配方的有 效成分相容(以及較佳為具有穩定有效成分之能力)以及不對病患有害。例如，助溶劑(例如環狀糊精(cyclodextrins))(其與一個或多個萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的複合物)，為了有效成分的傳送而作為藥理學上的輔藥。其他載體的例子包括膠狀二氧化矽(colloidal silicon dioxide)、硬脂酸鎂、纖維素與烷基硫酸鹽(sodium lauryl sulfate)。
另外，由於抗癌劑如以高劑量投予病患易產生毒性。是以，本發明之醫藥組合物為含有安全有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B，用於抑制癌細胞生長，其中該安全有效量為0.01μM至1000μM，較佳為0.5μM至50μM。施予個別病人的特定劑量是依所有可能存在因素而定，例如：所使用之特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、進食狀況、施用時間與路徑、排泄率、醫藥物質之組合、以及所欲治療之疾病的嚴重程度等。
圖一、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對卵巢癌細胞株的細胞存活率及蛋白表現量影響；1A為式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B結構圖；1B為SRB分析評估式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對不同卵巢癌細胞株(包括：卵巢癌細胞株-ES-2及OV-2008)之細胞毒性；1C為Atg5、Atg7和LC3BII在ES-2及OV-2008細胞株的表現量；1D為Atg5、Atg7和LC3BII在ES-2及OV-2008細胞株的螢光染色圖。
圖二、不同濃度的式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對細胞自噬的影響；2A為式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及抗癌藥物對於LC3BII在細胞株內的表現量免疫組織染色圖；2B為式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾 -B及抗癌藥物對於LC3BII在細胞株內的表現量西方墨點圖；2C為不同濃度式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對Atg-7及Atg-5的影響的西方墨點圖；2D為不同濃度式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B處理後的細胞群落生成圖。
圖三、不同處理時間的式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B在ES2及OV-2008細胞株中對AKT/mTOR/GSK-3 β/p70S6K信號分子的影響結果圖。
圖四、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及順鉑的藥物協同效應；4A為不同濃度的式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及Cisplatin對細胞毒性的影響；4B為式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及Cisplatin的combinational index(CI)。
圖五、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及抗癌藥物在腹腔暨口服卵巢癌動物模型的之抗癌功效及安全性評估；5A為口服試驗對腫瘤生長的影響；5B為腹腔試驗對腫瘤生長的影響及照片；5C為腹腔試驗對動物體重的影響(安全性)。
圖六、60位卵巢癌病人的不同臨床組織樣本圖。
以下實施例僅用於解釋本發明，但本發明的保護範圍並不僅限以下實施例。為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，作詳細說明如下：
實施例一、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之製備
牛樟芝菌絲體3公斤以95%乙醇10公升加熱回流萃取四 次，萃取液經過濾後濃縮，減壓乾燥得乙醇萃取物384公克，將乙醇萃取物懸浮於水以等量乙酸乙酯進行分配(partition)劃分，乙酸乙酯層經減壓濃縮可得乙酸乙酯層劃分部157.57公克及水層劃分部159.51公克。
上述乙酸乙酯層劃分部157.57公克以矽膠管柱(10cm i.d x 30cm)進行層析，依次以正己烷→正己烷-乙酸乙酯(10：1→10：2→10：3→10：4→10：5→1：1→1：2，v/v)→乙酸乙酯→甲醇每種比例各10L進行沖提，每1L收集成一劃分部。其中正己烷-乙酸乙酯(10：4)沖提之劃分部56-63(3.015g)，以逆相製備級管柱Tosoh ODS-80Ts(21.5mm x 300mm,10μm)進行層析，以H2O-CH3CN(20：80)為移動相，流速10ml/min進行層析，以265nm為檢測波長，管柱控溫40℃，可獲得4-乙醯基-安卓奎諾-B(131mg)。
實施例二、生物活性分析方法
1、冷凍細胞之活化
冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。細胞活化後，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其他蛋白質)。冷凍的細胞快速解凍的方法為：將冷凍管由液氮或乾冰容器中取出，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在3分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管的外部，移入無菌操作台內。取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1：10~1：15)，混合均勻，放入CO2培養箱培養。在解凍培養後隔日更換培養基。
2.人類癌症細胞之培養
細胞株培養 本研究所使用的卵巢癌細胞株包含：ES-2、OV-2008及SKOV-3，來源為American Type Culture Collection(ATCC)。ES-2是對鉑化學治療有高抵抗性的亮細胞癌細胞株，相較於其他種類癌症類型，亮細胞癌在研究中被發現預後較差，SKOV-3和OV-2008則是相對於ES-2作為較良性的細胞株。細胞培養液使用McCoy5A培養液(GIbco，16600-082)加上1%抗生素(Gibco，15140)以及10%胎牛血清(FBS，Sigma，F7524)，細胞在標準培養箱中(Shel Lab，Sheldon Manufacturing，USA)以37℃和5% CO2培養。
3.細胞藥物處理：
所有實驗的細胞皆培養於含10%胎牛血清的培養液中，待細胞長到約八成滿時，將舊培養液抽乾並以PBS緩衝液(磷酸鹽緩衝液)溶液清洗細胞後，加入10毫升不含血清之培養液。依實驗目的不同加入不同的藥物，於37℃恆溫培養箱中進行反應。
4、細胞毒性實驗(cytotoxicity)：
將卵巢癌細胞株ES-2、OV-2008及SKOV-3放置於96孔培養盤(2000細胞/孔)，以及將其隔夜培養於100μl的完全DMEM中。將50μl包含式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(0.5-50μM)之完全DMEM等量樣品加入培養盤的不同孔中。另外，控制組則只加入100μl的完全DMEM。於培養2天之後，以磺酰羅丹明B(sulforhodamine B)(一蛋白質結合染劑)分析測定每孔中的細胞數目。簡單地說，固定細胞於10%三氯醋酸(trichloroacetic acid)中，與以0.4%磺酰羅丹明B將其染色。染色20分鐘後再以1%乙酸清洗，之後，將與細胞結合的磺酰羅丹明B溶解於 10mM的Tris base中。以微量滴定盤檢測器(microtiter plate reader)在562nm下測定吸光值(optical density)。
5、細胞群落分析(clonogenicity)
細胞群落分析在六孔盤的每一格中分別種600個細胞，培養液為McCoy5A加上10%胎牛血清。
6、西方墨點法(Western blot)
以標準程序進行西方墨點法。細胞先以PBS清洗兩次後加入細胞溶解液，接著以離心去除細胞碎片藉以收集蛋白質降解物，蛋白質濃縮物以BCA assay kit(Pierce，Thermo Scientific，USA)定量，每個樣本取等量的蛋白質降解物至10% SDS-PAGE電泳，再轉印至PVDF膜，之後加入抗細胞自噬關基因(Atg-7、Atg-5、及LC3BII)的一級抗體，並以抗β-actin的抗體作為對照組，目標蛋白質和一級抗體隔夜反應後加入連接HRP的二級抗體，最後以冷光照膠系統(UVP，LLC，USA)測定目標的訊號。
7、藥物組合指標(combinational index，CI)分析
以Chou-Talalay algorithm及Compusyn software(ComboSyn Incorporated，Paramus，NJ，USA)用以分析兩種藥物之組合效應以探討4-AAQB與順鉑的藥物組合功效。CI是一個測定兩種藥物之協同(CI<1)、加成(CI=1)以及拮抗(CI>1)效應的分析指標。
實施例三、生物活性測定之結果
1、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B可抑制不同卵巢癌細胞之生長。
首先以細胞存活率的試驗測試式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(圖1A)對兩種不同的卵巢癌進行細胞毒性。該兩種卵巢癌細胞株分別具有特殊的意義，ES-2細胞株是源自於對包含順鉑治療在內等化療藥物有高抵抗性且預後較差的卵巢癌細胞株，OV-2008則是漿液性囊腺癌細胞株。實驗結果顯示本發明中使用的所有種類卵巢癌細胞株都對I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B有反應，有趣的是ES-2這株對順鉑抗性最高的細胞株對I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B反應也最明顯(圖1B)，這指出I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B可能與腫瘤增生及對藥物的抵抗性有某種程度的關聯性。
2、對藥物的抵抗性與細胞自噬的發展呈現負相關性
細胞自噬基礎表現量的高低與對化學治療的抗性呈現正相關性，包含化學治療及放射治療等抗腫瘤治療皆被證實會引發細胞自噬並活化能提升細胞存活力的分子機轉。與OV-2008相比，我們發現ES-2這株對順鉑有高抵抗性的細胞株有較高的Atg5、Atg7和LC3BII表現量(圖1C)。進一步利用細胞螢光染色也發現Atg-5與LC3BII會共同大量表現於高度惡性ES-2卵巢癌細胞中。推測，LC3BII會經過磷脂化後位於細胞自噬體膜上的結構，故Atg-5與LC3BII表現量高也就代表細胞自噬表現旺盛(圖1D)。
3、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B藉由抑制細胞自噬體的延長以抑制細胞自噬的發展
即使ES-2這細胞株本身就有較高的細胞自噬表現量，在順鉑處理後細胞自噬現象卻更加顯著，推測是因為順鉑處理引發了增強存活 力的細胞自噬反應。結果顯示式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B顯著抑制細胞自噬。在式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B處理後以免疫組織染色及西方墨點法檢測LC3BII，顯示式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B確實能抑制細胞自噬體的LC3BII表現(圖2A)。細胞自噬能保護癌細胞避免因化學治療而引發的細胞凋亡，羥氯喹是一種廣為使用的抗寄生蟲藥物，近期的第二期臨床研究也證實羥氯喹能成功的抑制細胞自噬。羥氯喹會提高溶小體內的pH值讓溶小體難以跟成熟的細胞自噬體融合，引此對細胞自噬的抑制效果也能解決癌細胞因化學治療產生細胞自噬阻抗性的問題。在本實施例中ES-2細胞株以5μM的順鉑預處理，再分別輔以式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B治療，結果顯示式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B處理細胞後對細胞自噬體成熟之抑制能力更勝過於羥氯喹(圖2B)，相同濃度下的式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B處理的細胞存活率也顯著比羥氯喹處理低。綜合以上結果，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B藉由抑制細胞自噬體延長階段降低細胞自噬的能力足以和已廣泛使用的細胞自噬抑制劑相提並論。更重要的是，從西方墨點的結果發現式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B的機轉和羥氯喹有所不同。羥氯喹主要是藉由提高溶小體內的pH值，進而減少細胞自噬體和溶小體的融合而達到抑制細胞自噬的效果，而式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B則是減少Atg-7的表現量進而使得下游的Atg-5表現量也受到抑制(圖2C)。Atg-5在細胞自噬體延長階段扮演重要的角色，所以Atg-5表現量降低也讓成熟的細胞自噬體數量變少。結果說明式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B能藉由抑制細胞自噬體的成熟而達到抑制細胞自噬的作用。此外，因為降低了細胞自噬的表現也同時降低了細胞存活力， 所以在式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B處理後也降低了細胞群落的生成效率(圖2D)。
4、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B藉由阻斷AKT/mTOR/p70S6K信號通路分子表達對ES2细胞增殖和自噬抑制
觀察式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B卵巢癌細胞株ES2細胞增殖和自噬的影響，並利用西方墨點法檢測自噬相關蛋白LC3BII表達的變化和AKT/mTOR/p70S6K信號通路分子表達的變化。實驗結果顯示20uM的I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B可明顯抑制ES2細胞的生長，並且具有時間依賴性效應(P<0.05)。用不同時間(0、3、6及12小時)的式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B作用ES2細胞後可以顯著降低降低AKT/mTOR/p70S6K信號通路關鍵分子的表現量(圖3)。
5、式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B和順鉑的合併使用呈現更加的抗癌效應
本實施例進一步以combinational index(CI)探討式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及順鉑的藥物協同效應(圖4A)。結果顯示，不同濃度之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(5、10、及20μM)與順鉑(5μM)具有協同效應(圖4B)。由此可知式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B通過下調AKT/mTOR/p70S6K信號通路抑制ES-2細胞增殖，並且誘導ES-2發生自噬，聯合使用式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B和順鉑可能會更有效發揮式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B抗腫瘤增殖的作用(圖4B)。
6、探討式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B在腹腔暨口服卵巢癌動物模型的之抗癌功效
本研究利用惡性卵巢癌細胞株ES-2誘導NOD-SCID小鼠產生腫瘤，建立惡性卵巢癌動物模式，評估式口服及腹腔I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B對於卵巢癌治療之功效。在卵巢癌動物模式中，以皮下注射方式植入惡性卵巢癌ES-2，模擬臨床上惡性卵巢癌的症狀，並同時開始每天餵食不同濃度I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B，持續六週，並分別在一到六週犧牲動物。研究結果顯示，口服或腹腔注射卵巢癌動物模式(圖5A與5B)，餵食式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B的實驗組其腫瘤嚴重程度都較控制組來的低。此外，腹腔注射不同劑量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(5mg/kg及10mg/kg)，於腫瘤大小約70-250立方公厘時，每週靜脈注射cisplatin(CIS)1劑，劑量為3mg/kg，共投與三劑，結果顯示式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B單獨投予對腫瘤的生長具有抑制作用，不但具有劑量依存性地抑制腫瘤生長(圖5B)，式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾更有加乘化療藥物Cisplatin及FOFOX對卵巢癌的抑制能力。與CIS合併亦有增強式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾的抗癌效果。重要的是，在式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾的安全性上，每週監測各組小鼠之體重變化。單獨投予cisplatin之小鼠體重呈現持續下降，由原本接近26克下降到約21克，但當同時投予式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及cisplatin，其小鼠體重與對照組間並無顯著差異。對照其腫瘤生長狀況，同時投予式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B及cisplatin皆可有效的抑制惡性卵巢癌細胞株-ES-2細胞的生長，但投予cisplatin時，輔以式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B卻可防止小鼠體重過度下降，降低cisplatin對個體造成的傷害(圖5C)，代表在活體內之安全性極高。因此，在卵巢癌治療過程中，式I化合物-4-乙 醯基-安卓奎諾-B具有相當潛力可以應用為一輔助治療劑。
7、Atg-5與卵巢癌預後相關
本實施例以60位卵巢癌病人的組織樣本研究Atg-5表現量和臨床指標的關係。不同臨床分類的卵巢癌免疫組織染色(IHC)結果整合在圖6，將IHC染色結果依前面實驗方法敘述分類為：無染色(n=9)、弱或焦點染色(n=30)、中等或強染色(n=21)三組。結果顯示Atg-5在惡性腫瘤細胞中表現較高，且表現量和病程進展有正相關性。末期病人組織的Atg-5染色濃度亦比早期病人組織高，另外，Atg-5染色結果呈中等或強染色組別的病人存活率顯著低於無染色及弱或是焦點染色的病人(OR：5.133；p=0.027)，因此Atg-5或許也能成為卵巢癌預後指標的病理標的。
實施例四、動物試驗方法
實驗動物
免疫缺陷小鼠由樂斯科生物科技股份公司購得(約4-6週大之NOD/SCID小鼠)，經馴養一週後，開始進行試驗。
細胞培養
選用的腫瘤細胞為ES2惡性卵巢癌細胞(ES-2細胞株是源自於對包含順鉑治療在內等化療藥物有高抵抗性且預後較差的卵巢癌細胞株)，為一貼附型之細胞株，且具很強的轉移能力。以培養液DMEM內含10%胎牛血清(FBS)，1%非必需氨基酸(NEAA)和1%抗生素(antibiotics)培養於37℃、5%二氧化碳之培養箱中，約3~4天繼代一次。
將細胞以0.05%胰蛋白酶(trypsin)-EDTA作用3~5分鐘，使呈懸浮狀態，加入含血清之培養基中和胰蛋白酶(trypsin)之作用，1000 rpm、20℃、離心5分鐘。去除上清液，輕輕打散細胞沈澱，將細胞回溶於適當體積之培養液，混合均勻後，取少許細胞液，以血球計數器進行細胞計數。將細胞稀釋成每毫升含107個細胞之濃度，取約0.15毫升分裝於1.5毫升小離心管中。
藥物配製
以DMSO為溶劑，將式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B配置成每毫升250毫克之溶液，待完全溶解後，進行分裝，為stock，保存於4℃，取stock加入無菌之生理實驗水做500倍稀釋，混合均勻，即可進行腹腔注射。目前臨床標準化學療法用藥順柏則為針劑，其濃度分別為每毫升50毫克及每毫升5毫克，兩藥物皆取原液進行靜脈注射。
腫瘤細胞注射
注射腫瘤細胞的前一天，將小鼠以10倍稀釋的舒泰50(zoletil 50)及若朋(rompun)2%經1：1混合後，每隻小鼠腹腔注射0.25毫升進行麻醉，待其完全睡著後，進行放射線照射，以抑制其免疫力，照射劑量為0.75Gy。
小鼠以2.5%之異氟烷(isoflurane)進行麻醉，並將欲注射部位之毛髮剔除，注射前用75%酒精及優碘消毒注射部位，選用29G胰島素針進行ES2腫瘤細胞注射，注射時，先用鑷子將小鼠表皮拉起，再將ES2腫瘤細胞注射到皮下之處，注射細胞數為106個，體積為0.1毫升，注射完畢後，確認細胞液無漏出，即可將小鼠移回籠中，待其甦醒，注意其保溫。持續觀察腫瘤生長狀況。
口服大腸癌及腹腔暨口服卵巢癌動物模型的建立
取對數生長期的ES-2卵巢癌混合於血清懸浮液0.1ml(2x106個細胞數)接種於NOD-SCID免疫缺陷鼠後腿下形成腫瘤皮丘，48小時之後隨機分成控制組、Cisplatin正對照組(3mg/kg body weight)、高劑量(10mg/kg body weight)及低劑量(3mg/kg body weigh)。ES2卵巢癌口服暨腹腔注射動物實驗部分，每組6隻老鼠，每天以式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B懸腹腔注射，對照組以等量生理食鹽水灌食，共持續6週。6週後犧牲老鼠，並測量老鼠最長徑為a、最短徑為b；腫瘤大小=(a*b2)/2，並計算腫瘤生長曲線。
實施例五、動物試驗測定之結果
腫瘤大小測定
每週測量一次腫瘤大小，利用游標量尺測量腫瘤之最長徑和最短徑，為確保量測之準確度，實驗期間由同一人進行腫瘤大小的量測。腫瘤體積計算公式：最長徑為a、最短徑為b；腫瘤大小=(a×b2)/2，最後，將小鼠犧牲，取其腫瘤組織，拍照存檔，再以福馬林固定。腫瘤大小的變化以倍數計算製成圖表顯示。腫瘤大小改變倍數(fold change in tumor volume)=腫瘤大小(N)/腫瘤大小(N-1)。N為周數。

Claims (6)

  1. 一種組合物用於製備抑制卵巢癌生長之藥物的用途，其中該組合物包含一有效量之式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B(4-acetyl-antroquinonol B) 或其醫藥上可接受鹽、一抗癌藥物及一醫藥上可接受載體，其中該抗癌藥物為順鉑(cisplatin)。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物可治療或預防癌症。
  3. 根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B是以有機溶劑萃取牛樟芝菌絲體，並經矽膠管柱純化製備而得。
  4. 根據申請專利範圍第1項所述之用途，其中該式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.01μM至1000μM。
  5. 根據申請專利範圍第6項所述之用途，其中該式I化合物-4-乙醯基-安卓奎諾-B之有效量為0.5μM至50μM。
  6. 根據申請專利範圍第2項所述之用途，其中該組合物可防止個體因服用抗癌藥物造成之體重降低。
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