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TWI606834B - 缺氧培養之間葉幹細胞用於修復血管內皮細胞的應用 - Google Patents

缺氧培養之間葉幹細胞用於修復血管內皮細胞的應用 Download PDF

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TWI606834B
TWI606834B TW104134423A TW104134423A TWI606834B TW I606834 B TWI606834 B TW I606834B TW 104134423 A TW104134423 A TW 104134423A TW 104134423 A TW104134423 A TW 104134423A TW I606834 B TWI606834 B TW I606834B
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TW
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atherosclerosis
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Inventor
洪士杰
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國立陽明大學
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Description

缺氧培養之間葉幹細胞用於修復血管內皮細胞的應用
本發明係關於以包含缺氧培養之間葉幹細胞的組成物治療動脈粥狀硬化之方法。特別地，本發明係關於利用缺氧培養之間葉幹細胞分泌細胞因子，以恢復動脈粥狀硬化處的血管內皮功能。
動脈粥狀硬化，係一種血管疾病導致血管內壁改變及損傷，在嚴重的情況下會造成如冠狀動脈疾病、中風、主動脈瘤和周邊動脈疾病(Hansson,Inflammation,atherosclerosis,and coronary artery disease,The New England journal of medicine,2005,352：1685-1695)。儘管係由多種因素所造成其病因，但高膽固醇血症扮演著主要角色。一般低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)之修飾會被巨噬細胞清除接受體(macrophage scavenger receptors)所辨認並吸收，導致膽固醇酯囤積。LDL之修飾型，例如氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL,oxLDL)已被連結與動脈粥狀硬化有關(Witztum et al.,Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis,J Clin Invest,1991,88：1785-1792)。OxLDL通過施 加直接細胞毒性於內皮細胞(Morawietz et al.,Induction of the oxLDL receptor LOX-1 by endothelin-1 in human endothelial cells,Biochem Biophys Res Commun,2001,284：961-965)以及亦藉由增強促發炎因子之產生(Li et al.,Antisense to LOX-1 inhibits oxidized LDL-mediated upregulation of monocyte chemoattractant protein-1 and monocyte adhesion to human coronary artery endothelial cells,Circulation,2000,101：2889-2895)促使血管內皮功能障礙。再者，oxLDL抑制內皮性一氧化氮酶與一氧化氮產生，導致內皮細胞內以NO為媒介之反應中斷，其部分歸因於下游調控的細胞內eNOS經由泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UUP)(Vieira et al.,Oxidized LDLs alter the activity of the ubiquitin-proteasome pathway：potential role in oxidized LDL-induced apoptosis,FASEB journal：official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2000, 14：532-542)。
一氧化氮在包括血管張力、血小板聚集、平滑肌細胞增殖及白血球附著於內皮細胞等維持血管功能上扮演重要角色(Vallance et al.,The effect of endothelium-derived nitric oxide on ex vivo whole blood platelet aggregation in man,European journal of clinical pharmacology,1992,42：37-41)。於正常內皮細胞中一氧化氮合成酶之優勢同型異構物為內皮性一氧化氮酶。內皮依賴性血管擴張為內皮性一氧化氮酶依賴，因eNOS-/-小鼠展現全身性及肺動脈壓力升高以及對於乙醯膽鹼會產生內皮依賴性舒張(Félétou, Endothelium-dependent regulation of vascular tone,2011)。為了良好控制的正常一氧化氮產生，內皮性一氧化氮酶之活性係藉由轉譯後修飾高度調控。由Akt/蛋白質激酶B(PKB)在eNOS Serl177的磷酸化會活化eNOS(Fulton et al.,Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt,Nature,1999,399：597-601)，而藉由oxLDL造成Akt的干擾則會去活eNOS(Chavakis et al.,Oxidized LDL inhibits vascular endothelial growth factor-induced endothelial cell migration by an inhibitory effect on the Akt/endothelial nitric oxide synthase pathway,Circulation,2001,103：2102-2107)。另外，僅管此方面研究較少見，藉由UPP調節eNOS之有效性亦在維護血管功能上扮演一關鍵角色(Stangl et al.,The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial(dys)function,Cardiovascular research,2010,85：281-290)。
間葉幹細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，例如骨髓來源的間葉幹細胞，其能夠自我更新以及具有分化成為間葉與非間葉組織的潛力(Prockop,Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues,Science,1997,276：71-74)。當MSCs移植入肢體缺血小鼠後血管新生並改善肢體缺血情形(Huang et al.,Hypoxic mesenchymal stem cells engraft and ameliorate limb ischaemia in allogeneic recipients,Cardiovasc Res,2014,101：266-276)。MSCs治療效果近期已被指出其係受內分泌或旁分泌之機制影響(Gnecchi et al.,Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells,Nature medicine,2005,11：367-368；Kinnaird et al.,Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms,Circulation,2004,109：1543-1549)。細胞治療之成功案例在臨床上仍然少見。例如，MSCs之移植有益於心肌梗塞及肢體缺血之治療。
本發明係基於非預期發現，缺氧培養之間葉幹細胞有效修復損傷，特別係指動脈粥狀硬化。
於是，本發明提供一種用於治療動脈粥狀硬化之方法，其包括對所需者投予一治療有效量之含有缺氧培養之間葉幹細胞的組成物，該間葉幹細胞係於低於10%氧氣的低氧條件下培養自體或異源間葉幹細胞所獲得。
另一方面，本發明提供一種用於治療動脈粥狀硬化之方法，其包括對所需者投予一治療有效量具有缺氧培養間葉幹細胞。於某些實施例中，該缺氧培養間葉幹細胞係於低於10%氧氣的低氧條件下培養自體或異源間葉幹細胞所獲得。
以上所述以及本發明之以下詳細內容說明可配合同圖式說明一同閱讀以助理解。於圖式中：圖1A-1D顯示MSCs對於oxLDL引發HUVEC傷害之效果，如 圖1A所示(穿孔轉移分析)，該HUVEC種於下層孔中，以不含有(控制組)或含有oxLDL進行處理，而MSCs種於上層孔中，並於24小時後檢測。圖1A(上)，其為穿孔膜區域中的代表視野，展現被染色的MSCs轉移至穿孔之下層膜側；圖1A(下)，為在高倍視野下每個轉移的MSC細胞之定量。其數據值是在8處高倍視野下(40X)之遷移細胞數之平均值。每個實驗為三重複，*為與控制組相比p<0.05。圖1B為HUVECs分別以特定濃度的oxLDL處理24小時，接續以甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)之定量RT-PCR分析。該HUVECs(1.5x104cells)以含有或不含有50μg/mL oxLDL在缺乏或存在MSCs(5x103cells)下間接共同培養24小時，而後(圖1C)西方墨點法以及(圖1D)以革利士方法(Griess method)測定培養物上清液NO產生之分析(每組n=6)。*為與控制組相比p<0.05，#為與控制組或oxLDL組相比p<0.05。
圖2A-2E顯示移植小鼠MSCs對於高脂飲食餵食apoE-/-小鼠之影響。圖2A顯示MMECs(1.5x104cells)以不含有或含有50μg/mL oxLDL在缺乏或存在小鼠MSCs(5x103cells)下間接共同培養於24孔孔盤的各孔中24小時，接著將細胞收集後進行西方墨點法分析。圖2B-2D顯示高脂飲食餵食apoE-/-小鼠以不含有(PBS，控制組)或含有MSCs(2x105cells)治療1週後進行犧牲。圖2B顯示乙醯膽鹼(acetylcholine)依賴性舒張(左欄)、普鈉依(sodium nitroprusside)賴性舒張(中欄)以及苯福林(Phenylephrine)依賴性舒張(右欄)之濃度反應曲線(每組n=5-6)。MSC組與控制組於特定濃度相比*為 p<0.05，**為p<0.01，***為p<0.001。圖2C係利用油紅組織染色縱切主動脈進行斑塊形成分析。圖2D顯示代表動脈粥狀硬化之紅色(左欄)，以及代表主動脈根部班塊形成之顯微部分(右欄)。圖2E顯示主動脈總管腔面積的百分比定量數據值(每組n=3-4)，*為p<0.05。圖2E(左欄)顯示磷酸化-Akt以及磷酸化-eNOS蛋白質表現之免疫染色結果。代表主動脈根部之顯微部分顯示磷酸化-Akt以及磷酸化-eNOS於內皮細胞內層表現(右欄)。該定量數值為總內皮內層細胞免疫陽性細胞的百分比(每組n=3-4)。*為p<0.05。比例尺於圖2D為500μm以及於圖2E為50μm(圖2D為40X，圖2E為400X倍)。
圖3E-3F所示等量之MSCs(2×104cells)單獨或間接與HUVEC(6×104cells)共培養於不含有(HUVEC+MSC)或含有50μg/mL oxLDL條件下24小時，而後以定量RT-PCR分析。圖3A為熱度圖之代表圖，其所示為以RT2 Profiler PCR Array分析相關mRNA濃度。相較於MSC單獨培養或HUVEC+MSC組別，在oxLDL+HUVEC+MSC組中IL-8基因表現量增加。圖3B為以定量RT-PCR測定IL-8 mRNA濃度之結果。圖3C為以不含或含有50μg/mL oxLDL條件下於不存在或存在指定倍率之衍生自oxLDL處理的MSCs(CM)條件培養液培養的HUVEC之西方墨點法結果。圖3D(下欄)隨後以不含或含有50μg/mL oxLDL條件下於具有或不具有MSCs、IL-8、抗-IL-8抗體或PI3K抑制劑LY294002中24小時處理的HEVECs使用槓-泛素抗體進行免疫轉漬以及圖3D(上欄)為p-Akt與p-eNOS濃度。 圖3E為以不含或含有50μg/mL oxLDL條件下於具有或不具有MSCs、IL-8、抗-IL-8抗體中24小時處理的HEVECs使用抗-eNOS抗體免疫沉澱後，以抗-泛素進行免疫轉漬。圖3F為MSC或IL-8對於HUVEC內eNOS蛋白穩定性的影響。使用cycloheximide處理之HUVEC，其因暴露於oxLDL而造成的eNOS負調控在使用MSC處理後被改善。以MG132廢止eNOS濃度之負調控以及該現象相似於MSC組。IL-8：10ng/ml。IL-8抗體：1500ng/ml。LY294002：20μM。
圖4A-4D所示為在高脂飲食apoE基因剔除小鼠，MSC的調控作用係取決於MIP-2。圖4A為以小鼠MSCs有或沒有間接與MMECs共培養於不含有或含有50μg/mL oxLDL條件下24小時，而後以定量RT-PCR分析。圖4B-4D為以MIP-2抗體或控制組同型IgG抗體前處理之MSCs治療高脂飲食apoE基因剔除小鼠並於治療一周後犧牲。圖4B為MIP-2抗體與控制同型IgG於不同濃度時其乙醯膽鹼依賴性舒張(左欄)、硝普鈉依賴性舒張(中欄)與苯福林依賴性舒張(右欄)之濃度反應曲線圖，*為p<0.05，**為p<0.01，***為p<0.001。圖4C(左欄)為代表主動脈根部微剖面呈現斑塊形成，以及定量結果係為總內皮內襯細胞中免疫陽性細胞之百分比(右欄)(每組n=3-4)。圖4D(左欄)為磷酸化-Akt與磷酸化eNOS蛋白質表現之免疫染色。該代表主動脈根部微剖面呈現內皮內襯中的磷酸化-Akt與磷酸化eNOS蛋白質表現。圖4D(右欄)定量結果係為總內皮內襯細胞中免疫陽性細胞之百分比(每組n=3-4)，*為p<0.05，比例尺於圖4C為500μm以及於圖4D為50μm(圖4C為40X，圖4D為400X 倍)。
圖5A-5C係顯示MIP-2可恢復內皮依賴性舒張，其中所述之高脂飲食apoE基因剔除小鼠係以不含(PBS，vehicle控制組)或含有MIP-2(50μg/kg)治療一周後犧牲。圖5A為為MIP-2與控制組於不同濃度時其乙醯膽鹼依賴性舒張之濃度反應曲線圖(每組n=5-6)，*為p<0.05，**為p<0.01，***為p<0.001。圖5B(左欄)為代表主動脈根部微剖面呈現斑塊形成。圖5B(右欄)定量結果係為主動脈總內腔表面面積之百分比(每組n=3-4)。圖5C(左欄)為磷酸化-Akt與磷酸化eNOS蛋白質表現之免疫染色。圖5C(右欄)定量結果係為總內皮內襯細胞中免疫陽性細胞之百分比(每組n=3-4)，*為p<0.05，比例尺於圖5B為500μm以及於圖5C為50μm(圖5B為40X，圖5C為400X倍)。
圖6為移植鼠MSC之體內運輸實驗。高脂飲食apoE基因剔除小鼠係以不含(PBS，vehicle控制組)或含有CFSE標記之MSCs(2×105cells)治療一周後犧牲並且採集主動脈環以抗-CFSE抗體進行免疫組織化學研究。代表圖所示為具CFSE標記之MSCs(長箭頭)與該內皮內襯(箭頭)尚有段距離。比例尺為100μm。(200X倍)。
圖7A-7C為MSCs內IL-8之表現與分泌取決於oxLDL活化的p38MAPK。圖7A(西方墨點法分析)為oxLDL作用於活化的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)途徑之影響。以西方墨點法(圖7B，上欄)、定量RT-PCR(圖7B，下欄)以及ELISA(圖7C)檢測以暫時性轉染shRNA拮抗p38基因剔除p38後抑 制了IL-8之表現量與其分泌。
除非另有定義，本說明書所使用的所有技術以及科學術語與屬於本發明所屬領域之習知技藝者通常理解之含義相同。
如本文中所使用的，單數形式「一」、「一個」與「該」包含複數表示，除非上下文另有明確說明。因此，舉例而言，若提及「一樣品」，則係包含數個相似樣品以及該領域習知技藝已知之同等物。
於本發明，提供一種用於治療動脈粥狀硬化之方法，其包括對所需者投予一治療有效量具有缺氧培養間葉幹細胞之組成物。
於其中一實施例中，該間葉幹細胞係於低氧條件低於10%氧氣下培養自體或異源間葉幹細胞所獲得。
如本文所述，該用語「動脈粥狀硬化」，亦被稱為「動脈硬化症」，係指動脈硬化的一種具體形式，因白血球細胞侵入並堆積導致動脈壁增厚之結果。因此動脈粥狀硬化或動脈硬化症為影響動脈血管之症狀由於在動脈壁中白血球細胞之慢性發炎反應，其於一些如冠狀動脈疾病、中風、主動脈瘤或周邊動脈疾病等血管動脈血管相關疾病或病症之受試者中被發現。一般而言，動脈粥狀硬化包括冠狀動脈粥狀硬化、腦動脈粥狀硬化、主動脈 粥狀硬化或腎動脈粥狀硬化。
如本文所述，該用語「間葉幹細胞」或「MSCs」，係指多潛能性幹細胞，其能夠分化成包含如成骨細胞、軟骨細胞以及脂肪細胞等多種細胞型態。間葉幹細胞或MSCs可來自包括但不限於骨髓組織、脂肪組織、肌肉組織、角膜基質或乳牙牙髓、臍帶組織或臍帶血等任何組織來源。於本發明之一實施例，該MSCs為骨髓間葉幹細胞。
本文中所述之該用語「缺氧」係指一種減少空氣含氧量如低於10%氧氣，較佳為1%-7%氧氣之條件。
於本發明，該缺氧培養之間葉幹細胞係於低氧條件低於10%氧氣下培養自體或異源間葉幹細胞所獲得。於本發明之一實施例，該間葉幹細胞係培養於含氧範圍為1%至7%氧氣之條件下。該間葉幹細胞係自體或異源間葉幹細胞。於本發明之一實施例，該間葉幹細胞係異源間葉幹細胞。於本發明之一實施例，該間葉幹細胞係分離自自體或異源間葉幹細胞於含氧1%至7%培養至少繼代2次。
依據本發明，該缺氧培養間葉幹細胞包含於一用於給藥之組成物中。例如，可以通過靜脈注射、冠狀動脈注射、心內注射、腹腔注射或局部施打給予該組成物。於本發明之一些實施例，該組成物係應用非經腸道給藥。
日程與給藥劑量可遵照該些產品的已知方法如製造商之說明書而定。例如，一間葉幹細胞製劑可供給 本發明中用於培養MSC組成物之一劑量範圍示範係介於5×105細胞/kg到8×106細胞/kg。用於24、48、72小時或一周或一個月或以上的缺氧培養MSC注射量與日程表可參考MSC治療效率及其藥物動力學參數而定。然而，應當理解的是這些日程表僅為範例以及最佳日程表與給藥方籤和抗體之耐受性必須由臨床試驗而定。
按照本發明中所使用的醫藥組成物可以一種或多種生理學上可接受之載體以包括賦形劑以及有助於將活性化合物加工成藥用製劑的助劑等常用方式使用。適當的藥物組成方式取決於所選擇的給藥途徑。
而對於非消化道給藥，優選為包括肌肉、靜脈、腹腔以及皮下注射。用於注射之本發明組成物可於水溶液中配製，優選為如漢克氏液、林格氏液或生理食鹽水等生理上可接受之緩衝液。以外，該化合物可以以固體形式配製並於使用前重新溶解或混合。冷凍乾燥粉之形式亦包含在內。
用於口服給藥，該組成物可經由與本領域習知之藥理學可接受之載體之活性化合物結合而得。所述載體使得本發明之組成物可以配製成片劑、丸劑、錠劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，提供患者口服攝取。用於口服使用之藥物製劑還可使用固體賦形劑，任選研磨所得混合物，並加工顆粒混合物，若需其他合適之助劑，而後加入以獲得片劑或糖衣丸芯。實用之賦形劑尤其是糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇等填充劑；纖維素製劑包括，例如，玉米澱粉、小麥澱粉、 稻米澱粉和馬鈴薯澱粉；以及如明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等其他材料。若有需要，亦可加入如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或藻酸等崩解劑。也可使用藻酸鈉之鹽類。
該用語「治療有效量」或「有效量」係指預計達到所期望之療效，即，預防或治療之預期量。於本發明中之某些實實例中，藥物組成物係含有2×105-8×106細胞/kg MSCs，較佳為5×105-8×106細胞/kg MSCs，更佳為5×105-5×106細胞/kg MSCs，最佳為8×105-5×106細胞/kg MSCs。
本發明進一步藉由以下實施例，提供用於示範而非限制的目的所示。
於本發明之實施方式中，其證明磷酸化Akt、磷酸化eNOS以及總eNOS之表現量以及NO的產生量在受試者通過施打具有缺氧培養MSCs之組成物後增高。因此，受試對象之內皮依賴性舒張與抑制斑塊形成係經由含有缺氧培養之MSCs的施用而增加。
實施方式
本發明之其他特徵與優點將於以下實施例中做進一步舉例說明。本文所述之實施例為用於說明，並非用以限制本發明之範圍。
本發明之實施係應用包含細胞生物學、細胞培養以及基因工程等習知技術，為本領域之習知技術範圍。這些技術已於文獻中充分解釋。
分離的缺氧培養間葉幹細胞之特性及其製備
分離的缺氧培養間葉幹細胞之特性及其製備已於先前研究所敘述(Tsai et al.,Hypoxia inhibits senescence and maintains mesenchymal stem cell properties through down-regulation of E2A-p21 by HIF-TWIST,Blood,2011,117：459-469；Yew et al.,Efficient expansion of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow under hypoxic conditions,Journal of tissue engineering and regenerative medicine,2013,7：984-993)。對於缺氧培養，係將間葉幹細胞培養於由94%氮氣、5%二氧化碳以及1%氧氣組成之混合氣體中。簡而言之，骨髓抽取物係取自知情同意正常成年捐贈者之髂骨並經過倫理審查委員會批准後取用。有核細胞經由密度梯度分離(Ficoll-Paque；Pharmacia；Peapack,NJ)並混合均勻於完全培養液中[CCM：α-MEM(α-minimal essential medium；Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)supplemented with 10.0% fetal bovine serum(FBS),100 units/mL penicillin,100μg/mL streptomycin,and 2mM L-glutamine]。
實驗動物與MSC移植療法
該動物實驗提案係經台北榮民總醫院動物實驗委員會批准。本研究係使用8週齡ApoE基因剔除(apoE-/-)小鼠，供鼠(C57BL/6-KO-apoetmlUnc/J,Jackson Laboratories)。實驗動物飼養於室溫22℃，12小時光照/黑暗週期之動物房中，採自由飲食。因其可提高血液中膽固醇含量類似於人類動脈硬化症，因此採用 58Y1高脂肪飲食(60% fat & 0.03% cholesterol；Test Diet；PMI Nutrition International,Richmond,IN)以建立動脈粥狀硬化。所有實驗小鼠以58Y1高脂肪飲食法餵養5週而後以尾靜脈注射MSCs(2×105cells)單劑。控制組實驗動物則使用不相對應不含細胞之PBS量。經施打細胞或PBS後，所有小鼠改以普通飼料餵養7天，立即收集組織樣本與採血。血脂濃度係經由常規化學方法測定。
OxLDL製備
將血漿加於EDTA中利用連續超高速離心法分離出LDL(1.019<d<1.063kg/L)。而後，用千倍體積磷酸鹽緩衝液(PBS)於4℃滲析native LDL24小時以去除EDTA。為了引發氧化作用，將LDL(0.5g protein/L)暴露於5M CuSO4處理18小時。以螢光偵測硫代巴比妥酸反應物質的產生以及該丙二醛等價物之數值從0.76±0.21nmol/mg protein的native LDL增加為24.3±2.6nmol/mgprotein硫酸銅處理的LDL。用500倍體積磷酸鹽緩衝液(PBS)於4℃滲析該新鮮製備的oxLDL 48小時以去除銅離子，並以0.22-μm濾膜過濾滅菌。native LDL與oxLDL製備之蛋白質含量以Lowry法測定(Lowry et al.,Protein measurement with the Folin phenol reagent,J Biol Chem,1951,193：265-275)。
主動脈環之準備與張力記錄
小心切下鎖骨下動脈下方之主動脈段約2mm並等長固定在含有改良的Krebs'溶液：120mMNaCl,4.5mMKCl,2.5mM CaCl2,1mM MgSO4,27mM NaHCO3,1mM KH2PO4，以及10mM glucose，維持於37℃與提供95%氧氣以及5%二氧化碳組成之混合氣體之器官培養槽(7ml)中。簡而言之，將2mm長度之主動脈環於被動張力下30分鐘進行平衡。於這段處理期間，每15分鐘潤洗該組織一次。達到平衡後，該主動脈環以苯福林穩定至近最大收縮(10-6M)。待該環達到一穩定收縮張力後，各藥物用逐漸提高濃度方式加入以獲得各累積濃度反應曲線：苯福林濃度為10-9M至10-5M、乙醯膽鹼濃度為10-9M至10-5M(與以苯福林預收縮後內皮依賴主動脈環舒張進行評估)以及硝化甘油濃度為10-11M至10-5M(與以苯福林預收縮後內皮依賴主動脈環舒張進行評估)。
即時反轉錄脢-聚合脢連鎖反應
依照經銷商說明書，使用RT2 Profiler PCR Array的人類細胞因子與趨化因子序列(SABiosciences,Frederick,MD)，以即時反轉錄酶脢-聚合酶連鎖反應定量mRNA濃度。簡而言之，總RNA(2μg)被反轉錄成為第一股cDNA並以其作為模版於ABI PRISM7700序列檢測系統中進行real-time PCR(Applied Biosystem,Foster City,CA)。PCR緩冷配對階段為於60℃下30秒。甘油醛-3-磷酸去氫酶與次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶之PCR放大反應被進行作為每一樣品以控制樣品量與樣品之間標準化。依照下載自SABiosciences網站的PCR Array Data Analysis，使用comparative △△Ct分析法分析該數據結果。標的基因SDF-1、IL8、MIP-2以及內參基因GAPDH之表現量被定量作為引子、探針以及標準。該引子與TaqMan探針係使用Primer Express軟體(Applied Biosystem)所設計。RT-PCR係使用ABI PRISM7700序列檢測系統(Applied Biosystem)依照TaqMan 2-階段方法進行。
統計分析
所有統計分析係以SPSS軟體，version 18.0(SPSS,Inc,Chicago,IL)進行。兩組之間的整體比對分析係以Student’s t test進行。三組或多組之間的比對分析係在不同組別之間用事後LSD檢定以ANOVA進行。定量的數據為至少三次獨立實驗以平均值±SEM呈現。顯著差異之標準設定為p<0.05。
實施例1 MSCs可恢復經oxLDL處理之內皮細胞中的Akt/eNOS活性並穩定eNOS
為了檢驗外源MSCs對於動脈粥狀硬化之組織修復潛力，我們首先以動脈粥狀硬化內皮細胞遷移實驗檢測MSCs的趨化程度。自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC,Hsinchu,Taiwan)獲得的人類臍帶靜脈內皮細胞(human umibilical vein endothelial cells,HUVEC)依據經銷商說明書培養於ECGM-2中，並使用第6代至第8代。細胞培養於37℃低於5%二氧化碳。
等分量的HUVECs(5×105)於含有或不含有oxLDL(50μg/ml)的600μl ECGM2+10% FBS中加入Costar聚碳酸酯膜穿越小室(Costar polycarbonate transwells)的下層槽中，而1×105MSCs於100μL ECGM2+1% FBS加入該transwells的上層槽中。並沒有以oxLDL處理過的細胞作為控制組。經過24小時遷移，仍滯留於上 層膜表面的細胞以棉花棒擦拭除去以及遷移至膜下側的細胞以5%(wt/vol)戊二醛固定並以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色。倒置濾芯並以螢光顯微鏡測量DAPI染色的細胞數目。數值係以8處高倍視野(40x)計算遷移細胞之平均數呈現。每個實驗為三重複進行，而後該數據結果取平均供統計分析。
細胞遷移實驗之結果如圖1A所示，顯示與以空載體處理的HUVECs相比，以oxLDL處理的HUVECs增加了MSCs的趨化。我們也證明了SDF-1α，吸引MSCs的趨化因子，由HUVECs量隨oxLDL處理濃度依賴性增加，於50μg/ml達到最高點，並於後續實驗中使用該oxLDL濃度。
我們接續研究是否MSCs的間接培養可以保護HUVECs遠離oxLDL引發的傷害。已知oxLDL經由抑制磷酸Akt化、磷酸化eNOS以及總eNOS表現量而導致內皮損傷。使用或未使用50μg/mL oxLDL處理的HUVECs(1.5×104cells)於存在或不存在MSCs(5×103cells)間接共培養24小時，而後進行西方墨點法分析。
細胞萃取物係以M-PER(Pierce,Rockford,IL)加蛋白酶抑制劑混合物(Halt；Pierce)製備而得並使用BCA方法(Pierce)測量蛋白質濃度。等量的細胞蛋白質而後於SDS-膠體中進行電泳，以及而後將蛋白質轉印至PVDF膜(Amersham Biosciences Co.,Piscataway,NJ)。於膜上之非專一性結合位置係使用5%脫脂牛奶於 4℃至隔夜進行阻斷。將膜與第一級抗體進行反應。該膜而後使用其各自帶有辣根過氧化酶的第二級抗體進行反應。該蛋白質條帶以增強的化學冷光試劑組顯示並以X光片感測。
如預期的，以oxLDL處理HUVECs會減少磷酸化-Akt、磷酸化-eNOS以及總eNOS之表現量(圖1C)。有趣的是，我們發現間接共培養MSCs廢止了oxLDL導致的磷酸化-Akt、磷酸化-eNOS以及總eNOS之表現量減少(圖1C)。
NO濃度係由硝酸鹽還原酶將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽後依照經銷商說明書使用市售檢測套組(Nitrate/Nitrite colorimetric assay kit,Cayman Chemical Co.,cat no：780001)以革利士方法檢測。簡而言之，100μl培養上清液與等體積之革利士試劑於室溫避光反應10分鐘。經過革利士試劑(磺胺和萘乙二胺二鹽酸鹽)反應後於吸光值540nm測得總亞硝酸鹽作為NO濃度。同樣地，共培養MSCs顯著增加以oxLDL處理的HUVECs中NO的生產。綜合以上，這些數據暗示由oxLDL導致的HUVEC損傷可特異性吸引MSCs，其可保護HUVECs免於oxLDL所導致的磷酸化-Akt、磷酸化-eNOS以及總eNOS之表現量喪失並產生NO。
實施例2 MSCs恢復動脈粥狀硬化動物模式中的內皮依賴擴張以及抑制斑塊形成。
由於吾等的結果顯示MSCs可特異性地趨回並恢復，體外實驗中以oxLDL處理的內皮細胞Akt/eNOS之活性，因此我們假設於動脈粥狀硬化之動物模式中，以全身性提供的外源 MSCs或許可以修復動脈粥狀硬化或是減緩斑塊形成。於實施動物實驗之前，我們已確認小鼠MSCs亦可恢復在小鼠內皮細胞中(MMECs)被oxLDL抑制的Akt/eNOS之磷酸化與總eNOS之表現量(圖2A)。小鼠腦微血管內皮細胞(Mouse brain microvascular endothelial cells，MMECs)係分離自4至6週齡大之C57BL/6小鼠。該細胞而後培養於DMEM-HG+10% FBS中。
我們而後研究是否以取自小鼠的MSCs(2×105cells)進行單一靜脈注輸，可以促進以高脂飲食餵養5週的ApoE基因剔除小鼠的內皮細胞功能。於MSC治療的第7天，以PBS處理(總膽固醇：405.3+51.9mg/dL，三酸甘油脂：58.1+14.1mg/dL)和以MSCs處理(總膽固醇：412.2+34.8mg/dL三酸甘油脂：87.4+15.8mg/dL)依照高脂飲食餵養apoE基因剔除小鼠之間的血脂濃度並無差異，顯示MSCs的注輸並不會對於血脂濃度之控制造成影響。然而，主動脈環之張力記錄顯示，與以PBS處理相比，以MSCs處理可顯著增加乙醯膽鹼依賴性舒張值，但並無影響硝普鈉依賴性舒張值以及苯福林依賴性舒張值(圖2B)，顯示MSCs促進內皮依賴性血管舒張，但舒張並非依賴於平滑肌細胞或收縮。
再者，我們發現相較於PBS組，MSCs組減少了主動脈斑塊負荷(圖2C及2D)。圖2C所示為以油紅O染色進行斑塊形成分析的主動脈被縱切。為動脈粥狀硬化apoE基因剔除小鼠的定量分析，於主動脈瓣葉之起點沿大動脈連續接片，並收集每隻小鼠之大動脈竇40片連續切片。為了內皮完整性，主動脈並非以生理 食鹽水灌流以避免灌流相關內皮損傷。於整段大動脈竇(200μm)之每一個第十個切片(5μm)皆以H&E染色並拍攝顯微照片。使用電腦影像圖像軟體(IPWin32)分析一給定顯微照片橫截面積。平均病變面積係定量自每隻小鼠5處數位捕捉的切片之平均值。
於免疫組織化學研究中，小鼠切片於二甲苯中脫蠟並在水中水合。組織切片使用3% H2O2於室溫處理10分鐘以去活化內生性過氧化酶。切片在含有1% BSA以及1%羊血清的PBS中於37℃30分鐘進行阻斷。將切片於所適之抗體中隔夜培養，而後以PBS潤洗。玻片而後培養於第二級抗體中(goat anti-rat,BD Pharmingen,San Diego,CA)30分鐘。經過PBS潤洗3次後，以0.1% 3,3'-diaminobenzidine(DAB)進行顯色。以只培養於第二級抗體的切片(省略第一級抗體)作為一陰性控制組。將切片再與蘇木精複染並使用光學顯微鏡檢測。為了著重於內皮細胞之訊號變化，定量並平均切片內皮層中為磷酸化-Akt與磷酸化-eNOS之陽性細胞。
與體外實驗結果一致，相較於PBS組，MSCs組亦顯著增加了主動脈內皮層中Akt/eNOS磷酸化的程度(圖2E)。這些結果顯示MSCs提供動脈粥狀硬化動物模式中內皮細胞的修復以及斑塊防治之效益。
實施例3 由MSCs介導修復之Akt/eNOS的活化以及eNOS的安定化需要IL-8。
自實施例1與2之結果顯示人類MSCs的間接共培養恢復了以oxLDL處理的HUVECs內Akt/eNOS的活化與總eNOS，其 說明具有旁分泌作用的參與。當使用人類PCR Array分析MSC的細胞因子與趨化因子分佈，我們判定當MSCs接觸到存在於oxLDL下的HUVECs時，IL-8為唯一表現量增加的細胞因子或趨化因子(圖3A)。第二個實驗以定量RT-PCR鑑定oxLDL單獨於存在或不存在之HUVECs之獨立，IL-8之表現量係透過MSC而增加。
依照經銷商說明書使用RT2 Profiler PCR Array的人類細胞因子與趨化因子序列(SABiosciences,Frederick,MD)以即時反轉錄酶-聚合酶連鎖反應定量mRNA濃度。簡而言之，總RNA(2μg)被反轉錄成為第一股cDNA並以其作為模版於ABI PRISM7700序列檢測系統中進行即時PCR(Applied Biosystem,Foster City,CA)。PCR緩冷配對階段為於60℃下30秒。甘油醛-3-磷酸去氫酶與次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶之PCR放大反應被進行作為每一樣品以控制樣品量與樣品之間標準化。依照下載自SABiosciences網站的PCR Array Data Analysis，使用comparative △△Ct分析法分析該數據結果。標的基因SDF-1、IL8、MIP-2以及內參基因GAPDH之表現量被定量作為引子、探針以及標準。該引子與TaqMan探針係使用Primer Express軟體(Applied Biosystem)所設計。RT-PCR係使用ABI PRISM7700序列檢測系統(Applied Biosystem)依照TaqMan 2-階段方法進行。
由細胞分泌的旁分泌因子可於條件培養液中被累積，因此我們使用源自oxLDL處理的MSCs之條件培養液進行研究(圖3C)。該CM-MSC以劑量依賴性地反轉了oxLDL對於Akt/eNOS 磷酸化與總eNOS表現量的抑制效果。而該CM-MSC之效益可藉由加入IL-8中和抗體的同時而被阻斷(圖3C)。此外，重新加入IL-8的CM-MSC亦可增加以ox-LDL處理的內皮細胞內之磷酸化Akt與eNOS表現量(圖3D)。我們進一步證明在間接培養MSCs或以IL-8介導的效應中有PI3K/Akt途徑的參與。該PI3K抑制劑，LY294002，顯著阻斷MSCs或IL-8對於oxLDL誘發改變的Akt與eNOS磷酸化之效益。
此外，我們亦檢測是否MSCs的間接共培養，或以IL-8之處理，可以減緩由oxLDL所導致的eNOS蛋白質降解。免疫沉澱法使用抗-eNOSd抗體進行而後以抗-泛素抗體進行免疫轉漬，發現MSCs明顯減緩eNOS之泛素化(圖3E)。MSCs減緩eNOS泛素化之效果可被IL-8抗體而阻斷(圖3E)。亦可在單獨存在IL-8時觀察到eNOS泛素化之減解效果(圖3E)。另外，以阻止蛋白質合成的放線菌酮(cycloheximide)處理HUVECs之情況下，注意到在接觸oxLDL以後之eNOS表現量下游調控以及在MSC處理後被促進(圖3F)。以蛋白酶抑制劑MG132處理，eNOS蛋白質量之下游調控與效果相似於MSC處理組。再者，由MSC上游調控之eNOS可被IL-8抗體阻斷。以及，單獨使用IL-8處理也可提高MSC上游調控之eNOS而且效果相似於MSC處理組。這些結果顯示，除了磷酸化eNOS活化之效果外，MSC也減緩了eNOS泛素化以及IL-8可能在MSCs的旁分泌作用中扮演關鍵角色。
實施例4 由MSCs介導修復之內皮依賴性舒張需要 MIP-2。
於本實施例中，與IL-8同源的小鼠基因MIP-2的參與MSCs為媒介之效益在高脂飲食apoE基因剔除小鼠中闡明。自4至6週齡大之C57BL/6小鼠獲得小鼠MSCs，並培養於含有10% FBS之α-MEM中。小鼠腦微血管內皮細胞(Mouse brain microvascular endothelial cells，MMECs)係分離自4至6週齡大之C57BL/6小鼠。該細胞而後培養於DMEM-HG+10% FBS中。以定量RT-PCR分析暴露於oxLDL之小鼠MSCs內MIP-2表現量之模式相似於暴露於oxLDL之人類MSCs內IL-8之表現量(圖4A)。為了進一步闡明於體內實驗中MIP-2在MSCs旁分泌作用之角色，在注射入高脂飲食apoE基因剔除小鼠前先以MIP-2抗體或控制組同型IgG抗體處理MSCs。另外，於為期5周高脂飲食結束後的apoE基因剔除小鼠同樣以腹腔注射的方式獲得不含有細胞的單劑MIP-2(50μg/kg)。
如結果所示，在以抗-MIP-2抗體前處理小鼠MSC輸液7天之組別，其主動脈乙醯膽鹼依賴性舒張之促進被顯著阻斷，同型IgG組則無(圖4B)。雖然並沒有達到顯著差異，相較於同型IgG組，在以抗-MIP-2抗體前處理小鼠MSC組觀察到之MSCs對於主動脈斑塊負荷之效益產生消除的趨勢(圖4C)。
再者，體內實驗中由MSC所介導而增加的磷酸化-Akt+與磷酸化-eNOS+內皮細胞百分比，相較於同型IgG組，在抗-MIP-2抗體前處理小鼠MSC組別中被顯著阻斷。結合以上結果顯示系統性提供外源MSC可恢復病變的內皮細胞以及其係經由小鼠 MSC與IL-8同源的MIP-2之分泌促進內皮功能。
實施例5 MIP-2恢復內皮依賴性舒張
為了證明MIP-2係為調控MSC於保護內皮細胞遠離動脈粥狀硬化所導致之功能喪失與抑制斑塊形成的效應中所必需，本實施例評估MIP-2對於恢復內皮功能與抑制斑塊形成之直接影響。
以腹腔注射MIP-2(50μg/kg)第七天之高脂飲食apoE基因剔除小鼠相較於控制組顯著增加了主動脈環之乙醯膽鹼依賴性舒張(圖5A)。甚至使用單劑注射時，可明顯觀察到MIP-2對於促進內皮功能之治療潛力。然而，單劑MIP-2對於主動脈斑塊負荷之影響與控制組無異(圖5B)。另外，與MSCs之影響相似，我們也發現，相較於同型IgG組，MIP-2顯著增加磷酸化-Akt+與磷酸化-eNOS+內皮細胞百分比(圖5C)。綜合這些結果顯示MIP-2為參與恢復內皮功能中由MSCs所介導的影響。
實施例6 MSCs之細胞運輸
為了探討是否可以通過移植MSCs調控動脈粥狀硬化內皮細胞之修復，於靜脈輸液以前使用CFSE標記MSCs。高脂飲食apoE基因剔除小鼠係以不含(PBS，vehicle控制組)或含有CFSE標記之MSCs(2×105cells)治療一周後犧牲並且採集主動脈環以抗-CFSE抗體進行免疫組織化學研究。帶有或不帶有CFSE標記MSCs之灌流小鼠主動脈環採集用於MSC移植檢測。
如圖6所示，CFSE標記的MSCs可以在第7天的時候觀 察到MSCs接近內皮細胞之區域，但並非其內部，而沒有使用MSCs處理的組別並沒有細胞被抗-CFSE抗體染色，顯示為旁分泌作用，而非分化作用，促成了動脈粥狀硬化療法。
實施例7 p38訊息傳遞途徑參與IL-8之分泌
我們進一步以MSCs闡明MAPK訊息傳遞參與IL-8之分泌。首先證明在MSC暴露於50μg/mL oxLDL時，磷酸化之p38濃度上升，而其他訊息途徑並無被活化(圖7A)。再者，MSCs以暫時性轉染shRNA拮抗p38基因剔除p38後也在曝露於oxLDL時抑制了IL-8之表現量與其分泌。綜合這些結果顯示該p38/IL-8訊息途徑參與內皮細胞內，由MSC調控的有益影響之全部機制。
總結，以人類MSCs共培養可逆轉oxLDL對於內皮細胞之影響以及恢復Akt/eNOS活性、eNOS濃度以及NO產生。MSCs之移植改善了高脂飲食apoE基因剔除小鼠內皮功能及斑塊形成。在體內或體外實驗研究中，MSCs經由IL-8/MIP-2之旁分泌作用，於oxLDL處理的內皮細胞中發揮其保護作用。通過IL-8/MIP-2於內皮細胞中Akt/eNOS途徑之活化係參與在MSCs之保護作用中。本發明亦揭示了該PI3K抑制劑LY294002顯著阻斷了hMSCs、CM-hMSC或IL-8在oxLDL所引發的Akt/eNOS途徑不活化之有益影響，以及使用IL-8抗體之結果相似於該效果。似乎p38與PI3K/Akt訊息傳遞參與在oxLDL處理的內皮異常中，hMSCs調控的有效影響中。
本發明確立了MSCs在動脈粥狀硬化早期階段，對於疾病之發展與/或進展之早期預防的影響。於以上實施例所述實 驗結果顯示MSC經由透過p38MAPK的活化，釋放一旁分泌因子之指令改善內皮功能，以及該MSCs或其分泌蛋白IL-8/MIP-2可能可以被應用於動脈粥狀硬化患者。此對於在MSCs用於動脈粥狀硬化治療之應用於臨床前或臨床試驗之方案的發展是有幫助的。
已知於本發明所屬領域具通常知識者可使用基於本說明書至最大範圍，於此無需進一步說明。因此本說明書及所請專利範圍所述應被理解為示範用途，而非以任何方式限制本發明之範圍。

Claims (13)

  1. 一種用於修復血管內皮細胞之醫藥組成物，其包含5×105-8×106細胞/kg之缺氧培養之間葉幹細胞(MSC)，與藥學上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑，其中，該缺氧培養之間葉幹細胞係經由旁分泌作用分泌IL-8或其同源物，恢復內皮功能而促成動脈粥狀硬化之治療。
  2. 如請求項1所述之醫藥組成物，其中，該動脈粥狀硬化係與冠狀動脈疾病、中風、主動脈瘤或周邊動脈疾病有關。
  3. 如請求項1所請之醫藥組成物，其中，該動脈粥狀硬化係冠狀動脈粥狀硬化、腦動脈粥狀硬化、主動脈粥狀硬化與腎動脈粥狀硬化之一。
  4. 如請求項1所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物係通過靜脈注射、冠狀動脈注射、心內注射、腹腔注射或局部投藥給予該組成物。
  5. 如請求項1所述之醫藥組成物，其中，該缺氧培養之間葉幹細胞係使患者內皮細胞中磷酸化-Akt以及磷酸化-eNOS與總eNOS之濃度與NO產生量增加。
  6. 如請求項1所述之醫藥組成物，其中，該缺氧培養之間葉幹細胞係使內皮依賴性舒張之恢復和斑塊形成之抑制增加。
  7. 如請求項1所述之醫藥組成物，其中，該間葉幹細胞係於低於10%氧氣之低氧條件下培養所獲得者。
  8. 如請求項7所述之醫藥組成物，其中，該缺氧培養之間葉幹細胞係於低氧條件1%-7%氧氣含量下培養自體或異源間葉幹細胞所獲得。
  9. 如請求項8所述之醫藥組成物，其中，該低氧條件係將自體或異源間葉幹細胞於以94%氮氣、5%二氧化碳與1%氧氣組成之混合氣體中培養。
  10. 如請求項7所述之醫藥組成物，其中，該缺氧培養之間葉幹細胞係培養於低氧條件1%-7%氧氣含量下至少2次繼代後而得者。
  11. 如請求項1所述之醫藥組成物，其中，該間葉幹細胞係衍生自骨髓組織、脂肪組織、肌肉組織、角膜基質或乳牙牙髓、臍帶組織或臍帶血。
  12. 如請求項11所述之醫藥組成物，其中，該間葉幹細胞係衍生自骨髓組織。
  13. 如請求項1所述之醫藥組成物，其包含8×105-5×106細胞/kg之間質幹細胞(MSC)。
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Wu et al. TSLPR deficiency attenuates atherosclerotic lesion development associated with the inhibition of TH17 cells and the promotion of regulator T cells in ApoE-deficient mice