TWI434853B

TWI434853B - 腫瘤血管內皮標誌８胜肽及包含此胜肽之疫苗

Info

Publication number: TWI434853B
Application number: TW097112625A
Authority: TW
Inventors: Takuya Tsunoda; Ryuji Osawa
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2007-04-11
Filing date: 2008-04-08
Publication date: 2014-04-21
Also published as: RU2013131089A; US8367799B2; US20120093843A1; TW201425333A; EP2508601A2; WO2008126413A1; CN102786582A; RU2498993C2; KR20100016355A; JP5320544B2; MX2009010965A; CN102786582B; EP2508601B1; RU2009141595A; BRPI0811021A2; CN101711280A; EP2155872A4; CA2683454A1; EP2155872A1; EP2508601A3

Description

腫瘤血管內皮標誌8胜肽及包含此胜肽之疫苗

本申請書主張2007年4月11日申請之美國臨時專利申請書案第60/911,194號之權利，為達到所有的目的，該案所揭露之全文以引用的方式併入本文中。

本發明係有關於生物科學的領域，更具體地來說係有關於癌治療的領域。本發明特別有關於腫瘤血管內皮標誌8胜肽，其為極有效的癌疫苗以及為治療和預防腫瘤的藥物。

目前已證實CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞會辨認位於主要組織相容複合體(MHC)第一類分子上之衍生自腫瘤相關抗原(TAAs)的抗原決定位胜肽，並殺死腫瘤細胞。雖然黑色素瘤抗原(MAGE)家族係第一個被發現的腫瘤相關抗原，許多其他的腫瘤相關抗原已經由免疫方法發現(Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9)，而其中一些腫瘤相關抗原現在則作為臨床發展過程中的免疫治療標靶。

新腫瘤相關抗原之鑑別引發可能與特定的抗腫瘤免疫反應，其可作為各種形式之癌當中胜肽接種策略之臨床使用發展的依據(Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94)。至今已有報告指出有數個臨床試驗使用這些腫瘤相關抗原衍生的胜肽。很不幸的目前在這些癌疫苗試驗中只能觀察到低客觀反應率(objective response rate)(Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15)。

此效力上相對缺乏的一個可能原因為腫瘤細胞上之人類白血球抗原(HLA)第一類分子的減少或下調表現，其經常發生在固態瘤並且嚴重地損害T細胞調控的抗腫瘤反應(Cormier JN et al., Int J Cancer 1998 Feb 9, 75(4): 517-24; Hicklin DJ et al., Mol Med Today 1999 Apr, 5(4): 178-86; Paschen A et al., Int J Cancer 2003 Mar 1, 103(6): 759-67)。雖然以腫瘤相關之抗原為標靶的癌疫苗誘發了強力的細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)，但是當該細胞毒性T淋巴細胞未表現足量的人類白血球抗原第一類分子時，該細胞毒性T淋巴細胞便無法辨認目標細胞。

腫瘤血管生成(angiogenesis)在腫瘤發展過程中為關鍵的現象。已經證實根據一種以內皮細胞為基礎的方法能夠發展有效對抗腫瘤血管生成的疫苗，該疫苗以血管內皮生長因子受體(VEGFRs)1與2為標靶，如同人類白血球抗原(HLA)第一類分子在內皮細胞上未下調(down-regulated)(Wada S et al., Cancer Res 2005 Jun 1, 65(11): 4939-46; Ishizaki H et al., Clin Cancer Res 2006 Oct 1, 12(19): 5841-9)。此外，由於這些治療標靶係與腫瘤無關，因此在腫瘤微環境中血管內皮細胞的消耗可有效對抗各種惡性腫瘤。再者，腫瘤內皮細胞立即經由淋巴細胞進入血流中，細胞毒性T淋巴細胞可直接地損害內皮細胞而不會使任何其他的組織滲透。另外，在腫瘤脈管系統內即使只有少數的內皮細胞溶解都可能破壞血管的完整性，因此抑制許多腫瘤細胞(Folkman J, Nat Med 1995 Jan, 1(1): 27-31)。因此，對於癌症免疫療法來說，腫瘤內皮細胞係一種好的標靶。為了以專一以及有效的細胞毒性T淋巴細胞反應抑制腫瘤血管生成，需在與血管生成有關的分子當中選擇適當的標靶。

腫瘤血管內皮標誌(TEMs)包括腫瘤血管內皮標誌8(TEM8)，在比較腫瘤血管內皮標誌與正常組織之後，已發現腫瘤血管內皮標誌之與腫瘤相關的內皮細胞層(tumor-associated endothelium)特別提高(St Croix B et al., Science 2000 Aug 18, 289(5482): 1197-202)。腫瘤血管內皮標誌8轉錄子表現在肺與腦腫瘤以及肝轉移(liver metastasis)上。以腫瘤血管內皮標誌8為標靶的治療可應用於廣泛形式的腫瘤。例如，WO 2005/048943提到疫苗的使用，其包括一編碼腫瘤血管內皮標誌8之胞外領域的載體以及一編碼腫瘤相關抗原的疫苗。然而，此文件未提供任何證據證明腫瘤血管內皮標誌8表示載體(TEM8-expressing vector)會誘發細胞毒性T淋巴細胞抵抗腫瘤相關的內皮細胞層，也未提供任何腫瘤血管內皮標誌8蛋白質內之表位位置的資訊。

因此，改善以腫瘤微環境為目標之癌治療的臨床效力是很重要的，特別是那些以腫瘤血管生成為目標的治療法。本發明將腫瘤血管視為抗腫瘤免疫療法的目標。由於一般認為腫瘤血管內皮標誌8(tumor endothelial marker 8 (TEM8))廣泛地在多種腫瘤形式的血管中表現，因此本發明特別以腫瘤血管內皮標誌8(GenBank Accession No. NP_115584 (SEQ ID NO: 76)，其被GenBank Accession No. NM_032208 (SEQ ID NO: 75)的基因編碼)為目標。本發明提供含有表位胜肽的腫瘤血管內皮標誌8基因產物，該表位胜肽誘發對於相對應分子具有專一性的細胞毒性T淋巴細胞。利用衍生自腫瘤血管內皮標誌8的人類白血球抗原-A﹡2402或人類白血球抗原-A﹡0201結合候選胜肽刺激從健康捐贈者得到的週邊血液單核細胞(PBMCs)。本發明進一步地提供已確立的細胞毒性T淋巴細胞，該細胞毒性T淋巴細胞專一地辨識以個別候選胜肽脈動產生的(pulsed)人類白血球抗原-A24((HLA-A24)或人類白血球抗原-A02陽性標的細胞，以及辨識人類白血球抗原-A24(HLA-A02)或人類白血球抗原-A02限定之表位胜肽，該表位胜肽可在腫瘤血管上引發對抗腫瘤血管內皮標誌8時之強烈與專一的免疫反應。這些結果證明腫瘤血管內皮標誌8具有強大的免疫性，而其表位為腫瘤免疫治療的有效標的。

因此，本發明提供一種具有細胞毒性T細胞誘發性之分離的九胜肽(nonapeptide)或十胜肽(decapeptide)，其中之九胜肽或十胜肽包含一選自SEQ ID NO: 76的胺基酸序列。本發明特別提供含有選自SEQ ID NOs:3、4、9、23、25、30、60、63與68之胺基酸序列的胜肽，而且其具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性。只要修改的胜肽保留原始的細胞毒性T淋巴細胞誘發性，則本發明之胜肽包含1個、2個或以上之取代或增加的胺基酸。

當投與本發明之胜肽至一個體時，該胜肽存在抗原表現的細胞表面上，然後誘發以個別胜肽為目標的細胞毒性T淋巴細胞。因此，根據本發明的觀點，本發明也提供抗原呈現的細胞與外吐小體(exosomes)-其呈現本發明的任何胜肽，以及提供用以引發抗原呈現之細胞的方法。

抗腫瘤免疫反應係經由投與本發明之腫瘤血管內皮標誌8多肽或編碼該多肽之多核苷酸以及表現腫瘤血管內皮標誌8多肽之外吐小體與抗原表現細胞所引起。因此，本發明提供含有多肽或含有編碼該多肽之多核苷酸的藥劑以及作為其活性成分的外吐小體與抗原表現細胞。本發明之藥劑係用來作為疫苗。

此外，本發明提供用來治療和/或預防癌症(腫瘤)和/或預防其術後復發的方法，以及提供誘發細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)的方法、誘發抵抗腫瘤相關的內皮細胞層而產生之免疫反應與抗腫瘤免疫力的方法，該方法包括以下步驟：投與腫瘤血管內皮標誌8多胜肽，編碼腫瘤血管內皮標誌8多胜肽、外吐小體或表現腫瘤血管內皮標誌8多胜肽之抗原表現細胞的多核苷酸，或本發明之藥劑。

此外，標靶此腫瘤血管內皮標誌多胜肽之細胞毒性T淋巴細胞加強了以腫瘤相關內皮細胞層為目標的免疫反應。因此，本發明提供以此腫瘤血管內皮標誌多胜肽為目標的細胞毒性T淋巴細胞。吾人也發現本發明之細胞毒性T淋巴細胞可作為對抗癌症的疫苗。

上述概述與下列實施例與圖示中的詳細說明為本發明之範例，並不因此限定本發明或本發明之其他實施例。

I.定義

除非有特別說明，否則本文中所使用的“一種”、“一個”、“該”或“該等”係指“至少一種”。

“多胜肽”、“胜肽”或“蛋白質”係指胺基酸殘基的聚合物，該等名詞在本文中可互換使用。該等名詞應用於胺基酸聚合物-其中之一種或以上之胺基酸殘基係修飾的殘基或非天然產生的殘基(例如：對應之天然胺基酸的人工化學模擬物質)，以及應用於天然產生的胺基酸聚合物。

本文中的“胺基酸”係指天然產生與合成的胺基酸以及胺基酸類似物與功能與天然胺基酸類似的胺基酸模擬物。天然產生的胺基酸係那些被基因密碼編碼的胺基酸以及那些在細胞中轉譯後被修飾的胺基酸(例如：羥脯胺酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷氨酸(carboxyglutamate)與0-磷絲胺酸(phosphoserine))。“胺基酸類似物”係指與天然胺基酸具有相同之基本化學結構(一個結合至氫、羧基、胺基與R基團的α碳)但具有一修飾之R基團或修飾之骨架(例如：高絲胺酸(homoserine)、正白胺酸(norleucine)、甲硫胺酸(methionine)、亞碸(sulfoxide)、甲硫胺酸甲基锍(methionine methyl sulfonium))的化合物。“胺基酸模擬物”係指與一般胺基酸具有相似功能但結構不同的化學化合物。

本文中的胺基酸可用一般所知的3個字母表示或以IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission建議的單一字母表示。

除非特別說明，否則本文中的“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”與“核酸”可交互使用，這些名詞與胺基酸相似並且以其常用的單一字母密碼表示。

除非另外定義，否則本文中所使用的技術與科學名詞皆與本發明所屬之技術領域人員所了解。

II.胜肽

為了證明衍生自腫瘤血管內皮標誌8的胜肽的功能為被細胞毒性T淋巴細胞辨識的抗原，分析衍生自腫瘤血管內皮標誌8的胜肽(GenBank Accession No. NP_115584 (SEQ ID NO: 76))以確定其是否為被人類白血球抗原-A24或人類白血球抗原-A02(其為常見的人類白血球抗原等位基因(HLA alleles))所限定的抗原表位(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994)。利用對於人類白血球抗原-A24與人類白血球抗原-A02的結合親合力，可鑑定出衍生自腫瘤血管內皮標誌8之人類白血球抗原-A24與人類白血球抗原-A02結合胜肽(HLA-A24 and HLA-A02 binding peptides)的候選物。將載有這些胜肽的樹肽細胞在體外刺激 T細胞之後，利用下列每一胜肽順利地建立細胞毒性T淋巴細胞。

腫瘤血管內皮標誌8-A24-9-39(SEQ ID NO: 3)，腫瘤血管內皮標誌8-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)，腫瘤血管內皮標誌8-A24-10-277(SEQ ID NO: 9)，腫瘤血管內皮標誌8-A02-9-337(SEQ ID NO: 23)，腫瘤血管內皮標誌8-A02-9-338(SEQ ID NO: 25)，腫瘤血管內皮標誌8-A02-9-278(SEQ ID NO: 30)，腫瘤血管內皮標誌8-A02-10-338(SEQ ID NO: 60)，腫瘤血管內皮標誌8-A02-10-265(SEQ ID NO: 63)以及腫瘤血管內皮標誌8-A02-10-333(SEQ ID NO: 68)。

這些已建立的細胞毒性T淋巴細胞顯現細胞毒性T淋巴細胞對抗以個別胜肽衝擊之目標細胞所產生之有效的專一活性。這些結果證明腫瘤血管內皮標誌8係一種被細胞毒性T淋巴細胞辨識的抗原，而以下的胜肽係被HLA-A24或HLA-A02所限定之腫瘤血管內皮標誌8的表位胜肽。

由於腫瘤血管內皮標誌8 基因在大部分癌症病人身上皆過度表現，因此若要評估免疫療法的臨床效力是否增加，該基因係一良好的評估目標。因此，本發明提供由腫瘤血管內皮標誌8得來之細胞毒性T淋巴細胞辨識位(CTL-recognized epitopes)的九胜肽(由9個胺基酸殘基組成的胜肽)與十胜肽(由10個胺基酸殘基組成的胜肽)。在本發明中，九胜肽或十胜肽的胺基酸序列可選自SEQ ID NO:76。因此，本發明提供具有細胞毒性T細胞誘發性之分離的胜肽，其中之胜肽包含選自SEQ ID NO:76胺基酸序列之9或10個連續的胺基酸序列。更具體地來說，在一些實施列中，本發明提供由SEQ ID NOs:3、4、9、23、25、30、60、63與68等胺基酸組成的胜肽。

大體而言，現在在網際網路上可獲得軟體程式，例如Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75所述的程式可經由電腦模擬(in silico )計算各種胜肽與人類白血球抗原之間的結合親合力。舉例來說，與人類白血球抗原的結合親合力可利用Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75與Kuzushima Ket al., Blood 2001, 98(6): 1872-81所述的方法來測量。確定結合親合力的方法描述於Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190.與Protein Science, 2000, 9: 1838-1846等文獻中。因此，本發明包含已被該等已知程式確認會與人類白血球抗原(HLA antigens)結合之腫瘤血管內皮標誌8的胜肽。

此外，只要本發明之胜肽可保持其細胞毒性T淋巴細胞誘發性，則可在胜肽側邊接上額外的胺基酸殘基。該等具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽含有少於40個胺基酸，經常少於20個胺基酸，通常少於15個胺基酸。由SEQ ID NOs:3、4、9、23、25、30、60、63與68等組成並由側邊接上胜肽的胺基酸序列未被限制，同時，只要其未減損原始胜肽的細胞毒性T淋巴細胞誘發性，則該胺基酸序列可由任何形式的胺基酸組成。因此，本發明也提供具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽，該胜肽包含選自SEQ ID NOs:3、4、9、23、25、30、60、63與68的胺基酸序列。

一般已知修飾蛋白質當中一個或以上的胺基酸並不會影響該蛋白質的功能，或在一些情況下甚至可增加原始蛋白質之期望的功能。事實上，已知修飾的胜肽(即由修飾之胺基酸序列組成的胜肽，該修飾係經由取代或添加1、2或數個胺基酸殘基至一原始的參考序列)能保持原始胜肽的生物活性(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13)。因此，根據本發明的實施例，本發明之具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽可由含有SEQ ID NO:3、4、9、23、25、30、60、63或68胺基酸序列的胺基酸組成，其中之1個、2個或甚至以上的胺基酸係經由添加和/或取代而來。

此技術將辨識到改變單一胺基酸或一小部分胺基酸的特定添加或取代作用會保留原始胺基酸側鏈的性質，因此稱該作用為“保留取代作用(conservative substitution)”或“保留修飾作用(conservative modification)”，其中，蛋白質之修改產生具有相似功能的蛋白質。提供相似功能之胺基酸的保留取代作用表(Conservative substitution tables)已為無人所熟知。胺基酸側鏈之特性的例子為疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)以及具有以下官能基或共同特性的側鏈：脂肪族側鏈(G、A、V、L、I、P)：含有羥基的側鏈(S、T、Y)；含有硫元子的側鏈(C、M)；含有羧酸與醯胺的側鏈(D、N、E、Q)；含有鹼基的側鏈(R、K、H)；以及含有芳香族的側鏈(H、F、Y、W)。另外，還有以下8個基團，其中每個基團含有可互作保留取代作用的胺基酸：1)丙胺酸(A)，甘胺酸(G); 2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E); 3)天門冬胺酸(N)、麩醯胺酸(Q); 4)精胺酸(R)、離胺酸(K); 5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V); 6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W); 7)絲胺酸(S)、羥丁胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參考例如：Creighton, Proteins 1984)。

該等保留特性的修飾胜肽也包含在本發明的胜肽。然而，本發明之胜肽並不限定為此類胜肽，可保留其細胞毒性T淋巴細胞誘發性的非保留修飾作用胜肽也包含在本發明中。再者，該修飾之胜肽未排除多態變異體(polymorphic variants)、種間同系物(interspecies homologues)與腫瘤血管內皮標誌8之等位基因(alleles of TEM8)的細胞毒性T淋巴細胞誘發胜肽。

為了保留必要的細胞毒性T淋巴細胞誘發性，吾人可修改(添加或取代)少數(1個、2個或數個)或少量百分比的胺基酸。此處的“數個”係指5個或以下的胺基酸，例如： 3個或以下。胺基酸的修改百分比可為20%或以下，例如：15%以下、10%或1%至5%。

本發明之胜肽腫瘤血管內皮標誌TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO: 3)、腫瘤血管內皮標誌TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)、腫瘤血管內皮標誌TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO: 9)、腫瘤血管內皮標誌TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO: 23)、腫瘤血管內皮標誌TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO: 25)、腫瘤血管內皮標誌TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO: 30)、腫瘤血管內皮標誌TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO: 60)、腫瘤血管內皮標誌TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO: 63)與腫瘤血管內皮標誌TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO: 68)的同源性分析(homology analysis)顯示這些胜肽與衍生自任何其他已知人類基因產物的胜肽不具有顯著的同源性。這降低了它們使用於免疫治療時產生未知或不良免疫反應的可能性。因此，從此觀點來看，這些胜肽可用於引發腫瘤病患抵抗腫瘤相關之內皮細胞層之腫瘤血管內皮標誌8的免疫力。

當這些胜肽用於免疫治療時，這些胜肽與人類白血球抗原形成一複合物，其存在於細胞或外吐小體的表面。因此，除了胜肽的細胞毒性T淋巴細胞誘發性之外，吾人還需選擇對人類白血球抗原具有高度結合親合力的胜肽。此外該等胜肽可經由取代、添加作用修改胺基酸序列殘基以達到較高的結合親合力。除了自然呈現的胜肽之外，由於已知經由結合至人類白血球抗原所呈現之胜肽序列的規則性(J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307)，以此規則性為基礎的修飾作用可用於本發明的致免疫性胜肽上。例如，也可適當地使用其N端之第二胺基酸被苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸取代並顯現高度人類白血球抗原結合親合力的胜肽，以及使用其胺基酸在C端被苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸取代的胜肽。因此，本發明包含具有SEQ ID NOs:3、4或9胺基酸序列(其中，N端的第二胺基酸被苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸取代)的胜肽，以及包含C端被苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸取代的胜肽。

另一方面，N端之第二胺基酸被白胺酸或甲硫胺酸取代以及C端胺基酸被纈胺酸或白胺酸取代之胜肽具有高度人類白血球抗原-02結合親合力，可作為本發明所使用的胜肽。因此，本發明包含具有SEQ ID NO:23、25、30、60、63與68任一胺基酸序列(其中之N端第二胺基酸被白胺酸或甲硫胺酸取代，和/或其中之C端被纈胺酸或白胺酸取代)的胜肽。取代作用不只發生在末端胺基酸，也會發生在胜肽之可能的T細胞受體識別區(the position of potential TCR recognition)。數個研究證明胜肽中的胺基酸取代作用可與原始的CAP1、p53_(264-272) 、Her-2/neu_(369-377) 或gp100_(209-217) 相同或更好(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002)Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003)52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004)53, 307-314)。

此外，可將1至2個胺基酸添加至本發明之胜肽的N和/或C端。本發明也包括該等具有高度人類白血球抗原結合親合力與保留細胞毒性T淋巴細胞誘發性的修飾胜肽。

然而，當胜肽序列與具有不同功能之內源性或外源性蛋白質的部分胺基酸序列相同時，可能會引起抵抗特定物質而生的副作用，例如：自體免疫疾病或過敏症狀。因此，吾人可利用現有的資料庫進行同源性研究，以避免胜肽的序列與另一蛋白質的胺基酸序列相符。當同源性研究清楚地證明一胜肽與目標胜肽甚至不存有1或2個不同的胺基酸，則可修飾該目標胜肽以增加其與人類白血球抗原的結合親合力及/或增加其細胞毒性T淋巴細胞誘發性，而不會有任何產生副作用的風險。

雖然吾人預期如上所述之對人類白血球抗原具有高度結合親合力的胜肽具有高效力，然而根據其高度結合親合力而選出的候選胜肽需進一步地檢視其是否具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性。此處所述的“細胞毒性T淋巴細胞誘發性”係指當細胞毒性T淋巴細胞存在於抗原表現細胞上時胜肽誘發細胞毒性T淋巴細胞的能力。再者，“細胞毒性T淋巴細胞誘發性”包括胜肽誘發細胞毒性T淋巴細胞活化、細胞毒性T淋巴細胞增生、促進目標細胞之細胞毒性T淋巴細胞溶解(lysis)以及增加細胞毒性T淋巴細胞干擾素-γ產生的能力。

經由誘發載有人類主要組織相容複合體抗體的抗原表現細胞(例如：B淋巴細胞、巨噬細胞與樹狀細胞(DCs))-或更具體地說誘發衍生自人類週邊血液單核白血球的樹狀細胞-完成細胞毒性T淋巴細胞誘發性的確定，以胜肽刺激之後，再與CD8陽性細胞混合，然後測量細胞毒性T淋巴細胞對抗目標細胞時所產生與釋放的干擾素-γ。為了表現人類白血球抗原(例如：BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J,1Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79、相關文章、書籍、Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A﹡0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H)response所述的人類白血球抗原)，可使用基因轉殖動物作為反應系統。舉例來說，可利用⁵¹ 鉻這類物質來放射標記目標細胞，然後由目標細胞釋出的放射性計算細胞毒殺活性。或者可在載有固定化胜肽之抗原表現細胞的存在下經由測量細胞毒性T淋巴細胞產生與釋出的干擾素-γ以及檢視培養基上抗干擾素-γ單株抗體的抑制區來檢視該活性。

如上所述檢視胜肽之細胞毒性T淋巴細胞誘發性的結果顯示：對於人類白血球抗原具有高度結合親合力的胜肽不必然具有高誘發性。此外，自含有胺基酸序列SEQ ID NOs:3、4、9、23、25、30、60、63與68之胜肽所選出的九胜肽或十胜肽顯示特別高的細胞毒性T淋巴細胞誘發性以及對於人類白血球抗原的高度結合親合力。因此，這些胜肽為本發明的實施例。

除了以上所討論之本發明胜肽的修飾，只要本發明之胜肽保留細胞毒性T淋巴細胞誘發性，便可進一步地連接至其他的物質。該物質的例子包括：胜肽、脂肪、糖與糖鏈、乙醯基、天然與合成的聚合物等。只要修飾作用未破壞本文所述胜肽的生物活性，則該胜肽可包含的修飾作用包括糖化作用、側鏈氧化作用或磷酸化作用。這些修飾作用可給予額外的功能(例如：標靶功能與傳送功能)或用以安定多胜肽。

例如，為了增加多胜肽的體內安定性，在此項技術中已知可使用D-胺基酸、胺基酸模擬物或非天然的胺基酸；此概念可應用於本發明之多胜肽。多胜肽的安定性可利用數種方法分析。例如，可用肽酶(peptidases)與各種生物介質-例如：人類血漿與血清-測試安定性(參考Verhoefet al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302)。

本發明之胜肽也可敘述為“腫瘤血管內皮標誌8胜肽(TEM8 peptide(s))”或“腫瘤血管內皮標誌8多胜肽(TEM8 polypeptide(s))”。

III.腫瘤血管內皮標誌8胜肽的製備

本發明之胜肽可利用已知的技術製備。例如，可利用重組去氧核糖核酸技術或化學合成合成該胜肽。本發明之胜肽可個別地合成或合成為包含2個或以上之胜肽的較長多胜肽。該胜肽可被分離，即大致上係純化或分離出來而無其他天然產生宿主細胞蛋白質及其片段或其他任何的化學物質。

本發明之胜肽可以選擇的胺基酸序列為基礎然後經由化學合成而獲得。例如，一般的胜肽合成方法可用來合成，包括：(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; (ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976; (iii)Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975; (iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985; (v)Development of Pharmaceuticals (second volume)(in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991; (vi)WO99/67288；以及(vii)Barany G. & Merrifield R. B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。

或者，本發明之胜肽可利用任何已知用以製造胜肽的基因工程法來獲得(例如：Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wuet al. )1983, 101: 347-62)。例如，首先製備一表達形式(expressible form)(例如，對應於一促進劑序列之調節序列的下游)之擁有多核苷酸(該多核苷酸編碼目標胜肽)的適當載體，並將該載體轉換至一適當的宿主細胞內。然後培養該宿主細胞進而產生吾人感興趣的胜肽。該胜肽也可利用in vitro 轉譯系統在in vitro 製造。

IV.多核苷酸

本發明提供一種多核苷酸，其編碼任何上述之本發明的胜肽。該多核苷酸包括衍生自天然產生之腫瘤血管內皮標誌8基因(GenBank Accession No. NM_032208 (SEQ ID NO: 75))的多核苷酸與其具有保留修飾之核苷酸序列(conservatively modified nucleotide sequence)的多核苷酸。此處所述之“保留修飾之核苷酸序列”係指編碼完全相同或大體上相同之胺基酸序列的序列。因為基因密碼的衰亡，造成大量功能性相同的核酸編碼任何指定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG與GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在每個丙胺酸被一密碼子指定的位置上，該密碼子可改變成所述之任何相對應的密碼子而不需改變編碼的多胜肽。該核酸變異體係“寂靜的變異體(silent variations)”，其為一種保留修飾的變異體。本文所述的每一種編碼胜肽的核酸序列也描述核酸之每一種可能的寂靜變異體。具備此技術的人員將辨識到在一核酸(除了AUG之外-其通常為甲硫胺酸的唯一密碼子，以及除了TGG之外-其通常為色胺酸的唯一密碼子)的每一密碼子可經過修飾而產生功能性相同的分子。因此，編碼胜肽之核酸的每一寂靜變異體係含蓄地描述於每一揭露的序列中。

本發明之多核苷酸可由去氧核糖核酸、核糖核酸及其衍生物組成。去氧核糖核酸適當地由鹼基(例如：A、T、C與G)組成，而在核糖核酸中T被U取代。

本發明之多核苷酸可利用或不利用介於中間的間隔胺基酸序列(intervening amino acid sequences)編碼多種本發明的胜肽。例如，該間隔胺基酸序列可提供多核苷酸或轉譯胜肽的分裂位置(例如：酶識別序列)。此外該多核苷酸可在編碼序列(其編碼本發明的胜肽)之外包含任何額外的序列。舉例來說，該多核苷酸可為一重組多核苷酸，其包括表現胜肽所需的調節序列或可為一具有標誌基因與同類物的表現載體(質體)。該等重組多核苷酸一般可經由傳統的重組技術使用聚合酶與內核酸酶等進行多核苷酸的控制而製備。

重組與化學合成技術皆可用以製造本發明的多核苷酸。例如，多核苷酸可經由插入一適當的載體而製得，當該多核苷酸轉染入一適當的細胞時即可表現。或者可利用聚合酶鏈鎖反應(PCR)技術或在適當的宿主中放大多核苷酸(參考Sambrooket al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)。或者，可利用如Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Mattheset al ., EMBO J 1984, 3: 801-5所述的固相技術合成多核苷酸。

V.外吐小體(exosomes)

本發明進一步地提供稱為外吐小體的胞間囊泡(intracellular vesicles)，其呈現形成於本發明之胜肽與人類白血球抗原表面之間的複合物。利用例如Japanese Patent Application Kohyo Publications Nos. Hei 11-510507與WO99/03499所詳述的方法以及從接受治療和/或預防之病人所得的抗原表現細胞可製備外吐小體。本發明之外吐小體可如疫苗般地接種，類似於本發明的胜肽。

包含在複合物中的人類白血球抗原形式必須與接受治療和/或預防之個體的人類白血球抗原形式相符。例如，對於日本人來說，HLA-A24，尤其是HLA-A2402通常為適當的形式。使用高度表現於日本人與高加索人的A-24或A-02形式有助於獲得有效的結果，而A-2402與A-0201等亞型也有其效用。在臨床上，需接受治療之病患的人類白血球抗原形式係進行預先的研究，這可適當地選擇對此抗原具有高度結合親合力的胜肽或經由抗原表現選擇具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽。此外，為了獲得顯現高度結合親合力與細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽，可以天然產生之腫瘤血管內皮標誌8部分胜肽的胺基酸序列為基礎，然後進行1、2或數個胺基酸的取代或添加。

萬一使用A-24形式人類白血球抗原於本發明的外吐小體，含有SEQ ID NO:3、4或9的序列表現其效用，而當使用A-02形式人類白血球抗原時，含有SEQ ID NO:23、25、30、60、63或68的序列表現其效用。

VI.抗原表現細胞(APCs)

本發明也提供抗原表現細胞，該抗原表現細胞於其表面呈現形成於人類白血球抗原與本發明之胜肽之間的複合物。經由接觸本發明之胜肽或載入表現形式之核苷酸(其編碼本發明之胜肽)而獲得的抗原表現細胞可衍生自接受治療和/或預防的病患，並且該抗原表現細胞可如疫苗般單獨地投與或與其他藥物(包括本發明的胜肽、外吐小體或細胞毒性T細胞)同時投與。或者，本發明也提供表現本發明之胜肽的抗原表現細胞與人類白血球抗原，其中之抗原表現細胞經由以下狀況而被誘發：(a)以抗原表現細胞接觸本發明之胜肽，或(b)將一編碼該等胜肽的多核苷酸載入抗原表現細胞以產生抗原表現細胞。

該抗原表現細胞不只限於特定種類的細胞，其包括樹狀細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cells)、巨噬細胞、B細胞與活化的T細胞，已知這些細胞在其細胞表面存在蛋白質的抗原(proteinaceous antigens)以便於被淋巴細胞辨識。由於樹狀細胞係抗原表現細胞當中具有最強之細胞毒性T淋巴細胞誘發活性的代表性抗原表現細胞，因此樹狀細胞可作為本發明的抗原表現細胞。

舉例來說，從週邊血液單核細胞誘發樹狀細胞，然後以本發明之胜肽在體外(in vitro )、活體外(ex vivo )或活體內(in vivo )接觸(刺激)這些樹狀細胞便可得到抗原表現細胞。當將本發明之胜肽投與至個體時，表現本發明之胜肽的抗原表現細胞便在個體體內被誘發。“誘發抗原表現細胞”包括以本發明之胜肽或編碼本發明之胜肽的核苷酸接觸(刺激)一細胞，以表現細胞表面上之人類白血球抗原與本發明之胜肽之間所形成的複合物。或是在將本發明之胜肽載入抗原表現細胞使得該抗原表現細胞表現該胜肽之後，可將該抗原表現細胞如疫苗般地投與至個體。例如，活體外(ex vivo) 的投與可包括以下步驟：a：從第一位個體收集抗原表現細胞；b：以胜肽接觸步驟a的抗原表現細胞以及c：投與該載有胜肽的抗原表現細胞至第二位個體。

第一位與第二位個體可為同一個體或不同個體。或者，本發明提供用來生產誘發抗原表現細胞之藥學組合物的胜肽。另外，本發明也提供用來誘發抗原表現細胞的胜肽。步驟b所得的抗原表現細胞可如疫苗般地投與至個體。

從本發明的觀點來看，抗原表現細胞具有高度的細胞毒性T淋巴細胞誘發性。“高度的細胞毒性T淋巴細胞誘發性”當中的高度係與未以胜肽接觸或以未能誘發細胞毒性T淋巴細胞之胜肽接觸的抗原表現細胞相互比較的程度。該等具有高度細胞毒性T淋巴細胞誘發性的抗原表現細胞可經由一種方法來製備，該方法包括在體外轉移含有多核苷酸(其編碼本發明的胜肽)之基因至抗原表現細胞的步驟。該載入的基因可為去氧核糖核酸或核糖核酸形式。載入的方法包括此技術領域一般所使用的各種方法-例如：脂質體轉染、電轉染與磷酸鈣法等。更具體地說，可使用Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281所述的方法。將基因轉移至抗原表現細胞內，該基因在細胞內進行轉錄、轉譯與類似作用，所得的蛋白質經由第一類或第二類主要組織相容複合體(MHC)處理，然後經過一表現途徑來表現部分的胜肽。

VII.細胞毒性T細胞

被誘發而抵抗任何本發明之胜肽的細胞毒性T細胞加強了活體內標靶腫瘤相關之內皮細胞層的免疫反應，因此該細胞毒性T細胞可作為類似於胜肽的疫苗。因此，本發明提供分離出來的細胞毒性T細胞，該細胞毒性T細胞被本發明之胜肽專一地誘發或活化。本發明提供一分離出來的細胞毒性T細胞， (a)該細胞毒性T細胞被誘發的步驟係以抗原表現細胞(其表現本發明之胜肽與人類白血球抗原)接觸CD⁸⁺ T細胞，或 (b)該細胞毒性T細胞係以核酸(該核酸編碼與本發明之胜肽在人類白血球抗原-A24或人類白血球抗原-A2中結合的T細胞受體次單元多胜肽(TCR subunits polypeptides))轉導。

該等細胞毒性T細胞可經由(1)投與至一個體或(2)在體外以本發明之胜肽接觸(刺激)個體衍生的抗原表現細胞與CD8陽性細胞或週邊血液單核白血球。

細胞毒性T細胞(其由表現本發明之胜肽的抗原表現細胞經由刺激而被誘發)可衍生自接受治療和/或預防的病患，並且可因應調節的目的而單獨投與或與其他藥物(包括本發明的胜肽或外吐小體)共同投與。所獲得的細胞毒性T細胞專一地產生作用並抵抗表現本發明之胜肽或同樣用以產生誘發作用之胜肽的目標細胞。該目標細胞可為內源性表現腫瘤血管內皮標誌8的細胞或為以腫瘤血管內皮標誌8 基因轉染的細胞；而因為被胜肽刺激而在細胞表面表現本發明之胜肽的細胞也可作為被活化之細胞毒性T淋巴細胞攻擊的目標。

VIII.T細胞受體(TCR)

本發明也提供一種包含編碼多胜肽(該多胜肽能夠形成T細胞受體的次單位)之核酸的組合物以及使用該組合物的方法。該T細胞受體次單位能夠形成T細胞受體，該T細胞受體提供T細胞抵抗腫瘤細胞(其表現腫瘤血管內皮標誌8)的專一性。利用此技術中已知的方法可確認以本發明之一個或以上胜肽誘發之細胞毒性T淋巴細胞之T細胞受體次單位-α與β鏈的核酸(WO2007/032255 and Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003))。該衍生的T細胞受體可以高活性結合顯現腫瘤血管內皮標誌8胜肽的目標細胞，並且隨意地在活體內或體外有效地殺死表現腫瘤血管內皮標誌8胜肽的目標細胞。

編碼T細胞受體次單元的核酸可被併入適當的載體中，例如：反轉錄病毒載體。這些載體在此項技術中已為吾人所熟知。該等核酸或含有該有用核酸的載體可轉移至一T細胞中，例如：從病患得來的T細胞。有利之處是本發明提供一現成的組合物，使得病患自身的T細胞(或其他哺乳動物的T細胞)快速地修飾，進而快速且容易地產生具有極佳之癌細胞殺死特性的修飾T細胞。

同時，本發明提供以核酸(該核酸編碼連接至腫瘤血管內皮標誌8胜肽-例如HLA-A24或HLA-A2當中的SEQ ID NOs:3、4、9、23、25、30、60、63與68-的T細胞受體次單元多胜肽)轉導而製備的細胞毒性T細胞。該被轉導的細胞毒性T淋巴細胞在活體內能夠返回癌細胞，並且可藉由吾人所熟知的體外培養方法進行擴增(例如：Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989))。本發明之T細胞可用以形成能有效治療或預防需接受治療或預防之病患之癌症的致免疫組合物(WO2006/031221)。

預防包括任何降低因疾病所造成之死亡或發病的活動。預防可發生在“初級、第二級與第三級的預防”。當初級預防避免了疾病的發展，第二級與第三級的預防活動便著重於預防疾病的惡化與症狀顯現，以及經由恢復功能與降低疾病相關的併發症來降低已發生之疾病的負面影響。或者，預防包括一廣泛的預防治療，其目的在減緩特定疾病的嚴重性，例如：減少腫瘤的增生與轉移、減少血管生成。

癌症的治療和/或預防和/或其術後復發的預防包括任何下列的步驟，例如：手術移除癌細胞、抑制癌細胞的生長、腫瘤的衰退或退化、誘發癌症發生的緩解與抑制作用、腫瘤緩解以及轉移的減少或抑制。有效治療和/或預防癌症會減少死亡率與改善患癌病患的預後、減少腫瘤標記在血液中的含量以及減緩伴隨癌症而來並可查覺的症狀。例如，症狀的減輕或改善係指有效地治療和/或預防包括10%、20%、30%或以上的減輕，或指病況穩定。

IX.藥劑

與正常的組織相比較之下，腫瘤血管內皮標誌8之表現在與腫瘤相關的內皮細胞層內會特別升高(St Croix B et al., Science 2000 Aug 18, 289(5482): 1197-202)，因此本發明之胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸可用來治療和/或預防癌症，和/或預防其術後復發。因此，本發明提供一用來治療和/或預防癌症，和/或預防其術後復發的藥劑，該藥劑包括一個或以上之作為活性成分之本發明的胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸。或者，本發明之胜肽可在任何前述之外吐小體或細胞(例如：作為藥劑的抗原表現細胞)的表面上表現。此外，前述之標靶任何本發明之胜肽的細胞毒性T細胞也可作為本藥劑的活性成分。

本藥劑的作用為疫苗。在本發明中，“疫苗”(也稱為致免疫組合物)一詞係指接種至動物體內後具有引發抗腫瘤免疫性功能的物質。

本發明之藥劑可用以治療和/或預防預防癌症，和/或預防其術後復發，其可適用於個體或病患，包括：人類或任何其他的哺乳動物-包括小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子、狒狒與黑猩猩，特別是經濟上重要的動物或畜產動物，但不只限於此類。

根據本發明，吾人已發現含有SEQ ID NO:3、4或9之胺基酸序列的多胜肽係HLA-A24限定的表位胜肽，其可誘發有效力且專一之抵抗與腫瘤相關的內皮細胞層(tumor-associated endothelium)的免疫反應。因此，包含任何該等多胜肽與SEQ ID NOs:3、4與9胺基酸序列的本發明藥劑特別適合投與至人類白血球抗原為人類白血球抗原-A24的個體。另一方面，吾人已發現含有SEQ ID NO:23、25、30、60、63或68之胺基酸序列的多胜肽係人類白血球抗原-A02限定的表位胜肽，其可誘發有效力且專一之抵抗與腫瘤相關的內皮細胞層的免疫反應。因此，包含任何該等多胜肽與SEQ ID NOs:23、25、30、60、63與68胺基酸序列的本發明藥劑特別適合投與至人類白血球抗原為人類白血球抗原-A02的個體。含有編碼任何該等多胜肽之多核苷酸的藥劑也可作相同的應用。

以本發明之藥劑治療的癌症未受限定，其包括所有形式的癌症，而腫瘤血管内皮標誌8 皆與其相關，這些癌症的例子包括：膀胱癌、腦癌、乳癌、頸癌、膽管細胞癌(cholangiocellular carcinoma)、子宮內膜異位(endometriosis)、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、神經胚細胞瘤(neuroblastoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、卵巢癌、黑色素瘤、胰臟癌、攝護腺癌、腎臟癌、睪丸腫瘤或結腸直腸癌(見第5圖)。

除了前述的活性成分之外，本發明之藥劑還可包含其他能夠誘發細胞毒性T淋巴細胞抵抗癌細胞的胜肽、編碼其他胜肽的其他多核苷酸、表現其他胜肽的其他細胞或同類物。此處所述之能夠誘發細胞毒性T細胞抵抗癌細胞的其他胜肽係以癌專一的抗體(例如：被鑑別的腫瘤相關抗原)為例子，但不因此受到限制。

如果有需要，本發明之藥劑可隨意地包含其他的治療物質作為一活性成分，只要該物質未抑制活性成分(例如：本發明之任何胜肽)在與腫瘤相關的之內皮細胞層上的抗腫瘤作用。例如，處方可包括抗發炎劑、止痛劑、化學治療劑與相似物。除了包含其他的治療物質在藥劑本身之外，本發明之藥劑也可與一個或以上的其他藥學製劑連續或同時投與。藥劑或藥學製劑的量當視使用之藥學製劑的形式、所治療疾病以及投與時程與途徑而定。

吾人應當了解除了此處特別提及的成分之外，本發明之藥劑可包括其他在一般技術當中考慮到處方形式的製劑。

在本發明之一實施例中，本發明之藥劑可包括在含有用以治療疾病(例如：癌症)病理狀態之物質的商品與套組之中。該商品可包括任何該藥劑的容器與標籤。適當的容器包括瓶子、小玻璃瓶與試管。該容器可為各種材質，例如：玻璃或塑膠。在容器上的標籤應標明用以治療或預防一個或以上之病症的製劑。該標籤也可標明投與方式等資訊。

除了上述的容器之外，包含本發明之藥劑的套組可任意地包含第二個貯存藥學上可接受之稀釋劑的容器。該套組可進一步地包含商業上或使用者所認可的其他原料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、針筒以及藥品使用說明。

該藥學組合物也可存在於一包裝或配藥裝置(dispenser device)中，其中含有一個或以上之單位劑量形式的活性成分。該包裝可包括金屬或塑料膜，例如：罩板包裝(blister pack)。依循使用說明可進行該包裝或配藥裝置的投與。

(1)含有胜肽並以其為活性成分的藥劑

本發明之胜肽可作為一藥劑而直接地投與，或者，如果有需要，可以一般的配製方法配製該胜肽。在之後的例子中，除了本發明的胜肽之外，一般用於藥物中的載體、賦形劑與這類物質也可適當地包含其中而沒有特定的限制。該等載體的例子為無菌水、生理食鹽水、磷酸緩衝液、培養液與這類物質。有必要的話，該藥劑還可包含安定劑、懸浮液、防腐劑、介面活性劑與這類物質。本發明之藥劑可用於抗癌症。

本發明的胜肽可配製在一組合中，為了在活體內 誘發細胞毒性T淋巴細胞，該組合包含2個或以上的本發明胜肽。該胜肽可混合在一混合物中，或利用標準技術相互結合。例如，該胜肽可化學連結或表現成單一融合多胜肽序列(single fusion polypeptide sequence)。在組合中的胜肽可以相同或不同。經由投與本發明之胜肽，在抗原表現細胞上之人類白血球抗原(HLA antigens)週邊表現高密度的胜肽，然後專一地與複合物(其形成於顯現之胜肽與人類白血球抗原之間)反應的細胞毒性T淋巴細胞被誘發。或者，從個體移出之抗原表現細胞(例如：樹狀細胞)獲得在其細胞表面表現任何本發明之胜肽的抗原表現細胞，以本發明之胜肽刺激該抗原表現細胞，將這些抗原表現細胞(例如：樹狀細胞)再投與至個體，細胞毒性T淋巴細胞在個體體內被誘發，便可增加對於與腫瘤相關之內皮細胞層的侵害。

該用以治療和/或預防癌症的藥劑(包含作為活性成分的本發明胜肽)可包含一佐劑，如此將可有效地建立細胞的免疫性，或者該等藥劑可與其他活性成分一起投與或可將該等藥劑配製成顆粒(granules)配方並進行投與。佐劑係指當與具有免疫活性之蛋白質同時(或連續地)投與時能夠增加對抗蛋白質之免疫反應的化合物。可使用的佐劑包括文獻(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89)中所述的佐劑。佐劑的例子包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素及其類似物，但不因此受限制。

此外，胜肽連接至數毫米直徑小珠的脂質體劑型、顆粒劑型以及脂質連接至胜肽的劑型也便於使用。

在一些實施例中，本發明之藥劑包含啟動(prime)細胞毒性T淋巴細胞的成分。已確定脂質係能夠在活體內 啟動細胞毒性T淋巴細胞對抗病毒抗原的製劑。舉例來說，棕櫚酸殘基可連接至離胺酸殘基的ε-與α-胺基，然後連接至本發明的胜肽。該脂類胜肽可以合併至脂質體中或在佐劑中乳化，然後以微膠粒或顆粒形式直接地投與。大腸桿菌脂蛋白(例如：tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine (P3CSS))係另一個脂質啟動細胞毒性T淋巴細胞反應的例子，當大腸桿菌共價地連接至一適當的胜肽時，大腸桿菌可啟動細胞毒性T淋巴細胞(其例見Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4)。

投與的方法可為口服的、皮膚內的、皮下的、靜脈內注射投與或這類方式以及全身性的投與或局部投與至目標位置的鄰近區域。投與可為單次投與或增加為多次投與。本發明之胜肽的劑量可根據治療的疾病、病患的年紀、體重、投與的方式與這類狀態而適當地調整，其一般劑量為0.001毫克至1000毫克，例如：0.001毫克至1000毫克或0.1毫克至10毫克，並且可數天至數月投與一次。熟悉此技術的人員可選擇一適當的劑量。

(2)含有多核苷酸並以其為活性成分的藥劑

本發明之藥劑也可包含編碼本文揭露之表現形式之胜肽的核酸。此處所稱之“表現形式”係指當多核苷酸載入一細胞時，該多核苷酸將在活體內表現成誘發抗腫瘤免疫性的多胜肽。在一實施例中，吾人感興趣之多核苷酸的核酸序列包括表現該核苷酸所需要的調節元素。可如此裝置該多核苷酸使其適當地插入目標細胞的基因組(同源重組基因盒載體(homologous recombination cassette vectors)例子的描述見Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12)。其例見Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；美國專利案號5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647與WO 98/04720。以去氧核糖核酸為基礎之傳送技術的例子包括“裸露的去氧核糖核酸(naked DNA)”、助益的(布比卡因(bupivacaine)、聚合物、胜肽促成的)傳送、陽離子脂質複合物與顆粒促成的(particle-mediated)(“基因槍”)或壓力促成的傳送(其例見美國專利案號5,922,687)。

本發明之胜肽也可經由病毒或細菌的載體表現。表現載體的例子包括弱病毒宿主(attenuated viral hosts)，例如：牛痘或禽痘。此方法的例子包括使用牛痘病毒為一表現核苷酸序列(其編碼胜肽)的載體。該重組的牛痘病毒經由載入一宿主而表現致免疫的胜肽，並因此引發免疫反應。用於免疫計畫之牛痘載體與方法的例子可見美國專利案號4,722,848。另一載體為卡介苗(BCG, Bacille Calmette Guerin)。卡介苗載體描述於Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60。其他各種用於治療投與或免疫的載體例子-例如：腺與腺相關的病毒載體、反轉錄病毒載體、沙門氏菌傷寒載體、解毒的炭疽熱毒素載體及其類似物-將顯而易見。其例見Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85。

多核苷酸可直接地傳送入一病患(病患直接接受多核苷酸-運送載體(polynucleotide-carrying vector))或非直接地傳送入一病患(首先在體外以吾人感興趣之多核苷酸轉換細胞，然後將該細胞移植入病患體內)。這兩種方式分別為眾人所知的活體內(in vivo )與活體外(ex vivo )基因治療。

基因治療的方法可見Goldspielet al ., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderscn, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215。也可用於本發明之一般所知的重組去氧核糖核酸技術係描述於Ausubelet al ., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993與Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990。

投與的方法可為口服的、皮膚內的、皮下的、靜脈內注射投與或這類方式以及全身性的投與或局部投與至目標位置的鄰近區域。投與可為單次投與或增加為多次投與。在適當載體中或以多核苷酸(其編碼本發明之胜肽)轉換之細胞中的多核苷酸的劑量可根據治療的疾病、病患的年紀、體重、投與的方式與這類狀態而適當地調整，其一般劑量為0.001毫克至1000毫克，例如：0.001毫克至1000毫克或0.1毫克至10毫克，並且可每數天至數月投與一次。熟悉此技術的人員可選擇一適當的劑量。

IIX.使用胜肽、外吐小體、抗原表現細胞與細胞毒性T淋巴細胞的方法

本發明之胜肽與編碼該胜肽的多核苷酸可用以誘發抗原表現細胞與細胞毒性T淋巴細胞。本發明之外吐小體與抗原表現細胞也可用以誘發細胞毒性T淋巴細胞。該等胜肽、多核苷酸、外吐小體與抗原表現細胞也可與任何其他化合物併用，只要該等化合物未抑制它們的細胞毒性T細胞誘發性。因此，任何上述之本發明的藥劑皆可用以誘發細胞毒性T淋巴細胞，另外，那些含有胜肽與多核苷酸的藥劑也可如以下所述地用以誘發抗原表現細胞。

(1)誘發抗原表現細胞的方法

本發明提供利用本發明之胜肽或編碼該等胜肽之多核苷酸誘發抗原表現細胞的方法。抗原表現細胞的誘發可依循之前“VI.抗原表現細胞”段落中所述的方法進行。本發明也提供一種誘發具有高度細胞毒性T淋巴細胞誘發性之抗原表現細胞的方法，該誘發作用也描述於之前的“VI.抗原表現細胞”段落中。較佳的情況是本發明提供一種誘發具有高度細胞毒性T淋巴細胞誘發性之抗原表現細胞的方法，其中，該方法包括以下步驟：以抗原表現細胞接觸本發明之胜肽，或將編碼該胜肽的多核苷酸載入抗原表現細胞，進而產生以人類白血球抗原表現本發明之胜肽的抗原表現細胞。

(2)誘發細胞毒性T淋巴細胞的方法

此外，本發明提供使用本發明之胜肽、編碼該胜肽之多核苷酸或表現該胜肽之外吐小體或抗原表現細胞誘發細胞毒性T淋巴細胞的方法。在一較佳實施例中，該方法包括以下步驟：(a)以人類白血球抗原表現本發明之胜肽的抗原表現細胞，或(b)將一基因(其包含一編碼本發明之胜肽的多核苷酸)載入一抗原表現細胞而被誘發的抗原表現細胞接觸CD⁸⁺ T細胞。當投與本發明之胜肽至一個體時，細胞毒性T淋巴細胞在個體體內被誘發，然後標靶與腫瘤相關之內皮細胞層的免疫反應強度增加。或者，該胜肽與編碼該胜肽的多核苷酸可用於活體外 的治療法，在此方法中，在體外以本發明之胜肽接觸(刺激)由個體衍生的抗原表現細胞與CD8陽性細胞或週邊血液單核白血球，然後在誘發細胞毒性T淋巴細胞後，將該活化的細胞毒性T淋巴細胞植回該個體。例如，該方法可包括以下步驟：a：由個體收集抗原表現細胞，b：以胜肽接觸步驟a的抗原表現細胞，C：將步驟b的抗原表現細胞與CD⁸⁺ T細胞混合，並且共同培養以誘發細胞毒性T淋巴細胞，以及d：從步驟c的共同培養物收集出CD⁸⁺ T細胞。

或者，本發明提供使用本發明之胜肽製造一誘發細胞毒性T淋巴細胞的藥學組合物。另外本發明也提供用以誘發細胞毒性T淋巴細胞的本發明胜肽。步驟d所得之具有細胞毒性的CD⁸⁺ T細胞可如疫苗般投與至個體。在步驟c與CD⁸⁺ T細胞混合的抗原表現細胞也可經由“VI.抗原表現細胞”段落所詳述的方法製備，其製備係將為本發明之胜肽編碼的基因轉移入抗原表現細胞；但此方法並不因此受限，任何能夠有效表現該等胜肽至T細胞的抗原表現細胞或外吐小體皆可用於本發明中。

雖然吾人可使用類似於或相等於此處所述的方法與材料實行或測試本發明，但以下仍將描述適當的方法與材料。所有本文所提及的出版物、專利申請書、專利與其他的參考文獻皆以引用的方式全部併入本文中。本說明書(包括定義)將可控制不一致的例子。此外，所有的材料、方法與實施例將只作為例證，並不因此限制本發明。

以下的實施例將說明本發明並協助具有一般技術的人員重複該等試驗。這些實施例並不以其他任何方式限制本發明的範圍。

實施例材料與方法 細胞株

將EB病毒(Epstein-bar virus)轉化成人類白血球抗原-A24陽性人類B淋巴細胞，建立A24淋巴母細胞株(A24lymphoblastoid cell line)(A24LCL)細胞。自ATCC購買T2(人類白血球抗原-A2)、人類淋巴母細胞株、COS7與CT26、小鼠結腸直腸癌細胞株。自Cell Resource Center for Biomedical Research, Tohoku University購買 RLmalel小鼠淋巴瘤細胞株。

衍生自腫瘤血管內皮標誌8(TEM8)之候選胜肽的選擇

利用結合預測軟體"BIMAS"(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)預測結合至人類白血球抗原-A﹡2402與人類白血球抗原-A﹡0201分子之TEM8所衍生的9-mer與10-mer胜肽，該軟體系統描述於Parker KCet al. (J Immunol 1994, 152(1): 163-75)與Kuzushima Ket al. (Blood 2001, 98(6): 1872-81)。這些胜肽係由Sigma(Sapporo, Japan)根據標準固相合成法合成並經由逆相高效液相層析法純化。以分析的高效液相層析法與質譜分析分別確定該等胜肽的純度與特性。將20毫克/毫升的胜肽溶於二甲基亞碸並貯存在攝氏-80度。

體外之細胞毒性T淋巴細胞的誘發

將單核白血球衍生的樹狀細胞作為抗原表現細胞，以誘發對抗存於人類白血球抗原上之胜肽所引起的細胞毒性T淋巴細胞反應。如(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8)所述的在體外產生樹狀細胞。具體地來說，經由Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液從一正常志願者分離出來的週邊血液單核細胞(PBMCs)(HLA-A﹡2402或HLA-A﹡0201陽性)係經由黏附至一塑膠組織培養皿(Becton Dickinson)(便於以單核白血球片段培養)而分離。將該單核白血球滋養的族群培養在含有2%熱不活化自體血清(autologous serum，AS)的AIM-V Medium (Invitrogen)，其中含有1000單位(U)/毫升的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CM-CSF))(R&D System)與1000單位/毫升的介白素(interleukin，IL)-4(R&D System)。培養7天之後，在攝氏37度的AIM-V Medium中以含有3微克(micrograms)/毫升之β2微球蛋白之20毫克/毫升之每一合成的胜肽衝擊該細胞介素誘發的樹狀細胞3小時。產生的細胞似乎在其細胞表面上表現與樹狀細胞相關的分子，例如：CD80、CD83、CD86與第二類人類白血球抗原(未顯示數據)。然後利用Mitomycin C(MMC)(以30微克/毫升進行30分鐘)使這些受胜肽衝擊的樹狀細胞失活，並且將其以1:20的比例與自體CD⁸⁺ T細胞混合，然後以CD8 Positive Isolation Kit (Dynal)選擇陽性反應的樹狀細胞。將這些培養物置於48孔的孔盤中，每一孔含有0.5毫升的AIM-V/2%自體血清培養基，另外含有1.5x10⁴ 個胜肽衝擊的樹狀細胞、3x10⁵ 個CD⁸⁺ T細胞與10奈克(ng)/毫升的介白素-7。3天之後，以介白素-2(CHIRON)補給這些培養物至最後濃度為20國際單位(IU)/毫升。在第7天與第14天進一步地以自體胜肽衝擊的樹狀細胞刺激該T細胞。這些樹狀細胞每一次皆以上述的相同方法製備。在第21天第3回合的胜肽刺激之後測試抵抗胜肽衝擊之A24LCL細胞的細胞毒性T淋巴細胞(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。

細胞毒性T淋巴細胞的擴增程序

利用類似於Riddell等人所述的方法(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)在培養基中擴增細胞毒性T淋巴細胞。總數為5x10⁴ 的細胞毒性T淋巴細胞與2種人類B淋巴母細胞株懸浮於25毫升的AIM-V/5%自體血清培養基中，在40奈克/毫升之抗CD3單株抗體(Pharmingen)存在下利用MMC使細胞失活。在開始培養1天之後，將120國際單位/毫升之介白素-2添加至該培養物中。在第5、8與11天以含有30國際單位/毫升之介白素-2的新鮮AIM-V/5%自體血清培養基供給該培養物(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。

細胞毒性T淋巴細胞株的建立

在96圓底微量滴定盤中作0.3、1與3倍的細胞毒性T淋巴細胞/孔的稀釋(Nalge Nunc International)。細胞毒性T淋巴細胞與1×10⁴ 個細胞/孔的2種人類B淋巴母細胞株、30奈克/毫升的抗CD3抗體與125單位/毫升的介白素-2在總量為150毫升/孔之含有5%自體血清的AIM-VMedium當中一起培養。10天之後將50微升/孔之介白素-2添加至該培養基，使介白素-2的最後濃度為125單位/毫升。在第14天測試細胞毒性T淋巴細胞的活性，利用上述的相同方法擴增細胞毒性T淋巴細胞株(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。

專一的細胞毒性T淋巴細胞活性

為了檢視細胞毒性T淋巴細胞的專一活性，吾人進行干擾素-γ酶連結免疫斑點(ELISPOT)分析與干擾素-γ酵素連結免疫吸附法(ELISA)。具體地來說，胜肽衝聲的A24LCL(1x10⁴ /孔)係製備成刺激物細胞(stimulator cells)。在限制稀釋之後，在48孔中的培養細胞或細胞毒性T淋巴細胞株係作為反應物細胞(responder cells)。在製造程序之下進行干擾素γELISPOT分析與干擾素γ酵素連結免疫吸附法分析。

在BALB/c小鼠中之表位胜肽的致免疫性

為了啟動胜肽專一的細胞毒性T淋巴細胞，利用100毫升的疫苗混合物(每隻小鼠含有50微升之人類白血球抗原-A24限制的胜肽(HLA-A24 restricted peptide)與50微升的不完全佐劑(IFA))提供免疫作用。在第0天時將疫苗從皮下注射入小鼠的右腹提供第一次的免疫作用，在第7天時將疫苗注射入小鼠的左腹提供第二次的免疫作用。第14天將接受接種之小鼠的脾細胞取出作為反應物細胞，而以胜肽或不以胜肽衝擊的RLmalel細胞則作為干擾素γ ELISPOT分析的刺激物細胞。

活體內的抗腫瘤作用

在第7天與第0天時利用不完全佐劑結合的胜肽進行接種。第0天時將CT26細胞(每隻小鼠5x10⁴ 個細胞)經由皮下注射入BALB/c小鼠的右腹。以兩垂直直徑的方式(mm² )測量腫瘤的生長。

結果 衍生自腫瘤血管內皮標誌8(TEM8)之人類白血球抗原-A24結合胜肽的預測

表1由高結合親合力依序顯示TEM8的人類白血球抗原-A﹡2402與人類白血球抗原-A﹡0201結合胜肽。選出並檢測共21個具有人類白血球抗原-A24結合潛力的胜肽以確定表位胜肽(表1a)，以及以類似方式選出並檢測共53個具有人類白血球抗原-A2結合潛力的胜肽以確定表位胜肽(表1b與表1c)。大多數被預測的胜肽未細胞毒性T細胞誘發性。因此，本發明著重於顯現細胞毒性T細胞誘發性的胜肽。

啟始位置係指TEM8之N端的胺基酸殘基號碼。結合分數由"BIMAS"得來。

以預測之胜肽(其來自以HLA-A﹡2402或HLA-A﹡0201限制的TEM8)誘發細胞毒性T淋巴細胞以及建立被TEM8衍生之胜肽刺激的細胞毒性T淋巴細胞株

根據“材料與方法”中所述的步驟產生針對衍生自TEM8 之胜肽的細胞毒性T淋巴細胞。以干擾素γ ELISPOT分析法確定胜肽專一的細胞毒性T淋巴細胞活性(第1a-1圖)。與對照孔相比較之下，TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO:3)、TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)、TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO: 9)、TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO: 23)、TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO: 25)、TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO: 30)、TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO: 60)、TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO: 63)與TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO: 68)產生有效力的干擾素γ。此外，在陽性孔號碼#5以SEQ ID NO: 3刺激的細胞、在#6以SEQ ID NO: 4刺激的細胞、在#3以SEQ ID NO: 9刺激的細胞、在#3以SEQ ID NO: 23刺激的細胞、在#6以SEQ ID NO: 25刺激的細胞、在#3以SEQ ID NO: 30刺激的細胞、在#2以SEQ ID NO: 60刺激的細胞、在#5以SEQ ID NO: 63刺激的細胞以及在#4以SEQ ID NO: 68刺激的細胞被擴增並建立細胞毒性T淋巴細胞株。以干擾素-γ酵素連結免疫吸附法確認那些細胞毒性T淋巴細胞株的細胞毒性T淋巴細胞活性(第2a-1圖)。結果顯示相對於未以胜肽衝擊的目標細胞，所有的細胞毒性T淋巴細胞株對於以相對應之胜肽衝擊的目標細胞產生有效力的干擾素γ。另一方面，經由表1顯示的其他胜肽刺激無法建立細胞毒性T淋巴細胞株，儘管那些胜肽與人類白血球抗原-A﹡2402或人類白血球抗原-A﹡0201具有可能的結合活性。例如，第1j圖與第2j圖顯示以TEM8-A02-9-207(SEQ ID NO: 46)刺激之細胞毒性T淋巴細胞反應的典型陰性數據。因此，有9個衍生自TEM8的胜肽被篩選為能夠誘發有效力之細胞毒性T淋巴細胞株的胜肽。

抵抗TEM8專一胜肽之細胞毒性T淋巴細胞株的建立

此外，如“材料與方法”中所述的從每一細胞毒性T淋巴細胞株進行限制的稀釋，進而建立細胞毒性T淋巴細胞株。而由於抵抗目標細胞衝擊之胜肽而從細胞毒性T淋巴細胞株產生的干擾素γ可由干擾素γ酵素連結免疫吸附法分析確定。。由第三圖之SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25與SEQ ID NO: 63刺激的細胞毒性T淋巴細胞株可確定有效力之干擾素γ的產生。

抵抗內源性表现TEM8與HLA-A﹡2402或HLA-A﹡0201之目標細胞的專一細胞毒性T淋巴細胞活性

檢測誘發來抵抗胜肽並且已建立之細胞毒性T淋巴細胞株之辨識目標細胞(其內源性地表現TEM8 與HLA-A﹡2402分子)的能力。將被相對應之胜肽引發的細胞毒性T淋巴細胞株作為效應物細胞(effector cells)，檢測細胞毒性T淋巴細胞對於COS7細胞(同時以全長的TEM8與HLA-A﹡2402分子基因(目標細胞特定模式，其內源性地表現TEM8與 HLA-A﹡2402基因)轉染該COS7細胞)的專一活性。以全長之TEM8 基因或HLA-A﹡2402轉染COS7細胞，其為對照組。第4a圖顯示細胞毒性T淋巴細胞對於同時以TEM8 與HLA-A24轉染的COS7細胞顯現有效力的活性。另一方面，在對照組中未偵測到顯著的細胞毒性T淋巴細胞專一活性。另外也檢測誘發來抵抗HLA-A2限制之胜肽(HLA-A2 restricted peptides)並且已建立之細胞毒性T淋巴細胞株之辨識目標細胞(其內源性地表現TEM8 與HLA-A﹡0201分子)的能力。檢測細胞毒性T淋巴細胞對於COS7細胞(同時以全長的TEM8與HLA-A﹡0201分子基因轉染該COS7細胞)的專一活性。將相對應之HLA-A2限制之胜肽所誘發的細胞毒性T淋巴細胞株作為效應物細胞。以全長之TEM8基因或HLA-A﹡0201基因轉染COS7細胞，其為對照組。第4b圖顯示以SEQ ID NO: 63刺激的細胞毒性T淋巴細胞對於同時以TEM8與HLA-A2轉染的COS7細胞顯現有效力的活性。另一方面，在對照組中未偵測到顯著的細胞毒性T淋巴細胞專一活性。因此，這些數據清楚地證明SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 63係與HLA-A﹡2402或HLA-A﹡0201分子自然地表現在目標細胞上，並且被細胞毒性T淋巴細胞所辨識。此外，這兩種衍生自TEM8的胜肽係表位胜肽，其能夠誘發細胞毒性T淋巴細胞並且可將癌症疫苗用於具有TEM8 表現細胞的病患。

在BALB/c小鼠中之表位胜肽的致免疫性

對BALB/c小鼠進行SEQ ID NO: 4的免疫作用以評估 TEM8表位胜肽的致免疫性。在第二次注射胜肽與不完全佐劑之後，以干擾素γ ELISPOT分析確定胜肽專一的細胞毒性T淋巴細胞活性。當使用被接種疫苗之小鼠的脾細胞為反應物細胞細胞時，便特別偵測有效力之干擾素γ的產生。第5a圖顯示5隻小鼠當中有4隻(M1、M3、M4與M5)偵測到SEQ ID NO: 4所特有的干擾素γ產生，但在對照小鼠(N1與N2)中未偵測到。這些數據顯示SEQ ID NO: 4在活體內 誘發抵抗胜肽衝擊之目標細胞時所產生的專一細胞毒性T淋巴細胞。

接種TFM8表位胜肽的抗腫瘤作用

為了使用胜肽檢視抗腫瘤作用，吾人利用CT26腫瘤細胞株檢視活體內 的抗腫瘤模式。在第7天與第0天投與SEQ ID NO: 4，在第0天時將CT26結腸直腸癌細胞經由皮下注射入BALB/c小鼠。與對照組相比之下，接種SEQ ID NO: 4之小鼠的腫瘤生長明顯降低(第5b圖)。接種SEQ ID NO: 4小鼠體內之腫瘤生長的抑制作用在統計學上有顯著的差異(P<0.05)。

抗原胜肽的同源性分析

已證明以下列胜肽分別刺激的細胞毒性T淋巴細胞會表現顯著且專一的細胞毒性T淋巴細胞活性。

TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO: 3)，TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)，TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO: 9)，TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO: 23)， TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO: 25)，TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO: 30)，TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO: 60)，TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO: 63)以及TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO: 68)。

此結果可歸因於該等胜肽的序列與衍生自其他已知會使人類免疫系統敏感之分子的胜肽同源。為了排除此可能性，使用BLAST演算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)對這些胜肽序列進行同源性分析，其顯示無一序列具有顯著的同源性。該同源性分析的結果顯示TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO: 3)、TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)、TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO: 9)、TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO: 23)、TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO: 25)、TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO: 30)、TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO: 60)、TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO: 63)與TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO: 68)都分別為獨特的序列，因此，就我們目前所知，這些分子對不相關分子產生非意料之免疫反應的可能性極小。

最後確認衍生自TEM8之新穎的人類白血球抗原-A﹡2402或A﹡0201表位胜肽。此外，吾人已證實TEM8的表位胜肽能用於癌症的免疫治療。

産業的適用性

本發明提供新穎的胜肽，其誘發標靶內皮細胞(其形成於許多與血管生成相關的疾病中)的細胞毒性T淋巴細胞，同時該胜肽為極有效的疫苗。本發明也提供用以治療以及預防與血管生成相關之疾病(例如：腫瘤)的藥劑，其包含作為活性成分的任何胜肽。根據本發明，誘發免疫性所需的胜肽很小(例如：9至10個胺基酸殘基)。因此本發明特別有利，因為可輕易地進行該等胜肽的合成與純化。

所有本文中的的出版物、專利與專利申請書皆以引用的方式併入本發明的描述中。

第1圖係顯示以衍生自TEM8之胜肽所誘發之細胞毒性T淋巴細胞的干擾素-γ ELISPOT分析(IFN-gamma ELISPOT assay)的結果。(e)係以TEM8-A24-9-39(SEQ ID NO:3)刺激#5與#6孔，(b)係以TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO:9)刺激#6孔，(c)係以TEM8-A24-10-277(SEQ ID NO:9)(c)刺激#3孔，(c)係以TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO: 23)刺激#3孔，(e)係以TEM8-A02-9-338(SEQ ID NO: 25)刺激#9號孔，(f)係以TEM8-A02-9-278(SEQ ID NO: 30)刺激#3孔，(g)係以TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO: 60)刺激#2孔，(h)係以TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO: 63)刺激#5孔，(i)係以TEM8-A02-10-333(SEQ ID NO: 68)刺激#4孔中的細胞毒性T淋巴細胞，其分別顯示與對照組比較之後可能之干擾素-γ的產生。相反地，在典型的陰性反應(未誘發細胞毒性T淋巴細胞)中，以TEM8-A02-9-207(SEQ ID NO: 46)刺激的細胞毒性T淋巴細胞未產生對抗胜肽衝擊目標細胞(peptide-pulsed target cells)的特定干擾素-γ(j)。大部分預測的胜肽皆未顯現細胞毒性T淋巴細胞的誘發，因此本發明著重於陽性反應(誘發細胞毒性T淋巴細胞)。在這些圖當中，孔上的方塊區域顯示從相對應之孔中得來的細胞係擴增來建立細胞毒性T淋巴細胞株。在圖中，“＋”代表對抗以適當胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ產生，而“-”代表對抗未以任何胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ產生。

第2圖係顯示對(a)TEM8-A24-9-39 (SEQ ID NO:3)、(b)TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4)、(c)TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9)、(d)TEM8-A02-9-337(SEQ ID NO: 23)、(e)TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO:25)、(f)TEM8-A02-9-278 (SEQ ID NO: 30)、(g)TEM8-A02-10-338(SEQ ID NO: 60)、(h)TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO: 63)與(i)TEM8-A02-10-333 (SEQ ID NO: 68)刺激之細胞毒性T淋巴細胞株的建立結果，此結果係以干擾素-γ酵素連結免疫吸附法分析的結果。其結果證明以每一胜肽刺激而建立的細胞毒性T淋巴細胞株在與對照組比較之後會有效地產生干擾素-γ。相反地，在典型的陰性反應中，以TEM8-A02-9-207(SEQ ID NO: 46)建立的細胞毒性T淋巴細胞未產生對抗胜肽衝擊目標細胞(peptide-pulsed target cells)的特定干擾素-γ(j)。在圖中，“＋”代表對抗以適當胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ產生，而“-”代表對抗未以任何胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ產生。

第3圖係顯示以(a)TEM8-A24-9-277 (SEQ ID NO:4)、(b)TEM8-A24-10-277 (SEQ ID NO:9)、(c)TEM8-A02-9-337 (SEQ ID NO: 23)、(d)TEM8-A02-9-338 (SEQ ID NO: 25)與(e)TEM8-A02-10-265 (SEQ ID NO: 63)刺激之細胞毒性T淋巴細胞株建立的結果。以每一胜肽刺激而建立的細胞毒性T淋巴細胞株有效地產生對抗以相對應之胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ。另一方面，對抗未以任何胜肽衝擊的目標細胞時則未產生干擾素-γ。在圖中，“＋”代表對抗以適當胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ產生，而“-”代表對抗未以任何胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ產生。

第4圖係顯示細胞毒性T淋巴細胞對抗內源地表現腫瘤血管內皮標誌與HLA-A﹡2402或HLA-A﹡0201之目標細胞的特定活性。以全長的TEM8基因或以相對應之人類白血球抗原基因(該基因係以衍生自TEM8的不適當胜肽衝擊(pulsing))轉染COS7細胞作為對照組。(a)以TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)建立之細胞毒性T淋巴細胞株顯現細胞毒性T淋巴細胞對抗同時以TEM8與HLA-A24(黑色菱形標誌)轉染之COS7細胞的高度專一活性。另一方面，未偵測到細胞毒性T淋巴細胞對抗表現HLA-A﹡2402(空心三角形標誌)或TEM8(空心圓形)之目標細胞的顯著專一活性。(b)以TEM8-A02-10-265(SEQ ID NO: 63)建立之細胞毒性T淋巴細胞株顯示細胞毒性T淋巴細胞對抗同時以TEM8與HLA-A02(黑色菱形標誌)轉染之COS7細胞的高度專一活性。另一方面，未偵測到細胞毒性T淋巴細胞對抗表現人類白血球抗原-A﹡0201(空心三角形標誌)或TEM8(空心圓形)之目標細胞的顯著專一活性。

第5圖係顯示接種TEM8-A24-9-277胜肽之體內致免疫力(immunogenicity)與抗腫瘤作用。(a)根據“材料與方法”中的步驟檢測體內 TEM8表位胜肽的致免疫力。將結合弗氏不完全佐劑(Incomplete Freund's adjuvant (IFA))的TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)(M1-M5)或只將弗氏不完全佐劑(N1與N2)注射至BALB/c小鼠。在圖中，“＋”代表對抗以胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ產生(黑色長條圖)，而“-”代表對抗未以任何胜肽衝擊之目標細胞時的干擾素-γ產生(白色長條圖)。由接種之小鼠得到的脾細胞產生對抗以TEM8-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)衝擊之RLmalel細胞的干擾素-γ，對於未以任何胜肽衝擊的RLmalel細胞則不產生干擾素-γ。SFC表示斑點形成細胞(spot forming cells)。(b)測試接種TEM8表位胜肽的抗腫瘤作用作為預防的測定。在第7天與第0天將結合TEM88-A24-9-277(SEQ ID NO: 4)的弗氏不完全佐劑(黑色三角形標誌)或未結合胜肽的弗氏不完全佐劑注射(空心菱形標誌)入BALB/c小鼠。在第0天時將5x10⁴ 個CT26(小鼠大腸直腸癌細胞株)經由皮下注射入接種的小鼠。腫瘤的大小係以5隻小鼠的平均值表示。接種表位胜肽表現出腫瘤生長抑制的顯著差異(﹡;P<0.05)。

<110> 腫瘤療法．科學股份有限公司

<120> 腫瘤血管內皮標誌8胜肽及包含此胜肽之疫苗

<130> ONC-A0706-TW

<150> US 60/911,194

<151> 2007-04-11

<160> 76

<170> PatentIn version 3.4

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<213>人類

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Claims

一種九胜肽或十胜肽，其含有一胺基酸序列，該胺基酸序列係擇自下列所組成之族群：SEQ ID NOs：4與9。
一種具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽，其中該胜肽係由一胺基酸所組成，該胺基酸擇自下列所組成之族群：(a)SEQ ID NO：4或9；以及(b)SEQ ID NO：4或9，其中之一或兩個胺基酸被取代。
如申請專利範圍第2項所述之胜肽，其中該胜肽具有至少一取代，該取代係擇自下列所組成之族群：(a)N端的第二個胺基酸係擇自下列所組成之族群：苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸與色胺酸，以及(b)C端的胺基酸係擇自下列所組成之族群：苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸與甲硫胺酸。
一種用以治療及/或預防腫瘤及/或預防其術後復發的藥劑，其中該藥劑包含一或複數個申請專利範圍第1至第3項任一項所述之胜肽或編碼該胜肽之多核苷酸。
如申請專利範圍第4項所述之藥劑，該藥劑係欲投與至一人類白血球抗原為HLA-A24之個體。
如申請專利範圍第5項所述之藥劑，該藥劑係欲治療癌症。
如申請專利範圍第6項所述之藥劑，該藥劑為一疫苗。
一種在複合物表面上存在的外吐小體，該複合物包含申請專利範圍第1至3項任一項所述之胜肽以及一人類白血球抗原。
如申請專利範圍第8項所述的外吐小體，其中該人類白血球抗原為HLA-A24。
如申請專利範圍第8項所述的外吐小體，其中之人類白血球抗原為HLA-A2402。
一種在體外利用申請專利範圍第1至3項中任一項所述之胜肽或編碼該胜肽之多核苷酸誘發一具有高度細胞毒性T淋巴細胞誘發性之抗原表現細胞的方法。
一種在體外利用申請專利範圍第1至3項中任一項所述之胜肽或編碼該胜肽之多核苷酸誘發細胞毒性T淋巴細胞的方法。
一種在體外利用申請專利範圍第1至3中項任一項所述之胜肽或編碼該胜肽之多核苷酸誘發具有高度細胞毒性T淋巴細胞誘發性之抗原表現細胞的方法，其中該方法包括以下步驟：將申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽與一抗原表現細胞接觸，或將一包含一多核苷酸的基因載入一抗原表現細胞，其中該多核苷酸編碼申請專利範圍第1至3項中任一項所述的胜肽。
一種申請專利範圍第1至3項所述之胜肽或其免疫活性片段或編碼該胜肽的多核苷酸之用途，其係用於製造誘發與腫瘤相關之內皮細胞免疫反應之疫苗。
一種在體外誘發細胞毒殺性T淋巴球的方法，藉由包括擇自由下列所組成之群組之至少一步驟的方法： (a)將CD8陽性T細胞與一抗原表現細胞接觸，該抗原表現細胞表現申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽與一人類白血球抗原；以及(b)將CD8陽性T細胞與一抗原表現細胞接觸，該抗原表現細胞係藉由將一基因載入一抗原表現細胞來誘發，該基因包括編碼申請專利範圍第1至3項之任一項所述之胜肽的一多核苷酸。