TWI402072B

TWI402072B - 組織蛋白酶ｓ抑制劑化合物

Info

Publication number: TWI402072B
Application number: TW100136576A
Authority: TW
Inventors: Gary Gang Deng; Konstantinos Gavardinas; Prabhakar Kondaji Jadhav; Euibong Jemes Kim; Matthew Allen Schiffler
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2011-10-07
Publication date: 2013-07-21
Also published as: CN103153989A; AR083364A1; WO2012054315A1; CA2816033C; AU2011318316A1; JP2013540154A; TW201231053A; US20120095020A1; US8227468B2; KR20130093120A; EA201370052A1; BR112013009670A2; MX2013004421A; EP2630141A1; CA2816033A1

Description

組織蛋白酶S抑制劑化合物

本發明係關於蛋白水解酶組織蛋白酶S之抑制劑化合物及包含其投藥之治療方法。特定言之，本發明係關於立體異構體。更特定言之，本發明提供有效、有選擇性及可逆的具有兩個對掌中心之立體異構體抑制劑化合物。

組織蛋白酶S為溶酶體半胱胺酸蛋白酶。其屬於組織蛋白酶的較大家族，該家族包括組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶K、組織蛋白酶V及組織蛋白酶F。對於組織蛋白酶S而言，具有選擇性可避免不當後果，諸如副作用。組織蛋白酶S係由發炎細胞(諸如樹突狀細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞)產生。其牽涉於包括動脈粥樣硬化及腹主動脈瘤(AAA)在內之若干病狀的病理學中(J. Clin. Invest. 1999 ,104(9),1191-1197)(Am. J. Path. 2007 ,170(3),809-817)。

動脈壁之內皮細胞可能由於在動脈壁中引起斑塊形成及累積之若干因素而功能異常，該等因素包括高膽固醇含量、壓力、總體健康及遺傳因素。此功能異常引起自血液中產生及募集發炎細胞，該等細胞穿透動脈壁以免受損。此等發炎細胞最終產生組織蛋白酶S。組織蛋白酶S之一作用為使構成動脈壁之胞外基質蛋白(諸如彈性蛋白及膠原蛋白)降解。儘管細胞之胞外再成型正在進行中以修復受損動脈壁，然若與基質蛋白之沈積相比，出現過多基質的蛋白水解降解，則不平衡可能引起動脈壁內已形成斑塊的不穩定性。過多斑塊不穩定可引起斑塊破裂及潛在地引起血栓相關的事件。因此，組織蛋白酶S之抑制提供治療動脈粥樣硬化的方法。

偶爾，腹主動脈之胞外基質亦可由於過量降解而減弱，引起稱為AAA之病狀。目前，AAA為大於55歲之人死亡的第十個主要原因。不存在指定用於AAA的已知經批准之藥物治療。組織蛋白酶S之抑制提供用於解決此未滿足之醫療需要的選擇。

此外，組織蛋白酶S經由其涉及起始免疫反應之胞內運輸而牽涉於可包括類風濕性關節炎、狼瘡及牛皮癬在內的自體免疫病症中(Immunity ,2001 ,15,909-919)(Eur. J. Immunol . 2005 ,35,2552-2562)。特定言之，組織蛋白酶S在B淋巴細胞及樹突狀細胞中裂解Iip10(p10)以產生CLIP(II類相關之Ii肽)。此允許裝載肽片段(例如自身抗原)及隨後II類主要組織相容性複合體(MHC)分子在抗原呈現細胞之細胞表面上呈現。未成熟T細胞隨後活化，進而導致產生自體免疫反應。因此，組織蛋白酶S之抑制阻斷p10加工及T細胞抗原之表面呈現，進而提供治療自體免疫相關病症(諸如類風濕性關節炎、牛皮癬及狼瘡)的方法。

因此，本發明提供式(I)化合物：

其中Z為-CH₂ -、-CH₂ CH₂ -、-OCH₂ -、-CH₂ CH₂ CH₂ -或-OCH₂ CH₂ -；R¹ 為H、F或Cl；R² 為H、甲基、乙基、丙基或異丙基；或其醫藥學上可接受之鹽。

本發明之一態樣提供一種醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。

本發明之另一態樣提供治療AAA之方法，其藉由投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物。本發明之另一態樣提供治療哺乳動物(諸如人類、犬、貓、牛、馬、羊或猴)之AAA的方法，其藉由投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物。本發明之另一態樣提供治療主動脈直徑大於約3 cm之正常直徑但不到約5 cm且不需要手術或血管內修復之人類AAA的方法，其藉由投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物。本發明之另一態樣提供治療主動脈直徑大於約5 cm但手術或血管內修復並非治療選項之人類AAA的方法，其藉由投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物。

本發明之另一態樣提供治療哺乳動物(諸如人類、犬、貓、牛、馬、羊或猴)之斑塊不穩定的方法，其藉由投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物。

本發明之另一態樣提供治療哺乳動物(諸如人類、犬、貓、牛、馬、羊或猴)之動脈粥樣硬化的方法，其藉由投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物來達成。

本發明之另一態樣提供治療有需要之哺乳動物(諸如人類、犬、貓、牛、馬、羊或猴)之自體免疫病症的方法，其藉由投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物來達成。本發明之另一態樣提供治療人類之牛皮癬、類風濕性關節炎或狼瘡的方法，其藉由投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽或包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的醫藥組合物來達成。

本發明之另一態樣提供一種化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於療法。本發明之另一態樣提供一種化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療腹主動脈瘤、斑塊不穩定、動脈粥樣硬化或自體免疫病症(諸如類風濕性關節炎、牛皮癬及狼瘡)。本發明之另一態樣為化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療腹主動脈瘤、斑塊不穩定、動脈粥樣硬化或自體免疫病症(諸如類風濕性關節炎、牛皮癬及狼瘡)之藥物。

本發明之另一態樣提供一種醫藥組合物，其包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽合併一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及視情況選用之一或多種其他治療劑。

本發明之另一態樣提供本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療腹主動脈瘤、斑塊不穩定、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬及狼瘡。

本發明之另一態樣提供本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療腹主動脈瘤、斑塊不穩定、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬及狼瘡之藥物。

在本發明中，抑制劑化合物之實施例及包含其投藥的治療方法包括如上所述之R₁ 、R₂ 及Z的任何組合。特定言之，本發明之一實施例係關於式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R₁ 為H或F。更特定言之，本發明之一實施例係關於式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R₁ 為F。

本發明之另一實施例為式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R₂ 為甲基或乙基。特定言之，本發明之一實施例為式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R₂ 為甲基。

本發明之另一實施例係關於式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z為-CH₂ -、-CH₂ CH₂ -、-OCH₂ -、-CH₂ CH₂ CH₂ -或-OCH₂ CH₂ -。特定言之，本發明之一實施例為式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z為-CH₂ CH₂ -或-OCH₂ -。本發明之其他實施例由如下組合組成，在該組合中R₁ 為H或F，R₂ 為甲基或乙基且Z為-CH₂ CH₂ -或-OCH₂ -。

如下文所例示，本發明之較佳化合物為：N-甲基胺基甲酸[(3R,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-3-基]酯，N-甲基胺基甲酸[(1S,2S)-1-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-7-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]萘滿-2-基]酯，N-甲基胺基甲酸[(1S,2S)-1-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]茚滿-2-基]酯，N-甲基胺基甲酸[(8S,9S)-9-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-6,7,8,9-四氫-5H-苯并[7]輪烯-8-基]酯，及N-甲基胺基甲酸[(4S,5S)-5-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-7-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-2,3,4,5-四氫-1-苯并氧呯-4-基]酯。

本發明之更佳化合物為：N-甲基胺基甲酸[(3R,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-3-基]酯，N-甲基胺基甲酸[(1S,2S)-1-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-7-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]萘滿-2-基]酯，及N-甲基胺基甲酸[(8S,9S)-9-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-6,7,8,9-四氫-5H-苯并[7]輪烯-8-基]酯。

本發明之最佳化合物為：N-甲基胺基甲酸[(3R,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-3-基]酯。

如以上所用及在本發明之說明書中，除非另外指明，否則以下術語將具有以下含義：如本文所用之術語「腹主動脈瘤」(或「AAA」)將意謂哺乳動物中腹主動脈的局部擴張或凸起，造成至少腹主動脈區段之尺寸超出在其他情況下所認為之正常狀態的尺寸。腹主動脈可以包括(但不限於)管腔直徑、管腔周長及管腔面積的任何量測尺寸表示來量測及比較。量測及診斷方法可經由使用超音波、CT掃描或其他成像技術來達成。舉例而言，當主動脈直徑大於其正常直徑(約3 cm)時，AAA存在於人體內。然而，若主動脈直徑大於約5 cm，則立即手術或血管內修復(支架或移植)成為護理標準以防止破裂及潛在死亡。然而，若該治療由於任何原因(例如年齡)而不可用或並非選擇，則亦可使用本發明來治療此群體。

如本文所用之術語「有需要」將意謂具有或經診斷具有需要治療的病狀，例如動脈粥樣硬化、AAA、自體免疫病症(諸如牛皮癬、狼瘡或類風濕性關節炎)。

如本文所用之術語「哺乳動物」將意謂人類或非人類哺乳動物，諸如犬、貓、牛、馬、羊或猴。

術語「其醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之鹽。實例及其製備方法完全在熟習此項技術者之知識範圍內。參見例如Stahl等人，「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties,Selection and Use,」VCHA/Wiley-VCH,2002。

術語「治療有效量」係指式(I)化合物或包含式(I)化合物之組合物達成治療的量或劑量。治療有效量可易於由主治醫師(作為熟習此項技術者)藉由考慮熟習此項技術者已知之多種因素，諸如患者之體重、身高、年齡、一般健康狀況、病狀之嚴重程度、投藥模式、給藥方案等來決定。

如本文所用之術語「治療」將意謂減緩疾病病況之速率或進程。其亦可包括停止疾病病況。該術語可進一步包括不僅停止疾病而且亦減少任何已出現之疾病病況。舉例而言，在AAA之情形中，術語「治療」可意謂減緩腹主動脈瘤之擴張速率。其亦可包括停止腹主動脈瘤之擴張。此外，其可包括減少任何已出現之擴張。

符號「」係指向頁平面前方伸出的鍵。

符號「」係指向頁平面後方伸出的鍵。

在「Z」之定義內，術語「-OCH₂ -」及「-OCH₂ CH₂ -」應理解為意謂氧與稠合苯并環相鄰。

本發明化合物較佳經調配為醫藥組合物。實例及其製備方法完全在熟習此項技術者之知識範圍內。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy(A. Gennaro等人編，第19版，Mack Publishing Co.,1995)。

式I化合物或其鹽可藉由此項技術中已知之多種程序以及以下流程、製備及實例中所描述之彼等程序來製備。所描述之各途徑的特定合成步驟可以不同方式組合來製備式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。

以下製備及實例進一步說明本發明且表示式(I)化合物(包括如以上一般描述之任何新穎化合物)的典型合成。一般技術者容易地獲得或可容易地合成試劑及起始物質。應瞭解製備及實例係以說明而非限制之方式進行闡述，且可由一般技術者進行各種修改。

本發明化合物之R組態或S組態可由標準技術(諸如X射線分析)測定且可與對掌性HPLC滯留時間相關聯。一般使用IUPAC命名特徵依Symyx Isentris第3.2.3版完成以下製備及實例之命名。

如本文中所用，以下術語具有所指示之含義：「AcOH」係指乙酸；「BCA」係指二喹啉甲酸；「b.i.d.」係指每天兩次；「鹽水」係指飽和NaCl水溶液；「cat.」係指催化量；「CD74」係指不變鏈(Ii)；「CDI」係指1,1'-羰基二咪唑；「DMAP」係指4-二甲基胺基吡啶；「DMSO」係指二甲亞碸；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「EtOH」係指乙醇；「hr.」係指小時；「IC₅₀ 」係指藥劑產生針對該藥劑可能出現的最大抑制反應之50%的濃度，或藥劑產生與受體結合之配位體之50%置換的濃度；「IMAC」係指固定化金屬親和性層析法；「IPA」係指異丙醇；「LC ES/MS」係指液相層析電噴霧質譜分析；「MCPBA」係指間氯過氧苯甲酸；「MeOH」係指甲醇；「min.」係指分鐘；「NBS」係指N-溴代丁二醯亞胺；「NMP」係指N -甲基吡咯啶；「N/A」係指無法獲得；「p10」係指不變鏈CD74之片段；「PBS」係指磷酸鹽緩衝生理食鹽水；「PWBC」係指周邊白血球；「RFU」係指相對螢光單位；「SFC」係指超臨界流體層析法；「STAB」係指三乙醯氧基硼氫化鈉；「SDS」係指十二烷基硫酸鈉；「THF」係指四氫呋喃；「t-boc」或「boc」係指第三丁氧羰基；「TRITONX-100」係指聚乙二醇對(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚。

除非另外指明，否則取代基係如先前所定義。

流程1

中間體(3)之形成可根據如流程1中所述之反應來進行。

在流程1步驟A中，以NBS處理6-溴-2H-烯，形成溴醇(1)。較佳條件為在約0℃至50℃下、但更佳在室溫下使用DMSO/水之溶劑混合物。

在步驟B中，以氫氧化銨處理溴醇(1)，提供胺基醇(2)。舉例而言，在室溫至60℃下，溴醇與氫氧化銨在THF及EtOH之溶劑混合物中反應4小時至24小時。

在流程1步驟C中，外消旋胺基醇經解析為其3R,4S及3S,4R對映異構體，提供對掌性胺基醇(3)。用於解析之方法通常為熟習此項技術者所已知且包括以對掌性酸之鹽形式結晶或藉由對掌性層析法分離對映異構體。

6-溴-2H-烯為市售的或可利用此項技術中通常已知之方法製備。舉例而言，可將6-溴-4-色滿酮還原為醇且隨後消除，得到6-溴-2H-烯。

流程2

流程2中描述式(7)之中間體之合成。

在流程2步驟A中，以MCPBA氧化式(4)之環狀烯烴，得到式(5)之環氧化物。反應在鹵化溶劑之兩相混合物，諸如二氯甲烷及鹼水溶液(諸如碳酸氫鈉水溶液)中進行。在-10℃至10℃下分數份添加MCPBA，且使反應在攪拌下升溫至室溫並維持1小時至8小時。若需要，則再添加MCPBA。

在步驟B中，以氨處理式(5)之環氧化物，形成式(6)之外消旋胺基醇。較佳條件為使用密封容器以及惰性溶劑(諸如THF)且添加含氨之MeOH。反應在50℃至100℃下加熱並維持1天至4天，必要時再添加氨。

在流程2步驟C中，如先前在流程1步驟C中所述，外消旋胺基醇(6)經解析為式(7)之對掌性胺基醇。舉例而言，1-胺基-7-溴-萘滿-2-醇(Y=-CH₂ -)藉由用(+)-二-1,4-甲苯甲醯基-D-酒石酸結晶而經解析。可藉由用鹼水溶液處理鹽來獲得游離胺，得到(1S,2S)-胺基醇(其中Y=-CH₂ -)。或者，可將外消旋物質(6)帶入最終產物中，且利用對掌性層析法分離對映異構體。

熟習此項技術者將瞭解，式(4)之環狀烯烴可容易地在市面上獲得或利用文獻中已知之方法獲得。舉例而言，可將相應酮還原為醇且隨後消除，得到烯烴。

流程3

中間體(11)之形成可根據如流程3中所述之反應來進行。

在流程3步驟A中，根據關於1R,2R對映異構體之文獻(US 7,326,731 B2)中所含的程序，藉由在5%鈀/碳上氫化而自硝基茚滿(8)獲得胺基茚滿(9)。

在步驟B中，使用山德邁耳(Sandmeyer)反應將胺基茚滿(9)轉化為碘茚滿(10)。使用對甲苯磺酸及亞硝酸鈉水溶液在溶劑(諸如乙腈)中當場形成重氮鹽。隨後在0℃至30℃之溫度下以碘化鉀水溶液處理重氮鹽0.5小時至6小時，提供碘茚滿(10)。

在步驟C中，在酸性條件(諸如HCl或三氟乙酸)下使經第三丁氧羰基保護之碘茚滿(10)變為碘胺基茚滿(11)。引入及移除氮保護基之方法為此項技術中所熟知(參見例如Greene及Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis ，第3版，John Wiley and Sons,New York,(1999))。較佳條件為在0℃至25℃下使用含HCl之二噁烷並維持0.5小時至4小時。

N-[(1S,2S)-6-胺基-2-羥基-茚滿-1-基]胺基甲酸第三丁酯(8)可利用此項技術中已知之方法製備。舉例而言，可以六個步驟自茚獲得外消旋反式 -1-胺基-6-硝基茚滿-2-醇(Adv. Synth. Catal. 2005 ,347 ,255-265)。該外消旋物質經解析且分離為(+)-L-杏仁酸之1R,2R鹽及1S,2S鹽。1S,2S鹽經釋放為1S,2S-反式-1-胺基-6-硝基茚滿-2-醇，且胺隨後經保護為胺基甲酸第三丁酯，得到如對掌性HPLC所分析大於97%ee的物質。

流程4

式I之本發明化合物的形成可根據如流程4中所述之反應來進行。

在流程4步驟A中，使式(12)之胺基醇(對掌性或外消旋)醯化，得到式(13)之醯胺。使用羧酸或酸氯化物的各種醯化方法為此項技術中所熟知。較佳條件使用適當苯甲醯氯於THF與碳酸氫鈉水溶液之溶劑混合物中在0℃至25℃之溫度歷時1小時至8小時。若起始胺基醇用作對掌性酸之鹽，則使用足夠鹼以產生游離胺。

在步驟B中，使用碘化銅(I)及配位體(諸如對稱二甲基伸乙基二胺)將式(13)之溴醯胺或碘醯胺與經保護之2-側氧基(_o xo)-哌嗪偶合，提供式(14)之側氧基哌嗪。反應較佳在密封容器中在惰性氛圍下在無機鹼(諸如碳酸鉀)存在下進行。反應在惰性溶劑(諸如NMP)中在80℃至150℃之溫度進行。

在流程4步驟C中，側氧基哌嗪在苯甲醯胺存在下選擇性還原，提供式(15)之哌嗪。該反應係使用還原劑(諸如硼烷-二甲硫複合物)在惰性溶劑(諸如THF)中在0℃至40℃之溫度歷時1小時至4小時完成。額外的硼烷-二甲硫複合物可用於驅使反應完成。

或者，在步驟D中，在偶合反應中使用N-第三丁氧羰基哌嗪使哌嗪直接與碘醯胺或溴醯胺(13)反應。反應在Pd催化劑(諸如氯化烯丙基鈀(II)二聚體)及配位體(諸如四氟硼酸三第三丁基鏻)存在下進行。使用鹼(諸如第三丁醇鈉)於惰性溶劑(諸如DMSO)中在20℃至120℃之溫度歷時0.5小時至8小時，提供式(15)之哌嗪。

在步驟E中，移除第三丁氧羰基保護基，得到未經保護的式(16)之哌嗪。用於移除第三丁氧羰基之酸性條件(諸如含HCl之二噁烷)為此項技術中所熟知。

隨後，在步驟F中，使未經保護的胺(16)與3-氧雜環丁酮進行還原胺化反應，提供式(17)之氧雜環丁基哌嗪。用於完成還原胺化之各種方法為此項技術中所熟知。較佳條件使用還原劑(諸如三乙醯氧基硼氫化鈉)於惰性溶劑(諸如乙腈)中。反應在0℃至40℃進行約0.5小時至4小時。可再添加三乙醯氧基硼氫化鈉及3-氧雜環丁酮來驅動反應完成。或者，可在分子篩存在下，使用含還原劑(諸如氰基硼氫化鈉)之溶劑混合物(諸如MeOH與冰乙酸)來完成反應。反應在0℃至60℃之溫度下進行約1小時至24小時。

在流程4步驟G中，使氧雜環丁基哌嗪(17)之醇轉化為式I之胺基甲酸酯。熟練技術人員可使用各種用於合成胺基甲酸酯的方法，諸如三光氣/胺、氯甲酸4-硝基苯酯/胺、CDI/胺或直接與經適當取代之異氰酸酯反應。用於本發明化合物(其中Z=-CH₂ -)之較佳方法利用了適當異氰酸酯(O=C=N-R² )。舉例而言，在有機鹼(諸如DMAP或較佳4-吡咯啶基吡啶)存在下，在非質子性溶劑(諸如二氯甲烷、二噁烷或較佳THF)中用異氰酸甲酯處理醇(17)。反應在20℃至70℃下在密封容器中進行約2小時至16小時。可使用CDI/氨、氰酸鈉或異氰酸氯磺醯酯合成本發明化合物，其中胺基甲酸酯部分為第一胺基甲酸酯(R² =H)。其他方法利用含異氰酸三氯乙醯酯之非質子性溶劑。隨後，使用中性Al₂ O₃ 或有機酸(諸如對甲苯磺酸)來裂解三氯乙醯基。用於合成式I之胺基甲酸酯的較佳方法在0℃至25℃下利用含CDI之惰性溶劑(諸如THF)並維持4小時至20小時，當場形成咪唑N-甲酸酯。隨後與適當胺(H₂ NR² )反應，提供式I之胺基甲酸酯。

熟習此項技術者將認識到，上述中間體可以外消旋混合物之形式一起帶入，且在最終步驟時較佳藉由對掌性HPLC進行解析，提供對映異構性純化合物。

製備1 6-溴色滿-4-醇

在室溫下經3小時將硼氫化鈉(221 g，5.84 mol)分數份添加至7-溴-3,4-二氫萘-1(2H)-酮(3.95 kg，17.4 mol)於乙醇(20 L)中之懸浮液中。濃縮澄清紅色溶液。將殘餘物添加至冰(約3 kg)中以形成懸浮液，隨後在攪拌下緩慢添加冰冷卻之0.5 M HCl(10 L)至以上懸浮液中。以甲基第三丁基醚(20 L及5 L)萃取混合物。以飽和碳酸氫鈉水溶液(10 L)及鹽水(2×10 L)洗滌合併之有機相，在減壓下濃縮溶劑且將濕的固體在空氣中乾燥隔夜，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物(4.10 kg，定量)。LC-ES/MS m/z 211[M- H-2O+H]+。

基本上按照製備1中所描述之程序，使用適當的酮來製備下表中之醇。

製備5 6-溴-2H-烯

在室溫下將單水合對甲苯磺酸(95 g，499.42 mmol)添加至6-溴色滿-4-醇(3.98 kg，17.4 mol)於甲苯(18 L)中之溶液中。附接迪恩-斯達克分水器(Dean-Stark trap)且回流3小時50分鐘。使混合物在空氣中冷卻至50℃，且在攪拌下傾入飽和碳酸氫鈉水溶液(10 L)及冰(約3 kg)中。使兩層分離。以甲基第三丁基醚(4 L)反萃取水層。以飽和碳酸氫鈉(10 L)及鹽水(1×10 L)洗滌有機層，且在減壓下蒸發溶劑以獲得呈棕色油狀之標題化合物(4.90 kg，大於100%，含有甲苯)。LCMS m/z(⁷⁹ Br) 209[M+H]⁺ 。

基本上按照製備5中所描述之程序，使用適當的醇來製備下表中之烯烴。

製備9 外消旋反式 -3,6-二溴色滿-4-醇

在室溫下將6-溴-2H-烯(4.90 kg，23.2 mol)添加至DMSO(16 L)與水(2.5 L)之溶液中。經3.5小時分數份添加NBS(3.47 kg，19.5 mol)。將混合物傾入甲基第三丁基醚(12 L)及水(18 L)中，使兩層分離。以飽和碳酸氫鈉(7 L)、水(8 L)及鹽水(2×8 L)洗滌有機層。以甲基第三丁基醚(4 L)反萃取水層，且在減壓下蒸發合併之有機層的溶劑，得到呈紅棕色固體狀的標題化合物(5.10 kg，71%)。

製 備10 (3R,4S)-4-胺基-6-溴-色滿-3-醇

在室溫下將氫氧化銨(13.0 L)一次性添加至外消旋反式-3,6-二溴色滿-4-醇(5.10 kg，16.6 mol)於四氫呋喃(5.0 L)及乙醇(5.0 L)中之溶液中，經2小時緩慢加熱至43℃且繼續加熱14小時。在減壓下濃縮混合物，移除約9 L溶劑。將甲基第三丁基醚(10 L)添加至殘餘漿液中，且在25℃下攪拌混合物3小時。藉由過濾來收集沈澱，相繼以水(2×2 L)及甲基第三丁基醚(3×1.5 L)洗滌以獲得濕的固體。在室溫下在空氣中乾燥隔夜，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物(2.78 kg，69%)。LC-ES/MS m/z(⁷⁹ Br) 244[M+H]⁺ 。藉由以100 g部分在11×33 cm CHIRALPAKAD 20 μm管柱上以100%甲醇與0.2%二甲基乙胺(穩態再循環純化)溶離進行純化來分離對映異構體，得到3S,4R對映異構體(異構體1，1362.5 g，97.4% ee)及標題化合物(異構體2，1323.7 g，97.5% ee)。用於分析性對掌性HPLC分析之條件：4.6×150 mm CHIRALPAKAD-H 5 μm管柱，100%甲醇與0.2%二甲基乙胺，流動速率0.5毫升/分鐘，異構體1 T_R =4.69分鐘，異構體2 T_R =6.27分鐘。

製 備11 外消旋順式-6-溴-1a,2,3,7b-四氫萘并[1,2-b]環氧乙烯

將飽和碳酸氫鈉水溶液(1250 mL)添加至6-溴-1,2-二氫萘(250 g，1.20 mol)於二氯甲烷(3.75 L)中之溶液中，且冷卻至0℃至5℃。分數份添加MCPBA(77%，275 g，1.23 mol，1.03當量)。在0℃至5℃下機械攪拌混合物1.5小時且使之升溫至室溫。在室溫下攪拌約1.5小時，且在室溫下再添加MCPBA(77%，15.0 g，67 mmol，0.05當量)且攪拌約1小時。以二氯甲烷(3750 mL)稀釋混合物且分離各層。以飽和碳酸氫鈉水溶液(3 L)洗滌有機層。將10%亞硫酸氫鈉水溶液(3750 mL)與飽和碳酸氫鈉水溶液(1250 mL)混合，製備最終pH值約為7之溶液。將此溶液添加至二氯甲烷層中，且在室溫下攪拌約10分鐘。分離各層，以飽和碳酸氫鈉水溶液(3 L)及鹽水(3 L)洗滌有機層。在真空中濃縮，得到呈油狀之標題化合物(263 g，98%)。GC/MS m/z(⁷⁹ Br/⁸¹ Br) 224/226[M⁺ ]。

基本上按照製備11中所描述之程序，使用適當的烯烴來製備下表中之環氧化物。

製備14 外消旋反式 -1-胺基-7-溴-萘滿-2-醇

在配備有機械攪拌器之2 L壓力反應器中，將外消旋順式-6-溴-1a,2,3,7b-四氫萘并[1,2-b]環氧乙烯(67.0 g，298 mmol)溶解於四氫呋喃(200 mL)中。添加含7 M氨之甲醇(350 mL)，密封反應器且在70℃下攪拌2天。再添加含7 M氨之甲醇(140 mL)，密封反應器且在70℃下攪拌1天。在真空中濃縮反應漿液，得到殘餘物(68.1 g)。添加乙醚(760 mL)，且在室溫下攪拌漿液約5小時。藉由過濾來收集固體，以乙醚(2×215 mL)沖洗且乾燥隔夜，得到標題化合物(58.1 g，81%)。GC/MS m/z(⁷⁹ Br/⁸¹ Br) 224/226[M-NH₂ ]⁺ 。

基本上按照製備14中所描述之程序，使用適當的環氧化物來製備下表中之胺基醇。

製備17 (1S,2S)-1-胺基-7-溴-1,2,3,4-四氫萘-2-醇(2S,3S)-2,3-雙(4-甲基苯甲醯氧基)丁二酸酯

將(+)-二-1,4-甲苯甲醯基-D-酒石酸(2.30 kg，5.95 mol)一次性添加至外消旋反式 -1-胺基-7-溴-1,2,3,4-四氫萘-2-醇(1.40 kg，5.78 mol)於乙腈(16.0 L)及水(3.50 L)中之溶液中。加熱濃稠懸浮液，在氮氣下回流(77℃)30分鐘。直至約46℃，攪拌器才開始攪拌。關掉油浴加熱，且使混合物在攪拌下冷卻至室溫。5小時後，經由布赫納(Bchner)漏斗過濾濃稠漿液且以乙腈(2 L)沖洗。繼續過濾1小時直至不再收集到溶劑為止。在室溫下在空氣中乾燥濕濾餅隔夜，獲得呈黃色固體狀之所需鹽(1.70 kg)。將固體添加至乙腈(15 L)及水(3.3 L)中，且在氮氣下在攪拌下加熱所得濃稠漿液至回流(77℃)並維持30分鐘。關掉油浴加熱，且使之在攪拌下冷卻至室溫。5小時後，經由布赫納漏斗過濾濃稠漿液且以乙腈(2 L)沖洗。繼續過濾30分鐘，直至不再收集到溶劑為止。在室溫下乾燥濕濾餅48小時，得到呈淺黃色固體狀之所需鹽(800 g，22%)。LC-ES/MS m/z(⁷⁹ Br) 242[M+H]⁺ ，游離鹼。99.0% ee。利用超臨界流體層析法(SFC)測定對映異構體過量之分析條件：管柱：CHIRALPAKAD-H(0.46×250 mm，5 μm)，二氧化碳流動速率：2.55毫升/分鐘，共溶劑：甲醇與0.1%二乙基胺，共溶劑流動速率：0.45毫升/分鐘，反壓力：150巴，管柱溫度：40.9℃。異構體1 T_R =7.36分鐘，0.5%面積，且異構體2(標題化合物)T_R =8.46分鐘，99.5%面積。

製備18 N-[(1S,2S)-6-胺基-2-羥基-茚滿-1-基]胺基甲酸第三丁酯

基本上按照文獻程序(Kozhushkov,S.I.等人，Adv. Synth. Catal. 2005 ,347 ,255-265)，得到大於97% ee之N-[(1S,2S)-2-羥基-6-硝基-茚滿-1-基]胺基甲酸第三丁酯。使用如關於1R,2R對映異構體(US 7,326,731 B2)所描述之相同程序還原硝基，得到標題化合物。

製備19 N-[(1S,2S)-2-羥基-6-碘-茚滿-1-基]胺基甲酸第三丁酯

N-[(1S,2S)-6-胺基-2-羥基-茚滿-1-基]胺基甲酸第三丁酯(25.0 g，94.6 mmol)於乙腈(800 mL)中之懸浮液在冰浴中冷卻30分鐘，且一次性添加單水合對甲苯磺酸(53.97 g，283.7 mmol)。經5分鐘將亞硝酸鈉(13.05 g，189.2 mmol)於水(30 mL)中之溶液分數份添加至混合物中，且攪拌30分鐘。經10分鐘將碘化鉀(39.25 g，236.5 mmol)於水(50 mL)中之溶液逐滴添加至混合物中，且在冰浴中攪拌20分鐘。使混合物升溫至室溫，且攪拌1.5小時。以10%碳酸鈉水溶液製造暗紅色鹼性溶液。在真空中濃縮所得混合物以移除乙腈。藉由過濾來收集棕色沈澱，且在真空烘箱中在50℃下乾燥隔夜，得到標題化合物(33.9 g，96%)。LC-ES/MS m/z 320[M+H]⁺ 。

製備20 N-[(3R,4S)-6-溴-3-羥基-色滿-4-基]-4-氟-苯甲醯胺

在17℃下經15分鐘將4-氟苯甲醯氯(369 mL，3.12 mol)經由加料漏斗逐滴添加至(3R,4S)-4-胺基-6-溴-色滿-3-醇(692 g，2.84)及碳酸氫鈉(476 g，5.67 mol)於四氫呋喃(3.0 L)及水(3.0 L)中之懸浮液中，且攪拌2小時。添加水(2 L)及甲基第三丁基醚(3.5 L)，且攪拌5分鐘。分離有機相，且以水(2 L)及鹽水(2 L)洗滌。經無水硫酸鎂乾燥有機部分且在真空中濃縮，得到淺黃色固體(2.3 kg)。在25℃下在庚烷(5 L)中濕磨固體3小時。藉由過濾來收集且在烘箱中在50℃下乾燥12小時，得到呈白色固體狀之標題化合物(975 g，94%)。LC-ES/MS m/z(⁷⁹ Br/⁸¹ Br) 366/368[M+H]⁺ 。

基本上按照製備20中所描述之程序，使用適當外消旋或對映純胺基醇游離鹼或鹽來製備下表中之醯胺。當使用胺基醇之鹽(製備21)時，使用飽和碳酸氫鈉作為鹼。

製備24 4-氟-N-[(1S,2S)-2-羥基-6-碘-茚滿-1-基]苯甲醯胺

在室溫下將4 M氯化氫於二噁烷(100 mL)中之溶液添加至N-[(1S,2S)-2-羥基-6-碘-茚滿-1-基]胺基甲酸第三丁酯(39.6 mmol，14.9 g)於1,4-二噁烷(200 mL)中之溶液中，且攪拌2小時。在真空中濃縮所得懸浮液，且在真空烘箱中乾燥48小時。將殘餘物溶解於THF(25 mL)中，且於冰浴中冷卻30分鐘。逐滴添加5 M氫氧化鈉水溶液(17.4 mL，87.2 mmol)及4-氟苯甲醯氯(3.78 mL，40.4 mmol)。使溶液升溫至室溫，且攪拌1小時。在真空中濃縮黑色溶液，且以水(50 mL)稀釋。藉由過濾來收集固體且在真空烘箱中在40℃下乾燥隔夜，得到標題化合物(14.4 g，91%)。LC-ES/MS m/z 398[M+H]⁺ 。

製備25 4-[(2S,3S)-3-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-羥基-茚滿-5-基]-3-側氧基-哌嗪-1-甲酸第三丁酯

以氮氣淨化4-氟-N-[(1S,2S)-2-羥基-6-碘-茚滿-1-基]苯甲醯胺(8.70 g，21.9 mmol)、4-N-第三丁氧羰基-2-側氧基-哌嗪(4.61 g，22.3 mmol)及碳酸鉀(6.12 g，43.8)於N-甲基吡咯啶酮(100 mL)中之混合物。添加碘化銅(I)(2.11 g，11.0 mmol)及對稱二甲基伸乙基二胺(2.34 mL，21.9 mmol)。以隔膜密封燒瓶且在100℃下攪拌6小時。將混合物冷卻至室溫，且以乙酸乙酯(100 mL)稀釋。相繼以水(3×100 mL)、鹽水洗滌有機部分，且隨後經硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮至乾。藉由管柱層析(120 g二氧化矽，2%至5%甲醇/氯仿)純化殘餘物，得到標題化合物(7.63 g，74%)。LC-ES/MS m/z 470[M+H]⁺ 。

製備26 4-[(3S,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-3-羥基-萘滿-6-基]-3-側氧基-哌嗪-1-甲酸第三丁酯

基本上按照關於4-[(2S,3S)-3-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-羥基-茚滿-5-基]-3-側氧基-哌嗪-1-甲酸第三丁酯之製備25，使用N-[(1S,2S)-7-溴-2-羥基-萘滿-1-基]-4-氟-苯甲醯胺來製備標題化合物。LC-ES/MS m/z 484[M+H]⁺ 。

製備27 4-[(2S,3S)-3-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-羥基-茚滿-5-基]哌嗪-1-甲酸第三丁酯

4-[(2S,3S)-3-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-羥基-茚滿-5-基]-3-側氧基-哌嗪-1-甲酸第三丁酯(8.85 g，18.9 mmol)於無水四氫呋喃(40 mL)中之溶液在冰浴中冷卻30分鐘，且在氮氣下添加硼烷-二甲硫複合物(2 M，37.7 mL，75.40 mmol)。使混合物升溫至室溫，且攪拌1.5小時。在室溫下添加第二份硼烷-二甲硫複合物(2 M，9.42 mL，18.9 mmol)，且攪拌1小時。在冰浴中冷卻10分鐘，且小心地逐滴添加水，隨後添加飽和碳酸氫鈉溶液(50 mL)。以乙酸乙酯(150 mL)稀釋所得懸浮液。以鹽水洗滌有機部分，經硫酸鈉乾燥，且在真空中濃縮。藉由急驟層析(120 g二氧化矽，40%至50%乙酸乙酯/己烷)來純化粗產物，得到標題化合物(6.8 g，79%)。LC-ES/MS m/z 456[M+H]⁺ 。

製備28 4-[(3S,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-3-羥基-萘滿-6-基]哌嗪-1-甲酸第三丁酯

基本上按照關於4-[(2S,3S)-3-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-羥基-茚滿-5-基]哌嗪-1-甲酸第三丁酯之製備27，使用4-[(3S,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-3-羥基-萘滿-6-基]-3-側氧基-哌嗪-1-甲酸第三丁酯來製備標題化合物。LC-ES/MS m/z 470[M+H]⁺ 。

製備29 4-氟-N-[(1S,2S)-2-羥基-7-哌嗪-1-基-萘滿-1-基]苯甲醯胺鹽酸鹽

在室溫下將含4 M氯化氫之二噁烷(135 mL)添加至4-[(3S,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-3-羥基-萘滿-6-基]哌嗪-1-甲酸第三丁酯(19.4 g，41.3 mmol)於1,4-二噁烷(430 mL)中之溶液中。在50℃下機械攪拌所得漿液13小時。在真空中濃縮反應物，得到標題化合物(24.8 g，定量)。LC-ES/MS m/z 370[M+H]⁺ 。

製備30 4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-哌嗪-1-基-色滿-4-基]苯甲醯胺鹽酸鹽

在室溫下在攪拌下使四氟硼酸三第三丁基鏻(16.0 g，54.6 mmol)及氯化烯丙基鈀(II)二聚體(5.07 g，27.3 mmol)於DMSO(1.40 L)中之懸浮液脫氣(氮氣鼓泡通過混合物)。添加N-第三丁氧羰基哌嗪(315 g，1.64 mol，97%純)及N-[(3R,4S)-6-溴-3-羥基-色滿-4-基]-4-氟-苯甲醯胺(200.0 g，546 mmol)。在氮氣下攪拌混合物15分鐘，且隨後在80℃下加熱。添加第三丁醇鈉(179 g，1.80 mol)，且在93℃至98℃下加熱45分鐘。將混合物傾於1 M磷酸(2.73 L，2.73 mol，以50%氫氧化鈉調整至pH值=2.3)與乙酸乙酯(800 mL)之溶液上，且攪拌10分鐘。分離各層，且以乙酸乙酯(3×300 mL)萃取水層。以半飽和鹽水(2×500 mL)洗滌合併之有機層。以活性碳(20 g)及矽膠(200 g)處理有機層，且攪拌30分鐘。經矽藻土墊過濾，且在減壓下濃縮，得到深色油狀物。將油狀物溶解於甲醇(800 mL)中，添加含4 M氯化氫之二噁烷(410 mL)，且在40℃下攪拌溶液1小時。在真空中蒸發溶劑，使殘餘物懸浮於乙腈(1.6 L)中，且在室溫下攪拌1小時。在氮氣下藉由過濾來收集固體以避免鹽之水合作用。以乙腈(500 mL)及甲基第三丁基醚(1 L)洗滌濾液，且在真空下乾燥，得到標題化合物(262 g，73%)。LC-ES/MS m/z 372[M+H]⁺ 。

基本上按照製備30中所描述之程序，使用適當外消旋或對映純溴化物來製備下表中之胺。

製備33 4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-4-基]苯甲醯胺

將三乙醯氧基硼氫化鈉(20 g，94.4 mmol)添加至4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-哌嗪-1-基-色滿-4-基]苯甲醯胺鹽酸鹽(32.0 g，78.5 mmol)及3-氧雜環丁酮(6.87 g，98.1 mmol)於乙腈(300 mL)中之漿液中。攪拌漿液20分鐘，且一次性再添加三乙醯氧基硼氫化鈉(20 g，94.4 mmol)。在28℃下攪拌棕色混合物約2小時。再添加三乙醯氧基硼氫化鈉(10 g，47.2 mmol)且攪拌混合物30分鐘。添加3-氧雜環丁酮(2 g，28.6 mmol)且在20分鐘後再添加3-氧雜環丁酮(1 g，14.3 mmol)。攪拌30分鐘，將混合物傾入飽和碳酸氫鈉水溶液(1 L)中且添加二氯甲烷(1 L)。分離有機層且在真空中濃縮，得到淺灰色固體。藉由矽膠管柱層析以3%至6%異丙醇/二氯甲烷溶離來純化固體，得到呈白色固體狀之標題化合物(19.2 g，73%)。LC-ES/MS m/z 428[M+H]⁺ 。

基本上按照製備33中所描述之程序，使用適當外消旋或對映純胺來製備下表中之氧雜環丁烷。

製備37 4-氟-N-[(1S,2S)-2-羥基-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]茚滿-1-基]苯甲醯胺

在室溫下將含4 M氯化氫之二噁烷(5.0 mL)添加至4-[(2S,3S)-3-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-羥基-茚滿-5-基]哌嗪-1-甲酸第三丁酯(300 mg，0.659 mmol)於1,4-二噁烷(5.0 mL)中之溶液中，且攪拌1小時。在真空中濃縮懸浮液。向殘餘物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液(50 mL)，且以乙酸乙酯(3×50 mL)萃取。以鹽水洗滌合併之有機層，經硫酸鈉乾燥，且在真空中濃縮。將殘餘物溶解於甲醇(20 mL)中，且添加3-氧雜環丁酮(142 mg，1.98 mmol)、冰乙酸(170 μL，2.96 mmol)及粉碎之活性4分子篩。在50℃下攪拌所得懸浮液1小時。在室溫下添加氰基硼氫化鈉(131 mg，1.98 mmol)，且攪拌隔夜。添加飽和碳酸氫鈉溶液(20 mL)且攪拌20分鐘。以二氯甲烷(3×50 mL)萃取，且以水及鹽水洗滌合併之有機層。經硫酸鈉乾燥有機部分，過濾且濃縮，得到標題化合物(220 mg，81%)。LC-ES/MS m/z 412[M+H]⁺ 。

製備38 外消旋反式 -3,6-二溴色滿-4-醇

將6-溴色滿-4-醇(25.0 g，109.1 mmol)於甲苯(500 mL)中之溶液加熱至100℃。添加單水合對甲苯磺酸(1.1 g，5.5 mmol)且使用迪恩-斯達克分水器收集水，在100℃下攪拌2小時。移除熱源，且以冰冷的0.5 N NaOH(250 mL)淬滅反應混合物。將反應混合物進一步冷卻至5℃至10℃，且隨後分離各層。以水(25 mL)洗滌有機層，且在減壓下將有機物濃縮至約為其原始體積的一半。添加DMSO(100 mL)，且繼續在減壓下濃縮直至不再有甲苯蒸餾出。

將中間體烯烴之DMSO溶液冷卻至0℃至5℃，添加水(17 mL)且再冷卻至0℃至5℃。經30分鐘分5份添加N-溴代丁二醯亞胺(21.7 g，120.0 mmol)。在0℃-5℃下攪拌1小時。以乙酸乙酯(100 mL)及水(50 mL)稀釋反應混合物，攪拌10分鐘，且分離各層。以乙酸乙酯(100 mL)反萃取水層。以1:1鹽水/水(2×50 mL)洗滌合併之有機物，經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮，得到呈白色固體狀之標題化合物(33.0 g，99%)。¹ H NMR(DMSO-d ₆ ) δ 4.26(m,1H),4.37(m,2H),4.65(m,1H),6.27(d,1H),6.80(d,1H),7.35(dd,1H),7.46(bd,1H)。GC/MS m/z(⁷⁹ Br/⁸¹ Br) 308/310[M⁺ ]。

製備39 外消旋反式 -4-胺基-6-溴-色滿-3-醇

在環境溫度下(500 mL)將氫氧化銨(28%至30%水溶液，150 mL，2.2 mol)添加至外消旋反式 -3,6-二溴色滿-4-醇(30.0 g，97.4 mmol)於異丙醇(300 mL)中之溶液中。緩慢攪拌15小時。過濾反應混合物，且以水(200 mL)稀釋濾液。在減壓下濃縮所得溶液至其原始重量之一半。添加水(100 mL)，在環境溫度下攪拌混合物10分鐘，隨後冷卻至0℃至5℃，且再攪拌30分鐘。藉由過濾收集沈澱，且以水(25 mL)及庚烷(25 mL)洗滌固體。在40℃下真空乾燥物質，提供呈淺黃色固體狀之標題化合物(21.2 g，89.2%)。¹ H NMR(DMSO-d ₆ ) δ 1.96(bs,2H),3.53(m,2H),3.87(dd,1H),4.11(dd,1H),5.15(bs,1H),6.66(d,1H),7.19(dd,1H),7.48(dd,1H)。LC-ES/MS m/z(⁷⁹ Br) 244[M+H]。

製備40 (3R,4S)-4-胺基-6-溴-色滿-3-醇

將外消旋反式 -4-胺基-6-溴色滿-3-醇(21.1 g，86.4 mmol)、D-(+)-樟腦酸(17.3 g，86.4 mmol)、乙腈(633 mL)及水(47.6 mL)之混合物加熱至70℃至75℃，且攪拌10分鐘。經4小時使溶液冷卻至環境溫度。24小時後，在環境溫度下過濾混合物。以含7% H₂ O之乙腈(2×20 mL)沖洗固體。加熱濾液至50℃且添加1 N NaOH(216.1 mL)。在減壓下濃縮所得混合物以移除乙腈。添加H₂ O(211 mL)且將溶液加熱至70℃。冷卻至環境溫度，且藉由過濾來收集沈澱。以水(25 mL)洗滌，且在50℃下真空乾燥隔夜，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(9.8 g，46.4%(理論重量50%)，98.7% ee)。

合併粗(3R,4S)-4-胺基-6-溴色滿-3-醇(1.5 g，6.15 mmol)、乙腈(12.0 mL)及水(3.0 mL)且加熱至70℃至75℃。攪拌溶液30分鐘，且使溶液冷卻至環境溫度，且隨後再攪拌1小時。將混合物冷卻至0℃至5℃，且攪拌30分鐘。過濾固體，且以冷的4:1之乙腈：H₂ O(10 mL)洗滌。在50℃下真空乾燥固體隔夜，得到呈白色固體狀之經純化之標題化合物(1.1 g，74.6%，99.7% ee)。¹ H NMR(DMSO-d ₆ ) δ 1.96(bs,2H),3.53(m,2H),3.87(dd,1H),4.11(dd,1H),5.15(bs,1H),6.66(d,1H),7.19(dd,1H),7.48(dd,1H)。LC-ES/MS m/z(⁷⁹ Br) 244[M+H]。分析性對掌性HPLC分析之條件：ChiralPak AD-H管柱(150×4.6 mm，4.6微米)；流動速率0.6毫升/分鐘；波長290 nm；溶離劑100% MeOH+0.2% v/v二甲基-乙胺；運作時間10分鐘；管柱溫度30℃；等濃度。

製備41 4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-(哌嗪-1-基)色滿-4-基]苯甲醯胺

在環境溫度下，將碳酸氫鈉(5.2 g，61.4 mmol)及水(50 mL)添加至(3R,4S)-4-胺基-6-溴-色滿-3-醇(10.0 g，41.0 mmol)於THF(50 mL)中之懸浮液中。攪拌5分鐘且將混合物冷卻至0℃至5℃。經10分鐘經由加料漏斗逐滴添加4-氟-苯甲醯氯(6.5 g，41.0 mmol)。在0℃至5℃下攪拌混合物30分鐘，使混合物升溫至15℃至20℃，且再攪拌2小時。以鹽水(50 mL)及THF(50 mL)稀釋混合物，且攪拌20分鐘。分離各層，且將有機層濃縮至其原始體積的一半。將添加THF(50 mL)及濃縮至一半體積重複三次，或直至溶液之卡費雪(Karl Fisher)水分分析小於0.1%。添加DMSO(100 mL)，且在減壓下在50℃下繼續濃縮混合物直至THF不再蒸餾出。

以DMSO(200 mL)及甲苯(45 mL)稀釋所得醯胺中間體之DMSO溶液，且使用氮氣表面下噴射來脫氣30分鐘。添加哌嗪(16.6 g，192.7 mmol)且將溶液脫氣30分鐘。將溶液加熱至40℃，且在氮氣層下添加氯化烯丙基鈀(II)二聚體(0.72 g，2 mmol)及四氟硼酸三第三丁基鏻(1.19 g，4 mmol)。攪拌混合物10分鐘，且在氮氣層下添加第三丁醇鈉(13.0 g，135.3 mmol)。提昇內部溫度至70℃，且攪拌混合物4小時。冷卻反應器內容物至20℃，且經15分鐘添加水(75 mL)。使用6 N HCl將混合物之pH值調整至6至7，且添加乙酸乙酯(150 mL)。攪拌反應器內容物30分鐘且隨後分離各層。以乙酸乙酯(2×150 mL)反萃取水層。丟棄乙酸乙酯萃取液，且使用NaOH(40%水溶液)將水層之pH值調整至11至12。以乙酸乙酯(3×150 mL)萃取水層。合併有機萃取液且在減壓下濃縮至約為原始體積的一半。添加活性碳(1.5 g)，且將混合物加熱至50℃至55℃。在50℃至55℃下攪拌1小時，冷卻混合物至20℃且過濾以移除固體。以鹽水(2×300 mL)洗滌濾液，且在減壓下將有機物濃縮至約2體積(以原始起始物質計)。冷卻混合物至0℃至5℃，且再攪拌3小時。藉由過濾來分離固體，以甲基第三丁基醚(30 mL)洗滌，且在50℃下真空乾燥固體。回收呈灰白色固體狀之標題化合物(7.9 g，52%)。¹ H NMR(DMSO-d ₆ ) δ 2.40-2.80(bm,8H),3.65-3.95(bm,2H),4.13(d,1H),4.95(m,1H),5.35(bs,1H),6.63(dd,1H),6.69(d,1H),6.80(d,1H),7.27(m,2H),7.96(m,2H),8.72(bd,1H)。LC-ES/MS m/z 372[M+H]。

製備42 4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-4-基]苯甲醯胺

合併4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-(哌嗪-1-基)色滿-4-基]苯甲醯胺(8.2 g，22.0 mmol)與含3-氧雜環丁酮(2.4 g，33.0 mmol)之THF(164 mL)。添加乙酸(1.3 mL，22.0 mmol)且將所得混合物加熱至35℃至40℃。1小時後，添加三乙醯氧基硼氫化鈉(8.4 g，39.6 mmol)，且在35℃至40℃下攪拌4小時。冷卻反應混合物至15℃，且經30分鐘添加2 N NaOH(81.6 mL)。添加鹽水(81.6 mL)，且將混合物攪拌30分鐘。分離各層，且以2 N NaOH(81.6 mL)及鹽水(81.6 mL)稀釋有機層。將所得混合物攪拌30分鐘。分離各層，且移除水層。將活性碳(1.0 g)添加至有機層中，提昇溫度至50℃至55℃且攪拌1小時。過濾混合物以移除固體，且在減壓下將濾液濃縮至約為原始體積的十分之一。添加乙酸乙酯(164 mL)，且在減壓下濃縮至約為原始體積之四分之一。以乙酸乙酯(2×164 mL)重複此過程兩次。將有機物濃縮至約3體積(以起始物質計)，提昇內部溫度至70℃至75℃，且攪拌2小時。冷卻混合物至10℃，經15分鐘添加庚烷(82 mL)，且再攪拌2小時。藉由過濾來分離工業級標題中間體，且在50℃至55℃下真空乾燥固體(回收10.1 g)。

純化：使工業級4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-4-基]苯甲醯胺(10.0 g，23.4 mmol)懸浮於乙腈(700 mL)中，且將混合物加熱至回流。在回流下攪拌2小時，冷卻至50℃至55℃且添加活性碳(1.0 g)。在50℃至55℃下攪拌2小時，且過濾移除固體。在減壓下將濾液濃縮至約5體積(以起始工業級物質計)。提昇內部溫度至75℃至80℃，且攪拌1小時。冷卻混合物至20℃，且再攪拌4小時。藉由過濾來分離標題化合物，提供白色固體(6.8 g，72%)。¹ H NMR(DMSO-d ₆ ) δ 2.33(m,4H),2.94(m,4H),3.40(m,1H),3.85(m,1H),3.93(d,1H),4.14(d,1H),4.40(dd,2H),4.49(dd,2H),4.94(m,1H),5.34(d,1H),6.65(d,1H),6.70(d,1H),6.84(dd,1H),7.27(m,2H),7.97(m,2H),8.75(bd,1H)。LC-ES/MS m/z 428[M+H]。

實例1 N-甲基胺基甲酸[(3R,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-3-基]酯

將1,1'-羰基二咪唑(35.5 g，219 mmol)添加至4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-4-基]苯甲醯胺(72.0 g，168 mmol)於THF(648 mL)中之溶液中，且在室溫下攪拌溶液隔夜。冷卻混合物至5℃，且在15分鐘期間逐滴添加2 M甲胺於THF(210 mL，421 mmol，2.5當量)中之溶液。攪拌30分鐘，且傾入水(720 mL)與甲基第三丁基醚(216 mL)之混合物上。攪拌混合物30分鐘且傾析各相。以二氯甲烷(3×216 mL)萃取水相。以鹽水(3×100 mL)洗滌合併之有機相，經無水硫酸鈉乾燥，且在真空中濃縮。使殘餘物懸浮於乙酸乙酯(720 mL)中，在回流下加熱2小時且冷卻至10℃。藉由過濾來收集固體，且在真空下乾燥隔夜，得到呈白色固體狀之標題化合物(64.0 g，78%)。LC-ES/MS m/z 485[M+H]⁺ 。

基本上按照實例1中所描述之程序，使用適當的對映純醇來製備下表中之胺基甲酸酯。

實例3 N-甲基胺基甲酸[(8S,9S)-9-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-6,7,8,9-四氫-5H-苯并[7]輪烯-8-基]酯

基本上按照以上關於實例1之程序，使用外消旋反式 -4-氟-N-[8-羥基-2-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-6,7,8,9-四氫-5H-苯并[7]輪烯-9-基]苯甲醯胺來製備外消旋胺基甲酸酯。LC-ES/MS m/z 497[M+H]⁺ 。將外消旋反式 -N-甲基胺基甲酸9-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-2-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-6,7,8,9-四氫-5H-苯并[7]輪烯-8-基]酯(1.03 g)溶解於二氯甲烷(8 mL)及甲醇(3 mL)中。藉由SFC於CHIRALPAKAD-H管柱(2.1×25 cm，5 μm)上分離300 μL部分中之對映異構體。移動相：30%異丙醇與0.2%異丙胺/二氧化碳。流動速率：70毫升/分鐘。偵測：225 nm。得到標題化合物作為異構體1(333 mg，99% ee)及8R,9R對映異構體作為異構體2(359 mg，97.5% ee)。藉由SFC於CHIRALPAKAD-H(4.6×150 mm，5 μm)管柱上使用30%異丙醇與0.2%異丙胺/二氧化碳來測定對映異構體過量。流動速率：5毫升/分鐘。偵測：225 nm。異構體1(標題化合物)T_R =1.76分鐘。異構體2 T_R =2.30分鐘。

實例4 N-甲基胺基甲酸[(4S,5S)-5-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-7-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-2,3,4,5-四氫-1-苯并氧呯-4-基]酯

基本上按照以上關於實例1之程序，使用外消旋反式 -4-氟-N-[4-羥基-7-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-2,3,4,5-四氫-1-苯并氧呯-5-基]苯甲醯胺來製備外消旋胺基甲酸酯。LC-ES/MS m/z 499[M+H]⁺ 。將外消旋反式 -N-甲基胺基甲酸[5-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-7-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]-2,3,4,5-四氫-1-苯并氧呯-4-基]酯(100 mg)溶解於甲醇(3 mL)中，且濾除不溶性固體。藉由層析法於CHIRALPAKAD-H管柱(3×25 cm，5 μm)上分離1.5 mL部分(2次注射)中之對映異構體。移動相：95%乙醇/5%乙腈。流動速率：18毫升/分鐘。偵測：225 nm。得到標題化合物作為異構體1(42 mg，99% ee)及4R,5R對映異構體作為異構體2(40 mg，99% ee)。藉由HPLC於CHIRALPAKAD-H(4.6×150 mm，5 μm)管柱上使用95%乙醇/5%乙腈與0.2%二甲基乙胺來測定對映異構體過量。流動速率：1.0毫升/分鐘。偵測：225 nm。異構體1(標題化合物)T_R =3.58分鐘。異構體2 T_R =5.13分鐘。

實例5 N-甲基胺基甲酸[(1S,2S)-1-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]茚滿-2-基]酯

將4-吡咯啶基吡啶(16 mg，0.107 mmol)添加至4-氟-N-[(1S,2S)-2-羥基-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]茚滿-1-基]苯甲醯胺(220 mg，0.535 mmol)於四氫呋喃(3.0 mL)中之溶液中，且密封於壓力小瓶中。藉由注射器將異氰酸甲酯(97 μL，1.60 mmol)添加至混合物中，且在60℃下攪拌隔夜。在冰浴中冷卻所得懸浮液，藉由過濾來收集白色固體，且在真空烘箱中在40℃下乾燥3小時，得到標題化合物(200 mg，80%)。LC-ES/MS m/z 469[M+H]⁺ 。

實例6 N-甲基胺基甲酸[(3R,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-3-基]酯

將4-氟-N-[(3R,4S)-3-羥基-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-4-基]苯甲醯胺(10.0 g，23.4 mmol)懸浮於THF(200 mL)中，且添加1,1羰基二咪唑(4.9 g，30.4 mmol)。在環境溫度下攪拌3小時。冷卻反應混合物至-5℃，且經15分鐘添加2 M甲胺(於THF中，21 mL，42.1 mmol)。在-5℃至0℃下攪拌所得混合物3小時。添加2 N NaOH(100 mL)，且在10℃至30℃下攪拌混合物1小時。分離各層且以2 N NaOH(4×100 mL)洗滌有機物。添加水(200 mL)且在減壓下將混合物濃縮至約二十體積(以起始物質計)。添加THF(200 mL)且在環境溫度下攪拌1小時。過濾混合物，且將產物濕濾餅轉移回潔淨反應容器。添加THF(200 mL)及水(200 mL)，且在環境溫度下攪拌1小時。藉由過濾來分離工業級標題化合物，且在80℃下真空乾燥(9.0 g，80%)。

實例7 N-甲基胺基甲酸[(3R,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-3-基]酯之結晶/固體形式轉化

在氮氣氛圍下將工業級N-甲基胺基甲酸[(3R,4S)-4-[(4-氟苯甲醯基)胺基]-6-[4-(氧雜環丁-3-基)哌嗪-1-基]色滿-3-基]酯(50 g，103.2 mmol)懸浮於THF(1500 mL)中。將混合物加熱至50℃至60℃，且攪拌1小時。添加活性碳(5.0 g)，且在50℃至60℃下繼續攪拌1小時。冷卻混合物至40℃至50℃，且過濾移除固體。在減壓下將濾液濃縮至約5體積(以起始物質計)。添加乙腈(1000 mL)，且在減壓下濃縮至約5體積。重複四次以移除所有THF，且隨後將混合物濃縮至10至15體積。加熱混合物至70℃至75℃，且攪拌18小時。冷卻混合物至15℃且攪拌4小時。藉由過濾來分離白色晶體，且在55℃至60℃下真空乾燥以提供標題化合物(42 g，84%)。¹ H NMR(DMSO-d ₆ ) δ 2.32(m,4H),2.53(d,3H),2.96(m,4H),3.39(m,1H),4.11-4.25(m,2H),4.39(dd,2H),4.51(dd,2H),4.86(m,1H),5.04(m,1H),6.70-6.75(m,2H),6.85(dd,1H),7.17(m,1H),7.28(m,2H),7.96(m,2H),8.90(bd,1H)。LC-ES/MS m/z 485[M+H]。對掌性分析法99.9% ee。

在以下活體外及活體內分析法中測試本發明之例示性化合物。

活體外

人類組織蛋白酶S及小鼠組織蛋白酶S之效能分析法以及人類組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶K、組織蛋白酶V及組織蛋白酶F之選擇性分析法描述如下。各分析法之實驗條件及/或物質略由不同，且因此該等差異直接在一般分析法條件內註解，或根據各別酶分析法使用緊接著一般分析法條件的表1中名稱1a至1g進行編號。

在DMSO中製備測試化合物以配製10 mM儲備溶液。在96孔圓底培養板中以DMSO連續稀釋儲備溶液，得到具有最終化合物濃度範圍1a 之10點稀釋曲線，接著進行活體外酶分析法。於下文緊接著描述的分析緩衝液(用於整個分析法)中進一步稀釋(1b )化合物：

人類組織蛋白酶S、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶F及小鼠組織蛋白酶S： 含有2.5 mM DTT及2.5 mM EDTA加0.01% TRITONX-100之50 mM磷酸鈉(pH 6.5)

人類組織蛋白酶K及組織蛋白酶V： 含有100 mM NaCl、2.5 mM DTT及2.5 mM EDTA加0.01% TRITONX-100之100 mM乙酸鈉(pH 5.5)

將10 μL各稀釋液添加至相應低蛋白結合半面積黑色培養板(Costar 3694)之A列至H列之各孔中。針對最終濃度1d ，將在分析緩衝液中製備之量1c 之受質、苄氧羰基-L-白胺醯基-L-精胺酸-4-甲基-香豆基-7-醯胺(Peptide Institute)添加至培養板之各孔中。將在分析緩衝液中製備之下文緊接著描述之量1e 的各別酶添加至含有受質及測試化合物之培養板的各孔中，產生最終濃度1f 以起始反應。

人類組織蛋白酶S、組織蛋白酶L、組織蛋白酶K及組織蛋白酶V： 自Calbiochem獲得。

小鼠組織蛋白酶S： 簡言之，使用含有組胺酸標籤之小鼠組織蛋白酶S-pAN51(T760)構築體將小鼠組織蛋白酶S選殖於桿狀病毒中。隨後使用IMAC來純化活性蛋白。

人類組織蛋白酶F： 簡言之，如下內部製備人類重組組織蛋白酶F酶。使用含有組胺酸標籤之組織蛋白酶F-pAN60(T-2188)構築體將組織蛋白酶F酶原(Procathepsin F)選殖於293E細胞中。隨後使用IMAC來純化蛋白。使用胃蛋白酶消化組織蛋白酶F酶原，且使用單S管柱層析法再純化，產生經純化之活化組織蛋白酶F。

在板式混合器上低速短暫震盪混合物。在室溫下在培育時間1g 之後使用Envision 2103多標記讀取器在激發波長355 nm及發射波長460 nm下記錄混合物之RFU並維持0.1秒。將RFU相對於抑制劑濃度作圖並以四參數對數方程式擬合曲線，使用Activity Base(第7.3.2.1版)得到IC₅₀ 值。對於人類組織蛋白酶F而言，使用Packard Fusion Alpha微定量板式讀取器(0.5秒讀取/孔)來量測RFU且使用GraphPad Prism 4.03軟體來作RFU相對於抑制劑濃度之圖。

表1.活體外分析法實驗條件

按照基本上如上所述之方案，例示性化合物在人類組織蛋白酶S及小鼠組織蛋白酶S酶抑制劑分析法中分別顯示小於800 nM及400 nM之IC₅₀ 。特定言之，實例1及實例2之化合物在人類組織蛋白酶S酶抑制劑分析法中分別顯示約6.4 nM及10.2 nM之IC₅₀ ，且在小鼠組織蛋白酶S酶抑制劑分析法中分別顯示約1.7 nM及3.9 nM之IC₅₀ ，因此顯示本發明範疇內之某些化合物為人類及小鼠組織蛋白酶S的有效抑制劑。

對於人類組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶K及組織蛋白酶V酶抑制劑分析法而言，實例1之化合物分別顯示約大於167 μM、5.2 μM、大於100 μM及33 μM之IC₅₀ ，且實例2之化合物分別顯示約大於167 μM、94 μM、大於100 μM及大於100 μM之IC₅₀ 。對於人類組織蛋白酶F而言，實例1之化合物顯示高達30 μM無抑制。此等結果顯示本發明範疇內之某些化合物為組織蛋白酶S之選擇性抑制劑。

活體內

CaCl ₂ 誘導之AAA動物功效模型

如下所述，用以研究組織蛋白酶S抑制劑對AAA之作用的使用CaCl₂ 誘導之AAA動物功效模型(J. Clin. Invest., 2002 ,110(5),625-632)經修改。

使用來自Taconic(Cambridge City,Indiana)之野生型雄性129SvEv小鼠(10週大)，分成六組用於實例1且分成五組用於實例2，其中各組含有12隻小鼠。藉由經口管飼向用於實例1及實例2之組1至組5分別投與媒劑溶液1%NATROSOL(羥基乙基纖維素)/0.25% TWEEN80(聚山梨醇酯80)/0.05% Antifoam-1510(Dow Corning)及含1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg測試化合物之媒劑溶液，每日兩次，維持4週。包括表示假手術組(0.9%生理食鹽水替代CaCl₂ 施用於主動脈且用媒劑給藥)的組6(在實例1之研究中)以確定基線。在手術(下午)前一天進行第一次給藥且在手術當天的早晨進行第二次給藥。在手術當天，動物不接受下午給藥。手術次日繼續進行每日兩次給藥(上午及下午)，維持28天。

在手術當天，動物接受手術前10分鐘及手術後3小時之皮下止痛(BUPRENEX，0.1 mg/kg)。小鼠藉由吸入2%異氟烷經麻痺，且進行剖腹術。藉由以手術牽開器橫向牽開腸且使腸留在腹腔中來暴露腹主動脈。使用微手術技術將自腎動脈位準至髂分叉的腹主動脈自下腔靜脈及周圍結締組織中分離。一旦經分離，即以在0.25 M CaCl₂ 水溶液中浸泡過的預量測之無菌棉紗布包裹腹主動脈相關區域。在假手術對照動物中，以0.9%生理食鹽水替代CaCl₂ 。7分鐘後移除紗布，且施用第二塊經CaCl₂ 浸泡之紗布(或假手術動物中經0.9%生理食鹽水浸泡之紗布)。在第二個7分鐘時期之後，移除紗布，以0.9%生理食鹽水沖洗主動脈，且閉合腹部。將動物送回一般畜舍，在一般畜舍中該等動物個別豢養且隨意取用標準齧齒動物飼料(Purina 2014)及水。

如上所述給藥4週後，藉由超音波(Biosound Ultrasound-7.5 MHz)測定經紗布包裹之主動脈區段的主動脈管腔周長、面積及直徑，且以JMP7軟體(Cary,North Carolina)進行統計學分析。藉由量測主動脈管腔周長(在此情況中由於與所量測之主動脈區段相關之不規則幾何形狀，其表示更精密的腹主動脈量測)所測定之AAA的減小百分比顯示於下表1中且以平均值±標準差形式表示。對於實例1，媒劑組與假手術組相比較，且測試化合物與媒劑相比較。對於實例2，測試化合物與媒劑相比較。

表2.活體內AAA減小百分比(%)

按照基本上如上所述之方案，實例1及實例2之化合物以劑量依賴型方式降低主動脈管腔周長，且因此顯示本發明範疇內之某些化合物減小AAA。

p10積累分析法

使用分成四組的來自Taconic(Cambridge City,Indiana)之野生型雄性C57B6或129SvEv小鼠(10週大)，其中各組具有3隻小鼠。藉由經口管飼向組1至組4分別投與媒劑溶液1%NATROSOL(羥基乙基纖維素)/0.25% TWEEN80(聚山梨醇酯80)/0.05% Antifoam-1510(Dow Corning)及含3 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg測試化合物之媒劑溶液。4小時後，自各小鼠抽取全血(300 μL-500 μL)。藉由添加1 mL Flow Cytometry Lysing Solution^TM (Santa Cruz Biotechnology,Inc)，在室溫下保持10分鐘，在4000 rpm下離心5分鐘且隨後丟棄上清液來進行移除紅血球之步驟。將此步驟重複一次以完全移除紅血球。以50 μL CytoBuster^TM 試劑(Novagen)再懸浮PWBC離心塊，且在高功率下音波處理5秒至10秒。使用BCA分析法(Anal. Biochem. 1988 ,175,231-237)來測定蛋白質濃度。

使用西方墨點法(Western blot)測定p10的量。在96℃下使樣品(0.5 μg/μl蛋白質濃度)變性5分鐘，且將樣品以20微升/孔(10微克/孔)裝載於4%-12% NUPAGENOVEXBis-Tris Midi-gel(Invitrogen)中。凝膠以NUPAGEMES SDS電泳緩衝液(Invitrogen)在120 V下電泳60分鐘。在100 V下以NUPAGE轉移緩衝液(Invitrogen)及20%甲醇(EMD)將蛋白轉移至0.2 μm硝化纖維素(BIO-RAD)並維持30分鐘。以PBS短暫沖洗墨點，且在室溫下在10 mL ODYSSEY阻斷緩衝液(LI-COR Biosciences)中阻斷60分鐘。對於p10，在4℃下以針對小鼠CD74之一次抗體(1 μg/ml大鼠抗CD74抗體)(BD Bioscience)在阻斷緩衝液中培育墨點隔夜。對於微管蛋白對照，在4℃下以兔抗β微管蛋白pAb(0.2 μg/ml)(Abcam)在阻斷緩衝液中培育墨點隔夜。以洗滌緩衝液(來自HyClone之DPBS)及0.01%聚山梨醇酯20洗滌墨點四次，每次10分鐘。隨後在室溫下以二次抗體培育墨點60分鐘。對於p10，使用ALEXA FLUOR680山羊抗大鼠IgG(1:5000稀釋液)(Invitrogen)。對於微管蛋白，使用ALEXA FLUOR680山羊抗兔IgG(1:5000稀釋液)(Invitrogen)。如上所述再次洗滌墨點，且置於PBS中用於掃描。

藉由在ODYSSEY紅外成像儀(LI-COR Biosciences)上掃描來擷取圖像。以ODYSSEY軟體分析p10的量且以微管蛋白的量進行校正。以JMP7軟體(Cary,North Carolina)對資料進行統計學分析。相對於媒劑之p10積累量(倍數增加)顯示於表3中。值以平均值±標準差形式表示。

表3.活體內PWBC中相對p10積累量

按照以上方案，實例1及實例2之化合物依劑量依賴型增加PWBC中之p10，顯示本發明範疇內之某些化合物阻斷抗原呈現。

Claims

一種式(I)化合物，其中，Z為-CH₂ -、-CH₂ CH₂ -、-OCH₂ -、-CH₂ CH₂ CH₂ -或-OCH₂ CH₂ -；R¹ 為H、F或Cl；R² 為H、甲基、乙基、丙基或異丙基；或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其中R¹ 為H或F，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其中R¹ 為F，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其中R² 為甲基或乙基，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其中R² 為甲基，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其中Z為-CH₂ CH₂ -或-OCH₂ -，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其具有下式：或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其具有下式：或其醫藥學上可接受之鹽。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之化合物及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
如請求項1至8中任一項之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其用於療法。
如請求項1至8中任一項之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療腹主動脈瘤、斑塊不穩定、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬或狼瘡。
一種如請求項1至8中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療腹主動脈瘤、斑塊不穩定、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬或狼瘡之藥物。