TWI482625B - 重組人溶酶體酸性脂肪酶（ｌａｌ）於治療人病患之溶酶體酸性脂肪酶缺乏症之用途 - Google Patents

Description

重組人溶酶體酸性脂肪酶(LAL)於治療人病患之溶酶體酸性脂肪酶缺乏症之用途

本申請案主張2010年9月9日提出申請的美國臨時申請案號61/403,011、2010年10月29日提出申請的美國臨時申請案號61/456,014、2011年1月13日提出申請的美國臨時申請案號61/432,372及2011年4月23日提出申請的PCT/US2011/033699之權益。上述申請案之全部教示係併入本文作為參考。

溶酶體酸性脂肪酶(LAL)缺乏症是罕見的溶酶體貯積病(LSD)，其特徵為因LAL缺乏而不能降解溶酶體內的膽固醇酯(CE)和甘油三酯(TAG)。LAL缺乏症與其他溶酶體貯積病相似之處在於受質於許多組織和細胞類型中積聚。對LAL缺乏症，受質積聚於網狀內皮系統的細胞內最為明顯，該細胞包括肝臟Kupffer細胞、脾臟組織細胞及小腸鼓膜中層。網狀內皮細胞表現巨噬細胞甘露糖/N-乙醯基葡糖胺受體(亦稱為巨噬細胞甘露糖受體、MMR或CD206)，該受體媒介蛋白質與GlcNAc或呈甘露糖末端的N-聚糖結合、細胞攝取及溶酶體內在化，並提供於此等主要細胞類型內潛在矯正LAL缺乏之途徑。

LAL缺乏症係一種多系統疾病，其最常顯現為胃腸、肝臟及心血管之併發症且顯現明顯的發病率和死亡率。LAL缺乏症的臨床效應係由於脂質物質在許多組織之溶酶體內大量積聚及膽固醇與脂質之穩態機轉被顯著干擾，該干擾包括肝臟膽固醇合成的實質增加。LAL缺乏症呈現至少兩種顯型：沃爾曼病(WD)和膽固醇酯貯積病(CESD)。

沃爾曼病係以首先描述該疾病的醫生命名且係LAL缺乏的最具侵略性表現者。該顯型的特徵為胃腸和肝臟表現，其包括生長障礙、吸收不良、脂肪瀉、顯著體重下降、淋巴結病、脾腫大及肝腫大。沃爾曼病會迅速發展且通常於1歲內導致死亡。案例報告回顧顯示：對呈現因嚴重的LAL缺乏症引起之1歲內生長障礙的病患而言，能存活超過12個月者極為稀少。於此最具侵略性的形式，生長障礙係主要之臨床特徵且係早期死亡率的主要原因。肝臟腫大和轉胺酶升高所顯現的涉及肝臟的情況對嬰兒亦為常見。

沃爾曼病的診斷係建立於臨床發現和實驗分析。嬰兒通常因腹瀉、持續性嘔吐、餵食困難、生長障礙及停止發育而於出生後兩個月內住院。臨床發現包括顯現肝腫大和脾腫大之腹脹，且放射性檢查通常顯現腎上腺鈣化。實驗檢驗通常顯示血清轉胺酶濃度升高及內源性LAL酶活性不存在或顯著降低。對某些病患，觀察到膽固醇和甘油三酯的血液濃度升高。

患有LAL缺乏症的病患於生命後期亦可呈現顯著的肝臟和心血管涉及病況，且此通常被稱為膽固醇酯貯積病(CESD)。對CESD病患，肝臟受明顯的肝腫大、肝細胞壞死、轉胺酶升高、肝硬化及肝纖維化嚴重影響。由於CE和TAG濃度升高，心血管涉及病況可表徵為高脂血症。在某些患有CESD的個體體內，已發現脂肪沉積積聚於動脈壁上(動脈硬化症)。該沉積使動脈腔管變窄並可導致血管栓塞，進而增加發生重要的心血管病變(其包括心肌梗塞和中風)的風險。然而，並非所有患有LAL缺乏症的個體會發展動脈硬化症。例如，沃爾曼病病患苦於與該疾病有關的其他徵狀(其包括肝臟和脾臟腫大、淋巴結病及小腸吸收障礙)，但通常不表徵為動脈硬化症。同樣地，並非所有CESD病患表現動脈硬化症(參見Di Bisceglie et al.,Hepatology 11: 764-772(1990))。某些病患之CESD呈現高度可變化性，該等病患未能被確診直到成年後期表現出併發症時方被確診，而其他病患可於兒童早期呈現肝功能障礙。CESD係與壽命縮短和明顯的病況有關。患有CESD的病患之預期壽命係取決於相關併發症的嚴重性。

沃爾曼病的現有治療選擇極為有限。將抗體施予至呈現發燒及/或感染跡象的嬰兒。可開出針對腎上腺機能不全之類固醇替代療法的處方並進行特定的營養支持，但是未有證據顯示此等介入方法能防止死亡，且目前亦不清楚該等介入方法是否會影響短期存活。對經骨髓移植的患有LAL缺乏症之一系列4位病患，所有該4位病患皆於移植數月內因該移植併發症而死亡。雖然隨後之某些案例報告描述成功的情況，但是死亡率仍高，且由於許多病患的病情太重而無法於移植前條件性治療下存活，因而未經移植。極少數被報導的長期存活者顯示：單獨矯正造血細胞內酶缺乏即足以實質上改善該疾病的臨床狀態。藉由飲食限制以提供典型之臨床支持，藉以嘗試限制與導致死亡之該疾病的急性徵候有關的不可轉運的和不可分解代謝的脂質之積累。

CESD顯型的當前治療選擇係聚焦於經由飲食以控制脂質積聚的徵狀治療(該飲食排除富含膽固醇和甘油三酯的食物)且藉由施予降膽固醇藥物(例如他汀類(statins)和消膽胺(cholestyramine))以抑制膽固醇合成和載脂蛋白B產生。雖然可見到某些臨床上之改善，但是潛伏的疾病之主要徵狀持續存在且疾病惡化仍然發生。

業已建議：使用重組LAL的酶替代治療可為溶酶體酸性脂肪酶缺乏症和相關病症的可存活性治療選擇(參閱Meyers et al.(1985) Nutrition Res. 5(4): 423-442；WO 9811206；及Besley(1984) Clinical Genetics 26: 195-203)。使用LAL缺乏症的小鼠模型之某些研究業已證實：經每3天1次輸注高劑量(超過1 mg/kg體重)之重組人LAL，可矯正LAL缺乏(LAL^-/- )之動物的某些異常現象(參閱例如Grabowski,US 2007/0264249)。此等矯正LAL缺乏之小鼠的缺陷之早期研究顯示：為矯正潛在的疾病，需要相對高量和高給藥頻率之重組LAL蛋白。亦重要的是注意：不同於初始所描述的LAL^-/- 大鼠模型(參閱Yoshida and Kuriyama(1990),Laboratory Animal Science,vol. 40,p. 486-489)，上述研究所使用的LAL^-/- 小鼠模型並不與人WD極類似，因為該LAL缺乏之小鼠並未顯示於人病患所觀察到的生長障礙。

迄今，尚未有外源性LAL施予至人體，且目前沒有有效的治療方法以治療LAL缺乏症(其包括WD、CESD或其他疾病)。因此，為改善病患的生活品質，極需要具有最少施藥頻率的治療方法。再者，所欲的是能使人病患恢復生長、肝功能正常化、增加LAL組織濃度及提高LAL活性之治療有效劑量。

本發明係基於首次之人體臨床病例，其中病患成功地被給予外源性LAL劑量。患有LAL缺乏症(沃爾曼病或早發性LAL缺乏症)的其他致命形式之嬰兒係藉由施予外源性LAL加以有效治療，且LAL酶替代治療的安全性評估係對患有遲發性LAL缺乏症的一組人病患進行評估。對患有早發性LAL缺乏症的嬰兒每週施予低劑量而未引起任何不良事件或反應。早在初始給藥後1至2周，觀察到生命徵候和臨床/實驗室的功效測量之顯著改善。每週給藥經4個月後，經治療的嬰兒已恢復正常生長並表現出與LAL缺乏症有關的所有徵狀(其包括吸收不良、肝腫大及肝功能)之明顯改善。遲發性成年病患亦經每週給予低劑量的外源性LAL且未有不良事件的徵候。因此，收集迄今的臨床數據顯示：使用本發明的外源性LAL之酶替代治療能提供針對LAL缺乏症的安全且有效的治療。

因此，本發明提供藉由施予有效量的外源性溶酶體酸性脂肪酶(LAL)以治療人病患之與LAL缺乏症有關的疾病或病症之方法。外源性LAL係重組人LAL，其具有N-連接的聚糖結構，該聚糖結構包含至少一個甘露糖及/或甘露糖-6-磷酸。外源性LAL能有效地被內在化至例如淋巴細胞、巨噬細胞或纖維組織母細胞的溶酶體內。

在某些實施態樣中，患有LAL缺乏症的人病患被診斷患有沃爾曼病(WD)。在一實施態樣中，根據本發明的給藥係足以增加WD病患的生長。在一實施態樣中，該給藥係足以恢復WD病患的正常生長。在其他之實施態樣中，患有LAL缺乏症的人病患被診斷患有膽固醇酯貯積病(CESD)。本發明的治療方法可提供給任何年齡的人病患。

本發明亦提供治療患有LAL缺乏症的人病患之方法，其係藉由對該人病患施予有效量的重組人LAL以改善肝功能。在某些實施態樣中，該施予係足以使肝臟檢驗正常化。在一實施態樣中，該施予係足以降低肝轉胺酶之血清濃度。例如，該肝轉胺酶可包括血清天冬胺酸轉胺酶(AST)及/或丙胺酸轉胺酶(ALT)。在一實施態樣中，該施予係足以使肝腫大最小化。在一實施態樣中，該施予係足以降低該病患之肝臟大小。在一實施態樣中，該施予係足以降低血清鐵蛋白濃度。

在一實施態樣中，該施予係足以降低血清脂質濃度，其包括例如膽固醇酯(CE)和甘油三酯(TG)之濃度。

本發明亦提供對患有LAL缺乏症的人病患增加LAL活性之方法。該方法包含對該病患施予重組人LAL，使得該施予能導致增加LAL活性，如在例如淋巴細胞及/或纖維組織母細胞中可被測量者。

在一實施態樣中，描述藉由每5天1次至每30天1次對人病患施予有效量的外源性LAL蛋白以治療該人病患體內與LAL缺乏症之相關病症之方法。

在某些實施態樣中，對患有LAL缺乏症的人病患施予約0.1 mg至約50 mg外源性LAL/kg體重。在一實施態樣中，對該人病患施予約0.1 mg至約10 mg外源性LAL/kg體重。在一實施態樣中，對該人病患施予約0.1 mg至約5 mg外源性LAL/kg體重。

在一實施態樣中，輸注速率為約0.1 mg/kg/hr至約4 mg/kg/hr。

在某些實施態樣中，對該人病患施予第二治療劑。該第二治療劑可包括例如降膽固醇藥物(例如他汀或依澤替米貝)、抗組織胺劑(例如苯海拉明)或免疫抑制劑。

[發明詳細說明]

本發明提供治療患有疾病或病症的人之方法，該疾病或病症回應被施予之外源性溶酶體酸性脂肪酶。

定義

為了方便，本說明書、實施例及附隨之申請專利範圍所使用的某些術語在本文中係用於說明並限定用於描述本發明的各種術語之意思和範圍。

本文所使用之"LAL"係指"溶酶體酸性脂肪酶"且在本文中該兩個術語互相交換使用。LAL可為人蛋白，即人溶酶體酸性脂肪酶。本文所使用之術語"SBC-102"係指重組人溶酶體酸性脂肪酶。LAL在文獻處亦被稱為酸性膽固醇酯水解酶、膽固醇酯酶、脂酶A、LIPA及甾醇酯酶。

LAL催化膽固醇酯和甘油三酯水解成游離膽固醇、甘油及游離脂肪酸。因此，"LAL活性"可例如藉由螢光受質4-甲基繖形酮油酸酯(4MUO)之裂解進行測量。4MUO之裂解可例如藉由下列方式加以檢測：被釋放的螢光素4-甲基繖形酮(4MU)在約360 nm處被激發且在460 nm處發射。結果可記錄為相對螢光單位(RFU)。例如，在30分鐘端點檢測中，裂解的受質量可以相對於4MU標準曲線定量，且活性單位(U)可被定義為在37℃下裂解1微摩爾的4MUO/分鐘所需要的酶量。因此，LAL的功能片段或變體包括具有LAL活性(例如能水解膽固醇酯及/或甘油三酯)的片段或變體。

本文所使用之"外源性LAL"係指非由病患天然產生的LAL。例如，外源性LAL包括施予至病患的重組LAL蛋白、分離自人或動物並施予至病患的LAL蛋白、及因施予編碼LAL之 RNA及/或DNA或增加內源性LAL蛋白表現的另一處理而在病患體內產生(即表現)的LAL蛋白。

醫學上，"靜脈內(IV)注射"通常係指IV推注或大丸注射，其係指給藥途徑，其中注射器連接IV接入裝置，且藥物直接注射，典型上快速地，且若可能引起靜脈刺激或太快效應，則偶而達15分鐘。一旦藥物被注射至IV管的流體流中，必須有某些方式以確保該藥物自該管進入病患體內。通常，藉由下述方式完成：允許流體流正常流動並因而攜帶藥物進入血流。然而，在某些情況下，在第一注射後，使用第二流體注射(有時稱為"沖洗(flush)")，藉以促進藥物進入血流。

"靜脈輸注"係指給藥途徑，其中藥物係在延長時間內給予。例如，藥物可在1至8小時內投予至病患。藥物亦可在約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7或約8小時內投予至病患。為完成靜脈輸注，可使用重力性靜脈輸注或IV泵。當病患僅在某些時段需要藥物且不需要額外的靜脈流體(例如可含有氯化鈉、葡萄糖或彼等之任意組合的水溶液，諸如回復電解質、血糖及水損失者)時，典型上可使用IV輸注。

本文所使用之術語"禽類"係指分類學上鳥綱的生物之任何種、亞種或種族，諸如但不限於雞、火雞、鴨、鵝、鶴鶉、野雞、鸚鵡、雀、鷹、鴉及平胸鳥(其包括鴕鳥、鴯鶓及食火雞)。該術語包括Gallus gallus者(即雞)或雞(例如White Leghorn、Brown Leghorn、Barred-Rock、Sussex、New Hampshire、Rhode Island、Australorp、Minorca、Amrox、California Gray)的各種不同之已知品種，及火雞、野雞、鶴鶉、鴨、鴕鳥及經商業量產之一般飼養的其他家禽的品種。該術語亦包括發育中所有階段(其包括胚胎和胎階段)的各別禽類生物體。

術語"家禽衍生的"或"禽類衍生的"係指由家禽產生或獲得的組合物或物質。"家禽"係指可作為家畜飼養的禽類，其包括但不限於雞、鴨、火雞、鶴鶉及平胸鳥。例如，"家禽產生的"可指雞產生的、火雞產生的及/或鶴鶉產生的。

本文所使用之術語"病患"係指正在接收或已經接收或準備接收醫療照護或治療的任何人，例如由醫療照護提供者所照料者。

本文所使用之"治療有效劑量"係指需要產生所期望的治療應答的藥物劑量(例如量及/或間隔)。治療有效劑量係指相較於未接受該劑量的對應個體，能致使改善對疾病、病症或副作用的治療、治癒、預防或強化或降低該疾病或病症的發生或進展速率之劑量。該術語之範圍亦包括有效增強生理功能之劑量。

術語"治療"係指減輕、減緩或改善疾病或症狀、預防額外症狀、改善或預防症狀的潛在原因、抑制疾病或病症、中止疾病或病症的發展、減輕疾病或病症、引起疾病或病症的復原、減輕由疾病或病症引起的病症、或中止預防性治療後及/或症狀發生後之疾病或病症的症狀。

本文所使用之有關特定劑量"kg^-1 "、"/kg"、"/kg"及"/千克"表示"/千克體重"的哺乳動物，因此該等術語相互交換使用。

本文所使用之術語"多肽"欲含括單一"多肽"及多個"多肽"且係指由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)所構成的分子。術語"多肽"係指兩或多個胺基酸的任一鏈或多鏈且非指特定長度的產物。因此，"多肽"的定義包括係指兩或多個胺基酸的一或多個鏈之肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白、胺基酸鏈或任何其他術語，且術語"多肽"可與此等術語之任一者互換或被取代。術語"多肽"亦欲指多肽經表現後之修飾產物，該修飾包括但不限於糖基化、乙醯化、磷醯化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團而衍生化、溶蛋白性剪切、或被非天然存在胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物源或經由重組技術製備，但其不必自指定之核酸序列轉譯。多肽可以任何方式產生，其包括化學合成。

本文所使用之兩個胺基酸序列或兩個核苷酸序列之間的同源性百分率等於兩個序列之間的一致性百分率。兩個序列之間的一致性百分率係由序列共有的相同位置的數量之函數(即%同源性=#相同位置數/#總位置數X 100)，其考慮間隙數及各間隙的長度，且需要引入進行兩個序列的最優比對。兩個序列之間的序列比較和一致性百分率的確定可使用數學演算法完成，如下所述之非限制性實例。

兩個胺基酸序列之間的一致性百分率可使用E. Meyers and W. Miller(Comput. Appl. Biosci.,4: 11-17(1988))的演算法確定，其引入ALIGN程式(版本2.0)，使用PAM120權重殘基表，間隙長度損失12及間隙損失4。另外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分率可使用Needleman and Wunsch(J. Mol,Biol. 48: 444-453(1970))演算法確定，其引入GCG套裝軟體(可得於http://www.gcg.com)的GAP程式，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，間隙權重為16、14、12、10、8、6或4，且長度權重為1、2、3、4、5或6。

"(經)分離的"多肽或其片段、變體或衍生物係指非天然本質的多肽。無需特定之純化。例如，分離的多肽可取自天然或自然環境。宿主細胞表現的重組產製的多肽和蛋白被認為是分離者(如本文所揭露者)，其係天然或重組多肽且係可藉由任何合適的技術經分離、分級、或部分或實質上純化者。

本文所揭露的其他多肽係上述多肽之片段、衍生物、類似物或變體及彼等之任一組合。當涉及本文所揭露的任何多肽時，術語"片段"、"變體"、"衍生物"及"類似物"包括任何多肽，其保有對應天然多肽的至少某些活性(例如，LAL多肽之片段、變體、衍生物及類似物，其保有水解膽固醇酯及/或甘油三酯的能力)。多肽片段包括例如蛋白水解片段及缺失片段。多肽變體包括上述片段及因胺基酸取代、缺失或插入而具有改變的胺基酸序列之多肽。變體可天然或非天然存在。非天然存在之變體可藉由使用此領域習知之突變技術製備。變體多肽可包含保守性或非保守性胺基酸取代、缺失或加入。衍生物係指已經改變以表現出未在天然多肽上發現的額外特徵之多肽。實例包括融合蛋白。變體多肽於本文中亦可稱為"多肽類似物"。本文所使用之標的多肽的"衍生物"可含有藉由官能性側基的反應經化學衍生化之一或多個殘基。亦包括的"衍生物"是含有20個標準胺基酸的一或多個天然存在胺基酸衍生物之肽。例如，4-羥基脯胺酸可取代脯胺酸；5-羥基離胺酸可取代離胺酸；3-甲基組胺酸可取代組胺酸；高絲胺酸可取代絲胺酸；及/或鳥胺酸可取代離胺酸。

術語"多核苷酸"欲含括單一核酸及多個核酸且係指分離的核酸分子或構建體，例如信使RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常規磷酸二酯鍵或非常規鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現者)。術語"核酸"係指多核苷酸中存在之任一或多個核酸片段，例如DNA或RNA片段。"分離的"核酸或多核苷酸意指自天然環境取出之核酸分子、DNA或RNA。例如，載體所含的編碼LAL之重組多核苷酸被認為是為本發明之目的而被分離。分離的多核苷酸的其他實例包括異源宿主細胞內的重組多核苷酸或溶液中經純化(部分或實質純化)的多核苷酸。分離的RNA分子包括本發明之多核苷酸的活體內或活體外RNA轉錄體。本發明的分離的多核苷酸或核酸亦包括經合成製備的此等分子。另外，多核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合部位或轉錄終止子。

本文所使用之"編碼區"係部分核酸，其係由將被轉譯成胺基酸的密碼子所構成。雖然"終止密碼子"(TAG、TGA或TAA)不被轉譯成胺基酸，但是其可被認為是編碼區的一部分，然而任何側翼序列(例如啟動子、核糖體結合部位、轉錄終止子、內含子等)不屬編碼區的一部分。本發明的兩個或多個編碼區可存在於單一多核苷酸構建體中，例如在單一載體上或者在分離之多核苷酸構建體中，例如在分離(不同)之載體上。再者，任一載體可含有單一編碼區或可包含兩個或多個編碼區。另外，本發明的載體、多核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，其可與編碼LAL多肽或其片段、變體或衍生物之核酸融合或未融合。異源編碼區包括但不限於特定元件或模體，諸如分泌信號肽或異源功能結構域。

多種轉錄控制區係熟習此領域之人員所習知。該等轉錄控制區包括但不限於：在脊椎動物細胞內發生功能之轉錄控制區，諸如但不限於源自細胞巨大病毒之啟動子和增強子片段(立即早期啟動子，連結內含子A)、猿猴病毒40之啟動子和增強子片段(早期啟動子)及逆轉錄酶病毒(例如羅斯肉瘤病毒)之啟動子和增強子片段。其他轉錄控制區包括衍生自脊椎動物基因的轉錄控制區，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β球蛋白以及能控制真核細胞內基因表現的其他序列。另外合適的轉錄控制區包括組織特異性啟動子和增強子及可由淋巴因子誘導的啟動子(例如可由干擾素或白介素誘導的啟動子)。

類似地，多種轉譯控制元件係熟習此領域之人員所習知。該等轉譯控制元件包括但不限於核糖體結合部位、轉譯起始和終止密碼子及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特別是內部核糖體進入部位或IRES(亦稱為CITE序列))。

於其他實施態樣中，本發明的多核苷酸係RNA，例如呈信使RNA(mRNA)的形式。

本發明的多核苷酸和核酸編碼區可連接其他編碼區，該等其他編碼區編碼分泌肽或信號肽，其指導由本發明的多核苷酸編碼的多肽的分泌。根據信號假說，由哺乳動物細胞所分泌的蛋白具有信號肽或分泌引導序列，且一旦生長蛋白鏈跨越粗內質網之遞出被起始，該信號肽或分泌引導序列會自成熟蛋白剪切。熟習此領域之人員理解脊椎動物細胞所分泌的多肽通常具有與該多肽之N端融合的信號肽，其係自完全或"全長"多肽剪切以產生該多肽之分泌或"成熟"形式。在某些實施態樣中，使用天然信號肽(例如人LAL的信號肽MKMRFLGLVVCLVLWTLHSEG(SEQ ID NO: 2))或保有指導該多肽分泌的能力且可與該多肽操作性連接的該序列之功能性衍生物。或者，可使用異源信號肽(例如異源哺乳動物或禽類信號肽)或其功能性衍生物。例如，野生型引導序列可被人組織纖溶酶原活化子(TPA)或小鼠β葡糖苷酸酶的引導序列取代。

"載體"係指包含單鏈、雙鏈、環狀或超螺旋DNA或RNA的多核苷酸。典型載體可包含於適當間隔下經操作性連接以利功能性基因表現的下述元件：複製原點、啟動子、增強子、5' mRNA引導序列、核糖體結合部位、核酸卡匣、終止和聚腺苷酸化部位及選擇性標記序列。在具體應用時可省略一或多個該等元件。核酸卡匣可包括供待表現之核酸序列插入的限制酶切位點。在功能性載體中，該核酸卡匣包含含有轉譯起始位點和終止位點的待表現之核酸序列。構建體中可任意地包含內含子，例如位於編碼序列的5”端。構建載體，使得特定編碼序列與適當調控序列位於該載體內且該編碼序列相對於該調控序列的位置和方向係使該編碼序列於該控制序列或調控序列的"控制"下被轉錄。為達到此目的，可能需要對編碼所欲之特定蛋白的序列進行修飾。例如，在某些情況下，可能需要修飾該序列，使得該序列能於適當之方向上與控制序列連接或保持讀碼框。在插入至載體之前，可將控制序列和其他調控序列與編碼序列連接。或者，可將編碼序列直接選殖至已含有控制序列和於該控制序列之調控下合適讀碼框內的限制酶切位點的表現載體中。

本文所使用之術語"表現"係指一種方法，藉由該方法使基因產生生物化學品，例如多肽。該方法包括基因於細胞內功能性存在的任何操作，其包括但不限於基因敲除及瞬態表現和穩定表現。該表現包括但不限於使基因轉錄成信使RNA(mRNA)及使該mRNA轉譯成多肽。基因表現產生"基因產物"。本文所使用之基因產物可為核酸(例如由基因轉錄所產生的信使RNA)或由轉錄物轉譯的多肽。本文所述之基因產物亦包括經轉錄後修飾(例如聚腺苷酸化)的核酸或經轉譯後修飾(例如甲基化、糖基化、脂質添加、與其他蛋白次單位連接、蛋白水解剪切等)的多肽。

本文所使用之"宿主細胞"係指含有載體的細胞，該載體係經使用重組DNA技術構建且編碼至少一種異源基因。

本文所使用之術語"N-聚糖"、"寡糖"、"寡糖結構"、"糖基化圖案"、"糖基化輪廓"及"糖基化結構"基本上具有相同意義且均指一或多種結構，該(等)結構係由糖殘基形成且連接糖基化蛋白。

本文所使用之術語"醫藥組成物"係指本文所述之化合物與其他化學成分(諸如載體、安定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑)的混合物。

具有不充足LAL活性的病患

不欲限制本發明為任何特定病症或病症群的治療，本發明包括治療病患之溶酶體酸性脂肪酶(LAL)缺乏症。本文所使用之患有LAL缺乏症的病患係具有不充足LAL活性的任何病患。病患體內不充足LAL活性可例如源自低RNA量、低蛋白量或低蛋白活性之結果。不充足LAL活性可源自LAL編碼序列、LAL調節序列或其他基因(例如調節LAL的基因)的突變。不充足LAL活性亦可為環境因素的結果。

可使用本發明以治療個體或病患之大範圍病症。因此，依據本發明，本發明的範圍包括可藉由外源性LAL有益地治療的任何病症。

本發明的一實施態樣聚焦於治療因溶酶體酸性脂肪酶缺乏所造成的溶酶體貯積病(LSD)，特別是沃爾曼病(WD)和膽固醇酯貯積病(CESD)。不欲限制本發明於任何特定之操作理論或機轉，WD和CESD皆可因LAL基因處突變所造成並導致在多種組織的溶酶體中大量積聚脂質物質及膽固醇和脂質穩態機轉的嚴重干擾，此可依據本發明之方法藉由施予外源性LAL進行治療。因此，在一實施態樣中，依據本發明加以治療的LAL缺乏症係WD。在另一實施態樣中，依據本發明加以治療的LAL缺乏症係CESD。在某些實施態樣中，WD或CESD的診斷係基於基因分析(例如鑑定編碼LAL之序列的功能突變)。在其他實施態樣中，WD或CESD的診斷係基於臨床發現(例如身體檢查及/或實驗室檢驗)。

在某些實施態樣中，外源性LAL可用於治療多種病症(例如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH))的併發症。NAFLD係指與因過量攝取酒精所引起的肝臟疾病具有類似的組織病理的肝臟疾病。NAFLD之表徵為引起肝臟腫大的大泡脂肪變性。NAFLD可發展成NASH，其係指類似於NAFLD且增加可導致纖維化和硬化的肝臟發炎或損害之肝臟疾病。

在某些實施態樣中，外源性LAL可用於治療之病症包括胰臟炎(例如慢性胰臟炎及/或急性胰臟炎)及酒精引起的胰損傷(例如酒精引起的胰臟炎)。

由任何有用之方法所產生的外源性LAL可用於治療因酒精引起的細胞損傷的疾病，其包括但不限於導致脂質酯在身體組織(例如但不限於肝臟、脾臟、腸及心血管組織)中積聚的該等因酒精引起的細胞損傷。根據本發明，吸收障礙亦可藉由施予外源性LAL加以治療。外源性LAL亦可用於治療患有高密度脂蛋白缺乏病(Tangier disease)和家族低α脂蛋白血症的病患。高密度脂蛋白缺乏病/家族低α脂蛋白血症係與膽固醇酯在巨噬細胞中積聚並伴隨有肝脾腫大及/或淋巴結病及低HDL濃度有關，該等疾病可藉由施予外源性LAL加以治療。例如，不欲限制本發明為任何特定之操作理論或機轉，受損的LAL活性可降低ABCA1表現，且相反地藉由施予外源性LAL至患有高密度脂蛋白缺乏病/家族低α脂蛋白血症的病患所增加之LAL活性將增加ABCA1表現，藉以克服因多形性所造成之功能活性降低的ABCA1基因之效果。

在某些實施態樣中，病患在治療前體內LAL之活性濃度為正常LAL活性濃度的約1%、約2%、約3%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%或約80%。在一實施態樣中，病患在治療前體內LAL之活性濃度為正常LAL活性濃度的約50%或更低。在一實施態樣中，病患在治療前體內LAL之活性濃度為正常LAL活性濃度的約40%或更低。在某些實施態樣中，病患在治療前體內LAL之活性濃度為正常LAL活性濃度的約30%或更低。在某些實施態樣中，病患在治療前體內LAL之活性濃度為正常LAL活性濃度的約30%或更低。在某些實施態樣中，病患在治療前體內LAL之活性濃度為正常LAL活性濃度的約20%或更低。在某些實施態樣中，病患在治療前體內LAL之活性濃度為正常LAL活性濃度的約10%或更低。在某些實施態樣中，病患在治療前體內LAL之活性濃度為正常LAL活性濃度的約5%或更低。在某些實施態樣中，病患在治療前顯示不可測得的LAL活性。

在某些實施態樣中，LAL活性濃度係在得自患有LAL缺乏症之人病患的經培養之纖維組織母細胞中測量。在某些實施態樣中，LAL活性濃度係在患有LAL缺乏症之人病患的淋巴細胞(例如白血球)中測量。淋巴細胞包括但不限於周圍血液單核細胞(PMBC)。測量方法係描述於例如Burton et al.,(1980) Clinica Chimica Acta 101: 25-32和Anderson et al.,(1999) Mol. Genet. & Metab.,66: 333-345，該等文獻之全部內容係併入本文。經外源性LAL治療的LAL缺乏症病患所表現的纖維組織母細胞LAL酶催化活性係小於約30、約20、約10、約5、約4、約3、約2或約1 pmol/mg/分鐘(min)，其係使用三油酸甘油酯作為受質進行測量。經外源性LAL治療的LAL缺乏症病患所表現的白血球LAL酶催化活性係小於約30、約20、約10、約5、約4、約3、約2或約1 pmol/mg/min，其係使用三油酸甘油酯作為受質進行測量。經外源性LAL治療的LAL缺乏症病患所表現的纖維組織母細胞LAL酶催化活性係小於約30、約20、約10、約5、約4、約3、約2或約1 pmol/mg/min，其係使用膽甾醇油酸酯作為受質進行測量。經外源性LAL治療的LAL缺乏症病患所表現的白血球LAL酶催化活性係小於約30、約20、約10、約5、約4、約3、約2或約1 pmol/mg/min，其係使用膽甾醇油酸酯作為受質進行測量。

施予外源性LAL

本發明提供使用外源性LAL以治療人病患之方法，其包含對該病患施予外源性LAL，其中該施予係足以使該病患恢復生長、改善肝功能、降低肝臟損害、增加組織LAL濃度及/或增加LAL活性。為治療因LAL缺乏所產生之病症(其包括WD和CESD)，本發明提供有用且先前未經表徵的外源性LAL之施予頻率(即給藥方案)及先前未經表徵的施予劑量。

本發明提供外源性LAL之治療有效劑量，該治療有效劑量將於每5天1次至每30天1次施予至病患體內達一段期間，該期間係由熟習醫藥領域之人員加以確定。在一實施態樣中，該期間將是病患壽命的剩餘時間。在一實施態樣中，所施予之劑量頻率為每5天1次至每25天1次。在一實施態樣中，所施予之劑量頻率為每5天1次至每21天1次。在另一實施態樣中，所施予之劑量頻率為每7天1次至每14天1次。外源性LAL可以每5天1次、每6天1次、每7天1次、每8天1次、每9天1次、每10天1次、每11天1次、每12天1次、每13天1次或每14天1次施予。在某些實施態樣中，外源性LAL約經每週施予。在其他實施態樣中，外源性LAL約經每兩周施予。在一實施態樣中，所施予之劑量頻率係約每30天1次。

為治療病症，通常所施予的外源性LAL量可取決於習知因素而加以改變，例如接受者的年齡、健康及重量、同期進行治療的類型、治療頻率等。通常，活性成分的劑量可介於約0.01至約50 mg/千克體重。在一實施態樣中，依據本發明，外源性LAL的劑量為約0.1至0.5 mg/千克體重。在一實施態樣中，劑量為約0.1 mg至約5.0 mg/千克。在一實施態樣中，劑量為約0.1 mg至約5.0 mg/千克。在一實施態樣中，劑量為約0.1、約0.2、約0.25、約0.30、約0.35、約0.40、約0.45、約0.50 mg/千克。在一實施態樣中，劑量為約1 mg至約5 mg/千克。在一實施態樣中，劑量為約1 mg/千克。在一實施態樣中，劑量為約3 mg/千克。例如，可施予0.1 mg/千克體重、0.2 mg/千克體重、0.3 mg/千克體重、0.4 mg/千克體重、0.5 mg/千克體重、1 mg/千克體重、2 mg/千克體重、3 mg/千克體重、4 mg/千克體重或5 mg/千克體重。在一實施態樣中，劑量為約1 mg至約20 mg/千克體重。

本發明亦包括當使用本發明的劑量方案時之其他劑量。例如，依據本發明的劑量方案，對病患施予約0.1 mg至約50 mg/千克體重。

在某些實施態樣中，將約0.5至約50 mg外源性LAL施予至例如患有沃爾曼病的1至24個月大的病患。在一實施態樣中，病患年齡小於1歲。在另一實施態樣中，病患年齡小於2歲。在某些實施態樣中，對患有沃爾曼病的病患施予約0.1 mg、約0.2 mg、約0.3 mg、約0.4 mg、約0.5 mg、約1 mg、約2 mg、約3 mg、約5 mg、約10 mg、約15 mg、約20 mg、約25 mg、約30 mg、約35 mg、約40 mg或約45 mg外源性LAL。在某些實施態樣中，對患有沃爾曼病的病患施予約0.5至約30 mg、約0.5至約20 mg、約0.5至約10 mg或約0.5至約5 mg。在某些實施態樣中，施予約1至約30 mg、約1至約20 mg、約1至約10 mg或約1至約5 mg。

在某些實施態樣中，對例如經診斷患有CESD的病患施予約1 mg至約350 mg外源性LAL。因此，在某些實施態樣中，對CESD病患施予約1、5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350 mg外源性LAL。在某些實施態樣中，對CESD病患施予約5至約350 mg、約5至約300 mg、約5至約250 mg或約5至約200 mg。在某些實施態樣中，對CESD病患施予約10至約350 mg、約10至約300、約10至約250或約10至約200 mg。

組合治療

本文所揭露的治療蛋白可與其他治療劑併用。本發明提供預處理方法，藉以使經由依據本發明所施予之外源性LAL所可能導致的任何潛在之過敏性反應最小化或預防該過敏性反應。在一實施態樣中，為預處理潛在之過敏性反應，對病患施予H-1受體拮抗劑(亦稱為抗組織胺劑(例如苯海拉明))。在一實施態樣中，該H-1受體拮抗劑係以約1 mg至約10 mg/千克體重的劑量施予。例如，抗組織胺劑之施予劑量可為約5 mg/千克。該抗組織胺劑的施予可先於本發明的外源性LAL的施予。在一實施態樣中，該H-1受體拮抗劑在施予外源性LAL之前約10至約90分鐘(例如約30至約60分鐘)施予。該H-1受體拮抗劑可經使用與血管接入埠連接的流動系統施予。在一實施態樣中，該抗組織胺劑係在施予外源性LAL之前約90分鐘施予。在一實施態樣中，該抗組織胺劑係在施予外源性LAL之前約10至約60分鐘施予。在另一實施態樣中，該抗組織胺劑係在施予外源性LAL之前約20至約40分鐘施予。例如，該抗組織胺劑可在施予外源性LAL之前20、25、30、35或40分鐘施予。在一實施態樣中，所施予的抗組織胺劑係苯海拉明。可使用任何有用的抗組織胺劑。該等抗組織胺劑包括但不限於克立馬丁、多西拉敏、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、非尼拉敏、西替立嗪、依巴斯汀、異丙嗪、氯苯那敏、左西替利嗪、奧洛他定、喹硫平、氯苯甲嗪、乘暈寧、恩布拉敏、二甲叮啶及去氯菲胺。

在一實施態樣中，該抗組織胺劑的施予劑量為約0.1 mg至約10 mg/千克體重。在一實施態樣中，該抗組織胺劑的施予劑量為約 1mg至約5 mg/千克體重，例如1 mg、2 mg、3 mg、4 mg或5 mg/千克體重。該抗組織胺劑可藉由任何有用之方法進行施予。在一實施態樣中，該抗組織胺劑係經靜脈內施予。在另一實施態樣中，該抗組織胺劑係經藥學上可接受的膠囊施予。

在另一實施態樣中，對於靜脈內輸注，潛在之過敏性反應可藉由施予使用增量(ramp-up)方案之輸注加以降低。對此，該增量方案係指在輸注期間緩慢地提高輸注速率，藉以使病患對藥物的輸注去敏化。

若預期病患會發生或該病患已經歷過敏性反應或不良之免疫應答，則於施予外源性LAL之前、期間或之後施予免疫抑制劑，該免疫抑制劑係諸如但不限於抗組織胺劑、皮質類固醇、西羅莫司、沃環孢素、西環孢素、甲胺蝶呤、IL-2受體定向抗體、T細胞受體定向抗體、TNF-α定向抗體或融合蛋白(例如英夫利昔單抗、依那西普或阿達木單抗)、CTLA-4-Ig(例如abatacept)及抗-OX-40抗體。

本發明亦包含涉及施予含有外源性LAL的組成物與一或多種降膽固醇劑(例如HMG-CoA還原酶抑制劑)之治療。該等降膽固醇劑的非限制性實例包括阿伐他汀(和)、氟伐他汀()、洛伐他汀()、匹伐他汀(,)、普伐他汀()、羅蘇伐他汀()及斯伐他汀()。

外源性LAL的效果

本發明提供經使用外源性LAL治療後與疾病相關症狀的校正或正常化。回應外源性LAL的臨床進展(即症狀改善)可藉由任何有用之方法或步驟進行監控。

在某些實施態樣中，施予外源性LAL係足以達到Cmax介於約200 ng/mL至1,000 ng/mL。在某些實施態樣中，施予外源性LAL係足以達到Cmax介於約200 ng/mL至800 ng/mL。在某些實施態樣中，施予外源性LAL係足以達到Cmax為約200 ng/mL、約300 ng/mL、約400 ng/mL、約500 ng/mL、約600 ng/mL、約700 ng/mL、約800 ng/mL、約900 ng/mL或約1,000 ng/mL。在某些實施態樣中，在輸注過程中達到Cmax。

在某些實施態樣中，外源性LAL的施予係足以達到LAL半衰期(t_1/2 )小於30分鐘。在某些實施態樣中，施予外源性LAL係足以達到LAL半衰期(t_1/2 )小於20分鐘。在某些實施態樣中，施予外源性LAL係足以達到LAL半衰期(t_1/2 )小於15分鐘。在某些實施態樣中，施予外源性LAL係足以達到LAL半衰期(t_1/2 )小於10分鐘。在某些實施態樣中，施予外源性LAL係足以達到LAL半衰期(t_1/2 )為約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分鐘。

在某些實施態樣中，外源性LAL增加病患體內LAL活性。可於例如肝臟、脾臟、淋巴結、大動脈、周圍血液白血球及/或皮膚纖維組織母細胞中增加LAL活性。在某些實施態樣中，在分離自血液樣品的淋巴細胞之萃取物中測量LAL活性。

外源性LAL可使LAL活性比施予LAL之前的活性增加至少約1.5、約2、約2.5、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15或約20倍。外源性LAL可使LAL活性比施予LAL之前的活性增加至少約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20倍。LAL活性可經使用此領域之任何習知方法進行評估，該方法包括例如使用膽甾醇[1-¹⁴ C]油酸酯、三油酸甘油酯(三[1-¹⁴ C]油酸甘油酯)、對硝基苯基肉豆蔻酸酯或4-MUO(4-甲基繖形酮油酸酯)受質進行檢測。

在一實施態樣中，器官和組織體積與表徵係用於確定施予本發明的外源性LAL後病症的改善。

在一實施態樣中，施予外源性LAL後肝功能/損傷的臨床進展係藉由在一定時間內定量血液轉胺酶(例如天冬胺酸轉胺酶(AST)及/或丙胺酸轉胺酶(ALT))及/或其他生物標記(例如白蛋白、鹼性磷酸酶及膽紅素(直接和總計))進行監控。

在一實施態樣中，使用影像技術監控臨床進展。例如且不受限制地，所使用的影像技術可為超音波、CT掃描、核磁共振顯像及核磁共振光譜。

在某些實施態樣中，施予本文所述之劑量的外源性LAL係足以使人病患恢復生長及/或增加體重。施予外源性LAL亦可使患有早發性LAL缺乏症的嬰兒或兒童病患增加生長速率(即體重增加)。例如，施予外源性LAL可使體重增加速率增為施予前所觀察的生長速率/速度之至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%、約400%或約500%。在某些實施態樣中，施予外源性LAL使患有早發性LAL缺乏症(例如WD)的年齡約1至約12個月的兒童病患恢復正常生長速率。於本文中，"正常"係指醫學領域之普通技術人員所測定的經治療之病患的正常生長速率。

在一實施態樣中，例如關於WD和CESD或其他LAL缺乏症，肝腫大明顯逆轉且肝臟大小回復至大於正常大小的約1%至約60%範圍內。本文中，"正常"係指醫學領域之普通技術人員所測定的經治療之病患的正常肝臟大小。在一實施態樣中，肝臟大小減小至大於正常大小的約1%至約50%。在另一實施態樣中，肝臟大小減小至大於正常大小的約1%至約40%。在一實施態樣中，肝臟大小減小至大於正常大小的約1%至約30%。在另一實施態樣中，肝臟大小減小至大於正常大小的約1%至約20%。在另一實施態樣中，肝臟大小減小至大於正常大小的約10%至約20%。例如，肝臟可大於正常大小的10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。再於另一實施態樣中，肝臟大小減小至大於正常大小的約0%至約10%。例如，肝臟可大於正常肝臟大小的0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。

使用外源性LAL治療亦可改善肝功能。因此，在某些實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以恢復正常肝功能及/或使肝臟檢驗正常化。在某些實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使肝臟轉胺酶血清濃度降低例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%及/或至少約90%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使肝臟轉胺酶血清濃度降低至少40%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使肝臟轉胺酶血清濃度降低至少50%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使肝臟轉胺酶血清濃度降低至少約60%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使肝臟轉胺酶血清濃度降低至少約70%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使肝臟轉胺酶血清濃度降低至少約80%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使肝臟轉胺酶血清濃度降低至少約90%。

在某些實施態樣中，肝臟轉胺酶係丙胺酸轉胺酶(ALT)。在一實施態樣中，施予外源性LAL係足以降低血清ALT。例如，施予外源性LAL可使血清ALT降低例如至少約50%、60%、70%、80%或90%。血清ALT濃度係作為肝臟損傷的指示。因此，本發明亦含括減少患有LAL缺乏症之人病患的肝臟損傷之方法，其係藉由施加有效量的外源性LAL以降低血清ALT。

在某些實施態樣中，肝臟轉胺酶是血清天冬胺酸轉胺酶(AST)。在一實施態樣中，施予外源性LAL係足以降低血清AST。例如，施予外源性LAL可使血清AST降低例如至少約50%、60%、70%、80%或90%。血清AST濃度係作為肝臟損傷的指示。因此，本發明亦含括減少患有LAL缺乏症之人病患的肝臟損傷之方法，其係藉由施加有效量的外源性LAL以降低血清AST。

在某些實施態樣中，使用外源性LAL治療可降低血清鐵蛋白濃度。因此，在某些實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使血清鐵蛋白濃度降低例如至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使血清鐵蛋白濃度降低至少50%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使血清鐵蛋白濃度降低至少約60%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使血清鐵蛋白濃度降低至少約70%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使血清鐵蛋白濃度降低至少約80%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使血清鐵蛋白濃度降低至少約90%。在一實施態樣中，使用外源性LAL治療係足以使血清鐵蛋白濃度降低至少約95%。

在一實施態樣中，例如關於沃爾曼病和CESD或其他LAL缺乏症，脾腫大明顯逆轉且脾臟大小回復至大於正常大小的約1%至約60%範圍內。本文中，"正常"係指醫學領域之普通技術人員所測定的經治療之病患的正常脾臟大小。在一實施態樣中，脾臟大小減小至大於正常大小的約1%至約50%。在另一實施態樣中，脾臟大小減小至大於正常大小的約1%至約40%。在一實施態樣中，脾臟大小減小至大於正常大小的約1%至約30%。在另一實施態樣中，脾臟大小減小至大於正常大小的約1%至約20%。在另一實施態樣中，脾臟大小減小至大於正常大小的約10%至約20%。例如，脾臟可大於正常大小的10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在另一實施態樣中，脾臟大小減小至大於正常大小的約0%至約10%。例如，脾臟可大於正常脾臟大小的0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。

在一實施態樣中，施予外源性LAL係足以減輕淋巴結病(即腫大淋巴結)。因此，在某些實施方案中，淋巴結減小至約大於正常大小的約1%至約60%範圍內。本文中，"正常"係指醫學領域之普通技術人員所測定的經治療之病患的正常淋巴結大小。在一實施態樣中，淋巴結大小減小至大於正常大小的約1%至約50%。在另一實施態樣中，淋巴結大小減小至大於正常大小的約1%至約40%。在一實施態樣中，淋巴結大小減小至大於正常大小的約1%至約30%。在另一實施態樣中，淋巴結大小減小至大於正常大小的約1%至約20%。在另一實施態樣中，淋巴結大小減小至大於正常大小的約10%至約20%。例如，淋巴結可大於正常大小的10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在另一實施態樣中，淋巴結大小減小至大於正常大小的約0%至約10%。例如，淋巴結可大於正常淋巴結大小的0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。

在另一實施態樣中，進行脂質分析以監控病症的改善。例如，可進行脂質分析以評估外源性LAL的治療效果。可藉由任何有用之方法對病患的組織樣品(例如血液樣品、肝臟組織切片樣品)進行脂質分析，該等方法係諸如但不限於熟習此領域之技術人員認為合適的高效液相層析、氣相層析、質譜或薄層層析或彼等之任何組合。在一實施態樣中，依據本發明進行的脂質分析證實總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及/或膽甾醇酯的濃度。

在一實施態樣中，例如關於沃爾曼病和CESD或其他LAL缺乏症，依據本發明所治療之病患的脂質分析顯示肝臟、脾臟、腸、淋巴結及/或大動脈中脂質濃度的正常化，此可由醫學領域之普通技術人員測定。

脂質濃度可使用血漿脂質分析或組織脂質分析進行評估。於血漿脂質分析中，可收集血漿，且可使用例如比色檢測用COD-PAP套組(Wako Chemicals)以測量全血漿游離膽固醇濃度，可使用例如甘油三酯/GB套組(Boehringer Mannheim)以測量全血漿甘油三酯濃度，及/或可使用膽固醇/HP套組(Boehringer Mannheim)以測定全血漿膽固醇濃度。於組織脂質分析中，脂質可萃取自例如肝臟、脾臟及/或小腸樣品(例如使用Folch et al. J. Biol. Chem 226: 497-505(1957)所描述的Folch方法)。可例如使用O-苯二醛以測量全組織膽固醇濃度。

在某些實施態樣中，施予外源性LAL係足以增加營養吸收。在一實施態樣中，施予外源性LAL能增加營養吸收，此係藉由測量血清α生育酚、25OH維生素D、血清視黃醇、二去氫視黃醇、轉甲狀腺素蛋白及血清鐵蛋白的濃度。在一實施態樣中，使用外源性LAL以降低患有LAL缺乏症的人病患之血清鐵蛋白濃度。

在某些實施態樣中，例如關於WD和CESD或其他LAL缺乏症，施予外源性LAL係足以增加血清血紅蛋白(Hb)濃度。在一實施態樣中，相較於施予外源性LAL之前所觀察者，血紅蛋白濃度增加至少約10%或約20%。

在某些實施方案中，外源性LAL可經使副作用最小之使用方法進行施予。例如，施予外源性LAL可使對外源性LAL的免疫應答最小。

LAL和包含外源性LAL的醫藥組成物

本發明包含治療任何本文所述之LAL缺乏相關病症和先前未述及之其他病症(但彼等將受益於該治療)。依據本發明，使用之外源性LAL包括重組LAL，該重組LAL可在任何有用的蛋白表現系統中產製，該蛋白表現系統包括但不限於細胞培養(例如CHO細胞,COS細胞)、細菌(諸如大腸桿菌(E. coli))、轉殖基因動物(諸如哺乳動物和禽類(例如雞、鴨及火雞))及植物系統(例如浮萍和煙草植物)。本發明的一方面涉及重組LAL，其產製係述於Du et al.,(2005) Am. J. Hum. Genet. 77: 1061-1074和Du et al.,(2008) J. Lipid Res.,49: 1646-1657，彼等之揭露內容係全部併入本文。在一有用之實施態樣中，外源性LAL在轉殖基因禽(例如轉殖基因小雞)的輸卵管中產生，例如2011年4月23日提出申請的PCT/US2011/033699所描述之方法，彼之揭露內容係全部併入本文。在某些實施態樣中，重組LAL係在禽細胞系中產生。在某些實施態樣中，重組LAL係在哺乳動物(例如人)細胞系中產生。

在一實施態樣中，依據本發明所使用的外源性溶酶體酸性脂肪酶含有聚糖，該聚糖具有實質之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)和甘露糖末端N-連接的結構。外源性LAL的GlcNAc和甘露糖末端聚糖可被巨噬細胞與纖維組織母細胞特異性辨識和內部化。甘露糖-6-磷酸酯(M6P；其可使蛋白靶向GlcNAc/甘露糖受體，該受體可藉由施予外源性LAL進行治療所涉及的病症之細胞上表現)亦典型地存在於本發明所使用的外源性LAL上。

通常，本文討論和描述的本發明之外源性LAL係人LAL。在一實施態樣中，外源性LAL具有Genbank RefSeq NM_000235.2所提供的胺基酸序列。在一實施態樣中，成熟外源性LAL具有下述之胺基酸序列：

SGGKLTAVDPETNMNVSEIISYWGFPSEEYLVETEDGYI

LCLNRIPHGRKNHSDKGPRPVVFLQHGLLADSSNWVT

NLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSV

SQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFILNKTGQEQVYYVG

HSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSP

MAKLGRLPDHLIKDLFGDREFLPQSAFLKWLGTHVCTH

VILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGT

SVQNMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSY

PPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQIT

NLVFHESIPEWEHLDFIWGLDAPWRLYNKIINLMRKYQ

(SEQ ID NO: 1)

在某些實施態樣中，外源性LAL包含SEQ ID NO: 1的胺基酸1-378、SEQ ID NO: 1的胺基酸3-378、SEQ ID NO: 1的胺基酸6-378或SEQ ID NO: 1的胺基酸7-378。在某些實施態樣中，外源性LAL包含至少兩種選自SEQ ID NO: 1的胺基酸1-378、SEQ ID NO: 1的胺基酸3-378、SEQ ID NO: 1的胺基酸6-378或SEQ ID NO: 1的胺基酸7-378之多肽的混合物。在某些實施態樣中，外源性LAL包含含有SEQ ID NO: 1的胺基酸1-378的多肽、含有SEQ ID NO: 1的胺基酸3-378的多肽及含有SEQ ID NO: 1的胺基酸6-378之多肽的混合物。

在某些實施態樣中，外源性LAL包含與SEQ ID NO: 1的胺基酸1-378、SEQ ID NO: 1的胺基酸3-378、SEQ ID NO: 1的胺基酸6-378或SEQ ID NO: 1的胺基酸7-378相一致之多肽。在其他實施態樣中，外源性LAL包含與SEQ ID NO: 1的胺基酸1-378、SEQ ID NO: 1的胺基酸3-378、SEQ ID NO: 1的胺基酸6-378或SEQ ID NO: 1的胺基酸7-378至少約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相一致之多肽。在某些實施態樣中，外源性LAL包含SEQ ID NO: 1的功能片段或包含與SEQ ID NO: 1的功能片段至少約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相一致之多肽。

在某些實施態樣中，外源性LAL係2011年4月23日提出申請的PCT/US2011/033699所描述之重組LAL蛋白，彼之揭露內容係全部併入本文。

經確認的是，不一致的胺基酸位置通常係經保守性胺基酸取代，其中胺基酸殘基係經具有類似化學性能(例如電荷或疏水性)的其他胺基酸殘基取代，因此不會改變分子的功能性質。若序列不同於保守性取代時，則序列一致百分率可向上調節以校正取代的保守性質。進行該調節的方式係熟習此技藝之人員所習知。保守性取代的計分可依據例如Meyers & Millers,Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17(1988)的演算法計算。

"比較窗"係指相鄰位置的片段，諸如約25至約400個位置、或約50至200個位置、或約100至150個位置，在上述範圍內，兩個序列經最適比對後，片段序列可與相同之相鄰位置數目的參考序列比較。用於比較的序列比對方法係此領域所習知。用於比較的序列最適比對可例如藉由局部同源性演算法(Smith & Waterman,Adv. Appl. Math. 2: 482(1981))、總體比對演算法(Needleman & Wunsch,J. Mol. Biol. 48: 443(1970))、類似檢索方法(Pearson & Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444(1988)；Altschul et al.,Nucl. Acids Res. 25: 3389-402(1997))、典型地使用除錯設定之此等演算法的電腦實施方式(例如Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.之GAP、BESTFIT、FASTA及BLAST)、或人工比對和視覺檢查(例如參閱Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.(eds.),1994)進行。例如，BLAST蛋白檢索可使用XBLAST程式，分數=50,字長=3進行，藉以獲得與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列或其片段超過80%一致性的胺基酸序列。

使用演算法實施的實例是PILEUP。PILEUP係藉由使用進行性配對比對自一組相關序列以產生多序列比對。亦可繪製系統樹圖，其顯示用於產生比對的集群關係。PILEUP使用Feng & Doolittle,J. Mol. Evol. 35: 351-360(1987)的進行性比對方法的簡化版。所使用之方法類似於Higgins & Sharp,CABIOS 5: 151-3(1989)所描述之方法。多比對程式開始於兩個最類似序列的配對比對，從而產生兩個比對序列的集群。然後，該集群可比對於後續最相關序列或比對序列的集群。序列的兩個集群可藉由兩個個體序列的配對比對的簡便延伸以進行比對。包括相異增加的序列或序列集群的一系列此種配對比對在各重複處產生最終比對。

在某些實施態樣中，本發明的外源性LAL多肽包括野生型序列的變體。該等變體符合下述3種類別中的一或多種：取代、插入或刪除變體。該等變體可為天然存在之對偶基因變體或種間變體，或彼等可藉由編碼蛋白之DNA中核苷酸的部位特異性突變製備。部位特異性突變可使用卡匣或PCR突變或其他此領域所習知的技術進行，藉以產生編碼變體的DNA，並隨後在重組細胞培養中表現該DNA。具有達約100-150個胺基酸殘基的變體標的蛋白片段可藉由使用已建立的技術經活體外合成製備。提供功能上類似胺基酸的保守性取代表係此領域所習知(Henikoff & Henikoff,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915-10919(1992))。

胺基酸取代通常是單一殘基取代。插入通常是約1至約20個胺基酸的等級，雖然可容忍相對較長的插入。刪除範圍為約1至約20個殘基，雖然在某些情況下刪除可以更長。取代、刪除及插入或彼等之任何組合可用於生成最終之衍生物。

在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為至少約100 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為至少約200 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為至少約250 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為約100至約1000 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為約100至約500 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為約100至約350 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為約200至約350 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為約250至約350 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為約250 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為約275 U/mg。在某些實施態樣中，外源性LAL的比活性為約300 U/mg。

人LAL之胺基酸序列含有6個用於N-連接糖基化之潛在部位：Asn36、Asn72、Asn101、Asn161、Asn273及Asn321，如示於SEQ ID NO: 1。在某些實施態樣中，至少1、2、3、4或5個N-連接糖基化部位經糖基化。在某些實施態樣中，所有該6個糖基化部位經糖基化。在某些實施態樣中，Asn36、Asn101、Asn161、Asn273及Asn321經糖基化。在某些實施態樣中，Asn36、Asn101、Asn161、Asn273及Asn321經糖基化，且Asn72未經糖基化。在某些實施態樣中，N-聚糖結構包含具有N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、甘露糖及/或甘露糖-6-磷酸酯(M6P)的二、三及四觸角結構。在某些實施態樣中，外源性LAL在Asn101、Asn161及Asn273處包含經M6P-修飾的N-聚糖。在某些實施態樣中，外源性LAL不包含O-連接的聚糖。在某些實施態樣中，外源性LAL不包含唾液酸。在某些實施態樣中，外源性LAL具有如2011年4月23日提出申請的PCT/US2011/033699所描述之糖基化形態，該文獻之全部內容併入本文作為參考。

在某些實施態樣中，外源性LAL的分子量約55 kD。

在某些實施態樣中，個體可使用例如載體之編碼外源性LAL的核酸分子進行治療。編碼多肽的核酸之劑量為約10 ng至1 g、100 ng至100 mg、1 μg至10 mg或30-300 μg DNA/病患。感染性病毒載體的劑量係10-100或更多個病毒粒子/劑。

在本發明的某些實施態樣中，經治療方法施予外源性LAL，該治療方法包括：(1)使用核酸(例如載體)轉形或轉染可移植之宿主細胞，該宿主細胞能表現LAL或彼之活性片段、變體或衍生物；及(2)將經轉形的宿主細胞移植至哺乳動物體內。在本發明的某些實施態樣中，可移植之宿主細胞取自哺乳動物，經分離的編碼外源性LAL的核酸暫時培養、轉形或轉染，且移植回與所取出之哺乳動物相同的哺乳動物體內。該細胞可以但並不需要自被移植的相同部位處取出。此等實施態樣(有時稱為活體外基因療法)可於有限時間內提供外源性LAL多肽的連續供應。

雖然重組LAL可以其原始形式經施予以用於提供本發明的治療蛋白，但是優選施予之治療蛋白係作為醫藥製劑的一部分。

因此，本發明亦提供醫藥製劑，其包含禽類衍生的糖基化治療蛋白或其藥學上可接受的衍生物及一或多種藥學上可接受的載體以及任意地其他治療及/或預防成分，且本發明亦提供施予該醫藥製劑之方法。本發明亦提供醫藥製劑，其包含哺乳動物衍生的糖基化治療蛋白或其藥學上可接受的衍生物及一或多種藥學上可接受的載體以及任意地其他治療及/或預防成分，且本發明亦提供施予該醫藥製劑之方法。

載體必須是"可接受的"，其意義係能與該製劑的其他成分相容且無害於接受者。使用本發明的醫藥組成物以治療病患之方法(例如施予藥物蛋白的量、施予頻率及治療持續時間)可經熟習此領域之醫師所習知的標準方法加以確定。

醫藥製劑包括適於經口服、直腸、鼻腔、局部(其包括頰和舌下)、陰道或胃腸外施予者。醫藥製劑包括適於經肌肉內、皮下及靜脈內注射施予者。醫藥製劑亦包括經吸入或吹入施予者。若合適，該等製劑可方便地配置於各別之劑量單位中且可藉由藥學領域習知的任何方法加以製備。製備醫藥製劑之方法典型地包括下列步驟：使治療蛋白結合液體載體或細分固體載體或該兩者，然後若需要使產物定形成所欲之製劑。

適於口服的醫藥製劑可方便地配置成各別單位，例如均含有預定量的活性成分的膠囊、扁囊或片劑；粉末或顆粒；溶液；懸浮劑；或乳劑。活性成分亦可配置為大丸劑、藥糖劑或糊劑。用於口服的片劑和膠囊可含有慣用之賦形劑，例如黏合劑、填料、潤滑劑、崩解劑或潤濕劑。片劑可依據此領域所習知之方法進行包衣。口服液體製劑可呈例如水性或油性懸浮劑、溶液、乳劑、糖漿或酏劑的形式，或可配置呈乾燥產物以利於在使用前與水或其他合適的載劑重構。此等液體製劑可含有慣用之添加劑，例如助懸劑、乳化劑、非水性載劑(其可包括食用油)或防腐劑。

本發明的治療蛋白亦可經配製以用於胃腸外施予(例如藉由注射，如大丸注射或連續輸注)且可與添加的防腐劑配置呈安瓿、預填充注射器、小體積輸注或多劑量容器的單位劑型。治療蛋白可例如藉由皮下注射、肌肉內注射及靜脈內(IV)輸注或注射的方式進行注射。

在一實施態樣中，外源性LAL可藉由任何有用之方法經IV輸注進行靜脈內施予。在一實例中，外源性LAL可藉由外部管線經靜脈輸注施予。在另一實例中，外源性LAL可藉由外部插入的中心導管經靜脈輸注施予。在另一實例中，外源性LAL可藉由附接靜脈血管接入埠的流動輸注機促進靜脈輸注施予。在一靜脈輸注的實施態樣中，取決於輸注藥物的量和病患之先前輸注相關反應史，藥物在1至8小時的時間內施予，此係由此領域之醫師確定。在另一實施態樣中，外源性LAL係藉由IV注射經靜脈施予。在另一實施態樣中，外源性LAL可經腹膜內注射施予。在另一實施態樣中，外源性LAL係藉由治療蛋白的藥學上可接受的膠囊施予。例如，膠囊可為腸包衣的明膠膠囊。

在某些實施態樣中，治療蛋白係藉由輸注施予且該輸注可在延長時間(例如30分鐘至10小時)內進行。因此，輸注可在例如約1小時、約2小時、約3小時、約4小時或約5小時內進行。輸注亦可經多種速率進行。因此，例如，輸注速率可為約1 ml/小時至20 ml/小時。在某些實施態樣中，輸注速率為5 ml至10 ml/小時。在一實施態樣中，輸注速率為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 ml/小時。在一實施態樣中，輸注速率為0.1至5 mg/kg/hr。在一實施態樣中，輸注速率為約0.1、約0.2、約0.3、約0.5、約1.0、約1.5、約2.0或約3 mg/kg/hr。

治療蛋白可採用例如於油性或水性載劑中之懸浮劑、溶液或乳劑之形式且可含有調製用劑，諸如助懸劑、穩定劑及/或分散劑。治療蛋白可呈粉末形式，其係藉由無菌固體的無菌分離或溶液的冷凍乾燥獲得，藉以於使用前與合適的載劑(例如無菌、無熱源水)重構。

對於表皮之局部施予，依據本發明所製備的治療蛋白可配製成油膏、乳膏或塗劑或者透皮貼劑。油膏和乳膏可經例如水性或油性基質調製並添加合適的增稠劑及/或凝膠劑。塗劑可經水性或油性基質調製且通常亦含有一或多種乳化劑、安定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。

適於口腔局部施予的製劑包括：錠劑，其包含於香味基質(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中的活性成分；香錠，其包含於惰性基質(例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)中的活性成分；及漱口劑，其包含於合適液體載體中的活性成分。

適於直腸施予之醫藥製劑(其中載體是固體)的最優選代表為單位劑量栓劑。合適的載體包括可可油和此領域通常使用的其他材料，且栓劑可方便地經下列方式形成：令活性化合物與軟化或熔融載體混合，然後經驟冷並在模具中成形。

適於陰道施予的製劑可呈子宮托、止血栓、油霜、凝膠、糊、泡沫或噴霧劑的形式，其含有除活性成分外之載體，諸如此領域習知合適者。

對於鼻內施予，本發明的治療蛋白可呈液體噴霧劑或可分散粉末或滴鼻劑的形式。

滴鼻劑可經水性或非水性基質調製且亦包含一或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。液體噴霧劑可方便地自加壓包遞送。

對於吸入施予，依據本發明的治療蛋白可方便地自吹入器、噴霧器或加壓包或者遞送氣溶膠噴霧的其他方便裝置遞送。加壓包可包含合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。對加壓氣溶膠，劑量單位可藉由設置閥以遞送經計量的量加以確定。

對於吸入或吹入施予，依據本發明的治療蛋白可呈乾燥粉末組成物的形式，例如化合物與合適的粉末基質(例如乳糖或澱粉)的粉末混合物。該粉末組合物可呈單位劑型，例如膠囊或匣劑，例如在吸入器或吸進器之輔助下可施予粉末的明膠或泡罩包。

當需要時，可使用適於提供活性成分的緩慢釋放的上述製劑。

本發明的醫藥組成物亦可含有其他活性成分，例如抗菌劑或防腐劑。

在某些實施態樣中，外源性LAL在醫藥組成物中之濃度約0.5至約10 mg/ml。在某些實施態樣中，LAL濃度為約1至約5 mg/ml。在某些實施態樣中，LAL濃度為約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5或約7.5 mg/ml。

在某些實施態樣中，包含外源性LAL的醫藥組成物亦包含緩衝劑。示例性緩衝劑包括乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽及麩胺酸鹽緩衝劑。示例性緩衝劑亦包括檸檬酸鋰、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸鈣、乳酸鋰、乳酸鈉、乳酸鉀、乳酸鈣、磷酸鋰、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈣、馬來酸鋰、馬來酸鈉、馬來酸鉀、馬來酸鈣、酒石酸鋰、酒石酸鈉、酒石酸鉀、酒石酸鈣、琥珀酸鋰、琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鈣、乙酸鋰、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸鈣及彼等之混合物。在某些實施態樣中，緩衝劑是檸檬酸三鈉二水合物。在某些實施態樣中，緩衝劑是檸檬酸單水合物。在某些實施態樣中，醫藥組成物包含檸檬酸三鈉脫水物和檸檬酸單水合物。

在某些實施態樣中，包含外源性LAL的醫藥組成物亦包含安定劑。示例性之安定劑包括白蛋白、海藻糖、糖、胺基酸、多元醇、環糊精、鹽(例如氯化鈉、氯化鎂及氯化鈣)、凍乾保護劑及彼等之混合物。在某些實施態樣中，該醫藥組成物包含入血清白蛋白。

在特定實例中，如本文揭露所製備的重組人LAL係用於醫藥製劑，其中每1毫升含有外源性LAL(例如2 mg LAL)、檸檬酸三鈉脫水物(例如13.7 mg)、檸檬酸單水合物(例如1.57 mg)及人血清白蛋白(例如10 mg)且經配製成酸性pH(例如5.9±0.1)。

本發明包含促進外源性LAL攝取至相關器官和組織的溶酶體內的任何施予途徑。

下列特定實施例欲用於說明本發明且不應被理解為限制本發明的範圍。

實施例1 藉由施予重組人LAL以治療早發性LAL缺乏症(沃爾曼病)

15周齡之男嬰住院，因為出生後增重不良(出生重量3.88 kg)。嬰兒表現嘔吐、餵食問題、較差營養狀態、腹瀉、增加之腹脹及貧血。病患被診斷為沃爾曼病。

在初始醫師檢查時，病患稱重5.62 kg，位於年齡標準體重的5%以下。自15周齡初始檢查後的4周與19周齡初始輸注之前，病患無法增重且估計的生長速度經計算為小於年齡標準體重的1%。腹部明顯腫大並伴有顯著肝腫大和脾腫大。腹部超音波和CT掃描證實肝脾腫大和雙邊對稱擴大之腎上腺且同時鈣化。血清丙胺酸轉胺酶(ALT)的濃度升高至119 U/L(正常10-50 U/L)，天冬胺酸轉胺酶(AST)至216 U/L(正常10-45 U/L)。在處理開始前，血清鐵蛋白(發炎標誌物)約1,500 μg/L(正常7-144 μg/L)。病患在處理前呈持續貧血，同時血紅蛋白值為7.2至8.3 g/dL。

在19周齡，經0.2 mg/kg的初始劑量開始每週一次IV輸注rhLAL(SBC-102)。在SBC-102輸注之前，病患經1 mg/kg苯海拉明預處理約90分鐘，藉以抵消潛在的輸注反應。輸注時間為約4小時。輸注良好地被容忍，且病患未經歷任何不良事件或輸注相關反應。

在初始輸注後7天，施予第二輸注。施予病患劑量0.3 mg/kg SBC-102約4小時，且良好地容忍輸注而未表現出任何不良事件的跡象。

在開始治療後的兩周內，病患之一般健康表現出顯著改善，其包括增加靈活性和反應性。腹瀉和嘔吐穩定。病患開始增重且血清轉胺酶(例如AST和ALT)明顯降低，基本上恢復至正常濃度(圖1A和1B)。病患的生長速度快速正常化(圖3和4)。治療醫師指出腹部膨脹降低且對應腹部周長減小。肝功能檢驗顯示持續改善(圖1A和1B)。

在第三次訪視，病患接受0.5 mg/kg SBC-102。輸注持續良好地被容忍。臨床狀態顯示持續改善，7天內增重150 g，臂圍增加1.5 cm，因為開始進行治療(圖3和4)。肝臟檢驗是穩定的，血紅蛋白增加(10-11 g/dL)且鐵蛋白濃度持續降低(圖2)。在處理之前，鹼性磷酸酶呈低範圍的137 U/L(正常110- 300 U/L)，且經治療後增加(204 U/L)。SBC-102施予的效果和臨床前疾病模型中進行之觀察情況一致。

開始第四次輸注，病患開始接受每週劑量1.0 mg/kg。在開始治療後兩個月，病患的生長逐漸改善，估計的生長速度接近95%。生長增加導致在63天內增重1.25 kg或2.79磅，重量為7.21 kg，位於年齡標準體重的30%(圖3和4)。AST和ALT濃度在第一次輸注後快速降低。

經三個月治療，醫生記錄AST和ALT呈正常。除了肝功能改善，亦觀察鐵蛋白的顯著改善(圖2)。

於治療4個月的過程中，病患的GI症狀解決，且病患的營養狀態被臨床醫生描述為優異。病患繼續增重(圖3和4)且證實呈正常健康嬰兒的身體跡象。病患繼續容忍輸注而未表現出任何輸注反應或其他副作用。病患最近接受在第21次劑量1.0mg/kg作為門診病人。

實施例2 早發性LAL缺乏症病患的身體評估 臨床上安定而足以容忍一般麻醉的病患應被認為供長期血管通路之中心處置。對接受一般麻醉及/或鎮靜的個體，考慮基線腹部核磁共振顯像(MRI)掃描。在要求一般麻醉及/或鎮靜的新方法之情況下，若第一次輸注後未達3個月，考慮隨後之MRI。測量人體測量參數(重量、高度、腹部周長、中上臂圍和頭圍)。進行一般身體檢查。進行完全身體檢查。檢查包括個體的一般外觀、皮膚、頭、眼、耳、鼻和喉嚨、心、肺、腹、四肢/關節及神經學狀態評估。每次身體檢查亦包括下列： 肝臟大小：進行肝臟大小(可觸知/不可觸知及前緣下釐米)、規則性(光滑/結節)及靈敏性(觸痛/非觸痛)的臨床評估。 脾臟大小：進行脾臟大小(可觸知/不可觸知及前緣下釐米)、規則性(光滑/結節)及靈敏性(觸痛/非觸痛)的臨床評估。 淋巴結病：進行任何可觸知之淋巴結大小、位置及特性評估。待檢查的區域包括：頭部(枕部、耳前、耳廓後、頦下、下頜下)、子宮頸、鎖骨、腋窩及腹股溝。任何放大的結節表徵為觸痛或非觸痛。 拍照：個體在仰臥位置(全長和腹部癒合)的數位圖像。 肝臟/脾臟超音波和MRI

可進行腹部超音波以測量肝臟和脾臟大小。腹部MRI可提供肝臟和脾臟體積的更佳量化，且被認為是基礎，在第一次輸注後訪視至少3個月。

生命徵候

生命徵候包括脈搏率、呼吸率、心臟收縮和心臟舒張血壓及核心體溫(直腸或口腔)。在個體處於仰臥位置後進行脈搏率和血壓的評估。生命徵候在所有研究訪視測量。在施予天數，生命徵候於下述重複記錄：輸注前、輸注期間每15分鐘(±10)和輸注後2小時，然後完成輸注後2至4小時內每30分鐘(±15)。

實施例3 實驗室評估

進行下列實驗室評估作為診斷試驗和功效：

1)CBC/血液學：白血球計數、紅細胞計數、血紅蛋白、血球密度、MCV、MCH、MCHC、血小板計數、嗜中性白血球、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性細胞、嗜鹼粒性細胞、細胞形態學檢查的外周塗片。

2)化學組：葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、鈉、鉀、氯化物、鈣(總和離子化)、鎂、無機磷、總蛋白、乳酸脫氫酶。

3)肝功能檢驗：AST/SGOT、ALT/SGPT、鹼性磷酸酶、GGTP、白蛋白、膽紅素(直接，總計)。

4)抗-藥物抗體：抗-SBC-102抗體。

5)驗尿：pH、葡萄糖、酮、血液、蛋白、亞硝酸鹽。

6)凝結研究：白血球(若血液、亞硝酸鹽及/或白血球異常，進行顯微鏡檢查)。

7)實驗室營養評估：血清α生育酚：膽固醇比、25OH維生素D、血清維生素A、二去氫視黃醇、轉甲狀腺素蛋白、血清鐵蛋白。

8)脂質組：總膽固醇、甘油三酯、HDL、LDL。

9)基因譜

DNA序列(其包括編碼蛋白序列和調控基因轉錄之序列)、信使核糖核酸(mRNA)安定性及可鑑定的蛋白轉譯的功效包括：

1.溶酶體酸性脂肪酶(LIPA基因)；

2.編碼涉及脂質生物的其他蛋白的基因，其可導致及/或修飾LAL缺乏症的疾病顯型，例如ABCAl；

3.修飾對於任何SBC-102的易感性的基因。

10)藥物動力學評估

為降低醫源性貧血的風險，可限制PK取樣。重要地，收集樣品以取得下列參數：1) Cmax和2) CL的估值。在第0天(劑量1)和第105天(劑量16)收集SBC-102血清濃度的測量取樣。在所有個體中，施予前立即(施予30分鐘內)；開始輸注後90(±5)分鐘；及開始輸注後110(±5)分鐘。在與生命徵候評估一致的所有時間點取得所有PK樣品，之後非輸注之臂用於BP評估的袖口通脹。在袖口通脹後至少5分鐘，在其他時間點進行PK取樣。

實施例4 劑量準備和輸注

SBC-102配置在單劑量10mL玻璃小瓶中呈透明液體。溶液(總計10.5 mL，包括5%過量填注)的濃度為2 mg‧mL^-1 。所有SBC-102小瓶儲存在2-8℃的控制溫度下。小瓶經冷凍，且在儲存期間之任何時間避光保存。在輸注前，立即製備含有在0.9%鹽水中經稀釋之SBC-102的注射器。當預先製備SBC-102的注射器時，稀釋溶液標記，且在製備4小時內使用。

病患的重量於施予前且在監控輸注時進行記錄且至最接近之0.1 kg，用於計算各別輸注的SBC-102體積。研究所使用的總輸注體積係基於表1列示的給藥方案。

劑量準備和施予應使用無菌且無熱源之一次性材料進行，其包括但不限於注射器、針頭、轉移試管和活塞。

在流量調節裝置上的輸注速率設定為約120分鐘內施予全部體積，如表2所示。

實施例5 不良事件(AE)

在經歷臨床顯著的心血管、呼吸或其他效果的AE或輸注相關反應(IRR)的個體，根據在小於2歲的嬰兒中嚴重輸注反應管理的說明指南，輸注應中斷且個體必須經過敏性反應處理。如果需要，此可包括靜脈抗組織胺劑、皮質類固醇及腎上腺素。對於相關生物產物，大部分延遲IRR在輸注後超過24小時發生。症狀包括關節痛、肌痛、流感樣症狀、頭痛、疲倦及皮疹或蕁麻疹。延遲反應可用臨床說明的鎮痛藥或抗組織胺劑來處理。IRR分類為急性(開始輸注後24小時內發生)或延遲(在輸注後1至6天發生)。治療高敏感性反應的藥物和設備必須適於在未預料的嚴重的高敏感性反應的條件下立即使用。該等供應包括但不限於氧氣、對乙醯胺基酚、抗組織胺劑(例如苯海拉明、胃腸外和PO)、皮質類固醇、腎上腺素和心肺復甦設備。在類似的生物產物中，大部分急性IRR在輸注後24小時內發生(,,處方資訊)。可能急性IRR的跡象可分類為：溫和至緩和IRR、充血、臉紅、發燒及/或寒冷、噁心、搔癢、蕁麻疹、胃腸症狀(嘔吐、腹瀉、腹部絞痛)。溫和反應定義為在暫時停止或降低輸注速率後自身有限同時解決的反應。緩和反應定義為使用簡易裝置未解決，要求延遲觀察和治療中斷的反應。嚴重的IRR具有胸痛、呼吸困難、哮鳴、喘鳴、低血壓或高血壓、呼吸停止、窒息、呼吸困難、心搏徐緩或心跳過速。在輸注過程中如果觀察到上述跡象和症狀中任一種，且個體保持血液動力穩定，輸注速率可減慢(在時間發作時降低至所施予速率的一半，例如10 mL‧hr^-1 至5 mL‧hr^-1 )，輸注時間延長。在事件解決後，輸注應該在降低的速率下持續最少30分鐘，之後速率增加至輸注方案中初始速率的75%。如果個體繼續顯顯示高敏感性的跡象，根據在小於2歲的嬰兒中輸注反應管理的慣例指南，可施予IM或低IV劑量的抗組織胺劑。

實施例6 大鼠模型中施予重組LAL

重複給予重組人LAL對患有LAL缺乏症之Donryu大鼠評估對重量、組織甘油三酯和膽固醇、肝腫大、脾腫大、淋巴結病、腸重量及其他參數的效果，如Yoshida and Kuriyama(1990) Laboratory Animal Science,vol 40,p 486-489(亦參見Kuriyama et al(1990) Journal of Lipid Research,vol 31,p 1605-1611;Nakagawa et al,(1995) Journal of Lipid Research,vol 36,p 2212-2218)所描述者，彼之揭露內容全部併入本文。

4周齡大Donryu大鼠同型LAL缺失(LAL -/-)分為施予重組人LAL組(在轉殖基因雞輸卵管系統中產製)或鹽水安慰劑組。野生型年齡匹配的同窩出生大鼠用作對照組。尾靜脈注射LAL -/-大鼠每週一次劑量計4周(總共4次劑量)，或者每兩週一次計4周(總共2次劑量)作為單劑量或在給定30分鐘間隔內兩次相等劑量。重組LAL的劑量為1 mg/kg或5 mg/kg。劑量方案示於表3。大鼠用苯海拉明(5mg/kg)處理至抵消潛在的過敏性反應，該方法係基於在用於治療溶酶體貯積病的酶替代療法的動物模型的先前試驗(Shull et al.(1994) Proceedings of the National Academy of Science,vol 91,p. 12937;Bielicki et al.(1999) The Journal of Biological Chemistry,274,p. 36335;Vogler et al.(1999) Pediatric Research,45,p.838)，彼之揭露內容全部併入本文。

圖9顯示施予1 mg/kg的重組LAL/周或5 mg/kg的重組LAL/周或5 mg/kg的重組LAL/兩周的大鼠增重的每日進展。該圖可見在兩個劑量大小和頻率之間的治療效果中有很小或沒有差異。

實施例7 經重組LAL處理的LAL -/-大鼠的病理檢查

在實施例6所述之研究結束時，將研究動物人工安樂死，且驗屍以檢查宏觀病理學、組織病理學和臨床化學。宏觀病理學包括檢查機體的外部表面、所有孔口及頭蓋、胸和腹部腔及它們的內容物。測定大鼠之內部器官和組織且收集器官和組織，固定在10%中性緩衝的福馬林中。在固定後，將組織處理且將蘇木精和曙紅染色的部分經組織切片製備和評估。

分析的處理動物的宏觀病理學檢查顯示肝臟大小和顏色基本上正常，圖10顯示切片。相比於安慰劑處理的大鼠，器官與體重比被測定且證實在被解剖的成功處理的動物中肝臟、脾臟、腸系膜組織、十二指腸、空腸和回腸的相對器官大小減小。明顯相比於泡沫狀巨噬細胞在安慰劑處理的動物中的實質性積聚，分析的重組LAL-處理大鼠的肝臟組織的組織病理學顯示基本上正常的肝臟組織學(圖10)。

實施例8 重組人LAL在巨噬細胞和纖維組織母細胞溶酶體內的內在化

轉殖基因禽衍生的重組人LAL("SBC-102")能結合細胞且內在化於溶酶體室之能力於活體外使用巨噬細胞和纖維組織母細胞被檢驗。當與巨噬細胞培育時，螢光標記之SBC-102被發現局部於溶酶體。此效果可藉由使用甘露糖多糖競爭對手減毒，其顯示N-乙醯基葡糖胺/甘露糖(GlcNAc/甘露糖)受體作為此等細胞識別和攝取之機轉。SBC-102能增加LAL缺乏之人纖維組織母細胞和正常小鼠纖維組織母細胞經體外培育後之細胞相關的LAL活性，其表示暴露SBC-102可導致大量更換所缺乏之酶活性。

甘露糖-6-磷酸酯(M6P)存在於SBC-102的寡糖結構中，其已顯示涉及溶酶體酶藉由普遍存在的M6P受體遞送至大範圍的細胞類型。

重組LAL自轉殖基因母雞的蛋白中純化。Oregon Green NHS得自Invitrogen^TM (#0-10241)。大鼠肺泡巨噬細胞系NR8383和小鼠纖維組織母細胞系NIH-3T3得自ATCC。LAL缺乏症Wolman氏纖維組織母細胞得自Coriell Institute for Medical Research，且LysoTrackerRed得自Invitrogen^TM 。

酶標記：根據生產商的推薦在PBS中4 mg的轉殖基因禽衍生的LAL標記Oregon Green，隨後針對PBS進行透析反應，然後濃縮。

巨噬細胞攝取：螢光標記的轉殖基因禽衍生的LAL(5μg/mL)和LysoTrackerRed與NR8383細胞培育2小時。藉由共焦螢光顯微鏡於連續掃描模式在488 nm且隨後在514 nm下檢查細胞。

與甘露聚糖的競爭抑制作用：螢光標記的SBC-102(5ug/mL)和甘露聚糖與NR8383細胞培育2小時。細胞經胰蛋白酶處理且藉由螢光啟動的細胞分選使用培養基螢光強度作為端點以測量重組LAL攝取。

轉殖基因禽衍生的LAL能夠被攝取且隨後被併入標的細胞的溶酶體內之能力係藉由使用巨噬細胞細胞系NR8383檢驗。螢光標記的轉殖基因禽衍生的LAL和溶酶體標誌物"LysoTrackerRed"(Invitrogen^TM )與細胞培育2小時。轉殖基因禽衍生的LAL和溶酶體標誌物共同局限於該等細胞的溶酶體中，隨後藉由共聚焦螢光顯微術於連續掃描模式進行檢驗(圖11)。重組LAL證實局限至溶酶體，其與使用源自多種來源的重組人(rhLAL)的活體外研究一致。

轉殖基因禽衍生的LAL與GlcNAc/甘露糖受體的結合特異性係由競爭結合檢測且使用巨噬細胞細胞系NR8383進行評估(圖12)。螢光標記的(Oregon Green)轉殖基因禽衍生的LAL(5 μg/ml)和各種濃度的含甘露糖之寡糖(甘露聚糖)與細胞培育2小時。轉殖基因禽衍生的LAL的攝取被甘露聚糖相對抑制且與無甘露聚糖之對照組相比，藉由螢光啟動的細胞分選且使用培養基螢光強度作為端點定量。在轉殖基因禽衍生的LAL結合/攝取中觀察甘露糖劑量依賴性抑制，此與轉殖基因禽衍生的LAL:GlcNAcR相互作用一致。

另外，在纖維組織母細胞中甘露糖-6-磷酸酯媒介的攝取係由使用甘露糖-6-磷酸酯的競爭試驗證實。

實施例9 經處理的細胞增加LAL活性

LAL催化膽固醇酯和甘油三酯水解成游離膽固醇、甘油和游離脂肪酸。因此，LAL活性可例如藉由螢光受質4-甲基繖形酮油酸酯(4MUO)的裂解測量。

纖維組織母細胞

使用正常和LAL缺乏之細胞，已於活體外檢驗轉殖基因禽衍生的LAL暴露增加細胞LAL活性之能力。纖維組織母細胞分離自Wolman氏病患，且正常小鼠纖維組織母細胞(NIH-3T3)於濃度0、0.16或0.5微克/ml的轉殖基因禽衍生的LAL存在下經培育5小時。然後將細胞洗滌以除去非特異性信號，且細胞胞溶物經使用4-甲基繖形酮油酸酯(4-MUO)受質以檢測LAL活性。圖13證實：相比於NIH-3T3，Wolman氏纖維組織母細胞顯現較低之內源性細胞相關的LAL活性，且與轉殖基因禽衍生的LAL培育後，在所有細胞類型皆觀察到LAL活性之劑量依賴性增加(圖13)。

白血球

血清單核白血球得自施予前和後的LAL缺乏症病患。血樣冷藏儲存且不損失酶活性。單核白血球(淋巴細胞)使用Ficoll和泛影酸鈉的製劑自血液分離。4-8 ml血液(先前用Hanks’平衡的鹽溶液1:1稀釋)溫和地在3 ml Ficoll-Paque上分層且經離心。單核細胞環吸入且使用Hanks’溶液洗滌一次，然後藉由重新懸浮沉降物於1-2 ml水中至少2次。使用前令沉降物冷凍於-20℃下。檢測前，將沉降物解凍，重新懸浮在蒸餾水中，且於冰上經超音波處理。然後在4℃下，將製劑在20,000 x g下離心15分鐘。將上清液(含有0.5-1.5 mg蛋白/ml)保持在冰上，之後進行檢測。

將用於酸性酯酶檢測的受質藉由下列方式製備：將在己烷中的1 ml 10 mM 4-MUO(4-甲基繖形酮油酸酯)加入CHCI₃ 中的1 ml 16 mM L-α-卵磷脂。在N₂ 下蒸發溶劑，加入水中的25 ml 2.4 mM牛磺去氧膽酸(鈉鹽)。將混合物在30-40W下在冰上經超音波處理1-2分鐘。檢測之前，將1體積受質儲液經7體積200 mM乙酸鈉/乙酸緩衝液(pH 4.0)稀釋。各2 ml反應試杯含有100奈莫耳之4-甲基繖形酮油酸酯、160奈莫耳之L-α-卵磷脂和600奈莫耳之牛磺去氧膽酸鈉。

藉由加入5-100 μl酶開始反應，且在37℃下使用螢光分光光度計監控。例如藉由釋放的螢光素4-甲基繖形酮(4-MU)在約360 nm激發且在約460 nm處發射，檢測4-MUO的裂解。記錄螢光隨時間的變化。

實施例10 重組人LAL(SBC-102)的活體內分析

LAL缺乏之Yoshida大鼠(即同型)(參見Kuriyama et al.(1990),Journal of Lipid Research,vol. 31,p 1605-1611;Nakagawa et al.,(1995) Journal of Lipid Research,vol. 36,p 2212-2218；及Yoshida and Kuriyama(1990) Laboratory Animal Science,vol. 40,p 486-489)於4周大開始經SBC-102(5 mg/kg,IV)或安慰劑處理，一週一次達4周。對於各別投藥，SBC-102以兩個相等劑量(2.5 mg/kg)間隔30分鐘注射至大鼠尾靜脈。大鼠和年齡匹配的野生型對照組在最後劑量後檢查一周。3重複進行分析。

經SBC-102處理的動物之宏觀病理檢查證實除了器官大小減小，肝臟顏色亦正常。明顯相較於泡沫狀巨噬細胞在經載體處理的動物體內實質積聚，經SBC-102處理的大鼠基本上顯現正常的肝臟組織(資料未顯示)。LAL^-/- 大鼠之血清丙胺酸和天冬胺酸轉移酶濃度升高，但彼等酶濃度亦在經SBC-102處理的大鼠體內降低(未顯示)。

每隻大鼠之內部器官和組織被檢定，且資料示於圖14。器官大小表示8周大LAL^-/- 大鼠和LAL^+/+ 大鼠經5 mg/kg每週施予載體或SBC-102達4周所測得的體重百分率。

經SBC-102或載體處理的Yoshida大鼠的體重相比於野生型大鼠係示於圖15。SBC-102(5 mg/kg)或載體係藉由IV注射施予，且以單一劑量或分開劑量(4小時內給予)施予LAL^-/- 大鼠。LAL^+/+ 大鼠係年齡匹配的同窩出生對照組。

實施例11 甘油三酯分析

對源自野生型、同型安慰劑及同型經SBC-102處理的動物之肝臟和脾臟組織進行甘油三酯分析。使用標準方法進行甘油三酯分析(即MBL International’s Triglyceride Quantification Kit Catalog # JM-K622-100)，且3重複進行。

肝臟受質濃度

圖16顯示8周大野生型和LAL缺乏之大鼠每週經5 mg‧kg^-1 施予載體或SBC-102達4周後測得的肝臟膽固醇、膽固醇酯及甘油三酯濃度。

實施例12 大鼠劑量應答研究

基於上述進行的研究，對LAL^-/- 大鼠檢測LAL(“SBC-102”)的劑量範圍和劑量方案(qw和qow)的藥效(PD)影響。此等研究中，於4周大開始，SBC-102係藉由IV注射施予劑量0.2、1、3及5 mg/kg(qow)或施予劑量0.35、1.0及5.0 mg/kg(qw)達1個月。結果證實體重(BW)增加改善(圖17)、器官巨大症改善(圖18)及組織受質濃度改善(圖19)。隨著SBC-102增加，血清轉胺酶濃度亦降低，且於更高劑量下該濃度基本上達到野生型濃度。

實施例13 SBC-102的藥物動力學 a.取樣

PK樣品取自患有遲發性LAL缺乏症的成年病患。對病患施予劑量0.35 mg/kg達2小時。第0天(劑量1,訪視2)和第21天(劑量4,訪視6)的血清樣品在給藥前立即(給藥30分鐘內)；輸注(DI)過程中10(±1)、15(±1)、20(±1)、40(±2)、60(±2)及90(±2)分鐘以及結束輸注(EOI)(從開始輸注計約120分鐘)；及完成輸注(AI)後5(±1)、10(±1)、20(±1)、30(±1)、40(±2)、60(±2)及120(±2)分鐘收集。

b.血清酶催化性檢測

保持在-20℃冷凍器中的4-MUO(4mM)在黑暗中在4℃冰箱中熔融，且在使用前置於黑暗中25℃下培育器中達1.5小時。藉由稀釋SBC-102藥物至1.56 ng/ml以製備標準品。包括空白檢測緩衝液。第一稀釋，所有樣品稀釋至50 ng/ml。稀釋後，標準品和樣品立即塗覆。在製備標準品和樣品後，將62.5 ul檢測緩衝劑(0.2莫耳/升之乙酸鈉三水合物，pH 5.5)加入各孔。將12.5 ul標準品和樣品加入各孔(2重複)。使用4% Triton X-100稀釋4-MUO(4 mM)至1.6倍，且添加25 ul/孔。將多孔板輕拍數次以混合，緊密密封並置於37℃的培育器中30分鐘。培育後，將50 ul停止溶液(0.77M Tris pH 8.0)加入各孔以使最終體積為150 ul/孔。將板置於微板閱讀器上，且從板的底部於360 nm激發和460 nm發射以測量螢光量。

表5至9顯示，施予至患有遲發性LAL缺乏症的成年病患的重組LAL的血清C_max 為約270 ng/mL至720 ng/mL。t_1/2 為7.6分鐘至16.7分鐘，平均t_1/2 為約13分鐘(標準偏差,3.812)。

C_max =369.93 ng/mL;t_1/2 =16.8分鐘；LLOQ=4.68 ng/ml

C_max =262 ng/mL;t_1/2 =15.3分鐘；LLOQ=4.68 ng/ml

C_max =718 ng/mL;t_1/2 =10.8分鐘；LLOQ=4.68 ng/ml

C_max =330 ng/mL;t_1/2 =15.3分鐘；LLOQ=4.68 ng/ml

C_max =379 ng/mL;t_1/2 =7.7分鐘；LLOQ=4.68 ng/ml

實例14 免疫原性分析：抗-SBC-102測量

各未知陽性和陰性樣品在1x PBS的5%奶粉中稀釋1:20，且在旋轉儀(500 rpm)上在4℃下經培育12-18小時。檢測之前，將樣品經2000 x g離心20分鐘，且移除上清液至新1.5 ml試管。

SBC-102在1X PBS緩衝液中稀釋至濃度0.5 ug/ml，且100 ul放置在96孔ELISA板的各孔內。將板覆蓋黏合蓋，且室溫下經培育8小時或於4℃下經隔夜培養。培育後，令孔經1x洗滌緩衝液洗滌3次。將200 uL游離5% BSA-IgG加入各孔，且將板密封，在4℃培育12-18小時或在室溫下培育2小時。培育後，令孔經1x洗滌緩衝液洗滌3次。將100 ul各對照組樣品、未知樣品及陰性樣品加入孔中(3重複)。將板在微板振盪器(500 rpm)上且於室溫下培育1.5小時。培育後，令孔經1x洗滌緩衝液洗滌3次。將100 uL經生物素化之SBC-102(於稀釋緩衝液中稀釋至濃度為100 ng/mL)加入各孔。將板在微板振盪器(500 rpm)上且於室溫下培育1.5小時。培育後，令孔經1x洗滌緩衝液洗滌3次。將100 ul抗生物素蛋白鏈菌素-HRP複合物(於稀釋緩衝液中稀釋至1:4000)加入各孔。將板在微板振盪器(500 rpm)上且於室溫下培育1.5小時。培育後，令孔經1x洗滌緩衝液洗滌3次。100 ul TMB受質加入各孔且將該板在黑暗中培育15分鐘。50 ul停止溶液(0.5N H₂ SO₄ )加入各孔以停止反應。測量在450 nm的OD值。

如示於表10，每週接受劑量0.35 mg/kg SBC-102達4周的病患並未顯示增加之抗SBC-102抗體濃度，其表示SBC-102輸注的酶替代治療並未在人病患體內引起任何明顯的免疫原性。該等病患並未顯示任何不良事件或輸注相關反應(IRR)。

*　*　*

上述說明書的各實施例係解釋本發明而非限制本發明。事實上，此領域之技術人員明白，在不偏離本發明的範圍或精神的條件下，可對本發明進行多種修改、組合、添加、刪除和變化。例如，說明或描述為實施態樣的部分之特徵可於另一實施態樣中產生另一實施態樣。本發明欲含括此等修改、組合、添加、刪除和變化。

本文所引用的所有公開文獻、專利、專利申請案、網站及登錄號/資料庫序列(其包括多核苷酸和多肽序列)係藉由引用方式全部併入本文作為參考，其目的是每個各別公開文獻、專利、專利申請案、網站及登錄號/資料庫序列係相同內容特異性且單獨地引用。

<110> 辛那杰瓦生物製藥公司(Synageva Biopharma Corp.)

<120> 重組人溶酶體酸性脂肪酶(LAL)於治療人病患之溶酶體酸性脂肪酶缺乏症之用途

<140> TW 100132633

<141> 2011-09-09

<150> US 61/403,011

<151> 2010-09-09

<150> US 61/456,014

<151> 2010-10-29

<150> US 61/432,372

<151> 2011-01-13

<150> PCT/US 2011/033699

<151> 2011-04-23

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

圖1A顯示每週接受給予之外源性LAL(SBC-102)(劑量0.2 mg/kg(初始輸注；第0周);0.3 mg/kg(第1周);0.5 mg/kg(第2周)和1.0 mg/kg(第3-8周))的沃爾曼病(即早發性LAL缺乏症)男嬰病患的血清天冬胺酸轉胺酶(AST)濃度。圖1B顯示相同病患的血清丙胺酸轉胺酶(ALT)濃度。病患在初始輸注時為4個月1周大。

圖2顯示每週接受給予外源性LAL(SBC-102)(劑量0.2 mg/kg(初始輸注；第0周);0.3 mg/kg(第1周);0.5 mg/kg(第2周)和1.0 mg/kg(第3-8周))的沃爾曼病病患的血清鐵蛋白濃度。病患在初始輸注時為4個月1周大。自第0周初始給藥後1周顯示血清鐵蛋白濃度。

圖3顯示每週接受給予外源性LAL(SBC-102)(劑量0.2 mg/kg(初始輸注；第0周);0.3 mg/kg(第1周);0.5 mg/kg(第2周)和1.0 mg/kg(第3-8周))的沃爾曼病病患的生長速度。

圖4顯示沃爾曼病病患的生長曲線(男孩的kg,年齡標準體重百分位數)。

圖5顯示每週接受0.35 mg/kg劑量的外源性LAL的41歲白人男性CESD病患的血清AST濃度。

圖6顯示每週接受0.35 mg/kg劑量的外源性LAL的41歲白人男性CESD病患的血清ALT濃度。

圖7顯示每週接受0.35 mg/kg劑量的外源性LAL的41歲白人男性CESD病患的血清白蛋白濃度。

圖8顯示每週接受0.35 mg/kg劑量的外源性LAL的41歲白人男性CESD病患的血清鐵蛋白濃度。

圖9顯示四隻年齡匹配的雄性大鼠的增重速率，其分別分配至下列四種外源性LAL劑量方案中一者：每週一次1 mg/千克、每週一次5 mg/千克、每2週一次5 mg/千克或安慰劑。柱內數字表顯示出生後天數。

圖10顯示野生型對照、經外源性LAL處理的LAL缺乏大鼠及經安慰劑處理的LAL缺乏大鼠的病理學和組織病理學檢查結果。宏觀病理學證實經外源性LAL處理的大鼠之肝臟顏色和大小正常。經外源性LAL處理的大鼠之肝臟組織的組織病理學顯示，明顯相較於經安慰劑處理的動物之泡沫狀巨噬細胞的大量積聚，基本上呈正常的肝臟組織情況。

圖11顯示使用連續掃描模式在藉由共聚焦螢光顯微術檢查的細胞溶酶體中重組人LAL(SBC-102)和溶酶體標誌物的共同位置。

圖12顯示使用巨噬細胞細胞系NR8383藉由競爭結合檢測評估的重組人LAL(SBC-102)和GlcNAc/甘露糖受體的結合特異性。

圖13顯示活體外於正常和LAL-缺乏之細胞中重組人LAL於細胞中的活性。

圖14顯示重組人LAL(SBC-102)處理對LAL缺乏之大鼠的內部器官的效果。器官大小表示為經每週施予5 mg/kg載體或SBC-102達4周後，測定8周大之LAL^-/- 大鼠和LAL^+/+ 大鼠的體重百分率。

圖15顯示每週給予劑量5 mg‧kg^-1 載體或SBC-102經4周後，野生型和LAL缺乏之大鼠的體重。劑量施予係強調於X軸上起始於第4周且以菱形表示。

圖16顯示每週給予劑量5 mg‧kg^-1 載體或SBC-102經4周後，野生型和LAL缺乏之大鼠於8周大所測定的肝臟膽固醇、膽固醇酯和甘油三酯濃度。

圖17顯示LAL缺乏之大鼠的體重增加百分率。

圖18顯示經施予SBC-102達4周後，LAL缺乏之大鼠的肝臟重量(體重百分率)。

圖19顯示經施予SBC-102達4周後，LAL缺乏之大鼠的組織膽固醇酯濃度。

Claims (32)

1. 一種重組人溶酶體酸性脂肪酶(LAL)於製備供治療人病患之LAL缺乏症以降低肝臟轉胺酶之血清或血液濃度至正常濃度的藥物之用途，其中約每7天1次至約每30天1次施予該重組人LAL且該施予係足以減輕該人病患之肝臟損傷。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該肝臟轉胺酶係選自血清天冬胺酸轉胺酶(AST)或丙胺酸轉胺酶(ALT)。
3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該肝臟轉胺酶係係AST。
4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該肝臟轉胺酶係係ALT。
5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該施予係足以改善肝腫大。
6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該施予係足以增加血清血紅蛋白濃度。
7. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該施予係足以減小肝臟大小。
8. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該施予係足以降低血清鐵蛋白濃度。
9. 如申請專利範圍第1項之用途，其中約每7天1次施予該重組人LAL。
10. 如申請專利範圍第1項之用途，其中約每14天1次施予該重組人LAL。
11. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該病患患有沃爾曼病(Wolman Disease)。
12. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該病患患有膽固醇酯貯積病(CESD)。
13. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該重組人LAL包含至少一個終端甘露糖或至少一個終端甘露糖-6-磷酸酯。
14. 如申請專利範圍第1項之用途，其中降低肝臟轉胺酶之血清或血液濃度至正常濃度的該重組人LAL之有效量係約1mg/kg該人病患體重。
15. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該重組人LAL之血清半衰期(t_1/2 )係小於約20分鐘。
16. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該重組人LAL之血清半衰期(t_1/2 )係約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17分鐘。
17. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該重組人LAL之C_max 係約200至約800ng/ml血清。
18. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該重組人LAL之C_max 係至少200ng/ml血清。
19. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該重組人LAL係經靜脈內施予。
20. 如申請專利範圍第19項之用途，其中該重組人LAL係經輸注施予。
21. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該人病患經 輸注達約1至約4小時。
22. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該施予係足以減輕淋巴結病。
23. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該人病患小於1歲且該施予係足以增加該人病患之生長速率。
24. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該藥物另包含第二治療劑。
25. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該第二治療劑係降膽固醇藥物。
26. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該第二治療劑係他汀(statin)。
27. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該第二治療劑係依澤替米貝(ezetimibe)。
28. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該第二治療劑係免疫抑制劑。
29. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該第二治療劑係抗組織胺。
30. 如申請專利範圍第29項之用途，其中該抗組織胺係苯海拉明(diphenhydramine)。
31. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該苯海拉明之施予量係約1至約5mg/kg該人病患體重。
32. 如申請專利範圍第30項之用途，其中於該施予重組LAL之前施予該苯海拉明約20至約90分鐘。