TWI444194B

TWI444194B - 抗癌萃取物及化合物

Info

Publication number: TWI444194B
Application number: TW100135651A
Authority: TW
Inventors: Chi Ying Huang
Original assignee: Univ Nat Yang Ming
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2014-07-11
Also published as: US20120259004A1; US20160051608A1; JP2013544766A; CN105482129B; WO2012041256A1; US20150132411A1; JP5902174B2; US9511104B2; US9132158B2; CN103269706A; JP2015212298A; TW201219047A; CN103269706B; US8686030B2; CN105482129A

Description

抗癌萃取物及化合物

本發明係關於自植物中萃取之具有抗癌活性之新穎萃取物及新穎化合物。

石蓮(Graptopetalum paraguayense ，GP)為一種中國傳統中草藥，且對於健康有多種助益。根據其古老的中國處方，GP被認為具有多種有益效用，如：緩和肝的病症、降低血壓、美白、緩解疼痛及感染、抑制發炎及改善腦部的功能。

於研究中發現，GP之葉子萃取物可抑制酪胺酸酶及血管收縮素轉化酶的活性，以及於體外試驗中可清除自由基(Chen,S-Jet al .,石蓮(Graptopetalum paraguayense E. Walther)萃取物於血管收縮素轉化酶之抑制效果的研究。Food Chemistry 100:1032-1036,2007;Chung,Y-Cet al .,石蓮(Graptopetalum paraguayense E. Walther)之抗氧化活性的研究。Food Chemistry 91:419-424,2005；及Huang,K-Fet al .,石蓮(Graptopetalum paraguayense E. Walther)萃取物於菇類酪胺酸酶之抑制效果的研究Food Chemistry 89:583-587,2005)。另外，發現GP之水、及50%乙醇的、及95%乙醇的莖部萃取物具有抗氧化活性，該等萃取物亦以人類HCC細胞株(HepG2)之增生作用，進行抑制效果之分析(Chen,SJet al .,石蓮之莖部萃取物於體外試驗之抗氧化活性及抗增生活性Am J Chin Med 36:369-383,2008)。體內試驗研究證明GP的葉子萃取物可抑制小神經膠質細胞活化、氧化壓力及iNOS表現，以降低缺血性腦損傷(Kao,TKet al .,石蓮(Graptopetalum paraguayense E. Walther)的葉子萃取物於缺血性老鼠中可保護、抵抗腦損傷Am J Chin Med 38:495-516,2010)。

由Hsu等人於2004年申請之美國專利(專利號：7,364,758)，其之體內及體外試驗中石蓮乙醇萃取物具有抗肝纖維化及抗發炎功效於2008年被授予專利。接著，其之部分連續申請案(美國專利號7,588,776)於2008年提出申請，並於2009年授予專利，其發現石蓮水溶性分液對於肝病或肝狀況，如發炎、脂肪變性、及纖維化，具有治療效果。

本發明關於從植物中所分離之一種新穎萃取物及其分液及新穎化合物；該植物尤其係指縞瓣屬(Graptopetalum sp)之植物。本發明亦提供一種使用該新穎萃取物或新穎化合物以治療癌症的新穎方法，該癌症尤其是指肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。

在一方面，本發明提供一種具有抗癌活性之萃取物，該萃取物係以二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO)從植物中萃取，該植物係選自由縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)及石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成之群組。在本發明中不可預期地發現了該DMSO萃取物具有抗癌活性。

於本發明之一具體實施例中，該植物為石蓮(Graptopetalum paraguayense )或紅景天(Rhodiola rosea )。於本發明之一實例中，藉由30% DMSO萃取該植物以取得該萃取物係。

另一方面，本發明提供來自植物之含有豐富抗癌成分的分液，該植物係選自由縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)及石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成之群組；尤其為石蓮(Graptopetalum paraguayense )或紅景天(Rhodiola rosea )；該分液係藉由二甲基亞碸(DMSO)萃取該植物，並藉由色層分析分離而製備得之分液，稱為HH-F3，該分液具有細胞毒殺作用，及於癌細胞中向下調控AURKA、AURKB、及FLJ10540之表現的效果。

本發明之一具體實施例中，使用Sephadex LH-20管柱作為層析管柱。根據本發明，該分液具有高度的細胞毒殺效果，以及於Huh7及HepG2細胞中，具有向下調控AURKA、AURKB、及FLJ10540之表現的效果。

於分液HH-F3之機轉研究方面，發現分液HH-F3可誘發HCC進行細胞凋亡。換言之，分液HH-F3對於癌細胞，尤其是HCC，具有療效。

又一方面，本發明提供一化合物，該化合物具有下式I之結構式，

其中R中有一者為H或原花青素(prucyanidin，PC)單元；而其他之R為OH或原飛燕草素(prodelphindine，PD)單元；n為從21至38之數字；且PC單元：PD單元<1:20。該原花青素(PC)單元之結構為

以及該原飛燕草素(PD)單元之結構為

根據本發明，具有式I結構式之化合物可分離自植物，該植物係選自由縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)或石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成之群組。本發明之一具體實施例中，該化合物係從石蓮(Graptopetalum paraguayense )或紅景天(Rhodiola rosea )之分液中純化而得。具有式I結構式之化合物被發現富含3,4,5-三羥基苯甲基部份(moieties)且具抗癌活性。

又另一方面，本發明提供一組合物或一醫藥組合物，其包含本發明之萃取物、分液或化合物，及醫藥上可接受之載劑。再者，該醫藥組合物具有抗癌活性，其可用以有效預防或治療癌症，如：肝癌，尤其是HCC。

再一方面，本發明提供該萃取物、該分液或具有式I結構式之化合物於製備用以治療癌症(尤其是HCC)的醫藥之用途。

又一方面，本發明提供一種預防或治療癌症之方法，其係包含投與治療有效量之本發明之萃取物、分液或化合物至有需求之對象。在本發明一實例中，該癌症為HCC。

除非有其他的定義，本文所使用的技術性及科學性術語之意義，與該領域具有通常技藝者一般理解之意義相同。

除非上下文中另有清楚指出，否則本文所用之單數形「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包含複數形式。因此，舉例而言，當指出為「一樣本(a sample)」，對於該領域具有通常技藝者可知係包含複數的樣本及其同等物。

本發明提供從植物中以DMSO萃取之新穎萃取物(簡稱為GP萃取物)，該植物選自由縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)或石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成之群組。本發明中不可預期地發現了該GP萃取物具有抗癌活性。

根據本發明，該萃取物可藉由二甲基亞碸(DMSO)以現有技藝中常用方法或標準方法萃取植物以製得。在本發明一實例中，將該植物之葉子磨碎並凍乾為粉末，再與DMSO進行劇烈震盪(vortex)，較佳為30% DMSO。於以DMSO萃取前，可使用甲醇(MeOH)進一步萃取。

於本文所用之術語「縞瓣屬(Graptopetalum )」，係指任何屬於縞瓣屬(Graptopetalum )之植物或其一或多部分。多於一種(species)之縞瓣屬(Graptopetalum )的組合、或其部分亦可被考量。該縞瓣屬(Graptopetalum )較佳為石蓮(Graptopetalum paraguayense )。

於本文所用之術語「紅景天屬(Rhodiola )」，係指任何屬於紅景天屬(Rhodiola )之植物、或部分或其部分。多於一種(species)之紅景天屬(Rhodiola )的組合、或其部分亦可被考量。該紅景天屬(Rhodiola )較佳為紅景天(Rhodiola rosea )。

於本文所用之術語「石蓮花屬(Echeveria )」，係指任何屬於石蓮花屬(Echeveria )之植物、或部分或其部分。多於一種(species)之石蓮花屬(Echeveria )的組合、或其部分亦可被考量。該石蓮花屬(Echeveria )較佳為石蓮(Echeveria peacockii )。

本發明之一較佳具體實施例中，該植物為石蓮(Graptopetalum paraguayense )或紅景天(Rhodiola rosea )。

於本文所用之術語「萃取物」，係指藉由將物質與溶劑浸泡或混合以萃取而得之溶液。於本發明中，該萃取物為DMSO萃取物。

本發明亦提供從植物中取得之含有豐富抗癌成分之分液，該植物係選自由縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)及石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成之群組；該分液係藉由二甲基亞碸(DMSO)萃取該植物，並藉由色層分析以分離取得之分液，稱為HH-F3。於本發明之一實例中，該植物為石蓮(Graptopetalum paraguayense )或紅景天(Rhodiola rosea )。該分液係藉由DMSO萃取該植物，並藉由色層分析以分離取得分液，稱為HH-F3。於本發明一實例中，色層分析係使用Sephadex LH-20管柱。發現該分液具有細胞毒殺效果，以及於癌細胞中，特別是HCC細胞株，如Huh7及HepG2細胞中，具有向下調控AURKA、AURKB及FLJ10540表現的效果。於分液HH-F3之機轉研究方面，發現分液HH-F3可誘發HCC進行細胞凋亡。因此，該分液HH-F3為一種具潛力之治療劑，可用以預防或治療癌症，尤其是肝癌，如HCC。

根據本發明之一實例，藉由將分液HH-F3進行透析獲得之一種次分液(sub-fraction)，稱為HH-F3a。接著，從HH-F3a分液中分離活性化合物，其與已知之原花色素(proanthocyanidin)化合物不同。該所得之化合物為富含3,4,5-三羥基苯甲基部份之原花色素。該化合物具有下式I之結構式，

以及該原飛燕草素(PD)單元之結構為

因此，本發明提供式I化合物，其被證明具有抗癌活性。於本發明之一實例中，該具有式I之化合物可從縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)或石蓮花屬(Echeveria sp.)植物中以DMSO萃取得到DMSO萃取物。透過西方墨漬法分析AURKA之向下調控表現情形以篩選DMSO萃取物，並透過透析及進一步純化得到稱為「HH-F3」的次分液。

本發明提供一種醫藥組合物，其包含治療有效量的本發明之萃取物、分液或式I化合物，及醫藥上可接受之載劑。

於本文所用之術語「治療有效量」，係指藥劑的量足以達成所欲之治療目的。例如，治療HCC的石蓮花有效量為足以殺死HCC細胞之劑量。給予藥劑的治療有效量可能會隨著不同因子而有所不同，諸如藥劑的本質、投與方式、動物之大小及種類、及投與目的皆會對治療有效量有所影響。每一個體案例之治療有效量可以藉由熟諳技藝之技能者，根據本發明所揭露者及現有技藝所建立之方法，以經驗決定。

本發明之醫藥組合物可藉由任何適用之路徑投與，包含但不限於非經口服的或經口服的投與方式。該用於非經口服的醫藥組合物包含溶液、懸浮液、乳化液、及固態之可注射的組合物，其在使用前可用溶劑立刻溶解或懸浮。該注射型可藉由將一種或多種之活性成分溶解、懸浮、或乳化於稀釋劑中以製得。該等稀釋劑之例子為用於注射之蒸餾水、生理食鹽水、植物油、酒精及其組合。再者，該注射型可能包含穩定劑、助溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩和劑、緩衝液、保存劑等。該注射型於最後之製備步驟係經滅菌的、或以無菌步驟製得。本發明之醫藥組合物亦可製備成無菌之固態製備物，例如，藉由冷凍乾燥，且可在滅菌後使用、或於使用前立即溶於無菌之可注射水或其他無菌之稀釋劑中以使用。

根據本發明，該組合物亦可透過口服路徑投與，其中該組合物可為固態或液態。該固態組合物包含片劑、丸劑、囊劑、分散的粉劑、顆粒及其類似物。該口服組合物亦包含漱口水，其可藉此黏貼於口腔中，以及舌下片劑。該囊劑包含硬膠囊及軟膠囊。於該等口服用固態組合物，一種或多種之活性化合物可被單獨地混合或以稀釋劑、結合劑、粉碎劑、潤滑劑、穩定劑、助溶劑、並接著以一傳統方式製備成製備物。若有必要時，該等製備物可以包覆劑進行包覆，或可以兩種或多種包覆層包覆。另一方面，該口服用液態組合物包含醫藥上可接受的水溶液、懸浮液、乳化液、糖漿、酏劑等。於該等組合物中，一種或多種活性化合物可被溶解、懸浮或乳化於常用之稀釋劑中(如純化水、乙醇或其混合物等)。除了該等稀釋劑外，該組合物亦可包含浸潤劑、懸浮劑、乳化劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、保存劑及緩衝液及其類似物。

於實例中之本發明萃取物、分液或化合物或其醫藥組合物，經確認可於HCC細胞中造成細胞凋亡，進而指出該等物質具有抗癌活性，其可用於預防或治療癌症，尤其是HCC。另外，其可有效治療纖維化，尤其是肝纖維化。

因此，本發明提供該萃取物、該分液或式I化合物於製備用於治療癌症(尤其是HCC)之醫藥之用途。另外，本發明提供用於預防或治療癌症或纖維化(尤其是HCC及肝纖維化)之方法，其係包含投與本發明之治療有效量之萃取物、分液或化合物至有需求之對象。

以下所提供之實例係用於闡述本發明，但不應以任何方式侷限本發明範圍之方式來解讀。

實例

實例1：從GP或紅景天( Rhodiola rosea )萃取及純化

將石蓮(Graptopetalum paraguayense )(稱作GP)之葉子磨碎，且於-20℃冷凍乾燥成粉末，並於萃取前儲存於25℃之防潮室中。首先，1.5 g GP粉末與10 ml 100%之甲醇(MeOH)一起劇烈震盪5分鐘，接著以1500g 進行5分鐘離心。經移除上清液後，將10 ml的水、100%丙酮、100%甲醇、100%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、100%DMSO及30% DMSO加入各個離心沈澱物以懸浮成各個萃取物。該等懸浮物分別藉由劇烈震盪5分鐘以混合，並於1500g 、5分鐘、離心兩次，再於9300g 離心5分鐘，並於室溫藉由層流方式以0.45μm濾紙過濾。將30% DMSO上清液可以Sephadex LH-20管柱進行分餾得到四個分液(F1-F4)、或以150 mg/ml的原液(係指30% DMSO GP萃取物)存放於-20℃。該GP萃取物或分液HH-F3亦以透析膜(MWCO 12-14,000)(Spectrum Laboratories,Rancho Dominguez,CA)進行對水透析，以取得活性化合物。透過西方墨漬法，分析AURKA、AURKB、及FLJ10540的蛋白表現程度來分析活性分子，其係稱為分液HH-F3。此外，該分液HH-F3進一步以HPLC、及¹ H-及¹³ C-NMR光譜分析以辨識該活性分子之結構。

相似地，將植物紅景天(Rhodiola rosea )(簡稱為RS)凍乾成粉末，並於萃取前存於25℃之防潮室中。將1.5 g的RS粉末溶解於10 ml水中，且接著以1500g 離心5分鐘，接著於室溫藉由層流方式以0.45μm濾紙過濾。該樣本以150 mg/ml的原液存放於-20℃。

於本發明之分液HH-F3進行化學性分析，根據於¹ H及¹³ C NMR光譜中大量之芳香族訊號，鑑定出其主要成分為多酚類化合物。於HH-F3分液之主要化合物經鑑定為單寧，係歸因於經冷凍乾燥後其特有之粉紅色，並帶有部分銀色似金屬光澤的特徵。藉由色度分析法分析濃縮之單寧量以測定HH-F3分液之總單寧含量約為68%，其中於OD₅₀₀ 監測時係以兒茶素作為標準。該HH-F3分液之HPLC圖譜(第一圖)顯示兩組化合物(A組和B組)，其於HH-F3分液中具有截然不同之分子量範圍，且於B組中可偵測到一主要及一次要之成分。一富含原花色素之高分子量分液HH-F3a(相較於起始物質HH-F3的量，HH-F3a有71.9%之產量)係從HH-F3分液經透析以製得。簡言之，HH-F3(112.1 mg)藉由透析膜(MWCO 12-14,000)進行對水透析，得到內膜分液(HH-F3A，80.6 mg)及外膜分液(7.4 mg)。經以西方墨漬法(第六D圖)測量AURKA的消失，以判別出該分液含有活性化合物。HH-F3a之原花色素分液的主要骨架係決定為原花色素聚合物(見如下)，及其生理化學特性，包含列於表一之平均分子量(mMW)、平均聚合度(mDP)、PC：PD之比例及立體化學(順式：反式)。mMW及mDP係藉由分析降解之尾端及延長之單體的比例以決定。此外，為了簡化製備步驟，遂施行另一種藉由將GP萃取物直接對水透析的方法(方法II)，而由方法II所製備之化合物的生理化學資料亦列於表一中。列於表一之生理化學特性指出由方法II所製備之分液與方法I(用以製備HH-F3a之方法)所製得者相同。

HH-F3a之預測結構：具有高原飛燕草素比例(>95%)之聚合的原花色素(21<n<38)。

表一

本發明具有式I結構式之原花色素聚合物的生理化學特性

¹ 　製備HH-F3a 之方法(藉由Sephadex LH-20色層分析)

² 　藉由透析

由於沒有自GP取得之聚合性化合物被報告過，因此，以另一種珍貴的景天科(Crassulaceae)草藥紅景天(Rhodiola rosea )(金色的根)的多酚化合物來做為參考化合物，以鑑定HH-F3a之結構。R. rosea 被報導具有聚合性原花色素(PAC)。HH-F3a分液之主要成分的結構與R. rosea 之原花色素化合物十分相近(見表二)，但具有不同之原花青素單元(PC單元)較次訊號(<5%)，此訊號無法於¹³ C NMR光譜(δ_C 114 ppm，B環C-2'及C-5')中被偵測到。此外，該PAC化合物易於許多常見之葡萄品種中發現，像是葡萄(Vitis vinifera )。因此，亦以得自葡萄(Vitis vinifera )之PACs進行比較。表二顯示自R. rosea 及葡萄(V. vinifera )(一種常見之葡萄品種)之原花色素聚合物的生理化學特性。比較表二之資料，於HH-F3a分液之原花色素化合物之PD對PC比例為2.5×內、R. rosea 之mDP及mMW為3.0×，以及30至80×、1.1至4.9×、及4.7至41.3×，較葡萄(Vitis vinifera )之mDP、mMW及3-O -沒食子醯基(3-O-galloyl)百分比(%)高。就吾人所知，尚無任何原花色素化合物從GP中被分離出，且亦無具有相同生理化學特性之原花色素化合物被報告過。此證據即表明於HH-F3a分液中所發現之原花色素化合物為一新穎化合物，其富含3,4,5-三羥基苯甲基部份(包含一個B環之PD單元及沒食子酸(gallic acid))；其與R. rosea 中所發現者十分相似，但相較於葡萄皮及種子中所發現者來的高。

表二

已知之原花色素聚合物的生理化學特性

¹ 　歐洲葡萄與地中海及中亞同本質者

實例3：功效實例

1.存活試驗

將細胞種於24孔盤中(每孔4,000-5,000細胞)，過夜培養，接著以30%DMSO GP萃取物或HH-F3分液處理0、24、48、或72小時。經處理後，以1x PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂ HPO₄ 、2 mM KH₂ PO₄ )輕輕地清洗細胞三次，接著以0.5 μg/ml MTT(溴化3-(4,5-二甲基唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)培養2小時。將培養基移除，並將溶解於100%DMSO之深藍色晶體，於室溫中作用10分鐘。以ELISA分析儀於570 nm測量其OD值。

2.西方墨漬法

所有的樣本藉由加溫至95℃ 10分鐘以變性，並進行8%或10%之SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，於焦集膠體(stacking gel)及分離膠體(running gel)分別以80V及100V進行。經SDS-PAGE後，藉由Bio-Rad轉漬系統，將蛋白質轉漬到聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜。待蛋白質轉漬後，將該膜以麗春紅(Ponceau S)染劑染色以確認蛋白轉漬的效率及一致性。再以5%之無脂的脫脂牛奶(BD)，將該膜於室溫進行阻隔(block) 30分鐘，接著以初級抗體於4℃整夜培養。之後，以1x Tris緩衝之生理食鹽水Tween-20(TBST)沖洗膜三次(每次10分鐘)。該膜再以二級抗體培養2小時。接著，以1x TBST沖洗三次(每次10分鐘)。藉由加入HRP受質過氧化物溶液/發光胺反應劑(luminol reagents)(Immobilon^TM 西方化學發光受質，微孔，以1：1比例混合)即可使二級抗體的訊號可視化，並以Fujifilm LAS4000發光影像分析系統偵測。

3.　細胞計量

將細胞種於12孔盤中(每孔10,000-30,000細胞)整夜，並接著以HH-F3分液處理0、24、48、或72小時。將該等細胞以胰蛋白酶消化後，接著經與0.4%台酚藍混合後計算之。

4.　細胞週期分析及流式細胞儀

經胰蛋白酶處理後之細胞，以1x PBS清洗三次，將該等細胞以800g 離心5分鐘。接著，將該等細胞重新懸浮於溶於PBS之70%乙醇中，並置於-20℃超過16小時。經800g 離心5分鐘後，該細胞沈澱物以含有100 μg/ml RNAse A(Sigma-Aldrich)之冷PBS重新懸浮20分鐘。接著，將該等細胞以20 μg/ml碘化丙啶(PI，Sigma-Aldrich)進行染色20-30分鐘，並以BD FACSCanto測量及以FlowJo軟體分析其DNA含量。

5.　粒線體膜電位分析

粒線體膜電位係使用JC-1(碘化5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑碳花青)分析；JC-1係購自Cayman Chemical Co.。以每孔7000個細胞之密度，將培養的細胞種於96孔黑色盤中，整夜培養，接著使用或不使用HH-F3分液處理48小時。將JC-1染色溶液加入每孔中，並於37℃黑暗中輕輕地混合15-30分鐘。將盤子以400g 、室溫離心5分鐘，並將上清液移除。接著，將JC-1分析緩衝液加入每一孔中，接著以400g 、室溫離心5分鐘，之後將上清液移除。最後，將JC-1分析緩衝液加入每一孔中，並以螢光盤分析儀分析。

6.　測量ROS程度

細胞內生成之超氧化物自由基(O₂ ^- )可藉由氫化乙啡啶螢光(hydroethidine fluorescence)(AAT Bioquest，Inc.)分析。該等細胞使用或不使用HH-F3分液處理48小時。將氫化乙啡啶(10 μM)加至每孔中，並於37℃、黑暗中，輕輕地混合30-60分鐘。細胞的螢光可於波長520 nm(激發)及610 nm(發射)監測。

細胞內的過氧化物程度可由二氯螢光素(dichlorofluorescein，DCFH)雙醋酸鹽(Marker Gene Technologies，Inc.)測定。以HH-F3分液處理48小時，將培養基移除，並以PBS將細胞清洗兩次。接著於37℃黑暗中，將細胞與最終濃度20 μM DCFH於無血清培養基中培養30-60分鐘。再以PBS清洗細胞，並維持於200 μl培養基。細胞的螢光可於波長485 nm(激發)及528 nm(發射)監測。

7.　動物及實驗環境

於實驗期間開始時為6週齡之Wistar品系大鼠(Wistar albino rat)用於進行試驗，共120隻雄性大鼠(150-180 g)。於研究期間，所有動物給予標準食物及水以自由採食方式餵食，於疾病誘導前7天馴化。

試驗方法

將大鼠隨機分為正常組(N=10)、二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)組(N=30)、低劑量GP組(N=30)、及高劑量GP組(N=30)。吾人另外取5隻大鼠做為HH-F3處理組。除了正常組之外，其餘組別之大鼠每天以DEN水溶液(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO,USA)作為飲用水達63天，並從第64天開始，以自來水餵飼14天。DEN溶液為每週配製，且配製成個別劑量，該個別劑量係根據動物對於先前劑量所反應之增重/減重來決定。第42天之後記錄可見之肝腫瘤，以及於第63天後觀察肝纖維化。於試驗期間，該等動物會每週秤重，以計算增重率，且每週測量水之消耗量。自第42天開始，於低劑量組，每天給予每隻大鼠0.6 g之凍乾GP粉末；於高劑量組，每天給予每隻大鼠1.8 g之凍乾GP粉末，長達3週。

採集步驟及肝臟型態的評估

所有的動物於第84天進行安樂死。該等動物進行整夜禁食，接著以CO₂ 吸入方式犧牲。待大鼠犧牲後，將其身體、肝臟及脾臟秤重，根據解剖標準，於屍體解剖後將各個器官之狀況記錄。迅速地採集所有肝葉，並徹底的於每個時間點檢查肝臟表面之狀況，以及肝(liver foci)之發育，持續性結節(PNs)之發育、或癌之發育；隨後，將肝臟切成5-mm之切片。計算所有於肝表面之肉眼可見的結節，並於5-mm切片決定其數量及大小。

腫瘤負荷評估

為了建立腫瘤發育的模式，係餵食動物DEN，所有肝葉皆被迅速地採取，且計算所有肉眼可視之肝臟表面結節，並於5-mm切片決定其數量及大小。腫瘤負荷係於每隻動物估計所有直徑超過3 mm之腫瘤結節的體積總和，比較各組以進行評估。

膽汁流速

將動物犧牲前，先以80 mg/kg克他明(ketamine)進行深度麻醉，以測量膽汁流速。為了要測量膽汁流速，將PE10矽管置於總膽管，接著與可記量的聚乙烯管連接。每5分鐘間隔測量一次管中之膽汁流。

病理學評估

經放血後，將每一個肝葉之腫瘤解取下來，做成約5-mm厚度的組織切片。以5 μm之厚度進行切片，並以蘇木色素(hematoxylin)及曙紅染料(eosin)染色，再藉由已公開的診斷標準來進行組織病理分析。

α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)免疫組織化學染色法

以福馬林將肝臟樣本固定，以石蠟包埋，接著切成5 μm切片。將該等切片脫蠟、復水，並接著以0.03%過氧化氫處理10分鐘，以停止內生性過氧化酶活性。之後以PBS沖洗兩次，再將該等切片以抗人類α-SMA單株抗體(1:50稀釋，DakoCytomation，丹麥)於室溫培養1小時。對於α-SMA染色，再將該等切片沖洗，並以二級抗體，兔抗鼠IgG(1:200稀釋)，於室溫進一步培養1小時。接著以相似方法培養該等切片。經染色後，將該等切片以蘇木色素進行對比染色，以進行顯微鏡檢驗。α-SMA陽性區域(肝臟切片之mm² /cm² )的百分比係以數位相機系統HC-2500(Fuji Photo Film)、Adobe Photoshop 5.0J版、及Image-Pro Plus 3.0.1J版測量。

肝臟之羥脯胺酸含量的分析

將肝臟樣本秤重，並將20 mg之冷凍樣本以20 ml 6N HCl進行水解，以及小心地磨碎。此外，每毫克組織加入6N HCl以達到總量30 ml。該於HCl中被磨碎的組織，係以120℃進行水解16小時。經短暫於冰上冷卻後，以8000 g離心10分鐘，將上清液移除，並換入新管中；蒸發所散失的體積係以水來補充。加入同等體積之6 N NaOH進行混合，接著以石蕊試紙將溶液調整至pH 4-9。將40 μl之中和後樣本溶液加入96孔ELISA盤之孔中，並以含有5 ml之7%氯胺T(chloramine T，Sigma-Aldrich)及20 ml之醋酸/檸檬酸緩衝液之溶液進行氧化。之後，加入150 mL Ehrlich溶液。最終混合物於60℃培養35分鐘，接著於室溫再培養10分鐘，之後於560 nm判讀其吸光值。標準溶液含有100、80、60、40、20、及0 mg/ml之可信的4-羥基-L-脯胺酸(4-hydroxy-L-proline，Sigma-Aldrich)以相同方式處理。標準曲線係於此範圍內(r =0.99)線性化。肝臟之羥脯胺酸量值係以羥脯胺酸(mg)/濕肝臟重量(g)表示。所有的分析會重複三次。

氧化壓力之免疫細胞化學分析

採用硝基四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，NBT，Sigma-Aldrich)灌注法以定位肝臟中重新合成(de novo)之ROS生成。將被NBT灌注之肝臟移除，並固定於鋅/福馬林溶液中，並進行組織檢查甲臢(formazan)之沈澱。以Adobe Photoshop 7.0.1影像軟體分析以判讀藍色NBT沈澱物之密度。

結果

於Huh7及Mahlavu細胞上不同GP製備物的效果

為了測試GP之潛在的生物活性，不同製備所得之GP萃取物包含製備水萃取物、丁醇萃取物、丙酮萃取物、甲醇萃取物、100%乙醇萃取物、70%乙醇萃取物、50%乙醇萃取物、100%DMSO萃取物及30%DMSO萃取物，並用以處理人類HCC細胞。如第一圖所示，以不同製備方式得到之GP萃取物所造成之生長抑制效果，係以劑量依賴方式評估。MTT分析結果指出30% DMSO萃取物可明顯地抑制Huh7(第二A圖)及Mahlavu(第二B圖)細胞之存活性。

於活化之肝的星狀細胞及HCC細胞株之間期及有絲分裂期時，GP可降低AURKA、AURKB及FLJ10540蛋白表現程度

AURKA、AURKA及FLJ10540為致癌基因，且於HCC中為過量表現。因此，吾人將不同製備所得之GP萃取物測試其是否可於人類HCC細胞株中抑制該等致癌蛋白。吾人發現GP萃取物(從100%甲醇取得，再以30%DMSO萃取，如同方法章節所述，稱作30% DMSO GP萃取物)可於活化之肝的星狀細胞(HSC-T6)(第三A圖)抑制Flj10540及Aurkb之蛋白表現程度，以及於HCC細胞(HepG2及Huh7)(第三B圖)中壓抑FLJ10540、AURKA、及AURKB之蛋白表現程度。於分裂中期之AURKA及FLJ10540表現程度較分裂間期高。吾人接著探討GP於HCC細胞有絲分裂期間是否可抑制該兩個蛋白之表現。將Huh7及HepG2細胞以50-75 ng/ml諾可達唑(nocodazole)處理18小時，接著以30% DMSO GP萃取物處理3小時，且不將諾可達唑沖洗掉。於先前發現一致，於有絲分裂期間，AURKA、AURKB、及FLJ10540皆高度地表現。於間期及中期(第三C圖)，AURKA、AURKB、及FLJ10540的蛋白表現程度皆下降，然而，吾人檢查其他有絲分裂蛋白之表現則無明顯變化，包含PIN1、HURP、及PLK(資料未顯示)。

該30% DMSO GP萃取物(分液HH-F3)，而不是其他不同溶劑所製備之其他萃取物，可於HCC細胞株抑制AURKA蛋白表現

人類HCC Huh7細胞係以500 μg/ml不同製備所得之GP萃取物處理48小時。該30% DMSO萃取物可於該等細胞中明顯抑制AURKA蛋白表現程度(第四A圖)。相反地，從水或丁醇所得之GP萃取物，經3小時處理後，於HepG2細胞無法抑制AURKA或AURKB蛋白表現程度(第四B圖)。由於AURKA及FLJ10540於HCC為過量表現，吾人分析GP對於HCC細胞之生長是否有影響。吾人發現30% DMSO GP萃取物以50%細胞存活率抑制濃度(IC₅₀ )，可造成Huh7及Mahlavu細胞之細胞毒殺；經48小時後處理，其IC₅₀ 分別約為500及250μg/ml(第五圖)。

HH-F3可於HCC細胞株中抑制AURKA蛋白表現

該30% DMSO GP萃取物於活化之肝的星狀細胞及肝癌細胞可降低AURKA及FLJ10540蛋白表現程度(第二圖)，故吾人推測可藉此分析方式從GP中純化出活性分子。吾人便以Sephadex LH-20管柱，從30% DMSO GP萃取物中取得四個分液(第六A圖)。當以西方墨漬法分析後處理3小時之樣本，僅第三個分液(稱作HH-F3)可於HepG2細胞抑制AURKA及AURKB之表現，而其他分液(HH-F1、HH-F2及HH-F4)不會抑制AURKA及AURKB之蛋白表現(第六B圖)。一併考量，從30% DMSO所製得之GP萃取物，以及HH-F3分液，經3小時後處理，皆可於HepG2細胞抑制AURKA及AURKB之蛋白表現程度(第六B圖及第六C圖)。吾人進一步自HH-F3中以透析取得具活性之次分液，稱作HH-F3a(相較於起始物質HH-F3的量，HH-F3a有71.9%之產量)。藉由西方墨漬法測量AURKA之消失，以判讀該HH-F3a分液，而非HH-F3b分液，包含活性化合物(第六D圖)。

HH-F3分液降低HSC-T6細胞及HCC細胞株之細胞存活性。

為了探討HH-F3分液於細胞存活性之功效，將Huh7、Mahlavu、PLC5、及HSC-T6細胞以HH-F3分液於5、25、50、75、及100 μg/ml之濃度，處理24、48、及72小時。該等測試細胞種類對於HH-F3處理所反應之存活率，亦以MTT分析法分析。於第72小時，Huh7、Mahlavu、PLC5、及HSC-T6細胞經HH-F3分液處理之IC₅₀ 值分別約為50、37.5、75、及20 μg/ml(第七A圖至第七D圖)。為了進一步確認此一發現，再藉由將Huh7、Mahlavu、及PLC5細胞進行台酚藍染色以判定細胞之存活性。經24、48、及72小時，於5、25、50、75、及100 μg/ml的濃度處理後，HH-F3分液處理導致之細胞存活率降低被證明為時間及劑量依存方式(第七E圖至第七G圖)。一併考量，30% DMSO GP萃取物及HH-F3分液可抑制HCC細胞及活化之肝星狀細胞的存活性。

接著，將Huh7、Mahlavu、PLC5、及HSC-T6細胞以25、50、及75μg/ml之HH-F3分液處理3小時。該HH-F3分液可用以抑制三種被測之HCC細胞株及HSC-T6細胞之AURKA及FLJ10540的表現(第八A圖及第八B圖)。吾人分析FLJ10540 及Aurora激酶家族(AURKA 、AURKB 、及AURKC )之基因表現量的變化，以探討HH-F3分液之抑制效用是否發生在轉錄階段。將HepG2細胞以50μg/ml HH-F3分液處理6小時，再藉由微陣列(U133A晶片，Affymetrix)分析基因表現程度，以及藉由西方墨漬法分析蛋白表現程度。相較於對照組，經HH-F3分液處理後，前述特定基因之基因表現無任何變化(資料未呈現)，儘管於蛋白表現程度上是有減少的。因此，HH-F3分液可能是於蛋白層次上調控HCC細胞生長，而非於轉錄層次。

於HCC細胞中，HH-F3分液經由細胞凋亡導致其細胞死亡

吾人接著分析HH-F3分液於誘導Huh7及Mahlavu細胞之細胞凋亡性死亡的能力。於濃度5、25、及50μg/ml處理24及48小時，切割的硫胱氨酸蛋白酶-3及切割的PARP之蛋白表現量係以劑量依存方式增加。該等資料顯示HH-F3分液可誘導與硫胱氨酸蛋白酶相依之細胞凋亡性死亡(第九A及B圖)。

該HH-F3分液於HCC細胞株中降低粒線體膜電位及增加ROS

於生理及病理情況中，活性氧化物(ROS)及粒線體於細胞凋亡中皆扮演重要角色。吾人接著探討HH-F3分液是否經由外在路徑或內在路徑以誘發細胞凋亡。吾人測試於HCC細胞中粒線體膜電位，內在路徑中之一種指標，是否可能被改變。將Huh7及Mahlavu細胞以5、25、及50μg/ml HH-F3分液處理，經48小時處理後，檢測該等細胞之粒線體膜電位。相較於對照組，細胞凋亡的細胞數目增加了。此與粒線體膜電位(△Ψ)之結果吻合，其顯示經HH-F3分液處理後，Huh7及Mahlavu細胞之膜電位皆下降了(第十A圖)。

許多報告指出當△Ψ損失後，ROS會生成。ROS包含超氧化物陰離子、過氧化氫、及氫氧自由基；該等物質皆衍生自氧。ROS係為光合作用及有氧呼吸時之電子傳遞過程中所產生者。一定生理濃度之ROS可維持正常的細胞性功能，以及ROS亦參與細胞內的訊息傳遞及氧化還原調控。過多之ROS量可造成氧化壓力，由於其會造成脂質、蛋白質及DNA之氧化，因此對於細胞具有潛在之傷害性。故，吾人測試HH-F3分液是否會刺激HCC細胞於ROS生成上的變化。藉由氫化乙啡啶螢光分析細胞內生成之O₂ ^- ，以及藉由DCFH雙醋酸鹽判讀細胞內的過氧化物的量。經HH-F3分液處理後之細胞，其細胞內過氧化物(第十C圖及第十D圖)及超氧化物(第十E圖及第十F圖)之細胞生成量，於HCC細胞中是增加的。此顯示，該HH-F3分液可藉由內在路徑以造成細胞凋亡。

HH-F3分液降低Akt之磷酸化，以及增強PTEN之表現

於HCC中，部分之細胞增生路徑與細胞凋亡之抑制及異常有關，例如AKT路徑。由於HH-F3造成HCC細胞之細胞毒殺，吾人接著探討HH-F3是否會影響HCC細胞之細胞增生路徑。將Huh7細胞以5、25、及50μg/ml HH-F3分別處理48小時。於Huh7細胞中，於HH-F3處理下，AKT之Ser⁴⁷³ 磷酸化為向下調控，然而總AKT蛋白則未受影響(第十一圖)。有趣的是，HH-F3活化了磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)的蛋白量，該PTEN係為PI3K/AKT依存之訊號傳遞的負調控者。此結果顯示，HH-F3可能調控細胞增生之AKT訊號傳遞路徑以誘發細胞凋亡。

GP萃取物增加硬化病變動物之膽汁分泌

藉由膽汁流速以評估肝硬化進而反應肝功能(第十二A圖)、藉由量化脾臟重量/體重之比例，一種硬化病變相關之肝門脈高血壓的指標(第十二B圖)、以及分析由DEN所誘導之α-SMA表現(第十二D圖)。所有的資料皆證實，經高劑量GP處理後，肝硬化之狀態有改善，且可觀察到膽汁流量明顯增加、脾臟大小明顯降低、及α-SMA(+)區域所佔的百分比明顯降低。

GP萃取物及HH-F3降低硬化病變肝之羥脯胺酸含量

藉由測量肝之羥脯胺酸含量可判讀肝之纖維化。於DEN誘導動物可觀察到羥脯胺酸量明顯地增加(143±30μg/g)。相反地，經以低劑量GP、高劑量GP或HH-F3處理後，羥脯胺酸含量分別為98±18μg/g(P<0.05相較於DEN組)，70±10μg/g(P<0.05)，及72±8.2μg/g(P<0.05)(第十二C圖)。

GP萃取物及HH-F3降低氧化壓力

NBT(氯化硝基四氮唑藍)為一種染劑，當接觸到超氧化物時，該染劑會被還原成不可溶之藍色甲臢(formazan)衍生物，且該藍色沈澱物可做為一組織學上的指標，並藉由光學顯微鏡可判別出組織中超氧化物的存在。NBT(+)聚集的密度可於10倍視野下觀察最深的染色區域以判別。於DEN誘導動物(23±3)可觀察到NBT(+)聚集明顯地增加。相反地，經以低劑量GP、高劑量GP或HH-F3處理後，NBT(+)聚集的密度分別為13±4(P<0.05相較於DEN組)，4.2±0.6(P<0.005)，及6.2±2.1(P<0.05)(第十二E圖)。此等發現顯示由DEN所造成之氧化壓力可藉由GP萃取物及HH-F3處理而降低。

GP萃取物及HH-F3降低腫瘤負荷

肝臟係取自犧牲之動物，並將該等肝臟切成5-mm切片。計數及測量所有直徑大於3mm之可視腫瘤結節的數量及大小。腫瘤負荷係以所有腫瘤結節的體積總和表示。於DEN誘導動物之可視腫瘤(腫瘤負荷2350±905mm³ )。相反地，經以低劑量GP、高劑量GP或HH-F3處理後，其肝臟之腫瘤負荷分別為110±105mm³ (P<0.005相較於DEN組)，23±31mm³ (P<0.005)，及86±12(P<0.05)(第十二F圖)。該等肝臟之代表性照片顯示，於硬化病變大鼠之肝臟中有多個肝腫瘤。可觀察到於該些動物表面有肉芽發生，以及有不均質邊界之多個肝腫瘤之形成，以及經以低劑量GP、高劑量GP或HH-F3處理後該些可視之腫瘤數目及不均質地肝表面皆可獲得改善。

該紅景天(Rhodiola rosea )萃取物亦被測試，且發現其可抑制HCC細胞之存活性及向下調控AURKA蛋白表現(第十三圖)。

吾人相信該領域具有通常知識者可藉由本說明，且不需進一步闡述，即可將本發明發揮至最廣泛地範圍。因此，於此提供之本說明書及申請專利範圍應被理解為僅做為示例性之目的，而不應以任何方式侷限本發明之範圍。

本發明前述之發明內容，以及之後的詳細說明，於閱讀時可配合圖示以更加了解。為了闡述本發明，所呈現之圖示為具體實施例中較佳之呈現方式。需明瞭的是，本發明並不受限於該等具體實施例，或其呈現之圖示。

於圖示中：第一圖提供本發明之分液HH-F3之HPLC圖譜，其中該層析圖譜及該梯度沖提曲線係分別以X線及Y線表示。

第二圖顯示本發明之分液HH-F3於增加細胞毒殺作用之功效；其中第二(A)圖顯示於Huh7細胞之效果，及第二(B)圖顯示於Mahlavu細胞之效果；將自不同溶劑所製得之萃取物進行比較；其中Huh7(A)及Mahlavu(B)細胞係以自水、丙酮、甲醇、100%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、100% DMSO、及30% DMSO製備之GP萃取物，以100、150、250、500、750、1000、及1500μg/ml之濃度處理72小時，接著將該等細胞進行MTT分析。於該等萃取製備物中，該30%DMSO之GP萃取物，於72小時時，具有明顯抑制Huh7及Mahlavu細胞存活性的功效。

第三圖顯示本發明之分液HH-F3，於HSC-T6(A)、及HepG2及Huh7細胞((B)及(C))之間期(interphase)及M期中，可降低許多有絲分裂調控子之降解；其中(A)HSC-T6細胞係以30% DMSO GP萃取物處理。將細胞溶解物以抗Flj10540及抗Aurkb抗體進行免疫墨點法分析；(B)HepG2及Huh7細胞係以不同濃度之30% DMSO GP萃取物處理，及將細胞溶解物以抗FLJ10540、抗AURKA、及抗AURKB抗體，進行免疫墨點法分析。(C)HepG2及Huh7細胞係以75ng/ml諾可達唑(nocodazole，NOC)處理16~18小時。經過同步劑(synchronizing agent)前處理後，該等細胞遂以750μg/ml 30% DMSO GP萃取物或空白對照組(30% DMSO)再處理3小時；再以抗FLJ10540、抗AURKA、及抗AURKB抗體進行西方墨漬法；下列數點需特別注意：(1)相較於位於間期之細胞，AURKA、AURKB、及FLJ10540可於有絲分裂的細胞中高度表現；及(2)經過30% DMSO GP萃取物處理後，可抑制於間期及中期(metaphase)之AURKA、AURKB、及FLJ10540的蛋白表現程度。

第四圖顯示本發明之分液HH-F3於HCC細胞株：Huh7細胞(A)、及HepG2及Huh7細胞(B)，之抑制AURKA蛋白表現的效果；其中(A)Huh7細胞係以500μg/ml濃度之GP萃取物處理48小時；該等GP萃取物係從水、丙酮、甲醇、100%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、100% DMSO、及30% DMSO所製得；顯示以30% DMSO GP萃取物處理後，可抑制AURKA 之表現程度；(B)於HepG2及Huh7細胞中，AURKA、AURKB、及FLJ10540之表現程度無法被水及BuOH分液所抑制。

第五圖顯示本發明之分液HH-F3於兩個HCC細胞株：Huh7細胞(A)及Mahlavu細胞(B)中所造成之細胞毒殺的時間及劑量依存性之反應；其中Huh7(A)及Mahlavu(B)細胞係以30% DMSO GP萃取物，於0、250、500、750、及1000μg/ml之濃度處理24、48及72小時，接著進行MTT分析。由30% DMSO GP萃取物於Huh7及Mahlavu細胞所造成之生長抑制的IC₅₀ 值，於48小時，分別約為500及250μg/ml。

第六圖顯示不同之GP純化分液於HCC細胞株中之AURKA蛋白表現的效果；包含第六(A)圖闡述本發明之GP萃取物及分液HH-F3的純化方式；第六(B)圖顯示HepG2細胞係以30% DMSO GP萃取物，HH-F1、HH-F2、HH-F3、及HH-F4，處理3小時。結果顯示，於HepG2細胞處理HH-F1、HH-F2、及HH-F4分液，無法抑制AURKA及AURKB表現程度；第六(C)圖顯示經過30% DMSO GP萃取物及HH-F3分液之處理後，可抑制AURKA之表現；以及第六(D)圖顯示經過HH-F3a分液之處理後，可抑制AURKA之表現。

第七圖顯示本發明之分液HH-F3於抑制Huh7細胞(A、E)、Mahlavu細胞(B、F)、PLC5細胞(C、G)、及HSC-T6細胞(D)之細胞存活性的效果；其中Huh7(A、E)、Mahlavu(B、F)、PLC5(C、G)、及HSC-T6(D)細胞係以HH-F3分液，於5、25、50、及75μg/ml之濃度，處理24、48、及72小時，之後接著進行MTT分析(A至D)及台酚藍(trypan blue)分析(E至F)。於Huh7、Mahlavu、PLC5、及HSC-T6細胞中，經由HH-F3分液處理，所造成之細胞存活性抑制效果的IC₅₀ 值，經過處理72小時後，分別約為50、37.5、75、及20μg/ml。

第八圖顯示該HH-F3分液，於HCC細胞株中，可向下調控AURKA及FLJ10540，以及活化肝臟星狀細胞；包含第八(A)圖顯示Huh7、Mahlavu、及PLC5細胞係以HH-F3分液，於25、50、或75μg/ml之濃度，處理3小時。藉由使用抗FLJ10540及抗AURKA抗體以進行免疫墨點法分析，AURKA及FLJ10540兩者的表現係以濃度依存方式被向下調控；以及第八(B)圖顯示HSC-T6細胞係以HH-F3分液，於5、15、或50μg/ml之濃度處理3小時，Flj10540之表現係以濃度依存方式被向下調控。

第九圖顯示分液HH-F3於HCC細胞株造成細胞凋亡之效果；其中Huh7及Mahlavu細胞係以5、25、及50μg/ml HH-F3處理48小時；第九(A)圖及第九(B)圖顯示經過HH-F3分液處理24及48小時，該細胞溶解物遂進行免疫墨點法分析抗切割的硫胱氨酸蛋白酶-3(anti-cleaved caspase-3)及切割的PARP(cleaved PARP)，結果顯示抗切割的硫胱氨酸蛋白酶-3、切割的PARP之表現程度提高了，此顯示細胞已進行細胞凋亡。

第十圖顯示該分液HH-F3於降低粒線體的膜電位，以及於HCC細胞株中增加ROS之生成；包含第十(A)圖及第十(B)圖係以JC-1粒線體膜電位分析法來分析Huh7及Mahlavu細胞之粒線體膜電位(△Ψ)，結果顯示經過分液HH-F3，以5、10、15、25、及50μg/ml濃度處理48小時後(n=2)，該等細胞之△Ψ降低了(RFU=△Ψ)；第十(C)圖及第十(D)圖係以氫化乙啡啶(hydroethidine，HE)染色法測量細胞內的超氧化物(O₂ ^- )的程度，結果顯示經過分液HH-F3，以5、10、15、25、及50μg/ml濃度處理48小時後，相較於對照組之HCC細胞(Huh7及Mahlavu細胞以DMSO處理)，經過分液HH-F3處理後之細胞內的超氧化物(O₂ ^- )的程度下降了；以及第十(E)圖及第十(F)圖係以DCFH測量細胞內過氧化物的程度，結果顯示經過分液HH-F3，以5、10、15、25、及50μg/ml濃度處理48小時後，相較於對照組之HCC細胞(Huh7及Mahlavu細胞以DMSO處理)，細胞內過氧化物程度增加了，且發現經過分液HH-F3處理後之Huh7及Mahlavu細胞，其細胞內的過氧化物及超氧化物的生成，係隨著劑量依存性方式增加。

第十一圖顯示該分液HH-F3於Huh7細胞中抑制AKT-Ser⁴⁷³ 磷酸化及活化PTEN蛋白表現之效果；經過分液HH-F3於25、50、或75μg/ml濃度處理48小時後，以抗FLJ10540、抗AURKA、抗AKT-Ser⁴⁷³ 、及抗PTEN抗體進行免疫墨點分析；結果顯示AURKA、FLJ10540、AKT-Ser⁴⁷³ 之表現是向下調節的(減少的)；然而PTEN則是隨著濃度依存性方式向上調節的(增加的)。

第十二圖顯示本發明之GP萃取物及分液HH-F3於降低硬化病變肝中羥脯胺酸的含量及腫瘤負荷之功效；其中將試驗動物分為四組；如同材料及方法所述，其中一組係僅給予自來水(正常組)或給予DEN溶液(另一組)；第十二(A)圖顯示於硬化病變之動物中，其膽汁流速減低了，其可被紀錄以測量肝功能(*P<0.05；ANOVA)；第十二(B)圖顯示於硬化病變之動物中，其脾臟之大小變大了；其中測量脾臟之重量及體重(body weights，BWs)，並以脾臟重量/BW表示；相較正常組，該DEN組之脾臟重量/BW比例明顯較高；此顯示脾肥大係因硬化病變相關之門脈高血壓所導致(P<0.05，ANOVA)；然而僅高劑量組之脾臟重量/BW比例是明顯低於該等DEN組別者(P<0.05，ANOVA)；第十二(C)圖顯示於硬變肝中之膠原蛋白含量增加；其中肝硬化病變係藉由肝之羥脯胺酸含量測量，且當將高劑量組、HH-F3組及對照組相比較時，可觀察到羥脯胺酸含量明顯降低；第十二(D)圖顯示由DNE誘導之α-SMA的表現程度。於DEN處理過程中，每一組肝樣本的福馬林/石蠟切片以抗α-SMA抗體進行染色，再以數位相機系統於10倍視野下觀察最深的染色區域來判別α-SMA(+)區域所佔的百分比(*P<0.05；**P<0.005，ANOVA)；第十二(E)圖顯示由DEN所誘導之氧化壓力。NBT(氯化硝基四氮唑藍(Nitrotetrazolium blue chloride))為一種染劑，當接觸到超氧化物時，該染劑會被還原成不可溶之藍色甲瓒(formazan)衍生物，且該藍色沈澱物可做為一組織學上的指標，並藉由光學顯微鏡可判別出組織中超氧化物的存在，即可判別NBT(+)聚集的密度；如同材料及方法所述，於10倍視野下觀察最深的染色區域以判別；第十二(F)圖顯示腫瘤負荷的測量，其中該些肝臟係取自犧牲之動物，並將該等肝臟切成5-mm切片，並計數及測量所有直徑大於3mm之可視腫瘤結節的數量及大小。腫瘤負荷係以所有腫瘤結節的體積總和表示(**P<0.005，***P<0.001相較於DEN組)；以及第十二(G)圖顯示化學誘導之HCC及硬化病變之外觀圖，其中經過添加DEN於飲用水中，並以口服投與9週之老鼠，導致於其硬變肝臟中出現許多的肝腫瘤，以及可觀察到於該些動物的表面有肉芽之形成，以及不均質邊界之多個肝腫瘤的形成。

第十三圖顯示紅景天(Rhodiola rosea)萃取物於抑制HCC細胞株之細胞存活性(第十三A圖)，及向下調節AURKA蛋白表現之功效(第十三B圖)。

Claims

一種具有抗肝癌活性之萃取物，其係自縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)或石蓮花屬(Echeveria sp.)之植物以30%之二甲基亞碸(DMSO)萃取而得。
如申請專利範圍第1項之萃取物，其中該植物為石蓮(Graptopetalum paraguayense )或紅景天(Rhodiola rosea )。
如申請專利範圍第1項之萃取物，其對於肝細胞癌(HCC)具有療效。
一種組合物，包含治療有效量之申請專利範圍第1項之萃取物。
一種如申請專利範圍第1項之萃取物在製備用於治療肝癌之藥物之用途。
如申請專利範圍第5項之用途，其中該肝癌為肝細胞癌(HCC)。
一種自植物製備之含有豐富抗肝癌成分之分液HH-F3，該植物係選自由縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)及石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成之群組；該分液HH-F3係藉由30%的二甲基亞碸(DMSO)萃取該植物以取得一萃取物，並藉由丙酮：水之色層分析分離該萃取物得4層分液，其中自下至上之第3層分液即為該分液HH-F3。
如申請專利範圍第7項之分液HH-F3，其於肝癌細胞具有造成細胞毒殺，以及向下調控AURKA、AURKB、及FLJ10540之表現的功效。
如申請專利範圍第7項之分液HH-F3，其中使用Sephadex LH-20管柱進行色層分析。
如申請專利範圍第7項之分液HH-F3，其中該植物為石蓮(Graptopetalum paraguayense )或紅景天(Rhodiola rosea )。
如申請專利範圍第7項之分液HH-F3，其對於肝細胞癌(HCC)具有療效。
一種醫藥組合物，包含治療有效量之申請專利範圍第7項之分液HH-F3，及醫藥上可接受之載劑。
一種如申請專利範圍第7項之分液HH-F3在製備用於治療肝癌之藥物之用途。
如申請專利範圍第13項之用途，其中該肝癌為肝細胞癌(HCC)。
一種化合物，具有如式I結構：其中R中有一者為H或原花青素(procyanidin，PC)單元，而其他之R為OH或原飛燕草素(prodelphindine，PD)單元；n為從21至38之數字；以及PC單元對PD單元之比例不超過1：20。
如申請專利範圍第15項之化合物，係從植物之萃取物中所分離；該植物係選自由縞瓣屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)及石蓮花屬(Echeveria sp.)所組成之群組。
如申請專利範圍第15項之化合物，係從石蓮(Graptopetalum paraguayense )或紅景天(Rhodiola rosea )所分離。
一種醫藥組合物，包含治療有效量之申請專利範圍第15項之化合物，及醫藥上可接受之載劑。
如申請專利範圍第18項之醫藥組合物，其具有抗肝癌活性。
一種用於治療肝癌之醫藥組合物，包含治療有效量之申請專利範圍第15項之化合物，及醫藥上可接受之載劑。
如申請專利範圍第20項之醫藥組合物，其中該肝癌為肝細胞癌(HCC)。
一種如申請專利範圍第15項之化合物在製備用於治療肝癌之藥物之用途。
如申請專利範圍第22項之用途，其中該肝癌為肝細胞癌(HCC)。
一種如申請專利範圍第15項之化合物在製備用於治療肝纖維化之藥物之用途。