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TWI398520B - 組合物及製造組合物之方法 - Google Patents

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TWI398520B
TWI398520B TW095147641A TW95147641A TWI398520B TW I398520 B TWI398520 B TW I398520B TW 095147641 A TW095147641 A TW 095147641A TW 95147641 A TW95147641 A TW 95147641A TW I398520 B TWI398520 B TW I398520B
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萊斯特 柯克Ｊ.
夏菲爾 尤金Ｊ.
貝蒂斯 羅納德
布倫后 伊莉莎白Ａ.
帝狄歐 大衛Ｍ.
唐納森 羅伯特
費雪 艾倫Ｒ.
哈傑逖 海倫Ｇ.
可克利 大衛Ｈ.
羅素二世 雷伯Ｊ.
史慕林 大衛Ｅ.
塔柏 約翰Ｍ.
泰 李Ｋ.
桑瑪納 帕拉阿
凡丹 布恩 湯瑪士
費勒尤翰 阿喬
布羅尼 丹
史瑞雪 傑佛瑞
懷特翰 喬伊絲
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必治妥美雅史谷比公司
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Description

組合物及製造組合物之方法
本專利申請案係主張2005年12月20日提出申請之美國專利序號60/752,267,2006年10月5日提出申請之美國專利序號60/849,543及2005年12月20日提出申請之美國專利序號60/752,150之優先權，其全部均據此以其全文併於本文供參考。本申請案亦將2006年12月19日提出申請，具有律師案件目錄編號10739 PCT，標題為"安定蛋白質調配物"之專利申請案，以其全文併入供參考。
於本文中引用之所有專利、專利申請案及公報均據此以其全文併入供參考。
本專利揭示內容含有受到版權保護之資料。版權所有者對於此專利文件或專利揭示內容，在其出現於美國專利與商標局專利檔案或記錄中時，由任何人之傳真複製沒有異議，但在其他情況下，係保留任何與所有版權之權利。
本發明係關於經改良之組合物，製造組合物之細胞，及大量製造CTLA4－Ig組合物之方法。本發明係針對CTLA4－Ig分子，包含CTLA4－Ig分子之經改良組合物，以及大量製造CTLA4－Ig分子及其他重組蛋白質之經改良方法。
細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA4)，免疫球蛋白超族群之一個成員，係為一種藉由經活化T細胞所表現之分子。CTLA4係類似T－細胞共刺激分子CD28，且兩種分子均結合至抗原呈現細胞(APC)上之B7－1(CD80)與B7－2(CD86)。但是，CTLA4會對T細胞傳送抑制訊息，然而CD28則傳送刺激訊息。
CTLA4－Ig分子係為細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA4)之配位體結合功能部位與免疫球蛋白(Ig)重鏈恒定區域之融合蛋白質。此可溶性分子係藉由結合至不同抗原呈現細胞(APC)表面上之B7抗原(CD80與CD86)施加其生理作用，因此阻斷B7－1和B7－2與T－細胞表面上之CD28之功能性交互作用。此阻抑會造成壓抑T－細胞活化作用，且因此壓抑免疫回應。CTLA4－Ig分子可因此提供一種抑制組織及/或固體器官移植排斥之方法，以及對於一般性地關於失調之免疫回應，通常包括自身免疫性之疾病或病症之治療用途。例如，CTLA4－Ig分子可在易患狼瘡之老鼠中壓抑抗－dsDNA抗體之生產，且減少腎炎；可在具有已進展腎炎之老鼠中降低蛋白尿且延長存活期；及可改善關於牛皮癬與風濕性關節炎之臨床結果。
為改良CTLA4－Ig分子之治療實用性，重要的是測定可被施行以提高分子作為T細胞刺激抑制劑之功效之分子改變，例如藉由增加分子對B7抗原之抗體親抗原性與功效。於CTLA4－Ig分子之抗體親抗原性與功效上之增加，可允許對病患投予減少量之CTLA4－Ig分子，以達成所要之治療作用(意即投予較低劑量)。於CTLA4－Ig分子之抗體親抗原性與功效上之增加，亦可減少被投予病患以達成所要治療作用之劑量數目或劑量頻率。
本發明係關於經改良之組合物，製造組合物之細胞，及大量製造CTLA4－Ig組合物之方法。本發明係針對CTLA4－Ig分子，包含CTLA4－Ig分子之經改良組合物，以及大量製造CTLA4－Ig分子及其他重組蛋白質之經改良方法。
本發明係包括本文中所述任何要件與特徵之任何替換及/或組合，無論是單獨或在某些組合或替換中描述。
細胞 ：本發明係提供能夠產生CTLA4－Ig之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集。本發明係提供能夠產生CTLA4－Ig之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，各細胞包含CTLA4－Ig表現卡匣之30種或更多種複製物。本發明亦提供能夠產生CTLA4－Ig之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，各細胞包含CTLA4－Ig表現卡匣之30種或更多種複製物，其中該30種或更多種複製物係被整合在各細胞基因組中之單一位置上。本發明係提供能夠產生CTLA4－Ig之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中CTLA4－Ig表現卡匣係為安定的，歷經約105個繼代。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig係被表現卡匣編碼，該表現卡匣包含一種由Koduri R.等人(Gene ,2001,280：87－95)且在美國專利案號6,800,457與6,521,419中描述之核酸順序，其係據此以其全文併入供參考。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig係被表現卡匣編碼，該卡匣係被整合至來自細胞群集之細胞基因組中，在特定位點，由Koduri R.等人(Gene ,2001,280：87－95)且在美國專利案號6,800,457與6,521,419中描述，其係據此以其全文併入供參考。於一項具體實施例中，該群集係包含細胞之亞群集，包含CTLA4－Ig表現卡匣之33種或更多種複製物，其中該33種或更多種複製物係被整合在亞群集之各細胞基因組中之單一位置上。
本發明係提供能夠產生CTLA4－Ig之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中至少75%細胞群集係具有CTLA4－Ig表現卡匣之30種或更多種複製物，其中該30種或更多種複製物係被整合在75%群集之各細胞基因組中之單一位置上。本發明係提供能夠產生CTLA4－Ig之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中至少85%細胞群集係具有CTLA4－Ig表現卡匣之30種或更多種複製物，其中該30種或更多種複製物係被整合在85%群集之各細胞基因組中之單一位置上。本發明係提供能夠產生CTLA4－Ig之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中至少95%細胞群集係具有CTLA4－Ig表現卡匣之30種或更多種複製物，其中該30種或更多種複製物係被整合在95%群集之各細胞基因組中之單一位置上。於一項具體實施例中，細胞群集係能夠產生每升液體培養物大於0.5或更多克之CTLA4－Ig蛋白質，且其中CTLA4－Ig顯示可接受之碳水化合物特徵，其中唾液酸對CTLA4－Ig之莫耳比，在1,000升或較大之培養規模下，為約6至約14。於另一項具體實施例中，細胞群集已被配合調整至不含血清、化學上定義之培養基。於另一項具體實施例中，製自細胞群集培養物之CTLA4－Ig具有消光係數為1.00±0.05 AU毫升公分－1毫克－1。於另一項具體實施例中，細胞群集當在培養物中生長時，係能夠產生CTLA4－Ig多肽，其中：(a)約90%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基27處之甲硫胺酸開始；(b)約10%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號26處之丙胺酸開始；(c)約4%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號383處之離胺酸終止，(d)約96%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號382處之甘胺酸終止；且視情況，(e)約低於1%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號25處之甲硫胺酸開始。
本發明係提供無性繁殖系細胞之後代細胞，其中後代細胞會產生CTLA4－Ig。於一項具體實施例中，後代細胞係得自將無性繁殖系母體細胞培養，歷經至少5個世代。於另一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養，歷經至少10個世代，歷經至少20個世代，歷經至少40個世代，歷經至少50個世代，歷經至少75個世代，或歷經至少100個世代。本發明係提供製自無性繁殖系細胞之細胞系。於一項具體實施例中，該細胞系為無性繁殖系。本發明係提供細胞系，其能夠產生：(a)具有順序識別碼：10之胺基酸順序之CTLA4－Ig融合蛋白質(甲硫胺酸在胺基酸位置27處，且甘胺酸在胺基酸位置382處；圖1A與1B)；(b)具有順序識別碼：7之胺基酸順序之CTLA4－Ig融合蛋白質(甲硫胺酸在胺基酸位置27處且離胺酸在胺基酸位置383處；圖1A與1B)；(c)具有順序識別碼：9之胺基酸順序之CTLA4－Ig融合蛋白質(丙胺酸在胺基酸位置26處，且甘胺酸在胺基酸位置382處；圖1A與1B)；(d)具有順序識別碼：6之胺基酸順序之CTLA4－Ig融合蛋白質(丙胺酸在胺基酸位置26處，且離胺酸在胺基酸位置383處；圖1A與1B)；(e)具有順序識別碼：8之胺基酸順序之CTLA4－Ig融合蛋白質(甲硫胺酸在胺基酸位置25處，且甘胺酸在胺基酸位置382處；圖1A與1B)；或(f)具有順序識別碼：5之胺基酸順序之CTLA4－Ig融合蛋白質(甲硫胺酸在胺基酸位置25處，且離胺酸在胺基酸位置383處；圖1A與1B)。於另一項具體實施例中，細胞系係能夠產生CTLA4－Ig融合蛋白質，其中：(a)約90%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基27處之甲硫胺酸開始；(b)約10%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號26處之丙胺酸開始；(c)約4%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號383處之離胺酸終止，(d)約96%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號382處之甘胺酸終止；且視情況，(e)約低於1%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號25處之甲硫胺酸開始。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig融合蛋白質，其係製自將細胞系培養，具有消光係數為1.00±0.05 AU毫升公分－1毫克－1。本發明係提供衍生自無性繁殖細胞系之細胞群集。在一項具體實施例中，當與原先無性繁殖細胞系比較時，細胞群集係包含至少一個其他基因改變，且其中所衍生之細胞群集係能夠產生CTLA4－Ig。於另一項具體實施例中，當與母體細胞比較時，細胞群集包含至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少10，至少15或至少20個其他基因改變，且其中所衍生之細胞群集係能夠產生CTLA4－Ig。於一項具體實施例中，基因改變包括至少一個非保守突變，在細胞基因組中或在使CTLA4－Ig編碼之重組表現卡匣中。於另一項具體實施例中，基因改變包括至少一個其他重組核酸在細胞內。於進一步具體實施例中，該改變包括細胞基因組之突變。於另一項具體實施例中，該改變包括添加核酸至無論是細胞基因組中或作為反式核酸，其會使抗細胞凋零多肽編碼。於另一項具體實施例中，抗細胞凋零多肽係關於糖基化作用。於另一項具體實施例中，基因改變包括細胞基因組或會使CTLA4－Ig編碼之重組表現卡匣之至少一個突變。
組合物 ：本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig之平均莫耳比為約6至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig之平均莫耳比為約8至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig之平均莫耳比為約11至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig之平均莫耳比為約12至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig之平均莫耳比為約13至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig之平均莫耳比為約14至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig之平均莫耳比為約15至約17。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig之平均莫耳比為約16。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中大於95%之分子為CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，大於98%之分子為CTLA4－Ig二聚體。於另一項具體實施例中，大於99%之分子為CTLA4－Ig二聚體。於另一項具體實施例中，大於99.5%之分子為CTLA4－Ig二聚體。於另一項具體實施例中，約95%至約99.5%之分子為CTLA4－Ig二聚體，而約0.5%至約5%之分子為CTLA4－Ig四聚體或高分子量物種。於另一項具體實施例中，約98.6%之分子為CTLA4－Ig二聚體，而約1.2%之分子為CTLA4－Ig四聚體或高分子量物種，及約低於0.7%之分子為CTLA4－Ig單體。本發明係提供包含CTLA4－Ig二聚體之群集。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中該群集係實質上不含CTLA4－Ig單體。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中該群集係實質上不含CTLA4－Ig四聚體。本發明係提供CTLA4－Ig單體分子之群集，其實質上不含CTLA4－Ig二聚體與四聚體。於一項具體實施例中，各CTLA4－Ig二聚體之各單體具有至少3個唾液酸基團。於另一項具體實施例中，各CTLA4－Ig二聚體之各單體具有至少3個唾液酸基團到至少8個唾液酸基團。本發明係提供CTLA4－Ig四聚體分子之經純化群集，此群集係實質上不含CTLA4－Ig二聚體，且視情況其中該群集係包含大於約100克之量。本發明係提供CTLA4－Ig四聚體分子之經純化群集，此群集係實質上不含CTLA4－Ig單體，且視情況其中該群集係包含大於約100克之量。於一項具體實施例中，各四聚體分子係包含兩對CTLA4－Ig多肽，其中各多肽具有胺基酸順序，選自包括順序識別碼：5－10，且其中此多肽對之各成員係以共價方式連結至另一成員，而其中兩對多肽係以非共價方式與彼此締合。於另一項具體實施例中，各四聚體分子係能夠結合至CD80或CD86。於進一步具體實施例中，當與CTLA4－Ig二聚體分子比較時，各四聚體分子對CD80或CD86具有至少2－倍較大抗體親抗原性。於另一項具體實施例中，當與CTLA4－Ig二聚體分子比較時，各四聚體分子具有至少2－倍較大之抑制T細胞增生或活化作用。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中此組合物包含可在CTLA4－Ig之等電焦聚凝膠上見及之優勢異構重組物，當藉等電焦聚測定時，其具有等電點pI低於或等於5.1。於一項具體實施例中，pI係在神經胺糖酸苷酶處理後增加。於另一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少40%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.1。於另一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少70%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.1。於另一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少90%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約2.5。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有pI為約2.0±0.2至約5.0±0.2。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有pI為約4.0±0.2至約5.0±0.2。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有pI約4.3±0.2至約5.0±0.2。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有pI為約3.3±0.2至約4.7±0.2。本發明係提供一種製備組合物之方法，該組合物包含CTLA4－Ig分子，具有pI為約2.0±0.2至約5.0±0.2，此方法包括：(a)使CTLA4－Ig分子之混合物接受等電焦聚凝膠電泳，其中在凝膠上之單一譜帶表示CTLA4－Ig分子之群集具有特定pI，與(b)單離具有pI為約2.0±0.2至約5.0±0.2之CTLA4－Ig分子群集，以製備組合物。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之海藻糖或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約3.5至約8.3。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之甘露糖或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7.2至約22。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；與(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；及(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17：及(d)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(d)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之海藻糖或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約3.5至約8.3；及(e)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig之GalNAc之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig之半乳糖之平均莫耳比為約8至約17；(d)每莫耳CTLA4－Ig之海藻糖之平均莫耳比為約3.5至約8.3；(e)每莫耳CTLA4－Ig之甘露糖之平均莫耳比為約7.2至約22；及(f)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中組合物顯示NGNA層析圖吸收峰為約9.589＋/－0.3，且NANA層析圖吸收峰為約10.543＋/－0.3。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA－Ig分子顯示如圖66中所示之碳水化合物分佈形態。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子顯示功能部位I－V之碳水化合物分佈形態，其中功能部位I包含表示非唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位II包含表示單－唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位III包含表示二－唾液酸基化寡醣之吸收峰，及功能部位IV包含表示三－唾液酸基化寡醣之吸收峰。功能部位V包含表示四－唾液酸基化寡醣之吸收峰。於一項具體實施例中，在功能部位I中之第一個吸收峰與功能部位II中之主峰間之N－連結寡醣，於滯留時間上之差異為約22至約28分鐘。本發明係提供包含CTLA4－Ig二聚體分子之組合物，其中至少0.5%之CTLA4－Ig二聚體分子係經半胱胺醯基化。於一項具體實施例中，至少1.0%之CTLA4－Ig二聚體分子係經半胱胺醯基化。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中該群集顯示如圖7中所示之質量光譜分佈形態。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中該群集顯示毛細電泳法分佈形態，如圖18與21中所示。本發明係提供CTLA4－Ig分子之組合物，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約6至約18。本發明係提供藉任何本文中所述方法所獲得之CTLA4－Ig組合物。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中分子係在順序識別碼：2之位置102處之天冬素胺基酸殘基上，在順序識別碼：2之位置134處之天冬素胺基酸殘基上，在順序識別碼：2之位置233處之天冬素胺基酸殘基上，在順序識別碼：2之位置155處之絲胺酸胺基酸殘基上，或在順序識別碼：2之位置165處之絲胺酸胺基酸殘基上被糖基化。
本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中分子群集之特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc或其對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig之GalNAc之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig之半乳糖之平均莫耳比為約8至約17；(d)每莫耳CTLA4－Ig之海藻糖之平均莫耳比為約3.5至約8.3；(e)每莫耳CTLA4－Ig之甘露糖之平均莫耳比為約7.2至約22；(f)每莫耳CTLA4－Ig之唾液酸之平均莫耳比為約6至約12；(g)當從等電焦聚凝膠上之顯像測定時，pI係在約2.4±0.2至約5.0±0.2之範圍內；(h)MCP－1低於或等於5 ppm；(i)低於2.5%四聚體；(j)低於0.5%單體；(k)此群集之CTLA4－Ig多肽具有胺基酸至少95%相同於任何順序識別碼：2－8；(l)其中在群集內之CTLA4－Ig分子係能夠結合至CD80與CD86。
組合物 ：本發明係提供一種組合物，其包含有效量之本發明CTLA4－Ig分子與藥學上可接受之載劑。本發明係提供一種組合物，其包含如2005年12月20日提出申請之美國專利申請案號60/752,150中所述之賦形劑。於一項具體實施例中，組合物包含CTLA4－Ig。於一項具體實施例中，此組合物進一步包含藥學上可接受之稀釋劑、佐劑或載劑。於另一項具體實施例中，此組合物進一步包含麥芽糖、單鹽基性磷酸鈉單水合物、氯化鈉、氫氧化鈉及無菌水。於另一項具體實施例中，此組合物包含蔗糖、聚氧體(poloxamer)、單鹽基性磷酸鈉單水合物、二鹽基性無水磷酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉及無菌水。
調配物與套件 ：本發明係提供包含至少95% CTLA4－Ig二聚體與不超過5% CTLA4－Ig四聚體之經凍乾CTLA4－Ig混合物。於一項具體實施例中，混合物包含至少98% CTLA4－Ig二聚體與不超過2% CTLA4－Ig四聚體。於另一項具體實施例中，混合物包含至少99% CTLA4－Ig二聚體與不超過1% CTLA4－Ig四聚體。於另一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig至少8.0莫耳唾液酸。於另一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig約15.7至約31莫耳GlcNAc。於另一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig約1.6至約3.2莫耳GalNAc。於另一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig約9.3至約15.5莫耳半乳糖。於一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig約3.6至約7.9莫耳海藻糖。於一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig約9.7莫耳甘露糖。本發明亦提供醫藥套件，其包含：(a)含有本發明經凍乾CTLA4－Ig混合物之容器；與(b)關於將經凍乾CTLA4－Ig混合物重配成注射用溶液之說明書。
說明之治療方法 ：本發明係提供一種抑制T細胞增生(或活化作用)之方法，此方法包括使T細胞與有效量之本發明CTLA4－Ig組合物接觸。本發明係提供一種在病患中抑制免疫回應之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中引致對抗原之免疫耐受性之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療發炎之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種治療風濕性關節炎之方法，其包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療牛皮癬之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療狼瘡之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療或預防過敏反應之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療或預防移植物對宿主疾病之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療或預防移植器官之排斥之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療多發性硬化之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療克隆氏病之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療第I型糖尿病之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療炎性腸疾病之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療卵巢炎之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療絲球體性腎炎之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療過敏性腦脊髓炎之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供一種在病患中治療重症肌無力之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物。本發明係提供具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約6至約18之CTLA4－Ig分子之群集於藥劑製造上之用途，該藥劑係用於治療及/或預防治療免疫病症。本發明係提供具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約6至約18之CTLA4－Ig分子之群集在抗風濕性關節炎劑製造上之用途，在包裝中，伴隨著其用於治療風濕性關節炎之說明書。
說明之組合療法 ：本發明係提供一種抑制T細胞增生(或活化作用)之方法，此方法包括使T細胞與併用胺甲喋呤之有效量本發明CTLA4－Ig組合物接觸。本發明係提供一種在病患中抑制免疫回應之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物，且併用胺甲喋呤。本發明係提供一種在病患中引致對抗原之免疫耐受性之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明CTLA4－Ig組合物，且併用胺甲喋呤。
製造CTLA4－Ig之方法 ：本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物至液體培養物，其中重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自液體培養物單離重組蛋白質。液體培養物可為至少1,000升，至少5,000升，至少15,000升，至少20,000升，至少25,000升，至少30,000升，至少40,000升。於一項具體實施例中，步驟(a)之擴大作用係包括：(i)將細胞在不含血清、化學上定義之培養基中培養，具有至少四個繼代，以致能夠獲得細胞密度為每毫升至少約1.0 x 105 個存活細胞，其中各接種階段係在每毫升約2 x 105 下開始，且進行至每毫升1－2百萬個細胞；(ii)保持細胞在培養物中，歷經一段足以自培養物產生至少約0.5克/升之時間。於一項具體實施例中，蛋白質為糖蛋白。於一項具體實施例中，蛋白質為CTLA4－Ig蛋白質。於一項具體實施例中，哺乳動物細胞為能夠產生CTLA4－Ig融合蛋白質之CHO無性繁殖細胞系之後代，其中CHO細胞已安定地被整合在其基因組中，CTLA4－Ig表現卡匣之至少30種複製物。於一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於30%之時間。於另一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於40%之時間。於另一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於50%之時間。於另一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於60%之時間。於另一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於70%或80%或90%或95%之時間。
於進一步具體實施例中，該至少四個繼代包括：(i)使細胞在至少50毫升之培養物體積中生長，直至達到細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止，(ii)使細胞在至少10升之培養物體積中生長，直至達到細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止；(iii)使細胞在至少100升之培養物體積中生長，直至達到細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止；及(iv)使細胞在200升之培養物體積中生長，直至達到細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止。於一項具體實施例中，係將半乳糖添加至不含血清、化學上定義之培養基中。於一項具體實施例中，該保持係包括(i)降低培養物之溫度從37±2℃至34±2℃；與(ii)降低培養物之溫度從34±2℃至32±2℃。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少5天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少6天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少7天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少8天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少9天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少10天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少11天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少12天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少13天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少14天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少15天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少16天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少17天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少18天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至高18天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，直到培養物之細胞密度為每毫升液體培養物約30 x 105 至約79 x 105 個細胞。
本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞擴大，從接種培養物至液體培養物，以致使重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自液體培養物單離重組蛋白質，其中單離只在液體培養物含有每莫耳蛋白質大於或等於約6.0莫耳NANA時進行。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞擴大，從接種培養物至液體培養物，以致使重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自液體培養物單離重組蛋白質，其中單離只在液體培養物具有細胞密度為每毫升約33 x 105 至約79 x 105 個細胞時進行。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞擴大，從接種培養物至液體培養物，以致使重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自液體培養物單離重組蛋白質，其中單離係在液體培養物中之細胞存活力尚未降至低於約20%，或約30%，或約38%時進行。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞擴大，從接種培養物到至少10,000升之液體培養物，以致使重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自液體培養物單離重組蛋白質，其中單離只在內毒素低於或等於每毫升液體培養物約76.8 EU時進行。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞擴大，從接種培養物到至少10,000升之液體培養物，以致使重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；且(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質，其中單離只在生物負載量為每毫升液體培養物低於1個菌落形成單位時進行。本發明之液體培養物可為至少5,000升，至少10,000升，至少15,000升，至少20,000升，至少25,000升，至少30,000升，至少40,000升，至少50,000升，至少60,000升之體積。
本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞擴大，從接種培養物至液體培養物，以致使重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自液體培養物單離重組蛋白質，其中單離只在符合下述情況之至少兩個時進行：(i)液體培養物含有每莫耳蛋白質大於或等於約6.0莫耳NANA，(ii)液體培養物具有細胞密度為每毫升約33 x 105 至約79 x 105 個細胞，(iii)在液體培養物中之細胞存活力尚未降至低於約20%或約38%，或(iv)CTLA4－Ig在培養物中之量係大於0.5克/升。於一項具體實施例中，該單離係包括：(i)獲得細胞培養物上層清液；(ii)使上層清液接受陰離子交換層析，以獲得經溶離之蛋白質產物；(iii)使步驟(ii)之經溶離蛋白質產物接受疏水性交互作用層析，以獲得富含之蛋白質產物；(iv)使富含之蛋白質產物接受親和層析法，以獲得經溶離且富含之蛋白質產物；及(v)使(iv)之經溶離且富含之蛋白質產物接受陰離子交換層析。於另一項具體實施例中，於步驟(iii)中所得之富含蛋白質產物，其特徵在於任何高分子量污染物之百分比係低於25重量%。於另一項具體實施例中，步驟(ii)之陰離子交換層析係使用包含約75 mM HEPES與約360 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(ii)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPES與約325 mM NaCl且具有pH值約7.0之溶離緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用包含約25 mM HEPES與約850 mM NaCl且具有pH值約7.0之單一洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(iv)之親和層析法係使用包含約25 mM Tris與約250 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(iv)之親和層析法係使用包含約100 mM甘胺酸且具有pH值約3.5之溶離緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(v)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPES與約120 mM NaCl至約130 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(v)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPES與約200 mM NaCl且具有pH值約8.0之溶離緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(ii)之陰離子交換層析係使用具有一級、二級、三級或四級胺官能基之陰離子交換樹脂之管柱進行。於另一項具體實施例中，樹脂具有四級胺官能基。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或異戊基官能基之疏水性交互作用樹脂進行。於另一項具體實施例中，官能基為苯基官能基。於另一項具體實施例中，步驟(iv)之親和層析法係使用含有蛋白質A之管柱進行。
本發明係提供一種製備CTLA4－Ig之方法，此方法包括使CTLA4－Ig自液體細胞培養物純化，因此經純化之CTLA4－Ig(a)具有每毫克CTLA4－Ig二聚體約38毫微克MCP－1，且(b)包含低於2.5% CTLA4－Ig四聚體，以重量計。本發明係提供一種製造CTLA4－Ig之方法，此方法包括：(a)使能夠產生CTLA4－Ig之後代細胞或CHO細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升之液體培養物，其中CTLA4－Ig濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig，其中層析係在使用具有至少一個苯基官能基之疏水性交互作用樹脂之管柱上，其中單離係包括疏水性交互作用層析之步驟，使用包含約25 mM HEPES與約850 mM NaCl且具有pH值約7.0之單一洗滌緩衝劑進行。
CTLA4－Ig分子包括β多肽分子。CTLA4A29YL104E －Ig為β多肽分子。本發明係關於大量製造β多肽組合物、經改良之組合物及會產生組合物之細胞之方法。本發明係針對β多肽分子，包含β多肽分子之經改良組合物，及大量製造β多肽與其他重組糖蛋白之經改良方法。
製造β多肽及其他糖蛋白之方法 ：本發明係提供一種製造重組糖蛋白之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組糖蛋白之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少約10,000升之液體培養物，其中重組蛋白質濃度為至少約0.5克/升液體培養物，其中該擴大係包括：(i)將細胞在不含血清、化學上定義之培養基中培養，具有至少四個繼代，以獲得細胞密度為每毫升至少約1.0 x 105 個存活細胞，其中各接種階段係在每毫升約2 x 105 下開始，且進行至每毫升約1－2百萬個細胞，其中該培養係包括：(1)將細胞在不含血清、化學上定義之接種物培養基中培養，歷經約15天至約25天；然後(2)將細胞在不含血清、化學上定義之基礎培養基中培養，直至達到細胞密度為每毫升約至少4百萬個細胞為止；與(ii)保持細胞在培養物中，歷經一段足以自培養物產生至少約0.5克/升之重組蛋白質之時間；與(b)自至少約10,000升液體培養物單離重組蛋白質。
本發明係提供一種製造重組糖蛋白之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組糖蛋白之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少約10,000升之液體培養物，其中重組蛋白質濃度為至少約0.5克/升液體培養物，其中該擴大係包括：(i)將細胞在不含血清、化學上定義之培養基中培養，具有至少四個繼代，以獲得細胞密度為每毫升至少約1.0 x 105 個存活細胞，其中各接種階段係在每毫升約2 x 105 下開始，且進行至每毫升約1－2百萬個細胞；與(ii)保持細胞在培養物中，歷經一段足以自培養物產生至少約0.5克/升之重組蛋白質之時間，其中該保持係包括：(1)降低培養物之溫度，從37±2℃至34±2℃；與(2)添加多陰離子性化合物至培養物中；與(b)自至少約10,000升液體培養物單離重組蛋白質。
本發明係提供一種製造重組糖蛋白之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組糖蛋白之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少約10,000升之液體培養物，其中重組蛋白質濃度為至少約0.5克/升液體培養物；與(b)自至少約10,000升液體培養物單離重組蛋白質，其中該單離係包括：(i)獲得步驟(a)培養物之可溶性離份；(ii)使可溶性離份接受親和層析，以獲得經溶離之蛋白質產物；(iii)使步驟(ii)之經溶離蛋白質產物接受陰離子交換層析，以獲得經溶離且富含之蛋白質產物；及(iv)使富含之蛋白質產物接受疏水性交互作用層析，以獲得富含之蛋白質產物。
於本發明之一項具體實施例中，蛋白質包括CTLA4－Ig。於另一項具體實施例中，蛋白質包括β多肽。於另一項具體實施例中，蛋白質包括具有順序識別碼：11、12、13、14、15或16之β多肽。
於本發明之一項具體實施例中，該至少四個繼代包括：(i)使細胞在至少50毫升之培養物體積中生長，直至達到細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止；(ii)使細胞在至少10升之培養物體積中生長，直至達到細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止；(iii)使細胞在至少100升之培養物體積中生長，直至達到細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止；及(iv)使細胞在200升之培養物體積中生長，直至達到細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止。
於本發明之一項具體實施例中，該單離係包括：(i)獲得步驟(a)培養物之可溶性離份；(ii)使可溶性離份接受親和層析，以獲得經溶離之蛋白質產物；(iii)使步驟(ii)之經溶離蛋白質產物接受陰離子交換層析，以獲得經溶離且富含之蛋白質產物；及(iv)使富含之蛋白質產物接受疏水性交互作用層析，以獲得富含之蛋白質產物。
於一項具體實施例中，步驟(iv)中所得富含蛋白質產物之特徵在於任何高分子量多聚體之百分比係低於25重量%。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之陰離子交換層析係使用包含約50 mM HEPES與約135 mM NaCl且具有pH值約7之洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之陰離子交換層析係使用包含約50 mM HEPES與約200 mM NaCl且具有pH值約7之溶離緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(iv)之疏水性交互作用層析係使用包含約50 mM HEPES與約1.2 M(NH4 )2 SO4 且具有pH值約7之洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法係使用包含約25 mM NaH2 PO4 與約150 mM NaCl且具有pH值約7.5之洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法係使用包含約250 mM甘胺酸且具有pH值約3之溶離緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之陰離子交換層析係使用具有一級、二級、三級或四級胺官能基之陰離子交換樹脂之管柱之進行。於另一項具體實施例中，樹脂具有四級胺官能基。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或異戊基官能基之疏水性交互作用樹脂進行。於另一項具體實施例中，官能基為苯基官能基。於另一項具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法係使用含有蛋白質A之管柱進行。
於另一項具體實施例中，該擴大係包括：(i)將細胞在不含血清、化學上定義之培養基中培養，具有至少四個繼代，以獲得細胞密度為每毫升至少約1.0 x 105 個存活細胞，其中各接種階段係在每毫升約2 x 105 下開始，且進行至每毫升約1－2百萬個細胞；與(ii)保持細胞在培養物中，歷經一段足以自培養物產生至少約0.5克/升之重組蛋白質之時間。於另一項具體實施例中，該培養係包括：(i)將細胞在不含血清、化學上定義之接種物培養基中培養，歷經約15天至約25天；然後(ii)將細胞在不含血清、化學上定義之基礎培養基中培養，直至達到細胞密度為每毫升約至少4百萬個細胞為止。
於另一項具體實施例中，該保持係包括(i)降低培養物之溫度，從37±2℃至34±2℃；與(ii)添加多陰離子性化合物至培養物中。於一項具體實施例中，多陰離子性化合物為右旋醣酐硫酸鹽，且其中係將右旋醣酐硫酸鹽添加至培養物中，於最後濃度為約50毫克/毫升下。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少5天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少6天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少7天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少8天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少9天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少10天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少11天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少12天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少13天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少14天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少15天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少16天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少17天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少18天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少19天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少20天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少21天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少22天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少23天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少24天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少25天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少26天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少27天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至少28天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，歷經至高28天。於另一項具體實施例中，溫度係被保持在34±2℃之範圍內，直到培養物之細胞密度為每毫升液體培養物約30 x 105 至約79 x 105 個細胞。
於一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於30%之時間。於另一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於40%之時間。於另一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於50%之時間。於另一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於60%之時間。於另一項具體實施例中，足夠之時間係為細胞存活力不會降至低於70%或80%或90%或95%之時間。
於一項具體實施例中，係將半乳糖添加至不含血清、化學上定義之培養基中。於另一項具體實施例中，單離係當液體培養物含有每莫耳蛋白質大於或等於約6莫耳唾液酸時進行。於另一項具體實施例中，單離係當液體培養物含有每莫耳蛋白質約5.2至約7.6莫耳唾液酸時進行。於另一項具體實施例中，單離係當液體培養物具有細胞密度為每毫升約33 x 105 至約79 x 105個細胞時進行。於另一項具體實施例中，單離係當液體培養物中之細胞存活力尚未降至低於約37%時進行。於另一項具體實施例中，單離係當內毒素為每毫升液體培養物低於或等於約4.8 EU時進行。於另一項具體實施例中，單離係當生物負載量為每毫升液體培養物低於約1個菌落形成單位(cfu/毫升)時進行。於另一項具體實施例中，若符合下述情況之至少兩個，則進行單離：(i)液體培養物含有每莫耳蛋白質大於或等於約6莫耳唾液酸，(ii)液體培養物具有細胞密度為每毫升約33 x 105至約79 x 105個細胞，(iii)液體培養物中之細胞存活力尚未降至低於約37%，或(iv)糖蛋白在培養物中之量為約0.46克/升至約0.71克/升。
於一項具體實施例中，哺乳動物細胞為中國大頰鼠卵巢無性繁殖細胞系之後代，其會產生β多肽之任何組合，各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16，其中該中國大頰鼠卵巢細胞各已安定地被整合在其基因組中，包含順序識別碼：23之表現卡匣之至少30種複製物。於一項具體實施例中，液體培養物包含本發明生產細胞系之細胞或該細胞之後代細胞。
本發明係提供包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之β多肽，藉本發明所提供之方法獲得。本發明係提供包含β多肽之組合物，各多肽包含藉本發明提供之方法所獲得之順序識別碼：11、12、13、14、15或16。本發明係提供藉本發明提供之方法所獲得之β多肽。
細胞 ：本發明係提供無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞，其包含會使β多肽編碼之核酸。本發明係提供會產生β多肽之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集。於一項具體實施例中，β多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16。本發明係提供無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞，其包含核酸，包含會使順序識別碼：11、12、13、14、15或16之胺基酸順序編碼之表現卡匣。於一項具體實施例中，表現卡匣包含順序識別碼：23。本發明係提供會產生β多肽之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中β多肽係表現自核苷酸順序，此順序係衍生自具有ATCC收受號碼PTA－2104之質粒，依布達佩斯(Budapest)條約之條款，於2000年6月19日寄存在美國培養物類型收集處(ATCC)，10801 Blvd.大學，Manassas,VA,20110。
本發明係提供會產生β多肽之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，各細胞包含β多肽表現卡匣之30種或更多種複製物。本發明係提供會產生β多肽之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，各細胞包含β多肽表現卡匣之30種或更多種複製物，其中該30種或更多種複製物係被整合在各細胞基因組中之單一位置上。本發明係提供會產生β多肽之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中β多肽表現卡匣係為安定的，歷經約105個繼代。於一項具體實施例中，β多肽係被整合至細胞基因組之表現卡匣編碼。於一項具體實施例中，群集包含細胞，各包含β多肽表現卡匣之33種或更多種複製物，其中該33種或更多種複製物係被整合在群集之各細胞基因組中之單一位置上。於另一項具體實施例中，群集包含細胞，各包含β多肽表現卡匣之36、38、40、45種或更多種複製物，其中複製物係被整合在群集之各細胞基因組中之單一位置上。
本發明係提供會產生β多肽之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中至少75%細胞群集，每細胞具有β多肽表現卡匣之30種或更多種複製物，其中該30種或更多種複製物係被整合在75%群集之各細胞基因組中之單一位置上。本發明係提供會產生β多肽之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中至少85%細胞群集，每細胞具有β多肽表現卡匣之30種或更多種複製物，其中該30種或更多種複製物係被整合在85%群集之各細胞基因組中之單一位置上。本發明係提供會產生β多肽之無性繁殖系中國大頰鼠卵巢細胞群集，其中至少95%細胞群集，每細胞具有β多肽表現卡匣之30種或更多種複製物，其中該30種或更多種複製物係被整合在95%群集之各細胞基因組中之單一位置上。於一項具體實施例中，表現卡匣係衍生自以ATCC收受號碼PTA－2104寄存之質粒。於另一項具體實施例中，表現卡匣包含具有順序識別碼：23順序之核酸。於一項具體實施例中，細胞群集會產生每升液體培養物至少約0.5克β多肽，且其中β多肽具有唾液酸對β多肽二聚體或β多肽分子之莫耳比為約5.5至約8.5，在培養規模為1,000升或更多下。於另一項具體實施例中，細胞群集會產生每升液體培養物至少5、至少10或至少20克β多肽。於另一項具體實施例中，β多肽具有唾液酸對β多肽二聚體或β多肽分子之莫耳比為約5至約10，在培養規模為1,000升或更多下。於另一項具體實施例中，細胞群集已被配合調整至不含血清、化學上定義之培養基中。於另一項具體實施例中，製自細胞群集之培養物之β多肽具有消光係數為1.0±0.05 AU毫升公分－1毫克－1。於另一項具體實施例中，當在培養物中生長時，細胞群集會產生β多肽，其中：(a)約90%或約80%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基27處之甲硫胺酸開始；(b)約10%或約20%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號26處之丙胺酸開始；(c)約4%至約8%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號383處之離胺酸終止；(d)約92%至約96%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號382處之甘胺酸終止；且視情況，(e)約低於1%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號25處之甲硫胺酸開始。
本發明係提供本發明細胞群集之後代細胞，其中後代細胞會產生β多肽。於一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養，歷經至少5、至少10、至少20、至少40、至少50、至少75個世代。於另一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養，歷經27個世代。
本發明係提供製自藉本發明所提供任何細胞之細胞系。於一項具體實施例中，細胞系為無性繁殖系。於一項具體實施例中，該細胞系會產生：(a)具有順序識別碼：16之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置27處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；(b)具有順序識別碼：13之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置27處，而離胺酸在胺基酸位置383處)；(c)具有順序識別碼：15之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之丙胺酸在胺基酸位置26處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；(d)具有順序識別碼：12之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之丙胺酸在胺基酸位置26處，而離胺酸在胺基酸位置383處)；(e)具有順序識別碼：11之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置25處，而離胺酸在胺基酸位置383處)；(f)具有順序識別碼：14之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置25處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；或(g)其任何組合。於一項具體實施例中，該細胞系會產生β多肽，其中：(a)約90%或約80%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基27處之甲硫胺酸開始；(b)約10%或約20%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號26處之丙胺酸開始；(c)約4%至約8%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號383處之離胺酸終止；(d)約92%至約96%之β多肽包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號382處之甘胺酸終止；且視情況，(e)約低於1%之β多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號25處之甲硫胺酸開始。於一項具體實施例中，其中製自將細胞系培養之β多肽，具有消光係數為1.0±0.05 AU毫升公分－1毫克－1。
本發明係提供衍生自本發明細胞之細胞群集。於一項具體實施例中，當與用以衍生群集之本發明細胞比較時，群集之細胞含有至少一個其他基因改變，且其中細胞會產生β多肽。於另一項具體實施例中，當與用以衍生群集之本發明細胞比較時，群集之細胞係含有至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10或至少20個其他基因改變，且其中細胞會產生β多肽。於一項具體實施例中，基因改變係包括至少一個非保守突變，在細胞基因組中，或在會使β多肽編碼之表現卡匣中。於另一項具體實施例中，基因改變包括至少一種其他重組核酸在細胞內。於另一項具體實施例中，基因改變包括細胞基因組之突變。於另一項具體實施例中，基因改變包括核酸之添加至細胞基因組中，或作為反式核酸，且其中核酸會使抗細胞凋零多肽編碼。於另一項具體實施例中，抗細胞凋零多肽係關於糖基化作用。於另一項具體實施例中，基因改變包括細胞基因組或會使β多肽編碼之表現卡匣之至少一個突變。於另一項具體實施例中，當在培養物中生長時，細胞群集會產生：(a)具有順序識別碼：16之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置27處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；(b)具有順序識別碼：7之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置27處，而離胺酸在胺基酸位置383處)；(c)具有順序識別碼：15之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之丙胺酸在胺基酸位置26處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；(d)具有順序識別碼：12之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之丙胺酸在胺基酸位置26處，而離胺酸在胺基酸位置383處)；(e)具有順序識別碼：11之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置25處，而離胺酸在胺基酸位置383處)；(f)具有順序識別碼：14之胺基酸順序之β多肽(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置25處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；或(g)其任何組合。
組合物 ：本發明係提供β多肽之經單離群集，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，具有唾液酸基團對β多肽二聚體或β多肽分子之平均莫耳比為約5至約10。於一項具體實施例中，唾液酸基團對β多肽二聚體或β多肽分子之平均莫耳比為約5.5至約8.5。於一項具體實施例中，唾液酸基團對β多肽二聚體或β多肽分子之平均莫耳比為約5.2至約7.6。本發明係提供β多肽之經單離群集，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，具有唾液酸基團對β多肽二聚體或β多肽分子之平均莫耳比為約6。本發明係提供β多肽之經單離群集，其中各多肽包含順序識別碼11、12、13、14、15或16之順序，且其中大於95%之多肽係形成二聚體。於一項具體實施例中，大於98%，大於99%或大於99.5%之多肽係形成二聚體。於另一項具體實施例中，約95%至約99.5%之多肽係形成二聚體，而約0.5%至約5%之多肽係形成四聚體或高分子量物種。於另一項具體實施例中，約98.6%之多肽係形成二聚體，而約1.2%之多肽係形成四聚體或高分子量物種，及約低於0.7%之多肽為單體。於另一項具體實施例中，約95%之多肽係形成二聚體，而約4%之多肽係形成四聚體或高分子量物種，及約1%之多肽為β多肽二聚體之經單離群集，其中各多肽單體包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序。於一項具體實施例中，群集係實質上不含β多肽單體。於另一項具體實施例中，群集係實質上不含β多肽四聚體。本發明係提供β多肽單體之經單離群集，實質上不含β多肽二聚體與四聚體。於一項具體實施例中，各β多肽二聚體之各單體係包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且具有至少2.5個唾液酸基團。
本發明係提供β多肽之經單離群集，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，在B7結合檢測中，與CTLA4－Ig標準物比較，具有功效為約70%至約130%，其中該檢測包括度量表面電漿激元共振。本發明係提供β多肽之經單離群集，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，在人類細胞IL－2抑制檢測中，與標準物比較，具有功效為約50%至約150%。本發明係提供β多肽四聚體或高分子量物種之經純化群集，其中各多肽單體包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，該群集係實質上不含β多肽二聚體且視情況其中該群集包含大於約100克之量。本發明係提供β多肽四聚體或高分子量物種之經純化群集，其中各多肽單體包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，該群集係實質上不含β多肽單體，且視情況其中該群集包含大於約100克之量。於一項具體實施例中，各四聚體分子包含兩對β多肽，其中各多肽單體包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽對之各成員係以共價方式連結至另一成員，且其中兩對多肽係以非共價鍵方式彼此締合。於一項具體實施例中，各四聚體分子係能夠結合至CD80或CD86。於一項具體實施例中，各四聚體分子，當與β多肽二聚體比較時，對CD80或CD86具有至少2－倍較大抗體親抗原性，其中二聚體之各多肽單體包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序。於另一項具體實施例中，各四聚體分子，當與包含順序識別碼：2之順序之CTLA4－Ig四聚體分子比較時，對CD80或CD86具有至少2－倍較大抗體親抗原性。於另一項具體實施例中，各四聚體分子，當與β多肽二聚體比較時，具有T細胞增生或活化作用之至少2－倍較大抑制，其中二聚體之各多肽單體包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序。於另一項具體實施例中，各四聚體分子，當與包含順序識別碼：2之順序之CTLA4－Ig四聚體分子比較時，具有T細胞增生或活化作用之至少2－倍較大抑制。
本發明係提供包含β多肽之經單離組合物，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中該組合物包含可在等電焦聚凝膠上見及之優勢異構重組物，當藉等電焦聚測定時，其具有等電點pI低於或等於5.5。於一項具體實施例中，在神經胺糖酸苷酶處理後，pI會增加。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少40%之β多肽顯示等電點低於或等於約5.3。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少70%之β多肽顯示等電點低於或等於約5.3。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少90%之β多肽顯示等電點低於或等於約5.3。本發明係提供具有pI為約2.0±0.2至約5.2±0.2之β多肽之經單離群集。本發明係提供具有pI為約4.5±0.2至約5.2±0.2之β多肽之經單離群集。本發明係提供具有pI為約4.7±0.2至約5.1±0.2之β多肽之經單離群集。本發明係提供一種製備組合物之方法，該組合物包含具有pI為約2.0±0.2至約5.2±0.2之β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，此方法包括：(a)使β多肽之混合物接受等電焦聚凝膠電泳，其中在凝膠上之單一譜帶表示具有特定pI之β多肽之群集，與(b)單離具有pI為約2.0±0.2至約5.2±0.2之β多肽之群集，以製備組合物。
本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GalNAc之平均莫耳比為約2.7至約3.6。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之海藻糖之平均莫耳比為約6.4至約7.0。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之甘露糖之平均莫耳比為約14至約16。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中分子之特徵為每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中分子之特徵為每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5至約10。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28；且(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中分子之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GalNAc之平均莫耳比為約2.7至約3.6；及(c)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中分子之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GalNAc之平均莫耳比為約2.7至約3.6；(c)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；及(d)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GalNAc之平均莫耳比為約2.7至約3.6；(c)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；(d)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之海藻糖之平均莫耳比為約6.4至約7.0；及(e)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GalNAc之平均莫耳比為約2.7至約3.6；(c)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；(d)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之海藻糖之平均莫耳比為約6.4至約7.0；(e)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之甘露糖之平均莫耳比為約14至約16；及(f)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約8至約17；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5；及(c)碳水化合物分佈形態係實質上與圖7相同。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約8至約17；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5；(c)碳水化合物分佈形態係實質上與圖7相同；及(d)β多肽四聚體含量低於約5%。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；與(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5；及(c)β多肽四聚體含量低於約5%。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5；與(b)碳水化合物分佈形態係實質上與圖7相同。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；與(b)碳水化合物分佈形態係實質上與圖7相同。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5；與(b)β多肽四聚體含量低於約5%。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；與(b)β多肽四聚體含量低於約5%。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽顯示碳水化合物分佈形態係實質上與圖7相同。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中多肽顯示功能部位I－IV之碳水化合物分佈形態，其中功能部位I包含表示非唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位II包含表示單－唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位III包含表示二－唾液酸基化寡醣之吸收峰，及功能部位IV包含表示三－唾液酸基化之吸收峰。於一項具體實施例中，在功能部位I中之第一個吸收峰與功能部位II中之主峰之間，於N－連結寡醣之滯留時間上之差異，係為約11至約13分鐘。於一項具體實施例中，功能部位III與IV之總和係佔全部碳水化合物分佈形態之約25%至約36。
本發明係提供包含β多肽二聚體之經單離組合物，其中各多肽單體包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中至少約0.5%之分子係經半胱胺醯基化。本發明係提供β多肽之經單離群集，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中該群集顯示如圖9中所示之質量光譜分佈形態。本發明係提供β多肽之經單離群集，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，具有唾液酸基團對β多肽二聚體或β多肽分子之平均莫耳比為約5.5至約8.5，其中β多肽二聚體係製自生產細胞系之細胞。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，其中多肽係在順序識別碼：4之位置102處之天冬素胺基酸殘基，在順序識別碼：4之位置134處之天冬素胺基酸殘基，在順序識別碼：4之位置233處之天冬素胺基酸殘基上經糖基化。本發明係提供經單離之組合物，其包含β多肽，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中分子之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GalNAc之平均莫耳比為約2.7至約3.6；(c)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；(d)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之海藻糖之平均莫耳比為約6.4至約7.0；(e)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之甘露糖之平均莫耳比為約14至約16；(f)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5；(g)當從等電焦聚凝膠上之顯像測定時，pI係在約2.4±0.2至約5.2±0.2之範圍內；(h)MCP－1低於或等於5 ppm；(i)低於5%四聚體；(j)低於1%單體；及(k)此群集之β多肽具有胺基酸至少95%相同於任何順序識別碼：4、11、12、13、14、15或16，其中在群集內之β多肽係能夠結合至CD80與CD86。本發明係提供β多肽之經單離群集，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中分子群集之特徵為：(a)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28；(b)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之GalNAc之平均莫耳比為約2.7至約3.6；(c)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之半乳糖之平均莫耳比為約11至約13；(d)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之海藻糖之平均莫耳比為約6.4至約7.0；(e)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之甘露糖之平均莫耳比為約14至約16；(f)每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子之唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約8.5；(g)當從等電焦聚凝膠上之顯像測定時，pI係在約2.4±0.2至約5.2±0.2之範圍內；(h)MCP－1低於或等於5 ppm；(i)低於5%四聚體；(j)低於1%單體；及(k)此群集之β多肽具有胺基酸至少95%相同於任何順序識別碼：4、11、12、13、14、15或16，其中在群集內之β多肽分子係能夠結合至CD80與CD86；或其醫藥相當物。
本發明係提供一種組合物，其包含有效量之本發明β多肽，及藥學上可接受之載劑。本發明係提供一種組合物，其包含如2005年12月20日提出申請之美國專利申請案號60/752,150中所述之賦形劑；於一項具體實施例中，該組合物包含貝拉塔謝特(belatacept)。於一項具體實施例中，組合物進一步包含藥學上可接受之稀釋劑、佐劑或載劑。於一項具體實施例中，組合物進一步包含蔗糖、單鹽基性磷酸鈉單水合物、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸及無菌水。於另一項具體實施例中，組合物包含蔗糖、聚氧體(poloxamer)、單鹽基性磷酸鈉單水合物、二鹽基性無水磷酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉及無菌水。於一項具體實施例中，組合物係經凍乾。本發明係提供一種經凍乾之組合物，其包含有效量之本發明β多肽，蔗糖、單鹽基性磷酸鈉單水合物、氯化鈉、氫氧化鈉及鹽酸。
調配物與套件 ：本發明係提供經凍乾之β多肽混合物，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，包含至少95% β多肽二聚體與不超過5% β多肽四聚體。於一項具體實施例中，該混合物包含98% β多肽二聚體與不超過2% β多肽四聚體。於一項具體實施例中，混合物包含至少99% β多肽二聚體與不超過1% β多肽四聚體。於一項具體實施例中，混合物中每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子包含至少5莫耳唾液酸。於一項具體實施例中，混合物中每莫耳β多肽二聚體包含約24至約28莫耳GlcNAc。於一項具體實施例中，混合物中每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子包含約2.7至約3.6莫耳GalNAc。於一項具體實施例中，混合物中每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子包含約11至約13莫耳半乳糖。於一項具體實施例中，混合物中每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子包含約6.4至約7.0莫耳海藻糖。於一項具體實施例中，混合物中每莫耳β多肽二聚體或β多肽分子包含約14至約16莫耳甘露糖。本發明亦提供醫藥套件，其包含：(a)含有本發明經凍乾β多肽混合物之容器，與(b)關於將經凍乾β多肽混合物重配成注射用溶液之說明書。
說明之治療方法 ：一種抑制T細胞增生、活化作用或兩者之方法，此方法包括使T細胞與有效量之本發明β多肽組合物接觸。本發明係提供一種在病患中抑制免疫回應之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療免疫病症之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中引致對抗原之免疫耐受性之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療發炎之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種治療風濕性關節炎之方法，其包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療牛皮癬之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療狼瘡之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療或預防過敏反應之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療或預防移植物對宿主疾病之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療或預防移植器官之排斥之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療或預防移植組織之排斥之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療或預防移植細胞之排斥之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。於一項具體實施例中，移植細胞為骨髓細胞。於另一項具體實施例中，移植細胞為胰島細胞。於另一項具體實施例中，移植細胞為會產生胰島素之胰小島細胞。本發明係提供一種在病患中治療多發性硬化之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療克隆氏病之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療第I型糖尿病之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療炎性腸疾病之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療卵巢炎之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療絲球體性腎炎之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療過敏性腦脊髓炎之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。本發明係提供一種在病患中治療重症肌無力之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物。
本發明係提供β多肽群集之用途，其中各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中該群集具有唾液酸基團對β多肽二聚體或β多肽分子之平均莫耳比為約5至約10，其係用於製造藥劑，以治療及/或預防治療免疫病症。本發明係提供β多肽群集之用途，其中各多肽包含順序識別碼11、12、13、14、15或16之順序，且其中該群集具有唾液酸基團對β多肽二聚體或β多肽分子之平均莫耳比為約5至約10，其係用於製造抗風濕性關節炎劑，在包裝中伴隨著關於其用於治療風濕性關節炎之說明書。於一項具體實施例中，該群集具有唾液酸基團對β多肽二聚體或β多肽分子之平均莫耳比為約5.5至約8.5。
說明之組合療法：本發明係提供一種抑制T細胞增生、活化作用或兩者之方法，此方法包括使T細胞與有效量之本發明β多肽組合物接觸，且併用胺甲喋呤。本發明係提供一種在病患中抑制免疫回應之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物，且併用胺甲喋呤。本發明係提供一種在病患中引致對抗原之免疫耐受性之方法，此方法包括對有需要之病患投予有效量之本發明β多肽組合物，且併用胺甲喋呤。
發明詳述
CTLA4－Ig分子可用以治療多種病症，包括關於迷行免疫增生性與免疫反應性現象之病症，譬如自身免疫性與過敏反應。本發明係提供CTLA4－Ig組合物，其包含例如具有特定糖基化作用修改，具有特定碳水化合物分佈形態或特徵，具有特定多聚體結構及/或具有特定抗體親抗原性強度之CTLA4－Ig分子之群集。亦描述CTLA4－Ig分子，其用途及方法，而據此以其全文併於本文供參考之文件，係包括美國專利5,434,131；5,851,795；5,885,796；5,885,579；及7,094,874。
本發明亦提供細胞系，其能夠經由本文中所提供之大量生產與培養方法，產生大量CTLA4－Ig分子。本發明之一種特定細胞系為無性繁殖細胞系，其可用以大量生產CTLA4－Ig分子，以致其具有特定糖基化作用與碳水化合物分佈形態。當與具有ATCC收受號碼68629之非均質與非無性繁殖細胞系群集(參閱美國專利5,434,131，其係據此以其全文併入供參考)比較時，本發明之無性繁殖細胞系可分泌具有更一致或更均勻糖基化作用或碳水化合物分佈形態之CTLA4－Ig分子群集。再者，當與具有ATCC收受號碼68629之非均質與非無性繁殖細胞系群集比較時，本發明之無性繁殖細胞系可分泌較大量之CTLA4－Ig分子，一部份由於本發明無性繁殖細胞系係經選擇，以具有高複製數目之CTLA4－Ig表現卡匣，經整合至細胞之基因組中之單一位置內。
本發明係提供以下發現，CTLA4－Ig(順序識別碼：2)之抗體親抗原性與功效，可藉由在CTLA－4結合功能部位之B7結合區域中施行兩個胺基酸取代而被增加：(i)在順序識別碼：2之位置29處之丙胺酸係被酪胺酸(A29Y)取代，與(ii)在順序識別碼：2之位置104處之離胺酸係被麩胺酸酯(L104E)取代。本發明係提供CTLA4－Ig分子之亞屬，稱為"β多肽"，其具有B7結合活性，且包含在順序識別碼：24中之胺基酸順序(CTLA4胞外功能部位具有A29Y與L104E突變)，經連結至免疫球蛋白恒定區域或其部份。
[順序識別碼：24]MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
術語
於本文中使用之"無性繁殖系"一詞係指自單細胞擴大之細胞群集。關於能夠表現CTLA4－Ig分子之無性繁殖細胞系或無性繁殖細胞群集，無性繁殖細胞系或群集係從單細胞擴大，該單細胞係單離自以會使CTLA4－Ig分子編碼之表現載體轉染之細胞群集。經轉染之細胞群集可為非均質群集。無性繁殖細胞系或群集可被認為是均質，其意義是所有在群集中之細胞係來自單一轉染體。
於本文中使用之"B7－1"一詞係指CD80；"B7－2"一詞係指CD86；而"B7"一詞係指B7－1與B7－2(CD80與CD86)之任一個或兩者。"B7－1－Ig"或"B7－1Ig"術語係指CD80－Ig；"B7－2－Ig"或"B7－2Ig"術語係指CD86－Ig。
於本文中使用之術語"CTLA4－Ig"或"CTLA4－Ig分子"或"CTLA4Ig分子"或"CTLA4－Ig蛋白質"或"CTLA4Ig蛋白質"可交換使用，且係指蛋白質分子，其包含至少CTLA4－Ig多肽，具有CTLA4胞外功能部位與免疫球蛋白恒定區域。在一些具體實施例中，例如CTLA4－Ig多肽係包含至少順序識別碼：18之胺基酸順序。在某些具體實施例中，CTLA4胞外功能部位與免疫球蛋白恒定區域或其部份可為野生型或突變體或經修改。突變CTLA4－Ig多肽為包含突變CTLA4胞外功能部位之CTLA4－Ig多肽。突變CTLA4Ig分子包含至少突變CTLA4－Ig多肽。在一些具體實施例中，CTLA4胞外功能部位與免疫球蛋白恒定區域或其部份可為哺乳動物，包括人類或老鼠。在一些具體實施例中，突變CTLA4胞外功能部位可具有胺基酸順序，其係為至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同於圖1中之CTLA4胞外功能部位[順序識別碼：18]。在一些具體實施例中，突變免疫球蛋白恒定區域或其部份可具有胺基酸順序，其係為至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同於如圖1中所示之Ig恒定區域。此多肽可進一步包含其他蛋白質功能部位。CTLA4－Ig分子可涵蓋CTLA4－Ig多肽之單體，且亦可涵蓋多肽之多聚體形式，譬如二聚體、四聚體及六聚體等(或其他高分子量物種)。CTLA4－Ig分子亦能夠結合至CD80及/或CD86。CTLA4－Ig分子包括突變CTLA4Ig分子，譬如"β多肽"，例如CTLA4A29YL104E －Ig。例如，阿巴塔謝特(Abatacept)包含CTLA4－Ig分子，而貝拉塔謝特(belatacept)包含β多肽(突變CTLA4－Ig分子之一種實例)。
於本文中使用之"CTLA4胞外功能部位"一詞係指蛋白質功能部位，包含順序識別碼：18中所示胺基酸順序之全部或一部份，結合至B7－1(CD80)及/或B7－2(CD86)。在一些具體實施例中，CTLA4胞外功能部位可包含具有胺基酸順序之多肽，其係為至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同於順序識別碼：2之胺基酸27－150，其係與順序識別碼：18所示之胺基酸相同。順序識別碼：2之胺基酸151係為接合胺基酸。
於本文中使用之"β多肽"一詞係指突變CTLA4－Ig多肽，其(1)包含順序識別碼：18之胺基酸順序，其中在位置29處之胺基酸係被突變成酪胺酸，而在位置104處之胺基酸係被突變成麩胺酸酯，視情況具有各種其他突變，及免疫球蛋白恒定區域或其一部份；且(2)係能夠結合至CD80及/或CD86。在一些具體實施例中，例如β多肽包含至少CTLA4A29YL104E －Ig之胞外功能部位之胺基酸順序。β多肽之非限制性實例包括CTLA4A29YL104E －Ig及順序識別碼：4與11－16。在某些具體實施例中，免疫球蛋白恒定區域或其部份可為野生型，或突變體或經修改。在某些具體實施例中，免疫球蛋白恒定區域或其部份可為哺乳動物，包括人類或老鼠。β多肽之其他非限制性實例包括一種β多肽，其包含一或多個胺基酸突變在免疫球蛋白恒定區域或其部份中(例如順序識別碼：4之半胱胺酸120之取代)，與一種β多肽，其包含一個突變在順序識別碼：18之一或多個胺基酸位置25、30、93、96、103或105上。β多肽分子包含β多肽。β多肽分子可涵蓋β多肽之單體，且可涵蓋β多肽之多聚體形式，譬如二聚體、四聚體及六聚體等。例如，貝拉塔謝特(belatacept)包含β多肽分子。β多肽分子係進一步描述於2006年10月5日提出申請之美國臨時申請案號60/849,543中，其係據此以其全文併入供參考。
於本文中使用之"麩胺酸酯"與"麩胺酸"術語可交換使用。
於本文中使用之"二聚體"一詞係指由兩個CTLA4－Ig多肽或單體連結或接合在一起所組成之CTLA4－Ig蛋白質或CTLA4－Ig分子。在二聚體之單體間之鏈結可為非共價鏈結或交互作用，共價鏈結或交互作用或兩者。CTLA4－Ig二聚體之實例係示於圖3中。由兩個相同單體所組成之CTLA4－Ig蛋白質或CTLA4－Ig分子係為同種二聚體。CTLA4－Ig同種二聚體亦涵蓋包含可在順序上稍微不同之兩個單體之分子。同種二聚體涵蓋一種二聚體，其中接合在一起之單體具有實質上相同順序，及其中在順序上之差異為輕微。包含同種二聚體之單體係共有相當可觀之結構類同性。例如，在順序上之差異可歸因於單體之N－末端處理修改。
於本文中使用之"保守突變"係指在核酸順序上之改變，其係以一個胺基酸替代另一個相同種類(例如，一個非極性胺基酸取代另一個，譬如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸；或一個極性胺基酸取代另一個，譬如精胺酸取代離胺酸，麩胺酸取代天門冬胺酸，或麩醯胺取代天冬素)。
於本文中使用之"非保守突變"係指在核酸順序上之改變，其係以一個胺基酸替代另一個不同種類(例如，一個鹼性胺基酸譬如離胺酸、精胺酸或組胺酸，以酸性胺基酸譬如天門冬胺酸或麩胺酸取代)。例如，一種胺基酸可於生物化學上不同於另一種胺基酸，以胺基酸類之大小、電荷、極性、反應性或其他此種特徵為基礎。
於本文中使用之"經單離"係指一種經部份或完全回收或分離自其環境之其他成份之物質，以致該物質係為存在於所形成組合物、混合物或成份收集物中之主要物種(例如，在莫耳濃度基礎下，其係比組合物中之任何其他個別物種更豐富)。例如，製劑可包含大於約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%經單離之CTLA4－Ig。"經單離"並未排除CTLA4－Ig分子與來自其中該分子自然地存在之環境之其他CTLA4－Ig分子之混合物。"經單離"並未排除與CTLA4－Ig合併之藥學上可接受之賦形劑，其中CTLA4－Ig已被回收自其環境，譬如細胞培養物、批次培養物或生物反應器等。於本文中使用之"單離"係指進行一種程序或方法以獲得經單離之CTLA4－Ig分子。
於本文中使用之"可溶性CTLA4"一詞係意謂未被結合至細胞膜之CTLA4。例如，可溶性CTLA4可包括CTLA4－Ig，其包含CTLA4之胞外區域，經連結至Ig。
於本文中使用之"細胞培養物之可溶性離份"一詞係指細胞培養物之液體部份，其係實質上不含細胞培養物之不溶性微粒子或固體成份，譬如細胞、細胞膜及核。可溶性離份可為例如在細胞培養物之離心分離後所形成之上層清液，或在細胞培養物之過濾後所形成之濾液。
於本文中使用之"表現卡匣"一詞係指核酸，其具有至少5'調節區域(例如啟動子)，可操作地連結至會使多肽編碼之核苷酸順序，與視情況選用之未轉譯3'末端區域(例如終止密碼子與聚腺苷酸化作用順序)。在適當條件下，被表現卡匣編碼之多肽係藉由該表現卡匣產生。表現卡匣亦可具有一或多種核苷酸順序，以表現卡匣之整合至宿主細胞基因組中之特定位置為標的(例如，參閱Koduri等人,(2001)Gene 280：87－95)。例如，衍生自以ATCC收受號碼PTA－2104寄存之質粒之CTLA4A29YL104E －Ig多肽表現卡匣，係為會使CTLA4A29YL104E －Ig編碼之表現卡匣之一項實例。
於本文中使用之"實質上純化"一詞係指包含CTLA4－Ig分子之組合物，或CTLA4－Ig分子之經選擇群集，其係移除自其天然環境，且為至少90%不含，91%不含，92%不含，93%不含，94%不含，95%不含，96%不含，97%不含，98%不含，99%不含，99.5%不含或99.9%不含其他成份，譬如天然地與其締合之細胞物質或培養基。例如，關於以重組方式製成之CTLA4－Ig蛋白質分子，"實質上純化"一詞亦可指包含CTLA4－Ig蛋白質分子之組合物，其係移除自製造環境，以致該蛋白質分子係為至少90%不含，91%不含，92%不含，93%不含，94%不含，95%不含，96%不含，97%不含，98%不含，99%不含，99.5%不含或99.9%不含不為令人感興趣之順序識別碼：2之多肽或順序識別碼：2之多肽變型之蛋白質分子。"實質上純化"並未排除CTLA4－Ig分子(譬如二聚體)與其他CTLA4－Ig分子(譬如四聚體)之混合物。"實質上純化"並未排除與CTLA4－Ig分子合併之藥學上可接受之賦形劑或載劑，其中CTLA4－Ig分子已被取出其原本環境。
於本文中使用之"大規模方法"一詞係可與"工業規模方法"一詞交換地使用。"培養容器"一詞係可與"生物反應器"、"反應器"及"槽桶"交換地使用。
"液體培養物"係指在載體上生長或在液體營養物培養基中懸浮生長之細胞(例如細菌、植物、昆蟲、酵母或動物細胞)。
"接種培養物"係指一種經生長之細胞培養物，以被用以接種較大體積之培養基。此接種培養物可用以接種較大體積之培養基，以擴大在培養物中生長之細胞數目(例如在懸浮液中生長之細胞)。
於本文中使用之"培養"係指使一或多個細胞於活體外，在所限定或受控之條件下生長。可被限定之培養條件，其實例包括溫度、氣體混合物、時間及培養基配方。
於本文中使用之"擴大"係指於活體外培養一或多個細胞，以達成在培養物中獲得較大數目細胞之目的。
於本文中使用之"群集"係指兩種或多種分子("分子群集")或細胞("細胞群集")之組群，其特徵為存在或不存在一或多種可度量或可偵測之性質。在均質群集中，分子或細胞於該群集中之特徵為相同或實質上相同之性質(例如無性繁殖細胞系之細胞)。在非均質群集中，分子或細胞於該群集中之特徵為至少一種性質係為相同或實質上相同，其中細胞或分子亦可顯示不相同之性質(例如，CTLA4－Ig分子之群集具有實質上類似之平均唾液酸含量，但具有不類似之甘露糖含量)。
於本文中使用之"高分子量聚集體"係可與"高分子量物種"交換地使用，以指稱包含至少三個CTLA4－Ig單體之CTLA4－Ig分子。例如，高分子量聚集體可為四聚體、五聚體或六聚體。
"百分比(%)產量"係指實際產量除以理論產量，並將此值乘以100。實際產量可以重量給予，以克或以莫耳(例如莫耳產量)表示。理論產率可以理想上或以數學方式計算之產率給予。
於本文中使用之"MCP－1之量"係指(1)MCP－1(單細胞向化性蛋白質－1，尤其是大頰鼠MCP－1)單獨之量，或(2)"似MCP－1"蛋白質之量，其中"似MCP－1"蛋白質包括MCP－1，伴隨著類似MCP－1之蛋白質、MCP－1之片段及/或類似MCP－1蛋白質之片段(例如，於各前述情況中，其可與抗體(例如多株ELISA)檢測具交叉反應性，用於MCP－1之偵測)。MCP－1(及/或類似MCP－1之蛋白質、MCP－1之片段及/或類似MCP－1之蛋白質片段)之不存在係意欲被涵蓋在內，其中關於MCP－1量之範圍未具有下限。
於本文中使用之"糖基化作用含量"係指以共價方式連接至蛋白質分子之N－連結或O－連結糖殘基之量，譬如糖蛋白，例如CTLA4－Ig分子。
於本文中使用之"唾液酸對蛋白質之莫耳比"一詞係經計算，且根據蛋白質之莫耳數，以唾液酸分子之莫耳數給予。
於本文中使用之"糖蛋白"一詞係指藉由添加一或多個碳水化合物，包括添加一或多個糖殘基，而被修改之蛋白質。
於本文中使用之"唾液酸基化作用"一詞係指添加唾液酸殘基至蛋白質中，包括糖蛋白。
於本文中使用之"糖蛋白異構重組物"一詞係指當藉等電焦聚(IEF)凝膠電泳或其他適當方法，藉由其分子量、電荷及/或其他特徵區別混合物中之不同蛋白質而測定時，其特徵為其碳水化合物與唾液酸含量之分子。例如，在IEF凝膠上所發現之各不同譜帶，係表示具有特定等電點(pI)，且因此是相同淨整體電荷之分子。糖蛋白異構重組物可為在IEF凝膠上發現之不同譜帶，其中各譜帶可為具有特定pI之分子群集。
"免疫耐受性"係指對於人們通常會回應之專一抗原或抗原組群未回應性之狀態(例如其中T細胞可不再對抗原回應之狀態)。
"功效"係指回應作為配位體濃度之函數之一種度量方式。例如，催動劑功效係以產生一半最大作用之配位體濃度(EC50 )作定量。功效之非限制性藥理學定義包括親和力與效力之成份，其中效力為藥物引起曾經被束縛回應之能力。功效係關於親和力，但功效與親和力係為藥物作用之不同度量方式。
於本文中使用之"藥學上可接受之載劑"係指供藥理學活性劑用之媒劑。載劑有助於活性劑之傳輸至標的位置，而不會終止藥劑之功能。載劑之適當形式之非限制性實例包括溶液、乳膏、凝膠、凝膠乳化液、膠凍、糊劑、洗劑、藥膏、噴霧劑、軟膏、粉末、固體互混物、氣溶膠、乳化液(例如，水在油中型或油在水中型)、凝膠水溶液、水溶液、懸浮液、擦劑、酊劑及適合局部投藥之貼藥。
於本文中使用之"培養基"與"細胞培養基"及"進料培養基"與"發酵培養基"術語，係指用於生長及/或保持細胞尤其是哺乳動物細胞之營養物溶液。在非限制下，此等溶液一般係提供至少一種成份，來自一或多種下列種類：(1)能量來源，通常呈碳水化合物譬如葡萄糖之形式；(2)所有必須胺基酸，且經常為二十種胺基酸加上半胱胺酸之基本組合；(3)維生素及/或在低濃度下所需要之其他有機化合物；(4)自由態脂肪酸或脂質，例如亞麻仁油酸；及(5)微量元素，其中微量元素係被定義為無機化合物或天然生成之元素，其典型上需要在極低濃度下，經常在微莫耳濃度範圍中。營養溶液可選擇地補充一或多種來自任何下列種類之成份：(1)激素及其他生長因子，譬如血清、胰島素、鐵傳遞蛋白及表皮生長因子；(2)鹽類，例如鎂、鈣及磷酸鹽；(3)緩衝劑，譬如HEPES；(4)核苷與鹼類，譬如腺苷、胸苷及次黃嘌呤；(5)蛋白質與組織水解產物，例如蛋白腖或蛋白腖混合物，其可得自純化之明膠、植物物質或動物副產物；(6)抗生素，譬如健大霉素；(7)細胞保護劑，例如普洛尼克(pluronic)多元醇；及(8)半乳糖。
於本文中使用之"接種"一詞係指添加細胞至培養基中，以起動培養。
於本文中使用之細胞培養物之"生長期"一詞，係指指數細胞生長期間(例如對數期)，其中細胞係主要為快速地分裂。在此時期之期間內，於存活細胞密度上之增加速率，係高於任何其他時間點。
於本文中使用之細胞培養物之"生產期"一詞係指一段時期，於此段期間內細胞生長係為固定或係被保持在幾乎恒定含量下。存活細胞之密度係保持大約恒定，歷經特定期間。在生產期之期間，對數細胞生長已終止，且蛋白質生產係為初期活性。此時培養基通常係被補充，以維持持續之蛋白質生產，且達成所要之糖蛋白產物。
於本文中使用之"表現作用"或"表現"術語，係用以指發生於細胞內之轉錄與轉譯。產物基因在宿主細胞中之表現程度，可以無論是存在於細胞中之相應mRNA之量，或被藉由細胞產生之產物基因所編碼之蛋白質之量或兩者為基礎作測定。
於本文中使用之"糖基化作用"係指添加複雜寡醣結構至蛋白質，在多肽鏈內之特定位置上。蛋白質之糖基化作用及所添加碳水化合物之後續處理，可影響蛋白質折疊與結構，蛋白質安定性，包括蛋白質半生期，及蛋白質之功能性質。蛋白質糖基化作用可由於其中發生修改之順序環境，被區分成兩個種類，O－連結之糖基化作用與N－連結之糖基化作用。O－連結之多醣係被連結至羥基，經常至無論是絲胺酸或蘇胺酸殘基之羥基。O－多醣並未被添加至每一個絲胺酸與蘇胺酸殘基，且關於決定何種絲胺酸與蘇胺酸將被糖基化之標準，並未完全被瞭解。O－連結之寡醣經常為單或雙天線，意即其包含一或至多兩個分枝(天線)，且包含一至四個不同種類之糖殘基，其係逐一被添加。N－連結之多醣係被連接至天冬素之醯胺氮。只有兩種三肽順序之一之一部份之天冬素，無論是天冬素－X－絲胺酸或天冬素－X－蘇胺酸(其中X為任何胺基酸，惟脯胺酸除外)，係為糖基化作用之標的。N－連結之寡醣可具有一至四個分枝，被稱為單－、雙－、三－、四－天線。在N－與O－連結之寡醣中所發現糖殘基之結構係為不同。儘管該差異，在N－與O－連結多醣兩者之各分枝上之末端殘基，可被唾液酸分子修改，一種被稱為唾液酸封端作用之修改。唾液酸為關於獨特九碳單醣族群之一般名稱，其可被連結至其他寡醣。兩個族群成員為N－乙醯神經胺酸，縮寫成Neu5Ac或NANA，與N－羥乙醯基神經胺酸，縮寫成Neu5Gc或NGNA。在人類中唾液酸之最常見形式為NANA。N－乙醯神經胺酸(NANA)為存在於CTLA4－Ig分子中之主要唾液酸物種。但是，應注意的是，較少但可偵測含量之N羥乙醯基神經胺酸(NGNA)，亦存在於CTLA4－Ig分子中。再者，本文中所述之方法可用以測定關於NANA與NGNA兩者之唾液酸之莫耳數，因此，NANA與NGNA兩者之含量係針對CTLA4－Ig分子測定與報告。N－與O－連結之寡醣具有不同數目之分枝，其係提供不同數目之位置，唾液酸分子可被連接至其上。N－連結之寡醣可提供至高四個供唾液酸用之連接位置，然而O－連結之寡醣可提供兩個供唾液酸連接之位置。
於本文中使用之"大規模方法"一詞可與"工業規模方法"一詞交換使用。再者，"培養容器"一詞可與"生物反應器"、"反應器"及"槽桶"交換使用。
於本文中使用之措辭"工作溶液"係指使用於方法中之溶液。工作溶液之非限制性實例包括緩衝劑。
於本文中使用之"參考物質"係指在方法中作為標準物使用之物質。例如，參考物質可作為實驗試樣將與其比較之標準物使用。
物質之不存在係意欲涵蓋在內，其中關於此種物質量之範圍未具有下限。
當於本文中使用時，關於細胞培養物所敘述之溫度係指調整生物反應器溫度之儀器上之溫度設定。當然，液體培養物本身之溫度，將採取調整生物反應器溫度之儀器上所設定之溫度。在溫度係指被保持在培養器中之貯架上之細胞培養物之情況下，溫度係接著指培養器之貯架溫度。
本發明之非限制性具體實施例：
本發明係提供CTLA4－Ig分子之組合物，與突變CTLA4－Ig分子之組合物，譬如CTLA4A29YL104E －Ig。本發明係提供具有某些特徵之組合物，譬如某些量之細菌內毒素、生物負載量、pI在某一範圍內(或在某一範圍pI內之某些IEF譜帶)，某一數量之單體(單鏈)、二聚體或高分子量物種(譬如四聚體)，某一胰蛋白酶肽分佈形態、某一組合之主要譜帶在SDS－PAGE上、某一DNA含量、不超過某一最高值之MCP－1量、不超過某一最高值之細胞蛋白質量、不超過某一最高值之Triton X－100量、不超過某一最高值之蛋白質A量、N－連結碳水化合物之某一分佈形態、某種胺基單醣組合物(GlcNac、GalNAc)、某種中性單醣組合物(半乳糖、海藻糖、甘露糖)、某一數量之B7結合、在IL－2抑制細胞檢測中之某一活性量及/或某種唾液酸組合物(NANA、NGNA)，於各情況中，其中該某些量可為一範圍或數範圍。本發明係提供組合物，其具有任一種前文所提及之特徵，或超過一種前文所提及之特徵，至高包含所有前文所提及之特徵，呈任何與所有可能之替換或組合。本發明包括所有本發明之組合物，呈單離或實質上純化形式，或未呈單離或實質上純化形式。本發明係提供成為醫藥組合物之組合物。
於一方面，本發明係針對一種獲得組合物之方法，該組合物包含CTLA4－Ig分子自液體培養基之經單離群集，該培養基包含CTLA4－Ig分子之最初群集，其中(1)最初群集之CTLA4－Ig分子具有一或多個唾液酸殘基，(2)每CTLA4－Ig分子之唾液酸殘基數目係在最初群集內改變，及(3)最初群集包含CTLA4－Ig二聚體與高分子量聚集體，且此方法包括(a)自表現CTLA4－Ig分子之哺乳動物細胞之培養物採集液體培養基；(b)自細胞成份分離CTLA4－Ig分子；(c)自CTLA4－Ig高分子量聚集體分離CTLA4－Ig二聚體；及(d)分離CTLA4－Ig分子成為兩個或多個離份，其中至少一個離份，與至少一個其他離份比較，具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之較大莫耳比，且其中步驟(b)、(c)及(d)係同時或以任何順序進行，以獲得該組合物。
在本發明方法之一項具體實施例中，步驟(a)中之採集係包括獲得液體培養物之可溶性離份。於另一項具體實施例中，該方法之步驟(c)與(d)係包括利用管柱層析，以獲得具有不同唾液酸含量之CTLA4－Ig分子之離份。於又另一項具體實施例中，此方法進一步包括利用管柱層析，以降低組合物中之MCP－1含量。
在本發明方法之一些具體實施例中，CTLA4－Ig分子包含具有順序識別碼：2、5、6、7、8、9或10之一或多種多肽。在其他具體實施例中，CTLA4－Ig分子包含具有順序識別碼：4、11、12、13、14、15或16之一或多種多肽。
在本發明方法之一些具體實施例中，於(d)中具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之較大莫耳比之離份，係顯示唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約14。在特殊具體實施例中，平均莫耳比為約8至約11，約8至約10或約8至約9。
本發明係提供一種單離CTLA4－Ig分子之方法，此方法包括：(i)獲得液體培養物之可溶性離份，其包含會產生包含CTLA4－Ig分子之組合物之哺乳動物細胞；(ii)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之經溶離組合物；(iii)使步驟(ii)之組合物接受疏水性交互作用層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含組合物；(iv)使(iii)之組合物接受親和層析法，以獲得包含CTLA4－Ig分子之進一步富含組合物；及(v)使(iv)之組合物接受陰離子交換層析。於一項具體實施例中，步驟(ii)中所獲得組合物之特徵為：(a)每莫耳CTLA4Ig分子，平均6.0－10.1莫耳NANA；與(b)當藉尺寸排阻層析測定時，低於或等於25.7面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。於另一項具體實施例中，步驟(iii)中所獲得組合物之特徵為：(a)每莫耳CTLA4Ig分子，平均6.8－11.4莫耳NANA；與(b)當藉尺寸排阻層析測定時，低於或等於2.5面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。於進一步具體實施例中，步驟(iv)中所獲得組合物之特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig分子，平均8.0－11.0莫耳NANA；與(b)低於或等於2.5面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。於另一項具體實施例中，步驟(v)中所獲得組合物之特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig分子，平均8.0－11.9莫耳NANA；與(b)當藉尺寸排阻層析測定時，低於或等於2.0面積百分比為CTLA4－Ig高分子量物種。
本發明亦提供一種單離CTLA4－Ig分子之組合物之方法，其包括：(i)獲得液體培養物之可溶性離份，其包含會產生CTLA4－Ig分子之哺乳動物細胞，及以任何順序，(ii)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；(iii)使可溶性離份接受疏水性交互作用層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；(iv)使可溶性離份接受親和層析法，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；及(v)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物。於另一方面，本發明係提供一種單離包含CTLA4－Ig分子之組合物之方法，此方法包括：(i)獲得液體培養物之可溶性離份，其包含會產生CTLA4－Ig分子之哺乳動物細胞；(ii)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之經溶離組合物；(iii)使步驟(ii)之蛋白質產物接受疏水性交互作用層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含組合物；(iv)使(iii)之蛋白質產物接受親和層析法，以獲得包含CTLA4－Ig分子之進一步富含組合物；及(v)使(iv)之蛋白質產物接受陰離子交換層析，以單離包含CTLA4－Ig分子之組合物。
於一項具體實施例中，在此方法之步驟(ii)中所獲得包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)NANA對CTLA4Ig分子之平均莫耳比為6.0至10.1，與(b)當藉尺寸排阻層析測定時，低於或等於2.5面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。於另一項具體實施例中，在此方法之步驟(iii)中所獲得包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵在於(a)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量物種係低於約2.5面積%，(b)細胞蛋白質係低於約95毫微克/毫升，及(c)MCP－1係低於約5 ppm。於另一項具體實施例中，在此方法之步驟(iii)中所獲得包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為6.8至11.4，與(b)當藉尺寸排阻層析測定時，低於或等於2.5面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。於進一步具體實施例中，在此方法之步驟(iv)中所獲得包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為8.0至11.0，與(b)當藉尺寸排阻層析測定時，低於或等於2.5面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。於又再另一項具體實施例中，在本發明之步驟(iii)中所獲得之組合物，其特徵在於當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量物種係低於2.5%面積百分比。於又另一項具體實施例中，在此方法之步驟(v)中包含CTLA4－Ig分子之蛋白質組合物，其特徵為：(a)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為8.0至11.9，與(b)當藉尺寸排阻層析測定時，低於或等於2.0面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。
於另一方面，本發明亦提供一種單離CTLA4－Ig分子之組合物之方法，其包括：(i)獲得液體培養物之可溶性離份，其包含會產生CTLA4－Ig分子之哺乳動物細胞，及以任何順序，(ii)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；(iii)使可溶性離份接受疏水性交互作用層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；(iv)使可溶性離份接受親和層析法，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；及(v)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物，其中步驟(iii)中所獲得組合物之特徵在於CTLA4－Ig高分子量物種之百分比係低於約2.5面積%，細胞蛋白質係低於95毫微克/毫升，且MCP－1係低於約5 ppm。
於又另一方面，本發明係提供一種單離CTLA4－Ig分子之組合物之方法，此方法包括：(i)獲得液體培養物之可溶性離份，其包含會產生CTLA4－Ig分子之哺乳動物細胞，及以任何順序，(ii)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；(iii)使可溶性離份接受疏水性交互作用層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；(iv)使可溶性離份接受親和層析法，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物；及(v)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之富含且經溶離組合物，其中於步驟(iii)中所獲得之組合物，其特徵在於CTLA4－Ig高分子量物種之百分比係低於約2.5面積%，細胞蛋白質係低於95毫微克/毫升，MCP－1係低於約5 ppm，且NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8.0至約12。
於一項具體實施例中，此方法步驟(ii)之陰離子交換層析係使用包含約75 mM HEPES與約360 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，本發明步驟(ii)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPES與約850 mM NaCl且具有pH值約7.0之溶離緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，此方法步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用包含約25 mM HEPES與約850 mM NaCl且具有pH值約7.0之單一洗滌緩衝劑進行。於進一步具體實施例中，此方法步驟(iv)之親和層析法係使用包含約25 mM Tris與約250 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於又再另一項具體實施例中，此方法步驟(iv)之親和層析法係使用包含約100 mM甘胺酸且具有pH值約3.5之溶離緩衝劑進行。於又另一項具體實施例中，此方法步驟(v)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPES與約120 mM NaCl至約130 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於又再另一項具體實施例中，此方法步驟(v)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPES與約200 mM NaCl且具有pH值約8.0之溶離緩衝劑進行。於又另一項具體實施例中，此方法步驟(ii)之陰離子交換層析係使用具有包含一級、二級、三級或四級胺官能基之陰離子交換樹脂之管柱進行。於一項特殊具體實施例中，樹脂包含四級胺官能基。於又再另一項具體實施例中，此方法步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用包含苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或異戊基官能基之疏水性交互作用樹脂進行。於一項特殊具體實施例中，官能基包含苯基官能基。於又再另一項具體實施例中，此方法步驟(iv)之親和層析法係使用包含蛋白質A之親和層析法樹脂進行。
於又另一方面，本發明係提供一種製備包含CTLA4－Ig分子之組合物之方法，其包括使CTLA4－Ig分子自液體細胞培養物純化，其中經純化之CTLA4－Ig組合物包含(a)每毫克CTLA4－Ig分子，藥學上可接受量之MCP－1，與(b)當藉尺寸排阻層析測定時，低於2.5面積%之CTLA4－Ig高分子量物種。於一項具體實施例中，藥學上可接受量之MCP－1包含約40至約0.5毫微克/毫克CTLA4－Ig分子。於另一項具體實施例中，藥學上可接受量之MCP－1包含約35至約0.5毫微克/毫克CTLA4－Ig分子。於另一項具體實施例中，藥學上可接受量之MCP－1包含約10至約0.5毫微克/毫克CTLA4－Ig分子。於進一步具體實施例中，此方法步驟(iv)之親和層析法係使用包含能夠降低經溶離蛋白質產物中MCP－1之樹脂之管柱進行。於又再另一項具體實施例中，此方法步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用疏水性交互作用樹脂進行，其中樹脂係能夠(a)使CTLA4－Ig二聚體與CTLA4－Ig高分子量物種分離；(b)增加經溶離CTLA4－Ig分子之唾液酸含量；或(c)(a)與(b)兩者。於又另一項具體實施例中，步驟(ii)或步驟(iv)或兩者之陰離子交換層析係使用陰離子交換樹脂進行，其中樹脂係能夠(a)降低經溶離組合物之CTLA4－Ig高分子量聚集體含量；(b)增加經溶離組合物之唾液酸含量；或(c)(a)與(b)兩者。
於另一方面，本發明係提供一種單離包含CTLA4－Ig分子之組合物之方法，此方法包括：(i)獲得液體培養物之可溶性離份，其包含會產生CTLA4－Ig分子之哺乳動物細胞，及以任何順序；(ii)使可溶性離份接受親和層析法，以獲得包含CTLA4－Ig分子之經溶離組合物；(iii)使可溶性離份接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之經溶離且富含之組合物；及(iv)使可溶性離份接受疏水性交互作用層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之經溶離且富含之組合物。於一項具體實施例中，親和層析法步驟係第一個進行。於另一項具體實施例中，此方法步驟(ii)之親和層析法係使用包含蛋白質A之樹脂進行。於另一項具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法係使用包含胍之溶離緩衝劑進行。於進一步具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法係使用包含尿素之溶離緩衝劑進行。於又另一項具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法會造成增加CTLA4－Ig二聚體在包含CTLA4－Ig分子之經溶離組合物中。
於又另一方面，本發明係提供一種從採集自哺乳動物細胞培養物之液體單離包含CTLA4－Ig分子之組合物之方法，其中細胞會產生CTLA4－Ig分子，此方法包括：(i)獲得經採集液體之可溶性離份；(ii)使可溶性離份接受親和層析法，以獲得包含CTLA4－Ig分子之經溶離組合物；(iii)使步驟(ii)之組合物接受陰離子交換層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之經溶離且富含之組合物；及(iv)使得自步驟(iii)之組合物接受疏水性交互作用層析，以獲得包含CTLA4－Ig分子之進一步富含組合物。於一項具體實施例中，此方法之步驟(iv)中所獲得之組合物，其特徵在於當藉尺寸排阻層析測定時，高分子量物種之百分比係低於約2.5面積%，而細胞蛋白質之百分比係低於約95毫微克/毫升，且MCP－1之百分比係低於約5 ppm。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之陰離子交換層析係使用包含約50 mM HEPES與約135 mM NaCl且具有pH值約7之洗滌緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之陰離子交換層析係使用包含約50 mM HEPES與約200 mM NaCl且具有pH值約7之溶離緩衝劑進行。於一項特殊具體實施例中，步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用包含苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或異戊基官能基之疏水性交互作用樹脂進行。於進一步具體實施例中，步驟(iv)之疏水性交互作用層析係使用包含約50 mM HEPES與約1.2 M(NH4 )2 SO4 且具有pH值約7之洗滌緩衝劑進行。於又再另一項具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法係使用包含約25 mM NaH2 PO4 與約150 mM NaCl且具有pH值約7.5之洗滌緩衝劑進行。於又另一項具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法係使用包含約250 mM甘胺酸且具有pH值約3之溶離緩衝劑進行。於另一項具體實施例中，步驟(iii)之陰離子交換層析係使用具有包含一級、二級、三級或四級胺官能基之陰離子交換樹脂之管柱進行。在一項特殊具體實施例中，樹脂包含四級胺官能基。
於一項具體實施例中，步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用包含苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或異戊基官能基之疏水性交互作用樹脂進行。於一項具體實施例中，官能基包含苯基官能基。於一項具體實施例中，步驟(ii)之親和層析法係使用包含蛋白質A之樹脂進行。本發明係提供一種藉本發明之任何方法所獲得包含CTLA4－Ig分子之組合物。於一項具體實施例中，此組合物包含一或多種具有順序識別碼：2、5、6、7、8、9或10之多肽。於一項具體實施例中，此組合物包含一或多種具有順序識別碼：4、11、12、13、14、15或16之多肽。本發明係提供具有順序識別碼：17之核酸順序之CTLA4－Ig表現質粒。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig蛋白質之平均莫耳比為約5.5至約18。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5至約10。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約18。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約18。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約12。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約11。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7至約12。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7至約11。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約18。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約12至約18。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約13至約18。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約14至約18。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約17。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約16。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約10。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6。於一項具體實施例中，唾液酸為N－乙醯神經胺酸(NANA)。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約12。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有N－羥乙醯基神經胺酸(NGNA)對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為低於或等於約1.5。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有NGNA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約0.5至約1.5。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有NGNA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.0至約1.5。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約18。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig分子，唾液酸之平均莫耳比為約6至約12。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中分子之各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig分子，唾液酸之平均莫耳比為約5.5至約9.5。於一項具體實施例中，每莫耳CTLA4－Ig分子，唾液酸之莫耳比係藉由酸水解與HPLC測定。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子包含一或多種具有順序識別碼：2、5、6、7、8、9或10之多肽。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子包含一或多種具有順序識別碼：4、11、12、13、14、15或16之多肽。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之實質上經純化組合物，其中大於或等於95%之CTLA4－Ig分子為CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，大於或等於98%之CTLA4－Ig分子為CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，大於或等於99%之CTLA4－Ig分子為CTLA4－Ig二聚體。
於一項具體實施例中，大於或等於99.5%之CTLA4－Ig分子為CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，約95%至約99.5%之CTLA4－Ig分子為CTLA4－Ig二聚體，而當藉尺寸排阻層析測定時，約0.5面積百分比至約5面積百分比之分子為CTLA4－Ig高分子量物種。於一項具體實施例中，約98.6%之分子為CTLA4－Ig二聚體，而當藉尺寸排阻層析測定時，約1.2面積百分比之分子為CTLA4－Ig高分子量物種，及約低於0.7面積百分比之分子為CTLA4－Ig單體。於一項具體實施例中，約低於約0.3%之分子為多聚體，包含五個或更多個CTLA4－Ig單體。本發明係提供基本上包含CTLA4－Ig二聚體之組合物。本發明係提供基本上包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中群集係實質上不含CTLA4－Ig單體。本發明係提供基本上包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中群集係實質上不含CTLA4－Ig高分子量物種。本發明係提供基本上包含CTLA4－Ig單體之組合物，其實質上不含CTLA4－Ig二聚體與高分子量物種。於一項具體實施例中，各CTLA4－Ig二聚體之各單體具有至少3個唾液酸基團。於一項具體實施例中，各CTLA4－Ig二聚體之各單體具有至少2.5個唾液酸基團。於一項具體實施例中，各CTLA4－Ig二聚體之各單體具有至少3個唾液酸基團到至少8個唾液酸基團。
於一項具體實施例中，各CTLA4－Ig二聚體之各單體具有至少2.5個唾液酸基團到至少5個唾液酸基團。於一項具體實施例中，各二聚體係包含兩個CTLA4－Ig多肽，其中各多肽具有胺基酸順序，選自包括順序識別碼：5－16。於一項具體實施例中，此組合物包含一或多種具有順序識別碼：2、5、6、7、8、9或10之多肽。於一項具體實施例中，此組合物包含一或多種具有順序識別碼：4、11、12、13、14、15或16之多肽。本發明係提供包含CTLA4－Ig四聚體之經單離組合物，其係實質上不含CTLA4－Ig二聚體。本發明係提供包含CTLA4－Ig四聚體之經單離組合物，其係實質上不含CTLA4－Ig單體。於一項具體實施例中，組合物係以大於約100克之量存在。於一項具體實施例中，各四聚體係包含兩對CTLA4－Ig多肽，其中各多肽具有胺基酸順序，選自包括順序識別碼：5－10。於一項具體實施例中，各四聚體包含兩對CTLA4－Ig多肽，其中各多肽具有胺基酸順序，選自包括順序識別碼：11－16。於一項具體實施例中，各四聚體係能夠結合至CD80或CD86。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之藥學上可接受之組合物，其中此組合物係實質上不含MCP－1。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之藥學上可接受之組合物，其中此組合物包含不超過約25 ppm MCP－1。於一項具體實施例中，此組合物包含不超過10 ppm MCP－1。於一項具體實施例中，此組合物包含約0.2毫微克/毫升之MCP－1至約10毫微克/毫升之MCP－1。於一項具體實施例中，本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之藥學上可接受組合物，其中此組合物包含(a)約0.2毫微克/毫升之MCP－1至約10毫微克/毫升之MCP－1，與(b)不超過25毫微克/毫升之CHO蛋白質或不超過10毫微克/毫升之CHO蛋白質。於一項具體實施例中，此組合物包含不超過約20微微克/毫升之DNA。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，其中當在靜脈內劑量為約10毫克/公斤下投予病患時，CTLA4－Ig分子係能夠顯示：曲線下方面積(AUC)為約44400微克.小時/毫升；分佈之體積為約0.09升/公斤；尖峰濃度(Cmax )為約292微克/毫升；及清除速率為約0.23毫升/小時/公斤。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，其中此組合物包含可在等電焦聚凝膠上見及之CTLA4－Ig分子之優勢異構重組物，當藉等電焦聚測定時，其具有等電點pI低於或等於5.1±0.2。於一項具體實施例中，組合物之平均pI係在神經胺糖酸苷酶處理後增加。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少40%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.1±0.2。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少70%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.1±0.2。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少90%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.1±0.2。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，具有pI為約3.0±0.2至約5.0±0.2。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，具有pI約4.3±0.2至約5.0±0.2。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，具有pI為約3.3±0.2至約4.7±0.2。於一項具體實施例中，組合物係實質上經純化。本發明係提供一種製備組合物之方法，該組合物包含CTLA4－Ig分子，具有pI為約3.0±0.2至約5.0±0.2，此方法包括：(a)使CTLA4－Ig分子之混合物接受等電焦聚凝膠電泳，其中在凝膠上之單一譜帶表示具有特定pI之CTLA4－Ig分子之群集，與(b)單離具有pI為約3.0±0.2至約5.0±0.2之CTLA4－Ig分子群集，以製備組合物。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，其中此組合物包含可在等電焦聚凝膠上見及之優勢異構重組物，當藉等電焦聚測定時，其具有等電點pI低於或等於5.5±0.2。於一項具體實施例中，組合物之平均pI係在神經胺糖酸苷酶處理後增加。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少40%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.3±0.2。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少70%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.3±0.2。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少90%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.3±0.2。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，具有pI為約3.0±0.2至約5.2±0.2。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，具有pI為約4.5±0.2至約5.2±0.2。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，具有pI為約4.7±0.2至約5.1±0.2。於一項具體實施例中，組合物係實質上經純化。
本發明係提供一種製備組合物之方法，該組合物包含CTLA4－Ig分子，具有pI為約2.0±0.2至約5.2±0.2，此方法包括：(a)使CTLA4－Ig分子之混合物接受等電焦聚凝膠電泳，其中在凝膠上之單一譜帶表示具有特定pI之CTLA4－Ig分子之群集，與(b)單離具有pI為約3.0±0.2至約5.2±0.2之CTLA4－Ig分子群集，以製備組合物。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約17至約28。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約17至約25。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中分子之各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中CTLA4－Ig分子之特徵為GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約24至約28。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中分子之各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中CTLA4－Ig分子之特徵為GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約2.7至約3.6。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中分子之各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中CTLA4－Ig分子之特徵為半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為海藻糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約3.5至約8.3。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中分子之各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中CTLA4－Ig分子之特徵為海藻糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6.4至約7.0。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為甘露糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7.7至約22。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中分子之各多肽包含順序識別碼：11、12、13、14、15或16之順序，且其中CTLA4－Ig分子之特徵為甘露糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約14至約16。
於一項具體實施例中，GlcNAc對CTLA4－Ig分子之莫耳比係藉由毛細電泳法測定。於一項具體實施例中，GalNAc對CTLA4－Ig分子之莫耳比係藉由毛細電泳法測定。於一項具體實施例中，半乳糖對CTLA4－Ig分子之莫耳比係藉由毛細電泳法測定。
於一項具體實施例中，海藻糖對CTLA4－Ig分子之莫耳比係藉由毛細電泳法測定。於一項具體實施例中，甘露糖對CTLA4－Ig分子之莫耳比係藉由毛細電泳法測定。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子係藉由一或多個碳水化合物對分子之酵素連接而獲得。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中分子包含於活體外以酵素方式連接至分子之碳水化合物殘基。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；與(b)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；及(c)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；及(d)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(d)海藻糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約3.5至約8.3；及(e)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(d)海藻糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約3.5至約8.3；(e)甘露糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7.2至約22；及(f)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約24至約28；與(b)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約24至約28；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約2.7至約3.6；及(c)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約24至約28；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約2.7至約3.6；(c)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13；及(d)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約24至約28；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約2.7至約3.6；(c)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13；(d)海藻糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6.4至約7.0；及(e)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約24至約28；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約2.7至約3.6；(c)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13；(d)海藻糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6.4至約7.0；(e)甘露糖對CTLA4－Ig蛋白質之平均莫耳比為約14至約16；及(f)唾液酸對CTLA4－Ig蛋白質之平均莫耳比為約5.5至約9.5。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子係在順序識別碼：2或4之位置102處之天冬素胺基酸殘基，在順序識別碼：2或4之位置134處之天冬素胺基酸殘基，在順序識別碼：2或4之位置233處之天冬素胺基酸殘基，在順序識別碼：2或4之位置155處之絲胺酸胺基酸殘基，或在順序識別碼：2或4之位置165處之絲胺酸胺基酸殘基上經糖基化。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子係經糖基化，且其中至少約2%總質量之糖基化作用係為O－連結之糖基化作用。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中組合物顯示NGNA層析圖吸收峰為約9.6±0.3，且NANA層析圖吸收峰為約10.5±0.3。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子顯示實質上與圖66相同之碳水化合物分佈形態。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA－Ig分子顯示如圖66中所示之碳水化合物分佈形態。本發明係提供基本上包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子顯示功能部位I－IV之碳水化合物分佈形態，其中功能部位I包含表示非唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位II包含表示單－唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位III包含表示二－唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位IV包含表示三－唾液酸基化寡醣之吸收峰，及功能部位V包含表示四－唾液酸基化寡醣之吸收峰，且其中分佈形態係為自CTLA4－Ig釋出之寡醣之層析圖。於一項具體實施例中，在功能部位I中之第一個吸收峰與功能部位II中之主峰間之N－連結寡醣，於滯留時間上之差異為約10至約12分鐘。於一項具體實施例中，在功能部位I中之第一個吸收峰與功能部位II中之主峰間之N－連結寡醣，於滯留時間上之差異為約11至約13分鐘。於一項具體實施例中，功能部位III與IV之糖基化作用，當藉由HPAEC度量時，係包含約25%至約36%之N－連結糖基化作用。於一項具體實施例中，功能部位I之糖基化作用，當藉由HPAEC度量時，係包含約24.5%至約35.2%之N－連結糖基化作用。於一項具體實施例中，功能部位II之糖基化作用，當藉由HPAEC度量時，係包含約26.3%至約34.1%之N－連結糖基化作用。於一項具體實施例中，功能部位III之糖基化作用，當藉由HPAEC度量時，係包含約21.9%至約31.5%之N－連結糖基化作用。於一項具體實施例中，功能部位IV與功能部位V之糖基化作用，當藉由HPAEC度量時，係包含約7.9%至約18.6%之N－連結糖基化作用。
於一項具體實施例中：(a)功能部位I顯示面積百分比為至少約31；(b)功能部位II顯示面積百分比為至少約33；(c)功能部位III顯示面積百分比為至少約24；(iv)功能部位IV顯示面積百分比為至少約9.4，(v)功能部位V顯示面積百分比為至少約67；且其中面積係度量自CTLA4－Ig釋出之寡醣之層析圖。
於一項具體實施例中：(a)功能部位I顯示至少約5個吸收峰；(b)功能部位II顯示至少約5個吸收峰；(c)功能部位III顯示至少約5個吸收峰；(iv)功能部位IV顯示至少約6個吸收峰，(v)功能部位V顯示至少約6個吸收峰，且其中吸收峰係被顯示於層析圖上。
本發明係提供包含CTLA4－Ig多肽之組合物，其中：(a)約80%之多肽具有雙天線N－連結之糖基化作用；(b)約14%之多肽具有三天線N－連結之糖基化作用；及(c)約6%之多肽具有四天線N－連結之糖基化作用。於一項具體實施例中，N－連結之糖基化作用係藉由高pH陰離子交換層析與脈衝式安培計偵測(HPEAC－PAD)測得。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；與(b)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(b)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12；及(c)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量物種面積百分比低於約3%。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(b)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12；及(c)NGNA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為低於或等於約1.5。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(b)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12；(c)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量聚集體含量低於約3面積百分比；及(d)碳水化合物分佈形態實質上與圖66相同。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(b)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12；(c)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量聚集體含量低於約3面積百分比；及(d)當藉HPAEC測定時，在功能部位III、IV及V中之糖基化作用含量為至少約29.8%至約50.1%之N－連結糖基化作用。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(b)NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12；及(c)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量物種低於約3面積百分比。於一項具體實施例中，分子之進一步特徵在於NANA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約12。
於一項具體實施例中，分子之進一步特徵為：(a)約80%雙天線N－連結之糖基化作用；(b)約14%三天線N－連結之糖基化作用；及(c)約6%四天線N－連結之糖基化作用。於一項具體實施例中，分子進一步包含一或多種以下之任何組合：(a)順序識別碼：10之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置27處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；(b)順序識別碼：7之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置27處，而離胺酸在胺基酸位置383處)；(c)順序識別碼：9之胺基酸順序(順序識別碼：2之丙胺酸在胺基酸位置26處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；及(d)順序識別碼：6之胺基酸順序(順序識別碼：2之丙胺酸在胺基酸位置26處，而離胺酸在胺基酸位置383處)。於一項具體實施例中，(a)約90%之分子包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基27處之甲硫胺酸開始；(b)約10%之分子包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號26處之丙胺酸開始；(c)約4%之分子包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號383處之離胺酸終止；及(d)約96%之分子包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號382處之甘胺酸終止。本發明係提供包含CTLA4－Ig多肽之組合物，其中：(a)約80%之多肽具有雙天線N－連結之糖基化作用；(b)約14%之多肽具有三天線N－連結之糖基化作用；(c)約6%之多肽具有四天線N－連結之糖基化作用；及(d)NGNA對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為低於或等於1.5。本發明係提供包含CTLA4－Ig多肽之組合物，其中：(a)約80%之多肽具有雙天線N－連結之糖基化作用；(b)約14%之多肽具有三天線N－連結之糖基化作用；(c)約6%之多肽具有四天線N－連結之糖基化作用；且(d)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35。本發明係提供包含CTLA4－Ig多肽之組合物，其中：(a)約80%之多肽具有雙天線N－連結之糖基化作用；(b)約14%之多肽具有三天線N－連結之糖基化作用；(c)約6%之多肽具有四天線N－連結之糖基化作用；且(d)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13；與(b)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13；(b)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5；及(c)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量物種低於約5面積百分比。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13；(b)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5；(c)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量物種含量低於約5面積百分比；及(d)碳水化合物分佈形態實質上與圖66相同。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13；(b)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為5.5至約9.5；(c)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量物種含量低於約5面積百分比；及(d)當藉HPAEC測定時，在功能部位III、IV及V中之糖基化作用含量為至少約29.8%至約50.1%之N－連結糖基化作用。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約11至約13；(b)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5.5至約9.5；及(c)當藉尺寸排阻層析測定時，CTLA4－Ig高分子量物種含量低於約5面積百分比。於一項具體實施例中，分子之進一步特徵為：(a)約80%雙天線N－連結之糖基化作用；(b)約14%三天線N－連結之糖基化作用；及(c)約6%四天線N－連結之糖基化作用。於另一項具體實施例中，分子進一步包含一或多種以下之任何組合：(a)順序識別碼：16之胺基酸順序(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置27處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；(b)順序識別碼：13之胺基酸順序(順序識別碼：4之甲硫胺酸在胺基酸位置27處，而離胺酸在胺基酸位置383處)；(c)順序識別碼：15之胺基酸順序(順序識別碼：4之丙胺酸在胺基酸位置26處，而甘胺酸在胺基酸位置382處)；及(d)順序識別碼：12之胺基酸順序(順序識別碼：4之丙胺酸在胺基酸位置26處，而離胺酸在胺基酸位置383處)。於另一項具體實施例中，(a)約90%之分子包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基27處之甲硫胺酸開始；(b)約10%之分子包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號26處之丙胺酸開始；(c)約4%之分子包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號383處之離胺酸終止；及(d)約96%之分子包含順序識別碼：4之胺基酸順序，以在殘基編號382處之甘胺酸終止。本發明係提供包含CTLA4－Ig多肽之組合物，其中：(a)約80%之多肽具有雙天線N－連結之糖基化作用；(b)約14%之多肽具有三天線N－連結之糖基化作用；(c)約6%之多肽具有四天線N－連結之糖基化作用；及(d)每莫耳CTLA4－Ig蛋白質，GlcNAc之平均莫耳比為約24至約28。本發明係提供包含CTLA4－Ig多肽之組合物，其中：(a)約80%之多肽具有雙天線N－連結之糖基化作用；(b)約14%之多肽具有三天線N－連結之糖基化作用；(c)約6%之多肽具有四天線N－連結之糖基化作用；及(d)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約2.7至約3.6。於另一項具體實施例中，組合物係為實質上經純化之組合物。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中低於或等於約2.5%之CTLA4－Ig分子係經氧化。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中低於或等於約2.0%之CTLA4－Ig分子係經脫醯胺酸化。本發明係提供包含CTLA4－Ig二聚體分子之組合物，其中至少0.5%之CTLA4－Ig二聚體分子係經半胱胺醯基化。於一項具體實施例中，至少1.0%之CTLA4－Ig二聚體分子係經半胱胺醯基化。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中該群集顯示質量光譜法分佈形態實質上與圖62、63或65相同。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中該群集顯示毛細電泳法分佈形態實質上與圖46相同。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中組合物之特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(d)海藻糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約3.5至約8.3；(e)甘露糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7.2至約22；(f)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12；(g)當從等電焦聚凝膠上之顯像測定時，pI係在約2.4±0.2至約5.0±0.2之範圍內；(h)MCP－1低於或等於3 ppm；(i)當藉尺寸排阻層析測定時，低於2.5面積百分比之高分子量物種；(j)當藉尺寸排阻層析測定時，低於0.5面積百分比之單體；(k)CTLA4－Ig多肽具有胺基酸至少95%相同於任何順序識別碼：5－10；(1)CTLA4－Ig分子能夠結合至CD80與CD86。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中分子群集之特徵為：(a)GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約15至約35；(b)GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.7至約3.6；(c)半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約8至約17；(d)海藻糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約3.5至約8.3；(e)甘露糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7.2至約22；(f)唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約12；(g)當從等電焦聚凝膠上之顯像測定時，pI係在約3.4±0.2至約5.0±0.2之範圍內；(h)MCP－1低於或等於5 ppm；(i)當藉尺寸排阻層析測定時，低於2.5面積百分比之高分子量物種；(j)當藉尺寸排阻層析測定時，低於0.5面積百分比之單體；(k)CTLA4－Ig多肽具有胺基酸至少95%相同於任何順序識別碼；5－10；(l)CTLA4－Ig分子能夠結合至CD80與CD86；或其醫藥相當物。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，具有致免疫性之發生率低於或等於7.4%。於一項具體實施例中，致免疫性之發生率為約2.1%至約7.4%。於一項具體實施例中，致免疫性之發生率係低於或等於3.7%。於一項具體實施例中，致免疫性之發生率係低於或等於3.0%。於一項具體實施例中，致免疫性之發生率為約2.8%至約3.0%。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，其中在該組合物對人類投予後，會結合至CTLA4－Ig分子之抗體之產生，於人類中係在低於或等於7.4%之發生率下發生。於一項具體實施例中，發生率為約2.1%至約7.4%。於一項具體實施例中，發生率係低於或等於3.7%。於一項具體實施例中，發生率係低於或等於3.0%。於一項具體實施例中，發生率為約2.8%至約3.0%。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，其中在該組合物對人類投予後，會結合至CTLA4－Ig分子之CTLA4部份之抗體之產生，係於人類中在低於或等於4.9%之發生率下發生。於一項具體實施例中，發生率為約0.5%至約4.9%。於一項具體實施例中，發生率係低於或等於1.2%。於一項具體實施例中，發生率係低於或等於1.0%。於一項具體實施例中，發生率為約0.9%至約1.0%。於一項具體實施例中，發生率係在酵素襯裡之免疫吸著檢測(ELISA)中度量。於一項具體實施例中，其中發生率係在電化學發光檢測(ECL)中度量。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之經單離組合物，其中在該組合物對人類投予後，會使CTLA4－Ig分子中和之抗體之產生，係發生在具有會結合至CTLA4－Ig分子之CTLA4部份之抗體之人類之低於或等於75%發生率下。於一項具體實施例中，發生率為40－75%。於一項具體實施例中，發生率係低於或等於40%。於一項具體實施例中，發生率係在細胞為基礎之蟲螢光素酶報告子檢測中度量。
本發明係提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中該擴大係從接種培養物到至少10,000升之液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係當液體培養物顯示每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子大於或等於約6.0莫耳NANA時發生，當藉由評估一液份之液體培養物測定時。此方法亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升之液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係當液體培養物顯示每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子約5.2至約7.6莫耳唾液酸時發生，當藉由評估一液份之液體培養物而測定時。此方法亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升之液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係在液體培養物具有細胞密度為每毫升液體培養物約33 x 105 個存活細胞至每毫升液體培養物約79 x 105 個細胞時發生。本發明亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升之液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係當液體培養物中之細胞存活力係不低於約38%時發生。本發明亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係當液體培養物中之細胞存活力係不低於約37%時發生。此方法亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係當內毒素係低於或等於每毫升液體培養物約76.8 EU時發生，當藉由評估一液份之液體培養物而測定時。此方法亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係當內毒素係低於或等於每毫升液體培養物約4.8 EU時發生，當藉由評估一液份之液體培養物而測定時。本發明亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離只在生物負載量為每毫升液體培養物低於1個菌落形成單位時發生，當藉由評估一液份之液體培養物測定時。本發明亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係在符合下述情況之至少兩個時發生：(i)每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子，液體培養物含有大於或等於約6.0莫耳NANA；(ii)液體培養物具有細胞密度為每毫升液體培養物約33 x 105 個存活細胞至每毫升液體培養物約79 x 105 個存活細胞；(iii)在液體培養物中之細胞存活力係不低於約38%；或(iv)CTLA4－Ig蛋白質之產率係為每升液體培養物大於約0.5克CTLA4－Ig蛋白質，其中在(i)中之NANA濃度與在(iv)中之產率係藉由評估一液份之液體培養物而測得。本發明亦提供一種製造CTLA4－Ig蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會產生CTLA4－Ig蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升液體培養物，直到當藉由評估一液份之液體培養物而測定時，CTLA4－Ig蛋白質係在每升液體培養物至少約0.5克CTLA4－Ig蛋白質之產率下產生為止；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig蛋白質，其中單離係在符合下述情況之至少兩個時發生：(i)每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子，液體培養物含有約5.2至約7.6莫耳唾液酸；(ii)在液體培養物中之細胞存活力係不低於約37%；或(iii)CTLA4－Ig蛋白質之產率係為每升液體培養物大於約0.5克CTLA4－Ig蛋白質，其中在(i)中之唾液酸含量與在(iii)中之產率係藉由評估一液份之液體培養物而測得。
順序： 順序識別碼：1[CTLA4－Ig核苷酸順序，參閱圖1]順序識別碼：2[CTLA4－Ig胺基酸順序，參閱圖1]順序識別碼：3順序識別碼：4[CTLA4A29YL104E －Ig胺基酸順序，圖4]順序識別碼：5[順序識別碼：2之胺基酸25－383]MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK順序識別碼：6[順序識別碼：2之胺基酸26－383]AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK順序識別碼：7[順序識別碼：2之胺基酸27－383]MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK順序識別碼：8[順序識別碼：2之胺基酸25－382]MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG順序識別碼：9[順序識別碼：2之胺基酸26－382]AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPHEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG順序識別碼：10[順序識別碼：2之胺基酸27－382]MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG順序識別碼：11[順序識別碼：4之胺基酸25－383]MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK順序識別碼：12[順序識別碼：4之胺基酸26－383]AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALNHNYTQKSLSLSPGK順序識別碼：13[順序識別碼：4之胺基酸27－383]MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQRNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK順序識別碼：14[順序識別碼：4之胺基酸25－382]MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG順序識別碼：15[順序識別碼：4之胺基酸26－382]AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
順序識別碼：16[順序識別碼：4之胺基酸27-382]MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
順序識別碼：17
順序識別碼：18[CTLA4胞外功能部位順序]MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVC AATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVEL MYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
順序識別碼：19 5’-AGAAAAGGGGCTGGAGAGATGGCTCAGTGGTTAAGAGCA-3’
順序識別碼：20--5’-GTACTCAGG
順序識別碼：21--5’-GTACTCAGG
順序識別碼：22--CGGCAGATCTCTGTGAGTTTGAGGCCAGCCTGGTCTACAAAGCAAGTT-3’
CTLA4-Ig單體與多聚體
在某些具體實施例中，本發明係提供具有包含順序識別碼：1(圖1A)之表現卡匣之細胞系。此種表現卡匣，當在哺乳動物細胞包括CHO細胞中表現時，可造成N-與C-末端變型之產生，以致自表現卡匣產生之蛋白質可具有以下殘基之胺基酸順序：(i)順序識別碼：2之26-383，(ii)順序識別碼：2之26-382；(iii)順序識別碼：2之27-383，或(iv)順序識別碼：2之27－382，或視情況為(v)順序識別碼：2之25－382，或(vi)順序識別碼：2之25－383(圖1A)。此等蛋白質於本文中可稱為"順序識別碼：2單體"或"具有順序識別碼：2順序"之單體。此等順序識別碼：2單體可進行二聚合，以致二聚體組合可包括例如：(i)與(i)；(i)與(ii)；(i)與(iii)；(i)與(iv)；(i)與(v)；(i)與(vi)；(ii)與(ii)；(ii)與(iii)；(ii)與(iv)；(ii)與(v)；(ii)與(vi)；(iii)與(iii)；(iii)與(iv)；(iii)與(v)；(iii)與(vi)；(iv)與(iv)；(iv)與(v)；(iv)與(vi)；(v)與(v)；(v)與(vi)；及(vi)與(vi)。此等不同二聚體組合亦可彼此締合，以形成四聚體CTLA4－Ig分子。此等單體、二聚體、四聚體及其他多聚體，於本文中可稱為"順序識別碼：2蛋白質"或"具有順序識別碼：2順序"之蛋白質。雖然此等細胞系可在轉譯時立即產生此等變型，但該變型可更典型上為在細胞中轉譯作用後之產物。此細胞系亦會分泌CTLA4－Ig分子。阿巴塔謝特(Abatacept)係指順序識別碼：2蛋白質。
CTLA4－Ig分子可包括例如在單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體或其他多聚體形式中之CTLA4－Ig蛋白質。CTLA4－Ig分子可包含與CTLA4之至少一個胞外功能部位及免疫球蛋白恒定區域之蛋白質融合物。CTLA4－Ig分子可具有野生型或突變順序，例如關於CTLA4胞外功能部位與免疫球蛋白恒定區域順序。CTLA4－Ig單體，單獨或在二聚體、四聚體或其他多聚體形式中，可被糖基化。
在一些具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有至少某一百分比之二聚體或其他多聚體分子。例如，本發明係提供CTLA4－Ig分子群集，其係為大於90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5% CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子群集，其包含約95%至約99.5%之CTLA4－Ig二聚體與約0.5%至約5%之CTLA4－Ig四聚體。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子群集包含約98% CTLA4－Ig二聚體、約1.5% CTLA4－Ig四聚體及約0.5% CTLA4－Ig單體。
於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中該群集係實質上不含CTLA4－Ig單體分子。實質上不含CTLA4－Ig單體分子可指具有低於1%、0.5%或0.1%單體之CTLA4－Ig分子群集。
於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中該群集係實質上不含CTLA4－Ig多聚體，其係大於二聚體，譬如四聚體、六聚體等(例如高分子量物種)。實質上不含大於二聚體之CTLA4－Ig多聚體分子可指CTLA4－Ig分子之群集，其具有低於6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%之大於二聚體形式之CTLA4－Ig多聚體(例如高分子量物種)。
CTLA4－Ig單體分子可具有例如胺基酸順序為：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，或(iv)順序識別碼：2之27－382，或視情況為(v)順序識別碼：2之25－382，或(vi)順序識別碼：2之25－383。當包含順序識別碼：1之核酸順序之表現卡匣係被表現於CHO細胞中時，經表現之主要單體形式具有甲硫胺酸之N－末端胺基酸殘基(順序識別碼：2之殘基27)，其係相應於野生型人類CTLA4之N－末端胺基酸殘基。但是，由於順序識別碼：1亦包括對於制瘤素M訊息順序之編碼順序(順序識別碼：1之核苷酸11－88)，故得自順序識別碼：1之經表現蛋白質含有制瘤素M訊息順序。此訊息順序係在蛋白質自細胞質輸出或分泌自細胞之過程期間，分裂自經表現之蛋白質。但分裂可造成N－末端變型，譬如在順序識別碼2之胺基酸殘基25與26間之分裂(造成殘基26之N－末端，意即"Ala變型")，或在順序識別碼2之胺基酸殘基24與25間之分裂(造成殘基25之N－末端，意即"Met－Ala變型")，與順序識別碼2之胺基酸殘基26與27間之分裂(造成殘基27之N－末端)不同。例如，Met－Ala變型可存在於CTLA4－Ig分子之混合物中，在約1%下，而Ala變型可存在於CTLA4－Ig分子之混合物中，在約8－10%下。此外，得自順序識別碼：1之經表現蛋白質可具有C－末端變型，此係由於不完全處理所致。主要C－末端為在順序識別碼：2之殘基382處之甘胺酸。於CTLA4－Ig分子之混合物中，具有離胺酸在C－末端(順序識別碼：2之殘基383)處之單體，可例如在約4－5%下存在。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子具有如下述順序識別碼：5 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：2之胺基酸25－383相同)：[順序識別碼：5] MAMHVAQPAASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEvKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALNHNYTQKSLSLSPGK；於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子具有如下述順序識別碼：6 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：2之胺基酸26－383相同)：[順序識別碼：6] AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子具有如下述順序識別碼：7 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：2之胺基酸27－383相同)：[順序識別碼：7] MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子具有如下述順序識別碼：8 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：2之胺基酸25－382相同)：[順序識別碼：8] MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子具有如下述順序識別碼：9 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：2之胺基酸26－382相同)：[順序識別碼：9] AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子具有如下述順序識別碼：10 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：2之胺基酸27－382相同)：[順序識別碼：10] MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
CTLA4－Ig單體分子可包含人類CTLA4之胞外功能部位。於一項具體實施例中，胞外功能部位可包含順序識別碼：1之核苷酸89－463之核苷酸順序，其係對順序識別碼：2之胺基酸27－151進行編碼。於另一項具體實施例中，胞外功能部位可包含人類CTLA4之突變順序。於另一項具體實施例中，胞外功能部位可包含對順序識別碼：1之核苷酸89－463之核苷酸改變，以致施行保守胺基酸變化。於另一項具體實施例中，胞外功能部位可包含核苷酸順序，其係至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同於順序識別碼：1之核苷酸89－463。
CTLA4－Ig單體分子可包含人類免疫球蛋白之恒定區域。此恒定區域可為恒定區域之一部份；此恒定區域可具有野生型或突變順序。恒定區域可來自人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。恒定區域可來自免疫球蛋白之輕鏈或重鏈。在恒定區域為來自IgG、IgD或IgA分子之情況下，此恒定區域可包含一或多個下列恒定區域功能部位：CL 、CH 1、鉸鏈、CH 2或CH 3。在恒定區域為來自IgM或IgE之情況下，該恒定區域可包含一或多個下列恒定區域功能部位：CL 、CH 1、CH 2、CH 3或CH 4。於一項具體實施例中，恒定區域可包含一或多個來自IgG、IgD、IgA、IgM或IgE之恒定區域功能部位。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig二聚體係由兩個單體所組成，其中各單體可具有相同或不同胺基酸順序，且其中此順序可為以下之胺基酸順序：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，及(vi)順序識別碼：2之25－383。此種CTLA4－Ig單體可經過人類CTLA4順序之胞外功能部位，經由順序識別碼：2之位置146處之半胱胺酸胺基酸殘基二聚合。
CTLA4－Ig分子可經過IgM或IgA恒定區域功能部位與J鏈蛋白質之交互作用而多聚體化。IgM與IgA經常被製成與另一個多肽鏈(J鏈)締合之多聚體。在五聚體IgM中，單體係藉由二硫鍵在CH3功能部位中交聯至彼此，及經過CH4功能部位至J鏈。IgM亦可形成缺乏J鏈之六聚體，其中多聚體化作用係經過對每一個之二硫鍵達成。在二聚體IgA中，單體具有對J鏈之二硫鍵，經由其CH3功能部位，而非彼此。因此，於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig多聚體，包括二聚體、五聚體及六聚體，其中Ig部份包含IgM恒定區域或其部份，或IgA恒定區域或其部份。此種以IgM或IgA為基礎之CTLA4－Ig多聚體可包含J鏈。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig單體分子(CTLA4基因銀行收受編號I13253)包含經修改之人類IgG1鉸鏈區域(順序識別碼：1之核苷酸464－508；順序識別碼：2之胺基酸152－166)，其中在順序識別碼：2之胺基酸殘基156、162及165處之絲胺酸，已從存在於野生型順序中之半胱胺酸被設計。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig單體分子包含經修改之人類IgG1 CH2區域與野生型CH3區域(經修改之人類IgG1 CH 2功能部位具有順序識別碼：1之核苷酸509－838，與順序識別碼：2之胺基酸167－276；人類IgG1 CH 3功能部位具有順序識別碼：1之核苷酸839－1159，與順序識別碼：2之胺基酸277－383)。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子群集包含單體，其具有以公報案號US 2002/0182211 A1公告之美國專利申請案之圖6、7或8之任一個或多個，及在以公報案號US20030083246與US20040022787公告之美國專利申請案中所示之順序，其每一個係據此以其全文併入供參考。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig四聚體分子包含CTLA4－Ig多肽之兩對或兩種二聚體，其中各多肽具有下列胺基酸順序之一：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，及(vi)順序識別碼：2之25－383。此對多肽或二聚體之各成員係以共價方式連結至另一成員，且兩對多肽係以非共價方式與彼此締合，於是形成四聚體。此種四聚體分子係能夠結合至CD80或CD86。於另一項具體實施例中，此種四聚體分子可結合至CD80或CD86，具有抗體親抗原性係為至少2－倍大於CTLA4－Ig二聚體(其單體具有上述胺基酸順序之一)對CD80或CD86之結合抗體親抗原性。於另一項具體實施例中，此種四聚體分子可結合至CD80或CD86，具有抗體親抗原性係為至少2－倍大於野生型CTLA4對CD80或CD86之結合親和力或抗體親抗原性。此種較大抗體親抗原性可幫助較高功效，以治療免疫病症及其他如下文所述之疾病，以及抑制組織及/或固體器官移植排斥。此外，較大或經改良之抗體親抗原性可產生藥物之較高功效結果。例如，包含CTLA4－Ig四聚體之治療組合物係比相同量之具有CTLA4－Ig單體之治療組合物，具有較高抗體親抗原性，且因此是較高功效。於另一項具體實施例中，此種四聚體分子對於T細胞增生，當與CTLA4－Ig二聚體(其單體具有上述胺基酸順序之一)比較時，可具有至少2－倍較大抑制。於另一項具體實施例中，此種四聚體分子對於T細胞增生，當與野生型CTLA4分子比較時，可具有至少2－倍較大抑制。
CTLA4 A29YL104E －Ig單體、二聚體及多聚體
CTLA4A29YL104E －Ig為CTLA4－Ig之經修改形式(圖1A；順序識別碼：1－2)。修改係包括點突變，其會造成兩個胺基酸取代(L104E與A29Y)，如圖中所示2(相應於圖4中之胺基酸位置55與130；順序識別碼：4)。相對於CTLA4－Ig，CTLA4A29YL104E －Ig(例如順序識別碼：5－10)係以大約2－倍增加之抗體親抗原性結合CD80(B7－1)，及以大約4－倍增加之抗體親抗原性結合CD86(B7－2)。CTLA4A29YL104E －Ig係比CTLA4－Ig大約10倍更有效，以抑制T細胞增生，細胞活素生產，及標的細胞被天然殺傷細胞之CD28－依賴性殺死作用。CTLA4A29YL104E －Ig會造成B7－1所媒介T細胞增生之適度抑制，但對於阻斷B7－2所媒介之T細胞增生，係比CTLA4－Ig顯著地更有效。增加之功效係為相當的，無論是阻斷單獨之B7－2或阻斷B7－1與B7－2兩者，這指出CTLA4A29YL104E －Ig之經增強免疫調制活性，最可能歸因於對阻斷B7－2之經加強功效。
CTLA4A29YL104E －Ig係為基因工程之融合蛋白質，其包含經修改人類CTLA－4之功能性結合功能部位與IgG1種類之人類免疫球蛋白之Fc功能部位。兩個胺基酸取代係在CTLA－4功能部位之B7結合區域(L104E與A29Y)中施行，以產生CTLA4A29YL104E －Ig分子。CTLA4A29YL104E －Ig二聚體係包含兩個糖基化CTLA4A29YL104E －Ig鏈。其係以連結經過鏈間二硫鍵之共價二聚體存在。CTLA4A29YL104E －Ig分子之分子模型係示於圖3中。CTLA4A29YL104E －Ig分子，當藉由基質輔助雷射解吸附作用－離子化作用飛行時間(MALDI－TOF)質量光譜法測定時，具有平均質量為大約91,800 Da。
在某些具體實施例中，本發明係提供具有包含順序識別碼：23之表現卡匣之細胞系。此種表現卡匣，當在哺乳動物細胞例如CHO細胞中表現時，可造成N－與C－末端變型產生，以致製自該表現卡匣之多肽可具有以下殘基之胺基酸順序：(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382；(iii)順序識別碼：4之27－383，或(iv)順序識別碼：4之27－382，或視情況為(v)順序識別碼：4之25－382，或(vi)順序識別碼：4之25－383。此等多肽可於本文中稱為"順序識別碼：4單體"或"具有順序識別碼：4順序"之單體。
此等順序識別碼：4單體可二聚合，以致二聚體組合可包括例如：(i)與(i)；(i)與(ii)；(i)與(iii)；(i)與(iv)；(i)與(v)；(i)與(vi)；(ii)與(ii)；(ii)與(iii)；(ii)與(iv)；(ii)與(v)；(ii)與(vi)；(iii)與(iii)；(iii)與(iv)；(iii)與(v)；(iii)與(vi)；(iv)與(iv)；(iv)與(v)；(iv)與(vi)；(v)與(v)；(v)與(vi)；及(vi)與(vi)。此等不同二聚體組合亦可彼此締合，以形成四聚體CTLA4A29YL104E －Ig分子。此等單體、二聚體、四聚體及其他多聚體可於本文中稱為"順序識別碼：4多肽"或"具有順序識別碼：4順序"之多肽。雖然該細胞系可在轉譯時立即產生此等變型，但該變型可更典型上為在細胞中轉譯作用後之產物。二聚體可以共價方式接合在一起，以非共價方式接合在一起，或兩者。本發明係提供基本上包含經共價結合在一起之二聚體之組合物。例如，本發明係提供其中至少50% CTLA4－Ig二聚體係由共價方式接合之單體所構成之組合物。本發明亦提供其中至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% CTLA4－Ig二聚體係由共價方式接合之單體所構成之組合物。本發明亦提供CTLA4－Ig分子之組合物，其中分子主要呈二聚體形式，且該二聚體主要藉由共價鏈結所形成。例如，本發明係提供其中大部份CTAL4－Ig二聚體係以共價方式接合之組合物。可能情況是，在組合物中之某一部份CTLA4－Ig二聚體係以非共價方式接合。
CTLA4A29YL104E －Ig分子可包括例如呈單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體或其他多聚體形式之CTLA4A29YL104E －Ig。CTLA4A29YL104E －Ig分子可包含與至少是經修改CTLA4之胞外功能部位及免疫球蛋白恒定區域之蛋白質融合物。CTLA4A29YL104E －Ig分子可具有突變順序，例如關於經修改CTLA4胞外功能部位與免疫球蛋白恒定區域順序。CTLA4A29YL104E －Ig單體，單獨或呈二聚體、四聚體或其他多聚體形式，可經糖基化。
在一些具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，其具有至少某一百分比之二聚體或其他多聚體分子。例如，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子群集，其係為大於90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體。於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子群集，其包含約95%至約99.5%之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體，與約0.5%至約5%之CTLA4A29YL104E －Ig四聚體。於進一步具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子群集，其包含約95%至約99.5%之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體、約0.5%至約2.5%之CTLA4A29YL104E －Ig單體及約0.5%至約5%之CTLA4A29YL104E －Ig四聚體。於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子群集包含約96%之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體、約2.5%之CTLA4A29YL104E －Ig四聚體及約0.5%之CTLA4A29YL104E －Ig單體。
於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，其中群集係實質上不含CTLA4A29YL104E －Ig單體。實質上不含CTLA4A29YL104E －Ig單體可指CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集具有低於1%、0.5%或0.1%單體。
於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，其中群集係實質上不含大於二聚體之CTLA4A29YL104E －Ig多聚體，譬如四聚體、六聚體等。實質上不含大於二聚體之CTLA4A29YL104E －Ig多聚體，可指CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集具有低於6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%之大於二聚體之CTLA4A29YL104E －Ig多聚體。
CTLA4A29YL104E －Ig單體可具有例如胺基酸順序為：(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，或(iv)順序識別碼：4之27－382，或視情況為(v)順序識別碼：4之25－382，或(vi)順序識別碼：4之25－383。當包含順序識別碼：23之核酸順序之表現卡匣係在CHO細胞中表現時，經表現之主要單體形式具有甲硫胺酸之N－末端胺基酸殘基(順序識別碼：4之殘基27)，其係相應於人類CTLA4之N－末端胺基酸殘基。但是，由於順序識別碼：23亦包含對於制瘤素M訊息順序之編碼順序，故來自識別碼：23之經表現蛋白質順序係含有制瘤素M訊息順序。
訊息順序係在蛋白質從細胞質輸出或分泌自細胞之過程期間，分裂自經表現之蛋白質。但此分裂可造成N－末端變型，譬如在順序識別碼：4之胺基酸殘基25與26間之分裂(造成殘基26之N－末端，意即"Ala變型")，或在順序識別碼：4之胺基酸殘基24與25間之分裂(造成殘基25之N－末端，意即"Met－Ala變型")，與在順序識別碼：4之胺基酸殘基26與27間之分裂不同(造成以Met殘基在胺基酸位置27處開始之N－末端)。例如，Met－Ala變型可存在於CTLA4A29YL104E －Ig分子之混合物中，在約1%下，而Ala變型可存在於CTLA4A29YL104E －Ig分子之混合物中，在約10－20%下。
此外，得自順序識別碼：23之經表現蛋白質可具有C－末端變型，此係由於不完全處理所致。主要C－末端為在順序識別碼：4之殘基382處之甘胺酸。於CTLA4A29YL104E －Ig分子之混合物中，具有離胺酸在C－末端(順序識別碼：4之殘基383)之單體，可例如在約4－8%下存在。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子包含如下述順序識別碼：11 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：4之胺基酸25－383相同)：[順序識別碼：11] MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子包含如下述順序識別碼：12 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：4之胺基酸26－383相同)：[順序識別碼：12] AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
於進一步具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子包含如下述順序識別碼：13 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：4之胺基酸27－383相同)：[順序識別碼：13] MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子包含如下述順序識別碼：14 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：4之胺基酸25－382相同)：[順序識別碼：14] MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子具有如下述順序識別碼：15 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：4之胺基酸26－382相同)：[順序識別碼：15] AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
於進一步具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子具有如下述順序識別碼：16 之胺基酸順序(其係與順序識別碼：4之胺基酸27－382相同)：[順序識別碼：16] MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
CTLA4A29YL104E －Ig單體包含人類CTLA4之胞外功能部位，其中兩個胺基酸取代係在CTLA－4功能部位(L104E與A29Y)中施行(圖4)。於一項具體實施例中，胞外功能部位可包含順序識別碼：23之核苷酸89－463之核苷酸順序，其係對順序識別碼：4之胺基酸27－151進行編碼。於另一項具體實施例中，胞外功能部位可包含人類CTLA4之突變順序(譬如在順序識別碼：4之胺基酸27－151中之單一、雙重及三重位置突變)。於另一項具體實施例中，胞外功能部位可包含核苷酸改變成順序識別碼：23之核苷酸89－463，以致施行保守胺基酸變化。於進一步具體實施例中，胞外功能部位可包含核苷酸改變成順序識別碼：23之核苷酸89－463，以致施行非保守胺基酸變化。於另一項具體實施例中，胞外功能部位可包含核苷酸順序，其係為至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同於順序識別碼：23之核苷酸89－463。CTLA4A29YL104E －Ig單體可包含人類免疫球蛋白之恒定區域。此恒定區域可為恒定區域之一部份。此恒定區域亦可具有野生型或突變順序。恒定區域可來自人類IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgM、IgA1 、IgA2 、IgD或IgE。恒定區域可來自免疫球蛋白之輕鏈或重鏈。在恒定區域為來自IgG、IgD或IgA分子之情況下，恒定區域可包含一或多個下列恒定區域功能部位：CL 、CH 1、鉸鏈、CH 2或CH 3。在恒定區域為來自IgM或IgE之情況下，恒定區域可包含一或多個下列恒定區域功能部位：CL 、CH 1、CH 2、CH 3或CH 4。於一項具體實施例中，恒定區域可包含一或多個來自IgG、IgD、IgA、IgM或IgE之恒定區域功能部位。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig二聚體係由兩個單體所組成，其中各單體可具有相同或不同胺基酸順序，且其中順序可為以下之胺基酸順序：(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，(iv)順序識別碼：4之27－382，(v)順序識別碼：4之25－382，及(vi)順序識別碼：4之25－383。此種CTLA4A29YL104E －Ig單體可經過人類CTLA4順序之胞外功能部位，經由順序識別碼：4中之位置146處之半胱胺酸胺基酸殘基(或圖4之位置120處之半胱胺酸胺基酸殘基)二聚合。
CTLA4A29YL104E －Ig分子可經過IgM或IgA恒定區域功能部位與J鏈蛋白質之交互作用而多聚體化。IgM與IgA係經常被製成與另一個多肽鏈(J鏈)締合之多聚體。於五聚體IgM中，單體係藉由對彼此之二硫鍵在CH 3功能部位中，及對J鏈經過CH 4功能部位而被交聯。IgM亦可形成缺乏J鏈之六聚體，其中多聚體化作用係經過對每一個之二硫鍵達成。於二聚體IgA中，單體具有對J鏈之二硫鍵，經由其CH 3功能部位，而非彼此。因此，於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig多聚體，包括二聚體、五聚體及六聚體，其中Ig部份包含IgM恒定區域或其部份，或IgA恒定區域或其部份。此種以IgM或IgA為基礎之CTLA4A29YL104E －Ig多聚體可包含J鏈。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig單體包含順序識別碼：4之經修改人類IgG1鉸鏈區域胺基酸152－166，其中在順序識別碼：4之位置156、162及165處之絲胺酸殘基，已被設計自存在於野生型順序中之半胱胺酸殘基。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig單體包含經修改之人類IgG1 CH2區域與野生型CH3區域(經修改之人類IgG1 CH 2功能部位具有順序識別碼：1之核苷酸509－838，與順序識別碼：2之胺基酸167－276；人類IgG1 CH 3功能部位具有順序識別碼：1之核苷酸839－1159，與順序識別碼：2之胺基酸277－383)。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子群集包含具有美國專利申請案公報U.S.2002/0039577、U.S.2003/0007968、U.S.2004/0022787、U.S.2005/0019859及U.S.2005/0084933，以及美國專利7,094,874中所示順序之單體，其每一案均據此以其全文併入供參考。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig四聚體包含CTLA4A29YL104E －Ig分子之兩對或兩種二聚體，其中各多肽具有下列胺基酸順序之一：(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，(iv)順序識別碼：4之27－382，(v)順序識別碼：4之25－382，及(vi)順序識別碼：4之25－383。此對多肽或二聚體之各成員係以共價方式連結至另一成員，而此兩對多肽係以非共價方式與彼此締合，於是形成四聚體。此種四聚體分子係能夠結合至CD80或CD86。於另一項具體實施例中，此種四聚體分子可結合至CD80或CD86，具有抗體親抗原性為至少2－倍大於CTLA4A29YL104E －Ig二聚體(其單體具有上述胺基酸順序之一)對CD80或CD86之結合抗體親抗原性。
此種較大抗體親抗原性可幫助較高功效，以治療免疫病症及其他如下文所述之疾病，以及抑制組織及/或固體器官移植排斥。此外，較大或經改良之抗體親抗原性可產生藥物之較高功效結果。例如，包含CTLA4A29YL104E －Ig四聚體之治療組合物，係比相同量之具有CTLA4A29YL104E －Ig單體之治療組合物，具有較高抗體親抗原性，因此是較高功效。於另一項具體實施例中，此種四聚體分子對於T細胞增生，當與CTLA4A29YL104E －Ig二聚體(其單體具有上述胺基酸順序之一)比較時，可具有至少2－倍較大抑制。於另一項具體實施例中，此種四聚體分子，對於T細胞增生，當與CTLA4－Ig四聚體分子比較時，可具有至少2－倍較大抑制。
CTLA4－Ig與CTLA4 A29YL104E －Ig分子之特徵鑒定
T細胞增生可使用此項技藝中已知之標準檢測度量。例如，評估T細胞增生之最常用方法之一，係為經由抗原或對TCR之催動性抗體以刺激T細胞，及度量例如經氚化胸苷(3 H－TdR)在增生T細胞中之併入量，或藉由增生T細胞所釋出進入培養物中之細胞活素量。CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子於T細胞活化或增生時之抑制作用，可藉以度量。
CTLA4－Ig分子之親和力係為分子對單一配位體包括CD80、CD86或CD80Ig或CD86Ig融合蛋白質之結合強度。CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig對配位體之親和力，可例如利用以表面電漿激元技術為基礎之結合交互作用分析(BIA)度量。除了度量結合強度之外，其允許即時測定結合動力學，譬如締合與解離速率常數。感測晶片包括以薄金屬膜塗覆之載玻片，表面基質係以共價方式連接至其上，其係以交互作用劑之一，意即CTLA4－Ig、CTLA4A29YL104E －Ig，或配位體之一塗覆。允許含有另一種交互作用劑之溶液流過其表面上。連續光束係被導引對著該表面之另一個側面，並度量其反射角度。在CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig結合至配位體時，光束之共振角度會改變(因其係依接近感測器反應性側面之媒質之折射率而定，其依次係直接關聯於培養基中經溶解物質之濃度)。其係接著藉助於電腦分析。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig結合實驗可藉由表面電漿激元共振(SPR)於BIAcore儀器(BIAcore Ag,Uppsala,Sweden)上進行。CTLA4－Ig可藉由一級胺基團以共價方式偶合至BIAcore感測晶片上之羧甲基化右旋醣酐基質，於是使CTLA4－Ig固定至感測晶片。或者，抗－恒定區域抗體可用以使CTLA4－Ig經由Ig片段間接地固定至感測器表面。然後，將配位體添加至晶片以度量CTLA4－Ig結合至配位體。親和力度量可例如按van der Merwe,P.等人，J.Exp.Med. (1997)185(3)：393－404中所述進行，其係據此以其全文併入供參考。於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig結合實驗可如上文所述，使用表面電漿激元共振(SPR)技術(圖5；參閱實例21)進行。
亦可度量CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子之抗體親抗原性。抗體親抗原性可被定義為兩個分子或細胞對彼此在多重位置處之結合強度之總和。抗體親抗原性係不同於親和力，後者係為在分子上之一個位置結合至其配位體之強度。在不受理論束縛下，CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子之較高抗體親抗原性，可導致增加藉由CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子對於T－細胞增生與活化作用之抑制功效。抗體親抗原性可例如藉由兩個種類之固相檢測度量：a)競爭性抑制檢測，與b)溶離檢測。在此兩者中，係使配位體連接至固態載體。在競爭性抑制檢測中，CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子係接著以在固定濃度下之溶液添加，伴隨著不同濃度下之自由態配位體，及測定會抑制固相結合達50%之配位體量。所必須之配位體愈少，抗體親抗原性愈強。在溶離檢測中，配位體係以溶液添加。在獲得平衡狀態後，促溶劑或變性劑(例如異硫氰酸酯、尿素或二乙胺)係以不同濃度添加，以瓦解CTLA4－Ig/配位體交互作用或CTLA4A29YL104E －Ig/配位體交互作用。接著以ELISA測定CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig抵抗溶離之量。抗體親抗原性愈高，需要愈多促溶劑，以溶離某一數量之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig。CTLA4－Ig分子或CTLA4A29YL104E －Ig之不均勻混合物之相對抗體親抗原性，可以抗體親抗原性指數(AI)表示，等於為溶離50%經結合CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子所必須溶離劑之濃度。可進行數據之精修分析，其方式是在溶離劑之不同濃度下測定經溶離CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig之百分比。
苯基瓊脂糖4快速流動管柱層析，疏水性交互作用層析(HIC)方法可用以降低CTLA4－Ig高分子量物種在HIC純化步驟中溶離之量(參閱實例15)。因此，得自HIC管柱之清晰吸收峰係富含CTLA4－Ig HMW物種。例如，可採用預備之單一或協力管柱SEC HPLC，以純化得自HIC清晰吸收峰物質之二聚體、四聚體及多聚體亞群集。於一項具體實施例中，經純化之成份為CTLA4－Ig二聚體、四聚體及六聚體。存在於HIC清晰吸收峰中之CTLA4－Ig之高分子量成份之特徵鑒定，可藉由靜態與動態光散射技術完成。在疏水性交互作用層析(HIC)處理步驟下採取之試樣，係溶出而發現二聚體、四聚體及多聚體存在於不同取樣點下。六聚體物種僅可在相應於"清晰吸收峰之開始"與"清晰吸收峰最高值OD"之試樣中檢出。十聚體物種係僅在"清晰吸收峰最高值OD"中檢出。莫耳質量與流體動力學半徑形成可採用與準彈性光散射(QELS)偵測聯結之多角光散射(MALS)，經由尺寸排阻層析(SEC)，藉由分級分離測得。
關於製自細胞系之CTLA4－Ig分子，SEC顯示蛋白質A溶離物為多聚體、四聚體及二聚體成份之混合物。此混合物在預備協力SEC管柱上之分級分離，使得能夠單離多聚體、四聚體及二聚體物種之量。關於經單離溶離份之SEC分析中各成份之回收面積百分比，係造成對各溶離份之93－98%均一性。於一方面，個別成份之純化使得能夠將CTLA4－Ig HMW物質成份之物理化學性質與CTLA4－Ig二聚體之性質比較。圖6 顯示表觀分子量，其係相應於CTLA4－Ig HIC清晰吸收峰之多聚體、四聚體及二聚體離份，當藉由SEC測定時，伴隨著動態光散射偵測(DSL)及SEC上之滯留時間。於一項具體實施例中，得自HIC清晰吸收峰之經純化成份之生物專一性結合活性，係相當於藉由BIAcore所測得之結合活性，以經固定之B7－1Ig結合檢測為基礎。於另一方面，關於單離自HIC清晰吸收峰之成份之唾液酸莫耳比，係在4.9至7.6之範圍內，然而CTLA4－Ig總蛋白質或二聚體(未在HIC清晰吸收峰中)之唾液酸莫耳比，係在8－10之範圍內。藉由IEF凝膠之分析顯示，與CTLA4－Ig二聚體之潛移比較，經純化自HIC清晰吸收峰之CTLA4－Ig異構重組物之經降低移動性。此係與關於CTLA4－Ig HIC清晰吸收峰離份所發現之較低唾液酸莫耳比一致(圖7)。
細胞培養條件之選擇可影響重組蛋白質產物之單鏈(意即單體)與高分子量物種(意即二聚體、四聚體等)之形成。生長條件，亦包括但不限於培養基組成，其係為可影響單鏈之形成與半胱胺醯基化作用程度之因素。這可能是會導致二硫鍵還原之作用劑存在之結果。半胱胺酸直接地或含有半胱胺酸之培養基之補充至會分泌CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig之細胞，可造成單鏈與高分子量物種之快速形成。此速率係與所添加之半胱胺酸量成正比。於另一項具體實施例中，碘乙醯胺，一種會與自由態氫硫基反應之化合物，其補充會阻斷CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig之高分子量物種之形成，其係依二硫鍵而定。
例如，碘乙醯胺敏感性與非敏感性高分子量途徑係使兩個主要且顯著不同之機制醒目，高分子量物種可藉其在CTLA4－Ig中形成。高鹽濃度(0.5M)之補充至CTLA4－Ig溶液，會造成持續、快速之高分子量形成速率。EDTA、ConAcidSol II及酵母煉製物係適度地增加單鏈形成(參閱實例5)。
在某些具體實施例中，本發明係提供產生高分子量CTLA4－Ig群集之方法，其中含有CTLA4－Ig之主要單體或二聚體之混合物係被補充高鹽，以致該混合物具有鹽濃度大於約0.3、0.4、0.45、0.5或0.6M。於一項具體實施例中，此種方法係產生包含CTLA4－Ig群集之混合物，其具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之CTLA4－Ig四聚體分子。
於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig單鏈物種之群集，其含有在Cys146 上之修改，以致其係經半胱胺醯基化(參閱實例4)。半胱胺醯基化作用為轉譯後修改，其中在多肽鏈內之半胱胺酸係藉由另一個半胱胺酸，經由二硫鍵連接而被修改。蛋白質之半胱胺醯基化作用係與修改蛋白質生物活性有關聯，包括MHC種類－I限制病毒決定子之致免疫性與抗原性。於一項具體實施例中，本發明係提供一種組合物，其包含至少1、5、10、15、20、25、50、75、90或95%之半胱胺醯基化單鏈CTLA4－Ig分子。於本發明之另一項具體實施例中，CTLA4－Ig群集具有不超過約1% CTLA4－Ig單體分子，或於另一項具體實施例中，低於0.6% CTLA4－Ig單體。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子具有唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5至約18。在一些具體實施例中，唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至約Y，其中X為約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17，而Y為約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。在其他具體實施例中，唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至Y，其中X為約4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，而Y為約8.0、8.5、9.0、9.5或10.0。在其他具體實施例中，唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至Y，其中X為約6.0、6.5、7.0、7.5或8.0，而Y為約11.0、11.5、12.0、12.5或13.0。在其他具體實施例中，唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約14，約7至約13，約8至約12或約9至約11。在其他具體實施例中，唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約5至約9，約5.5至約9.5，約6至約9，約6至約10或約7至約10。在其他具體實施例中，唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比係大於或等於5，或大於或等於8。在某些具體實施例中，唾液酸為N－乙醯神經胺酸(NANA)。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子具有N－羥乙醯基神經胺酸(NGNA)對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為低於或等於2.5，低於或等於2.0，低於或等於1.5，低於或等於1.0或低於或等於0.5。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子當藉尺寸排阻層析測定時，係大於或等於93.0面積百分比，大於或等於93.5面積百分比，大於或等於94.0面積百分比，大於或等於94.5面積百分比，大於或等於95.0面積百分比，大於或等於95.5面積百分比，大於或等於96.0面積百分比，大於或等於96.5面積百分比或大於或等於97.0面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。在一些具體實施例中，此組合物包含CTLA4－Ig分子，其中CTLA4－Ig分子當藉尺寸排阻層析測定時，係大於或等於95.0面積百分比之CTLA4－Ig二聚體，與低於或等於4.0面積百分比之高分子量物種。在一些具體實施例中，此組合物包含CTLA4－Ig分子，其中CTLA4－Ig分子當藉尺寸排阻層析測定時，係大於或等於95.0面積百分比之CTLA4－Ig二聚體，與低於或等於5.0面積百分比之高分子量物種。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子當藉尺寸排阻層析測定時，係為低於或等於2.0面積百分比，低於或等於1.5面積百分比，低於或等於1.0面積百分比，或低於或等於0.5面積百分比之CTLA4－Ig單體。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子當藉尺寸排阻層析測定時，係為低於或等於5.0面積百分比，低於或等於4.5面積百分比，低於或等於4.0面積百分比，低於或等於3.5面積百分比，低於或等於3.0面積百分比，低於或等於2.5面積百分比，低於或等於2.0面積百分比，低於或等於1.5面積百分比，低於或等於1.0面積百分比，或低於或等於0.5面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。在涉及包含CTLA4－Ig分子之濃縮組合物之一些具體實施例中，譬如供皮下投藥，CTLA4－Ig分子當藉尺寸排阻層析測定時，係為低於或等於10面積百分比，低於或等於9面積百分比，低於或等於8面積百分比，低於或等於7面積百分比，低於或等於6面積百分比之CTLA4－Ig高分子量物種。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中此組合物包含低於或等於5 ppm，低於或等於4 ppm，低於或等於3 ppm，低於或等於2 ppm或低於或等於1 ppm。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中此組合物包含MCP－1，在低於或等於5毫微克/毫克，低於或等於4毫微克/毫克，低於或等於3毫微克/毫克，低於或等於2毫微克/毫克或低於或等於1毫微克/毫克MCP－1下。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子具有半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約6至約19。在一些具體實施例中，唾液酸對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至約Y，其中X為約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18，而Y為約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在其他具體實施例中，半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至Y，其中X為約6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，而Y為約12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5或16.0。在其他具體實施例中，半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至Y，其中X為約6.0、6.5、7.0、7.5或8.0，而Y為約15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5或19.0。在其他具體實施例中，半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7至約15，約8至約14，約9至約13，約10至約12。在其他具體實施例中，半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約7至約18，約8至約17，約9至約16或約10至約15。在其他具體實施例中，半乳糖對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比係大於或等於8。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子係為低於或等於5.0面積百分比，低於或等於4.5面積百分比，低於或等於4.0面積百分比，低於或等於3.5面積百分比，低於或等於3.0面積百分比，低於或等於2.5面積百分比，低於或等於2.0面積百分比，低於或等於1.5面積百分比，低於或等於1.0面積百分比，或低於或等於0.5面積百分比之經氧化物種。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子係低於於或等於5.0面積百分比，低於或等於4.5面積百分比，低於或等於4.0面積百分比，低於或等於3.5面積百分比，低於或等於3.0面積百分比，低於或等於2.5面積百分比，低於或等於2.0面積百分比，低於或等於1.5面積百分比，低於或等於1.0面積百分比，或低於或等於0.5面積百分比之脫醯胺酸化物種。在一些具體實施例中，此組合物包含CTLA4－Ig分子，其中CTLA4－Ig分子係低於於或等於3.0面積百分比之經氧化物種，與低於或等於2.5面積百分比之脫醯胺酸化物種。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中此組合物包含DNA在低於或等於4.0微微克/毫克，低於或等於3.5微微克/毫克，低於或等於3.0微微克/毫克，低於或等於2.5微微克/毫克，低於或等於1.5微微克/毫克，低於或等於1.0微微克/毫克，或低於或等於0.5微微克/毫克下。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中此組合物包含細胞蛋白質，在低於或等於70毫微克/毫克，低於或等於60毫微克/毫克，低於或等於40毫微克/毫克，低於或等於30毫微克/毫克，低於或等於20毫微克/毫克，低於或等於10毫微克/毫克，或低於或等於5毫微克/毫克下。本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中此組合物包含細胞蛋白質，在低於或等於125 ppm，低於或等於100 ppm，低於或等於75 ppm，低於或等於50 ppm，低於或等於25 ppm，或低於或等於10 ppm下。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子具有GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約10至約40。在一些具體實施例中，GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至約Y，其中X為在10與39間之任何整數，而Y為在11與40間之任何整數。在其他具體實施例中，GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至Y，其中X為約12、14、15、16或17，而Y為約32、33、34、35、36或37。在其他具體實施例中，GlcNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約12至約35，約13至約35，約14至約35，約15至約35。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子具有GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約0.5至約5.0。在一些具體實施例中，GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至約Y，其中X為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0，而Y為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在其他具體實施例中，GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約X至Y，其中X為約0.6、0.7、0.8、0.9或1.0，而Y為約3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1或4.2。在其他具體實施例中，GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約0.7至約4.1，約0.8至約4.0，約0.9至約3.9，或約1.0至約3.8，或約1.1至約3.7。在其他具體實施例中，GalNAc對CTLA4－Ig分子之平均莫耳比為約1.6至約3.7，約1.7至約3.6，約1.8至約3.5或約1.9至約3.4。
本發明係提供一種包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig組合物當在等電焦聚凝膠(IEF凝膠)上測定時顯示在pI範圍內之譜帶如下：約10至約22個譜帶，在約4.3至約5.6之pI範圍內；累積譜帶強度為約90%至約110%，在約4.3至約5.3之pI範圍內，及約3個主要譜帶，在約4.5至約5.2之pI範圍內。於一項具體實施例中，在約4.3至約5.6範圍內之譜帶為約5至約30，約6至約29，約7至約28，約8至約27，約9至約26，約10至約25，約11至約24，約12至約23，約13至約22，約14至約21，約15至約20，約16至約19，約17至約20，約18至約19個。
經糖基化之CTLA4－Ig與CTLA4 A29YL104E －Ig分子及其群集
在非限制下，糖基化作用可指添加複雜寡醣結構至蛋白質，在多肽鏈內之特定位置處。蛋白質之糖基化作用，及所添加碳水化合物之後續處理，可影響蛋白質折疊與結構，蛋白質安定性，包括蛋白質半生期，及蛋白質之功能性質。蛋白質糖基化作用可由於其中發生修改之順序環境，而被區分成兩個種類，O－連結之糖基化作用與N－連結之糖基化作用。O－連結之多醣係被連結至羥基，經常至無論是絲胺酸或蘇胺酸殘基之羥基。O－聚醣並未被添加至每一個絲胺酸與蘇胺酸殘基，而關於決定何種絲胺酸與蘇胺酸將被糖基化之標準並未完全被明瞭。O－連結之寡醣經常為單或雙天線，意即其包含一個或至多兩個分枝(天線)，且包含一至四個不同種類之糖殘基，其係逐一添加。
N－連結之多醣係連接至天冬素之醯胺氮。兩種三肽順序，無論是天冬素－X－絲胺酸或天冬素－X－蘇胺酸(其中X為任何胺基酸，惟脯胺酸除外)，只有作為其中一種之一部份之天冬素，係為供糖基化作用之標的。N－連結之寡醣可具有一至四個分枝，被稱為單－、雙－、三－、四－天線。在N－與O－連結寡醣中所發現糖殘基之結構係為不同。儘管該差異，在N－與O－連結多醣兩者之各分枝上之末端殘基，可藉由唾液酸分子修改，一種被稱為唾液酸封端作用之修改。唾液酸為關於獨特九碳單醣族群之一般名稱，其可被連結至其他寡醣。兩個族群成員為N－乙醯神經胺酸，縮寫成Neu5Ac或NANA，與N－羥乙醯基神經胺酸，縮寫成Neu5Gc或NGNA。
唾液酸在人類中之最常見形式為NANA。N－乙醯神經胺酸(NANA)為存在於CTLA4－Ig分子中之主要唾液酸物種。但是，應注意的是，較少但可偵測含量之N－羥乙醯基神經胺酸(NGNA)亦存在於CTLA4－Ig分子中。再者，本文中所述之方法可用以測定關於NANA與NGNA兩者之唾液酸莫耳數，因此測得NANA與NGNA兩者之含量，並對CTLA4－Ig分子作報告。N－與O－連結之寡醣具有不同數目之分枝，其係提供不同數目之位置，唾液酸分子可被連接至其上。N－連結之寡醣可提供至高四個供唾液酸連接之位置，而O－連結之寡醣可提供兩個供唾液酸連接之位置。
糖基化蛋白質(糖蛋白)，其中許多已藉由重組DNA技術方法製成，其具有很大重要性作為診斷與治療劑。許多註定供細胞表面用之真核細胞跨膜蛋白質及所分泌之蛋白質，係以轉譯後方式經修改，以併入N－連結與O－連結之碳水化合物基團。N－連結之寡醣係被連接至天冬素殘基，當其係為肽主體Asn－X－Ser/Thr之一部份時，其中X可為任何胺基酸，惟脯胺酸除外。O－連結之寡醣係被連接至絲胺酸或蘇胺酸殘基。N－連結與O－連結之寡醣以及在每一個中所發現糖殘基之結構，可為不同。常被發現於兩者上之一種糖類型，係為N－乙醯神經胺酸(NANA；後文稱為唾液酸)。通常，唾液酸為N－連結與O－連結寡醣兩者之末端殘基。糖蛋白由於其負電荷，故可顯示酸性之性質。
糖基化蛋白質係意圖在增進蛋白質折疊、調節細胞揀選與運輸、預防蛋白質聚集、媒介細胞－細胞黏連及增加對蛋白水解之抵抗性上，扮演數項角色。在真核細胞生物體中，糖基化作用之性質與程度，可對於糖蛋白治療劑藉由涉及受體所媒介細胞攝粒作用之過程之循環半生期與生物活性及清除率，具有深遠衝擊。受體所媒介之系統係被認為是藉由辨識寡醣之各種糖成份，而在清除血清糖蛋白上，扮演一項主要角色。糖蛋白之末端唾液酸基團可影響吸收、半生期及血清清除率。因此，糖蛋白生產策略，其係保持糖基化蛋白質之末端唾液酸成份，可更良好地增加蛋白質之生物利用率與血清半生期。關於重組糖蛋白合成之數種生產製程參數已被研究，尤其是培養基組成與溫度之作用係在各種生產策略中移轉。
由具有以下殘基之胺基酸順序(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，或(vi)順序識別碼：2之25－383之單體所組成之CTLA4－Ig二聚體，可具有經預測之理論MW為約78,000至約79,000道爾吞。但是，關於藉由MALDI－TOF所獲得之此種二聚體之MW係為大約91,000道爾吞。於MW上大約13,000－14,000道爾吞之此項差異，係至少部份由於糖基化作用所致，其在一項具體實施例中，係構成此特定CTLA4－Ig單體分子之大約15%質量。上文指定之單體具有三個N－連結之糖基化作用位置，其已藉由肽定譜圖法確認係發生在順序識別碼：2之殘基102、134及233處之天冬素上。經過天冬素連結之碳水化合物分子，可選擇性地使用酵素肽－N糖苷酶F(PNGase F)分裂。在一種情況中，具有順序識別碼：2之順序27－383之單體以PNGase F處理，會造成具有MW大約80,200道爾吞之物種，且由於此單體之理論MW為約80,200，故該處理指出未被計算之1,400道爾吞(80,200－78,800＝1,400)可由於O－連結之糖基化作用所致。雖然有許多絲胺酸與蘇胺酸殘基具有成為糖基化作用位置之可能性，但只有兩個O－連結之位置被確認：順序識別碼：2之Ser155 與Ser165 。於一項具體實施例中，經連接至此兩個位置之主要聚醣為HexNAc－Hex－NeuAc。
例如，圖8呈現CTLA4－Ig分子上之N－連結與O－連結碳水化合物結構之整體視圖，該分子包含具有順序順序識別碼：2之單體(意即具有下列順序之一之單體：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，或(vi)順序識別碼：2之25－383)，其中，於一項具體實施例中，此種具有所顯示碳水化合物特徵之分子係藉由本發明之細胞系或其後代，根據實例14－15中所述之製造方法製成。關於各位置所列示之主要結構係以正交技術(參閱本文)為基礎。關於各結構，有在此等實驗期間所發現該結構之經估計百分比。此等百分比表示得自該正交技術之最良好估計。
由具有以下殘基之胺基酸順序(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，(iv)順序識別碼：4之27－382，(v)順序識別碼：4之25－382，或(vi)順序識別碼：4之25－383之單體所組成之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體，可具有經預測之理論MW為約78,000至約79,000道爾吞。但是，關於藉由MALDI－TOF所獲得此種二聚體之MW係為大約91,500道爾吞。於MW上大約12,000－13,000道爾吞之此項差異，係至少部份由於糖基化作用所致。上文指定之單體具有三個N－連結之糖基化作用位置，其已藉由肽繪圖法確認係發生在順序識別碼：4之殘基102、134及233處(圖3之N76、N108及N207)之天冬素上。經過天冬素連結之碳水化合物分子，可選擇性地使用酵素肽－N糖苷酶F(PNGase F)分裂。雖然有許多絲胺酸與蘇胺酸殘基具有成為糖基化作用位置之可能性，但只有三個O－連結之位置被確認：順序識別碼：4之Ser149、Ser155及Ser165(參閱實例22中之表25 )。於一項具體實施例中，經連接至此等位置之主要聚醣為HexNAc－Hex－NeuAc。
在某些具體實施例中，CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子係為糖蛋白，其可藉由本發明之培養方法製成。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig糖蛋白係以表示大約15%(w/w)該分子之寡醣修改。此等寡醣可在CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白之藥物動力學(PK)參數上，扮演一項重要角色。此外，不同寡醣分佈形態可影響蛋白質之安定性與降解。例如，O－連結之寡醣可藉由預防免疫球蛋白恒定區域之鉸鏈區域中之自溶作用，而增強CTLA4A29YL104E －Ig分子之安定性。
於CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子群集上之寡醣分佈，可在本性上為非均質，此係由於細胞培養物與製程之複雜性所致。異質性可由於糖基化作用位置被完全佔據至未被佔據所致而存在，以及以下事實，任何特定位置可被許多不同寡醣結構群集，其可進一步顯示唾液酸修改型式上之變異。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子上之一級唾液酸部份基團為N－乙醯神經胺酸(NeuAc、NANA)，而二級唾液酸部份基團為N－羥乙醯基神經胺酸(NGNA)。唾液酸之荷電性質與複徵之含唾液酸結構，可個別造成CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig之多重異構重組物，其中此種異構重組物可顯見於等電焦聚(IEF)分佈形態中。例如，參閱圖9 與實例3，關於CTLA4－Ig之IEF分佈形態。此外，參閱圖10 與實例22，關於CTLA4A29YL104E －Ig之IEF分佈形態。
於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有優勢CTLA4－Ig異構重組物，具有等電點(pI)低於或等於5.1或5.0，其可例如藉由IEF測定。於另一項具體實施例中，係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，其具有優勢CTLA4A29YL104E －Ig異構重組物，具有等電點(pI)低於或等於5.5，其可例如藉由IEF測定(圖10 )。
於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有pI為約4.2至約5.7，約4.25至約5.5’約4.3至約5.3或約4.5至約5.2。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有pI為約4.45至約5.30。於進一步具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有pI為約4.3至約5.1。在一項特定具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有pI為約4.45至約5.0。於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中在群集中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%分子，當藉IEF測定時，顯示等電點低於或等於約5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1或2.1(此等數值可具有標準偏差為±0.2)。於一項具體實施例中，本發明係提供製備CTLA4－Ig分子群集之方法，該分子具有pI為約4.45至約5.30，或約4.45至約5.1或約4.45至約5.0，其中該方法係涉及使CTLA4－Ig分子之群集接受IEF凝膠電泳，其中在凝膠上之單一譜帶表示具有特定pI之CTLA4－Ig分子之亞群集，且單離具有特定pI之CTLA4－Ig分子之亞群集，其方式是自凝膠切除譜帶，及蛋白質自經切除凝膠譜帶之後續純化。
在進一步具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，具有pI為約4.5至約5.2。在其他具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，具有pI為約4.7至約5.1。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，具有pI為約2.0至約5.2。於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，其中在群集中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%分子，當藉IEF測定時，顯示等電點低於或等於約5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0(此等數值可具有標準偏差為±0.2)。於一項具體實施例中，本發明係提供一種製備CTLA4A29YL104E －Ig分子群集之方法，該分子群集具有pI為約4.5至約5.2；約4.7至約5.1；約2.0至約5.2，其中該方法係涉及使CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集接受IEF凝膠電泳，其中在凝膠上之單一譜帶表示具有特定pI之CTLA4A29YL104E －Ig分子之亞群集，且單離具有特定pI之CTLA4A29YL104E －Ig分子之亞群集，其方式是自凝膠切除譜帶，及蛋白質自經切除凝膠譜帶之後續純化。
在某些具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有莫耳唾液酸基團對莫耳CTLA4－Ig總蛋白質之平均莫耳比為：約6至約32，約8至約32，約11至約30，約12至約20，約13至約19，約14至約18，約15至約17，約6至約16，約8至約16，約8至約14，約8至約12。
在一些具體實施例中，≦25 ppm至≦10毫微克/毫克之最高可容許CHO宿主細胞蛋白質，係表現CTLA4－Ig分子之組合物之特徵。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之組合物之特徵為宿主細胞DNA，在≦2.5微微克/毫克至≦1.0微微克/毫克之含量下。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之組合物之特徵為Triton X－100，在≦1.0毫微克/毫克或≦1.0 ppm之含量下。Triton X－100之濃度可經由使用Waters OASIS－HLB固相萃取法，萃取Triton X－100，接著以水洗滌以移除殘留蛋白質而測得。經結合之Triton X－100係經由以乙腈溶離而被移除。乙腈溶離物係藉逆相層析，使用SAS Hypersil 5微米管柱，及包含乙腈：水(80：20)之流動相進行分析。偵測係藉由225毫微米下之UV吸光率。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之組合物之特徵為＝2.5面積%氧化作用與＝2.0面積%脫醯胺作用。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之組合物之特徵為＝3.0面積%氧化作用與＝2.5面積%脫醯胺作用。胰蛋白肽定譜圖方法係用於氧化作用與脫醯胺作用之定量。百分比氧化作用數據係利用RP－HPLC胰蛋白定圖譜檢測法測得，其係定量CTLA4－Ig蛋白質中之Met85成為甲硫胺酸亞碸之面積百分比氧化作用。在此方法中之百分比氧化作用係藉由度量RP－HPLC胰蛋白圖譜中之UV吸收峰面積而獲得，該吸收峰係關於T6胰蛋白肽，由含有Met85之殘基84－93所組成，及其相應之含有Met(O)85之經氧化胰蛋白肽T6ox。Met85之面積百分比氧化作用成為Met(O)85，係與T6ox吸收峰之面積百分比成正比：百分比氧化作用＝100 * AT6ox/(AT6ox＋AT6)，其中AT6＝T6胰蛋白肽(84－93)之吸收峰面積。AT6ox＝T6ox胰蛋白肽Met(O)85(84－93)之吸收峰面積。利用定量面積百分比氧化作用與脫醯胺作用之RP－HPLC胰蛋白定圖譜檢測所獲取之百分比脫醯胺作用數據，係藉由度量RP－HPLC胰蛋白圖譜中之UV吸收峰面積而獲得，該吸收峰係關於T26胰蛋白肽，由含有Asn294之殘基281－302所組成，及其相應之含有isoAsp294之脫醯胺酸化胰蛋白肽T26deam1。於是，Asn294至isoAsp294之面積百分比脫醯胺作用，係與T26deam1之吸收峰面積百分比成正比：其中AT26＝T26,(281－302)之吸收峰面積，AT26deam1＝T26deam1,isoAsp294(281－302)之吸收峰面積。AT26deam2＝T26deam2,Asp299(281－302)之吸收峰面積。AT26deam3＝T26deam3,Asp294(281－302)之吸收峰面積。AT26deam4＝T26deam4,Asu294(281－302)之吸收峰面積。
於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之組合物之特徵為N－乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)為15至35莫耳：莫耳CTLA4－Ig蛋白質，或N－乙醯半乳糖胺(GalNAc)為1.7至3.6莫耳：莫耳CTLA4－Ig蛋白質。胺基單醣係在藉由酸水解從蛋白質釋出後，藉由毛細電泳法(CE)定量。所釋出之胺基單醣係經重乙醯化，並以胺基蒎三磺酸(APTS)螢光標識，以幫助其偵測與定量。將N－乙醯甘露糖胺添加至試樣與胺基單醣標準物中，以充作內標準。胺基單醣在試樣中之吸收峰面積係使用內標準正規化，且經由與其在標準物中個別經正規化之胺基單醣吸收峰面積作比較而被定量。然後計算各單醣相對於CTLA4－Ig分子之莫耳比。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之組合物之特徵為下列N－連結寡醣分佈形態詳細說明：
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之組合物之特徵為中性單醣，其中組合物具有比例為約：半乳糖：8.0至17莫耳：莫耳CTLA4－Ig蛋白質海藻糖：3.5至8.3莫耳：莫耳CTLA4－Ig蛋白質甘露糖：7.7至22莫耳：莫耳CTLA4－Ig蛋白質，或半乳糖：9.0至17莫耳：莫耳CTLA4－Ig蛋白質甘露糖：11至19莫耳：莫耳CTLA4－Ig蛋白質。
說明之中性單醣組合物：半乳糖、海藻糖及甘露糖之莫耳：
於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig組合物之單醣莫耳比範圍如下：甘露糖約10－20莫耳/莫耳蛋白質；海藻糖約4.2－7.0莫耳/莫耳蛋白質；及半乳糖約9.2－17莫耳/莫耳蛋白質。於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig組合物之特徵為NANA莫耳比為約5.0－10.0莫耳NANA/莫耳蛋白質。於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig組合物之特徵為NGNA莫耳比為<1.5莫耳NGNA/莫耳蛋白質。於一些具體實施例中，唾液酸之莫耳比之%偏差為≦15%或≦20%或≦30%。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之群集可包含各具有至少3個唾液酸基團之CTLA4－Ig單體。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之群集包含各具有3至8個唾液酸基團之CTLA4－Ig單體。
於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中在群集中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%分子，顯示等電點低於或等於約5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1或3.0。在一些具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有莫耳NANA對莫耳CTLA4－Ig總蛋白質或二聚體之平均莫耳比：約6至約16，約6至約14，約6至約12，約8至約12，約8至約14，約8至約16。
在其他具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有莫耳NGNA對莫耳CTLA4－Ig總蛋白質或二聚體之平均莫耳比低於或等於約2、1.8、1.6、1.5、1.4、1.0、0.8或0.5。
在特定具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，具有莫耳唾液酸基團對莫耳CTLA4A29YL104E －Ig總蛋白質或二聚體之平均莫耳比為約5.5至約8.5。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，具有莫耳唾液酸基團對莫耳CTLA4A29YL104E －Ig總蛋白質或二聚體之平均莫耳比為約5至約10。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集可包含各具有至少2.5個唾液酸基團之CTLA4A29YL104E －Ig單體。於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集包含各具有2.5至5個唾液酸基團之CTLA4A29YL104E －Ig單體。
在其他具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其係以莫耳胺基單醣及/或中性單醣及/或唾液酸對莫耳CTLA4－Ig總蛋白質或二聚體之群集平均莫耳比為特徵。在特定具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，其係以莫耳胺基單醣及/或中性單醣及/或唾液酸對莫耳CTLA4A29YL104E －Ig總蛋白質或二聚體之群集平均莫耳比為特徵。胺基單醣包括N－乙醯半乳糖胺(GalNAc)與N－乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)。中性單醣包括甘露糖、海藻糖及半乳糖。唾液酸包括N－乙醯神經胺酸(NANA)與N－羥乙醯神經胺酸(NGNA)。
於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳GlcNAc之平均莫耳比係為約10至約40，約15至約35，約15至約25或約15至約20。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中在群集中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳GlcNAc之平均莫耳比係低於或等於約40、38、35、30、25、20、18或15。
於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳GalNAc之平均莫耳比為約1.5至約8.5，約1.7至約3.0，約1.7至約4.0，約1.7至約5.0，約1.7至約6.0，約1.7至約7.0，約1.7至約8.0或約1.7至約8.3。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中在群集中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳GalNAc之平均莫耳比係低於或等於約8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4.0、3.8、3.6、3.5、3.0、2.5、2.0、1.7或1.5。
於進一步具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳半乳糖之平均莫耳比為約7.5至約20.0，約8.0至約19.0，約8至約18.0，約8.0至約17.0，約8.5至約17.0或約9.0至約17.0。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中在群集中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳半乳糖之平均莫耳比係低於或等於約20.0、19.0、18.0、17.0、16.0、15.0、14.0、13.0、12.0、11.0、10.0、9.0、8.5、8.0或7.5。
於進一步具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳海藻糖之平均莫耳比為約3至約8.5，約3.5至約8.5，約3.5至約8.3，約3.5至約8.0，約3.5至約7.5或約3.5至約7.0。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中在群集中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳海藻糖之平均莫耳比係低於或等於約8.5、8.3、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.2或3.0。
於進一步具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳甘露糖之平均莫耳比為約7至約23，約7.5至約23，約7.7至約23，約7.7至約22.5，約7.7至約22，約7.7至約20，約7.7至約18，約7.7至約16，約8.0至約16.0，約9.0至約17.0，約10至約19.0或約11至約19.0。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中在群集中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子之莫耳甘露糖之平均莫耳比係低於或等於約23、22.5、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9.5、9、8.5、8、7.7、7.5、7.3或7。
於一項具體實施例中，本發明係提供經糖基化之CTLA4－Ig群集，當藉由曲線下方面積(AUC)度量時，其顯示增加之PK值，譬如增加之曝露，譬如由於降低來自血清之清除率而同時保持生物活性所造成或如由其所証實者。於另一項具體實施例中，本發明係提供經糖基化之CTLA4A29YL104E －Ig群集，其顯示增加之藥物動力學(PK)值，如由降低來自血清之清除率，而同時保持生物活性所証實者。
在一些具體實施例中，本發明係提供可溶性CTLA4－Ig分子之類似物，其具有另外之糖基化作用位置。在其他具體實施例中，本發明係提供可溶性CTLA4A29YL104E －Ig分子之類似物，其具有另外之糖基化作用位置。另外之糖基化作用位置係提供可被唾液酸基化之另外碳水化合物結構之連接點。增加之唾液酸含量可導致增加之PK值及/或增加之糖蛋白安定性。較高唾液酸含量係為有利的。活體外後純化方法係利用酵素以添加更多唾液酸，其可被進行以產生本發明CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子之進一步具體實施例。
本發明之具體實施例包括本文中所揭示之任一範圍，且併用本文中所揭示之任一個或多個範圍。本發明之具體實施例包括本文中所揭示CTLA4－Ig之任一特徵或性質，且併用本文中所揭示CTLA4－Ig之任一個或多個特徵或性質。
供分析與單離CTLA4－Ig與CTLA4 A29YL104E －Ig糖蛋白之方法
下文中所述之方法可用以區別、確認或單離特定CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子群集，以各種糖分佈形態為基礎，包括但不限於每莫耳CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig總蛋白質或二聚體之莫耳胺基單醣及/或中性單醣及/或唾液酸之群集平均莫耳比。
分泌自經培養細胞之糖蛋白，可單離自培養基或上層清液。在總細胞培養期結束時，使用如此項技藝中已知與實施或如本文中所述之單離與純化方法，將藉由細胞製成之糖蛋白收集、回收、單離及/或純化，或實質上純化，按需要而定。於一項具體實施例中，本發明之糖蛋白，其係藉由細胞表現，而非被細胞分泌，其仍然可自細胞回收，例如經由製造細胞溶胞產物，且單離糖蛋白，及/或使用此項技藝中已知與實施且如進一步於下文所述之方法。
藉由本發明之細胞培養方法所製成之糖蛋白，包括複雜碳水化合物，其可藉由各種碳水化合物分析技術進行分析。舉例而言，譬如此項技藝中所習知之外源凝集素沾吸之技術，係顯現出末端甘露糖或其他糖類譬如半乳糖之比例。單－、雙、三－或四－天線寡醣被唾液酸之末端化，可藉由糖類從蛋白質之釋出，使用無水肼或酵素方法，及寡醣藉由離子交換層析、尺寸排阻層析或其他此項技藝中已知方法之分級分離而確認。
有兩種主要類型之糖苷鏈結被發現於糖蛋白中，經N－與O－連結。N－糖基化作用係藉由聚醣對天冬素殘基之醯胺氮之共價鏈而產生。O－糖苷鏈結係藉由絲胺酸、蘇胺酸、羥離胺酸或羥脯胺酸之羥基對聚醣之共價鏈結而產生。糖蛋白之碳水化合物部份基團係涉及許多分子辨識現象，包括宿主－病原交互作用、自血清之清除及不同組織之作為標的。關於CTLA4－Ig與CTLA4A29YL104E －Ig分子，碳水化合物部份基團可至少影響CTLA4－Ig分子與CD80或CD86之間，或CTLA4A29YL104E －Ig分子與CD80或CD86間之結合。
碳水化合物結構典型上係以N－連結或O－連結之碳水化合物出現在經表現之蛋白質上。N－連結與O－連結之碳水化合物主要差異在其核心結構。N－連結之糖基化作用係指碳水化合物部份基團經由GlcNAc連接至肽鏈中之天冬素殘基。於一項具體實施例中，N－連結之碳水化合物全部含有共同之Man1－6(Man1－3)Man β 1－4Glc－NAc β 1－4GlcNAc β－R核心結構，其中在此核心結構中之R表示天冬素殘基。所產生蛋白質之肽順序將含有天冬素－X－絲胺酸、天冬素－X－蘇胺酸及天冬素－X－半胱胺酸，其中X為任何胺基酸，惟脯胺酸除外。
對照上而言，O－連結碳水化合物之特徵為共同核心結構，其含有經連接至蘇胺酸或絲胺酸之羥基之GalNAc。於N－連結與O－連結之碳水化合物中，最重要者為複雜N－與O－連結之碳水化合物。此種複雜碳水化合物含有數種天線結構。單－、雙－、三－及四－天線結構對於添加末端唾液酸係為重要的。此種外部鏈結構係提供包含蛋白質產物之碳水化合物之特定糖類與鏈結用之其他位置。
治療用糖蛋白經常使用重組DNA細胞培養技術製成。在細胞培養物中之蛋白質糖基化作用分佈，可因pH、細胞密度、營養物濃度及新陳代謝產物濃度上之變異而受影響。聚醣分佈對環境影響之敏感性，使得必須在產物發展與製造期間小心地監測聚醣分佈，以確保製造可再現性產物。
重組衍生之糖蛋白對於治療用途之發展，已導致對於特徵鑒定與剖析其碳水化合物結構之方法增加之需求。寡醣定圖譜已在重組蛋白質之最初特徵鑒定期間被使用，以供比較原本蛋白質，以確認存在之寡醣結構，以監測寡醣組成之一致性，以評估可能由於細胞培養物或製造過程中之變更所造成之改變，及確認糖基化作用上之改變，其係由於在不同細胞系中表現之結果而發生。
多種技術係可用以評估碳水化合物結構分佈。其包括凝膠過濾、層析及電泳分離技術，與廣範圍偵測技術結合。若試樣量有限，則糖蛋白經常以螢光試劑衍化，譬如2－胺基苯甲酸與2－胺基吡啶，以改良偵測。但是，衍化作用與衍生物之純化可能是費時的。當試樣大小不是問題時，碳水化合物結構分佈之直接評估是可能的。
糖蛋白之寡醣含量之分析
特定糖蛋白可顯示碳水化合物之大異質性。異質性可在數種層次下見及：糖基化作用位置可從完全被佔據改變至未被佔據，及任何特定位置可被許多不同寡醣結構群集，其中各結構可被唾液酸分子譬如NANA或NGNA修改。
本發明蛋白質之碳水化合物含量可藉此項技藝中已知之方法分析，包括本文實例中所述之方法。此項技藝中已知數種方法供糖基化作用分析，且可用於本發明之環境中。此等方法係提供關於經連接至所製成肽之寡醣之身分與組成之資訊。可伴隨著本發明使用之碳水化合物分析之方法，係包括但不限於外源凝集素層析；與脈衝式安培計偵測併用之高性能陰離子交換層析(HPAEC－PAD)，其係使用高pH陰離子交換層析以分離寡醣，以電荷為基礎；NMR；質量光譜法；HPLC；多孔性石墨化碳(GPC)層析。
釋出寡醣之方法係為已知。此等方法包括1)酵素方法，其經常使用肽－N－糖苷酶F/內向－α－半乳糖苷酶進行；2)β－脫除方法，使用嚴酷鹼性環境，以釋出主要為O－連結之結構；及3)化學方法，使用無水肼以釋出N－與O－連結之寡醣兩者。分析之方法可包括下列步驟：1.試樣對著去離子水之滲析，以移除所有緩衝劑鹽，接著為冷凍乾燥。2.完整寡醣鏈以無水肼之釋出。3.完整寡醣鏈以無水甲醇性HCl處理，以釋放個別單醣，為O－甲基衍生物。4.任何一級胺基之N－乙醯化作用。5.衍化作用以產生全－O－三甲基矽烷基甲基糖苷。6.藉由毛細管氣液層析法(GLC)於CP－SIL8管柱上分離此等衍生物。7.個別糖苷衍生物藉由得自GLC之滯留時間與質譜之確認，與已知標準物作比較。8.個別衍生物藉由具有內標準(13－O－甲基－D－葡萄糖)之FID之定量。
中性與胺基糖類之存在可利用與脈衝式安培計偵測合併之高性能陰離子交換層析(HPAEC－PAD碳水化合物系統；Dionex公司)測定。例如，糖類可藉由在20%(v/v)三氟醋酸中，於100℃下水解6小時而被釋出。水解產物係接著藉由冷凍乾燥，或使用Speed－Vac(Savant儀器)乾燥。然後，使殘留物溶於1%醋酸鈉三水合物溶液中，並於HPLC－AS6管柱上分析(如由Anumula等人,1991,Anal.Biochem. ,195：269－280所述者)。
或者，可進行免疫沾吸碳水化合物分析。在此程序中，蛋白質結合之碳水化合物係使用市售聚醣偵測系統(Boehringer)進行偵測，其係以藉由Haselbeck等人所述之氧化免疫沾吸程序為基礎(1993,Glycoconjugate J. ,7：63)。遵照由製造者所建議之染色擬案，惟蛋白質係被轉移至聚二氟亞乙烯薄膜代替硝基纖維素薄膜，及阻斷緩衝劑含有5%牛血清白蛋白，在具有0.9%氯化鈉之10 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris)緩衝液pH 7.4中。偵測係使用與鹼性磷酸鹽共軛物連結之抗－異羥洋地黃毒苷元抗體(Boehringer)進行，以1：1000稀釋於Tris緩衝鹽水中，使用磷酸酶受質，4－氮藍氯化四唑0.03%(w/v)與5－溴基－4－氯基－3－吲哚基－磷酸鹽0.03%(w/v)，在100 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris)緩衝液pH 9.5中，含有100 mM氯化鈉與50 mM氯化鎂。含有碳水化合物之蛋白質譜帶經常在約10至15分鐘內呈現。
與蛋白質締合之碳水化合物，亦可經由以肽－N－糖苷酶F消化而被分裂。根據此程序，使殘留物懸浮於含有0.18% SDS,18 mM β－巰基乙醇,90 mM磷酸鹽,3.6 mM EDTA在pH 8.6下之14微升緩衝劑中，並於100℃下加熱3分鐘。於冷卻至室溫後，將反應混合物區分成兩個大約相等部份。一部份未經進一步處理，充作對照組。另一部份係經調整至約1% NP－40清潔劑，接著添加0.2單位之肽－N－糖苷酶F(Boehringer)。使兩部份在37℃下溫熱2小時，然後藉由SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。
糖蛋白之聚醣定圖譜係逐漸地被接受。本文中所述之操作法係允許寡醣之快速特徵鑒定，以聚醣類型、唾液酸基化作用之程度及在碳水化合物之非還原性末端上之分枝數目為觀點。因此，在某些具體實施例中，本發明係提供特徵為特定寡醣分佈形態之CTLA4－Ig群集。寡醣形態剖析典型上係藉由寡醣之層析分離，接著為偵測與相對定量而完成。層析形態剖析之替代方式為寡醣在線上脫鹽後藉由ESI灌注之直接分析。
寡醣藉由PGC之形態剖析可用以特徵鑒定得自CTLA4－Ig分子之N－連結寡醣。有31種自CTLA4－Ig分子(順序識別碼：2)確認之寡醣之結構種類，包括含有O－乙醯化唾液酸基團之結構種類。結構種類証明係經由利用MS/MS與正離子模式MS達成。結構種類之相對定量係可能經過206毫微米下之UV軌跡之積分。得自個別N－鏈位置之亞群集分佈形態之比較係為已知，顯現出N－鏈位置間之顯著群集差異。使用PGC之寡醣形態剖析係提供對於較傳統形態剖析方法譬如HPAEC之合宜資訊富含替代方式。
在包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子中之N－連結結構
於CTLA4－Ig多聚體或二聚體上每鏈(意即每單體)有三個N－連結之糖基化作用位置，其中單體具有來自順序識別碼：2之順序，例如：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，或(vi)順序識別碼：2之25－383。於糖基化作用上因位置所致之變異，係藉由從蛋白質之胰蛋白酶消化，單離含有N－連結聚醣之肽片段而進行分析。於蛋白質上之N－連結糖基化作用位置，係位於Asn102 、Asn134 及Asn233 ，個別被包含在胰蛋白酶片段5、7及14中。N－連結寡醣自經單離肽片段之酵素釋出，接著為經釋出寡醣之PGC形態剖析，造成圖11 中所示之分佈形態。自Asn233 (胰蛋白酶片段14,T14)釋出之聚醣之分佈形態，得以明瞭寡醣群集係被富含於非唾液酸基結構(結構未具有唾液酸)中。得自被連接在Asn102 與Asn134 (T5與T7)之聚醣之寡醣分佈形態，係含有整體唾液酸基化結構。
自糖蛋白釋出之經單離寡醣係被直接注入多孔性石墨化碳LC/UV/MS系統中。圖14 與15 顯示藉由含有酸性與鹼性添加劑之乙腈梯度液所產生之典型PGC分佈形態之TIC與UV層析圖。在大部份情況中，得自單一層析吸收峰之質譜含有關於單一寡醣之質量吸收峰。三十種寡醣結構種類係被確認自含有TFA之溶離分佈形態。只有十六種寡醣結構種類係被確認自含有NH4 OH之溶離分佈形態。在各結構種類內，有變型結構，其含有N－羥乙醯基神經胺酸(NGNA)之取代，替代N－乙醯神經胺酸(NANA)，以及不同程度之唾液酸乙醯化作用。雖然只有定性資訊得自寡醣種類之離子計數之比較，但顯而易見的是，在四個功能部位之每一個內之主要結構種類係為P2100、P2111、P2122及P3133。此係與得自206毫微米下之UV軌跡之積分值一致。進一步結構証明可得自正離子質譜圖。正離子模式離子化作用會促進寡醣之來源碎裂，主要在糖苷鍵結處。當藉負離子質譜測定時，由於有寡醣之良好分離，故得自正離子模式之碎裂光譜係模擬正離子MS/MS光譜。功能部位III(二－唾液酸基化結構)含有顯著量之O－乙醯化結構P2122－Ac。正離子m/s數據係支持結構上唾液酸之一之O－乙醯化作用。唾液酸殘基之最常見O－乙醯化作用位置係在C－7與C－9位置(Shi Wx,Chammas R.,VarkiA.,J.Biol.Chem. 271(1996)15130－15188)。在生理學胞外pH下，於C－7之O－乙醯基酯類係自發性地潛移至C－9。最可能O－乙醯化作用位置係因此為C－9。
N－連結寡醣含量之分析 ：分析技術可包括N－連結寡醣藉管柱層析之分裂與單離，其在非限制性具體實施例中係使用Hypercarb管柱。接受Hypercarb層析之聚醣係被單離，並可藉由HPAEC－PAD分析，此分析係測定修改特定糖蛋白之碳水化合物之類型。N－連結寡醣之分析特徵鑒定亦可藉液相層析法/質量光譜法(LC/MS)，使用多孔性經石墨化之碳(PGC)達成。碳水化合物分析亦可包括胰蛋白酶、Asp－N及胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶原肽定譜圖，以測定包含碳水化合物結構之肽。
N－連結之寡醣結構可使用一系列正交質量光譜法與HPAEC－PAD技術(參閱實例)分析。此等技術包括數種內肽酶分裂，接著為LC/MS/MS分析。關於具有來自順序識別碼：2之順序之CTLA4－Ig單體，N－連結糖基化作用之三個主要位置係使用LC/MS與LC/MS/MS電噴霧離子化作用進行特徵鑒定，而在各N－鏈位置之主要結構係經測定。此等資料係摘錄於圖8 中。關於N－連結之寡醣有至少三個主要連接點在Asn102 、Asn134 及Asn233 處。此外，係發現Asn233 含有N－連結結構之群集，其未含有唾液酸基團，發生約80%之時間。
藉由糖肽之LC/MS、寡醣之LC/MS及HPAEC－PAD測得之CTLA4－Ig之N－連結寡醣結構 ：N－連結之碳水化合物係與Asn－X－Ser/Thr之同感順序主體締合。此順序出現三次，在具有下列順序之一之CTLA4－Ig單體鏈上：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，及(vi)順序識別碼：2之25－383。此同感順序主體出現在順序識別碼：2中，於：Asn102 Leu103 Thr104 ；Asn134 Gly135 Thr136 及Asn233 Ser234 Thr235 處。以同感順序為基礎，每二聚體分子有六個N－連結碳水化合物位置，該分子係由任一個或兩個下列單體順序所形成：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，及(vi)順序識別碼：2之25－383。
N－連結之碳水化合物可具有三個一般變種：高甘露糖、混合種及/或複合物。關於糖肽分析之LC/MS技術係經發展。單體(具有以下順序之一(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，及(vi)順序識別碼：2之25－383)之胰蛋白酶內蛋白分解分裂，會造成含有N－連結糖基化作用之三種肽。全部三個N－連結之位置係被碳水化合物結構群集。相應於順序識別碼：2之胺基酸65－109之胰蛋白酶片段T5，含有糖基化作用在Asn 102 上。相應於順序識別碼：2之胺基酸120－154之胰蛋白酶片段T7，含有糖基化作用在Asn134 上。相應於順序識別碼：2之胺基酸229－237之胰蛋白酶片段T14，含有糖基化作用在Asn233 上。
為測定各位置上之糖基化作用之特定類型，碳水化合物係得自各特定位置，其方式是增加蛋白質消化與分離之規模，接著收集T5、T7及T14肽。將吾人感興趣之胰蛋白肽吸收峰以PNGase F處理，並進行處理以供藉由LC/MS在Hypercarb管柱上分析。結果顯示複雜雙－、三－及四－天線結構在各位置之非均質群集。此等可於圖11 中見及，其中層析係將糖類分離成五個功能部位：非唾液酸基、單－唾液酸基、二－唾液酸基、三－唾液酸基及四－唾液酸基結構(個別稱為功能部位I、II、III、IV及V)。關於Asn102 (T5)碳水化合物之層析圖(圖11 面板A)係說明一系列單－與二－唾液酸基結構在位置上。關於Asn134 (T7)之層析圖(圖11 面板B)係說明兩個主要二－唾液酸基結構，與單－唾液酸基結構之群集。關於Asn233 (T14)之層析圖(圖11 面板C)係說明極少唾液酸基化作用。對各N－連結碳水化合物位置，係顯示MS光譜與相應結構，關於各層析圖上之主要吸收峰(參閱圖11 面板E、F、H)。於圖11 中，面板D，係將CTLA4－Ig之全部N－連結碳水化合物分佈形態顯示於層析圖中。經選擇吸收峰之質量與結構係列示於表1中。寡醣LC/MS數據係被肽定圖譜之深度分析所支持。Asn102 (T5肽)具有最大程度之碳水化合物異質性，範圍從雙天線非唾液酸基化結構至四－天線四－唾液酸基化結構。Asn134 (T7肽)主要含有雙天線結構。此位置比Asn102 位置含有遠較小異質性。Asn233 (T14肽)位置含有極少唾液酸基化作用。第三種分析技術HPAEC－PAD亦被採用，以支持兩種正交LC/MS發現。
全部N－連結碳水化合物之群集係使用HPAEC－PAD分析。藉此方法所獲得之數據係列示於表2與3中。在表2中，非唾液酸基對三－唾液酸基功能部位之相對面積百分比，係被列示於各位置(順序識別碼：2之Asn102 、Asn134 及Asn233 )內。在表3中，寡醣功能部位面積百分比係被列示為寡醣整個群集之分率。
藉由糖肽之LC/MS、寡醣之LC/MS及HPAEC－PAD所測得之CTLA4 A29YL104E －Ig分子之N－連結寡醣結構 ：N－連結之碳水化合物係與Asn－X－Ser/Thr之同感順序主體締合。此順序係出現三次，在具有下列順序之一之CTLA4A29YL104E －Ig單體鏈上：(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，(iv)順序識別碼：4之27－382，(v)順序識別碼：4之25－382，及(vi)順序識別碼：4之25－383。此同感順序主體係出現在順序識別碼：4中，於：Asn102 Leu103 Thr104 ；Asn134 Gly135 Thr136 及Asn233 Ser234 Thr235 處。以同感順序為基礎，每二聚體分子有六個N－連結之碳水化合物位置，該分子係由任一個或兩個下列單體順序所形成：(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，(iv)順序識別碼：4之27－382，(v)順序識別碼：4之25－382，及(vi)順序識別碼：4之25－383。
N－連結之碳水化合物可具有三個一般變種：高甘露糖、混合種及/或複合物。關於糖肽分析之LC/MS技術係經發展。單體(具有以下順序之一(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，(iv)順序識別碼：4之27－382，(v)順序識別碼：4之25－382，及(vi)順序識別碼：4之25－383)之胰蛋白酶內蛋白分解分裂，會造成含有N－連結糖基化作用之三種肽(參閱實例22中之表25 )。全部三個N－連結位置係被碳水化合物結構群集。相應於順序識別碼：4之胺基酸65－109之胰蛋白酶片段T5，含有糖基化作用在Asn102 上。相應於順序識別碼：4之胺基酸120－154之胰蛋白酶片段T7，含有糖基化作用在Asn134 上。相應於順序識別碼：4之胺基酸229－237之胰蛋白酶片段T14，含有糖基化作用在Asn233 上(參閱實例22中之表25 )。
為測定各位置上之糖基化作用之特定類型，碳水化合物係得自各特定位置，其方式是增加蛋白質消化與分離之規模，接著收集T5、T7及T14肽。將吾人感興趣之胰蛋白肽吸收峰以PNGase F處理，並進行處理以供藉由LC/MS在Hypercarb管柱上分析。結果顯示複雜雙－、三－及四－天線結構在各位置處之非均質群集。此等可於圖14中見及，其中層析係將糖類分離成四個功能部位：非唾液酸基、單－唾液酸基、二－唾液酸基及三－唾液酸基結構(個別稱為功能部位I、II、III及IV)。可被分析且在糖基化分子或包含糖基化分子之群集或組合物之間比較之碳水化合物分佈形態之特徵，包括吸收峰面積百分比、功能部位面積百分比、波谷間距離或峰間距離。
CTLA4－IgN－連結寡醣之LC/MS特徵鑒定
LC/MS多孔性石墨碳(PGC)層析為一種用於形態剖析N－連結寡醣之方法，其可提供數項優點，勝過高pH陰離子交換層析(HPAEC)。一些此等優點包括：自消化混合物直接形態剖析，其係使試樣損失與降解降至最低；直接MS界面係提供寡醣之快速特徵鑒定與分析之方法；增加經過PGC層析之解析係允許功能部位間比較，以及更精細之功能部位內分析兩者。
LC/MS PGC方法允許寡醣之快速形態剖析與特徵鑒定，以聚醣類型為觀點，與測定唾液酸基化作用之程度，及在碳水化合物之非還原端上之分枝。然後，負離子模式MS光譜係產生易於解釋之數據，具有最少寡醣碎裂，而正模式離子化作用係允許結構種類証明。此處所述之方法可被應用至糖蛋白之整體消化混合物，以及至先前單離之寡醣試樣，而無需衍化作用。所使用之層析流動相允許收集得自分佈形態之吸收峰，及濃縮至乾涸，無需進一步操控即可供更詳細特徵鑒定。於一項具體實施例中，此方法係用以特徵鑒定CTLA4－IgN－連結之寡醣。使用LC/MS PGC方法，三十一種不同種類之寡醣可被確認於CTLA4－Ig分子上，其包含具有得自順序識別碼：2之順序之單體，例如順序識別碼：5、6、7、8、9或10。
高pH陰離子交換層析(HPAEC)已被用以廣泛地形態剖析自糖蛋白釋出之寡醣，無需衍生作用。HPAEC之高解析度，及分離係被所存在糖殘基之類型、鏈結類型及聚醣大小所影響之事實，均為廣泛使用此項技術之原因。分離上之主導因素為電荷，高度地帶電之寡醣比起較不帶電之聚醣係稍後溶離。層析分佈形態經常被區分成功能部位，藉由帶有電荷物種之數目所界定，典型上為在聚醣上之唾液酸殘基(圖15 )。
為獲得關於未知寡醣結構之更多資訊，可將HPAEC吸收峰收集、脫鹽及藉由MS及/或NMR作特徵鑒定。對寡醣分佈之HPAEC－PAD形態剖析之一項考量是偵測模式所固有之變異性。電化學電池老化與電極表面積垢會造成分佈形態變異性。亦已被報告的是，寡醣結構與唾液酸基化作用之程度，當使用HPAEC與脈衝式安培計偵測(HPAEC－PAD)時，可造成偵測電池中之變異性。此變異性可影響用以評估製程變化之作用或測定批次間一致性之定量與相對定量結果。由於質量光譜法(MS)之速度與專一性，故其已獲得受歡迎性，作為評估糖蛋白之寡醣形態剖析之技術。雖然MS分佈形態不能用以直接測定異頭組態或分枝圖樣，但MS數據可用以確認結構種類，及偵測糖式分佈之定性改變。
關於以酵素方式釋出之N－連結寡醣之多孔性石墨化碳(PGC)層析形態剖析方法，係利用紫外光(UV)與質量光譜(MS)偵測，以剖析與特徵鑒定N－連結之寡醣，無論是直接來自酵素消化混合物或來自單離之寡醣。此方法可用以剖析與特徵鑒定自CTLA4－Ig糖蛋白釋出之寡醣。LC/MS PGC方法可評估由於生產過程所造成寡醣分佈之一致性，以及由於製程修改所造成寡醣分佈上之任何改變。在CTLA4－Ig分子之N－連結寡醣之層析微量分析中，以酵素方式釋出之N－連結寡醣可容易地藉由PGC管柱分離，以漸增唾液酸基化作用與漸增大小之順序。所存在結構之範圍，及各結構種類之相對量，係經過MS與UV分析之組合而測得(實例3)。
為使LC/MS PGC方法達最佳化，質譜條件之最佳化可為有用的。最佳化可包括一組表面定圖譜實驗，以評估溶劑組成與MS離子化參數對於寡醣偵測之作用。用於評估之溶劑組成參數，包括百分比乙腈(體積比)與溶離劑添加劑(三氟醋酸與氫氧化銨)。用於評估之經評估MS離子化參數係包括關於電噴霧來源之去溶劑化溫度、毛細管電壓及圓錐體電壓設定。
離子化參數可在信號回應上扮演一項重要角色。由於表面定圖譜測定所造成之模式，係用以在層析測定期間設定離子化參數。關於去溶劑化作用溫度與圓錐體電壓兩者之較高數值，會造成較大回應。最適宜毛細管電壓係依溶離劑添加劑，含具有稍微較高最適宜毛細管電壓之溶劑系統之TFA而改變。具有最大作用之因數為乙腈之體積百分比，較高乙腈含量會造成較高回應。
多孔性石墨化碳層析
多孔性經石墨化之碳(PGC)已被使用於寡醣之固相萃取脫鹽。亦已知PGC為一種在酸性與鹼性溶離兩種條件下用於寡醣分離之有效層析介質。用於自具有來自順序識別碼：2之單體順序之CTLA4－Ig分子，以酵素方式釋出寡醣之酸性與鹼性兩種形態剖析之層析條件已經發展。各條件係可與UV與MS偵測兩者相容。正如在灌注實驗中所發現者，酸性溶離條件會造成比鹼性條件較高之MS敏感性。關於在酸性條件下溶離，以TFA加成物檢出之中性寡醣之MS回應，係為在鹼性條件下溶離之相應吸收峰強度之五至九倍。於信號回應上之差異，對於酸性寡醣係較不顯著，為對於單唾液酸基化聚醣之信號回應之平均三倍，而對於二－唾液酸基化聚醣為相等信號回應。與NH4 OH溶離層析圖(圖13A－B )比較，在TFA溶離層析圖中增加之吸收峰數目(圖12A－B )，係為寡醣異頭形式分離之結果。自TFA梯度液溶離之個別吸收峰之收集與濃縮，於再注射時會造成單一吸收峰分裂成相同質量之兩個吸收峰。寡醣自PGC管柱之鹼性溶離，會造成較簡易分佈形態(圖13A－B )。鹼性溶離條件不會造成完全異頭分離，但是，發現顯著峰加寬。吸收峰解析可藉由增加柱溫而被增加，其將加速異頭形式之交換(Itoh S.,等人,J.Chromatogr.A. 2002 968(1－2),89－100)。但是，對於經偵測寡醣之敏感性(離子計數)，與酸性溶離條件比較，仍然保持被降低。已有報告指出添加鹽譬如醋酸銨，可增加敏感性(Churms SC,J.Chromatogr.A. 500(1990)555－583)。
醋酸銨、三氟醋酸銨或甲酸銨之添加，會造成增加之回應，但亦造成不對稱峰加寬。所形成之峰加寬與所添加鹽之可能干擾UV偵測，使得鹽添加成為不吸引人之選項。排除異頭分離之一種替代方式，係為使寡醣還原成其相應之醛醇。
較高敏感性與層析解析使得酸性溶離條件可用於寡醣形態剖析。特定形態剖析系統包括Luna C18管柱，經過兩個雙位置六孔閥聯結至Hypercarb 5 μM管柱(100 x 4.6毫米)。Hypercarb管柱係聯結至UV偵測器(Waters 2996 PDA)，與具有標率ESI探針之Q－ToF Micro(Micromass)串聯。經過適當開關控制，經預純化之CTLA4－Ig試樣可單獨使用Hypercarb管柱進行形態剖析，或消化混合物可藉由消化混合物之直接注射至與Hypercarb管柱串聯之Luna C18而進行形態剖析。典型上，分佈形態係得自10至20毫微莫耳蛋白質釋出之N－連結寡醣。
在某些具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有層析圖，根據任一個或多個具有代表性吸收峰之層析圖。關於具有順序識別碼：2順序之單體之CTLA4－Ig分子，其代表性寡醣分佈形態層析圖係示於圖11、圖12A－B、圖13A－B(PGC)、圖15(HPAEC/PAD)及圖16A－B中。此兩種層析分佈形態可被分解成四個獨特功能部位，含有在稍後溶離功能部位中具有漸增唾液酸基化作用程度之寡醣結構。PGC層析系統允許與質量偵測器之直接界面。質量分辨與信噪比係為可接受的，即使對於以低百分比存在之寡醣亦然。當與HPAEC比較時，個別寡醣結構之層析解析在PGC層析分離中顯示較大。
收集得自HPAEC方法之吸收峰需要脫鹽，且所採用之高pH會引進剝離反應之可能性，其可能干擾吸收峰之正確結構確認。由於與PGC層析一起使用之層析條件係為不含鹽，故經溶離之寡醣吸收峰可被收集與濃縮，使用最少操作。這允許經溶離吸收峰之收集與濃縮，接著為所收集寡醣之注射至HPAEC系統上。經收集寡醣之再注射至HPAEC－PAD系統上，允許存在於HPAEC分佈形態中之一些吸收峰之結構指定(圖15 )。由於在陰離子交換管柱上之不完全峰解析，故並非所有經單離之吸收峰均可被定圖譜至HPAEC分佈形態。
由於直接注射消化混合物所造成之分佈形態，與關於來自相同蛋白質試樣之經單離寡醣之分佈形態，並不相同。由於直接注射所造成之分佈形態(圖18A－B )具有不同異頭物比例，這指出經收集寡醣之濃縮正造成增加之異頭化作用。更重要的是，由於直接注射所造成之分佈形態係含有相應於四－唾液酸基化結構之吸收峰。此結構並未被確認於經收集與經單離寡醣之分佈形態中。除了縮短檢測時間以外，直接來自消化混合物之形態剖析可藉由避免收集與濃縮期間之聚醣降解，而造成寡醣分佈之更精確表示。
相對定量
於灌注試樣上進行之表面定圖譜，顯示乙腈之體積百分比對於溶離寡醣之電離效率具有顯著作用。信號強度對於流動相中乙腈含量之依存性，使得寡醣藉由MS之相對定量係依溶離峰之滯留時間而定。於管柱條件中之變異可影響PGC管柱上之溶離時間。因此，難以獲得來自離子層析圖溶離分佈形態之一致相對定量。於206毫微米下之UV軌跡不應受溶劑組成所影響，達與離子軌跡相同之程度。相對定量係使用UV軌跡進行，離子軌跡僅用於特徵鑒定與定性比較。單離自單一糖蛋白批料之寡醣之複製注射，對四個經定量寡醣功能部位之每一個，會造成百分比相對標準偏差(%RSD)低於4%。
在包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子中之O－連結結構除了N－連結碳水化合物以外，CTLA4－Ig分子可含有O－連結之碳水化合物。O－連結之寡醣結構可使用一系列正交質量光譜法技術分析。此等技術包括數次內肽酶分裂，接著為LC/MS/MS分析。
關於由具有得自順序識別碼：5、6、7、8、9或10順序之單體所形成之CTLA4－Ig分子，O－連結糖基化作用之兩個主要位置係使用正確質量電噴霧離子化作用進行特徵鑒定，並測定各O－鏈位置上之主要結構。此等數據係摘錄於圖9中。數據係與有三種主要O－連結結構一致：(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 ；(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 ；(GalNAc)1 (GlcNac)1 (Gal)2 (NeuAc)2 。各結構係以不同量被發現於每一位置上。此等量係相對較為定量，且表示得自多重分析之數據。O－連結之寡醣有助於實質量之唾液酸至CTLA4－Ig。每鏈有兩個主要O－連結之寡醣連接點。關於O－連結寡醣存在之主要位置為Ser165 ，其係在約95%時間內被佔據。關於O－連結寡醣存在之二級位置為Ser155/156 ，其係被佔據＝25%之時間。本文所提出之正交數據係提供存在於此種CTLA4－Ig分子上之主要碳水化合物結構之概論，且係摘錄於圖9 中。
一般而言，O－連結之碳水化合物比存在於N－連結碳水化合物中者，具有遠為較大之結構異質性。此外，對O－鏈連接沒有同感順序。因此，一系列正交技術係被發展，供使用於O－連結寡醣之結構特徵鑒定：LC/MS完整分析與LC/MS糖肽分析。
以Edman降解與MALDI為基礎，據報告O－鏈位置係為Ser165 (關於順序識別碼：2)。為獲得關於Ser165 糖基化作用存在之直接數據，係進行MS/MS定序，使用b'與y"離子系列於T9肽上(參閱表4與表5)。表4係列出關於T9肽之離子系列，在四種不同糖基化作用狀態中。在全部四種狀態中，b'離子系列，b1...b6離子係為一致。但是，b'離子系列，b7...bmax ，係因在b7(Ser165 )上之不同糖基化作用狀態而改變。作為一項確認，其相應之y"離子系列係經報告。在所有四個y"離子系列中，y1...y19離子係完全一致。但是，y"離子系列，y20...ymax係因y20(Ser139 )上之不同糖基化作用狀態而改變。b'與y"離子系列一起採用係支持Edman定序之關聯性，意即Ser139 為在T9肽上O－連結糖基化作用之主要位置。T9為含有數個絲胺酸與蘇胺酸殘基之肽。
表4提出關於具有與未具有(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 之O－連結梯狀物之T9肽之LC/MS/MS b'與y"離子。b'離子系列對所有直到b7之光譜均為相同，其中光譜於是因上文各系列所列示之O－連結碳水化合物結構而不同。y'離子系列對所有直到y19之光譜係為相同，其中光譜於是因上文各系列所列示之O－連結碳水化合物結構而不同。
在Ser165 上之O－連結碳水化合物結構表示三個主要物種之非均質群集。於圖17 中，T9糖肽係被發現於去旋光譜中。有基峰在2689.2 amu處，其係與此肽2689.11 amu之理論質量一致。此光譜係說明三個主要O－連結之結構。此光譜係說明基本肽，具有與O－連結結構(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 一致之糖梯狀物。光譜之放大粗體部份已被加強10倍，且確認兩個其他O－連結之結構，與(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 及(GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2 一致。
使用質量光譜法以評估各O－連結物種之相對豐度。於圖17 中，(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 聚醣係被發現與(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 聚醣呈10：1比例，及與(GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2 聚醣呈30：1比例。因此，於一項具體實施例中，本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之群集，其具有10：1比例之(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 聚醣對(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 聚醣。於另一項具體實施例中，本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之群集，其具有30：l比例之(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 聚醣對(GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2 聚醣。(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 聚醣係被發現與(HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2 聚醣呈20：1之比例。於另一項具體實施例中，本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之群集，其具有20：1比例之(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 聚醣對(HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2 聚醣。於另一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其包含此段落中之所有該比例。此外，負離子電噴霧光譜係確認此三種主要結構；各相對豐度係示於圖8 中。
關於包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子，除了Ser165 位置以外，第二個O－鏈位置係被發現於Ser155 或Ser156 處。此位置係被稱為Ser155/156 。含有Ser155/156 之D8肽係產生自AspN消化，且係相應於順序識別碼：2之胺基酸150－156。肽係被LC/MS分離與檢出。關於D8 O－連結糖肽之光譜(未於本文示出)係顯示790.2 amu之基峰，其係與理論質量790.8 amu一致。此光譜係說明肽離子，及與結構(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 一致之一系列離子。此肽主要為非糖基化；經糖基化之(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 物種係構成大約22%吸收峰面積。
CTLA4－Ig單鏈之O－連結寡醣結構係使用一系列正交質量光譜法技術進行特徵鑒定。此等技術包括O－連結糖基化作用之兩個主要位置之內肽酶分裂與LC/MS分析，並利用電噴霧離子化作用，以測定各O－鏈位置上之主要結構。此等數據係摘錄於圖18中。可以有四種主要O－連結之結構：(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 ；(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 ；(HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2 ；(HexNAc)2 (Gal)2 ,(NeuAc)3 。此等結構係以不同量在各位置上被檢出。大於95%之CTLA4－Ig單鏈具有至少(HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2 。
另一種檢測係經發展，以確認O－連結之碳水化合物，及尋找較不盛行之結構。此項技術係利用胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶原共消化，以產生藉MS/MS確認係為THTSPPSPAPELL(順序識別碼：2之胺基酸159－171)之肽。此肽允許確認一種單唾液酸基化、兩種二－唾液酸基化及一種三－唾液酸基化之O－連結物種。關於三－唾液酸基化物種之明確結構，尚未被闡明，但是，提出兩種可能性：一種肽，含有一個核心2結構，具有3個唾液酸，或兩個核心1結構存在於兩個不同胺基酸殘基上。
一種補充技術，藉由MS之完整分析，係用以確認CTLA4－Ig分子之非均質O－鏈糖基化作用之存在。CTLA4－Ig二聚體與CTLA4－Ig單鏈係以PNGase F處理，以移除N－連結寡醣。然後，藉由質譜儀偵測分子，並使其相應之離子去旋至光譜中。在單鏈物質中，主要聚醣組合物為(HexNAc)2(Hex)2(NeuAc)2，而參考物主要為(HexNAc)1(Hex)1(NeuAc)1。糖基化作用組合物係與LC/MS肽分析期間所發現者一致。除了O－連結糖基化作用型式上之改變以外，發現第二個主要修改。在單鏈未經還原物種與經還原CTLA4Ig標準物之間發現113±4 u之質量位移。113±4 u之質量位移係在以DTT還原時消失。在二聚體物質中，所形成離子包封係被去旋至光譜(未於本文中示出)中，具有主要吸收峰在79944 amu處，其係相應於兩種(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 結構之存在。下一個最大吸收峰，在80600 amu處，係相應於三個O－鏈結構，或至多一個分枝狀O－鏈結構之組合。第三個最大吸收峰係相應於無論是四個O－連結之結構，或含有至多兩個分枝狀O－鏈結構之組合。
唾液酸含量之測定
糖蛋白特徵鑒定之另一方面係為唾液酸之測定。唾液酸含量可為糖蛋白之記號特徵。本發明糖蛋白之唾液酸含量可藉習用方法評估。例如，唾液酸可個別地藉由直接比色方法(Yao等人,1989,Anal.Biochem. ,179：332－335)，使用至少一式三份試樣測定。唾液酸測定之另一種方法係涉及利用硫基巴比妥酸(TBA)，如由Warren等人,1959,J.Biol.Chem. ,234：1971－1975所述。又另一種方法係涉及高性能層析，譬如由H.K.Ogawa等人,1993,J.Chromatography,612：145－149所述。
於一項具體實施例中，一種測定N－乙醯神經胺酸(NANA)與N－羥乙醯基神經胺酸(NGNA)量之方法，係經過吾人感興趣之糖蛋白之酸水解處理(例如，參閱實例3)。於此方法中，NANA與NGNA係藉由酸水解分裂自蛋白質。於一項具體實施例中，糖蛋白係實質上藉由適合其純化之方法純化。所釋出之NANA與NGNA係藉由HPLC於Rezex單醣RHM管柱上分離，且藉由UV吸光率(206毫微米)偵測。NANA與NGNA係以共同地操作之NANA與NGNA標準物之回應因子為基礎進行定量。此等結果可以NANA與NGNA個別對蛋白質之莫耳比(MR)作報告。
度量唾液酸含量之酸水解方法之目的係為度量CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig試樣中總唾液酸(NANA與NGNA)對蛋白質之量(莫耳比)。但是，重要的是指出此等唾液酸莫耳比係包括經結合與自由態NANA與NGNA。莫耳比結果係以得自經水解CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig試樣之NANA與NGNA，對未經水解NANA與NGNA標準物之吸收峰面積比較為基礎而獲得。亦可使用NANA與NGNA之水解標準物。
例如，莫耳比係對具有順序識別碼：2胺基酸順序之CTLA4－Ig分子獲得。未經水解時，在NANA與NGNA標準物之層析圖中吾人感興趣之吸收峰，係以單一吸收峰呈現。當NANA標準物與CTLA4－Ig試樣被水解時，所形成之層析圖顯示NANA為主要吸收峰，接著接近地為小肩峰(主要吸收峰面積之<10%；被稱為"經降解NANA")；相同濃度之具有與未具有水解作用之NANA標準物，係造成極接近之吸收峰面積，包括降解物。無吸收峰明顯地在關於經降解NGNA物種之層析圖中見及，惟見及NGNA吸收峰在經水解NGNA標準物中之面積計數，係降低大約8－9%。質量光譜法(MS)實驗証實在經水解NANA標準物與經水解CTLA4－Ig試樣兩者中之"NANA降解物"係由於自NANA損失18道爾吞(水)所造成。因此，此方法適當地包括在經水解CTLA4－Ig中，於NANA吸收峰之整合中之小肩峰。亦藉由MS實驗証實的是，NGNA係在水解時降解，伴隨著18道爾吞之損失。NGNA降解物係在NANA與NANA降解物之間被溶離，以致UV並未偵測之。在CTLA4－Ig物質中，NGNA含量係大致上為NANA含量之5%，且因此，NGNA降解物之共溶離會造成NANA吸收峰面積之低於0.5%改變，其係在NANA吸收峰面積之變異性範圍內。此方法不能夠包括經降解NGNA之面積在NGNA結果中；因此，NGNA結果可低達<10%，亦在此方法之變異性內。
由於NGNA係被認為比NANA較具致免疫性，故對於含有低NGNA莫耳比之重組治療劑有臨床優先性。於本發明之一項具體實施例中，唾液酸在CTLA4－Ig分子之群集中之優勢係為NANA而非NGNA，其中在此群集中，每莫耳CTLA4－Ig總蛋白質或二聚體之莫耳唾液酸之莫耳比，係為約5至約18。於另一項具體實施例中，唾液酸在CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集中之優勢為NANA而非NGNA，其中在此群集中，每莫耳CTLA4A29YL104E －Ig總蛋白質或二聚體之莫耳唾液酸之莫耳比，係為約5.5至約8.5。
CTLA4－Ig與CTLA4 A29YL104E －Ig表現卡匣
本發明係提供一種使CTLA4－Ig分子編碼之核酸，其在一項具體實施例中為表現卡匣。本發明亦提供一種使CTLA4A29YL104 E－Ig分子編碼之核酸。於一項具體實施例中，使CTLA4－Ig分子編碼之核酸係被包含在表現卡匣中。於另一項具體實施例中，使CTLA4－Ig分子編碼之核酸係被包含在衍生自具有順序識別碼：17之核苷酸順序之質粒之表現卡匣中。在進一步具體實施例中，使CTLA4A29YL104E －Ig分子編碼之核酸係被包含在表現卡匣中。在某些具體實施例中，使CTLA4A29YL104E －Ig分子編碼之核酸係被包含在衍生自以ATCC收受號碼PTA－2104寄存之質粒之表現卡匣中。
本發明之核酸可為吾人感興趣之cDNA、似cDNA、DNA或RNA核酸分子，在可表現格式中，譬如表現卡匣，其可被表現自天然啟動子或其衍生物或完全異質啟動子。或者，吾人感興趣之核酸可使反有意義RNA編碼。吾人感興趣之核酸可使蛋白質(例如糖蛋白，譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白)編碼，且可以或可以不包括插入序列。
於一項具體實施例中，使具有CTLA4活性之肽編碼之核酸，可得自T細胞基因組DNA或得自存在於經活化T淋巴球中之mRNA。於另一項具體實施例中，使CTLA4A29YL104E －Ig編碼之核酸，亦可得自T細胞基因組DNA或得自存在於經活化T淋巴球中之mRNA。於本發明之另一項具體實施例中，使吾人感興趣之蛋白質編碼之基因，例如CTLA4或CTLA4A29YL104E －Ig，可無性繁殖自無論是基因組庫或cDNA，根據熟諳此藝者實施之標準擬案。cDNA，例如使CTLA4或CTLA4A29YL104E －Ig編碼，可藉由從適當細胞系單離全部mRNA而獲得。使用此項技藝中已知之方法，雙股cDNA可製自全部mRNA，及接著可被插入適當噬菌體載體或質粒中。基因亦可使用此項技藝中良好建立之PCR技術無性繁殖。於一項具體實施例中，使CTLA4或CTLA4A29YL104E －Ig編碼之基因可經由PCR根據藉本發明提供之核苷酸順序資訊進行無性繁殖。
於另一項具體實施例中，含有CTLA4或CTLA4A29YL104E －Ig cDNA之DNA載體，可充作PCR反應中之模板，其中經設計以放大吾人感興趣區域之寡核苷酸引物，可用以獲得涵蓋該區域之經單離DNA片段。在本發明之一項特定具體實施例中，在CTLA4 cDNA中作為標的之吾人感興趣之區域，可為CTLA4之胞外功能部位，包括人類CTLA4之胞外功能部位。在某些具體實施例中，於CTLA4A29YL104E －Ig cDNA中作為標的之吾人感興趣之區域，可為CTLA4之胞外功能部位，具有胺基酸改變在順序識別碼：2之胺基酸位置55與130處，包括隱藏上述胺基酸改變之人類CTLA4之胞外功能部位。
為表現本發明內文中之融合蛋白質，於一項具體實施例中，嵌合基因融合(例如使CTLA4－免疫球蛋白(CTLA4－Ig)融合蛋白質或CTLA4A29YL104E －Ig融合蛋白質編碼之基因)係包含核苷酸順序，其係使訊息順序編碼，而其中在嵌合基因之轉錄與轉譯時，係導引新合成之融合蛋白質供分泌。於一項具體實施例中，可使用原本CTLA4訊息順序(例如人類CTLA4訊息順序，經描述於Harper,K.等人(1991,J.Immunol. 147,1037－1044)中)。於本發明之一項替代具體實施例中，異質訊息順序可用以導引CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分泌(例如制瘤素－M訊息順序(Malik N.等人,1989,Mol Cell Biol 9(7),2847－2853)或免疫球蛋白訊息順序)。熟諳此藝者明瞭相應於該訊息順序之核苷酸順序可藉由標準重組DNA技術，被插入嵌合基因融合中，譬如藉由進行訊息順序在使CTLA4編碼之核酸順序之5'末端處之架構內連接。
在布達佩斯(Budapest)條約之條款下，使相應於CTLA4－Ig融合蛋白質之胺基酸順序編碼之DNA已於1991年5月31日被寄存於美國培養物類型收集處(ATCC),10801 Blvd.大學,Manassas,VA,20110。其已被指定為ATCC收受號碼68629。此外，包含使相應於CTLA4A29YL104E －Ig之胺基酸順序編碼之核酸順序之表現質粒，係在布達佩斯(Budapest)條約之條款下，於2000年6月19日寄存於ATCC。已寄存之質粒已被指定為ATCC收受號碼PTA－2104。已寄存之質粒亦被稱為pD16 LEA29Y與pD16 L104EA29Y。CTLA4A29YLl04E －Ig係進一步被描述於美國專利7,094,874與共待審美國專利申請案號09/579,927,60/287,576及60/214,065中，以及在國際專利公報案號WO 01/923337 A2中，其全部均以其全文併於本申請案中供參考。
本發明之表現載體可用以轉染細胞，無論是真核細胞(例如酵母、哺乳動物或昆蟲細胞)或原核細胞，以產生被該載體之核苷酸順序編碼之蛋白質(例如融合蛋白質，譬如CTLA4－Ig、CTLA4A29YL104E －Ig分子等)。熟諳此藝者明瞭所要蛋白質產物在原核生物中之表現，最常在具有含構成或可誘發啟動子之載體之大腸桿菌中進行。一些大腸桿菌表現載體(於此項技藝中亦稱為融合載體)係經設計以添加許多胺基酸殘基，經常至經表現重組蛋白質之N－末端。該融合載體可充當三種功能：1)增加所要重組蛋白質之溶解度；2)增加吾人感興趣之重組蛋白質之表現；及3)藉由充作親和純化中之配位體，以幫助重組蛋白質純化。融合表現載體之一些實例包括但不限於：a)pGEX(Amrad公司,Melbourne,澳洲)，其係使谷胱甘肽S－轉移酶融合至所要之蛋白質；b)pcDNATM 3.1/V5－His A B & C(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)，其係使6x－His融合至吾人感興趣之重組蛋白質；及c)pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)，其係使麥芽糖E結合蛋白質融合至標的重組蛋白質。
適合根據本發明製程與方法培養之細胞，可隱藏引進表現載體(構造物)，譬如質粒等。表現載體構造物可經由轉移感染、帶脂化作用、轉變、注射、電擊穿孔或感染而被引進。表現載體可含有編碼順序或其部份，使蛋白質編碼以在培養方法中表現與生產。此種表現載體可包含供插入之編碼順序轉錄與轉譯所需要之成份。含有使所製成蛋白質與多肽編碼之順序，以及適當轉錄與轉譯控制元素之表現載體，可使用熟諳此藝者所習知與實施之方法產生。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組，其係描述於J.Sambrook等人,1989,分子無性繁殖,實驗室手冊,Cold Spring Harbor出版社,Plainview,N.Y.中，及在F.M.Ausubel等人,1989,分子生物學之現行擬案,John Wiley & Sons,New York,N.Y中。
一種可選擇標記物可被使用於重組表現載體(例如質粒)中，其中載體係被安定地整合至細胞之基因組中，以對隱藏該載體之細胞賦予抗藥性。這允許其在適當選擇培養基中之選擇。可使用許多選擇系統，包括但不限於次黃嘌呤－鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT)、單純疱疹病毒胸腺核苷激酶(HSV TK),(Wigler等人,1977,Cell ,11：223),(Szybalska與Szybalski,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48：202)及腺嘌呤轉磷酸核糖基酶(APRT)(Lowy等人,1980,Cell ,22：817)基因，其可個別被採用於hgprt－、tk－或aprt－細胞中。
可被包含在表現載體中之下述標記基因之非限制性實例，亦可作為抗－新陳代謝產物抗藥性之選擇基礎使用：gpt ，其係賦予對霉菌酚酸之抗藥性(Mulligan與Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78：2072)；dhfr ，其係賦予對胺甲喋呤之抗藥性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77：357；及O'Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78：1527)；hygro ，其係賦予對潮霉素之抗藥性(Santerre等人,1984,基因,30：147)；及neo，其係賦予對胺基糖苷G418之抗藥性(臨床製藥學 ,12：488－505；Wu與Wu,1991,生物療法,3：87－95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. ,32：573－596；Mulligan,1993,Science ,260：926－932；Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem. ,62：191－21；1993年5月,TIB Tech ,11(5)：155－215)。此項技藝中一般已知之重組DNA技術可例行性地被應用，以選擇所要之重組細胞無性繁殖系。此種技術係描述於例如Ausubel等人(編著),分子生物學之現行擬案,John Wiley & Sons,NY(1993)；Kriegler,1990,基因轉移與表現,實驗室手冊,Stockton出版社,NY；在第12與13章中，Dracopoli等人(編著),人類遺傳學之現行擬案,John Wiley & Sons,NY(1994)；Colberre－Garapin等人,1981.J.Mol.Biol. ,150：1中，其係以其全文併於本文供參考。
經表現蛋白質分子之表現程度可經由表現載體之放大而被增加(關於回顧，可參閱Bebbington與Hentschel,"在哺乳動物細胞中，於DNA無性繁殖中，以基因放大為基礎之載體用於表現經無性繁殖基因之用途",第3卷,大學出版社,New York,1987)。當在表現吾人感興趣蛋白質之表現載體系統中之標記物為可放大時，增加存在於宿主細胞培養基中抑制劑之含量，將會增加標記基因複製之數目。由於經放大區域係與蛋白質編碼用之基因締合，故蛋白質生產將伴隨地增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell.Biol. ,3：257)。隱藏會使可選擇標記物麩醯胺合成酶(GS)或二氫葉酸鹽還原酶(DHFR)編碼之核酸順序之載體，可於藥物甲硫胺酸磺醯亞胺或胺甲喋呤個別存在下被放大。此種載體之優點是細胞系之可取用性，例如老鼠骨髓細胞瘤細胞系NSO，與中國大頰鼠卵巢CHO細胞系DG44，其個別為麩醯胺合成酶陰性與二氫葉酸鹽還原酶陰性。
在本發明之一項具體實施例中，使可溶性CTLA4或CTLA4A29YL104E －Ig融合蛋白質分子編碼之核酸順序，可被插入經設計以在真核細胞宿主中表現外來順序之表現載體中。載體之調節成份可根據經選擇供使用之真核細胞宿主而改變。用以在真核生物宿主細胞中表現可溶性CTLA4或CTLA4A29YL104E －Ig之載體，可包含供蛋白質表現最佳化之增強子順序。
哺乳動物細胞(譬如BHK細胞、VERO細胞、CHO細胞等)可經由引進表現載體至適當宿主細胞，而隱藏表現載體(例如，含有使CTLA4－Ig融合蛋白質或CTLA4A29YL104E －Ig融合蛋白質編碼之基因者)。因此，本發明係涵蓋含有使CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig融合蛋白質編碼之核酸順序之表現載體，及涵蓋宿主細胞，此種表現載體可經由此項技藝中已知之方法被引進其中。如本文中所述，本發明之表現載體可包含使CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig融合蛋白質編碼之核苷酸順序，經連結到至少一種調節順序，其方式是允許該核苷酸順序在宿主細胞中表現。對熟諳此藝者而言，調節順序係為習知，且可經選擇以導引吾人感興趣之蛋白質在適當宿主細胞中表現，如在Goeddel,基因表現技術：酶學方法185,大學出版社，San Diego,Calif.(1990)中所述者。調節順序可包括下列：增強子、啟動子、聚腺苷酸化作用訊息及其他表現控制元素。於此項技藝中之執行者明瞭設計表現載體可依一些因素而定，譬如欲被轉染宿主細胞之選擇及/或欲被表現之所要蛋白質之類型及/或量。
無性繁殖與表現質粒(例如pcSD與piLN)係按實例11中所述被建構。在本發明之一項具體實施例中，得自質粒pSV2dhfr －之經單離DNA片段係被連接至會產生表現載體pcSD之pcDNA3載體主鏈。載體pcSD係包含下列特徵：巨細胞病毒(CMV)啟動子，接著為多重無性繁殖位置(MCS)；牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化作用訊息與轉錄終止順序；老鼠dhfr cDNA順序，供選擇與放大；胺苄青霉素抗藥性基因；及複製之pUC來源，供選擇與維持在大腸桿菌中。載體piLN係被建構，含有cDNA，其會使實例11相應於人類CTLA4受體之胞外功能部位之片段之胺基酸順序部份編碼，其中會使第一個胺基酸順序編碼之cDNA係被接合至會使第二個胺基酸順序編碼之DNA，其係相應於IgC區域，其允許藉由變更經表現CTLA4蛋白質之溶解度，表現CTLA4受體基因(參閱圖1，及圖1之簡述，關於相應於CTLA4胞外部份與IgG1恒定區域之殘基)。於一項具體實施例中，制瘤素M訊息肽順序可經融合至相應於CTLA4胞外功能部位之胺基酸順序，其係接著經融合至相應於Ig功能部位(例如人類IgC1 功能部位)之第二個胺基酸順序，如前文圖1中所述。制瘤素M訊息順序允許CTLA4基因(例如CTLA4－Ig)蛋白質產物之可溶性形式被產生。
為建構含有會使CTLA4－免疫球蛋白融合蛋白質編碼之基因之pcSD表現載體，可使用此項技藝中已知之方法(例如限制位置次代無性繁殖)。供本發明一項具體實施例用之起始物質，可為得自實例11中所述之無性繁殖載體piLN之經消化與切除之DNA片段。於另一項具體實施例中，得自該載體之經切除DNA片段含有制瘤素M訊息順序與CTL4Ig融合蛋白質之胺基酸順序，其中該DNA片段係被連接至經消化之pcSD載體。制瘤素M－CTLA4－Ig DNA片段可被插入CMV啟動子與含有BGH聚腺苷酸化作用訊息及轉錄終止順序之卡匣之間。這將在CMV啟動子之控制下放置CTLA4－Ig基因產物於稱為pcSDhuCTLA4－Ig之質粒(圖21；順序識別碼：17)中。
此外，無性繁殖與表現質粒(例如pD16LEA29Y)可被衍生自Invitrogen質粒pcDNA3。載體pD16LEA29Y(圖22)包含下列特徵：得自pcDNA3之新霉素抗藥性基因係在較不增強(弱化)SV40啟動子之控制下，被老鼠二氫葉酸鹽還原酶(DHFR)基因置換；使CTLA4A29YL104E －Ig編碼之基因係表現自CMV啟動子，而聚腺苷酸化作用訊息係來自牛生長激素基因；供吾人感興趣基因用之表現卡匣係被轉錄終止順序側面相接，意即5'至啟動子，而3'至聚A位置；載體含有兩個不同限制位置多鏈結，一個3'至啟動子，供無性繁殖吾人感興趣之基因，與一個5'至啟動子，在轉移感染之前，供載體線性化；載體含有胺苄青霉素抗藥性基因，與ColE1複製來源，供大腸桿菌中之質粒傳播；CTLA4A29YL104E －Ig順序之前係為制瘤素M訊息肽，且被組裝在稱為載體pD16LEA29Y之表現載體中。
載體係經建構，含有使相應於人類CTLA4受體胞外功能部位片段之胺基酸順序部份編碼之cDNA(順序識別碼：2)，其中在位置55處之胺基酸A1a係被胺基酸Tyr置換，而在位置130處之胺基酸Leu係被胺基酸Glu置換(圖4)。此等胺基酸改變係描繪於具有順序識別碼：4之CTLA4A29YL104E －Ig胺基酸順序中。使第一個胺基酸順序編碼之cDNA(例如使CTLA4A29YL104E －Ig編碼之順序)係被接合至使第二個胺基酸順序編碼之DNA，其係相應於IgC區域，其允許藉由變更具有順序識別碼：23之經表現CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質之溶解度，表現CTLA4A29YL104E －Ig受體基因。
於一項具體實施例中，制瘤素M訊息肽順序可經融合至相應於CTLA4胞外功能部位之胺基酸順序，其接著被融合至相應於Ig功能部位(例如人類IgC1 功能部位)之第二個胺基酸順序。制瘤素M訊息順序允許CTLA4基因(例如CTLA4A29YL104EIg )蛋白質產物之可溶性形式被產生。
安定轉移感染以產生細胞系
含有使吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等)編碼之DNA之載體，可被轉變至適當宿主細胞(例如細菌細胞)中，以產生大量無性繁殖DNA。供轉變之細菌細胞之一些非限制性實例，包括細菌細胞系大腸桿菌菌種DH5a或MC1061/p3(Invitrogen公司,San Diego,Calif.)，其可使用此項技藝中實施之標準程序被轉變，且菌落可接著經篩檢，以供適當質粒表現。
供真核細胞譬如哺乳動物細胞用之表現載體，可包含可與哺乳動物細胞相容之啟動子與控制順序。於本發明之一項具體實施例中，此等調節元素可為例如在pcSD或pD16LEA29Y載體中發現之CMV啟動子，或位於piLN載體中之鳥類肉瘤病毒(ASV)。其他常用之早期與晚期啟動子包括但不限於來自猿病毒40(SV 40)者(Fiers等人,1973,Nature 273：113)，或其他病毒啟動子，譬如衍生自牛乳頭狀瘤、多瘤及腺病毒2病毒者。除了其他此項技藝中已知者之外，亦可使用可調節啟動子hMTII(Karin等人,1982,Nature 299：797－802)。關於在經培養昆蟲細胞(例如SF9細胞)中之重組蛋白質表現，一些可採用之桿狀病毒載體包括pVL系列(Lucklow,V.A.與Summers,M.D.,1989,病毒學170：31－39)與pAc系列(Smith等人,1983,Mol.Cell Biol. 3：2156－2165)。熟諳此藝之執行者亦明瞭增強子區域(在非編碼DNA區域中，啟動子區域上游或下游所發現之順序)在使表現達最佳化上亦為重要的。複製之來源若需要可採用自病毒來源，例如若利用原核細胞宿主以引進質粒DNA。但是，染色體整合為在真核細胞生物體中關於DNA複製之共同機制。
雖然於本發明之一項具體實施例中，哺乳動物宿主細胞(譬如CHO細胞)係被採用於所要蛋白質(例如融合蛋白質、糖蛋白等)之表現，但其他真核細胞生物體亦可作為宿主使用。出芽酵母釀酒酵母 (亦稱為Baker氏酵母或啤酒酵母)之實驗室菌種，可像其他酵母菌種一樣良好地使用，譬如分裂酵母粟酒裂殖酵母 。隱藏會使吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等，譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig)編碼之DNA之酵母載體，可利用Broach,Meth.Enz .101：307(1983)之2 μ複製來源，或可與酵母相容之其他複製來源(例如Stinchcomb等人,1979,Nature 282：39；Tschempe等人,1980,Gene 10：157；及Clarke等人,1983,Meth.Enz. 101：300)。被包含在酵母載體中之調節元素可為用於合成糖原酵解酵素之啟動子(Hess等人,1968,J.Adv.Enzyme Reg .7：149；Holland等人,1978,生物化學,Biochemistry 17：4900)。
熟諳此藝者亦可利用其他啟動子，其中生長條件可調節該可調節基因之轉錄，且可包括下述非限制性實例：異細胞色素C、醇去氫酶2、負責麥芽糖與半乳糖利用性之酵素、酸性磷酸酶及與氮新陳代謝作用有關聯之降解性酵素。類似哺乳動物表現系統，在酵母表現載體中之鏈終止子順序亦期望在編碼順序之3'末端處，且已被發現於3'未轉譯區域中，在酵母衍生基因中之開放譯讀骨架之後。適合在酵母中(例如在釀酒酵母中)之重組蛋白質表現之酵母載體之一些非限制性實例，包括pMFa(Kurjan與Herskowitz,(1982)Cell 30：933－943)、pJRY88(Schultz等人,1987,Gene 54：113－123)、pYepSec1(Baldari等人,1987,Embo J. 6：229－234)、pYES2(Invitrogen公司,San Diego,Calif.)，以及歸屬於酵母載體之pRS族群者。
無性繁殖系，例如細菌無性繁殖系，其含有按上述獲得之使吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等)編碼之DNA，可接著被轉染至適當宿主細胞譬如哺乳動物細胞中，供所要產物之表現。轉移感染技術係使用此項技藝中所建立適當該宿主細胞之標準技術進行，其中轉移感染技術係依所使用之宿主細胞而定。例如，哺乳動物細胞轉移感染可使用帶脂化作用、原生質體融合、DEAE－右旋醣酐所媒介之轉移感染、CaPO4 共沉澱、電擊穿孔、直接顯微注射達成，以及此項技藝中已知之其他方法，其可包括：刮削、直接吸收、滲透或蔗糖震盪、溶菌酶融合或紅血球融合，間接顯微注射，譬如經由紅血球所媒介之技術及/或經由使宿主細胞接受電流。因引進遺傳訊息至宿主細胞中之其他技術將被發展，故上文所提及轉移感染方法之清單，不被認為是無遺漏地。
使吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等)編碼之DNA在衍生自多細胞生物體(例如哺乳動物來源)之真核生物宿主細胞中之表現，係特別被使用於本發明之內文中(組織培養物,大學出版社,Cruz與Patterson編著(1973))。衍生自多細胞生物體之宿主細胞，具有疊接插入序列之能力，因此可直接用以表現基因組DNA片段。如前文陳述,可使用之宿主細胞系包括但不限於中國大頰鼠卵巢(CHO)、BHK細胞、猴子腎臟(COS)、VERO及HeLa細胞。於本發明中，係使用安定地表現吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等)之細胞系。於一項具體實施例中，哺乳動物細胞系(譬如CHO細胞系)係以含有使吾人感興趣之糖蛋白編碼之DNA順序之表現載體(例如，pcSDhuCTLA4－Ig、pD16LEA29Y等)轉染(例如藉由電擊穿孔)。於一項具體實施例中，吾人感興趣之糖蛋白可為CTLA4－Ig蛋白質，包括具有被包含在順序識別碼：2中之胺基酸順序，被順序識別碼：1中之一部份核苷酸順序編碼之CTLA4－Ig蛋白質。於另一項具體實施例中，吾人感興趣之糖蛋白可為CTLA4A29YL104E －Ig，包括具有被包含在順序識別碼：4中之胺基酸順序之CTLA4A29YL104E －Ig。
重組蛋白質，譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig，可被表現於真核生物宿主細胞中，譬如哺乳動物細胞(例如CHO、BHK、VERO或NS0細胞)、昆蟲細胞(例如使用桿狀病毒載體)或酵母細胞。熟諳此藝者可利用其他適當宿主細胞，譬如在本發明之內文中，於前文所述者。於一項具體實施例中，係採用重組融合蛋白質(譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig)之真核細胞而非原核細胞表現。真核細胞重組蛋白質，譬如人類CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig，於真核細胞譬如CHO細胞中之表現，可導致部份及/或完全糖基化作用，以及鏈內或鏈間二硫鍵之形成。關於所要蛋白質之短暫放大與表現，隱藏使吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等，譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig)編碼之DNA之載體，係藉由此項技藝中已知之轉移感染方法，被傳輸至真核細胞，而非整合至細胞之基因組中。經轉染基因之表現可在16－96小時內被度量。哺乳動物細胞(譬如COS細胞)可併用載體譬如pCDM8，以短暫地表現所要之蛋白質(Gluzman,Y.,1981,Cell 23：175－182；Seed,B.,1987,Nature 329：840)。
於此項技藝中應明瞭的是，關於哺乳動物細胞之安定轉移感染，一小部份之細胞可使DNA整合至其基因組中，且成功之整合可依所利用之表現載體與轉移感染方法而定。關於所要蛋白質之安定放大與表現，隱藏使吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等，譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104EIg )編碼之DNA之載體，係被安定地整合至真核細胞(譬如哺乳動物細胞)之基因組中，造成經轉染基因之安定表現。為確認與選擇會安定地表現使吾人感興趣之蛋白質編碼之基因之無性繁殖系，可將會使可選擇標記物(例如對抗生素之抗藥性)編碼之基因引進宿主細胞中，伴隨著吾人感興趣之基因。由熟諳此藝者使用之可選擇標記物，可為會賦予對藥物譬如G418與潮霉素之抗藥性者。會使可選擇標記物編碼之基因，可被引進個別質粒上之宿主細胞中，或可被引進相同質粒上，作為吾人感興趣之基因。含有吾人感興趣基因之細胞，可藉由藥物選擇而確認，其中已併入可選擇標記物基因之細胞，將於該藥物存在下存活，然而未曾併入可選擇標記物基因之細胞係死亡。然後，存活細胞可經篩檢，供生產所要之蛋白質(例如CTLA4－Ig蛋白質或CTLA4A29YL104E －Ig)。
如前文所述，缺乏二氫葉酸鹽還原酶(dhfr )基因表現之CHO細胞，只能夠藉由添加核苷而存活。當該細胞以隱藏dhfr 基因之DNA載體安定地轉染時，接著細胞係能夠產生必要核苷。利用dhfr 作為可選擇標記物，熟諳此藝者明瞭，於抗－新陳代謝產物胺甲喋呤存在下，dhfr 以及吾人感興趣之轉染基因(例如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig)之基因放大作用，係容易地發生。在本發明之一項具體實施例中，哺乳動物細胞，譬如CHOdhfr －細胞，係以表現載體譬如pcSDhuCTLA4－Ig(實例11－13)或pD16LEA29Y轉染，以產生細胞群集，其可被安定地放大，且可安定地表現所要之蛋白質產物(譬如個別為CTLA4－Ig或β pCTLA4A29YL104E －Ig多肽)。於另一項具體實施例中，dhfr －陰性細胞系DG44(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)可被採用於安定轉移感染。於本發明之另一項具體實施例中，轉移感染可經由電擊穿孔發生。
正如此項技藝中所容易地實施者，經轉染之哺乳動物細胞(例如dhfr －陰性CHO細胞)係於轉移感染後，被保持在含有血清之非選擇性培養基中，歷經1－2天。然後，將細胞以胰蛋白酶處理，並再覆蓋於含血清之培養基中，於選擇性壓力(例如藥物，譬如胺甲喋呤)存在下。細胞係在選擇性含血清培養基中培養2－3週，伴隨著選擇性培養基之頻繁更換，以排除碎屑與死亡細胞，直到可見及顯著菌落為止。個別菌落可接著被胰蛋白酶化，且放置在多井板中，於選擇性培養基存在下，供進一步繁殖與放大，以經由此項技藝中所建立之方法，譬如ELISA或免疫沉澱作用，確認會表現高含量所要蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等)之產生劑。在本發明之一項具體實施例中，係進行上述方法，以供轉染dhfr－陰性CHO細胞(例如DG44細胞)，以建立會表現吾人感興趣之重組蛋白質(例如CTLA4－Ig蛋白質)之安定細胞系(參閱，例如實例12－13)。於另一項具體實施例中，會表現CTLA4A29YL104 E－Ig之安定細胞系係經建立(參閱實例23)。
本發明之安定CHO細胞系會安定地表現CTLA4－Ig蛋白質分子，作為具有以下順序之CTLA4－Ig單體，(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，及(vi)順序識別碼：2之25－383。此細胞系可分泌CTLA4－Ig分子群集，該分子可以多聚體形式(譬如二聚體、四聚體等)存在，其中多聚體形式可具有順序識別碼：2之不同單體順序。被整合至此細胞系中之表現卡匣包含順序識別碼：1，且係被包含在pcSDhuCTLA4－Ig內。
本發明亦提供安定CHO細胞系，其係安定地表現CTLA4A29YL104E －Ig。於一項具體實施例中，該細胞系係表現CTLA4A29YL104E －Ig單體，其具有(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，(iv)順序識別碼：4之27－382，(v)順序識別碼：4之25－382，及(vi)順序識別碼：4之25－383之順序。於另一項具體實施例中，該細胞系可分泌CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，該分子可以多聚體形式(譬如二聚體、四聚體等)存在，其中多聚體形式可具有順序識別碼：4之不同單體順序。被整合至此細胞系中之表現卡匣包含順序識別碼：23，且係被包含在pD16LEA29Y內。
次代無性繁殖以產生細胞之無性繁殖群集
經確認為所要蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等)之產生劑之細胞，係單離自細胞培養物，且接著於生產相當條件下放大，其中培養基可含有血清。可採用此項技藝中已知之次代無性繁殖方法，譬如但不限於柔軟瓊脂無性繁殖。所獲得之安定重組細胞無性繁殖系可接著進一步在不含血清與動物產物條件下經多重化。根據本發明，表現所要蛋白質產物(例如CTLA4－Ig、CTLA4A29YL104E －Ig等)之安定細胞無性繁殖系，係經由從細胞培養物獲得重組細胞無性繁殖系而達成，該培養物係在含血清培養基中培養重組原始細胞無性繁殖系，及再配合調整此細胞至不含血清與動物產物之培養基中之後獲得。於一項具體實施例中，表現CTLA4－Ig之細胞無性繁殖系，可持續在不含血清與動物產物之培養基中培養，經過至少50世代。於本發明之另一項具體實施例中，細胞無性繁殖系可持續按前述培養，經過至少75世代。根據本發明，細胞無性繁殖系亦可持續在不含血清與動物產物之培養基中培養，經過至少100世代。
於進一步具體實施例中，表現CTLA4A29YL104E －Ig之細胞無性繁殖系可持續在不含血清與動物產物之培養基中培養，經過至少27世代。於另一項具體實施例中，細胞無性繁殖系可持續按前述培養，經過至少75世代。此外，細胞無性繁殖系可在不含血清與動物產物之培養基中培養，經過至少100世代。
於一項具體實施例中，本發明係提供一種細胞系，其會產生包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子，其中細胞系係為安定的，歷經超過100世代，且其中細胞系安定性包括：(1)在世代100下之加倍時間係低於約24.5±2.6小時；(2)在世代100下之細胞存活力係大於95%，(3)CTLA4－Ig在5－升生物反應器中之生產滴定度，在世代100下係大於1.69毫克/毫升；(4)在世代105下，對蛋白質之唾液酸莫耳比為約9.3至約11.0。
本發明之安定重組細胞無性繁殖系係以經單離形式存在，其中單離可根據此項技藝中所實施之方法發生(例如柔軟瓊脂無性繁殖或限制稀釋無性繁殖或其類似方式)。在本發明中，安定重組細胞無性繁殖系係衍生自重組哺乳動物細胞(例如CHO細胞)，其含有使吾人感興趣之重組蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等，譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig)編碼之DNA順序，其可呈懸浮或黏連方式生長。藉由本發明細胞系表現之重組蛋白質，可為治療用糖蛋白，譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig。根據本發明，衍生自真核細胞(譬如哺乳動物CHO細胞、DG44細胞或dhfr －陰性CHO細胞)之安定重組細胞無性繁殖系，其含有使重組糖蛋白譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig編碼之DNA順序，且其係能夠安定地表現重組糖蛋白，歷經數世代，係為有用的。
於本發明之一項具體實施例中，安定地表現吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等，譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig)之哺乳動物宿主細胞之群集，係在不含血清與動物產物條件下，經由使安定地經轉染之細胞放大而獲得。根據本發明，重組細胞無性繁殖系可接著經特徵鑒定，因其在不含血清且不含動物產物之培養基中係安定經過例如至少105世代。
於本發明之一項具體實施例中，細胞之無性繁殖群集會產生CTLA4－Ig分子。此CTLA4－Ig分子群集之一些特定特徵，係列示於下文表6中。CTLA4－Ig分子群集可至少包含CTLA4－Ig二聚體分子，其包含兩個單體分子，各可具有下列順序之一：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之27－382，(v)順序識別碼：2之25－382，及(vi)順序識別碼：2之25－383。因此，CTLA4－Ig分子群集可主要包含同種二聚體或異種二聚體。該群集可包含同種二聚體與異種二聚體兩者。於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其具有表6中所示之特徵或其醫藥相當物。於本文中使用之醫藥相當物係為其中分子群集對於治療病患具有安全性與功效作用形態相當於原先群集(標準群集)，如由政府機構譬如FDA所瞭解者。例如，本發明之CTLA4－Ig群集可具有表6中所示之特徵。於另一項具體實施例中，本發明之CTLA4－Ig分子群集可具有表6中所示之特徵，或其相當物，單獨或呈其任何組合或替換。
於另一項具體實施例中，吾人感興趣之無性繁殖系亦可根據所表現之重組產物及其生物化學特徵(例如CTLA4－Ig具有特定消光係數值)表現其特徵。消光係數值(亦稱為吸收率值(as ))可於理論上或實驗上衍生。於280毫微米下，CTLA4－Ig之吸收率值(as )係經測定為1.01毫升毫克－1 公分－1 ，使用Mach等人(分析生物化學，第200卷,第74－80頁,1992)之方法，如下文詳述。
方程式1係用以測定克分子吸收係數(e)。
方程式1 ：e＝[(二硫鍵數目x 134)＋(色胺酸殘基數目x 5,540)＋(酪胺酸殘基數目x 1,480)]
CTLA4－Ig具有9個二硫鍵、8個色胺酸殘基及32個酪胺酸殘基，而得克分子吸收係數(e)為92,886 M－1 公分－1 ，如方程式2所示。
方程式2 ：e＝(9 x 134)＋(8 x 5,540)＋(32 x 1,480)]＝92，886 M－1 公分－1
吸收率常數(as )係經由將克分子吸收係數(e)除以分子量計算而得，其中分子量係藉由MALDI－TOF測得，如方程式3所示：方程式3 ：as ＝e/分子量＝92,886 M－1 公分－1 /92,278 Da＝1.01毫升毫克－1 公分－1
關於兩批號之CTLA4－Ig(包含順序識別碼：2)物質之理論上衍生之吸收率值對實驗上測得之吸收率值之比較，係使用胺基酸分析進行。平均實驗上測得之吸收率常數為1.00±0.05毫升毫克－1 公分－1 。實驗值係確認1.01毫升毫克－1 公分－1 之理論值，在實驗測定之誤差內。因此，於一項具體實施例中，本發明係提供一種會產生CTLA4－Ig分子之細胞系，其具有吸收率值或消光係數為約1.00±0.05毫升毫克－1 公分－1 。
根據本發明，吾人感興趣之重組無性繁殖系亦可根據位置之數目表現其特徵，一種使吾人感興趣之蛋白質(例如融合構造物、糖蛋白等，譬如CTLA4－Ig)編碼之DNA順序係被整合至宿主細胞基因組中。熟諳此藝者明瞭，標準Southern雜化作用技術將允許此種分析。於本發明之一項具體實施例中，大約1.2 kb之單一雜化片段係在製自本發明之重組細胞無性繁殖系之基因組DNA之各Eco RI與Xba I限制消化中檢出，與CTLA4－Ig基因之預期大小一致(Southern混合種；圖21 )。該圖描繪係與質粒之單一整合位置一致，以及在CTLA4－Ig基因中沒有插入或缺失可藉由Southern雜化作用分析偵測。
於一項具體實施例中，本發明係提供能夠產生CTLA4－Ig分子之CHO細胞群集，其中群集之各細胞包含對CTLA4－Ig蛋白質進行編碼之核酸之至少30種複製物，其中30或更多種複製物係被協力整合在細胞基因組中之單一位置處，且其中細胞之群集為無性繁殖系。在其他具體實施例中，能夠產生CTLA4－Ig分子之CHO細胞群集包含一種群集，其中在群集中之至少75%、80%、85%、90%、95%或99%細胞包含對CTLA4－Ig蛋白質進行編碼之核酸之至少30種複製物。
於另一項具體實施例中，本發明係提供一種細胞系，當在根據實例14之條件下培養時，其會產生包含順序識別碼：2之CTLA4－Ig分子，在生產階段下，其量為每升細胞培養物至少1.0、1.3、1.6、1.8、2.0或2.5克CTLA4－Ig分子。
根據本發明，係產生哺乳動物細胞系(例如dhfr 陰性CHO細胞系)，其會表現所要之蛋白質(例如CTLA4－Ig蛋白質)，以致當在懸浮培養物中生長時，可產生分子之群集，其係被分泌至培養物上層清液中。此分子群集可具有例如一或多個或所有列示於表6 中之下列特徵。
根據表6，CTLA4－Ig二聚體之百分比、HMW物種(例如CTLA4－Ig多聚體，譬如四聚體)之百分比及LMW物種(例如CTLA4－Ig單體)百分比係關於CTLA4－Ig分子之群集。描述於表6 中之糖類莫耳與唾液酸莫耳係關於CTLA4－Ig總蛋白質或二聚體之莫耳。於表6 中所發現之B7結合百分比係關於藉由前文所述之表面電漿激元共振(SPR)在BIAcore儀器上進行之CTLA4－Ig結合實驗，其中百分比係為對B7結合至CTLA4－Ig對照組之比較。
於一項具體實施例中，哺乳動物細胞系(譬如dhfr 陰性CHO細胞系)產生CTLA4－Ig分子之群集，顯示來自表6 之特徵性特質編號1－5。於本發明之另一項具體實施例中，哺乳動物細胞系產生CTLA4－Ig分子之群集，具有來自表6 之特徵性特質編號1－10。在其他具體實施例中，哺乳動物細胞系產生CTLA4－Ig分子之群集顯示來自表6 之特徵性特質編號l－15。於進一步具體實施例中，在CTLA4－Ig上之自由態氫硫基量為約＝每分子0.20自由態硫醇類。
在含有藉由經轉染哺乳動物細胞(例如dhfr 陰性CHO細胞)群集所分泌之所要蛋白質(例如CTLA4－Ig蛋白質)之細胞培養物上層清液純化時，該分子群集可具有進一步特徵。除了表6 中所列示之特徵以外，此分子群集可具有例如一或多個或所有下列特徵：pH值範圍約7.0－8.0；抑制人類細胞IL－2活性達50－150%之能力；存在於最後純化產物中之單細胞向化性蛋白質(MCP－1)在＝5毫微克/毫克CTLA4－Ig二聚體或CTLA4－Ig分子下；存在於最後純化產物中之DNA濃度在＝2.5微微克/毫克CTLA4－Ig二聚體下；存在於最後純化產物中之CHO宿主細胞蛋白質在＝50毫微克/毫克CTLA4－Ig二聚體下；Triton X－100在最後純化產物中之濃度在＝1.0 ppm下；蛋白質A之量在＝5毫微克/毫克CTLA4－Ig二聚體下；細菌內毒素在最後純化產物中之量在＝0.3 EU/毫克CTLA4－Ig二聚體下；生物負載量在最後純化產物中之量在＝3.0 CFU/10毫升下。
於一項具體實施例中，單細胞向化性蛋白質(MCP－1)係存在於最後純化產物中，在＝3毫微克/毫克CTLA4－Ig二聚體或CTLA4－Ig分子下；存在於最後純化產物中之DNA濃度在＝1.0微微克/毫克CTLA4－Ig二聚體下；存在於最後純化產物中之CHO宿主細胞蛋白質在＝10毫微克/毫克CTLA4－Ig二聚體下；蛋白質A之量在＝1毫微克/毫克CTLA4－Ig二聚體下；細菌內毒素在最後純化產物中之量在＝0.15 EU/毫克CTLA4－Ig二聚體下；及生物負載在最後純化產物中之量在＝1.0 CFU/10毫升下；pH值範圍約7.2－7.8。在一項特定具體實施例中，單細胞向化性蛋白質(MCP－1)係存在於最後純化產物中，在＝1毫微克/毫克CTLA4－Ig二聚體或CTLA4－Ig分子下。於進一步具體實施例中，CTLA4－Ig分子會抑制人類細胞IL－2活性達60－140%。
於本發明之另一項具體實施例中，細胞之無性繁殖群集會產生CTLA4A29YL104E －Ig分子。此CTLA4A29YL104E －Ig分子群集之一些特定特徵，係列示於表7中。CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集可至少包含CTLA4A29YL104E －Ig二聚體分子，包含兩個單體分子，各可具有下列順序之一：(i)順序識別碼：4之26－383，(ii)順序識別碼：4之26－382，(iii)順序識別碼：4之27－383，(iv)順序識別碼：4之27－382，(v)順序識別碼：4之25－382，及(vi)順序識別碼：4之25－383。因此，CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集可主要包含同種二聚體或異種二聚體或任何其混合物。於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，具有表7 中所示之特徵，或其醫藥相當物。於本文中使用之醫藥相當物係為其中分子群集具有對於治療病患之安全性與功效作用形態相當於原先群集(標準群集)，如由政府機構譬如FDA所瞭解者。例如，本發明之CTLA4A29YL104E －Ig群集可具有表7中所示之特徵。於另一項具體實施例中，本發明之CTLA4A29YL104E －Ig分子群集可具有表7 中所示之特徵或其相當物，單獨或呈其任何組合或替換。
於一項具體實施例中，本發明係提供能夠產生CTLA4A29YL104E －Ig分子之CHO細胞群集，其中群集之各細胞包含對CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質進行編碼之核酸之至少30種複製物，其中30或更多種複製物係被協力整合在細胞基因組中之單一位置處，且其中細胞之群集為無性繁殖系。
在其他具體實施例中，能夠產生CTLA4A29YL104E －Ig分子之CHO細胞群集包含一種群集，其中在群集中之至少75%、80%、85%、90%、95%或99%細胞包含對CTLA4A29YL104E －Ig進行編碼之核酸之至少30種複製物。
於另一項具體實施例中，本發明係提供一種細胞系，當在根據圖22或實例19－20之條件中培養時，會產生包含順序識別碼：4之CTLA4A29YL104E －Ig分子，在生產階段下，其量為每升細胞培養物至少22、22.5、23、27.5或28克CTLA4A29YL104E －Ig分子。
根據本發明，係產生哺乳動物細胞系(例如dhfr 陰性CHO細胞系)，其會表現所要之蛋白質(例如CTLA4A29YL104E －Ig)，當在懸浮培養物中生長時，可產生分子之群集，其係被分泌至培養物上層清液中。此分子群集可具有例如一或多個或所有列示於表7 中之下列特徵。
根據表7 ，CTLA4A29YL104E －Ig二聚體之百分比，HMW物種(例如CTLA4A29YL104E －Ig多聚體，譬如四聚體)之百分比，及LMW物種(例如CTLA4A29YL104E －Ig單體)之百分比，係關於CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集。描述於表7中之糖類之莫耳與唾液酸之莫耳，係關於CTLA4A29YL104E －Ig總蛋白質或二聚體之莫耳。在表7 中所發現之B7結合百分比，係關於藉由前文所述之表面電漿激元共振(SPR)，在BIAcore儀器上進行之CTLA4A29YL104E －Ig結合實驗，其中百分比係為對B7結合至CTLA4A29YL104E －Ig對照組之比較。
於一項具體實施例中，哺乳動物細胞系(譬如dhfr 陰性CHO細胞系)會產生CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，顯示來自表7 之特徵性特質編號1－5。於本發明之另一項具體實施例中，哺乳動物細胞系產生CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，具有來自表7 之特徵性特質編號1－10。在其他具體實施例中，哺乳動物細胞系產生CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，顯示來自表7 之特徵性特質編號1－13。
在含有藉由經轉染哺乳動物細胞(例如dhfr 陰性CHO細胞)群集所分泌之所要蛋白質(例如CTLA4A29YL104E －Ig)之細胞培養物上層清液純化時，該分子群集可具有進一步特徵。除了表7中所列示之特徵以外，此分子群集可具有例如一或多個或所有下列特徵：存在於最後純化產物中之單細胞向化性蛋白質(MCP－1)在＝5毫微克/毫克CTLA4A29YL104E －Ig二聚體下；存在於最後純化產物中之DNA濃度在＝2.5微微克/毫克CTLA4A29YL104E －Ig二聚體下；及存在於最後純化產物中之CHO宿主細胞蛋白質在＝50毫微克/毫克CTLA4A29YL104E －Ig二聚體下。
細胞系之一般培養
根據本發明，係培養哺乳動物細胞，以產生所要之蛋白質，包括糖蛋白，如熟諳此藝者習用上所已知。會表現吾人感興趣之糖蛋白之哺乳動物細胞，應表現或被操控以表現適當酵素，以致在令人滿意之條件下，最相關於糖基化作用之轉譯後修改係發生於活體內。酵素包括添加與完成N－與O－連結之碳水化合物所必須者，譬如在Hubbard與Ivatt,Ann.Rev.Biochem. ,50：555－583(1981)中關於N－連結寡醣所述者。酵素視情況包括寡醣基轉移酶、α－葡萄糖苷酶I、α－葡萄糖苷酶II、ER α(1,2)甘露糖苷酶、Golgi氏α－甘露酶I、N－乙醯基葡萄糖胺基轉移酶I、Golgi氏α－甘露酶II、N－乙醯基葡萄糖胺基轉移酶II、α(1,6)海藻糖基轉移酶、β(1,4)半乳糖基轉移酶及適當唾液酸基轉移酶。
於細胞凋零(程式化之細胞死亡)上之延遲，可在細胞培養方法期間具有增加細胞存活力之作用。降低細胞凋零，及依次增加特定細胞之壽命，可增加蛋白質自細胞培養物之生產。細胞凋零事件可在細胞中被抑制，其方式是於細胞(譬如哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞)中引進一或多種抗細胞凋零蛋白質，其會抑制細胞中之細胞凋零，在沿著細胞凋零途徑之明確點處。抑制細胞凋零之另一種方法係為抑制前細胞凋零分子自細胞中之粒線體釋出。此項技藝中已知之前細胞凋零蛋白質之變型，譬如卡斯蛋白酶－9之優勢陰性形式，可在細胞中作為細胞凋零之抑制劑使用。此種變型蛋白質可被引進細胞中，以延遲程式化之細胞死亡。抑制細胞之細胞凋零依次會延長特定細胞產生蛋白質之時間，而造成所要蛋白質藉由特定細胞生產之整體增加。會使卡斯蛋白酶抑制劑(譬如細胞凋零之X－連結抑制劑(XIAP)或其變型)或抗細胞凋零基因(例如，Bcl－2與Bcl－xL 或其變型)編碼之數種基因，可被轉染至基因工程之哺乳動物細胞中(譬如CHO細胞、VERO細胞、BHK細胞等)(Sauerwald,T.等人,2003,Biotechnol Bioeng. 81：329－340；Sauerwald,T.等人,2002,Biotechnol Bioeng. 77：704－716；Mastrangelo,A.等人,2000,Biotechnol Bioeng. 67：544－564；Kim,N.等人,2002,J Biotechnol.95：237－248；Figueroa B.等人,2001,BiotechnolBioeng. 73：211－222)。
於一項具體實施例中，會產生重組蛋白質之哺乳動物細胞，可以含有抗細胞凋零基因(譬如bcl－2 )之載體轉染。於另一項具體實施例中，重組哺乳動物細胞可以質粒轉染，該質粒含有使卡斯蛋白酶抑制劑編碼之基因，或使如上述前細胞凋零分子之變型編碼之基因，使熟諳此藝者已知具有抗細胞凋零活性之蛋白質編碼之基因或其任何組合。
於另一項具體實施例中，所要重組蛋白質(譬如治療用蛋白質)之整體產物品質(例如提高之糖基化作用)，可被加強。為增加重組蛋白質之糖基化作用，哺乳動物細胞(例如CHO細胞、VERO細胞、BHK細胞等)可以會使一或多種酵素編碼之核酸轉染，該酵素係涉及蛋白質之糖基化作用(譬如a2,3－唾液酸基轉移酶、β 1,4－半乳糖基轉移酶等)(Weikert等人,1999,Nature Biotechnol 17：1116－21)。於一項具體實施例中，會使β 1,4－半乳糖基轉移酶編碼之質粒，可被引進會表現吾人感興趣之蛋白質之哺乳動物細胞中。於另一項具體實施例中，會使a2,3－唾液酸基轉移酶編碼之質粒，可被引進會表現吾人感興趣之蛋白質之哺乳動物細胞中。
各種培養參數可關於被培養之宿主細胞使用。哺乳動物細胞之適當培養條件係為此項技藝中所習知(Cleveland等人,J.Immunol.Methods ,56：221－234(1983))或可由熟練技師測定(參閱，例如動物細胞培養物：實用途徑第2版,Rickwood,D.與Hames,B.D.編著(牛津大學出版社：New York,1992))，及根據所選擇之特定宿主細胞而改變。
在非限制下，細胞培養基(譬如接種物培養基、進料培養基、基底培養基等)可指用於生長及/或保持細胞尤其是哺乳動物細胞之營養溶液。此等溶液一般係提供至少一種成份，來自一或多種下列種類：(1)能量來源，經常呈碳水化合物形式，譬如葡萄糖；(2)所有必須胺基酸，而經常是二十種胺基酸加上半胱胺酸之基本組合；(3)需要在低濃度下之維生素及/或其他有機化合物；(4)自由態脂肪酸或脂質，例如亞麻仁油酸；及(5)微量元素，其中微量元素係被定義為無機化合物或天然生成之元素，典型上需要在極低濃度下，經常在微莫耳濃度範圍內。營養溶液可選擇地補充一或多種成份，來自任何下列種類：(1)激素及其他生長因子，譬如血清、胰島素、鐵傳遞蛋白及表皮生長因子；(2)鹽類，例如鎂、鈣及磷酸鹽；(3)緩衝劑，譬如HEPES；(4)核苷與鹼基，譬如腺苷、胸腺核苷及次黃嘌呤；(5)蛋白質與組織水解產物，例如蛋白腖或蛋白腖混合物，其可得自純化明膠、植物物質或動物副產物；(6)抗生素，譬如健大霉素；(7)細胞保護劑，例如普洛尼克(pluronic)多元醇；及(8)半乳糖。基底培養基之實例可為細胞生長基底培養基。接種物培養基之實例可為接種細胞生長基底培養基。進料培養基之實例可為製造生物反應器進料培養基。
可利用市購可得之培養基，且包括例如最低必須培養基(HEM,Sigma,St.Louis,MO.)；Dulbecco氏變性Eagles培養基(DHEM,Sigma)；Ham氏F10培養基(Sigma)；HyClone細胞培養基(HyClone,Logan,Utah)；RPMI－1640培養基(Sigma)；及化學上定義(CD)之培養基，其係經調配，以供特定細胞類型用，例如CD－CHO培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。任何此等培養基可按需要補充先前定義之補充成份或組份，包括選用成份，在適當濃度或量下，按需要或想要而定。可與本發明一起使用之哺乳動物細胞培養物，係在適合被培養之特定細胞之培養基中製備。於一項具體實施例中，細胞培養基可為前文所提及者之一，其一般係不含來自任何哺乳動物來源之血清(例如牛胎兒血清(FBS))。於本發明之另一項具體實施例中，哺乳動物細胞培養物可在市購可得化學上定義(CD)－CHO培養基中生長，經補充表15中所指定之其他成份。於進一步具體實施例中，哺乳動物細胞培養物可在經補充表20或21中所指定之其他成份之CD－CHO培養基中生長。
本發明之方法包括許多細胞類型之培養。於本發明之一項具體實施例中，細胞為動物或哺乳動物。於另一項具體實施例中，細胞可表現與分泌大量所要之蛋白質。於本發明之另一項具體實施例中，細胞可表現與分泌大量吾人感興趣之糖蛋白至培養基中。動物或哺乳動物細胞亦可以分子方式修改，以表現與分泌吾人感興趣之蛋白質。藉由宿主細胞製成之蛋白質可為內源或類似宿主細胞。蛋白質亦可對宿主細胞為異質(例如外來)，而其中對吾人感興趣之蛋白質進行編碼之遺傳訊息係經由此項技藝中標準之方法(例如藉由電擊穿孔、轉移感染等)被引進宿主細胞中。於一項具體實施例中，哺乳動物糖蛋白可藉由中國大頰鼠卵巢(CHO)宿主細胞產生與分泌至培養基中。
在一些具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，藉由本文中所討論之製造方法製成，包括大量製造方法，其係描述於實例14中。此方法可造成高分子量(HMW)之CTLA4－Ig分子產生(例如參閱實例14與15)。於另一項具體實施例中，係提供CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集，其係藉由本文中所討論之製造方法製成，譬如大量製造方法，其係描述於實例19與20中，且示於圖22中。此方法可造成高分子量(HMW)CTLA4A29YL104E －Ig分子產生(例如參閱實例19與20)。在一些具體實施例中，HMW物種可為藉由製造方法所製成總蛋白質或二聚體之約15－25%，包括化學上定義(CD)－CHO1發酵方法。在其他具體實施例中，本發明係提供藉由CD－CHO1發酵方法所製成CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig HMW成份之單離、純化及特徵鑒定之方法。CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig HMW成份為多聚體(意即四聚體、六聚體等)，其具有比CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig二聚體較高之分子量。
能夠隱藏、表現及分泌大量吾人感興趣之糖蛋白至培養基中，以供隨後單離及/或純化之動物或哺乳動物宿主細胞，包括但不限於中國大頰鼠卵巢細胞(CHO)，譬如CHO－K1(ATCC CCL－61)、DG44(Chasin等人,1986,Som.Cell Molec.Genet ,12：555－556；Kolk ekar等人,1997,Biochemistry ,36：10901－10909；及WO 01/92337A2)、二氫葉酸鹽還原酶陰性CHO細胞(CHO/dhfr －,Urlaub與Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,77：4216)及dp12.CHO細胞(美國專利5,721,121)；藉由SV40轉變之猴子腎臟CV1細胞(COS細胞、COS－7、ATCC CRL－1651)；人類胚胎腎臟細胞(例如293細胞或經次代無性繁殖以在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人,1977,J.Gen.Virol. ,36：59)；大頰鼠嬰兒之腎臟細胞(BHK,ATCC CCL－10)；猴子腎臟細胞(CV1,ATCC CCL－70)；非洲綠猴腎細胞(VERO－76,ATCC CRL－1587；VERO,ATCC CCL－81)；老鼠賽托利氏細胞(TM4,Mather,1980,Biol.Reprod. ,23：243－251)；人類子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL－2)；犬科動物腎臟細胞(MDCK,ATCC CCL－34)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL－75)；人類肝細胞瘤細胞(HEP－G2,HB 8065)；老鼠乳房腫瘤細胞(MMT 060562,ATCC CCL－51)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL－1442)；TRI細胞(Mather,1982,Annals NY Acad.Sci. ,383：44－68)；MCR 5細胞；FS4細胞。於本發明之一方面，係利用CHO細胞，特別是CHO/dhfr －與CHO DG44細胞。
可藉由本發明方法製成之哺乳動物糖蛋白之實例，係包括但不限於細胞活素、細胞活素受體、生長因子(例如EGF、HER－2、FGF－a、FGF－β、TGF－a、TGF－β、PDGF、IGF－1、IGF－2、NGF、NGF－β)；生長因子受體，包括融合或嵌合蛋白質。其他實例包括但不限於生長激素(例如人類生長激素、牛生長激素)；胰島素(例如胰島素A鏈與胰島素B鏈)、胰島素原；促紅血球生成素(EPO)；菌落刺激因子(例如G－CSF、GM－CSF、M－CSF)；間白血球活素(例如IL－1至IL－12)；血管內皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGF－R)；干擾素(例如IFN－a、β或γ)；腫瘤壞死因子(例如TNF－a與TNF－β)及其受體，TNFR－1與TNFR－2；血栓造血素(TPO)；凝血酶；腦部利鈉尿肽(BNP)；塊凝因子(例如VIII因子、IX因子、von Willebrands因子等)；抗凝血因子；組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)，例如尿激酶或人類尿液或組織類型TPA；促卵泡成熟激素(FSH)；促黃體生成激素(LH)；降血鈣素；CD蛋白質(例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD19等)；CTLA蛋白質(例如CTLA4)；T－細胞與B－細胞受體蛋白質；骨質形態發生蛋白質(BNP，例如BMP－1、BMP－2、BMP－3等)；神經營養因子，例如骨質衍生之神經營養因子(BDNF)；神經營養素，例如3－6；腎浩素；類風濕因子；RANTES；白蛋白；弛緩素；巨噬細胞抑制性蛋白質(例如MIP－1、MIP－2)；病毒蛋白質或抗原；表面膜蛋白質；離子通道蛋白質；酵素；調節蛋白質；抗體；免疫調制蛋白質(例如HLA、MHC、B7族群)；導航受體；輸送蛋白質；超氧化歧化酶(SOD)；G－蛋白質偶合之受體蛋白質(GPCR)；神經調制劑蛋白質；阿耳滋海默氏疾病有關聯之蛋白質與肽(例如A－β)，以及其他此項技藝中已知者。可藉由本發明方法製成之適當蛋白質、多肽及肽，包括但不限於融合蛋白質、多肽、嵌合蛋白質，以及任何前文所提及蛋白質與多肽之片段或部份，或突變體、變型或類似物。
本發明方法亦可用以產生CTLA4－Ig分子，其係為順序識別碼：5、6、7、8、9或10之變型。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子可包含在殘基55(A55Y)與130(L130E)(所指稱之殘基係來自順序識別碼：2)上具有一或多個改變之單體。參閱美國公報案號US 2002/0182211 A1中所述CTLA4－Ig之變型與突變之說明，其係據此以其全文併入供參考。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig變型可包含CTLA4－Ig分子，其具有突變在CTLA－4區域內或突變在Ig區域中或其任何組合。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig變型分子包含CTLA4－Ig分子，其具有至少約70%，約75%，約80%，約85%，約90%，約95%或約99%相同於順序識別碼：5、6、7、8、9或10之胺基酸順序。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig變型分子係能夠結合至CD80或CD86。於另一項具體實施例中，該變型係能夠形成二聚體。於進一步具體實施例中，該變型顯示碳水化合物分佈形態，類似藉由未突變CTLA4－Ig分子群集所顯示者。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig變型分子具有相同潛在之N－連結與O－連結之糖基化作用位置，存在於順序識別碼：2中。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig變型分子具有相同N－連結與O－連結之糖基化作用位置，存在於順序識別碼：2中，及具有其他糖基化作用位置。突變可包括但不限於核苷酸刪除、插入、添加；胺基酸刪除、取代、添加；核酸架構位移；取代可為無論是非保守(例如甘胺酸被色胺酸取代)或保守取代(例如白胺酸用以取代異白胺酸)。
CTLA4－Ig變型分子包括但不限於CTLA4－L104EA29YIg(使用根據順序識別碼：2之殘基編號系統，CTLA4－Ll04EA29YIg於本文係被稱為CTLA4－L130EA55YIg)，以及在美國專利申請案序號09/865,321(美國公報案號US2002/0182211),60/214,065及60/287,576中；在WO 01/92337 A2中；在美國專利6,090,914,5,844,095及5,773,253中所述；及如在R.J.Peach等人,1994,J Exp Med ,180：2049－2058中所述之CTLA4－Ig變型分子。於一項具體實施例中，在本發明方法中製成之CTLA4－Ig變型分子可分泌自包含對CTLA4－Ig變型蛋白質進行編碼之表現載體之細胞。
一種CTLA4－Ig變型，L130EA55Yig，為於結構上類似CTAL4－Ig分子之基因工程融合蛋白質。L130EA55Y－Ig具有經修改人類CTLA－4之功能性胞外結合功能部位，與IgG1種類之人類免疫球蛋白之Fc功能部位。兩個胺基酸修改，白胺酸成為麩胺酸，在L104EA29Y變型之位置104(L104E)處，其係相應於順序識別碼：2之位置130，與丙胺酸成為酪胺酸，在L104EA29Y變型之位置29(A29Y)處，其係相應於順序識別碼：2之位置55，係在CTLA－4功能部位之B7結合區域中製成，以產生L130EA55Y。L130EA55Y－Ig可包含兩個同系糖基化多肽鏈，各大約45,700道爾吞，其係藉由一個鏈間二硫鍵與非共價交互作用固定在一起。使L130EA55Y－Ig編碼之DNA係在布達佩斯(Budapest)條約之條款下，以使L104EA29Y－Ig編碼之DNA，於2000年6月20日寄存於美國培養物類型收集處(ATCC)。其已給予ATCC收受號碼PTA－2104。L104EA29Y－Ig(在本申請案中係相應於L130EA55Y－Ig)係進一步描述於共待審美國專利申請案序號09/579,927,60/287,576及60/214,065，及09/865,321中，以及在WO/01/923337 A2中，其全部均以其全文併於本申請案中供參考。
與具有Ala在順序識別碼：2之胺基酸位置55處及Leu在胺基酸位置130處之CTLA4－Ig單體比較，由於重組蛋白質L130EA55Y－Ig僅在2個胺基酸(Tyr在胺基酸位置55處與Glu在胺基酸位置130處)處不同，且由於此2個突變不會影響N－或O－連結之糖基化作用，故包含L130EA55Y－Ig之CTLA4－Ig變型分子群集可具有相同分佈形態或極類似糖基化作用分佈形態，如同包含野生型CTLA4－Ig之群集。再者，與具有Ala在順序識別碼：2之胺基酸位置55處與Leu在胺基酸位置130處之CTLA4－Ig單體比較，由於重組蛋白質L130EA55Y－Ig僅在2個胺基酸(Tyr在胺基酸位置55處與Glu在胺基酸位置130處)處不同，故本發明方法應能夠產生具有類似如表6中所述特徵性特質之L130EA55Y－Ig。
本發明方法亦可用以產生CTLA4A29YL104E －Ig分子，其係為順序識別碼：11、12、13、14、15或16之變型。於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig可包含具有一或多個改變在順序識別碼：18中之單體。例如，其他CTLA4A29YL104E －Ig分子之說明係描述於美國專利申請案公報U.S.2002/0039577,U.S.2003/0007968,U.S.2004/0022787,U.S.2005/0019859及U.S.2005/0084933，以及美國專利7,094,8874中，其係據此以其全文併入供參考。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig包含一或多個突變在CTLA－4區域(順序識別碼：18)內，或一個突變在Ig區域中，或其任何組合。在其他具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子包含CTLA4A29YL104E －Ig，其具有至少約70%，約75%，約80%，約85%，約90%，約95%或約99%相同於順序識別碼：11、12、13、14、15或16之胺基酸順序。於進一步具體實施例中，如上述之CTLA4A29YL104E －Ig分子係能夠結合至CD80或CD86。於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig係能夠形成二聚體。於進一步具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig顯示碳水化合物分佈形態，類似藉由未突變CTLA4A29YL104E －Ig分子群集所顯示者。在又其他具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子具有相同潛在N－連結與O－連結之糖基化作用位置，存在於順序識別碼：4中。於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig具有相同N－連結與O－連結之糖基化作用位置，存在於順序識別碼：4中，且具有其他糖基化作用位置。突變可包括但不限於核苷酸刪除、插入、添加；胺基酸刪除、取代、添加；核酸架構位移；取代可為無論是非保守(例如甘胺酸被色胺酸取代)或保守取代(例如白胺酸用以取代異白胺酸)。
於本發明之一項具體實施例中，CTLA4－Ig變型分子之群集可藉由哺乳動物細胞(例如dhfr 陰性CHO細胞)製成，其會表現使所要蛋白質(例如L130EA55Y－Ig蛋白質或其類似物)編碼之基因，根據本發明之大量製造方法以懸浮生長。根據本發明，藉由哺乳動物細胞製成之重組CTLA4－Ig變型蛋白質，可根據本文中所述之採集參數回收。在其他具體實施例中，藉由哺乳動物細胞製成之重組CTLA4－Ig變型蛋白質，可根據本發明中所述之純化方案純化(實例15)。
於本發明之一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig分子之群集可藉由哺乳動物細胞(例如dhfr 陰性CHO細胞)製成，其會表現使所要蛋白質(例如CTLA4A29YL104E －Ig)編碼之基因，根據本發明之大量製造方法以懸浮生長。根據本發明，藉由哺乳動物細胞製成之重組CTLA4A29YL104E －Ig，可根據本文中所述之採集參數回收。在其他具體實施例中，藉由哺乳動物細胞製成之重組CTLA4A29YL104E －Ig可根據本發明中所述之純化方案純化(實例19－20)。
細胞培養物類型與一般培養方法
吾人感興趣之蛋白質，例如糖蛋白、融合蛋白質等，可經由使會表現所要蛋白質產物之細胞在多種細胞培養條件下生長而製成。熟諳此藝之執行者瞭解關於蛋白質生產之細胞培養物與培養操作可包括但不限於三種一般類型：連續培養、批次培養及餵入批次培養。在連續培養方法中，係將新鮮培養基補充物(例如進料培養基)在培養期之期間內供應至細胞，同時移除舊培養基。在連續培養期間所製成之產物，亦可例如以每日為基礎或連續地被採集。只要細胞仍然活著，且環境與培養條件係被保持著，細胞可留在培養物中，與連續培養方法中所需要之時間一樣長。
在批次培養方法中，細胞係首先在培養基中培養，且此培養基既不被置換，亦未被移除或亦未被補充。在培養操作期間或結束之前，細胞不被"餵食"新培養基，因此培養係持續直到營養物被耗盡。蛋白質產物係於培養操作結束時採集。
關於餵入批次培養方法，培養操作時間可經由在操作期間，每日(或連續地)以新培養基補充培養基一或多次而被增加。於此方法中，細胞係在培養期之期間內被供應新培養基"進料培養基"。餵入批次培養可包括前述之各種進料時間表，例如每日、每兩天、每隔一天等；每天超過一次或每天低於一次，等等。餵入批次培養亦可連續餵入進料培養基。於培養/大量生產操作結束時，係接著採集吾人感興趣之蛋白質產物。
供小－或大規模製造藉由哺乳動物宿主細胞產生之蛋白質(包括糖蛋白)之細胞培養系統，係可用於本發明之環境內。熟諳此藝者明瞭組織培養皿、轉子燒瓶及T－燒瓶，典型上係用於實驗室規模之培養方法。可用於以較大規模(例如500升、5000升、10,000升、20,000升等)培養之方法，係包括但不限於中空纖維生物反應器、流體化床生物反應器、攪拌式槽桶生物反應器系統或滾筒瓶培養。後述兩種方法可使用或未使用微載體。
此等系統可以批次、餵入批次或連續模式操作。關於生產規模培養，攪拌式槽桶生物反應器係為所選擇之系統，因其具有彈性。此等反應器可保持細胞呈懸浮，其方式是經過機械攪拌，以氣泡噴射或葉輪攪動。攪拌式槽桶生物反應器可按比例增大至大生產規模體積(例如20,000升)，且可以不同進料模式操作。此等系統係提供大表面積供細胞生長，及代謝廢物、氧及營養物之有效轉移，以及經由反應器內諸成份之連續攪拌或混合，藉由防止細胞沉降至底部，保持在整個反應器中之均質環境。關於所要糖蛋白之製造，本發明係具體化表現被保持在攪拌式槽桶生物反應器中之大規模餵入批次細胞培養物，每日餵入含有D－半乳糖之進料培養基。於另一項具體實施例中，餵入批次細胞培養物亦可被保持在攪拌式槽桶生物反應器中，每日餵入進料培養基，其含有適當濃度之對蛋白質糖基化作用重要之有限細胞培養營養物，譬如葡萄糖與麩醯胺(Chee等人,2005,Biotechnol.Bioeng. 89：164－177)。
會產生吾人感興趣蛋白質之培養物之細胞，可根據最適合特定哺乳動物宿主細胞與意欲涵蓋在內之特定生產計劃之任何方案或例行事項進行繁殖。可發展細胞培養條件，以增強哺乳動物宿主細胞群集在細胞培養物生長期中之擴大或生長，歷經使此種擴大與生長達到最大程度之時間。細胞培養物之生長期包括指數細胞生長期(例如對數期)，其中細胞主要是快速地分裂。在此時期之期間內，於存活細胞密度上之增加速率，係高於任何其他時間點下。
細胞培養條件亦可經發展，以加強細胞培養物生產期之期間內之蛋白質生產，歷經一段時間。細胞培養物之生產期包括一段時間，於此段期間內細胞生長係為固定，或係被保持在幾乎恒定程度下。存活細胞之密度係保持大約恒定，歷經特定期間。對數細胞生長已終止，且蛋白質生產在生產期之期間內係為初期活性。此時培養基通常係被補充，以支持持續之蛋白質生產，及達成所要之糖蛋白產物。
培養條件，譬如溫度、pH、溶解氧(DO2 )等，係為用於培養哺乳動物宿主細胞者，其係為熟諳此藝者所明瞭。關於培養哺乳動物宿主細胞譬如CHO細胞之適當溫度範圍，係在30至40℃之間，而於一項具體實施例中為約37℃。pH一般係經調整至約6.5與7.5間之程度，使用無論是酸或鹼。適當DO2 係在5－90%空氣飽和之間。此等培養條件可用以幫助會產生所要蛋白質或糖蛋白產物之哺乳動物細胞之培養。
哺乳動物宿主細胞群集可在生長期培養物中被擴大與生長，其中係將可自儲存移除之細胞接種至可接受用於促進生長與高存活力之培養基中。然後，可藉由添加新培養基至宿主細胞培養物中，將細胞保持在生產期中，歷經一段適當時間。在生產期之期間內，可使細胞在溫度上接受各種移轉，以加強蛋白質生產。多重溫度移轉培養方法係被描述於專利申請案中，2003年12月18日提出申請之美國專利序號10/742,564，與2003年12月18日提出申請之美國專利序號10/740,645。來自此等申請案之內容係以其全文併於本文供參考。在本發明中，包含兩個或多個溫度移轉之細胞培養方法，可造成增加留存於培養物中之存活細胞數目，直到製程或生產操作結束時。在培養物生產期之期間內，留存細胞之數目愈大，可造成較大量之蛋白質或糖蛋白產物被製成，於製程結束時增加蛋白質產物之量。
本發明之特定方面係具體化表現餵入批次大規模(例如500升、5000升、10000升等)哺乳動物細胞培養物，其係每日或以表14、15中所述之包含D－半乳糖之進料培養基餵入，以使細胞產生吾人感興趣之糖蛋白。為增加此項具體實施例中所製成蛋白質之品質，可在培養期間採用兩個或多個溫度移轉，以延長蛋白質生產期，超過當未使用溫度移轉或當只使用一個溫度移轉時所發生之情況。於另一項具體實施例中，本發明需要餵入批次大規模(例如500升、5000升、10000升等)哺乳動物細胞培養物，其係每日以表22中所述之進料培養基餵入1或多次，其包含D－半乳糖，以使細胞產生吾人感興趣之糖蛋白(例如CTLA4A29YL104E －Ig)。在培養期之期間內，亦可採用一或多個溫度移轉，以延長蛋白質生產期，超過當未使用溫度移轉時所發生之情況，以增加糖蛋白之品質。或者，可添加右旋醣酐硫酸鹽至培養物，且伴隨溫度移轉。
重組蛋白質在生物反應器中之大量製造
本發明係提供真核細胞之習用攪拌式槽桶生物反應器培養(例如20000升細胞培養體積)之方法，特別是為產生大規模或工業量之所要蛋白質產物，其係被此種細胞表現。此培養方法係為呈懸浮生長之真核細胞之餵入批次培養方法，伴隨著培養物上層清液之採集，其中表現吾人感興趣之蛋白質之真核細胞，例如哺乳動物細胞，係分泌所要之蛋白質產物至培養基中。
關於哺乳動物細胞之大規模培養之方法，特別是為產生被此種細胞表現之大量所要蛋白質產物，係具體表現於本發明中。此方法可藉由一些步驟進行，包括：(i)接種細胞至含有不含血清培養基之接種培養容器(例如，T－175燒瓶)中，並使接種培養物(例如用以接種較大體積之起始培養物)繁殖，至少直到細胞達成最低交叉接種密度為止，而其中該密度係為細胞在後續培養體積中足夠繁殖所必須之預定值；(ii)轉移經繁殖接種培養物至含有缺乏動物衍生成份之培養基之較大培養容器(例如滾筒瓶或細胞袋)中，以擴大培養物；(iii)轉移經擴大之接種培養物至含有不含血清培養基之大規模培養容器中，以進一步繁殖至細胞培養物；及(iv)保持大規模培養物在缺乏動物衍生成份之培養基中，至少直到該細胞達成標的密度或顯示特定生物化學特徵為止。
在一些具體實施例中，此方法可包括步驟(v)，採集培養基，且以新培養基置換該培養基。
在其他具體實施例中，大規模培養哺乳動物細胞之方法可藉由一些步驟進行，包括：(i)接種細胞至含有不含血清培養基(例如接種培養基)之接種培養容器(例如T－175燒瓶)中，並使接種培養物(例如，用以接種較大體積之起始培養物)繁殖，至少直到細胞達成最低交叉接種密度為止，而其中該密度係為細胞在後續培養體積中足夠繁殖所必須之預定值；(ii)轉移經繁殖接種培養物至含有缺乏動物衍生成份之培養基(例如接種物培養基)之較大培養容器(例如滾筒瓶或細胞袋)中，以擴大培養物；(iii)轉移經擴大之接種培養物至含有不含血清培養基(例如基底培養基)之大規模培養容器(譬如1000－升生物反應器)中，以進一步繁殖至細胞培養物；及(iv)保持大規模培養物在缺乏動物衍生成份之培養基(例如進料培養基)中，至少直到該細胞達成標的密度或顯示特定生物化學特徵為止。
在本發明之一些具體實施例中，方法可包括以下步驟：(v)採集培養基，並以新培養基置換用過之培養基。
本發明係可應用於任何細胞類型，在缺乏動物衍生成份之培養基之任何調配物中，以產生大規模量之所要蛋白質產物，且可利用下列兩種方法之任一個或其變型：a)微載體方法，或b)懸浮細胞方法。細胞例如哺乳動物細胞之培養，可利用任一種方法，在兩個不同時期中操作，生長期與生產期。於本發明之另一項具體實施例中，含有動物衍生之成份(一些非限制性實例為牛血清白蛋白(BSA)或FBS)之培養基之任何調配物，亦可被採用，以按上述產生大規模蛋白質量。
熟諳此藝者明瞭微載體方法，不限於標準微載體方法或灌注微載體方法，可用於細胞培養，其中細胞係被連接至及/或固定於巨孔性載體中。在標準微載體方法中，細胞係被接種至含有不含血清培養基之接種培養容器中，且繁殖直到細胞達成最低接種密度為止。接著，經繁殖之接種培養物係被轉移至含有不含血清培養基與微載體之大規模培養容器中。在此生長期中，係使細胞生長於微載體上，直到載體完全被移殖為止，例如在使用巨孔性載體之方法之情況中，經由細胞潛移至載體中。
培養基交換可當微載體沉降至培養容器底部時發生，然後移除預定百分比之槽桶體積，並將相應百分比槽桶體積之新培養基添加至容器中。然後，使微載體再懸浮於培養基中。熟練技師明瞭培養基移除與置換之程序可在預定間隔下重複，例如每24小時，而其中被置換培養基之量係依細胞密度而定，且典型上可為槽桶體積之25%至80%。於槽桶中之60－95%槽桶培養基，當細胞密度達成適合蛋白質表現之預定值時，可每24小時更換。熟諳此藝者亦經常在整個生產期中使用前述培養基交換%值。
在生產期之期間內，培養基可被交換，其方式是允許微載體沉降至槽桶底部，然後將所選擇%之槽桶體積移除，並將相應%槽桶體積，例如前文所述60－95%之新培養基添加至容器中。然後，使微載體再懸浮於培養基中，且培養基移除與置換程序可每日重複。
微載體灌注方法係類似標準微載體方法，且亦在生長/擴大與生產期中操作。於兩種方法間之主要差異是採用此方法以更換培養基。限定量之槽桶體積，例如60－95%之總槽桶體積，在標準微載體方法中係全部立即更換，而在灌注方法中，培養基係連續地添加。基本上，%槽桶體積培養基係逐漸更換，歷經預定長度之時間，同時微載體係利用分離裝置(或灌注裝置)被保持在容器中，該裝置係允許培養基離開容器，但保留微載體在槽桶內。於此方法中之生長期係如關於標準微載體方法所述，惟關於逐漸培養基交換除外。
關於懸浮細胞方法之兩個非限制性選項，包括懸浮細胞灌注方法與懸浮細胞批次方法。在灌注方法中，於培養基中之細胞係自由地懸浮，未被固定於載體中，且類似微載體方法，可在兩個不同時期(例如生長期與生產期)中操作。在懸浮細胞灌注方法生長期之期間內，係使細胞接種至含有不含血清培養基之接種培養容器中，且繁殖直到細胞達成標的交叉接種密度為止。經繁殖之接種培養物可接著被轉移至大規模培養容器中，其含有缺乏動物衍生成份之培養基，且繁殖直到達成適合蛋白質表現之預定細胞密度值為止。進行培養容器以新培養基之連續灌注，以執行培養基交換方法。
在此懸浮細胞批次方法中，細胞培養可經由下列非限制性格式進行：a)簡易批次方法，或b)餵入批次方法。在簡易批次方法中，係將細胞接種至含有缺乏動物衍生成份之培養基之接種培養容器中，且繁殖直到細胞達成預定交叉接種密度為止。接著，經繁殖之接種培養物係被轉移至含有不含血清培養基之大規模培養容器中，且操作培養容器，直到培養基中之營養物已被耗盡為止。在餵入批次方法中，餵入營養物之濃溶液(例如進料培養基)至槽桶，可延長營養物供應在此培養方法之培養基中，因此延長此製程時間，且最終導致增加所要蛋白質在培養容器內之產生。添加進料培養基之方法可以改變。其可無論是以單一脈動大丸劑添加(一天一次、兩次、三次等)，或可逐漸地在整個24－小時期間餵入。此進料允許細胞在大規模培養容器中被繁殖，且培養基，其可含有吾人感興趣之經分泌蛋白質產物，係在任何營養物變得耗盡之前，於操作結束時被採集。代替從容器移除所有內含物，熟諳此藝者可僅移除一部份槽桶體積(可為約80%)。
餵入批次方法之一個選用方面，係為溫度移轉之使用。於此方法中，在生產期之期間內被採用作為操作溫度之溫度，係低於生長期之期間內所使用之溫度。關於餵入批次方法，例如本發明中所使用之方法，該溫度範圍可包括最初生長期，在適合特定使用中細胞系生長之溫度下，接著在預定細胞密度下降低操作溫度。
於一項具體實施例中，關於大規模餵入批次培養製程之方法，係包括下述：(i)接種細胞至含有不含血清培養基之接種培養容器(例如T－175燒瓶)中，且在適合生長之溫度下繁殖接種培養物，至少直到細胞達成預定交叉接種密度為止；(ii)轉移經繁殖接種培養物至含有缺乏動物衍生成份之培養基之較大培養容器(例如滾筒瓶或細胞袋)，以在適當溫度下擴大培養物；(iii)轉移經擴大之接種培養物至含有不含血清培養基之大規模培養容器中，以在適當溫度下進一步繁殖至細胞培養物；及(iv)在適合蛋白質表現之降低溫度下，於缺乏動物衍生成份之培養基中，保持大規模培養物，伴隨著藉由新進料培養基之每日置換，至少直到該細胞達成標的密度或臨界時間長度為止。
在(iv)中以新進料培養基置換之步驟，可能需要移除預定體積，例如槽桶體積之80%，並將其以相同體積之新進料培養基置換。
於進一步具體實施例中，關於大規模餵入批次培養製程之方法，係包括下述：(i)接種細胞至含有不含血清培養基之接種培養容器(例如T－175燒瓶)中，且在適合生長之溫度下繁殖接種培養物，至少直到細胞達成預定交叉接種密度為止；(ii)轉移經繁殖接種培養物至含有缺乏動物衍生成份之培養基之較大培養容器(例如滾筒瓶或細胞袋)中，以在適當溫度下擴大培養物；(iii)轉移經擴大接種培養物至含有不含血清培養基之大規模培養容器(例如1000升生物反應器)中，以在適當溫度下進一步繁殖至細胞培養物；及(iv)在適合蛋白質表現之降低溫度下，於缺乏動物衍生成份之培養基中，保持大規模培養物，伴隨著藉由新進料培養基之每日置換，至少直到該細胞達成標的密度或臨界時間長度為止。
在(iv)中以新進料培養基置換之步驟，可能需要移除預定體積，例如約80%槽桶體積，並將其以相同體積之新進料培養基置換。
在本發明之一項具體實施例中，於餵入批次方法中培養之細胞係為哺乳動物細胞，例如CHO細胞，其會表現所要之蛋白質產物。哺乳動物細胞係被接種至含有不含血清培養基例如CD－CHO培養基(實例13)之接種培養容器(例如T－175燒瓶)中，且在適合生長之溫度下，例如在約35－39℃下繁殖3－4天，直到細胞達成預定交叉接種密度(例如具有＝6.0 x 106 個存活細胞，或其中最後培養物存活力＝80%)為止。經繁殖之接種培養物係接著被轉移至含有缺乏動物衍生成份之培養基之大培養容器(例如滾筒瓶)中，以在適當溫度下(例如在約35－39℃下)擴大約3－4天。細胞培養物係進一步在含有不含血清培養基例如CD－CHO培養基之較大培養容器(例如20升細胞袋、100升細胞袋等)中，於適合生長之溫度例如在約35－39℃下，擴大3－4天，直到細胞達成標的接種密度(例如具有＝1－2 x 106 個存活細胞/毫升或其中最後培養物存活力＝80%)為止。於一項具體實施例中，接種物擴大係涉及最少4個繼代。於本發明之另一項具體實施例中，接種物擴大需要不超過20個繼代。
經擴大之接種培養物可接著用以接種含有不含血清培養基(例如CD－CHO培養基)之大規模培養槽桶(例如1000升、4000升生物反應器等)，以在適當溫度例如在約35－39℃下，進一步繁殖細胞培養物3－6天，直到細胞達成標的接種密度(例如具有＝1－2 x 106 個存活細胞/毫升，或其中最後細胞培養物存活力＝80%)為止。大規模培養物(例如10,000升、15,000升、20,000升培養物，在生物反應器及其類似物中)係接著被保持在不含血清培養基中，其中培養基為進料培養基(例如eRDF培養基，實例14)，在溫度低於適合蛋白質表現與產生經分泌蛋白質產物之生長溫度下(例如在於或約33－35℃下，歷經3－4天，及在於或約31－33℃下，歷經6－8天)。進料培養基係以新進料培養基每日置換，而其中槽桶以新進料培養基置換需要移除預定體積，例如80%之槽桶體積，並將此槽桶以相同體積之新進料培養基置換。商業規模培養物係被保持直到該細胞達成製造參數之標的值，其可為但不限於時間長度、標的細胞密度或生物化學蛋白質特徵(譬如NANA莫耳比，如前文所述)，其中存活細胞密度可為3.0－8.0 x 106 個細胞/毫升；NANA莫耳比可為＝6.0；最後細胞培養物存活力可為＝30%；及最後蛋白質產物滴定度可為＝0.5克/升)。
在本發明之一項特定具體實施例中，於餵入批次方法中培養之細胞為哺乳動物細胞，例如CHO細胞，其會表現所要之蛋白質產物(例如CTLA4－Ig分子)。CHO細胞係被接種至含有不含血清培養基例如CD－CHO培養基之接種培養容器(例如T－175燒瓶)，且在適合生長之溫度下，例如在約37℃下，繁殖3－4天，直到細胞達成預定交叉接種密度(例如具有＝10.0x106 個存活細胞，或其中最後培養物存活力＝84%)為止。經繁殖之接種培養物係接著被轉移至含有缺乏動物衍生成份之培養基之大培養容器(例如滾筒瓶)中，以供在適當溫度(大約37℃)下擴大約4天。細胞培養物係在含有不含血清之培養基例如CD－CHO培養基之較大培養容器(例如20升細胞袋、100升細胞袋等)中，於適合生長之溫度下(例如在約37℃下)，進一步擴大4天，直到細胞達成標的接種密度(例如具有＝1－2 x 106 個存活細胞/毫升，或其中最後培養物存活力＝91%)為止。接種物擴大可涉及最少7個繼代。
經擴大之接種培養物係接著用以接種含有不含血清培養基(例如CD－CHO培養基)之大規模培養槽桶(例如4000升生物反應器等)中，以在適當溫度例如在約37℃下，進一步繁殖細胞培養物5－6天，直到細胞達成標的接種密度(例如具有＝1－2 x 106 個存活細胞/毫升，或其中最後細胞培養物存活力＝86%)。商業規模培養物(例如20,000升培養物，在生物反應器中)係接著被保持在不含血清培養基中，其中培養基為進料培養基(例如eRDF培養基)，在溫度低於適合蛋白質表現與產生經分泌蛋白質產物(例如CTLA4－Ig)之生長溫度下。商業規模培養物係首先被降低，從約37℃至約34℃，歷經4天，然後使其接受第二個溫度移轉，其方式是降低溫度，從約34℃至約32℃，歷經8天。進料培養基係以新進料培養基每日置換，而其中在生物反應器槽桶中置換進料培養基需要移除預定體積，例如80%之槽桶體積，並將其以相同體積之新進料培養基置換。商業規模係被保持直到該CHO細胞及/或經分泌之蛋白質產物達成下列非限制性製造參數之標的值為止：存活細胞密度為4.0－7.0 x 106 個細胞/毫升；NANA莫耳比＝8.0；最後細胞培養物存活力＝38%；及最後蛋白質產物滴定度＝0.6克/升。
於本發明之另一項具體實施例中，在餵入批次方法中培養之細胞為哺乳動物細胞，例如CHO細胞，其會表現所要之蛋白質產物。哺乳動物細胞係被接種至含有不含血清培養基例如CD－CHO培養基(實例19)之接種培養容器(例如T－175燒瓶)中，且在適合生長之溫度例如約35℃至約39℃下，繁殖約3－4天；或約36℃至約38℃，歷經大約至高達約4天，直到細胞達成預定交叉接種密度(例如具有細胞密度大於或等於1.5 x 106 ，或其中最後培養物存活力係大於或等於約80%)為止。然後，將經繁殖之接種培養物轉移至含有缺乏動物衍生成份之培養基之大培養容器(例如滾筒瓶)中，以在適當溫度(例如約35℃至約39℃，或約36℃至約38℃)下擴大約3－4天或至高達約4天。細胞培養物係在含有不含血清培養基例如CD－CHO培養基之較大培養容器(例如20升細胞袋、100升細胞袋等)中，於適合生長之溫度，例如約35℃至約39℃，或約36℃至約38℃下，進一步擴大約3－4天或至高達約4天，直到細胞達成標的接種密度(例如具有至少約1.5x106 個存活細胞/毫升，或其中最後培養物存活力係大於或等於80%)為止。於一項具體實施例中，接種物擴大係涉及最少4個繼代。於本發明之另一項具體實施例中，接種物擴大需要不超過20個繼代。在一些具體實施例中，CD－CHO培養基為CD－CHO接種物培養基。
經擴大之接種培養物可接著用以接種含有不含血清培養基(例如CD－CHO培養基，譬如CD－CHO接種物培養基及/或CD－CHO基底培養基)之大規模培養槽桶(例如1000升、4000升生物反應器等)，以進一步繁殖細胞培養物，在適當溫度下，例如約35℃至約39℃，或約36℃至約38℃，歷經約3至約6天，或歷經約4至約5天，或歷經約4.7天，或歷經低於或等於約113小時，直到細胞達成標的接種密度(例如具有約2.3x106 個存活細胞/毫升，或其中最後細胞培養物存活力為至少約88%)為止。
商業規模培養物(例如10,000升、15,000升、20,000升、30,000升培養物，在生物反應器及其類似物中)係接著被保持在不含血清培養基中，其中培養基為進料培養基(例如eRDF培養基，實例19 )，在適合蛋白質表現與產生經分泌蛋白質產物之約35℃至約39℃之溫度下，歷經約3至約6天或約4至約5天。或者，多陰離子性化合物(例如右旋醣酐硫酸鹽)可被添加至被保持在不含血清培養基中之培養物內，其中培養基為進料培養基(例如eRDF培養基，實例19 )，如下文及在美國專利案號2005/0019859中所述者，其係據此以其全文併入供參考。培養可伴隨接受降低之單步驟溫度(例如在於或約32℃，至在於或約36℃，歷經約3至約14天，或歷經約10至約13天，或歷經約234至約304小時)。
於本發明之一項具體實施例中，培養亦可伴隨接受降低之多步驟溫度(例如在於或約33℃至在於或約35℃，歷經約3－6天，及在於或約31℃至在於或約33℃，歷經約6－8天)。上述處理係適合蛋白質表現與產生經分泌蛋白質產物。
在上述情況中之進料培養基可每日(每日1、2、3次)或每隔數天以新進料培養基置換。槽桶以新進料培養基置換，需要移除預定體積，例如80%之槽桶體積，並將此槽桶以相同體積之新進料培養基置換。商業規模培養物係被保持直到該細胞達成製造參數之標的值為止，其可為但不限於時間長度、標的細胞密度或生物化學蛋白質特徵(譬如NANA莫耳比，如前文所述)，其中存活細胞密度可為3.0－8.0 x 106 個細胞/毫升；NANA莫耳比可為＝5.0，或約6，或約5.2至約7.6；最後細胞培養物存活力可為大於或等於約30%或大於或等於約37%；及最後蛋白質產物滴定度可為約0.46至約0.71克/升，大於或等於0.5克/升，或大於或等於20克/升。
根據本發明，係提供一種涉及延遲添加多陰離子性化合物之細胞培養方法。此方法包括在接種後之某一時間添加多陰離子性化合物至細胞培養物(例如在培養方法之生長期之期間內或生產期之期間內)。延遲添加多陰離子性化合物係達成增加之細胞存活力。於一項具體實施例中，本發明係針對細胞培養方法，其包括培養會表現吾人感興趣之蛋白質之宿主細胞，及在接種後之某一時間添加多陰離子性化合物至細胞培養物。
多陰離子性化合物包括但不限於右旋醣酐硫酸鹽(可得自Sigma－Aldrich,St.Louis,Mo.)、肝素(可得自Sigma－Aldrich)、硫酸乙醯肝素(可得自Sigma－Aldrich)、甘露聚糖硫酸鹽、硫酸軟骨素(可得自Sigma－Aldrich)、硫酸皮膚素(可得自Sigma－Aldrich)、硫酸角質素(可得自Sigma－Aldrich)、玻尿酸鹽(可得自Sigma－Aldrich)、聚(乙烯基硫酸鹽)(可得自Sigma－Aldrich)、κ－角叉菜膠(可得自Sigma－Aldrich)及蘇拉明(suramin)(可得自Sigma－Aldrich)。此等化合物易於得自所列示之來源，或可容易地經過熟諳此藝者已知之方式獲得。此等化合物經常以鹽形式取得，包括但不限於鈉鹽，但亦可以非鹽形式使用。多陰離子性化合物包括其所有形式，包括但不限於鹽形式，譬如鈉鹽。
本發明多陰離子性化合物之特別有用非限制性實例包括多硫酸化之化合物：右旋醣酐硫酸鹽、肝素、硫酸乙醯肝素、甘露聚糖硫酸鹽、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、聚(乙烯基硫酸鹽)、κ角叉菜膠及蘇拉明(suramin)。於一項具體實施例中，多陰離子性化合物為右旋醣酐硫酸鹽。右旋醣酐硫酸鹽可具有平均分子量為5,000至500,000 Da。於本發明之另一項具體實施例中，係使用具有分子量為5,000 Da之右旋醣酐硫酸鹽。
根據本發明之方法，可在所指定之細胞培養期之期間(例如於接種後之某一時間，譬如在生長期或生產期之期間內)，將多陰離子性化合物添加至細胞培養物中一次、兩次、三次或任何次數。一或多種多陰離子性化合物可搭配使用。例如，多陰離子性化合物之任何特定單次添加可包括添加一或多種其他多陰離子性化合物。同樣地，若有多陰離子性化合物之一次以上添加，則不同多陰離子性化合物可在不同添加下添加。其他化合物與物質，包括多陰離子性化合物，可在添加多陰離子性化合物之前、伴隨著或之後，被添加至培養物中，無論是在所指定時期之期間或不在該期間。在一項特定具體實施例中，有多陰離子性化合物之單一例如一次添加。於另一項具體實施例中，係添加一種多陰離子性化合物。
多陰離子性化合物可藉任何方式被添加至細胞培養物中。添加多陰離子性化合物之方式，包括但不限於溶於水中、溶於培養基中、溶於進料培養基中、溶於適當培養基中及呈其被獲得之形式。特定言之，多陰離子性化合物係經溶於水中添加。根據本發明，係添加多陰離子性化合物，以使在培養物中之濃度來到適當程度。作為非限制性實例，多陰離子性化合物係被添加至濃度為1－1000毫克/升，1－200毫克/升，1－100毫克/升或25－75毫克/升。被添加至細胞培養物中之多陰離子性化合物之特別有用濃度，包括但不限於約25－200毫克/升；約25－100毫克/升；及50－100毫克/升。於本發明之一項具體實施例中，被添加至培養物中之多陰離子性化合物濃度係為約50毫克/升。於另一項具體實施例中，被添加至培養物中之多陰離子性化合物濃度係為約100毫克/升。
本發明方法係提供培養物可於添加多陰離子性化合物後被操作歷經任何時間之長度。培養操作時間可由熟諳此藝者測定，以有關聯之因素為基礎，譬如可回收蛋白質之量與品質，及在由於細胞溶解所形成之上層清液中污染細胞物種(例如蛋白質與DNA)之含量，其將使吾人感興趣蛋白質之回收複雜化。在細胞培養方法之一些具體實施例中，多陰離子性化合物係在接種後之某一時間(例如，在細胞培養方法生長期之期間內，或在細胞培養方法生產期之期間內)添加。多陰離子性化合物係在接種後之某一時間添加，意即在於或大約生長期結束期間。特定言之，多陰離子性化合物係在接種後之某一時間添加，意即在生產期之期間內，例如在生產期展開時。
在本發明之一項特定具體實施例中，於餵入批次方法中培養之細胞係為哺乳動物細胞，例如CHO細胞，其會表現所要之蛋白質產物(例如CTLA4A29YL104E －Ig分子)。CHO細胞係被接種至含有不含血清培養基例如CD－CHO培養基(譬如CD－CHO接種物培養基)之接種培養容器(例如T－175燒瓶)中，且在適合生長之溫度例如在約37℃下，繁殖約3－4天，直到細胞達成預定交叉接種密度(例如具有＝1.5x106 個存活細胞，或其中最後培養物存活力＝80%)為止。經繁殖之接種培養物係接著被轉移至含有缺乏動物衍生成份之培養基之大培養容器(例如滾筒瓶)，以供在適當溫度下(在約37℃下)擴大約4天。細胞培養物係在含有不含血清之培養基例如CD－CHO培養基(譬如CD－CHO接種物培養基)之較大培養容器(例如20升細胞袋、100升細胞袋等)中，於適合生長之溫度下(例如在約37℃下)，進一步擴大約4天，直到細胞達成標的接種密度(例如具有＝1.5x106 個存活細胞，或其中最後培養物存活力＝80%)為止。接種物擴大可涉及最少7個繼代。
經擴大之接種培養物係接著用以接種含有不含血清培養基(例如CD－CHO培養基，譬如CD－CHO基底培養基)之大規模培養槽桶(例如1000－升、4000－升生物反應器等)，以在適當溫度例如在約37℃下，進一步繁殖細胞培養物約5－6天，直到細胞達成標的接種密度(例如具有約2.3x106 個存活細胞/毫升，或其中最後細胞培養物存活力＝88%)為止。商業規模培養物(例如10,000升、15,0000升或20,000升培養物等，在生物反應器中)係接著被保持在不含血清培養基中，其中培養基為進料培養基(例如eRDF培養基)，在溫度低於適合蛋白質表現與產生經分泌蛋白質產物(例如CTLA4A29YL104E －Ig)之生長溫度下。
商業規模培養物係被降低，例如從約37℃至約34℃，歷經約4天。當溫度被降低時，多陰離子性化合物可被伴隨添加至培養物中。或者，商業規模培養物係被降低，從約35℃－37℃至約32℃－36℃，歷經約12天，且當溫度被降低時，多陰離子性化合物係被伴隨添加至培養物中。
在上述情況中之進料培養基可每日(每日1、2、3次)或每隔數天，以新進料培養基置換。槽桶以新進料培養基置換需要移除預定體積，例如80%之槽桶體積，並將此槽桶以相同體積之新進料培養基置換。於一項具體實施例中，進料培養基係每日添加，歷經約2至3天，直到例如葡萄糖濃度下降至1克/升為止。於另一項具體實施例中，進料培養基係每8小時添加，例如一旦葡萄糖濃度已達到1克/升時。商業規模係被保持，直到該CHO細胞及/或經分泌之蛋白質產物達成下述非限制性製造參數之標的值為止：NANA莫耳比為約6.0，或約5.2至約7.6；最後細胞培養物存活力＝37%；及最後蛋白質產物滴定度為約0.46至約0.71克/升。
在本發明之一項具體實施例中，被培養之細胞可為哺乳動物細胞或已建立之哺乳動物細胞系，包括但不限於CHO(例如ATCC CCL 61)、HEK293(例如ATCC CRL 1573；Graham等人,J.Gen.Virol. 36：59－72,1977)、COS－1(例如ATCC CRL 1650)、DG44(CHO細胞系)(Cell ,33：405,1983，及體細胞與分子遺傳學12：555,1986)及大頰鼠嬰兒腎臟(BHK)細胞系。其他可使用之非限制性實例為骨髓細胞瘤、3T3細胞、Namalwa細胞及骨髓細胞瘤與其他細胞之融合物。在一些具體實施例中，細胞可為突變或重組細胞，例如會表現不同範圍酵素(相較於其被衍生之細胞類型)之細胞，該酵素會催化蛋白質之轉譯後修改(例如，處理酵素，譬如前肽，或糖基化作用酵素，譬如糖基轉移酶及/或糖苷酶)。於本發明一個特定方面，係特別使用CHO/dhfr －細胞。
用於擴大細胞培養物之培養容器，可為但不限於Erlenmyer燒瓶、T－175燒瓶、滾筒瓶及細胞袋。大規模培養容器可為例如空氣提升反應器，其中攪拌係利用從容器底部引進空氣而獲得，或習用攪拌式槽桶反應器(CSTR)，其中攪拌係利用習用葉輪類型獲得。其中在所指定範圍內控制之參數係為溫度、pH及溶解氧張力(DOT)。在此系統中之溫度控制媒質為水，且可按需要被加熱或冷卻。可使水通過被浸沒在細胞培養基中之管件線圈，或經過圍繞容器之夾套。例如，當需要時，pH可藉由添加鹼至細胞培養基中而被調整，或藉由改變頭部空間氣體中之CO2 濃度。DOT可經由以純氧或空氣或其混合物噴射而被保持。
因此，本發明係提供一種產生重組蛋白質之方法，此方法包括至少兩個步驟：(a)擴大哺乳動物細胞，其會從接種培養物分泌重組蛋白質(意即哺乳動物細胞不會於正常情況下表現或過度表現之蛋白質，其中重組蛋白質係經由已被轉染至細胞或細胞之母體中之表現載體或構造物，而被表現於細胞中)到至少10,000升之液體培養物中，與(b)自該至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質。於一項具體實施例中，可使用此方法，以致在蛋白質自液體培養物純化之前，重組蛋白質係在每升液體培養物至少0.5克之濃度下產生。於另一項具體實施例中，根據本發明之方法可用以產生重組蛋白質，在蛋白質自液體培養物純化之前，於每升液體培養物至少約0.46至約0.71克之濃度下。
於一項具體實施例中，擴大步驟可涉及(i)在不含血清之培養基中培養細胞，具有至少四個繼代，以獲得細胞密度為每毫升至少約1.0 x 105 個存活細胞，與(ii)保持細胞在培養物中，歷經足以產生至少約0.5克/升重組蛋白質之時間。於一項具體實施例中，繼代之數目不超過36個繼代。於另一項具體實施例中，繼代之數目可超過36個繼代，其中細胞於世代上關於對重組蛋白質進行編碼之核酸之複製物數目、細胞存活力及加倍時間係為安定的。
足以產生至少約0.5至約1.3克/升重組蛋白質之時間，可為任何時間量，只要細胞存活力不會落至低於5%、10%、25%、30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%及/或只要細胞世代之數目不超過50、75、100、105或125個世代即可。保持步驟亦可包括溫度移轉步驟，譬如降低培養溫度，首先從37±2℃至34±2℃，及在稍後時間從34±2℃至32±2℃。32±2℃之溫度可被保持至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、30、50或100天。32±2℃之溫度可被保持至少20、50、75或100個細胞世代。32±2℃之溫度可被保持直到培養物之細胞密度為每毫升液體培養物約30至約100 x 105 個細胞為止。
在其他具體實施例中，本發明係提供一種產生重組蛋白質之方法，此方法包括至少以下步驟：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞，從接種培養物擴大到至少10,000升之液體培養物中，以致重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質，此時液體培養物：(i)含有每莫耳蛋白質(於此情況中為糖蛋白)大於或等於約6.0莫耳NANA；(ii)具有細胞密度為每毫升約33至約79 x 105 個細胞；(iii)在液體培養物中之細胞存活力係不低於約38%或係大於或等於約38%；(iv)內毒素係為每毫升液體培養物低於或等於約76.8EU；及/或(v)生物負載量係為每毫升液體培養物低於1個菌落形成單位。
於進一步具體實施例中，擴大步驟可涉及(i)在不含血清之培養基中培養細胞，具有至少四個繼代，以獲得細胞密度為每毫升至少約1.0 x 106 個存活細胞，與(ii)保持細胞在培養物中，歷經足以產生每升液體培養物至少約0.46至約0.71克重組蛋白質之時間。於一項具體實施例中，繼代之數目不超過36個繼代。於另一項具體實施例中，繼代之數目可超過36個繼代，其中細胞於世代上關於對重組蛋白質進行編碼之核酸之複製物數目、細胞存活力及加倍時間係為安定的。
足以產生約0.46至約0.71克/升重組蛋白質之時間，可為任何時間量，只要細胞存活力不會落至低於5%、10%、25%、30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%及/或只要細胞世代之數目不超過27、50、75、100、105或125個世代即可。保持步驟亦可包括溫度移轉步驟，譬如降低培養溫度，首先從37±2℃至34±2℃。34±2℃之溫度可被保持至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、30、50或100天。或者，保持步驟可為溫度移轉步驟，譬如降低培養溫度，從37±2℃至34±2℃。
當溫度降低開始時，多陰離子性化合物可被添加至培養物中。被添加至培養物中之多陰離子性化合物濃度可為約1毫克/升，5毫克/升，10毫克/升，12.5毫克/升，15毫克/升，25毫克/升，50毫克/升，75毫克/升，100毫克/升，200毫克/升，250毫克/升，500毫克/升，750毫克/升或1000毫克/升。32±2℃之溫度可被保持至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、30、50或100天。34±2℃之溫度可被保持至少20、27、50、75或100個細胞世代。
在進一步具體實施例中，本發明係提供產生重組蛋白質之方法，此方法包括至少以下步驟：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞，從接種培養物擴大到至少10,000升之液體培養物中，以致重組蛋白質濃度為每升液體培養物至少約0.46至約0.71克；與(b)自至少10,000升液體培養物之培養物單離重組蛋白質，此時液體培養物：(i)含有每莫耳蛋白質(於此情況中為糖蛋白)約6莫耳NANA；(ii)在液體培養物中之細胞存活力係不低於約37%；(iii)內毒素係為每毫升液體培養物低於或等於約4.8 EU；及/或(iv)生物負載量係為每毫升液體培養物低於1個菌落形成單位。
藉由本發明之此等方法製成之重組蛋白質，可為經分泌蛋白質、糖蛋白、細胞活素、激素、CTLA4－Ig蛋白質或CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質。於一項具體實施例中，哺乳動物細胞為藉本發明所提供細胞之後代或次代無性繁殖系。於另一項具體實施例中，哺乳動物細胞為衍生自本發明細胞系之細胞之後代或次代無性繁殖系。於進一步具體實施例中，哺乳動物細胞為來自以包含順序識別碼：1之表現卡匣轉染細胞之無性繁殖群集。在一項特定具體實施例中，哺乳動物細胞為來自以包含順序識別碼：23之表現卡匣轉染細胞之無性繁殖群集。
純化得自培養物之重組蛋白質之一般技術
在細胞培養方法之蛋白質生產期後，吾人感興趣之蛋白質，例如糖蛋白，係使用熟諳此藝者所明瞭之技術，自細胞培養基回收。特定言之，吾人感興趣之蛋白質係自培養基以經分泌之多肽回收，惟其亦可自宿主細胞溶胞產物回收。培養基或溶胞產物係首先經離心，以移除細胞碎屑與微粒子。所要之蛋白質係接著自污染物DNA、可溶性蛋白質及多肽純化，使用此項技藝中經良好建立之下述非限制性純化程序：SDS－PAGE；硫酸銨沉澱作用；乙醇沉澱作用；於免疫親和力或離子交換管柱上之分級分離；逆相HPLC；於矽膠上或於陰離子交換樹脂譬如QAE或DEAE上之層析；聚焦層析；凝膠過濾，使用例如交聯葡聚糖(Sephadex)G－75TM 管柱；及蛋白質A SepharoseTM 管柱，以移除污染物，譬如IgG。添加蛋白酶抑制劑，譬如氟化苯基甲磺醯(PMSF)，或蛋白酶抑制劑藥液混合物，亦可用以抑制純化期間之蛋白分解性降解。熟諳此藝者將明瞭適合吾人感興趣之蛋白質例如糖蛋白之純化方法，可能需要變更，以考慮蛋白質於重組細胞培養物中表現時之特性上改變。
針對糖蛋白之碳水化合物基團選擇之純化技術與方法，就本發明而論亦具有利用性。例如，此種技術包括HPLC或離子交換層析，使用陽離子－或陰離子交換樹脂，其中係收集較具鹼性或較具酸性溶離份，依何種碳水化合物正被選擇而定。此種技術之利用亦可造成污染物之伴隨移除。
於本發明中，能夠產生CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig融合蛋白質之CHO細胞，係在CHO專一培養基中以懸浮液生長至預定細胞密度。在不含血清表現培養基中，呈懸浮生長之CHO細胞，係接著產生CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子，其係藉由CHO細胞分泌至培養基中。細胞懸浮液可經由離心分離而被澄清，而CTLA4－Ig分子可接著自已澄清之培養物上層清液，藉由標準純化技術分離。用於獲得CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig之較大純度與均一性之適當純化程序之非限制性實例，無論是個別或併用，係為：於瓊脂糖上之親和層析法；於陰離子交換管柱(AEC)上之分級分離；及疏水性交互作用層析(HIC)。
在一些具體實施例中，自本文中所述生產方法單離CTLA4－Ig分子或其他蛋白質(包括糖蛋白)可至少包括下列步驟：(i)獲得細胞培養物上層清液；(ii)使上層清液接受陰離子交換層析，以獲得經溶離之蛋白質產物；(iii)使步驟(ii)之經溶離蛋白質產物接受疏水性交互作用層析，以獲得富含之蛋白質產物；(iv)使富含之蛋白質產物接受親和層析法，以獲得經溶離且富含之蛋白質產物；及(v)使(iv)之經溶離且富含之蛋白質產物接受陰離子交換層析。於步驟(iii)中所獲得之富含蛋白質產物，其特徵可在於例如其任何HMW蛋白質或污染物之百分比係低於5、10、15或25%。步驟(ii)之陰離子交換層析可例如利用洗滌緩衝劑進行，該緩衝劑包含約25－100 mM HEPES與約300－900 mM NaCl，且具有pH值為約7.0－8.0。步驟(iii)之疏水性交互作用層析可例如利用具有pH值約7.0且包含約25 mM HEPES與約850 mM NaCl之單一洗滌緩衝劑；或具有pH值約8.0且包含約25 mM Tris與約250 mM NaCl之洗滌緩衝劑進行。步驟(iv)之親和層析法可例如利用具有pH值約3.5且包含約100 mM甘胺酸之溶離緩衝劑進行。步驟(v)之親和層析法可例如利用具有pH值約8.0且包含約25 mM HEPES與約120 mM NaCl至約130 mM NaCl之洗滌緩衝劑，或具有pH值約8.0且包含約25 mM HEPES與約200 mM NaCl之洗滌緩衝劑進行。步驟(ii)之陰離子交換層析可使用具有一級、二級、三級或四級胺官能基之陰離子交換樹脂之管柱進行。步驟(iii)之疏水性交互作用管柱可使用具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或異戊基官能基之疏水性交互作用樹脂進行。
在其他具體實施例中，自本文所述生產方法單離CTLA4A29YL104E －Ig分子或其他蛋白質(包括糖蛋白)可至少包括下列步驟：(i)獲得細胞培養物上層清液；(ii)使上層清液接受親和層析法，以獲得經溶離之蛋白質產物；(iii)使步驟(ii)之經溶離蛋白質產物接受陰離子交換層析，以獲得富含之蛋白質產物；及(iv)使富含之蛋白質產物接受疏水性交互作用層析，以獲得經溶離且富含之蛋白質產物，具有降低之高分子量(HMW)蛋白質複合物。於步驟(iv)中所得之富含蛋白質產物，其特徵可在於例如其任何HMW蛋白質或污染物之百分比係低於5、10、15或25%。步驟(ii)之親和層析法可例如利用具有pH值約3.0且包含約250 mM甘胺酸之溶離緩衝劑進行。步驟(ii)之親和層析法可例如利用具有pH值約7.5且包含約25 mM NaH2 PO4 與約150 mM NaCl之洗滌緩衝劑進行。步驟(iii)之陰離子交換層析可例如利用包含約50 mM HEPES與約135 mM NaCl且具有pH值約7.0之洗滌緩衝劑進行。步驟(iii)之陰離子交換層析可例如利用包含約50 mM HEPES與約200 mM NaCl且具有pH值約7.0之溶離緩衝劑進行。步驟(iv)之疏水性交互作用層析可例如利用具有pH值約7.0且包含約50 mM HEPES與約1.2M(NH4 )2 SO4 之洗滌緩衝劑進行。步驟(iii)之陰離子交換層析可使用具有一級、二級、三級或四級胺官能基之陰離子交換樹脂之管柱進行。步驟(iv)之疏水性交互作用管柱可使用具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或異戊基官能基之疏水性交互作用樹脂進行。
於一項具體實施例中，本發明係提供一種自液體細胞培養物純化CTLA4－Ig分子之方法，以致經純化之CTLA4－Ig係實質上不含單細胞向化性蛋白質－1(MCP－1)。於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig分子之藥學上可接受組合物，其中此組合物包含不超過0.5 ppm MCP－1、1 ppm MCP－1、2 ppm MCP－1、3 ppm MCP－1、4 ppm MCP－1、5 ppm MCP－1、6 ppm MCP－1、7 ppm MCP－1、8 ppm MCP－1、9 ppm MCP－1或10 ppm MCP－1。於另一項具體實施例中，在該組合物中，MCP－1之量不能夠超過經純化CTLA4－Ig重量之1%、0.5%或0.1%。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子之組合物係實質上不含MCP－1，其中有低於50、45、40、38、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1毫微克/毫升之MCP－1在QFF溶離物液體中。於另一項具體實施例中，本發明係提供一種自液體細胞培養物純化CTLA4－Ig分子之方法，以致經純化之CTLA4－Ig係實質上不含MCP－1，且包含低於2.5%之CTLA4－Ig四聚體。
單細胞向化性蛋白質1(MCP－1)在組合物中之量，可使用ELISA方法定量。塗覆之抗體為山羊抗－老鼠MCP－1 IgG抗體。次生抗體為兔子抗－大白鼠MCP－1 IgG抗體。偵測係使用辣根過氧化酶共軛之山羊抗兔子IgG抗體與受質TMB達成。辣根過氧化酶試劑會產生比色反應，與被捕獲之蛋白質量成比例地發展。ELISA係定量MCP－1相對於物質標準曲線之含量。於一項具體實施例中，MCP－1係在組合物中定量，且MCP－1含量係在0－0.097毫微克/毫克與0.0140.154毫微克/毫克之範圍內。
於另一項具體實施例中，本發明係提供一種自液體細胞培養物純化CTLA4A29YL104E －Ig分子之方法，以致經純化之CTLA4A29YL104E －Ig係實質上不含單細胞向化性蛋白質－1(MCP－1)。於一項具體實施例中，MCP－1之量不能夠超過經純化CTLA4A29YL104E －Ig重量之1%、0.5%或0.1%。於另一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig係實質上不含MCP－1，其中有低於50、45、40、38、35或30毫微克/毫升之MCP－1在HIC溶離物液體中。於進一步具體實施例中，本發明係提供一種自液體細胞培養物純化CTLA4A29YL104E －Ig分子之方法，以致經純化之CTLA4A29YL104E －Ig係實質上不含M CP－1，且包含低於2.5%之CTLA4A29YL104E －Ig四聚體。
糖蛋白自細胞培養物之回收與純化
本發明係描述自含有吾人感興趣之糖蛋白(譬如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig)與不想要污染物之不純細胞培養物上層清液，蛋白質匯集庫分離糖蛋白(例如CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig)之一系列步驟。此不純細胞培養物上層清液可作為CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白純化之起始物質使用。
在本發明之一項具體實施例中，係將含有CTLA4－Ig糖蛋白與不想要污染物之不純細胞培養物上層清液，施加至陰離子交換媒質。存在於不純細胞培養物上層清液中之CTLA4－Ig糖蛋白係結合至陰離子交換媒質。然後，將陰離子交換媒質洗滌，以自陰離子交換媒質移除任何未結合物質。CTLA4－Ig糖蛋白係在未結合物質被移除後經溶離，並收集溶離物。
在本發明之一項具體實施例中，係將含有CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白與不想要污染物之不純細胞培養物上層清液，施加至親和層析媒質。存在於不純細胞培養物上層清液中之CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白，係結合至親和層析媒質。然後，將親和層析媒質洗滌，以自陰離子交換媒質移除任何未結合物質。CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白係在未結合物質被移除後經溶離，並收集溶離物。
在本發明之一項特定具體實施例中，係採用Q－瓊脂糖陰離子交換層析(AEC)，例如使用Q－瓊脂糖XL管柱(GE保健)，以自採集物質分離CTLA4－Ig糖蛋白，以及用於降低整體污染物。此管柱可在從哺乳動物細胞培養物純化CTLA4－Ig糖蛋白中，作為早期步驟用於分級分離所採集之細胞培養基。於另一項具體實施例中，Q－瓊脂糖陰離子交換層析，例如Q－瓊脂糖快速流動(GE保健)，可於親和層析法純化步驟後使用。陰離子交換管柱之極高流動性質允許大體積CTLA4－Ig糖蛋白或經採集細胞培養基，在後續層析步驟譬如SP－瓊脂糖或HIC之前，容易地藉由調整條件而被濃縮，以致CTLA4－Ig糖蛋白係結合該管柱。對於pH從約pH 5至9，特別是約8之洗滌緩衝劑，係可使用75 mM HEPES與360 mM NaCl濃度。典型上，對於pH從約pH 5至8，特別是約7之溶離緩衝劑，係可使用25 mM HEPES與325 mM NaCl濃度。
用於從經採集培養基分離CTLA4－Ig糖蛋白之適當樹脂，係為具有固定化胺官能基者。最有用者為四級胺官能基樹脂，例如在得自GE保健之Q－瓊脂糖快速流動樹脂上者，其中四級銨配位體係結合至高孔隙度交聯瓊脂糖。亦有用者為一級、二級及三級胺官能基樹脂，例如在得自GE保健之DEAE瓊脂糖快速流動樹脂上者，其中三級二乙胺基乙基配位體係結合至高孔隙度交聯瓊脂糖。
於本發明之另一項具體實施例中，收集得自陰離子交換媒質之含CTLA4－Ig糖蛋白之溶離物，然後與疏水性交互作用樹脂接觸。如下文所述，含CTLA4－Ig糖蛋白之體積係通過HIC管柱與收集庫，其可進一步經純化，然後結合至陰離子交換樹脂。
HIC係可用於自哺乳動物細胞培養物分離所要之CTLA4－Ig糖蛋白二聚體與高分子量物質及其他蛋白質不純物。例如，CTLA4－Ig－表現－CHO細胞培養物係含有CTLA4－Ig糖蛋白之高分子量聚集體。亦被發現於哺乳動物細胞培養基中者為CHO細胞蛋白質不純物。此等不想要之產物可在病患中產生不期望之抗原回應，且助長不良產物品質或活性。HIC係有效地分離疏水性變型CTLA4－Ig糖蛋白二聚體與CTLA4－Ig糖蛋白HMW複合物及CHO蛋白質不純物，經由後述產物結合至HIC樹脂，及CTLA4－Ig糖蛋白二聚體通過管柱。因此，可獲得CTLA4－Ig糖蛋白匯集庫，其係實質上不含此等物種，且其係特別適合另一個層析步驟，譬如陰離子交換層析。與HIC一起使用之CTLA4－Ig糖蛋白混合物之來源，係為哺乳動物細胞培養物，例如CHO細胞培養物。特定言之，可使此培養物接受至少一個先前純化步驟，如先前所討論。
於本發明之另一項具體實施例中，HIC方法可經修改以收集其他糖蛋白(例如CTLA4－Ig HMW複合物)之匯集庫。HMW聚集體可結合至HIC樹脂(例如包含CTLA4－Ig四聚體等)。此等HMW複合物具有較高抗體親抗原性，且於活體內比單獨之CTLA4－Ig二聚體更有效結合。因此，熟諳此藝者可經由使CTLA4－Ig匯集庫溶離出HIC，而獲得CTLA4－Ig HMW聚集體之匯集庫。
用於分離CTLA4－Ig糖蛋白形式之最有用HIC樹脂，係為具有固定化苯基官能基者。於苯基－HIC樹脂中，GE保健之苯基瓊脂糖快速流動高取代(高取代)為最有用。TosoHaas之Phenyl Toyopearl媒質與TSK Phenyl 5PW係為可使用之其他苯基－HIC樹脂之非限制性實例。其他HIC官能基包括但不限於丙基、辛基、烷氧基、丁基及異戊基部份基團。
例如，一種苯基瓊脂糖4快速流動管柱層析，疏水性交互作用層析(HIC)方法可用以降低HIC純化步驟中溶離之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig高分子量物種之量(參閱實例15與實例20)。因此，得自HIC管柱之清晰吸收峰係富含CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig HMW物種。
可使得自HIC純化步驟之含有CTLA4－Ig糖蛋白之未結合部份，接受另一個純化方法，譬如親和層析法，而所形成之溶離物可接著被施加至陰離子交換媒質。CTLA4－Ig糖蛋白係結合至陰離子交換樹脂，其可接著被洗滌以移除未結合之蛋白質。在移除未結合蛋白質之後，CTLA4－Ig糖蛋白係自第二種陰離子交換樹脂溶離。收集溶離物，並可進一步濃縮。
於本發明之另一項具體實施例中，係採用親和層析法，例如蛋白質A瓊脂糖快速流動(GE保健)，以進一步富含CTLA4－Ig糖蛋白，其可進一步接著為陰離子交換層析步驟，例如Q－瓊脂糖快速流動(GE保健)。親和層析法步驟亦可降低CHO蛋白質與單細胞向化性蛋白質(MCP－1，化學細胞活素)不純物之含量。親和層析法係涉及吸附分離，其中欲被純化之吾人感興趣分子，例如CTLA4－Ig糖蛋白，係專一性地且可逆地結合至被固定於一些基質或樹脂上之配位體。親和純化管柱之一些非限制性實例，包括外源凝集素；親和標記(例如GST管柱或6X－His管柱)；鏈霉胺基酸；肝素；或抗體(例如蛋白質A管柱或蛋白質G管柱)。特定言之，本發明係利用蛋白質A樹脂以結合CTLA4－Ig糖蛋白。對於pH從約5至9，更有效在約8下之洗滌緩衝劑，可使用25 mM Tris與250 mM NaCl濃度。對於pH從約2至5，更有效在約3.5下之溶離緩衝劑，可使用100 mM甘胺酸濃度。親和層析法溶離物可接著經中和，並裝載至陰離子交換層析管柱上，Q－瓊脂糖快速流動為最有用。
為在前述回收/最初純化步驟後進一步降低蛋白質A、DNA及非所要之CTLA4－Ig糖蛋白物種在產物中之含量，另一個離子交換步驟可被併入純化程序中。本發明可採用市購可得之離子交換管柱，譬如得自GE保健之Q－瓊脂糖快速流動管柱，或亦得自GE保健之DEAE瓊脂糖快速流動管柱。當於本文中測定時，用於自經採集培養基分離CTLA4－Ig糖蛋白之最適合樹脂，係為具有固定化胺官能基者。其他可使用之基團為四級胺官能基樹脂，例如在得自GE保健之Q－瓊脂糖快速流動管柱中者，其中四級銨配位體係結合至高孔隙度交聯瓊脂糖。亦可使用者為一級、二級及三級胺官能基樹脂，例如在得自GE保健之DEAE瓊脂糖快速流動管柱中者，其中三級二乙胺基乙基配位體係結合至高孔隙度交聯瓊脂糖。在本發明之一項特定具體實施例中，利用強陰離子交換劑之管柱，譬如Q－瓊脂糖快速流動管柱，係被使用。
於本發明之一項具體實施例中，係將CTLA4－Ig糖蛋白溶離物裝載至陰離子交換管柱上，例如Q－瓊脂糖快速流動。洗滌管柱，並將CTLA4－Ig糖蛋白接著自陰離子交換管柱溶離。對於pH從約5至9，於一項具體實施例中，pH 8之洗滌緩衝劑，可使用25 mM HEPES與100－140 mM NaCl濃度。對於pH從約5至9，或於另一項具體實施例中，pH 8之溶離緩衝劑，可使用25 mM HEPES與200 mM NaCl濃度。將自陰離子交換媒質溶離之CTLA4－Ig糖蛋白回收、濃縮及洗滌，藉由滲濾或熟諳此藝者所已知之其他適當方法，以提供最後純化之CTLA4－Ig糖蛋白產物。根據本發明方法製成之CTLA4－Ig糖蛋白產物，係具有高純度，例如含有＝95%之CTLA4－Ig二聚體，含有＝5%之CTLA4－Ig HMW產物，及含有＝1%之CTLA4－Ig單體。
純化方法可進一步包括其他步驟，其係使失活及/或移除病毒及/或反轉錄酶病毒，其可能潛在地存在於哺乳動物細胞系之細胞培養基中。可觀數目之病毒清除步驟係可採用，包括但不限於以促溶劑處理，譬如尿素或胍，清潔劑，其他超過濾/滲濾步驟，習用分離，譬如離子交換或尺寸排阻層析，pH極端、加熱、蛋白酶、有機溶劑，或其任何組合。
於本發明之另一項具體實施例中，係採用親和層析法，例如MabSelect蛋白質A瓊脂糖樹脂(GE保健)，以捕獲CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白，其可進一步接著為陰離子交換層析步驟，例如Q－瓊脂糖快速流動(GE保健)。親和層析法步驟亦可降低CHO蛋白質與單細胞向化性蛋白質(MCP－1，化學細胞活素)不純物之含量。親和層析法係涉及吸附分離，其中欲被純化之吾人感興趣分子，例如CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白，係專一性地且可逆地結合至被固定於一些基質或樹脂上之配位體。親和純化管柱之一些非限制性實例包括外源凝集素；親和標記(例如GST管柱或6X－His管柱)；鏈霉胺基酸；肝素；或抗體(例如蛋白質A管柱或蛋白質G管柱)。特定言之，本發明係利用蛋白質A樹脂，以結合CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白。對於pH從約5至9，更有效在約7.5下之洗滌緩衝劑，可使用25 mM Tris、25 mM NaH2 PO4 及250 mM NaCl濃度。對於pH從約2至5，更有效在約3.5下之溶離緩衝劑，可使用100－300 mM甘胺酸濃度。親和層析法溶離物可接著經中和，且裝載至陰離子交換層析管柱上，Q－瓊脂糖快速流動為最有用。
為進一步在前述回收/最初純化步驟後降低蛋白質A、DNA及非所要CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白物種在產物中之含量，陰離子交換步驟可被併入純化程序中。本發明可採用市購可得之離子交換管柱，譬如得自GE保健之Q－瓊脂糖快速流動管柱，Q－瓊脂糖XL管柱(GE保健)，或亦得自GE保健之DEAE瓊脂糖快速流動管柱。用於分離CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白之最適合樹脂為具有固定化胺官能基者。其他可使用之基團為四級胺官能基樹脂，例如在得自GE保健之Q－瓊脂糖快速流動管柱中者，其中四級銨配位體係結合至高孔隙度交聯瓊脂糖。亦有用者為一級、二級及三級胺官能基樹脂，例如在得自GE保健之DEAE瓊脂糖快速流動管柱中者，其中三級二乙胺基乙基配位體係結合至高孔隙度交聯瓊脂糖。在本發明之一項特定具體實施例中，利用強陰離子交換劑之管柱，譬如Q－瓊脂糖快速流動管柱，係被使用。
於本發明之一項具體實施例中，係將CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白溶離物裝載至陰離子交換管柱上，例如Q－瓊脂糖快速流動。洗滌管柱，並使CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白接著自陰離子交換管柱溶離。對於pH從約5至9，於一項具體實施例中，pH7之洗滌緩衝劑，可使用25－55 mM HEPES與100－140 mM NaCl濃度。對於pH從約5至9，或於另一項具體實施例中，pH 7之溶離緩衝劑，可使用25－50 mM HEPES與200 mM NaCl濃度。
於本發明之另一項具體實施例中，係將得自陰離子交換媒質之含CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白之溶離物收集，然後與疏水性交互作用樹脂接觸。HIC可用於自哺乳動物細胞培養物分離所要之CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白二聚體與高分子量物質及其他蛋白質不純物。例如，CTLA4A29YL104E －Ig－表現－CHO細胞培養物係含有CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白之高分子量聚集體。亦被發現於哺乳動物細胞培養基中者為CHO細胞蛋白質不純物。此等不想要之產物可在病患中產生不期望之抗原回應，且助長不良產物品質或活性。
HIC係有效地分離疏水性變型CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白二聚體與CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白HMW複合物及CHO蛋白質不純物，經由後述產物結合至HIC樹脂，及CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白二聚體通過管柱。因此，可獲得實質上不含此等物種之CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白匯集庫。與HIC一起使用之CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白混合物之來源為哺乳動物細胞培養物，例如CHO細胞培養物。特定言之，可使培養物接受至少一個先前純化步驟，如先前所討論。
於本發明之另一項具體實施例中，HIC方法可被修改，以收集其他糖蛋白(例如CTLA4A29YL104E －Ig HMW複合物)之匯集庫。HMW聚集體可結合至HIC樹脂(例如，包括CTLA4A29YL104E －Ig四聚體)。此等HMW複合物具有較高抗體親抗原性，且於活體內比單獨之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體更有效地結合。因此，熟諳此藝者可經由使CTLA4A29YL104E －Ig匯集庫溶離出HIC，而獲得CTLA4A29YL104E －Ig HMW聚集體之匯集庫。
自HIC培養基溶離之CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白係藉由滲濾或熟諳此藝者所已知其他適當方法，被回收、濃縮及洗滌，以提供最後純化之CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白產物。根據本發明方法製成之CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白產物係具有高純度，例如含有＝95%之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體，含有＝5%之CTLA4A29YL104E －Ig HMW產物，及含有＝1%之CTLA4A29YL104E －Ig單體。
用於分離CTLA4A29YL104E －Ig糖蛋白形式之最有用HIC樹脂為具有固定化苯基官能基者。於苯基－HIC樹脂中，GE保健之苯基瓊脂糖快速流動高取代(高取代)為最有用。得自TosoHaas之Phenyl Toyopearl媒質與TSK Phenyl 5PW為可使用之其他苯基－HIC樹脂之非限制性實例。其他HIC官能基包括但不限於丙基、辛基、烷氧基、丁基及異戊基部份基團。
純化方法可進一步包括其他步驟，其係使失活及/或移除病毒及/或反轉錄酶病毒，其可能潛在地存在於哺乳動物細胞系之細胞培養基中。可觀數目之病毒清除步驟係可採用，包括但不限於以促溶劑處理，譬如尿素或胍，清潔劑，其他超過濾/滲濾步驟，習用分離，譬如離子交換或尺寸排阻層析，pH極端、加熱、蛋白酶、有機溶劑，或其任何組合。
於一方面，已被濃縮且接受滲濾步驟之經純化CTLA4－Ig分子，可被填入2－升Biotainer瓶、50－升生物處理袋或任何其他適當容器中。在此種容器中之CTLA4－Ig分子可在冷凍之前，於2°至8℃下被儲存約60天。經純化CTLA4－Ig在2°至8℃下之長期儲存，可導致增加CLTA4－Ig四聚體之比例。因此，關於長期儲存，CTLA4－Ig分子可在儲存之前，於約－70℃下冷凍，並儲存於約－40℃之溫度下。冷凍溫度可從約－50℃改變至約－90℃。冷凍時間可以改變，且主要係依含有CTLA4－Ig分子之容器體積，及被裝載在冷凍庫中之容器數目而定。例如，於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子係在2－升Biotainer瓶中。裝載低於四個2－升Biotainer瓶在冷凍庫中，可能需要約14到至少18小時之冷凍時間。裝載至少四瓶可能需要約18到至少24小時之冷凍時間。具有經冷凍CTLA4－Ig分子之容器係被儲存在溫度約－35℃至約－55℃下。
在約－35℃至約－55℃溫度下之儲存時間可以改變，且可為短達18小時。可使經冷凍之CTLA4－Ig分子以控制方式融解。經冷凍CTLA4－Ig分子之融解係經控制，並可在培養器中，於溫度約20℃至約24℃下進行。融解步驟之延續時間係依培養器之裝載量而定，其中裝載量低於四個2－升Biotainer瓶可能需要低於約24小時之融解時間。裝載量為四個2－升Biotainer瓶可能需要約18小時。可將包含CTLA4－Ig分子之融解溶液混合，以避免潛在濃度梯度液。因此，融解可在經控制溫度培養器中進行，其亦允許含有CTLA4－Ig之容器之振盪。振盪之速度可為約40至約80 rpm。經融解CTLA4－Ig分子可在約3 rpm之旋轉速率下，被進一步混合另外5－10分鐘。可將經融解之CTLA4－Ig分子儲存於2°至8℃下，於包含CTLA4－Ig之醫藥組合物製造期間層化與凍乾。
本發明可進一步應用於以大規模製成之治療用糖蛋白之其他非限制性實例之純化。本發明方法可應用於哺乳動物細胞培養物中具有一種以上糖基化變型之其他糖蛋白之製造。熟諳此藝者將明瞭一些修改，其在舉例方法對於不同糖蛋白製造之配合調整之過程中可能變得必須。
調配物與套件
本發明亦提供任何所述CTLA4－Ig分子作成經凍乾混合物。欲被凍乾之包含CTLA4－Ig之調配物可進一步包含三種基本成份：(1)另一種活性成份，包括其他重組蛋白質或小分子(譬如免疫壓抑劑)，(2)賦形劑，及(3)溶劑。賦形劑包括藥學上可接受之試劑，以提供良好凍乾餅性質(膨鬆化劑)，以及提供蛋白質之冷凍保護及/或低溫保護("安定劑")，pH之維持(緩衝劑)，及蛋白質在儲存期間之適當構形，以致保持生物學活性(包括活性成份安定性，譬如蛋白質安定性)之實質保留。關於賦形劑，調配物之實例可包含一或多種緩衝劑、膨鬆劑、蛋白質安定劑及抗微生物劑。糖類或多元醇可作為非專一性蛋白質安定劑使用，在溶液中及在冷凍－融解與冷凍－乾燥期間。聚合體可用以使蛋白質安定化，在溶液中及在冷凍－融解與冷凍－乾燥期間。一種受歡迎之聚合體為血清白蛋白，其已被使用作為低溫保護劑與凍乾保護劑兩者。於一項具體實施例中，本發明係提供不含白蛋白之調配物。各種鹽可作為膨鬆化劑使用。說明性鹽膨鬆化劑包括例如NaCl、MgCl2 及CaCl2 。某些胺基酸可作為低溫保護劑及/或凍乾保護劑及/或膨鬆化劑使用。可使用之胺基酸類，包括但不限於甘胺酸、脯胺酸、4－羥脯胺酸、L－絲胺酸、麩胺酸鈉、丙胺酸、精胺酸及離胺酸鹽酸鹽。涵蓋寬廣pH範圍之許多緩衝劑係可取用，供調配物中之選擇。緩衝劑包括例如醋酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸、磷酸鹽(鈉或鉀)、二乙醇胺及Tris。緩衝劑係涵蓋會保持溶液pH值在凍乾之前，於可接受範圍內之作用劑。調配物具有先前已被描述於2005年12月20日提出申請之美國專利申請案號60/752,150中者，其係據此以其全文併入供參考。
於一項具體實施例中，本發明係提供經凍乾之CTLA4－Ig混合物，其包含至少90%、95%、99%或99.5% CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，本發明係提供經凍乾之CTLA4－Ig混合物，其包含至少90%、95%、99%或99.5%之CTLA4－Ig二聚體，與不大於5%、4%、3%、2%或1%之CTLA4－Ig四聚體。於另一項具體實施例中，本發明係提供經凍乾之CTLA4－Ig混合物，其包含至少90%、95%、99%或99.5%之CTLA4－Ig二聚體，與不大於5%、4%、3%、2%或1%之CTLA4－Ig四聚體，與不大於2%、1.5%、1.0%、0.8%、0.5%或0.3%之CTLA4－Ig單體。於進一步具體實施例中，本發明係提供經凍乾之CTLA4－Ig混合物，其包含每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子，至少8.0莫耳唾液酸。於另一項具體實施例中，本發明係提供經凍乾之CTLA4－Ig混合物，其包含：每莫耳CTLAIg全部蛋白質或二聚體約15至約35莫耳GlcNAc；每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子約1至約5莫耳GalNAc；每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子約5莫耳至約20莫耳半乳糖；每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子約2至約10莫耳海藻糖；及/或每莫耳CTLA4－Ig二聚體或對CTLA4－Ig分子約5－15莫耳甘露糖。
CTLA4A29YL104E －Ig藥物係可以水溶液採用，在大約25毫克/毫升(22.5－27.5毫克/毫升)濃度下，於25 mM磷酸鈉與10 mM氯化鈉緩衝劑中，在pH~7.5下。CTLA4A29YL104E －Ig具有在水溶液中形成高分子量物種之傾向。因此，係發展凍乾產物，以使可在藥物產物中形成之高分子量物種之含量降至最低。各種賦形劑，譬如麥芽糖、蔗糖及胺基酸譬如L－精胺酸鹽酸鹽，係經篩選在CTLA4A29YL104E －Ig凍乾期間作為潛在凍乾保護劑。已發現蔗糖係為最有效之凍乾保護劑。進一步發現增加蔗糖對蛋白質比例，會改良蛋白質安定性。蔗糖：蛋白質比例2：1(重量：重量)係經選擇，用於欲被凍乾之蛋白質溶液。經凍乾之藥物產物具有適當安定性與令人滿意之構造行為。
治療之方法
根據本發明，藉由T細胞與B7陽性細胞之交互作用所媒介之疾病，可藉由接受藥學上可接受之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig調配物而被治療。藉由經設計哺乳動物細胞系(例如dhfr －陰性中國大頰鼠卵巢細胞系，其係隱藏會使CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig編碼之DNA)所分泌之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子，可為具有特定糖基化作用分佈形態之分子群集。如本文所陳述，特定糖基化作用分佈形態可影響CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig結合至CD80及/或CD86，以致CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子對於T細胞活化作用及/或增生可提供較大抑制。如本文所陳述，特定糖基化作用分佈形態可受細胞系與製造方法所影響。因此’在本發明之某些具體實施例中，本發明係提供在本文中所述製造方法中藉由細胞系所製成之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子，以治療T－細胞相關之疾病或病症，一般性地包括但不限於任何T－細胞依賴性淋巴增生疾病或病症，與任何T－細胞依賴性自身免疫疾病或病症，而更明確言之，為：T細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴胚細胞白血病、睪丸血管中心T細胞淋巴瘤、溫和淋巴管炎、移植物對宿主疾病(GVHD)、與移植物移植排斥有關聯之免疫病症、牛皮癬、發炎、過敏反應、卵巢炎、炎性腸疾病、絲球體性腎炎、腦脊髓炎、橋本氏病、格雷武司氏病、Addison氏病、克隆氏病、Sjogren氏徵候簇、紅斑性狼瘡、原發性黏液性水腫、惡性貧血症、自身免疫萎縮胃炎、風濕性關節炎、胰島素依賴性糖尿病、Goodpasture氏徵候簇、重症肌無力、天疱瘡、多發性硬化、共感性眼炎、自身免疫葡萄膜炎、自身免疫溶血性貧血、自發性血小板減少症、原發性膽硬化、慢性作用肝炎、潰瘍性結腸炎、硬皮病、多肌炎及混合結締組織疾病。
本發明係提供任何所揭示之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子在病患或活體外中抑制T細胞增生或活化作用，抑制免疫回應，及在病患中用於治療免疫病症，或在病患引致對抗原免疫耐受性之方法中之用途。免疫耐受性為一種免疫回應類型，其中係發展淋巴樣組織針對專一抗原之專一非反應性，於耐受性不存在下，抗原係能夠引致免疫回應。於一項具體實施例中，本發明之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子與組合物可用以治療已接受移植之病患，以引致耐受性，且降低排斥之可能性。於另一項具體實施例中，移植物為器官移植物、組織移植物或細胞移植物。於另一項具體實施例中，細胞移植物包括骨髓細胞或胰島細胞。
本發明係提供任何所揭示CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子於藥劑製造上之用途，該藥劑係用於治療任何上述疾病或病症。本發明亦提供任何所揭示CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子與另一種藥劑共同投藥以治療上文所提及疾病或病症之用途。本發明之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子可被投予病患，例如以靜脈內方式、皮下方式及/或藉吸入。可適用於靜脈內或皮下投藥之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig調配物，係描述於2005年12月20日提出申請之美國專利序號60/752,150中，其係據此以其全文併入供參考。CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig調配物亦可包含微脂粒為基礎之調配物，其中微脂粒可傳輸CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子至標的細胞或組織。CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子亦可藉由包含CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig基因表現卡匣之病毒載體之投藥，而被傳輸至標的細胞或組織。CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子群集之投藥與劑量係描述於以US20030083246與US20040022787公告之美國專利申請案，以及於2005年4月6日提出申請之待審美國專利申請案序號60/668,774中，其全部均據此以其全文併入供參考。
本文中所述之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子可呈多種劑型，其包括但不限於液體溶液或懸浮液、片劑、丸劑、粉末、栓劑、聚合體微膠囊或微泡囊、微脂粒及可注射或可灌注溶液。此形式係依投藥模式與治療應用而定。關於本發明分子之有效投藥模式與劑量服用法，係依疾病之嚴重性與期間，病患之健康情況與對治療之回應，及治療醫師之判斷而定。因此，分子之劑量應針對個別病患調整。關於不同大小與物種之動物及人類以毫克/平方米表面積為基準之劑量之相互關係，係由Freireich,E.J.等人描述(抗癌劑在老鼠、大白鼠、大頰鼠、狗、猴子及人類中之毒性之定量比較.Cancer Chemother,Rep. ,50,第4期,219－244,1966年5月)。可施行劑量服用法上之調整，以使生長抑制回應達最佳化。
劑量可以每日為基礎被區分與投藥，或劑量可成比例地降低，依狀況而定。例如，數份分離劑量可每日或每月投予，或劑量可按特定治療狀況所指示，成比例地降低。於一項具體實施例中，投藥係為每月、四分之一月、每日、一天兩次、約每10小時、約每6小時、約每4小時、約每2小時、約一小時一次。根據本發明之實施，治療病患之有效量可在約0.1與約10毫克/公斤病患體重之間。有效量亦可為在約1與約10毫克/公斤病患體重間之量。本發明之CTLA4－Ig或CTLA4A29YL104E －Ig分子亦具有活體內臨床應用。其可在一些免疫不全症狀之診斷或預後，白血病與淋巴瘤之形成表現型，及在器官移植後之免疫學改變之監測上，用於B7陽性細胞之計算。
本文中所述組合物之傳輸可經由注射、口腔傳輸、噴霧劑或其他特定分散液之吸入、皮下注射、靜脈內傳輸、局部傳輸、栓劑、眼部傳輸、鼻或口腔傳輸而達成。組合物可經由包覆在微脂粒或其他薄膜狀傳輸媒劑中而傳輸。組合物可經由血液或其他流體傳輸，其係預先以組合物處理，然後接著輸血至病患中。
序列表
順序識別碼：17為會使pcSDhuCTLA4Ig編碼之核苷酸順序：
順序識別碼：18為人類CTLA4胞外功能部位之胺基酸順序。
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQ
其他非限制性具體實施例：
本發明係提供能夠產生CTLA4－Ig之無性繁殖中國大頰鼠卵巢細胞群集。於一項具體實施例中，此細胞群集係能夠產生每升液體培養物大於0.5或更多克之CTLA4－Ig蛋白質，且其中CTLA4－Ig在1,000升或更多之培養規模下，顯示唾液酸對CTLA4－Ig二聚體之莫耳比為約6至約14。於一項具體實施例中，細胞群集已被配合調整至不含血清化學上定義之培養基。於另一項具體實施例中，製自細胞群集培養物之CTLA4－Ig具有消光係數為1.00±0.05 AU毫升公分－1 毫克－1 。於進一步具體實施例中，細胞群集當在培養物中生長時，係能夠產生CTLA4－Ig多肽，其中：(a)約90%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基27處之甲硫胺酸開始；(b)約10%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號26處之丙胺酸開始；(c)約4%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號383處之離胺酸終止；(d)約96%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號382處之甘胺酸終止；及視情況，(e)約低於1%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號25處之甲硫胺酸開始。
本發明係提供上述細胞之後代細胞，其中後代細胞會產生CTLA4－Ig。於一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養歷經至少5個世代。於另一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養歷經至少10個世代。於另一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養歷經至少20個世代。於另一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養歷經至少40個世代。於另一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養歷經至少50個世代。於另一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養歷經至少75個世代。於另一項具體實施例中，後代細胞係得自將細胞培養歷經至少100個世代。
本發明係提供製自任何上述細胞之細胞系。於一項具體實施例中，細胞系為無性繁殖系。於另一項具體實施例中，細胞系係能夠產生：(a)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：10之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置27與甘胺酸在胺基酸位置382)；(b)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：7之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置27與離胺酸在胺基酸位置383)；(c)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：9之胺基酸順序(順序識別碼：2之丙胺酸在胺基酸位置26與甘胺酸在胺基酸位置382)；(d)CTLA4－Ig融合蛋白質具有順序識別碼：6之胺基酸順序(順序識別碼：2之丙胺酸在胺基酸位置26與離胺酸在胺基酸位置383)；(e)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：5之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置25與離胺酸在胺基酸位置383)；或(f)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：8之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置25與甘胺酸在胺基酸位置382)。
於另一項具體實施例中，細胞系係能夠產生CTLA4－Ig融合蛋白質，其中：(a)約90%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基27處之甲硫胺酸開始；(b)約10%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號26處之丙胺酸開始；(c)約4%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號383處之離胺酸終止；(d)約96%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號382處之甘胺酸終止；及視情況(e)約低於1%之CTLA4－Ig多肽包含順序識別碼：2之胺基酸順序，以在殘基編號25處之甲硫胺酸開始。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig融合蛋白質，其係製自培養細胞系，具有消光係數為1.00±0.05 AU毫升公分－1 毫克－1。於一項具體實施例中，本發明係提供衍生自本發明細胞之細胞群集。於一項具體實施例中，當與原先經轉染細胞比較時，細胞群集包含至少一個另外之基因改變，且其中經衍生之細胞群集係能夠產生CTLA4－Ig。在其他具體實施例中，當與原先經轉染細胞比較時，細胞群集包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26個另外之基因改變，且其中經衍生之細胞群集係能夠產生CTLA4－Ig。於一項具體實施例中，基因改變包括至少一個非保守突變在細胞基因組中或在使CTLA4－Ig編碼之重組表現卡匣中。
於一項具體實施例中，基因改變包括至少一個其他重組核酸在細胞內。於一項具體實施例中，改變包括細胞基因組之突變。於一項具體實施例中，改變包括添加核酸至無論是細胞基因組或作為反式核酸，其係使抗細胞凋零多肽編碼。於一項具體實施例中，抗細胞凋零多肽係關於糖基化作用。
於一項具體實施例中，基因改變包括細胞基因組或會使CTLA4－Ig編碼之重組表現卡匣之至少一個突變。於一項具體實施例中，細胞群集當在培養物中生長時係能夠產生：(a)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：10之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置27與甘胺酸在胺基酸位置382)；(b)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：7之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置27與離胺酸在胺基酸位置383)；(c)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：9之胺基酸順序(順序識別碼：2之丙胺酸在胺基酸位置26與甘胺酸在胺基酸位置382)；(d)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：6之胺基酸順序(順序識別碼：2之丙胺酸在胺基酸位置26與離胺酸在胺基酸位置383)；(e)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：15之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置25與離胺酸在胺基酸位置383)；或(f)CTLA4－Ig融合蛋白質，具有順序識別碼：8之胺基酸順序(順序識別碼：2之甲硫胺酸在胺基酸位置25與甘胺酸在胺基酸位置382)。
本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約6至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約8至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約11至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約12至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約13至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約14至約18。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約15至約17。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約16。
本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中大於95%之分子為CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，大於98%之分子為CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，大於99%之分子為CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，大於99.5%之分子為CTLA4－Ig二聚體。於一項具體實施例中，約95%至約99.5%之分子為CTLA4－Ig二聚體，與約0.5%至約5%之分子為CTLA4－Ig四聚體。於一項具體實施例中，約98.6%之分子為CTLA4－Ig二聚體，與約1.2%之分子為CTLA4－Ig四聚體，及約低於0.7%之分子為CTLA4－Ig單體。本發明係提供包含CTLA4－Ig二聚體之群集。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中群集係實質上不含CTLA4－Ig單體。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中群集係實質上不含CTLA4－Ig四聚體。本發明係提供CTLA4－Ig單體分子之群集，實質上不含CTLA4－Ig二聚體與四聚體。於一項具體實施例中，各CTLA4－Ig二聚體之各單體具有至少3個唾液酸基團。
於一項具體實施例中，各CTLA4－Ig二聚體之各單體具有至少3個唾液酸基團到至少8個唾液酸基團。本發明係提供CTLA4－Ig四聚體分子之經純化群集，此群集係實質上不含CTLA4－Ig二聚體，且視情況其中該群集包含大於約100克之量。本發明係提供CTLA4－Ig四聚體分子之經純化群集，該群集係實質上不含CTLA4－Ig單體，且視情況其中該群集包含大於約100克之量。於一項具體實施例中，各四聚體分子包含兩對CTLA4－Ig多肽，其中各多肽具有胺基酸順序，選自包括順序識別碼：3－8，且其中該多肽對之各成員係以共價方式連結至另一成員，及其中兩對多肽係以非共價方式與彼此締合。於一項具體實施例中，各四聚體分子係能夠結合至CD80或CD86。於一項具體實施例中，當與CTLA4－Ig二聚體分子比較時，各四聚體分子對CD80或CD86具有至少2－倍較大之抗體親抗原性。於一項具體實施例中，當與CTLA4－Ig二聚體分子比較時，各四聚體分子具有T細胞增生或活化作用之至少2－倍較大抑制。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中此組合物包含可在CTLA4－Ig之等電焦聚凝膠上見及之優勢異構重組物，當藉等電焦聚測定時，其具有等電點pI低於或等於5.1。於一項具體實施例中，在神經胺糖酸苷酶處理後pI會增加。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少40%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.1。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少70%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約5.1。於一項具體實施例中，當藉等電焦聚測定時，至少90%之CTLA4－Ig分子顯示等電點低於或等於約2.5。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有pI為約2.0±0.2至約5.0±0.2。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有pI約4.3±0.2至約5.0±0.2。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，具有pI為約3.3±0.2至約4.7±0.2。本發明係提供一種製備組合物之方法，此組合物包含具有pI為約2.0±0.2至約5.0±0.2之CTLA4－Ig分子，此方法包括：(a)使CTLA4－Ig分子之混合物接受等電焦聚凝膠電泳，其中在凝膠上之單一譜帶表示具有特定pI之CTLA4－Ig分子之群集，與(b)單離具有pI為約2.0±0.2至約5.0±0.2之CTLA4－Ig分子群集，以製備組合物。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比為約17至約25。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比為約15至約35。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc之平均莫耳比為約1.7至約3.6。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖之平均莫耳比為約8至約17。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之海藻糖之平均莫耳比為約3.5至約8.3。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之甘露糖之平均莫耳比為約7.2至約22。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子之特徵為每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸之平均莫耳比為約6至約12。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比約15至約35；與(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸之平均莫耳比約6至約12。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc之平均莫耳比約1.7至約3.6；及(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸之平均莫耳比約6至約12。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc之平均莫耳比約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖之平均莫耳比約8至約17；及(d)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸之平均莫耳比約6至約12。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc之平均莫耳比約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖之平均莫耳比約8至約17；(d)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之海藻糖之平均莫耳比約3.5至約8.3；及(e)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸之平均莫耳比約6至約12。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc之平均莫耳比約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖之平均莫耳比約8至約17；(d)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之海藻糖之平均莫耳比約3.5至約8.3；(e)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之甘露糖之平均莫耳比約7.2至約22；及(f)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸之平均莫耳比約6至約12。
本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中組合物顯示NGNA層析圖吸收峰為約9.589＋/－0.3，與NANA層析圖吸收峰為約10.543＋/－0.3。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA－Ig分子顯示如圖6中所示之碳水化合物分佈形態。本發明係提供包含CTLA4－Ig分子之組合物，其中CTLA4－Ig分子顯示功能部位I－IV之碳水化合物分佈形態其中功能部位I包含表示非唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位II包含表示單－唾液酸基化寡醣之吸收峰，功能部位III包含表示二－唾液酸基化寡醣之吸收峰，及功能部位IV包含表示三－唾液酸基化寡醣之吸收峰。於一項具體實施例中，在功能部位I中之第一個吸收峰與在功能部位II中之主峰間之N－連結寡醣，於滯留時間上之差異為約22至約28分鐘。本發明係提供包含CTLA4－Ig二聚體分子之組合物，其中至少0.5%之CTLA4－Ig二聚體分子係經半胱胺醯基化。於另一項具體實施例中，至少1.0%之CTLA4－Ig二聚體分子係經半胱胺醯基化。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中群集顯示如圖7中所示之質量光譜法分佈形態。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中群集顯示如圖18與19中所示之毛細電泳法分佈形態。本發明係提供CTLA4－Ig分子之組合物，其具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約6至約18，其中CTLA4－Ig二聚體係製自市售細胞系之細胞。本發明係提供藉本發明之任何方法獲得之CTLA4－Ig組合物。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中分子係在順序識別碼：2之位置102處之天冬素胺基酸殘基，在順序識別碼：2之位置134處之天冬素胺基酸殘基，在順序識別碼：2之位置233處之天冬素胺基酸殘基，在順序識別碼：2之位置155處之絲胺酸胺基酸殘基或在順序識別碼：2之位置165處之絲胺酸胺基酸殘基上經糖基化。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中分子群集之特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc之平均莫耳比約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖之平均莫耳比約8至約17；(d)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之海藻糖之平均莫耳比約3.5至約8.3；(e)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之甘露糖之平均莫耳比約7.2至約22；(f)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸之平均莫耳比約6至約12；(g)pI當測定自等電焦聚凝膠上之顯像時在約2.4±0.2至約5.0±0.2之範圍內；(h)MCP－1低於或等於5ppm；(i)低於2.5%四聚體；(j)低於0.5%單體；(k)群集之CTLA4－Ig多肽，具有胺基酸至少95%相同於任何順序識別碼：2－8；(1)其中在群集內之CTLA4－Ig分子係能夠結合至CD80與CD86。本發明係提供CTLA4－Ig分子之群集，其中分子群集之特徵為：(a)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GlcNAc之平均莫耳比約15至約35；(b)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之GalNAc之平均莫耳比約1.7至約3.6；(c)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之半乳糖之平均莫耳比約8至約17；(d)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之海藻糖之平均莫耳比約3.5至約8.3；(e)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之甘露糖之平均莫耳比約7.2至約22；(f)每莫耳CTLA4－Ig二聚體之唾液酸之平均莫耳比約6至約12；(g)pI當測定自等電焦聚凝膠上之顯像時在約2.4±0.2至約5.0±0.2之範圍內；(h)MCP－1低於或等於5 ppm；(i)低於2.5%四聚體；(j)低於0.5%單體；(k)群集之CTLA4－Ig多肽，具有胺基酸至少95%相同於任何順序識別碼：2－8；(1)其中在群集內之CTLA4－Ig分子係能夠結合至CD80與CD86；或其醫藥相當物。本發明係提供一種組合物，其包含有效量之CTLA4－Ig分子，及藥學上可接受之載劑。本發明係提供包含有效量CTLA4－Ig分子之組合物，其中此組合物進一步包含一數量之麥芽糖單水合物。於一項具體實施例中，此組合物進一步包含藥學上可接受之稀釋劑、佐劑或載劑。於一項具體實施例中，此組合物進一步包含麥芽糖、磷酸鈉單鹽基性單水合物、氯化鈉、氫氧化鈉及無菌水。於一項具體實施例中，此組合物進一步包含蔗糖、聚氧體(poloxamer)、磷酸鈉單鹽基性單水合物、無水二鹽基性磷酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉及無菌水。
本發明係提供經凍乾之CTLA4－Ig混合物，包含至少95%CTLA4－Ig二聚體與不大於5% CTLA4－Ig四聚體。於一項具體實施例中，混合物包含至少98% CTLA4－Ig二聚體與不超過2%CTLA4－Ig四聚體。於一項具體實施例中，混合物包含至少99%CTLA4－Ig二聚體與不超過1% CTLA4－Ig四聚體。於一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig二聚體至少8.0莫耳唾液酸。於一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig二聚體約15.7至約31莫耳GlcNAc。於一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig二聚體約1.6至約3.2莫耳GalNAc。於一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig二聚體約9.3至約15.5莫耳半乳糖。於一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig二聚體約3.6至約7.9莫耳海藻糖。於一項具體實施例中，混合物包含每莫耳CTLA4－Ig二聚體約9.7莫耳甘露糖。本發明係提供醫藥套件，其包含：(a)含有如請求項1之經凍乾CTLA4－Ig混合物之容器；與(b)關於將經凍乾之CTLA4－Ig混合物重配成注射用溶液之說明書。
本發明係提供抑制T細胞增生(或活化作用)之方法，此方法包括使T細胞與有效量之CTLA4－Ig組合物接觸。本發明係提供在病患中抑制免疫回應之方法，此方法包括對於需要其治療之病患投予有效量之組合物。本發明係提供在病患中引致對抗原之免疫耐受性、在病患中治療發炎、治療風濕性關節炎、在病患中治療牛皮癬、在病患中治療狼瘡、在病患中治療或預防過敏反應、在病患中治療或預防移植物對宿主疾病、在病患中治療或預防經移植器官之排斥、在病患中治療多發性硬化、在病患中治療第I型糖尿病、在病患中治療炎性腸疾病、在病患中治療卵巢炎、在病患中治療絲球體性腎炎、在病患中治療過敏性腦脊髓炎或在病患中治療重症肌無力之方法，其方式是將本發明組合物以一數量投予病患，以治療該疾病或病症。組合物可併用藥學上可接受之載劑。本發明係提供具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約6至約18之CTLA4－Ig分子之群集於藥劑製造上之用途，該藥劑係用於免疫病症之治療及/或預防治療。本發明係提供具有唾液酸基團對CTLA4－Ig二聚體之平均莫耳比為約6至約18之CTLA4－Ig分子之群集於抗風濕性關節炎劑製造上之用途，在包裝中伴隨著其在風濕性關節炎治療中使用之說明書。本發明係提供抑制T細胞增生(或活化作用)之方法，此方法包括使T細胞與併用胺甲喋呤之有效量本發明組合物接觸。本發明係提供在病患中抑制免疫回應之方法，此方法包括對於需要其治療之病患投予有效量之本發明組合物，且併用胺甲喋呤。本發明係提供在病患中引致對抗原之免疫耐受性之方法，此方法包括對於需要其治療之病患投予有效量之如請求項1－64中任一項之組合物，且併用胺甲喋呤。本發明係提供製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞擴大，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升液體培養物，其中重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質。於一項具體實施例中，步驟(a)之擴大係包括：(i)在不含血清化學上定義之培養基中培養細胞，具有至少四個繼代，以獲得細胞密度為每毫升至少約1.0 x 105個存活細胞，其中各接種階段係在每毫升約2 x 105 下開始且進行至每毫升1－2百萬個細胞；(ii)保持細胞在培養物中，歷經足以從培養物產生至少約0.5克/升之時間。於一項具體實施例中，蛋白質係為糖蛋白。於一項具體實施例中，蛋白質為CTLA4－Ig蛋白質。於一項具體實施例中，哺乳動物細胞為後代細胞。於一項具體實施例中，哺乳動物細胞為能夠產生CTLA4－Ig融合蛋白質之CHO無性繁殖細胞系之後代，其中CHO細胞已在其基因組中安定地整合CTLA4－Ig表現卡匣之至少30種複製物。於一項具體實施例中，足夠時間為達其細胞之存活力不會落至低於30%之時間。於一項具體實施例中，足夠時間為達其細胞之存活力不會落至低於40%之時間。於一項具體實施例中，足夠時間為達其細胞之存活力不會落至低於50%之時間。於一項具體實施例中，足夠時間為達其細胞之存活力不會落至低於60%之時間。於一項具體實施例中，足夠時間為達其細胞之存活力不會落至低於70%，或80%，或90%，或95%之時間。於一項具體實施例中，至少四個繼代包括：(i)使細胞在至少50毫升之培養體積中生長，直到達成細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止，(ii)使細胞在至少10升之培養體積中生長，直到達成細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止；(iii)使細胞在至少100升之培養體積中生長，直到達成細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止；及(iv)使細胞在200升之培養體積中生長，直到達成細胞密度為每毫升約1百萬至約2.5百萬個細胞為止。於一項具體實施例中，係將半乳糖添加至不含血清化學上定義之培養基中。於一項具體實施例中，保持係包括(i)降低培養溫度，從37±2℃至34±2℃；與(ii)降低培養溫度，從34±2℃至32±2℃。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少5天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少6天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少7天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少8天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少9天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少10天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少11天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少12天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少13天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少14天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少15天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少16天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少17天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至少18天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，歷經至高18天。於一項具體實施例中，溫度係被保持在32±2℃之範圍內，直到培養物之細胞密度為每毫升液體培養物約30 x 105 至約79 x 105 個細胞為止。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞，從接種培養物擴大到至少10,000升之液體培養物中，以致重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質，其中單離僅發生在液體培養物含有每莫耳蛋白質大於或等於約6.0莫耳NANA時。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞，從接種培養物擴大到至少10,000升之液體培養物中，以致重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質，其中單離僅發生在液體培養物具有細胞密度為每毫升約33 x 105 至約79 x 105 個細胞時。
本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞，從接種培養物擴大到至少10,000升之液體培養物中，以致重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質，其中單離係發生在液體培養物中之細胞存活力尚未落至低於約20%，或約30%，或約38%時。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞，從接種培養物擴大到至少10,000升之液體培養物中，以致重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質，其中單離僅發生在內毒素係為每毫升液體培養物低於或等於約76.8 EU時。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞，從接種培養物擴大到至少10,000升之液體培養物中，以致重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質，其中單離僅發生在生物負載量係為每毫升液體培養物低於1個菌落形成單位時。本發明係提供一種製造重組蛋白質之方法，此方法包括：(a)使會分泌重組蛋白質之哺乳動物細胞，從接種培養物擴大到至少10,000升之液體培養物中，以致重組蛋白質濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離重組蛋白質，其中單離僅發生在符合至少兩個下列條件時：(i)液體培養物含有每莫耳蛋白質大於或等於約6.0莫耳NANA，(ii)液體培養物具有細胞密度為每毫升約33 x 105 至約79 x 105 個細胞，(iii)在液體培養物中之細胞存活力尚未落至低於約20%，或約38%，或(iv)CTLA4－Ig在培養物中之量係大於0.5克/升。於一項具體實施例中，單離係包括：(i)獲得細胞培養物上層清液；(ii)使上層清液接受陰離子交換層析，以獲得經溶離之蛋白質產物；(iii)使步驟(ii)之經溶離蛋白質產物接受疏水性交互作用層析，以獲得富含之蛋白質產物；(iv)使富含之蛋白質產物接受親和層析法，以獲得經溶離且富含之蛋白質產物；及(v)使(iv)之經溶離且富含之蛋白質產物接受陰離子交換層析。於一項具體實施例中，於步驟(iii)中所得之富含蛋白質產物，其特徵在於任何高分子量多聚體之百分比係低於25重量%。於一項具體實施例中，步驟(ii)之陰離子交換層析係使用包含約75 mM HEPES與約360 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於一項具體實施例中，步驟(ii)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPES與約325 mM NaCl且具有pH值約7.0之溶離緩衝劑進行。於一項具體實施例中，步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用包含約25 mM HEPES與約850 mM NaCl且具有pH值約7.0之單一洗滌緩衝劑進行。於一項具體實施例中，步驟(iv)之親和層析法係使用包含約25 mM Tris與約250 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於一項具體實施例中，步驟(iv)之親和層析法係使用包含約100 mM甘胺酸且具有pH值約3.5之溶離緩衝劑進行。於一項具體實施例中，步驟(v)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPEs與約120 mM NaCl至約130 mM NaCl且具有pH值約8.0之洗滌緩衝劑進行。於一項具體實施例中，步驟(v)之陰離子交換層析係使用包含約25 mM HEPES與約200 mM NaCl且具有pH值約8.0之溶離緩衝劑進行。於一項具體實施例中，步驟(ii)之陰離子交換層析係使用具有一級、二級、三級或四級胺官能基之陰離子交換樹脂之管柱進行。於一項具體實施例中，樹脂具有四級胺官能基。於一項具體實施例中，步驟(iii)之疏水性交互作用層析係使用具有苯基、辛基、丙基、烷氧基、丁基或異戊基官能基之疏水性交互作用樹脂進行。於一項具體實施例中，官能基為苯基官能基。於一項具體實施例中，步驟(iv)之親和層析法係使用含有蛋白質A之管柱進行。於一項具體實施例中，係提供製備CTLA4－Ig之方法，此方法包括自液體細胞培養物純化CTLA4－Ig，以致經純化之CTLA4－Ig(a)具有每毫克CTLA4－Ig二聚體約38毫微克MCP－1，與(b)包含低於2.5重量%之CTLA4－Ig四聚體。
於一項具體實施例中，液體細胞培養物包含本發明之細胞或後代細胞。本發明係提供製造CTLA4－Ig之方法，此方法包括：(a)擴大能夠產生CTLA4－Ig之任何市售細胞系或CHO細胞之後代細胞，其中擴大係從接種培養物到至少10,000升液體培養物，其中CTLA4－Ig濃度為至少0.5克/升液體培養物；與(b)自至少10,000升液體培養物單離CTLA4－Ig，其中層析係在具有至少苯基官能基之疏水性交互作用樹脂之管柱上，其中單離包括疏水性交互作用層析之步驟，使用包含約25 mM HEPES與約850 mM NaCl且具有pH值約7.0之單一洗滌緩衝劑進行。
 本發明之實例
許多實例係提供於下文，以幫助更完全瞭解本發明。下述實例係說明製造與實施本發明之舉例模式。但是，本發明之範圍並不限於此等實例中所揭示之特殊具體實施例，其係僅為達說明之目的，因為可利用替代方法以獲得類似結果。
下述實例係指CTLA4－Ig分子，其包含一或多個順序識別碼：2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16之順序。此等實例並非意謂限制，且熟諳此藝者明瞭實例可被擴大並經調整以適合例如其他CTLA4－Ig分子、其他糖蛋白及其他相關於或包含Ig－超族群蛋白質部份之蛋白質。
下表係詳述關於CTLA4－Ig與CTLA4A29YL104E －Ig之實例
實例1：在質粒pcSDhuCTLA4－Ig中之CTLA4－Ig編碼順序之確認
存在於pcSDhuCTLA4－Ig中之CTLA4－Ig基因之註解核酸順序，與CTLA4－Ig之相應經推論胺基酸順序，係示於圖1中。使pcSDhuCTLA4－Ig核酸轉染至CHO細胞中，以產生可表現CTLA4－Ig分子之安定轉染體(參閱實例12)。篩檢轉染體，並使某些轉染體次代無性繁殖或擴大，以產生無性繁殖細胞系。
DNA順序資料之分析係確認質粒建構期間所產生之接合係按設計，且於聚合酶鏈反應中所使用之合成寡核苷酸引物會產生CTLA4－Ig順序上游之正確制瘤素M訊息順序。融合蛋白質之鉸鏈區域中所要之半胱胺酸對絲胺酸改變(在順序識別碼：2之位置156,162及165處)係經確認。此等胺基酸殘基係以具有星號之粗體指定於圖1中。亦偵測順序識別碼：2之位置174處，脯胺酸對絲胺酸之另一個胺基酸改變。此改變係於IgG1 cDNA合成期間，藉由聚合酶鏈反應而被引進。此胺基酸殘基亦以具有星號之粗體指定於圖1中。
當與人類CTLA4與人類IgG1 恒定區域之經發表核苷酸順序比較時，DNA順序資料之分析係確認另一個差異。於CTLA4密碼區域之胺基酸110處之密碼子係被確認為ACC(蘇胺酸)，而非GCC(丙胺酸)。
實例2：CTLA4－Ig調配物
注射用之CTLA4－Ig組合物，250毫克/小玻瓶，係為無菌非熱原親液物，用於靜脈內(IV)投藥。將CTLA4－Ig分子之群集包裝在15－cc類型I燧石管件小玻瓶中。將各小玻瓶以20毫米經Daikyo灰色丁基D－21－7－S/B2－TR氟樹脂塗覆之塞子塞住，並以20毫米鋁製白色翻開式密封物密封。
各單次使用之小玻瓶係含有250毫克CTLA4－Ig組合物，其係於使用時以注射用之無菌水USP構成，並以0.9%氯化鈉注射液USP進一步稀釋。注射用之CTLA4－Ig組合物，250毫克/小玻瓶，與各成份之功能係列示於下表中。
CTLA4－Ig組合物係含有大約50毫克/毫升CTLA4－Ig，在25 mM磷酸鈉緩衝劑與50 mM氯化鈉中，於pH 7.5下。在早期發展期間，此緩衝系統係以CTLA4－Ig之物理與化學安定性作為pH、緩衝劑類型、緩衝劑濃度及氯化鈉濃度之函數之評估為基礎作選擇。CTLA4－Ig溶液之安定性係於5至9之pH範圍中研究。其結果顯示高分子量物種之形成係為pH依存性，且最高安定性之pH範圍係在7與8之間。在個別測定中，係評估緩衝劑類型與濃度之作用，其中已發現CTLA4－Ig組合物在pH 8下之磷酸鈉或三羥甲基胺基甲烷(Tris)緩衝液中，係同樣地安定。此外，在10至100 mM濃度間之緩衝劑濃度，對於CTLA4－Ig組合物在2°－8℃下之安定性，並未有任何衝擊。同樣地，在30至500 mM濃度間存在之氯化鈉，對於被儲存在2°－8℃下之CTLA4－Ig組合物之溶液狀態安定性無影響。
以此等結果為基礎，CTLA4－Ig組合物在10毫克/毫升下，於25 mM磷酸鈉緩衝劑與50 mM氯化鈉中，在pH 7.5下，係經選擇用於50毫克/小玻瓶強度下之調配物。稍後將CTLA4－Ig濃度在相同緩衝劑組合物中改變至50毫克/毫升，以允許具有200與250毫克/小玻瓶強度之CTLA4－Ig組合物之發展。
除了磷酸鈉緩衝劑與氯化鈉以外，注射用之CTLA4－Ig係與麥芽糖一起調配。於此產物中使用之賦形劑之功能係列示於上文表中。
無機鹽之存在，譬如氯化鈉與磷酸鈉緩衝劑成份，會降低冷凍系統之玻璃轉移溫度(Tg)。再者，在pH 7.5下當場形成之二鹽基性磷酸鈉，會在冷凍期間進行優先結晶化作用，其會降低經冷凍溶液之微環境pH。以此等理由為基礎，係選擇最少量之氯化鈉與磷酸鈉緩衝劑，以使其對冷凍乾燥過程之衝擊降至最低。添加麥芽糖作為安定劑，其係個別在藥物產物之冷凍乾燥期間及在隨後儲存時，充作低溫－與凍乾保護劑。注射用之CTLA4－Ig組合物，250毫克/小玻瓶，係為無菌、單次使用小玻瓶，未具有抗微生物防腐劑。
實例3：CTLA4－Ig組合物之碳水化合物含量分析
此方法之目的係為提供CTLA4－Ig N－連結寡醣之層析分佈形態。此程序可用以獲得N－乙醯神經胺酸(NANA)與N－羥乙醯基神經胺酸(NGNA)對CTLA4－Ig試樣(全部經結合加上自由態)中蛋白質之莫耳比。NANA與NGNA為唾液酸之兩種形式。於CTLA4－Ig蛋白質上之糖基化作用含有N－連結之寡醣。例如，此等寡醣可藉由酵素水解，以PNGase F釋出，歷經22小時期間。自由態寡醣係使用高pH陰離子交換層析，採用電化學偵測，進行形態剖析。關於N－連結寡醣之碳水化合物分佈形態係使用具有脈衝式安培計偵測之高pH陰離子交換層析(HPAEC－PAD)進行評估。確認此等分佈形態，並使用與MS聯結之多孔性經石墨化之碳(PGC)層析獲得結構資訊。技術與結果兩者均被描述於此段落中。此程序係為順序識別碼之CTLA4－Ig之舉例：N－連結寡醣單離 ：天冬素連結(N－連結)寡醣自CTLA4－Ig之分裂係藉由酵素水解，使用PNGase F進行。為進行去糖基化作用，係首先使CTLA4－Ig還原與變性：將含有0.5% SDS與1% β－巰基乙醇之176微升5 mM磷酸鈉緩衝劑中之1－2毫克CTLA4－Ig在100℃下加熱2分鐘，然後允許冷卻至環境溫度。於已冷卻之混合物中，添加16微升10% NP－40。將試樣充分混合，並添加40微升PNGase F(50,000 U/毫升，在50 mM磷酸鈉緩衝劑中)。將試樣充分混合，並在38℃下培養24小時。使以酵素方式釋出之寡醣(聚醣)，在1.0毫升/分鐘之流率下，藉逆相高性能液相層析法(HPLC)，使用與熱HyperCarb管柱(4.6 x 100毫米；5微升)聯結之Phenomenex Luna C18管柱(4.6 x 150毫米；5微升)純化；用於單離之層析儀為裝有Waters 2996偵測器之Waters Alliance 2695。首先使管柱以0.05%三氟醋酸(TFA)達成平衡。於注射試樣後，起始乙腈之梯度液，在15分鐘下，以0.05% TFA在12%乙腈中之溶劑組合物終止。然後，使聚醣以逐步梯度液至0.05% TFA在60%乙腈中，自HyperCarb管柱溶離。收集聚醣，同時藉由206毫微米下之UV吸光率監控，並在真空下濃縮至乾涸。於後續注射之前，將Luna C18管柱以40%乙腈、40%異丙醇、20%水中之0.05% TFA清洗。
NANA儲備溶液(N－乙醯神經胺酸)(1毫克/毫升)之製備。重要的是：在稱重之前，允許NANA標準物溫熱至室溫。未能如此進行將會造成水凝結在標準物中。僅打開足夠長之時間以獲得所要之量，然後將瓶子緊密地再封合，並返回冷凍庫，與乾燥劑一起儲存。將在3與10毫克間之N－乙醯神經胺酸精確地稱量。記錄至最接近0.1毫克。若使用稱量紙/船形物進行稱量，則轉移至適當大小容器。添加足量之HPLC級水，以產生濃度為1毫克/毫升之溶液。以攪拌棒塊或藉由渦旋混合，直到溶解為止。於聚丙烯管件中，在2與8℃之間儲存至高3個月。
NGNA儲備溶液(N－羥乙醯基神經胺酸)(1毫克/毫升)之製備。重要的是：在稱重之前，允許NGNA標準物溫熱至室溫。未能如此進行將會造成水凝結在儲備液中。僅打開足夠長之時間以獲得所要之量，然後將瓶子緊密地再封合，並返回冷凍庫，與乾燥劑一起儲存。將在3與10毫克間之N－羥乙醯基神經胺酸精確地稱量(記錄至最接近0.1毫克)。記錄至最接近0.1毫克。若使用稱量紙/船形物進行稱量，則轉移至適當大小容器。添加適當體積之HPLC級水，以產生標的濃度為1毫克/毫升之溶液。以攪拌棒塊或藉由渦旋混合，直到溶解為止。於聚丙烯管件中，在2與8℃之間儲存至高3個月。
系統適合性溶液. 在適當容器中，將各0.050毫升之1毫克/毫升NANA與NGNA儲備溶液添加至0.900毫升HPLC級水中。藉由渦旋混合。在2與8℃之間儲存至高3個月。N－乙醯神經胺酸工作溶液(0.050毫克/毫升)。精確地度量0.050毫升之1毫克/毫升NANA儲備溶液，並添加至0.950毫升HPLC級水中。藉由渦旋混合。於使用時重複製備。N－羥乙醯基神經胺酸工作溶液(0.050毫克/毫升)。精確地度量0.050毫升1毫克/毫升NGNA儲備溶液，並添加至0.950毫升HPLC級水中。藉由渦旋混合。於使用時重複製備。
試樣與水解空白試驗之製備. 自分析證明書(COA)獲得CTLA4－Ig物質之蛋白質濃度。經由將0.190毫升HPLC級水添加至1.5毫升微離心管中，製備水解空白試驗之單一試樣。使用HPLC級水，製備試樣與CTLA4－Ig參考物質之兩種1毫克/毫升溶液。藉由渦旋混合。
試樣、CTLA4－Ig參考物質及水解空白試驗之水解作用.在1.5毫升微離心管中，進行參考物質與試樣之重複製備之水解作用。註：重要的是使用微離心管，將其完全地安裝至加熱板塊中。將0.010毫升1M H2 SO4 添加至0.190毫升之試樣與CTLA4－Ig參考物質之1毫克/毫升稀釋液及水解空白試驗中。藉由渦旋混合，並將蓋子藉由蓋鎖或膠帶固定。將微離心管放置在80℃±2℃加熱板塊中，歷經1小時±2分鐘。於培養後，自加熱板塊移除管件，將管件放置在微離心機中，並旋轉，以迫使試樣至管件底部。將經水解之溶液分成數液份至自動取樣小玻瓶中，並放置在自動取樣器內供注射。
儀器條件. 準備高性能液相層析法(HPLC)系統。安裝下列條件。在0.6毫升/分鐘之流率與40℃之溫度下，使管柱達成平衡，歷經至少一小時。
系統適合性. 以作為儀器空白試驗之流動相之注射開始分析，以評估系統基線，其應為平坦且安定。若基線不為平坦且安定，則應施行其他空白試驗注射。註：基線之位移不應超過0.25 AU。進行系統適合性溶液之六份複製注射。計算解析度(R)與理論板數(N)。
使用第一個適合性注射，利用下列方程式計算理論板數(N)： 其中：N＝理論板數計數t＝NANA吸收峰之滯留時間，以分鐘表示W＝在基線下之NANA峰寬，以分鐘表示
計算CTLA4－Ig參考物質與試樣中之NANA與NGNA之莫耳數。在各操作開始與結束時注射NANA與NGNA標準物。將關於NANA與NGNA之複製注射之面積計數平均。將此面積使用於下列方程式中： X＝段落7.3.1中所計算之工作用溶液中之NANA或NGNA之莫耳數Y＝對於各製備之阿巴塔謝特(Abatacept)參考物質或試樣中之NANA或NGNA之面積計數(註：參閱段落7.2與圖3，關於吸收峰整合以提供NANA)Z＝工作溶液中之複製NANA或NGNA之平均面積
於一項具體實施例中，在NGNA與NANA吸收峰間之解析度必須>1.3。理論板數計數必須>或＝4000。以NANA吸收峰面積計數之%RSD所評估系統適合性注射再現性必須≦3%。理論板數計數必須≧4000。以NANA吸收峰面積計數之%RSD所評估系統適合性之注射再現性必須≦3%。
藉由具有脈衝式安培計偵測之高pH陰離子交換層析(HPAEC－PAD)之N－連結寡醣剖析 ：經單離寡醣之HPAEC係於層析系統上進行，其包括裝有Waters 464電化學偵測器之Waters Alliance，利用Dionex CarboPack PA1(4 x 250毫米)陰離子交換管柱與Dionex CarboPack防護管柱。將寡醣試樣使用200 mM氫氧化鈉中之醋酸鈉梯度液溶離(將醋酸鈉濃度從注射時之0 mM增加至60分鐘下之225 mM)。電化學偵測器係在脈衝模式下，使用脈衝電位E1＝0.05V(t1 ＝0.4秒)，S＝0.75V(t2 ＝0.2秒)，E3＝－0.15V(t3 ＝0.4秒)操作。偵測元件係由金工作電極、不銹鋼逆電極及銀/氯化銀參考電極所組成。
此方法係描述測定自CTLA4－Ig試樣中之蛋白質所釋出N－連結寡醣之HPAEC(高pH陰離子交換層析)寡醣分佈形態之程序。此方法之目的係為提供CTLA4－Ig之層析分佈形態，譬如CTLA4－Ig藥物N－連結寡醣，其可用於CTLA4－Ig分子之不同組合物間之比較分析。於CTLA4－Ig蛋白質上之糖基化作用含有N－連結之寡醣。此等寡醣係藉由酵素水解，以PNGase F(肽：N－糖苷酶F)釋出，歷經22小時期間。自由態寡醣係使用高pH陰離子交換層析，採用電化學偵測，進行形態剖析。
藥物之寡醣分佈形態係針對同時操作之參考物質試樣進行評估。結果係以經選擇之功能部位及吸收峰，與參考標準中之相同吸收峰之百分比偏差作報告。
藉由陰離子交換層析之寡醣分佈形態之層析條件
註：使管柱與偵測器，在分析流率下，以最初流動相達成平衡，歷經大約2小時，或直到在製造注射液之前基線為安定為止。
自動取樣器溫度經設定為：4℃注射體積 60微升操作時間 100分鐘於各功能部位中之主吸收峰之大約滯留時間(RT；分鐘)(參閱圖1)；數值可依系統適合性(SS)標準之RT而改變
關於HPAEC寡醣碳水化合物形態剖析之流動相之製備HPAEC溶離劑1：500 mM醋酸鈉(NaOAc)。稱量20.51±0.05克醋酸鈉(無水)，置於含有400毫升HPLC級水之500毫升量筒中。以HPLC級水使體積來到500毫升，並使用塑膠血清學吸量管攪拌5分鐘，直到完全混合為止。使溶液經過0.2微米尼龍濾器過濾。轉移至1升溶離劑瓶。將瓶鬆散地加蓋，並以氦噴射20分鐘。束緊蓋子，並以氦加壓瓶子。將此溶液於室溫及氦下儲存至高三週。
HPAEC溶離劑2：400 mM氫氧化鈉(NaOH)。使用1升量筒，度量960毫升HPLC級水，並轉移至乾淨1升溶離劑瓶。使用血清學塑膠吸量管，將40.0毫升10N NaOH直接添加至溶離劑瓶中，並藉由漩渦打轉混合溶離劑。將瓶鬆散地加蓋，並以氦噴射20分鐘。束緊蓋子，並以氦加壓瓶子。將溶液於室溫及氦下儲存至高三週。
HPAEC溶離劑3：HPLC級水。將1升溶離劑瓶以大約1升HPLC級水充填。將溶離劑瓶放置在系統上，鬆散地加蓋，並噴射大約20分鐘。束緊蓋子，並以氦加壓瓶子。將溶液於室溫及氦下儲存至高三週。
50 mM磷酸鈉緩衝劑,0.02%疊氮化鈉,pH＝7.5.NaH2 PO4 ．H2 O 6.9克NaN3 0.2克H2 O 1.0升最後體積
稱量出6.9克±0.1克NaH2 PO4 ．H2 O與0.2克NaN3 ，並在1升試劑瓶中，溶解於800毫升HPLC級H2 O內，使用以磁攪拌棒之連續混合。使用pH計，將溶液之pH值使用10M NaOH調整至7.5。使用1升量筒使最後體積來到1.0升。將溶液於室溫下儲存至高六個月。
50 mM磷酸鈉緩衝劑,0.02%疊氮化鈉,pH＝7.5中之PNGase F酵素工作儲備液50 mM磷酸鈉緩衝劑0.02%疊氮化鈉,pH＝7.5. 1.8毫升得自套件之PNGase F，目錄編號P0704L 0.2毫升
將1.8毫升50 mM磷酸鈉緩衝劑,0.02%疊氮化鈉,pH 7.5以吸量管吸取至1.8毫升低溫小玻瓶中。添加0.2毫升得自套件之PNGase F，並充分地混合。將溶液於－20℃或較低下儲存至高六個月。溶液可在冷凍之前被分成數液份。
外部系統適合性標準物. 水蘇四糖儲備溶液(1.25毫克/毫升)。將0.125克水蘇四糖於稱量紙上稱量。使用分析天平，並轉移至100毫升量瓶。以HPLC級水充填至記號處，並充分地混合。以2毫升數液份，分至Nalgene低溫小玻瓶中。將溶液於－20℃或較低下儲存至高六個月。
水蘇四糖系統適合性標準物(12.5微克/毫升)。將1毫升1.25毫克/毫升儲備液以吸量管吸取至100毫升量瓶中。以HPLC級水充填至記號處，並充分地混合。以200微升數液份分至0.65毫升微離心管件中。將管件放置在經適當標識之儲存箱中。將系統適合性溶液於－20℃或較低下儲存至高六個月。
標準物與試樣製備 參考物質製備. 於含有1毫克經凍乾RapiGest SF之小玻瓶中，添加含有0.02%疊氮化Na,pH 7.5之625微升50 mM磷酸Na緩衝劑。於0.65毫升Eppendorf管件中，添加120微升含有緩衝劑之RapiGest SF。添加40微升參考物質(~50毫克/毫升)。最後RapiGest SF濃度應為0.12% w/v。添加40微升PN Gase F工作儲備液，充分地混合，使試樣旋轉而下，並在38±2℃下放置22±2小時(水浴或Alliance自動取樣器隔室)。將試樣以吸量管吸取至microcon YM－10離心濾器中，並在13,000克下離心30分鐘。將200微升HPLC水放置在濾器中，並經由在13,000克下再離心30分鐘沖洗至濾液中。使合併之濾液渦旋15秒，並使試樣離心10秒。使用吸量管，將所形成之溶液(~380微升)轉移至HPLC總回收自動取樣器小玻瓶(項目1.15)。
試樣製備. 於0.65毫升Eppendorf管件中，添加120微升含有緩衝劑之RapiGest SF。添加40微升蛋白質試樣(此體積應與在1與2毫克間之CTLA4－Ig相等)。最後RapiGest SF濃度應為0.12% w/v。添加40微升PNGase F工作儲備液，藉由渦旋充分地混合10秒。使試樣旋轉而下，並放置在38±2℃下22±2小時(水浴或Alliance自動取樣器隔室)。將試樣以吸量管吸取至microcon YM－10離心濾器中，並在13,000克下離心30分鐘。將200微升HPLC水放置在濾器中，並經由在13,000克下再離心30分鐘沖洗至濾液中。使合併之濾液渦旋15秒，並使試樣離心10秒。將所形成之溶液(~380微升)轉移至總回收HPLC自動取樣器小玻瓶(項目1.15)。
系統適合性 電化學偵測器元件安定化作用。注射30微升外部水蘇四糖系統適合性標準物(12.5微克/毫升)。確保水蘇四糖之峰高為≧800 nA。確保沒有來自元件之過度電噪音，且基線為平坦。代表性系統適合性層析圖係示於圖2中。若水蘇四糖敏感性或基線為無法令人接受，則檢查緩衝劑組合物，清洗電極，或置換電極。若存在過度噪音，則檢查元件，以確保所有氣泡之移除。使元件再安定化，並再注射水蘇四糖標準物。
理論板數(N). 使用下式，以水蘇四糖吸收峰為基準測定理論板數(N)。其係經過Empower數據分析系統進行，或亦可以手動方式進行。N＝16(t/W)2 ，其中t：在最高高度下，從注射時間至吸收峰溶離時間所度量之滯留時間。W：峰寬，藉由側面至基線之外推法。N必須≧6000。若板數計數低於6000，則調整操作梯度液或置換管柱。
拖尾因數(T). 使用下式，以水蘇四糖吸收峰為基準測定管柱拖尾因數(T)。其係經過Empower數據分析系統進行，或亦可以手動方式進行。T＝(W0.05 /2f)，其中：W0.05 ：在5%高度(0.05h)下之峰寬。f：從在W0.05 下之吸收峰前方至吸收峰頂端之度量值(寬度)。T必須≦1.2。若拖尾因數大於1.2，則檢查緩衝劑組合物，置換管柱，或按指示清洗管柱，並再注射系統適合性標準物。
水蘇四糖系統適合性標準物滯留時間確認. 滯留時間為系統依存性。水蘇四糖系統適合性標準物應顯示18.5±2.0分鐘之滯留時間。CTLA4－Ig標準物質.觀察得自注射試樣前所注射第一個一起進行之參考物質之碳水化合物分佈形態。碳水化合物分佈形態應類似圖1中所示者。絕對滯留時間為系統依存性。確保在功能部位I中之第一個吸收峰(吸收峰1A)與功能部位III中之主峰(吸收峰3)間之滯留時間上之差異係於22分鐘與28分鐘之間。若吸收峰之描繪圖並不相似圖1中所獲得者，則採取適當行動(例如檢查儀器功能、清洗管柱、檢查/置換緩衝劑、置換管柱)，並再評估。下述程序可用以清洗管柱：關閉元件，並以80%溶離劑1、20%溶離劑2清洗管柱5分鐘，接著以50%溶離劑1、50%溶離劑2，清洗10分鐘。使管柱與元件(其中元件被打開)在最初條件下再達成平衡，並再評估。
注射順序按下述安裝經單離寡醣之注射順序：水蘇四糖標準物(30微升)參考物質(60微升)試樣(60微升)參考物質(60微升)建議≦五個試樣應在一起進行之參考物質注射之間操作。
數據分析 處理層析圖。在Empower中處理關於參考物質與試樣之層析圖。設定整合參數以致使吸收峰描繪圖與基線係類似圖74 中所示者，整合線可能需要以手動方式放置。進行關於所示相對功能部位面積與相對吸收峰面積之計算。若施行複製注射，則測定關於CTLA4－Ig物質與各試樣之此等參數之平均值。對於參考物質，係針對各複製關於所有複製平均值，測定其功能部位I、II、III、吸收峰1A與1B之相對偏差。
試樣之分佈形態與參考物質分佈形態之比較. 目視比較.測定試樣與參考物質兩者是否具有相同數目之功能部位與主要吸收峰。主要吸收峰為圖74中所標識之吸收峰(吸收峰1A、1B、1C、1D、2、3及4)。相對定量比較.將試樣之面積(功能部位I、II及III及吸收峰1A與1B；若複製注射由試樣製成，則使用其平均值)與得自一起進行之CTLA4－Ig注射之平均相對面積作比較。測定此等面積與平均CTLA4－Ig物質值之相對差異。計算－%功能部位面積(相對功能部位面積).計算關於參考物質與試樣分佈形態之功能部位之%功能部位面積。參考圖74關於功能部位面積之圖樣。按照圖74中之實例，利用下列資訊與公式(滯留時間為系統依存性，並於圖74中反映出結果)計算功能部位百分比例：功能部位I：在滯留時間大約18－24分鐘下之吸收峰面積之總和(吸收峰1A－1E)功能部位II：26－38分鐘之吸收峰之總和功能部位III：39－50分鐘之吸收峰之總和功能部位IV：51－64分鐘之吸收峰之總和功能部位V 65－75分鐘之吸收峰之總和
註：對於功能部位之滯留時間窗口將根據每日層析性能中之偏差而位移。據此調整時間。
關於功能部位I－III，亦計算一起進行之參考物質注射中之平均值，以及試樣注射中之平均值(若施行複製注射時)。
%吸收峰面積(相對峰面積)。計算關於參考物質與試樣分佈形態之吸收峰1A、1B、1C及3之%吸收峰面積。參考圖1關於吸收峰面積之圖樣；滯留時間為系統依存性。利用下列資訊與公式，計算吸收峰百分比例：
關於各吸收峰1A與1B，亦計算一起進行之參考物質注射中之平均值，以及試樣注射中之平均值(若施行複製注射時)。與平均參考物質值之百分比差異之計算。與參考物質比較，使用下式計算試樣之功能部位I－III、吸收峰1A與1B之平均相對面積中之百分比差異：%Diff＝| RM－S|/RM x 100其中：RM＝關於參考物質之吾人感興趣之平均相對面積值S＝關於試樣之吾人感興趣之平均相對面積值||＝絕對值
標準. 對於成為可接受之一項操作，必須符合系統適合性標準，且所有關於試樣之注射必須已成功地發生。此外，對於各一起進行之參考物質注射，功能部位I、II及III之%功能部位面積與吸收峰1A與1B之%吸收峰面積必須在其平均值之15%內。
藉由HPAEC－PAD之分析 ：使N－連結之寡醣自CTLA4－Ig分子分裂，並藉由HPAEC－PAD分析。寡醣係以所存在之唾液酸量為基準，溶離成四個功能部位。功能部位係以寡醣標準物之潛移為基礎被建立，並藉由MS確認。功能部位I表示非唾液酸基化之物種。功能部位II、III及IV係個別表示單－、二－及三－唾液酸基化之物種。為特徵鑒定在三個N－連接位置上之寡醣結構，係將肽T5、T7及T14個別地單離(參考表59關於此等肽之身分)。其係使用CTLA4－Ig之胰蛋白酶消化，及以手動方式收集相應於此三種肽之吸收峰而進行。
將經單離之肽以PNGase F處理以釋出寡醣，接著使其純化，並藉由HPAEC－PAD分析。肽T5並未產生良好分佈形態，因其難以純化，此係由於其極端疏水性所致。經分裂寡醣之量很低，此係由於在胰蛋白酶消化後，此肽自逆相層析步驟之低回收所致。
關於所有得自CTLA4－Ig與三種肽之N－連結碳水化合物之HPAEC－PAD分佈形態，係示於圖53A－D中。面板A係顯示CTLA4－Ig分子之N－連結寡醣分佈形態，而面板B、C及D係個別顯示T5、T7及T14之分佈形態。由於製備方法，故對各肽所注射寡醣之量係為不同。於肽T5上所檢出之大部份寡醣係包含單－與二－唾液酸基化之寡醣。T7之分佈形態主要含有經單－、二－及一些非－與三唾液酸基化之聚醣物種。只有少量三－唾液酸基化之結構可在T5上被檢出。肽T14主要包含非唾液酸基化之寡醣與少量經單－與二－唾液酸基化之寡醣。
藉由HPAEC－PAD所獲得之結果係提供位置專一之N－連接糖基化作用之資訊。得自CTLA4－Ig之CTLA4區域之N－連結寡醣，含有比得自CTLA4－Ig之Fc區域者較大比例之唾液酸基化之物種。
CTLA4－Ig之胰蛋白酶、Asp－N及胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶原肽定圖譜： 使CTLA4－Ig在含有6M胍與5 mM二硫基蘇糖醇(DTT)之50 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris)緩衝液(pH 8.0)中變性與還原。於50℃下20分鐘培養後，將碘乙醯胺(IAA)添加至最後濃度為10 mM，以使自由態硫醇類烷基化，並於50℃下，在黑暗中再持續培養20分鐘。將經還原與烷基化之混合物裝填至脫鹽管柱(Amersham NAP－5)上，然後以無論是50 mM Tris,10 mM CaCl2 ,pH 8.0或50 mM磷酸鈉緩衝劑,pH 7.5溶離至空隙體積中。於脫鹽之後，將經還原/烷基化之CTLA4－Ig使用兩種不同蛋白酶：胰蛋白酶或Asp－N消化。關於胰蛋白酶加上胰凝乳蛋白酶原消化，既不使CTLA4－Ig還原亦不使其烷基化。
關於胰蛋白酶消化，係添加定序級胰蛋白酶(Roche，2%，w/w，酵素/蛋白質)，並在37℃下培養4小時。關於Asp－N消化，係添加定序級Asp－N(Roche，4%，w/w，酵素/蛋白質)，並在37℃下培養16小時。關於胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶原消化，係添加定序級胰蛋白酶(Promega，4%，w/w，酵素/蛋白質)，並在37℃下培養4小時，然後添加a－胰凝乳蛋白酶原(Sigma，4%，w/w，酵素/蛋白質)，且在37℃下培養16小時。於消化後，將所有試樣放置在冷凍庫中。
將所形成之肽混合物在0.120毫升/分鐘下，藉由梯度溶離液自Waters Alliance HPLC工作站上之Waters AtlantisTM dC18管柱(2.1 x 250毫米)分離。將管柱直接連接至裝有離子噴霧來源之Waters Micromass Q－Tof microTM 質譜儀，供收集質譜用。亦將肽混合物於Varian Polaris C18管柱(4.6 x 250毫米)上，在0.7毫升/分鐘下，使用相同HPLC工作站分離。使管柱以溶劑A(在水中之0.02% TFA)達成平衡，並使肽藉由溶劑B(95%乙腈/水中之0.02% TFA)之漸增濃度溶離。使用管柱後分流器閥，以導引15%流量至Q－Tof工作站，其係於正TOF模式(m/z 100－2000)中操作。所使用之典型離子噴霧電壓為3000 V。
藉由MS之CTLA4－Ig分析 ：將CTLA4－Ig以100 mM Tris,25 mM NaCl,pH 8稀釋，達最後濃度為0.7毫克/毫升。將PNGase F(New England Biolabs)以100 mM Tris,25 mM NaCl,pH 8稀釋30倍，達最後濃度為17 U/微升。將等體積(各60微升)之經稀釋、純化之發酵試樣與經稀釋之糖苷酶溶液混合，並在37℃下培養4小時。
將所形成經去糖基化之CTLA4－Ig(2微克)裝填至聚合體為基料(聚苯乙烯與聚N－乙烯基－2－四氫吡咯酮之共聚物)之Waters Oasis逆相萃取藥筒管柱(2.1 x 20毫米)上。將經裝填之管柱在0.2毫升/分鐘之流率下，以5%溶劑B(溶劑A：水中之1%甲酸，溶劑B：乙腈中之1%甲酸)洗滌五分鐘，以脫鹽，其中溶離劑係轉向廢棄。於5分鐘結束時，快速梯度液(在10分鐘內，5%溶劑B至95%溶劑B)，係開始使CTLA4－Ig溶離出管柱；此處，溶離劑係於流動分離後，在45微升/分鐘下，導入質譜儀(Waters Micromass Q－Tof microTM )中(所使用之層析系統為裝有Waters 2996偵測器之Waters Alliance 2695)。
將Q－Tof microTM 之毛細管電壓設定在3 kV下，且試樣圓錐體電壓在40V下。將以每0.9秒之掃描平均成為一次掃描；掃描間之時間為0.1秒。Q－Tof分析器係從m/z 800掃描至2500。使用Waters MassLynxTM 軟體，將相應於高於最高峰高度(在TIC層析圖中)一半之部份之光譜合併。使合併之光譜接受Waters MaxEnt1去旋。將解析度設定在1 Da/通道，且均勻高斯傷害模式係經選擇，具有設定在0.5－1 Da間之半高度下之寬度。將左邊吸收峰與右邊吸收峰之最低強度比例均設定在50%下。
使用多孔性經石墨化之碳(PGC)藉液相層析法/質量光譜法(LC/MS)之N－連結寡醣分析 ：使用裝有Waters 2996光二極體陣列偵測器之Waters Alliance 2695 HPLC系統，將經單離之寡醣於多孔性經石墨化之管柱(Thermo Hypercarb；4.6 x 100毫米)上分離。寡醣分離係使用乙腈在0.05% TFA中漸增比例之兩階段梯度液達成。於梯度液之第一階段中，乙腈百分比係涵蓋從注射時之9.6%至80分鐘時之24%之範圍。於梯度液之第二階段中，乙腈百分比係涵蓋從80分鐘時之24%至110分鐘時之60%之範圍。在整個階段使用0.2毫升/分鐘之流率。溶離液流係藉由206毫微米下之UV偵測監控，並使用Waters Micromass Q－Tof microTM ，藉由質量光譜法分析，供質量鑑定。
藉由LC/MS PGC方法之碳水化合物分析 ：藉由蛋白質之去糖基化作用之寡醣單離，係經由酵素水解，使用PNGase F(New England Biolabs,Beverly,MA)進行。關於去糖基化作用，使含有0.15%(w/v)Rapigest SF(Waters公司)之160微升50 mM磷酸鈉緩衝劑中之1與2毫克間之糖蛋白，藉由在100℃下加熱2分鐘而被變性。將已冷卻之溶液混合，並添加40微升PNGase F(50,000 U/毫升，在50 mM磷酸鈉緩衝劑中，pH 7.5)。使試樣渦旋，接著在38℃下培養24小時。使以酵素方式釋出之寡醣藉高性能液相層析法純化。逆相液相層析法係於1.0毫升/分鐘之流率下，在與Thermo HyperCarb 5微升(4.6 x 100毫米，Phenomenex,Torrance,CA)聯結之Phenomenex Luna 5微升C18管柱(4.6 x 150毫米，Phenomenex,Torrance,CA)上進行。於注射之前，使管柱以0.05%三氟醋酸(TFA)達成平衡，於注射試樣(150微升消化混合物)後，起始乙腈之梯度液，在15分鐘與0.05% TFA在12%乙腈中之溶劑組成下終止。然後，將聚醣經由以60%乙腈中之0.05% TFA洗滌，自HyperCarb管柱溶離。藉由在206毫微米下之UV吸光率偵測聚醣。收集自Hypercarb洗滌所溶離之吸收峰，並在真空下濃縮至乾涸。於後續注射之前，將Luna C18管柱以40%乙腈、40%異丙醇、20%水中之0.05% TFA清洗。
經單離寡醣以PGC之形態剖析 用於經單離寡醣之PGC層析之系統包括裝有Waters 2996光二極體陣列偵測器，利用Hypercarb管柱(2.1 x 100毫米)之Waters Alliance。將寡醣試樣使用乙腈梯度液溶離。
酸性流動相溶離：0.05%三氟醋酸(TFA)中之乙腈梯度液.將漸增乙腈之兩階段梯度液使用於寡醣之層析分離。乙腈體積百分比從注射時之9.6%增加至80分鐘時之24%之最初線性梯度液，係接著為乙腈體積百分比從80分鐘時之24%增加至110分鐘時之60%乙腈之第二種梯度液。在整個梯度液中使用0.15毫升/分鐘之流率。溶離液流係於206毫微米下，以Waters UV偵測器監控，接著針對質量鑑定，使用Micromass Q－Tof Micro。將關於ESI探測之離子化作用參數按下述設定：毛細管電壓＝3 kV，圓錐體電壓＝45V，來源溫度80℃，及去溶劑化作用溫度為175℃。
鹼性流動相溶離：將0.4%氫氧化銨(NH4 OH)中之乙腈梯度液使用於寡醣之層析分離。使用乙腈體積百分比從注射時之10.4%增加至150分鐘時之28%之線性梯度液，在0.15毫升/分鐘之流率下，產生分佈形態。溶離液流係於206毫微米下，以Waters UV偵測器監控，接著針對質量鑑定，使用Micromass Q－Tof Micro。將關於ESI探測之離子化作用參數按下述設定：毛細管電壓＝3 kV，圓錐體電壓＝45V，來源溫度80℃，及去溶劑化作用溫度為175℃。
寡醣消化混合物以PGC之直接形態剖析：用於寡醣消化混合物之PGC層析之系統包括裝有Luna C18與Hyperca rb多孔性石墨管柱(4.6 x 100毫米，Thermo)兩者之Waters Alliance。將系統與Waters 2996光二極體陣列偵測器及Q－ToF Micro(Micromass)接合。蛋白質之去糖基化作用係藉由酵素水解，使用PNGase F進行。關於去糖基化作用，係使含有0.15重量% RapiGest SF(Waters公司)之160微升50 mM磷酸鈉緩衝劑中之1與2毫克間之糖蛋白，藉由在100℃下加熱2分鐘而被變性。將已冷卻之溶液充分混合，並添加40微升PNGase F(50,000 U/毫升，在50 mM磷酸鈉緩衝劑中，pH 7.5)。混合試樣，然後在38℃下培養24小時。使以酵素方式釋出之寡醣藉高性能液相層析法進行形態剖析。逆相液相層析法係於1.0毫升/分鐘之流率下，在與Thermo HyperCarb管柱5微升(4.6 x 100毫米)聯結之Phenomenex Luna 5微升C18管柱(4.6 x 150毫米)上進行。使管柱以0.05%三氟醋酸(TFA)達成平衡。於注射試樣(150微升消化混合物)後，起始乙腈之梯度液，在11分鐘與0.05% TFA在9%乙腈中之溶劑組成下終止。使用管柱切換，以隔離hyperCarb管柱，然後將聚醣以漸增乙腈百分比之線性梯度液自HyperCarb管柱溶離。使用乙腈百分比從注射時之9%增加至160分鐘時之36%之最初梯度液。第二種梯度液係涉及乙腈體積百分比從160分鐘時之36%增加至170分鐘時之60%乙腈。在整個溶離梯度液中使用0.15毫升/分鐘。聚醣係於206毫微米下，藉由UV吸光率偵測，並藉由MS掃描400－3000 m/z範圍之質量。將MS參數設定成下列數值：毛細管3 kV，圓錐體45V。在後續注射之前，將Luna C18管柱以40%乙腈、40%異丙醇、20%水中之0.05% TFA清洗。
藉由多孔性經石墨化之碳層析之分析 ：得自功能部位I－IV之寡醣之結構，係使用經聯結至MS之多孔性經石墨化之碳層析(PGC)研究。將N－連結之寡醣自CTLA4－Ig單離，並按先前HPAEC－PAD段落中所述純化。寡醣係使用具有UV偵測器之Hypercarb(PGC)管柱，接著使用Q－TOF ESI/MS分析。關於藉由PNGase F消化自CTLA4－Ig所釋出之N－連結寡醣之PGC分佈形態係示於圖54中，其中功能部位經指出。溶離之順序與HPAEC－PAD中所發現者相同。所獲得之結構係示於表60中。
用於命名表60中所顯示寡醣之命名法係示於下文：
灰色陰影區域係顯示N－連結之寡醣核心結構，其中P表示PNGase F消化，而接著之數字則個別說明甘露糖(圓形)、海藻糖(向下指之三角形)、半乳糖(向右指之三角形)及唾液酸殘基(星形)之數目。N－乙醯胺基葡糖(GlcNAc)係由方形表示。
於功能部位I中，六個吸收峰係經確認，相應於三種非唾液酸基化寡醣(結構P2100,P2110,P2120)。在預測結構與發現質量間之113道爾吞質量差異，係由於三氟醋酸(TFA)加成物之偵測所致。相應於P2100，具有相同質量為1,463之不同吸收峰，係表示其可能為不同異頭物。
於功能部位II中，六個吸收峰係經確認，相應於三種雙天線與三天線寡醣(個別為結構P2111,P2121及P3131)，各含有一個唾液酸殘基(N－乙醯神經胺酸，NANA)。
於功能部位III中，六個吸收峰係經確認，相應於三種雙天線、三天線及四天線寡醣(個別為結構P2122,P3132及P4142)，各含有兩個唾液酸殘基(NANA)。
於功能部位IV中，兩個吸收峰係經確認，相應於兩種三天線與四天線寡醣(結構P3133與P4133)，各含有三個唾液酸殘基(NANA)。
藉由CTLA4－Ig分子之水解處理，度量莫耳唾液酸對莫耳CTLA4－Ig全部蛋白質或二聚體之莫耳比(參閱圖25與26) ：於此方法中，NANA與NGNA係藉由酸水解自蛋白質分裂。將所釋出之NANA與NGNA於Rezez單醣RHM管柱上，藉HPLC分離，並藉由UV吸光率(206毫微米)偵測。NANA與NGNA係以同時操作之NANA與NGNA標準物之回應因子為基準定量。試驗結果係以個別NANA與NGNA對蛋白質之莫耳比(MR)作報告。此項檢測係測定唾液酸之經結合與未結合之總莫耳數。
於檢測中所使用之試劑、儀器配置及層析條件：1M硫酸H2 SO4 (儲備液)與5 mM H2 SO4 流動相操作緩衝劑；1毫克/毫升之NANA標準溶液；1毫克/毫升之NGNA標準溶液。Alliance層析系統－具有整合自動取樣器之Waters公司2695分離模組；Rezex單醣RHM管柱－8微米,7.8 x 300毫米,Phenomenex，裝有7.8 x 50毫米防護管柱,Phenomenex；偵測器－Waters公司996光二極體陣列偵測器或Waters公司2487雙波長吸光率偵測器。層析參數：流量－－0.600毫升/分鐘；流動相－－5 mM H2 SO4 ；注射體積－－5微升；標的濃度－－1毫克/毫升；操作時間－－25分鐘；柱溫－－40℃；自動取樣器溫度－－4℃；波長－206毫微米；滯留時間NANA(系統依存性)－10.8分鐘(＋或－1分鐘)，滯留時間NGNA(系統依存性)－9.8分鐘(＋或－1分鐘)。
系統適合性標準物：在適當容器中，將50微升各1毫克/毫升NANA與NGNA添加至900微升H2 O內。於4℃下儲存至高3個月；N－乙醯神經胺酸工作標準物(0.05毫克/毫升)；N－羥乙醯基神經胺酸工作標準物(0.05毫克/毫升)。
試樣與CTLA4－Ig標準物質之水解作用：將試樣與CTLA4－Ig標準物質於H2 O中稀釋至1毫克/毫升，以進行水解作用。藉由將10微升1M H2 SO4 添加至190微升1毫克/毫升經稀釋之試樣與CTLA4－Ig中，使CTLA4－Ig試樣與CTLA4－Ig標準物質水解。於1.5毫升微離心管中，重複進行水解作用。將蓋子藉由蓋鎖或膠帶固定。將管件藉由渦旋混合，並放置在80℃加熱板塊中，歷經1小時。於培養後，自加熱板塊移除管件，在室溫下冷卻下來，歷經3分鐘，並放置在離心機中快速旋轉，以收集管件底部之試樣。將得自管件之50微升經水解之溶液分成數液份，置於試樣小玻瓶中，將其放置在已冷卻之自動取樣器內，供注射用。水解空白試驗係經由在1.5毫升微離心管中，將10微升1M H2 SO4 添加至190微升水內，而製成單一製劑。此空白試驗係如試樣一樣處理。
系統適合性：為檢查系統適合性，故注射系統適合性標準物之六份複製注射液(各5微升)，接著為水解空白試驗之一份注射液(5微升)。使用此最後系統適合性標準注射液，個別計算解析度(R)，可接受值係高於1.3，與理論板數(N)，可接受之理論板數計數必須為至少4000。使用最後五種系統適合性複製，計算NANA計數之再現性，並評估水解空白試驗。在操作CTLA4－Ig試樣之前，符合系統適合性標準。
解析度：使用最後系統適合性標準注射液，計算峰解析度，使用下列方程式：R＝2(T2－T1)/(W2＋W1)，其中R為解析度，T2為NANA吸收峰(吸收峰2)之滯留時間，T1為NGNA吸收峰(吸收峰1)之滯留時間，W2為在對吸收峰2之側面相切所畫出線之基線上之寬度，W1為在對吸收峰1之側面相切所畫出線之基線上之寬度。圖24係描繪典型系統適合性注射。
理論板數(N)：使用最後系統適合性標準注射液計算理論板數計數(N)，使用下列方程式：N＝16(RT2 /W)，其中N為理論板數計數，RT為NANA吸收峰之滯留時間，以分鐘表示，W為在對NANA吸收峰之側面相切所畫出線之基線上之寬度。
使用最後五種系統適合性標準物之注射，以計算NANA之平均面積計數及其標準偏差。相對標準偏差等於或小於3%。水解空白試驗無任何顯著吸收峰與NANA及NGNA之滯留時間。
注射順序：注射NANA與NGNA工作標準物之各一份注射液，接著為經水解之CTLA4－Ig試樣物質(重複試樣)，接著為經水解之CTLA4－Ig物質。於完成CTLA4－Ig操作後，注射NANA與NGNA工作標準物之各一份注射液。
為測定工作標準物中所注射之NANA或NGNA之莫耳數，故使用下列方程式：莫耳NANA或NGNA＝(C)(P)(I)/MW，其中C為NANA與NGNA在工作標準物中之濃度，P為標準物之純度，I為注射體積，MW為分子量(對NANA為309.2克/莫耳，而對NGNA為325.3克/莫耳)。
為測定NANA與NGNA在CTLA4－Ig試樣中之莫耳數，故使用下列方程式：在試樣中之莫耳NANA或NGNA＝(X)(Y)/Z，其中X為在NANA與NGNA工作標準物中之莫耳數，Y為NANA與NGNA在CTLA4－Ig試樣中之平均計數，Z為重複之NANA與NGNA在工作標準物中之平均面積。得自標準物之重複注射，NANA與NGNA標準物之面積計數必須具有小於10%之RSD。
為測定各試樣中所注射之量，故使用下列方程式：莫耳蛋白質＝(C)(D)(I)/MW，其中C為CTLA4－Ig二聚體之濃度，以克/毫升表示(得自UV分析)，D為用於水解作用之稀釋(0.95)，I為注射體積(0.005毫升)，而當從質量光譜法測定時，MW為CTLA4－Ig二聚體之分子量(92,439克/莫耳)。
NANA或NGNA對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比(MR)係藉下列方程式計算：MR＝A/B，其中A為NANA或NGNA之莫耳數，且B為CTLA4－Ig全部蛋白質或二聚體之莫耳數。
唾液酸、NANA及NGNA對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比(MR)係藉下列方程式計算：MR＝(A＋B)/C，其中A為NANA之莫耳數，B為NGNA之莫耳數，而C為CTLA4－Ig全部蛋白質或二聚體之莫耳數。CTLA4－Ig試樣與CTLA4－Ig標準物質之複製物在NANA之莫耳比中，必須具有小於10%之RSD。
藉由度量唾液酸含量之水解方法所測得回應之線性： NANA回應係經証實關於0.5微克/毫升(~0.1%額定NANA標準物＝NANA~QL)至98.7微克/毫升(－200%額定NANA標準物)範圍內之NANA標準濃度為線性。NGNA回應係經証實對於5.0微克/毫升(－10%額定NGNA標準物)至82.0微克/毫升(－160%額定NGNA標準物)範圍內之NGNA標準濃度為線性。
得自經水解CTLA4－Ig物質之NANA之回應，關於在0.25毫克/毫升(25%額定CTLA4－Ig負載)至2.0毫克/毫升CTLA4－Ig(200%額定CTLA4－Ig負載)範圍內之蛋白質濃度為線性。得自經水解CTLA4－Ig物質之NGNA之回應對在0.25毫克/毫升(25%額定CTLA4－Ig負載)至2.0毫克/毫升CTLA4－Ig 200%額定CTLA4－Ig負載)範圍內之蛋白質濃度為線性。
度量唾液酸含量之水解方法之準確度 ：針對添加NANA或NGNA標準物之CTLA4－Ig物質(1毫克/毫升)，証實其準確度。
度量唾液酸含量之水解方法之精密度：有效性實驗係証實儀器精密度(%RSD<3%)，試樣製備之重複性(%RSD<4%)，及橫越不同試樣製備、不同天數、不同儀器以及不同分析器之再現性(對NANA為%RSD<6%，對NGNA為%RSD<12%)。NANA與NGNA莫耳比個別在所報告結果之10%與20%範圍內被認為是精確的。
度量唾液酸含量之水解方法之範圍：關於此項檢測之作用範圍係被証實為從0.49毫克/毫升至3.87毫克/毫升CTLA4－Ig物質。
度量唾液酸含量之水解方法之偵測極限(DL)：關於NANA與NGNA標準物之個別DL值，使用光二極體陣列偵測器(PDA；HPLC系統1)，係個別為0.464微克/毫升與0.402微克/毫升；關於NANA與NGNA之個別DL值，使用雙波長偵測器(HPLC系統2)，係個別為0.131微克/毫升與0.111微克/毫升。關於兩種唾液酸物種，並以使用最不敏感性偵測器為基礎之方法DL，對於NANA與NGNA係為0.5微克/毫升。
度量唾液酸含量之水解方法之定量極限(QL)：關於NANA與NGNA標準物之個別QL值，使用光二極體陣列偵測器(PDA；HPLC系統1)，係個別為1.68微克/毫升與1.52微克/毫升；關於NANA與NGNA之個別QL值，使用雙波長偵測器(HPLC系統2)，係個別為0.48微克/毫升與0.41微克/毫升。關於兩種唾液酸物種並以使用最不敏感性偵測器為基礎之方法QL，對於NANA與NGNA係為1.7微克/毫升。
耐久性/強效性：關於試樣48小時經冷凍溶液安定性、差異管柱之使用、不同NANA與NGNA批料之使用及具有濃度之±5%改變之流動相之使用，此方法係被証實為強效。
IEF凝膠電泳 ：以神經胺酸苷酶處理以移除唾液酸之前與之後，亦可度量糖蛋白之pI。於神經胺酸苷酶處理後，於pI上之增加，係表示唾液酸存在於糖蛋白上。IEF凝膠可用以測定等電點、CTLA4－Ig之異構重組物數目。用於操作IEF凝膠之適當系統為Multiphore II電泳系統，且IEF凝膠為pH 4.0至6.5(Amersham Biosciences)。陽極緩衝劑具有下列組成：0.5M磷酸中之0.1M麩胺酸。陰極緩衝劑具有下列組成：0.1M β－丙胺酸。IEF凝膠係於恒定功率(25瓦特)與電流(25毫安培)下預聚焦，直到電壓達到≧300V為止。裝填IEF校準標準物與適當濃度之試樣，並於恒定功率(25瓦特)與電流(25毫安培)下操作凝膠，使用最高2000V，歷經2.5小時。於IEF凝膠之固定與柯麥西(Coomassie)藍色染色後，藉由光密度計使蛋白質譜帶呈現。CTLA4－Ig二聚體製劑之典型IEF凝膠係示於圖9 中。
實例4：CTLA4－Ig之單鏈(單體)之單離與特徵鑒定
原本單鏈CTLA4－Ig之製備：將藉由本發明方法所製成之CTLA4－Ig重組蛋白質之試樣，藉由非變性SEC，使用2695 Alliance HPLC(Waters,Milford,MA)，於兩個21.5 x 300毫米TSK GelG3000SWXL 預備管柱(Tosoh生物科技,Montgomery,PA)上，以協力方式分離。將在~50毫克/毫升下之試樣之三十份注射液(各1.0毫升)，於恒定組成條件下，使用包含0.2M NaH2 Po4 ,0.9% NaCl,pH 7.0之流動相，在1.0毫升/分鐘之流率下分離。試樣係於280毫微米之吸光率下，使用Water's 2996 PDA偵測器監控。分析係使用Waters Millennium 4.0TM 與Empower Pro軟體進行。於Foxy 200自動化溶離份收集器上，收集從90至150分鐘之溶離份(各1.0毫升)。匯集溶離份16至39(在105毫升下開始，並在129毫升下終止)，並使用具有截止值為3500 MW之centricon濃縮器濃縮。
使試樣(2.0毫升，在~4毫克/毫升下)於變性條件下，使用HiLoad 26/60 Superdex 200預備級管柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)，在2.0毫升/分鐘之恒定組成流率下，使用200 mM NaH2 PO4 、在pH 6.0下之6.0M胍鹽酸鹽作為流動相，於AKTAexplorerTM (Amersham Biosciences)上進一步層析。收集溶離份12－16，匯集，使用HiPrep 26/10脫鹽管柱(Amersham Biosciences)，緩衝劑交換成200 mM NaH2 PO4 pH 6.0，且最後濃縮。
所引致單鏈CTLA4－Ig之製備：所引致單鏈CTLA4－Ig係經過藉由本發明方法所製成CTLA4－Ig重組蛋白質之變性作用、還原作用及烷基化作用而製成。將胍鹽酸鹽(0.684克)稱量，置於1.5毫升Eppendorf離心管中，並添加512微升200 mM NaH2 PO4 ,pH 6.0，且渦旋直到胍鹽酸鹽完全溶解為止。經由將238微升CTLA4－Ig物質(濃度：50毫克/毫升)添加至上文管件中，使CTLA4－Ig重組蛋白質變性，並渦旋，而造成CTLA4－Ig最後濃度為~10.0毫克/毫升，在6.0M胍鹽酸鹽中。使經變性之蛋白質藉由添加2.6微升1.0M DTT，並在37℃下培養90分鐘還原。然後，經由將0.047克碘乙醯胺固體添加至試樣混合物中，使經還原之蛋白質烷基化，接著渦旋，並於黑暗中，在37℃下培養60分鐘。使試樣(對各注射液，2.0毫升，在~4.0毫克/毫升下)於變性條件下，使用HiLoad 26/60 Superdex 200預備級管柱，在2.0毫升/分鐘之恒定組成流率下，使用200 mM NaH2 PO4 、在pH 6.0下之6.0M胍鹽酸鹽，於AKTAexplorerTM 上層析。收集所形成之單鏈溶離份(9－12)，匯集，於HiPrep 26/10脫鹽管柱上，緩衝劑交換成200 mM NaH2 PO4 ,pH 6.0，並濃縮。
純真與所引致單鏈CTLA4－Ig之MALDI－TOF質量光譜法分析 ：使單鏈試樣(20微升)脫鹽，並以C4 ZipTips(Millipore,Billerica,MA)濃縮，然後使用具有以芥子酸飽和之0.1% TFA之20微升80%乙腈溶離。將混合物(1.0微升)點加至MALDI試樣板之井上，並使其風乾，然後放置在質譜儀中。MALDI－MS光譜係於OmniFlex質譜儀(Bruker Daltonics,MA)上，使用氮雷射(337毫微米)獲得。試樣係於反射、正離子模式中，藉由延遲之萃取，使用20 kV之加速電壓與200毫微秒之延遲時間分析。對各試樣，將總共250個單射光譜加總。外部校準係使用胰蛋白酶原(23982 m/z)、蛋白質A(44613 m/z)及牛白蛋白(66431 m/z)之混合物達成。
使用變性(胍HCl)尺寸排阻層析之單鏈分析 ：製備得自在時間過程期間之不同點下所收集細胞培養物生長之CTLA4－Ig上層清液，供HPLC分析。製備試樣，其方式是在0.65毫升Eppendorf微離心管中，稱量0.114克胍鹽酸鹽(Mallinckrodt Baker公司)；添加125微升時間過程CTLA4－Ig試樣，並渦旋，以完全溶解胍HCl。然後，立即添加1.8微升250 mM碘乙醯胺，並混合，且在37℃下培養30分鐘。
將具有TSK管柱防護(SWXL ，6.0毫米內徑x 4.0公分)之協力TSK－GELG3000SWXL 尺寸排阻管柱(7.8毫米內徑x 30公分)使用於單鏈SEC分析，其係於具有2996光二極體陣列偵測器之Waters 2695分離模組上進行。將25微升之各試樣注射在以200 mM磷酸鈉,6.0M胍鹽酸鹽,pH 6.0作為流動相而達成平衡之管柱上。將蛋白質以0.5毫升/分鐘之流率在管柱上分離，並收集所形成之層析圖，歷經60分鐘窗幅。個別吸收峰(單體、單鏈等)之整合與定量係使用Empower Pro軟體進行。為確保HPLC系統適當地工作，注射亦在試樣注射之前與之後，於流動相、蛋白質試樣緩衝劑、系統適合性標準物及目前之CTLA4－Ig物質上施行。計算在系統適合性標準層析圖上之峰解析度與板計數。
CTLA4－Ig單鏈藉由LC/MS肽分析法分析半胱胺醯基化作用 ：使CTLA4－Ig在含有6M胍與5 mM二硫基蘇糖醇(DTT)之50 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris)緩衝液(pH 8.0)中變性與還原。於50℃下20分鐘培養後，將碘乙醯胺(IAM)添加至10 mM之最後濃度中，以使自由態硫醇類烷基化，並在黑暗中，於50℃下再持續培養20分鐘。將經還原與烷基化之混合物裝填至脫鹽管柱(Amersham，NAP－5)上，然後以無論是50 mM Tris,10 mM CaCl2 ,pH 8.0或50 mM磷酸鈉緩衝劑,pH 7.5溶離至空隙體積中。於脫鹽之後，將經還原/烷基化之CTLA4－Ig使用兩種不同蛋白酶：胰蛋白酶或Asp－N消化。使CTLA4－Ig物質亦接受胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶原消化，無需進行還原作用與烷基化作用。
關於胰蛋白酶消化，係添加定序級胰蛋白酶(Promega，2%，w/w，酵素/蛋白質)，並將混合物在37℃下培養4小時。關於Asp－N消化，係添加定序級Asp－N(Roche，2%，w/w，酵素/蛋白質)，並將混合物在37℃下培養16小時。關於胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶原消化，係添加定序級胰蛋白酶(Promega，4%，w/w，酵素/蛋白質)，並將混合物在37℃下培養4小時，然後添加a－胰凝乳蛋白酶原(Sigma，4%，w/w，酵素/蛋白質)，並將混合物在37℃下培養16小時。於消化後，將所有試樣冷凍(－20℃)。
將所形成之肽混合物在0.12毫升/分鐘下，藉由梯度溶離液自Waters Alliance HPLC工作站上之Waters AtlantisTM dC18管柱(2.1 x 250毫米)分離。將管柱直接連接至裝有離子噴霧來源之Waters Micromass Q－Tof microTM 質譜儀，供收集質譜。亦將肽混合物於Varian Polaris C18管柱(4.6 x 250毫米)上，在0.70毫升/分鐘下，使用相同HPLC工作站分離。使管柱以溶劑A(在水中之0.02% TFA)達成平衡，並使肽藉由溶劑B(95%乙腈/水中之0.02% TFA)之漸增濃度溶離。使用管柱後分流器閥，以導引15%流量至Q－Tof工作站，其係於正TOF(飛行時間)模式(m/z 100－2000)中操作。所使用之典型離子噴霧電壓為3000 V。
於還原作用時之113±4u之損失係指出有對於蛋白質之共價二硫化物修改。對於半胱胺醯基作用之預測位移為119.14u。但是，於單鏈物種之還原作用時，係預期111.14u之實際質量損失。於八個鏈內半胱胺酸(順序識別碼：2之Cys47,74,92,118,197,157,303,361 )之還原作用時，119.14u之損失係由於移除半胱胺酸所造成，而8u之增進係由於添加8個質子所造成。因此，在完整質量上之另外113±4u係相應於使用半胱胺酸胺基酸之半胱胺醯基化作用。最可能被修改之半胱胺酸為Cys146 ，因為鏈間二硫化物鏈結不存在於單鏈物種中，以完整之MALDI數據為基礎。使用LC/MS肽分析檢驗肽，其含有Cys146 ，發現經還原與未經還原之物質顯示與單鏈物質不同之滯留時間與質量。為確認半胱胺醯基作用，故收集含有Cys146 之單鏈肽，並使用MALDI分析。
對於使用Cys146 之半胱胺醯基化作用之肽，所收集之含有Cys146 之吸收峰具有1787.48u之質量，與1787.51u之預測質量一致(圖25，面板A)。此肽於接受還原作用後係損失119.11u，與119.14u之預測損失一致；半胱胺酸之損失(圖25，面板B)。然後，將物質以碘乙醯胺進一步操控，產生56.99u之位移，與57.03u之預測質量增進一致(圖25 ，面板C)。
實例5：操控單體或多聚體CTLA4－Ig形成
培養基與培養基成份對單鏈形成之催動劑作用 ：針對單鏈形成，測定不同培養基與培養基成份之催動劑影響。CTLA4－Ig分子可在37℃下以各種培養基與個別培養基組份培養，歷經60小時期間，並藉由協力管柱變性SEC分析其單鏈形成。對單鏈形成之無法抵抗催動劑回應，已於將10 mM半胱胺酸添加至調配物緩衝劑中時被發現。於單鏈形成中有快速上升，其在添加半胱胺酸後約六小時達到最高峰。此回應在其餘56小時期間逐漸降低。此外，＋30%加侖進料係於單鏈形成中，影響更逐漸但仍然相對較快速之增加。＋30%加侖進料係為半乳糖與117E之組合物。每天添加此混合物，以餵食細胞。雖然在此實驗中，半胱胺酸係在以人工方式大量下被引進，與117E無關，但仍有需要測定哪一種117E成份可能涉及單鏈形成。
將117E及其他培養基之特定成份以CTLA4 Ig培養，歷經60小時期間，並藉由協力管柱變性SEC分析其單鏈形成。在此培養基中之研究係以可能之二硫化物還原成份及/或抑制劑為中心，其會達成單鏈形成，以先前實驗為基礎，顯示鏈間二硫化物為不存在。測試已知對二硫化物具有一些還原影響之117E之組份；硫辛酸、胱胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸及谷胱甘肽。再一次，對單鏈形成之無法抵抗催動劑回應，已於將10 mM半胱胺酸添加至調配物緩衝劑中時被發現。於單鏈形成中有快速回應，其在添加半胱胺酸後約六小時達到最高峰。此回應在其餘56小時期間逐漸降低。主要單鏈形成係以含半胱胺酸之培養基發生：半胱胺酸、酵母煉製物及發酵培養基。其他含硫成份，譬如甲硫胺酸與谷胱甘肽，對單鏈形成未具有至極少影響。沒有發現氯化銨之影響。
高鹽對高分子量形成之催動劑作用 ：在純化程序期間，CTLA4－Ig係曝露至高鹽濃度，歷經不同量之時間。針對高分子量形成，測定高鹽濃度之影響。在37℃下，將CTLA4－Ig(在~50毫克/毫升下)於500 mM磷酸鈉,pH＝6.0存在下培養。在磷酸鈉之高濃度下有催動劑影響；於100小時期間，發現高分子量形式中之持續快速增加，主要為四聚體。
對單鏈形成之拮抗作用 ：先前製作模型實驗係藉由添加含半胱胺酸成份証實對單鏈形成之大且快速影響。半胱胺酸為含有自由態氫硫基之胺基酸。若氫硫基涉及單鏈之形成，則其應經由使用拮抗化合物阻斷。一種此類化合物為碘乙醯胺。碘乙醯胺為水溶性化合物，其係以快速方式與任何自由態氫硫基反應，以形成不可逆硫醚鍵。將CTLA4－Ig在37℃下以各種培養基，半胱胺酸與碘乙醯胺培養，歷經60小時期間，並藉由協力管柱變性SEC分析其單鏈形成，且藉由協力管柱非變性SEC分析其HMW。碘基乙醯亞胺在CTLA4－Ig組合物與高鹽兩者中，不僅會阻斷單鏈形成，而且會阻斷聚集體形成。碘乙醯胺在低唾液酸單體中，不會阻斷聚集體形成。但是，在低唾液酸物質中所形成聚集體之量相當於在CTLA4－Ig組合物中所形成之量。
此模式係提供對先前未被充分明瞭之機制之洞悉。在已被確認之CTLA4－Ig方法中，顯示有至少兩種主要之聚集體形成途徑。第一種途徑，其會產生大量之聚集、自由態氫硫基半胱胺酸，係充作形成單鏈物種之催動劑。半胱胺酸之催動劑影響可藉由添加碘乙醯胺阻斷。令人驚訝的是，碘乙醯胺不僅為單鏈形成而且為高分子量形成之拮抗劑。應注意的是，當與下游純化期間之發酵比較時，此方法係經設計，以產生含有增加量之唾液酸之組合物。於第二種途徑中，其會產生較少聚集體，含有低量唾液酸之亞種不會受形成單鏈或聚集體之碘乙醯胺所影響。
以此等數據為基礎，並不難以想像至少兩種關於聚集體形成之途徑，係在CTLA4－Ig中引致。於主要途徑中，單鏈係經過仍未完全清楚之機制涉及聚集體之形成。第二種較小途徑，其與單鏈形成無關，係涉及聚集體之形成。此等途徑可幫助解釋為何有至少三種形式之高分子量物種，其可以層析方式分離。此等係為模式，且必須在實際發酵過程期間中被測試，以測定若具有時之實際影響與此影響之程度。以此數據為基礎，應考慮測試不僅目前常用之發酵方法，而且是缺乏半胱胺酸之發酵。
實例6：CTLA4－Ig二聚體與四聚體 結合至B7－1Ig之CTLA4－Ig二聚體與四聚體
本發明係提供關於評估結合至B7－1Ig之CTLA4－Ig二聚體與四聚體之方法。物理特徵(例如擴散係數、分子量、結合價鍵)與儀器操作參數(例如流率、晶片密度)可影響Biacore檢測結果。於質量傳遞限制下，對於相同莫耳濃度，四聚體之結合速率係比二聚體慢大約20%。於所指定之流率下，與二聚體作比較，四聚體分子穿透基質較不有效是有可能的。於高密度B7－1Ig固定晶片下，四聚體與二聚體之競爭性結合係顯示可比較之抑制曲線。這表示四聚體(四個)對二聚體(兩個)之理論價鍵對於結合至B7－1Ig沒有影響。四聚體之莫耳濃度可以二聚體標準曲線為基準計算而得。使用此途徑，已發現與二聚體作比較，四聚體對B7－1Ig之結合具有相等劑量依賴性回應。
四聚體與二聚體之結合功效之比較，係被關於製備標準物與試樣所使用之度量單位所影響。四聚體與二聚體試樣可在2000毫微克/毫升之濃度下作比較。以質量為基準(毫微克/毫升)，使用相同物種之標準曲線，各物種係顯示大約100%之結合功效。但是，當四聚體於二聚體標準曲線上測定時，其結合功效被減半，而當二聚體於四聚體標準曲線上測定時，其結合功效超過兩倍。因為Biacore儀器係以質量為基準偵測分子交互作用，故得自四聚體與二聚體之相同濃度(毫微克/毫升)之信號共振單位(RU)應為相同。雖然偵測系統為質量之函數，但在分子間之交互作用會以莫耳濃度基準發生。因此，在2000毫微克/毫升下，CTLA4－Ig二聚體與CTLA4－Ig四聚體之莫耳濃度個別為21.6 nM與10.8 nM。使用莫耳濃度，CTLA4－Ig二聚體與CTLA4－Ig四聚體試樣兩者均在二聚體標準曲線上顯示可比較之結合功效。於CTLA4－Ig四聚體標準曲線上使用相同莫耳濃度途徑，與四聚體試樣作比較，CTLA4－Ig二聚體試樣會顯示結合功效之另外30%增加。此觀察係由於在高濃度下之四聚體標準曲線之斜率減少所致，而造成對特定最初結合速率之較高計算而得之濃度。關於此觀察之一種解釋係為質量傳遞之作用。
質量傳遞限制實驗係顯示對於相同分子數，CTLA4－Ig四聚體之最初結合速率比CTLA4－Ig二聚體慢大約20%(意即四聚體之結合速率與二聚體不同達0.8之因數)。此觀測差係由於兩種物種之分子量，及其對於分子至晶片表面之擴散之作用所致。分子之擴散係數係與分子量之立方根成反比。較低擴散係數係表示分子之較緩慢移動。以個別分子量為基準，計算而得之CTLA4－Ig四聚體擴散係數為CTLA4－Ig二聚體擴散係數之0.8倍，或反之，二聚體為四聚體之1.25倍。實驗數據係與此觀察一致，其中當使用莫耳濃度，計算自CTLA4－Ig四聚體標準曲線時，CTLA4－Ig二聚體顯示133%之功效。於高密度晶片上之質量傳遞限制，在較低流率與較低分析物濃度下係為較顯著。當流率增加時，與四聚體作比較，二聚體會顯示較快最初結合速率。因此，與二聚體作比較，四聚體之增加分子量與較低擴散係數有助於最初結合速率差異。
CTLA4－Ig四聚體與二聚體對B71Ig之競爭性結合係表示四聚體與二聚體於質量傳遞限制條件下會顯示類似結合價鍵。其他四聚體對於最初與無論是二聚體或四聚體結合之B7－1Ig晶片之作用係顯示低結合位能。此觀察並非由於限制結合位置可取用性所致，因為其他二聚體可結合至最初與CTLA4－Ig二聚體或CTLA4－Ig四聚體結合之B7－1Ig晶片。受限制之穿透至基質可解釋所發現之四聚體結合之降低。
其中分子於Biacore上結合之性質會影響結果之說明。由於分子大小之差異，四聚體與二聚體分子係於不同速率下，在質量傳遞限制之條件下擴散。此外，在高密度晶片之表面上之位阻，會影響後續分子之穿透至基質。
當於Biacore上進行濃度分析時，需要考慮物理特徵，譬如分子量、擴散係數及各物種之結合。用於與吾人感興趣之分析物作比較之標準物，應為相同物質。但是，於分子大小被納入考量之情況中，若標準物與試樣兩者以莫耳濃度基準表示，則四聚體可仍然針對二聚體標準物進行分析。所呈現之數據顯示CTLA4－Ig二聚體與CTLA4－Ig四聚體對B7－lIg之結合為可比較。
CTLA4－Ig二聚體與四聚體兩者均顯示類似締合速率(k on )。但是，四聚體顯示較緩慢解離速率(k off )，其係歸因於結合位置數目之增加所致之抗體親抗原性。
於兩種蛋白質譬如配位體與受體間之結合動力學分析，可於Biacore上，使用以大約600－800 RU之配位體之低密度所固定之晶片進行，以致使最高結合容量(Rmax )於50－150 RU之範圍內。低密度晶片之目的係為使抗體親抗原性與質量輸送之作用降至最低。當多價分析物仍然保持結合至晶片之表面時，抗體親抗原性被發現，此係由於當解離個別結合位置時，發生可取得配位體之緊密接近所致。當晶片之表面與整體溶液間之分析物濃度有顯著差異時，質量輸送被發現。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig分子係為包含兩個單鏈分子之二聚體，藉由單一鏈間－二硫鍵連結，並含有對於B7分子之兩個結合位置。於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig四聚體之形成，當藉由光散射SEC與SDS－PAGE確認時，會造成具有可能地四個結合位置之分子。經純化單體與二聚體之結合動力學係於統計學上與CTLA4－Ig二聚體物質作比較。於k on 速率(p 值>0.05)上沒有顯著差異。四聚體之k off 速率與二聚體之k off 速率有顯著不同。自HIC清晰吸收峰所純化之二聚體之k off 速率與CTLA4－Ig二聚體物質之k off 速率並無顯著不同，因此，四聚體比二聚體較慢解離，這顯示歸因於每分子增加數目之結合位置之抗體親抗原性作用。
四聚體可藉由胍處理而被打開，並解離至二聚體中。分析此經胍處理之CTLA4－Ig二聚體，且結果顯示其結合動力學特徵係類似在生理學條件下所形成CTLA4－Ig二聚體之特徵。此觀察係支持以下假說，於抗體親抗原性在結合動力學上扮演一項角色之情況中，在二聚體與四聚體間之k off 速率上之觀測差係與分子之結合價鍵與特定Biacore方法之固有性質有關。
得自HIC清晰吸收峰之CTLA4－Ig物質之親和純化： 蛋白質A－瓊脂糖親和層析法：將500毫升HIC清晰吸收峰經過0.22微米1升濾器系統(Corning,Corning,NY,零件編號430517)過濾，並裝填至rProtein A－瓊脂糖管柱(5公分x 15公分)上，使其在pH 7.4下，以磷酸鹽緩衝之鹽水(Sigma,St.Louis,MO,P－4417)預先達成平衡。將管柱以700毫升PBS,pH 7.4洗滌，並以100 mM甘胺酸，pH 3.5溶離。使各50毫升之溶離份，經由將0.5毫升2.0M tris,pH 10添加至收集管件中，於收集期間被中和。溶離份係於280毫微米吸光率下進行檢測，匯集，並使用centriprep YM－3藥筒(Millipore公司,Bedford,MA,零件編號4203)濃縮。將經純化之蛋白質溶液儲存在－70℃下。
PROSEP－rA(重組蛋白質A)親和層析法：將500毫升HIC清晰吸收峰經過0.22微米1升濾器系統(Corning,Corning,NY,零件編號430517)過濾，並在25毫升/分鐘之流率下，裝填在PROSEP－rA高容量(Millipore公司,Bedford,MA)管柱(25毫米x 28公分)上，使其以含有250 mM氯化鈉之25 mM Tris,pH 8.0預先達成平衡。將裝有Waters 2767試樣處理器與Waters 2996光二極體陣列偵測器之Waters PrepLC系統使用於此層析中。將管柱在25毫升/分鐘之流率下，以25份平衡緩衝液洗滌30分鐘，並在25毫升/分鐘之流率下，以100 mM醋酸鹽,pH 3.0溶離30分鐘。使各10毫升之溶離份，藉由收集超過50微升2.0M tris,pH 10(其先前已被添加至管件中)，於溶離期間中和。匯集280毫微米下具有高吸光率之溶離份，並使用centriprep YM－3藥筒(Millopore公司,Bedford,MA,零件編號4203)濃縮。將經純化之蛋白質溶液儲存在－70℃下。
尺寸排阻層析法：尺寸排阻層析法係於裝有Waters 2996光二極體陣列偵測器(Milford,MA)與Foxy 200離份收集器之Waters Alliance 2695分離模組上進行，其係藉由Millennium32 3.20版或Empower軟體加以控制。將協力TOSOH生物科技(Montgomery,PA)TSK G3000 SW(21.5毫米x 300毫米)與協力TSK G3000 SWxL(7.8毫米x 300毫米)管柱個別使用於預備及分析SEC。經溶離之蛋白質係於280毫微米下藉由UV吸光率監控。
二聚體、四聚體及多聚體之預備單離係藉由蛋白質A純化之HIC清晰吸收峰物質之SEC達成。將蛋白質A溶離物之十三個試樣(各~10毫克)在1毫升/分鐘之流率下，注射至預備之協力SEC管柱上，使用含有0.9%氯化鈉之100 mM單鹽基性磷酸鈉緩衝劑pH 7.0之流動相。對於十三次注射之每一次，在每分鐘下收集90－160分鐘之溶離份。單次注射之操作時間為180分鐘。
各溶離份係藉由協力管柱分析尺寸排阻HPLC檢驗。匯集溶離份13－15(含有多聚體)、溶離份22與23(含有四聚體)及溶離份43－49(含有二聚體)。經純化之多聚體、四聚體及二聚體溶離份係於分析二管柱SEC上，以動態光散射偵測(DSL)檢驗。
HIC清晰吸收峰之CTLA4－Ig成份與經純化之成份對固定化B7－1Ig之生物專一性結合分析 ：CTLA4－Ig對固定化B7－1Ig(在CM5晶片上)之生物專一性結合，係使用SPR為基礎之BIAcore C生物感測器(BIAcore,AB,Piscataway NJ)度量。使用CTLA4－Ig物質，以產生標準曲線。使B7－1Ig在5000至10,000共振單位(RU)之密度下，於經活化之CM5感測器晶片上固定化。於20微升/分鐘之流率下，在B7－1Ig感測晶片表面上注射CTLA4－Ig參考標準物、品質對照組及試樣，以產生感測圖。CTLA4－Ig於固定化B7－1Ig上之最初結合速率(RU/s)係於擴散限制條件下，在高密度B7－1Ig表面上度量，且此係直接與試樣中之CTLA4－Ig之活性濃度有關聯。標準物、品質控制試樣及未知試樣濃度係自標準曲線插入，該曲線係藉由將RU對CTLA4－Ig濃度作圖而產生，在125－8000毫微克/毫升之額定範圍內。最後結果係以百分比結合(未知/試樣之平均濃度/2000)x100表示。
莫耳質量與流體動力學半徑之測定 ：SEC分離係使用TSK3000 SWXL管柱與相應之防護管柱進行。流動相包含25 mM HEPES,850 mM NaCl,pH 7.0，使用恒定組成條件，以在0.8毫升/分鐘下溶離。HPLC分析係於環境溫度下進行，並在分析期間將試樣保持在4℃下。莫耳質量測定係併入Wyatt Dawn EOS，利用15個不同散射角度，以對各物種度量其光散射之角度偏差。Zimm繪圖形式係被使用於莫耳質量測定，其中係將各物種之切片對莫耳質量作平均。用以計算絕對莫耳質量之比折射率增量(dn/dc)值為0.189，其係使用a)獲得，且Optilab DSP干涉儀(RI.流體動力學半徑(Rh)測定)係與被置於對流動細胞大約90°角度處之光子相關器QELS偵測器於線上進行。平移擴散常數係度量自此信號，且Rh 係使用愛因斯坦－史托克斯關係計算。數據分析係使用得自Wyatt技術之Astra軟體4.90版達成。
已發現關於二聚體與四聚體物種之分子量與流體動力學半徑值個別為86－91 kDa與172－199 kDa。發現清晰吸收峰試樣包含其他HMW物種，藉由分子量係相應於六聚體與十聚體。關於二聚體物種之流體動力學半徑之範圍為3.8－4.7毫微米。非均質四聚體物種之流體動力學半徑之範圍為5.7毫微米至6.2－6.3毫微米。
CTLA4－Ig二聚體與四聚體對B7－1Ig之結合，使用表面電漿激元共振 ：濃度分析：各種CTLA4－Ig物種對B7－1Ig之濃度分析係根據方法7441－42 ，其中有少許修正，於Biacore 3000儀器(Biacore,Piscataway,NJ)上進行。修正包括下列：使用Biacore 3000代替Biacore C。流率為10微升/分鐘代替20微升/分鐘。將試樣注射60秒而非15秒。於30微升/分鐘下，藉由含有100 mM NaCl之10 mM檸檬酸鈉,pH 4.0(再生作用緩衝劑)之三次短30秒(15微升)脈衝，接著為水之一次30秒脈衝，再生感測晶片表面。
使CM5感測晶片以B7－1Ig，在20微克/毫升之濃度下，於醋酸鹽緩衝劑，pH 5.0中固定化，針對6000－12000共振單位(RU)之標的密度。標準物係藉由在HBS－EP緩衝劑中，連續性地將CTLA4－Ig物質稀釋至62.5－8000毫微克/毫升(0.675－86.3 nM)之濃度，及二聚體至125－16000毫微克/毫升(0.675－86.3 nM)之濃度而製成，將包含無論是單體或二聚體之測試試樣稀釋至~2000毫微克/毫升之標的濃度，並在Biacore上分析。濃度係藉由BIA評估軟體(4.0.1版)，使用無論是CTLA4－Ig物質(>98%單體)或經純化之二聚體之標準曲線測定。結合功效係按在Biacore上所測得濃度除以藉由A280毫微米所測得濃度之百分比計算。
分子對特定表面之結合速率係為濃度之函數，其允許未知濃度之測定。當與CTLA4－Ig四聚體比較時，CTLA4－Ig二聚體顯示較高結合速率作為濃度(毫微克/毫升)之函數。
CTLA4－Ig二聚體與四聚體之結合功效係摘錄於表7中。以毫微克/毫升為基準，二聚體試樣之結合功效係計算自二聚體標準曲線，並發現為99.5%；然而四聚體試樣之相當濃度為47.2%。反之，二聚體試樣之結合功效係計算自四聚體標準曲線，並發現為266%；然而，四聚體試樣之相當濃度為103%。但是，當二聚體與四聚體以莫耳濃度(nM)表示時，兩種物種之結合功效為可比較。計算自二聚體標準曲線之二聚體與四聚體試樣之結合功效個別為99.4%與94.3%。於四聚體標準曲線上，其個別為133%與103%。以莫耳濃度為基準，二聚體與四聚體之標準曲線為可比較。
結合價鍵 ：將CTLA4－Ig二聚體(25－1600 nM)或四聚體(25－400 nM)在不同莫耳比下，與B7－1Ig預混合三分鐘，然後在10微升/分鐘之流率下，於以9392 RU之密度固定化之B7－1Ig晶片上，注射30微升混合物。於各注射後，藉由再生作用緩衝劑之三次30秒脈衝，接著為水之一次30秒脈衝，再生晶片。將於各注射結束時所獲得之RU作比較。
理論上，二聚體分子之結合價鍵為兩個；各單鏈包含一個結合位置。四聚體分子包含兩個二聚體分子，因此具有四個結合價鍵。為測定顯而易見之二聚體與四聚體之結合價鍵，競爭性檢測係經設計，並於Biacore 3000上進行。於實驗中，將分析物在不同莫耳比下，與B7－1Ig預混合三分鐘，然後將混合物在10微升/分鐘之流率下，注射至B7－1Ig晶片(9392 RU)上，歷經一分鐘。表10係顯示以漸增莫耳量之B7－1Ig被競爭性地抑制之無論是二聚體或四聚體之百分比。於1.25(B7－1Ig)比1(二聚體或四聚體)之莫耳比下，在以96.1%下之單體與84.9%下之二聚體之競爭性抑制中發現顯著差異。但是，二聚體與四聚體顯示類似抑制曲線，這指出價鍵係為大約相等。此外，二聚體與四聚體兩者亦顯示類似抑制作用形態，使用較低密度晶片。
B7－1Ig晶片之飽和作用：於10微升/分鐘下，在高密度B7－1Ig晶片(6738 RU)上，首先注射CTLA4－Ig二聚體或四聚體(200,1000或8000毫微克/毫升)，歷經一分鐘，接著使用無論是單體或二聚體(200,1000或8000毫微克/毫升)之一系列七次1分鐘注射。晶片係於各條件後，藉由再生作用緩衝劑之四次25微升注射，接著為水之25微升注射而再生。將於各注射結束時所獲得之RU作比較。
將無論是二聚體或四聚體重複注射在以無論是二聚體或四聚體預先塗覆之B7－1Ig表面上，未進行表面再生作用。與四聚體之最初結合不會妨礙二聚體之後續注射結合，但是，當與二聚體注射比較時，其他四聚體注射會造成顯著地降低結合速率。與二聚體之最初結合，接著為二聚體之後續注射會造成針對飽和作用之增加結合。四聚體之後續注射至經二聚體預先塗覆之晶片，係顯示結合之逐漸降低，這表示分子自晶片之解離，及缺乏四聚體穿透至基質。關於無論是200毫微克/毫升或8000毫微克/毫升CTLA4－Ig分子之最初注射，發現類似結果。
CTLA4－Ig四聚體具有對B7－1Ig受體之較高抗體親抗原性 ：使CTLA4－Ig物種純化，其包括純化管柱之拋棄部份，譬如HIC與QFF管柱之清晰吸收峰，並於Biacore上分析其結合動力學。
得自HIC清晰吸收峰之CTLA4－Ig物種：將HIC管柱使用於CTLA4－Ig方法中，以移除高分子量物種，譬如DNA。可將得自HIC管柱之清晰吸收峰之CTLA4－Ig物種使用於後續純化與動力學分析。使HIC清晰吸收峰通過蛋白質A管柱，以捕獲所有CTLA4－Ig物種，並移除其他可能存在之雜質。得自蛋白質A管柱之溶離物，其包含所有CTLA4－Ig物種(意即二聚體、四聚體、六聚體多聚體)之混合物，係顯示表觀k on 與k off 速率，其可與CTLA4－Ig二聚體標準物作比較。蛋白質A溶離物藉由2－管柱SEC之分離會造成三種CTLA4－Ig物種：二聚體、四聚體及六聚體/多聚體，其中k on 與k off 速率如表11 中所摘錄者。與CTLA4－Ig二聚體作比較，得自HIC清晰吸收峰之經純化二聚體之唾液酸含量很低。
於表11 中，75－200 nM之試樣濃度係於B7－1Ig晶片(694 RU)上被測試。與CTLA4－Ig參考物作比較，自HIC清晰吸收峰所純化之CTLA4－Ig物種係顯示降低結合。經解聚集之四聚體係獲得對CTLA4－Ig參考物之可比較k on 與k off 速率。
數據之統計分析係使用Student氏T－試驗進行，以CTLA4－Ig二聚體標準物之7個觀察及經純化二聚體與四聚體之14個觀察為基礎。將CTLA4－Ig二聚體標準物與無論是經純化之二聚體或四聚體作比較，在k on 速率上沒有差異。但是，當參考物與經純化之四聚體作比較時(表12 )，k off 速率與KD 為統計學上有意義的。將經純化之四聚體與經純化之二聚體作比較，k on 與k off 兩速率以及KD 係為統計學上不同。應指出的是，雖然數據係被分組成二聚體與四聚體，但試樣之個別分類(意即額面、背側等)可具有稍微不同之特徵，可影響其結合動力學。對於二聚體，k on 與k off 速率個別平均為3.3±1.0 x 105 M－1s－1 與8.8±3.5 x 10－ 3s－1 。四聚體之k on 與k off 速率個別為2.6±0.8 x 105 M－1s－1 與3.1±1.4 x 10－ 3s－1 。
於表12 中，係分析二聚體(n＝14)與四聚體(n＝14)及CTLA4－Ig二聚體標準物(n＝7)。
得自QFF清晰吸收峰之CTLA4－Ig物種 ：QFF管柱係為用以自產物清除殘留雜質之最後純化管柱。將CTLA4－Ig物種使用2－管柱SEC方法自QFF管柱之清晰吸收峰單離，並在Biacore 3000上分析。數據係顯示此"QFF清晰吸收峰"試樣之結合動力學類似CTLA4－Ig二聚體標準物。此外，與自組合物所純化者作比較，自QFF清晰吸收峰所純化之二聚體與四聚體兩者，係獲得類似結合動力學。再者，經純化之單體溶離份之唾液酸含量大於CTLA4－Ig二聚體標準物之唾液酸含量。
胍處理(四聚體之二聚合作用) ：可使四聚體經由以胍處理轉化成二聚體，接著滲析至磷酸鹽緩衝劑中，並藉由分析SEC確認其以二聚體存在。得自HIC清晰吸收峰之經"二聚合"四聚體之動力學分析係顯示其k on 與k off 速率類似CTLA4－Ig二聚體之k on 與k off 速率。
實例7：藉由MS電噴霧雜子化作用(ESI)之完整分析
將CTLA4－Ig以100 mM Tris,25 mM NaCl,pH 8稀釋，達最後濃度為0.7毫克/毫升。將PNGase F(New England Biolabs)以100 mM Tris,25 mM NaCl,pH 8稀釋30倍，達最後濃度為17單位/微升。將等體積(各60微升)之經稀釋試樣與經稀釋糖苷酶溶液混合，並在37℃下培養4小時。
將所形成之去糖基化CTLA4－Ig(2微升)裝填至Waters Oasis逆相萃取藥筒管柱(2.1 x 20毫米)上。將經裝填之管柱在0.2毫升/分鐘之流率下，以5%溶劑B(溶劑A：水中之1%甲酸，溶劑B：乙腈中之1%甲酸)洗滌五分鐘以脫鹽，其中溶離劑係轉向廢料。於5分鐘結束時，快速梯度液(在10分鐘內，5%溶劑B至95%溶劑B)係開始使CTLA4－Ig溶離出管柱；此處係於流動分離後，將溶離劑在45微升/分鐘下，導入質譜儀(Waters Micromass Q－Tof microTM )中(所使用之層析系統為裝有Waters 2996偵測器之Waters Alliance 2695)。
將Q－Tof microTM 之毛細管電壓設定在3 kV下，並將試樣圓錐體電壓設定在40V下。將掃描(每0.9秒)平均成為一次掃描；掃描間之時間為0.1秒。Q－Tof分析器係從m/z 800掃描至2500。使用Waters MassLynxTM 軟體，將相應於高於最高峰高度(在TIC層析圖中)一半部份之光譜合併。使合併之光譜接受Waters MaxEnt1去旋。將解析度設定在1 Da/通道下，且均勻高斯傷害模式係經選擇，具有設定在0.5－1 Da間之半高度下之寬度。將左邊吸收峰與右邊吸收峰之最低強度比例均設定在50%下。
實例8：基質輔助雷射解吸附離子化作用－飛行時間(MALDI－TOF)
MALDI－MS光譜係於OmniFlexTM (Bruker Daltonics,MA)上，使用氮雷射(337毫微米)獲得。使用蛋白質試樣，無需脫鹽化或被脫鹽，使用固相萃取，呈C4 ZipTip吸量管尖端(Millipore,Bedford MA)形式。在使用之前，將吸量管尖端以乙腈－水(1：1 v/v)潤濕，並以0.1%三氟醋酸(TFA)達成平衡。然後，經由將10微升試樣自吸量管吸取與逐出三次，裝填吸量管尖端。將經裝填之試樣以10微升0.1% TFA洗滌三次。使經脫鹽之蛋白質試樣以10微升乙腈對水(1：1 v/v)自吸量管溶離。點加試樣，其方式是將1微升試樣(無論是經脫鹽或含有緩衝劑)與1微升基質溶液混合，並將1微升混合物放置在不銹鋼標的上。基質溶液係為含有0.1% TFA之芥子酸在1：1水對乙腈(v/v)中之飽和溶液。將混合物點加至MALDI試樣板上，並使其風乾，然後放置在質譜儀中。所有蛋白質試樣係於線性、正離子模式中，藉由延遲之萃取，使用20 kV之加速電壓與200毫微秒之延遲時間分析。總共400個單射光譜係累積自各試樣。外部校準係使用含有胰蛋白酶原(23982 m/z)、蛋白質A(44613 m/z)及牛白蛋白(66431 m/z)之標準蛋白質之混合物達成。
肽之MALDI－TOFMS分析 將肽混合物藉逆相層析法分離，並收集得自層析吸收峰之溶離份，且蒸發至乾涸。於50微升25 mM磷酸鹽緩衝劑pH 7.5中重製試樣。將DTT添加至5 mM之最後濃度中，並將溶離份在50℃下培養20分鐘。於還原作用後，將IAM添加至10 mM最後濃度中，並在黑暗中，於50℃下再培養20分鐘。
MALDI－MS光譜係於OmniFlex(Bruker Daltonics,MA)上，使用氮雷射(337毫微米)獲得。試樣係經由將1微升試樣與1微升基質溶液混合而製成。基質溶液係為具有0.1% TFA之a－氰基－4－羥基桂皮酸在1對1水：乙腈中之飽和溶液。將混合物點加至MALDI試樣板之井上，並使其風乾，然後放置在質譜儀中。所有肽係於反射、正離子模式中，藉由延遲之萃取，使用20 kV之加速電壓與200毫微秒之延遲時間分析。總共100個單射光譜係累積自各試樣。外部校準係使用含有血管收縮素II(1046.54 m/z)、血管收縮素I(1296.68 m/z)、物質P(1347.74 m/z)、朋貝辛(bombesin)(1619.82 m/z)、ACTH夾子1－17(2093.09 m/z)、ACTH夾子18－39(2465.20 m/z)及生長激素釋放抑制因子(3147.47 m/z)之標準肽之混合物達成。
實例9：對CTLA4－Ig單鏈與多聚體物種之培養基與培養基組份作用之分析
製備CTLA4－Ig之CTLA4－Ig二聚體、低唾液酸亞溶離份、高唾液酸亞溶離份、單體額面及單體物種，並經純化。將此等試樣使用於一系列製作模型實驗中，其係經設計以測定培養基與培養基組份對單鏈與高分子量形成之影響，歷經零到至少60小時之時間。測試調配物緩衝劑、碘乙醯胺、磷酸鈉、氯化銨、基底培養基、發酵肉湯、培養基177e、培養基濃酸溶液I、培養基濃酸溶液II、胰島素、EDTA、半胱胺酸、硫辛酸、谷胱甘肽、甲硫胺酸及酵母煉製物單獨及呈組合之影響。
實例10：藉由尺寸分析CTLA4－Ig分子
可採用使用變性條件之尺寸排阻層析(SEC)之方法，以定量不同尺寸之蛋白質物種。於一項具體實施例中，可採用使用變性條件之協力SEC以定量CTLA4－Ig單鏈物種。單鏈CTLA4－Ig可為缺乏鏈間二硫化物橋基之物種。於純化程序期間被單離之單鏈CTLA4－Ig物種，係被稱為原本單鏈CTLA4－Ig。藉由CTLA4－Ig二聚體之還原作用與烷基化作用所產生之經純化單鏈，係被稱為所引致之單鏈。原本與所引致之單鏈CTLA4－Ig具有相同特徵。
物料： 單鹽基性磷酸鉀(KH2 PO4 )ACS級氫氧化鉀(KOH)45% w/w溶液ACS級氯化鈉(NaCl)ACS級經校準可調整之單一吸量管，100＿升Rainin(目錄編號P－100)水(H2 O)HPLC級2.0毫升低溫小玻瓶Nalgene(目錄編號5000－0020)濃鹽酸(HCl)Fisher(目錄編號A144－212)氫氧化鈉(NaOH)10N溶液J.T.Baker(目錄編號5674－02)1000毫升濾器單元0.22毫米Corning(目錄編號430517)聚丙烯15毫升試管Falcon(目錄編號352097)疊氮化鈉(NaN3)ACS級磷酸鈉單鹽基性單水合物(NaH2 PO4 ．H2 O)氫氧化鉀(KOH)丸粒
儀器配置與條件 HPLC系統Waters 2695分離模組管柱Toso Haas 5 μTSK 3 0 0 0 SWXL,300毫米x 7.8毫米內徑(零件編號08541)防護管柱Toso Haas 5 μTSK 3000 SWXL,40毫米x 6.0毫米內徑(零件編號08543)偵測器Waters 2487雙波長偵測器波長280毫微米流率1毫升/分鐘整合系統Empower注射體積20微升檢測標的濃度10毫克/毫升流動相0.2M KH2PO4,0.9% NaCl,pH 6.8,具有KOH檢測操作時間20分鐘管柱環境溫度試樣溫度4℃滯留時間單體8.7分鐘±1.0分鐘,HMW物種在7.5分鐘±1.0分鐘下，若存在時，則MW物種將於單體吸收峰後溶離
試劑 4N氫氧化鉀(4N KOH)(100毫升)使用如所述之下列製備之一：將40毫升HPLC級水與11.6毫升45% w/w之KOH溶液添加至100毫升量瓶中。以HPLC級水使體積來到至高100毫升。於100毫升量瓶中，添加80毫升HPLC級水，將22.4克KOH丸粒稱量，並磁攪拌直到完全溶解為止。以HPLC級水使來到100毫升之體積。將溶液轉移至250毫升玻璃試劑瓶中。藉由翻轉充分混合。於室溫下儲存至高1年。流動相(0.2M KH2PO4,0.9% NaCl,pH 6.8)稱量出27.2克KH2PO4與9.0克NaCl，置於1000毫升燒杯中。以磁攪拌棒，使用連續混合，使固體溶解於800毫升HPLC級水中。使用pH計，將溶液之pH值使用4N KOH溶液調整至6.8。若pH值超過6.8，則將其以濃HCl調整。使用1000毫升量筒，使最後體積來到1升。將溶液經過0.22微米濾器單元過濾。轉移至1000毫升玻璃試劑瓶中，並音振，同時真空脫氣5 ＋/－1分鐘。於各使用前脫氣。於室溫下儲存至高1月。2N氫氧化鈉(2N NaOH)將20毫升10N NaOH轉移至100毫升玻璃量筒中。以HPLC水使體積來到至高100毫升。將溶液轉移至250毫升玻璃試劑瓶中。藉由翻轉充分混合。於室溫下儲存至高1年。將3.45克NaH2 PO4 ．H2 O與2.92克NaCl稱量，並溶解，且以攪拌棒在900毫升HPLC級水中混合。使用pH計，將溶液之pH值以2N NaOH調整至7.4。若pH值超過7.4，則將其以濃HCl調整。
使用1000毫升量筒，使最後體積來到1升。將溶液經過0.22微米濾器單元過濾。於2°－8℃下儲存至高6個月。管柱儲存緩衝劑(在水中之0.05% w/v NaN3 )將50±5毫克疊氮化鈉稱量，並以磁攪拌棒將其添加至1000毫升燒杯中。將500毫升HPLC級水添加至燒杯中，並攪拌直到完全溶解為止。以水使體積來到1升。將溶液經過0.22微米濾器單元過濾，並傾倒至1000毫升HPLC試劑瓶中。於室溫下儲存至高6個月。
高分子量物種與系統適合性標準物之製備 此將提供經加熱至未經加熱之CTLA4－Ig參考物質之三倍稀釋液與15%－30%高分子量物種面積百分比量。於15毫升Falcon試管中，在10.0±1.0毫克/毫升下，使用CTLA4－Ig稀緩衝液製備大約3毫升參考物質。CTLA4－Ig之起始濃度係得自COA。從該值製造10.0±1.0毫克/毫升稀釋液。轉移1.0毫升經稀釋之參考物質，其係於2.0毫升低溫小玻瓶中，使用1毫升吸量管製成，並將其在水浴中，於67±2℃下加熱45±2分鐘。使用1毫升吸量管，轉移所製成之經加熱參考物質，返回15毫升試管中。溫和地以吸量管上下吸取1毫升體積之試管含量，總共10次。此係為系統適合性標準物。儲存條件：在2.0毫升低溫小玻瓶中製備150微升液份之系統適合性標準物，以在－80±5℃下儲存至高1年。獲得參考物質之起始濃度，並從該值製造10.0±1.0毫克/毫升稀釋液。使用最少100微升參考物質與適當量之稀緩衝液，以達成最後濃度為10.0±1.0毫克/毫升。參考下列關於稀釋之方程式
關於CTLA4－Ig藥物，從蛋白質濃度，使用最少100微升液份試樣與適當量之稀緩衝液製造10.0±1.0毫克/毫升稀釋液，以達成最後濃度為10.0±1.0毫克/毫升。參考下列關於稀釋之方程式：
一旦稀釋至10.0±1.0毫克/毫升，試樣可在2°－8℃下儲存至高24小時。關於CTLA4－Ig藥物產物，從蛋白質濃度，使用最少200微升液份試樣與適當量之稀緩衝液製造10.0±1.0毫克/毫升稀釋液，以達成最後濃度為10.0±1.0毫克/毫升。參考下列關於稀釋之方程式：
將流動相放置在一個溶劑儲槽中，並將HPLC級水放置在另一個溶劑儲槽中。於操作之前音振，並真空脫氣。在操作之前打開偵測器，並允許15分鐘溫熱。在使用新穎或目前常用管柱於分析之前，以HPLC級水沖洗管柱至少20分鐘，接著為流動相緩衝劑平衡至少20分鐘。使用1.0毫升/分鐘之流率。將150微升液份系統適合性標準物解凍，將其添加至自動取樣器小玻瓶中，並將小玻瓶放置在自動取樣器中。在此條件下注射20微升標準物。
根據下式，測定在大約7.5分鐘下溶離之高分子量物種之百分比：(在下式中，單體實際上係指二聚體) 其中：A＝高分子量物種之吸收峰面積B＝單體之吸收峰面積
面積百分比高分子量物種不應小於15%。若其小於15%，則將另外之濃高分子量物種添加至上文系統適合性標準物中。解析度(R)測定與滯留時間評估。注射20微升系統適合性標準物。計算高分子量物種(滯留時間大約7.5分鐘)與單體吸收峰(滯留時間大約8.7分鐘)間之解析度，使用下列方程式：(在下式中，"單體"實際上係指二聚體) 其中：t1 ＝高分子量物種之滯留時間t2 ＝單體之滯留時間W1 ＝高分子量物種之峰寬W2 ＝單體之峰寬
峰寬係以分鐘表示，在吸收峰之底部上度量，於外推吸收峰之相對較直側面至基線後，滯留時間與峰寬係以相同單位度量。於一項具體實施例中，(R)必須≧1.2，且對於吸收峰之滯留時間應為8.7±1.0分鐘。
理論板數測定(N) 從系統適合性標準物層析圖測定管柱之效率，其方式是根據下列方程式，計算理論板數(N)： 其中：t＝為單體之滯留時間(以分鐘表示)w＝為在單體基線上之寬度(以分鐘表示)，藉由外推吸收峰之側面至基線所獲得
將製造總共六(6)份CTLA4－Ig物質之注射液。將200微升10毫克/毫升參考物質分成數液份，置於自動取樣器小玻瓶中，並將小玻瓶放置在自動取樣器中，且注射六次。處理層析圖，並計算各層析圖之二聚體吸收峰面積。將得自六份層析圖之二聚體吸收峰面積加總，並根據下列方程式計算平均標準偏差與%RSD： 其中：X1.2.3... ＝一組數據中之特定值nx ＝一組數值(x)
5.4.4.2按下述計算標準偏差： 其中：n＝一組數據中之數值(x)之數目x＝一組數據中之一個數值
5.4.4.3按下述計算%相對標準偏差(RSD)：
注射順序之實例：
吸收峰之積分將層析圖中從5.5至11.8分鐘之所有吸收峰面積積分。放大層析圖之基線，以確保所有LMW與HMW物種之總面積均被包含在積分中。不考慮相應於對照組中吸收峰之試樣中吸收峰。夾雜吸收峰(11.8－13.5分鐘)與後來之吸收峰，不被考慮在此計算中。但是，若在夾雜體積上之面積為總面積之0.1%或較大，則應加以注意。二聚體吸收峰係於8.7±1.0分鐘時溶離，高分子量物種吸收峰係於7.5±1.0分鐘時溶離，且低分子量物種(例如單體，若存在時)將於二聚體吸收峰後溶離。應注意具有280毫微米吸光率，超過總吸收峰面積之0.1面積%之高分子量物種、二聚體或低分子量物種以外之任何吸收峰。按下述計算面積百分比：(在下文方程式中，對"阿巴塔謝特(Abatacept)單體"之指稱，係指CTLA4－Ig二聚體)。
面積%單體＝100－(面積%HMW＋面積%LMW)其中：A＝阿巴塔謝特單體吸收峰面積B＝具有小於阿巴塔謝特單體滯留時間之所有吸收峰之總面積C＝具有大於阿巴塔謝特單體吸收峰滯留時間之所有吸收峰之總面積(排除夾雜體積)
將試樣藉尺寸排阻層析，使用Water's Alliance2695(Milford,MA)，於串聯放置之兩個7.8 x 300毫米TSK Gel G3000SWXLTM 管柱(Tosoh Biosep,Montgomery,PA)上分離，採用6.0 x 40毫米防護管柱。注射25微升各經純化之試樣，並於恒定組成條件下，使用0.1M Na2 HPO4 ,0.1M Na2 SO4 ,pH 6.8，在1.0毫升/分鐘下分離。試樣係在280毫微米下，使用996 PDA偵測器(Waters,Milford,MA)偵測，並使用Millennium 4.0TM 層析軟體(Waters,Milford,MA)分析。
得自變性分析協力尺寸排阻層析之原本與所引致單鏈物質之經覆蓋層析圖，係個別顯示平均滯留時間(6份複製)為27.96±0.02與27.99±0.02。發現原本單鏈之平均吸收峰面積為495525.0±9589.6，而所引致之單鏈為463311.8±7997.2(表13)。原本與所引致單鏈物質之經覆蓋MALDI－TOF光譜具有十分寬廣之吸收峰，其中基線寬度為約15000個質量單位。由於兩種試樣中之糖基化作用之異質性，故有此期望。使用各質譜中單鏈吸收峰之頂端以計算平均質量。關於原本與所引致CTLA4－Ig單鏈之平均質量，係個別為45694.426±297.735與45333.086±264.778個質量單位，以六份複製之分析為基準(表14)。預期原本單鏈質量會高於所引致單鏈之質量，因為於原本單鏈上有額外半胱胺酸(殘基質量103道爾吞)在順序識別碼：2之Cys146 上，然而所引致之單鏈係為選擇性地使單一鏈間二硫化物橋基還原，接著為添加乙醯基(質量58道爾吞)之烷基化作用之結果。
此等數據顯示原本與所引致物質藉由協力變性SEC層析與MALDI－TOF分析，會產生相等結果。此等結果係証實在原本與所引致CTLA4－Ig單鏈物質間之可比較性。
半胱胺酸之存在於多肽鏈內，係允許二硫化物鍵結之形成，其可為分子內或分子間，導致二聚體或多聚體蛋白質複合物之形成。CTLA4－Ig係以二聚體存在(其中二聚體係由兩個單體構成，具有下列順序之任一項：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382；(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之26－382)，(v)順序識別碼：2之25－382，及(vi)順序識別碼：2之25－383，在各鏈上藉由在C146 間之一個二硫鍵固定在一起。此二硫鍵之還原作用可造成藉由非共價靜電力固定在一起之兩個相當蛋白質鏈之形成。當接受壓倒或蓋過吸引靜電力之變性條件時，此種CTLA4－Ig可完全解離，而造成大約46 kDa之兩個相同蛋白質結構。所形成之結構係被稱為單鏈或單體。單鏈之存在可藉由協力管柱尺寸排阻層析操作，於變性條件下監控。
CTLA4－Ig分子之亞群集係於Cys146 上含有一項修改：存在於大部份群集中之二硫化物鏈結，係被改變成自由態半胱胺酸胺基酸(被稱為半胱胺醯基化作用)。CTLA4－Ig二聚體主要為蛋白質，具有分子量為大約92,000。其係由兩個經糖基化之多肽鏈所組成，其係藉由Cys146 上之一個鏈間二硫鍵與非共價交互作用固定在一起(亦被稱為CTLA4－Ig"二聚體")。經純化之蛋白質係以非均質群集存在，且含有修改，譬如在N－與C－末端上之糖基化作用與變型。
CTLA4－Ig分子之不同群集係存在，其缺少鏈間二硫鍵鏈結。此以非共價方式連結之群集係存在於藉由尺寸排阻層析所產生之額面二聚體吸收峰內。已發現額面二聚體缺少鏈間二硫鍵。缺少鏈間二硫化物鏈之CTLA4－Ig物種係藉由在Cys146 上之半胱胺醯基化作用被修改，其修改係發生在>99%之單鏈物種上，以ESI－MS完整數據為基礎。O－連結碳水化合物之Cys146 半胱胺醯基化作用與富含為在CTLA4－Ig單鏈物種上之兩項主要修改。使額面二聚體接受變性尺寸排阻層析，而造成CTLA4－Ig單鏈吸收峰之單離。將經純化之額面單體物質與CTLA4－Ig作比較，使用以及未使用固相萃取(SPE)，並於MALDI上分析。經純化之額面單體係含有兩種優勢物種：主要物種，在無論是對經SPE處理為47005u或對未經處理為46897u上；較少物種，在無論是對經SPE處理為95070u或對未經處理為96172u上。CTLA4－Ig物質亦含有兩種優勢物種：主要物種，在無論是對經SPE處理為91518u或對未經處理為91143u上；較少物種，在無論是對經SPE處理為45660u或對未經處理為46014u上。
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig組合物係具有下列特徵，關於二聚體、高MW物種及低MW物種(單體、單鏈)之大小均一性(HPLC)分析：．≧97.0%二聚體．≦2.0% HMW物種．≦0.5% LMW物種(例如單體、單鏈)
於另一項具體實施例中，CTLA4－Ig組合物具有下列特徵量之各物種：．≧95.5%二聚體．≦3.0% HMW物種．≦0.5% LMW物種(例如單體、單鏈)
對於使用方法CD－CHO1所製造之藥物，百分比單體係涵蓋從98.4至99.8%之範圍，具有平均值為99.4%。百分比HMW物種係從0.2改變至1.6%。平均值為0.6%，具有CV為45.7%。對於二聚體，95%容許度間隔為≧98.7%，而對於HMW物種為≦1.3%。批料之百分比HMW物種係從0.4%之最低值改變至2.1%之最大值。平均百分比HMW物種為0.8%，具有%CV為40%。在所有情況中，LMW或單體物種係低於偵測極限(DL＝0.1%)。關於由方法CD－CHO1所製造之CTLA4－Ig之95%容許度間隔(以提供99面積%群集之覆蓋)，對於HMW物種係個別為≦1.3與≦1.8%。對於得自方法CD－CHO1之藥物中二聚體之95%容許度間隔，係個別為98.7%與96.5%。
上表顯示百分比HMW物種係涵蓋從0.2至2.1%之範圍，具有平均值為0.6%。二聚體係涵蓋從94.8%至99.8%之範圍，具有99.3%之平均值與0.3%之精密度。關於二聚體在位置之間、在位置內及全部位置變型中之偏差係在0.3至0.5%內。對於HMW在位置間之變型為26.4%。對於百分比HMW物種，在位置內與全部位置變型，係個別為44.2與51.4%。對於二聚體(97.3%)與HMW物種(1.8%)之95%容許度間隔，係在本專利說明書內。
實例11：載體建構
pcSD表現載體之建構 ：表現載體pcSD係建構自市購可得之pcDNA3載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)，如圖26中所示。將新霉素抗藥性基因卡匣藉由以核酸內切限制酶Nae I之消化，自質粒pcDNA3移除。核酸內切限制酶Nae I會產生鈍末端。將DNA片段藉由瓊脂糖凝膠電泳分離，並使3.821 kb pcDNA3載體主鏈自凝膠純化。將含有會對老鼠二氫葉酸鹽還原酶(dhfr )編碼之基因與SV40啟動子之DNA片段，經由質粒以限制核酸內切酶Pvu II與Bam H I之消化自質粒pSV2－dhfr單離。將相應於dhfr 基因卡匣之1.93 kb片段分離，並藉由瓊脂糖凝膠電泳純化。將藉由Bam H I消化所產生之3－引動凹陷末端，使用DNA聚合酶I之Klenow片段充填，以產生鈍末端。將此經單離之片段連接至鈍末端化之3.8 kb pcDNA3載體主鏈，以產生表現載體pcSD。此表現載體具有下列特徵：巨細胞病毒(CMV)啟動子，接著為多個無性繁殖位置，牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化作用訊息與轉錄終止順序，用於選擇與放大之老鼠dhfr cDNA順序，及用於選擇與維持在大腸桿菌中之胺苄青霉素抗藥性基因與pUC複製來源。
pcSDhuCTLA4－Ig表現載體之建構 ：將含有使CTLA4－Ig蛋白質編碼之順序之1.2千鹼基(kb)DNA片段，藉由以限制酵素Hind III與Xba I之消化，自質粒pCDM8－CTLA4－Ig單離。將1.2－kbHind III/Xba I片段連接至先前以限制酵素Hind III與Xba I消化之載體piLN中。所形成之質粒構造物，被稱為piLN－huCTLA4－Ig，係示於圖9 中。將piLN－huCTLA4－Ig質粒作為CTLA4－Ig編碼順序之來源使用，其係使用於最後表現載體pcSDhuCTLA4－Ig之建構中。
對於CTLA4－Ig基因表現之最後載體，係按圖27 中所示建構。將含有CTLA4－Ig基因之1.2 kb DNA片段藉由兩步驟限制消化程序，自質粒piLN－huCTLA4－Ig單離。首先將質粒piLN－huCTLA4－Ig以限制酵素Hind III消化。將所形成之3－引動凹陷末端，經由以DNA聚合酶I之Klenow片段之處理充填。然後將質粒以限制酵素Xba I消化，以釋出含有CTLA4－Ig基因之1.2 kb片段。使此片段純化，並連接至自pcSD之限制消化單離之Eco R V與Xba I片段。Eco R V與Xba I限制位置係位於pcSD之多個無性繁殖位置，其在CMV啟動子與含有牛生長激素聚腺苷酸化作用訊息與轉錄終止順序之卡匣之間。此將CTLA4－Ig基因片段置於CMV啟動子之控制下。此質粒係被為稱為pcSDhuCTLA4－Ig，並包含順序識別碼：1。
實例12：CTLA4－Ig表現載體之轉染，以獲得安定細胞系
此實例與實例13係描述細胞之新經轉染群集，個別無性繁殖系係選自其中並擴大，且因此經擴大之無性繁殖系係不同於寄存於ATCC成為收受號碼CRL－10762之細胞。隱藏表現載體之前述CHO細胞系，含有使相應於CTLA4－Ig之胺基酸順序編碼之DNA(具有ATCC收受號碼68629之DNA)，係描述於美國專利5,434,131中。簡言之，使含有cDNA之表現質粒(例如pCDM8)，其係寄存於ATCC收受號碼68629下，藉由帶脂化作用，使用標準程序轉染至dhfr 陰性－CHO細胞中，以獲得會安定地表現CTLA4－Ig之細胞系。於培養基中使用免疫染色，針對B7結合活性篩檢B7陽性CHO細胞系，造成會表現CTLA4－Ig之安定轉染體。此經轉染細胞之非均質群集係被稱為中國大頰鼠卵巢細胞系，CTLA4－Ig－24，且於1991年5月31日，依布達佩斯(Budapest)條約，寄存於ATCC，具有ATCC收受號碼CRL－10762。
中國大頰鼠卵巢細胞系，DG44，係含有對酵素二氫葉酸鹽還原酶編碼之基因之缺失。表現質粒pcSDhuCTLA4－Ig係含有二氫葉酸鹽還原酶基因(dhfr )之複製物。質粒pcSDhuCTLA4－Ig之插入至DG44基因組中，會造成dhfr 缺失之功能性互補。此功能性互補可於胺甲喋呤(MTX)存在下用於選擇轉染體，及dhfr 與相鄰基因之放大。
人類CTLA4－Ig－分泌細胞系1D5係藉由細胞系DG44以pcSDhuCTLA4－Ig表現質粒之轉染而被建構，如圖27 中所示。將質粒DNA藉由電擊穿孔，使用此項技藝中已知之標準程序，引進至DG44細胞中。轉染體係經選擇，使用經補充5%(v/v)經滲析牛胎兒血清之最低必要培養基(MEM；JRH生物科技公司,Kansas)。得自轉染體之培養物上層清液係使用夾層ELIsA方法，對人類IgG生產進行篩檢。將Fc－專一山羊抗人類IgG作為捕獲抗體使用。使用經共軛至辣根過氧化酶之山羊抗人類IgG抗體，以偵測人類IgG。表現較高含量之人類CTLA4－Ig基因之轉染體係經選擇，供進一步放大。
經選擇轉染體之基因放大作用係藉由在100 nM之最後濃度下，將MTX添加至培養基中而達成。MTX為葉酸類似物，其係充作二氫葉酸鹽還原酶之競爭性抑制劑。MTX之添加至培養基中，係允許含有dhfr 基因之多個複製物與提高含量之二氫葉酸鹽還原酶之轉染體之選擇。亦含有相鄰CTLA4－Ig基因之多個複製物之轉染體，係使用人類IgG專一ELISA方法確認。產生CTLA4－Ig之無性繁殖系，被稱為1D5，係經選擇供進一步發展，一部份被描述於實例13中。
實例13：安定地經轉染細胞之次代無性繁殖
使細胞系1D5接受軟性瓊脂無性繁殖。衍生自軟性瓊脂無性繁殖之次代無性繁殖系係使用ELISA方法分析人類IgG生產。經選擇之次代無性繁殖系係評估CTLA4－Ig生產與生長性質。先導次代無性繁殖，被稱為1D5－100A1，係經選擇。
1D5－100A1細胞系係從含有動物來源原料之DE培養基(JRH生物科技公司,Kansas)修改成稱為CD－CHO之化學上定義之培養基(表15 )。CD－CHO培養基係為由Invitrogen公司，Carlsbad,CA所製造之專賣不含動物成份之培養基。
將細胞系1D5－100A1根據標準組織培養擬案，在DE培養基中培養並產生繼代。然後，將細胞轉移至由50% DE培養基與50% CD－CHO培養基所組成之培養基。於此培養基中數繼代後，將細胞轉移至含有100% CD－CHO培養基之T－燒瓶中。使細胞在100% CD－CHO培養基中生長數繼代。然後，使經修改之細胞藉由限制稀釋接受無性繁殖。
使得自CD－CHO－經修改1D5－100A1細胞系藉由限制稀釋，使用不含血清培養基無性繁殖。將1D5－100A1細胞在1個細胞/井之標的下，接種至含有經補充MCDB培養基之96－井微滴定板中。MCDB為化學上定義之培養基調配物，由Sigma－Aldrich,St.Louis,Mo配銷。將MCDB培養基以4 mM麩醯胺、500微克/毫升重組人類胰島素、100 nM MTX及10%經調理之培養基補充。此經調理之培養基係為經濾器滅菌之上層清液，得自在MCDB培養基中生長之CD－CHO經修改1D5－100A1細胞系之培養物。
確認含有單一菌落之井，且無性繁殖系係使用ELISA方法評估CTLA4－Ig生產。將經選擇之無性繁殖系從96－井微滴定板擴大至6－井細胞培養板。將培養物進一步擴大至25平方公分T－燒瓶，然後是滾筒瓶中。
滾筒瓶培養物係經評估CTLA4－Ig滴定度、CTLA4－Ig唾液酸含量及生長。三種無性繁殖系係經選擇，供在生物反應器中進一步評估及進一步特徵鑒定。使用經儲存於－80℃下之無性繁殖細胞系1D5－100A1.17之冷凍小玻瓶研究儲備液，以產生細胞儲存體。
實例14：CTLA4－Ig在生物反應器中經由餵入批次方法之生產
表現CTLA4－Ig之懸浮哺乳動物細胞之商業規模培養 ：此實例係描述包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子之製自懸浮培養之dhfr －陰性CHO細胞。於此實例中所述之方法可經修改與延伸，供其他重組蛋白質之生產，包括但不限於經分泌之蛋白質，譬如細胞活素及其他激素，作為Ig超族群之成員或包含Ig超族群蛋白質之一部份之經分泌蛋白質，及一般為在CHO細胞中表現之任何蛋白質。
培養燒瓶(例如T－175與Erlenmyer燒瓶)、滾筒瓶及細胞袋係被使用於CTLA4－Ig培養方法之接種物擴大步驟，以連續性地自冷凍小玻瓶繁殖細胞，以提供足夠數目之存活細胞，以接種20,000升生物反應器。
將細胞之單一小玻瓶自液態氮儲存冷凍庫之氣相移除，並在37℃下，於水浴中解凍。將小玻瓶之全部內容物以無菌方式轉移至無菌15毫升圓錐形離心管中。添加CD－CHO培養基，以使最後體積來到10毫升。將細胞懸浮液離心，拋棄上層清液，並使細胞丸粒再懸浮於10毫升CD－CHO細胞培養基中。將再懸浮之細胞轉移至含有10毫升CD－CHO培養基之T－175燒瓶。測定T－175燒瓶中培養物之存活細胞密度與百分比存活力。關於在此步驟下之百分比存活力≧84%之標準係經建立。將CD－CHO培養基添加至T－175燒瓶中，以達成標的存活細胞密度為1.7－2.6 x 105 個細胞/毫升。
將T－175燒瓶在37℃及6%二氧化碳之大氣下培養最高四天，以達成標的最後細胞數目為＝6 x 106 個存活細胞。在各繼代下，將細胞在2.0 x 105 個存活細胞/毫升之標的密度下接種，其中培養物係以具有最後培養物細胞存活力＝80%作為標的。將培養物於CD－CHO培養基中，在37℃及6%二氧化碳之大氣下培養最高四天。
培養物之擴大係發生在一系列細胞袋(20升、100升及200升)中，以進一步接種1000升生物反應器。匯集得自2升滾筒瓶接種物擴大步驟之細胞培養物質，以在2.0x105個存活細胞/毫升之標的接種密度下接種20升細胞袋。關於在1.0至2.0 x 106 個細胞/毫升之2升滾筒瓶接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度，及≧80%之最低百分比細胞存活力之條件係經建立。於接種時，係將20升細胞袋培養物於CD－CHO培養基中，在37℃及6%二氧化碳之大氣下培養最高四天。對於各後續繼代(100升與200升細胞袋)，係將細胞在2.0 x 105 個存活細胞/毫升之標的密度下接種，其中培養物係以具有最後培養物細胞存活力＝80%作為標的。將培養物於CD－CHO培養基中，在37℃及6%二氧化碳之大氣下培養最高四天。關於在1.0至2.0 x 106 個細胞/毫升之20升、100升及200升細胞袋接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度，及≧80%之最低百分比細胞存活力之標準係經建立。此等標準係確保足夠數目之存活細胞被用以接種1000升生物反應器。
CTLA4－Ig方法之1000升與4000升接種生物反應器接種物擴大步驟之目的，係為提供足夠數目之存活細胞，以接種20,000升製造生物反應器。
接種生物反應器係以批次模式，使用CD－CHO細胞培養基操作。溫度、pH、經溶解之氧、壓力，空氣、氧及二氧化碳之攪拌與氣流速率，係藉由分佈控制系統(DCS)控制，並提供培養物在接種生物反應器中最適宜生長之條件。接種生物反應器係在37℃下操作。將培養物試樣自接種生物反應器移除，供存活細胞密度、百分比存活力及新陳代謝產物濃度之測定。
將1000升接種生物反應器以得自200升細胞袋擴大步驟之接種物接種，達標的最初存活細胞密度為1.0至3.0 x 105 個存活細胞/毫升。將培養物於CD－CHO培養基中，在37℃下培養最高5天。關於在1000升接種生物反應器接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度係為1.0至2.0 x 106個細胞/毫升，且最低百分比細胞存活力為≧80%。
將4000升接種生物反應器以得自1000升接種生物反應器擴大步驟之接種物接種，達標的最初存活細胞密度為1.0至3.0 x 105 個存活細胞/毫升。將培養物於CD－CHO培養基中，在37℃下培養最高6天。關於在4000升接種生物反應器接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度為1.0至2.0 x 106個細胞/毫升，且最低百分比細胞存活力為≧80%。此等標準係確保足夠數目之存活細胞被用以接種20,000升製造生物反應器。
將20,000升接種生物反應器以得自4000升接種生物反應器擴大步驟之接種物接種，達標的最初存活細胞密度為1.0至1.8 x 105 個存活細胞/毫升。將培養物於CD－CHO培養基中，在37℃下培養最高6天。關於在20,000升接種生物反應器接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度為1.0至2.0 x 106 個細胞/毫升，且最低百分比細胞存活力為≧80%。此等標準係確保在20,000升製造生物反應器中起始生產期之前，使用足夠數目之存活細胞。
CTLA4－Ig之商業規模製造 ：發生在20,000升製造生物反應器中之本發明生產期，會產生高量與高品質CTLA4－Ig蛋白質，其係涉及具有兩步驟溫度移轉之培養物操作。使於CD－CHO培養基中，在37℃下培養最高6天之20,000升培養物(如上文所述)，於第6天(對數生長期結束)接受從37℃至34℃之溫度移轉(T－移轉)。於37℃至34℃溫度移轉後之十二小時，將CD－CHO培養基以經修改之eRDF進料培養基(Invitrogen公司,Carlsbad,CA；表16,17 )補充，且此進料係以大丸劑(1% w/w)每日提供至製造反應器。
將20,000升培養物於經每日補充eRDF進料培養基之CD－CHO培養基中，在34℃下培養最高4天。於第10天，使20,000升培養物接受從34℃至32℃之第二次T－移轉。將製造生物反應器中之20,000升生產培養物在32℃下保持最高8天。於第18天，培養物試樣係被分析關於下列標準：在20,000升接種生物反應器製造步驟下之存活細胞密度為3.0至8.0 x 106 個細胞/毫升；最低百分比細胞存活力為≧38%；最後唾液酸莫耳比(描述於別處)為≧6；及最後CTLA4－Ig蛋白質產物滴定度為0.5至1.3克/升。此等標準係確保足夠品質與量之蛋白質產物正藉由重組CHO細胞系製造，且20,000升哺乳動物細胞培養物係準備被採集。
在生產期之期間內，於生物反應器中之培養物，係給予每日大丸劑進料，使用經修改之eRDF培養基(表16 ,17 )，如下述：於起始溫度移轉(37℃至34℃)後12小時開始，添加最低1%培養物體積作為進料培養基；若葡萄糖含量降至低於3克/升，則添加經計算之體積，以使葡萄糖含量回復至3克/升。
生產期在20,000升規模下具有18天之延續時間。以每日為基礎，自製造生物反應器採取試樣以供分析。例如，將用於細胞計數之試樣以錐藍(Sigma,St.Louis,Mo.)染色。細胞計數與細胞存活力測定係使用血球計進行，以在顯微鏡下計數存活經染色之細胞。對於新陳代謝產物之分析，係將另外之試樣液份在2000 rpm(4℃)下離心20分鐘，以將細胞製成丸粒。將上層清液使用此項技藝中習用上實施之技術與擬案，分析蛋白質滴定度、唾液酸、葡萄糖、乳酸酯、麩醯胺、麩胺酸酯、pH、pO2 、pCO2 、氨及LDH。
實例15：重組CTLA4－Ig之純化
關於CTLA4－Ig純化之QXL陰離子交換層析 ：於CTLA4－Ig方法中之陰離子交換層析步驟，係使用Q瓊脂糖極端負載(QXL)陰離子交換層析樹脂。此樹脂係由GE保健,Waukesha,WI(以前為Amersham Biosciences)所供應。QXL層析步驟係為捕獲且濃縮得自採集作業步驟之進行中物質之CTLA4－Ig二聚體，供進一步下游處理。
將1.0 －2.0米內徑管柱以QXL樹脂填充，達高度為17至30 公分，這表示體積為約643升至1018升。經由測定經填充管柱之理論塔板高度(HETP)與不對稱性(As )，評定管柱合格供使用。採用0.02至0.08公分之HETP與0.8至1.2之As ，供QXL管柱之資格評定。
QXL管柱作業係於環境溫度下進行。將澄清之細胞培養物培養基裝填至已達成平衡之QXL管柱上。QXL層析步驟係使用99.4升/分鐘之最高流率進行。將管柱入口壓力保持低於35 psig。關於QXL管柱之最高CTLA4－Ig蛋白質負載，係為每升樹脂28克CTLA4－Ig。
首先，將QXL層析管柱以1N氫氧化鈉溶液消毒。此消毒係使用2至4個管柱體積(CV)之1N氫氧化鈉溶液進行。當管柱流出物之導電率等於169±33 mS/公分，且管柱被保持60至120分鐘時，消毒係完成。
於消毒步驟後，使管柱以75 mM HEPES,360 mM氯化鈉，pH 8.0緩衝劑達成平衡。當最低3 CV平衡緩衝液已通過管柱，且流出物之pH值為8.0±0.2，及流出物之導電率為13.4±1.0 mS/公分時，平衡係完成。
將得自採集作業步驟之進行中物質裝填至QXL管柱上。將管柱以最低10 CV洗滌緩衝劑(75 mM HEPES,360 mM NaCl,pH 8.0)洗滌，且管柱流出物在280毫微米(A280 )下之吸光率係在洗滌步驟結束時度量。然後，使CTLA4－Ig以25 mM HEPES,325 mM NaCl,pH 7.0緩衝劑自管柱溶離。當A280 增加至高於洗滌步驟結束時之AU值≧0.02吸光率單位(AU)時，使溶離物轉向至收集容器中。收集溶離物，直到溶離吸收峰之拖曳邊緣之A280 降至數值≦1.0 AU為止。
收集具有莫耳唾液酸對莫耳CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為＝8之CTLA4－Ig二聚體產物，且CTLA4－Ig高分子量物質之匯集庫係存在於＝25.7%下。然後可使包含四聚體之CTLA4－Ig高分子量物質進一步純化，作為個別物質用於本文中所述之處理方法。
關於CTLA4－Ig純化之苯基瓊脂糖FF HIC ：疏水性交互作用層析(HIC)步驟係使用苯基瓊脂糖快速流動樹脂(GE保健,Waukesha,WI(以前為Amersham Biosciences))。HIC步驟會降低存在於QXL產物匯集庫中之CTLA4－Ig高分子量物質之含量。CTLA4－Ig二聚體在用於HIC步驟之裝填條件下，不會結合至HIC樹脂。
將1.0 至2.0米內徑管柱以苯基瓊脂糖快速流動樹脂填充，至高度為18至22公分，這表示體積為約680至852升。經由測定經填充管柱之HETP與As ，評定管柱合格供使用。採用0.02至0.08公分之HETP與0.8至1.2之As ，供HIC管柱之資格評定。
HIC管柱作業係於環境溫度下進行。將得自QXL管柱步驟之溶離物匯集庫裝填至經達成平衡之HIC管柱上，無需進一步處理。HIC步驟係在65.4升/分鐘之最高流率與≦13 psig之操作壓力下操作。施加至HIC管柱之最高CTLA4－Ig蛋白質負載，係為每升樹脂10.0克CTLA4－Ig蛋白質。可採用HIC步驟之多次循環，以存在於QXL溶離物匯集庫中之CTLA4－Ig蛋白質之量為基準。
首先，將HIC管柱以1N氫氧化鈉溶液消毒。當2至4 CV之1N氫氧化鈉溶液已通過管柱時，消毒係完成。然後，將管柱保持60至120分鐘，以確保消毒。
於消毒步驟後，使管柱以75 mM HEPES,2.55M氯化鈉，pH 7.0緩衝劑達成平衡。當最低3 CV平衡緩衝液已通過管柱，且流出物之pH值為7.0±0.3，及導電率為71.5至75.5 mS/公分時，平衡係完成。
將得自QXL步驟之溶離物施加至已達成平衡之HIC管柱。然後將管柱以溶出平衡緩衝液洗滌，直到流出物之A280 降至0.8與1.0 AU之間為止。將得自HIC步驟之各循環之含CTLA4－Ig蛋白質流出物，經過0.2微米纖維素醋酸酯濾器過濾至常用不銹鋼收集容器中。將此HIC產物匯集庫在2°至8℃下保持在收集容器中。於收集容器中之最高保持時間為3天。
收集具有莫耳唾液酸對莫耳CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為＝8之CTLA4－Ig二聚體產物，且CTLA4－Ig高分子量物質之匯集庫係存在於＝2.5%下。
關於CTLA4－Ig純化之重組蛋白質A親和層析 ：使用於下游CTLA4－Ig製造方法之重組蛋白質A瓊脂糖快速流動親和力樹脂(rPA)，係得自GE保健(Waukesha,WI(以前為Amersham Biosciences))。rPA管柱層析步驟係使CTLA4－Ig蛋白質進一步純化。此步驟係將DNA與宿主細胞蛋白質移除，包括單細胞向化性蛋白質1(MCP－1)。
將80 至140公分內徑管柱以rPA樹脂填充，達高度為18至25公分，這表示體積為約339至372升。經由測定經填充管柱之HETP與As ，評定管柱合格供使用。採用0.02至0.08公分之HETP與0.8至1.2之As ，供管柱之資格評定。對於在樹脂壽命研究中所建立之rPA樹脂之最高使用次數為60。
rPA管柱作業係於環境溫度下進行。將病毒失活產物匯集庫裝填至經達成平衡之rPA管柱上。rPA步驟係在26.7升/分鐘之最高流率與≦13 psig之操作壓力下操作。施加至rPA管柱之最高CTLA4－Ig蛋白質負載，係為每升樹脂25克CTLA4－Ig蛋白質。
使rPA管柱以25 mM Tris,250 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑達成平衡。當最低3 CV平衡緩衝液已通過管柱，且流出物之pH與導電率值個別在7.8至8.2及23.0至27.0 mS/公分之間時，平衡係完成。
將病毒失活步驟產物匯集庫施加至已達成平衡之rPA管柱。rPA層析步驟係包括兩個洗滌步驟。第一個洗滌步驟係使用最低5 CV之25 mM Tris,250 mM NaCl,0.5% Triton X－100,pH 8.0緩衝劑進行，以自rPA管柱移除微弱地結合之物質。第二個洗滌步驟係使用25 mM Tris,250 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑進行。第二個洗滌步驟係使用最低值5 CV，以自rPA管柱移除殘留Triton X－100。
使CTLA4－Ig蛋白質以100 mM甘胺酸,pH 3.5緩衝劑自rPA層析管柱溶離。當A280 增加至高於基線≧0.2 AU時，使溶離物轉向至收集容器中。將管柱流出物經過0.2微米纖維素醋酸酯濾器過濾至裝有攪拌器之收集容器中。收集溶離物，直到溶離吸收峰之拖曳邊緣之A280 降至數值≦0.2 AU為止。將溶離物匯集庫之pH值以2M HEPES,pH 8.0緩衝劑調整至pH 7.5±0.2。將rPA層析步驟產物匯集庫在2°至8℃下保持最高3天。
收集具有莫耳唾液酸對莫耳CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為＝8之CTLA4－Ig二聚體產物；CTLA4－Ig高分子量物質之匯集庫係存在於＝2.5%下；且MCP－1＝38毫微克/毫升之匯集庫係存在。
關於CTLA4－Ig純化之QFF陰離子交換層析 ：下游CTLA4－Ig製造方法中之陰離子交換層析步驟係使用Q瓊脂糖快速流動(QFF)陰離子交換層析樹脂(GE保健,Waukesha,WI(以前為Amersham Biosciences))。QFF層析步驟之目的係為降低殘留蛋白質A含量，並提供得自病毒過濾步驟產物匯集庫之宿主細胞DNA之另外降低。QFF管柱步驟亦用以控制QFF層析步驟產物匯集庫之唾液酸對CTLA4－Ig蛋白質莫耳比，並提供進行中CTLA4－Ig HMW物質含量之另外控制。關於降低CTLA4－Ig HMW物質之主要進行中控制點為HIC步驟。
將60 至140公分內徑管柱以QFF樹脂填充，達高度為28至35公分，這表示體積為約536至667升。經由測定經填充管柱之HETP與As ，評定管柱合格供使用。採用0.02至0.08公分之HETP與0.8至1.2之As ，供管柱之資格評定。
QFF管柱作業係於環境溫度下進行。將病毒過濾步驟產物匯集庫裝填至已達成平衡之QFF管柱上。QFF步驟係在38.7升/分鐘之最高流率與≦35 psig之操作壓力下操作。施加至QFF管柱之最高CTLA4－Ig蛋白質負載為每升樹脂25克CTLA4－Ig蛋白質。
首先，將QFF層析管柱以1N氫氧化鈉溶液消毒。消毒係使用2至4 CV之1N氫氧化鈉溶液進行。當管柱流出物之導電率等於136至202 mS/公分，且管柱管柱被保持60至120分鐘時，消毒係完成。
於消毒步驟後，使管柱以25 mM HEPES,100 mM氯化鈉，pH 8.0緩衝劑達成平衡。當最低4 CV平衡緩衝液已通過管柱，且流出物之pH值為7.7至8.3，及導電率為10.5至12.9 mS/公分時，平衡係完成。將包含在生物處理袋中之病毒過濾步驟產物匯集庫轉移至無菌不銹鋼收集容器中。
將病毒過濾步驟產物匯集庫施加至已達成平衡之QFF管柱。QFF層析步驟係包括兩個洗滌步驟。第一個洗滌步驟係使用最低5.0 CV之25 mM HEPES,120 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑進行。第二個洗滌步驟係使用最低5.0 CV之25 mM HEPES,130 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑進行。
將CTLA4－Ig二聚體使用25 mM HEPES,200 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑自QFF層析管柱溶離。當流出物之A280 開始增加時，則起始溶離物收集。在溶離期間，將管柱流出物經過0.2微米纖維素醋酸酯濾器過濾至不銹鋼收集容器中。收集溶離物，直到溶離吸收峰之拖曳邊緣之吸光率降至高於基線≦0.2 AU為止。然後，使收集容器冷卻至2°至8℃。關於QFF層析步驟產物匯集庫在2°至8℃下之最高保持時間為3天。
收集具有莫耳唾液酸對莫耳CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為＝8之CTLA4－Ig二聚體產物；CTLA4－Ig高分子量物質之匯集庫係存在於＝2.5%下；CTLA4－Ig低分子量物質(例如CTLA4－Ig單體)之匯集庫係存在於＝0.5%下；且MCP－1＝9.5毫微克/毫升之匯集庫係存在。
將Pall Filtron TFF系統使用於下游CTLA4－Ig製造方法之濃縮與滲濾步驟。此步驟之目的係為使QFF層析步驟產物匯集庫濃縮至45至55克/升，並將QFF層析步驟中所使用之溶離緩衝劑與用於CTLA4－Ig組合物之最後緩衝劑交換。將經濃縮之CTLA4－Ig蛋白質產物匯集庫經過0.2微米聚二氟亞乙烯濾器轉移，並進入50升生物處理袋中。
實例16：胺基單醣之CTLA4－Ig－莫耳比測定
此實例係提供獲得胺基單醣(N－乙醯半乳糖胺，N－乙醯胺基葡糖)對CTLA4－Ig試樣中蛋白質之莫耳比之方法。
儀器配置：毛細電泳系統Beckman P/ACE MDQ CE系統；偵測器Beckman雷射所引致螢光(LIF)偵測系統(與P/ACE MDQ聯結)；未經塗覆之毛細管(內徑25微米；外徑360微米)，27－31公分總長度，以順應無論是P/ACE MDQ或5510 PolyMicro技術，目錄編號TSP025375；Maxi－Mix混合器Thermolyne(VWR目錄編號58810－185)。
試劑：水解作用溶液(4N HCl水溶液) 將160毫升6N HCl與80毫升HPLC級水添加至250毫升玻璃瓶中。攪拌以充分混合。於2－8℃下儲存至高6個月。衍化作用溶液I(0.1M APTS水溶液) 於小玻瓶中，將192微升HPLC級水添加至之10毫克APTS之粉末內。將小玻瓶渦旋5－10秒，以完全溶解APTS。於－20℃下儲存至高一年。衍化作用溶液II(1M醋酸與0.25M NaBH 3 CN) 將20微升醋酸在0.4毫升離心管中，以320微升HPLC級水稀釋(17倍稀釋)，以製造1M醋酸溶液。將2.0±0.5毫克NaBH3 CN稱量，置於低溫小玻瓶中。使用下式，添加適當體積之1M醋酸溶液，以製造0.25M NaBH3 CN。體積(微升)＝103 x(NaBH3 CN之重量，以毫克表示)/(62.84克/莫耳x 0.25莫耳/升)
．應將氰基硼氫化鈉(NaBH3 CN)於黑暗中，儲存在乾燥器內。．建議將試劑區分至一系列2.0毫升低溫小玻瓶中供儲存，以避免重複打開最初之試劑瓶，如下述：．將1.0克±0.2毫克氰基硼氫化鈉稱量至2.0毫升低溫小玻瓶中。將氰基硼氫化鈉之全部內容物依此方式自最初瓶子取出液份。．緊密地加蓋，並順序地將低溫小玻瓶貼上標籤(1,2,3等)，伴隨著試劑名稱、批號及6個月失效期。．應將小玻瓶以帕拉膜(parafilm)密封，以避免濕氣。．對於衍化作用溶液II，從相同低溫小玻瓶稱出氰基硼氫化鈉之重量，不超過三次。在實驗室工作圖上記下此事項及低溫小玻瓶順序編號。．無論是在CE分佈形態中所發現之試劑吸收峰或不良標識，可能會在重複打開低溫小玻瓶或使用特定批號之氰基硼氫化鈉後發生。若這會影響結果，則拋棄正被使用之低溫小玻瓶，且無論是從具有下一順序編號之低溫小玻瓶或從新批號之氰基硼氫化鈉稱出試劑之重量。
再乙醯化作用緩衝劑(25 mM碳酸氫鈉,pH 9.5) 將0.210±0.02克碳酸氫鈉稱量至乾淨100毫升玻璃燒杯中。
添加90毫升HPLC級水，並在攪拌板上混合，直到鹽完全溶解為止。
將pH值以10N NaOH調整至9.5±0.l。
添加HPLC級水，以製造最後體積100毫升。將溶液過濾(步驟1.26)，並在室溫下儲存至高3個月。
操作緩衝劑(60±5 mM四硼酸鈉,pH 9.25) 將1.21±0.02克四硼酸鈉稱量至100毫升乾淨玻璃燒杯中。
添加90毫升HPLC級水，並在攪拌板上混合，直到鹽完全溶解為止。
將pH值以10N NaOH調整至9.25±0.10。
添加HPLC級水以製造最後體積100毫升，提供最後濃度為60±5 mM。
對於55 mM溶液，將1.11克(±0.02)四硼酸鈉稱量，並按照上文指示用於溶解及滴定。
對於65m M溶液，將1.31克(±0.02)四硼酸鈉稱量，並按照上文指示用於溶解及滴定。
於室溫下儲存至高3個月。若影響峰解析度(R值<1.0)，則製備新緩衝劑。
選用：經由將120毫升超純水添加至80毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑中，稀釋四硼酸鹽緩衝溶液(MicroSolv)，提供最後濃度為60 mM(±5 mM)。以10N NaOH滴定，以使溶液pH來到9.25(±0.1)。
對於55 mM四硼酸鹽溶液，將66毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑稀釋至114毫升超純水中。按上述滴定。
對於65 mM四硼酸鹽溶液，將78毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑稀釋至102毫升超純水中。按上述滴定。
將溶液在室溫下儲存最高3個月。若影響峰解析度(R值<1.0)，則製備新緩衝劑。
毛細管沖洗溶液N NaOH溶液 將1毫升10N NaOH溶液添加至含有9毫升HPLC級水之15毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。
將溶液在室溫下儲存最高6個月。
N HCl溶液： 將1毫升6N HCl溶液添加至含有5毫升HPLC級水之15毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。
將溶液在室溫下儲存最高6個月。
3.6.3 80%甲醇溶液：將8毫升HPLC級甲醇添加至含有2毫升HPLC級水之15毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。
將溶液在室溫下儲存最高6個月。
單醣標準儲備溶液N－乙醯胺基葡糖(GalNAc) 將5±1毫克GalNAc精確地稱量至2.0毫升低溫小玻瓶中。
添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合，直到溶解為止。
記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
N－乙醯半乳糖胺(GlcNAc) 將5±1毫克GlcNAc精確地稱量至2.0毫升低溫小玻瓶中。
添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合，直到溶解為止。
記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
N－乙醯甘露糖胺(ManNAc) 將5±1毫克ManNAc精確地稱量至2.0毫升低溫小玻瓶中。
添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合，直到溶解為止。
記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
將單醣標準儲備溶液在－20℃下儲存至高1年。
單醣工作溶液I：內標準工作溶液 將ManNAc之儲備溶液以HPLC級水100倍稀釋，其方式是將20微升ManNAc儲備溶液添加至已含有1980微升HPLC級水之2毫升低溫小玻瓶中。渦旋大約5至10秒。
將內標準工作溶液在2－8℃下儲存至高6個月。
單醣工作溶液H：胺基混合物標準工作溶液 於含有1960微升HPLC級水之2.0毫升低溫小玻瓶中，個別添加20微升GalNAc與GlcNAc之儲備溶液。渦旋大約5至10秒。
將胺基混合物標準工作溶液在2－8℃下儲存至高6個月。
試樣與參考物質溶液 將冷凍蛋白質試樣在2－8℃下解凍，並藉由倒置溫和地混合。
將試樣與參考物質兩者以HPLC級水稀釋至約1.0毫克/毫升。記下濃度，達三位有效數字。
CE操作條件 操作緩衝劑(步驟2.5)60 mM四硼酸鈉,pH 9.25毛細管藥筒溫度25℃電壓25－30 kV，正模式偵測器條件LIF偵測器，激發：488毫微米，發射：520毫微米試樣注射壓力注射模式，20s，在0.5 psi下操作時間10分鐘試樣儲存10℃
程序註 ：使用10微升吸量管與微尖端，以轉移10微升試樣體積，及適當大小之吸量管，以轉移其他試劑(參閱步驟2.10至2.14中之範圍)。
水解作用 於0.65毫升離心管中，添加10微升ManNAc工作溶液與200微升4N水解溶液(步驟3.1)。其係充作系統空白試驗。
於0.65毫升離心管中，添加10微升ManNAc工作溶液與10微升胺基混合物標準溶液(步驟3.9)。進一步添加200微升4N水解溶液。其係充作單醣標準物，用於定量與系統適合性。重複製備。
於0.65毫升離心管中，添加10微升ManNAc工作溶液與10微升CTLA4－Ig參考物質溶液(大約1毫克/毫升)。
進一步添加200微升4N HCl溶液。重複製備。
於0.65毫升離心管中，添加10微升ManNAc工作溶液與10微升試樣溶液(大約1毫克/毫升)。進一步添加200微升4N HCl溶液。重複製備。
將試樣渦旋大約10秒，並離心大約5－10秒。將試樣放置在96－位置小玻瓶掛架中，並在烘箱中，於95℃下培養6小時。
於水解後，將已水解試樣放置在－20℃下10分鐘，以冷卻下來。
將已水解之試樣短暫地離心，直到任何冷凝液被強迫至管件底部(於高速下5－10秒)為止。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。
註 ：關閉SpeedVac加熱，並將蒸發速率設定為"低"。
以100微升HPLC級水重配各試樣，並渦旋10－15秒。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。
註 ：關閉SpeedVac加熱，並將蒸發速率設定為"低"。
再乙醯化作用 以10微升M6再乙醯化作用緩衝劑重配各試樣，並渦旋5－10秒，以充分混合。將4微升M3再乙醯化作用試劑添加至各管件中。渦旋大約5－10秒。在冰上培養30分鐘。
註 ：可將序乙醯化作用緩衝劑(M6)與試劑(M3)個別以自行製成之25 mM NaHCO 3 (添加20微升)與醋酸酐(添加4機升)置換。
使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。
註 ：關閉SpeedVac加熱，並將蒸發速率設定為"低"。 以100微升HPLC級水重配各試樣，並渦旋10－15秒。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。
註 ：關閉SpeedVac加熱，並將蒸發速率設定為"低"。
衍化作用 將微離心機放置在烘箱中，以達成平衡至烘箱溫度為55℃。
以10微升衍化作用溶液I(0.1M APTS溶液，步驟3.2)重配各試樣。渦旋大約5－10秒。
添加5微升衍化作用溶液II(1MHAc與0.25M NaBH3 CN，步驟3.3)。渦旋大約5－10秒，並離心。
將試樣小玻瓶快速地裝載至經預熱之離心機中，並將離心機放回55℃烘箱中。培養3小時，同時在2000 rpm下離心。此係防止溶劑在小玻瓶表面上之凝結。
儀器配置製備 安裝新毛細管，以高壓模式(80 psi)沖洗，使用下列步驟：1N NaOH，歷經20分鐘。
HPLC級水，歷經10分鐘。
60 mM四硼酸鈉緩衝劑，歷經10分鐘。
作業 於各作業之前，操作洗滌/沖洗順序，以沖洗毛細管。
然後操作系統適合性標準物(單醣標準物)，以確保系統為適當的。
使用1N NaOH可蝕刻來自不同賣主之毛細管內側，並在整個操作中造成潛移時間之移轉。若其造成最後吸收峰(GlcNAc)之潛移時間成為超過10.0分鐘，則對於步驟2沖洗，可能必須以0.1N NaOH或HPLC級水置換1N NaOH。
當使用相當毛細管，且上文洗滌程序不足夠時，則對於欲在10.0分鐘標準內之最後吸收峰(GlcNAc)，可能必須使用80%甲醇及/或1N HCl。
注射液之製劑 於衍化作用後，使試樣冷卻下來至室溫。在室溫下離心大約10秒，直到冷凝液被強迫至管件之底部。
將85微升HPLC級水添加至各管件中，以使各試樣之最後體積來到100微升。渦旋5－10秒。
將10微升試樣從各管件轉移至CE微小玻瓶，並將190微升HPLC級水添加至各管件中。渦旋5－10秒。
沖洗步驟與注射順序： 註 ：對於每四次注射，係將CE操作緩衝劑以新製成之CE操作緩衝劑更換(此係由於離子耗乏作用所致)。在40 psi下進行毛細管沖洗。
系統適合性 註 ：系統適合性數值係使用系統適合性標準物之第一次注射測定，除非另有指明。
第一種系統適合性之電泳圖譜應類似圖79 中所示者，其中吸收峰1為GalNAc；吸收峰2為ManNAc；吸收峰3為GlcNAc。
註 ：當Beckman PACE MDO以外之CE儀器欲被使用時，由於容納分離毛細管之藥筒之不同型態，故毛細管之長度可能不同於此方法中所指定者。其會造成分析物潛移時間以及吸收峰強度上之偏差。
在兩個相鄰吸收峰間之解析度，係藉由儀器計算第一種系統適合性標準物，根據下列方程式： 其中：R＝解析度t2 ,t1 ＝個別為兩個相鄰吸收峰之潛移時間W1 ,W2 ＝個別為在兩個相鄰吸收峰基線下之峰寬
R值必須≧1.0。若R<1.0，則以洗滌/沖洗順序沖洗毛細管；若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。對於最後系統適合性注射，最後吸收峰(GlcNAc)必須具有拖尾因數<1.4，使用下式：T＝W0.05 /2f其中：T＝拖尾因數W0.05 ＝在5%高度下之峰寬f＝在峰頂前方之峰寬若T≧1.4，則以洗滌/沖洗順序沖洗毛細管；若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。
系統適合性標準物之複製注射必須符合下列標準：．GlcNAc對MaNAc之峰面積比：RSD≦10%(於步驟7.1中計算而得)．GlcNAc之潛移時間應≦10.0分鐘．分佈形態應相當於圖79 ，其中發現三個吸收峰，且內標準物(ManNAc)為編號2吸收峰。
若在測試試樣之前未符合任何上文標準，則若GlcNAc之潛移時間大於10.0分鐘，會首先增加電壓。接著，若峰面積比>10%，則製備新CE緩衝劑，確認其pH值，或置換毛細管。於調整儀器後，重複系統適合性注射。當分析吸收峰分佈形態時，若發生ManNAc峰高之顯著降低，則檢查以確認進入LIF模組中之光纖電纜並未不對準。
藉由比較內標準物與單醣標準成份之吸收峰面積比例，測定單醣標準物百分比RSD。將各單醣成份之吸收峰面積，除以各單醣標準物注射之內標準之吸收峰面積。計算關於兩種一起進行之標準物之GalNAc與GlcNAc之百分比RSD。RSD應≦10%。若未符合此平均標準，則應按上述將毛細管沖洗或置換。試樣與一起進行之單醣標準物必須重複。
計算 計算GalNAc與GlcNAc相對於內標準物(ManNAc)之峰面積比。使用於最初四種系統適合性標準物之複製注射上，以致能夠符合上文標準，並對試樣前與後所注射之所有一起進行之系統適合性標準物進行相同計算。
峰面積比＝將各單醣成份(GlcNAc,GalNAc)之吸收峰面積除以各系統適合性標準物注射之內標準物(ManNAc)之吸收峰面積。
計算系統適合性標準物中GlcNAc與GalNAc之吸收峰面積比例之平均值。亦計算標準偏差(S.D.)與百分比相對標準偏差(%RSD)。
系統適合性標準物標準：關於GlcNAc之峰面積比之RSD≦10%。
在試樣前後所注射之兩種一起進行之系統適合性標準物：關於GlcNAc與GalNAc之峰面積比之百分比RSD≦10%。若未符合此平均標準(RSD>10%)，則毛細管需要以沖洗程序再沖洗，且此等試樣與一起進行之單醣標準物需要再一次操作。若仍未符合平均標準，則置換毛細管並沖洗。再一次操作試樣與一起進行之單醣標準物。
其中：n＝試樣中度量值之數目x＝個別度量值 計算GalNAc/蛋白質之莫耳比： 其中：RGalNAc ＝GalNAc對蛋白質之莫耳比AGalNAc ＝試樣中GalNAc之吸收峰面積(μV．秒)AManNAc ＝試樣中ManNAc之吸收峰面積(μV．秒)AManNAcO ＝單醣標準物中ManNAc之平均吸收峰面積(μV．秒)AGalNAcO ＝單醣標準物中GalNAc之平均吸收峰面積(μV．秒)VGalNAcO ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GalNAc之體積(以微升表示)CGalNAcO ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GalNAc之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWAbatacept ＝根據分析證明書(COA)之阿巴塔謝特參考物質之分子量MWGlcNAC ＝GalNAc之分子量(221.2道爾吞)
標準物一起進行 當計算CTLA4－Ig物質與試樣之莫耳比時，係使用全部八種一起進行之系統適合性標準物。將吸收峰面積平均，以包含在此等方程式中。此係欲被用於最初三個試樣。關於所有其他試樣，對於莫耳比計算，總是使用接著四種一起進行之單醣標準物與先前四種一起進行之單醣標準物之平均吸收峰面積。
計算GlcNAc/蛋白質之莫耳比 其中：RGlcNAc ＝GalNAc對蛋白質之莫耳比AGlcNAc ＝試樣中GlcNAc之吸收峰面積(μV．秒)AManNAc ＝試樣中ManNAc之吸收峰面積(μV．秒)AManNAcO ＝單醣標準物中ManNAc之平均吸收峰面積(μV．秒)AGlcNAcO ＝單醣標準物中GlcNAc之平均吸收峰面積(μV．秒)VGlcNAcO ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GlcNAc之體積(以微升表示)CGlcNAcO ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GlcNAc之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWAbatacept ＝根據COA之阿巴塔謝特參考物質之分子量MWGlcNAc ＝GlcNAc之分子量(221.2道爾吞)
標準. 對於欲被接受之數據，應符合所有系統適合性標準。關於兩種一起進行之胺基系統適合性標準物吸收峰面積比例之百分比RSD，不應超過10%。關於參考物質中之胺基單醣之平均莫耳比，必須在正下方表中所指定之範圍內。關於各成份，對於四種結果(複製製劑之重複注射)之%RSD必須</＝25%。
實例17：胺基單醣(GalNAc與GlcNAc)藉由毛細電泳法(CE)測定莫耳比
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig組合物具有約15－35莫耳GlcNAc/莫耳蛋白質與約1.7－3.6莫耳GalNac/莫耳蛋白質之特徵。下述實例係描述測定此等莫耳比之方法。
試劑：水解溶液(4N HCl)；衍化作用溶液I(0.1M 8係基－1,3,6－三磺酸三鈉鹽(APTS)水溶液)；衍化作用溶液II(0.25M NaBH3 CN，在1M醋酸中)；再乙醯化作用緩衝劑(25 mM碳酸氫鈉，pH 9.5)；操作緩衝劑(60±5 mM四硼酸鈉，pH 9.25)；毛細管沖洗溶液(1N NaOH；1N HCl；80%甲醇)；GalNAc、GlcNAc及ManNAc之單醣標準儲備溶液，在5毫克/毫升之濃度下；單醣工作溶液I：內標準工作溶液為ManNAc儲備溶液之100倍稀釋液；單醣工作溶液II：胺基混合物標準工作溶液，GalNAc與GlcNAc儲備溶液之100倍稀釋液。
儀器配置：CE系統為Beckman P/ACE MDQ CE系統；偵測器：與P/ACE MDQ聯結之Beckman雷射所引致(LIF)偵測系統；未經塗覆之毛細管(內徑25微米，外徑360微米)27－31公分總長度，以順應P/ACE MDQ。
毛細電泳法操作條件：操作緩衝劑(60 mM四硼酸鈉,pH 9.25)；毛細管藥筒溫度：25℃；電壓：25－30 kV，正模式；偵測器條件：LIF偵測器，在488毫微米下激發，在520米下發射；注射試樣：壓力注射模式，20s，在0.5 PSI下；操作時間：10分鐘；試樣儲存：10℃。
水解作用：將10微升ManNAc工作溶液與200微升4N HCl混合，以製造系統空白試驗。將10微升ManNAc工作溶液與10微升胺基混合物標準溶液及200微升4N HCl混合，以製造單醣標準物。將10微升ManNAc工作溶液與10微升CTLA4－Ig二聚體(大約1毫克/毫升)及200微升4N HCl混合，以製造測試試樣。將所有管件渦旋10秒，並離心10秒，接著在95℃下培養6小時。於水解步驟後，將試樣放置在－20℃下10分鐘，以冷卻下來。使試樣旋轉而下歷經10秒，並在SpeedVac中蒸發至乾涸。
再乙醯化作用：將經水解並乾燥之試樣以100微升HPLC級水重配。使經重配之試樣藉由添加10微升M6再－N－乙醯化作用緩衝劑(Glyko)與4微升M3再－乙醯化作用試劑(Glyko)進行再乙醯化，接著混合，並在冰上培養(30分鐘)。使試樣旋轉而下歷經10秒，並在SpeedVac中蒸發至乾涸。
衍化作用：使經重配之試樣(100微升HPLC級水)達成平衡55℃，接著添加10微升衍化作用溶液I，短暫混合，並添加5微升衍化作用溶液II。將試樣裝填在經預熱之離心機中，並在55℃下培養3小時，同時在2000 rpm下離心。
CE注射：使衍化作用後試樣之最後體積藉由添加HPLC級水來到100微升，並將10微升試樣與190微升HPLC級水一起轉移至CE微小玻瓶。於試樣注射之前，將CE藥筒以HPLC級水廣泛地沖洗(1－3分鐘操作時間)，接著以操作緩衝劑進行平衡沖洗(5分鐘操作時間)。於最初沖洗之後，將供分析用之單醣標準物與試樣注射在CE藥筒中(10分鐘操作時間)。於各標準物或測試試樣之注射操作後，將CE藥筒以HPLC級水與操作緩衝劑沖洗並達成平衡。系統適合性之電泳圖譜應類似圖28。
計算：計算GalNAc與GlcNAc相對於內標準ManNAc之峰面積比。
峰面積比＝單醣吸收峰面積(GalNAc或GlcNAc)/ManNAc吸收峰面積，其中關於峰面積比之相對標準偏差(RSD)係等於或低於10%。
計算單醣(例如GalNAc)對CTLA4－Ig蛋白質之比例：比例GalNAc ＝(AGalNAc x AManNAcO x VGalNAcO x CGalNAco x MWCTLA4－Ig二聚體 )/(AManNA c x AGalNAcO x Vp x Cp x MWGalNAc )比例GalNAc ＝GalNAc對蛋白質之莫耳比AGalNAc ＝GalNAc試樣中之吸收峰面積(μV.秒)AManNAc ＝ManNAc試樣中之吸收峰面積(μV.秒)AManNAcO ＝單醣標準物中ManNA c之平均吸收峰面積(μV.秒)AGalNAcO ＝單醣標準物中GalNAc之平均吸收峰面積(μV.秒)VGalNAcO ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GalNAc之體積(以微升表示)CGalNAcO ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GalNAc之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWCTLA4－Ig ＝CTLA4－Ig二聚體之分子量MWGalNAc ＝221.2道爾吞
實例18：中性單醣(甘露糖、海藻糖及半乳糖)藉由毛細電泳法(CE)測定莫耳比
試劑：水解溶液(2M三氟醋酸(TFA))；衍化作用溶液I(0.1M 8－胺基－1,3,6－三磺酸三鈉鹽(APTS)水溶液)；衍化作用溶液II(0.25M NaBH3 CN，在1M醋酸中)；操作緩衝劑(60±5 mM四硼酸鈉,pH 9.25)；毛細管沖洗溶液(1N NaOH；1N HCl；80%甲醇)；甘露糖(Man)、海藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)及木糖(Xyl)之單醣標準儲備溶液，在5毫克/毫升之濃度下；單醣工作溶液I：內標準工作溶液為Xyl儲備溶液之100倍稀釋液；單醣工作溶液II：中性混合物標準工作溶液，Man、Fuc及Gal儲備溶液之100倍稀釋液。
儀器配置：CE系統為Beckman P/ACE MDQ CE系統；偵測器：與P/ACE MDQ聯結之Beckman雷射所引致(LIF)偵測系統；未經塗覆之毛細管(內徑25微米，外徑360微米)27－31公分總長度，以順應P/ACEMDQ。
毛細電泳法操作條件：操作緩衝劑(60 mM四硼酸鈉,pH 9.25)；毛細管藥筒溫度：25℃；電壓：25－30 kV，正模式；偵測器條件：LIF偵測器，在488毫微米下激發，在520米下發射；注射試樣：壓力注射模式，20s，在0.5 PSI下；操作時間：10分鐘；試樣儲存：10℃。
毛細電泳法操作條件：操作緩衝劑(60 mM四硼酸鈉,pH 9.25)；毛細管藥筒溫度：25℃；電壓：25－30 kV，正模式；偵測器條件：LIF偵測器，在488毫微米下激發，在520米下發射；注射試樣：壓力注射模式，20s，在0.5 PSI下；操作時間：10分鐘；試樣儲存：10℃。
水解作用：將10微升木糖工作溶液與200微升2M TFA混合，以製造系統空白試驗。將10微升木糖工作溶液與10微升中性混合物標準溶液及200微升2M TFA混合，以製造單醣標準物。將10微升木糖工作溶液與10微升CTLA4－Ig二聚體(大約1毫克/毫升)及200微升2M TFA混合，以製造測試試樣。將所有管件渦旋10秒，並離心10秒，接著在95℃下培養6小時。於水解步驟後，將試樣放置在－20℃下10分鐘，以冷卻下來。使試樣旋轉而下歷經10秒，並在SpeedVac中蒸發至乾涸。
衍化作用：將試樣以100微升HPLC級水重配，並達成平衡55℃，接著添加10微升衍化作用溶液I，短暫混合，並添加5微升衍化作用溶液II。將試樣裝填在經預熱之離心機中，並在55℃下培養3小時，同時在2000 rpm下離心。
CE注射：使衍化作用後試樣之最後體積藉由添加HPLC級水來到100微升，並將10微升試樣與190微升HPLC級水一起轉移至CE微小玻瓶。於試樣注射之前，將CE藥筒以HPLC級水廣泛地沖洗(1－3分鐘操作時間)，接著以操作緩衝劑進行平衡沖洗(5分鐘操作時間)。於最初沖洗之後，將供分析用之單醣標準物與試樣注射在CE藥筒中(15分鐘操作時間)。於各標準物或測試試樣之注射操作後，將CE藥筒以HPLC級水與操作緩衝劑沖洗並達成平衡。系統適合性之電泳圖譜應類似圖29 。
計算：計算Man、Gal及Fuc相對於內標準木糖之峰面積比。
峰面積比＝單醣吸收峰面積(Gal、Fuc或Man)/木糖吸收峰面積，其中關於峰面積比之相對標準偏差(RSD)係等於或低於10%。
計算單醣(例如Man)對CTLA4－Ig蛋白質之比例：比例Man ＝(AMan x AXylO x VManO x CManO x MWCTLA4－Ig二聚體 )/(AXyl x AManO x Vp x Cp x MWMan )比例Man ＝Man對蛋白質之莫耳比AMan ＝在試樣中之Man內之吸收峰面積(μV.秒)Axyl ＝在試樣中之Xyl內之吸收峰面積(μV.秒)AXylO ＝單醣標準物中之Xyl之平均吸收峰面積(μV.秒)AManO ＝單醣標準物中之Man之平均吸收峰面積(μV.秒)VManO ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之甘露糖之體積(以微升表示)CManO ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之甘露糖之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWCTLA4－Ig ＝CTLA4－Ig二聚體之分子量MWMan ＝180.2道爾吞
實例19：CTLA4 A29YL104E －Ig在生物反應器中經由餵入批次方法之生產
表現CTLA4 A29YL104E －Ig之懸浮哺乳動物細胞之培養 ：此實例係描述包含順序識別碼：4單體之CTLA4A29YL104E －Ig分子之製自懸浮培養之dhfr －陰性CHO細胞。於此實例中所述之方法可經修改與延伸，供其他重組蛋白質之生產，包括但不限於經分泌之蛋白質，譬如細胞活素及其他激素，作為Ig超族群之成員或包含Ig超族群蛋白質之一部份之經分泌蛋白質，及一般性地在CHO細胞中表現之任何蛋白質。關於CTLA4A29YL104E －Ig培養步驟之流程圖，係示於圖22 中。
培養燒瓶(例如T－175與Erlenmyer燒瓶)、滾筒瓶及細胞袋係被使用於CTLA4A29YL104E －Ig培養生產方法之接種物擴大步驟，以連續性地自冷凍小玻瓶繁殖細胞，以提供足夠數目之存活細胞，以接種20,000升生物反應器。
將細胞之單一小玻瓶自液態氮儲存冷凍庫之氣相移除，並在37℃下，於水浴中解凍。將小玻瓶之全部內容物以無菌方式轉移至無菌15毫升圓錐形離心管中。添加CD－CHO接種物培養基(表20 )，以使最後體積來到10毫升。將細胞懸浮液離心，拋棄上層清液，並使細胞丸粒再懸浮於10毫升CD－CHO細胞培養物接種物培養基中。將經再懸浮之細胞轉移至含有10毫升CD－CHO接種物培養基之T－175燒瓶。測定在T－175燒瓶中之培養物之存活細胞密度與百分比存活力。關於在此步驟下之百分比存活力之標準≧80%係經建立。將CD－CHO接種物培養基添加至T－175燒瓶中，以達成標的存活細胞密度為約1.5 x 106 個細胞/毫升。
將T－175燒瓶在37±1℃及6%二氧化碳之大氣下培養最高四天，以達成標的最後細胞數目為＝6 x 106 個存活細胞。於T－175燒瓶步驟後，將培養物使用一系列振盪器燒瓶、1升與2升滾筒瓶擴大，如圖22 中所示。在各繼代下，係將細胞在約1.0－3.0 x 105 個存活細胞/毫升之標的密度下接種，其中培養物係以具有最後培養物細胞存活力＝80%作為標的。將培養物於CD－CHO接種物培養基中，在37±1℃及6%二氧化碳之大氣下培養最高四天。
培養物之擴大係發生在一系列之細胞袋(20升,100升及200升)中，以進一步接種1000升生物反應器。匯集得自2升滾筒瓶接種物擴大步驟之細胞培養物質，以在1.5 x 106 個存活細胞/毫升之標的接種密度下接種20升細胞袋。關於在約1.5 x 106 個細胞/毫升之2升滾筒瓶接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度，及≧80%之最低百分比細胞存活力之標準係經建立。於接種後，將20升細胞袋培養物於CD－CHO接種物培養基中，在37±1℃及6%二氧化碳之大氣下培養最高四天。對於各後續繼代(100升與200升細胞袋)，係將細胞在1.5 x 106 個存活細胞/毫升之標的密度下接種，其中培養物係以具有最後培養物細胞存活力＝80%作為標的。將培養物於CD－CHO接種物或基底培養基中，在37±1℃及6%二氧化碳之大氣下培養最高四天。關於在1.5 x 106 個細胞/毫升之20升、100升及200升細胞袋接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度，及≧80%之最低百分比細胞存活力之標準係經建立。此等標準係確保足夠數目之存活細胞被用以接種1000升生物反應器。
CTLA4A29YL104E －Ig生產方法之1000升與4000升接種生物反應器接種物擴大步驟之目的，係為提供足夠數目之存活細胞，以在20,000升製造生物反應器中接種商業規模培養物。
接種生物反應器係以批次模式，使用CD－CHO細胞培養物基底培養基操作(表21 )。溫度、pH、經溶解之氧、壓力，空氣、氧及二氧化碳之攪拌與氣流速率係被分佈控制系統(DCS)控制，並提供培養物在接種生物反應器中之最適宜生長條件。接種生物反應器係在37＋1℃下操作。將培養物試樣自接種生物反應器移除，供存活細胞密度、百分比存活力及新陳代謝產物濃度之測定。
將1000升接種生物反應器以得自200升細胞袋擴大步驟之接種物接種，達標的最初存活細胞密度為2.3 x 105 個存活細胞/毫升。將培養物於CD－CHO基底培養基中，在37℃下培養最高約5天或至高約113小時。關於在1000升接種生物反應器接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度之標準，為2.3 x 106 個細胞/毫升，且最低百分比細胞存活力為≧88%。
將4000升接種生物反應器以得自1000升接種生物反應器擴大步驟之接種物接種，達標的最初存活細胞密度為2.3 x 105 個存活細胞/毫升。將培養物於CD－CHO基底培養基中，在37℃下培養最高約5天或113小時。關於在4000升接種生物反應器接種物擴大步驟下之最後存活細胞密度之標準，係為2.3 x 106 個細胞/毫升，且最低百分比細胞存活力為≧88%。此等標準係確保足夠數目之存活細胞被使用於20,000升製造生物反應器中接種商業規模培養物。
CTLA4 A29YL104E －Ig之生產 ：發生在20,000升製造生物反應器中之本發明生產期，會產生高量與高品質CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質，其係涉及具有單步驟溫度移轉之培養物操作。使在經補充eRDF培養基之CD－CHO基底培養基(表22 )中，在37℃下培養最高6天之20,000升培養物，於第5或6天(對數生長期結束)接受從37±2℃至34±2℃之溫度移轉(T－移轉)。此進料係以大丸劑(1% w/w)每日提供給製造反應器。
將20,000升培養物於經每日補充eRDF進料培養基之CD－CHO培養基中，在34±2℃下培養最高18天。於第18天，培養物試樣係經分析下列標準：在20,000升接種生物反應器製造步驟下之存活細胞密度為3.0至8.0 x 106 個細胞/毫升；最低百分比細胞存活力為≧37%；最後唾液酸莫耳比(描所於別處)為約6或約5.2至約7.6；且最後CTLA4A29YL104E －Ig產物滴定度為約0.46至約0.71克/升。此等標準係確保足夠品質與量之蛋白質產物正藉由重組CHO細胞系製造，且20,000升哺乳動物細胞培養物準備被採集。
在生產期之期間內，於生物反應器中之培養物，係每日給予大丸劑進料，使用經修改之eRDF培養基(表22)。每日在1% v/v下添加含有12.5克/升半乳糖之進料培養基，歷經2至3天，直到葡萄糖濃度降至1克/升為止。一旦葡萄糖濃度已達到1克/升，即以計算之體積(典型上係大於1% v/v)每8小時添加進料培養基，以使葡萄糖濃度回復至1克/升。
培養物在20,000升生物反應器中之生產期具有18天之延續時間。以每日為基礎，自製造生物反應器採取試樣以供分析。例如，將用於細胞計數之試樣以錐藍(Sigma,St.Louis,Mo.)染色。細胞計數與細胞存活力測定係使用血球計進行，以在顯微鏡下計算存活經染色之細胞。對於新陳代謝產物之分析，係將另外之試樣液份在2000 rpm(4℃)下離心20分鐘，以將細胞製成丸粒。上層清液係使用習用上於此項技藝中實施之技術與擬案，分析蛋白質滴定度、唾液酸、葡萄糖、乳酸酯、麩醯胺、麩胺酸酯、pH、pO2 、pCO2 、氨及LDH。
實例20：重組CTLA4 A29YL104E －Ig之純化
病毒失活 將已澄清之濃縮採集物質之pH值藉由添加0.5M Tris溶液調整至8.0。使可能之偶發病毒劑藉由添加20% Triton X－100失活，達最後濃度為0.5%(v/v)。將經Triton X－100－處理之蛋白質溶液混合≧2小時。
關於CTLA4 A29YL104E －Ig純化之蛋白質A親和層析 ：使用MabSelect蛋白質A樹脂(GE保健，從前稱為Amersham Biosciences)之管柱之親和層析，係用以從得自病毒失活步驟之進行中物質捕獲CTLA4A29YL104E －Ig，並將CTLA4A29YL104E －Ig自大部份雜質分離。
將140公分內徑管柱以MabSelect PrA樹脂填充，達高度為18至25公分，這表示體積為約339至372升。經由測定經填充管柱之HETP與As ，評定管柱合格供使用。採用0.02至0.08公分之HETP與0.8至1.2之As ，供管柱之資格評定。
MabSelect PrA管柱作業係於環境溫度下進行。將病毒失活產物匯集物裝填至已達成平衡之MabSelect PrA管柱上。MabSelect PrA步驟係在26.7升/分鐘之最高流率與≦13 psig之操作壓力下操作。施加至MabSelect PrA管柱之最高CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質負載係為每升樹脂25克CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質，在350公分/小時之線速度下。管柱床係能夠結合大約3.9公斤CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質。
使MabSelect PrA管柱以25 mM NaH2 PO4 ,150 mM NaCl,pH 7.5緩衝劑達成平衡。當最低3 CV平衡緩衝液已通過管柱，且流出物之pH與導電率值個別在7.3至7.7與14.5至17.5 mS/公分之間時，平衡係完成。
將經Triton X－100－處理之進行中物質施加至已達成平衡之MabSelect PrA管柱。將管柱以最低3 CV之25 mM NaH2 PO4 ,150 mM NaCl,0.5% Triton X－100,pH 7.5緩衝劑洗滌，以自MabSelect PrA管柱移除微弱地被保留之雜質。此等雜質包括細胞活素單細胞向化性蛋白質－1(MCP－1)與Triton X－100。後續洗滌步驟係使用25 mM NaH2 PO4 ,150 mM NaCl,pH 7.5緩衝劑進行，以自MabSelect PrA管柱移除殘留Triton X－100。
使CTLA4A29YL104E －Ig以250 mM甘胺酸,pH 3.0緩衝劑自MabSelect PrA層析管柱溶離。當A280 增加至高於基線≧0.2 AU時，使溶離物轉向至收集容器中。將管柱流出物經過0.2微米纖維素醋酸酯濾器過濾至裝有攪拌器之收集容器中。收集溶離物，直到溶離吸收峰之拖曳邊緣之A280 降至數值≦0.2 AU為止。使CTLA4A29YL104E －Ig在大約2至3 CV溶離緩衝劑中溶離成狹窄吸收峰。將溶離物匯集物之pH值以2M HEPES,pH 7.5緩衝劑調整至pH 7.5±0.2，以快速地增加pH值，藉以使CTLA4A29YL104E －Ig高分子量(HMW)物種之形成降至最低。將MabSelect PrA層析步驟產物匯集物保持於環境溫度下最高5天。可使產物匯集物冷卻以供儲存；CTLA4A29YL104E －Ig之安定性分佈形態在5℃與22℃下為相同。可將產物儲存至高5天。
收集具有莫耳唾液酸對莫耳CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質之莫耳比為約6或約5.2至約7.6之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體產物。
關於CTLA4 A29YL104E －Ig純化之QFF陰離子交換層析 ：Q－瓊脂糖快速流動(QFF)樹脂(GE保健)之陰離子交換層析，主要係用以富含CTLA4A29YL104E －Ig之較高度唾液酸基化物種之量，以及降低殘留蛋白質A含量。將得自MabSelect蛋白質A管柱之經pH－調整CTLA4A29YLl04E －Ig產物匯集物在施加至QFF管柱之前，以注射用水(WFI)稀釋大約兩倍。
將80公分內徑管柱以QFF樹脂填充，達高度為27至35公分，這表示體積為約136至176升。經由測定經填充管柱之HETP與As ，評定管柱合格供使用。採用0.02至0.08公分之HETP與0.8至1.2之不對稱性(As )，供管柱之資格評定。
QFF管柱作業係於環境溫度下進行。使QFF管柱以50 mM HEPES,50 mM NaCl,pH 7.0緩衝劑達成平衡。將經pH與導電率調整之MabSelect蛋白質A步驟產物匯集物施加至QFF管柱。QFF步驟係在16.4升/分鐘(196公分/小時)之最高流率與35 psi之最高操作壓力下操作。
將管柱在使用之前與之後均以1N NaOH溶液消毒。使最低2管柱體積之氫氧化鈉溶液通過管柱。然後，將管柱保持為靜態，歷經60至120分鐘。關於溶液與管柱流出物之可接受導電率範圍為136至202 mS/公分。
使管柱以最低5管柱體積之50 mM HEPES,50 mM氯化鈉,pH 7.0緩衝劑達成平衡。關於此緩衝劑之pH與導電率範圍，係個別為6.8至7.2與5.0至7.0 mS/公分。此等範圍亦用以測定管柱是否為達成平衡。
將經pH與導電率調整之MabSelect蛋白質A步驟產物匯集物施加至QFF管柱，並將管柱以最低3 CV平衡緩衝液洗滌，以移除微弱地結合之雜質。然後將管柱以50 mM HEPES,135 mM NaCl,pH 7.0緩衝劑洗滌，以移除具有低唾液酸含量之CTLA4A29YL104E －Ig物種。
將CTLA4A29YL104E －Ig之較高度唾液酸基化之物種，使用50 mM HEPES,200 mM NaCl,pH 7.0緩衝劑自QFF層析管柱溶離。當溶離緩衝劑首先被施加至管柱時，起始溶離物收集。在溶離期間，將管柱流出物經過0.2微米濾器過濾至收集容器中。收集溶離物，直到溶離吸收峰之拖曳邊緣之吸光率降至高於基線≦0.2 AU為止。將CTLA4A29YL104E －Ig使用≦5 CV之50 mM HEPES,200 mM NaCl,pH 7.0緩衝劑自管柱溶離。然後使收集容器冷卻至2°至8℃。關於QFF層析步驟產物匯集物在2°至8℃下之最高保持時間為3天。
收集具有莫耳唾液酸對莫耳CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質之莫耳比為約6或約5.2至約7.6之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體產物。
關於CTLA4 A29YL104E －Ig純化之苯基瓊脂糖FF HIC ：使用Toyopearl苯基650M樹脂(Tosoh生物科技)之疏水性交互作用層析(HIC)，主要係用以降低得自QFF層析步驟之產物匯集物中之CTLA4A29YL104E －Ig HMW物種之量。
將100公分內徑管柱以苯基瓊脂糖苯基650M樹脂填充，達高度為18至22公分，這表示體積為約141至173升。經由測定經填充管柱之HETP與As ，評定管柱合格供使用。採用0.02至0.08公分之HETP與0.8至1.2之As ，供HIC管柱之資格評定。
HIC管柱作業係於環境溫度下進行。在施加至HIC管柱之前，將QFF層析步驟產物匯集物使用50 mM HEPES,pH 7.0緩衝劑與50 mM HEPES,3.6M硫酸銨,pH 7.0緩衝劑稀釋，以在QFF產物匯集物中達成導電率為大約135 mS/公分，及CTLA4A29YL104E －Ig濃度為≦1克/升。HIC步驟係在22.7升/分鐘(173公分/小時)之最高流率與45 psi之最高操作壓力下操作。HIC步驟之多次循環可以存在於QXL溶離物匯集物中之CTLA4A29YL104E －Ig之量為基準被採用。
首先將HIC管柱以1N氫氧化鈉溶液消毒。當2至4 CV之1N氫氧化鈉溶液已通過管柱時，消毒係完成。然後將管柱保持60至120分鐘，以確保消毒。
於消毒步驟後，使管柱以50 mM HEPES,1.2M硫酸銨,pH 7.0緩衝劑達成平衡。當最低3 CV平衡緩衝液已通過管柱，且流出物之pH值為7.0±0.3，及導電率為大約135 mS/公分時，平衡係完成。
將經濃度與導電率調整之CTLA4A29YL104E －Ig QFF層析步驟產物匯集物施加至管柱。然後將管柱以50 mM HEPES,1.2M硫酸銨,pH 7.0緩衝劑洗滌，以移除微弱地結合之雜質。將CTLA4A29YL104E －Ig使用50 mM HEPES,0.55M硫酸銨,pH 7.0緩衝劑自HIC管柱溶離。將此HIC產物匯集物在2°至8℃下保持在收集容器中。於收集容器中之最高保持時間為3天。
CTLA4A29YL104E －Ig二聚體產物具有莫耳唾液酸對莫耳CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質之莫耳比為約6或約5.2至約7.6；CTLA4A29YL104E －Ig高分子量物質之匯集物係存在於＝2.5%下；CTLA4A29YL104E －Ig低分子量物質(例如CTLA4A29YL104E －Ig單體)之匯集物係存在於＝0.5%下；且MCP－1＝9.5毫微克/毫升之匯集物係存在。
病毒過濾. 得自HIC步驟之CTLA4A29YL104E －Ig產物匯集物之濃度與滲濾，係藉由超過濾(UF)達成。UF步驟係利用30－kDa NMWCO薄膜與25 mM NaH2 PO4 ,10 mM NaCl,pH 7.5緩衝劑。UF步驟係接著為病毒過濾步驟，使用15毫微米Planova薄膜(Asahi Kasei)。然後將CTLA4A29YL104E －Ig產物匯集物藉由UF，使用30－kDa NMWCO薄膜調整至25克/升之蛋白質濃度。
Pall Filtron TF F系統係使用於下游CTLA4A29YL104E －Ig生產方法之濃縮與滲濾步驟中。此步驟之目的係為使HIC層析步驟產物匯集物濃縮至45至55克/升，並將於HIC層析步驟中所使用之溶離緩衝劑用於CTLA4A29YL104E －Ig組合物之最後緩衝劑交換。將經濃縮之CTLA4A29YL104E －Ig產物匯集物經過0.2微米聚二氟亞乙烯濾器轉移，並置於50升生物處理袋中。
實例21：生物學活性－藉由表面電漿激元共振測定
CTLA4 A29YL104E －Ig對B－7IG共受體之生物專一性結合表面電漿激元共振(B7結合) 此方法係藉由表面電漿激元共振，度量CTLA4A29YL104E －Ig對代表性B7共受體之結合。使B7Ig在高密度下經由一級胺基固定至經活化CM5感測晶片之表面。將CTLA4A29YL104E －Ig物質、品質對照組及試樣稀釋至0.125與8毫微克/毫升間之濃度，並注射在B7Ig表面上，以產生結合感測圖。CTLA4A29YL104E －Ig結合至經固定化B7Ig之最初速率(斜率)係在質量傳遞(擴散)限制條件下，於此B7Ig表面上度量。以每秒共振單位(RU/s)表示之最初結合速率係直接地與活性濃度產生關聯。使用參考標準曲線，使試樣之結合速率轉化成活性濃度，其中係將CTLA4A29YL104E －Ig物質之結合速率對著濃度作圖。任一個最後結果係以相對於CTLA4A29YL104E －Ig物質之試樣之百分比結合表示。
人類IgG1 Fc區域之存在於CTLA4A29YL104E －Ig中，係使用表面電漿激元共振(SPR)偵測。SPR使得生物專一性交互作用能夠即時度量。對人類IgG之Fc區域專一之抗體片段(山羊F(ab')2 抗人類IgG Fc)，係以共價方式固定化於感測晶片之表面上。CTLA4A29YL104E －Ig試樣之結合係經由度量在此表面上所獲得之回應而偵測，與未修改之感測晶片表面作比較。關於方法B、方法C及共混合物，以所結合共振單位表示之結果係為可比較的，如圖5與表23 中所示。
人類細胞IL2抑制檢測 當以抗－CD3與B細胞刺激時，此方法係以藉由CTLA4A29YL104E －Ig抑制IL－2製自T細胞為基礎。將Jurkat T細胞，其係在IL－2啟動子之控制下以蟲螢光素酶基因轉染，於不同濃度之CTLA4A29YL104E －Ig存在下，以Daudi B細胞與抗－CD3共刺激。共刺激係使IL－2啟動子活化，其依次會產生蟲螢光素酶蛋白質。所形成之發光信號係使用蟲螢光素酶檢測系統度量。在此系統中，CTLA4A29YL104E －Ig會產生蟲螢光素酶活性上之劑量依賴性降低。
關於方法B批料000929－278、方法C批料224818－2004－007及共混合物批料55128－162之結果係為可比較，如表24中所示。對於所有三種試樣而言，EC50 值、斜率因數及上方與下方漸近線係為類似，在一個標準偏差內。這顯示得自方法C與方法B之CTLA4A29YL104E －Ig在活體外功效檢測中可相當地表現。
物料：－感測晶片CM5，檢定合格等級Biacore(目錄編號BR－1000－13)－HBS－EP緩衝劑BIA檢定合格10 mM HEPES,pH 7.4,150 mM NaCl,3.4 mM EDTA,0.005% v/v－界面活性劑P20 Biacore(目錄編號BR－1001－88)－胺偶合套件BIA檢定合格115毫克N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)，750毫克1－乙基－3－(3二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)，10.5毫升乙醇胺HCl Biacore(目錄編號BR－1000－50)－具有PC可相容電腦Biacore之Biacore C儀器(目錄編號BR－1100－51)－Biacore C控制軟體Biacore，譬如備有Biacore C儀器，1.0.1版
胺偶合套件BIA檢定合格：套件含有一個小玻瓶，每一個：115毫克NHS、750毫克EDC及10.5毫升乙醇胺。根據製造者說明書製備各小玻瓶。將200微升體積之NHS與EDC溶液分成數液份至具有適當大小與蓋子之個別塑膠/小玻瓶中。當儲存在－20℃下時，此等溶液係安定達2個月。將200微升乙醇胺分成數液份至具有適當大小與蓋子之塑膠/小玻瓶中。根據製造者說明書，將此溶液儲存在2－8℃下，且為安定的。為確保良好結合至流動細胞，將使用流動細胞一週或286次注射，無論那一個首先來到。新流動細胞將在各週開始時被固定化。B7.1 Ig在關於試樣測試之製備中之固定化作用. 註 ：將200微升所有溶液分成數液份至7毫米Biacore管件中，以供分析。 於環境溫度下，將含有B7.1 Ig之一個小玻瓶解凍。使用10 mM醋酸鹽pH 5.0緩衝劑(1.7)稀釋B7.1 Ig，以達成表面質量在3000－9000共振單位(RU)之間。將一個小玻瓶(200微升)，各為EDC與NHS，解凍至環境溫度。將乙醇胺HCl自冷藏室移除，並允許溫熱至室溫。從Biacore軟體：打開所發表之計劃"B7 Ig固定化作用 "，選自"固定化作用能手(Wizard) "。開啟所發表之檔案"B7 Immob.blw"。經過能手(wizard)，並藉由點選"下一步"確認或改變選擇。於"使用者資訊"下選擇流動細胞，並提供實驗資訊於"筆記本"標籤中。將試劑與配位體小玻瓶按所概述放置在試樣掛架中。調閱說明書。將樣板檔案儲存為：B7 Immob BIOQC# Date Initials Chip# Flow cell#.blw。藉由點選"開始"以開始固定化作用。將結果檔案儲存為：B7 Immob BIOQC# Date Initial Chip# Flow cell#.blr。當檢測完成時，列印能手(Wizard)結果與感測圖。
實例22：CTLA4 A29YL104E －Ig組合物之碳水化合物含量分析、胰蛋白酶肽定圖譜及IEF
胰蛋白酶消化肽定圖譜 於此胰蛋白酶消化方法中，係將CTLA4A29YL104E －Ig試樣使用胍－HCl變性，並使用DTT與IAA還原及烷基化。將試樣使用NAP－5管柱脫鹽，並以胰蛋白酶消化。將消化混合物藉逆相(C18)層析分離，並經由在215毫微米下之UV吸光率偵測吸收峰。
試劑 ：流動相A溶液(在水中之0.02%三氟醋酸(TFA)(v/v))；流動相B溶液(在95% ACN(乙腈)與5%水中之0.02% TFA(v/v))；烷基化劑(200 mM碘乙醯胺(IAA))；稀緩衝液(100 mM Tris,25 mM NaCl,pH 8.0)；變性緩衝劑(8M胍,50 mM TRIS,pH 8.0)；消化緩衝劑(50 mM TRIS,10 mM CaCl2 ,pH 8.0)；還原劑(100 mM DTT)。
儀器配置 ：(可使用相等儀器配置)NAP－5管柱(Amersham，目錄# 17－0853－02)；HPLC管柱加熱器；具有管柱加熱器與UV偵測器之Water's Alliance HPLC系統。
程序之概論
還原作用與烷基化作用 ：將試樣(例如CTLA4A29YL104E －Ig等)經由添加水至最後體積為100微升(1毫克)，被稀釋至10毫克/毫升。將560微升變性緩衝劑與35微升還原劑(100 mM DTT)添加至100微升試樣中，混合，並在微離心機中旋轉而下歷經3秒。然後將試樣在50℃下培養20分鐘±2分鐘。接著，將35微升烷基化劑(200 mM IAA)添加至各試樣中，並再一次混合，且在微離心機中旋轉而下歷經3秒。然後，將試樣以鋁箔覆蓋，並在50℃下培養20分鐘＋2分鐘。在使NAP－5管柱經由傾倒3管柱體積(約7－8毫升)之消化緩衝劑而達成平衡後，將500微升經還原與烷基化之混合物傾倒於NAP－5管柱上，允許液體經過管柱排乾。接著經由以1毫升消化緩衝劑，使試樣溶離出管柱，自NAP－5管柱收集試樣。
消化 ：將試樣以20微升胰蛋白酶(0.5微克/微升)，在38℃水浴中消化4小時(±0.5小時)。於完成消化後，使試樣以2.5微升TFA酸化。然後，將試樣放置在自動取樣器小玻瓶中，以供隨後分析。
儀器方法 ：儀器方法係示於下文：
於第一次注射之前，使管柱以100%流動相A緩衝劑達成平衡，歷經25分鐘。UV吸光率係在215毫微米下監控，同時將柱溫保持在37℃下，及自動取樣器溫度在4℃下。於第一個系統適合性標準物之前，操作流動相A緩衝劑空白試驗，接著為各試樣之單次50微升注射。參考物質注射應每六次試樣注射一起進行。
理論板數 ：以理論板數評估之管柱效率，可使用滯留時間與峰寬，根據以下方程式定量地度量： 其中："w"為在基線下，經由將相對較直側面外推至基線所度量之峰寬，"t"為自注射時間至峰頂溶離時間所度量吸收峰之滯留時間。
若N<50000，則使管柱再達成平衡。
解析度 ：測定2個吸收峰間之解析度(R)，例如圖30中所顯示之吸收峰T2與吸收峰T12，可使用下列方程式測定： 其中：t1,t2＝個別為片段吸收峰T2與吸收峰T12之滯留時間w1,w2＝個別為具有滯留時間t1與t2之吸收峰於基線下之切線界定之峰寬
若R<1.5，則應使管柱再達成平衡，而若問題持續，則應將管柱置換。
圖30 與表25 係顯示得自CTLA4A29YL104E －Ig之胰蛋白酶消化之肽片段。顯示在~50分鐘下之肽T7與T9之區域有時係反映不完整試樣消化，且吸收峰可能逐日顯示不同品質；但是，所有試樣在一次操作內顯示可比較性。
等電焦聚 使用等電焦聚(IEF)以評估在藥物物質與藥物產物兩者中之CTLA4A29YL104E －Ig之各種異構重組物之等電點(pI)。此方法係使用在4.0－6.5之pH梯度下之Pharmacia Biotech AmpholinePAGplates與Multiphore II平坦床電泳系統。將試樣(例如CTLA4A29YL104E －Ig等)稀釋於Milli－Q水中，並使用點樣施加片條直接裝填至凝膠上。將凝膠在漸增電壓下，使用100 mM β－丙胺酸浸泡之陰極片條與100 mM麩胺酸/500 mM磷酸浸泡之陽極片條聚焦2.5小時。於聚焦後，將凝膠使用磺酸基柳酸/三氯醋酸固定，然後使用柯麥西(Coomassie)藍色染色系統染色。於染色後，將濕凝膠使用雷射為基礎之光密度計，在50或100微米空間解析度下，以至高4096階層之光密度解析度，掃描至數值影像檔案中。CTLA4A29YL104E －Ig係聚焦至10至15個範圍為4.5至5.5 pI之譜帶中。
對於方法C批料224818－2004－007、方法B批料000929－287及共混合物批料55128－162，原本CTLA4A29YL104E －Ig於凝膠(pH 4.0－6.5)上之等電焦聚，係在4.6－5.5之pI範圍內，產生類似帶狀圖樣。此程序顯示當在相同IEF凝膠上分析時，方法B及C物質為可比較。
等電焦聚標準物應容易地與背景區別(參閱圖10)。
CTLA4A29YL104E －Ig係經確認為多重譜帶(>10)，其具有範圍為約4.5至約5.5之pI(圖30)。
CTLA4A29YL104E －Ig為第二世代CTLA4－Ig融合糖蛋白，其包含細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA4)之經修改配位體結合功能部位與人類IgG1重鏈之恒定區域。此新穎分子具有作為免疫壓抑劑之治療應用。CTLA4A29YL104E －Ig含有多重電荷異構重組物，其可藉由等電焦聚(IEF)解析。關於分析CTLA4A29YL104E －Ig藥物物質與藥物產物之IEF方法已被發展出。此方法係在AmpholinePAG板pH 4.0－6.5 Multiphore II平坦床電泳系統中，用以檢驗CTLA4A29YL104E －Ig。將CTLA4A29YL104E －Ig藥物物質、藥物產物及參考物質稀釋於Milli－Q水中，並直接裝填至凝膠上。將凝膠在漸增電壓下，使用100 mM β－丙胺酸浸泡之陰極片條與100 mM麩胺酸/500 mM磷酸浸泡之陽極片條聚焦2.5小時。於聚焦後，將凝膠固定，並以以柯麥西(Coomassie)藍色染色。將經染色之凝膠藉由雷射光密度度量法掃描，而凝膠譜帶之半定量分析係在數值影像檔案上進行。
物料：Ampholine PAG板凝膠pH 4.0－6.5 GE保健(目錄編號80－1124－81)IEF電極片條6 x 280毫米 GE保健(目錄編號80－1004－40)試樣施加片塊 GE保健(目錄編號80－1129－46)
設備：Multiphor II電泳系統 GE保健(目錄編號18－1018－06)冷卻板125 x 260毫米 GE保健(目錄編號80－1106－54)電源 NOVEX(基本3540型)BioRad(PAC3000型)恒溫循環器 VWR(13271－074/1160S 1160A型)軌道振盪器 IKA(KS250/260型)個人用光密度計SI GE保健(375型)ImageQuantTL軟體 GE保健
試劑製備：陽極緩衝溶液(100毫升)：0.5M磷酸中之0.1M麩胺酸；3.4毫升85%磷酸；1.47±0.02克麩胺酸；Milli－Q水。將麩胺酸添加至50毫升Milli－Q水中。添加85%磷酸，並足量至100毫升，攪拌以混合。指定6個月之失效期，並儲存於4℃下。
陰極緩衝溶液(100毫升)：0.1M β－丙胺酸，0.9±0.02克β－丙胺酸，Milli－Q水。以Milli－Q水使試劑足量至100毫升。攪拌以混合。指定6個月之失效期，並儲存於4℃下。
固著溶液(2000毫升)：12%三氯醋酸中之3.5% 5－磺酸基柳酸，240±5.0克三氯醋酸，70±2.0克5－磺酸基柳酸，Milli－Q水。合併試劑，並以Milli－Q水足量至2000毫升。指定3個月之失效期，並儲存在室溫下。
裝置與凝膠製備. 將Multiphore II電泳單位冷卻平台連接至多溫度恒溫循環器，並將溫度設定為10℃。允許循環器達到10±2℃。將凝膠自冷藏室移除。使用剪刀，小心地沿著封套之全部四個側面切割，確定不會切至凝膠/凝膠載體中。將大約1.0毫升Milli－Q水添加至冷卻平台之一個邊緣。將凝膠/凝膠載體之一個邊緣放置在水中，以致使水移動橫越凝膠之整個邊緣。小心地施加凝膠至整個冷卻平台，避免氣泡形成。將透明薄膜自凝膠之表面移除。將各電極片條以大約3.0毫升適當電極溶液(正下方表)浸泡。於距凝膠之頂部與底部邊緣大約10毫米處施加電極片條。將最接近(－)記號之陰極片條與最接近(＋)記號之陽極片條放置於冷卻平台上。於電極片條已被施加後，將片條切割以吻合凝膠，避免與凝膠載體接觸。
於陰極片條上方大約10毫米處施用試樣施加片塊。使用正上方表中所定義之電泳參數，將凝膠預聚焦直到電壓達到300V為止。
IEF pI標記物與染色對照組製備. 以100微升Milli－Q水重配IEF pI標記物。以1000微升Milli－Q水重配碳酸酐酶II染色對照組，以製造1.0毫克/毫升儲備溶液。將10微升儲備溶液(1.0毫克/毫升)添加至90微升Milli－Q水中，以得到0.10毫克/毫升之最後裝填濃度。
試樣製備. 將CTLA4A29YL104E －Ig參考物質與試樣稀釋至2毫克/毫升之濃度。實例：若CTLA4A29YL104E －Ig試樣具有25毫克/毫升之濃度，則使用下列稀釋液以製備2毫克/毫升之最後裝填濃度：10微升(來自25毫克/毫升中)＋115微升Milli－Q水＝2毫克/毫升
註 ：若試樣濃度≦2.0毫克/毫升，則裝填試樣無需稀釋。
凝膠裝填. 以操作圖樣為基礎裝填凝膠，以幫助試樣確認。不要對稱地裝填凝膠。裝填IEF pI標記物、染色對照組、CTLA4A29YL104E －Ig參考物質及CTLA4A29YL104E －Ig試樣，如正下方表中所概述。將所有試樣裝填至試樣施加片塊上。
凝膠處理. 將電極保持器放置在Multiphor II單元上，並將電極與凝膠上之電極片條中心對準。將得自電極保持器之兩個電極連接至基底單元，並將安全蓋放置在適當位置。使用黏膠帶，覆蓋安全蓋中之孔洞，以防止凝膠變乾。將電極連接至電源。在適當電壓、電流及電源下操作電泳。當電泳完成時，關閉電源，並移除安全覆蓋物與電極保持器。將電極片條與試樣施加片塊自凝膠小心地移除。將全部凝膠與凝膠載體自冷卻板移除，並放置在含有200毫升固著溶液之280 x 180 x 40毫米PyrexTM 培養皿中。以塑膠包覆物覆蓋培養皿，並在室溫下放置於軌道振盪器上，歷經最少20分鐘。
註 ：應將凝膠固定最高1小時。當固定完成時，將凝膠以大約200毫升Milli－Q水各洗滌3次，歷經5分鐘。經由將瓶子翻轉數次，混合GelCode藍色染色試劑溶液。重要的是，在分配之前混合染色試劑，以確保使用試劑之均勻試樣。將大約200毫升染色試劑添加至培養皿中。以塑膠包覆物覆蓋培養皿，並在室溫下放置於軌道振盪器上，歷經18至20小時，以達成最適宜譜帶發展。當染色完成時，經由將染色試劑以大約200毫升Milli－Q水置換而洗滌凝膠。於1－2小時期間內，進行最少3次水更換，以獲得最適宜結果。
凝膠掃描與分析. 使用正上方表中所界定之掃描參數掃描凝膠。凝膠之分析係在經掃描之影像檔案上進行。
從ImageQuantTL中之<1D凝膠分析 >開啟凝膠影像檔案(經掃描之原始數據)。至工具桿上之<對比 >，並降低<影像直方圖 >參數，直到所有譜帶清楚可見為止。選擇<通道建立 >，並選擇<手動 >以設立欲被分析之<通道數目 >。調整<通道%寬度 >至高達100%，以涵蓋凝膠通道。若必要則適當地排列單一通道。使用<滾球 >方法以減去背景。這對於IEF凝膠影像分析並不重要。使用表3中所列示之最初<最低斜率 >、<噪音降低 >及<%最高吸收峰 >設定以偵測譜帶。此等數值之調整係為正確地確認譜帶所必須。以手動方式修正任何漏失之譜帶與錯誤確認之譜帶。對於pH/pI 4.0－6.5凝膠，利用得自系統適合性段落中所列示之經標識標記物之標準物pI標記物，計算譜帶pI值。不要進行校準與正規化步驟。將被包含在度量值視窗內之數據輸出至Excel工作表中，供進一步計算與報告。將Excel數據輸入經確認有效之試算表中，以進行用於報告結果之定量分析。
系統適合性. 等電焦聚標準物(pI標記物)必須易於與背景區別，且藉由經掃描凝膠影像之目視檢查，顯示有限之失真(關於所列示之pI標記物，可參閱正下方表)。
CTLA4A29YL104E －Ig參考物質與試驗物件之形成帶狀圖樣，應藉由掃描凝膠影像之目視檢查顯示有限之失真。碳酸酐酶II(pI 5.4)在低含量之蛋白質負載(1.0微克)下之染色對照組，係用以証實一致凝膠染色。譜帶必須容易地藉由掃描凝膠影像之目視檢查而與背景區別。CTLA4A29YL104E －Ig參考物質必須在4.5至5.6之pI範圍內，含有8至15個具有譜帶強度≧1.0%之譜帶。CTLA4A29YL104E －Ig參考物質譜帶在4.5至5.6之pI範圍內，必須具有≧95%之累積百分比強度。
數據計算. 利用下列方程式，以計算CTLA4A29YL104E －Ig試樣相對於參考物質之累積百分比強度： 實例：若試樣具有95%之%譜帶強度(pI 4.5－5.6)，且參考物質具有100%之%譜帶強度(pI 4.5－5.6)，則累積%強度將為95%。
於一項具體實施例中，CTLA4A29YL104E －Ig物質將在4.5－5.6之pI範圍內具有具相對譜帶強度>1.0%之譜帶。CTLA4A29YL104E －Ig物質在4.5－5.6之pI範圍內，具有相對於CTLA4A29YL104E －Ig參考物質之累積百分比強度。
實例23：細胞系之轉移感染與產生
於電擊穿孔之前，使表現載體pD16LEA29Y以BstBI 酵素線性化，以產生可相容之4 bp懸垂物。經線性化之載體與經剪切之鯡精蟲載體DNA(作為載體)係與乙醇共沉澱，並以無菌方式再懸浮於PF CHO培養基(JRH生物科技)中，供電擊穿孔至DG44細胞中。
於電擊穿孔之後，將細胞在非選擇性培養基中回收。然後將細胞在含有500毫微克/毫升瑞肯布林(recombulin)(Gibco)、4 mM L－麩醯胺(Gibco)及胺甲喋呤(ICN)之PFCHO之選擇性培養基中，接種至96井板內。
自此覆蓋物選擇會產生CTLA4A29YL104E －Ig之細胞系，供表現放大，使用被添加至培養基之胺甲喋呤(MTX)濃度之下列進展：
將全部CTLA4A29YL1o4E －Ig表現質粒整合至細胞基因組中。
生產細胞系選擇 於最良好進行之經放大主井細胞系之兩次限制稀釋無性繁殖後，將最後生產細胞系GF1.1.9單離。細胞系GF1.1.9之選擇係以生長圖樣、滴定度及含有減量之高分子量成份與相對於製自其他無性繁殖系物質之較高唾液酸含量之產物為基礎。
實例24：CTLA4 A29YL104E －Ig之基因特徵鑒定
基因組安定性研究 自衍生細胞儲存體之細胞所單離之DNA與RNA係使用於Southern與Northern雜化作用分析，及供CTLA4A29YL104E －Ig編碼順序用之DNA之定序。將此等結果與自CTLA4A29YL104E －Ig所獲得之結果作比較。
關於Northern雜化作用分析與cDNA定序評估之結果，係於下文提出。
Northern雜化作用分析 將以得自細胞儲存體之細胞所接種之培養物擴大，且用以單離RNA，以供Northern雜化作用分析。所製備之培養物表示細胞大約27世代超過CTLA4A29YL104E －Ig生產方法中所使用之活體外細胞年齡。將總RNA從衍生自CTLA4A29YL104E －Ig細胞儲存體之細胞，與得自經擴大CTLA4A29YL104E －Ig細胞之細胞萃取。一種利用得自母體CHO細胞系之總RNA之對照組，亦被使用於此等實驗中。使大約5微克總RNA於變性條件下接受瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠中之RNA沾吸至尼龍薄膜上，並以含有CTLA4A29YL104E －Ig基因之32 P－標識之1.2 kbHindIII/Xba I DNA片段雜化。將用於探測物之1.2kbHindIII/Xba I DNA片段自質粒pD16LEA29Y單離。
經雜化成CTLA4A29YL104E －Ig基因探測物之大約1千7百個鹼基之mRNA物種，係於得自細胞儲存體之總RNA試樣中檢出，如圖31 中所示。圖31 中所示之面板A與面板B係個別表示溴化乙錠染色之瓊脂糖凝膠與其相應之放射自顯影譜。
此等結果顯示只有一個使CTLA4A29YL104E －Ig編碼之轉錄本，於衍生自CTLA4A29YL104E －Ig經擴大之細胞儲存體之培養物中表現。此外，當與使用細胞儲存體所獲得之結果比較時，在此等試樣中沒有發現CTLA4A29YLl04E －Ig mRNA轉錄本中之可測得之變化。
實例25：尺寸排阻層析
尺寸排阻方法已被發展，使用裝有防護管柱之7.8毫米x 300毫米TosoHaas TSK－3000 SWXL管柱，且在280毫微米下偵測，以分析CTLA4A29YL104E －Ig組合物。CTLA4A29YL104E －Ig係被評估產物均一性，包括單體(單鏈)、二聚體或高分子量物種(例如四聚體)。此方法顯示在~10毫克/毫升之額定濃度下之良好精密度(<2%)，且為線性，從~0.5至15毫克/毫升(r2 ＝0.999)。DL(偵測極限)為~2.26微克/毫升，而QL(定量極限)為~7.53微克/毫升。此等可溶性CTLA4－Ig分子係為包含細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA4)之配位體結合功能部位與人類IgG1重鏈之恒定區域之融合蛋白質，具有作為免疫壓抑劑之潛在治療應用。此等化合物係經過結合至各種抗原呈現細胞(APC)表面上之B7抗原(CD80與CD86)而施加其生理作用，因此阻斷B7.1與B7.2及T－細胞表面上之CD28之功能性交互作用。因此，此阻抑會造成抑制T－細胞活化作用，因此是免疫回應。雖然LEA29Y僅在兩個胺基酸殘基Leu104 －glu與Ala29 －Try上，與CTLA4Ig不同，但此等分子針對B7.1與B7.2抗原具有顯著不同抗體親抗原性。對於B7.2(CD86)之人類形式，LEA29Y顯示5至10倍較大抗體親抗原性，而對於人類B7.1(CD80)顯示類似抗體親抗原性，與母體CTLA4Ig作比較。
使用裝有防護管柱之TSK－3000 SWXL管柱(7.8毫米x 300毫米)且在280毫微米下偵測之尺寸排阻層析，係針對均一性用以分析CTLA4A29YL104E －Ig藥物。CTLA4A29YL104E －Ig二聚體、高分子量(HMW)及低分子量(LMW)物種係經區別。
尺寸排阻層析(SEC)係針對產物均一性用以評估CTLA4A29YL104E －Ig。圖34A－C 係顯示關於方法B、方法C及共混合物批料之CTLA4A29YL104E －Ig之SEC層析圖。CTLA4A29YL104E －Ig之SEC顯示方法C物質為99.8面積百分比二聚體，0.2面積百分比HMW物種，而沒有可測得之LMW物種。此等結果與方法B物質(二聚體97.4面積百分比，HMW 2.6面積百分比，且LMW<DL)為可比較。
試劑：4N KOH(100毫升)；系統適合性標準物(溶於HPLC級水中之分子量標記物)；流動相操作緩衝劑(0.2M KH2 PO4 ,0.9% NaCl,pH 6.8)；4N NaOH；稀緩衝液(25 mM NaH2 PO4 －H2 O,10 mM NaCl,pH 7.5)
儀器配置與條件 －相等儀器配置可經取代：泵類型 Waters 600型管柱 Toso Haas 5微米TSK 3000 SWXL，300毫米x 7.8米內徑Hewlett Packard(目錄編號79912S3－597)，裝有5微米TSK 3000 SWXL，40毫米x 6.0毫米內徑防護管柱，Hewlett Packard(目錄編號79912S3－527)偵測器 Waters 486型，允許15分鐘溫熱波長 280毫微米流率 1毫升/分鐘積分系統 VG Multichrom注入系統 Waters 717型Plus自動取樣器，裝有冷凍至4℃注射體積 20毫升檢測標的濃度 10毫克/毫升流動相 0.2M KH2 PO4 ,0.9%NaCl,pH 6.8，具有KOH檢測操作時間 20分鐘柱溫 環境滯留時間 CTLA4A29YL104E －Ig~8.5分鐘±0.5分鐘，高分子量物種，在~7.5分鐘±0.5分鐘下
標準物與試樣(10毫克/毫升)係在經標識之自動取樣器小玻瓶中製成50毫升體積。重複製備試樣。
計算解析度(R)測定與滯留時間評估 ：注射20毫升系統適合性標準物，以計算得自使用此種標準物所產生層析圖之2個吸收峰間之解析度(例如，一個吸收峰，吸收峰1，具有滯留時間~8.5分鐘，而第二個吸收峰，吸收峰2，具有滯留時間~10分鐘)，使用下列方程式： 其中：t1 ＝吸收峰1之滯留時間t2 ＝吸收峰2之滯留時間W1 ＝吸收峰1之峰寬W2 ＝吸收峰2之峰寬
峰寬係等於將吸收峰之相對較直側面外推至基線後，在吸收峰之底部下之寬度(以分鐘表示)。滯留時間與峰寬係以相同單位度量。
R必須≧1.3，且吸收峰之滯留時間應為~8.5±0.5分鐘。若未符合上文標準，則採取校正措施，並並再測試系統適合性標準物。
理論板數測定 ：從系統適合性標準物層析圖，管柱之效率可根據下列方程式，藉由計算理論板數測定： 其中：(t)＝為吸收峰2之滯留時間(以分鐘表示)(w)＝為在吸收峰2之基線下之寬度(以分鐘表示)，經由將吸收峰之側面外推至基線所獲得，如在圖1中所見及。
N應≧2500。
吸收峰之積分 ：將在層析圖中之吸收峰面積積分(例如圖34A－C)。CTLA4A29YL104E －Ig二聚體吸收峰係在~8.5分鐘下，而高分子量物種吸收峰係在~7.4分鐘下。
面積百分比可根據下式計算而得：面積%單體100－(面積%高分子量物種＋面積%低分子量物種) 其中：A＝CTLA4A29YL104E －Ig二聚體吸收峰面積B＝具有滯留時間小於CTLA4A29YL104E －Ig二聚體之所有吸收峰之總面積C＝具有滯留時間大於CTLA4A29YL104E －Ig二聚體吸收峰之所有吸收峰之總面積(排除夾雜體積)
測定總面積計數(排除夾雜體積)之%RSD。總面積計數之%RSD必須為2%或較小。若面積為<2707面積計數，則以≦DL(偵測極限)(~2.26微克/毫升)報告結果。若面積計數在2707－9014之間，則以≦QL(定量極限)(~7.53微克/毫升)報告結果。若面積計數為≧9014，則報告結果至最接近一百分比之十分之一。
實例26：SDS－PAGE與二硫鍵
十二基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 關於分析CTLA4A29YL104E －Ig之十二基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS－PAGE)程序，係作為純度試驗使用。試樣係於二硫基蘇糖醇(DTT)存在(經還原)或不存在(未經還原)下，在Tris－HCl(pH 6.8)、SDS、蔗糖及溴酚藍試樣緩衝劑中製備。將試樣放置在80℃水浴中，歷經兩分鐘，並在預鑄膜梯度液(4－20%)聚丙烯醯胺SDS凝膠中，使用Tris－甘胺酸SDS操作緩衝劑進行電泳。於電泳後，將凝膠固定，並使用柯麥西(Coomassie)藍色或銀染色系統染色。發現未經還原之CTLA4A29YL104E －Ig為具有明顯約略分子量~104 kD之一個大譜帶。發現CTLA4A29YL104E －Ig為具有明顯約略分子量~53 kD之一個主要譜帶。
使方法B批料000929－278、方法C批料224818－2004－007及共混合物批料551218－162之試樣，使用4－20%梯度液SDS－PAGE凝膠，於還原與非還原兩者條件下以電泳方式解析。將凝膠以無論是柯麥西(Coomassie)或銀染色個別地染色，如圖33 與圖34 中所示。未經還原之CTLA4A29YL104E －Ig之SDS－PAGE在代表完整單體之大約104 kDa下顯示主要譜帶。三個較小譜帶，其不容易於電子複製上觀察到，亦在~200、65及53 kDa下被發現。CTLA4A29YL104E －Ig之經還原試樣在代表單鏈形式之53 kDa下顯示主要譜帶，並在~150 kDa下顯示較小譜帶。此比較顯示當在相同凝膠上分析時，三種經測試之物質為可比較。
二硫鍵 對於方法C藥物，將二硫鍵使用批料224818－2004－007進行特徵鑒定。CTLA4A29YL104E －Ig之各鏈含有九個半胱胺酸。其係為Cys21、Cys48、Cys66、Cys92、Cys120、Cys171、Cys231、Cys277及Cys335。以經還原與未經還原之CTLA4A29YL104E －Ig兩者之線上LC/MS/MS之肽定圖譜，係用以確認CTLA4A29YL104E －Ig中之分子內與分子間二硫化物鏈結之位置。得自未經還原CTLA4A29YL104E －Ig之肽定圖譜之肽清單，伴隨著所預期與所發現之MW係示於表27中。
某些吸收峰於未經還原肽圖譜中之消失，與新吸收峰於經還原肽圖譜中之出現，係提供三種二硫化物連結肽之証據：T2－T6、T11－T17及T25－T30，其係相應於Cys21－Cys92、Cys171－Cys231及Cys277－Cys335之二硫鍵。肽T5與T7具有相對較高分子量，且含有N－連結之碳水化合物，其造成難以確定二硫化物鏈結之位置。為產生較短與不含碳水化合物之肽，將CTLA4A29YL104E －Ig以胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶原之混合物消化。由於另外胰凝乳蛋白酶原分裂所造成之結果，故T7從35－胺基酸肽縮短成15－胺基酸肽，稱為T7'－T7'，其中N－連結之碳水化合物被移除。二硫化物連結之肽T7'－T7'出現在未經還原之圖譜中(參閱圖37 )。於T7'－T7'上之MS/MS係確認其在Cys120－Cys120下之順序與鏈間二硫化物鏈結。
表27. 於非還原條件下得自CTLA4 A29YL104E －Ig之胰蛋白酶消化之二硫化物連結肽之肽順序與MW
以胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶原之混合物處理，亦會造成形成片段，其係相應於CTLA4A29YL104E －Ig藉由單獨胰蛋白酶之水解作用時所發現之其他二硫化物連結肽之較短變型。此等係示於表28 中。
CTLA4A29YL104E －Ig以胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶原混合物之消化，係確立T7－T7中之二硫化物配對，並以藉由單獨胰蛋白酶之消化確認所觀察到之二硫鍵。但是，此酵素混合物對肽T5並未具有任何作用，該肽亦為糖肽。為自T5移除N－連結之碳水化合物，將CTLA4A29YL104E －Ig以胰蛋白酶與彈性蛋白酶之混合物消化，如圖36 中所示。此酵素之混合物係在四個不同位置上水解T5，產生稱為(T5'－T5")之較短肽，如表29 中所示。此所產生之肽具有1259 Da之預期質量，且含有相應於Cys46－Cys66之二硫化物鏈結。得自未經還原CTLA4A29YL104E －Ig藉由胰蛋白酶與彈性蛋白酶混合物之水解作用之肽圖譜分佈形態，係示於圖36 中，且肽T5'－T5"之順序係在表29 中。
此等結果顯示CTLA4A29YL104E －Ig在位置Cys21－Cys92(T2－T6)、Cys48－Cys66(相應於一個單一肽T5)、Cys171－Cys231(T11－T17)及Cys277－Cys335(T25－T30)上具有四個分子內二硫化物鏈結，且在位置Cys120－Cys120(T7－T7)上具有一個鏈間二硫化物鏈結。此數據係說明所有十八個半胱胺酸殘基。沒有發現任何錯誤配對。
實例27：CTLA4 A29YL104E －Ig調配物
注射用之CTLA4A29YL104E －Ig，100毫克/小玻瓶，係為無菌非熱原親液物。藥物產物之組合物係示於表30中。白色至灰白色，整個或片段餅狀物係被提供於以灰色丁基塞子塞住，並以鋁密封物密封之類型I小玻瓶中。此產物包含10%滿溢，以供小玻瓶、針頭及注射器滯留。
於投藥之前，將注射用之CTLA4A29YL104E －Ig，100毫克/小玻瓶，以4.2毫升注射用無菌水USP構成，而產生25毫克/毫升之濃度。其可以5%右旋糖注射液USP或0.9%氯化鈉注射液USP進一步稀釋至低達1毫克/毫升之濃度。經構成與稀釋之溶液在目視檢查時為透明無色，且基本上不含微粒子物質。
欲被凍乾之冷凍溶液之玻璃轉移溫度係被測定為－28.9℃。凍乾研究係在各種貯架溫度下進行，以測定在初期乾燥期間可容許之最高可能貯架溫度，而不會危害到產物品質。以此等研究為基礎，－20℃之貯架溫度係經選擇，供CTLA4A29YL104E －Ig之冷凍乾燥期間之初期乾燥步驟。於冷凍乾燥循環結束時，將小玻瓶在減壓下以塞子塞住。
生產方法係涉及將含有供冷凍乾燥用(以適當賦形劑)之整體溶液之小玻瓶在冷凍乾燥器室中冷凍，接著為冷凍水在經控制溫度與壓力下之昇華作用。使該室中之溫度與壓力條件達最佳化，以具有有效昇華作用，而不會危害到產物品質。
溶液與各種產物接觸表面及包裝組件之相容性已經研究。已發現溶液與不銹鋼316L、聚矽氧管件、AcrodiscTM 、HT Tuffryn(聚碸)、Millipore PVDF(聚次乙烯基氟化物)濾器薄膜及經選擇之容器閉合系統為可相容。
將注射用之CTLA4A29YL104E －Ig，100毫克/小玻瓶，包裝在15 cc類型I燧石管件小玻瓶中，並以20毫米經Daikyo灰色丁基D－21－7－S/B2－TR氟樹脂塗覆之塞子塞住，且以20毫米鋁翻開式密封物密封。
關於注射用CTLA4A29YL104E －Ig小玻瓶之選擇，係以5.5毫升之裝滿體積為基準，以確保有效冷凍乾燥，而20毫米經Daikyo灰色丁基D－21－7－S/B2－TR氟樹脂塗覆塞子之選擇係以相容性數據為基準。
已進行廣泛用途時間相容性研究。注射用之CTLA4A29YL104E －Ig100毫克/毫升，當以注射用無菌水構成至25毫克/毫升時，可在15°－25℃(59°－77℉)之環境室溫與室內光線下儲存24小時。經構成之溶液，當以0.9%氯化鈉注射液(生理食鹽水/NS)或以5%右旋糖注射液(D5W)進一步稀釋至無論是1毫克/毫升或10毫克/毫升，並於無論是PVC或Intra Via非PVC袋中，在15°－25℃之環境室溫與室內光線下儲存時，未顯示功效之損失或高分子量物種之增加，歷經24小時期間。稀溶液在投藥之前必須經過0.2微米或1.2微米混合纖維素/醋酸酯濾器過濾。稀溶液與0.2微米及1.2微米混合纖維素/醋酸酯濾器為可相容。
產物與聚矽氧為不相容。其會與聚矽氧交互作用，以形成可見粒子。因此，應避免與經聚矽氧處理之表面譬如矽化注射器接觸。
實例28：CTLA4－IG生產方法
關於上游CTLA4－Ig生產方法之流程圖係示於下文。CTLA4－Ig係在大規模細胞培養物中，使用中國大頰鼠卵巢細胞系製成胞外蛋白質。生產方法係以細胞儲存體小玻瓶之解凍起始。將培養物在T－燒瓶中繁殖，接著為一系列轉子燒瓶培養物。將此等培養物轉移至140升接種生物反應器。然後將得自140升接種生物反應器之培養物轉移至1100升接種生物反應器，其係用以接種5000升製造生物反應器。製造生物反應器主要係以標的唾液酸(SA)對CTLA4－Ig蛋白質莫耳比為基準採集。將細胞培養物採集物使用微過濾(MF)與超過濾(UF)之組合澄清與濃縮。最後，調整經濃縮之不含細胞採集物質，以在下游處理之製備中達成所指定之pH與導電率。
培養基製備步驟之目的，係為以一致方式製造基底與進料培養基。兩種培養基調配物係被使用於CTLA4－Ig細胞培養物生產方法中。培養基127－G係用於接種物按比例放大，且在製造生物反應器中作為基底培養基使用。培養基117－E係作為製造生物反應器之進料培養基使用。
接種物擴大：細胞儲存體小玻瓶解凍，T－燒瓶及轉子燒瓶步驟CTLA4－Ig生產方法之接種物擴大步驟之目的，係為提供足夠細胞培養物生物物質，以接種140升接種生物反應器。CTLA4－Ig生產方法之接種物擴大階段，係以得自細胞儲存體之冷凍小玻瓶之解凍起始。然後將經解凍之細胞培養物在一系列繼代中，使用含有培養基127－G之T－燒瓶與轉子燒瓶擴大，以製造足夠細胞培養物生物物質，以接種140升接種生物反應器。6%之經証明二氧化碳設定點係經建立。足夠存活細胞在四天培養期內進行至250毫升轉子燒瓶之達成，係証實對解凍與培養物回收方法之適當控制。於T－燒瓶中之最後百分比存活力具有84%之警戒範圍。
接種物之後續擴大係涉及250毫升轉子燒瓶步驟(繼代2)與最後重複繼代步驟(繼代5)及繼代3、繼代4以及繼代6接種物擴大步驟。於250毫升轉子燒瓶(繼代2)接種物擴大步驟中，最初VCD為0.20 x 106 個細胞/毫升之標的。在接種物擴大過程中之其他步驟內，0.20 x 106 個細胞/毫升之最初VCD係為標的。關於轉子燒瓶擴大步驟之最後百分比存活力係經建立為≧91%。
CTLA4－Ig生產方法之140升與1100升接種生物反應器步驟之目的，係為提供足夠細胞培養物生物物質，以接種5000升製造生物反應器。接種生物反應器係代表CTLA4－Ig生產方法之接種物擴大中之最後兩個步驟。接種生物反應器係以批次模式操作。
將得自1100升接種生物反應器之細胞在0.15 x 106 個細胞/毫升之標的最初VCD下，以無菌方式轉移至5000升製造生物反應器中。5000升製造生物反應器係以餵入批次模式操作。將每日試樣自生物反應器取出，以監測細胞生長、培養物存活力、新陳代謝產物與CTLA4－Ig濃度及CTLA4－Ig蛋白質之SA含量。
關於最初存活細胞密度(VCD)與培養物存活力之範圍，係提供培養物在製造生物反應器中一致生長之條件。培養物最初VCD標的值為0.15 x 106 個細胞/毫升。培養物之存活力會在各製造生物反應器操作期間降低。由於細胞溶解，低培養物存活力可能會導致增加之雜質含量。
吸收峰存活細胞密度(PVCD)之達成係証實在製造生物反應器中之一致細胞生長。CTLA4－Ig滴定度會在整個製造生物反應器操作期間增加。
生物反應器採集步驟之目的，係為經過0.65微米MF，自含有CTLA4－Ig蛋白質之採集物質移除細胞。使不含細胞MF滲透物藉由30 kDa額定分子量截止值UF同時濃縮。關於採集作業步驟之流程圖已顯示。溫度、UF留存物流率、MF滲透物流率、UF TMP及MF延續時間係經控制。在採集作業中之最後步驟為採集物質之pH值與導電率調整，接著為0.2微米過濾。關於經調整之進行中採集物質之pH值與導電率係經建立，供在第一個下游層析步驟中有效捕獲CTLA4－Ig蛋白質。
實例29－純化方法－下游處理方法
縮寫：15N 15毫微米A 280 在280毫微米下之吸光率CTLA4－Ig 細胞毒性T－淋巴細胞抗原－4免疫球蛋白；CTLA－4 IgAPI 活性醫藥成份AU 吸光率單位B7 CTLA－4受體配位體cfu 菌落形成單位CHO 中國大頰鼠卵巢CHOP 中國大頰鼠卵巢宿主細胞蛋白質CQA 關鍵性品質屬性CV 管柱體積藥物充填 藥物濃度/滲濾及充填步驟ELISA 酵素連接免疫吸附檢測EU 內毒素單位Fc 抗體之恒定區域GalNAc N－乙醯基－半乳糖胺GlcNAc N－乙醯基－葡萄糖胺HEPES 4－(2－羥乙基)六氫吡－1－乙烷磺酸HIC 疏水性交互作用層析；苯基SepharoseTM 快速流動HMW 高分子量HPLC 高性能液相層析法IgG1 在種類G1中之免疫球蛋白IPC 進行中控制LAL Limulus阿米巴樣細胞溶胞產物MBR 母批料記錄MCP－1 單細胞向化性蛋白質1MTX 胺甲喋呤MW 分子量N/A 不適用NANA N－乙醯神經胺酸；唾液酸；SANMWC 額定分子量截止值OD 光密度PAR 証實可接受之範圍Planova 病毒移除濾器，孔隙大小15毫微米，由Asahi所製造PP 製程參數PQ 性能資格評定psi 每平方英吋之磅數psid 每平方英吋之磅數，示差psig 每平方英吋之磅數；表壓QFF Q SepharoseTM 快速流動QXL Q瓊脂糖極端負載rPA 重組蛋白質A瓊脂糖快速流動SA 唾液酸；N－乙醯神經胺酸；NANASDS－PAGE 十二基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳SOP 標準操作程序Tris 參(羥甲基)胺基甲烷Triton X－100 第三－辛基苯氧基聚乙氧基乙醇；聚乙二醇第三－辛基苯基醚UF 超過濾UV 紫外光v/v 每體積之體積VF 病毒過濾；毫微米過濾VI 病毒失活
CTLA4－Ig係為以基因方式設計之融合蛋白質，其係由人類細胞毒性T－淋巴細胞抗原－4之功能性結合功能部位與IgG1種類之人類單株免疫球蛋白之Fc功能部位所組成。CTLA4－Ig二聚體包含兩個大約46 kDa之同系糖基化多肽鏈，其各經過單一之二硫鍵以共價方式連結。關於CTLA4－Ig生產方法之下游步驟之流程圖已顯示。CTLA4－Ig係在5000升製造生物反應器中，使用中國大頰鼠卵巢(CHO)細胞系製成。於下游CTLA4－Ig生產方法中之層析與過濾步驟係在環境溫度下進行。將進行中物質在加工處理步驟之間，儲存於2至8℃下。下游處理係以自採集作業步驟收到進行中採集物質起始。首先將此物質經過陰離子交換層析管柱，使用Q SepharoseTM 極端負載(QXL)樹脂處理。QXL管柱之功能為自採集物質捕獲CTLA4－Ig蛋白質。QXL管柱捕獲步驟亦達成體積減少，供進一步下游處理。
使QXL產物匯集物利用苯基瓊脂糖快速流動樹脂通過疏水性交互作用層析(HIC)管柱。於此步驟期間，使CLTA4－Ig高分子量(HMW)物質與中國大頰鼠卵巢宿主細胞蛋白質(CHOP)結合至管柱。CLTA4－Ig二聚體蛋白質不會結合至HIC樹脂及通過管柱。於HIC步驟之後，進行使用TritonX－100清潔劑之病毒失活(VI)，以使可能之偶發病毒劑失活。下一步驟係利用重組蛋白質A瓊脂糖快速流動(rPA)樹脂親和力管柱。於此層析步驟中，CHOP與單細胞向化性蛋白質1(MCP－1)之含量被減低。rPA步驟係被定義為病毒清除步驟。於親和層析步驟之後，將CLTA4－Ig蛋白質使用30 kDa超過濾(UF)薄膜濃縮與滲析，並經過PlanovaTM 15毫微米濾器處理，以移除可能附加之作用劑。於完成病毒過濾(VF)步驟後，將CLTA4－Ig蛋白質於第二個陰離子交換管柱上，使用Q瓊脂糖快速流動(QFF)樹脂處理。QFF層析步驟會降低殘留重組蛋白質A與DNA含量。QFF步驟係被定義為病毒清除步驟。最後，將CLTA4－Ig蛋白質使用30 kDa UF薄膜對著25 mM磷酸鈉,50 mM NaCl,pH 7.5之溶液，進行濃縮與滲濾，然後將CLTA4－Ig藥物在最後充填步驟之前，經過0.2微米濾器過濾。
製程相關之雜質CHOP、MCP－1、殘留重組蛋白質A、DNA及Triton X－100係在CTLA4－Ig生產方法之特定下游處理步驟下被減少。具有作用範圍之PP係針對各雜質建立在主要進行中控制點下。產物匯集物CHOP與MCP－1係被確認為rPA層析步驟之PP。產物匯集物殘留重組蛋白質A配位體、DNA及Triton X－100係被確認為QFF層析步驟之PP。以胰島素之已知結構與層析滯留為基礎，HIC、rPA及QFF步驟應以交互作用之正交模式為基礎，提供胰島素之顯著清除。此外，具有5.8 kDa之分子量之胰島素應藉由採集與下游處理中之三個30 kDa濃縮/滲濾步驟清除。rPA步驟係提供胺甲喋呤(MTX)之>3.0 log10 清除率。此外，具有0.455 kDa之分子量之MTX應藉由採集與下游處理中之三個30 kDa濃縮/滲濾步驟清除。將胰島素與MTX以固定量添加至發酵媒質中，並在下游處理之前，於5000升發酵過程期間消耗，作為細胞新陳代謝之函數。胰島素與MTX係在下游處理中之多個點上度量。對於所完成之過去操作，在各點上之胰島素與MTX含量係低於定量之含量。
緩衝劑 ：緩衝劑製備之目的係為製造符合標準物、作用範圍及警戒範圍之下游處理緩衝劑。一致緩衝劑品質係為確保可再現性層析性能所必要。CTLA4－Ig方法CD－CHO1之下游步驟需要17種緩衝劑與溶液。緩衝劑與溶液係經製備，並在批料內用於特定處理步驟。與CTLA4－Ig進行中物質具有接觸之緩衝劑被認為是重要製程緩衝劑。產物接觸緩衝劑包括平衡、洗滌、溶離及產物匯集物調整緩衝劑。於清洗與消毒步驟中所使用之緩衝劑與溶液，及層析滑道中之紫外光(UV)偵測器之功能性測試具有寬廣規格範圍。關於此等緩衝劑之最高保持時間限制為三天，並衍生自緩衝劑容器保持研究9,10 ，且被緩衝劑安定性研究支持。產物－接觸緩衝劑亦已指定具有相應警戒範圍之PP。關於此等緩衝劑之PP與相應之警戒範圍係經提出。不會與CTLA4－Ig進行中物質接觸之緩衝劑與溶液已指定具有警戒或作用範圍之PP，且經提出。非產物－接觸緩衝劑與溶液並未測試內毒素，因其係為無論是消毒溶液或層析樹脂清洗緩衝劑或溶液，接著為管柱消毒步驟。
Q瓊脂糖極端負載陰離子交換層析步驟 陰離子交換層析係使用得自GE保健(以前為Amersham Biosciences)之QXL樹脂進行。QXL管柱之功能為捕獲得自進行中採集物質之CTLA4－Ig蛋白質。QXL捕獲步驟亦達成對於進一步下游處理之體積減少。管柱係經由以25 mM HEPES,100 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑達成平衡而製成。在管柱達成平衡之後，將採集物質裝填至管柱上，並在280毫微米下連續監測流出物之UV吸收。在裝填應用之後，將管柱以25 mM HEPES,120 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑洗滌。使CTLA4－Ig蛋白質以25 mM HEPES,850 mM NaCl,pH 7.0緩衝劑自管柱溶離。正下方表係顯示關於Q瓊脂糖極端負載層析步驟之製程參數。
採集保持時間係確保與所建立之警戒範圍之製程一致性。預過濾產物匯集物生物負載量PP係被個別指定中間警戒與作用範圍<10 cfu/毫升與<100 cfu/毫升。藉由作用範圍所定義之六個QXL PP為管柱高度、流率、洗滌緩衝劑導電率、溶離吸收峰末端光密度(OD)、步驟產率及裝填生物負載量。管柱高度範圍係經建立以提供足夠體積之樹脂，以自採集物質捕獲產物。關於此參數之作用範圍係建立自數據。流率係為確保層析步驟之一致性與性能之重要因素。關於QXL步驟係被定義為具有最高作用範圍之PP。洗滌緩衝劑導電率係經建立，以自QXL樹脂微弱地移除結合雜質。按比例降低範圍之研究係測定此參數為保持QXL步驟一致性之重要因素。溶離吸收峰末端OD係經界定，以使產物匯集物中之CTLA4－Ig HMW物質之含量降至最低。CTLA4－Ig HMW物質係於溶離吸收峰之末端溶離。步驟產率作用範圍係確保關於QXL步驟之製程一致性。關於流率、溶離吸收峰末端OD及步驟產率PP之作用範圍係經建立。裝填生物負載量係被指定為<1 cfu/毫升之作用範圍。QXL PP中有十二個係藉由警戒範圍所界定，如所提出者。
於下游處理中之緩衝劑pH值與導電率參數係被確認為具有警戒範圍之PP。將於製備時未符合pH值與導電率標準之緩衝劑排除，並拋棄此緩衝劑批號。對於QXL步驟，平衡緩衝液導電率與pH值、洗滌緩衝劑pH值及溶離緩衝劑導電率與pH值係被定義為具有警戒範圍之PP。管柱入口壓力係確保在結合與溶離層析步驟期間之一致性。QXL步驟係在35 psig之最高壓力範圍下進行。根據製造者之詳細說明，35 psig之壓力範圍係被採用，以防止QXL樹脂之壓縮。產物匯集物導電率係為具有警戒範圍之PP。產物匯集物導電率係被指定警戒範圍，以確保在QXL產物匯集物中之CTLA4－Ig HMW物質與CHOP有效地結合至後續HIC管柱。58.5至69.1 mS/公分之警戒範圍係經建立。產物匯集物滴定度、唾液酸(SA)N－乙醯神經胺酸(NANA)莫耳比、CTLA4－Ig HMW物質及CHOP係被指定警戒範圍，以確保製程一致性。產物匯集物滴定度與SA警戒範圍係經建立。
a 資訊係得自PAR最後報告：純化中之表1。
苯基瓊脂糖快速流動疏水性交互作用層析步驟 HIC步驟係使用得自GE保健之苯基瓊脂糖快速流動樹脂進行。HIC管柱係結合CTLA4－Ig HMW物質與CHOP，藉以降低其在CTLA4－Ig蛋白質液流中之濃度。HIC管柱係經由以25 mM HEPES,850 mM NaCl,pH 7.0緩衝劑達成平衡而製成。將得自QXL步驟之CTLA4－Ig產物匯集物施加至已達成平衡之管柱。在裝填施用之後，將25 mM HEPES,850 mM NaCl,pH 7.0緩衝劑施加至管柱。在流經與管柱溶出離份中，自管柱收集CTLA4－Ig。HIC管柱係以多次循環操作，以處理單一批料之CTLA4－Ig，依QXL產物匯集物中之CTLA4－Ig之總質量而定。將管柱在循環與批料之間清洗與消毒。
HIC裝填生物負載量PP係藉由警戒與作用範圍所界定。HIC裝填生物負載量PP係被個別指定<10 cfu/毫升與<100 cfu/毫升之中間警戒與作用範圍。藉由作用範圍所界定之五個HIC PP，係為管柱高度、流率、溶出末端OD、步驟產率及裝填持續時間。測定管柱高度，以提供足夠樹脂體積，以在每批料之任一個、兩個或三個循環中處理得自QXL管柱之溶離匯集物。關於此參數之作用範圍係建立自數據。流率係為確保層析步驟之一致性與性能之重要因素。關於HIC步驟係被定義為具有最高作用範圍之製程參數。溶出末端OD係經界定，以使產物匯集物中之CTLA4－Ig HMW物質之含量降至最低。CTLA4－Ig HMW物質係於產物吸收峰之末端溶離。處理步驟產率係確保關於HIC步驟之製程一致性。關於流率、溶出末端OD及步驟產率PP之作用範圍係經建立。關於裝填持續時間之作用範圍係確保製程一致性。關於≦5天之裝填持續時間PP之作用範圍係被產物容器保持時間研究與生物化學安定性研究所支持。九個HIC PP係藉由警戒範圍所界定，如所提出者。在下游處理之緩衝劑pH值與導電率參數係被確認為具有警戒範圍之PP。將於製備時未符合pH值與導電率標準之緩衝劑排除，並拋棄此緩衝劑批號。關於HIC步驟，達成平衡/溶出緩衝劑之導電率與pH值係被定義為具有警戒範圍之PP。
管柱入口壓力係確保在層析步驟期間之一致性。HIC步驟係在13 psig之最高壓力範圍下進行。根據製造者之詳細說明，13 psig之壓力範圍係被採用，以防止HIC樹脂之壓縮。產物匯集物滴定度與SA警戒範圍係確保製程一致性，並被建立在PAR報告12 中。產物匯集物DNA、CHOP及MCP－1係在此步驟下被指定警戒範圍，以幫助其在後續rPA步驟中移除之定量。
a 資訊係得自PAR最後報告：純化中之表2。
病毒失活步驟 ：在得自HIC步驟之產物匯集物中之可能偶發病毒劑之失活作用，係藉由添加20% Triton X－100達最後濃度為0.5%(v/v)而達成。將經清潔劑處理之溶液混合，並保持在22±3℃下一至四小時，然後進行至下一步驟。20% Triton X－100添加參數之上限為3.8%。參閱正下方表，其係說明關於病毒失活步驟之製程參數。
重組蛋白質A瓊脂糖快速流動親和力步驟. 親和層析係使用得自GE保健之經固定rPA樹脂進行。rPA層析步驟係藉由降低CHOP、MCP－1及可能偶發病毒劑之含量進一步純化CTLA4－Ig蛋白質。使親和層析管柱以25 mM Tris,250 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑達成平衡。於管柱之達成平衡後，將得自VI步驟之經Triton X－100處理之物質施加至親和層析管柱。首先將管柱以25 mM Tris,250 mM NaCl,0.5% Triton X－100,pH 8.0緩衝劑洗滌，接著以25 mM Tris,250 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑第二次洗滌。使CTLA4－Ig蛋白質以100 mM甘胺酸,pH 3.5緩衝劑自管柱溶離。將得自親和力管柱之產物匯集物之pH值以2M HEPES,pH 8.0緩衝劑調整至7.5±0.2。rPA層析步驟係被確認為病毒清除步驟。參閱正下方表，其係說明關於重組蛋白質A瓊脂糖快速流動層析步驟之製程參數。
關於rPA步驟之三個PP係藉由警戒與作用範圍兩者所界定，如所提出者。裝填持續時間係確保與PAR報告中所建立之警戒範圍之製程一致性。關於裝填持續時間之作用範圍係確保製程一致性。關於≦48小時之裝填持續時間PP之作用範圍係被產物容器保持時間研究與生物化學安定性研究所支持。範圍研究係確認溶離緩衝劑pH值為影響rPA產物匯集物中之CTLA4－Ig HMW物質含量之重要因素。關於溶離緩衝劑pH值之警戒範圍係經建立。關於溶離緩衝劑pH值之作用範圍係建立自按比例降低範圍研究。rPA裝填生物負載量PP係被個別指定<10 cfu/毫升與<100 cfu/毫升之中間警戒與作用範圍。
藉由作用範圍所界定之七個rPA PP為管柱入口壓力、流率、步驟產率、產物匯集物最初pH值、產物匯集物HMW、產物匯集物CHOP及產物匯集物MCP－1。根據製造者之詳細說明，≦13 psig之壓力範圍係被採用，以防止rPA樹脂之壓縮。流率係為確保層析步驟之一致性與性能之重要因素。關於rPA步驟係被定義為具有最高作用範圍之PP。關於步驟產率與產物匯集物最初pH值之作用範圍係確保對於rPA步驟之製程一致性。關於流率與產物匯集物最初pH值之作用範圍係經建立。CTLA4－Ig HMW物質在吸收峰溶離期間之可能形成，係需要關於此參數之≦2.5%之作用範圍之界定。66至108%之作用極限範圍係使用得自單一批號rPA樹脂之平均±3標準偏差數據建立。此範圍係與樹脂壽命研究中所發現之步驟產率一致。產物匯集物CHOP與MCP－1係被定義為具有標準之CQA，以確保此等製程相關雜質之控制。rPA PP中有十二個係藉由所提出之警戒範圍所界定。在下游處理中之緩衝劑pH值與導電率參數，係被確認為具有警戒範圍之PP。將於製備時未符合pH值與導電率標準之緩衝劑排除，並拋棄此緩衝劑批料。對於rPA步驟，達成平衡/洗滌2緩衝劑導電率與pH值、洗滌1緩衝劑導電率與pH值及溶離緩衝劑導電率係被定義為具有警戒範圍之PP。
濃縮/滲濾及病毒過濾步驟. 於自rPA管柱溶離後，使產物匯集物濃縮，以在CTLA4－Ig濃度之範圍內達成標的體積。然後使濃縮物接受以25 mM HEPES,100 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑滲濾，使用具有30 kDa額定分子量截止值(NMWC)薄膜之UF系統。在滲濾之後，使用濾器序列裝置以移除可能偶發之病毒粒子。濾器序列裝置包括0.2微米濾器、0.1微米濾器及15毫微米薄膜濾器(Planova 15N濾器)。於VF步驟中所使用之濾器(0.2微米、0.1微米及15毫微米)為單次使用濾器。關於後－UF CTLA4－Ig濃度與Planova分壓範圍之上限，係以經証實之病毒清除率為基準，使用此等條件增加。關於說明病毒過濾步驟之製程參數，可參閱下表。
a 資訊係得自PAR最後報告：純化中之表5。b 資訊係得自BD－2005－706.015 。
Q瓊脂糖快速流動陰離子交換層析步驟. 陰離子交換層析係使用得自GE保健之QFF樹脂進行。QFF陰離子交換層析步驟係移除殘留重組蛋白質A、宿主細胞DNA、Triton X－100及可能之偶發病毒劑。使用QFF層析步驟，以控制產物流之SA含量。使QFF管柱以25 mM HEPES,100 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑達成平衡。於管柱達成平衡後，將Planova濾液施加至QFF管柱。首先將管柱以25 mM HEPES,120 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑洗滌，接著以25 mM HEPES,130 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑第二次洗滌。使CTLA4－Ig蛋白質以25 mM HEPES,200 mM NaCl,pH 8.0緩衝劑自管柱溶離。
QFF裝填生物負載量PP係被個別指定<10 cfu/毫升與<100 cfu/毫升之中間警戒與作用範圍。藉由作用範圍所界定之十二個QFF PP係為流率、洗滌2緩衝劑導電率、溶離緩衝劑導電率、裝填持續時間、步驟產率，及QFF產物匯集物中之殘留蛋白質A、DNA、Triton X－100、SA、HMW、CHOP及MCP－1之含量。流率係為確保層析步驟之一致性與性能上考慮之因素。關於QFF步驟係被定義為具有PAR報告中所建立之最高作用範圍之製程參數。洗滌2與溶離緩衝劑之導電率值係為具有作用範圍之PP，因為其在測定步驟產率與產物品質上為重要之故。關於此等參數之作用範圍，係在按比例降低QFF範圍研究期間測得。關於裝填持續時間之作用範圍，係確保製程一致性。關於≦5天之裝填持續時間PP之作用範圍，係被產物容器保持時間研究與生物化學安定性研究所支持。步驟產率係確保關於QFF步驟之製程一致性。品質參數、產物匯集物SA、HMW、CHOP及MCP－1必須於最後層析步驟上緊密地加以控制。關於步驟產率與QFF產物匯集物中之SA、CHOP及MCP－1含量之作用範圍，係經建立。殘留蛋白質A、DNA及Triton X－100係被定義為具有標準物之CQA，以確保此等製程相關雜質之控制。在此實例中，關於產物匯集物HMW之作用範圍，係從≦2.5被修訂為≦2.0%。
在下游處理中之緩衝劑pH值與導電率參數係被確認為具有警戒範圍之PP。將於製備時未符合pH值與導電率標準之緩衝劑排除，並拋棄此緩衝劑批料。對於QFF步驟，平衡緩衝液導電率與pH值、洗滌1緩衝劑導電率與pH值、洗滌2緩衝劑pH值及溶離緩衝劑pH值係被定義為具有警戒範圍之PP。此等範圍係經建立。管柱入口壓力係確保在結合與溶離層析步驟期間之一致性。根據製造者之詳細說明，QFF步驟係在35 psig之最高壓力範圍下進行。參數洗滌1緩衝劑體積、洗滌2緩衝劑體積、產物匯集物滴定度及產物匯集物體積係被指定警戒範圍12 ，以確保製程一致性。
濃縮/滲濾及充填步驟. 使得自QFF陰離子交換層析步驟之產物匯集物濃縮，並使其接受以25 mM磷酸鈉,50 mMNaCl,pH 7.5緩衝劑滲濾，使用具有30 kDa NMWC薄膜UF系統。將經滲濾之濃縮物經過0.2微米濾器過濾至無菌容器中，並儲存於2至8℃下。可使藥物於－70℃下冷凍，若需要並儲存於－40℃下。參閱正下方表，其係說明關於藥物濃縮/滲濾及充填步驟之製程參數。
UF II產物匯集物生物負載量PP係被個別指定<10 cfu/毫升與<50 cfu/毫升之中間警戒與作用範圍。藉由關於濃縮/滲濾及充填步驟之作用範圍所界定之六個PP，係為滲濾體積、濾液導電率與pH值、步驟產率、裝填持續時間及方法產率，如所提出者。滲濾體積之下限係經建立，以確保在充填步驟前CTLA4－Ig蛋白質之完全緩衝劑交換成最後藥物緩衝劑。濾液導電率與濾液pH值係進一步確保一致藥物調配物。步驟產率係確保關於濃縮/滲濾及充填步驟之製程一致性。關於滲濾體積、濾液導電率與pH值及步驟產率之作用範圍係經建立。關於裝填持續時間之作用範圍，係確保製程一致性。≦5天之UF II裝填持續時間係被產物容器保持時間研究與生物化學安定性研究所支持。20至62%之製程產率作用範圍係被建議。兩個PP係藉由警戒範圍所界定，以確保步驟之製程一致性，如所提出者。
實例30：藥物最後充填步驟
於完成CTLA4－Ig之濃縮與滲濾II步驟後，將CTLA4－Ig藥物在種類100環境內，從300升生物處理袋充填至預滅菌之2升與10升Biotainer PC瓶中。
將各瓶子之外部以70%異丙醇溶液消毒。將各瓶蓋周圍之密封物移除，並在充填之前量瓶子重量。將計算值記錄在批料記錄中，以確保對2升瓶填充重量在500克至1950克之間，且對10升瓶在7500克至10200克之間。將藥物使用蠕動泵，經過單次使用0.45/0.2微米濾器與充填鐘形物分配至Biotainer瓶中。將瓶子加蓋，並將蓋子束緊至指定之轉矩設定。將各經充填瓶以膠帶密封，並在膠帶上簽名且註明日期。將各瓶以確認之資訊，以及充填日期、經充填瓶在此批號內之連續編號及操作者之字首簽名作標識。
於充填過程期間，係進行空氣與表面微生物監測及粒子計數。藥物試樣係在充填作業期間獲得。在充填第一瓶之前獲得一個試樣，供內毒素測試。供內毒素測試用之其他試樣係在充填過程之中間與結束時獲得。於充填過程期間獲得試樣，供藥物釋出測試。
實例31：致免疫性與藥物動力學研究
CTLA4－Ig為可溶性融合蛋白質，其包含人類細胞毒性T－淋巴細胞有關聯抗原4(CTLA－4)之胞外功能部位，經連結至人類免疫球蛋白(Ig)G1之經修改Fc(鉸鏈、CH2及CH3功能部位)部份。其係為新穎藥劑種類中第一個被許可用於治療風濕性關節炎(RA)，其會選擇性地調制供完全T－細胞活化作用所採用之CD80/CD86：CD28共刺激訊息。在RA中，一般假設未知抗原係經由主要組織相容性複合物呈現，並會使自反應性T細胞於共刺激訊息存在下活化。接著，經活化之T細胞係添補並活化下游免疫細胞，編製且使會導致發炎與關節破壞之細胞過程永久存在(Choy與Panayi(2001)N Engl J Med ,344 (12)：907－916)。
治療重組生物學劑，譬如CTLA4－Ig，可為致免疫，因此具有誘出抗體回應之潛力。抵抗生物劑之致免疫性理論上可影響安全性、功效及藥物動力學。生物學療法之抗體所媒介清除可能會造成藥物含量減少，而造成降低之功效。抗體回應亦可防止藥物結合至其藥理學標的，其亦會降低功效。其可能會導致需要劑量隨著時間逐步修正－所謂"劑量蠕變"。劑量蠕變已被報告，在RA之治療上長期使用抗－TNF抗體、因弗利西馬(infliximab)(Anderson(2005)Semin Arthritis Rheum ,34 (5補充1：19－22)，且其最近已被發現係為在一些病患中導致臨床功效降低之抗－因弗利西馬(infliximab)抗體之結果(Haraoui等人,(2006)JRheumatol ,33 (1)：31－36)。
此處，抗－CTLA4－Ig與抗－CTLA－4抗體之形成，及其對CTLA4－Ig治療之功效與安全性之可能作用係經檢驗。因為CTLA4－Ig可能會抑制對其本身之免疫回應，以其作為選擇性共刺激調制劑之活性與在非臨床模式中所發現之回應為基礎，故短缺1－2劑量或中斷治療對致免疫性程度之作用亦被檢驗。最後，血清陽性試樣係被測試關於中和抗體活性。
物料與方法 經評估之研究 為測定CTLA4－Ig是否會在患有RA之病患中引致致免疫回應，抗體回應係橫越多階段II與III臨床試驗，包括六個DB與四個OL研究期間，於2,237位RA病患中評估，其包括對胺甲喋呤(MTX)或抗－TNF療法具有不適當回應之病患。一項研究(階段IIa)亦針對RA治療作為單一療法，評估CTLA4－Ig(表40)。試樣係一般性地於研究前、在整個治療中及最後劑量後之56及/或85天(以允許清除CTLA4－Ig之時間)進行評估。
預先指定之周圍灌注不利事件(AE)、整體AE及嚴重AE(SAE)，以及中止之發生率與類型，係在針對CTLA4－Ig或CTLA－4發展陽性抗體回應之病患中被檢驗。致免疫性對功效之作用亦在具有陽性抗體回應之病患中，藉由評估美國風濕病學院(ACR)20與健康評估調查表回應而進行檢驗。
致免疫性檢測 基本檢測格式 ：因為在人類血清中，特別是在RA群集中，針對CTLA4－Ig之Fc部份之高而先前存在之交叉反應，故使用兩種直接格式酵素連結之免疫吸著劑檢測(ELISA)以評估抗體回應。抗－CTLA4－Ig檢測係度量對分子之所有部份之抗體回應，但具有較低敏感性。抗－CTLA－4檢測僅度量對CTLA－4部份之抗體回應，移除Ig區域，且因此給予較大敏感性。兩種檢測係被使用於無論是終點滴定度(EPT)格式(檢測A)或篩檢格式(檢測B)中。
檢測A格式：階段II雙盲臨床致免疫性檢測方法 在階段IIRA試驗期間所使用之抗－CTLA4－Ig檢測與抗－CTLA－4檢測，係總稱為檢測A。在檢測A中，係將CTLA4－Ig或CTLA－4吸附至96－井微滴定板上，然後將其以試驗血清(3倍連續稀釋液，在1：10下開始)培養。結合抗體係使用鹼性－磷酸酶共軛之抗人類抗體藥液(南方生物科技，Birmingham,US)檢出，並使用對－硝基苯基磷酸鹽(PNPP)受質呈現。由於沒有可取用之人類抗－CTLA4－Ig抗體或正對照組血清，故此等檢測係使用獮猴屬猴子中所產生之CTLA4－Ig－專一抗－血清，經確認有效。得自各檢測之結果係以EPT值表示。當相對於該個體之服藥前(第1天)EPT，病患之EPT增加達兩個或多個連續稀釋液(＝9倍)時，病患被認為是已經血清轉化。
檢測B格式：階段III與階段II開放標識臨床致免疫性檢測方法 對於階段III試驗與2年階段IIOL期間，係將抗CTLA4－Ig與抗CTLA－4檢測兩者修改，以減少非專一性背景，改良敏感性，且改變測定確定性之方法，並總稱為檢測B。此等檢測亦使用純化自獮猴屬猴子抗－血清之CTLA4－Ig－專一抗體，經確認有效。對於各ELISA，係將以CTLA4－Ig(0.25微克/毫升)或CTLA－4(0.5微克/毫升)塗覆之96－井微滴定板在22±5℃下，以稀釋1：400之試驗血清培養2小時(抗－CTLA4－Ig)，或以稀釋1：25，在32－40℃下2小時(抗－CTLA－4)。於初次培養後，經結合抗體係以辣根－過氧化酶(HRP)共軛之抗人類抗體藥液檢出，接著為四甲基聯苯胺受質。
關於抗－CTLA4－Ig檢測之結果，係以後－/前－比例表示，其係經由將服藥後試樣OD值除以在相同板上所分析之其相應服藥前試樣OD值計算而得。確定性係以使用經安慰劑治療之RA病患試樣所建立之截止值為基準。若比例值小於截止值，則試樣被認為是陰性，並以滴定值<400作報告。超過此截止值之任何數值均被認為是條件上陽性。
關於抗－CTLA－4檢測之結果，係以"比例1"值表示，其係經由將平均病患血清試樣OD除以在相同板上之負對照組之平均OD計算而得。確定性係以使用得自經安慰劑治療之RA病患之經匯集物血清作為負對照組所建立之數值為基準。若數值小於所指定之截止值，則試樣被認為是陰性，並以<25之滴定值作報告。超過此截止值之任何數值均被認為是條件上陽性。
証實之分析 在各檢測(抗－CTLA4－Ig與抗－CTLA－4)與各檢測格式(檢測A與B)中被確認之條件上陽性試樣係於免疫耗乏檢測中評估，以測定回應之專一性。將抗－CTLA4－Ig陽性試樣以大約40微克/毫升無論是CTLA4－Ig(分子之CTLA－4部份)、另一種不相關Ig融合蛋白質(CD40Ig)或不相關之蛋白質(卵清蛋白)預培養，以確認抗－CTLA4－Ig反應性可能針對之分子區域(CTLA－4、Ig或接合區域)。將抗－CTLA－4陽性試樣同樣地以無論是CTLA4－Ig、CTLA－4部份或卵清蛋白預培養，以確認抗－CTLA－4反應性之專一性。在預培養之後，所有試樣係於上述相同原始檢測格式中再作分析。其中與未經處理之試樣作比較，預培養會造成經預培養試樣之OD之≧30%降低之試樣，被認為是經確認之陽性。若經確認，則滴定試樣，以確認會造成比例值等於特定檢測之截止值之血清稀釋，且此數值係以EPT作報告。
中和－抗體活性評估 進行生物檢測，以評估具有針對CTLA－4之藥物專一性抗體之病患試樣抑制或中和CTLA4－Ig之活性之能力(抑制結合至CD80/86)，其方式是防止其在T細胞表面上結合CD80/86。將在間白血球活素(IL)－2啟動子之控制下表現蟲螢光素酶基因之安定Jurkat T－細胞轉染體，於抗－CD3抗體存在下以Daudi B－細胞共刺激。此共刺激，經過Jurkat T細胞上之CD28與Daudi B細胞上之CD80/86間之交互作用所媒介，且併用抗－CD3抗體，會使IL－2啟動子活化，導致增加之蟲螢光素酶基因轉錄，且因此增加蟲螢光素酶蛋白質表現。發光信號係使用蟲螢光素酶檢測系統度量。由於CTLA4－Ig會阻斷CD80/86：CD28交互作用，故CTLA4－Ig添加至細胞混合物中會阻斷此IL－2啟動子活化作用，且減少發光，然而以中和抗體預培養會恢復共刺激交互作用，並造成發光增加。
中和抗體活性之CTLA4－Ig係藉由測定CTLA4－Ig回應，於0.1、0.25或0.5微克/毫升之濃度下，在生物檢測中，於1：25服藥後血清陽性血清存在下評估，且將其與相應之第1天試樣存在下之回應統計學上作比較。在生物檢測中具有CTLA4－Ig－中和活性之抗人類CTLA－4老鼠單株抗體(11D4)，係於各分析操作中作為正對照組使用。由於生物檢測試驗方法中固有之限制，故僅具有現有含量為≦1微克/毫升之CTLA4－Ig之服藥後試樣可被評估，因為較高藥物含量會被中和回應干擾，且進一步試樣稀釋會降低檢測敏感性。
藥物動力學評估 群集藥物動力學(POPPK)分析係在得自病患，得自階段II/III試驗之DB期間之血清試樣數據上進行，其中陽性免疫回應係經確認。將經確認有效之POPPK模式應用至個別病患血清濃度數據，並獲得個別PK參數值之最高後來Bayesian估計值。將關於此等病患之清除率分佈、體積估計值、於曲線(AUC)值下之穩定狀態面積及服藥(Cmin )值後之藥物在身體中之最低濃度，與來自相同試驗之病患之較大數據集合中之此等數值之分佈比較，該病患並未發展免疫回應。
結果 抗－CTLA4－Ig與抗－CTLA－4回應之發生率 總共2,237位病患具有基線前與後兩者血清試樣，並具有評估資格。當使用檢測A或B測定時，其中有62位(2.8%)病患具有抗－CTLA4－Ig或抗－CTLA－4回應之証據(圖37)。沒有任何病患証實對CTLA4－Ig之Fc與CTLA－4功能部位兩者之免疫回應。有三位病患具有對接合區域之回應。當使用更多敏感性檢測B時，對CTLA4－Ig之抗體回應係在1,990位病患之60位中(3.0%)被檢出(圖37)。
在階段III研究中被評估之病患內(n＝1,764)，有203位在DB或OL期間中止CTLA4－Ig治療，或並未進入後續OL研究期，且於中止治療後已血清收集56及/或85天。在203位病患中，有15位(7.4%)對無論是CTLA4－Ig(整個分子；n＝5，2.5%)或CTLA－4(n＝10，4.9%；表42)具有免疫陽性回應。在完成階段III DB期間，且繼續進入OL治療之其餘1,561位RA病患中，有40位(2.6%)在DB或OL期間具有陽性抗體回應：對CTLA4－Ig有33位(2.1%)，而對CTLA－4有7位(0.4%)。令人感興趣的是，在CTLA4－Ig作為單一療法之階段IIa研究中，沒有病患對CTLA4－Ig或分子之CTLA－4部份經血清轉化；但是，較不敏感檢測A格式係被採用。
總共191位病患具有超過30天期間，在其參與DB與OL期間之間未使用CTLA4－Ig。其中，在OL期間有3位(1.6%)病患對CTLA4－Ig具有陽性抗體回應，而有1位(0.5%)病患對CTLA－4具有陽性抗體回應(表41)。亦分析得自587位RA病患之血清，其短缺1－2劑量之研究藥物，且在研究期間任何時點上重新開始。在此等病患中，有15位(2.6%)証實對CTLA4－Ig具陽性抗體回應，且有七位(1.2%)對CTLA－4具有陽性抗體回應(表41)。
共同胺甲喋呤對於致免疫性之作用 總共2451位病患接受共同MTX，而有493位病患並未接受。整體上，具有對CTLA4－Ig之陽性抗體回應之病患之百分比大致上類似，不管其是否接受共同MTX(2.3%對1.4%)(表42)。
CTLA－4＝細胞毒性T－淋巴細胞－有關聯之抗原－4
致免疫性對CTLA4－Ig之安全性與功效之衝擊 關於所有陽性病患之AE、SAE、周圍灌注AE之速率係經評估，且沒有發現在致免疫性與安全性間之關係。同樣地，沒有發現致免疫性與功效間之關係；但是，由於經血清轉化病患之數目有限，此等數據之解釋係被限制。
抗－CTLA－4抗體之中和活性 得自20位病患之二十四個血清試樣在抗－CTLA－4抗體篩選檢測中，對於抗－CTLA－4反應性被確認為陽性。其中，有14個試樣(收集自13位病患)在中和作用生物檢測中，符合評估標準(＝1微克/毫升CTLA4－Ig)。在此13個試樣中，有1個在服藥後第56天為陽性，而有10個在第85天為陽性。14個試樣(取自8位病患)中有九個顯示中和抗體活性。除了一位病患中之敗血病之外，在於或接近血清轉化之時間，沒有醫療上顯著AE被報告於病患中，血清轉化被認為與此八位病患中之治療有關聯或可能有關聯。在研究中止後之期間(於中止後56與85天)並未收集功效數據，其係為主要數目之試樣適用於評估中和抗體時之期間。因此，評估中和抗體對於功效之作用為不可能。
與物動力學評估 對於在階段II/III試驗之DB期間具有陽性抗體回應之32位病患中之31位，藥物動力學參數係經估計。關於PK分析之血清試樣，未必在陽性免疫回應被記載之日收集。得自DB研究期間之病患數據之群集PK製作模型，係指出在31位免疫陽性病患中之經預測PK參數與在較大群集之病患(n＝386)中未具有陽性免疫回應者為可比較。當血清轉化被記載時，在DB期間於研究日之峰谷血清濃度，範圍為1.16－24.21微克/毫升，其中大部份血清濃度係在5－20微克/毫升之間。血清轉化並非顯示會影響血清峰谷含量。藉由致免疫性狀態之清除率之分佈與中央隔室之體積係示於圖38中。
MSD電致化學發光檢測. 於藥物(藥物耐藥性)存在下，在改良結合致免疫性檢測之敏感性與偵測抗體能力之努力中，新世代之致免疫性檢測正被發展，藉由採用Meso－型Discovery(MSD)技術，監控對CTLA4－Ig之抗－藥物抗體。此新穎技術係使用會在電化學刺激時在微板之電極表面上引發之光線發射之標識物。MSD格式已被証實於藥物存在下具有偵測抗體之經改良敏感性與較佳能力，與ELISA格式作比較。此溶液相技術係允許經標識之藥物更有效地與血清中之藥物競爭，且具有較大動態範圍、信號噪聲比及增加之表面容量，勝過ELISA格式。不像現行ELISA，其係使用無論是分子之CTLA4部份或整個分子作為捕獲試劑，新穎檢測係為採用經生物素化與釕－標識之CTLA4－Ig分子之橋接檢測，該分子在添加至經抗生物素蛋白塗覆之MSD板之前以病患試樣培養。藉由釕標記所發射之電致化學發光信號係使用MSD儀器度量。陽性試樣，以經確認有效之檢測切點為基準，將在MSD檢測中，藉由免疫耗乏，以無論是CTLA4－Ig、CTLA4－T或CD40Ig進一步評估，以確認確定性，並証實致免疫回應係針對CTLA4－Ig分子之何部份，且界定終點滴定度。
實例32：在猴子中之藥物動力學參數
每組六隻母獮猴屬猴子係被投予單一靜脈內10－毫克/公斤劑量之製自CD－CHO1方法之CTLA4－Ig。使六隻母猴子之對照組接受鹽水(1毫升/公斤)。為評估CTLA4－Ig之生物活性，使所有猴子在服藥之前，於30分鐘內以10毫克/動物T－細胞依賴性抗原鍵孔青貝血藍質(KLH)肌內方式免疫。
在治療之後觀察動物6週。在服藥前；在3與30分鐘下；在1、2、4、8、24及48小時下；及在服藥後第4、8、11、15、22、29、36及43天獲得血液試樣，以測定與比較藥物動力學分佈形態。在藥物動力學報告中，此等研究天數係個別相應於第0、1、2、3、7、10、14、21、28、35及42天。血清試樣係藉由ELISA方法分析其CTLA4－Ig。於相同天數自對照動物收集可比較之血液試樣，當適當時並用以評估抗－KLH抗體回應。CTLA4－Ig－專一抗體形成之評估係在研究前與接著每週，於得自經CTLA4－Ig－治療動物之血清上進行。KLH－專一抗體形成係在免疫前與免疫後接著大約每週，歷經4週，於得自所有動物之血清試樣上測定。其他評估標準包括存活期、臨床跡象、身體檢查(包括神經病、呼吸速率及聽診評估)、體重、體溫及食物消耗。
臨床病理學疾病評估係在研究前與第45天進行。在完成研究之後，使所有動物返回庫存。
藥物專一抗體回應係在第29天或之後，發生於以CD－CHO1－製程物質治療之六隻猴子之三隻中(表43；圖39)。在以CD－CHO1製程物質治療之猴子中，血液尿氮(BUN)之最小增加(20%)與血清鉀之降低(14%)並非生理學上或毒物學上有意義，因為數值僅邊際地在歷史對照組範圍之外，且對於BUN，血清肌酸酐之共同增加並不存在。沒有發現臨床病理學疾病參數之其他變化。KLH抗體回應(＝94%吸收峰對照回應)之顯著抑制係於被投予CD－CHO1製程物質之猴子中被發現。致免疫性被顯著地延遲，直到CTLA4－Ig血清含量於第29天或之後降至低於大約1微克/毫升之免疫壓抑含量為止。
臨床病理學疾病. 血液試樣係在服藥之前(第13天)與最後藥物動力學採血之後(第45天)收集自經斷食動物之股靜脈。尿分析法係在研究前(第13天)與最後藥物動力學取樣之後(第45天)，於所收集之尿液上進行，歷經18小時期間。測定下列分析參數：血液學：血紅素、血球容積計、紅血球計數、平均小體體積、平均小體血紅素、平均小體血紅素濃度、網狀紅血球計數、總與差別白血球計數、血小板計數及末梢血液塗片中之細胞形態學之評估係經測定。凝血：凝血酶原時間、經活化之部份促凝血酶原激酶時間及血漿血纖維蛋白原係經測定。血清化學：尿氮、肌酸酐、葡萄糖、總膽固醇、總蛋白質、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白比例、丙胺酸轉胺酶、天冬胺酸鹽轉胺酶、鹼性磷酸酶、總膽紅素質、三酸甘油酯、γ麩胺醯轉換酶、鈉、鉀、鈣、氯化物及磷係經測定。尿分析法：輸出、比重、pH值、顏色與外觀，及葡萄糖、蛋白質、酮類、膽紅素質、隱血及尿膽素原之定性測定係經測定。尿沉積物係以顯微鏡方式檢查。
專一抗體回應. 可比較程度之藥物專一抗體回應係在第29天或之後，發生於以CD－CHO1製程物質治療之六隻猴子之三隻中。正如預期，關於此方法之致免疫性係被顯著地延遲，直到CTLA4－Ig血清含量於第29天或之後降至低於大約1微克/毫升之免疫壓抑含量為止。對於被給予CD－CHO1製程物質之猴子之平均CTLA4－Ig－專一抗體回應，係於第36天變成陽性，且於第43天達到最高峰(所評估之最後時間點)。在被給予CD－CHO1製程物質之個別猴子中之吸收峰抗體滴定度，範圍係涵蓋23至10,448。
實例33：CTLA4－Ig解聚作用
在製造生物反應器中所製成之CTLA4－Ig高分子量(HMW)物質，可利用促溶劑，無論是在溶液中(批次模式)或搭配親和力層析步驟(在管柱上模式)被部份轉化成功能性CTLA4－Ig二聚體。此方法係被稱為"解聚作用"。以迄今已完成之經解聚集CTLA4－Ig物質之分析特徵鑒定研究為基礎，此物質顯示與未接受解聚作用方法之對照組物質為生物化學上可比較。
在現行方法中，大約20至25% CTLA4－Ig蛋白質係以HMW物質而損失。回收此物質之一部份作為功能性二聚體，係具有整體製程產率提高>10%之可能性。
批次模式解聚作用方法 解聚作用已經以批次模式(在溶液中)証實，其方式是以適當濃度之促溶劑譬如胍鹽酸鹽或尿素處理，接著快速稀釋至低鹽再折疊緩衝劑中，以幫助分子增進其原本構形。
將使用蛋白質A(所使用之樹脂MAbSelect)純化之CTLA4－Ig調整至最後濃度為~4－5毫克/毫升，將其作為此等批次實驗之起始物質使用。然後，將其以1：1體積比與2x濃促溶緩衝劑接觸，以達成最後促溶劑濃度為1－3M(對於胍鹽酸鹽)與2－7M(對於尿素)。胍鹽酸鹽濃度>2M與尿素濃度>＝4M在造成CTLA4－Ig HMW物質之解聚作用上為有效。用於此等實驗之流動相為在6.5－7.0之pH值範圍下之磷酸鹽緩衝系統。藉由快速稀釋(以1：5之體積比)至包含50 mM Tris,25 mM NaCl,pH 8.5之再折疊緩衝劑中，使解聚作用反應淬滅。在批次解聚作用實驗中，係使50至60% HMW物質轉化成CTLA4－Ig二聚體，伴隨著>95%步驟產率。在解聚作用步驟後所發現之HMW物質含量之減少，係示於圖40中。
管柱上解聚作用方法 為克服批次解聚作用方法之按比例放大期間之潛在槽桶與混合限制，結合蛋白質A捕獲步驟與解聚作用步驟之方法係經評估。此方法係涉及對於蛋白質A步驟使用促溶溶液作為溶離緩衝劑，接著收集溶離匯集物至再折疊/稀緩衝液中。
解聚作用效率中之類似性能係使用批次與管柱上方法發現。管柱上解聚作用方法具有減少加工處理步驟數目之顯著優點。關於蛋白質A步驟，使用管柱上解聚作用之實驗細節，係摘述於下表中。所使用之樹脂：MAbSelect(得自GE保健)；管柱床高度：20－25公分。
併入下游處理中之可行性 進行試樣3－管柱純化序列裝置，以產生最後製程物質，使用與未使用管柱上蛋白質A解聚作用步驟。得自兩種純化序列裝置之層析步驟產率係提供於表44中。
解聚作用步驟之併入試樣3－管柱方法中會造成在製程產率上大約10%改良。分析得自兩種製程順序之產物匯集物，以評估所形成之CTLA4－Ig物質之生物化學可比較性。
兩種產物匯集物藉由MALDI－TOF之N－聚醣分析係示於圖41中。以此分析為基礎，物質顯示為可比較。此MALDI－TOF結果係使用HPLC為基礎之N－聚醣檢測方法確認。HPLC分析係証實在對照組與經解聚集之最後製程物質間之雙天線唾液酸吸收峰上之<1.7%差異。
胰蛋白酶肽定圖譜亦在兩種產物匯集物上進行，以定量存在於經純化物質中之經脫醯胺酸化與氧化肽之百分比。此等結果(摘述於表45)係証實關於兩種試樣之可比較脫醯胺作用與氧化作用程度。
此外，對於對照組與管柱上經解聚集之物質，B7－結合檢測結果係個別為101%與98%。
實例34：藥物動力學
階段2B、多中心、隨機、雙盲、經安慰劑控制之研究為評估兩種不同劑量之CTLA4－Ig之安全性與臨床功效將CTLA4－Ig以靜脈內方式投予患有活性風濕性關節炎，同時接受胺甲喋呤之病患：在此項研究中，使病患在2種不同劑量(2與10毫克/公斤)下接受CTLA4－Ig，或安慰劑，且併用MTX。CTLA4－Ig係根據本發明之方法製成，且供應於含有200毫克CTLA4－Ig之個別小玻瓶中。CTLA4－Ig係於第1、15及30天，以及接著每30天，歷經1年，以靜脈內方式投予病患。多重劑量PK係衍生自血清濃度對時間數據，其係在服藥間隔期間，於第60與90天之間得自已登記至位置專一性PK亞研究之病患。對於PK亞研究中之病患，係於第60天收集血液試樣，然後服藥，且對於PK分佈形態，係開始於第60天，在30分鐘時(相應於CTLA4－Ig灌注之結束)，在灌注開始後4小時，及接著每週，直到第90天為止。總共90位病患登記參與PK亞研究。但是，在服藥間隔之間，從第60至90天之完整PK分佈形態係得自29位病患(15位病患在2毫克/公斤下服藥；14位病患在10毫克/公斤下服藥)。
PK參數之摘述係呈現在表46中。得自研究之結果係証實Cmax 與AUC(TAU)兩者，其中TAU＝30天，以劑量成比例方式增加。對於以1：5之比例增加之額定劑量，Cmax 之幾何平均值係以1：5.2之比例增加，然而AUC(TAU)之幾何平均值係以1：5.0之比例增加。此外，T－HALF、CLT及Vss值顯示與劑量無關。在此等RA病患中，平均T－HALF、CLT及Vss值係個別為約13天、~0.2毫升/小時/公斤及~0.07升/公斤。小Vss顯示CTLA4－Ig主要是被限制至細胞外液體積。以第一次灌注後，在2與4週下，然後是接著每月一次服藥之服藥方案為基礎，CTLA4－Ig之穩定狀態條件係藉由第三次每月劑量達成。而且，由於服藥方案之結果，血清濃度在治療之最初2個月期間會高於穩定狀態峰谷濃度。在第60、90及180天之峰谷(Cmin )值之比較，係顯示CTLA4－Ig在每月服藥之後不會出現累積。關於接受2與10毫克/公斤CTLA4－Ig之每月IV劑量之所有病患之平均Cmin 穩定狀態值，範圍係個別在4.4至6.7微克/毫升與22.0至28.7微克/毫升之間。
表46.
在RA病患中，於多次靜脈內灌注後，CTLA4－Ig之藥物動力學顯示在2毫克/公斤至10毫克/公斤之劑量範圍期間Cmax 與AUC之成比例增加。在10毫克/公斤下，到第60天時血清濃度顯示達到穩定狀態，具有平均(範圍)峰谷濃度為24(1－66)微克/毫升。在以10毫克/公斤，於每月間隔下持續重複治療時，於RA病患中沒有CTLA4－Ig之系統蓄積發生。
在RA病患中之群集藥物動力學分析，係顯示有朝向CTLA4－Ig之較高清除率之趨勢，伴隨著漸增體重。年齡與性別(當針對體重校正時)不會影響清除率。共同胺甲喋呤(MTX)、非類固醇消炎藥物(NSAID)、皮質類固醇及TNF阻斷劑不會影響CTLA4－Ig清除率。
實例35：甘露糖、海藻糖及半乳糖之莫耳比藉由CE之測定
毛細電泳方法已針對在LEA2 CTLA4A29YL104E －Ig中之中性單醣含量之定量分析而發展。包括甘露糖、海藻糖及半乳糖之中性單醣係藉由酸性水解，在高溫條件(2M三氟醋酸，在95℃下6小時)下，自CTLA4A29YL104E －Ig試樣釋出。然後將所釋出之中性單醣於作為觸媒之醋酸及作為還原試劑(67 mM APTS,330 mM HAc,83 mM NaBH3 Cn，在55℃下3小時)之NaBH3 CN存在下，以胺基蒎三磺酸(APTS)進行螢光標識。將木糖添加至各試樣中，並充作內標率物。利用各中性單醣之吸收峰面積對內標準物之吸收峰面積之比例，以供定量。
試劑：水解溶液(2M三氟醋酸(TFA))；衍化作用溶液I(0.1M 8－胺基－1,3,6－三磺酸三鈉鹽(APTS)水溶液)；衍化作用溶液II(在1M醋酸中之0.25M NaBH3 CN)；操作緩衝劑(60±5 mM四硼酸鈉,pH 9.25)；毛細管沖洗溶液(1N NaOH；1N HCl；80%甲醇)；甘露糖(Man)、海藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)及木糖(Xyl)之單醣標準儲備溶液，在10毫克/毫升之濃度下；單醣工作溶液I：內標準物工作溶液為Xyl儲備溶液之100倍稀釋液；單醣工作溶液II：中性混合物標準工作溶液，Man、Fuc及Gal儲備溶液之100倍稀釋液。
儀器配置：CE系統為Beckman P/ACE MDQ CE系統；偵測器：與P/ACE MDQ聯結之Beckman雷射所引致(LIF)偵測系統)；未經塗覆之毛細管(內徑25微米，外徑360微米)27－31公分總長度，以順應P/ACE MDQ。
毛細電泳法操作條件：操作緩衝劑(60 mM四硼酸鈉,pH 9.25；毛細管藥筒溫度：25℃；電壓：25－30 kV，正模式；偵測器條件：LIF偵測器，在488毫微米下激發，在520米下發射；注射試樣：壓力注射模式，20s，在0.5 PSI下；操作時間：10分鐘；試樣儲存：10℃。
水解作用：將10微升木糖工作溶液與200微升2M TFA混合，以製造系統空白試驗。將10微升木糖工作溶液與10微升中性混合物標準溶液及200微升2M TFA混合，以製造單醣標準物。將10微升木糖工作溶液與10微升試樣(例如CTLA4A29YL104E －Ig，大約1毫克/毫升)及200微升2M TFA混合，以製造測試試樣。將所有管件渦旋10秒，並離心10秒，接著在95℃下培養6小時。於水解步驟後，將試樣放置在－20℃下10分鐘，以冷卻下來。使試樣旋轉而下歷經10秒，並在SpeedVac中蒸發至乾涸。
衍化作用：將試樣以10微升衍化作用溶液I重配。將試樣短暫地混合，並添加5微升衍化作用溶液II。將試樣裝填在經預熱之離心機中，並在55℃下培養3小時，同時於2000 rpm下離心。
CE注射：使衍化作用後之試樣之最後體積藉由添加HPLC級水來到100微升，並將10微升試樣與190微升HPLC級水一起轉移至CE微小玻瓶。於試樣注射前，將CE藥筒以HPLC級水廣泛地沖洗(1－3分鐘操作時間)，接著以操作緩衝劑進行平衡沖洗(5分鐘操作時間)。於最初沖洗之後，將供分析用之單醣標準物與試樣注射在CE藥筒中(15分鐘操作時間)。於各標準物或測試試樣之注射操作後，將CE藥筒以HPLC級水與操作緩衝劑沖洗並達成平衡。系統適合性之電泳圖譜應類似圖43 ，其中吸收峰1為甘露糖；吸收峰2為木糖；吸收峰3為海藻糖；及吸收峰4為半乳糖。
系統適合性： 系統適合性之電泳圖譜應類似圖43中所示者，其中吸收峰1為甘露糖；吸收峰2為木糖；吸收峰3為海藻糖；及吸收峰4為半乳糖。
當使用Beckman MDQ系統以外之CE儀器時，毛細管之長度可能不同於此方法中所指定者。其會造成分析物潛移時間以及吸收峰強度之偏差。但單醣分析物之吸收峰圖樣應保持相同。
關於第一種系統適合性標準物之兩個相鄰吸收峰間之解析度，可根據下列方程式計算：R＝2(t2 －t1 )/(W1 ＋W2 )其中：R：解析度t2 ,t1 ：個別為兩個相鄰吸收峰之潛移時間W1 ,W2 ：個別為在兩個相鄰吸收峰之基線下之峰寬
R值必須≧1.0。若R<1.0，則使用洗滌/沖洗順序沖洗毛細管。若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。
對於最後系統適合性注射，最後吸收峰(半乳糖)必須具有拖尾因數<1.4，使用下式：T＝W0.05 /2f其中：T：拖尾因數W0.05 ：在5%高度下之峰寬f：在峰頂前方之峰寬
若T≧1.4，則以洗滌/沖洗順序沖洗毛細管；若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。半乳糖與木糖之峰面積比必須具有≦10%之RSD。半乳糖之潛移時間必須≦15.0分鐘。電泳圖譜分佈形態應相當於圖43。
單醣標準物百分比RSD可藉由比較內標準物與單醣標準成份之吸收峰面積比例，經由將各單醣成份之吸收峰面積除以各單醣標準物注射之內標準物吸收峰面積而測定。百分比RSD可對於甘露糖、海藻糖及半乳糖進行計算。RSD應≦10%。
中性單醣對蛋白質之莫耳比之測定 中性單醣(例如Man、Gal及Fuc)相對於內標準物木糖之吸收峰面積比例可根據下文所提供之方程式計算，以測定各中性單醣對蛋白質之莫耳比。例如，峰面積比係等於單醣吸收峰面積(Gal、Fuc或Man)除以木糖吸收峰面積，其中對於峰面積比之相對標準偏差(RSD)係等於或低於該10%。可使用下列方程式以計算下列：關於甘露糖/蛋白質之莫耳比： 其中，Rman ：甘露糖對蛋白質之莫耳比Aman ：試樣中之甘露糖之吸收峰面積(μV.秒)Axyl ：試樣中之木糖之吸收峰面積(μV.秒)AxylO ：單醣標準物中之木糖之平均吸收峰面積(μV.秒)AmanO ：單醣標準物中之甘露糖之平均吸收峰面積(μV.秒)VmanO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之甘露糖之體積(以微升表示)CmanO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之甘露糖之濃度(以毫克/毫升表示)Vp ：用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp ：用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWLEA29Y ：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E －Ig)之分子量(91,232 Da)甘露糖之MW：180.2道爾吞
關於海藻糖/蛋白質之莫耳比： 其中， Rfc ：海藻糖對蛋白質之莫耳比Afuc ：試樣中之海藻糖之吸收峰面積(μV.秒)Axyl ：試樣中之木糖之吸收峰面積(μV.秒)AxylO ：單醣標準物中之木糖之平均吸收峰面積(μV.秒)AfucO ：單醣標準物中之海藻糖之平均吸收峰面積(μV.秒)VfucO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之海藻糖之體積(以微升表示)CfucO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之海藻糖之濃度(以毫克/毫升表示)Vp ：用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp ：用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWLEA29Y ：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E －Ig)之分子量(91,232 Da)海藻糖之MW：164.2道爾吞
關於半乳糖/蛋白質之莫耳比： 其中，Rgal ：半乳糖對蛋白質之莫耳比Agal ：試樣中之半乳糖之吸收峰面積(μV.秒)Axyl ：試樣中之木糖之吸收峰面積(μV.秒)AxylO ：單醣標準物中之木糖之平均吸收峰面積(μV.秒)AgalO ：單醣標準物中之半乳糖之平均吸收峰面積(μV.秒)VgalO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之半乳糖之體積(以微升表示)CgalO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之半乳糖之濃度(以毫克/毫升表示)Vp ：用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp ：用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWLEA29Y ：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E －Ig)之分子量(91,232 Da)MW半乳糖：180.2道爾吞。
實例36：GalNAc與GlcNAc之莫耳比藉由CE之測定
毛細電泳方法已針對在CTLA4A29YL104E －Ig中之胺基單醣含量之定量分析而發展，其係為具有6個N－連結糖基化作用位置及至少1個O－連結糖基化作用位置之糖蛋白。包括N－乙醯半乳糖胺(GalNAc)與N－乙醯胺基葡糖(GlcNAc)之胺基單醣係藉由酸性水解，在高溫條件(4N HCl，在95℃下6小時)下，自CTLA4A29YL104E －Ig試樣釋出。將所釋出之胺基單醣經由以醋酸酐在冰上培養半小時，經過再乙醯化作用步驟。然後將其於作為觸媒之醋酸及作為還原試劑(67 mM APTS,330 mM HAc,83 mM NaBH3 Cn，在55℃下3小時)之NaBH3 CN存在下，以胺基蒎三磺酸(APTS)進行螢光標識。將N－乙醯甘露糖胺添加至各試樣中，並充作內標準物。利用各胺基單醣之吸收峰面積對內標準物之吸收峰面積之比例，以供定量。
試劑：水解溶液(4N HCl)；衍化作用溶液I(0.1M 8－胺基－1,3,6－三磺酸三鈉鹽(APTS)水溶液)；衍化作用溶液II(在1M醋酸中之0.25M NaBH3 CN)；再乙醯化作用緩衝劑(25 mM碳酸氫鈉，pH 9.5)；操作緩衝劑(60±5 mM四硼酸鈉，pH 9.25)；毛細管沖洗溶液(1N NaOH；1N HCl；80%甲醇)；GalNAc、GlcNAc及ManNAc之單醣標準儲備溶液，在10毫克/毫升之濃度下；單醣工作溶液I：內標準物工作溶液為ManNAc儲備溶液之100倍稀釋液；單醣工作溶液II：胺基混合物標準工作溶液，GalNAc與GlcNAc儲備溶液之100倍稀釋液。
儀器配置：CE系統為Beckman P/ACE MDQ CE系統；偵測器：與P/ACE MDQ聯結之Beckman雷射所引致(LIF)偵測系統。
毛細電泳法操作條件：操作緩衝劑(60 mM四硼酸鈉，pH 9.25)；毛細管藥筒溫度：25℃；電壓：25－30 kV，正模式；偵測器條件：LIF偵測器，在488毫微米下激發，在520米下發射；注射試樣：壓力注射模式，20s，在0.5 PSI下；操作時間：10分鐘；試樣儲存：10℃。
水解作用：將10微升ManNAc工作溶液與200微升4N HCl混合，以製造系統空白試驗。將10微升ManNAc工作溶液與10微升胺基混合物標準溶液及200微升4N HCl混合，以製造單醣標準物。將10微升ManNAc工作溶液與10微升試樣(例如CTLA4A29YL104E －Ig試樣等，大約l毫克/毫升)及200微升4N HCl混合，以製造測試試樣。將所有管件渦旋10秒，並離心10秒，接著在95℃下培養6小時。於水解步驟後，將試樣放置在－20℃下10分鐘，以冷卻下來。使試樣旋轉而下歷經10秒，並在SpeedVac中蒸發至乾涸。
再乙醯化作用：將經水解並乾燥之試樣以20微升再乙醯化作用緩衝劑與4微升醋酸酐重配，接著混合，並在冰上培養(30分鐘)。使試樣旋轉而下歷經10秒，並在SpeedVac中蒸發至乾涸。將試樣各以100微升HPLC級水重配，並在SpeedVac中蒸發至乾涸。
衍化作用：提供經重配之試樣(10微升衍化作用溶液I HPLC)5微升衍化作用溶液II。於混合後，將試樣裝填在經預熱之離心機中，並在55℃下培養3小時，同時在2000 rpm下離心。
CE注射：使衍化作用後之試樣之最後體積藉由添加HPLC級水來到100微升，並將10微升試樣與190微升HPLC級水一起轉移至CE微小玻瓶。於試樣注射前，將CE藥筒以HPLC級水廣泛地沖洗(1－3分鐘操作時間)，接著以操作緩衝劑進行平衡沖洗(5分鐘操作時間)。於最初沖洗之後，將供分析用之單醣標準物與試樣注射在CE藥筒中(10分鐘操作時間)。於各標準物或測試試樣之注射操作後，將CE藥筒以HPLC級水與操作緩衝劑沖洗並達成平衡。系統適合性之電泳圖譜應類似圖44 ，其中吸收峰1為GalNAc；吸收峰2為ManNAc；及吸收峰3為GlcNAc。
系統適合性： 系統適合性之電泳圖譜應類似圖43中所示者，其中吸收峰1為GalNAc；吸收峰2為ManNAc；及吸收峰3為GlcNAc。
當使用Beckman MDQ系統以外之CE儀器時，毛細管之長度可能不同於此方法中所指定者。其會造成分析物潛移時間以及吸收峰強度之偏差。但單醣分析物之吸收峰圖樣應保持相同。
關於第一種系統適合性標準物之兩個相鄰吸收峰間之解析度，可根據下列方程式計算：R＝2(t2 －t1 )/(W1 ＋W2 )其中，R：解析度t2 ,t1 ：個別為兩個相鄰吸收峰之潛移時間W1 ,W2 ：個別為在兩個相鄰吸收峰之基線下之峰寬
R值必須＝1.0。若R<1.0，則使用洗滌/沖洗順序沖洗毛細管。若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。
對於最後系統適合性注射，最後吸收峰(GlcNAc)必須具有拖尾因數<1.4，使用下式：T＝W0.05 /2f其中：T：拖尾因數W0.05 ：在5%高度下之峰寬f：在峰頂前方之峰寬
若T≧1.4，則以洗滌/沖洗順序沖洗毛細管；若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。GlcNAc與ManNAc之峰面積比必須具有≦10%之RSD。GlcNAc之潛移時間必須≦10.0分鐘。電泳圖譜分佈形態應相當於圖44。
單醣標準物百分比RSD可藉由比較內標準物與單醣標準成份之吸收峰面積比例，經由將各單醣成份之吸收峰面積除以各單醣標準物注射之內標準物吸收峰面積而測定。百分比RSD可對於GalNAc與GlcNAc進行計算。RSD應≦10%。
胺基單醣對蛋白質之莫耳比之測定 胺基單醣(例如GalNAc與GlcNAc)相對於內標準物ManNAc之吸收峰面積比例可根據下文所提供之方程式計算，以測定各胺基單醣對蛋白質之莫耳比。例如，峰面積比係等於單醣吸收峰面積(GalNAc或GlcNAc)除以ManNAc吸收峰面積，其中對於峰面積比之相對標準偏差(RSD)係等於或低於該10%。可使用下列方程式以計算下列：關於GalNAc/蛋白質之莫耳比： 其中RGalNAc ：GalNAc對蛋白質之莫耳比AGalNAc ：試樣中GalNAc之吸收峰面積(μV.秒)AManNAc ：試樣中之ManNAc之吸收峰面積(μV.秒)AManNAcO ：單醣標準物中之ManNAc之平均吸收峰面積(μV.秒)AGalNAcO ：單醣標準物中之GalNAc之平均吸收峰面積(μV.秒)VGalNAcO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GalNAc之體積(以微升表示)CGalNAcO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GalNAc之濃度(以毫克/毫升表示)Vp ：用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp ：用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWLEA29Y ：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E －Ig)之分子量(91,232 Da)MW GalNAc：221.2道爾吞
關於GlcNAc/蛋白質之莫耳比： 其中，RGlcNAc ：GlcNAc對蛋白質之莫耳比AGlcNAc ：試樣中GlcNAc之吸收峰面積(μV.秒)AManNAc ：試樣中之ManNAc之吸收峰面積(μV.秒)AManNAcO ：單醣標準物中之ManNAc之平均吸收峰面積(μV.秒)AGlcNAco ：單醣標準物中之GlcNAc之平均吸收峰面積(μV.秒)VGlcNAcO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GlcNAc之體積(以微升表示)CGlcNAcO ：包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GlcNAc之濃度(以毫克/毫升表示)Vp ：用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp ：用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWLEA29Y ：LEA29Y(或CTLA4A29YL104E －Ig)之分子量(91,232 Da)MW GlcNAc：221.2道爾吞
實例37：CTLA4 A29YL104E －Ig藉由高性能陰離子交換層析之N－連結寡醣碳水化合物形態剖析
存在於糖蛋白上之碳水化合物結構可影響其功能與活體內清除。因此，重要的是，監控糖蛋白之以重組方式製成批料之碳水化合物結構一致性。此處，存在於CTLA4A29YL104E －Ig上之N－連結(天冬素－連結)碳水化合物係被監控。於此方法中，寡醣係經由以PNGase F(肽：N－GlycosidaseF)酵素消化分裂，藉由高性能陰離子交換層析(HPAEC)分離，並經由電化學偵測(經整合之電流測定法)監控。所產生之層析圖係為N－連結碳水化合物分佈形態，其中CTLA4A29YL104E －Ig試樣之分佈形態應類似此種。
關於藉由逆相與石墨碳HPLC單離寡醣之流動相之試劑 ：溶離劑1(在HPLC級水中之0.05%三氟醋酸(TFA))；溶離劑2：(在60%乙腈(ACN),40% HPLC水(60：40，ACN：H2 O)中之0.05% TFA；溶離劑3：(在40%乙腈,40%異丙醇(IPA),20% HPLC水(40：40：20，ACN：IPA：H2 O)中之0.05% TFA)。
關於製備HPAEC寡醣碳水化合物形態剖析之流動相之試劑 ：溶離劑1：500 mM醋酸鈉(NaOAc)；溶離劑2：400 mM氫氧化鈉(NaOH)；Milli－Q水；4M氫氧化鈉(大約4M NaOH)；50 mM磷酸鈉緩衝劑,0.02%疊氮化鈉,pH＝7.5；50 mM磷酸鈉緩衝劑,0.02%疊氮化鈉,pH＝7.5中之PNGase F酵素工作儲備液；水蘇四糖儲備溶液(1.25毫克/毫升)；水蘇四糖系統適合性標準物(12.5微克/毫升)。
儀器配置與條件－(相等儀器配置可經取代)儀器配置：
試樣製備 ：於1.7毫升Eppendorf管件中，添加含有0.02% Na疊氮化物,pH 7與80微升試樣(對於總共2毫克CTLA4A29YL104E －Ig為~25微克/微升等)之80微升50 mM磷酸Na緩衝劑，接著16微升10X變性緩衝劑(5% SDS,10% β－巰基乙醇)。將試樣充分地混合，並接著煮沸2分鐘，以使蛋白質變性。使小玻瓶冷卻至室溫，然後添加16微升NP40(10%)與40微升PNGase F工作儲備液，並接著混合。將試樣在37℃下培養24±2小時後，將其轉移至HPLC自動取樣器小玻瓶中，預備供在HPLC儀器上注射。
關於寡醣單離之層析條件： 自動取樣器溫度 37℃注射體積 100微升操作時間 50分鐘數據收集時間 50分鐘
藉由陰離子交換層析，關於寡分佈形態之層析條件： 自動取樣器溫度 4℃注射體積 30微升操作時間 80分鐘
CTLA4A29YL104E －Ig試樣可具有圖45之層析圖中所描繪之碳水化合物分佈形態。各功能部位之滯留時間，如圖45中所確認，應為大約：功能部位I(吸收峰1A、1B、1C、1D及1E)10－17分鐘功能部位II：21－29分鐘功能部位III：33－43分鐘功能部位IV：48－56分鐘
滯留時間為系統依存性，且應以類似水蘇四糖方式移轉。
計算 理論板數(N) ：理論板數(N)可以水蘇四糖吸收峰為基準，使用下式測得。其係經過Millennium數據分析系統進行，或亦可以手動方式進行。
N＝16(t/W)2 其中：t：在最高之高度下，從注射時間至吸收峰溶離時間所度量之滯留時間。W：峰寬，藉由側面至基線之外推法。
N必須≧6000。若板計數低於6000，則應置換管柱。
拖尾因數(T)：管柱拖尾因數(T)可以水蘇四糖吸收峰為基準，使用下式計算而得。其係經過Millennium數據分析系統進行，或亦可以手動方式進行。
T＝(W0.05 /2f)其中：W0.05 ：在5%高度(0.05h)下之峰寬。f：在最高高度下，從在W0.05 下之吸收峰前方邊緣至吸收峰之中間之度量值(寬度)。
T必須≦1.2。若拖尾因數大於1.2，則應評估緩衝劑組合物，應置換或清洗管柱。
%功能部位面積： 功能部位I：在大約滯留時間10－15分鐘下之吸收峰面積之總和(吸收峰1A－1E；例如圖45)功能部位II：21－27分鐘之吸收峰之總和功能部位III：34－40分鐘之吸收峰之總和功能部位IV：關於在45－56分鐘下之吸收峰之吸收峰面積
百分比主峰面積 ：關於五個主峰之每一個之%吸收峰面積可對於下述使用下文方程式進行計算：吸收峰1A、1B、1C、2(兩種未經解析之物種)、3(兩種未經解析之物種)及4。
實例38：CTLA4 A29YL104E －Ig在藥物物質與藥物產物中之毛細電泳確認
CTLA4A29YL104E －Ig為具有免疫壓抑活性之水溶性糖蛋白。使用未經塗覆熔凝矽石毛細管之毛細電泳方法係用於CTLA4A29YL104E －Ig之確認。將試樣(例如CTLA4A29YL104E －Ig等)於70℃下加熱5分鐘，然後，立即藉由經設定在214毫微米下之UV偵測分析，以証實確認。
此外，將CTLA4A29YL104E －Ig與CTLA4－Ig物質之1：1混合物混合並注射，以確認兩種蛋白質可被分離且區別。此方法可在CTLA4A29YL104E －Ig與CTLA4－Ig之間作區別，其方式是將CTLA4A29YL104E －Ig物質對試樣之潛移時間作比較。
設備(相當設備可被取代)：毛細電泳法儀器 Beckman P/ACE MDQ偵測器模組 UV在214毫微米下毛細管 Polymicro技術公司,360微米外徑/75微米內徑，未經塗覆(零件編號2000019,TSP075375)毛細管窗口製造者MicroSolve技術(目錄編號07200－S)
試劑與溶液 ：操作緩衝劑(14.4 mM硼酸鈉；17.3 mM十二基硫酸鈉；2.0%乙腈)；磷酸鹽稀緩衝液(22.3 mM二鹽基性磷酸鈉；4.2 mM單鹽基性磷酸鈉；53.4 mM氯化鈉)；硼酸鹽稀緩衝液(83.5 mM NaBO2 ,pH 9.6)；參考或試樣工作溶液(在磷酸鹽稀緩衝液中之10±1毫克/毫升試樣)；參考或試樣注射溶液(10.0微升試樣＋50微升硼酸鹽稀緩衝液)；試樣1：1 CTLA4－Ig－CTLA4A29YL104E －Ig混合物溶液(10.0微升CTLA4－Ig試樣＋10.0微升CTLA4A29YL104E －Ig試樣＋50微升硼酸鹽稀緩衝液)；注射溶液。
操作條件： UV偵測器波長 214毫微米資料速率 4Hz峰寬(點) 16－25注射 10秒(0.5 psi)總長度＊ ~60公分毛細管有效長度＊＊ ~50公分毛細管藥筒溫度 15℃電壓 19kV－23kV操作時間 15分鐘＊總長度 ：從毛細管入口至出口＊＊有效長度 ：從毛細管入口至偵測窗口
主峰之CTLA4－Ig試樣潛移時間為約11.0±0.4分鐘。主峰之CTLA4A29YL104E －Ig試樣潛移時間為約12.0±0.4分鐘。在各試樣間之主峰潛移時間應為至少0.6分鐘間隔(圖46)。
實例39：於CTLA4 A29YL104E －Ig上之N－乙醯神經胺酸與N－羥乙醯基神經胺酸含量測定之水解作用與HPLC分析
在重組蛋白質中之唾液酸基化作用程度可影響藥物動力學與清除速率。CTLA4A29YL104E －Ig為具有N－與O－連結碳水化合物位置兩者之重組蛋白質。佔據此等位置之聚醣具有可改變程度之唾液酸基化作用。除了其唾液酸基化作用之結構不均勻性之外，個別唾液酸之含量可逐批改變。因此，獲得唾液酸對蛋白質比例之整體度量。
存在於CTLA4A29YL104E －Ig中之N－乙醯神經胺酸(NANA)與N－羥乙醯神經胺酸(NGNA)含量係經檢查。唾液酸係藉由酸水解自蛋白質釋出，然後以DMB螢光標識。經標識之唾液酸係在RP－HPLC C－18管柱上被分離，且自共同地操作之唾液酸標準物之回應因子定量。數據分析與報告值(作成NANA或NGNA對蛋白質之莫耳比)係在此實例方法內指定。此實例係描述用以測定N－乙醯神經胺酸(NANA)與N－羥乙醯神經胺酸(NGNA)存在於CTLA4A29YL104E －Ig中之量之方法。唾液酸係藉由酸水解自蛋白質釋出。然後，將已釋出之NANA與NGNA以1,2－二胺基－4,5－甲氧基苯(DMB)以螢光方式標識。經標識之唾液酸係在RP－HPLC C－18管柱上被分離，並藉由螢光偵測(Ex＝373毫微米，Em＝448毫微米)檢出。NANA與NGNA係以共同地操作之NANA與NGNA標準物之回應因子為基礎進行定量。試驗結果係以NANA與NGNA個別對蛋白質之莫耳比(MR)報告。
試劑與溶液：1.0 M H2 SO4 ；50 mM H2 SO4 ；螢光標識試劑(18 mM亞硫酸氫鈉(Na2 S2 O4 ),7% 2－巰基乙醇,7 mM 1,2－二胺基－4,5－亞甲基－二氧苯二鹽酸鹽(DMB))；流動相操作緩衝劑A(20%甲醇)；流動相操作緩衝劑B(70%甲醇)；N－乙醯神經胺酸標準溶液(1毫克/毫升)；N－羥乙醯神經胺酸標準溶液(1毫克/毫升)；系統適合性標準物(在900微升水中之50微升NANA或NGNA溶液)；試樣溶液(例如2毫克/毫升CTLA4A29YL104E －Ig等)；NANA工作儲備標準溶液(稀釋儲備液至50微克/毫升)；NGNA工作儲備標準溶液(稀釋儲備液至50微克/毫升)。
水解作用：取得20微升各NANA標準、NGNA標準物、CTLA4A29YL104E －Ig及系統適合性標準物溶液之液份至個別1.5毫升離心管中，並將200微升50 mM硫酸溶液添加至各小玻瓶中。將內容物溫和地混合，並在80℃下培養1小時±5分鐘。當水解作用完成時，將取樣快速地離心。
螢光標識：將螢光標識試劑(200微升)添加至各試樣中，並充分地混合。然後，將試樣於80℃下，在黑暗中培養45±5分鐘，接著冷卻。
儀器配置與層析條件 (相當儀器配置可經取代)： 層析參數流量：1.0毫升/分鐘流動相A：20% MeOH/水流動相B：70% MeOH/水 注射體積：10微升操作時間：6分鐘柱溫：室溫滯留時間(NANA)：3.1±0.5分鐘滯留時間(NGNA)：2.3±0.5分鐘最高壓力：300巴激發波長：373毫微米發射波長：448毫微米PMT增進：8 HPLC系統：Waters 2690/2695分離模組或等效物。螢光偵測器：Waters 2475多波長螢光偵測器或等效物。數據獲取：Waters Millennium 32或Empower。管柱：Lnna5 μ，C18，100 A，150 x 4.6毫米，Phenomenex(目錄編號00F－4252－E0)數字加熱塊 WVR(目錄編號13259－056)或等效物。小型離心機 WVR(型號C－1200)或等效物。流動相A：10%(v/v)MeOH/90%水流動相B：70%(v/v)MeOH/30%水流率：1毫升/分鐘注射體積：10微升操作時間：30分鐘柱溫：室溫激發波長：373毫微米發射波長：448毫微米增進：1溶離梯度液：
唾液酸標準物製備(~5 mM). N－乙醯神經胺酸(NANA,MW＝309.3)標準物(~5 mM)。精確地稱量154.5±1.0毫克N－乙醯神經胺酸，置於100毫升量瓶中。溶解，並以DI水足量至該體積，充分混合。將溶液分成數液份至2毫升低溫小玻瓶中。
P＝NANA之純度－來自賣主COA(意即99%＝0.99)。
N－羥乙醯神經胺酸(NGNA,MW＝325.7)標準物(~0.25 mM).精確地稱量8.0±1.0毫克N－羥乙醯神經胺酸，置於100毫升量瓶中。溶解，並以DI水足量至該體積，充分混合。將溶液分成數液份至2毫升低溫小玻瓶中。
P＝NGNA之純度－來自賣主COA(意即99%＝0.99)。分成數液份之唾液酸標準物可被儲存於－20℃下，歷經至高六個月。
唾液酸標準混合物製備. 供系統適合性與定量之唾液酸標準混合物(50 μM NANA，1 μM NGNA)。將1毫升5 mM NANA、400微升0.25 mM NGNA添加至100毫升量瓶中，以DI水足量至該體積，並充分混合。將唾液酸標準混合物分成數液份至2毫升低溫小玻瓶中。分成數液份之唾液酸標準混合物可被儲存於－20℃下，歷經至高六個月。
試樣與參考物質製備. 使經冷凍之蛋白質試樣於2－8℃下融解，充分混合。將試樣與參考物質兩者稀釋至約略0.5毫克/毫升CTLA4A29YL104E －Ig(例如蛋白質濃度＝25.0毫克/毫升，添加50.0微升蛋白質至2450微升水中)。使經稀釋之測試試樣與參考物質在10,000 rpm下離心5分鐘，以移除微粒子。
水解作用.空白試驗 ：於2.0毫升離心管中添加50微升DI水與200微升50 mM硫酸。將此充作空白試驗。供系統適合性與定量用之唾液酸標準物. 於2.0毫升離心管中添加50微升唾液酸標準混合物與200微升50 mM硫酸。重複製備。以Std1與Std2表示。參考物質 ：於2.0毫升離心管中，添加50微升經稀釋之CTLA4A29YL104E －Ig參考物質(~0.5毫克/毫升)與200微升50 mM硫酸。重複製備，以RM1與RM2表示。測試試樣 ：於2.0毫升離心管中，添加50微升經稀釋之CTLA4A29YL104E －Ig藥物(~0.5毫克/毫升)與200微升50 mM硫酸。重複製備。以S1－1、S1－2；S2－1、S2－2；S3－1、S3－2等表示。使試樣渦旋大約5秒，並離心大約5－10秒。將試樣放置在加熱板塊中，並於80℃±5℃下培養1小時±5分鐘。允許經水解試樣冷卻至室溫。使已水解試樣短暫地離心，以迫使冷凝液進入管件(~10秒，於高速下)中。
衍化作用. 將加熱板塊預熱至80℃±5℃。將200微升螢光標識之試劑添加至各水解試樣中。渦旋大約5秒，並離心~10秒。將試樣放置在80℃±5℃加熱板塊中，歷經40±5分鐘。以鋁箔覆蓋加熱板塊，因經標識之溶液為光敏感性。使經衍化試樣冷卻至室溫。渦旋並離心試樣，歷經大約10秒，以迫使冷凝液進入管件中。
注射用製劑. 在分析之前，確保管柱係以流動相達成平衡。將足夠試樣(100－200微升)自各離心管轉移至自動取樣器小玻瓶中，使用有限插入物。典型自動取樣器裝填10種試樣注射液，係如下述：
其中Std1與Std2為唾液酸標準混合物溶液之製劑；RM1與RM2為對照試樣之製劑；且S為注射試樣。唾液酸標準物(Std1)注射之最初四份(試樣#2 & 3)係用於系統適合性目的。試樣#3(Std1)與試樣#4(Std2)之四份注射係用於計算。關於其他試樣注射，係重複自動取樣器裝填5至16。
系統適合性. 系統適合性試樣之層析圖分佈形態，應類似圖47中所示之層析圖。對於系統適合性標準物(Std1)之第一次注射，關於NGNA與NANA之USP解析度(R)必須＝1.5。系統適合性標準物(Std1)之四次注射必須符合下列標準：關於NANA吸收峰面積之RSD必須≦5%。關於NGNA吸收峰面積之RSD必須≦10%。NGNA吸收峰之潛移時間必須在11.3±2.0分鐘下溶離。NANA吸收峰之潛移時間必須在16.0±2.5分鐘下溶離。四次標準注射(Std1，試樣#3)與(Std2，試樣#4)之吸收峰面積之RSD必須≦10%。來自此順序之所有一起進行標準注射之吸收峰面積之RSD必須≦15%。
HPLC系統之製備：使管柱以98%緩衝劑A與2%緩衝劑B，在1毫升/分鐘下平衡15分鐘。將10微升螢光標識之系統適合性溶液注入系統中。然後，可使用下列方程式計算峰解析度與理論板數： 其中：R＝解析度T1＝N－羥乙醯基神經胺酸之滯留時間(分鐘)T2＝N－乙醯神經胺酸之滯留時間(分鐘)W1＝在N－羥乙醯神經胺酸之基線下之峰寬(分鐘)W2＝在NANA之基線下之峰寬(分鐘)
解析度值必須≧1.5。
理論板數可使用下列方程式計算：N＝16(T2/W2)2 其中：N＝理論板數T2＝N－乙醯神經胺酸之滯留時間(分鐘)W2＝在N－乙醯神經胺酸之基線下之峰寬(分鐘)
理論板數必須為2000。CTLA4A29YL104E －Ig水解作用分佈形態層析圖應類似圖47。
試樣係藉逆相HPLC(RP－HPLC)以下列順序分析：首先注射NANA與NGNA標準物，接著為試樣之注射，若需要則重複(例如CTLA4A29YL104E －Ig等)。於試樣分析後，將管柱以流動相B於0.5毫升/分鐘下洗滌20分鐘。若需要，則可逆轉管柱。
唾液酸(NANA或NGNA)對蛋白質之莫耳比(MR)之測定 唾液酸對蛋白質之莫耳比可藉由Millennium或Empower軟體計算。
稀釋因數： 其中，V蛋白質 ＝所添加蛋白質儲備溶液之體積(微升)，V水 ＝所添加水之體積(微升)
蛋白質工作溶液(用於水解作用之蛋白質)濃度(μM)： 其中，C蛋白質 ＝蛋白質工作溶液之濃度(μM)，CA280 ＝蛋白質儲備溶液之A280 濃度(毫克/毫升)，MWCTLA4A29YL104E－Ig ＝CTLA4A29YL104E－Ig之分子量，91232 Da。
唾液酸在蛋白質工作溶液中之濃度(μM)： 其中，C未知 ＝唾液酸(NANA或NGNA)在未知試樣中之濃度Cstd ＝唾液酸(NANA或NGNA)在標準物中之濃度(μM)Au ＝唾液酸(NANA或NGNA)在未知試樣中之吸收峰面積Astd ＝唾液酸(NANA或NGNA)在標準物中之吸收峰面積
唾液酸(NANA或NGNA)對蛋白質之莫耳比(M.R.)：
唾液酸對蛋白質(TSA)之總莫耳比之計算：TSA＝NANA莫耳比＋NGNA莫耳比
兩個一起進行之NANA標準物之面積計數之相對標準偏差應<10%。兩個一起進行之NGNA標準物之面積計數之相對標準偏差應<10%。兩個獨立水解產物之面積計數之相對標準偏差應<10%。
於一項具體實施例中，唾液酸在CTLA4A29YL104E －Ig中之平均莫耳比必須在正下方表中所指定之範圍內。
關於兩種試樣製劑，在參考物質與試樣中之唾液酸莫耳比之%偏差必須≦15%、≦20%、≦25%、≦30%或≦35%。
實例40：關於CTLA4 A29YL104E －Ig之活體外細胞為基礎之生物檢測
T細胞需要關於活化作用與後續增生之兩個訊息。第一個訊息係藉由抗原肽與TCR－CD3複合物之交互作用所提供。第二個共刺激訊息係以在T細胞上之CD28與在抗原呈現細胞上之B7蛋白質間之交互作用發生。在收到此兩個訊息時，T細胞會分泌細胞活素間白血球活素2(IL－2)。IL－2之釋出會導致細胞活化作用與增生。CTLA4A29YL104E －Ig，一種可溶性免疫壓抑化合物，亦會結合至抗原呈現細胞上之B7蛋白質，因此阻斷與CD28之功能性交互作用，並防止IL－2生產所必須之共刺激訊息。
於此方法中，在IL－2啟動子之控制下以蟲螢光素酶基因轉染之Jurkat T細胞，係於抗－CD3存在下，以Daudi B細胞共刺激。共刺激會活化IL－2啟動子，其依次會產生蟲螢光素酶蛋白質。所形成之發光信號係使用蟲螢光素酶檢測系統度量。於此系統中，CTLA4A29YL104E －Ig會在蟲螢光素酶活性上，產生劑量依賴性降低。
此方法係檢驗CTLA4A29YL104E －Ig對於IL－2生產所必須之共刺激訊息之作用。可溶性CTLA4A29YLl04E －Ig之存在會阻止T細胞與抗原呈現細胞間之發出訊息。無此訊息，IL－2不會被產生，因此防止T細胞之無性繁殖擴大。具有蟲螢光素酶基因之載體係使用IL－2啟動子產生。然後，將JurkatT細胞以此報告子載體轉染。選擇陽性無性繁殖系Jurkat.CA，並使用於此方法中。
此生物檢測係涉及以抗－CD3與B細胞(Daudi)刺激經轉染之T細胞(Jurkat.CA)。藉由B細胞所提供之共刺激係藉由添加CTLA4A29YL104E －Ig而被抑制。將Jurkat.CA與Daudi細胞接種至96井白色不透明平底板之井中，並以抗－CD3，於不同濃度之CTLA4A29YL104E －Ig存在下刺激。於37℃下培養16至20小時後，檢測此等井關於蟲螢光素酶活性。共刺激藉由CTLA4A29YL104E －Ig之抑制係以蟲螢光素酶活性上之劑量依賴性降低而明瞭。
試劑 ：Daudi細胞培養基(10%牛胎兒血清，1% MEM丙酮酸鈉在RPMI 1640中)；Jurkat.CA細胞培養基(10%小牛血清，1%MEM丙酮酸鈉,400微克/毫升基因素在RPMI 1640中)；生物檢測培養基(0.2微克/毫升抗－CD3抗體與1%青霉素－鏈霉素溶液在Daudi細胞培養基中)；明亮－Glo蟲螢光素酶溶液檢測系統(Promega，目錄#E2620)。
儀器配置 ：Nikon,Diaphot 200倒置顯微鏡；Packard TopCount NXT發光計；Tecan Genesis液體處理器；Coulter Vi－Cell細胞計數器；Zymark RapidPlate－96。
程序
工作溶液之製備：3毫升CTLA4A29YL104E －Ig溶液(5000毫微克/毫升)在生物檢測培養基中。
Daudi細胞培養基. 將300毫升RPMI 1640添加至1升Corning濾器單元中。然後，添加100毫升牛胎兒血清與10毫升MEM丙酮酸鈉。添加足夠RPMI 1640，以造成1升。過濾並儲存於4℃下，歷經至高一個月。
Jurkat.CA細胞培養基. 將300毫升RPMI 1640添加至1升Corning濾器單元中。然後，於50毫克/毫升(最後濃度為400微克/毫升)下，添加100毫升小牛血清、10毫升MEM丙酮酸鈉及8毫升基因素。添加足夠RPMI 1640以造成1升。過濾並儲存於4℃下，歷經至高一個月。
生物檢測培養基. 將100毫升Daudi細胞培養基(2.1)添加至100毫升培養基瓶中。然後，將抗－CD3抗體添加至濃度為0.2微克/毫升與1毫升之青霉素－鏈霉素溶液(1.11)中。藉由倒置溫和地混合，並儲存在室溫下，歷經不超過8小時。
明亮－Glo蟲螢光素酶溶液. 按系統(1.21)中所述，藉由將檢測緩衝液添加至蟲螢光素酶受質中，並藉由倒置混合，以製備溶液。試劑應在2小時內使用，或儲存於－20℃下，並保護隔離光線，歷經至高4週。
細胞系維持. 經由以細胞計數器計數，測定關於Jurkat.CA與Daudi細胞系兩者之每毫升細胞數。細胞應在1 x 105 與1.5 x 106 個細胞/毫升之間。將12 x 106 個Jurkat.CA細胞與12 x 106 個Daudi細胞合併在無菌離心管中。使細胞於~125 x克下，在室溫下離心10分鐘。使細胞充分地再懸浮於9毫升Daudi細胞培養基(2.1)中，其方式是溫和地以血清學吸量管重複吸取，直到沒有細胞團塊可見為止，以獲得2.7 x 106 個細胞/毫升之濃度。藉由在細胞計數器上計數細胞，確認細胞濃度。將再懸浮之細胞於每井75毫升(每井200,000個細胞)下接種至96井板之井中(1.3)。將板在培養器設定點為37℃，5% CO2 及85%濕度下培養，同時製備標準物、品質對照組及試樣。製備額定濃度之CTLA4A29YL104E －Ig，供標準物、品質對照組及試樣1與2用。製備3毫升CTLA4A29YL104E －Ig物質工作溶液，在5000毫微克/毫升下，於生物檢測培養基(2.3)中，供使用於標準曲線中。製備3毫升CTLA4A29YL104E －Ig物質工作溶液，在5000毫微克/毫升下，於生物檢測培養基(2.3)中，供使用於品質控制曲線中。製備兩種CTLA4A29YL104E －Ig之各3毫升試樣工作溶液，在5000毫微克/毫升下，於生物檢測培養基(2.3)中，供使用於試樣曲線中(CTLA4A29YL104E －Ig試樣之近似濃度可用以製備8個點曲線，且當所測得之濃度可採用時，相對功效值可按5.5中所述校正)。
對於標準物、品質對照組及試樣製備八點曲線，在濃度為5000、200、100、50、25、10、5及0.1毫微克/毫升CTLA4A29YL104E －Ig下，如下文表55中所示，關於檢測中之最後濃度，在兩倍稀釋至板中之後為2500、100、50、25、12.5、5、2.5及0.05毫微克/毫升。
可使用兩個板圖。無規則板圖需要利用液體處理器以供安裝。有規則板圖具有相鄰三份複製，且試驗物件之各曲線點係以相繼有規則佈置添加。關於無規則板圖，係將75微升各溶液(4.8)添加至含細胞板之適當井(4.5)中，如下文板圖中所示。關於有規則板圖，係將75微升各溶液(4.8)添加至含有細胞之兩個板之適當井(4.5)中，如下文板圖中所示。
將板以TopSeal－A密封(1.22)。確保密封物緊密地在適當位置上。應無空氣間隙。將板在培養器設定點為37℃，5% CO2 及85%濕度下培養16至20小時。使板與明亮－Glo蟲螢光素酶溶液(2.4)達成平衡至儀器溫度。將150微升明亮－Glo蟲螢光素酶溶液同時添加至各井中，並混合。將板於混合後立即放置在TopCount NXT中，以在黑暗中平衡10分鐘。度量TopCount NXT中之發光信號，每井使用1秒整合或按對於所使用特定型式發光計之適當方式。記錄得自TopCount NXT之輸出。當使用有規則板圖時，係讀取兩個板。第一個板(直立)係以左上方角落中之井A1讀取。第二個板(倒置)係以右下方角落中之井A1讀取。
生物檢測無規則板圖安裝： Stnd：於井中從2500至0.05毫微克/毫升最後濃度之標準物。QC：於井中從2500至0.05毫微克/毫升毫升最後濃度之品質對照組。Smp1,Smp2：於井中從2500至0.05毫微克/毫升毫升最後濃度之試樣1至2。
生物檢測有規則板圖安裝： Stnd：於井中從2500至0.05毫微克/毫升毫升最後濃度之標準物。QC：於井中從2500至0.05毫微克/毫升毫升最後濃度之品質對照組。Smp1,Smp2：於井中從2500至0.05毫微克/毫升毫升最後濃度之試樣1至2。
於96井板之每井中添加200,000個細胞，並在37℃，5% CO2 及85%濕度下培養。將12 x 106 個Jurkat.CA細胞與12 x 106 個Daudi細胞合併在無菌離心管中。使細胞在室溫下，於~125 x 克下離心10分鐘，並充分地再懸浮於9毫升Daudi細胞培養基中，其方式是溫和地以血清學吸量管重複吸取，直到沒有細胞團塊可見為止，以獲得2.7 x 106 個細胞/毫升之濃度。將得自表55之75微升各溶液添加至含細胞板之適當井中。然後，將板以TopSeal－A密封，並在37℃，5%CO2 及85%濕度下培養16至20小時。於板與明亮－Glo蟲螢光素酶溶液平衡至儀器溫度後，將150微升明亮－Glo蟲螢光素酶溶液同時添加至各井中，並混合。接著，將板在混合後立即置於TopCount NXT中，以在黑暗中平衡10分鐘。接著在TopCount NXT中度量發光信號，使用每井1秒整合或按對於所使用特定型式發光計之適當方式。
記錄得自TopCount NXT之輸出，讀取至標準分析程式中，並將藉由採用其對數(底10)轉變數據。使得自各物件之經轉變數據吻合四參數計算術模式，如下文方程式中所示： 其中：A 為曲線之頂部平坦區，D 為曲線之底部平坦區，B 為斜率因數，而C 為會產生等於A 與D 平均之作用之濃度。
R2 統計與缺乏吻合F－試驗可對各物件計算。亦可計算試驗物件相對於標準物質之最低、最高及斜率之比例。此外，關於此等比例之可信度間隔亦可計算。
各物件之相對功效係藉由吻合單一方程式至與得自參考物件之數據合併之得自吾人感興趣物件之數據而測得。
其中：A、B及D參數係為參考物與試驗物件兩者所共用，且CR 為參考參數，CA 為試驗物件參數，而比例CR /CA 為相對功效。上標I 為指示變數。若數據得自吾人感興趣之物件，則其係被設定等於1，而若數據得自標準物質則為0。
各試驗物件之相對功效係被轉化成百分比標度，而相對功效係以得自此程式之輸出給予。
以近似濃度所獲得相對功效值之調整 ：由於試樣收到與獲得精確蛋白質濃度間之時間延遲，故試樣可於檢測中，在近似濃度下測試，而當測定精確濃度時調整結果。此調整係使用下文方程式2進行，其中係將檢測中測得之相對功效乘以用以設立檢測之CTLA4A29YL104E －Ig濃度對所測得CTLA4A29YL104E －Ig試樣濃度之比例。
實例：試樣係在蛋白質濃度為25毫克/毫升下，於檢測中測試。
所測得之相對功效為105%。
所測得之CTLA4A29YL104E －Ig濃度係經測定為25.5毫克/毫升可報告之相對功效＝(105 * 25)/25.5＝103%。
標準物質：關於輸出之標準物之EC50 值應在5與35毫微克/毫升之間。在2500毫微克/毫升與0.05毫微克/毫升濃度標準物(範圍)間之差異應為每秒≧40,000次計數(CPS)。參考資料之R－平方值應大於0.95。
在表9中之試驗物件相對功效值必須在參考標準物之25與175%之間，其係為此檢測之範圍。若相對功效值係在此範圍外，則試樣必須被稀釋或濃縮，以落在此範圍內，並再分析試樣。
Daudi B細胞系： 來源：Daudi細胞係得自ATCC。產生包含64個小玻瓶之母儲存體。工作儲存體係產生自4個繼代後之母儲存體小玻瓶(註：繼代0係被視為解凍物，接著3個其他繼代係在工作儲存體產生之前製成) 。
培養基：使Daudi細胞在經補充10%牛胎兒血清與1%丙酮酸鈉之RPMI 1640培養基(含有HEPES與L－麩醯胺)中生長。
培養器條件：細胞係於37℃，5% CO2 及70－90%濕度下，被保持在經抽氣T－燒瓶中。
解凍擬案：將細胞之小玻瓶自液態氮冷凍室移除，並在37℃水浴中解凍。將內容物與10毫升培養基混合。將細胞計數，然後藉由在125 x克下離心10分鐘收集。在離心分離之後，移除上層清液，並使細胞在3 x 105 個存活細胞/毫升下，懸浮於新培養基中。此時細胞係被界定為在繼代0下。
生長性質：細胞系係呈懸浮生長。
繼代培養：培養物係藉由一週繼代兩次而被保持著，其中在繼代之間不長於5天。細胞係在經抽氣T－燒瓶中，以新培養基進行繼代，在0.5 x 105 與2 x 105 個存活細胞/毫升之間。細胞不應達到密度大於1.5 x 106 個細胞/毫升。當藉由錐藍染色評估時，細胞應大於80%存活。日期與繼代數目應在繼代後標識於T－燒瓶上。
加倍時間：加倍時間範圍為18至26小時。
繼代限制：得自工作儲存體之細胞，在使用於生物檢測中之前應通過3次，意即其應在繼代3或較高之下。細胞應僅留在培養物中，歷經20個繼代。新工作小玻瓶應在此時解凍。
冷凍擬案：使細胞於低溫小玻瓶中冷凍，從5至10 x 106 個細胞/毫升。低溫保護劑培養基係經由以5%(v/v)DMSO補充完全培養基而製成。使細胞在1℃/分鐘之速率下冷凍，直到其達到液態氮溫度(－190℃)為止。
Jurkat.CAT細胞系： 來源：使Jurkat T細胞以會使CTLA4－Ig分子編碼之質粒轉染。工作儲存體係由3繼代後之母儲存體小玻瓶產生(註：繼代0係被視為融解物，接著2個其他繼代係在工作儲存體產生之前製成) 。
培養基：使Jurkat.CA細胞在最後濃度為400微克/毫升下，於RPMI 1640培養基(含有HEPES與經補充10%小牛血清之L－麩醯胺及經補充基因素(G418硫酸鹽)之1%丙酮酸鈉)中生長。
培養器條件：使細胞於37℃，5% CO2 及70－90%濕度下，被保持在經抽氣之T燒瓶中。
解凍擬案：將細胞之小玻瓶自液態氮冷凍室移除，並於37℃水浴中解凍。將內容物與10毫升培養基混合。將細胞計數，然後藉由在125 x克下離心10分鐘收集。在離心分離之後，移除上層清液，並使細胞於3 x 105 個存活細胞/毫升下懸浮在新培養基中。此時細胞係被界定為在階段0下。
生長性質：細胞系係呈懸浮生長。
培養：培養物係藉由一週繼代兩次而被保持著，其中在繼代之間未超過5天。細胞係在經抽氣T－燒瓶中，以新培養基，在0.5與2 x 105 個存活細胞/毫升之間進行繼代。細胞不應達到密度大於1.5 x 106 個細胞/毫升。當藉由錐藍染色評估時，細胞應大於80%存活。日期與繼代數目應在繼代後標識於T－燒瓶上。
加倍時間：加倍時間範圍為18至26小時。
繼代限制：細胞工作儲存體應在使用於生物檢測中之前通過3次，意即其應在繼代3或較高之下。細胞應僅留在培養物中，歷經20個繼代。新工作小玻瓶應在此時解凍。
冷凍擬案：使細胞於低溫小玻瓶中冷凍，從5至10 x 106 個細胞/毫升。低溫保護劑培養基係經由以5%(v/v)DMSO補充完全培養基而製成。使細胞在1℃/分鐘之速率下冷凍，直到其達到液態氮溫度(－190℃)為止。
實例41：CTLA4 A29YL104E －Ig對B7.1－Ig受體之生物專一性結合藉由表面電漿激元共振(BIAcore)測定
CTLA4A29YL104E －Ig試樣對B7.1Ig受體之相對結合係藉由表面電漿激元共振，使用BIAcore儀器度量。在此項檢測中，CTLA4A29YL104E －Ig係結合至衍生自APC細胞膜蛋白質B7.1之B7.1Ig免疫球蛋白融合蛋白質。在使B7.1Ig受體於經活化感測晶片之表面上固定化至高密度後，將CTLA4A29YL104E －Ig物質、品質對照組及試樣稀釋，以產生結合感測圖。CTLA4A29YL104E －Ig對固定化B7.1Ig表面之最初結合速率(斜率)/所結合共振單位(RU)，係在質量傳遞(擴散)受到限制之條件下，於此高密度B7.1Ig表面上度量。以每秒之共振單位(RU)表示之最初結合速率，係與生物活性濃度直接產生關聯。試樣之結合速率係使用參考標準曲線計算至活性濃度中，其中CTLA4A29YL104E －Ig物質之結合速率係對濃度作圖。最後結果係無論是藉由試樣相對於CTLA4A29YL104E －Ig物質之百分比結合，或以濃度表示。
試劑 ：檢定合格之胺偶合套件BIA(套件含有一個小玻瓶，各具有：115毫克N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)、750毫克N－乙基－N'－(3－二甲基)(EDC)及乙醇胺)；再生作用緩衝劑(10 mM檸檬酸鈉,100 mM NaCl,pH 4.0)；儀器配置 ：具有PC可相容電腦之BIAcore C儀器(BIAcore(目錄批號BR－1100－51))；BIAcore C控制軟體1.0.2版；BIAcore評估軟體1.0；BIAcore 96－井微滴定板U－形BIAcore(目錄編號BR－1005－03)；BIAcore 96－井微板箔板封閉器(目錄編號BR－1005－78)。
方法概述：
物料
試劑 檢定合格之胺偶合套件BIA. 套件含有一個小玻瓶，各具有：115毫克N－羥基琥珀醯亞胺、750毫克N－乙基－N'－(3－二甲基)及乙醇胺。將各溶液根據製造者指引分成數液份，並儲存，如下文所指出：將數液份之11.5毫克/毫升N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)儲存於－20℃下。此經冷凍之液份從製備日期起2個月到期。將數液份之75毫克/毫升1－乙基－3－(3－二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)儲存在－20℃下。此經冷凍之液份從製備日期起2個月到期。將數液份之1.0M乙醇胺－HCl pH 8.5儲存在－20℃下。此經冷凍之液份從製備日期起2個月到期。再生作用緩衝劑(10 mM檸檬酸鈉,100 mM NaCl,pH 4.0).以分析方式稱量出1.5±0.1克檸檬酸鈉與2.9±0.1克NaCl。添加至500毫升Milli－Q水中，並以1N HCl調整pH至4.0。以0.22微米濾器過濾溶液，然後，將500毫升分成數液份至45毫升/50毫升圓錐形管件中。當儲存在2－8℃下時，溶液從製備日期起6個月到期。
儀器配置
感測晶片之製備. 將新感測晶片CM5插入此儀器之偵測器單元上之卡匣孔中。按 BIAcore C手冊中所述，使用HBS－EP緩衝劑引動此系統。
關於方法功能之BIAcore C儀器之操作. BIAcore C儀器係自可相容PC電腦，於Microsoft Windows環境下，使用BIAcore C控制軟體控制。參考工作說明書，"BIAcore C儀器之操作"與"BIAcore C儀器之校準與維修"，關於BIAcore C儀器之使用與維修。
B7.1Ig之固定化方法 B7.1Ig之製備 ：將含有B7.1Ig之小玻瓶在22.5±5℃下解凍，並稀釋至使3000－9000 RU固定化之濃度，使用10 mM醋酸鹽pH 5.0緩衝劑作為稀釋劑。將EDC、NHS及乙醇胺之小玻瓶各自如上述之胺偶合套件解凍。然後，當藉由BIAcore程式指示時，將試劑與配位體小玻瓶放置在試樣掛架中，且固定化作用係根據BIAcore儀器指示引發。
CTLA4 A29YL104E －Ig標準曲線之製備 將標準物與試樣(譬如CTLA4A29YL104E －Ig等)在室溫下解凍。將用以產生標準曲線之標準物稀釋至標準曲線之標的濃度(250、500、1000、2000、4000及8000毫微克/毫升)。
關於標準試樣(譬如CTLA4A29YL104E －Ig物質儲備液)之稀釋，且濃度為25毫克/毫升，吾人可施行下列稀釋：i.稀釋1/50(500微克/毫升)，藉由將20微升添加至980微升HBS－EP中ii.稀釋至16微克/毫升，藉由將30微升500微克/毫升添加至908微升HBSEP中iii.連續性地以1/2步驟(500微升前一稀釋液＋500微升HBS－EP)稀釋，降至250毫微克/毫升
各標準物可以重複注射分析，其將造成2個斜率值。
品質控制試樣. 貝拉塔謝特(belatacept)之品質控制(QC)試樣係在HBS－EP緩衝劑中，於三個標的濃度含量為750、2500及5000毫微克/毫升下製成，並於－80℃下以200微升液份冷凍在7毫米塑膠小玻瓶中。在QC試樣中之貝拉塔謝特濃度係在三個獨立濃度分析實驗中，使用此方法測得。於各實驗中，所有QC試樣注射必須為可接受，在額定濃度之±20%內偵測。經檢定合格且經冷凍之QC試樣係於製備之後6個月到期。在實驗當天，於室溫下將三份QC試樣之各一個小玻瓶解凍。將QC試樣放置在試樣掛架位置中，如在方法能手(wizard)中所述者，並以三份複製注射分析各QC。或者，QC可在分析當天新製成。
CTLA4A29YL104E －Ig測試試樣. CTLA4A29YL104E －Ig試樣必須被稀釋至檢測範圍內之濃度(在750與5000毫微克/毫升之間)。具有已知大約CTLA4A29YL104E －Ig濃度之試樣應被稀釋至標的濃度為2000毫微克/毫升。在室溫下將試樣解凍之後，使用HBS－EP緩衝劑將其稀釋至標的濃度為2000毫微克/毫升。試樣稀釋液可針對分析在無論是BIAcore檢定合格聚丙烯試管或96－井微滴定板中製成。下述為關於稀釋CTLA4A29YL1o4E －Ig測試試樣之實例：在室溫下使試樣解凍之後，將CTLA4A29YL104E －Ig試樣稀釋至檢測範圍內之濃度(譬如在750毫微克/毫升與5000毫微克/毫升之間)。具有已知大約CTLA4A29YL104E －Ig濃度之試樣應被稀釋至標的濃度為2000毫微克/毫升，使用HBS－EP緩衝劑，在無論是BIAcore檢定合格聚丙烯試管或96－井微滴定板中。
下述為關於稀釋CTLA4A29YL104E －Ig試樣(濃度＝25.0毫克/毫升)之實例：i.稀釋1/50(500微克/毫升)，藉由將20微升添加至980微升HBS－EP中ii.稀釋1/25(20微克/毫升)，藉由將30微升500微克/毫升添加至720微升HBS－EP中iii.稀釋1/10(2微克/毫升)，藉由將100微升20微克/毫升添加至900微升HBS－EP中
使各稀釋液在適當速度下渦旋2－4秒。試樣係以三份複製製成(得自儲備試樣溶液之三份獨立稀釋液)，並以一次注射，分析各稀釋液。試樣係以三份複製製成(得自儲備試樣溶液之三份獨立稀釋液)，並以一次注射，分析各稀釋液。
使用BIACORE C軟體開始分析 ：開啟BIAcore C控制軟體，並選擇檔案 －>計劃 －>已發表 －>8164 －2 －>濃度分析能手(wizard) ，點選"下一個 "，並選擇適於欲被進行分析之已發表樣板，例如"CTLA4A29YL104E －Ig試樣濃縮分析.blw"。進入針對所計劃分析之最高試樣數目。此試樣數目包括複製，因此例如分析以三份複製之8種試樣，應進入數目24。選擇流動細胞(1－4)，B7.1Ig配位體係固定於其上。點選"下一個 "，並進入試樣ID、稀釋因數及複製數目。點選"下一個 "，並檢查小玻瓶位置。此時小玻瓶之位置可被移動至所要位置。點選"下一個 "，並在"準備分析"螢幕上確認關於檢測之安裝與選擇。點選"下一個 "以向下捲動。將標準物、QC、再生作用溶液及測試試樣放置在適當位置中。點選"開始 "以起動分析。
數據評估. 起動BIAcore C軟體，並開啟所產生之BIAcore檔案＊＊＊ .blr。然後，從"視圖 "清單選擇"能手(wizard)結果 "，以評估數據。
關於B7.1Ig表面之標準 被固定在經活化流動細胞上之B7.1Ig之質量，係以RU(共振單位)表示。表面質量應在3000至9000 RU之間，以提供最適宜檢測性能。若表面質量並未符合此標準，則可施行活化作用時間(EDC/NHS注射)或B7.1Ig濃度之調整，而另一個流動細胞可被固定化。若具備所有其他接受標準，則其他表面密度可為可接受的。
基線漂移之標準 各操作之基線漂移係以在各循環相對於配位體之經固定表面質量間之基線("絕對回應值")之百分比變化計算。在任兩個操作循環間之最大百分比變化必須≦5.0%。例如：若基線在循環20下＝13500 RU，基線在循環23下＝13650 RU，且B7.1Ig表面密度＝6000 RU，則基線漂移＝(13650－13500)/6000 x 100＝2.5%。
關於標準物之標準 標準係適用於標準曲線濃度，在於或高於500毫微克/毫升下。數值在各斜率值下，於用以測定標準曲線之各標準濃度下之變易係數(% CV)必須在±10%內。在各標準濃度下之平均經計算濃度數值(毫微克/毫升)必須在標的(額定)值之15%內。可將經計算濃度與標的(額定濃度)間之差異除以標的(額定)濃度，並乘以100。例如，在標準500毫微克/毫升下，BIAcore C經計算之濃度為510毫微克/毫升。%偏差係按下述計算而得：(510毫微克/毫升－500毫微克/毫升)/500毫微克/毫升x 100%＝2.0%。
關於QC試樣之標準：各QC試樣標的濃度之三份複製經計算濃度值之% CV必須在±10%內。對於九次QC測定之至少七次，QC試樣結果必須在其個別標的數值之±15%內。於2500毫微克/毫升含量下，在第一個與最後一個QC注射之間，於斜率值上之差異必須在±5.0%內。例如，第一個斜率值為10.366 RU/s，而最後一個斜率值為10.230 RU/s，百分比差異係如下：(10.366－10.230)/10.366 x 100%＝1.3%
關於測試試樣之標準 關於各試驗試樣標的濃度所獲得三份複製觀察之% CV必須在20%內。關於試樣之斜率值必須在方法之範圍內：在品質控制試樣1下之平均斜率≦試樣之平均斜率≦品質控制試樣3之平均斜率。
試樣結果計算 為測定測試試樣相對於CTLA4A29YL104E －Ig物質之百分比結合，各試驗試樣之濃度值係以毫微克/毫升計算自標準曲線。BIAcore儀器配置之結果能手(wizard)係計算未經稀釋試樣中之CTLA4A29YL104E －Ig濃度，以毫克/毫升表示，以針對各試樣進入之稀釋因數為基準。
測定百分比結合：可將關於各所測試試樣之經計算平均濃度值，乘以100，並除以試樣之經報告蛋白質濃度，當藉由在280毫微米(A280 )下度量之吸光率測定時。此數值可接著以相對於標準試樣之百分比結合，報告至最接近整數。例如，將試樣藉由稀釋因數12,500(試樣蛋白質濃度為大約25毫克/毫升)稀釋。得自試樣三份複製注射之經計算平均CTLA4A29YL104E －Ig濃度為25.3毫克/毫升。關於試樣之A280 為24.2毫克/毫升。相對於標準試樣之經計算百分比結合可如下述：25.3毫克/毫升/24.2毫克/毫升x 100%＝104.545%。
CTLA4A29YL104E －Ig固定化作用能手(wizard)樣板
實例42：在CTLA4－Ig之碳水化合物分析數據與藥物動力學數據間之關聯性
於CTLA4－Ig上之碳水化合物結構係在CTLA4－Ig治療組合物之藥物動力學(PK)上扮演一項重要角色。數種分析方法已被發展，以特徵鑒定此等碳水化合物結構。兩個分析參數良好地與清除速率有關聯：唾液酸(NANA)對CTLA4－Ig蛋白質比例，與得自碳水化合物分佈形態之百分比功能部位III與IV。第三個參數(得自單醣分析之半乳糖對甘露糖比例)亦顯示良好地產生關聯。例如，此等參數之規格可為：NANA：CTLA4－Ig蛋白質比例 ＝8.0碳水化合物分佈形態 功能部位III與IV＝25%(方法1)半乳糖：甘露糖比例 ＝0.65
在CTLA4－Ig發酵過程中之重要步驟可為採集參數之選擇，其將使包含本文所指定特徵之最後產物產率(滴定度)達到最大程度(參閱表6)。此等參數(NANA：蛋白質比例)之一係足夠快速且正確以作為採集參數之一使用。NANA對CTLA4－Ig蛋白質之標的莫耳比為約8.0，可確保大部份採集物將具有NANA比例>7.0。在純化期間之加強作用，可接著產生具有NANA比例>9.0之CTLA4－Ig分子。
CTLA4－Ig為具有數個N－連結與O－連結糖基化作用位置之糖蛋白。N－連結碳水化合物結構典型上為雙－或三－天線，且若充分經唾液酸基化，則以碳水化合物NANA－Gal－GlcNAc末端化。大部份分子僅經部份唾液酸基化，且含有一些以Gal或GlcNAc末端化之碳水化合物鏈。末端唾液酸(NANA)殘基之不存在為會導致增加自血流曝露速率之一項因素。在此實例中，係呈現數據，顯示末端半乳糖亦提供一些保護免於快速清除。
用以評估糖基化作用之主要參數為NANA：CTLA4－Ig蛋白質莫耳比。猴子PK研究已証實可接受之清除率可使用具有NANA比例為6.9之CTLA4－Ig分子達成。於猴子中測試之方法Y CTLA4－Ig物質(得自Y方法之CTLA4－Ig組合物)之第一個批號具有NANA比例為7.1。令人驚訝的是，已發現明顯兩倍快速地如具有NANA比例為6.9之CTLA4－Ig物質。兩個試樣之單醣分析之回顧，顯示X製程物質顯著地具有較多半乳糖，勝過CDCHO製程物質。一種方法已被發展，其係包含半乳糖於進料中(CDCHO1)。藉此方法所製成之CTLA4－Ig具有較高含量之半乳糖與唾液酸兩者，相較於Y製程物質。關於得自CDCHO1方法之物質之分析與PK數據係討論於下文，並與方法Y及方法X物質作比較。
分析方法 碳水化合物分佈形態檢測包括整個碳水化合物結構之酵素移除，及其藉由陰離子交換層析之分離。碳水化合物吸收峰係解析成四或五個群集體("功能部位")，大部份以唾液酸殘基在各結構中之數目為基礎。功能部位I係大部份被非唾液酸基化，功能部位II係被單唾液酸基化，功能部位III係被二－唾液酸基化，功能部位IV係被三－唾液酸基化，而功能部位V係被四－唾液酸基化。在各吸收峰或功能部位下之面積可以所有吸收峰下總面積之百分比測定並報告。
清除速率係經由使用10毫克/公斤之CTLA4－Ig，以三份複製注射猴子，然後，追蹤血清濃度上之降低，歷經28－天期間而測得。清除速率係關於經度量之"曲線下方面積"或AUC。AUC係關於清除率，較高清除速率係關於較小AUC，而較低清除速率係關於較大AUC值。較高數值表示CTLA4－Ig之較緩慢清除率。
圖48描繪哺乳動物蛋白質中所發現之許多N－連結碳水化合物結構中之數種。所有鏈係共用一種含有兩個GlcNAc與三個甘露糖殘基之共同核心結構。自此核心，兩個至四個鏈係向外延伸，包括三種結構之一：－GlcNAc－Gal－NANA、－GlcNAc－Gal或－GlcNAc(圖48，結構(1)、(2)及(3))。假設末端唾液酸(NANA)係負責降低蛋白質自血流之清除率。令人驚訝的是，CTLA4－Ig之清除速率係在猴子PK研究中加倍(表56)，即使NANA比例仍然保持相同亦然(表56－試樣CTLA4－Ig S1與CTLA4－Ig(－)Gal，個別地在圖51－52中)。在不同培養基中製備之試樣間所發現之一項差異是半乳糖－對－蛋白質莫耳比，其在藉方法X所製成之試樣中係顯著較高，勝過藉由方法Y(CTLA4－Ig)者。這指出清除速率主要是藉由末端GlcNAc殘基決定，而末端半乳糖可能提供一些保護。為增加CTLA4－Ig之半乳糖基化作用，係將半乳糖添加至Y方法之進料中。新穎方法(CD－CHO1；CTLA4－Ig S2在圖51－52中)係顯著增加CTLA4－Ig在生物反應器中之半乳糖與NANA莫耳比兩者。
已進行進一步猴子PK研究。其已包括藉由三種不同方法所製成之CTLA4－Ig產物(方法X、方法Y及CD－CHO1方法；CTLA4－Ig S1、CTLA4－Ig(－)Gal及CTLA4－Ig S2個別地在圖51－52中)。此外，具有極低NANA比例之CTLA4－Ig(自純化程序中之洗滌步驟回收；參閱圖60)已被測試。得自所有迄今已測試試樣之分析與PK數據，係被收集在表56中。在最近PK研究(表56)中，係評估製自長期方法Y發酵操作之CTLA4－Ig(CTLA4－Ig S3)。
圖49顯示四項研究中關於所有試樣之NANA比例與猴子PKAUC數值間之關聯性。藉由Y方法(參閱圖49中之CTLA4－Ig(－)Gal)與CD－CHO1方法(在圖49中之CTLA4－Ig S2)所製成之試樣，顯示此等參數間之強關聯性，這指出NANA比例對CTLA4－Ig之清除速率具有顯著衝擊。關於此等點之趨勢線之分析顯示在NANA＝9下，藉由Y(CTLA4－Ig(－)Gal)或CDCHO1(CTLA4－Ig S2)方法製成之CTLA4－Ig將在與方法X物質CTLA4－Ig S1約相同速率下清除。降低NANA比例至8，會降低猴子PK中之AUC達約25%，然而增加比例至10會增加AUC達約25%。雖然在Y(CTLA4－Ig(－)Gal)與CD－CHO1(CTLA4－Ig S2)方法之環境內，在NANA與AUC之間有強關聯性，但重要的是記住NANA＝7，對於X物質(CTLA4－Ig S1)，具有相同清除速率，如具有NANA比例為9之CD－CHO1物質(CTLA4－Ig S2)。因此，NANA比例並非僅僅負責決定CTLA4－Ig之清除速率。
表56. CTLA4－Ig之碳水化合物評估. M－1表示CTLA4－Ig物質係使用方法1分析，M－2表示CTLA4－Ig物質係使用稍微不同之方法2分析。"PA"表示物質係為來自發酵肉湯之蛋白質A－純化試樣。
進行另一種猴子PK研究(表56)，以比較藉由三不同方法(方法X、方法Y及CD－CHO1方法)所製成CTLA4Ig之清除速率。此外，具有極低NANA比例之CTLA4Ig(自純化程序(PA)中之洗滌步驟回收)係被包含在此研究中。藉由CDCHO方法，在無論是50升或5000升生物反應器中所製成之CTLA4Ig具有NANA莫耳比接近X製程物質，而在PK研究中，兩者均具有AUC值為方法X值之約一半。藉由CD－CHO1方法所製成之CTLA4Ig具有較高NANA比例，勝過方法X物質(9.9對6.9)，且AUC值約30%較高，顯示較緩慢之清除速率。不良唾液酸基化與半乳糖基化之洗滌物質(NANA＝2.3)係極端快速地清除(AUC＝2337小時－微克/毫升對方法X物質之15753)。
另一項猴子PK研究(表56)係比較藉由CD－CHO1方法於5,000升生物反應器中製成，及在不同天採集之CTLA4Ig。在發酵操作之過程期間，NANA比例典型上係在約第8天達到最高峰，然後逐漸下降。自兩次操作，於第12、14及16天移除液份，接著純化。於純化後，NANA比例範圍涵蓋從8.8至10.0。第12與14天試樣(NANA個別＝9.8與10.0)具有AUC值20－30%高於方法X物質。第16天試樣(NANA＝8.8)具有AUC值幾乎與方法X物質相同。
評估CTLA4－Ig之糖基化作用之另一種分析工具為碳水化合物分佈形態。整個N－連結之碳水化合物結構係以酵素方式移除，並藉由陰離子交換HPLC分離。產生極大數目之吸收峰，其係解析成四或五個功能部位(參閱圖58－62)。功能部位I與II係大部份為非唾液酸基化與單－唾液酸基化結構，而功能部位III與IV及V係大部份為二－與三－及四－唾液酸基化結構。
於經驗上發現在功能部位III與IV中之總分佈形態之百分比，係良好地與所有試樣，包括方法X物質之AUC有關聯(圖48)。預期在此等功能部位中之大部份結構係充分地經唾液酸基化與半乳糖基化。使用得自M－1組群之數據，約29%之功能部位III與IV百分比應具有與方法X物質相同之清除速率。得自方法2之功能部位III與IV數據典型上為約4%低於(21%對25%)藉由方法1所產生之數據。
此外，亦發現功能部位I與II中總分佈形態之百分比係良好地與所有試樣之AUC有關聯(圖55)。預期在此等功能部位中之大部份結構係大部份為非唾液酸基化與單－唾液酸基化之結構。圖55顯示清除速率在具有較低百分比之功能部位I與II之試樣中，相對於具有較高百分比之功能部位I與II之試樣，係為較高。功能部位I與II之經降低糖基化作用係與在功能部位III與IV中糖基化之肽之推測上增加存在有關聯。
雖然唾液酸對蛋白質莫耳比已於傳統上被用以預測CTLA4Ig之清除速率，但不同發酵培養基已在猴子PK研究中產生具有相同NANA比例但不同清除速率之分子。為發展更良好方式以預測清除速率，係評估兩組其他分析數據(單醣分析與碳水化合物分佈形態)，並與猴子PK數據比較。最具預測性之分析參數為CTLA4Ig之半乳糖基化作用程度。為減少此項檢測之分析變異性，係使半乳糖莫耳比正規化至甘露糖莫耳比。所形成之Gal：Man比例係良好地與對於所有試樣，包括方法X物質，得自猴子PK研究之AUC結果有關聯。此結果係與CTLA4Ig之清除速率係主要由分子上外露末端GlcNAc殘基之數目所決定之模式一致。若此模式為正確，則半乳糖基化作用之程度應預測清除速率而比唾液酸基化作用更良好。為確保藥物動力學可比較性(得自X方法之物質之AUC>75%)，關於半乳糖對甘露糖比例Gal：Man>0.65之規格係對經純化之整體CTLA4－Ig藥物(BDS)建議。
當只有藉由Y方法或CD－CHO1方法所製成之物質被分析時，NANA對蛋白質莫耳比可精確地預測清除速率。但是，此關係並不適用於藉由X方法所製成之物質。為可比擬X製程物質，藉由Y方法或CD－CHO1方法所製成之CTLA4－Ig必須具有NANA比例較高2單位(對CD－CHO1之NANA＝9係可比擬X製程物質之NANA＝7)。由於此唾液酸檢測係為正確，且具有快速轉向時間，故其可作為進行中分析工具使用，以在發酵操作期間監測CTLA4Ig之品質。
為保持可比擬藥物動力學(參考物之AUC>75%)，NANA>8之規格係對經純化之BDS建議。此數值亦表示關於採集發酵操作之合理標的。由於純化方法可增加唾液酸比例達至少2個單位，故設定採集標的在NANA＝8，將確保實際採集值為至少NANA＝7。純化方法可增加此數值到至少NANA＝9，其係可比擬方法X物質，且遠高於前文所提及BDS之建議最低規格。
在將功能部位III與IV下之面積百分比與此AUC比較時，碳水化合物分佈形態亦對方法X物質與方法Y物質兩者良好地預測猴子PK結果。功能部位III與IV大部份係由完全唾液酸基化與半乳糖基化碳水化合物結構所組成。
在表56中之數據可進一步呈現以顯示AUC值、NANA值、Gal值及功能部位II與IV之AUC總和之總百分比間之關聯性。參閱下文：
上文此表顯示在功能部位III(與IV)之總和與組合物之PK結果之間有關聯性。功能部位III與IV及V之AUC係直接相關於NANA與Gal對CTLA4－Ig蛋白質莫耳之莫耳比。因此，本發明係提供組合物，其特徵在於其碳水化合物分佈形態含有功能部位III與IV之總和，或功能部位III、IV及V之總和為18至約37 AUC%。於一項具體實施例中，功能部位II、IV及V之總和為約19至約36、約20至約35、約21至約34、約22至約33、約23至約32、約24至約31、約25至約30、約26至約29、約27至約28 AUC%。於一項具體實施例中，本發明係提供CTLA4－Ig組合物，其特徵在於功能部位III具有合計之AUC%為19±4；且功能部位IV具有合計之AUC%為7±4。
實例43：CTLA4－Ig之胰蛋白酶肽定圖譜
衍生自經轉染中國大頰鼠卵巢(CHO)細胞之CTLA4－Ig為具有分子質量大約92500道爾吞之糖蛋白。肽定圖譜為用於測定蛋白質一級結構身分之高度敏感性方法，且可用於偵測轉譯後修改物。此蛋白質係使用胍－HCl變性，還原，及使用DTT與IAA烷基化。此蛋白質係使用NAP－5管柱脫鹽，且消化混合物係藉由逆相(C18)層析分析。吸收峰偵測係藉由215毫微米下之UV吸光率完成。
試劑 ：流動相A溶液(0.02%三氟醋酸(TFA)在水(v/v)中)；流動相B溶液(0.02% TFA在95% ACN(乙腈)與5%水(v/v)中)；烷基化劑(200 mM碘乙醯胺(IAA))；稀緩衝液(100 mM Tris,25 mM NaCl,pH 8.0)；變性緩衝劑(8 M胍,50 mM TRIS,pH 8.0)；消化緩衝劑(50 mM TRIS,10 mM CaCl2 ,pH 8.0)；還原劑(100 mM DTT)。
儀器配置 ：(可使用相當儀器配置)NAP－5管柱(Amersham,目錄#17－0853－02)；HPLC管柱加熱器；Water's Alliance HPLC系統，伴隨著管柱加熱器與UV偵測器。
還原作用與烷基化作用 ：將試樣(例如CTLA4A29YL104E －Ig標準物等)稀釋至10毫克/毫升，其方式是添加水至最後體積為100微升(1毫克)。將560微升變性緩衝劑與35微升還原劑(100 mM DTT)添加至100微升試樣中，混合，並在微離心機中旋轉而下，歷經3秒。然後，將試樣在50℃下培養20分鐘±2分鐘。接著，將35微升烷基化劑(200 mM IAA)添加至各試樣中，並再一次將試樣混合，及在微離心機中旋轉而下，歷經3秒。接著，將試樣在黑暗中，於50℃下培養20分鐘±2分鐘。在NAP－5管柱藉由傾倒3個管柱體積(約7－8毫升)之消化緩衝劑而達成平衡後，將500微升經還原且烷基化之混合物傾倒於NAP－5管柱上，允許液體經過管柱排乾。然後，經由以1毫升消化緩衝劑使試樣溶離出管柱，自NAP－5管柱收集試樣。
消化 ：將試樣以20微升胰蛋白酶(0.5微克/微升)，在38℃水浴中消化4小時(±0.5小時)。於消化完成時，使試樣以2.5微升TFA酸化。然後，將試樣放置在自動取樣器小玻瓶中，以供隨後分析。
儀器方法 ：儀器方法係示於下文：
在第一次注射之前，使管柱以100%流動相A緩衝劑平衡25分鐘。在215毫微米下監測UV吸光率，同時使柱溫保持在37℃下，而自動取樣器溫度在4℃下。在第一個系統適合性標準物之前，係操作流動相A緩衝劑空白試驗，接著為各試樣之單次50微升注射。參考物質注射應每六試樣注射一起進行。關於CTLA4－Ig試樣所產生之肽圖譜層析圖係藉由圖52描繪。關於吸收峰T2、T3、T15及T19(圖51與表57)，在最初與一起進行之參考物質層析圖間之滯留時間差異，必須為±0.5分鐘。
理論板數：以理論板數評估之管柱效率，可根據方程式使用滯留時間與峰寬定量地度量： 其中："w"為藉由將相對較直側面外推至基線所度量之基線下峰寬，"t"為自注射時間至峰頂溶離時間所度量之吸收峰滯留時間。
若N<50000，則使管柱再達成平衡。
解析度 ：在2個吸收峰間之解析度(R)，例如，如圖51中顯示之吸收峰T30與吸收峰T12，可使用下列方程式測得： 其中：t1,t2＝個別為片段吸收峰T30與吸收峰T12之滯留時間w1,w2＝個別具有滯留時間t1與t2之吸收峰，在基線下之切線界定之峰寬。
若R<1.5，則應使管柱再達成平衡，而若問題持續，則應將管柱置換。
標準 ：關於在試驗物件與參考物質中之吸收峰T3、T15及T19，於相對峰面積間之差異必須≦10.0%。吸收峰之相對峰面積係被定義為以吸收峰T2之吸收峰面積之百分比表示之吸收峰面積。在試驗物件與最初系統適合性參考物之相對峰面積間之差異係按下文所示獲得。相對峰面積(RSX )可對試驗物件之層析圖中之各吸收峰T3、T15及T19，利用下式計算：RSX ＝(AsX /AS2 )* 100其中：RSX ＝吸收峰X在層析圖中之相對峰面積ASX ＝吸收峰X在試樣中之面積，及AS2 ＝吸收峰T2在試樣中之面積。
同樣地，相對峰面積(RRX )可對標準物層析圖中之各吸收峰T3、T15及T19計算。在試樣與標準物中之相對峰面積間之差異(DX)可隨後利用下式計算：DX ＝[(RSX －RRX )/(RRX )]* 100
若單一其他吸收峰係存在於試樣中，則該吸收峰之相對峰高，當與吸收峰T11比較時，可利用下式測定：相對峰高RT ＝(HT /H11 )* 100，其中HT ＝具有滯留時間t分鐘之吸收峰之高度H11 ＝吸收峰T11 之高度，層析圖中之最高吸收峰
於一項具體實施例中，若新吸收峰之相對峰高係≦5.0%，則分佈形態係被視為與CTLA4－Ig標準物之分佈形態一致。若新吸收峰之相對峰高係>5.0%，則分佈形態係被視為未與CTAL4－Ig標準物質之分佈形態一致。
百分比氧化作用數據係利用RP－HPLC胰蛋白酶定圖譜檢測獲得，其係定量蛋白質中之Met85氧化成甲硫胺酸亞碸之面積百分比。於此方法中之百分比氧化作用，係藉由度量RP－HPLC胰蛋白酶圖譜中之UV吸收峰面積而獲得，關於T6胰蛋白酶肽，由含有Met85之殘基84－93所組成，及其相應之氧化胰蛋白酶肽T6ox，含有Met(O)85。Met85氧化成Met(O)85之面積百分比係與T6ox吸收峰之面積百分比成正比：百分比氧化作用＝100 * AT6ox /(AT6ox ＋AT6 )其中，AT6 ＝T6胰蛋白酶肽(84－93)之吸收峰面積AT6ox ＝T6ox胰蛋白酶肽Met(O)85 (84－93)之吸收峰面積
百分比脫醯胺作用數據係利用RP－HPLC胰蛋白酶定圖譜檢測獲得，其係定量檢測中脫醯胺作用之面積百分比，藉由度量RP－HPLC胰蛋白酶圖譜中之UV吸收峰面積而獲得，關於T26胰蛋白酶肽，由含有Asn294之殘基281－302所組成，及其相應之脫醯胺酸化胰蛋白酶肽T26deam1，含有isoAsp294。於是，Asn294之脫醯胺作用成為isoAsp294之面積百分比係與T26deam1吸收峰之面積百分比成正比： 其中，AT26 ＝T26,(281－302)之吸收峰面積AT26deam1 ＝T26deam1,isoAsp294 (281－302)之吸收峰面積AT26deam2 ＝T26deam2,Asp299 (281－302)之吸收峰面積AT26deam3 ＝T26deam3,Asp294 (281－302)之吸收峰面積AT26deam4 ＝T26deam4,Asu294 (281－302)之吸收峰面積
實例44：CTLA4－Ig N－連結之寡醣碳水化合物藉由高性能陰離子交換層析與電化學偵測之形態剖析
存在於糖蛋白上之碳水化合物結構可影響其功能與活體內清除率。因此，重要的是監測以重組方式製成之糖蛋白批料之碳水化合物之結構一致性。CTLA4－Ig為含有N－連結與O－連結(絲胺酸－連結)糖基化件用位置兩者之重組蛋白質。此處，存在於CTLA4－Ig上之N－連結(天冬素－連結)碳水化合物係被監測。於此方法中，寡醣係以PNGase F(肽：N－糖苷酶F)經由酵素消化而被分裂，然後藉由逆相HPLC在二管柱系統中單離，藉由高性能陰離子交換層析(HPAEC)分離，及藉由電化學偵測(整合電流測定法)監測。所產生之層析圖為N－連結碳水化合物分佈形態，其中CTLA4－Ig試樣之分佈形態應類似此種。
此方法係描述測定從CTLA4－Ig試樣釋出之N－連結寡醣之HPAEC寡醣分佈形態之程序。此方法之目的係為提供阿巴塔謝特藥物N－連結寡醣之層析分佈形態，其可用於其間之比較分析。在CTLA4－Ig上之糖基化作用係含有N－連結之寡醣。此等寡醣係以PNGase F，藉由酵素水解，在22小時期間內釋出。自由態寡醣係使用高pH陰離子交換層析，採用電化學偵測進行形態剖析。藥物之寡醣分佈形態係對著參考物質之共同操作試樣評估。結果係以參考標準物中得自相同吸收峰之經選擇功能部位與吸收峰之百分比偏差作報告。
物料. 相當物料可經取代，除非另有指明。
儀器配置與條件. 可使用相當儀器配置，除非另有指明。
儀器配置：
藉由陰離子交換層析之寡醣分佈形態之層析條件 註：使管柱與偵測器，在分析流率下，以最初流動相達成平衡，歷經大約2小時，或直到在製造注射液之前基線為安定為止。
自動取樣器溫度設定為：4℃注射體積 60微升操作時間 100分鐘於各功能部位中之主吸收峰之大約滯留時間(RT；分鐘)(參閱圖1)；數值可依系統適合性(SS)標準物之RT而改變
電極清洗(Waters 2465). 按照偵測器手冊中之清洗說明書。使用流動元件套件中所提供之金剛石漿液，以拋光電極之表面。若拋光並未產生可接受之結果，則以新流動元件套件替代電極。使用隔體(50微米)重建流動元件。
試劑. 註 ：根據部門程序標識且考証所有試劑製備。
供HPAEC寡醣碳水化合物形態剖析用之流動相之製備。
HPAEC 溶離劑1：500 mM醋酸鈉(NaOAc)。稱量20.51±0.05克醋酸鈉(無水)至含有400毫升HPLC級水之500毫升量筒中。以HPLC級水使體積來到500毫升，並使用塑膠血清學吸量管攪拌5分鐘，直到完全混合為止。使溶液經過0.2微米尼龍濾器過濾。轉移至1升溶離劑瓶。將瓶鬆散地加蓋，並以氦噴射20分鐘。束緊蓋子，並以氦加壓瓶子。將此溶液於室溫及氦下儲存至高三週。
HPAEC 溶離劑2：400 mM氫氧化鈉(NaOH)。使用1升量筒，度量960毫升HPLC級水，並轉移至乾淨1升溶離劑瓶。使用血清學塑膠吸量管，將40.0毫升10 N NaOH直接添加至溶離劑瓶中，並藉由漩渦打轉混合溶離劑。將瓶鬆散地加蓋，並以氦噴射20分鐘。束緊蓋子，並以氦加壓瓶子。將溶液於室溫及氦下儲存至高三週。
HPAEC 溶離劑3：HPLC級水。將1升溶離劑瓶以大約1升HPLC級水充填。將溶離劑瓶放置在系統上，鬆散地加蓋，並噴射大約20分鐘。束緊蓋子，並以氦加壓瓶子。將溶液於室溫及氦下儲存至高三週。
50 mM磷酸鈉緩衝劑，0.02%疊氮化鈉，pH＝7.5.應小心處理疊氮化鈉(NaN3 )，以避免吸入(有毒性)及與皮膚接觸(刺激性)。查閱MSDS工作單關於其他需要。在稱量NaN3 之後，天平區域應經微底清潔過。
NaH2 PO4 ．H2 O 6.9克NaN3 0.2克H2 O 1.0升最後體積
稱量出6.9克±0.1克NaH2 PO4 ．H2 O與0.2克NaN3 ，並在1升試劑瓶中，溶解於800毫升HPLC級H2 O內，使用以磁攪拌棒之連續混合。使用pH計，將溶液之pH值使用10M NaOH調整至7.5。使用1升量筒使最後體積來到1.0升。將溶液在室溫下儲存至高六個月。在50 mM磷酸鈉緩衝劑、0.02%疊氮化鈉pH＝7.5中之PNGase F酵素工作儲備液。
50 mM磷酸鈉緩衝劑0.02%疊氮化鈉，pH＝7.5. 1.8毫升得自套件之PNGase F，目錄編號P0704L 0.2毫升
將1.8毫升50 mM磷酸鈉緩衝劑,0.02%疊氮化鈉,pH 7.5以吸量管吸取至1.8毫升低溫小玻瓶中。添加0.2毫升得自套件之PNGase F，並充分地混合。將溶液於－20℃或較低下儲存至高六個月。溶液可在冷凍之前被分成數液份。
外部系統適合性標準物. 水蘇四糖儲備溶液(1.25毫克/毫升)：將0.125克水蘇四糖於稱量紙上稱量。使用分析天平，並轉移至100毫升量瓶。以HPLC級水充填至記號處，並充分地混合。以2毫升數液份，分至Nalgene低溫小玻瓶中。將溶液於－20℃或較低下儲存至高六個月。
水蘇四糖系統適合性標準物(12.5微克/毫升)：將1毫升1.25毫克/毫升儲備液以吸量管吸取至100毫升量瓶中。以HPLC級水充填至記號處，並充分地混合。以200微升數液份分至0.65毫升微離心管件中。將管件放置在經適當標識之儲存箱中。將系統適合性溶液於－20℃或較低下儲存至高六個月。
標準物與試樣製備 參考物質製備. 於含有1毫克經凍乾RapiGest Sf之小玻瓶中，添加含有0.02%疊氮化Na,pH 7.5之625微升50 mM磷酸Na緩衝劑。註：應將含有RapiGest SF單一匯集庫之緩衝劑用於試樣組內之所有試樣。RapiGest SF之數個小玻瓶可經重配並合併，以提供適當體積。於0.65毫升Eppendorf管件中，添加120微升含有RapiGest SF之緩衝劑。添加40微升參考物質(~50毫克/毫升)。最後RapiGest SF濃度應為0.12% w/v。添加40微升PNGase F工作儲備液，充分地混合，使試樣旋轉而下，並在38±2℃下放置22±2小時(水浴或Alliance自動取樣器隔室)。將試樣以吸量管吸取至microcon YM－10離心濾器中，並在13,000克下離心30分鐘。將200微升HPLC水放置在濾器中，並經由在13,000克下再離心30分鐘沖洗至濾液中，使合併之濾液渦旋15秒，並使試樣離心10秒。使用吸量管，將所形成之溶液(~380微升)轉移至HPLC總回收自動取樣器小玻瓶。
試樣製備：於0.65毫升Eppendorf管件中，添加120微升含有RapiGest SF之緩衝劑。添加40微升蛋白質試樣(此體積應等於1與2毫克間之CTLA4－Ig)。最後RapiGest SF濃度應為0.12% w/v。添加40微升PNGase F工作儲備液，藉由渦旋10秒充分地混合。使試樣旋轉而下，並在38±2℃下放置22±2小時(水浴或Alliance自動取樣器隔室)。將試樣以吸量管吸取至microcon YM－10離心濾器中，並在13,000克下離心30分鐘。將200微升HPLC水放置在濾器中，並經由在13,000克下再離心30分鐘沖洗至濾液中，使合併之濾液渦旋15秒，並使試樣離心10秒。將所形成之溶液(~380微升)轉移至總回收HPLC自動取樣器小玻瓶。
系統適合性 電化學偵測器細胞安定化作用：注射30微升水蘇四糖系統適合性標準物(12.5微克/毫升)。確保水蘇四糖之峰高係≧800 nA。確保沒有過度電噪音來自元件，且基線為平坦。若水蘇四糖敏感性或基線為無法令人接受，則檢查緩衝劑組合物，清潔電極或置換電極。若存在過量噪音，則檢查元件以確保移除所有氣泡。使元件再安定化，並再注射水蘇四糖標準物。若問題持續，則採取其他適當動作或聯絡管理者。
理論板數(N)：使用下文方程式測定理論板數(N)，以水蘇四糖吸收峰為基礎。此係經過Empower數據分析系統達成，或亦可以手動方式達成。
N＝16(t/W)2 其中： t：自注射時間至最高高度下之吸收峰溶離時間所度量之滯留時間W：藉由側面外推至基線之峰寬N必須≧6000。若板計數係低於6000，則調整操作梯度液或置換管柱
拖尾因數(t)：使用下文方程式測定管柱拖尾因數(t)，以水蘇四糖吸收峰為基礎。此係經過EMPOWER數據分析系統達成，或亦可以手動方式達成。
T＝(W0.05 /2f)其中： W0.05 ：在5%高度(0.05h)下之峰寬f：從W0.05 下之吸收峰前方邊緣至吸收峰頂端之度量值(寬度)
T必須≦1.2。若拖尾因數係大於1.2，則檢查緩衝劑組合物，置換管柱或清理管柱，及再注射系統適合性標準物。
水蘇四糖系統適合性標準物滯留時間証明：滯留時間為系統依存性。水蘇四糖系統適合性標準物應顯示滯留時間為18.5±2.0分鐘。
CTLA4－Ig參考物質－觀察得自試樣注射前所注射之第一個一起進行之參考物質之碳水化合物分佈形態。此碳水化合物分佈形態應類似圖66中所示者。絕對滯留時間係為系統依存性。確保功能部位I中之第一個吸收峰(吸收峰1A)與功能部位III中之主峰(吸收峰3)間之滯留時間上之差異係在22分鐘與28分鐘之間。若吸收峰之描繪圖未相似圖66中所獲得者，則採取適當動作(例如檢查儀器功能，清理管柱，檢查/置換緩衝劑，置換管柱)，且再評估。下述程序可用以清理管柱：關閉元件，並清理管柱，以80%溶離劑1、20%溶離劑2，歷經5分鐘，接著為50%溶離劑1、50%溶離劑2，歷經10分鐘。使管柱與元件(並起動元件)在最初條件下再達成平衡，且再評估。
注射順序： 按下述設立經單離寡醣之注射順序：水蘇四糖標準物(30微升)參考物質(60微升)試樣(60微升)參考物質(60微升)
建議應≦五個試樣在一起進行之參考物質注射之間操作。
數據分析 ：處理層析圖. 在EMPOWER中處理關於參考物質與試樣之層析圖。設定整合參數，以致使吸收峰描繪圖與基線係類似圖66中所示者，整合線可能需要以手動方式放置。對相對功能部位面積與相對峰面積進行計算(參閱被包含在圖66簡述及此實例末端之表)。若施行複製注射，則測定關於參考物質與各試樣之此等參數之平均值。
關於參考物質，對於功能部位I、II、III、吸收峰1A及1B，對各複製測定相對於所有複製平均之相對偏差。
試樣分佈形態對參考物質分佈形態之比較。
若試樣與參考物質兩者具有相同數目之功能部位與一級吸收峰，則目視比較測定。一級吸收峰為圖66之說明中所標識之吸收峰(吸收峰1A、1B、1C、1D、2、3及4)。相對定量比較. 將試樣之相對面積(功能部位I、II及III，以及吸收峰1A與1B；若複製注射係製自試樣，則使用其平均值)與得自一起進行之參考物質注射之平均相對面積作比較。測定得自平均參考物質數值之此等面積之相對差異。
計算. %功能部位面積(相對功能部位面積)：計算參考物質與試樣分佈形態之功能部位之%功能部位面積。參考圖66關於功能部位面積之圖樣。按照圖66中之實例，利用下文資訊與公式計算功能部位百分比例(滯留時間為系統依存性，且反映出圖66中之結果)：功能部位I：在大約滯留時間18－24分鐘下之吸收峰面積總和(吸收峰1A－1E)功能部位II：得自26－38分鐘之吸收峰之總和功能部位III：得自39－50分鐘之吸收峰之總和功能部位IV：得自51－64分鐘之吸收峰之總和功能部位V：得自65－75分鐘之吸收峰之總和
註 ：關於功能部位之滯留時間窗口，將根據每日層析性能上之偏差而移轉。據此調整時間。
對於功能部位I－III，若施行複製注射，則亦計算一起進行之參考物質，以及在試樣中之注射平均值。
%吸收峰面積(相對峰面積). 計算關於參考物質與試樣分佈形態之吸收峰1A、1B、1C及3之%吸收峰面積。參考圖66關於吸收峰面積之圖樣；滯留時間為系統依存性。利用下文資訊與公式計算吸收峰百分比例：
對於各吸收峰1A與1B，若施行複製注射，則亦計算一起進行之參考物質注射以及試樣中之平均值。
計算得自平均參考物質數值之百分比差異。使用下式以計算試樣與參考物質比較之功能部位I－III、吸收峰1A及1B之平均相對面積上之百分比差異：% Diff＝|RM－S|/RM x 100其中： RM＝關於參考物質之吾人感興趣之平均相對面積數值S＝關於試樣之吾人感興趣之平均相對面積數值||＝絕對值
結果：欲被報告之結果為關於功能部位I、功能部位II、功能部位III、吸收峰1A及吸收峰1B，與參考物質之經計算百分比差異。包括關於參考物質與試樣兩者之經整合代表性層析圖。包括對試樣與參考物質兩者之功能部位I－III與吸收峰1A及1B之相對面積百分比(一起進行之注射之平均)，至一個百分比之十分之一。此外，對各一起進行之參考物質注射，關於功能部位I、II及III之%功能部位面積，與關於吸收峰1A與1B之%吸收峰面積，應在其平均值之15%內。
圖55－60、66、74及80－82顯示得自N－連結寡醣分佈形態之所形成數據，如本文中所述。圖66描繪典型N－連結之寡醣分佈形態(功能部位I、II、III、IV及V，以及吸收峰1A與1B，在批號平均之5%內)。吸收峰1A、1B及1C表示G0、G1及G2之非唾液酸基N－連結寡醣結構。
圖66顯示CTLA4－Ig組合物之典型N－連結碳水化合物分佈形態。
正上方之表顯示CTLA4－Ig之N－連結寡醣分佈形態之表列數據。
正下方之表顯示所發現之CTLA4－Ig範圍。
實例45：關於CTLA4－Ig之活體外細胞為基礎之生物檢測
T細胞需要兩個訊息，供活化作用與後續增生。第一個訊息係藉由抗原肽與TCR－CD3複合物之交互作用所提供。第二個共刺激訊息係隨著T細胞上之CD28與抗原呈現細胞上之B7蛋白質間之交互作用而發生。於收到此兩個訊息時，T細胞會分泌細胞活素間白血球活素2(IL－2)。IL－2之釋出會導致細胞活化作用與增生。CTLA4－Ig，一種可溶性免疫壓抑化合物，亦會結合至抗原呈現細胞上之B7蛋白質，因此阻斷與CD28之功能性交互作用，且防止IL－2生產所必須之共刺激訊息。
於此方法中，以蟲螢光素酶基因，於IL－2啟動子之控制下轉染之Jurkat T細胞，係與Daudi B細胞，於抗－CD3存在下共刺激。共刺激會活化IL－2啟動子，其依次產生蟲螢光素酶蛋白質。所形成之發光信號係使用蟲螢光素酶檢測系統度量。在此系統中，CTLA4－Ig會產生蟲螢光素酶活性上之劑量依賴性降低。
此方法係檢驗CTLA4－Ig對IL－2生產所需要之共刺激訊息之影響。可溶性CTLA4－Ig之存在係阻止T細胞與抗原呈現細胞間之發出訊息。無此訊息，IL－2不會被製成，因此防止T細胞之無性繁殖擴大。具有蟲螢光素酶基因之載體係使用IL－2啟動子產生。Jurkat T細胞係接著以此報告子載體轉染。陽性無性繁殖系，Jurkat.CA，係經選擇，並使用於此方法中。
此生物檢測係涉及以抗－CD3與B細胞(Daudi)刺激經轉染之T細胞(Jurkat.CA)。藉由B細胞所提供之共刺激係藉由添加CTLA4－Ig而被抑制。Jurkat.CA與Daudi細胞係被接種至96井白色不透明平底板之井中，並以抗－CD3於不同濃度之CTLA4－Ig存在下刺激。在37℃下培養16至20小時後，係檢測此等井關於蟲螢光素酶活性。共刺激作用藉由CTLA4－Ig之抑制係被視為蟲螢光素酶活性上之劑量依賴性減少。
試劑 ：Daudi細胞培養基(10%牛胎兒血清,1% MEM丙酮酸鈉在RPMI 1640中)；Jurkat.CA細胞培養基(10%小牛血清,1% MEM丙酮酸鈉,400微克/毫升基因素在RPMI 1640中)；生物檢測培養基(0.2微克/毫升抗－CD3抗體與1%青霉素－鏈霉素溶液在Daudi細胞培養基中)；明亮－Glo蟲螢光素酶溶液檢測系統(Promega,目錄#E2620)。
儀器配置 ：Nikon,Diaphot 200倒置顯微鏡；Packard TopCount NXT發光計；Tecan Genesis液體處理器；Coulter Vi－Cell細胞計數器；Zymark RapidPlate－96。
工作溶液之製備 ：3毫升CTLA4－Ig溶液(5000毫微克/毫升)在生物檢測培養基中。
對於標準物、品質對照組及試樣製備八點曲線，在濃度為100、4、2、1、0.5、0.2、0.1及0.002微克/毫升CTLA4－Ig下，如下表58中所示，關於檢測中之最後濃度，於兩倍稀釋至板中之後，為50、2、1、0.5、0.25、0.1、0.05及0.001微克/毫升。
96井板之每井添加200,000個細胞，並在37℃，5%CO2 及85%濕度下培養。將12 x 106 個Jurkat.CA細胞與12 x 106 個Daudi細胞合併在無菌離心管中。使細胞在室溫下，於~125 x克下離心10分鐘，並充分地再懸浮於9毫升Daudi細胞培養基中，其方式是溫和地以血清學吸量管重複吸取，直到沒有細胞團塊可見為止，以獲得2.7x106 個細胞/毫升之濃度。將得自表58之75微升各溶液添加至含有細胞之板之適當井中。然後，將板以TopSeal－A密封，並在37℃，5%CO2 及85%濕度下培養16至20小時。在使板與明亮－Glo蟲螢光素酶溶液達成平衡至儀器溫度後，將150微升明亮－Glo蟲螢光素酶溶液同時添加至各井中，並混合。接著，在混合以於黑暗中平衡10分鐘之後，立即將板置於TopCount NXT中。然後，在TopCount NXT中，使用每井1秒整合或對所使用特定型式之發光計按適當方式度量發光信號。
將得自TopCount NXT之輸出記錄，讀取至標準分析程式中，並將數據藉由採用其對數(底10)而轉變。使得自各物件之經轉變數據吻合至四參數計算術模式，如下文方程式中所示： 其中：A 為曲線之頂部平坦區，D 為曲線之底部平坦區，B 為斜率因數，及C 為會產生等於A 與D 平均之作用之濃度。
R2統計與缺乏吻合F－試驗可對各物件計算。亦可計算試驗物件相對於標準物質之最低、最高及斜率之比例。此外，關於此等比例之可信度間隔亦可計算。
各物件之相對功效係藉由吻合單一方程式至與得自參考物件之數據合併之得自吾人感興趣物件之數據而測得。
其中：A、B及D參數係為參考物與試驗物件兩者所共用，且CR 為參考參數，CA 為試驗物件參數，而比例CR /CA 為相對功效。上標I 為指示變數。若數據得自吾人感興趣之物件，則其係被設定等於1，而若數據得自CTLA4－Ig物質則為0。
各試驗物件之相對功效係被轉化成百分比標度，而相對功效係以得自此程式之輸出給予。
得自所分析各八個數據組之輸出之八個相對功效結果可被平均，且標準偏差可個別使用方程式3與4計算而得。平均結果係以"百分比相對功效"圓化至最接近整數作報告。
其中：8為功效度量值之數目x＝個別度量值
以近似濃度所獲得相對功效值之調整 ：由於試樣收到與獲得精確蛋白質濃度間之時間延遲，故試樣可於檢測中，在近似濃度下測試，而當測定精確濃度時調整結果。此調整係使用下文方程式5進行，其中係將檢測中測得之相對功效乘以用以設立檢測之CTLA4－Ig濃度對所測得CTLA4－Ig試樣濃度之比例。
實例：試樣係在蛋白質濃度為25毫克/毫升下，於檢測中測試。
所測得之相對功效為105%。
所測得之CTLA4－Ig濃度係經測得為25.5毫克/毫升可報告之相對功效＝(105 * 25)/25.5＝103%。
試驗物件相對功效值必須在參考標準之25與175%之間，其係為該檢測之範圍。若相對功效值係在此範圍之外，則試樣必須被稀釋或濃縮，以落在此範圍內，並再分析試樣。
實例46：O－連結寡醣之結構特徵鑒定
CTLA4－Ig之O－連結糖基化作用係藉由肽定圖譜，接著為ESI－MS/MS與MALDI－TOF作特徵鑒定。
T8與T9藉由肽定圖譜與ESI－MS/MS之分析 進行胰蛋白酶消化方法之經修改手動變型與線上ESI－MS/MS，使用Finnigan離子阱質譜儀，以特徵鑒定O－連結之糖肽T8與T9(參考表59，關於肽身分)。
圖61顯示CTLA4－Ig之胰蛋白酶肽圖譜，指示T8係於溶劑前沿結束時溶離，而T9係在T27之肩部溶離。
肽T8之全質譜係示於圖62中，其中吸收峰436.2係相應於單電荷未修改肽T8之所預期MW，而吸收峰1092.2係相應於單電荷糖基化T8之MW。相應於主要吸收峰之質量及其結構(T8－HexNAc－Hex－NeuAc)係示於表61中。
肽T9之全質譜係示於圖63中，其中呈現糖肽之雙－與三電荷離子，相應於一範圍之非均質糖式。主要吸收峰1115.9係相應於以HexNAc－Hex－NeuAc糖基化之三電荷T9之MW。吸收峰1213.0與1334.8係相應於個別以HexNAc(NeuAc)－Hex－NeuAc與(HexNAc－Hex－NeuAc)2 糖基化之三電荷T9之分子量(表62)。優勢糖式為經單唾液酸基化之T9－HexNAc－Hex－NeuAc，而其他糖式係於遠為較低之豐度下存在。
為測定O－連結之位置，CTLA4－Ig之肽定圖譜係按前文實例4中所述進行，且離份T8－9(由於被胰蛋白酶之不完全消化所致)係經收集，及使其接受Edman定序。定序資料顯示，在第1個循環中，除了Ser以外，出現額外吸收峰。該額外吸收峰之滯留時間並未與任何標準胺基酸一致，這指出T8中位置1處之Ser(Ser129)係被修改，且含有O－連結之聚醣。Ser與額外吸收峰兩者之出現，表示Ser係部份經修改。此係與T8之MS數據吻合。定序實驗亦發現T9中之O－連結位置為Ser 139。總而言之，兩個O－連結之糖基化作用位置，係被確認於胺基酸殘基絲胺酸129與絲胺酸139處。經連接至此兩個位置之主要聚醣為HexNAc－Hex－NeuAc。
T9肽之MALDI－TOF分析 肽T9之MALDI－TOF分析証實數種糖式之存在(圖64)。具有MW為2690.8之吸收峰係與T9片段一致。具有MW為2893.7之吸收峰係與T9加上HexNAc有關聯。具有MW為3055.7之吸收峰係與T9加上HexNAc－Hex有關聯。具有MW為3345.8之吸收峰表示T9加上HexNAc－Hex－NANA。半乳糖與N－乙醯半乳糖胺係在T9中檢出，以單醣分析為基礎，因此，在T9中之大部份O－連結物種係被假設為GalNAc－Gal－NANA。肽T8之MALDI－TOF分析並未進行，歸因於低回收產率。
實例47：於CTLA4－Ig中之氧化作用與脫醯胺作用變型
氧化作用與脫醯胺作用係為肽與蛋白質之常見產物變型。其可出現在發酵、採集/細胞澄清、純化、藥物物質/藥物產物儲存期間及試樣分析期間。
蛋白質氧化作用之典型特徵為一或多個氧原子之化學添加至蛋白質中。數種胺基酸Met、Cys、Tyr、His及Trp，相較於其他天然胺基酸類，係更容易接受氧化作用。對氧化作用具有最高程度感受性之胺基酸為甲硫胺酸。迄今經確認之大部份蛋白質氧化作用係為甲硫胺酸之氧化成亞碸變型。在蛋白質中之氧化作用可因數種不同機制所造成。氧化作用之常見機制係因光曝露或過渡金屬催化作用而發生。
脫醯胺作用係為NH3 自蛋白質之損失，形成琥珀醯亞胺中間物，其可進行水解作用。琥珀醯亞胺中間物會造成母體肽之17 u質量降低。後續水解作用會造成18 u質量增加。琥珀醯亞胺中間物之單離很困難，此係由於在含水條件下之不安定性所致。因此，脫醯胺作用典型上可以1 u質量增加測得。天冬素之脫醯胺作用會造成無論是天門冬胺酸或異天門冬胺酸。影響脫醯胺作用速率之參數，包括pH、溫度、溶劑介電常數、離子強度、一級順序、局部多肽構形及三級結構。鄰近肽鏈中Asn之胺基酸殘基會影響脫醯胺作用速率。於蛋白質順序中，在Asn後之Gly與Ser，會造成對脫醯胺作用之較高感受性。
物料與方法試樣 ：CTLA4－Ig標準物CTLA4－Ig之胰蛋白酶/Asp－N/胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶原肽定圖譜： 使蛋白質在含有6 M胍與5 mM二硫基蘇糖醇(DTT)之50 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris)緩衝液(pH 8.0)中變性與還原。在50℃下培養20分鐘後，將碘乙醯胺(IAM)添加至最後濃度為10 mM，並將試樣在50℃下，於黑暗中再培養20分鐘。將經還原且烷基化之混合物裝填至NAP－5管柱上，然後，以50 mM Tris,10 mM CaCl2 ,pH 8.0溶離出。添加定序級胰蛋白酶(2% w/w，酵素：蛋白質)，並於37℃下培養4小時。在Asp－N消化之情況中，添加定序級Asp－N(4% w/w，酵素：蛋白質)，並將試樣在37℃下培養16小時。
在胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶原消化之情況中，蛋白質係在50 mM磷酸鈉緩衝劑,pH 7.5中。添加定序級胰蛋白酶(4% w/w，酵素：蛋白質)，並將試樣在37℃下培養4小時。添加胰凝乳蛋白酶原(4% w/w，酵素：蛋白質)，並將試樣在37℃下培養16小時。在消化後將試樣儲存於－20℃下。
肽混合物係自Atlantis C18管柱(2.1 x 250毫米)，於Waters Alliance HPLC工作站(Waters,Milford,MA)上，在0.120毫升/分鐘下，藉梯度溶離而分離。管柱係直接連接至裝有電噴霧離子化作用噴霧來源之Q－Tof micro(Waters,Milford,MA)，並收集質譜。在Asp－N肽定圖譜之情況中，係使肽混合物於Varian C18管柱(4.6 x 250毫米)上，在0.7毫升/分鐘下，使用相同HPLC工作站分離。使管柱以溶劑A(在水中之0.02% TFA)達成平衡，並藉由增加溶劑B(在水中之95%乙腈/0.02% TFA)之濃度使肽溶離。管柱後分流器閥係用以導引15%之流動至Q－Tof micro。儀器係以正模式(m/z 100－2000)操作。毛細管電壓係被設定為3000 V。
肽之MS/MS分析 ：收集得自逆相層析法之離份，並灌注至Q－Tof micro中，在流率為20微升/分鐘下。MS/MS光譜係使用對個別肽達最佳化之碰撞能量(範圍為25至42 eV)獲得。
結果CTLA4－Ig之氧化作用 ：CTLA4－Ig每單鏈具有七個甲硫胺酸：Met1 、Met53 、Met54 、Met85 、Met97 、Met162 及Met338 。肽定圖譜係用以確認各此等位置處之氧化產物變型。Met1 、Met85 及Met162 之氧化作用係使用胰蛋白酶肽定圖譜技術確認(圖65A－B)。未檢出Met338 之氧化作用。含有Met53 、Met54 或Met97 之胰蛋白酶片段為含有非均質N－連結碳水化合物之大肽。此等肽不易接受氧化作用之確認與相對定量。因此，進行使用多重酵素之蛋白水解，其會產生較短未經糖基化之肽。ASp－N肽EVCAATYMMGN(46－56)與胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶肽MYPPPY(97－102)係用以測定Met53 、Met54 及Met97 之氧化作用。甲硫胺酸氧化作用之相對定量，係根據經萃取離子層析圖之吸收峰面積百分比計算。經氧化肽之相對量係列示於表63中。在每單鏈之七個CTLA4－Ig甲硫胺酸中之六個上之氧化作用係被檢出。吸收峰A與B為肽EVCAATYMMGN(46－56)(吸收峰3)之單一氧化形式。得自吸收峰2A與2B之肽係為同量異序，且當與未修改之肽質量比較時，具有質量增加為16 u。各吸收峰表示在不同Met處之氧化作用。氧化作用之程度在此兩個位置上係為不同。
計算CTLA4－Ig甲硫胺酸氧化作用之總估計量，對CTLA4－Ig係為2.0%。此係藉由將各位置上之氧化作用之總百分比相加，並除以甲硫胺酸之總數(其係為七)計算而得。MS/MS分析係在列示於表63中之經氧化與原本肽上進行。
所有肽，惟D5除外，係使用MS/MS定序。經氧化之胺基酸係藉由在b與y離子系列內之質量差異測定。經氧化與原本T1肽之MS/MS光譜需要雙重電荷先質離子，在m/z 741.4與733.4下。質量差異為8 u(對雙重電荷狀態)，當對電荷狀態校正時其係為16 u。胰蛋白酶肽T1(1－14)含有Met1 殘基。原本肽及其氧化衍生物為藉由逆相層析法分離之基線。關於T1及其衍生物之雙重電荷離子之離子層析圖係示於圖65A－B中。b與y離子系列為在碰撞所引致之解離中所產生之主要離子。y6－y13離子具有相同經修改與未修改之離子質量。經氧化肽之b2離子係為16 u高於原本肽之相應b2離子。與肽質量一起採用之b與y離子系列係確認甲硫胺酸1為在T1肽中經修改之胺基酸。以相同方式，在AT1、T6、T10及MYPPPY(97－102)肽中之Met氧化作用係經確認。
CTLA4－Ig之脫醯胺作用 ：CTLA4－Ig每單鏈具有15個天冬素。已知三個天冬素係連接至N－連結之碳水化合物結構。肽定圖譜係用以確認及相對地定量發生在另外12個Asn殘基上之脫醯胺作用。Asn186 、Asn225 、Asn271 、Asn294 及Asn344 之脫醯胺作用係藉由LC/MS胰蛋白酶肽圖譜(表64)確認。天冬素脫醯胺作用之相對定量係根據經萃取離子層析圖之吸收峰面積百分比計算。脫醯胺酸化肽之相對量係列示於表64中。計算CTLA4－Ig天冬素脫醯胺作用之總估計量，對CTLA4－Ig係為0.3%。此係經由將各位置處之脫醯胺作用之總百分比相加，並除以15計算而得。MS/MS分析係在列示於表64中之經脫醯胺酸化與原本肽上進行。
經脫醯胺酸化之胺基酸係藉由在b與y離子系列內之質量差異測得。例如，若對肽T15有兩個經脫醯胺酸化之吸收峰，則質量為905.0 u。吸收峰1係在原本吸收峰之前溶離；吸收峰3係在原本吸收峰之後溶離。胰蛋白酶肽及其脫醯胺酸化形式係為在逆相管柱上經分離之基線。MS/MS分析係於胰蛋白酶肽上進行，且經脫醯胺酸化之肽係列示於表64中。吸收峰1－3含有相同y1與y2離子，這顯示C－末端胺基酸類對全部三個吸收峰為相同；但是，得自吸收峰1與3之y3－y14離子係為1 u高於得自吸收峰2之相應離子。在y2與y3間之質量差異，對吸收峰2係為114 u；此係相應於Asn殘基。對吸收峰1與3之115 u，與Asn殘基質量比較，係為1 u質量增加；此係相應於無論是天門冬胺酸或異天門冬胺酸。以相同方式，在T12、T25、T26及T30中之脫醯胺作用係經確認，且片段離子係確認修改位置。
天冬素脫醯胺作用與甲硫胺酸氧化作用係自CTLA4－Ig之內肽酶分裂之LC/MS與LC/MS/MS分析測定。修改物係藉由經修改與未修改肽間之質量上轉變而確認。經修改之胺基酸係藉由MS/MS定序確認。每單鏈六個甲硫胺酸氧化作用與五個天冬素脫醯胺作用，係以小百分比存在於CTLA4－Ig物質中。CTLA4－Ig Met1 、Met53 、Met54 、Met85 、Met97 及Metl62 係全部經發現被氧化。自CTLA4－Ig測得之此等氧化作用已被發現係低於所有CTLA4－Ig甲硫胺酸之2.5%。CTLA4－Ig Asn186 、ASn225 、ASn271 、Asn294 及Asn344 全部被發現以低量經脫醯胺酸化。自CTLA4－Ig測得之此等脫醯胺作用，已被發現係低於所有CTLA4－Ig天冬素之0.5%。
實例48－關於CTLA4－Ig與CTLA4 A29YL104E －Ig之細菌內毒素檢測
於一項具體實施例中，CTLA4－Ig組合物藥物具有低於或等於0.15 EU/毫克細菌內毒素。CTLA4－Ig係經檢測關於細菌內毒素之存在，使用Limulus阿米巴樣細胞溶胞產物(LAL)凝膠凝塊技術，以USP<85>為基礎。於製備與應用此檢測時，係在處理試樣中遵守注意事項，以避免總體微生物污染；處理任何所採用之容器或器具，以摧毀可能存在於其表面上之外來內毒素，譬如在乾燥－加熱烘箱中，使用經確認有效之循環加熱。
LAL試劑：(Cape Cod聯合公司－或相當物)經凍乾Limulus 阿米巴樣細胞溶胞產物(LAL)試劑，譬如Pyrotell，應根據製造者之說明書儲存。經重配之LAL試劑可被保持冷凍，歷經不超過一個月，且不應被解凍或冷凍超過一次。
內毒素標準物：(Cape Cod聯合公司－或相當物)。用於此等試驗中之對照標準內毒素(CSE)必須可追蹤，且對著參考標準內毒素(RSE)標準化。將未經重配之內毒素容器儲存在冷藏室中；一旦經重配，其可被保持在2°－8℃下，歷經不超過14天，除非有效確認較長期顯示適當反應性。
生產批號之測試 LAL程序之產物抑制或增強之缺乏，應對各藥物配方確認有效。生產批號之測試係使用三個各別單元進行，代表生產之開始、中間及結束。此等單元可個別地操作或匯集。試樣在試驗濃度下，以作為溶胞產物之經標識敏感性之CSE(或RSE)量之兩倍接種之代表性陽性產物對照組，必須被加入，以供有效試驗用。調整pH以致使最後產物/溶胞產物溶液係在6.0至8.0之範圍內，使用無菌不含內毒素之HCl、NaOH或適當緩衝劑。在一些狀況中，使用緩衝劑譬如Pyrosol作為一種pH調整之替代方式，可能有幫助。參考製造者指引，關於特定用途。
利用緩衝劑供溶胞產物重配 使用緩衝劑，譬如Pyrosol(Cape Cod聯合公司)，以重配用於測試之溶胞產物，且係經設計以放大溶胞產物之緩衝能力。經Pyrosol重配之溶胞產物可用以測試試樣或試樣稀釋液，其在其他情況下可能需要以酸或鹼調整pH，或其在pH調整時會沉澱。當與測試試樣合併時，Pyrosol重配之溶胞產物會賦予粉紅色，以表示pH值係在供有效試驗之範圍內。若在該範圍外側，則顏色將為黃色或紫色；於此情況中，測試試樣係需要其他pH值調整。特定方法將指示利用Pyrosol，供溶胞產物重配。
利用聚葡糖抑制緩衝劑供溶胞產物重配 使用聚葡糖抑制緩衝劑，譬如Glucashield(Cape Cod聯合公司)以重配用於測試之溶胞產物，且係經設計以阻斷潛在聚葡糖干擾。Glucashield重配之溶胞產物可用以測試可能含有聚葡糖污染之試樣或試樣稀釋液。來自聚葡糖污染之干擾可在某些試驗物質中賦予偽陽性，因此使用Glucashield重配之溶胞產物可阻斷或降低干擾，允許降低偽陽性之數目。特定方法將指示利用Glucashield，供溶胞產物重配。
試樣稀釋液 若必須接近試樣中內毒素濃度之含量，則製備試樣在無菌不含內毒素水中之適當系列稀釋液。渦旋，並將0.1毫升欲被測試之各製劑添加至兩個無菌不含內毒素之10 x 75毫米玻璃試管之每一個中。
供標準曲線用之內毒素標準溶液之製備 依照製造者之說明書，以不含內毒素之水，重配內毒素之小玻瓶。將小玻瓶在旋渦混合器上激烈地混合，間歇性地歷經30分鐘。將濃縮物在2°－8℃下保存在冷藏室中，歷經不超過4週。在使用之前，使用旋渦混合器激烈地混合，歷經不低於3分鐘。查閱製造者之分析證明書，以証實內毒素儲備液之濃度，及製備標準內毒素稀釋系列，經設計以囊括終點，譬如於下列實例中：0.5毫升(1000 EU/毫升)＋9.5毫升不含內毒素之水＝50 EU/毫升5.0毫升(50 EU/毫升)＋5.0毫升不含內毒素之水＝25 EU/毫升1.0毫升(25 EU/毫升)＋9.0毫升不含內毒素之水＝2.5 EU/毫升1.0毫升(2.5 EU/毫升)＋9.0毫升不含內毒素之水＝0.25 EU/毫升5.0毫升(0.25 EU/毫升)＋5.0毫升不含內毒素之水＝0.125 EU/毫升5.0毫升(0.125 EU/毫升)＋5.0毫升不含內毒素之水＝0.06 EU/毫升5.0毫升(0.06 EU/毫升)＋5.0毫升不含內毒素之水＝0.03 EU/毫升5.0毫升(0.03 EU/毫升)＋5.0毫升不含內毒素之水＝0.015 EU/毫升
在進行至下一次稀釋之前，確定激烈地渦旋各稀釋液，歷經至少30秒。加入所使用稀釋劑之陰性水對照組。渦旋，並將各0.1毫升之0.125 EU/毫升、0.06 EU/毫升、0.03 EU/毫升、0.015 EU/毫升濃度(或交替曲線)及陰性水對照組，添加至兩個無菌不含內毒素之10 x 75毫米玻璃試管之每一個中，以提供兩個複製曲線。
LAL試劑溶液之製備 將經凍乾之LAL試劑自冷凍庫移除。以無菌方式將5.0毫升不含內毒素之水(除非特定方法另有指示，以使用重配緩衝劑)添加至小玻瓶中。漩渦打轉或滾動小玻瓶，以溶解試劑。
陽性產物對照組之製備 所有產物必須以陽性產物對照組測試。參考可應用之特定方法，關於陽性對照組製備之指示。若沒有提供指示，則製備陽性產物對照組，以包含內毒素加料，在溶胞產物敏感性含量之2X下，且併用產物，在其試驗含量下。當測試注射用水或高品質生產用水時，係使用經重配內毒素標準物之稀釋液，以致當被添加至試樣中時，內毒素濃度係為LAL溶液敏感性之2X。例如，若溶胞產物敏感性＝0.06 EU/毫升，則添加0.1毫升2.5 EU/毫升內毒素溶液至1.9毫升測試試樣中(以作為被添加至LAL溶液中之形式)＝0.125 EU/毫升。內毒素溶液之體積係不大於0.1毫升，且整體稀釋係不低於1：20。
試驗程序 1.以無菌方式將0.1毫升LAL試劑溶液分配至各測試試樣管件與內毒素標準管件中，小心不要在管件之間交叉污染。註：將任何其餘試劑放置於冷凍庫中，在約－10℃至－25℃下。
2.參考特定溶胞產物插圖，關於產物－溶胞產物混合物之混合指示。
3.將各管件放置在培養裝置中，譬如被保持在370 ±1℃下之水浴或加熱板塊。記錄培養開始時間與水浴或加熱板塊之溫度。
4.培養各管件，未受干擾，歷經60±2分鐘。
5.在培養之後，記錄培養結束時間，並藉由溫和地翻轉管件180°觀察各管件。陽性結果係藉由牢固凝膠表示，當小心地翻轉時其仍然保持牢固，陰性結果之特徵為此種凝膠不存在，或藉由形成黏稠凝膠，其並未保持其完整性。小心地處理管件，並避免使其接受振動，其可能會造成錯誤陰性觀察。
評估 於各複製系列中獲得陽性結果之最低濃度係被稱為終點。藉下述程序計算試驗之幾何平均終點：幾何平均＝凝膠化終點之對數總和之逆對數，除以複製終點檢測之數目。此項試驗係為有效，其條件是幾何平均終點係在經標識溶胞產物敏感性之兩倍稀釋內，陽性產物對照組為陽性，而陰性水對照組為陰性。測定近似細菌內毒素含量在試驗項目中或在其上，其方式是將經標識之溶胞產物敏感性與所測試項目之稀釋因數結合之陽性或陰性結果作比較。若在個別專題論文或規格中所指定之內毒素含量下沒有形成牢固凝膠，則物件符合試驗之要求條件。
關於CTLA4 A29YL104E －Ig之方法 此方法係使用動力學比濁計LAL方法，用以定量CTLA4A29YL104E －Ig藥物質與藥物產物之試樣中之細菌內毒素。其結果係以EU/毫升與EU/毫克藥物產物相當物作報告。
術語：LAL－Limulus 阿米巴樣細胞溶胞產物CSE－對照標準內毒素EU－美國藥典內毒素單位EU/毫克－每毫克美國藥典內毒素單位EU/毫升－每毫升美國藥典內毒素單位LRW－LAL試劑水
Limulus阿米巴樣細胞溶胞產物比濁計(Pyrotell－T)溶液.在打開之前，允許Pyrotell－T與Pyrosol之小玻瓶溫熱至室溫，歷經30分鐘。將金屬密封物自Pyrotell－T移除，並以無菌方式移除塞子。以5.0毫升PyroSol重配緩衝劑重配Pyrotell－T。使瓶子溫和地漩渦打轉以混合，直到完全溶解為止。在即將使用之前重配緩衝劑。可將經重配之Pyrotell－T保持在2－8℃下，歷經不超過24小時。以一層Parafilm覆蓋容器之頂部。
對照標準內毒素溶液. 在打開之前，允許CSE(1.2)之小玻瓶溫熱至室溫，歷經30分鐘。將金屬密封物自小玻瓶移除，並以無菌方式移除塞子。小心地舉起塞子，正好足夠允許空氣進入，於是破除真空。以5.0毫升LRW(1.4)重配對照標準內毒素(CSE)。以Parafilm密封。於室溫下，在5－10分鐘間隔下激烈渦旋一分鐘，歷經30－60分鐘間隔。CSE係接著立即供使用。參考製造者之分析證明書，以獲得對照標準內毒素(CSE)功效，以USP－EU表示，每小玻瓶對特定批號之Pyrotell－T。計算CSE在小玻瓶中之USP－EU/毫升。可將經重配之CSE保持在2－8℃下，歷經30天。在每次使用後，以新Parafilm密封容器。
實例：對於具有功效為6,000 USP－EU之小玻瓶/以5.0毫升LRW重配之小玻瓶，功效係為1,200 USP－EU/毫升。
安裝檢測參數於Pyrosoft－11軟體中。一般參數.安裝參數於一般試驗資訊標位中，如下表中所示。
製備標準曲線濃度。製備在4 USP－EU/毫升下之對照標準內毒素(CSE，2.2)工作儲備溶液。製備在功效為4 EU/毫升下之CSE工作溶液。使用方程式1計算稀釋所需要之LRW體積。將20微升CSE溶液(2.2)添加至聚苯乙烯管件(1.9)中之適當量(方程式1)LRW(1.4)內。使稀釋液渦旋30秒。
實例：關於在功效為1,200 EU/毫升下之CSE溶液，係將20微升CSE溶液添加至5,980微升LRW中。
在0.64 EU/毫升下製備CSE工作儲備溶液。在功效為0.64 USP－EU/毫升下製備CSE之工作溶液，其方式是將1.6毫升在4 USP－EU/毫升下之CSE儲備溶液添加至聚苯乙烯管件中之8.4毫升LRW內。渦旋30秒。
製備標準儲備溶液。標準儲備溶液係在0.128、0.064、0.032、0.016、0.008及0.004 EU/毫升下製自CSE在聚苯乙烯管件中之工作溶液。於稀釋後使各管件渦旋30秒。稀釋方案係示於下表中。
試樣製備. 藥物試樣製備. 製備試樣稀釋液至0.25毫克/毫升。使用下文方程式，計算稀釋所需要之LRW體積。小心地移除試樣容器之頂部，並將50微升試樣添加至聚苯乙烯管件中之適當量(下文方程式)LRW內，以製造0.25毫克/毫升溶液。使試樣渦旋30秒。以一層Parafilm覆蓋試樣容器之頂部。
實例：對於具有濃度為24.7毫克/毫升之試樣，係將50微升(0.05毫升)試樣添加至4.89毫升水中
藥物產物親液物試樣製備. 註：單一藥物產物批號係包含三個各別試樣，"開始"、"中間"及"結束"。根據產物確認(PI)規格，以LAL試劑水重配藥物產物之小玻瓶。將已重配之試樣稀釋至0.25毫克/毫升。使用方程式2計算稀釋所需要之LRW體積。小心地移除試樣容器之頂部，並將50微升試樣添加至聚苯乙烯管件中之適當量(方程式2)LRW內，以製造0.25毫克/毫升溶液。使試樣渦旋30秒。以Parafilm覆蓋試樣容器之頂部。
藥物產物立即可用試樣製備. 將試樣稀釋至0.25毫克/毫升。使用方程式3計算稀釋所需要之LRW體積。小心地移除試樣容器之頂部，並將10微升試樣添加至聚苯乙烯管件中之適當量(方程式3)LRW內，以製造0.25毫克/毫升溶液。使試樣渦旋30秒。以Parafilm覆蓋試樣容器之頂部。
實例：對於具有濃度為125.0毫克/毫升之試樣，係將10微升(0.01毫升)試樣添加至4.99毫升水中
藥物產物立即可用安慰劑. 將安慰劑(猶如其係在額定藥物產物蛋白質濃度為125毫克/毫升下一般)稀釋至0.25毫克/毫升。這相當於1：500稀釋。使用方程式3計算稀釋所需要之LRW體積。小心地移除試樣容器之頂部，並將10微升試樣添加至聚苯乙烯管件中之適當量(方程式3)LRW內，以製造0.25毫克/毫升相當溶液。
陽性水對照組. 陽性對照組係藉由將100微升0.032 EU/毫升標準物添加至反應管件中之100微升LRW內，製自標準曲線。
添加Pyrotell－T試劑。將50微升Pyrotell－T溶液以重複吸量管添加至各反應管件(陰性對照組、標準物、試樣、加料試樣及陽性水對照組)中。使各管件渦旋1－2秒，並將其插入Pyros Kinetix儀器中之指定井內(表1)。
數據分析 分析. PyroSoft－11軟體將進行所有標準物、對照組及試樣之自動分析，且在操作完成時報告試樣結果，以EU/毫升表示。各重複試樣係以兩個之平均值報告。若複製對值管件之一係未被PyroSoft－11軟體檢出，則該管件可自其他數據分析中排除，並再計算其結果。加料回收(陽性試樣對照組)係以內毒素在試樣中之量，加上內毒素被添加至試樣(0.016 EU/毫升)中之量為基準計算而得。
使EU/毫升數值轉換成經稀釋藥物物質或藥物產物試樣之EU/毫克數值原始數據係以EU/毫升產生，並以EU/毫克蛋白質報告。為使EU/毫升轉換成EU/毫克，係將內毒素數值(EU/毫升)除以蛋白質濃度(0.125毫克/毫升)。其結果係被報告至一個有效數字。
實例：對於在檢測中具有0.23 EU/毫升之試樣，可報告之EU/毫克值為2 EU/毫克(1.8圓化成一個有效數字)。
關於藥物試樣之結果. 其結果係經測定至一個有效數字。檢測之QL為0.02 EU/毫克。若試樣係≦0.02 EU/毫克，則可報告之結果為[<QL,(QL＝0.02 EU/毫克)]。藥物產物試樣之結果.對於各批號藥物產物之三個試樣("開始"、"中間"及"結束")之平均，以EU/毫克表示，係為藥物產物試樣之可報告結果，在一個有效數字下。關於其中一個批號之一或多個試樣為<QL(0.02 EU/毫克)之情況，將使用0.02 EU/毫克之數值以計算平均。若平均可報告結果係≦0.02 EU/毫克，則可報告之結果為[<QL,(QL＝0.02 EU/毫克)]。
實例：
關於此實例，藥物產物安慰劑係被報告為：3 EU/毫升，相當於0.02 EU/毫克，在額定藥物產物濃度為125毫克/毫升下。
系統適合性. 藥物試樣應在聚苯乙烯容器中，於2－8℃下得到。若試樣係於不同容器中，在不同溫度下得到，則其可能不被使用於此檢測中。關於標準曲線之測定係數(r2 )必須≧0.99。若r2 數值係<0.99，則檢測並非有效，且必須重複。陰性對照組之平均度量內毒素濃度必須<0.002 EU/毫升。若陰性對照組係≧0.002 EU/毫升，則檢測並非有效，且必須重複。加料試樣值必須落在期望值之50－200%之範圍內。若加料試樣值為期望值之≦49%或≧201%，則檢測並非有效，且必須重複。陽性水對照組之平均度量內毒素濃度必須落在標準曲線中相同濃度之50－200%之範圍內。若陽性水對照值係為期望值之≦49%或≧201%，則檢測並非有效，且必須重複。試樣之內毒素值必須落在內毒素標準曲線之範圍內(在0.002與0.064 USP－EU/毫升之間)。若試樣係<0.002 EU/毫升，則其係低於檢測之QL，且根據段落5.4報告。若試樣係>0.064 USP－EU/毫升，則試樣必須進一步稀釋至檢測之範圍內。
實例49－CTLA4－Ig之微生物限制試驗(生物負載量)
此方法係提供關於評估所存在之存活需氧微生物數目及免除所指定微生物物種之試驗程序。於一項具體實施例中，CTLA4－Ig組合物應具有在≦1 CFU/10毫升含量下之生物負載量。於製備與應用此等試驗時，係在處理試樣時遵守無菌注意事項。"生長"一詞係被定義為存活微生物之存在與假設之增生。試驗結果之有效性主要係仰賴証實其被施用之待測試樣本身在試驗條件下不會抑制可能存在微生物之生長。此証實應包括以適當激發生物體之個別存活培養物，激發經適當地製成之欲被測試物質試樣，以確保試驗不會抑制此等生物體種類之生長，如果其存在於經測試之物質中時。任何用於測試之β－內醯胺產物之部份，必須根據經確認有效之程序，以適當量之青霉素酶處理。
稀釋流體與培養基 1.培養基與稀釋流體之製備. 可製備培養基與稀釋流體，或可使用經脫水之培養基，其條件是當按製造者或銷售商所指示而重配時，其具有類似成份及/或產生相當於得自本文所予配方之培養基。在藉由配方製備培養基時，係使可溶性固體溶於水中，若必要則使用熱，以達成完全溶液，當其準備供使用時，係以足以產生所要pH之量添加鹽酸或氫氧化鈉之溶液在培養基中。培養基係欲在熱壓鍋中，使用經確認有效之滅菌程序經滅菌。於滅菌後，在25°±2℃下測定pH。
生長促進作用 a)測試各批次經熱壓處理之培養基，關於其生長促進能力，其方式是將各培養基之重複試驗容器以低於100個微生物接種，並根據下文所指定之條件培養。來自最初從ATCC收到之培養物之生物體不可超過5個繼代。
b)若生長之証據對於細菌在48－72小時內顯現，而對於真菌為5天，則試驗培養基係為令人滿意的。生長促進試驗可與利用此試驗培養基供物質測試同時進行。但是，若此生長促進試驗並未成功，則物質測試係被視為無效。
關於總需氧微生物計數或總合併霉菌與酵母計數之程序 a)試樣製備. 除非特定方法另有指示，否則係按下述製備供測試之試樣。參考下文適當段落，關於培養基與培養程序之其他資訊，依正進行何種試驗而定。
i)膨鬆粉末與原料－使10克或10毫升試樣溶解或懸浮於90毫升無菌磷酸鹽緩衝劑pH 7.2中。充分混合，並將1.0毫升轉移至兩個無菌陪替氏培養皿之每一個中。
ii)膠囊－以無菌方式將2個膠囊殼及其內容物轉移至20毫升無菌磷酸鹽緩衝劑pH 7.2中。於水浴(大約45℃)中溫熱約10分鐘。激烈振盪，直到此懸浮液變得均勻為止，並將1.0毫升轉移至兩個無菌陪替氏培養皿之每一個中。
iii)供懸浮液用之粉末－根據標籤指示，使用無菌磷酸鹽緩衝劑pH 7.2作為稀釋劑，重配試樣。充分振盪，並將1.0毫升轉移至兩個無菌陪替氏培養皿之每一個中。
iv)溶液/懸浮液－將1.0毫升轉移至兩個無菌陪替氏培養皿之每一個中。
v)片劑－將4個片劑(堅硬片劑應首先以無菌研缽與杵棒粉碎)轉移至20毫升無菌磷酸鹽緩衝劑pH 7.2中。充分振盪，直到片劑完全崩解或溶解為止，並將1.0毫升轉移至兩個無菌陪替氏培養皿之每一個中。
vi)膠囊殼－將25個膠囊殼轉移至100毫升無菌磷酸鹽緩衝劑pH 7.2中，並在水浴(大約45℃)中溫熱約15分鐘，間歇性地振盪以溶解。充分振盪，並將1.0毫升轉移至兩個無菌陪替氏培養皿之每一個中。
vii)軟膏－於無菌容器中，匯集大約5毫升來自3個取自橫越批號之試樣之每一個，並混合。將0.1毫升此匯集之試樣轉移至十個陪替氏培養皿之每一個中。藉助於無菌彎曲玻璃棒(曲棍球棒狀物)，將試樣塗覆在培養基表面上。對各板使用個別無菌棒，按"總需氧計數"中所述培養。
b)細胞膜過濾. 可使用適當經確認有效之細胞膜過濾試驗程序，作為傾倒覆蓋程序之一種替代方式。這可特別使用於含有抑制物質之產物。
c)再測試. 為達成藉任何下述程序確認有疑問結果之目的，可進行再測試，使用最初試樣大小之2.5倍(最低值)，伴隨著適當稀釋劑調整。
關於總需氧微生物計數之試驗 1.按上述製備欲被測試之試樣。於各板中，添加15－20毫升無菌TSA，其已被熔解並冷卻至大約45℃。覆蓋各培養皿，並使培養皿溫和地傾斜或漩渦打轉，以將試樣與瓊脂一起混合，且允許內容物在室溫下固化。翻轉此板，並於30°－35℃下培養48至72小時。
2.在培養之後，使用放大裝置，譬如Quebec菌落計數器，檢驗板之生長，計數菌落之數目，並在如物質規格中所指定之單位基礎(每片劑、膠囊、毫升、克等)下計算結果，及評估針對物質規格之可接受性。
3.經由革蘭染色與微觀形態學，進一步特徵鑒定細菌污染。使革蘭陰性細菌與革蘭陽性球菌接受生物化學測試(或替代之適當確認方式)。
註：當計數菌落時，為幫助區別菌落生長與被測試之物質，有時最好使用氯化2,3,5－三苯基四銼(TTC)之2%溶液作為加強劑，以觀察微生物生長。TTC為無色氧化－還原指示劑，當其被活細胞中所發現之還原糖氫化時，其係轉變成紅色，於是使菌落轉變成深紅色。為使用TTC，將陪替氏板以大約1毫升2%溶液溢流，並將板在30°－35℃下培養大約2小時。微生物菌落將從存在於板上之其他物質中清晰地突出，並可更容易地計數。
C.關於總合併霉菌與酵母計數之試驗. 1.按上述製備欲被測試之試樣。於各板中添加15－20毫升無菌SDA，其已被熔解，並冷卻至大約45℃。覆蓋各培養皿，並使培養皿溫和地傾斜或漩渦打轉，以將試樣與瓊脂一起混合，及允許內容物在室溫下固化。翻轉此板，並在20°－25℃下培養5至7天[註：在培養期間不要擾動板，因為霉菌在板內之散佈可產生比實際上存在者較高之計數]。
2.在培養之後，使用放大裝置，譬如Quebec菌落計數器，檢驗板之生長，計數菌落之數目，並在如物質規格中所指定之單位基礎(每片劑、膠囊、毫升、克等)下計算結果，及評估針對物質規格之可接受性。
3.藉由巨觀與微觀形態學，進一步特徵鑒定真菌污染。在適當情況下，使酵母接受生物化學測試(或替代之適當確認方式)。
關於測試不可接受生物體之不存在之程序 a)試樣製備－除非特定方法另有指示，否則係如前文在試樣製備段落中關於總需氧與總合併霉菌與酵母所述，製備測試用試樣。參考下文適當段落，關於其他資訊，依正在進行何種試驗而定。
b)細胞膜過濾－可使用適當經確認有效之細胞膜過濾試驗程序，作為預富含程序一種替代方式。這可特別使用於含有抑制物質之產物。
c)再測試－為達成藉任何下述程序確認有疑問結果之目的，可進行再測試，使用最初試樣大小之2.5倍(最低值)，伴隨著適當稀釋劑調整。
B.關於金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌之不存在之試驗.於試樣中添加TSB，以造成100毫升，混合，並在30°－35℃下培養24－48小時。檢驗培養基之生長，而若存在則使用接種圈環，將一部份加條紋至選擇之培養基，培養，並檢驗列示於下文之特徵(市購可得之確認套件可用以取代個別反應試驗)：
金黃色葡萄球菌之特徵：
若未發現生長，或若被發現之菌落均無順應上表中所示之特徵組合，則試樣符合關於生物體不存在之試驗要求條件。
關於沙門桿菌屬物種與大腸桿菌之不存在之試驗 將試樣轉移至無菌容器，以包含總共100毫升流體乳糖培養基，並在30°－35℃下培養24－48小時。溫和地振盪，並檢驗生長(市購可得之確認套件可用以取代個別反應試驗)。a)沙門桿菌屬－若生長係存在於流體乳糖培養基中，則：1.將1.0毫升部份轉移至流體亞硒酸鹽－胱胺酸培養基與流體連四硫酸鹽培養基之10毫升管件中，混合，並在30°－35℃下培養24－48小時。
2.利用接種圈環，將得自兩種培養基之部份加條紋至明亮綠色瓊脂培養基、木糖－離胺酸－脫氧膽酸鹽瓊脂培養基及亞硫酸鉍瓊脂培養基。覆蓋，翻轉，並在30°－35℃下培養24－48小時，及檢驗列示於下文之形態學特徵：
3.進一步確認可經由將可疑菌落轉移至三重－糖－鐵－瓊脂培養基之對接傾斜管件進行，其方式是首先加條紋於傾斜之表面，然後刺穿位於表面下方之金屬網井。在30°－35℃下培養24－48小時，並檢驗。若沒有管件顯示鹼性(紅色)傾斜與酸(黃色)對接(具有或未具有對接之共存黑化)之証據，則試樣符合沙門桿菌屬不存在之試驗要求條件。
b)大腸桿菌－若生長係存在於流體乳糖培養基中，則：1.利用接種圈環，將一部份加條紋至MacConkey瓊脂培養基。覆蓋，翻轉，並在30°－35℃下培養24－48小時。
2.若所形成之菌落均未顯示磚紅色外觀(具有可能之經沉澱膽汁之圍繞區帶)且係為革蘭陰性棒狀物(球桿菌)，則試樣符合大腸桿菌不存在之試驗要求條件。
3.若菌落符合此項描述，則將彼等轉移至Levine－曙紅－亞甲基藍色瓊脂培養基中。覆蓋培養皿，翻轉，並在30°－35℃下培養24－48小時。若菌落均未顯示在反射光下之特徵性金屬光澤與在透射光下之藍黑色外觀兩者，則試樣符合大腸桿菌不存在之試驗要求條件。
培養基配方 1.磷酸鹽緩衝劑pH 7.2 a)儲備溶液：單鹽基性磷酸鉀34.0克；水(經蒸餾或去離子)1000毫升；氫氧化鈉TS 175毫升。使34克單鹽基性磷酸鉀溶於被包含在1000－毫升量瓶中之約500毫升水內。藉由添加氫氧化鈉TS(約175毫升)將pH調整至7.1－7.3，添加水至適當體積，並混合。滅菌，並儲存於冷凍(2°－8℃)下直到使用。
b)工作溶液. 為供使用，將儲備溶液以水在1至800之比例下稀釋，並滅菌。
2.TSA (胰酪蛋白大豆瓊脂/大豆－酪蛋白消化瓊脂). 酪蛋白之胰消化物15.0克；大豆粉之胃液素消化物5.0克；氯化鈉5.0克；瓊脂15.0克；水1000毫升；滅菌後之pH：7.3±0.2。
3.TSB (胰酪蛋白大豆肉湯/大豆－酪蛋白消化肉湯). 酪蛋白之胰消化物17.0克；大豆粉之胃液素消化物5.0克；氯化鈉5.0克；二鹽基性磷酸鉀2.5克；右旋糖2.5克；水1000毫升；滅菌後之pH：7.3±0.2；4. SDA(Sabouraud右旋糖瓊脂)；右旋糖40克；動物組織之胃液素消化物與酪蛋白之胰消化物相等部份之混合物10.0克；瓊脂15.0克；水1000毫升；混合並煮沸以達成溶液；滅菌後之pH：5.6±0.2。
5.FLM(流體乳糖培養基). 牛肉萃液3.0克；明膠之胰消化物5.0克；乳糖5.0克；水1000毫升；於滅菌之後儘可能迅速地冷卻。滅菌後之pH：7.1±0.2。
實例50－CTLA4－Ig之等電焦聚凝膠分析
此實例之目的係為測定CTLA4－Ig之等電點、異構重組物之數目及微觀不均一性。
物料 IEF校準套件(pH 3至10)(Amersham Pharmacia,目錄編號17－0471－01)或(pH 2.5至6.5)(Amersham Pharmacia,目錄編號17－0472－01)。
AmphOline PAGplate凝膠：pH 4.0至6.5(Amersham Pharmacia,目錄編號80－1124－81)。
IEF試樣塗液器(Amersham Pharmacia,目錄編號80－1129－46)。
IEF電極片條(Amersham Pharmacia,目錄編號80－1104－40)。
磷酸(85%)(EMD,目錄編號PX0995－6)。
設備 Multiphor II電泳系統(GE保健,目錄編號18－1018－06)。
試劑之製備 陽極緩衝溶液(0.1M麩胺酸在0.5M磷酸中)(將以此浸泡之芯吸物放置在平板之(＋)側上)。
實例： 3.4毫升85%磷酸。
1.47克±0.02克麩胺酸。
HPLC級水。
將上文試劑合併在100毫升量筒中，以HPLC級水使其來到100毫升，加蓋，並翻轉數次以混合。
將溶液在2－8℃下儲存至高六個月。
陰極緩衝溶液(0.1 M β－丙胺酸)(將以此浸泡之芯吸物放置在平板之(－)側上)。
實例： 0.9克±0.02克β－丙胺酸。
HPLC級水。
將上文試劑合併在100毫升量筒中，以HPLC級水使其來到100毫升，加蓋，並翻轉數次以混合。
將溶液於2－8℃下儲存六個月。
固著溶液(3.5%5－磺酸基柳酸在12%三氯醋酸中)。
實例：240克±5.0克三氯醋酸。
70克±2.0克5－磺酸基柳酸。
2000毫升HPLC水。
合併上文試劑，補充至2000毫升體積。
將溶液在室溫下儲存至高三個月。
染色溶液：在即將使用之前，使瓶子藉由溫和地翻轉並漩渦打轉數次，混合GelCOde藍色試劑溶液。
註 ：重要的是，在傾倒或分配之前，將染色試劑混合，以確保使用試劑之均勻試樣。
染色對照組製備： 以HPLC級水重配碳酸酐酶II，以製造1.0毫克/毫升儲備溶液。
將10微升儲備溶液與90微升HPLC級水合併，以獲得0.10微克/微升工作溶液。
將10微升0.10微克/微升溶液裝填於凝膠(1.0微克負載)上。
程序 試樣稀釋製備試樣與參考物質在HPLC水中之20微克/10微升溶液。
實例：
裝置與凝膠製備使Multiphore II電泳單元之冷卻板連接至恒溫循環器，並設定溫度在10±2℃下。
註 ：允許循環器至少20分鐘達到上述溫度。
將凝膠自冷藏室移除。小心地沿著封套之側面切割，確定不會切到凝膠/凝膠載體。
將大約1.0毫升HPLC級水添加至冷卻平台之一個邊緣。
將凝膠/凝膠載體之一個邊緣置於水中，故毛細作用會攜帶此水越過凝膠之整個邊緣。慢慢地，確定氣泡不會被捕獲，塗敷凝膠越過冷卻平台。若需要則可施用其他HPLC級水。
自凝膠表面移除透明薄膜。
以陽極緩衝溶液浸泡一個電極，並放置在最接近冷卻平台之(＋)標記之凝膠邊緣上。
在陰極緩衝溶液中浸泡一個電極，並放置在凝膠之另一個側面上，其係最接近冷卻板上之(－)標記。
在電極片條已被施加後，使用新剃刀片小心地切割超過部份，以致使片條在凝膠邊緣結束，而非凝膠載體。
塗敷試樣施加片塊於最接近冷卻平台上之(－)標記之側面上，確定試樣施加片塊與凝膠之間有良好接觸。註：確定IEF試樣塗液器並未接觸陰極緩衝劑浸泡之片條，並未吸上陰極緩衝劑，且係足夠分隔以確保各試樣個別地進行。試樣塗液器應牢固地置於平板凝膠上。
放置Multiphor II單元之電極保持器，並將電極沿著凝膠上電極片條之中心對準。使兩個電極從電極保持器連接至基底單元，並將安全蓋放置在適當位置中。使用黏膠帶覆蓋安全蓋中之孔洞，以防止凝膠乾燥。使電極連接至電源。
以被設定在下文設定下之電源，使凝膠預聚焦，直到電壓達到≧300 V為止。
凝膠裝填在凝膠已被預聚焦後，關閉電源，移除安全蓋，解開電極，並自Multiphor II單元移除電極保持器。
將試樣以特定順序裝載於試樣塗液器上。對於此程序，確定(－)陰極緩衝劑片條側面最接近分析器。
將試樣從右邊裝載至左邊。首先，施行IEF校準標準物(通道1 & 2)、參考物質之一(通道3)、測試試樣# 1之一(通道4)、染色對照製劑之一(通道5)、測試試樣# 2之一(通道6)、參考物質之一(通道7)及IEF校準標準物之一(通道8)之兩次或多次塗敷。
添加第三與第四個試樣，其方式是施加參考物質之一次塗敷(通道9)、測試試樣#3之一次塗敷(通道10)、染色對照製劑之一次塗敷(通道11)、測試試樣#4之一次塗敷(通道12)、參考物質之一次塗敷(通道13)及IEF校準標準物之一次塗敷(通道14)。第五與第六個試樣係藉由重複如試樣3與4之相同圖樣而施加，使用通道15至20。試樣裝填圖樣係示於表2中。
電泳. 當裝填凝膠時，放置Multiphor II單元之電極保持器，並將電極沿著凝膠上之電極片條之中心對準。將得自電極保持器之兩個電極連接至基底單元，並將安全蓋放置在適當位置。使用黏膠帶，覆蓋安全蓋上之孔洞，以防止凝膠變乾。將電極連接至電源。設定適當電壓、電流及恒定功率設定值，並開始操作。
在操作凝膠之後，關閉電源，移除安全蓋，切斷電極，並自Multiphor II單元移除電極保持器。
將電極片條與試樣塗液器自凝膠小心地移除。
註 ：可將平板凝膠直接放置在固著溶液中，並使電極片條與施加片塊浮離凝膠。
將凝膠/凝膠載體自冷卻板移除，並放置在含有足夠體積之固著溶液之扁平培養皿中(步驟3.3)，以保持凝膠潤濕。以塑膠包覆物覆蓋，並放在軌道平台上，且培養20－60分鐘。於IEF工作單上記錄開始與停止時間。
註 ：IEF凝膠留在固定劑中太久，有時會脫層。其係藉由限制固定時間至大約一小時而避免。
4.5將凝膠染色於固定後，將凝膠以足夠體積之HPLC級水沖洗3 x 5分鐘，以保持凝膠潤濕。於IEF工作單上記錄開始與停止時間。
於使用前混合GelCode藍色染色試劑溶液後(步驟3.4)，將凝膠放置在足夠體積之著色料中，以保持凝膠潤濕。在緊密地密封之容器中培養15－24小時，以防止試劑蒸發。於IEF工作單上記錄開始與停止時間。
經染色之凝膠係經由將染色溶液以HPLC級水置換而去除染色。沖洗凝膠，至少更換水三次，歷經1－2小時期間。於IEF工作單上記錄開始與停止時間。於去除染色後，凝膠係立即用於掃描。
註 ：可能需要額外洗滌，以降低IEF凝膠上之背景染色。
系統適合性等電焦聚標準物應容易地與背景區別。潛移至4.0與6.5間之pI值之蛋白質標準物於凝膠上為可見的。具有在此範圍外之pI之蛋白質標準物於凝膠上為不可見的。在3.50、4.55、5.20及5.85下之pI標記物係經確認，並標識在凝膠影像上。
碳酸酐酶II標準物(pI 5.4)在低含量蛋白質負載量(1.0微克)下之染色對照組係用於凝膠染色一致性之顯像。此譜帶必須能夠藉由經掃描凝膠影像之目視檢查而容易地與背景區別。
CTLA4－Ig參考物質應於4.3至5.6之pI範圍內，經計算係在10－22個譜帶下。
CTLA4－Ig參考物質之最顯著譜帶之累積百分比強度，在4.3至5.3之pI範圍內，應≧90%。
對於阿巴塔謝特參考物質，藉由目視檢查，係確認有三個在pI標記物4.5－5.2之間聚焦之主要譜帶(參閱關於主要譜帶圖樣之圖)。
凝膠掃描與分析 在電泳與染色後，將所有凝膠使用光密度計掃描。將影像檔案儲存在電腦局部硬碟機/網路上，並經由局部區域網路收集歸檔。經掃描凝膠影像之分析係使用ImageQuant TL軟體(v2003.03)進行。掃描與分析參數係列示於表5中。掃描係使用部門程序產生與定量。
使用表中所定義之掃描參數掃描凝膠。凝膠之所有分析與評估係自經掃描之影像施行。從ImageQuantTL中之<1D凝膠分析 >開啟凝膠影像檔案(經掃描之原始數據)。進入工具桿上之<對比 >，並降低<影像直方圖>參數直到所有譜帶清楚可見為止。選擇<通道建立 >，並選擇<手動 >以設立欲被分析之<通道數目 >。調整<通道%寬度 >至高達100%，以涵蓋凝膠通道。若必要則適當地對準單一通道。使用<滾球 >方法，以扣除背景。使用表3中所列示之最初<最低斜率 >、<噪音降低 >及 <%最高吸收峰 >設定，以偵測譜帶。此等數值之調整係為正確地確認譜帶所必須。對於pH/pI 4.0－6.5凝膠，係利用得自系統適合性段落中所列示之經標識標記物之標準pI標記物計算譜帶pI值。跳過校準與正規化步驟。計算4.3至5.6 pI範圍內之譜帶數目。將此等結果輸出至Excel工作表中，供進一步記載與報告。試樣相對於參考物質之累積百分比強度之計算.註 ：關於試樣之累積百分比強度，當與存在於通道中之100%所有譜帶比較時，係為在4.3－5.3之pI範圍內潛移之譜帶之百分比。下列方程式應被使用於計算試樣相對於參考物質之累積百分比強度：
註 ：參考凝膠裝填圖樣，緊接於試樣後之參考物質應被用於計算。若參考物質具有100%之累積值，且試樣具有95%值，則試樣相對百分比為95/100 * 100＝95%。若參考物具有95%之累積數值，且試樣具有100%值，則試樣相對百分比為100/95 * 100＝105%。
報告結果 報告在範圍4.3－5.6之pI內所計算之譜帶數目。報告在4.3－5.3之pI範圍內，相對於CTLA4－Ig參考物質之累積百分比強度(參閱對於此方法中所定義之定量IEF凝膠分析之報告實例之圖)。藉由目視檢查，確認相對於參考物質有三個在pI標記物4.5－5.2之間聚焦之主要譜帶(參閱關於主要譜帶圖樣之圖1)，並報告在pI標記物4.5－5.2內所發現之主要譜帶數目。藉由目視檢查，確認相對於參考物質在pI標記物4.5－5.2之間沒有新的顯著譜帶。
於某些具體實施例中，此方法之結果將顯示在4.3－5.6或4.3－5.3之pI範圍中之譜帶，其中10至22個譜帶被確認，具有90－110%之累積譜帶強度。在另一項具體實施例中，pI範圍為4.5－5.2，具有3個主要譜帶。在另一項具體實施例中，pI範圍為4.3－5.6，具有10至22個譜帶。在另一項具體實施例中，pI範圍為4.3－5.3，具有95－105%之累積譜帶強度。在另一項具體實施例中，pI範圍為4.5－5.2，具有2個顯著譜帶。
實例51：CTLA4－Ig之SDS－PAGE
實例係顯示在經還原與未經還原兩條件下藉由SDS－PAGE檢查CTLA4－Ig。
物料 Tris－甘胺酸(Tris－Gly)SDS試樣緩衝劑2X(Invitrogen,目錄編號LC2676)NuPAGE"試樣還原劑10X(Invitrogen,目錄編號NP0004)4－20% Tris－甘胺酸凝膠－1.0毫米x 12個井(Invitrogen,目錄編號EC60252BOX)Tris－甘胺酸SDS操作緩衝劑10X(Invitrogen,目錄編號LC2675)Mark12TM 廣範圍未經染色之標準物(Invitrogen,目錄編號LC5677)GelCode藍色染料試劑(柯麥西(Coomassie)藍色),(Pierce,目錄編號24590：500毫升目錄編號24592：3.5升)SilverSnap染色套件II(銀染色)(Pierce,目錄編號24612)
儀器配置：Xcell SureLock小型元件(Invitrogen,目錄編號EI0001)供電泳之電源(OWL分離系統,目錄編號OSP－300)
試劑：柯麥西(Coomassie)藍色染料用之固著溶液(在HPLC級水中之50%甲醇與7%醋酸)
實例：於含有攪拌棒之適當大小有刻度容器中：添加500毫升甲醇。添加70毫升醋酸。將體積以HPLC級水調整至1000毫升。在室溫下儲存至高六個月。柯麥西(Coomassie)藍色染料(GelCode藍色)直接從容器使用。添加足量以覆蓋凝膠，對一種小型凝膠(10 x 10公分)大約50毫升，在小淺盤中。在2－8℃下儲存至高一年。
銀染色固著溶液(在HPLC級水中之30%乙醇與10%醋酸)於含有攪拌棒之適當大小有刻度容器中：添加300毫升乙醇。添加100毫升醋酸。將體積以HPLC級水調整至1000毫升。混合溶液，並將溶液在室溫下儲存至高六個月。凝膠洗滌溶液(10%乙醇)。
於50毫升離心管中：添加1.0毫升增強劑(銀染色套件)。添加50毫升銀染料(銀染色套件)。將管件加蓋，並藉由溫和地渦旋混合3至5秒。顯像劑工作溶液.在即將使用之前製備。
於50毫升離心管中：添加1毫升增強劑(銀染色套件)。添加50毫升顯像劑(銀染色套件)。將管件加蓋，並藉由溫和地渦旋混合3至5秒。1X Tris－甘胺酸SDS操作緩衝劑.在使用當天製備。於量筒中：添加900毫升HPLC級水。添加100毫升Tris－甘胺酸－SDS 10X操作緩衝劑。合併上文試劑，以帕拉膜(parafilm)覆蓋，並翻轉數次以混合。
染色對照組. 將1毫升HPLC級水添加至含有2毫克胰蛋白酶抑制劑(染色對照組)之小玻瓶中。這將產生2微克/微升儲備溶液，在－200℃下會安定六個月。為防止歸因於許多冷凍解凍循環之降解，係將50微升液份轉移至小管件中，並儲存在－200℃下。將25微升儲備溶液添加至75微升HPLC級水中，而得0.5微克/微升溶液。將40微升0.5微克/微升溶液添加至160微升HPLC級水中，而得0.1微克/微升之濃度。將10微升0.1微克/微升溶液、50微升2X TrisGly試樣緩衝劑及40微升HPLC級水添加至微離心管中。胰蛋白酶抑制劑染色對照組之最後濃度為0.01微克/微升。在每10微升10毫克之濃度下，裝填供釋出分析且以柯麥西(Coomassie)藍色染色之試樣。
對於柯麥西(Coomassie)藍色凝膠，係將參考物質與試樣在HPLC級水中稀釋至10微克/微升之濃度。實例：添加80微升50微克/微升參考物質試樣溶液＋320微升HPLC級水。對於未經還原之試樣 ，係將10微升10微克/微升溶液濃度添加至50微升2X Tris－Gly試樣緩衝劑中，並將40微升HPLC級水添加至微離心管內。對於經還原之試樣，係將10微升10微克/微升溶液添加至50微升2X TrisGly試樣緩衝劑、30微升HPLC級水及10微升10X還原劑中。對於銀染色凝膠，係進一步將10微克/微升溶液在HPLC級水中稀釋成1微克/微升。實例：添加40微升10微克/微升溶液＋360微升HPLC級水。對於未經還原之試樣 ，係於微離心管中，將10微升1微克/微升溶液添加至50微升2X TrisGly試樣緩衝劑與40微升HPLC級水內。對於經還原之試樣 ，係將10微升1微克/微升溶液、50微升2X TrisGly試樣、30微升HPLC級水及10微升10X還原劑添加至微離心管中。對於空白試驗，係在微離心管中，將50微升2X TrisGly試樣緩衝劑與50微升HPLC級水合併。
將凝膠移離其包裝紙，並以HPLC級水沖洗外側，以移除聚丙烯醯胺片塊。若必要則小心地移除井梳，以確定井係與凝膠裝填尖端呈直線。將井以HPLC級水充填，並輕打，以致使水移離此等井。再重複井沖洗兩次。5.2將凝膠插入XCell裝置中，以致使短板表面面對內室。若只有一種凝膠正被使用，則將有機玻璃板插在相反側面上。緊密地擠進凝膠，形成內部與外部隔室。將內部隔室以1X Tris－甘胺酸SDS操作緩衝劑充填。檢查滲漏，然後，將外部隔室以1X Tris－甘胺酸SDS操作緩衝劑充填。所有凝膠必須含有至少一個空白試驗通道與一個分子量標記物通道。僅對柯麥西(Coomassie)藍色染色之凝膠，添加染色對照組。使用凝膠裝填頂端。在經還原與未經還原試樣之間，裝填至少一個"空白試驗"。處理分子量標記物作為經還原之試樣。這將有助於防止歸因於還原劑瀝濾之未經還原試樣之還原作用。連接Xcell裝置之頂部，並將電極連接至電源。將電流調整至每凝膠25毫安培，並將電壓(V)與恒定功率(W)設定至最高。若操作兩種凝膠，則將電流設定至50毫安培。當在一個裝置或多個Xcell裝置中，於相同電源上操作兩種凝膠時，調整電流。電泳60±5分鐘，或直到緩衝劑前方移動可採用潛移距離之至少80%為止。於工作單上記錄開始時間與停止時間。經由以凝膠刀撬開，小心地將容納凝膠之兩個塑膠板分離。於分離凝膠後，接著為染色程序。
柯麥西(Coomassie)藍色染料 －將凝膠放置在50毫升柯麥西(Coomassie)藍色固著溶液(50%甲醇與7%醋酸)中15分鐘。將凝膠以~100毫升HPLC級水沖洗3次，歷經5分鐘，總共15分鐘。將柯麥西(Coomassie)藍色染料直接添加至凝膠中，並培養15至24小時。經染色之凝膠係經由將柯麥西(Coomassie)藍色染料試劑以100毫升HPLC級水置換而去除染色。於1小時去除染色後，凝膠係立即供掃描。
凝膠掃描與分析. 在電泳與染色後，將凝膠使用光密度計掃描。將影像檔案儲存在電腦局部硬碟機及/或網路上，並經由局部區域網路收集歸檔。經掃描凝膠影像之分析係使用ImageQuant TL軟體(v2003.03)進行。掃描係使用部門程序產生與定量。
藉由目視檢查，經還原CTLA4－Ig之主要譜帶必須顯示為潛移至貼近55,400 Da分子量標記物(麩胺酸脫氫酶)基部位置之寬譜帶。
實例52－CTLA4 A29YL104E －Ig藥物中之中國大頰鼠卵巢(CHO)宿主細胞蛋白質雜質藉由ELISA之測定
此實例係描述定量測試試樣中之CD－CHO1殘留宿主細胞蛋白質(HCP)之污染程度之酵素－連結免疫吸著檢測(ELISA)。首先將兔子多株抗－CD CHO1 HCP IgG塗覆於微滴定板上。將HCP參考標準物、品質對照組及CTLA4A29YL104E －Ig藥物試樣以經結合之兔子抗－CD CHO1 HCP IgG培養。在洗滌微滴定板後，添加多株兔子抗－CD CHO1 HCP生物素IgG抗體，其會結合至最初步驟期間所捕獲之蛋白質A。將微滴定板洗滌，以移除任何未經結合之多株抗體。添加鏈霉胺基酸－辣根過氧化酶，並將微滴定板再一次洗滌，以移除任何未經結合之共軛抗體。然後，添加TMB色原，以產生比色反應。使反應以硫酸終止，且在450毫微米下，於96－井微板讀取器中度量吸光率。顏色係與所捕獲HCP之量成比例而顯像。試樣濃度係以經由將吸光率對於在4.11毫微克/毫升至3000毫微克/毫升範圍內之HCP濃度作圖所產生之標準曲線為基準而測得。
中國大頰鼠卵巢(CHO)細胞系(DG44)係用於CTLA4A29YL104E －Ig之生產。對於CD－CHO1蛋白質(HCP)之生產，係使DG44細胞以重組載體pD16安定地轉染，並在經補充半乳糖與瑞肯布林(Recombulin))之CD－CHO1培養基中生長。供此ELISA變型用之多株抗體，係在以CD－CHO1 HCP物質之濃縮物而致免疫之紐西蘭白兔中產生。兔子抗體係經親和力純化(蛋白質A)，然後滲析至磷酸鹽緩衝之鹽水中，並濃縮。大約50毫克兔子抗－CD－CHO1抗體之IgG離份係使用N－羥基磺酸基琥珀醯亞胺酯化學物質生物素化。使用未經修改之兔子抗－CHO1抗體，以塗覆96－井微滴定板。捕獲藉由經生物素化之兔子抗－CD－CHO1抗體所檢出之CD－CHO1 HCP。鏈霉胺基酸辣根過氧化酶共軛物係結合至生物素，並使用具有TMB色原之比色反應，以定量CD－CHO1 HCP。
此方法係經設計，以藉由ELISA定量地測定CD－CHO1宿主細胞蛋白質之殘留含量，供CTLA4A29YL104E －Ig藥物物質之釋出測試用。
方法概述
兔子抗－CD－CHO1抗體係使用生物素基化作用套件，以6－(生物素醯胺基)己酸磺酸基琥珀醯亞胺基酯作為生物素基化作用試劑，而被生物素化。可使用得自PIERCE(產物#21335)具有磺酸基－NHS－LC－生物素之生物素基化作用試劑。根據與生物素基化作用試劑一起提供之手冊中之製造者建議，標識抗體。於標識並在所提供之尺寸排阻管柱上分離後，測定生物素併入，並使試樣在50微升或較小之液份中，在於或低於－70℃下冷凍。最後產物之生物素/IgG比例應在2與4之間。在於或低於－70℃下儲存。
板塗覆. 在碳酸酯緩衝劑中製備欲被用於塗覆微滴定板(每微滴定板需要12毫升溶液)之經純化兔子抗－CD－CHO1 HCP IgG之8微克/毫升溶液。將100微升此溶液使用經校準之多通道吸量管添加至Immulon 4微滴定板之各井中。將微滴定板以帕拉膜(parafilm)覆蓋，並在4℃下培養18±2小時。
板洗滌與阻斷. 將板以洗滌緩衝劑，使用板洗滌器工具洗滌三次。將300微升SeaBlock使用經校準之多通道吸量管添加至各井中。將板在22.5±5℃下培養1小時。在15毫升有刻度無菌聚丙烯管件中，製備CD－CHO1蛋白質參考標準物與品質對照組試樣之濃度。將參考物質與品質對照組試樣使用Teknova稀釋劑稀釋(1.21)。標準物濃度係於實驗當天，在下文實例所列示之濃度下製備：關於標準曲線試樣之稀釋液(每日製劑之實例) CD－CHO1蛋白質之儲備液濃度為5.7毫克/毫升稀釋液A：26.3微升(5.7毫克/毫升)＋4.973毫升PTB稀釋劑＝30微克/毫升稀釋液B：0.6毫升(30微克/毫升)＋5.4毫升稀釋劑 3000毫微克/毫升2毫升(3000毫微克/毫升)＋4毫升稀釋劑 1000毫微克/毫升2毫升(1000毫微克/毫升)＋4毫升稀釋劑 333.3毫微克/毫升2毫升(333.3毫微克/毫升)＋4毫升稀釋劑 111.1毫微克/毫升2毫升(111.1毫微克/毫升)＋4毫升稀釋劑 37.0毫微克/毫升2毫升(37.0毫微克/毫升)＋4毫升稀釋劑 12.3毫微克/毫升2毫升(12.3毫微克/毫升)＋4毫升稀釋劑 4.11毫微克/毫升0＋4毫升稀釋劑 0毫微克/毫升
QC濃度分析、儲存及到期日 三種不同標的濃度(25、100及700毫微克/毫升)下之品質對照組(QC)試樣，係在分析當天新製備並使用，或以較大量製備，且以數液份在於或低於－70℃下冷凍儲存。經冷凍液份係在三個獨立實驗中分析。對於三個QC試樣之每一個，係將得自三個實驗之平均結果報告於分析證明書(COA)中。於實驗當天，將經冷凍QC試樣解凍，並分析，如下文所述。於解凍後，將各QC試樣在中間速度下渦旋2－4秒。經冷凍QC試樣係在製備日期後之6個月到期。在COA上所報告之其額定濃度下使用此等試樣。剛製成之QC係在製備後之24小時到期。
關於品質對照組(QC)試樣之稀釋液(實例) 稀釋液A：26.3微升(5.7毫克/毫升)＋4.973毫升稀釋劑＝30微克/毫升 233微升(30微克/毫升)＋9.767毫升稀釋劑＝700毫微克/毫升(QC1) 1.43毫升(700毫微克/毫升)＋8.57毫升稀釋劑＝100毫微克/毫升(QC2) 2.5毫升(100毫微克/毫升)＋7.5毫升稀釋劑＝25毫微克/毫升(QC3)
試樣製備. 將藥物試樣稀釋至大約12.5、6.25及3.125毫克/毫升。
稀釋液A：400微升試樣(~25毫克/毫升)＋400微升稀釋劑＝12.5毫克/毫升稀釋液B：400微升(~12.5毫克/毫升)＋400微升稀釋劑＝6.25毫克/毫升稀釋液C：400微升(~6.25毫克/毫升)＋400微升稀釋劑＝3.125毫克/毫升
板洗滌. 將板以洗滌緩衝劑，使用板洗滌器洗滌三次。將每井100微升之各標準濃度、試樣及QC試樣以三份複製添加至經阻斷與洗滌之板中。將各QC濃度添加兩次至每板總共六個井中。關於建議之安置，可參閱方法附件中之板圖。在22.5±5℃下培養1小時。重複步驟洗滌5次。將兔子抗－CD－CHO1 HCP生物素在Teknova緩衝劑中稀釋至2微克/毫升。將溶液在中間速度下渦旋大約2－4秒。每井添加100微升。在22.5±5℃下培養1小時。重複步驟洗滌5次。將鏈霉胺基酸－HRP(SA－HRP)在Teknova緩衝劑中適當地稀釋(實例：1/20,000稀釋液通常會造成可接受之吸光率讀數)。將100微升SA－HRP稀釋液添加至各井中，並在22.5±5℃下培養1小時。將TMB色原自冷藏室移除，並將每板最少10毫升傾析至適當容器中。放置在暗位置處，並允許回復至室溫。重複步驟洗滌5次。將100微升TMB色原添加至各井中，並在22.5±5℃下培養大約2分鐘。經由將100微升1N H2 SO4 添加至各井中，使色原反應停止。將終止溶液以如同添加色原之相同順序添加至板與井中，以確保色原與酵素在各井中之相同反應時間。以630毫微米之參考波長，於適當96井板讀取器上度量450毫微米下之吸光率。
數據分析. Softmax程式樣板"CHO1 Elisa template.ppr"係經安裝，以產生平均值、標準偏差、%CV、經計算之濃度、曲線吻合參數等。標準曲線.參考標準物數據係使用四參數曲線吻合功能被吻合至標準曲線：Y＝((A－D)/(1＋(X/C^B))＋D 其中：Y＝吸光率值(A450 －A630 )A＝相應於最低漸近線之吸光率值D＝相應於最高漸近線之吸光率值C＝相應於最高與最低漸近線值間之一半絕對差異之吸光率(轉折點)B＝在曲線之轉折點處之斜率X＝CD－CHO1 HCP之濃度
Softmax程式樣板"CHO1 Elisa template.ppr"係使用計算而得之平均值，測定關於標準物之回歸線之相關係數(R2 )。
標準. 測定關於標準物、QC及試樣之結果是否符合下文所列示之標準。關於標準物之標準.關於標準曲線之相關係數(R2 )必須≧0.99。關於零毫微克/毫升標準物濃度之平均背景必須≦0.2吸光率單位。若標準曲線之七個額定濃度之兩個或多個，排除零及低於QL(12.3毫微克/毫升)之濃度，未能符合條件6.1.4與6.1.5，則檢測被認為是無效，且必須重複。在用以測定標準曲線之各標準物濃度下，排除零及低於QL(12.3毫微克/毫升)之濃度，計算值之平均值(毫微克/毫升)必須在標的(額定)值之20%內。在各標準物濃度下，排除零及低於QL(12.3毫微克/毫升)之濃度，三份複製吸光率值之變易係數(%CV)必須低於20%。為確保有至少兩個適合數據點可用於計算；故將標準物、品質對照組及試樣裝填在三份複製井中。個別地分析各三份複製數值。捨棄位於離標的最遠之數值。再計算曲線，並再分析標準。
實例：
離25毫微克/毫升之標的值最遠之單一值為12毫微克/毫升。經由將12毫微克/毫升值自三份複製排除，其餘數值之平均值係符合所有標準。若顯示其餘兩個數值之平均值仍然未能符合標準，則將單一點排除，並再計算曲線。
實例：
平均值係距標的>20%，而不管那一個數值被排除，因此將單一點自曲線捨棄，且將再計算曲線。
關於QC試樣之標準. QC試樣在所述之濃度下為一組六個井。關於QC試樣之六個井中有至少四個，必須在對於QC試樣為可接受之額定之20%內。所有三個QC試樣必須為可接受。若未能符合此等標準，則必須重複檢測。
關於測試試樣之標準. 關於經檢測之測試試樣之吸光率值，必須低於最高QC。若數值超過最高QC之吸光率值，則必須將測試試樣充分稀釋，以致能夠獲得在700與12.3毫微克/毫升間之平均值。對於可報告之結果，三種試樣稀釋液(12.5、6.25及3.125毫克/毫升)中有至少一種必須落在標準曲線之範圍內，除非所有稀釋液之吸光率均低於檢測之QL。在該情況中，測試試樣係以<QL作報告。大於QL且落在檢測範圍內之試樣稀釋液之三份複製吸光率值之平均值應顯示低於20%之CV。
試樣中之CD－CHO1 HCP濃度之計算與報告結果. 試樣中之CD－CHOlHCP濃度之計算.對於各稀釋液，係將平均試樣結果乘以適當稀釋因數(意即2、4及8)，以獲得未經稀釋試樣中之CD CHO1 HCP之濃度，以毫微克/毫升表示。測定關於落在檢測範圍內之此等稀釋液之結果之平均值。將結果除以報告之CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質濃度(毫克/毫升)，以獲得CTLA4A29YL104E －Ig之CD CHO1 HCP之濃度，以毫微克/毫克表示。
實例計算：平均試樣結果：235毫微克CD－CHO1 HCP/毫升＝ 9.4毫微克/毫克蛋白質濃度：25.0毫克/毫升註：毫微克CD－CHO1 HCP/毫克產物(毫微克/毫克)係相當於每百萬份之份數(ppm)。
實例53：在CTLA4 A29YL104E －Ig中之蛋白質A含量藉由ELISA之測定
此酵素連結之免疫吸收檢測(ELISA)係定量CTLA4A29YL104E －Ig測試試樣中之蛋白質A之污染程度。首先將兔子抗－蛋白質A塗覆於微滴定板上。將蛋白質A參考標準物、品質對照組、回收對照組及CTLA4A29YL104E －Ig試樣以經結合之兔子抗－蛋白質AIgG培養。在洗滌微滴定板後，添加經生物素化之單株抗－兔子蛋白質AIgG抗體，其會結合至最初步驟期間所捕獲之蛋白質A。將微滴定板洗滌，以移除任何未經結合之單株抗體。然後，於一小時培養後，添加鏈霉胺基酸－辣根過氧化酶；將微滴定板再一次洗滌，以移除任何未經結合之共軛抗體。接著，添加TMB色原，以產生比色反應。使反應以硫酸終止，且在450毫微米下，於96－井微板讀取器中度量光學密度。顏色係與所捕獲蛋白質A之量成比例而顯像。試樣濃度係以經由將光密度對在0.188毫微克/毫升至12毫微克/毫升範圍內之蛋白質A濃度作圖所產生之標準曲線為基準而測得。
方法概述
以捕獲抗體之板塗覆. 在塗覆緩衝劑中製備兔子抗－蛋白質A抗體之1微克/毫升溶液，並將100微升溶液添加至Costar微滴定板之各井中。於4℃下培養18±2小時。
板洗滌與阻斷. 將板以洗滌溶液，使用板洗滌器洗滌三次。將200微升SuperBlockTM 添加至各井中。將微滴定板於環境溫度下培養60分鐘。參考標準物之製備. 經由將適當量之蛋白質A參考物質混合至適當體積之醋酸鹽緩衝劑中，製備參考標準物。將溶液在中間速度下渦旋2－4秒。在添加至微滴定板中之前，將參考標準物、品質對照組及回收對照試樣於環境溫度下培養10分鐘。
實例：參考物質蛋白質A,儲備液濃度2.3毫克/毫升1：200 10微升(2.3毫克/毫升)＋1990微升(醋酸鹽緩衝劑)＝11500毫微克/毫升1：47910微升(11500毫微克/毫升)＋4780微升(醋酸鹽緩衝劑)＝24毫微克/毫升2毫升(24毫微克/毫升)＋2毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝12毫微克/毫升2毫升(12毫微克/毫升)＋2毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝6毫微克/毫升2毫升(6毫微克/毫升)＋2毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝3毫微克/毫升2毫升(3毫微克/毫升)＋2毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝1.5毫微克/毫升2毫升(1.5毫微克/毫升)＋2毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝0.75毫微克/毫升2毫升(0.75毫微克/毫升)＋2毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝0.375毫微克/毫升2毫升(0.375毫微克/毫升)＋2毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝0.188毫微克/毫升 0毫升＋2毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝0毫微克/毫升
以三份複製，分析各標準物濃度。將試樣按方法附件中所述放置在微滴定板上。品質對照組試樣之製備.蛋白質A之品質對照組(QC)試樣係在醋酸鹽緩衝劑中，於0.5、2及5毫微克/毫升之三個標的濃度程度下製成。其係無論是於實驗當天製備新的，或以較大量製備，並在≦－70℃下，於750微升液份中冷凍。在經冷凍QC試樣中之蛋白質A濃度係在三個獨立蛋白質A ELISA實驗中，使用此方法預先測定，且對於各QC試樣，平均濃度結果係以分析證明書中之"額定"QC濃度作報告。
在實驗當天，將三個QC試樣之各一個小玻瓶於室溫下解凍。分析各QC濃度兩次(每濃度在兩次三份複製分析中)。將QC試樣按方法附件中所述放置在微滴定板上。
參考物質蛋白質A,2.3毫克/毫升1：200 10微升(2.3毫克/毫升)＋1990微升(醋酸鹽緩衝劑)＝11500毫微克/毫升 1：47910微升(11500毫微克/毫升)＋4780微升(醋酸鹽緩衝劑)＝24毫微克/毫升 833.3微升(24毫微克/毫升)＋3.166毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝5毫微克/毫升(QC1) 1.600毫升(5毫微克/毫升)＋2.4毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝2毫微克/毫升(QC2) 1毫升(2毫微克/毫升)＋3毫升(醋酸鹽緩衝劑)＝0.5毫微克/毫升(QC3)
測試試樣之製備. 在聚丙烯管件中，使用醋酸鹽緩衝劑(pH 3.5)製備濃度為2.5毫克/毫升、1.25毫克/毫升及0.625毫克/毫升之CTLA4A29YL104E －Ig測試試樣。在添加至微滴定板中之前，將測試試樣於環境溫度下培養大約10分鐘。
板洗滌. 將板以洗滌溶液，使用板洗滌器洗滌三次。應將板洗滌器設定為裝滿井，使用300微升洗滌緩衝劑，零浸泡時間。將100微升各參考標準物、品質對照組、回收對照組及測試試樣添加至各井中，並於環境溫度下培養一小時。重複步驟。將經生物素化之抗－蛋白質A抗體，按藉由對各新批號達最佳化所指示，以Teknova稀釋劑稀釋至所要之濃度。例如，對於單株抗－蛋白質A生物素共軛物而言，係製造1：64,000稀釋液，在中間速度下渦旋，並使用多通道吸量管將100微升添加至各井中。於環境溫度下培養一小時。
將鏈霉胺基酸－辣根過氧化酶，按藉由對各新批號達最佳化所指示，以Teknova稀釋劑稀釋至所要之濃度。例如，對於鏈霉胺基酸－辣根過氧化酶而言，係製造1：80,000稀釋液。在中間速度下渦旋，並將100微升添加至各井中，且在環境溫度下培養30分鐘。重複步驟，但洗滌五次。將100微升TMB色原添加至各井中。在室溫下培養大約2分鐘。關於標準曲線之最高濃度之光密度應在0.980與1.400之間。藉由添加100微升/井之1 N H2 SO4 使色原反應停止。將終止溶液以如同添加色原之相同順序添加至板與井中，以確保色原與酵素在各井中之相同反應時間。以630毫微米之參考波長，於適當96井板讀取器上度量450毫微米下之吸光率。
數據分析. 關於蛋白質A ELISA，係參考Softmax程式樣板，因其會產生平均值、標準偏差及%Cv等。所有在數據分析段落中進行之計算，將使用Softmax Pro中之蛋白質AELISA template.ppr進行。
將對經檢測之各參考與試樣濃度所獲得之三份複製吸光率值(Abs)平均。使用未加權之四參數回歸形式，製作蛋白質A標準物數據之模型： 其中：Abs＝吸光率最低值＝相應於最低漸近線之吸光率值最高值＝相應於最高漸近線之吸光率值ED50 ＝相應於最高與最低漸近線值間之一半絕對差異之吸光率B＝曲線吻合之轉折點之斜率C＝蛋白質A之濃度
標準. 關於標準物之標準. 關於標準物之標準對在於或高於定量極限(QL)之數值係適用，因低於QL之數值僅用以幫助建立曲線之極端值。關於標準曲線之測定係數(R2 )應≧0.99。對於零毫微克/毫升標準物之平均背景應≦0.08吸收單位。在用以測定標準曲線(惟零與QL除外)之各標準濃度下之計算值平均(毫微克/毫升)，必須在標的(額定)值之15%內。標準曲線之QL之三份複製吸光率值之平均必須顯示%CV低於20%，且在標的之20%內。
實例54－關於測定CTLA4 A29YL104E －Ig中之似MCP－1蛋白質之ELISA
進行此ELISA，以測定CTLA4A29YL104E －Ig中之似MCP－1蛋白質之濃度。標準曲線(0.4至25.6毫微克/毫升)、品質對照組及測試試樣之濃度係被施用至山羊抗－老鼠MCP－1吸收微滴定板，並於環境溫度(22.5±5℃)下培養60分鐘。將板洗滌，添加次生抗體(兔子抗－大白鼠MCP－1 IgG)，並在22.5±5℃下培養60分鐘。將板洗滌，將山羊抗兔子IgG辣根過氧化酶添加至各井中，並在22.5±5℃下培養30分鐘。將板洗滌，並添加TMB色原，以產生比色反應。以1N H2 SO4 使反應停止後，在450毫微米下，於96－井微板讀取器中度量光學密度，並將數據使用4－參數回歸曲線製作成模型。然後，似MCP－1蛋白質之濃度係對於各試驗試樣相對於MCP－1參考物質進行計算。濃度係以每毫克(每百萬份之份數，ppm)試樣之毫微克似MCP－1蛋白質(ppm)作報告，其方式是將相對於標準曲線所獲得之結果與未經稀釋之試樣濃度相除。此方法係允許測定在細胞培養物所衍生生物試樣中之似MCP－1雜質，該試樣包括進行中之經純化藥物與藥物產物。似MCP－1蛋白質可存在於中國大頰鼠卵巢(CHO)細胞培養物中所製成之生物試樣內。兩種多株抗體係經確認會結合至自CHO細胞所純化之似MCP－1雜質。抗體係針對老鼠與大白鼠MCP－1(完整)，且兩者確實會與得自CHO細胞之似MCP－1蛋白質交叉反應，其係在此報告中被証實。
板塗覆. 關於塗覆，係將山羊抗－老鼠MCP－1抗體以塗覆緩衝劑稀釋至5微克/毫升。將板以100微升/井塗覆。以板封閉器覆蓋板，並在22.5±5℃下培養12至18小時。板洗滌.將板以洗滌溶液，使用板洗滌器洗滌三次。應將洗滌器設定在三次洗滌，300微升/井與零浸泡時間。或者，可將板以手動方式洗滌。將300微升溶液使用經校準之多通道吸量管添加至各板之各井中。將井藉由輕打出至排水槽中排空，並於紙巾上溫和地吸乾。重複三次。
板阻斷. 將300微升塗覆安定劑與阻斷緩衝劑，使用經校準之多通道吸量管，添加至各井中。將板在22.5±5℃下培養一至二小時。板洗滌與儲存.將板按4.2中所述，以洗滌溶液洗滌三次。將板以每井300微升塗覆緩衝劑充填，以板封閉器覆蓋，並於黑暗中，在2－8℃下儲存至高一週。
標準物之製備. 自似MCP－1蛋白質儲備液，在PTB中製備25.6毫微克/毫升溶液，並在連續稀釋步驟(1：2)中，使用PTB作為稀釋劑，自其稀釋至12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4及0毫微克/毫升。或者，經冷凍之標準物可藉由製備大量標準物使用。分成數液份，並於－70℃至－80℃下儲存。避免重複冷凍/解凍。經冷凍標準物在三種獨立ELISA操作中，必須針對品質對照組被檢定合格。經冷凍標準物與QC於各操作中必須為可接受。於完成三種可接受之操作後，頒予分析證明書。經冷凍標準物將在其額定濃度下使用。其係於製備之日期起3個月到期。
關於具有0.97毫克/毫升儲備液濃度之MCP－1參考物之實例：在PTB中，製備2.5毫升之5200毫微克/毫升：13.4毫升儲備液＋2.487毫升稀釋劑b)在PTB中，製備160毫升之25.6毫微克/毫升：788毫升儲備液a＋160毫升稀釋劑經由將管件渦旋大約2－3秒，混合各溶液，然後溫和地翻轉2－3次。
品質對照組. 品質對照組(QC)為在17.7毫微克/毫升、5.3毫微克/毫升及1.2毫微克/毫升之額定濃度下，於PTB中製成之似MCP－1蛋白質。製備大量QC，分成數液份，並於－70℃至－80℃下儲存至高3個月。避免重複冷凍/解凍。品質對照組係在三種獨立ELISA操作中，針對標準曲線被檢定合格。QC於各操作中必須為可接受。於完成三種可接受之操作後，報告關於各可接受QC之平均結果，並頒予分析證明書。QC將在其計算而得之濃度下使用。其係於製備之日期起三個月到期。自具有0.97毫克/毫升之儲備液濃度之MCP－1參考物製備經冷凍QC稀釋液之實例：a)在PTB中製備2.5毫升之5200毫微克/毫升：13.4毫升儲備液＋2.487毫升稀釋劑b)按下述製備似MCP－1蛋白質品質對照組試樣之最後稀釋液：
藉由渦旋2－3秒，混合各溶液，然後溫和地翻轉2－3次。或者，QC可在分析當天新製備。
測試試樣. 測試試樣係經由將200微升測試試樣添加至200微升PTB中而製成，並渦旋2－4秒。將參考標準物、品質對照組(x2)及測試試樣添加至板中，以三份複製，每井100微升，並在22.5±5℃下培養1小時(不要使用外部井)。於PTB緩衝劑中，在2微克/毫升之濃度下製備次生兔子抗－大白鼠MCP－1抗體，以提供檢測中所使用板之足夠體積。將溶液渦旋大約2－4秒。重複洗滌作業，但洗滌五次。將100微升次生抗體溶液添加至各井中，並在22.5±5℃下培養60分鐘。製備三級山羊抗兔子HRP共軛溶液(例如1：20,000稀釋液或適當稀釋液)，使用PTB作為稀釋劑。將溶液渦旋大約2－4秒。重複洗滌。將100微升HRP共軛物添加至各井中，並在22.5±5℃下，於黑暗中培養30分鐘。重複洗滌。將100微升TMB添加至各井中，並在22.5±5℃下，於黑暗中培養3－6分鐘，或直到適當顏色已顯像為止。以如施行添加色原之相同順序，藉由添加100微升1.0N H2 SO4 ，使色原反應停止。以630毫微米之參考波長，於適當96－井板讀取器上讀取450毫微米下之光學密度。
數據減少 使用具有擬案檔案MCP－1.ppr之SoftmaxTM 軟體，以建構標準曲線，使用未加權之四參數回歸形式。
其中：A＝相應於最低漸近線之吸光度450值D＝相應於最高漸近線之吸光度450 值C＝相應於最高與最低漸近線值間之一半絕對差異之濃度B＝曲線之線性部份之大約斜率X＝參考標準物之濃度
對於標準曲線、品質對照組及測試試樣，僅報告具有可接受數據之試樣之結果。
關於標準物之標準. 關於標準物之標準係應用至在於或高於定量極限(QL)(0.8毫微克/毫升)之數值，因低於QL之數值僅用以幫助建立曲線之極端值。平均背景(零毫微克/毫升標準)必須≦0.1吸收單位。在用以測定標準曲線之各標準物濃度下，平均逆計算之MCP－1濃度(毫微克/毫升)必須在標的(額定)值之15%內。在用以測定標準曲線之各標準物濃度下，三份複製AB450 值之變異係數(%CV)必須≦15%。在標準曲線之QL下之三份複製AB450 值之平均值必須顯示%CV≦20%，且逆計算至標的(額定濃度0.8毫微克/毫升)之20%內。用以計算平均值之三份複製之各值將個別地分析。位於離平均值最遠之數值將被捨棄，再計算曲線，並再分析標準。若顯示其餘兩個數值之平均值仍然未能符合標準，則將單一點排除，並再計算曲線。
關於QC試樣之標準. QC試樣在所述濃度下係被定義為一組三個井，因此，關於此方法中所述之三種額定濃度，有總共六個QC試樣。關於QC試樣之三個井中有至少兩個之逆計算濃度，必須在對於QC試樣為可接受之20%先前所測得標的濃度(參閱COA)內。六個QC試樣中有至少四個必須為可接受；六個QC試樣中有兩個(並非在相同濃度下之兩個)可能無法令人接受，且18個QC試樣井中有不超過6個可偏離個別標的濃度超過20%。若未符合此等標準，則必須重複檢測。
關於測試試樣之標準. 平均計算之MCP－1濃度必須低於最高QC之濃度。若平均計算之MCP－1濃度≧0.8毫微克/毫升(QL)，則三份複製測定之%CV必須≦20%。若未能夠符合此條件，則試樣結果不為有效，且必須重複。若符合此標準，則使用平均MCP－1濃度以計算最後結果。若計算之MCP－1濃度<0.8毫微克/毫升(QL)，則試樣係以<QL作報告，並將數值"<0.8毫微克/毫升"使用於最後結果之計算。
實例55 －在CTLA4 A29YL104E －Ig與CTLA4－Ig中之CHO DNA藉由定量聚合酶連鎖反應之偵測
此程序已被發展，使用即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)檢測，以偵測藥物試樣中之殘留CHO DNA。PCR為DNA混合物之複製。此項檢測係使用螢光原探測物，以偵測特定CHO PCR產物，因其會在檢測期間累積。PCR產物之放大速率係直接與存在於試樣中之起始DNA量成正比。
DNA值之轉化成微微克/毫克. 將微微克/毫升值除以試樣之濃度，藉由在280毫微米下之吸光率測定。關於具有50毫克/毫升之蛋白質濃度與得自可信賴＝0.67 fg/微升之報告值之試樣之實例計算。步驟1：轉化成微微克/毫升＝0.67微微克/毫升。步驟2：轉化成微微克/毫克＝(0.67微微克/毫升/50.0毫克/毫升)＝0.013微微克/毫克。
實例56：CTLA4 A29YL104E －Ig藉由SDS－PAGE之分析
此實例係描述CTLA4A29YL104E －Ig之分析，以評估CTLA4A29YL104E －Ig藥物物質與藥物產物之純度。CTLA4A29YL104E －Ig係為經設計之融合蛋白質，其係由人類細胞毒性T－淋巴細胞抗原－4(CTLA4)之經修改配位體結合功能部位與人類IgG之Fc γ1區域所組成。CTLA4A29YL104E －Ig具有~92k道爾吞之分子量與97k道爾吞(未經還原)或55k道爾吞(經還原)之表觀分子量。CTLA4A29YL104E －Ig在4－20%梯度液SDS－聚丙烯醯胺凝膠上之電泳，係將主要單體性物種自較高分子量物種(聚集體、二聚體及較高階多聚體)以及任何低分子量物種(降解片段)分離。柯麥西(Coomassie)藍色染料凝膠之光密度度量掃描與ImageQuantTLTM 定量，係產生蛋白質純度之度量值。其結果在經還原與未經還原之條件下，係以CTLA4A29YL104E －Ig之百分比純度作報告。
試劑 註：所有試劑可被相當替代物取代。1X Tris－甘胺酸－SDS操作緩衝劑.將100毫升Tris－甘胺酸－SDS 10X操作緩衝劑添加至1升量筒中。以Milli－Q或HPLC級水使足量至1升。覆蓋，翻轉數次以混合。應在檢測當天製備此試劑。註：若需要則製備額外之體積。
柯麥西(Coomassie)藍色染色試劑. 在即將使用之前，經由將瓶子溫和地翻轉或傾斜，並漩渦打轉數次，混合GelCode藍色染料試劑溶液。當使用具有手動泵之3.5升GelCode容器(目錄編號24592)時，此種混合係為特別重要。不要振盪瓶子以混合溶液。註：重要的是，在分配之前混合染色試劑，以確保溶液為均勻。
固著溶液：50%甲醇/水中之7%醋酸. 將500毫升甲醇與70毫升醋酸在1升量筒中合併。以Milli－Q水使足量至1升，並混合。固著溶液在室溫下係為安定的，歷經至高六個月。
註：固著溶液應在化學煙霧通風櫥中製成。
染色對照組製備. 使用Milli－Q水，重配胰蛋白酶抑制劑，以製造2毫克/毫升儲備溶液。製備50微升液份，並在－30±10℃下冷凍至高6個月。使用下述稀釋方法，以將儲備液蛋白質溶液稀釋至工作濃度：25微升儲備溶液＋75微升Milli－Q水＝0.5微克/微升40微升之0.5微克/微升＋160微升Milli－Q水＝100毫微克/微升利用正下方表，以製備染色對照組裝填溶液。
裝填10微升染色對照組製劑，將產生100毫微克之蛋白質負載。
標準與試樣製備 關於固定方法、GLP/GMP藥物物質、藥物產物或安定性試樣之裝填圖樣.關於柯麥西(Coomassie)藍色染色凝膠之稀釋. 將試驗物件與參考物質稀釋至1.0微克/微升之工作濃度，並裝填具有分子量標記物之經還原與未經還原兩者，如正下方表中所述。
試樣製備與電泳. 關於10微克/通道蛋白質負載之試樣稀釋. 按照下文方法以製備10微升/10微升負載之試樣。使用Milli－Q水作為稀釋劑，將測試試樣與參考物質稀釋成10毫克/毫升CTLA4A29YL104E －Ig。近似濃度可用於計算。例如：若CTLA4A29YL104E －Ig藥物之試樣具有25毫克/毫升之濃度，則製備1：2.5稀釋液(將40微升試樣添加至60微升Milli－Q水中)。按照正下方表以製備最後試樣，以供電泳。對於此等稀釋液，係使用微離心管件。
試樣加熱. 在製備試樣稀釋液後，使微離心管件閉合，並使管件渦旋，以混合溶液。將試樣在水浴中，於80±5℃下加熱2.0±0.5分鐘(使用校準計時器)。將試樣自熱移除，並允許彼等冷卻至室溫。翻轉管件數次，以移除得自管件頂部與側面之凝結物。
裝置與凝膠製備. 將凝膠自其包裝移除，並小心地移除梳狀物，以確定此等井之壁為直的。若必要，則此等井可與凝膠裝填尖端直通。將凝膠插入電泳單元中，以致使短玻璃板朝向內室。若只有單一凝膠係被操作，則於相反側面上插入有機玻璃隔體。緊密地擠進凝膠以密封內室，隔離外室。以1X Tris－甘胺酸－SDS操作緩衝劑完全充填內室。檢查滲漏，然後，以1X Tris－甘胺酸SDS操作緩衝劑充填外室至井之底部。使用吸量管，以1X Tris－甘胺酸－SDS操作緩衝劑溫和地沖洗井，以移除任何殘留丙烯醯胺。重複井沖洗，直到井完全清理且經界定。
試樣裝填. 使用凝膠裝填尖端，以10微升試樣裝載各井。以10微升1X非還原試樣緩衝劑充填所有空白試驗通道。這將幫助防止未經還原試樣之還原，此係由於還原劑之瀝濾所致，且將保持同樣鹽濃度越過整個凝膠。
電泳. 連接凝膠箱蓋，並使電極連接至電源。將電流調整至25毫安培/凝膠(mA)，並設定電壓(v)與電源(w)至最高。註：電源設定可隨著不同賣主而改變。調整設定以達成25 mA/凝膠。使凝膠電泳60分鐘，或直到試樣緩衝劑染色前方正好抵達凝膠之底部為止。關閉電源，解開導線，並將凝膠自裝置移除。小心地拉開塑膠板。保持塑膠板與凝膠貼附於供染色技術用之適當固著溶液上。將凝膠浸沒於該溶液中，直到凝膠自塑膠板逐出為止。
凝膠固定. 註：所有步驟係在室溫下進行，伴隨著軌道振盪器上之溫和擺動。註：在緊密地密封容器中進行染色，以防止試劑蒸發。註：雖然可使用所引述之體積，但絕對必要的是，在所有步驟中凝膠應完全被覆蓋。凝膠與染色盤之大小必須被納入考量，以決定所需要之體積。在電泳後，添加50毫升固著溶液(50%甲醇/7%醋酸溶液)，歷經15分鐘。各以~100毫升Milli－Q水沖洗凝膠3次，歷經5分鐘。在使用之前將柯麥西(Coomassie)染色試劑溶液混合，並對8 x 10公分小凝膠添加50毫升。若使用較大盤子，則可能需要其他試劑。使用軌道振盪器溫和地振盪盤子，歷經20±1小時。關於一致性，將所有凝膠在相同操作中染色，歷經相同延續時間。經由以100毫升Milli－Q水，替代柯麥西(Coomassie)染色試劑而去除染色。在去除染色1小時後，凝膠係立即供掃描。
凝膠掃描與分析 在電泳與染色後，將所有凝膠使用光密度計掃描，並使用ImageQuantTLTM 軟體分析。將影像檔案儲存於電腦局部硬碟機上，並經由局部區域網路收集歸檔。掃描與分析參數係列示於正下方之表中。
註 ：在此表中之掃描參數不得在掃描期間改變。譜帶偵測參數、通道%寬度(設定在75%下)及背景校正(設定在200半徑下)係對所有掃描凝膠影像分析(任何改變將必須被記載)作建議。最低斜率、噪音降低及%最高吸收峰參數之調整，可能必須正確地確認譜帶，此係由於凝膠之物理性質上之差異，譬如於染色/去除染色後之凝膠收縮率，或於凝膠譜帶形狀之形狀上差異所致。以手動方式校正任何漏失或錯誤確認譜帶。參考ImageQuantTL(v2003.03)手冊與螢幕上說明書，關於譜帶偵測參數之其他資訊。
使用上表中所列示之掃描參數掃描凝膠。凝膠之所有分析與評估應自經掃描之影像施行。從ImageQuantTL軟體中之<1D凝膠分析 >開啟凝膠影像檔案(經掃描之影像)。進入工具桿上之<對比 >，並設定<影像直方圖－高 >參數至0.3，以加強凝膠影像，供所有譜帶之清楚顯像。註 ：此步驟係為凝膠影像之易於顯像，供下文分析，且對於定量結果沒有衝擊。不要使用經加強之凝膠影像，以達成目視評估凝膠譜帶或凝膠報告之目的。選擇<通道建立 >，並選擇<手動 >以安裝欲被分析之<通道數目 >。將<通道%寬度 >設定成75%。若必要則適當地對準單一通道。使用<滾球 >方法，以扣除背景。為正確地考慮背景，將<半徑 >設定成200。使用列示於表4中之最初<最低斜率 >、<噪音降低 >及<%最高吸收峰 >設定以偵測譜帶。此等數值之調整可能必須正確地確認譜帶。以手動方式評估任何漏失或錯誤確認之譜帶。利用列示於下文之分子量標記物，測定譜帶分子量。跳過校準與正規化步驟。將此等結果，包括分子量、譜帶體積及譜帶%，輸出至Excel工作單，以進一步考証與報告。列示於表5中之十二種分子量標準之十一種，應容易地與背景區別(圖77)。註：胰島素B鏈(3,500 Da)與胰島素A鏈(2,500 Da)可以單一寬帶呈現，或胰島素A鏈可能不會以目視方式被確認於凝膠上。
在此實例中，試驗物件之主要譜帶，關於未經還原(單體)與經還原(單鏈)兩者，係欲在凝膠上如CTLA4A29YL104E－Ig參考物質之相同相對位置中。參閱圖77。大豆胰蛋白酶抑制劑(21,500 Da)標準物在100毫微克/負載下之染色對照組，必須可見於經掃描之凝膠影像上(圖77,通道12)。在非還原條件下常被發現(單鏈)貼近55,400 Da分子量標記物基部之較小譜帶除外，於柯麥西(Coomassie)藍色染色凝膠中之任何其他譜帶之相對百分比強度對參考物質應為＝2%。註 ：主要譜帶之分子量評估不能精確地被測定，此係由於非高斯分佈所致。經還原參考物質之目視檢查係為產生單一寬帶，潛移至貼近55,400 Da分子量標記物基部之位置(參閱圖77)。經還原主要譜帶之百分比純度必須≧97%。未經還原參考物質主要譜帶之目視檢查必須產生單一寬帶，潛移至貼近97,400 Da與116,300 Da分子量標記物基部之位置(圖77，通道2)。參考物質主要譜帶之百分比純度必須≧97%。未經還原參考物質主要譜帶之目視檢查必須產生單一寬帶，潛移至貼近97,400 Da與116,300 Da分子量標記物基部之位置(圖77，通道2)。參考物質主要譜帶之百分比純度必須≧97%。
實例57－定量測定CTLA4 A29YL104E －Ig中之Triton X－100之HPLC方法
Triton X－100係於CTLA4A29YL104E －Ig之蛋白質試樣中，藉HPLC，在低每百萬份之份數(ppm)含量(<10 ppm)下測定。此方法係涉及萃取Triton X－100至固相萃取媒質上，接著以水洗滌，以移除殘留蛋白質，並以乙腈溶離Triton X－100。乙腈溶離物係使用Phenomenex Hypersil C1管柱，與包含乙腈：水(80：20)之流動相層析。藉由UV在225毫微米下偵測。此方法在1－22 ppm之間係為線性，具有檢測極限為0.25 ppm。CTLA4A29YL104E －Ig，一種潛在免疫壓抑劑，為第二代融合蛋白質，由細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA4)之配位體結合功能部位與人類IgG1重鏈之恒定區域所組成。Triton X－100，一種非離子性界面活性劑，係在CTLA4A29YL104E －Ig之純化中用於病毒失活。即使移除Triton X－100，此界面活性劑來自蛋白質之殘留含量或不存在，必須針對產物品質與調節目的而建立。為達此目的，一種能夠檢測且定量Triton X－100微量程度之方法係被發展。Triton X－100係自蛋白質萃取至SPE媒質上，並以乙腈溶離，以藉由HPLC分析。
標準物製備空白試驗. 先前藉此方法分析且發現並未包含可偵測含量之Triton X－100之任何試樣或參考標準物，可作為空白試驗使用。在空白試驗與試樣中之蛋白質濃度應為同樣。空白試驗應伴隨著試樣操作。
儲備標準溶液. 精確地稱量10.0±1.0毫克Triton X－100至100毫升體積中，並以水稀釋至適當體積，及混合。註：Triton X－100係慢慢地溶解於水中。在使用之前，檢驗溶液關於完全溶解(典型上在15分鐘後)。Triton X－100係比水黏稠，故未溶解之量係於水存在下可見。
工作標準溶液. 將25微升Triton X－100儲備標準溶液加料至0.5毫升CTLA4A29YL104E －Ig空白試驗中。經由渦旋或其他適當方式充分地混合。此工作標準溶液含有大約5 ppm(或5微克/毫升重量體積)之Triton X－100。註 ：標準溶液應每日新製備。
試樣製備. 試樣係以本身使用。空白試驗應伴隨著試樣操作。Triton X－100自標準與試樣溶液之萃取.下文所述之萃取步驟係在3－5英吋Hg之真空下進行。
固相萃取(SPE)媒質之活化作用. 升高真空歧管蓋，並將試管放置在歧管內部之掛架中。此等係為"廢棄"試管。置換蓋子，並將SPE管件放置於真空歧管上，確定有"廢棄"試管在各SPE管件之下方。將一毫升乙腈添加至各管件中，並將真空施加至管件中，直到所有乙腈已通過媒質床為止。重複步驟。得自標準物/試樣基質之Triton X－100在SPE媒質上之濃度. 於個別經活化SPE管件中，以吸量管吸取0.50毫升各工作標準溶液、試樣及空白試驗。將真空施加至SPE管件中，直到溶液已完全通過媒質床為止。自SPE床移除殘留蛋白質。將一毫升水添加至各SPE管件中，並將真空施加至管件中，直到水已通過媒質床為止。重複步驟。Triton X－100自SPE床之溶離.關閉對歧管之真空，以使該單元來到常壓。溫和地升高歧管蓋，其中標準物與試樣SPE管件仍然附著。以一組預先標識之試管(關於標準物、空白試驗及試樣)置換"廢棄"試管，以收集任何可能自下列步驟中之SPE床溶離之Triton X－100。此等係為溶離物試管。置換歧管蓋，確定各試樣、空白試驗及標準SPE床在下方具有個別溶離物試管。將0.50毫升乙腈添加至各SPE管件中，並將真空施加至管件中，直到所有乙腈已通過媒質床為止。關閉對歧管之真空，並升高蓋子，以取回溶離物試管。將標準物、試樣及空白試驗之乙腈溶離物放置於自動取樣器小玻瓶中，供注射至層析系統中。
系統適合性 於開始注射前，使管柱/系統以流動相平衡約一小時。獲得標準溶液之層析圖。關於Triton X－100之滯留時間應為5±1分鐘。當根據下列方程式計算時，關於Triton X－100之管柱效率，以理論板數(N)評估，必須>2000板/管柱： 其中：t 為Triton X－100吸收峰之滯留時間，而w 為在Triton X－100吸收峰基線上之寬度，藉由外推吸收峰之側面至基線所獲得。施行標準溶液之至少三次注射。最後三份注射之面積計數之百分比RSD不應大於3.0%。
將空白試驗層析圖自標準物與試樣層析圖扣除，並以下列計算進行： 其中：
實例58－關於測定CTLA4－Ig組合物CHO細胞DNA含量之檢測
此程序已被發展，使用即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)檢測，以偵測CTLA4－Ig藥物之試樣中之殘留CHO DNA。PCR為DNA混合物之複製物。此項檢測係使用螢光原探測物，以偵測特定CHO PCR產物，因其會在檢測期間累積。PCR產物之放大速率係直接與存在於試樣中之起始DNA之量成正比。此目的係為偵測CTLA4－Ig組合物之試樣中之CHO基因組DNA之量。
分析試樣，其方式是藉由定量聚合酶連鎖反應分析偵測生物試樣中之CHO DNA。進行計算，並將結果以微微克/毫克之單位報告至兩個有效數字。若其結果低於檢測之定量極限，則結果係以<Q.L.作報告，並記錄檢測之Q.L.。有DNA值之轉化成微微克/毫克。將微微克/毫升值除以試樣之濃度，藉由在280毫微米下之吸光率測得。關於具有50毫克/毫升之蛋白質濃度與得自可信賴＝0.67 fg/微升之報告值之試樣之實例計算。步驟1：轉化成微微克/毫升＝0.67微微克/毫升 步驟2：轉化成微微克/毫克＝(0.67微微克/毫升/50.0毫克/毫升)＝0.013微微克/毫克。
實例59－在生物試樣與CTLA4－Ig組合物中之MCP－1蛋白質之測定
實例係詳述用以定量生物試樣與CTLA4－Ig之試樣中之殘留似MCP－1蛋白質之方法。
物料：
試劑磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS,10 mM磷酸鹽緩衝劑,137 mM NaCl,2.7 mM KCl,pH 7.3至7.5).根據製造者說明書在瓶上製備。於足夠大小之容器中，加入HPLC級水、PBS丸粒及攪拌棒。於攪拌板上混合，直到丸粒與鹽溶解為止。按需要將pH 7.3以氫氧化鈉或鹽酸調整至7.5。攪拌直到充分混合為止。經過用後即棄之0.22微米濾器單元過濾。從製備之日期起，將溶液在2－8℃下儲存至高30天。
MCP－1(單細胞向化性蛋白質－1)係為人類蛋白質，其在單細胞之添補至損傷與感染之位置上，係扮演一項角色。以同系性及與針對MCP－1之抗體之交叉反應性為基礎，蛋白質可被認為是似MCP－1。由於ELISA中所使用之抗體僅會辨識標的蛋白質之一部份，故MCP－1之截頭形式可在檢測中反應，即使其可能並非技術上活性。因此，在檢測中反應之大頰鼠MCP－1之任何變型將經定量，以致檢測會偵測全長MCP－1與MCP－1之任何變型，其含有正確抗原決定部位，應注意的是，利用多株抗體混合物，較可能情況是多個抗原決定部位將被提出。
洗滌溶液(1.0 mM磷酸鹽緩衝劑,137 mM NaCl,0.27 mM KCl,pH 7.3至7.5,含有0.01% v/v Tween 20). 於4.0升經蒸餾或HPLC級水中，加入攪拌棒、2個PBS片劑、28.8克NaCl及0.4毫升Tween 20。溫和地混合，直到所有內容物溶解為止。按需要將pH 7.3以氫氧化鈉或鹽酸調整至7.5。從製備之日期起，在2－8℃下儲存至高30天。
稀釋劑(PBS,pH 7.3至7.5,含有1% w/v BSA與0.05% v/v Tween 20). (請注意這是使用市購可得稀釋劑之一種替代方式)。於4升磷酸鹽緩衝之鹽水中，加入攪拌棒、40克BSA及2毫升Tween 20。溫和地混合，直到所有內容物均被溶解為止。經過0.22微米濾器過濾。當未打開或打開後7天儲存時，從製備之日期起，在2－8℃下儲存至高30天。
板塗覆試劑. 依照製造者說明書，重配數個小玻瓶之山羊抗－老鼠MCP－1抗體，藉由溫和地翻轉數次混合，並合併。製備液份，並在－20℃下儲存至高一年(不超過製造者失效期)。避免重複冷凍融解。或者，可將經凍乾之試樣小玻瓶在－20℃下儲存大於六個月。於重配後，可將抗體在2－4℃下儲存一個月。
二級試劑. 依照製造者說明書，重配一個小玻瓶之兔子抗－大白鼠MCP－1抗體，藉由溫和地翻轉數次混合。將溶液在2－8℃下儲存至高四週。或者，經凍乾之試樣小玻瓶在－20℃下係為安定的，歷經大於一年。
三級試劑. 匯集數個小玻瓶之山羊抗兔子IgG(H＋L)HRP，並藉由溫和地翻轉數次混合。製備液份，並在－20℃下儲存至高2年(不超過製造者失效期)。避免重複冷凍融解。一旦融解，可將小玻瓶在2至8℃下儲存至高30天。
標準物之製備. 自似MCP－1蛋白質儲備液，在稀釋劑中製備25.6毫微克/毫升溶液，並在連續稀釋(2倍)步驟中，自其稀釋至12.8、6.4、3.2、1.6、0.8及0.4。0毫微克/毫升標準物係為未經稀釋之稀釋劑。
關於使用MCP－1參考物質，以0.97毫克/毫升之儲備液濃度製備標準物之實例：b)(溶液A)在稀釋劑中製備2.5毫升之5200毫微克/毫升：13.4微升儲備液＋2.487毫升稀釋劑c)(溶液B)在稀釋劑中製備3.9毫升25.6毫微克/毫升：19.2微升儲備液a＋3.881毫升稀釋劑使用下文所定義之體積製備其餘標準物：
將各溶液藉由渦旋在中間設定下混合大約2－3秒，然後溫和地翻轉2－3次。
品質對照組試樣之製備. 自一個小玻瓶之似MCP－1蛋白質，在稀釋劑中製備品質對照組(QC)試樣。製備520毫微克/毫升溶液儲備液濃度，下列供冷凍之品質對照組試樣係自其製成：11.0毫微克/毫升、5.3毫微克/毫升及1.2毫微克/毫升。按下表中所述稀釋。
關於使用MCP－1參考物質，以0.97毫克/毫升之儲備液濃度製備QC之實例： a)(溶液A)在稀釋劑中製備2.5毫升之5200毫微克/毫升：13.4微升儲備液＋2.487毫升稀釋劑b)(溶液B)在稀釋劑中製備5.0毫升之520毫微克/毫升：500微升儲備液＋4.500毫升稀釋劑c)按下述製備似MCP－1蛋白質QC試樣之最後稀釋液：
將各溶液藉由渦旋在中間設定下混合大約2－3秒，然後溫和地翻轉2－3次。
測試試樣之製備. 各試驗試樣包括經稀釋之試驗物件。測試試樣係經由將200微升測試試樣添加至200微升稀釋劑中而製成。將各溶液藉由渦旋在中間速度下混合大約2－3秒，然後溫和地翻轉2－3次。
程序. 板塗覆. 將山羊抗－老鼠MCP－1抗體以PBS稀釋至5微克/毫升。將抗體與PBS溶液藉由渦旋在中間設定下混合大約2－3秒，然後溫和地翻轉2－3次。使用多通道吸量管，將100微升此溶液添加至各井中。將板以板封閉器覆蓋，並在室溫下培養12至18小時。板洗滌.將板以洗滌溶液，使用板洗滌器洗滌三次。將洗滌器設定在三次洗滌，300微升/井與零浸泡時間。或者，可將板以手動方式洗滌。將300微升洗滌溶液使用多通道吸量管添加至各板之各井中。將井藉由輕打出至排水槽中排空，並於紙巾上溫和地吸乾。重複三次。板阻斷.將300微升CSBB使用多通道吸量管添加至各井中。將板在室溫下培養大約60±10分鐘。添加試樣。將參考標準物、品質對照組(每一濃度兩組)及測試試樣添加至板中，以三份複製，100微升/井，並在室溫下培養大約60±10分鐘。不要使用外部井。製備次生兔子抗－大白鼠MCP－1抗體。將兔子抗－大白鼠MCP－1抗體儲備液在稀釋劑中，以供檢測中所使用板之足夠體積，稀釋至2微克/毫升或適當稀釋(根據批料等效性測試或COA)。將溶液在中間速度下渦旋大約2－4秒。重複板洗滌，但洗滌五次。使用多通道吸量管，將100微升次生抗體溶液添加至各井中，並在室溫下培養60±10分鐘。使用稀釋劑製備三級山羊抗兔子HRP共軛溶液(0.5微克/毫升或適當稀釋)。將HRP共軛物藉由渦旋在中間設定下混合大約2－3秒，然後溫和地翻轉2－3次。稀釋至根據部門SOP所建立之濃度，供試劑合格評定。重複板洗滌五次。使用多通道吸量管，將100微升HRP共軛物添加至各井中，並在室溫下，於黑暗中培養大約30±5分鐘。重複板洗滌五次。使用多通道吸量管，將100微升TMB添加至各井中，並在環境溫度下於黑暗中培養大約2.5－4分鐘。使用多通道吸量管，以與施行TMB添加之相同順序，添加100微升1.0N H2 SO4 ，使TMB反應停止。以630毫微米之參考波長，於96－井板讀取器上讀取450毫微米下之光學密度。
標準. 關於標準物之標準係應用至在於或高於定量極限(QL)(0.8毫微克/毫升)之此等數值，因低於QL之數值僅用以幫助建立曲線之極端值。使用下文計算，平均背景(零毫微克/毫升標準物)必須≦0.1吸收單位。
其中：X1,2,3 ＝一組數據中之特定值N＝一組數據中之數值之數目
用以測定標準曲線之各標準物濃度，排除零、0.4及QL(0.8毫微克/毫升)，必須在標的(額定)值之15%內。在用以測定標準曲線之各標準物濃度下，除了零、0.4及QL(0.8毫微克/毫升)之外，三份複製AB450 值之變異係數(%CV)必須≦15%。對於CTLA4－Ig組合物之測試試樣，平均計算之MCP－1濃度應≦11.0毫微克/毫升。若平均計算之MCP－1濃度≧0.8毫微克/毫升(檢測QL)，則計算三份複製測定之%CV，且標準必須≦20%。若符合標準，則使用平均MCP－1濃度以計算ppm。若計算之MCP－1濃度≦0.8毫微克/毫升(檢測QL)，則試樣係以<QL作報告，並將數值"<0.8毫微克/毫升"用於ppm之計算中。三份複製測定之%CV不被考慮。
QC試樣在所述濃度下係被定義為一組三個井，因此，關於此方法中所述之三種額定濃度，有總共六個QC試樣。關於QC試樣之三個井中有至少兩個之濃度，必須具有對於QC試樣為可接受之20%所述額定濃度。十八個QC試樣測定中有至少十二個必須在其個別標的值之20%內。十八個QC試樣中有六個(並非在相同濃度下之三個)可偏離個別額定值超過20%。六個QC試樣中有至少四個必須為可接受。允許有兩個為無法令人接受，其條件是其皆不在相同濃度下。數據評估. 使用具有擬案檔案MCP－1.ppr之SoftmaxTM 軟體，以建構標準曲線，使用未加權之四參數回歸形式。
其中：A＝相應於最低漸近線之吸光度450 值D＝相應於最高漸近線之吸光度450 值c ＝相應於最高與最低漸近線值間之一半絕對差異之濃度b ＝曲線之線性部份之大約斜率x ＝參考標準物之濃度
關於似MCP－1蛋白質之濃度之計算. 於測試試樣中之似MCP－1蛋白質之量，可使用Softmax板讀取器軟體計算。下文實例係說明最後結果可如何被報告。各試樣之兩倍稀釋液係經檢測。將計算之濃度乘以適當稀釋因數(2)，而得未經稀釋試驗物件中之濃度。
實例：1)經稀釋之測試試樣為10.0毫微克/毫升。於未經稀釋試驗物件中之似MCP－1蛋白質濃度為：10毫微克/毫升x 2＝20毫微克/毫升MCP－1
2)經稀釋之試樣結果為"<0.8毫微克/毫升"。於未經稀釋試驗物件中之似MCP－1蛋白質濃度為："<0.8毫微克/毫升"x 2＝"<1.6毫微克/毫升"MCP－1
為以每毫克試樣之毫微克似MCP－1蛋白質(ppm)報告最後結果，故將上文所獲得之結果除以未經稀釋之試樣濃度。實例：1)測試試樣蛋白質濃度＝50毫克/毫升似MCP－1蛋白質濃度＝200毫微克/毫升：200毫微克/毫升MCP－1/50毫克/毫升＝4毫微克/毫克試樣係以4 ppm(每百萬份之份數)作報告
2)測試試樣蛋白質濃度＝50毫克/毫升似MCP－1蛋白質濃度＝"<1.6毫微克/毫升"："<1.6毫微克/毫升"MCP－1/50毫克/毫升＝"<0.032毫微克/毫克"
試樣係以"<QL,(<0.032 ppm)"作報告
實例60：關於藉由ELISA測定CD－CHO1蛋白質之殘留含量之檢測，以供CTLA4－Ig藥物物質之釋出測試
碳酸鹽緩衝劑. 於含有攪拌棒之適當容器中添加200毫升HPLC級水、2個碳酸鹽緩衝劑膠囊之內容物。使用攪拌板，混合直到物質溶解為止。使用pH計，按需要將pH以無論是1N NaOH或H2 SO4 調整至9.6。使用攪拌板，將溶液混合最少5分鐘。將溶液經過0.22微米濾器過濾。將溶液在2－8℃下儲存至高30天，並根據部門程序標識。
洗滌緩衝劑(PBS,含有0.05% v/v Tween 20,pH 7.4). 於HPLC級水之4升瓶中，加入攪拌棒、20個PBS片劑，添加2毫升Tween 20。使用攪拌板，混合直到物質溶解為止。使用pH計，按需要將pH以無論是1N NaOH或1N HCl調整至7.4。使用攪拌板，將溶液混合最少5分鐘。將溶液在2－8℃下儲存至高30天，並根據部門程序標識。
鏈霉胺基酸－HRP. 將0.5毫升HPLC級水添加至鏈霉胺基酸－HRP之小玻瓶中。混合，將小玻瓶加蓋，並溫和地渦旋大約10秒。將0.5毫升甘油添加至鏈霉胺基酸－HRP之小玻瓶中。混合。經由將溶液抽出至乾淨巴斯德吸量管中，檢查溶液透明度。若溶液不為透明，則根據3.3.2混合，並重複3.3.5直到溶液透明為止。根據部門程序，測定欲被用於鏈霉胺基酸HRP之批料之適當稀釋方案。將20微升體積分成數液份至0.5毫升螺帽管件。加蓋，並放置在細胞儲存箱中。將溶液在－20℃下儲存至高365天，並根據部門程序標識。
終止溶液(1N H2 SO4 ). 於煙霧通風櫥中，將適當容器放置在攪拌板上。加入攪拌棒。添加485.6毫升HPLC級水。轉向攪拌位置，以開始攪拌水。慢慢地添加14.4毫升濃H2 SO4 。當在室溫下儲存時，溶液係為安定的，歷經90天。根據部門程序，將溶液標識。
程序. 板塗覆. 製備欲被用於塗覆微滴定板(每微滴定板需要10毫升溶液)之8微克/毫升經純化之兔子抗－CDCD CHO1抗體在碳酸鹽緩衝劑中之溶液。將100微升此溶液使用多通道吸量管添加至Immulon 4微滴定板之各井中。將微滴定板以帕拉膜(parafilm)覆蓋，並在2－8℃下培養18±2小時。
板洗滌. 將板以300微升洗滌緩衝劑，使用板洗滌器工具洗滌三次(或者，可將板使用多通道吸量管以手動方式洗滌)。於最後一次洗滌之後，應將板倒置，並對著舖設在硬質表面上之紙巾輕拍。
板阻斷. 使用多通道吸量管，將300微升SeaBlock添加至各井中。將板在室溫下，於黑暗中培養1小時(±6分鐘)。可將板無論是以鋁箔包覆，或放置在箱櫃或盒中。使用Teknova稀釋劑，在15毫升有刻度無菌聚丙烯管件中，根據下文稀釋方案製備標準曲線試樣。 註 ：下文稀釋方案係用於5種板。按需要對檢測中之塔板數調整體積。 自分析證明書(COA)獲得CD－CHO1蛋白質參考標準物(Ref Std)之蛋白質濃度。製備CD－CHO1蛋白質參考標準物之30微克/毫升溶液。計算CD－CHO1蛋白質參考標準物之所需要體積，以獲得30微克/毫升溶液。關於CD－CHO1蛋白質參考標準物之最小轉移體積應為10微升。
公式 ： 註 ：確保單位為可相容。
實例 ：
藉由從所要之體積減去CD－CHO1蛋白質參考標準物之所需要體積，計算稀釋劑之體積。
公式： (所要之體積)－(參考標準物體積)＝(稀釋劑體積)
實例： 10.0毫升－0.012毫升＝9.988毫升稀釋劑
將計算之CD－CHO1蛋白質參考標準物之體積添加至含有計算之稀釋劑體積之15毫升無菌管件中。將管件加蓋，並在2－4秒間之設定下渦旋。製備其餘標準物。顯示下表作為實例：
按照各稀釋步驟將管件加蓋，並在進行至下一稀釋步驟之前溫和地渦旋2－4秒。
使用Teknova稀釋劑，在15毫升有刻度無菌聚丙烯管件中，根據下文稀釋方案，製備品質對照組(QC)溶液。自分析證明書(COA)獲得CD－CHO1蛋白質參考物質(Ref Mat)之蛋白質濃度。製備CD－CHO1蛋白質參考標準物(Ref Mat)之30微克/毫升溶液。將管件加蓋，並在2－4秒間之設定下渦旋。製備在700、100及25毫微克/毫升之濃度下之QC溶液。實例稀釋方案係示於下文：
對於各QC溶液，係將管件加蓋，並溫和地渦旋2－4秒。可於檢測當天製備新品質對照組溶液，或可從其取得液份並冷凍。在三個獨立實驗中，測定三種QC溶液之實際濃度。對於各QC溶液，係將得自三個實驗之結果平均，並對各三種QC溶液給予COA。當於CTLA4－Ig試樣上進行分析時，此等經實驗上測定之QC濃度係欲被作為標的值使用。將立即可用液份中之QC溶液在－70℃下儲存。QC溶液係於製備後6個月到期。將QC溶液在檢測當天自儲存庫移除，並在室溫下解凍。在使用之前，將經解凍之QC溶液在中間速度下渦旋2－4秒。
試樣製備. 在稀釋劑中，經由將250微升藥物試樣添加至750微升稀釋劑中，對欲被分析之各CTLA4－Ig試樣製備大約12.5毫克/毫升溶液。將管件加蓋，並溫和地渦旋2－4秒。經由將400微升12.5毫克/毫升溶液添加至含有400微升稀釋劑之管件中，對欲被分析之各CTLA4－Ig試樣製備6.25毫克/毫升溶液。將管件加蓋，並溫和地渦旋2－4秒。經由將400微升6.25毫克/毫升溶液添加至含有400微升稀釋劑之管件中，對欲被分析之各CTLA4－Ig試樣，製備3.125毫克/毫升溶液。將管件加蓋，並溫和地渦旋2－4秒。藉由重複洗滌步驟洗滌板。將每井100微升各標準物濃度、試樣及QC溶液以三份複製添加至經阻斷與洗滌之板中。將各QC溶液添加兩次至每板總共六個井中。在室溫下，於黑暗中培養1小時(±6分鐘)。重複洗滌5次。將鏈霉胺基酸－HRP自冷凍庫移除，並允許回復至室溫。將兔子抗－CD CHO1－生物素抗體在Teknova緩衝劑中稀釋至2微克/毫升。將溶液在中間速度下渦旋大約2－4秒。使用多通道吸量管，每井添加100微升。在室溫下，於黑暗中培養1小時(±6分鐘)。將鏈霉胺基酸－HRP稀釋至經建立以供使用於此檢測中之濃度，以試劑批料之合格評定為基礎，根據部門程序。加蓋，並將溶液在中間速度下渦旋大約2－4秒。使用多通道吸量管，將100微升鏈霉胺基酸－HRP稀釋液添加至各井中。在室溫下，於黑暗中培養1小時(±6分鐘)。重複。使用多通道吸量管，將100微升TMB色原添加至各井中。於環境溫度下培養2分鐘(±12秒)。使用多通道吸量管，添加100微升/井終止溶液(1N H2 SO4 )。將終止溶液以如添加色原之相同順序添加至板與井中，以確保色原與酵素於各井中之相同反應時間。使用Spectramax Plus板讀取器，以630毫微米之參考波長，於適當96井板讀取器上度量450毫微米下之吸光率。
數據評估. 參考Softmax程式樣板，因其會產生平均值、標準偏差及%CV等。使用對經檢測之各參考、QC及試樣稀釋液所獲得之三份複製吸光率值，測定各標準。產生標準曲線。使用四參數回歸形式，製作參考標準物數據模型。
其中：AB＝在450毫微米下之吸光度A＝相應於最低近線之吸光度值D＝相應於最高漸近線之吸光度值c＝相應於最高與最低漸近線值間之一半絕對差異之濃度B＝曲線之線性部份之大約斜率x＝CD－CHO1參考物質之濃度
使用計算之平均值，使用上式，測定關於標準物之回歸線之測定係數(R2 )。計算試樣中之CD－CHO1濃度。將平均試樣結果乘以適當稀釋因數(意即4、8及16)，以獲得原試樣中之CD－CHO1之濃度，以毫微克/毫升表示。將其結果除以所報告之CTLA4－Ig蛋白質濃度(毫克/毫升)，以獲得CTLA4－Ig之CD－CHO1之濃度，以毫微克/毫克表示。測定所有結果之平均值，其係落在標準曲線之範圍內。藉由應用稀釋因數，計算未經稀釋試樣中之CD－CHO1蛋白質濃度。為測定相對於CTLA4－Ig試樣濃度之CD－CHO1蛋白質濃度，係除以未經稀釋之濃度。
實例計算： 註 ：毫微克CD CHO1毫克產物(毫微克/毫克)係相當於每百萬份之份數(ppm)。
標準. 關於標準物之標準. 關於標準曲線之測定係數(R2 )應≧0.99。關於零毫微克/毫升標準物之平均值應≦0.10吸收單位。當藉軟體測定時，在用以測定標準曲線之各標準物濃度下，排除零與低於QL(12.3毫微克/毫升)之濃度，計算值之平均值(毫微克/毫升)必須在標的(額定)值之20%內。當藉軟體測定時，在用以測定標準曲線之各標準物濃度下，排除零與低於QL(12.3毫微克/毫升)之濃度，三份複製吸光率值之變易係數(%CV)必須低於20%。為確保有至少兩個適合數據點可用於計算，故將標準物、品質對照組及試樣裝填在三份複製井中。個別地分析各三份複製數值。捨棄位於離標的最遠之數值。
實例：
離50毫微克/毫升之標的值最遠之單一值為25毫微克/毫升。經由將25毫微克/毫升值自三份複製排除，其餘數值之平均值係符合所有標準。若於再計算後，另一個濃度未能符合標準，則檢測不為有效，且必須重做。若顯示其餘兩個數值之平均值仍然未能符合標準，則將單一點排除，並再計算曲線。
實例：
平均值為距標的>20%，而不管那一個數值被排除，因此將單一點自曲線捨棄，且將再計算曲線。在標準曲線上只有2個點可被排除。
關於QC試樣之標準. QC試樣在所述濃度下係被定義為一組三個井，因此，關於此方法中所述之三種額定濃度，有總共六個QC試樣。關於QC試樣之三個井中有至少兩個，必須在對於QC試樣為可接受之20%額定內。當藉由軟體計算時，六個QC試樣中有至少四個必須在其個別標的濃度之20%內；六個QC試樣中有兩個(並非在相同濃度下兩個)可超過20%偏離額定。18個QC試樣井中有不超過6個可偏離個別標的濃度超過20%。若未符合此等標準，必須重複檢測。
關於測試試樣之標準. 關於經檢測之測試試樣之平均吸光率，必須低於標準曲線上之最高點。若試樣之平均吸光率超過平均吸光率3000毫微克/毫升標準物，則必須將測試試樣充分稀釋，以獲得在3000與12.3毫微克/毫升間之平均吸光率。對於可報告之結果，三種試樣稀釋液(12.5、6.25及3.125毫克/毫升)中有至少一種之平均吸光率必須落在標準曲線之範圍內，除非所有稀釋液之平均吸光率低於QL(12.3毫微克/毫升標準物)之平均吸光率。在該情況中，測試試樣係以<QL作報告。當藉軟體測定時，大於QL且落在標準曲線範圍內之試樣稀釋液之三份複製吸光率值之平均值必須顯示低於20%之CV。若於排除一個三份複製吸光率之一且再計算後，CV仍然>20%，或若兩種試樣稀釋液具有大於20%之吸光率CV，且落在標準曲線之範圍內，則必須重複分析此試樣。
實例61－關於CTLA4－Ig組合物中之Triton X－100之殘留量之檢測
物料HPLC小玻瓶 Waters,總回收小玻瓶套件,具有經結合之預切開PTFE/聚矽氧隔片之螺帽(目錄186000385) 註 ：需要小玻瓶 固相萃取管件 Waters,OASIS HLB值,30毫克/lcc,(目錄編號WAT094225)管柱 Thermo Electron公司SAS Hypersil,5 μ,4.6 x 250毫米(零件編號30505－254630)儀器配置液體層析儀 Waters 2695分離模組偵測器 Waters 2487雙波長UV偵測器SPE管柱處理器 JT Baker真空歧管,Spe－21型分析天平 任何能夠精確地稱量0.01毫克之天平積分 Waters Empower數據系統
試劑之製備流動相製備：乙腈：水(80：20). 對於1升，以攪拌棒充分地混合800毫升乙腈與200毫升經純化或HPLC級水。經過0.2微米尼龍濾器過濾。將流動相使用管線內脫氣器，譬如Alliance系統，或使用氦噴射脫氣。每日製備新的。
2N NaOH. 稱量，並將80±1克固體NaOH定量地轉移至1升燒瓶。以經純化或HPLC級水使來到適當體積。以攪拌棒充分混合，並經過0.22微米濾器裝置過濾。或者，序列稀釋10N NaOH溶液。在室溫下儲存至高6個月。
藥物緩衝劑. 稱量，並將3.45克NaH2 PO4 ．H2 O與2．92克NaCl定量地轉移至1升燒瓶。添加大約800毫升經純化或HPLC級水。以攪拌棒充分混合，並以經純化或HPLC級水使來到適當體積。將pH以2N NaOH調整至7.5。使溶液經過0.22微米濾器單元過濾。於4℃下儲存至高4個月。
標準試樣空白試驗之製備. 任何先前經分析且發現不包含可偵測含量之Triton X－100之CTLA4－Ig試樣或參考物質可作為試樣空白試驗使用。試樣空白試驗蛋白質應伴隨著試樣一起操作。使Triton X－100慢慢地溶解在水中。在使用之前，檢查溶液完全溶解(典型上為15分鐘後)。Triton X－100係比水黏稠，所以未溶解量於水存在下為可見的。
10.0微克/毫升Triton X－100儲備液標準物#1之製備. 將10.0±1.0毫克Triton X－100精確地稱量至100毫升量瓶中，並以水稀釋至適當體積；且以攪拌棒溫和地混合。標識為TX100儲備液標準物A。將10毫升TX100儲備液標準物A採取至100毫升量瓶中。以水稀釋至適當體積。標識為TX100儲備液標準物# 1。每日製備新的。
10.0微克/毫升Triton X－100儲備液標準物#2之製備. 將10.0±1.0毫克Triton X－100精確地稱量至100毫升量瓶中，並以水稀釋至適當體積；且以攪拌棒溫和地混合。標識為TX100儲備液標準物B。將10毫升TX100儲備液標準物B採取至100毫升量瓶中。以水稀釋至適當體積。標識為TX100儲備液標準物#2。每日製備新的。
TX100系統適合性評估溶液# 1(SS# 1)之製備. 自TX100儲備液標準物# 1，經由將300微升TX100儲備液標準物# 1以300微升乙腈稀釋，而製備5.0微克/毫升TX100系統適合性評估溶液。藉由以吸量管上下吸取而充分混合。
TX100系統適合性評估溶液#2(SS#2)之製備. 自TX100儲備液標準物#2，經由將300微升TX100儲備液標準物# 1以300微升乙腈稀釋，而製備5.0微克/毫升TX100系統適合性評估溶液。藉由以吸量管上下吸取而充分混合。
TX100通過對照組、極限標準物、未能通過對照組之製備. 自TX儲備液標準物# 1，製備下表中所確認之溶液。
製備試樣. 使用試樣，而無需濃縮或稀釋。
程序 ：將Triton X－100自標準物與試樣溶液萃取。注意：下文所述之萃取步驟係在3－3.5英吋Hg之真空下進行。
固相萃取(SPE)媒質之活化作用. 升高真空歧管之蓋子，並將空12 x 75毫米試管放置在歧管內部之掛架中。此等係為"廢棄"試管。置換蓋子，並將SPE藥筒放置在真空歧管上，確定在各SPE管件下方有"廢棄"試管。將1000微升乙腈添加至各SPE藥筒中，並施加真空直到所有乙腈已通過媒質床為止。以另外1000微升乙腈重複。將500微升經純化或HPLC級水添加至各SPE藥筒中，並施加真空直到所有水已通過媒質床為止。以另外500微升經純化或HPLC級水重複。
關於極限標準物與對照組之SPE媒質上之Triton X－100之濃縮. 將500微升各極限標準物、通過對照組、未能通過對照組空白試驗及試樣以吸量管吸取至個別經活化之SPE藥筒中。將真空施加至SPE管件，直到各溶液已完全通過媒質床為止。
殘留蛋白質自SPE床之移除. 將1000微升水添加至各SPE藥筒中，並將真空施加至管件，直到水已通過媒質床為止。以另外1000微升水重複步驟。
Triton X－100自SPE床之溶離. 關閉對歧管之真空，以釋出單元壓力至零。溫和地升高歧管之蓋子，其中SPE藥筒仍然連接著。將"廢棄"試管以一組預標識之"溶離物"試管或自動取樣器小玻瓶(預標識之極限標準物、通過對照組、未能通過對照組、空白試驗及試樣)置換，以收集任何自SPE床溶離之Triton X－100。置換歧管之蓋子，確定各極限標準物、通過對照組、未能通過對照組、空白試驗及試樣SPE藥筒在下方具有個別溶離物試管或自動取樣器小玻瓶。將500微升乙腈添加至各SPE藥筒中，並將真空施加至管件，直到所有乙腈已通過媒質床為止。關閉對歧管之真空，並升高蓋子以取回溶離物試管或自動取樣器小玻瓶。若使用溶離物試管，則將極限標準物、通過對照組、未能通過對照組、空白試驗及試樣之乙腈溶離物放置在自動取樣器小玻瓶中，供注入層析系統中。若使用自動取樣器小玻瓶收集溶離物，則將小玻瓶直接地放置在層析系統中。
操作條件波長 225毫微米敏感性 0.1滿刻度吸光度單位流動相 乙腈：水(80：20)流率 0.8毫升/分鐘注射體積 25微升柱溫 環境(20－25℃)大約滯留時間 Triton X－100：5.0±1分鐘總操作時間 10分鐘自動取樣器溫度 10±4℃
系統適合性. 安裝層析系統；使燈溫熱，並在分析之前以流動相使系統達成平衡，歷經至少一小時。注射SS# 1最少四次。將第二次SS# 1注射使用於所有系統適合性分析，除非另有指明。關於Triton X－100之滯留時間應為5.0±1分鐘。關於Triton X－100之管柱效率，當根據下列方程式計算時，以理論板數(N)評估，必須≧2000板/管柱： 其中：t＝從注射時間至峰頂之溶離時間所度量之Triton X－100吸收峰之滯留時間w＝將吸收峰之側面外推至基線所度量之Triton X－100吸收峰之寬度
在Triton X－100吸收峰與最接近相鄰峰間之解析度必須>1。
其中：t＝標準物中之Triton X－100吸收峰與相鄰峰之滯留時間W＝相應之吸收峰底部之寬度，藉由外推吸收峰之側面至基線所獲得
使用下列方程式計算最後三次SS#1注射之回應因數： 其中：A＝Triton X－100吸收峰之面積W＝用於製備相應之TX100儲備液標準物溶液之Triton X－100之重量(以毫克表示)
SS#1之最後三次注射之回應因數必須具有相對標準偏差(RSD)≦10%。使用下列方程式計算%RSD： 其中：n＝試樣中之度量值數目x＝個別度量值
將SS# 2之單次注射之回應因數與SS# 1之最後三次注射之平均回應因數作比較。在SS# 2回應因數與三次SS# 1注射之平均回應因數間之百分比差異必須≦10%。使用下列方程式計算百分比差異。
其中：RF1＝三次SS# 1注射之平均回應因數RF2＝SS# 2之回應因數
施行試樣空白試驗後－SPE之單次注射. 若發現Triton X－100含量，則再施行兩次試樣空白試驗之注射。若Triton X－100存在，則拋棄CTLA4－Ig藥物，並以先前經分析且發現未含有可偵測含量Triton X－100之新批號CTLA4－Ig藥物製造新極限標準物與對照組。若未符合上文標準，則延長管柱之達成平衡再一小時，並再注射標準溶液。若仍然未符合標準，則執行下列步驟。檢查滲漏，確定所有管件接頭為牢固。若經延長之達成平衡未能發生作用，則調整流動相之有機物含量，及/或製造新批次之流動相，並再製備SS# 1與SS# 2。若經延長之達成平衡及/或流動相調整並未造成符合標準，則改變管柱。在重複之前達成平衡至少一小時。
注射順序. HPLC系統之初步達成平衡與上文之成功操作. 參考上文段落，施行藥物緩衝劑後－SPE之單次注射作為校準空白試驗。沒有發現Triton X－100回應。若吸收峰存在於Triton X－100吸收峰之滯留時間下，則繼續注射空白試驗直到沒有發現回應為止。參考上文段落，施行CTLA4－Ig藥物後－SPE之單次注射作為試樣空白試驗。沒有發現Triton X－100回應。在進行數據處理前，此層析圖將自標準物、對照組及試樣層析圖扣除。施行通過對照組、極限標準物、未能通過對照組之重複注射。施行藥物緩衝劑之單次注射，且必須沒有發現Triton X－100回應。施行試樣之重複注射。將試樣注射與極限標準物之重複注射與藥物緩衝劑之一次注射一起進行，以致使在一起進行之極限標準物與藥物注射之間沒有超過10次試樣注射。操作之結束必須以極限標準物之重複注射與藥物緩衝劑空白試驗之一次注射完成。
數據處理. 在進行數據處理前，將試樣空白試驗注射之層析圖自所有標準物、對照組及試樣層析圖扣除。確保極限標準物、對照組及試樣層析圖中之Triton X－100吸收峰經適當地整合。試樣中之Triton X－100吸收峰，若存在時，必須在與極限標準物相同之滯留時間窗口內。將各組重複注射之吸收峰面積平均。重複注射必須在≦10%之吸收峰面積中具有%差異。若極限標準物、通過對照組或未能通過對照組之重複注射未符合此標準，則整個操作被認為是無效的，且將必須重複。若試樣之重複注射未能符合此標準，則試樣被認為是無效的，且將必須重複。只要所有其他試樣、對照組及標準物符合≦10%標準，其會被認為是有效的。在所有一起進行之極限標準物中，包括最後注射液，關於Triton X－100吸收峰之平均吸收峰面積，必須在極限標準物之最初平均吸收峰面積之10%內。若任何中間物極限標準物未能符合10%比較要求條件，則所有經分析，在最後通過極限標準物後之試樣被認為是無效的，且必須被再分析。
極限標準物、通過對照組、未能通過對照試樣之評估.將關於極限標準物、通過對照組及未能通過對照組之平均Triton X－100吸收峰面積作比較。未能通過對照試樣之吸收峰面積必須大於極限標準物之吸收峰面積。通過對照試樣之吸收峰面積必須低於極限標準物之吸收峰面積。若兩個條件均符合，則繼續評估該試樣。
試樣之評估. 極限標準物之平均Triton X－100吸收峰面積必須被校正，以成為在製備Triton X－100儲備液標準物# 1中所稱重之物質之量，如下述：AL ＝ALS X(10.00毫克/重量)其中：AL ＝經校正至0.5微克/毫升極限之吸收峰面積ALS ＝一起進行之極限標準物之平均Triton X－100吸收峰面積
註 ：A L 為在0.5微克/毫升極限下之經校正面積，且將用於與試樣比較。
將得自試樣之平均Triton X－100吸收峰面積與AL 作比較。若吸收峰面積≦AL ，則試樣通過規格。若吸收峰面積>AL ，則試樣未能通過規格。將通過規格之結果以"<0.50 ppm"，或未能通過規格以">0.50 ppm"，或以報告慣例所需要之其他方式作報告。
實例62－定量CTLA4－Ig藥物物質中殘留蛋白質A量之檢測
物料兔子抗－蛋白質A抗體 Sigma(目錄編號P3775)生物素化抗－蛋白質A Sigma(目錄編號B3150)
單株抗體試劑碳酸鹽塗覆緩衝劑. 於適當容器中添加；加入攪拌棒。添加500毫升HPLC級或Millipore水。添加5個碳酸鹽膠囊之內容物。攪拌直到充分混合為止。檢查，並使用NaOH(1.16)或HCl(1.23)將pH調整至9.6±0.1。將溶液傾倒至500毫升過濾滅菌系統中。施加真空以過濾滅菌溶液。在無菌條件下，移除濾器單元，並將瓶子加蓋。當在2－8℃下儲存時，溶液係為安定的，歷經30天。將溶液標識為"碳酸鹽塗覆緩衝劑"。洗滌緩衝劑：(PBS＋0.05% Tween20)：於HPLC級或Millipore水之4升瓶中添加；加入攪拌棒。添加20個PBS片劑。添加2.0毫升Tween 20。檢查，並使用NaOH 或HCl將pH調整至7.4±0.1。使用攪拌板，攪拌直到充分混合為止。當在2－8℃下儲存時，溶液係為安定的，歷經30天。將溶液標識為"洗滌緩衝劑"。終止溶液(1N H2 SO4 )或使用得自VWR之1.000當量濃度硫酸，而無需稀釋。在煙霧通風櫥中，將適當容器放置在攪拌板上：加入攪拌棒，添加485.6毫升HPLC級或Millipore水。起動攪拌板，以開始攪拌水。慢慢地添加14.4毫升濃H2 SO4 。當在室溫下儲存時，溶液係為安定的，歷經30天。將容器標識為"終止溶液"。
醋酸鹽緩衝劑(0.5M醋酸,0.1M氯化鈉,0.1% Tween 20,pH 3.5).在煙霧通風櫥中，將適當容器放置在攪拌板上：加入攪拌棒。添加400毫升HPLC級或Millipore水。起動攪拌板，以開始攪拌水。慢慢地添加14.8毫升濃冰醋酸。攪拌直到充分混合為止。添加2.9克氯化鈉。攪拌直到充分混合為止。檢查，並使用NaOH或HCl將pH調整至3.5±0.1。添加0.5毫升Tween 20。攪拌直到充分混合為止。以HPLC級或Millipore水調整至最後體積為500毫升。攪拌直到充分混合為止。當在2－8℃下儲存時，溶液係為安定的，歷經30天。將容器標識為"醋酸鹽緩衝劑"。
兔子抗－蛋白質A抗體. 將小玻瓶自冷藏室移除，並允許回復至室溫。添加2.0毫升HPLC級或Millipore水。將20微升體積分成數液份至0.5毫升螺帽管件。加蓋，並放置在細胞儲存箱中。當在－20℃下儲存時，溶液係為安定的，歷經365天。生物素化之抗－蛋白質A抗體.將小玻瓶自冷藏室移除，並允許回復至室溫。添加1.0毫升HPLC級或Millipore水。將60微升體積分成數液份至2.0毫升螺帽管件。加蓋，並放置在細胞儲存箱中。當在－20℃下儲存時，溶液係為安定的，歷經365天。
鏈霉胺基酸－HRP. 將0.5毫升HPLC級或Millipore水添加至鏈霉胺基酸－HRP之小玻瓶中。混合，將小玻瓶加蓋，並溫和地渦旋大約10秒。將0.5毫升甘油添加至鏈霉胺基酸－HRP之小玻瓶中。將小玻瓶加蓋，並將小玻瓶溫和地翻轉數次。經由將溶液抽出至乾淨巴斯德吸量管中，檢查溶液透明度。將20微升體積分成數液份至0.5毫升螺帽管件。加蓋，並放置在細胞儲存箱中。當在－20℃下儲存時，溶液係為安定的，歷經365天。
標準物之製備. 自分析證明書(COA)獲得蛋白質A參考物質(ref mat)之蛋白質濃度。經由在室溫下將儲備液蛋白質A溶液解凍出，製備蛋白質A參考物質之11,500毫微克/毫升溶液。計算蛋白質參考物質之所需要體積，以獲得11,500毫微克/毫升溶液。最小轉移體積應為10微升。
公式 ：
註：確保單位為可相容。
實例 ：
藉由從所要之體積減去蛋白質A參考物質之所需要體積，計算醋酸鹽緩衝劑(3.4)之體積。
公式：(所要之體積)－(參考標準物體積)＝(稀釋劑體積)
實例：10.0毫升－0.920毫升＝9.180毫升稀釋劑
將計算之蛋白質A參考物質之體積添加至含有計算之醋酸鹽緩衝劑體積之15毫升無菌管件中。將管件加蓋。溫和地渦旋(在Vortex Genie 2上設定4)2－4秒。使用下文所定義之體積，製備其餘標準物：
按照各稀釋步驟將管件加蓋，並在進行至下一稀釋步驟之前溫和地渦旋2－4秒。於添加至微滴定板中之前，將參考標準物與品質對照組試樣在室溫下培養10分鐘。各標準物濃度係在三份複製井中分析。
測試試樣之製備. 於聚丙烯管件中，使用醋酸鹽緩衝劑，製備CTLA4－Ig測試試樣之5毫克/毫升、2.5毫克/毫升及1.25毫克/毫升之濃度。在使用以製備稀釋液前，將CTLA4－Ig試樣在室溫下解凍。計算測試試樣之所需要體積，以獲得5.0毫克/毫升溶液。最小轉移體積應為10微升。
公式 ：
實例 ：
5.1.3藉由從所要之體積減去測試試樣之所需要體積，計算醋酸鹽緩衝劑之體積。
公式：(所要之體積)－(測試試樣體積)＝(稀釋劑體積)
實例：1.0毫升－0.200毫升＝0.800毫升稀釋劑
將計算之測試試樣體積添加至含有計算之醋酸鹽緩衝劑體積之15毫升無菌管件中。將管件加蓋，並溫和地渦旋(在Vortex Genie 2上設定4)2－4秒。於添加至微滴定板中之前，將測試試樣在室溫下培養10分鐘。
品質對照組試樣之製備. 自COA獲得蛋白質A參考物質之蛋白質濃度。製備蛋白質A參考物質之11,500毫微克/毫升溶液。按下表中所述製備品質對照組(QC)試樣。
將700微升體積分成數液份至2.0毫升螺帽管件。加蓋，並放置在細胞儲存箱中。當在於或低於－70℃下儲存時，溶液係為安定的，歷經180天。在QC試樣中之蛋白質A濃度係被預先測定，藉由：使用此方法進行3種獨立蛋白質A ELISA檢測。18個結果(3種獨立檢測乘以每檢測6個井)將被平均。關於各QC試樣之蛋白質A濃度將被指定至各製備。在實驗當天，將各QC試樣之一個小玻瓶在室溫下解凍，或自蛋白質A之儲備液小玻瓶製造新QC試樣。溫和地渦旋(在Vortex Genie 2上設定4)2－4秒。
程序. 以捕獲抗體進行板塗覆. 自製造者COA獲得兔子抗－蛋白質A抗體之蛋白質濃度。計算兔子抗－蛋白質A抗體之所需要體積，以獲得10毫升之100微克/毫升溶液。最小轉移體積應為10微升。
公式 ：
註：確保單位為可相容。
實例 ：
藉由從所要之體積減去兔子抗－蛋白質A抗體之所需要體積，計算稀釋劑之體積。
公式：(所要之體積)－(抗體體積)＝(稀釋劑體積)
實例：3.0毫升－0.012毫升＝2.988毫升稀釋劑
將計算之兔子抗－蛋白質A抗體體積添加至含有計算而得稀釋劑體積之15毫升無菌管件中。將管件加蓋，並溫和地渦旋2－4秒。使用公式，在塗覆緩衝劑中製備兔子抗－蛋白質A抗體之1微克/毫升溶液。將100微升溶液添加至Immulon IV微滴定板之各井中。在2－8℃下培養18±2小時。將板以洗滌溶液洗滌三次，使用具有300微升洗滌緩衝劑與零浸泡時間之板洗滌器。可將板替代地使用多通道吸量管洗滌。使用多通道吸量管，將200微升SuperBlockTM 添加至各井中。將微滴定板在室溫下，於黑暗中培養60分鐘。重複洗滌。將100微升各參考標準物、品質對照組及測試試樣添加至檢測板中。將微滴定板在室溫下，於黑暗中培養60分鐘±10分鐘。重複洗滌。自製造者COA獲得生物素抗－蛋白質A抗體之蛋白質濃度。在稀釋劑中製備1.0毫升生物素抗－蛋白質A抗體之1.0毫克/毫升溶液。在中間速度下渦旋。將50微升之1毫克/毫升溶液(7.9.1)添加至0.950毫升稀釋劑中。在中間速度下渦旋。將150微升之50微克/毫升溶液(7.9.3)添加至14.850毫升稀釋劑中。將100微升使用多通道吸量管添加至各井中。在室溫下培養60分鐘±10分鐘。重複洗滌。按下述稀釋鏈霉胺基酸－HRP：將10微升鏈霉胺基酸－HRP添加至0.990微升稀釋劑中，而產生0.01毫克/毫升鏈霉胺基酸－HRP。在中間速度下渦旋。將80微升0.01毫克/毫升鏈霉胺基酸－HRP添加至39.920毫升稀釋劑中。在中間速度下渦旋。將100微升使用多通道吸量管添加至各井中。在室溫下培養30分鐘±5分鐘。將TMB自冷藏室移除，並將每TMB板最小10毫升傾析至適當容器中。放置在暗位置，並允許回復至室溫。重複洗滌，但洗滌五次。將100微升TMB色原添加至各井中。在室溫下培養大約2分鐘±1分鐘。藉由添加100微升/井終止溶液使色原反應停止。將終止溶液以如添加色原之相同順序添加至板與井中，以確保色原與酵素於各井中之相同反應時間。以630毫微米之參考波長度量450毫微米下之吸光率(AB)。
標準. 關於標準曲線之標準. 關於標準物之標準係應用至在於或高於定量極限(QL)之此等數值，因低於QL之數值僅用以幫助建立曲線之極端值。當藉Softmax Pro軟體測定時，關於標準曲線之測定係數(R2 )應為＝0.99。關於零毫微克/毫升標準物之平均背景應＝0.08吸收單位。當藉軟體測定時，在用以測定標準曲線之各標準濃度下，除了零與QL之外，計算值(毫微克/毫升)之平均值必須在標的(額定)值之15%內。當藉軟體測定時，在用以測定標準曲線之各標準濃度下，排除零與QL，三份複製AB450 值之變易係數(%CV)必須≦15%。當藉軟體測定時，標準曲線之QL之三份複製吸光率平均值必須顯示%CV低於20%，且在標的之20%內。為確保至少兩個適合數據點可用於計算，故將標準物、對照組及試樣裝填在三份複製井中。用以計算平均值之三份複製之各值將個別地分析。位於離標的最遠之數值將被捨棄，再計算曲線，並再分析標準。
例如：
離2.5毫微克/毫升之標的值最遠之單一值為1.2毫微克/毫升。經由將1.2毫微克/毫升值自三份複製排除，其餘數值之平均值係符合所有標準。若於再計算後，另一個點未能符合標準，則檢測不為有效，且必須重做。若顯示其餘兩個數值之平均值仍然不符合標準，則將單一點(所有3個井)排除，並再計算曲線。
關於QC試樣之標準. QC試樣在所述濃度下係被定義為一組三個井，因此，關於此方法中所述之三種額定濃度，有總共六個QC試樣(總共18個井)。關於QC試樣之三個井中有至少兩個必須在對於QC試樣為可接受之20%額定內。六個QC試樣中有至少四個必須為可接受；六個QC試樣中有兩個(並非在相同濃度下之兩個)及18個QC試樣井中有不超過6個可偏離個別標的濃度超過20%。若未符合此等標準，則必須重複檢測。
關於測試試樣之標準. 當藉軟體測定時，經檢測之測試試樣之三份複製之各值，在該濃度下必須在平均值之20%內。若因兩個或多個平均AB450 值高於標準曲線上之最高點，使無法計算該數值，則試樣必須在較高稀釋下被再檢測，直到三個數值中有至少兩個落在標準曲線上。當藉軟體測定時，對各試驗試樣標的濃度所獲得之三份複製觀察之%CV必須＝20%。
計算. 關於蛋白質A ELISA，係參考Softmax程式樣板，因其會產生平均值、標準偏差及%CV。將對經檢測之各參考與試樣濃度所獲得之三份複製吸光率(AB)值平均。使用未加權之四參數回歸形式，製作關於蛋白質A標準物數據之模式： 其中：min＝相應於最低漸近線之AB值max＝相應於最高漸近線之AB值ED50 ＝相應於最高與最低漸近線值間之一半絕對差異之AB B＝曲線之線性部份之大約斜率C＝蛋白質A之濃度
試樣中之蛋白質A濃度之計算. 將平均試樣結果乘以適當稀釋因數(意即2、4及8)，以獲得原試樣中之蛋白質A之濃度，以毫微克/毫升表示。將其結果除以所報告之CTLA4－Ig蛋白質濃度(毫克/毫升)，以獲得CTLA4－Ig中之蛋白質A之濃度，以毫微克/毫克表示。
實例計算：
註： 毫微克蛋白質A/毫克CTLA4－Ig(毫微克/毫克)係相當於每百萬份之份數(ppm)。
關於試樣之蛋白質A濃度之計算，以毫微克/毫升表示.測試試樣中之蛋白質A之量係使用目前常用之SoftMax軟體，使用回歸方程式計算。各試樣之三種稀釋液係經檢測。將計算之濃度乘以適當稀釋因數，而得最初測試試樣中之濃度。
實例：測試試樣之濃度為50毫克/毫升。
5毫克/毫升試樣－ELISA數據係測定蛋白質A之濃度，為10毫微克/毫升10毫微克/毫升x 10(稀釋因數)＝測試試樣中之100毫微克/毫升蛋白質A 2.5毫克/毫升試樣－ELISA數據係測定蛋白質A之濃度，為5.0毫微克/毫升5毫微克/毫升x 20(稀釋因數)＝測試試樣中之100毫微克/毫升蛋白質A 1.25毫克/毫升試樣－ELISA數據係測定蛋白質A之濃度，為2.5毫微克/毫升2.5毫微克/毫升x 40(稀釋因數)＝測試試樣中之100毫微克/毫升蛋白質A
從該三個數值計算平均濃度。
結果之報告. 結果可以"% w/w全部蛋白質，毫微克蛋白質A/毫克全部蛋白質"為觀點作報告，另被稱為"ppm"(w/w)。
實例：0.0001% w/w＝1毫微克/毫克＝1 ppm(w/w)實例計算：
會造成小於QL(0.188毫微克/毫升)之AB450 之AB450 值之試樣應以"低於QL"作報告。會造成大於QL(0.188毫微克/毫升)之AB450 之AB450 值之試樣應以每百萬份之份數(ppm)報告至最接近整數。
實例：試樣濃度為50毫克/毫升。經分析之最高試樣濃度為5毫克/毫升(1/10稀釋)。試樣之AB450 係小於QL。
QL＝0.188毫微克/毫升≦0.188毫微克/5毫克≦0.04毫微克/毫克以"≦QL＝0.04 ppm"作報告
實例63：獲得胺基單醣(N－乙醯半乳糖胺,N－乙醯胺基葡糖)對CTLA4－Ig藥物試樣中之蛋白質之莫耳比之方法
試劑水解溶液(4N HCl水溶液). 將160毫升6N HCl與80毫升HPLC級水添加至250毫升玻璃瓶中。攪拌以充分混合。在2－8℃下儲存至高6個月。衍化作用溶液I(0.1M APTS水溶液).將192微升HPLC級水在小玻瓶中添加至10毫克APTS粉末內。將小玻瓶渦旋5－10秒，以完全溶解APTS。於－20℃下儲存至高一年。
衍化作用溶液II(1M醋酸與0.25M NaBH3 CN). 將20微升醋酸在0.4毫升離心管中以320微升HPLC級水(17倍稀釋)稀釋，以製造1M醋酸溶液。稱量2.0±0.5毫克NaBH3 CN，置於低溫小玻瓶中。使用下列公式，添加適當體積之1M醋酸溶液，以製造0.25M NaBH3 CN。體積(微升)＝103 x(NaBH3 CN之重量，以毫克表示)/(62.84克/莫耳x 0.25莫耳/升)。註：在即將使用之前製備。應將氰基硼氫化鈉(NaBH3 CN)在黑暗中，儲存於乾燥器內。建議將試劑細分至一系列2.0毫升低溫小玻瓶中供儲存，以避免重複打開最初之試劑瓶，如下述：稱量1.0克±0.2毫克氰基硼氫化鈉，置於2.0毫升低溫小玻瓶中。將氰基硼氫化鈉之全部內容物依此方式自最初瓶子取出液份。蓋緊，並順序地將低溫小玻瓶貼上標籤(1,2,3等)，伴隨著試劑名稱、批號及6個月失效期。應將小玻瓶以帕拉膜(parafilm)密封，以避免濕氣。對於衍化作用溶液II，從相同低溫小玻瓶稱出氰基硼氫化鈉之重量，不超過三次。在實驗室工作單上記下此項及低溫小玻瓶順序編號。無論是在CE分佈形態中所發現之試劑吸收峰或不良貼標籤，可能會在重複打開低溫小玻瓶或使用特定批號之氰基硼氫化鈉後發生。若其達成此等結果，則拋棄正被使用之低溫小玻瓶，並無論是從具有下一順序編號之低溫小玻瓶或從新批號之氰基硼氫化鈉稱出試劑之重量。
再乙醯化作用緩衝劑(25 mM碳酸氫鈉,pH 9.5).稱量0.210±0.02克碳酸氫鈉，置於清潔100毫升乾淨玻璃燒杯中。添加90毫升HPLC級水，並於攪拌板上混合，直到鹽完全溶解為止。將pH以10N NaOH調整至9.5±0.1。添加HPLC級水，以製造最後體積100毫升。過濾溶液，並在室溫下儲存至高3個月。操作緩衝劑(60±5 mM四硼酸鈉,pH 9.25).稱量1.21±0.02克四硼酸鈉，置於100毫升乾淨玻璃燒杯中。添加90毫升HPLC級水，並在攪拌板上混合，直到鹽完全溶解為止。將pH以10N NaOH調整至9.25±0.10。為提供最後濃度60±5 mM，添加HPLC級水以製造最後體積100毫升。對於55 mM溶液，係將1.11克(±0.02)四硼酸鈉稱量，並按照上文指示用於溶解及滴定。對於65 mM溶液，係將1.31克(±0.02)四硼酸鈉稱量，並按照上文指示用於溶解及滴定。在室溫下儲存至高3個月。若影響峰解析度(如系統適合性段落中所定義)(R值<1.0)，則製備新緩衝劑。選用：為提供最後濃度60 mM(±5 mM)，經由將120毫升超純水添加至80毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑中，稀釋四硼酸鹽緩衝溶液(MicroSolv)。以10N NaOH滴定，以使溶液pH來到9.25(±0.1)。對於55 mM四硼酸鹽溶液，係將66毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑稀釋至114毫升超純水中。按上述滴定。對於65 mM四硼酸鹽溶液，係將78毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑稀釋至102毫升超純水中。按上述滴定。將溶液在室溫下儲存最高3個月。若影響峰解析度(如系統適合性段落中所定義)(R值<1.0)，則製備新緩衝劑。
毛細管沖洗溶液1N NaOH溶液：將1毫升10N NaOH溶液添加至含有9毫升HPLC級水之15毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。將溶液在室溫下儲存至高6個月。
1N HCl溶液：將1毫升6N HCl溶液添加至含有5毫升HPLC級水之15毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。將溶液在室溫下儲存至高6個月。80%甲醇溶液：將8毫升HPLC級甲醇添加至含有2毫升HPLC級水之15毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。將溶液在室溫下儲存至高6個月。
單醣標準儲備溶液：N－乙醯胺基葡糖(GalNAc). 將5±1毫克GalNAc精確地稱量，置於2.0毫升低溫小玻瓶中。添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合，直到溶解為止。記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
N－乙醯半乳糖胺(GlcNAc)：將5±1毫克GlcNAc精確地稱量，置於2.0毫升低溫小玻瓶中。添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合，直到溶解為止。記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
N－乙醯甘露糖胺(ManNAc)：將5±1毫克ManNAc精確地稱量，置於2.0毫升低溫小玻瓶中。添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合，直到溶解為止。記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
將單醣標準儲備溶液在－20℃下儲存至高1年：單醣工作溶液I：內標準工作溶液. 將ManNAc之儲備溶液以HPLC級水100倍稀釋，其方式是將20微升ManNAc儲備溶液添加至已經含有1980微升HPLC級水之2毫升低溫小玻瓶中。渦旋大約5至10秒。將內標準工作溶液在2－8℃下儲存至高6個月。
單醣工作溶液II：胺基混合物標準工作溶液. 於含有1960微升HPLC級水之2.0毫升低溫小玻瓶中，個別添加20微升GalNAc與GlcNAc之儲備溶液。渦旋大約5至10秒。將胺基混合物標準工作溶液在2－8℃下儲存至高6個月。
試樣與參考物質溶液. 將冷凍蛋白質試樣在2－8℃下解凍，並藉由倒置溫和地混合。將試樣與參考物質兩者以HPLC級水稀釋至約1.0毫克/毫升。記下濃度，達三個有效數字。
CE操作條件操作緩衝劑(步驟2.5) 60 mM四硼酸鈉,pH 9.25毛細管藥筒溫度 25℃電壓 25－30 kV,正模式偵測器條件 LIF偵測器，激發：488毫微米，發射：520毫微米注射試樣 壓力注射模式，20s，在0.5 PSI下操作時間 10分鐘試樣儲存 10℃
程序水解作用. 於0.65毫升離心管中，添加10微升ManNAc工作溶液與200微升4N水解溶液。其係充作系統空白試驗。於0.65毫升離心管中，添加10微升ManNAc工作溶液與10微升胺基混合物標準溶液。進一步添加200微升4N水解溶液。其係充作單醣標準物，用於定量與系統適合性。重複製備。於0.65毫升離心管中，添加10微升ManNAc工作溶液與10微升CTLA4－Ig參考物質溶液(大約1毫克/毫升)。進一步添加200微升4N HCl溶液。重複製備。於0.65毫升離心管中，添加10微升ManNAc工作溶液與10微升試樣溶液(大約1毫克/毫升)。進一步添加200微升4N HCl溶液。重複製備。將試樣渦旋大約10秒，並離心大約5－10秒。將試樣放置在96－位置小玻瓶掛架中，並在烘箱中，於95℃下培養6小時。於水解作用後，將經水解之試樣放置在－20℃下10分鐘，以冷卻下來。將經水解之試樣短暫地離心，直到任何冷凝液被迫至管件之底部為止(於高速下5－10秒)。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。以100微升HPLC級水重配各試樣，並渦旋10－15秒。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。
再乙醯化作用. 以10微升M6再乙醯化作用緩衝劑重配各試樣，並渦旋5－10秒，以充分混合。將4微升M3再乙醯化作用試劑添加至各管件中。渦旋大約5－10秒。在冰上培養30分鐘。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。以100微升HPLC級水重配各試樣，並渦旋10－15秒。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。
衍化作用. 將微離心機放置在烘箱中，以達成平衡至烘箱溫度為55℃。以10微升衍化作用溶液I(0.1M APTS溶液)重配各試樣。渦旋大約5－10秒。添加5微升衍化作用溶液II(1M HAc與0.25M NaBH3 CN)。渦旋大約5－10秒，並離心。將試樣小玻瓶快速地裝載至經預熱之離心機中，並將離心機放置回55℃烘箱中。培養3小時，同時在2000 rpm下離心。其係防止溶劑在小玻瓶表面上之凝結。
儀器配置製備5.4.1安裝新毛細管，以高壓模式(80 PSI)沖洗，使用下列步驟：1N NaOH，歷經20分鐘；HPLC級水，歷經10分鐘。60 mM四硼酸鈉緩衝劑，歷經10分鐘。
每日作業於每一天作業之前，操作洗滌/沖洗順序，以沖洗毛細管。
然後操作系統適合性標準物(單醣標準物)，以確保系統為適當的。使用1N NaOH可蝕刻來自不同賣方之毛細管之內側，並在整個操作中造成潛移時間之移轉。若其造成最後吸收峰(GlcNAc)之潛移時間超過10.0分鐘，則對於步驟2沖洗，可能必須以0.1N NaOH或HPLC級水置換1N NaOH。
當使用相等毛細管，且上文洗滌程序不足夠時，則對於欲在10.0分鐘標準內之最後吸收峰(GlcNAc)，使用80%甲醇及/或1N HCl可能為必須的。
注射用之製劑於衍化作用後，使試樣冷卻下來至室溫。在室溫下離心大約10秒，直到冷凝液被迫至管件之底部為止。
將85微升HPLC級水添加至各管件中，以使各試樣之最後體積來到100微升。渦旋5－10秒。
將10微升試樣從各管件轉移至CE微小玻瓶，並將190微升HPLC級水添加至各管件中。渦旋5－10秒。
沖洗步驟與注射順序： 註 ：對於每四次注射，係將CE操作緩衝劑以新製成之CE操作緩衝劑更換(由於離子性耗竭作用所致)。在40 psi下進行毛細管沖洗。
＊＊ 將試樣與CTLA4－Ig參考物質之各製劑之兩次注射一起進行。
系統適合性註 ：系統適合性意義係使用系統適合性標準物之第一次注射測定，除非另有指明。第一種系統適合性之電泳圖譜應類似圖1中所示者，其中吸收峰1為GalNAc；吸收峰2為ManNAc；吸收峰3為GlcNAc。 註 ：當Beckman PACE MDO以外之CE儀器欲被使用時，由於容納分離毛細管之藥筒之不同結構，故毛細管之長度可能不同於此方法中所指定者。其會造成分析物潛移時間以及吸收峰強度之偏差。
在兩個相鄰吸收峰間之解析度，係藉由儀器根據下列方程式，計算其第一種系統適合性標準物：其中：R＝解析度t2 ,t1 ＝個別為兩個相鄰吸收峰之潛移時間W1 ,W2 ＝個別為在兩個相鄰吸收峰之基線下之峰寬
R值必須≧1.0。若R<1.0，則以洗滌/沖洗順序沖洗毛細管；若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。
對於最後系統適合性注射，最後吸收峰(GlcNAc)必須具有拖尾因數<1.4，使用下式：T＝W0.05 /2f其中：T＝拖尾因數W0.05 ＝在5%高度下之峰寬f＝在峰頂前方之峰寬
若T≧1.4，則以洗滌/沖洗順序沖洗毛細管；若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。
6.1系統適合性標準物之複製注射必須符合下列標準：．GlcNAc對MaNAc之峰面積比：RSD≦10%(於步驟7.1中計算而得)．GlcNAc之潛移時間應≦10.0分鐘．分佈形態應相當於圖1，其中發現三個吸收峰，且內標準物(ManNAc)為編號2吸收峰。
若在測試試樣之前未符合任何上文標準，則若GlcNAc之潛移時間大於10.0分鐘，係首先增加電壓。接著，若峰面積比>10%，則製備新CE緩衝劑，確認其pH，或置換毛細管。於調整儀器後，重複系統適合性注射。當分析吸收峰分佈形態時，若發生ManNAc峰高之顯著降低，則檢查確認進入LIF模組中之光纖電纜並未不對準。
藉由比較內標準物與單醣標準成份之吸收峰面積比例，測定單醣標準物百分比RSD。將各單醣成份之吸收峰面積除以各單醣標準物注射之內標準物之吸收峰面積。計算關於兩種一起進行標準物之GalNAc與GlcNAc之百分比RSD。RSD應≦10%。若未符合此平均標準，則應按上述將毛細管沖洗或置換。試樣與一起進行之單醣標準物必須重複。
計算計算GalNAc與GlcNAc相對於內標準物(ManNAc)之峰面積比。使用於最初四種系統適合性標準物之複製注射上，以致能夠符合上文標準，並對所有試樣前與後注射之一起進行之系統適合性標準物進行相同計算。
峰面積比＝將各單醣成份(GlcNAc,GalNAc)之吸收峰面積除以各系統適合性標準物注射之內標準物(ManNAc)之吸收峰面積。
計算系統適合性標準物中之GlcNAc與GalNAc之吸收峰面積比例之平均值。亦計算標準偏差(S.D.)與百分比相對標準偏差(%RSD)。
系統適合性標準物標準：關於GlcNAc之峰面積比之RSD≦10%。試樣前後注射之兩種一起進行之系統適合性標準物：關於GlcNAc與GalNAc之峰面積比之百分比RSD≦10%。
若未符合此平均標準(RSD>10%)，則毛細管需要以沖洗程序再沖洗，且此等試樣與一起進行之單醣標準物需要再一次操作。若仍未符合平均標準，則按所述置換毛細管並沖洗。再一次操作試樣與一起進行之單醣標準物。
其中：n＝試樣中度量值之數目x＝個別度量值
計算GalNAc/蛋白質之莫耳比： 其中：RGalNAc ＝GalNAc對蛋白質之莫耳比AGalNAc ＝試樣中GalNAc之吸收峰面積(μV．秒)AManNAc ＝試樣中ManNAc之吸收峰面積(μV．秒)AManNAc0 ＝單醣標準物中之ManNAc之平均吸收峰面積(μV．秒)AGalNAc0 ＝單醣標準物中之GalNAc之平均吸收峰面積(μV．秒)VGalNAc0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GalNAc之體積(以微升表示)CGalNAc0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GalNAc之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWCTLA4－Ig ＝根據分析證明書(COA)之CTLA4－Ig參考物質之分子量MWGlcNAc ＝GalNAc之分子量(221.2道爾吞)
一起進行之標準物. 當計算CTLA4－Ig物質與試樣之莫耳比時，使用全部八種一起進行之系統適合性標準物。將吸收峰面積平均，以包含在此等方程式中。此係欲被用於最初三個試樣。關於所有其他試樣，對於莫耳比計算總是使用接著四種一起進行之單醣標準物與先前四種一起進行之單醣標準物之平均吸收峰面積。
計算GlcNAc/蛋白質之莫耳比 其中：RGlcNAc ＝GlcNAc對蛋白質之莫耳比AGlcNAc ＝試樣中GlcNAc之吸收峰面積(μV．秒)AManNAc ＝試樣中ManNAc之吸收峰面積(μV．秒)AManNAc0 ＝單醣標準物中之ManNAc之平均吸收峰面積(μV．秒)AGlcNAc0 ＝單醣標準物中之GlcNAc之平均吸收峰面積(μV．秒)VGlcNAc0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GlcNAc之體積(以微升表示)CGlcNAc0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之GlcNAc之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWCTLA4－Ig ＝根據COA之CTLA4－Ig參考物質之分子量MWGlcNAc ＝GlcNAc之分子量(221.2道爾吞)
標準. 關於兩種一起進行之胺基系統適合性標準物吸收峰面積比例之百分比RSD，不應超過10%。關於參考物質中之胺基單醣之平均莫耳比，必須在所指定之範圍內。關於各成份，對於四種結果(複製製劑之重複注射)之%RSD必須</＝25%。
報告結果. 將平均結果以每CTLA4－Ig分子之GalNAc分子數目與每CTLA4－Ig分子之GlcNAc分子數目作報告。報告莫耳比結果至兩個有效數字。關於各成份，對於四種結果(複製製劑之重複注射)之%RSD必須</＝25%。
實例64：獲得中性單醣(甘露糖、海藻糖、半乳糖)對CTLA4－Ig藥物試樣中之蛋白質之莫耳比之方法
試劑水解溶液(2M TFA水溶液). 將148微升TFA與852微升HPLC級水添加至1.7微離心管中。渦旋5－10秒。按需要而定，按比例增加。在即將使用之前製備溶液。
衍化作用溶液I(0.1 M APTS水溶液). 於小玻瓶中，將192微升HPLC級水添加至10毫克APTS之粉末內。將瓶渦旋5－10秒，以完全溶解APTS。在－20℃下儲存至高一年。
衍化作用溶液II(1M醋酸與0.25M NaBH3 CN). 將20微升醋酸在0.4毫升離心管中，以320微升HPLC級水(17倍稀釋)稀釋，以製造1M醋酸溶液。稱量2.0±0.5毫克NaBH3 CN，置於低溫小玻瓶中。使用下列公式，添加適當體積之1M醋酸溶液，以製造0.25M NaBH3 CN。
體積(微升)＝103 x(NaBH3 CN之重量，以毫克表示)/62.84克/莫耳x 0.25莫耳/升)
．應將氰基硼氫化鈉(NaBH3 CN)於黑暗中，儲存在乾燥器內。
．建議將試劑細分，置於一系列2.0毫升低溫小玻瓶中供儲存，以避免重複打開最初之試劑瓶，如下述：．稱量1克±0.2毫克氰基硼氫化鈉，置於2.0毫升低溫小玻瓶中。將氰基硼氫化鈉之全部內容物依此方式自最初瓶子取出液份。
．將低溫小玻瓶蓋緊，並順序地貼上標籤(1,2,3等)，伴隨著試劑名稱、批號及6個月失效期。
．應將小玻瓶以帕拉膜(parafilm)密封，以避免濕氣。
．對於衍化作用溶液II，從相同低溫小玻瓶稱出氰基硼氫化鈉之重量，不超過三次。在實驗室工作單上記下此項及低溫小玻瓶順序編號。
．無論是在CE分佈形態中所發現之試劑吸收峰或不良貼標籤，可能會在重複打開低溫小玻瓶或使用特定批號之氰基硼氫化鈉後發生。若這會影響結果，則拋棄正被使用之低溫小玻瓶，並無論是從具有下一順序編號之低溫小玻瓶或從新批號之氰基硼氫化鈉稱出試劑之重量。
操作緩衝劑(60±5毫米四硼酸鈉,pH 9.25)稱量1.21±0.02克四硼酸鈉，置於100毫升乾淨玻璃瓶中。
添加90毫升HPLC級水，並在攪拌板上混合，直到鹽完全溶解為止。
將pH以10N NaOH調整至9.5±0.1。
為使最後濃度為60 mM(±5 mM)，添加HPLC級水以製造最後體積100毫升。
對於55 mM溶液，係將1.11克(±0.02)四硼酸鈉稱量，並按照上文指示用於溶解及滴定。
對於65 mM溶液，係將1.31克(±0.02)四硼酸鈉稱量，並按照上文指示用於溶解及滴定。
在室溫下儲存至高3個月。若影響峰解析度(如系統適合性段落中所定義)(R值<1.0)，則製備新緩衝劑。
選用：為使最後濃度為60 mM(±5 mM)，經由將120毫升超純水添加至80毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑中，稀釋四硼酸鹽緩衝溶液(MicroSolv)。以10N NaOH滴定，以使溶液pH來到9.25(±0.1)。
對於55 mM四硼酸鹽溶液，係將66毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑稀釋至114毫升超純水中。按上述滴定。
對於65 mM四硼酸鹽溶液，係將78毫升150 mM四硼酸鈉緩衝劑稀釋至102毫升超純水中。按上述滴定。
將溶液在室溫下儲存最高3個月。若影響峰解析度(如系統適合性段落中所定義)(R值<1.0)，則製備新緩衝劑。
毛細管沖洗溶液1N NaOH溶液將1毫升10N NaOH溶液添加至含有9毫升HPLC級水之14毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。
將溶液在室溫下儲存至高6個月。
1N HCl溶液：將1毫升6N HCl溶液添加至含有5毫升HPLC級水之15毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。將溶液在室溫下儲存至高6個月。
80%甲醇溶液：將8毫升HPLC級甲醇添加至含有2毫升HPLC級水之15毫升有刻度塑膠管件中。藉由渦旋充分混合5－10秒。將溶液在室溫下儲存至高6個月。
單醣標準儲備溶液甘露糖(Man)將5±1毫克甘露糖精確地稱量至2.0毫升低溫小玻瓶中。添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合5－10秒記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
海藻糖(Fuc)將5±1毫克海藻糖精確地稱量至2.0毫升低溫小玻瓶中。添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合5－10秒。記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
半乳糖(Gal)將5±1毫克半乳糖精確地稱量至2.0毫升低溫小玻瓶中。添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合5－10秒。記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。
木糖(Xyl)將5±1毫克木糖精確地稱量至2.0毫升中。添加1毫升HPLC級水，並藉由渦旋充分混合5－10秒。記錄溶液之正確濃度(毫克/毫升)。將單醣標準儲備溶液在－20℃下儲存至高1年。
單醣工作溶液I：內標準工作溶液. 為製造內標準工作溶液，將木糖之儲備溶液以HPLC級水稀釋100倍，其方式是將20微升木糖儲備溶液(3.6.4)添加至已經含有1980微升HPLC級水之2毫升低溫小玻瓶中。渦旋大約5至10秒。將此內標準工作溶液在2－8℃下儲存至高6個月。
單醣工作溶液II：中性混合物標準工作溶液. 於含有1960微升HPLC級水之2.0毫升低溫小玻瓶中，個別添加20微升甘露糖、海藻糖及半乳糖之儲備溶液。渦旋大約5至10秒。將此內標準工作溶液在2－8℃下儲存至高6個月。
試樣與參考物質溶液. 將冷凍蛋白質試樣在2－8℃下解凍，並藉由倒置溫和地混合。將試樣與參考物質兩者以HPLC級水稀釋至約1.0毫克/毫升。
CE操作條件操作緩衝劑60 mM四硼酸鈉,pH 9.25毛細管藥筒溫度 25℃電壓 25－30 kV,正模式偵測器條件節 LIF偵測器，激發：488毫微米，發射：520米注射試樣 壓力注射模式，20s，在0.5 PSI下操作時間 15分鐘試樣儲存 10℃
程序水解作用：於0.65毫升離心管中，添加10微升木糖工作溶液與200微升2M TFA溶液。其係充作系統空白試驗。於0.65毫升離心管中，添加10微升木糖工作溶液與10微升中性混合物標準工作溶液。進一步添加200微升2M TFA溶液，並渦旋3－4秒。其係充作單醣標準物，用於定量與系統適合性。重複製備。於0.65毫升離心管中，添加10微升木糖工作溶液與10微升CTLA4－Ig參考物質溶液(大約1毫克/毫升)。進一步添加200微升2M TFA溶液，並渦旋3－4秒。重複製備。於0.65毫升離心管中，添加10微升木糖工作溶液與10微升試樣溶液(大約1毫克/毫升)。進一步添加200微升2M TFA溶液，並渦旋3－4秒。重複製備。將試樣渦旋大約20秒，並離心大約5－10秒。將試樣放置在96－位置小玻瓶掛架中，並在烘箱中，於95℃下培養6小時。於水解作用後，將試樣放置在－20℃下10分鐘，以冷卻下來。將經水解之試樣短暫地離心，直到任何冷凝液被迫至管件之底部為止(於高速下5－10秒)。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。以100微升HPLC級水重配各試樣，並渦旋10－15秒。使試樣在SpeedVac中蒸發至乾涸。
衍化作用：將微離心機放置在烘箱中，以達成平衡至烘箱溫度為55℃。以10微升衍化作用溶液I(0.1M APTS溶液)重配各試樣。渦旋大約5－10秒。添加5微升衍化作用溶液II(1M HAc與0.25M NaBH3 CN)。渦旋大約5－10秒，並離心。將試樣小玻瓶快速地裝載至經預熱之離心機中，並將離心機放置回55℃烘箱中。培養3小時，同時在2000 rpm下離心。其係防止溶劑在小玻瓶表面上凝結。
儀器配置製備：安裝新毛細管，以高壓模式(80 PSI)沖洗，使用下列步驟：1N NaOH，歷經20分鐘HPLC級水，歷經10分鐘60 mM四硼酸鈉緩衝劑，歷經10分鐘。
操作洗滌/沖洗順序，以沖洗毛細管。然後操作系統適合性標準物(單醣標準物)，以確保系統為適當的。使用1N NaOH可蝕刻來自不同賣方之毛細管之內側，並在整個操作中造成潛移時間之移轉。若其造成最後吸收峰(半乳糖)之潛移時間超過15.0分鐘，則對於步驟2沖洗，可能必須以0.1N NaOH或HPLC級水置換1N NaOH。當使用相等毛細管，且上文洗滌程序不足夠時，則對於欲在15.0分鐘標準內之最後吸收峰(半乳糖)，使用80%甲醇及/或1N HCl可能為必須的。
注射用之製劑：於衍化作用後，使試樣冷卻下來至室溫。在室溫下離心大約10秒，直到冷凝液被迫至管件之底部為止。將85微升HPLC級水添加至各管件中，以使各試樣之最後體積來到100微升。渦旋5－10秒。將10微升試樣從各管件轉移至CE微小玻瓶，並將190微升HPLC級水添加至各管件中。渦旋5－10秒。
沖洗步驟與注射順序：
系統適合性. 第一種系統適合性之電泳圖譜應類似其中吸收峰1為甘露糖；吸收峰2為木糖；吸收峰3為海藻糖；及吸收峰4為半乳糖。 註 ：當Beckman PACE MDQ以外之CE儀器欲被使用時，由於容納分離毛細管之藥筒之不同結構，毛細管之長度可能不同於此方法中所指定者。其會造成分析物潛移時間以及吸收峰強度之偏差。
在兩個相鄰吸收峰間之解析度，係藉由儀器根據下列方程式，計算其第一種系統適合性標準物： 其中：R＝解析度t2 ,t1 ＝個別為兩個相鄰吸收峰之潛移時間W1 ,W2 ＝個別為兩個相鄰吸收峰之基線下之峰寬
R值必須≧1.0。若R<1.0，則以洗滌/沖洗順序沖洗毛細管；若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。
對於最後系統適合性注射，最後吸收峰(半乳糖)必須具有拖尾因數<1.4，使用下式：T＝W0.05 /2f其中：T＝拖尾因數W0.05 ＝在5%高度下之峰寬f＝在峰頂前方之峰寬
若T≧1.4，則以洗滌/沖洗順序沖洗毛細管；若問題持續，則以剛製成之操作緩衝劑置換舊緩衝劑，或置換毛細管。
最初四種系統適合性標準物之複製注射必須符合下列標準：．半乳糖對木糖之峰面積比：RSD≦10%．半乳糖之潛移時間必須≦15.0分鐘．分佈形態應相當於圖1，其中發現四個吸收峰，且內標準物(木糖)為編號2吸收峰。
若未符合任何上文標準，則若半乳糖之潛移時間大於15.0分鐘，係首先增加電壓。接著，若峰面積比>10%，則製備新CE緩衝劑，確認其pH，或置換毛細管。
於調整儀器後，重複系統適合性注射。當分析吸收峰分佈形態時，若發生木糖峰高之顯著降低，則檢查確認進入LIF模組中之光纖電纜並未不對準。藉由比較內標準物與單醣標準成份之吸收峰面積比例，測定單醣標準物百分比RSD。將各單醣成份之吸收峰面積除以各單醣標準物注射之內標準物之吸收峰面積。計算關於兩種一起進行標準物之甘露糖、海藻糖及半乳糖之百分比RSD。RSD應≦10%。若未符合此平均標準，則應按上述將毛細管沖洗或置換。試樣與一起進行之單醣標準物必須重複。
計算. 計算Man、Fuc及Gal相對於內標準物(木糖)之峰面積比。使用於最初四種系統適合性標準物之複製注射上，以致能夠符合標準，並對所有試樣前與後注射之一起進行之系統適合性標準物進行相同計算。峰面積比＝將各單醣成份(Man、Fuc及Gal)之吸收峰面積除以各系統適合性標準物注射之內標準物(木糖)之吸收峰面積。
計算系統適合性標準物中之Man、Fuc及Gal之吸收峰面積比例之平均值。亦計算標準偏差(S.D.)與百分比相對標準偏差(%RSD)。系統適合性標準物標準：關於半乳糖之峰面積比之RSD≦10%。試樣前後注射之兩種一起進行之系統適合性標準物：關於Man、Fuc及Gal之峰面積比之百分比RSD≦10%。
若未符合此平均標準(RSD>10%)，則毛細管需要以沖洗程序再沖洗，且此等試樣與一起進行之單醣標準物需要再一次操作。若仍未符合平均標準，則置換毛細管並沖洗。再一次操作試樣與一起進行之單醣標準物。
其中：n＝試樣中度量值之數目x＝個別度量值
計算甘露糖/蛋白質之莫耳比 其中：RMan ＝甘露糖(Man)對蛋白質之莫耳比AMan ＝試樣中Man之吸收峰面積(μV．秒)AXyl ＝試樣中木糖(Xyl)之吸收峰面積(μV．秒)AXyl0 ＝單醣標準物中之Xyl之平均吸收峰面積(μV．秒)AMan0 ＝單醣標準物中之Man之平均吸收峰面積(μV．秒)VMan0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之Man之體積(以微升表示)CMan0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之Man之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWCTLA4－Ig ＝根據分析證明書(COA)之CTLA4－Ig參考物質之分子量MWMan ＝甘露糖之分子量(180.2道爾吞)
一起進行之標準物. 當計算CTLA4－Ig參考物質與試樣之莫耳比時，使用全部八種一起進行之系統適合性標準物。將吸收峰面積平均，以包含在此等方程式中。此係欲被用於最初三個試樣。關於所有其他試樣，對於莫耳比計算總是使用接著四種一起進行之單醣標準物與先前四種一起進行之單醣標準物之平均吸收峰面積。
計算海藻糖/蛋白質之莫耳比： 其中：RFuc ＝海藻糖(Fuc)對蛋白質之莫耳比AFuc ＝試樣中Fuc之吸收峰面積(μV．秒)AXyl ＝試樣中木糖(Xyl)之吸收峰面積(μV．秒)AXyl0 ＝單醣標準物中之Xyl之平均吸收峰面積(μV．秒)AFuc0 ＝單醣標準物中之Fuc之平均吸收峰面積(μV．秒)VFuc0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之Fuc之體積(以微升表示)CFuc0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之Fuc之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWCTLA4－Ig ＝根據分析證明書(COA)之CTLA4－Ig參考物質之分子量MWFuc ＝海藻糖之分子量(164.2道爾吞)
計算半乳糖/蛋白質之莫耳比： 其中：RGal ＝半乳糖(Gal)對蛋白質之莫耳比AGal ＝試樣中Gal之吸收峰面積(μV．秒)AXyl ＝試樣中木糖(Xyl)之吸收峰面積(μV．秒)AXyl0 ＝單醣標準物AGal0 中之Xyl之平均吸收峰面積(μV．秒)VGal0 ＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之Gal之體積(以微升表示)CGal0 ：＝包含在單醣工作溶液中，用於水解作用之Gal之濃度(以毫克/毫升表示)Vp＝用於水解作用之蛋白質試樣之體積(以微升表示)Cp＝用於水解作用之蛋白質試樣之濃度(以毫克/毫升表示)MWCTLA4－Ig ＝根據分析證明書(COA)之CTLA4－Ig參考物質之分子量MWGal ＝Gal之分子量(180.2道爾吞)
註 ：當計算CTLA4－Ig參考物質與試樣之莫耳比時，使用最後系統適合性標準物與下一種一起進行之系統適合性標準物製劑。將吸收峰面積平均，以包含在此等方程式中。此係欲被用於最初六個試樣。關於所有其他試樣，對於莫耳比計算總是使用兩種一起進行之單醣標準物之平均吸收峰面積。
標準. 關於兩種一起進行之中性系統適合性標準物吸收峰面積比例之百分比RSD，不應超過10%。關於參考物質中之中性單醣之平均莫耳比，可在正下方表中所指定之範圍內。關於各成份，對於四種結果(複製製劑之重複注射)之%RSD必須</＝25%。
報告結果. 將平均結果以每CTLA4－Ig分子之甘露糖分子數目、每CTLA4－Ig分子之海藻糖分子數目及每CTLA4－Ig分子之半乳糖分子數目作報告。報告莫耳比結果至兩個有效數字。關於各成份，對於四種結果(複製製劑之重複注射)之%RSD必須</＝25%。
實例65－CTLA4－Ig氧化作用與脫醯胺作用之胰蛋白酶定圖譜定量
此方法之目的係為使用手動胰蛋白肽定圖譜程序，以甲硫胺酸氧化作用與天冬素脫醯胺作用之特定偵測與定量，監控CTLA4－Ig之批次間一致性。肽定圖譜係涉及蛋白質之蛋白水解或其他斷裂，以產生良好界定之肽片段組合，然後將其分析，通常藉HPLC進行。層析圖或肽圖譜對即使是蛋白質化學結構之最小變化係極為敏感，且因此可用於偵測與特徵鑒定轉譯後修改物。使CTLA4－Ig蛋白質試樣在8M胍－HCl緩衝劑中變性，並使胱胺酸二硫化物橋基在以蛋白分解酵素胰蛋白酶消化之前，以二硫基蘇糖醇還原，且以碘乙醯胺S－烷基化。然後將所形成之胰蛋白肽混合物藉逆相高性能液相層析法(RP－HPLC)，以在215與280毫微米下之UV偵測分析。一些縮寫係列示於下文：
化學品與試劑 流動相A－HPLC級水中之0.1% TFA將1毫升安瓿TFA之全部內容物轉移至1000毫升HPLC級水中，並充分地混合，以製備0.1% TFA(流動相A)。可將0.1% TFA在室溫下儲存至高兩個月。
流動相B－80% ACN與20% HPLC級水中之0.1% TFA將1毫升安瓿TFA之全部內容物轉移至800毫升乙腈與200毫升HPLC級水中，並充分地混合，以製備80% ACN中之0.1% TFA(流動相B)，可將其在室溫下儲存至高兩個月。
稀緩衝液－100 mM TRIS,25 mM NaCl,pH 7.6使14.0克緩血酸胺預設結晶pH 7.6與1.46克NaCl溶於1000毫升HPLC級水中，其方式是將溶液於磁性攪拌板上攪拌。使溶液經過0.2微米濾器單元過濾。將溶液在2至8℃下儲存至高兩個月。
變性緩衝劑－8M胍,50 mM TRIS,pH 8.0使152.8克胍鹽酸鹽與1.4克緩血酸胺預設結晶pH 8溶於90毫升HPLC級水中，其方式是將溶液於磁性攪拌板上攪拌。將pH以無論是HCl或NaOH調整至8.0，並以HPLC級水使來到200毫升之最後體積。使溶液經過0.2微米濾器過濾。將溶液於室溫下儲存至高六個月。
消化緩衝劑－50 mM TRIS,10 mM CaCl2 ,pH 7.6使7.0克緩血酸胺預設結晶pH7.6與1.47克CaCl2 溶於1000毫升HPLC級水中，其方式是將溶液於磁性攪拌板上攪拌。使溶液經過0.2微米濾器過濾。將溶液在2至8℃下儲存至高兩個月。
還原劑－200 mM二硫基蘇糖醇(DTT)於30.8±0.2毫克DTT中，在即將使用之前添加1000微升水，並渦旋，直到溶解為止。溶液係於從製備時起之24小時到期。
烷基化試劑－400 mM碘乙醯胺(IAM)於74.0±0.5毫克碘乙醯胺中，在即將使用之前添加1000微升水，並渦旋，直到溶解為止。溶液係於從製備時起之24小時到期。1.0M HCl將8.7毫升濃鹽酸以HPLC級水稀釋至100毫升。將溶液於室溫下儲存至高兩個月。
標準物與對照組 T6ox肽標準物,30 μM T6ox胰蛋白肽合成標準物為Ala－Met(O)－Asp－Thr－Gly－Leu－Tyr－Ile－Cys－Lys．2TFA,FW 1358.4,~95%純度重量比。將緊密地密封之固體在－20℃下儲存，且總是於乾燥器中溫熱至室溫，以防止水份吸收。稱量出1.0±0.1毫克T6ox，記錄正確之重量，並溶於1.50毫升消化緩衝劑中。添加40微升200 mM DTT，並在37℃下放置20分鐘。冷卻至室溫，添加48微升400 mM碘乙醯胺，並在室溫下，於黑暗中烷基化，歷經30分鐘。以消化緩衝劑稀釋至最後體積為24.5毫升，而得30±3 μM標準溶液。將1毫升液份之30 μM T6ox標準物在－70℃下儲存至高24個月。
T26deaml肽標準物,30 μM T26deam1胰蛋白肽合成標準物為Gly－Phe－Tyr－Pro－Ser－Asp－Ile－Ala－Val－Glu－Trp－Glu－Ser－isoAsp－Gly－Gln－Pro－Glu－Asn－Asn－Tyr－Lys．2TFA,FW 2773.7,~85%純度重量比。將緊密地密封之固體在－20℃下儲存，且總是於乾燥器中溫熱至室溫，以防止水份吸收。稱量出1.0±0.1毫克T26deam1，記錄正確之重量，並溶於1毫升消化緩衝劑中之30% v：v乙腈內。稀釋至最後體積為10.7毫升，而得30±3 μM標準溶液。將1毫升液份之30 μM T26deam1標準物在－70℃下儲存至高24個月。
標準物與試樣之製備 還原作用與烷基化作用關於肽定圖譜之蛋白質濃度範圍為大約20毫克/毫升。若蛋白質濃度>20毫克/毫升，則將試樣以稀緩衝液稀釋，達最後濃度為大約20毫克/毫升。製備至少100微升稀溶液。於1.7毫升離心管中，將100微升20毫克/毫升(2毫克)CTLA4－Ig溶液(試樣或參考物質)添加至550微升變性緩衝劑中。添加35微升200 mM還原試劑，將管件渦旋3－5秒，然後離心大約3秒。將管件在37℃下培養20±2分鐘。將38.5微升400 mM烷基化試劑添加至各管件中，渦旋3－5秒，接著離心大約3秒。將試樣在室溫下，於黑暗中培養20±2分鐘。將NAP－5管柱放置在架臺中。每試樣使用一個管柱。當試樣在IAM中培養時，使NAP－5管柱以7.5毫升消化緩衝劑達成平衡。根據位置程序拋棄流出物。將500微升經還原與烷基化之混合物添加於NAP－5管柱上，允許液體經過管柱排乾。根據位置程序拋棄流出物。將1.0毫升消化緩衝劑添加至NAP－5管柱中，並將流出物收集至1.7毫升離心管內，且溫和地混合所收集之流出物。
消化. 對於欲被消化之各毫升試樣或參考物質，係以86微升各胰蛋白酶緩衝劑(與酵素一起提供)重配一個胰蛋白酶小玻瓶(20微克)，加上另外一個胰蛋白酶小玻瓶，以獲得0.25微克/微升。將胰蛋白酶小玻瓶之內容物匯集至一個小玻瓶中。使各試樣以每毫升試樣80微升上文經匯集之胰蛋白酶溶液在37℃下消化120±12分鐘。於完成消化後，使試樣以每毫升試樣40微升1.0M HCl酸化，並渦旋3－5秒。將100微升各試樣與參考物質之消化物以吸量管吸取至自動取樣器小玻瓶中。製備另外系統適合性對照組，其含有與5微升30 μM T6ox肽標準物及5微升30 μM T26deaml肽標準物混合之95微升參考物質消化物，而得經添加5% T6ox與5% T26deaml之消化物。將全部小玻瓶於5±5℃下放置在自動取樣器中，以供HPLC分析。將所有其餘消化試樣儲存在－70℃下。
層析條件 下表係說明流率與層析梯度液。
在第一次注射之前，使管柱在55℃下以100%流動相A平衡至少25分鐘。監控215毫微米與280毫微米下之UV吸光率。從管柱至偵測器之管件應具有≦0.01"之內徑，以使擴散譜帶變寬降至最低。將柱溫保持在55±2℃下。將自動取樣器溫度保持在5±5℃下。流動相A係作為空白試驗注射使用。將試樣(一次不超過十個)與參考物質注射一起進行。下表係說明關於層析分析之注射順序。應注意的是，所有注射體積均為25微升，惟對照試樣除外，其包含經添加5%T6ox與5% T26deaml肽標準物之參考物質，其係注射28微升：
標準 系統適合性標準物. 參考物質之肽圖譜分佈形態，關於顯著吸收峰之數目、相對大小及溶離順序，對215毫微米與280毫微米軌跡，必須於.視覺上可與圖1中所呈現之層析圖比較。關於最初與一起進行之參考物質中之吸收峰T4、T25及T27之滯留時間差異，不應超過±0.5分鐘。理論板數(N)必須≧100,000。若N<100,000，則使管柱再達成平衡。若問題持續，則置換管柱。對於T2與T12吸收峰，解析度(R)必須≧1.5。若R<1.5，則使管柱再達成平衡。若問題持續，則置換管柱。經添加5% T6ox與T6deam1之參考標準物之280毫微米層析圖必須顯示在~33.0分鐘下溶離之T6ox吸收峰之增加，如圖83中所示。經添加5% T6ox與T6deam1之參考標準物之215毫微米層析圖必須顯示在~66.5分鐘下溶離之T26deam1吸收峰之增加，如圖85中所示。
試樣標準. 第一次參考物質注射與試樣之層析圖，關於顯著吸收峰之數目、相對大小及溶離順序，對215毫微米與280毫微米軌跡，必須於視覺上為相等，如圖83中關於經標識之吸收峰所顯示者，除了被個別地報告之T6ox與T26deam之經氧化及/或脫醯胺酸化吸收峰之外。關於試樣中之吸收峰T4、T25及T27之滯留時間必須在第一次參考物質注射之相應吸收峰之滯留時間之±0.5分鐘內。
計算. 註 ：對於此等計算係使用215毫微米數據，除非另有指明。在一起進行之參考物質操作中之吸收峰T4、T25及T27之滯留時間(圖83)不得差別超過0.5分鐘(圖83)。
理論板數. 管柱效率，以理論板數(N)評估，係使用得自參考物質操作之吸收峰T27之滯留時間與寬度計算(圖83)，根據下列方程式： 其中w＝在基線上之寬度，藉由外推相對較直側面至基線所度量t＝從注射時間至峰頂之溶離時間所度量之吸收峰T27之滯留時間
解析度. 在吸收峰T12與吸收峰T2間之解析度(R)(圖83)，係使用下列方程式計算： 其中：t1 ,t2 ＝個別為吸收峰T12與吸收峰T2之滯留時間w1 ,w2 ＝個別為具有滯留時間t1 與t2 之吸收峰，在基線下之經切線界定之峰寬
對於所有試樣與標準物，係按下述計算得自280毫微米吸收峰面積數據之Met85之百分比氧化作用：百分比氧化作用＝100 * AT6ox /(AT6ox ＋AT6 )其中：AT6 ＝關於T6,(84－93)之吸收峰面積，在280毫微米軌跡中AT6ox ＝關於T6ox,Met(O)85 (84－93)之吸收峰面積，在280毫微米毫微米軌跡中
對於所有試樣與標準物，係按圖85中所示之數據計算關於215毫微米吸收峰面積之Asn294之百分比脫醯胺作用： 其中AT26 ＝關於T26,(281－302)之吸收峰面積，在215毫微米軌跡中AT26deam1 ＝關於T26deam1,isoAsp294 (281－302)之吸收峰面積，在215毫微米軌跡中AT26deam2 ＝關於T26deam2,Asp299 (281－302)之吸收峰面積，在215毫微米軌跡中AT26deam3 ＝關於T26deam3,Asp294 (281－302)之吸收峰面積，在215毫微米軌跡中AT26deam4 ＝關於T26deam4,Asu294 (281－302)之吸收峰面積，在215毫微米軌跡中
理論上預期之CTLA4－Ig胰實白酶消化片段(參考圖83) ＊ 含有N－連結之碳水化合物＊＊ 含有O－連結之碳水化合物
實例66－健康單一劑量人類研究
使用單一位置、隨機、單一劑量研究，以評估在健康被實驗者中CTLA4－Ig(藉由CD－CHO1所製成)方法之藥物動力學。讓符合加入與排除標準之十三位(13)被實驗者進入臨床研究單位，並以10毫克/公斤之單次靜脈內灌注，接受藉由方法CD－CHO1所製成之CTLA4－Ig，歷經30分鐘。在灌注之後，各被實驗者在臨床研究單位中被觀察24小時。於服藥至高71天後，在所指定之時間點收集血液試樣，以供定量CTLA4－Ig。評估被實驗者，至於各被實驗者之藥物動力學：Cmax 、Tmax 、AUC(INF)、T－HALF、CLT及Vss係衍生自血清濃度對時間數據。CTLA4－Ig係以200毫克/小玻瓶調配物供應。健康被實驗者係被投予10毫克/公斤CTLA4－Ig之30分鐘IV灌注。於服藥後，在所指定之時間點評估PK、安全性之測定與致免疫測定，至第71天。
統計方法： 試樣大小：13位被實驗者之試樣大小係提供幾何平均比例之估計對於CTLA4－Ig之Cmax 在真實值之15%內，而對於AUC(INF)在真實值之10%內之90%可信度。統計分析：被實驗者人口統計學、身體檢查、實驗室數據及生命跡象係經摘述。不利事件之發生率係藉由身體系統與嚴重性而表列出。對於CTLA4－Ig之Cmax 與AUC(INF)，關於方法CD－CHO1之群集幾何平均比例之90%可信度間隔係計算自log(Cmax )與log(AUC)上之方差分析之結果。
藥物動力學結果 ：藥物動力學結果係使用經確認有效之非區隔分析程式測定。藥物動力學參數係得自服用方法CD－CHO1 CTLA4－Ig之13位被實驗者。下表係列出在健康被實驗者中關於CTLA4－Ig之藥物動力學參數。下表係顯示關於CTLA4－Ig藥物動力學參數之摘要統計學。
CTLA4－Ig在健康被實驗者中具有大約17天之平均T－HALF值，與在牛皮癬病患(10－18天)與風濕性關節炎病患(大約13天)中所獲得之半生期一致。所發現之0.09至0.10升/公斤之平均Vss值係顯示CTLA4－Ig主要是被限制至血管系統，且不會顯著地分配至血管外空間中。
下表係說明每位被實驗者之血清濃度(毫微克/毫升)。
關於CTLA4－Ig之血清檢測 血清試樣係在總共25種分析操作中，藉由酵素－連結之免疫吸著檢測(ELISA)分析CTLA4－Ig。在試樣分析之前所有分析結果均符合所建立之標準，這顯示ELISA方法對研究試樣中之CTLA4－Ig之定量為精確與正確的。關於血清中之CTLA4－Ig之標準曲線參數與平均QC數據係呈現於表48中。關於CTLA4－Ig之分析QC之操作間與操作內變異性，係個別為4.5%與3.5% CV。分析QC試樣之平均經發現濃度係偏離額定值小於±8.9%(表48)。
CTLA4－Ig之藥物動力學 關於所有被實驗者之CTLA4－Ig血清濃度因方法所致之平均與標準偏差，係呈現於正下方表中。平均CTLA4－Ig血清濃度對時間分佈形態，歷經71天，係呈現於圖42中。
對於CTLA4－Ig之平均血清濃度對時間數據(毫微克/毫升)
關於藥物動力學參數(Cmax 、AUC(INF)、CLT、Vss、Tmax 及T－HALF)之摘要統計學係呈現於表50中。其結果係顯示製自本發明方法之CTLA4－Ig具有大約17天(範圍為7－25天)之T－HALF值。所發現之0.09至0.10升/公斤之Vss值係顯示CTLA4－Ig主要是被限制至細胞外液體體積。
其結果係顯示關於藉由本發明方法所製成之CTLA4－Ig之平均T－HALF為大約17天。分佈值之清除率與體積兩者亦呈現於表50中。
在單次10毫克/公斤靜脈內灌注後之健康成人被實驗者與在多次10毫克/公斤靜脈內灌注後之RA病患中之CTLA4－Ig之藥物動力學，係詳述於表47中。
實例67－質粒pcSDhuCTLA4Ig之DNA順序
上文實例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、21、28、29、30、31、32、33、34、42、44、45、46、47、48、49、50、51、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67係特別地關於具有順序識別碼：1、2、5、6、7、8、9、10或18之CTLA4－Ig蛋白質，而上文實例19、20、22、23、24、25、26、27、35、36、37、38、39、40、41、52、53、54、55、56、57係特別地關於具有順序識別碼：4、11、12、13、14、15或16之CTLA4－Ig蛋白質。如本專利說明書中所述，關於實例中此等蛋白質之方法與用途，係為關於本發明其他CTLA4－Ig蛋白質之方法與用途之說明例。
本發明之舉例與非限制性CTLA4－Ig蛋白質包括：(1)CTLA4－Ig蛋白質，特別是具有任一個或多個順序識別碼：1、2、5、6、7、8、9、10或18，此種蛋白質具有二聚體形式，更特別是當藉尺寸排阻層析測定時，具有小於或等於約3面積百分比之高分子量物種，及約8.0至約12.0之唾液酸對CTLA4－Ig蛋白質或二聚體之莫耳比。更特定言之，本發明係提供進一步具有一或多個下列特徵之此種CTLA4－Ig蛋白質與組合物：當藉實例48中所提出之方法測定時，細菌內毒素之最高量不超過總蛋白質之0.15 EU/毫克；當藉實例49中所提出之方法測定時，不超過1 CFU/10毫升之最高生物負載量；當藉實例50中所提出之IEF方法測定時，提供具有pI範圍為約4.3至約5.6之約10至22個譜帶，在pI範圍為4.3至5.3下之90%－110%或95%－105%之累積譜帶強度，及在pI範圍為約4.5至約5.2下之約3個主要譜帶；當藉實例65中所提出之胰蛋白肽定圖譜方法測定時，具有經氧化物種之量<＝2.5或3.5面積%，及經脫醯胺酸化物種之量<＝2.0或2.5面積%；當藉實例10中所提出之尺寸排阻層析方法測定時，具有大小均一性，其中有至少95面積%、95.5面積%或97面積%之二聚體；當藉實例10中所提出之尺寸排阻層析方法測定時，具有大小均一性，其中組合物不超過2.0面積%、2.5面積%、3.0面積%、3.4面積%、4.0面積%或5.0面積%高分子量物種(譬如四聚體)之最大值；當藉實例10中所提出之尺寸排阻層析方法測定時，具有大小均一性，其中組合物不超過0.5面積%或0.3面積%低分子量物種(譬如單體)之最大值；當藉實例58中所提出之方法測定時，不超過約0.20、1.0或1.5微微克/毫克總蛋白質之最高DNA含量；當藉實例59中所提出之方法測定時，不超過1、3或5毫微克/毫克總蛋白質之最高MCP－1與似MCP－1物質；當藉實例60中所提出之方法測定時，不超過5、10或25毫微克/毫克總蛋白質之宿主細胞蛋白質之最高量；當藉實例61中所提出之方法測定時，不超過0.50或1.0 ppm Triton X－100之最大值；當藉實例62中所提出之方法測定時，不超過0.20、1.0或5.0毫微克/毫克總蛋白質之最高蛋白質；當藉實例63中所提出之方法測定時，具有GlcNAc對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為約15至約35莫耳/莫耳蛋白質；當藉實例63中所提出之方法測定時，具有GalNAc對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為約1.7至約3.6莫耳/莫耳蛋白質；當藉實例64中所提出之方法測定時，具有半乳糖對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為約8.0至約17莫耳/莫耳蛋白質，或約9.0至約17莫耳/莫耳蛋白質；當藉實例64中所提出之方法測定時，具有海藻糖對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為約3.5至約8.3莫耳/莫耳蛋白質；當藉實例64中所提出之方法測定時，具有甘露糖對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為約11至約19莫耳/莫耳蛋白質，或約7.7至約22莫耳/莫耳蛋白質；當藉實例16中所提出之方法測定時，NANA對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比係大於8.0莫耳/莫耳蛋白質，或為約8.0至約12.0莫耳/莫耳蛋白質，其中對於功能部位I所測得之量可為±29%，對於功能部位II之量可為±27%，及對於功能部位III之量可為±25%；當藉實例16中所提出之方法測定時，NGNA對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比係小於或等於1.5莫耳/莫耳蛋白質，其中對於功能部位I所測得之量可為±29%，對於功能部位II之量可為±27%，及對於功能部位III之量可為±25%。
本發明係提供欲被單離或實質上純化之此種組合物。本發明係提供具有此等特徵之任何替換或組合之蛋白質與組合物。
(2)CTLA4－Ig蛋白質，特別是具有任一個或多個順序識別碼：4、11、12、13、14、15或16，此種蛋白質具有二聚體形式，更特別是具有約5.0至約12.0之唾液酸對CTLA4－Ig蛋白質或二聚體之莫耳比。例如，本發明係提供CTLA4A29YL104E －Ig蛋白質。更特定言之，本發明係提供進一步具有一或多個下列特徵之蛋白質與組合物：約95%二聚體、約4%高分子量物種及約1%單體，譬如藉由實例25中所提出之方法製成；當藉實例55中所提出之方法測定時，不超過約2.5微微克/毫克總蛋白質之DNA之最高量；當藉實例53中所提出之方法測定時，不超過5 ppm蛋白質A之最大值；當藉實例54中所提出之方法測定時，不超過5毫微克/毫升總蛋白質之MCP－1與似MCP－1物質之最高量；當藉實例52中所提出之方法測定時，不超過50 ppm宿主細胞蛋白質之最大值；當藉實例48中所提出之方法測定時，不超過0.2 EU/毫克總蛋白質之細菌內毒素之最大值；當藉實例49中所提出之方法測定時，不超過1 CFU/毫升之最高生物負載量；當藉實例57中所提出之方法測定時，不超過2 ppm之Triton X－100之最大值；當藉實例39中所提出之方法測定時，唾液酸對CTLA4－Ig蛋白質之莫耳比為約5.0至約12.0。本發明係提供欲被單離或實質上純化之此種組合物。本發明係提供具有此等特徵之任何替換或組合之蛋白質與組合物。
上文實例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、21、28、29、30、31、32、33、34、42、44、45、46、47、48、49、50、51、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67係特別地關於上文(1)之CTLA4－Ig蛋白質，惟如本專利說明書中所述，關於此等實例中此等蛋白質之方法與用途，係為關於本發明其他CTLA4－Ig蛋白質之方法與用途之說明例。
上文實例19、20、22、23、24、25、26、27、35、36、37、38、39、40、41、52、53、54、55、56、57係特別地關於上文(2)之CTLA4－Ig蛋白質，惟如本專利說明書中所述，關於此等實例中此等蛋白質之方法與用途，係為關於本發明其他CTLA4－Ig蛋白質之方法與用途之說明例。
圖1A－1B 係呈現關於CTLA4－Ig分子之表現卡匣之一部份之核苷酸順序(順序識別碼：1)。亦顯示者為被核酸編碼之胺基酸順序(順序識別碼：2)。可製自此表現卡匣之CTLA4－Ig分子係包含具有以下殘基之胺基酸順序之分子：(i)順序識別碼：2之26－383，(ii)順序識別碼：2之26－382，(iii)順序識別碼：2之27－383，(iv)順序識別碼：2之26－382，(v)順序識別碼：2之25－382及(vi)順序識別碼：2之25－383。表現卡匣包含下列區域：(a)制瘤素M訊息順序(順序識別碼：1之核苷酸11－88；順序識別碼：2之胺基酸1－26)；(b)人類CTLA4之胞外功能部位(順序識別碼：1之核苷酸89－463；順序識別碼：2之胺基酸27－151)；(c)人類IgG1恒定區域之修改部份(順序識別碼：1之核苷酸464－1159；順序識別碼：2之胺基酸152－383)，包括經修改之鉸鏈區域(順序識別碼：1之核苷酸464－508；順序識別碼：2之胺基酸152－166)、經修改之人類IgG1 CH 2功能部位(順序識別碼：1之核苷酸509－838；順序識別碼：2之胺基酸167－276)及人類IgG1 CH 3功能部位(順序識別碼：1之核苷酸839－1159；順序識別碼：2之胺基酸277－383)。
圖2 係呈現核酸(上方橫列)(順序識別碼：23)與胺基酸(下方橫列)(順序識別碼：4)順序，相應於CTLA4A29YL104E －Ig。與順序識別碼：2之胺基酸比較，此胺基酸順序含有胺基酸改變在位置29(A至Y)處與在位置104(L至E)處，其中胺基酸殘基之編號係在被標示為"＋1"之甲硫胺酸(M)處開始。
圖3 為CTLA4A29YL104E －Ig之模式，經顯示具有N－連結之糖基化作用位置(N76、N108及N207)，C120－C120二硫鍵，及在CTLA－4功能部位(L104E與A29Y)中施行之兩個胺基酸取代。
圖4 係呈現CTLA4A29YL104E －Ig之理論cDNA－衍生之胺基酸順序(順序識別碼：4)。兩個胺基酸取代係在CTLA－4胞外功能部位(L104E與A29Y)中施行，以產生CTLA4A29YL104E －Ig。此順序係確認伴隨著N－連結糖基化作用位置之制瘤素M之訊息肽(前順序)。
圖5 為一圖表，描繪CTLA4A29YL104E －Ig試樣之結合至山羊抗人類IgG Fc抗體。CTLA4A29YL104E －Ig試樣之結合，係藉由度量此表面上所獲得之回應，與未經修改之感測晶片表面比較，而被檢出。不同批號表示三種不同CTLA4A29YL104E －Ig試樣。
圖6 為一圖表，顯示表觀分子量，當藉由二管柱SEC之覆蓋，伴隨著動態光散射偵測(DSL)與在SEC上之滯留時間測定時，其係相應於CTLA4－Ig HIC清晰吸收峰之多聚體、四聚體及二聚體離份。
圖7A (上方)與7B (下方)顯示經單離與純化自HIC清晰吸收峰之糖基化CTLA4－Ig分子(包含順序識別碼：2單體)離份之代表性IEF凝膠。上方凝膠之裝填順序為：通道1，pI標記物(Amersham)；通道2，CLTA4－Ig二聚體標準物；通道3，蛋白質A溶離物；通道4，多聚體；通道5，四聚體；通道6，二聚體。下方凝膠之裝填順序為：通道1，pI標記物(Amersham)；通道2，CLTA4－Ig二聚體標準物；通道3，四聚體；通道4，經解離四聚體。此面板顯示四聚體係比二聚體較少被唾液酸基化。
圖8 顯示在包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig二聚體上所發現之主要碳水化合物結構與碳水化合物之相對量。在此圖中之胺基酸殘基編號並未與順序識別碼：2一致。為使此圖中之胺基酸殘基編號與順序識別碼：2一致，計數法必須增加達26，意即N76 為N102 。
圖9 顯示包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig二聚體之代表性IEF凝膠(pH 4.0至6.5)。通道1與5顯示校正標準物，通道2、3、4各顯示20微克/微升之CLTA4－Ig二聚體。
圖10 顯示包含順序識別碼：4單體之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體之代表性IEF凝膠(pH 4.0至6.5)。通道1與8顯示校正標準物，通道2－7各顯示10微克/微升之CTLA4A29YL104E －Ig二聚體。
圖11 顯示包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子群集之N－連結碳水化合物分佈形態。此碳水化合物係收集自糖肽，並使用LC/MS PGCN－連結之寡醣技術分離。層析圖係提供關於各N－鏈連接位置之群集分佈形態。A)來自T5肽之Asn76 (順序識別碼：2之Asn102 )碳水化合物，與B)來自T7肽之Asn108 (順序識別碼：2之Asn134 )碳水化合物，兩者均顯示在單－與多唾液酸基化物種中之分佈。C)來自T14肽之Asn207 (順序識別碼：2之Asn233 )碳水化合物包括主要為非唾液酸基化之物種。D)顯示關於CTLA4－Ig分子之N－連結碳水化合物之分佈。E)來自T5肽之經選擇原光譜顯示相應於所描繪雙天線單唾液酸基化結構之主要吸收峰。F)來自T14之經選擇原光譜顯示相應於雙天線非唾液酸基結構之主要吸收峰。G)經選擇原光譜係包含較少物種，其係與在64.23分鐘下之吸收峰共溶離，其係相應於三天線二－唾液酸基化結構。H)經選擇原光譜顯現出主要物種在64.23分鐘下之吸收峰中，其係相應於雙天線二－唾液酸基化結構。
圖12A－B 顯示在酸性溶離條件(0.05% TFA)下，得自PGC層析之CTLA4－Ig順序識別碼：2單體之N－連結寡醣分佈形態之UV與TIC軌跡。圖12A之軌跡顯示在酸性溶離條件(0.05% TFA)下，PGC層析圖之陰離子總計數(TIC)。圖12B之軌跡顯示在酸性溶離(0.05% TFA)下之PGC層析圖，於206毫微米下之UV軌跡。
圖13A－B 顯示在鹼性溶離條件(0.4% NH4 OH)下，得自PGC層析之CTLA4－Ig順序識別碼：2單體之N－連結寡醣分佈形態之UV與TIC軌跡。圖13A之軌跡顯示在鹼性溶離條件(0.4% NH4 OH)下，PGC層析圖之陰離子總計數(TIC)。圖13B之軌跡顯示在鹼性溶離(0.4% NH4 OH)下之PGC層析圖，於206毫微米下之UV軌跡。
圖14 係呈現關於包含順序識別碼：4之CTLA4A29YL104E －Ig分子之比較性N－連結寡醣碳水化合物分佈形態。發現四個寡醣功能部位值：功能部位I含有未經唾液酸基化物種，而功能部位II、III及IV個別含有單－唾液酸基化、二－唾液酸基化及三－唾液酸基化物種。以層析方式單離此等寡醣及藉由質量光譜分析彼等，測得此等功能部位。
圖15 顯示包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子之N－連結寡醣之HPAEC－PAD分佈形態。功能部位係以關於寡醣之漸增唾液酸含量之順序顯示。功能部位I、II、III及IV個別含有具0、1、2及3個唾液酸之寡醣結構。吸收峰標識表示收集自PGC剖析之吸收峰藉由HPAEC－PAD剖析所指定之寡醣結構。碳水化合物結構之結構鑑定係與先前測定一致。
圖16A－B 顯示包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子之PGC分佈形態。分佈形態係得自直接注射按實例3中所述製成之碳水化合物經消化混合物。直接注射會造成在130分鐘下溶離之結構P4144之偵測。四－唾液酸基化結構P4144並未被發現於注射之前經單離寡醣之分佈形態中。
圖17 係呈現順序識別碼：2單體之T9片段之LC/MS去回旋正電噴霧光譜。此光譜係圖解三種主要O－連結之結構。此光譜係圖解具有糖梯狀物之基本肽，與O－連結之結構(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 一致。此光譜之粗體部份已相對於光譜之非粗體部份被加強10倍，且係圖解兩種另外之O－連結結構，具有(GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 與(GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2 。
圖18 顯示具有順序識別碼：2單體順序之CTLA4－Ig單鏈之O－連結碳水化合物結構之連接點與相對群集。在各位置處之相對量顯示藉由兩種或多種正交技術產生之數據，且係接受變異性。亦描繪共價半胱胺醯基化作用之位置。
圖19 係描繪中間質粒piLN－huCTLA4－Ig之圖譜。此質粒包含一種可使藉由限制酵素位置HindIII 與XbaI 側面相接之人類CTLA4－Ig分子(huCTLA4－Ig)編碼之順序(意即順序識別碼：1)。
圖20 係描繪質粒pD16LEA29Y之圖譜。此質粒包含一種可使人類CTLA4A29YL104E －Ig分子編碼之順序(意即順序識別碼：23)。
圖21 為萃取自會表現衍生自1D5－100A1(例如無性繁殖系17)之CTLA4－Ig表現卡匣之CHO細胞之DNASouthern沾吸之照片。關於凝膠之通道，由左至右為：通道M，DNA分子量標記物；通道N，EcoRI/XbaI消化之未轉染CHODNA(5毫克)；通道1，EcoRI/XbaI消化之未轉染CHO DNA(2.5微克)＋1毫微克pcSDhuCTLA4－Ig；通道2，EcoRI/XbaI消化之未轉染CHO DNA(2.5微克)＋0.5毫微克pcSDhuCTLA4－Ig；通道3，EcoRI/XbaI消化之未轉染CHO DNA(2.5微克)＋0.25毫微克pcSDhuCTLA4－Ig；通道4，EcoRI/XbaI消化之未轉染CHO DNA(2.5微克)＋0.125毫微克pcSDhuCTLA4－Ig；通道5，EcoRI/XbaI消化之未轉染CHO DNA(2.5微克)＋0.0625毫微克pcSDhuCTLA4－Ig；通道6，EcoRI/XbaI消化之未轉染CHO DNA(2.5微克)＋0.03125毫微克pcSDhuCTLA4－Ig；通道7，EcoRI/XbaI消化之DNA：MCB(5.0微克)；通道8，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030618A－01(5.0微克)；通道9，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030712A－01(5.0微克)；通道10，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030801A－01(5.0微克)；通道11，EcoRI/XbaI消化之DNA：MCB(2.5微克)；通道12，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030618A－01(2.5微克)；通道13，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030712A－01(2.5微克)；通道14，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030801A－01(2.5微克)；通道15，EcoRI/XbaI消化之DNA：MCB(1.25微克)；通道16，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030618A－01(1.25微克)；通道17，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030712A－01(1.25微克)；通道18，EcoRI/XbaI消化之DNA：EPCB批號C20030801A－01(1.25微克)。
圖22 係描繪生產規模培養方法之流程圖。此方法允許在25,000－升製造生物反應器中大量生產重組蛋白質。
圖23 顯示NGNA與NANA系統適合性標準之代表性層析圖。在~9.7分鐘下之吸收峰為NGNA，而在~10.7分鐘下之吸收峰為NANA。
圖24 顯示經水解之包含順序識別碼：2單體之CTLA4－Ig分子之代表性層析圖。在~8.4分鐘下之吸收峰為溶劑吸收峰。在~9.6分鐘下之吸收峰為NGNA。在~10.5分鐘下之吸收峰為NANA。在~11.3分鐘下之吸收峰為經降解之NANA，由於水解條件所形成。將NANA與經降解NANA之面積計數合併，供NANA莫耳比之計算。
圖25A、25B及25C 顯示CTLA4－Ig半胱胺醯基化肽之MALDI光譜。MALDI光譜針對含有順序識別碼：2之Cys146 之CTLA4－Ig胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶原片段獲得。圖25A顯示單鏈肽光譜，說明半胱胺醯基化修改。圖25B顯示還原後之單鏈肽光譜，且証實修改係發生在Cys146 上。圖25C顯示經還原單鏈肽之烷基化作用，其証實半胱胺醯基化作用係發生在Cys146 上。
圖26 係呈現可用於產生載體pcSD之一種無性繁殖圖式。pcDNA3係以限制酵素NaeI 消化，以單離3.821 Kb片段，其含有CMV啟動子、胺苄青霉素抗藥性基因及對大腸桿菌之複製來源。pSV2－dhfr係以限制酵素PvuII 與BamHI 消化，以單離1.93 Kb片段，其含有SV40啟動子與dhfr基因，及接著為鈍末端化。為產生pcSD，係使兩片段連接。質粒pcSD之圖譜係顯示於此圖之底部。
圖27 係呈現可用於產生表現載體pcSDhuCTLA4－Ig之一種無性繁殖圖式。pcSD係以限制酵素EcoRV 與XbaI 消化。piLN－huCTLA4－Ig係以限制酵素HindIII 消化，鈍末端化，然後以限制酵素XbaI 消化，以單離1.2 Kb huCTLA4－Ig片段。為產生pcSDhuCTLA4－Ig，係使CTLA4－Ig片段連接至經消化之pcSD載體。質粒pcSDhuCTLA4－Ig之圖譜係顯示於此圖之底部。此質粒係經線性化且轉染至未具有功能性dhfr 基因之CHO細胞中。當質粒含有功能性dhfr基因時，安定轉染體可以細胞存活率為基礎作選擇。pcSDhuCTLA4－Ig具有表現卡匣，其包含CMV啟動子，可使人類CTLA4－Ig分子(huCTLA4－Ig)編碼之順序(意即順序識別碼：1)及得自BGH之多(A)尾順序。
圖28 顯示系統適合性胺基單醣之電泳圖譜，以相對螢光單位(RFU)對時間(分鐘)描繪。
圖29 顯示系統適合性中性單醣之電泳圖譜，以相對螢光單位(RFU)對時間(分鐘)描繪。
圖30 係呈現具有經標識肽之CTLA4A29YL104E －Ig之胰蛋白酶肽圖譜。表23係與該經標識肽相應。
圖31 顯示CTLA4A29YL104E －Ig之Northern雜化作用分析。面板A描繪溴化乙錠染色之瓊脂糖凝膠，其中通道M為RNA標記物；通道1為全部CHO RNA；通道2為全部MCB RNA；而通道3為全部EPCB RNA。面板B為相應放射自顯影譜，其中通道M為RNA標記物；通道1為全部CHO RNA；通道2為全部MCB RNA；而通道3為全部EPCB RNA。
圖32A－C 顯示尺寸排阻層析圖，其係區別CTLA4A29YL104E －Ig二聚體與高及低分子量物種。
圖33 顯示以柯麥西(Coomassie)藍色染色之CTLA4A29YL104E －Ig之SDS－PAGE(經還原與未經還原)分析。通道1係裝填分子量標記物；通道2、7及12為空白試驗；通道3－6為CTLA4A29YL104E －Ig試樣(經還原)；通道8－11為CTLA4A29YL104E －Ig試樣(未經還原)。
圖34 顯示已接受銀染色之CTLA4A29YL104E －Ig之SDS－PAGE(經還原與未經還原)分析。通道1係裝填分子量標記物；通道2、7及12為空白試驗；通道3－6為CTLA4A29YL104E －Ig試樣(經還原)；通道8－11為CTLA4A29YL104E －Ig試樣(未經還原)。
圖35 係描繪使用胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶原消化之組合之未經還原CTLA4A29YL104E －Ig之肽圖譜。
圖36 係描繪使用胰蛋白酶與彈性蛋白酶消化之組合之未經還原CTLA4A29YL104E －Ig之肽圖譜。
圖37 為一圖表，描述具有抗－CTLA4－Ig或抗－CTLA－4回應之病患。對整體CTLA4－Ig分子(CTLA－4與Ig部份)及僅CTLA－4部份之抗體回應係使用檢測A與B之測定，如實例32中所概述。
圖38 為示意展現藉由致免疫性狀態之清除率分佈與中央隔室體積。
圖39 為一圖表，展現在經投予10毫克/公斤藉由本發明方法所製成藥物之猴子中，平均(SD)CTLA4－Ig血清濃度隨著時間之分佈形態。
圖40 為經純化自對照物與解聚集CTLA4－Ig物質之蛋白質A(MAbSelect)之尺寸排阻層析(SEC)層析圖之圖表。
圖41 為N－多醣分析之圖表，將解聚處理之物質(ii)與對照物(i)作比較。
圖42 為描繪平均CTLA4－Ig血清濃度[微克/毫升]對時間(歷經71天)之圖表。
圖43 顯示中性單醣之電泳圖譜，以相對螢光單位(RFU)對時間(分鐘)描繪。
圖44 顯示胺基單醣之電泳圖譜，以相對螢光單位(RFU)對時間(分鐘)描繪。
圖45 係呈現關於包含順序識別碼：4之CTLA4A29YL104E －Ig分子之比較性N－連結寡醣碳水化合物分佈形態。發現四個寡醣功能部位，其中功能部位I含有未經唾液酸基化物種，而功能部位II、III及IV係個別含有單－唾液酸基化、二－唾液酸基化及三－唾液酸基化物種。
圖46 為以1：1與CTLA4A29YL104E －Ig混合之CTLA4－Ig之毛細管電泳分離之圖表。主峰潛移時間為大約0.8分鐘間隔。
圖47 為經水解CTLA4A29YL104E －Ig物質之層析圖，其中NANA吸收峰係在3.4分鐘下發現。
圖48 係描繪數種在哺乳動物蛋白質中發現之不同N－連結碳水化合物結構。所有鏈均共有一種含有兩個GlcNAc與三個甘露糖殘基之共用核心結構。
圖49 為描繪CTLA4－Ig曝露(AUC)作為糖蛋白之唾液酸基化作用(NANA比例)之函數之圖表。
圖50 為描繪CTLA4－Ig曝露(AUC)作為CTLA4－Ig碳水化合物分佈形態之函數之圖表。大數目之吸收峰係藉由陰離子交換HPLC產生，其係被解析成四或五個功能部位。功能部位1與2大部份為非唾液酸基化與單唾液酸基化結構，而功能部位3與4大部份為二－與三－唾液酸基化結構。
圖51 係呈現具有經標識肽之CTLA4A29YL104E －Ig之胰蛋白酶肽圖譜。表56係與經標識肽相應。
圖52 係呈現關於包含順序識別碼：2之CTLA4－Ig分子之比較性N－連結寡醣碳水化合物分佈形態。發現四個寡醣功能部位，其中功能部位I含有未經唾液酸基化物種，而功能部位II、III及IV個別含有單－唾液酸基化、二－唾液酸基化及三－唾液酸基化物種。
圖53A－D 為一圖表，呈現CTLA4－Ig與肽T5、T7及T14藉由HPAEC－PAD之寡醣分佈形態。
圖54 為一圖表，描繪得自PGC(Hypercarb)管柱之CTLA4－Ig之經標識寡醣分佈形態。
圖55 係描繪藥物動力學數據之圖表，顯示猴子AUC在Y軸上，及N－連結糖基化作用之百分比，以得自碳水化合物分佈形態之功能部位I與II顯示於X軸上。參閱測定N－連結碳水化合物分佈形態之方法，在例如實例3、44、22及37中。當功能部位I與II之百分比增加(而功能部位III、IV及V之百分比降低)時，清除率增加。應指出的是，負對照組，具有低唾液酸之CTLA4－Ig，係極快速地被清除。應指出的是，CTLA4－Ig變型，LEA(CTLA4－IgA29YL104E －Ig)，係被加入此圖表中。
圖56A與56B 係描繪自CTA4－Ig釋出之N－連結碳水化合物(如得自譬如實例3、44、22及37中所述之方法者)之N－連結碳水化合物層析圖之軌跡。於圖56A中之軌跡係為得自未於培養物中添加其他半乳糖之培養方法中所製成CTLA4－Ig之分析。於圖56B中之軌跡確實已添加半乳糖至培養物中。N－連結碳水化合物於各功能部位中之百分比，係示於插入表中。
圖57 係描繪自CTA4－Ig釋出之N－連結碳水化合物(如得自譬如實例3、44、22及37中所述之方法者)之N－連結碳水化合物層析圖之軌跡。此係為得自在第8天具有半乳糖被添加至培養物之培養方法中所製成CTLA4－Ig之分析。此軌跡係為得自未於培養物中添加其他半乳糖之培養方法中所製成CTLA4－Ig之分析。N－連結之碳水化合物於各功能部位中之百分比係示於插入表中。
圖58 係描繪自CTA4－Ig釋出之N－連結碳水化合物(如得自譬如實例3、44、22及37中所述之方法者)之N－連結碳水化合物層析圖之軌跡。此係為得自在第14天具有半乳糖被添加至培養物之培養方法中所製成CTLA4－Ig之分析。此軌跡係為得自未於培養物中添加其他半乳糖之培養方法中所製成CTLA4－Ig之分析。N－連結之碳水化合物於各功能部位中之百分比係示於插入表中。
圖59A與59B 係描繪自CTA4－Ig釋出之N－連結碳水化合物(如得自譬如實例3、44、22及37中所述之方法者)之N－連結碳水化合物層析圖之軌跡。圖59A係為得自未添加半乳糖之培養方法中所製成CTLA4－Ig之分析，而圖59B係為得自其中在第14天添加半乳糖至培養物中之分析。此軌跡係為得自未於培養物中添加其他半乳糖之培養方法中所製成CTLA4－Ig之分析。N－連結之碳水化合物於各功能部位中之百分比係示於插入表中。
圖60 係描繪自CTA4－Ig釋出之N－連結碳水化合物(如得自譬如實例3、44、22及37中所述之方法者)之N－連結碳水化合物層析圖之軌跡。此軌跡係得自CTLA4－Ig物質，其係回收自QFF管柱之洗滌步驟，產生具有低唾液酸之CTLA4－Ig物質之離份。相較於圖59、58及57中所示之軌跡，功能部位I與II之相對量係被增加，而功能部位III與IV係被減少。N－連結之碳水化合物於各功能部位中之百分比係示於插入表中。
圖61 顯示CTLA4－Ig之胰蛋白酶肽圖譜，顯示T8係於溶劑前沿結束下溶離，而T9係在T27之肩部處溶離。
圖62 為一圖表，呈現相應於得自CTLA4－Ig之糖肽T8之全質譜。
圖63 為一圖表，呈現相應於得自CTLA4－Ig之糖肽T9之全質譜。
圖64 為一圖表，呈現得自CTLA4－Ig之T9肽片段之MALDI－TOF數據。
圖65A－B 係描繪得自CTLA4－Ig之經氧化與原本胰蛋白酶肽之離子層析圖與質譜。
圖66 係描繪典型N－連結寡醣分佈形態(功能部位I、II、III、IV及V，以及吸收峰1A與1B，在批號平均之5%內)。吸收峰1A、1B及1C表示G0、G1及G2之非唾液酸基N－連結寡醣結構。關於此分佈形態之數據係在正下方之表中。參閱實例44。
圖67 係描繪CTLA4－Ig之等電焦聚凝膠。譜帶之特徵為：
圖68 係描繪CTLA4－Ig之代表性等電焦聚凝膠定量分析報告。進行凝膠之定量，且數據如下：
圖69A 係描繪系統適合性標準物在裝有防護管柱之TOSO HAAS 3000 SWXL管柱上之典型20微升注射。圖69B係描繪CTLA4－Ig參考物質在裝有防護管柱之TOSO HAAS 3000 SWXL管柱上之20微升注射。
圖70 －CTLA4－Ig藉由柯麥西(Coomassie)藍色染色之聚丙烯醯胺(4－20%)凝膠電泳之以數字方式獲取SDS－PAGE分析影像之實例。
圖71 係描繪柯麥西(Coomassie)藍色染色SDS－PAGE之定量分析報告之實例。
圖72 顯示詳述圖71中經染色SDS－PAGE凝膠之定量分析之表。
圖73 係描繪CTLA4－Ig柯麥西藍色染色凝膠之經加強SDS－PAGE分析影像之實例，用於說明主要與預期較小譜帶相對於分子量標記物之潛移位置。
圖74 為CTLA4－Ig參考/標準物質之代表性N－連結碳水化合物分佈形態之描繪。此係為在Waters系統上操作之代表性碳水化合物分佈形態。滯留時間為系統依存性。
圖75 為代表性水蘇四糖系統適合性層析圖之描繪。
圖76 為經水解CTLA4－Ig物質之代表性層析圖之軌跡。
圖77 係描繪CTLA4A29YL104E －Ig柯麥西藍色染色之聚丙烯醯胺(4－20%)凝膠電泳柯麥西藍色染色之SDS－PAGE分析之錄影凝膠影像。
圖78 係描繪採集步驟之流程圖，參閱實例28。
圖79 係描繪胺基單醣之系統適合性之電泳圖譜。參閱實例16。
圖80 係描繪藥物動力學數據之圖表，顯示猴子AUC在Y軸上，及N－連結糖基化作用之百分比，以得自碳水化合物分佈形態之功能部位I與II顯示於X軸上。參閱測定N－連結碳水化合物分佈形態之方法，在例如實例3、44、22及37中。當功能部位I與II之百分比增加(而功能部位III、IV及V之百分比降低)時，清除率係增加。應指出的是，負對照組，具有低唾液酸之CTLA4－Ig係極快速地被清除。應指出的是，CTLA4－Ig變型LEA(CTLA4－IgA29YL104E －Ig)係被加入此圖表中。
圖81 係描繪藥物動力學數據之圖表，顯示AUC在Y軸上，及N－連結糖基化作用之百分比，以功能部位III與IV(當由N－連結碳水化合物分佈形態測定時)顯示於X－軸上。當功能部位III與IV之百分比增加時，AUC係增加。應指出的是，負對照組，具有低唾液酸之CTLA4－Ig，係極快速地被清除。參閱測定N－連結碳水化合物分佈形態之方法，在例如實例3、44、22及37中。應指出的是，CTLA4－Ig變型LEA(CTLA4－IgA29YL104E －Ig)係被加入此圖表中。
圖82 係描繪藥物動力學數據之另一個圖表，顯示AUC在Y軸上，及N－連結糖基化作用之百分比，以得自碳水化合物分佈形態之功能部位III與IV顯示於X軸上。當功能部位III與IV之百分比增加時，AUC係增加。應指出的是，負對照組，具有低唾液酸之CTLA4－Ig，係極快速地被清除。參閱測定N－連結碳水化合物分佈形態之方法，在例如實例3、44、22及37中。應指出的是，CTLA4－Ig變型LEA(CTLA4－IgA29YL104E －Ig)係被加入此圖表中。
圖83 係描繪CTLA4－Ig標準物之胰蛋白酶圖譜，參閱實例65末端之表，關於吸收峰指定。經標識為T1＋A之小吸收峰，係為被N－末端丙胺酸殘基延長之T1胰蛋白酶肽。經標識為T31＋K之小吸收峰，係為被C－末端離胺酸殘基延長之T31胰蛋白酶肽。
圖84 係描繪280毫微米數據之覆蓋，關於CTLA4－Ig標準物加上其經加入5莫耳% T6ox指示劑肽Met(O)85(84－93)之胰蛋白酶圖譜。參閱實例65。
圖85 係描繪215毫微米數據之擴大視圖，關於CTLA4－Ig標準物加上其經加入5莫耳% T26deaml指示劑肽isoAsp294(281－302)之胰蛋白酶圖譜。參閱實例65。
<110> 美商必治妥美雅史谷比公司<120> 組合物及製造組合物之方法<140> 095147641 <141> 2006－12－19 <150> 60/849,543 <151> 2006－10－05 <150> 60/752,267 <151> 2005－12－20 <150> 60/752,150 <151> 2005－12－20 <160> 77 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1223 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> CTLA4Ig <220> <221> CDS <222> (11)..(1159) <400> 1 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CTLA4Ig <400> 2 <210> 3 <400> 3 <210> 4 <211> 384 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CTLA4A29YL104E <400> 4 <210> 5 <211> 359 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CTLA4Ig－SEQ ID NO：2之胺基酸25－383 <400> 5 <210> 6 <211> 358 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CTLA4Ig－SEQ ID NO：2之胺基酸26－383 <400> 6 <210> 7 <211> 357 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CTLA4Ig－SEQ ID NO：2之胺基酸27－383 <400> 7 <210> 8 <211> 358 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CTLA4Ig－SEQ ID NO：2之胺基酸25－382 <400> 8 <210> 9 <211> 357 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CTLA4Ig－SEQ ID NO：2之胺基酸26－382 <400> 9 <210> 10 <211> 356 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> CTLA4Ig－SEQ ID NO：2之胺基酸27－382 <400> 10 <210> 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37<210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 38<210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 39<210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 40<210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 41<210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 42<210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 43<210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 44<210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 45<210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 46<210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 47<210> 48 <211> 22 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 48<210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 49<210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 50<210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 51<210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 52<210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 53<210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 54<210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 55<210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 56<210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 57<210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 58<210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 59<210> 60 <211> 35 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 60<210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 61<210> 62 <211> 28 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 62<210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 63<210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 64<210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 65<210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 66<210> 67 <211> 26 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 67<210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 68<210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 69<210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> Asp－N肽<400> 70<210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 71<210> 72 <211> 23 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 72<210> 73 <211> 22 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> iso－Asp <400> 73<210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Cam <400> 74<210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成6x His tag <400> 75<210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> Asp－N肽<400> 76<210> 77 <211> 13 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 胰蛋白酶肽<400> 77

Claims (12)

  1. 一種包含CTLA4-Ig分子之組合物，其特徵為：(a)N-乙醯神經胺酸(NANA)對CTLA4-Ig分子之平均莫耳比為8.0至11.9，及(b)當藉尺寸排阻層析及分光光度測定時，係少於或等於2.0面積百分比之CTLA4-Ig高分子量物種。
  2. 如請求項1之組合物，進一步特徵在於CTLA4-Ig分子中宿主細胞蛋白量少於或等於95毫微克/毫升，且MCP-1之量少於約9.55毫微克。
  3. 如請求項1之組合物，其中該CTLA4-Ig分子當藉尺寸排阻層析時，係大於或等於97.0面積百分比為CTLA4-Ig二聚體，且當藉尺寸排阻層析及分光光度測定時，係少於或等於0.5面積百分比為低分子量物種。
  4. 如請求項1之組合物，其中該CTLA4-Ig分子當藉尺寸排阻層析及分光光度測定時，係少於或等於1.0面積百分比為高分子量物種。
  5. 如請求項1之組合物，其中該CTLA4-Ig分子當藉尺寸排阻層析及分光光度測定時，係少於或等於0.5面積百分比為高分子量物種。
  6. 如請求項1之組合物，其中該CTLA4-Ig分子包含一或多個具有SEQ ID NO：2、5、6、7、8、9或10之多肽。
  7. 如請求項1之組合物，其中該CTLA4-Ig分子包含一或多個具有SEQ ID NO：18之多肽。
  8. 如請求項1之組合物，其中該CTLA4-Ig分子為CTLA4-Ig突變體CTLA4A29YL104E -Ig。
  9. 如請求項8之組合物，其中該CTLA4-Ig分子包含一或多個具有SEQ ID NO：4、11、12、13、14、15或16之多肽。
  10. 如請求項8之組合物，其中該CTLA4-Ig分子包含一或多個具有SEQ ID NO：24之多肽。
  11. 如請求項1至10中任一項之組合物，其中該組合物為醫藥組合物。
  12. 一種如請求項1至11中任一項之組合物之用途，其係用於製備治療或預防移植物對宿主疾病(GVHD)、治療或預防移植器官排斥、治療或預防移植器官、組織或細胞之排斥、治療與移植物移植排斥有關聯之免疫病症、治療牛皮癬、治療狼瘡、治療風濕疾病、治療風濕性關節炎或治療多發性硬化的藥劑。
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