TWI393568B - 抑制酪胺酸酶及黑色素生成之中草藥純化物及其製造方法 - Google Patents

Description

抑制酪胺酸酶及黑色素生成之中草藥純化物及其製造 方法

本發明係有關於一種中草藥萃取物，特別是有關於一種抑制酪胺酸酶及黑色素生成之中草藥萃取物。

將植物用於保健、保養或醫療，不論在東、西方均有悠久歷史。過去，植物萃取物最主要的應用著重於保健食品及藥品的開發。近年來，將植物萃取物添加於化粧保養品上則已大幅成長為主流應用之一。

由於自然主義的抬頭，樂活、養生概念的流行，植物萃取物的添加幾乎已成為國、內外各大化粧品公司最重要的訴求。典型的化妝品用植物萃取物是由單一植物萃取而成，隨著功效訴求的需要而增加萃取物的種類，現在流行在化妝品中添加多種不同植物萃取物來達到天然成分多樣化及複方化。

植物萃取物是否適合添加至化妝品中，除功效外尚有萃取物的顏色是否適合，顏色過深的植物萃取物添加於化妝品中經常造成賣相不討喜的現象，以致於只能微量添加。而植物萃取物的本身即是數百種以上的化學成分所組成，因此，添加量大亦容易造成化妝品不穩定現象，如乳液乳霜的分層。但若只能少量添加的結果則造成產品功效不彰，故仍需借助添加額外的化學成分才能達到所需訴求，如產品訴求美白時，除植物萃取物外需再添加熊果素或維他命C等。

中草藥複方萃取物之應用，一向以濃縮中藥藥品及健康食品為主要大宗，添加在化妝品中者，目前產品並不多見。原因有二：其一是中草藥複方萃取物在化妝品的應用性較單一植物萃取物來得不易，如中草藥複方萃取物的顏色普遍均較單方植物萃取物來的更深，更易造成產品觀感不佳、所含化學成分種類更多，使得產品不穩定現象更易發生、複方中藥氣味濃厚，氣味不易修飾而使產品接受度不良等。原因之二就是中草藥複方向來為東方民族所用，所使用之植物種類多而繁雜，又具有中醫理論基礎，因此，對於西方社會而言較為陌生，不易引起消費者興趣及理解，加上中藥複方技術對化妝品集團而言，入門門檻較高，使得開發意願低落，也導致此類產品缺乏大型化妝品集團的投入與推廣。因此，除非以現代科學驗證功效及安全性，又經過適當純化製成簡單易用之化妝品原料，才能使中草藥複方萃取物在化妝品的應用展開新頁。

市售美白化粧品及藥品成分的作用原理不外乎以延遲黑色素的形成為主，方法主要有以下幾類：(1)隔離紫外線，(2)抑制酪氨酸酶活性，(3)降低黑色素細胞的作用及(4)使用抗氧化劑。

目前，衛生署公告的美白成分如magnesium ascorbyl phosphate、sodium ascorbyl phosphate、ascorbyl glucoside、kojicacid、arbutin及ellagic acid等，均可抑制酪氨酸酶活性，由此顯示此生物活性在美白功效的評估上佔有重要地位。就學理而言，黑色素的合成是黑色素細胞(melanocytes)中一種重要反應，其合成受到細胞內多種酶的催化，但最主要是酪氨酸酶，其作用為將酪氨酸羥化(hydroxylation)為L－DOPA，再將L－DOPA氧化為dopaquinone。此反應是一連串黑色素合成反應中的速率決定步驟，因此，能將酪氨酸酶的作用抑制下來，就可大幅延緩黑色素合成而達到美白功效。

目前，普遍用於抑制酪氨酸酶活性試驗的酵素為洋菇的酪氨酸酶。此酵素來源穩定，價格低廉，實驗操作僅需試管試驗即可完成，輔以ELISA reader來進行操作時，更能建構出一方便快速的篩選平台，提供研發人員更有效率地開發新的美白成分或處方。

然而，洋菇的酪氨酸酶畢竟與人體酪氨酸酶有不同差異，洋菇酪氨酸酶的試驗結果也許不見得能夠在人體酪氨酸酶試驗中得到重現，因此，細胞活性試驗則顯示出其重要性，若能以一有系統的體外試驗篩選，再針對作用效力較強的材料，進一步以細胞培養的方式研究其對正常細胞的毒性、黑色素腫瘤細胞的生長抑制及黑色素合成的抑制效果進行評估，將能得到較完整的活性分析且提供動物及人體實驗的重要參考依據。

本發明之一實施例，提供一種抑制酪胺酸酶及黑色素之中草藥萃取物，包括有效量之白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及以及細辛。

上述中草藥萃取物中，白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及與細辛之比例大體介於1~6：1~6：1~6：1：1：1~1.7：1或3.3：3.3：3.3：1：1：1.7：1。本發明中草藥萃取物為水或乙醇之萃取物，其中乙醇之濃度大體介於10~95%。本發明中草藥萃取物係以一大孔吸附樹脂充填之管柱進行純化，以獲得一中草藥純化物。本發明中草藥萃取物或純化物係添加於包括乳霜、乳液、化妝水或精華液之化妝品中。

為讓本發明之上述目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉一較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：

本發明之一實施例，提供一種抑制酪胺酸酶及黑色素之中草藥萃取物，包括有效量之白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及以及細辛。

上述中草藥萃取物中，白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及與細辛的比例大體介於1~6：1~6：1~6：1：1：1~1.7：1或為3.3：3.3：3.3：1：1：1.7：1。本發明中草藥萃取物可為水或乙醇的萃取物，例如可以濃度大體介於10~95%的乙醇進行萃取。本發明中草藥萃取物更可以一大孔吸附樹脂充填的管柱進行純化，以獲得一中草藥純化物。目前市面使用的大孔吸附樹脂型號例如D101、AB－8、H103、HLD16、HP－20、XAD－2、XAD－4、XAD－16HP或HPD系列(HPD－DHPD－80、HPD－100、HPD－100A、HPD－100B、HPD－100C、HPD－300、HPD－400、HPD－500、HPD－600、HPD－700)均可應用於本發明，作為萃取物純化之用。本發明中草藥萃取物或純化物適合添加於例如乳霜、乳液、化妝水或精華液等的化妝品或外用藥品中。

【實施例】

【實施例1】本發明中草藥萃取物(複方萃取物)之製備 首先，將白芷、白蘞、白朮、白附子(生用)、白茯苓、白及及細辛分別研磨成細粉(40mesh)。之後，以3.3：3.3：3.3：1：1：1.7：1(30：30：30：9：9：15：9)的比例均勻混合，以製得複方粉末。

接著，取10克的複方粉末，以50mL的水、50%乙醇及95%乙醇，於四種溫度(25℃、50℃、75℃及沸騰)下，分別以超音波萃取1.0小時，續以5000rpm離心15分鐘，於傾出上清液後濃縮之。最後，以冷凍乾燥將水分去除，即可獲得12種依不同製備方式製成的複方萃取物。

此外，亦可取10克的複方粉末，以50mL的水於25℃下以超音波萃取1.0小時，續以5000rpm離心15分鐘，於傾出上清液後倒入150mL的95%乙醇。待多醣成分析出後，以1號濾紙過濾之。待濾液以真空濃縮機濃縮後，以冷凍乾燥將水分去除，即可獲得以水抽醇沈法製備之複方萃取物。

【實施例2】本發明中草藥萃取物(單味藥材水萃取物)之製備 首先，將白芷、白蘞、白朮、白附子(生用)、白茯苓、白及及細辛分別研磨成細粉(40mesh)，以獲得七種不同的單味藥材粉末。

接著，分別取七種單味藥材粉末各10克，以50mL的純水於25℃下以超音波萃取1.0小時，續以5000rpm離心15分鐘，於傾出上清液後濃縮之。之後，以冷凍乾燥將水分去除，即可獲得七種不同的單味藥材水萃取物。

【實施例3】本發明中草藥複方純化物之製備(1) 首先，取1kg實施例1的複方粉末，於第一次萃取時，加入5倍量(5L)的50%乙醇。待室溫下攪拌萃取1.0小時後，以60目篩網過濾之。之後，將藥渣加入3倍量(3L)的50%乙醇，於室溫下進行第二次攪拌萃取。待1.0小時後，以60目篩網過濾。綜合兩次濾液，以5000rpm離心15分鐘，並取上清液減壓濃縮至無酒精味，以獲得約1920g之50%乙醇萃取液，乾浸膏率約為3.75%。

接著，將上述萃取液倒入以1L大孔吸附樹脂Diaion HP－20充填的管柱中進行吸附。先以2.5L的純水脫除醣類、蛋白質及胺基酸等物質後，以不同濃度的乙醇進行沖提，沖提量均為2.5L。待沖提液收集後，以減壓濃縮機進行濃縮。最後，以冷凍乾燥將水分去除，即可獲得數種以不同乙醇比例沖提的複方純化物。

【實施例4】本發明中草藥複方純化物之製備(2) 首先，將白芷、白蘞、白朮、白附子(生用)、白茯苓、白及及細辛分別研磨成細粉(40mesh)。之後，以3.3：3.3：3.3：1：1：1.7：1(30：30：30：9：9：15：9)的比例均勻混合，以製得複方粉末(古方)。

另提高白芷、白蘞及白朮的比例。待白芷、白蘞、白朮、白附子(生用)、白茯苓、白及及細辛分別研磨成細粉(40mesh)後，以6：6：6：1：1：1：1的比例均勻混合，以製得複方粉末(變方A)。

另提高白附子(生用)、白茯苓、白及及細辛的比例。待白芷、白蘞、白朮、白附子(生用)、白茯苓、白及及細辛分別研磨成細粉(40mesh)後，以1：1：1：1：1：1：1的比例均勻混合，以製得複方粉末(變方B)。

接著，分別取上述三種不同配方的複方粉末各100克，以500mL的50%乙醇於室溫下靜置隔夜，以1號濾紙過濾之。待濾液以真空濃縮機進行濃縮至50mL左右後，可製得三種不同配方的萃取液。

之後，將上述三種萃取液分別倒入三支以100mL大孔吸附樹脂Diaion HP－20充填的管柱中進行吸附。先以250mL的純水脫除雜質後，以50%的乙醇進行沖提，沖提量為250mL。待沖提液收集後，以減壓濃縮機進行濃縮。最後，以冷凍乾燥將水分去除，即可獲得三種不同配方的複方純化物。

【實施例5】本發明中草藥萃取物(複方萃取物)對洋菇酪氨酸酶活性之影響 首先，將實施例1中以12種不同製備方式製得的複方萃取物，以水或適量DMSO溶解配製成儲備溶液。之後，取適量儲備溶液以水稀釋成30mg/mL，成為待測溶液，於試管中的實際受測濃度為10mg/mL。

接著，取90μ L、2 mM的tyrosine溶液(83.3mM磷酸緩衝液，pH6.8)與50μ L的不同待測樣品溶液混合。之後，加入10μ L的酪胺酸酶溶液(526.5U/mL)，偵測60min時在波長492 nm下的吸光值，再計算抑制百分率。以不同濃度ascorbic acid為正向控制組。

酪胺酸酶抑制率：Inhibition(%)＝(Control－Sample)/Control

Sample：為樣品扣除干擾顏色後，在波長492 nm的吸光值。

Control：為不加待測樣品之blank，在波長492 nm的吸光值。

Positive control：Ascorbic acid,IC₅₀ ＝0.42mg/mL

由表一結果可知，不論以何種溶劑於不同溫度下萃取，均能獲得不等程度具有抑制洋菇酪胺酸酶效能之萃取物，其中以95%的乙醇萃取物具有最佳抑制率，其次為50%的乙醇萃取物。於10mg/mL的受測濃度下，抑制率可達50%以上。

由表二可知，與傳統水萃取物比較，以水抽醇沈法、50%及95%的乙醇進行萃取，可大幅提升洋菇酪胺酸酶抑制效能達四倍以上。

【實施例6】本發明中草藥萃取物(複方萃取物)對黑色素瘤細胞存活率之影響 (1)細胞型態變化(Morphological change)依據Lee et al.所揭露之實驗方法。首先，將細胞繼代於96孔盤中(1x10⁴ 細胞)。待貼盤後，加入本發明複方萃取物，分別培養24、48及72小時，以倒立式顯微鏡觀察細胞形態。

(2)細胞存活率(Cell viability determination)MTT[3－(4,4－dimethylthiazol－2－yl)－2,5－diphenol tetrazolium bomide]為tetr－azolium salt，經細胞內粒腺體琥珀酸去氫酶(dehydrogenase)分解後，由透明無色轉為產生藍色formazan晶體，死細胞則因胞內粒腺體去氫酶失去活性而不能產生藍色結晶。故此處以產生藍色結晶的多寡判斷細胞存活率。

將細胞培養於96孔盤中，每孔接種1×10⁴ cells。之後，加入上述不同製程之複方萃取物於37℃下培養24－72小時。接著，以PBS(phosphate butter saline)清洗兩次，並加入MTT培養1小時。待移除液體後，加入100μL的DMSO溶解藍色固體結晶。使用microplate reader(FLUO star OPIMAs BMG Labtechnologies GembH,Germany)於570 nm偵測其吸光值。

結果請參閱第1圖。圖1顯示，本發明複方F1~F5對A2058黑色素瘤細胞在500μg/mL的濃度下，並無顯著細胞毒性，細胞存活率均>90%。而F6及F7在500μg/mL的濃度下，則會明顯使細胞存活率下降，降至60~80%。由顯微鏡觀測細胞型態，初步推測F6及F7在500 μg/ml的濃度下應具有細胞毒性，為不使細胞存活率較低而影響實驗數據，本發明對A2058黑色素瘤細胞之酪胺酸酶活性及melanin含量測定均以100μg/mL之萃取物濃度進行之。

【實施例7】本發明中草藥萃取物(複方萃取物與單方萃取物)對黑色素瘤細胞酪胺酸酶活性之影響 首先，於96孔培養盤中接種細胞(3 x 10⁴ 細胞/孔)，並於37℃，5% CO₂ 條件下培養24小時。之後，加入樣品處理24小時。待每孔以200μ l的PBS(phosphate butter saline)清洗後，分別加入20μ l、0.5%(v/v)Triton－X－100/50mM sodium phosphate buffer solution(pH6.9)，置於－80℃環境下30分鐘。待取出後，於室溫(25℃)培養25分鐘，再於37℃培養5分鐘。接著，每孔加入190μ l受質溶液(含6.3mM MBTH(3－methyl－benzothiazolinone hydrazone)，1.1mM L－dopa(in 48mM sodium phosphate buffer solution，pH7.1)，4%(v/v)N,N－dimethyl formamide)，於37℃反應60分鐘，以免疫酵素分析儀microplate reader(FLUO star OPIMAs BMG Labtechnologies GembH,Germany)於570 nm偵測吸光值。

結果請參閱第2~3圖。圖2顯示，在100μg/mL濃度下於A2058細胞系統中，單味藥材萃取物S5~S7具有30~40%的抑制率，此與10μM的kojic acid的抑制能力相當。

另由圖3結果可知，本發明複方萃取物F1~F4的抑制能力較單味藥材萃取物稍有提升，達40~60%的抑制率，而F5~F7則提升至相當於50μM kojic acid的抑制能力，抑制率可達70%以上。

【實施例8】本發明中草藥萃取物(複方萃取物與單方萃取物)對黑色素瘤細胞黑色素含量之影響 依據Rosenthal et al.所揭露之方法。首先，取細胞萃取液(定量2mg蛋白質)加入0.05M Na₂ CO₃ (pH7.8)至5ml體積。待以3000 rpm離心10分鐘並去除上清液後，加入0.05M Na₂ CO₃ (pH7.8)至體積25ml並與50μ l、30% H₂ O₂ 混合均勻。之後，加熱100℃持續30分鐘。待冷卻後，檢測波長450nm螢光值。

結果請參閱第4圖。圖4顯示，單味藥S1~S7在100μg/mL濃度下，並沒有明顯抑制A2058細胞黑色素含量的能力，甚至單味藥S1、S2、S7及複方F1~F4顯示出有促進細胞黑色素含量增加的趨勢。而F5~F7則具有60~90%抑制黑色素生成的能力，此與50 M kojic acid之效能相仿。

由實施例7~8之A2058黑色素瘤細胞酪胺酸酶活性及黑色素含量的分析可知，單味藥材的美白表現並不突出，但以本發明經適當製程後之複方萃取物，則可增加美白潛力，其中以F5~F7為最佳。F7為25℃水萃液再以等量乙酸乙酯萃取後取有機層濃縮乾燥而得之萃取物。

第5圖為本發明複方萃取物之HPLC分析圖譜。由圖5可知，經乙酸乙酯處理後之水萃取物F7與F1相比較，F7較F1大幅地提升了在260nm下可檢測出之成分濃度。且由圖3及圖4可知，F7的美白效能是較F1有所提升，顯示乙酸乙酯的處理可有效地將水萃取液中具美白功效之成分濃度提高，並可在260nm下檢視得到。另由圖5之HPLC分析圖譜可知，複方萃取物F5~F7均具有相似成分組成，差異儘在於所含成分之濃度不同，由此可推論，本發明複方中具美白功效性之成分，可透過水或不同濃度之酒精被提取出來。

【實施例9】本發明中草藥複方純化物對洋菇酪氨酸酶活性之影響 首先，將各種不同製備方式製得的複方純化物，以水或適量DMSO溶解配製成儲備溶液。之後，取適量儲備溶液以水稀釋成30mg/mL，成為待測溶液，用以測定待測樣品對洋菇酪胺酸酶活性之影響，於試管中的實際受測濃度為10mg/mL。結果請參閱表四及表五。

由表四可知，本發明複方萃取物經大孔吸附樹脂之吸附再以水沖提脫除水溶性醣類、蛋白質及胺基酸等成分後，不同濃度乙醇純化物均可表現出程度不等的洋菇酪胺酸酶抑制能力。

由表五可知，採用不同純化製程所獲得的純化物，亦呈現出程度不等的洋菇酪胺酸酶抑制能力。組別B所獲得的純化物在意義上相等於組別A中10%與40%乙醇純化物的混合物。雖單獨之10%乙醇純化物在洋菇酪胺酸酶抑制能力的表現上相對較差，但以B製程方式純化後，仍可使純化物的IC₅₀ 下降至0.53mg/mL。在C組別中，20%乙醇純化物的IC₅₀ 可達0.25mg/mL，與下表六對照，其對洋菇酪胺酸酶之抑制能力與熊果素相似，並優於維他命C等其他已知之美白功效化合物。同樣情形，D組之意義相等於C組中20%與50%乙醇純化物的混合物，亦相等於表四中10%~50%乙醇純化物的混合物。經由上述實驗可知，本發明複方萃取液經大孔吸附樹脂吸附並以水沖提後，可以任何濃度的乙醇進行脫附沖提，而所獲得之純化物均具有洋菇酪胺酸酶抑制能力，並較表二之不同溶劑萃取物具有更佳抑制效能。

【實施例10】本發明中草藥複方純化物對洋菇酪氨酸酶活性之影響 表七為實施例4所製得之中草藥複方純化物對洋菇酪胺酸酶活性影響之評估結果。

表七為不同比例之七種藥材經萃取及大孔吸附樹脂純化處理後對洋菇酪胺酸酶活性之影響，其中以變方A有最佳之抑制效率，變方B則效果較差，但IC₅₀ 仍可達0.465mg/mL。結果顯示，白芷、白蘞及白朮之比例加重，可能對提升複方純化物對洋菇酪胺酸酶活性之抑制效能有幫助。結果來說，白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及與細辛之比例介於1~6：l~6：l~6：1：1：1~1.7：1所製備而得之萃取物及純化物，應均可達到抑制洋菇酪胺酸酶之有效量。

【實施例11】本發明中草藥複方純化物對A2058人類黑色素瘤細胞株之影響 結果請參閱第6~7圖。由圖6可知，在500及1000μg/ml濃度下，F5－4及F6會使細胞存活率明顯下降，顯示此兩萃取物有較強細胞毒性。由圖7可知，在100μg/ml試驗濃度下，F5複方純化物中以F5－3抑制細胞酪胺酸酶活性及melanin生成的能力最佳，其抑制能力分別約為61及76%，相當於10M kojic acid(53%及53%)，優於50 M ascorbic acid(25%及47%)，並顯著大於未純化前的F5複方。而其餘純化物如F5－2及F5D亦具有抑制細胞酪胺酸酶活性及黑色素生成的能力。

為進一步瞭解F5複方純化物是否具有太陽照射後，預防細胞形成黑色素的能力，乃先將細胞與F5複方純化物培養24小時後，換掉培養基，依陽光下之照射能量(180 KJ/m² )照射細胞30分鐘，以誘導細胞生成大量黑色素，若純化物具有抑制UVA照射後細胞形成黑色素的能力，應可初步推測其具有開發成為抗UVA照射之美白產品潛力。此處選取抑制黑色素能力最佳的F5－3、F5D及未純化前的F5複方進行試驗。由第8圖的結果顯示，F5－3幾乎能完全抑制UVA照射誘導黑色素細胞形成黑色素的能力，其次為F5D，約有73%的抑制能力，而未純化前的F5複方則未有明顯抑制效果。因此，本發明經大孔吸附樹脂處理後的純化物是具有開發成為抗UVA照射的美白產品潛力。

【實施例12】本發明中草藥複方純化物皮膚安全性之評估 (1)皮膚刺激性依據Draize試驗方法。符合衛生署「藥品非臨床試驗安全性規範」之皮膚刺激性試驗(Skin Irritation Study)(2000)，亦符合美國環保署對化學物安全評估準則中有關皮膚刺激性試驗規範處理(Health Effects Test Guidelines ,OPPTS 870.2500,Acute Dermal Irritation ,US EPA 712－C－98－196,August 1998)，及歐洲經濟合作暨開發組織『皮膚刺激性/腐蝕性』試驗規範(OECD Guidelines for Testing of Chemicals,Acute Dermal irritation/corrosion .Section 4：Health Effects：No.404.Adapted 24^th April 2002)。

首先，以0.5g的F5D覆蓋白兔背部皮膚。待4小時後，除去藥劑、膠布及紗布，並以足量蒸餾水洗去殘留藥物，觀察第4、24、48及72小時皮膚刺激性。結果顯示，F5D藥劑覆蓋皮膚區在除去貼布後，第4、24、48及72小時均無明顯紅斑或腫脹。依據Draize皮膚刺激指數評估法，F5D對白兔皮膚的第4、24、48及72小時之平均刺激指數為0。試驗期間，試驗動物體重增重亦無明顯變化。皮膚組織切片經H&E及Masson Trichrome染色觀察均無明顯組織病理變化。F5D覆蓋白兔背部皮膚後之平均皮膚刺激指數為『0』。依據Draize試驗之皮膚刺激評估法，F5D的皮膚刺激性等級屬於『無皮膚刺激性』。

(2)皮膚過敏性依據Behler試驗方法。符合衛生署「藥品非臨床試驗安全性規範」之皮膚過敏性(Skin Sensitization Study)(2000)，亦符合美國環保署對化學物安全評估準則中有關皮膚過敏性試驗規範處理(Health Effects Test Guidelines,OPPTS 870.2600,Skin Sensitization,US EPA 712－C－98－197,August,1998)，及歐洲經濟合作暨開發組織『皮膚過敏性』試驗規範(OECD Guidelines for Testing of Chemicals,Skin Sensitization,Section 4：Health Effects：Test No.406.1992)。

測試F5D對天竺鼠之皮膚過敏性。於第1、2及3週進行藥劑誘導期試驗(induction phase)，第5週及第6週進行藥劑攻擊期試驗(challenge phase)。試驗結果顯示，F5D藥劑與對照組於天竺鼠右腰窩部皮膚暴露24小時，取下貼布後，觀察24及48小時均無皮膚過敏性，皮膚過敏陽性率為0%，等級屬『I,(0－8)』，分類為『無』過敏性；另外，陽性藥劑組(0.1% DNCB)造成皮膚輕度至中度紅斑及腫脹，皮膚過敏陽性率為100%，等級屬「V,(81－100)」，為「極強過敏性」藥物。F5D對天竺鼠皮膚過敏性試驗等級屬『I,(0－8)』，分類為『無皮膚過敏性』藥劑。

綜合以上結果，本發明中草藥複方純化物F5D對白兔不具皮膚刺激性(non dermal irritation)及對天竺鼠不具皮膚過敏性(non dermal sensitization)。

【實施例13】本發明中草藥複方純化物於化妝品及外用藥品之應用 將本發明複方純化物溶解於適量水相後，倒入適量油相，以均質機(IKA T25，Germany)在轉速11,000rpm下進行乳化，可製成乳霜、乳液、藥膏等乳化劑型。

將本發明複方純化物溶解於適量水相，再與其他成分攪拌均勻後，可製得不需乳化步驟之化粧水與精華液等產品。

【實施例14】本發明中草藥萃取物所製化妝品美白功效之評估 本發明化妝品之試用評估，由20位女性自願配合，試用進行前，先以色卡比對並記錄雙手膚色。試用期間，請每位受測人員於晚上睡前取適量擦於右手，2個月後再以色卡比對膚色之變化情形。

功效評估請參閱第9A~9B圖，無論乳霜(9A圖)或乳液(9B圖)，在20位女性經兩個月的試用期後，顯示出約有70%的受試人員有不等程度之膚色改善。

本發明透過洋菇酪胺酸酶活性平台及A2058人類黑色素瘤細胞株之篩選，並以Draize test及Behler test確認對皮膚之刺激性及過敏性，已獲得安全性佳、應用方便及確實具有美白功效之萃取物或純化物。將此萃取物或純化物添加至例如乳霜的化妝品中，可製成穩定性佳，色淺味淡的產品，並以20位女性進行試用後，確認其具有美白功效性。

本發明複方可透過水或不同濃度酒精被提取出來，與傳統水萃取物相比較，以水抽醇沈、50%及95%乙醇進行萃取者，可大幅提升對洋菇酪胺酸酶之抑制效能達四倍以上。

本發明中草藥萃取物之各單味藥材的美白表現並不突出，但以複方組合再經適當製程後，則可增加美白潛力(抑制細胞酪胺酸酶活性及黑色素生成能力)。

本發明複方萃取液經大孔吸附樹脂吸附並以水沖提後，可以任何濃度之乙醇進行脫附沖提，所獲得之純化物均具有洋菇酪胺酸酶抑制能力，其中以10~50%乙醇沖提者較佳，較水、水抽醇沈、50%乙醇及95%乙醇等不同溶劑之萃取物有更佳之抑制效能外，亦無細胞毒性、皮膚刺激性及皮膚過敏性。由此顯示，經大孔吸附樹脂進行適當純化後，可有效提升洋菇酪胺酸酶抑制能力及純化物之安全性。且經大孔吸附樹脂處理後之複方純化物亦具有抑制A2058細胞酪胺酸酶活性及黑色素生成能力，並可抑制UVA照射所誘導的黑色素形成能力。

此外，經大孔吸附樹脂處理後之複方純化物可廣泛應用於各種化粧品。且經20位女性試用後，所製得的乳霜及乳液確實具有美白功效性。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖為本發明不同製程複方萃取物對黑色素瘤細胞存活率之影響。

第2圖為本發明中草藥萃取物單方對黑色素瘤細胞酪胺酸酶活性之影響。

第3圖為本發明不同製程複方萃取物對黑色素瘤細胞酪胺酸酶活性之影響。

第4圖為本發明中草藥萃取物單方與不同製程複方萃取物對黑色素瘤細胞黑色素含量之影響。

第5圖為本發明不同溶劑複方萃取物之HPLC層析圖。

第6圖為本發明F5複方純化物對黑色素瘤細胞存活率之影響。

第7圖為本發明F5複方純化物對黑色素瘤細胞之酪胺酸酶活性及黑色素含量之影響。

第8圖為本發明F5複方純化物對UVA照射黑色素瘤細胞誘導黑色素形成能力之影響。

第9A~9B圖為本發明中草藥萃取物所製乳霜及乳液產品之功效評估結果。

Claims (12)

1. 一種抑制酪胺酸酶之中草藥純化物的製造方法，包括：提供一種抑制酪胺酸酶之中草藥萃取物，包括有效量之白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及以及細辛，其中該抑制酪胺酸酶之中草藥萃取物為以水或濃度大體介於10~95%的乙醇進行萃取；以及將該抑制酪胺酸酶之中草藥萃取物以一大孔吸附樹脂充填之管柱進行純化。
2. 如申請專利範圍第1項所述之抑制酪胺酸酶之中草藥純化物的製造方法，其中白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及芨與細辛之比例大體介於1~6：1~6：1~6：1：1：1~1.7：1。
3. 如申請專利範圍第1項所述之抑制酪胺酸酶之中草藥純化物的製造方法，其中白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及芨與細辛之比例為3.3：3.3：3.3：1：1：1.7：1。
4. 如申請專利範圍第1項所述之抑制酪胺酸酶之中草藥純化物的製造方法，其中該抑制酪胺酸酶之中草藥純化物係添加於化妝品或外用藥品中。
5. 如申請專利範圍第4項所述之抑制酪胺酸酶之中草藥純化物的製造方法，其中該化妝品係包括乳霜、乳液、化妝水或精華液。
6. 一種抑制酪胺酸酶之中草藥純化物，包括有效量之 白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白芨以及細辛，其中該抑制酪胺酸酶之中草藥純化物是由申請專利範圍第1~5項中任一項所述之製造方法所製得者。
7. 一種抑制黑色素生成之中草藥純化物的製造方法，包括：提供一種抑制黑色素生成之中草藥萃取物，包括有效量之白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及以及細辛，其中該抑制黑色素生成之中草藥萃取物為以水或濃度大體介於10~95%的乙醇進行萃取；以及將該抑制黑色素生成之中草藥萃取物以一大孔吸附樹脂充填之管柱進行純化。
8. 如申請專利範圍第7項所述之抑制黑色素生成之中草藥純化物的製造方法，其中白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及芨與細辛之比例大體介於1~6：1~6：1~6：1：1：1~1.7：1。
9. 如申請專利範圍第7項所述之抑制黑色素生成之中草藥純化物的製造方法，其中白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白及芨與細辛之比例為3.3：3.3：3.3：1：1：1.7：1。
10. 如申請專利範圍第7項所述之抑制黑色素生成之中草藥純化物的製造方法，其中該抑制黑色素生成之中草藥純化物係添加於化妝品或外用藥品中。
11. 如申請專利範圍第10項所述之抑制黑色素生成之中草藥純化物的製造方法，其中該化妝品係包括乳霜、乳 液、化妝水或精華液。
12. 一種抑制黑色素生成之中草藥純化物，包括有效量之白芷、白蘞、白朮、白附子、白茯苓、白芨以及細辛，其中該抑制黑色素生成之中草藥純化物是由申請專利範圍第7~11項中任一項所述之製造方法所製得者。