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TWI381834B - Abnormal protein removal composition - Google Patents

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TWI381834B
TWI381834B TW095127786A TW95127786A TWI381834B TW I381834 B TWI381834 B TW I381834B TW 095127786 A TW095127786 A TW 095127786A TW 95127786 A TW95127786 A TW 95127786A TW I381834 B TWI381834 B TW I381834B
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Satoshi Miyata
Yukari Umino
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Description

異常蛋白質除去用組成物
本發明係關於一種異常蛋白質除去用組成物及其用途。
近年來，活性氧對生體內的細胞及組織所造成的種種氧化傷害問題漸受關注。目前已確知，活性氧的反應性相當高，它會破壞生體種種成分，與阿茲海默症、巴金森氏症、路易士體失智症、重覆序列疾病、肌萎縮性脊髓側索硬化症、白內障、動脈硬化、糖尿病性腎病變、腦中風、心肌梗塞、風濕、癌症、胃潰瘍、皮膚的皺紋、鬆弛、暗沉、斑點等種種病症有關(非專利文獻1)。增加活性氧的因素，有例如增齡、過度運動、暴露於紫外線中、精神上的壓力等。活性氧増加，將會在生體內堆積氧化蛋白質，也就是所謂的異常蛋白質，而引起如前述之種種病症(非專利文獻2)。而在皮膚方面，亦已知尤以暴露於紫外線中所帶來的氧化傷害影響甚鉅，暴露於紫外線中可能引起表皮角質細胞及皮膚纖維母細胞的DNA損傷、彈力蛋白及膠原蛋白等皮膚彈性成分的分解等等，促進皺紋和斑點的形成(非專利文獻3)。
以往為了防止活性氧所造成的氧化傷害，曾嘗試藉由攝取、應用抗氧化物質，以消除生體內的活性氧，抑制蛋白質氧化。代表性的抗氧化物質，有生育醇類、胡蘿蔔素類及類黃酮類等，此等物質之中已有數種添加至食品或化粧品中，加以利用。
然而，抗氧化物質的攝取、應用，雖與消除生體內所產生的活性氧有關，卻完全無關於消除既已堆積的異常蛋白質。因此，要改善與堆積於生體內的異常蛋白質相關之種種疾病，必須去除已堆積的異常蛋白質。
去除生體內的異常蛋白質之酵素，有蛋白酶體。蛋白酶體為一具有複雑分子結構之巨大多成分複合體，近年來，其在生體內之生理機能的研究備受矚目。蛋白酶體係去除在蛋白質形成立體結構的過程中，阻礙其正常摺疊及分子集合的異常蛋白質，發揮管理蛋白質品質的功能，且去除因紫外線及氧化壓力等而變性或受損的蛋白質，因此亦和壓力反應有密切關係(非專利文獻4)。目前已知皮膚會隨著增齡，導致蛋白酶體活性逐漸降低，氧化膠原蛋白増加(非專利文獻5)。諸如上述，蛋白酶體係一種藉由去除異常蛋白質，具有維持並監視細胞恆常性的重要功能之物質。
目前已知隨著增齡，皮膚上的蛋白酶體活性會降低，且氧化膠原蛋白増加。
有鑑於上述，已開發了促進生體內的蛋白酶體活性，預防及改善種種疾病的組成物。例如現已開發出含有靈芝萃取物的蛋白酶體活性促進劑(專利文獻1)，含有特定胜肽(petide)化合物的蛋白酶體作用増強劑(專利文獻2)，含有具蛋白酶體活性促進作用的大豆皂素(soy saponin)之去除異常蛋白質用組成物(專利文獻3)，及含有羽衣甘藍(Kale)及/或其萃取物之蛋白酶體活性促進用組成物(專利文獻4)。
【專利文獻1】日本特開2002－29996號公報【專利文獻2】國際公開00/04042號手冊【專利文獻3】日本特開2002－179592號公報【專利文獻4】日本特開2004－91398號公報【專利文獻5】日本特開平5－286864號公報【專利文獻6】日本專利第2948818號【專利文獻7】日本特開2000－169328號公報【專利文獻8】日本特開2000－169332號公報【專利文獻9】日本特願2002－255448號【專利文獻10】日本特公平5－9406號公報【專利文獻11】國際公開番號WO2004/085429【專利文獻12】日本特公昭63－41396號公報【專利文獻13】日本特開2004－115438號公報【專利文獻14】日本特開2004－131431號公報【非專利文獻1】老化機制與控制，藤本大三郎編著，IPC股份有限公司，平成5年6月30日【非專利文獻2】BIO Clinica，11巻，第5號，1996年【非專利文獻3】化粧品的實用性．評估技術的進歩與未来展望，日本化粧品技術者会編，藥事日報社，2001年，共立出版社【非專利文獻4】蛋白質 核酸 酵素，第44巻，第6號，766~775頁，1999，共立出版社【非專利文獻5】老化現象學期刊(Journal of Gerontology)2000,Vol.55(5),p220－227【非專利文獻6】天然藥物事典，奧田拓男編，廣川書店，昭和61年3月3日發行【非專利文獻7】Wagner,H.等人,Arznein.Forsch,18,696,1968.
【非專利文獻8】Wagner,H.等人,Arznein.Forsch,24,466,1974.
【非專利文獻9】Tittel,G.等人,J.Chromatogr.,135,499,1977.
【非專利文獻10】Tittel,G.等人,J.Chromatogr.,153,227,1978.
【非專利文獻11】Quercia,V.等人,生化學之層析術(Chromatography in Biochemistry)，醫學與環境之研究(Medicine and Enviromental Research),Frigerio A.(Ed).,Elsevier科學出版公司,阿姆斯特丹,1983,p1.
【非專利文獻12】Nam－Cheol,Kim.等人,水飛薊賓與異水飛薊賓自乳薊之完整分離與特徵化(Complete isolation and characterization of silybins and isosilybins from milk thistle(Silybum Marianum),Org.Biomol.Chem.,2003,1,1684－1689.
【非專利文獻13】Agric Biol Chem,55 315－322,1991【非專利文獻14】Agric Biol Chem,57 546－550,1993【非專利文獻15】基礎與臨床Vol.15 No.5 1981
本發明之目的係提供可有效率地去除因暴露於紫外線等而於生體組織、特別是皮膚所產生之異常蛋白質的組成物。
本案發明人為了達成上述目的，使用種種自植物提煉之化合物及植物萃取物，促進蛋白酶體活性，尋找抑制生體內的氧化蛋白質、特別是因暴露於紫外線中所増加的氧化蛋白質之堆積的成分。其結果，在自植物提煉之化合物中取自水飛薊精華的水飛薊賓(Silybin)，以及植物萃取物的白芨(Bletilla striata)萃取物、溪蓀(Iris sanguinea)萃取物中，發現了預期的效果。再者，亦發現了將水飛薊賓與白芨萃取物或大豆皂素併用，將可得到相乘效果，促進蛋白酶體活性，去除氧化蛋白質，遂而完成了本發明。同時發現異常膠原蛋白為本發明對象的異常蛋白質之一。
本發明之要旨如下。
(1)一種異常蛋白質除去用組成物，其含有1種或2種以上選自水飛薊賓、白芨萃取物、溪蓀萃取物者。
(2)如(1)之異常蛋白質除去用組成物，其中異常蛋白質為異常膠原蛋白。
(3)一種蛋白酶體活性促進用組成物，其含有1種或2種以上選自水飛薊賓、白芨萃取物、溪蓀萃取物者。
(4)如(1)或(2)之異常蛋白質除去用組成物，或如(3)之蛋白酶體活性促進用組成物，其含有水飛薊賓及白芨萃取物。
(5)如(1)或(2)之異常蛋白質除去用組成物，或如(3)所記載之蛋白酶體活性促進用組成物，其含有水飛薊賓及大豆皂素。
(6)一種預防及/或改善皺紋、鬆弛、暗沉、斑點之組成物，其含有(1)~(5)中任一項之組成物。
(7)如(1)~(6)中任一項之組成物，其形態係呈外用劑。
(8)一種化粧品，其含有水飛薊賓與白芨萃取物及/或大豆皂素。
(9)一種食品，其含有水飛薊賓與白芨萃取物及/或大豆皂素。
(10)如(7)或(9)之組成物，其係動物用者。
藉由使用本發明之組成物，可去除或抑制異常蛋白質。由於可有效率地去除隨著增齡同時増加的異常蛋白質之異常膠原蛋白(氧化膠原蛋白等)，故可有效改善皺紋、鬆弛、暗沉等皮膚老化。此外，藉由使用本發明之組成物，可促進蛋白酶體活性。
因此，本發明之組成物，對於蛋白質分解異常所導致的疾病或者障礙(阿茲海默症、巴金森氏症、路易士體失智症、重覆序列疾病、肌萎縮性脊髓側索硬化症、白內障、動脈硬化、糖尿病性腎症、皮膚光老化、皮膚之皺紋、鬆弛、暗沉、斑點)等蛋白質分解異常產生的疾病，可有效預防或治療。除此之外，亦為有效的抗老化用化粧品及食品。
具體而言，可望有抗老化效果、皺紋抑制效果、鬆弛抑制效果、暗沉抑制效果、斑點抑制效果，紫外線傷害抑制效果。
具體的利用形態可利用為化粧品及食品等。亦可利用為寵物等動物用。
以下將詳細說明本發明。
在本發明中，所謂異常蛋白質，一般係指伴隨增齡而氧化或糖化，或經乙醛修飾(aldehyde)的蛋白質或不正常摺疊蛋白質。
水飛薊素(Silymarin；CAS No.65666－07－1)，係指由菊科水飛薊(學名Silibum Marianum Gaertn，別名大薊、大翅薊、乳薊；CAS No.84604－20－6)所抽出之黃酮木脂素類(flavonolignans)的總稱，分子式為C2 5 H2 2 O1 0 ，係含有水飛薊賓(Silybin；CAS No.22888－70－6)、水飛薊寧(Silydianin；CAS No.29782－68－1)、水飛薊亭(Silychristin；CAS No.33889－69－9)、異水飛薊賓(lsosilybin；CAS No.72581－71－6)等之組成物(非專利文獻6)。在本發明中，將含有水飛薊萃取物中所含有的此等黃酮木脂素之組成物，與既有技術一樣，稱之為水飛薊素。而水飛薊素如前所述，為黃酮木脂素之混合物，植物萃取物及植物中的水飛薊素含有量，可根據利用分光光度計測定之方法(非專利文獻7)、利用薄層層析法(lamella chromatography)之方法(非專利文獻8)、利用高速液體層析法之方法(非專利文獻9~11)加以測定。此等測定法中，尤以根據分光光度計測定的方法之一的2,4－二硝基聯胺(dinitro hydrazine)分析，經德國製藥業標準(DAB)(Silybum Marianum的果實之相關論文)報告，而廣為運用。在本發明中亦使用2,4－二硝基聯胺(dinitro hydrazine)分析法，將上述成分的混合組成物之定量換算為水飛薊素，以質量%表示。
水飛薊素自古以來在歐洲即用於預防及治療肝臟疾病。此外，亦是一種廣為人知的氧化防止劑。對皮膚具有功效的組成物，已知有例如乾癬及異位性皮膚炎治療製劑(專利文獻5)，含黃酮木脂素與磷脂質之錯合物等活性成分，對紅斑、燒傷、皮膚或粘膜的萎縮狀態、皮膚炎等之治療、皮膚的老化防止，及保護皮膚不受放射線、風、太陽等外部環境刺激，為具有功效的組成物(專利文獻6)，表皮穿透障壁強化劑(專利文獻7)，皮脂分泌抑制劑(專利文獻8)，預防、防止、改善表皮扁平化之皮膚老化防止用組成物(專利文獻9)，防止抗氧化能所導致的皮膚老化用之化粧品(專利文獻10)，促進I型膠原蛋白產生之作用，及促進彈力蛋白產生之作用(專利文獻11)等。
但目前尚未得知關於其促進蛋白酶體活性作用，進而產生的抑制異常蛋白質堆積作用。在本發明中揭露了藉由併用水飛薊素，特別是水飛薊賓與白芨萃取物或大豆皂素，較其各自單獨使用，更可獲得相乘效果，抑制、去除異常蛋白質的堆積。
將水飛薊素由水飛薊果實以高純度分離的方法，既已得知有以70~80%的純度分離之方法，即以90~96%的純度分離之方法(專利文獻12)。水飛薊素通常係以乙醇、醋酸乙酯、丙酮等由水飛薊的種實中萃取出，以噴霧乾燥法得到呈乾燥粉末狀的萃取物原料，在市面上販賣。本發明中所使用的水飛薊賓，可直接使用如上述方法所調製的市售水飛薊賓。此外，亦可使用以既有方法從水飛薊濃縮水飛薊賓之萃取物，及將其分離、精製之化合物(非專利文獻12)。此外，亦可將含有水飛薊賓之水飛薊精華等植物萃取精華或水飛薊素作為水飛薊賓使用。
大豆皂素廣泛分布於大豆種子中的種皮、子葉、胚軸(Hypocotyle)或大豆植物體的葉、莖、根等。其具有與甘草甜素(Glycyrrhizin)類似的結構，但三萜類(triterpenoid)骨架上具有2個~5個由糖形成的糖鏈。大豆皂素依照糖苷配基(aglycon；非糖部)的構造分為4群(A、B、E及DDMP四群)，所有群的皂素皆具有多種多様的糖鏈構造。至今為止已檢測出以大豆皂草精醇(Soyasapogenol)A、B、E及DDMP為配糖基之8種A群，2種E群，5種B群，6種DDMP群(非專利文獻13、14)。
至今為止，本案發明人著眼於大豆皂素的藥理作用持續進行研究，發現其具有去除異常蛋白質機能(專利文獻3及專利文獻13)、紫外線傷害預防或改善機能(專利文獻14)等。本發明中更進一步持續研究，揭露了藉由併用水飛薊素，特別是水飛薊賓與大豆皂素，較其各自單獨使用，更可獲得相乘效果，抑制異常蛋白質的堆積。
本發明中所使用的大豆皂素，可為包含前述所有大豆皂素，再者，亦可為含有較高的大豆皂素之某種特定種類者。本發明所使用的大豆皂素，可以使用乾燥粉末及乙醇、二甲基亞碸等有機溶媒溶解後之溶解物等的形狀使用。
一般而言，皂素多呈現溶血性。但經證實大豆皂素幾乎無溶血性(非專利文獻15)。另外，本案發明人測定由大豆所得之大豆皂素類對家兔2%血液懸浮液的溶血指數後，發現其值與胡蘿蔔皂素一様為100以下，在其他報告中也同樣發現並無溶血性。另外，本案發明人為了調查大豆皂素B群的安全性，對變異原性及急性毒性另行試驗的結果，發現皆無異常，確認其安全性高。
白芨(Bletilla striata)為蘭科的植物，生長在濕地及山崖上等的野生多年草。在蘭科植物中一反常例，格外容易栽培，繁殖力亦強。將白芨的根經蒸或燙過一次後加以乾燥，為中藥的白芨，作為止血、排膿、粘滑、緩和藥，可針對喀血、吐血、鼻血、切傷、火傷、腫物內外服用(非專利文獻；天然藥物事典，奧田拓男編，廣川書店，p355)。已知其具有抗氧化作用(日本特開2002－205933)、梅納反應(Maillard reaction)阻礙劑(日本特開平11－106336)、美白作用(日本專利第3233776號)。但目前卻尚未得知關於蛋白酶體活性促進作用，會產生異常蛋白質堆積抑制作用。在本發明中發現，同時使用水飛薊賓和白芨萃取物，較其各自單獨使用，在抑制異常蛋白質的堆積方面，更可獲得相乘效果，。
溪蓀(Iris sanguinea)係分布於包含日本(北海道~九州)等東亞區域的多年草，野生地大部分皆為日照良好的乾燥山野草地。其根莖含有豆豉草黃酮苷(flavoayamenin)，故除用於皮膚真菌外，亦用於消炎、腹痛、胃痛。亦已知其過氧化氫消除作用(日本特開2001－131046)。卻尚未得知關於促進蛋白酶體活性作用產生的抑制異常蛋白質堆積作用。在本發明中揭露了溪蓀萃取物具有抑制起因於促進蛋白酶體活性作用的異常蛋白質堆積作用。
本發明中，含水飛薊賓的植物體、白芨及溪蓀可使用其葉、莖、芽、花、木質部、木皮部(樹皮)等地上部分，根、塊莖等地下部分，種子、樹脂等所有部位。
本發明中之水飛薊賓及含有其之植物體、白芨、溪蓀及大豆皂素，可使用令此等本身乾燥後之乾燥物及將此等以各種溶媒溶解後之溶解物。例如可使用以水，或乙醇、甲醇等醇類，丙二醇、1,3－丁二酯等多價醇類，醚、丙酮、醋酸乙酯等有機溶媒所溶解之溶解物。
本發明中所含有之水飛薊賓植物體、白芨及溪蓀，可直接使用令其天然乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥，或發酵後者。另外，調製植物萃取物時，可使用依循一般方法進行抽出、濃縮、粉末化等處理後所得者。
目前已知堆積下來的異常蛋白質與阿茲海默症、巴金森氏症、路易士體失智症、重覆序列疾病、肌萎縮性脊髓側索硬化症、白內障、動脈硬化、糖尿病性腎症、腦中風、心肌梗塞、風濕、癌、胃潰瘍等疾病及皺紋、鬆弛、暗沉、斑點等皮膚老化症狀有關。因此，藉由攝取本發明之異常蛋白質除去用組成物，可預防或治療上述病症。特別是關於皺紋、鬆弛、暗沉、斑點等皮膚老化症狀之預防及改善效果可期，可保持肌膚年輕。
本發明之組成物，可作為有用的老化預防及老化防止用化粧品或健康食品、抗老化粧品或美容食品、氧化預防及氧化防止化粧品或健康食品。本發明之異常蛋白質除去用組成物對哺乳類動物呈現優異作用，且安全性高。
本發明之組成物可有效率地分解因暴露於紫外線中所發生的活性氧而產生之細胞內變性蛋白質(異常蛋白質)。因此，抑制了暴露於紫外線中所導致的細胞傷害。對暴露或被暴露在紫外線下的生體組織，尤其是對其皮膚，為一可預防或改善紫外線帶來的傷害之紫外線傷害預防或改善用組成物。
含有水飛薊賓或水飛薊素、白芨萃取物、溪蓀萃取物及/或大豆皂素為主要成分之本發明組成物，可製造為化粧品等皮膚外用劑、口服食品。
作為化粧品，可直接將含水飛薊賓水飛薊素(silybin silymarin)、水飛薊賓(silybin)的植物體或植物萃取物作為化粧品成分使用，或添加至小麥胚芽油或橄欖油等之中後作為化粧品成分使用，而製造出化粧品。
作為食品，可直接將水飛薊賓水飛薊素或含水飛薊賓的植物體或萃取物作為食品使用，或添加種種營養成分後作為食品使用，亦可添加至期望的食品中。例如添加澱粉、乳糖、麥芽糖、植物油脂粉末、可可脂粉末、硬脂酸等適當的助劑後，使用慣用的方法，成形為適於食用的形態，例如顆粒狀、粒狀、錠劑、膠囊、膏狀等，製成健康輔助食品、保健機能食品等。另外亦可添加至各種食品中使用，例如火腿、香腸等食肉加工食品，魚板、竹輪等水產加工食品，麵包、菓子、奶油、粉乳、發酵乳製品中，亦可添加至水、果汁、牛乳、清涼飲料等飲料中使用。
水飛薊賓或水飛薊素、白芨萃取物、溪蓀萃取物及/或大豆皂素對組成物之有效配合量，可依各成分的調製法、製劑的形態等適切選擇、決定，並未特別限制，但將水飛薊賓及/或大豆皂素用於皮膚外用劑時，理想的是令其含有0.01~2重量%。另一方面，將白芨萃取物及/或溪蓀萃取物用於皮膚外用劑時，理想的是令其含有0.1~5重量%。
將水飛薊賓及/或大豆皂素製成錠劑或飲料等作為食品使用時，理想的是令其含有0.1~10重量%。另一方面，將白芨萃取物及/或溪蓀萃取物製成錠劑或飲料等作為食品使用時，理想的是令其含有1~20重量%。
本發明中之含有水飛薊賓或水飛薊素、白芨萃取物、溪蓀萃取物及/或大豆皂素為主要成分的組成物之有效適用量，可依投與路徑、投與時間表、製劑形態等，適切決定。例如可將含有水飛薊賓、白芨萃取物、溪蓀萃取物及/或大豆皂素為主要成分的組成物，適切調節在1天0.01g~10g的範圍內，1次或分數次投藥。
作為食品，可直接、或添加種種營養成分後使用。例如可添加澱粉、乳糖、麥芽糖、植物油脂粉末、可可脂粉末、硬脂酸等適當的賦形劑後，使用慣用的方法，成形為適於食用的形態，例如顆粒狀、粒狀、錠劑、膠囊、膏狀等，製成健康輔助食品、保健機能食品等，供作食用，另外亦可添加至種種食品使用，例如火腿、香腸等食肉加工食品，魚板、竹輪等水產加工食品，麵包、菓子、奶油、粉乳、發酵乳製品中，亦可添加至水、果汁、牛乳、清涼飲料等飲料中使用。此種製劑、食品可利用一般所採用的製劑技術製造得。
作為化粧品，可直接或添加至小麥胚芽油或橄欖油等中，作為化粧品成分使用，使用此等製造化粧品。
非口服的組成物，可應用於例如水溶液、油劑、乳液、懸濁液等液劑，凝膠、霜劑等半固形劑，粉末、顆粒、膠囊、微膠囊、固形等固形劑之形態。可使用以往已周知的方法調製此等形態，製成化妝水劑、乳劑、凝膠劑、霜劑、軟膏、硬膏、濕敷藥劑、噴霧劑、栓劑、注射劑、粉末劑等種種劑型。可將此等對身體塗布、貼付、噴霧等而加以應用。特別在此等劑型中，化妝水劑、乳劑、霜劑、軟膏劑、硬膏劑、濕敷藥劑、噴霧劑等，適於用作皮膚外用劑。作為化粧品，可製成化粧水、乳液、霜劑、面膜等皮膚化粧品，彩妝基礎化妝水、彩妝乳霜、乳液狀或霜狀或軟膏型之粉底、口紅、眼彩、腮紅等彩妝化粧品，護手霜、護腿霜、身體用化妝水等身體用化粧品等。
令組成物為與増量劑混合之狀態可便於使用。増量劑可使用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等糖類，山梨醇等糖醇，糊精、環糊精(cyclo dextrin)等加工澱粉，小麥澱粉、玉米澱粉等澱粉類，酪蛋白、大豆蛋白質等蛋白質，阿拉伯膠、海藻酸鈉、酪蛋白鈉、明膠、果膠、粉末纖維素、羧甲基纖維素等高分子安定劑，磷脂、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯等乳化劑，鈣粉末等。
本發明之異常蛋白質除去用組成物，除上述水飛薊賓、白芨萃取物、溪蓀萃取物及/或大豆皂素之外，可令其含有具抗氧化作用之化合物。具有抗氧化作用的化合物，並未特別限定，有例如各種維他命類、水飛薊素等各種多酚類、生育三烯醇(Tocotrienol)、輔酶Q10及含有此等之天然成分等。
本發明之異常蛋白質除去用組成物，除上述水飛薊賓、白芨萃取物及大豆皂素之外，可令其含有具生體膠原蛋白合成促進劑之化合物。具有生體膠原蛋白合成促進作用的化合物，並未特別限定，有例如例如膠原蛋白及明膠的分解物、含有在NN末端含甘胺酸(glycine)之三聚肽(TriPeptide)的胜肽混合物等。
膠原蛋白可使用由牛或豬或魚等動物皮膚、骨頭及肌腱等結合組織所抽出者，或將膠原蛋白熱變性後之明膠等全部。膠原蛋白及/或明膠的分解物，理想的是使用含有分子量在400以下者之多肽。更理想的是，高度含有平均分子量在200~300附近者之多肽。分子量在400以下者，更理想的是高度含有平均分子量在200~300附近者之多肽，由於其胺基酸的分子量在100左右，相當於高度含有三聚肽之多肽(polypeptide)。分子量在400以下的膠原蛋白及/或明膠之分解物，可為精製者，亦可為未精製者。亦可為例如其他膠原蛋白及/或明膠的分解物等之混合物。
對此，膠原蛋白及/或明膠的分解物，含有分子量約400以下的肽作為特定有效成分，藉由其加水分解處理，可望提升在生體內之膠原蛋白合成促進活性。
本發明之異常蛋白質除去用組成物，可用作抗老化用、抗紫外線傷害用。再者，同時含有具有去除異常蛋白質作用之化合物，與具有抗氧化作用之化合物或具有促進生體膠原蛋白合成作用之化合物的組成物，具有抗老化作用，可提供具有防止異常蛋白質之堆積及去除異常蛋白質機能的抗老化用組成物。再者，對於異常蛋白質之一的異常膠原蛋白，已發現可提供具有防止堆積及去除功效之抗老化用組成物。
具有去除異常蛋白質作用之化合物，可作為化粧品使用。該化粧品具有抗皺紋用、抗鬆弛用、抗暗沉用、抗斑點用，保濕用之用途。本發明之組成物，可經口，或非經口投與，例如無溶血性者可以注射劑形態投與等。經口投與時，可以健康食品、美容食品之類的食品之形態投與。
本發明之組成物，可以例如水溶液、油劑、乳液、懸濁液等液劑、凝膠、霜劑等半固形劑，散劑、顆粒劑、錠劑、膠囊劑等固形劑的形態加以應用。可以以往既已周知的方法調製為此等形態，製成種種劑型。化妝水劑、乳劑、霜劑、軟膏劑、硬膏劑、濕敷藥劑、噴霧劑等，可適用為皮膚外用劑。
本發明之化粧品中，可含有植物油之類的油脂類、高級脂肪酸、高級醇類、矽膠、陰離子界面活性劑、陽離子界面活性劑、雙性界面活性劑、非離子界面活性劑、防腐劑、糖類、金屬離子封鎖劑、水溶性高分子之類的高分子、増稠劑、粉體成分、紫外線吸收劑、紫外線阻斷劑、玻尿酸之類的保濕劑、香料、pH調整劑等。亦可含有維他命類、皮膚賦活劑、血液循環促進劑、常在菌控制劑、活性氧消除劑、抗炎症劑、抗癌劑、美白劑、殺菌劑等其他藥效成分、生理活性成分。
作為化粧品，可製成化粧水、乳液、霜劑、面膜等皮膚化粧品，彩妝基礎化妝水、彩妝乳霜、乳液狀或霜狀或軟膏型之粉底、口紅、眼彩、腮紅等彩妝化粧品，護手霜、護腿霜、身體用化妝水等身體用化粧品等，入浴劑、毛髮化粧品等。可依照一般化粧品所使用之製劑化方法，製成此等劑型。亦可製成口紅、眼彩、腮紅等彩妝化粧品。
除此之外，亦可視用途及劑型，添加下列各類。
油脂類，例如椿油、月見草油、夏威夷堅果油、橄欖油、油菜子油、玉米油、芝麻油、荷荷葩油、胚芽油、小麥胚芽油、三辛酸甘油脂(glyceryl trioctanoate)等液體油脂，可可亞脂、椰子油、硬化椰子油、棕櫚油、棕櫚核油、木蠟、木蠟核油、硬化油、硬化蓖麻籽油等固體油脂，蜜蠟、小燭樹蠟(candelilla wax)、棉臘、米糠臘(rice bran wax)、羊毛脂、乙醯羊毛脂(acetylated lanolin)、液狀羊毛脂、甘蔗臘等臘類。
碳化氫類，例如流動石蠟、鯊烯(squalene)、鯊烷(squalane)、微晶臘(microcrystalline wax)等。
高級脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻油酸、二十二碳六烯酸(DHA，docosahexaenoic acid)、二十碳五烯酸(EPA，eicosapetaenoic acid)等。
高級醇類，例如樟醇(lauryl alcohol)、硬脂醇(又稱十八醇)(stearyl alcohol)、鯨蠟醇(cetyl alcohol)、脂肪醇(十八十六醇)(cetostearyl alcohol)等直鏈醇類、mono stearyl glycerin ether、羊毛醇(lanolin alcohol)、膽固醇、植物醇、辛基十二醇等分枝鏈醇類等。
矽，例如鏈狀聚矽氧烷(polysiloxane)的聚二甲基矽氧烷(dimethylpolysiloxane)、聚甲基苯基矽氧烷(methyl phenyl polysiloxane)等、環狀聚矽氧烷的十甲基環戊矽氧烷(decamethylcyclopentasiloxane)等。
陰離子界面活性劑，例如月桂酸鈉等脂肪酸鹽，月桂酸基硫酸鈉(Sodium Laureth Sulfate)等高級烷基硫酸酯鹽(AS)，POE十二烷基硫酸三乙醇胺(Triethanolamine lauryl sulfate)等脂肪醇醚硫酸鹽(AES)，N－醯基肌胺酸、磺基琥珀酸酯(Sulfosuccinate)、N－胺醯酸鹽等。
陽離子界面活性劑，例如十八烷基三甲基氯化銨(STEARTRIMONIUM CHLORIDE)等烷基三甲銨鹽、苯扎氯銨(Benzalkonium Chloride)、苄索氯銨(BENZETHONIUM CHLORIDE)等。
雙性界面活性劑，例如烷基甜菜鹼、醯胺甜菜鹼等甜菜鹼(betaine)系界面活性劑等。
非離子界面活性劑，例如山梨糖醇單油酸酯(Sorbitan Monooleate)等脂肪酸山梨醇酐酯類、硬化蓖麻籽油誘導體。
防腐劑，例如對羥苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥苯甲酸乙酯(ethyl paraben)等。
金屬離子封鎖劑，例如乙二胺四乙酸二鈉(disodium etbylene diamine tetraacetate)、乙二胺四乙酸、依地酸二鈉鹽(disodium edetate)等乙二胺四乙酸鹽(EDTA)。
高分子，例如阿拉伯膠、黃耆膠、半乳聚醣(galactan)、關華豆膠(Guar Gum)、角叉菜(carrageenan)、果膠、洋菜、榅桲籽(pyrus cydonia seed extract)、葡聚糖(dextran)、支鏈澱粉(pullulan)、羧甲基澱粉(carboxy methyl starch)、膠原蛋白、酪蛋白、明膠、甲基纖維素、甲基羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉(CMC)、海藻酸鈉、高分子聚合物(CARBOPOL等)等乙烯系高分子等。
増稠劑，例如角叉菜、黃耆膠(Gum Tragacanth)、榅桲籽、酪蛋白、糊精、明膠、CMC、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、高分子聚合物、關華豆膠、黃原膠(Xanthan Gum)、膨潤土等。
粉末成分，例如滑石、高嶺土、雲母、二氧化矽、沸石、聚乙烯粉末、聚苯乙烯粉末、纖維素粉末、無機白色顏料、無機紅色系顏料、雲母外覆二氧化鈦、滑石外覆二氧化鈦(Titanium oxide Coated)、著色雲母外覆二氧化鈦等珍珠顏料、紅色201號、紅色202號等有機顏料。
紫外線吸收劑，例如對胺基苯甲酸(Para－aminobenzoic Acid)、水楊酸苯酯(Phenyl salicylate)、親水性對甲氧基肉桂酸(para－methoxy cinnamic acid hydrophile)、對甲氧基肉桂酸辛酯(octyl para－metoxy cinnamate)、2,4－二羥基二苯甲酮(Dihydroxy benzophenone)等。
紫外線遮断劑，例如二氧化鈦、滑石、胭脂紅(carmin)、膨潤土、高嶺土、氧化亜鉛等。
保濕劑，例如聚乙二醇、丙二醇、二丙二醇、1,3－丁二酯、1,2－戊二醇、甘油、二甘油、聚甘油、木糖醇、麥芽糖醇、麥芽糖、山梨醇、葡萄糖、果糖、軟骨素硫酸鈉、玻尿酸鈉、乳酸鈉、吡咯烷羧酸(PCA，Pyrrolidone carboxylic acid)、環糊精等。
藥效成分，例如維他命A油、視黃醇(retinol)等維他命A類，核黃素等維他命B2 類，鹽酸吡哆辛(Pyridoxine Hydrochloride)鹽等B6 類，L－抗壞血酸、L－抗壞血酸磷酸酯(L－ascorbic acid－phosphate ester)、L－抗壞血酸單棕櫚酸酯(L－ascorbic acid－monopalmitate ester)、L－抗壞血酸二棕櫚酸酯(L－ascorbic acid－dipalmitate ester)、L－抗壞血酸－2－葡萄糖苷(L－ascorbic acid－2－glucoside)等維他命C群，泛酸鈣(calcium pantothenate)等泛酸類，維他命D2 、膽鈣化醇(Cholecalciferol)等維他命D群，α－生育醇、醋酸生育醇、菸鹼酸DL－α－生育醇等維他命E類等之維他命類。
尚有胎盤精華、麩胱氨酸、虎耳草(Saxifraga stolonifera)萃取物等美白劑，蜂王乳、山毛櫸精華等皮膚賦活劑，辣椒素、薑素(gingeron)、斑蝥酊(Cantharides Tincture)、魚石脂(Ichthammol)、咖啡因、丹寧酸、γ－谷維素(Oryzanol)等血液循環促進劑，甘草素酸誘導體、甘草亭酸誘導體、甘菊藍(azulene)等消炎劑，精胺酸(arginine)、絲胺酸(serine)、白胺酸(leucine)、色胺酸(Tryptophan)等胺基酸類，常在菌控制劑之麥芽糖蔗糖縮合物、氯化溶菌酶(lysozyme chloride)等。
此外，還有德國洋甘菊精華、荷蘭芹精華、山毛櫸精華、葡萄酒酵母精華、葡萄柚精華、金銀花精華、白米精華、葡萄精華、啤酒花精華、米糠精華、枇杷精華、黃檗精華、薏苡仁精華、當藥精華、草木樨精華、樺木精華、甘草精華、芍藥精華、皂質草精華、絲瓜精華、辣椒精華、檸檬精華、龍膽草精華、紫蘇精華、蘆薈精華、迷迭香精華、山艾茶精華、百里香精華、茶精華、海藻精華、胡瓜精華、丁香精華、胡蘿蔔精華、西洋栗樹精華、金縷梅精華、桑白皮精華等各種萃取物。
以下，將參照實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不限於此等實施例。
<藥劑之調製及試驗方法> 〔評估試驗用化合物溶液之調製〕
將大豆皂素(和光純藥)、視黃酸(全反式－視黃酸；和光純藥)，視黃醇(全反式－視黃醇；和光純藥)及水飛薊賓(Silibin；Sigma Aldrich Japan)，以生化學用試藥等級之二甲基亞碸(DMSO；和光純藥)溶解後的溶液，適量添加至培養液，處理成皮膚纖維母細胞及三次元皮膚模型。
將白芨(Bletilla striata)的根部切成細條，取其100g使用高速溶媒抽出裝置(ASE－200，日本Dionex株式會社)進行熱水萃取。將其經凍結乾燥而濃縮，得到5.2g的萃取物。加水溶解使萃取物含有量為1%。將此稱之為白芨萃取液。
將溪蓀(Iris sanguinea)的葉子部分及龍眼(Euphoria longan)的假種皮部分(龍眼肉)切細，用其各100g以高速溶媒抽出裝置(ASE－200，日本Dionex股份有限公司)進行乙醇(99.5%)萃取。將其濃縮，各得到10.5g及11.3g的萃取物。以50%的1,3丁二酯溶解，令其萃取物含有量各為1%。將此稱為溪蓀萃取液、龍眼萃取液。
〔正常人體皮膚纖維母細胞之培養〕
正常人體皮膚纖維母細胞(以下簡稱NFB)；CCD1059(購自大日本製藥)為皮膚纖維母細胞用培養基；在37℃－5%CO2 培養箱以FGM(三光純藥)進行培養。FGM係在纖維母細胞基礎培養基中添加入體纖維母細胞増殖因子(1 μ g/ml)、胰島素(5mg/ml)、慶大黴素(gentamicin)(50 μ g/ml)、兩性黴素B(50 μ g/ml)者。本試驗中使用繼代培養數為3~7代的細胞。
〔處理各藥劑後NFB培養上清液及NFB萃取物之調製〕
將NFB播種於Φ90mm的細胞培養用皿中，培養至達90%生長匯合。對添加各種藥劑之FGM更換培養基，培養24小時。丟棄培養液，以1×PBS(－)(不含鈣及鎂之磷酸緩衝生理食鹽水)洗淨NFB後，添加FGM，以10J/cm2 照射UVA(紫外線A)。UVA係使用FL20S．BL/DMR(Clinical Supply(株))，以5.55W/cm2 的紫外線強度照射30分鐘，累計照射量為10J/cm2 。紫外線強度以UVMONITOR MS－211－I(英弘精機(株)製)測定。
再次對添加了各種藥劑之FGM進行培養基更換，培養24小時。同時製作未照射UVA群的NFB，作為對照組。
處理各藥劑後之NFB的培養上清樣本，如下進行調整。回收各藥劑處理後之NFB的培養上清液，以1,200×G、5分鐘離心去除浮遊細胞後，以15,000×G、15分鐘離心去除細胞片。在水中透析後，令其凍結乾燥，以20mM Tris－HCl(pH7.5)溶解成為50倍濃縮液。將此作為培養上清樣本使用。
處理各藥劑後之NFB的細胞萃取樣本，如下進行調整。回收培養上清液後，以PBS(－)洗淨細胞，添加細胞萃取用溶液{含有0.4% Nonidet P－40之20mM Tris－HCl(pH7.5)}，在4℃下攪拌30分鐘。回收細胞萃取液，在水中透析後，令其凍結乾燥，以細胞萃取用溶液溶解成為20倍濃縮液。將此作為纖維母細胞萃取樣本使用。
〔三次元人體皮膚模型之培養〕
三次元人體皮膚模型為人體皮膚的擬似模型，廣泛運用於安全性評估及有效性評估上。三次元人體皮膚模型係使用TESTSKIN(LSE－high)(東洋紡織)。
〔處理各藥劑後之三次元人體皮膚模型萃取物之調製〕
TESTSKIN(LSE－high)的外側濾膜添加培養基，培養24小時。UVA及UVB(紫外線B)各以10J/cm2 及100mJ/cm2 處理。UVB係使用FL20S．E－30/DMR(Clinical Supply(株))以0.83W/cm2 的紫外線強度照射2分鐘，累積照射量為100mJ/cm2 。紫外線強度以UV MONITOR MS－211－I(英弘精機(株)製)測定。
另外製作未照射UVA及UVB的群之三次元人體皮膚模型，作為對照組。
其後，更換培養液，並將各藥劑添加100 μ l至試料分析環內的組織上，培養36小時。回收組織，添加組織萃取用溶液{50mM Tris－HCl(pH7.5)、0.5%(Octylphenoxy)polyethoxyethanol(Sigma－aldrich)}，以鐵氟龍(登録商標)均質機進行均質攪拌。以10,000×G、30分鐘離心去除組織片後，在4℃蒸餾水中透析一晚。之後，以凍結乾燥去除水分。添加組織萃取用溶液令其成為20倍濃縮，將此作為三次元皮膚模型萃取樣本使用。
〔羰基化蛋白質之測定〕
羰基化蛋白質為一種氧化蛋白質，乃生體內老化的指標之一。測定處理藥劑時生體內的羰基化蛋白質，可試驗出該藥劑的老化抑制作用(治療學，第32巻，第4號，58~61頁，1998年)。例如，對處理藥劑後的NFB照射紫外線，以周知的方法(中村等人，生物化學期刊(Journal of biochemistry),卷199,p768－774,1996)測定細胞內的羰基化蛋白質，可試驗出該藥劑的老化抑制作用。
在本試驗中，對於因氧化障害所產生的蛋白質羰基，以特異鍵結的2,4－二硝基苯肼(DNPH)標識出羰基化蛋白質後，以與DNPH特異鍵結之抗DNPH抗體，加以檢驗。
具體方法如下。樣本中的蛋白質使用DNPH化套組(OxiBlotT M 蛋白質氧化作用偵測套組(Protein Oxidation Detection Kit)，Chemicon國際公司)，將DNPH化蛋白質以西方轉印法檢驗出。此檢驗係使用螢光偵測組(ECL PLUS，Amersham)令PVDF膜感光，以自動顯影裝置(FPM100、FUJIFILM Medical)轉寫影像。使用密度測定儀(MOLECULAR DYNAMICS)進行圖解分析，將底片黑密度(film density)數據化。另外，將樣本中的蛋白質適切還原後進行測定。此時，添加2巰基乙醇(2－Mercaptoethanol)作為還原劑，以100℃加熱5分鐘切斷雙硫鍵。
〔I型膠原蛋白之免疫沉澱〕
使用取自處理各藥劑後之三次元人體皮膚模型萃取物之蛋白質，以周知的方法(水島等人，Jpn.J.Cancer Res.Vol,93,p652－659,2002)令I型膠原蛋白進行免疫沉澱(immunoprecipitation)。取自處理各藥劑後之三次元人體皮膚模型萃取物的蛋白質20 μ g，添加STEN緩衝液{50mM Tris－HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA，0.2% Nonidet P－40}，使全量為500 μ l，再添加I型膠原蛋白的免疫沉澱用多株抗體(Rockland)，使最後濃度為1 μ g/ml。在4℃下攪拌一日一夜、令其反應後，添加結合了抗兔免疫球蛋白G的瓊脂糖凝膠4B(ICN Pharmaceuticals.,Inc.)20 μ g，在4℃下攪拌2小時、令其反應。以STEN緩衝液洗淨免疫沉澱物3次後，添加50 μ l不含蛋白質還原劑的SDS－PAGE用樣本緩衝液，以西方轉印法測定羰基化蛋白質的量及I型膠原蛋白的量。
〔蛋白酶體活性之測定〕
以周知的方法(林等人,老化機制與發展(Mechanisms of aging and development),卷102,p55－66,1998)，使用細胞萃取樣本測定蛋白酶體活性。
具體方法如下。測定擬胰蛋白酶之蛋白酶體活性之用的基質，使用t－叔丁氧羥基－L－亮胺醯基(leucyl)－L－精胺醯基(arginyl)－L－精胺醯基－L－4－甲基－薰草素－7－胺(肽研究所)。以100mM Tris－HCl(pH8.0)調製的100 μ M基質溶液10.5 μ l中，添加含相當於10 μ g蛋白質的細胞萃取樣本，再添加細胞萃取用溶液使全量為50 μ l。在37℃下處理30分鐘後，以激發波長(Ex)380nM、吸收波長(EM)440nM測定游離的7－氨－4－甲基薰草素之螢光強度。結果於各個處理各藥劑之樣本，由3樣本之測定值，計算出平均±標準誤差。
(實施例1) 〔羰基化蛋白質沉積抑制作用之評估〕
評估20種植物萃取物之羰基化蛋白質堆積抑制作用之結果，於白芨萃取物，溪蓀萃取物觀察出顯著效果。與觀察出效果的白芨萃取物、溪蓀萃取物之結果，一併呈現龍眼萃取物之結果，作為未辨識出效果之植物萃取物的例子。將各種植物萃取液(萃取物含量為1%)以1%(萃取物最終濃度0.01%)處理為皮膚纖維母細胞，以西方轉印法(Western blotting)測量照射UVA及未照射情形下羰基化蛋白質之量。
藉由UVA照射，促進細胞內及培養上清液中的蛋白質羰基化。藉由處理白芨萃取液及溪蓀萃取液，不論是否經UVA照射，皆抑制細胞內的羰基化蛋白質(圖1及表1；還原蛋白質之結果〔於蛋白質加上2－巰基乙醇，以100℃加熱5分鐘切斷雙硫鍵〕)以及培養上清液中的羰基化蛋白質(圖2及表2；非還原蛋白質之結果〔無還原處理〕)的沉積。而表1、2中的‘底片黑密度相對值，其係表示以UV未照射下已處理水之樣本的底片黑密度(羰基化蛋白質量)為100%時的相對值。而表1係表示藉圖解分析處理將圖1結果數據化之數值者，表2~表8亦同樣是將圖2~圖8數據化。
圖1及表1細胞內之羰基化蛋白質(施予還原處理者)之結果方面，UV未照射下，相較於未處理(水處理)者，藉由以白芨萃取液處理使羰基化蛋白質量減少至5%。此外，與未處理(BG(1,3－butyleneglycol)處理)相較，藉由以溪蓀萃取物處理，使羰基化蛋白質量減少為8%。此外，藉由UV照射而生成羰基化蛋白質，而相較於UV未照射，沉積量於未處理(水處理)下增加為9倍，而於未處理(BG處理)下增加為11倍。在此藉由以白芨萃取液處理，與未處理(水處理)相較減少至22%，而藉由以溪蓀萃取液處理而與未處理(BG處理)相較減少為13%。
圖2及表2培養上清液中的羰基化蛋白質(未進行還原處理者)之結果方面，在UV未照射下，相較於未處理(水處理)，藉由以白芨萃取液處理使羰基化蛋白質量減少至5%。此外，相較於未處理(BG處理)，藉由以溪蓀萃取物處理，使羰基化蛋白質量減少為10%。此外，藉由UV照射而生成羰基化蛋白質，相較於UV未照射，沉積量於未處理(水處理)下增加為12倍，於未處理(BG處理)下增加為12倍。在此藉由以白芨萃取液處理，與UV照射未處理相較(水處理)減少為21%，而藉由以溪蓀萃取液處理，與UV照射未處理(BG處理)相較減少為27%。
UV照射雖會造成羰基化蛋白質的生成，但藉由其後添加白芨萃取液、溪蓀萃取液並加以培養，使得不論在細胞內或細胞上清液，羰基化蛋白質皆呈現減少。從而，白芨萃取物、溪蓀萃取物中應存在去除已生成的異常蛋白質之效果。另一方面，龍眼萃取物卻未能觀察出異常蛋白質之沉積抑制效果。不論對於UV照射或未照射，皆藉由使白芨萃取物、溪蓀萃取物發揮作用，使羰基化蛋白質相較於末處理者減少為約1/10~1/4一事獲得確認，因而得以承認其不僅具有抑制生成之功能，甚至有分解或去除之功能。上述情形亦於下列各實驗結果呈現同樣傾向。
此外，以白芨萃取液(萃取物含有量1%)0.1、0.5及1%(萃取物最終濃度分別為0.001、0.005及0.01%)處理三次元人體皮膚模型後，便呈濃度依存地抑制羰基化蛋白質之沉積(圖3及表3；還原蛋白質的結果，圖4及表4；非還原蛋白質的結果)。而表3、4中之底片黑密度相對值，係表示以UV未照射下未以白芨萃取液(處理濃度0%)處理的樣本之底片黑密度(羰基化蛋白質量)為100%時之相對值。
圖3及表3之還原蛋白質的結果方面，UV未照射下的羰基化蛋白質沉積量藉由以0.1%、0.5%、1.0%之白芨萃取液處理，與未處理相較，分別減少為45%、25%、10%。此外，雖然UV照射使羰基化蛋白質量增大，與未照射相比成為5.6倍(未處理)，然而藉由以0.1%、0.5%、1.0%白芨萃取液進行處理，使得與UV照射未處理相較，減少為56%、15%、3%。
於圖4及表4非還原蛋白質的結果方面，UV未照射下之羰基化蛋白質沉積量，藉由以0.1%、0.5%、1.0%之白芨萃取液進行處理，與未處理相較，分別減少為63%、37%、9%。此外，UV照射雖使羰基化蛋白質量增加，與未照射相較成為6．2倍(未處理)，但藉由以0.1%、0.5%、1.0%之白芨萃取液進行處理，與UV照射未處理相較減少為62%、14%、2%。
其次，進行水飛薊賓及維生素A類之羰基化蛋白質沉積抑制作用之評估。由於水飛薊賓於抑制表皮角質細胞之分化以及促進I型膠原蛋白之產生等方面具有與視黃酸、視黃醇等維生素A類相同的作用，故以視黃酸及視黃醇作為對照。於三次元人體皮膚模型，以不產生細胞毒性之濃度3及10 μ M的水飛薊賓進行處理後，便呈濃度依存地抑制羰基化蛋白質之沉積(圖5及表5；還原蛋白質的結果，圖6及表6；非還原蛋白質的結果)。另一方面，以不產生細胞毒性之濃度3及10 μ M的視黃酸及視黃醇進行處理時，與未處理相同，並未影響羰基化蛋白質之沉積。而表5、表6中的底片黑密度相對值，係表示以UV未照射下未進行藥劑處理之樣本的底片黑密度(羰基化蛋白質量)為100%時之相對值。
具體而言，圖5及表5還原蛋白質的結果方面，UV未照射下的羰基化蛋白質沉積量藉由以3 μ M、10 μ M之水飛薊賓進行處理，與未處理相較，分別減少為50%、10%。另一方面，即使以視黃酸3 μ M、視黃醇10 μ M進行處理，羰基化蛋白質量與未處理者幾乎無異。此外，UV照射雖使羰基化蛋白質量增加，與未照射相較成為3.4倍(未處理)，但藉由以3 μ M、10 μ M之水飛薊賓進行處理，與UV照射未處理者相較，分別減少為25%、10%。另一方面，即使以視黃酸3 μ M、視黃醇10 μ M進行處理，羰基化蛋白質量與未處理者幾乎無異。
圖6及表6非還原蛋白質的結果方面，在UV未照射下的羰基化蛋白質沉積量藉由以3 μ M、10 μ M之水飛薊賓進行處理，與未處理相比較，分別減少為55%、8%。另一方面，即使以視黃酸3 μ M、視黃醇10 μ M進行處理，羰基化蛋白質量卻與未處理幾乎無異。此外，UV照射雖使得羰基化蛋白質量增加，與未照射相較成為3.2倍(未處理)，卻藉由以3 μ M、10 μ M之水飛薊賓進行處理，與UV照射未處理相比較，分別減少為30%、9%。另一方面，即使以視黃酸3 μ M、視黃醇10 μ M進行處理，羰基化蛋白質量卻與未處理幾乎無異。
經由上述結果顯示，於三次元皮膚模型，白芨萃取物及水飛薊賓將呈濃度依存地抑制羰基化蛋白質之沉積。於是，便針對同時使用白芨萃取物與水飛薊賓是否能加乘抑制羰基化蛋白質的沉積進行評估。此外，關於已知具備抑制羰基化蛋白質沉積之作用的大豆皂素，亦針對與水飛薊賓同時使用是否能加乘抑制羰基化蛋白質的沉積進行評估。結果，在三次元皮膚模型之羰基化蛋白質沉積方面，不論有無UV照射，與單獨以水飛薊賓(3 μ M)、白芨萃取液(0.1%；萃取物最終濃度為0.001%)、大豆皂素(0.0005%)分別進行處理相比較，同時使用水飛薊賓(3 μ M)及白芨萃取液(0.1%；萃取物最終濃度為0.001%)或同時使用水飛薊賓(3 μ M)與大豆皂素(0.0005%)較能加乘抑制羰基化蛋白質之沉積(圖7及表7；非還原蛋白質的結果)。而表7中的底片黑密度相對值，係表式以UV未照射下未進行藥劑處理之樣品黑化度(羰基化蛋白質量)為100%時之相對值。此外，圖7中各藥劑份量與表7相同。
具體而言，圖7及表7非還原蛋白質的結果方面，在UV未照射下的羰基化蛋白質沉積量藉由以水飛薊賓3 μ M、白芨萃取液0.1%、大豆皂素0.0005%進行處理，與未處理者相較，分別減少為60%、75%、72%。再者，藉由同時使用水飛薊賓3 μ M與白芨萃取液0.1%，羰基化蛋白質量降低為10%。此外，藉由同時使用水飛薊賓3 μ M與大豆皂素0.0005%，羰基化蛋白質量降低為11%。上述皆為加乘效果。
UV照射使羰基化蛋白質量增加，與未照射相較呈現5倍(未處理)，藉由以水飛薊賓3 μ M、白芨萃取液0.1%、大豆皂素0.0005%進行處理，與UV照射未處理相較，分別減少為60%、70%、73%。再者，藉由同時使用水飛薊賓3 μ M與白芨萃取液0.1%，羰基化蛋白質量與UV照射未處理相較減少為10%。此外，藉由同時使用水飛薊賓3 μ M與大豆皂素0.0005%，羰基化蛋白質量與UV照射未處理相較減少為11%。上述皆為加乘效果。
圖7及表7結果顯示，藉由同時使用水飛薊賓及白芨萃取物或水飛薊賓及大豆皂素，將加乘抑制羰基化蛋白質。再者，為確認是否能夠去除伴隨老化而沉積，係造成皺紋、鬆弛、暗沉等皮膚老化原因的氧化膠原蛋白，藉由同時使用水飛薊賓及白芨萃取物或水飛薊賓及大豆皂素，檢驗I型膠原蛋白之羰基化能否獲得抑制。將包含在三次元皮膚模型萃取物之蛋白質利用I型膠原蛋白之抗體進行免疫沉澱，並藉由西方轉印法檢驗出羰基化膠原蛋白。
圖8上圖，係於I型膠原蛋白抗體之免疫沉澱(IP)後，藉由使用DNP抗體之西方轉印法(WB)檢驗出羰基化膠原蛋白之結果。圖8下圖，係於I型膠原蛋白抗體之免疫沉澱(IP)後，藉由使用I型膠原蛋白抗體之西方轉印法(WB)而檢驗出被免疫沉澱之I型膠原蛋白的結果。被免疫沉澱之I型膠原蛋白量並未因各種藥劑處理及紫外線照射有差異，而是相同的。因此，圖8上圖檢驗出的羰基化膠原蛋白量並非依賴膠原蛋白量，而是依賴膠原蛋白的羰基化度。
在三次元皮膚模型之羰基化膠原蛋白沉積方面，不論有無UV照射，與單獨以水飛薊賓(3 μ M)、白芨萃取液(0.1%；萃取物最終濃度為0.001%)、大豆皂素(0.0005%)個別處理時相較，同使使用水飛薊賓(3 μ M)與白芨萃取液(0.1%；萃取物最終濃度為0.001%)或同時使用水飛薊賓(3 μ M)與大豆皂素(0.0005%)時較能加乘抑制羰基化膠原蛋白的沉積(圖8及表8；非還原蛋白質的結果)。而表8中底片黑密度相對值係表示以UV未照射下未進行藥劑處理之樣本的底片黑密度(羰基化膠原蛋白量)為100%時的相對值。此外，圖8中各藥劑份量與表8相同。
具體而言，圖8及表8非還原蛋白質的結果方面，UV未照射下的羰基化膠原蛋白沉積量藉由進行水飛薊賓3 μ M、白芨萃取液0.1%、大豆皂素0.0005%處理，而與未處理相較，分別減少為72%、83%、78%。再者，藉由同時使用水飛薊賓3 μ M與白芨萃取液0.1%，使得羰基化膠原蛋白量減少為12%。此外，藉由同時使用水飛薊賓3 μ M與大豆皂素0.0005%，使得羰基化膠原蛋白量減少為15%。上述皆為加乘效果。UV照射使得羰基化膠原蛋白量增加，與未照射相比呈現6倍(未處理)，並藉由以水飛薊賓3 μ M、白芨萃取液0.1%、大豆皂素0.0005%進行處理，使得與UV照射未處理相比，分別減少為72%、80%、75%。再者，藉由同時使用水飛薊賓3 μ M與白芨萃取液0.1%，使得羰基化蛋白質量與UV照射未處理相比減少為13%。此外，藉由同時使用水飛薊賓3 μ M與大豆皂素0.0005%，使得羰基化蛋白質量與UV照射未處理相比減少為15%。上述皆為加乘效果。
(實施例2) 〔蛋白酶體活性促進作用之評估〕
針對白芨萃取物、溪蓀萃取物、龍眼萃取物之蛋白酶體活性促進作用進行評估。將各種植物萃取液(萃取物含量1%)以1%(萃取物最終濃度0.01%)於皮膚纖維母細胞進行處理，依照前述方式檢測照射或未照射UVA時的蛋白酶體活性。經由UVA照射後之蛋白酶體活性較未照射者降低約20%。藉由進行白芨萃取液及溪蓀萃取液處理，不論是否經UVA照射，皆觀察到蛋白酶體活性獲得促進(圖9)。
具體而言，蛋白酶體活性於未照射UVA下，與未處理(水處理)相較，藉由以白芨萃取液處理而增加為163%。此外，未處理(BG處理)及經過溪蓀萃取液處理之蛋白酶體活性相對值分別為127%、185%，相較於未處理(BG處理)，經溪蓀萃取物處理之蛋白酶體活性增加為146%。另一方面，若以龍眼萃取液進行處理(蛋白酶體活性相對值104%)，與未處理(BG處理)相較，蛋白酶體活性降低為82%。
UVA照射將使蛋白酶體活性降低。未處理下(水)將降低為80%，未處理(BG)下則是降低為97%。UVA照射方面，藉由以白芨萃取液進行處理，蛋白酶體活性之相對值增加為129%。若與UVA照射未處理(水處理)(80%)相比較，便是161%的增加。此外，於UVA照射下藉由以溪蓀萃取液進行處理，蛋白酶體活性的相對值增加為167%。此與UVA照射未處理(BG處理)(97%)相較，便是172%的增加。另一方面，即使以龍眼萃取液進行處理，蛋白酶體活性仍幾乎無增加。
此外，以白芨萃取液(萃取物含有量1%)0.1、0.5及1%(萃取物最終濃度分別為0.001，0.005及0.01%)於三次元人體皮膚模型進行處理，便呈濃度依存地促進蛋白酶體活性(圖10)。
具體而言，蛋白酶體活性於UVA未照射下，與未處理(水處理)相較，經由以白芨萃取液0.1%、0.5%、1.0%進行處理，使得分別增加為115%、145%、185%。
照射UVA使蛋白酶體的活性降低。於未處理(水)下降低為75%。於UVA照射下，藉由以白芨萃取液0.1%、0.5%、1.0%進行處理，各自呈現95%、112%、135%。然而，這在UVA照射方面，與降低成75%之未處理(水處理)相較，則相當於分別增加127%、149%、180%。
其次，針對水飛薊賓及維生素A類的蛋白酶體活性促進作用進行評估。由於水飛薊賓於抑制表皮角質細胞分化、促進I型膠原蛋白產生等方面，與視黃酸、視黃醇等維生素A類具有相同作用，因此將視黃酸及視黃醇作為對照。於三次元人體皮膚模型，以不產生細胞毒性之水飛薊賓濃度3及10 μ M進行處理，便呈濃度依存地促進蛋白酶體活性(圖11)。另一方面，以不產生細胞毒性之視黃酸及視黃醇濃度3及10 μ M進行處理時，與未處理相同，並未對蛋白酶體活性產生影響。
具體而言，UV未照射下的蛋白酶體活性經水飛薊賓3 μ M、10 μ M處理後，與未處理相較，分別增加為145%、178%。另一方面，即使以視黃酸3 μ M、視黃醇10 μ M進行處理，蛋白酶體活性與未處理幾乎無異。此外，UV照射雖使得蛋白酶體活性降低，與未照射相較降低為75%，但即使經UV照射，藉由以3 μ M、10 μ M的水飛薊賓進行處理，蛋白酶體活性的相對值便增加為105%、128%。與UV照射未處理(75%)相較，相當於各自增加140%、170%。另一方面，即使以視黃酸3 μ M、視黃醇10 μ M進行處理，蛋白酶體活性仍與未處理幾乎無異。
根據上述結果得知，於三次元皮膚模型，白芨萃取物及水飛薊賓將呈濃度依賴性地促進蛋白酶體活性。於是，針對同時使用白芨萃取物與水飛薊賓時是否能加乘促進蛋白酶體活性進行評估。此外，亦針對已知具有促進蛋白酶體活性作用之大豆皂素，評估是否將藉由與水飛薊賓同時使用而加乘促進蛋白酶體之活性。結果，於促進三次元皮膚模型之蛋白酶體活性方面，不論有無經過UV照射，與單獨以水飛薊賓(3 μ M)、白芨萃取液(0.1%；萃取物最終濃度為0.001%)、大豆皂素(0.0005%)個別處理之情形相較，同時使用水飛薊賓(3 μ M)與白芨萃取液(0.1%；萃取物最終濃度為0.001%)以及同時使用水飛薊賓(3 μ M)與大豆皂素(0.0005%)時較能加乘促進蛋白酶體之活性(圖12)。
具體而言，UV未照射下的蛋白酶體活性藉由以水飛薊賓3 μ M、白芨萃取液0.1%、大豆皂素0.0005%進行處理，與未處理相較分別增加125%、121%、123%。再者，藉由以水飛薊賓3 μ M、白芨萃取液0.1%一併進行處理，蛋白酶體活性增加為198%。此外，藉由以水飛薊賓3 μ M、大豆皂素0.0005%一併進行處理，蛋白酶體活性增加為205%。上述皆為加乘效果。
UV照射使蛋白酶體的活性降低，與未照射相較成為73%(未處理)。藉由以水飛薊賓3 μ M、白芨萃取液0.1%、大豆皂素0.0005%進行處理，蛋白酶體活性的相對值將呈現88%、85%、86%，與UV照射未處理(73%)相較，係相當於分別增加121%、116%、118%。再者，藉由以水飛薊賓3 μ M、白芨萃取液0.1%一併進行處理，使得蛋白酶體活性的相對值呈現132%。此與UV照射未處理(73%)相較，相當於181%的增加。此外，藉由以水飛薊賓3 μ M、大豆皂素0.0005%一同進行處理，蛋白酶體活性的相對值成為136%。此與UV照射未處理(73%)相較，係相當於增加186%。上述皆為加乘效果。
配方例1〔膠囊劑〕
為合上述成分，並填入混合明膠與甘油的膠囊基劑中，成為軟膠囊。
配方例2〔膠囊劑〕
為合上述成分，並填入混合明膠與甘油的膠囊基劑中，成為軟膠囊。
配方例3 〔錠劑〕
混合上述成分並打錠成為錠劑。
配方例4 〔果汁〕
配方例5 〔霜劑〕
將上述成分(1)~(12)加熱溶解為80℃使之成為油相。將成分(13)~(15)加熱溶解為70℃使之成為水相。將水相緩慢加入油相中使之乳化，攪拌並使之冷卻至40℃，再攪拌冷卻至30℃成為霜劑。
配方例6 〔霜劑〕
將上述成分(1)~(12)加熱溶解為80℃使之成為油相。將成分(13)~(15)加熱溶解為70℃使之成為水相。將水相緩慢加入油相中使之乳化，攪拌並使之冷卻至40℃，再攪拌冷卻至30℃成為霜劑。
圖1係各種植物萃取物之UV照射或非照射時之皮膚纖維母細胞上之羰基化蛋白質堆積抑制作用，在還原條件下以西方轉印法檢測出之圖。
圖2係各種植物萃取物之UV照射或非照射時之皮膚纖維母細胞上之羰基化蛋白質堆積抑制作用，在非還原條件下以西方轉印法檢測出之圖。
圖3係白芨萃取物之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之羰基化蛋白質堆積抑制作用，在還原條件下以西方轉印法檢測出之圖。
圖4係白芨萃取物之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之羰基化蛋白質堆積抑制作用，在非還原條件下以西方轉印法檢測出之圖。
圖5係水飛薊賓，視黃酸及視黃醇之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之羰基化蛋白質堆積抑制作用，在還原條件下以西方轉印法檢測出之圖。
圖6係水飛薊賓，視黃酸及視黃醇之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之羰基化蛋白質堆積抑制作用，在非還原條件下以西方轉印法檢測出之圖。
圖7係水飛薊賓，白芨萃取物及大豆皂素之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之羰基化蛋白質堆積抑制作用，在非還原條件下以西方轉印法檢測出之圖。
圖8係水飛薊賓，白芨萃取物及大豆皂素之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之羰基化膠原蛋白堆積抑制作用，在非還原條件下以西方轉印法檢測出之圖。
圖9係顯示各種植物萃取物之UV照射或非照射時之皮膚纖維母細胞上之蛋白酶體活性促進作用之圖。
圖10係顯示白芨萃取物之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之蛋白酶體活性促進作用之圖。
圖11係顯示水飛薊賓、視黃酸及視黃醇之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之蛋白酶體活性促進作用之圖。
圖12係顯示水飛薊賓、白芨萃取物及大豆皂素之UV照射或非照射時之三次元人體皮膚模型上之蛋白酶體活性促進作用之圖。

Claims (8)

  1. 一種異常蛋白質除去用組成物，其含有水飛薊賓、與白芨萃取物及/或大豆皂素。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之異常蛋白質除去用組成物，其中該異常蛋白質為異常膠原蛋白。
  3. 一種蛋白酶體活性促進用組成物，其含有水飛薊賓、與白芨萃取物及/或大豆皂素。
  4. 一種用於預防及/或改善皺紋、鬆弛、暗沉、斑點之組成物，其含有申請專利範圍第1或3項所述之組成物。
  5. 如申請專利範圍第1或3項所述之組成物，其形態係呈外用劑。
  6. 一種化粧品，其特徵為含有水飛薊賓、與白芨萃取物及/或大豆皂素。
  7. 一種食品，其特徵為含有水飛薊賓、與白芨萃取物及/或大豆皂素。
  8. 如申請專利範圍第4或第6項所述之組成物，其係動物用者。
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