TW528598B

TW528598B - Mixtures which can be isolated from Eugenia Jambolana Lamarck seeds, their preparation and their use as medicaments

Info

Publication number: TW528598B
Application number: TW086101379A
Authority: TW
Inventors: Ratsimamanga Albert Rakoto; Ratsimamanga Suzanne Rakoto; Philippe Rasoanaivo; Jean Leboul; Jean Provost
Original assignee: Inst Malgache De Rech S Appliq; Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1996-02-06
Filing date: 1997-02-05
Publication date: 2003-04-21
Also published as: DK0879058T3; DE69705108T2; US20020051828A1; CN1148178C; AR005726A1; NO318694B1; YU4197A; HU227958B1; GR3036007T3; US5972342A; ES2158496T3; CN1325685A; AU1727197A; NO983592L; PL186798B1; CN1210469A; AU726628B2; MA24077A1; BG102673A; RS49527B

Description

五經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528598 Λ7 B7 、發明説明（i ) 本發明係關於由烏墨蒲祧種子（桃金娘科）分離之混合物，包含此等混合物或其某些組份之醫藥品，此等混合物及组份製備抗糖尿病醫藥品之用途及其製備。甴烏墨蒲桃種子或樹皮製備之植物萃取物含有多酚及固醇混合複合物係描述於專利FR 2,465,484。甴烏墨蒲桃種子分離之新混合物，且其不含多系、及固醇複合物，及此等混合物之某些組份具有降血糖性質，現已被發現。此等混合物之特性爲其不具多驗及固醇衍生物且可分離自研磨烏墨蒲祧種子，以低碳脂肪醇經加熱浸款粉末，過 ;慮，回收不再合有多酚及固醇化合物之不可溶部份，以銨溶液處理不可溶部份，以低碳脂肪醇經加熱處理銨混合物，過遽，回收不可溶物質及乾燥此構成混合软I之不可溶物質，接著選擇性以水/低碳脂肪醇溶液處理混合物· 過濾，部份濃縮過濾物，於非極性吸收性樹脂上绝化，部份濃縮，離心，超過遽，離心及分離混合物II。此處所指之低碳脂肪醇典型上具有多至4個碳原子。自混合物II亦可分離出草胺酸鈉及下式之化合物：

OH 0H

其中I代表氫原子及R2代表下式之鏈：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公慶) (請先閱讀背面之注意事項再填窍本頁)

528598 Λ7 B7 經濟部中央標準局S工消费合作杜印11 五、發明説明（2 -CH2-CHOH-CHOH-CH2OH (A) -CHOH-CHOH-CH〇H-CH2〇H (B) 或R!代表式（a)之鏈及R2代表氫原子3 草胺酸鈉已被 TOUSSAINT，Ann·，120, 237 (1861)描述。式（I)之化合物已被描述於KUHN等人，Ann.，644, 122-127 (1961) : TSUCHIDA等人，Agr. Biol Chem.，39 (5)，1143-1148 (1975) : TSUCHIDA等人，Agr. Biol· Chem., 40 (5)，921-925 (1976) : TSUCHIDA 等人，Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi， 37，154-161 (1990)及 AVALOS等人，tetrahedron，49, 2655-2675 i 1093) 衣發明亦關於由乾燥及細研之烏墨蒲桃種子製備混合物 [之方法。將粉末過篩，典型上藉移除直徑大於0.5 μηι之粒子。較洼粉末係經具有0.5 μιη直徑孔洞之標準篩之助而篩選。過篩之粉末經下列處理： a -浸軟，伴隨攪:拌，在低碳脂肪醇中，於溫度40及70 C 間， b -於眞空下過濾及回收不可溶物質， c -以低碳脂肪醇在溫度40及7(TC間浸軟，伴隨攪拌，不可溶物質， d -於眞空下過濾及移除含有主要是不要之多酚及固醇之醇才9 ， e -於按溶液中在溫度1〇及3〇°C間收緊不可溶物質’ f-於水/低碳脂肪醇溶液，在40及70°C之溫度時’收緊整 ml nn- —HI— vm— ln>— faml 1— Hals I— (請先閱讀背面之注意事項再填_寫本頁') 訂---- έ 528598 Λ7 Β7 五、發明説明（3 ) 個濕的銨塊， g -過;慮及移除醇溶液， h -以低碳脂防醇洗不可溶物質，過濾及移除醇溶液， i -回收不可溶物質及乾燥。於步躁a ’其步驟通常係以2至10升低碳脂昉醇如甲醇或乙醇每公斤過篩粉末來進行。較佳地，於6〇，c使闬5升具有滴定度93-95。Gay Lussac之乙醇經1小時。步驟b之過濾較佳係在4〇 kPa之眞空下進行。於步骤c ’其步驟通常係以2至1〇升低碳脂肪醇如甲醇或乙醇每公斤起始過篩粉末來進行。較佳地，於6〇T溫度下 ί赶用4升具有滴定度93-95。Gay Lussac之乙醇經1小時。步驟d之過濾較佳係在40 kPa之眞空下進行〕於步驟e，每公斤起始過篩粉末通常使用了咒至丨250 ml銨 ;各液°按;谷液典型上爲按或按鹽之水溶液3較佳地，其每 1000 ml含有350 ml 28%氫氧化按，溶液之其它部份典型上爲蒸餾水。特別適合使用1升之銨溶液及進行步驟1〇至3〇小時，且較佳地，20小時，於溫度接近20°C時。經濟部中央標準局員工消费合作社印製於步躁f ’得自1公斤起始過篩粉末之濕的按塊通常經擾掉’在2至1 〇升之低後脂肪醇-水混合物（甲每或乙醇，例如）（70/30至80/20體積比）收緊，且較佳地，在5升之乙醇_ 水混合物（75/25體積比）中，於60°C，經1小時。於步骤g，過濾較佳係在棉布上及於約80 kPa之眞空下進行0 於步驟h，洗if条通常以5 00至15 00 ml低竣脂肪醇（甲醇咬 528598 Λ7 B7 五、發明説明（4 ) 乙醇，例如）每公斤之起始過篩粉末進行’及权佳係以1升之乙醇，而過濾係於棉布上在約80 kPa之眞空下進行。於步驟i，乾燥較佳係在開放空間及避光下進行。本發明亦關於製備混合物II之方法3 使上述所得之混合物I經下列處理： •i -以水/低碳脂肪醇溶液處理混合物I， k -輕輕儀；出及接著一方面，吸出頂相，其經過濾而得到過 ;::1物1，及另一方面，以水處理底相及過濾以得到過濾物 2，集合過濾物1及2及濃縮成水相， 1 -以非極性吸收性樹脂處理及接著過濾， η卜濃縮過濾物，過濾及接著超過濾， η ·'冷；東乾燥及分離萃取物π。於步骤j，通常使用10至25升水/低碳脂肪醇溶液（例如甲醇或乙醇）（95/5至90/10體積比）每公斤混合物I。較佳在18 升之水-乙醇溶液（17·7_〇 93體積比）中進行此步驟。經濟部中央蜾準局只工消费合作社印製於步驟k ’較佳於棉布上過濾頂相。每公斤混合物I加入 10至25升水至底相係相益的，特別是1〇升，且於多孔玻璃上過;慮。於步驟k，濃縮通常在熱虹吸管濃縮器中於35。〇之溫度在0.4 kPa之眞空下進行。於步骤1 ’較佳使用S861樹脂或灿⑽及Hass標誌之XAD-型樹脂及混合物係於多孔玻璃上過遽。於步驟m，濃縮通常在熱虹吸管濃縮器中於35。〇之溫度在0.4 kPal眞2下進行。在1〇 kd，3 kd及i kd筒中進行3個 528598 五、發明説明（5 ) 連續超過濾亦是有益的。本發明亦關於製備草胺酸鈉及式⑴化合物之方法。該方法包含使混合物π經下列處理：〇 -使混合物Π於矽藻土柱中經色層分離，回收含有4種產物之館分及收集此等鶴份成單一餘分， P -使先前所得之餾分經色層分離，較佳於Sephadex®柱中，以得到草胺酸鈉，式（I)之化合物其中Ri代表氫原子及及2代表殘基（B)，與式（I)之化合物其中心代表氫原子及R2代表殘基（A)及式（I)化合物其中1^代表殘基（八）及R2代表氫原子之昆合物， q -選擇性地，使式（I)之化合物其中代表氫原子及R2代表殘基（A)，與式（I)之化合物其中:^代表殘基(；八）及R2代表氫原子之混合物經HPLC色層分離。步驟〇之色層分離係藉有機溶劑如庚烷，乙酸乙酯或低碳脂肪醇進行。較佳地，使用Pr〇lab〇標誌之CHEM ELUT® 柱，以水飽和及接著順序以庚烷，庚烷-乙酸乙酯混合物 (50/50體積比），乙酸乙酯，乙酸乙酯-正丁醇混合物

經濟部中夬標準局Κ工消资合作红U (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (95/5 ; 90/10 ; 80/20 ; 50/50 ; 20/80)，正丁醇，及正丁醇-水混合物（98/2及接著95/5體積比）連續洗提。步驟p之色層分離較佳係以水-乙醇混合物（50/50體積比）進行。步驟q之色層分離通常係在AIT標誌之YMC 180DS-AQ柱上進行，含有0· 1%甲醇混合物之水作爲洗提液。含有混合物I或II或草胺酸鈉或式（I)之一或多種化合物之疋度边用中S3家樣这i C\s ) Λ41格（2:0 U97公货） 528598 A/ B; 五、發明説明（醫藥品通常形成本發明之一部份。本發明亦關於混合物，草胺酸納及式⑴之化合物或此等之混合物之用③，與治療或預防糖尿病及糖尿病併發症之醫藥品之製備。下列實例例示本發明。實例1 :混合物I之製備於開放空間中避光乾燥烏墨蒲桃種子，及接著細研磨如此所得之粉末以篩孔0.5 μηΊ之篩過篩。浸潰〗公斤之過篩粉末，經機械攪拌，在5升具滴定度93-95。Qay L^ssac之乙醇中，於6〇r經1小時。於眞空過濾後，不可溶物質於相同條件下進一步以4升具同樣滴定度之乙醇於6〇 ' 理另1小時。含有主要是不要的多g分及固醇複合物之兩個乙醇萃取物被移除。在完全過遽後，不可溶物質被於 1升銨溶液（28% NHUOH 350 ml及充分量之蒸餾水以得到：[ 升溶液）中被收緊，而留下混合物在溫度近20Ό時接觸約 20小時。使濕的銨塊再次浸潰於5升滴定度93至95。Gay Lussac之乙醇-水混合物中（75/25體積比），伴隨機械攪拌，於60°C經1小時。過濾不可溶物質及以1升具同樣滴定度之乙醇洗；移除過濾物及洗液。最終之不可溶物質在開放空間中避光乾燥。因此得到之混合物I呈粉末型式其不含多反固醇衍生物。來自磨粉及過篩種子之產量爲80°/〇實例2 -混合物II之製備將1公斤得自實例1之混合物I，在含有17.7升水及0.93升之溶液中，搜掉3小時。傾析過液後，一方面，慢慢 -9- 家標这：C、:S : G規洛（：丨0:>(29，公釐} 一 " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁-) -裝· 經濟部，f央褚洚扃只；消贫合作社印¾

52859〇 A: 經濟部中央標準局Η工消f合作社釦¾ 五、發明説明（倒出頂相（13.5升）及接著於棉布上在7升過濾液（Sch〇n)中過 ;慮以彳寸到過;慮物1 ( 13.5升）及，另一方面，將底相以2〇公升水攪拌1小時，於3號多孔玻璃上過濾以得到過濾物2 (24升）。過濾物1及2經收集及接著在熱虹吸管濃縮器 (Schott)於35°C在0.4 kPa眞空下濃縮成水相（33.5升）。將濃縮物以2.5升S861樹脂（Rhom及Haas)攪拌1小時及接著於3號多孔玻璃上過濾。過濾物於熱虹吸管濃縮器（Sch〇tt)在351 於0.4 kPa眞2下濃縮成5.5升。濃縮物於柱狀離心機（離心刀 62000 g)離心及於 0.22 μηι過遽（Gelman suporcap 100型）冢上過滹。在10 kd，3 kd及1 kd筒之3個連續超過濾及冷陳乾燥後，獲得25 g混合物II，呈暗棕色吸濕性粉末型式。實例3 -得自混合物II之組份將在1.1 ml毫Q-經過濾水溶液中之得自實例2的525 mg混合物 n^^PROLABO標註、之 CHEMELUT® 柱，50(：111高及具1〇11 直徑，以毫Q-過濾水飽和者上色層分離。洗提之進行係以庚坑使用乙酸乙酯梯度及接著正丁醇，正丁醇/鹽酸及水飽分1:庚fe ;飽分2 :庚規/乙酸乙g旨（50/50體積比）；擬份3-4 ··乙酸乙酯；餾分5-6 :乙酸乙酯/正丁醇（95/5體積比），餾分7-8 :乙酸乙酯/正丁醇（90/10體積比），餾分9-10 :乙酸乙酯/正丁醇（ 80/20體積比）；餘分U-12 :乙酸乙酯/正丁醇（ 50/50體積比）；餾分13-14 :乙酸乙酯/正丁醇 ( 20/80體積比），餾分15-16 ··正丁醇，餾分17-18 ··正丁醇/ 水（98/2體積比），餾分19-21 :正丁醇/水（95/5體積比）。收集50 mils份。聯合飽分19至21及在降壓下濃縮至乾燥。因 -10-

•SS家標卒（CNS ---^---；----裝-----=--1T' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本百；-) 破，· 528598

經濟部中央標準局ΗΧ消费合作；、發明説明（s ) 此所得之108 mg^分其在Pharmacia標誌'之Sephadex@ LH20柱 (高100 cm ’直fe 1 cm)色層分離，以乙醇-水混合物（50/50 體積比）產生。洗提係以相同洗提混合物進行。收集1 鶴分。卜聯合餾份88至91及濃縮至乾燥。獲得14.4 mg產物，此產物得到，經自0.5 ml乙醇結晶後，2 mg之2.5-二-(四羥基丁基）p比17秦，呈白色結晶形式，其性質如下。 -旋光度[a]2。（Na 589) = -137。± 2.0 (二甲基亞颯：c = 0.5)， -紅外線光譜產生於Nicolet 60SX-R裝置在KBr溶液中，主要特性吸收帶：3281 cm·1 (ν bound〇Η基包含Η2〇），2972 + 2940 + 2901 + 2880 cm-1 基之 v CH)，2733 cm"1 (v bound OH基），163 5 cm·1 (〇H基之變形，包含 H2〇），1491 cm·1 ( v口比σ秦核之C=C及C=N) ， 1449 cm·1 ( v 口比嗜核+〇H基之變形之 C=C及 C=N)，1413 cm·1 (OH基之變形），1343 cm·1 ( v 吡嗪核之 C=C 及 C=N)，1309+1290+1251+1215+1181+1161+1123 cm-1 (CH基之變形），1092 cm·1 (v二級醇之 CO)，1048+1035 cm·1 (v初級醇 + 说 σ秦核之 CO)，947+899+854 cm-1 (二級醇），877 crrf1 ( vp比σ秦核之CH)，727 cnT1 ( p比喚核+ OH基之變形）， 639 cnT1 (吡嗪核），607+531 cm·1寬帶（OH基之變形）， 451+411 cm·1 (说 17秦核）， -質譜在FINMIGAN TSQ46裝置上進行，質量離子化型式 M/z=321 (MH)+，

-1HNMR光譜（ 600 MHz，DMSO，ppm之化學移動）：3·40及 3.61 (2 mts，2H各別：CH2於位置 4’，4") : 3.58 (2 mts，2H • 11 - :卜家標达：c、:s (請先聞讀背面之注意事項再填寫大二艮) -裝· 528598 Λ*： B' 經濟部中央標率局只工消费合作社印釔發明説明（各別：CH在位置 2,，2，，，3,，3，，）； 4.36 (寬 t, 2H : OH在位置 4’，4") ; 4.40 (d，J=7.2 Hz, 2H : OH在位置 2,，2") : 4.63 (d, J=4.8 Hz，2H : OH在位置 3,，3") ; 4·95 (dd, J=6.0 及 0.6 Hz， 2H : CH在位置 1·，1") ; 5.30 ( d，J=6.0 Hz，2H : OH在位置 Γ， 1") : 8.61 ( s，2H，CH在位置 3 及 6 )， -紫外線光譜：λ最 < =275 nm (6=8260) : 206 nm (€ = 10220) (c=19 mg/ml 水），<= 276 nm (6=7960) : 206 nm (€=9920) (c二 19 mg/ml ; HC1 0·1Ν) ，λ最大= 275 nm (e = 7690) ; (c=19 mg/ml : K〇H 0.1N)， -HPLC 在 AIT標誌之 Y.M.C. 180DS-AQ 柱 150 x 4.6 mm (批次 AIT/DE940377)，平衡洗提液H2O+0.1%甲酸，具流速1 ml/min，於270 nm UV檢查，保留時間：2分32秒。 2 -聯合餾份92及93及濃縮至乾燥。獲得9 mg餾份，此餾份具有，經結晶自0.5 ml乙醇，1.2 mg之草胺酸鈉，具有 TOUSSAINT，Ann.，120, 237 (1861)所描述之相同性質。 3 -聯合餾份94至97及濃縮至乾燥。獲得25,9 mg餾份，此餾份具有，經結晶自0.5 ml乙醇，6.2 mg之2-(四經基丁基）-5-( 2，，3，,4，-三羥基丁基）吡嗪及2-(四羥基丁基）-6-( 2·,3，，4·-三經基丁基）17比咬之混合物’其進一步被HPLC於1 50x4.6 mm 之 Y.M.C. 180DS-AQ柱（批次 AIT/DE940377):平衡洗提液 H2O+0.1%甲酸，具流速 1 ml/min，於 270 nm UV檢查 3 因此獲得5.2 mg之2-(四經基丁基）三經基丁基）吡嗪，其具有下列性質： -旋光度[a]20 (Na 589)二-116。士口（二甲基亞颯·’ c = 〇·5)， -12- 二乂度中S3家標筚（) ( 210x297公沒 n In in In m —士^ (請先閲讀背面之注意事項再4,寫本頁') 經涛部t央標準局Η工消贽合作、社印釔 528598 A7 B7 五、發明説明（10) -紅外線光譜產生於Nicolet 60SX-R裝置在KBr溶液中，主要特性吸收帶在：3398 cm·1 ( v bound 0H基包含H2〇），2951 + 2922 + 2891 cm·1 ( v CH〇H 基包含 CH)， 2761 cm*1 (v bound 〇11基），1636 cnT1 ( OH基之變形，包括 H20)，1483 + 1463 cm· 1 ( v吡嗪核之C=C及C=N)，1411 cm·1 ( OH基之變形）， 1367+1328+1270+1227+1 191 cm] (CH基之變形），1071 cm] (v 二級醇之CO)，1041 cm·1 (V初級醇+ 秦核之CO)，943+897 cm·1 (二級醇），869 cm·1 ( v吡嗪核之 CH)，645 cm·1 (吡嗪核 t CH) ’ 607 cm-1寬帶（OH基之變形），446+409 cnT〖（叶匕17秦戌）， -質譜在FINNIGAN TSQ46裝置上進行，質量離子化型式 M/z=305 (MH)+， -4 NMR 光譜（ 600 MHz，DMSO，ppm之化學移動）：2.70及 3.04(2(1〇1，>9.0及15.01^及】=3.0及15.0«^，11^各另|1:0^2在丫立置 Γ);在 3·30及 3.45 間（mts，CH在位置 31，，4,，4Μ);在 3.53 及 3.65 間（mts，4Η : CH在位置 2,，3,，4,，4") ; 3.73 (mt，1H ·· CH在位置 2") ; 4.37 (寬 t，1H : OH在位置 4，）； 4.42 (mt，2H ·· OH在位置 2·及4") : 4.60 ( d，J=6 Hz, 1H : OH在位置 2") ; 4.63 (d，J=6 Hz，1H ·· OH在 3’）； 4.67 (d，J=6 Hz，1H : OH 在位置 3") ; 4.92 (dd J=6.0及 0.6 Hz，1H : CH在位置 Γ) ; 5.30 (d J=6.0 Hz，1H ·· OH在位置 Γ) ; 8.39 (s，1H : CH在位置 6)， 8.61 (s，1H : CH在位置 3)， -紫外線光譜：λ最大=276 nm (e=7756) ; 206 nm (e=8738) (c=19 mg/ml :水），λ*< = 277 nm (€=7218) ; 208 nm (€==7171) ________-13.-____ Ύ丨：_、家標这：) Λ4规格（2⑴『公浚） ---„---；----^^裝-- (請先閔讀背面之注意事項再成寫本頁·) 1Τ------- 經濟部中央標隼局負工消资合作社印u 528598 五、發明説明（11 ) _ (c=19 mg/ml ; HC1 0.IN) ’ λ 最 < = 276 run (6=7467)( c=19 mg/ml ·· KOH 0.1N)， -HPLC在 AIT標誌之 150x4.6 mm之 Y.M.C. 180DS-AQ 柱（批次 AIT/DE940377)，平衡洗提液H2〇+0.1%甲酸，具流速1 ml/min，於270 nm UV檢查，保留時間：3分75秒及1 gm之2- (四羥基丁基）-6-( 2\3’，4’-三羥基丁基）吡嗉，其具有下列性貝 . NMR光譜（600 MHz，DMSO，在ppm之化學移動）·· 2.70 殳3.04 (2 dd，J=9.0及 15.0 Hz及 J=3.0及 15.0 Hz，1H各另|J : CH2 在位置 Γ);在 3·30 及 3.45 間（mts，CH在位置 3M，4,，4，，）；在 3.53 及 3.65 間（mts，4H : CH在位置 2,，3,，4,，4") ; 3.73 (mt，1H : CH在位置 2") ; 4.37 (寬 t，1H : OH在位置 4，）； 4.42 (mt，2H ·· OH在位置 2’及4·’）： 4.60 ( d，J=6 Hz，1H ·· OH在位置 2") : 4.63 (d, J=6 Hz，1H ··〇H在 3’）； 4.67 (d，J=6 Hz, 1H :〇H 在位置 3") ; 4.92 ( dd J=6.0及〇·6 Hz，1H : CH在位置 Γ) : 5·3〇 (d J=6.0 Hz，1H ·· OH在位置 1，）·，8.31 (s，1H : CH在位置 5)， 8.53 (s, 1H : CH在位置 3 )， -HPLC在 AIT標語之 150x4.6 mm之 Y.M.C, 180DS-AQ柱（批次 AIT/DE940377)，平衡洗提液η2Ο+0·1%甲酸，具流速1 ml/min，於270 nm UV檢查，保留時間：3分61秒。混合物I及II，草胺酸鈉及式⑴化合物之降低血糖活性已在以鏈腸佐菌素造成糖尿病之老鼠及餐後血糖過多之正常老鼠中根據下列步驟而決定： I.以缝脉佐3素造成糖尿病之老鼠 ____ - 14- 二中 SK 家標华（CM ) 2 丨卜—--—-- -----„----裝-----！--訂.------ (請先閱讀背面之注意事項再4-寫本百Ο 528598 Λ7 B7 五、發明説明（12 ) 將重量在22及25 g間之瑞士小白鼠以鏈脲佐菌素造成择尿病，其經腹膜内注射以劑量210或265 mg/kg之老氧投藥，稀釋於檸檬酸鹽缓衝液以一種母一老鼠於第1天 (D1)接受0.2 ml之溶液之濃度。3至4天後，檢查2至3隻老鼠以了解是否造成糖尿病（血糖大於7.2 mmol/升（13〇瓜泛每 1 〇〇 ml)。接著於殘存4小時後測量血糖。苦老鼠已變成具错尿病，將其分成5至7老氛之批次。每一批次接受，自 D 1及每天，一選擇劑量之產物。每天投樂一次及在一固定時間，藉胃插管及以0.4 ml蒸餾水之體積作賦形劑3兩^比次之對照組组成：一批次之未經處理糖尿病老鼠 -一批次正常老鼠此兩批次對照組藉胃插管接受0.4 ml賦形劑且同時與柄$ 理之老鼠。此處理持續4天。第5天（D5)，不投與產物。辦t 4小時沒，測量最後之血糖。 II.餐後血糖過多之正常老鼠經濟部中央標弘局只工消费合作枉印製使重量在22及25 g間之瑞士小白鼠藉下到击驶广丄& 7氣而成餐後立糖過多： -斷食2小時 -銀食超過1小時 -斷食2小時

在最後2小時斷食結束後測量血糖，A ，、攝成時間TO之血糖。4者將老鼠根據測得血糖分成均勻批>。“ 夂3將欲測量之 __ _- 15 - ί、纸ft尺度適用中§國家標準（CNS )八4規格（21()〉< 297公幻 528598 Λ7 __B7 五、發明説明（13 ) 產物於0.4 ml之蒸餾水中毫無延遲地經胃插管投藥。對照组批次接受佐劑（0.4 ml蒸餾水）。1小時後，測量最後血糖，其構成時間T60之血糖。 {1 —^1ϋ ^m· —m nm ϋϋ·1 mvl nn I im· mu dhli (Hal \ -y —nil In·— mu ml In.— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本百c 經濟部中央標準局N工消贤合作社印¾ 得自以鏈脲佐菌素造成糖尿病之老鼠的血糖產物mg/老鼠/天老鼠號碼於D1之血糖 mg/100 ml 於D5之血糖 mg/100 ml %抑制鈉(0.5 mg) 5 153.40±11.53 89.90土13.94 -41.46 混合物Γ1 (0.5 mg) 5 270.50±58.72 117.50土17.35 -56.56 丨2-(四羥基丁基)-5-(2’，3，,4，- | 三羥基丁基)-吡嗪(0.5 mg) 5 304.25土99.35 164.50±95.13 -45.93 2-(四羥基丁基)-5-(2’，3，，4匕三經基丁基)-^σ秦及2-{四羥基丁基)-6-(2’，3’,4’-三羥基丁基)-吡嗪(50/50) (0.25 mg) 6 320.83+130.30 174.00±97.74 -45.77 對照組 5 221.66士 50.17 210.33±20.07 -5.11 -16- 因 3 家標準：) ( 2丨，、.':297公^： 528598

AT _____ _B7__ 五、發明説明（14 ) 在餐後血糖過多之正常老鼠所得血糖之結杲產物mg/老鼠/天老氣號碼於T0之血糖 mg/100 ml 於Τ60之血糖 mg/100 ml %抑制混合物I (5 mg) 5 129·50±29.06 87.60±14.16 -32.35 鈉(0.5 mg) 15 136.46±23.69 102.93±20.95 -24.57 I 混合物II €〇.5 mg) 15 133.93±17.50 105.60±16.91 -21.15 I |丄5-(四羥基丁基)吡嗪(0.5 ； ;mg) 10 136.25土 16.92 102.41±14.12 -24.83 ;2-(四羥基丁基)-5-(2，工4·-三經基丁基比17秦(0.5 mg) 10 128.75±21.23 90.50±19.55 -29.70 ;2-(四羥基-丁基)-5-(2·,3·，三羥基丁基)-吡嗪及2-(四 1 基丁基)-6-(2\3'，4·-三羥基丁基)-吡嗪(50/50) (0.25 mg) 5 126.60±17.03 100.60±16.88 -20.53 對照組 10 137·83±13.99 130.50±20.23 -5.32 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 -裝· 訂

經濟部中央標準局Η工消費合作社印-U 根據本發明之混合物，草胺酸鈉及式（I)之化合物具低毒性。其LD50在老鼠大於2000 mg/kg 口月良。根據本發明之混合物，草胺酸鈉及式（I)之化合物在糖尿病者身上可降低血糖及因而可用於治療糖尿病及糖尿病併發症3 單獨使用此等產物治療糖尿病時，沒有血糖過低之危險。其爲眞正抗糖尿病劑。其顯示此等功效來自葡萄搪在 __ - 17- 嘌一::.\4巧格、：i〇x:u，公空） ^-- 528598

15 發明説明（周圍之增加。此產物不顯著促進賧島素之分泌，但少量胰島素之存在對其作用是必需的。在沙鼠（Psammomys obesus)，其在被囚禁時自動造成糖尿病’此產物降低過多血糖，防止或降低白内障及恢復部分生殖力。在人類治療上，此等產物因而可用於預防或治療糖尿病及神別是沒有丙酮尿之第π型糖尿病（NID糖尿病），肥胖糖在歲之糖尿病’後多血質（metaplethoric)糖尿的’影響較長者之糖尿糖及輕度糖尿病。其在胰島素依賴』尿病可作爲胰島素治療之補充劑（因爲其胰島素·加強 …么）’其使逐漸降低胰島素劑量成爲可能，不穩定糖尿柄，柷胰島素糖尿病，及當無法充分降低血糖時，作爲降 k iin <硫gg胺的補充劑。此產物亦可用在糖尿病之併發症w问皿/Ig 1 ’脂肪代謝異常，血脂異常及肥胖，其亦可用於預防及治療動脈硬化之傷害及其併發症（冠狀病，心肌便&，心肌病，此等併發症演變成左心室機能不全，各種動脈疾病，跋行下肢之動脈演變成潰瘍與壞疽，腦血管機把不全及其併發病與來自血管之性無能），.糖尿病視網膜病及其所有表徵（微血管滲透性增加，擴張及微血管拴塞，微動脈瘤，動脈與靜脈分流，靜脈擴張，點狀及斑點出血，滲出，斑點水腫，增生視網膜表徵：新血管，增生視’’罔膜薇破璃狀體出血，視網膜剥離），糖尽病白内障不同形式之糖尿病性神經病（周圍多神經病及其表敬如感^異^，感覺過敏及疼痛，單神經病，脊神經病，自 -18 ---^---:----0·^-----訂------ (請先閲讀背面之注意事項再4-寫本百() 經濟部中央標浪烏β工¾费合作社印^ 528598

A 五 '發明説明（16 主神經病，糖尿病肌萎縮），糖尿病足之表徵（下肢及下足潰癌），兩擴散及結節型式之糖尿病性神經病，粥瘤病 (HDL脂質蛋白之增加促進膽固醇自瘤斑釋放，LDL脂質蛋白之卩条低，LDL/HDL比例之降低，LDLs氧化之抑制，血小板黏連之降低），血脂質過多及血脂異常（膽固醇過高症，二酸甘油過南症’脂肪量之正常化，尿酸也症之正常化， A及B輔蛋白質之正常化），白内障，高血歷及其結果。恨據本發明之醫藥品包含根據本發明之混合物，草胺酸別，式⑴之化合物或此等產物之組合，呈純品狀態或呈组 r π型式其與可能不活化或具生理活性之任何醫藥上可相 >凌π砠合。根據本發明之醫藥品可以口服，腸胃外的，直時的或局部的使用。共口服投藥疋固體組合物，其可爲片劑、丸劑、粉劑 :广、;则、藥包)或顆粒。在此等组合物中，根據本發 3 <活性成分係與一成多伽 A夕1固不活性稀釋刎混合，如澱粉，、’戰維素，蔗糖，乳糖或矽，，—& < /在氧‘「3此組合物亦可包含 a釋劑以外之物質，例如—+夕 ^ 、或夕種潤滑劑如硬脂酸鎂或滑著巴劑，塗層（糖衣片劑）或釉。供口服投藥之液體組合物，、 h ·Λί、、其可局資樂上可接受溶液，卞政’乳液，糖槳及酏劑轉，^^ 有不活化稀釋劑如水，乙甘油，植物油或蠟油。 χ 此寺組合物可包含 4¾ 質如濕潤，封味，非稀釋劑之 ^ ^ 一 &稠，香味或穩定劑。々胃外投藥之無菌組合物 & 泣.，目n丄I 又可馬水性或非水性型式之至於溶劑或賦形劑，可使用水，丙 ζ〜咴，懸浮液或乳液 n : . m : -.- mu I 士 -· - - . 1 - . ......^ 1 - I .、一 -0: - I ml - - - I -1 -1 (請先Μ讀背面之注意事項再疼寫本百c 528598 五、發明説明（17 二醇，聚乙二醇，植物油，特別是橄欖油，可注射之有機酯，例如油酸乙酯或其它適當有機溶劑。此等組合物亦可含有助劑，特別是濕潤，等滲，乳化，分散及穩定劑。消毒可以數種方式進行，例如藉無菌過遽，藉加消毒劑入組合物中，藉照射或藉加熱。其亦可製備成無菌固體組合物型式其可在使用時溶解於無菌水或任何可注射無菌基質° 直腸投與之組合物爲栓劑或直腸膠囊，其包含，除活性產物外，佐劑例如可口奶油，半合成甘油或聚乙二醇。苟部投與之组合物可爲例如奶油乳液，洗眼劑，漱口剞，鼻滴劑或氣溶膠3 劑量取決於所要之效果，治療時間及泛用之投藥路徑：在成人其通常在150 mg及600 mg間每天經口服路徑，具在 50 mg至200 mg間活性物質之單位劑量° 通常，醫師將根據年齡、體積及患者所有其它特定因素來決定適當劑量。下列實例例示根據本發明之組合物：請 « 讀背黑之意事填- 寫本百經声部中央標違局只工消费合作社印11 -20- 528598 Λ7 B7

五、發明説明（1S 實例A 劑量爲50 mg活性產物之乳膠膠囊具有下列組成，係根據

一般技術製備·· —活性產物.....................................50 mg —纖維素........................................18 mg —乳糖..................................... 55 mg -醪體矽.........................................1 mg —羧曱基鈉澱粉.................................1〇 mg —滑石..........................................10 mg -硬脂酸銕...................... 1 mg Ό; B 劑量爲50 mg活性產物之片劑具下列組成，係根據一般技 •裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本I.)

:項再4-A 、-tv 沒濟部中央標進^Jg工消资合作社印袈衔製備： —活性產物....................................50 mg —乳糖.......................................1〇4 mg —纖維素......... 40 mg -聚維酮（polyvidone)...........................10 mg -羧甲基鈉................................. 22 mg —滑石........................................10 mg —硬脂酸鎂.....................................2 mg —膠體矽.......................................2 mg -經甲基纖維素，甘油，氧化鈥 (72-3.5-24.5)qs 1嚴光膜塗覆片劑含有........245 mg -21 -，3驾家禕达::CNS ' 八*1規格（公,¾ ) Φ. 528598

AT B7 五、發明説明（I9 )

實例C 製備含有50 mg活性產物之可注射溶液具下列組成·· 一活性產物.......... 50 mg —苯甲酸................................ 80 mg -苯甲基醇..................................0.06 ml —苯酸鈉................................ 80 mg —95〇/〇乙醇....................................0.4 ml —氫氧化鈉....................................24 mg -丙二醇......................................1.6 ml —水......................................qs.… 4 ml - ；裝訂- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本瓦) 經;^.部中央標龙局負工消资合作社印裝 -22- 中园國家標準；:) Λ4規格（210乂2〇7公鋒

Claims

528598 frit- 第086101379號專利申請案中文申請專利範圍替換本(92年1月）丨·· _ ’ 申請專利範圍 ι· 一種得自烏墨蒲桃種子且實質上無多酚及固醇衍生物之此合物，此混合物係得自研磨烏墨蒲桃種子，以低碳脂肪醇經加熱軟化如此獲得之粉末，過濾及回收不可落物質，實質上無多酚及固醇衍生物，以銨溶液處理不可/合物質，以低碳脂肪醇加熱處理如此獲得之銨混合物，過濾及回收不可溶物質及乾燥此不可溶物質以獲得混合物〗，及選擇性以水/低碳脂肪醇溶液處理此&物I過’慮，；辰縮過濾、物，於非極性吸收性樹脂上純化，濃縮，離心，超離心，及自洗提液分離混合物 II 〇 2· —種製備如申請專利範圍第丨項所定義之混合物之方法’此方法包含研磨烏墨蒲桃種子，以低碳脂肪醇經加熱軟化如此獲得之粉末，過滤及回收不可溶物質，貝貝上典多紛及固醇衍生物，以铵溶液處理不可溶物負，以低碳脂肪醇加熱處理如此獲得之铵混合物，過滤及回收不可溶物質及乾燥此不可溶物質以獲得混合物I ’及選擇性以水/低碳脂肪醇溶液處理混合物I，過濾’濃縮過濾物，於非極性吸收性樹脂上純化，濃縮，離心，超離心，及自洗提液分離混合物π。 3· —種製備如申請專利範圍第1項所定義之混合物I之方法’此方法包含乾燥烏墨蒲桃種子，研磨乾燥種子成粉末及使粉末經下列處理：本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4规格(210 X 297公釐) 528598

a-浸軟，伴隨攪拌，在低碳脂肪醇中，於溫度4〇及7〇它間， b -於真空下過濾及回收不可溶物質， c -以低碳脂肪醇在溫度4〇及7(^c間浸軟，伴隨攪拌，不可溶物質， d-於真空下過濾及移除含有主要是不要之多酚及固醇之醇相， e-於銨溶液中在溫度1〇及3〇。〇間收緊在d獲得之不可溶物質， f-於水/低碳脂肪醇溶液，在40及川它之溫度時，收緊如此獲得的濕的銨塊， g-過濾及丟棄醇溶液， h -以低碳脂肪醇洗如此獲得之不可溶物質，過淚及丢棄醇溶液， i -回收如此獲得之不可溶物質及乾燥混合物I。 4.根據申請專利範圍第3項之方法，其中在步驟a，使用2 至10升之低碳脂肪醇每公斤之過篩粉末。 5·根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟a，在 60°C時使用5升具有93-95%之乙醇1小時。 6. 根據申凊專利範圍第3或4項之方法，其中步驟b及d之過滤係在40 kPa之真空下進行。 7. 根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟c，使 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 528598 A8 B8 C8 "^7----~_____D8 _____ 六、申請專利範圍用2 土 1 〇之低碳脂肪醇每公斤之起始過篩粉末。 8.根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟c，在 6〇°C之溫度時使用4升具有93_95%之乙醇1小時。 9·根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟^，使用750至1250 ml銨溶液每公斤之起始過篩粉末。 10.根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟^ ,每公斤之起始過篩粉末，使用1升含有35〇瓜丨之以％氫氧化銨之銨溶液，及該步驟係在約20°C溫度下進行1〇至3〇小時。 11·根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟f，得自1公斤起始過篩粉末之濕的銨塊在2至丨〇升水/低碳脂肪醇溶液中收緊。 12·根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟f，該步驟係在5升乙醇-水混合物（75/25體積比）中，6〇ΐ：下進行1小時。 13·根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟h，洗條係以500至1500 ml低破脂肪鮮母公斤之起始過篩粉末進行。 14·根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟h，洗條係以1升乙醇進行及過濾係在棉布上及於約8〇匕以之真空下進行。 15·根據申請專利範圍第3或4項之方法，其中在步驟丨，乾 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x297公釐) 528598 A8 B8 C8 ______ D8 ____ 六、申請專利範圍燥係在開放空間避光下進行。 16· —種製備根據申請專利範圍第i項之混合物Π之方法，其中如申請專利範圍第1項所定義之混合物I經下列處理： j -以水/低碳脂肪醇溶液處理混合物I , k -輕輕倒出吸出頂相，其經過濾而得到過濾物丨，及以水處理底相及過濾以得到過濾物2，集合過濾物1及2及濃縮水相， 1 -以非極性吸收性樹脂處理如此獲得之物質及接著過濾， m -濃縮如此獲得之過滤物，進一步過滤及接著進行超過滤， η -冷凍乾燥如此獲得之物質及分離混合物Π。 17.根據申請專利範圍第16項之方法，其中在步驟j，使用 10至25升之水/低碳脂肪醇溶液（95/5至90/10體積比）每公斤之混合物I。 18·根據申請專利範圍第16或17項之方法，其中在步驟j , 使用18升水-乙醇溶液（17.7-0.93體積比）。 19·根據申請專利範圍第16或17項之方法，其中在步驟k, 頂相係在棉布上過濾及將10至25升水每公斤混合物I加入底相，及在多孔玻璃上過濾所得混合物。 20.根據申請專利範圍第16或17項之方法，其中在步驟k， -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 528598 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍濃縮係在熱虹吸管濃縮器中於35°C之溫度在0.4 kPa真空下進行。 21. 根據申請專利範圍第16或17項之方法，其中在步驟1，非極性吸收性樹脂為S861樹脂或Rh 〇 m及H a s s標誌之 XAD-型樹月旨及混合物係在多孔玻璃上過濾。

裝 22. 根據申請專利範圍第16或17項之方法，其中在步騾m，濃縮係在熱虹吸管濃縮器中於35°C之溫度在0.4 kPa真空下進行。 23. 根據申請專利範圍第16或17項之方法，其中在步騾m，三個連續超過濾係在10 kd，3 kd及1 kd筒進行。 24. —種製備草胺酸鈉或下列式（I)化合物之方法：

(0 i 其中心代表氫原子及R2代表下列式（A)或（B)之鏈： -CH2-CHOH-CHOH-CH2OH (A) -CHOH-CHOH-CHOH-CH2OH (B) 或心代表式（A)之鏈及R2代表氫原子，此方法包含使如申請專利範圍第1項所定義之混合物II經下列處理：〇 -在碎蕩土柱進行混合物II之色層分離，回收含所要產 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 528598 8 8 8 8 A B c D 々、申請專利範圍物之餾分，及收集此等餾份成單一餾分， p -對如此獲得之單一餾分進行色層分離以獲得草胺酸鈉：式（I)之化合物其中Ri代表氫原子及及2代表殘基 (B)，及式（I)化合物其中&代表氫原子及R2代表殘基（A) 與式⑴化合物其中心代表殘基（A)及尺2代表氫原子之混合物，及 q -選擇性，對式（I)化合物其中Ri代表氫原子及R2代表殘基（A)及式（I)化合物其中R/代表殘基（八)及R2代表氫原子之混合物進行HPLC。 25. 根據申請專利範圍第24項之方法，其中步驟〇之色層分離係在P r ο 1 ab 〇標誌之CHEM ELUT®柱進行，其以水飽和及接著連續洗提以庚烷，庚烷-乙酸乙酯混合物 (50/50體積比），乙酸乙酯-正丁醇混合物（95/5 ; 90/10 ; 80/20 ; 50/50 ; 20/80及接著0/100體積比）及正丁醇-水混合物（98/2及接著95/5體積比）。 26. 根據申請專利範圍第24項之方法，其中在步驟p之色層分離，使用水-乙醇混合物（50/50體積比）。 27. 根據申請專利範圍第24項之方法，其中在步驟q之色層分離係在AIT標誌之YMC 180DS-AQ柱，以水及0.1 %甲酸之混合物作為洗提液進行。 28. —種治療糖尿病之醫藥組合物，此組合物包含如申請專利範圍第1項所定義之混合物I，如申請專利範圍第1 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 528598 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍項所定義之混合物II，如申請專利範圍第24項所定義之草胺酸鈉或式（I)之化合物，及一或多種賦形劑。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)