TW518340B - Tumor antigen peptide derivative - Google Patents

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518340 _案號87120187_年月日_ 五、發明說明（1) 技術領域 本發明係關於新穎的腫瘤抗原肽衍生物。 背景技術 在藉身體排除腫瘤方面，已知免疫系統，尤其是T細 胞，扮演重要的角色。實際上，在人類的腫瘤患部，可見 到對腫瘤細胞顯示傷害活性之淋巴球之浸潤（Arch.

Surg·， 126:200-205， 1990)，能識別自體腫瘤細胞之細 胞傷害性T細胞（C T L )較容易自黑素瘤分離（I m m u η ο 1.

Today， 8:385, 1987， J· Immunol·, 138 : 989， 1987 ; Int· J. Cancer, 52 :52-59， 1992 等）。又，藉著T 細胞 移入治療黑素瘤之臨床結果暗示T細胞在腫瘤排除方面具 重要性（J. Natl. Cancer· Inst·， 86:1159， 1994)。 雖然長k間以來對於C T L在攻擊自體腫瘤細胞時之標的 分子不甚明瞭，但藉著最近之免疫學及分子生物學之進步 已漸次明白。亦即，C T L，藉著使用τ細胞受器（τ C R )，以 及識別被稱為腫瘤抗原肽之肽與主要組織適合基因複合體 第I類抗原（Μ H C第I類抗原，在人類的場合被稱為H L a抗原）-之複合體而攻擊自體腫瘤細胞之事已被明白。 . &亥腫瘤抗原狀為腫瘤特有的蛋白質，即腫瘤抗原蛋白質 在細胞内被合成後，藉著在細胞質内被溶蛋白質小體 (proteosome)分解成肚而生成。另一方面，在小胞體内形 成之MHC第I類抗原（HL A抗原）與上述腫瘤抗原肽結合，經 順向高基氏體而移動至成熟側之反向高基氏體，然後被運 送至細胞表面而施行抗原呈現。腫瘤特異性c T L能識別該 被抗原呈現之複合體，並經由細胞傷害作用及淋巴因子之

O:\56\56214-910709.ptc 第5頁 518340 一案號 87120187 Λ_η 曰 修正 五、發明說明（2) 產生而顯示抗腫瘤效果（臨床免疫，呈1(9) :1〇 34- 1 0 42， 1 9 9 5 )。隨著對此一連串作用之了解，於是利用腫瘤抗原 蛋白質或腫瘤抗原肽做為所謂的癌疫苗，以增強腫瘤患者 體内之腫瘤特異性C T L而可以治療腫瘤。 關於做為該腫瘤抗原蛋白質者，1991年被T. Boon等人 初始命名為MAGE之蛋白質從人類黑素瘤被鑑定出 (Science， 25 4:1 64 3 - 1 647， 1991)，此後，多個腫瘤抗原 蛋白質從黑素瘤被鑑定出。 至今，被鑑定出之腫瘤抗原蛋白質，按照在T. Boon等 人之總論（J· Exp. Med·， 1 8 3, 7 2 5- 7 2 9， 1 9 9 6 )中所述， 分為下列四類：

第I類所含之腫瘤抗原蛋白質，為於正常組織僅在睪丸 中被發現，而於腫瘤組織在黑素瘤、頭頸部癌、非小細胞 性肺癌、膀胱癌等中被發現之一群蛋白質。做為該類腫瘤 抗原蛋白質者，有上述的MAGE、形成1 2種以上其類似族群 之蛋白質群（j· Exp. Med·， 178: 48 9 - 49 5， 1 99 3 )、BAGE (Immunity, 2:1 6 7- 1 7 5, 1 99 5 )及GAGE (J· Exp. Med.， 1 8 2 : 68 9 - 6 98， 1 9 9 5 )，其皆可從黑素瘤細胞中鑑定出。 然而，該類腫瘤抗原蛋白質在黑素瘤之場合雖常被發 現，但在其他種類腫瘤之場合，該等腫瘤患者之中僅有 1 0 %至3 0 %被發現有此腫瘤抗原蛋白質，所以無法被廣泛應 用於各種腫瘤之治療及診斷。 第I I類所含之腫瘤抗原蛋白質，為於正常組織僅在黑色 素細胞及視網膜中被發現，而於腫瘤組織僅在黑素瘤中被 發現之一群蛋白質。此等組織特異性蛋白質由於在腫瘤'細

Η

O:\56\56214-910709.ptc 第6頁 518340 __案號87120187_年月日__ 五、發明說明（3) 胞之黑素瘤中經常被發現，所以有做為黑素瘤-特異性腫 瘤抗原蛋白質之機能。做為該類腫瘤抗原蛋白質者，有酪 胺酸（J· Exp. Med·， 178： 489-495, 1993) - MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 91：3 5 1 5, 1 9 94 )、gpl00 (J· Exp. Med·, 1 7 9: 1 00 5 - 1 0 0 9, 1 9 9 4 ) &gp75(J· E x p · M e d ·， 181 :799-804, 1995)，此等抗原之基函—^~是 從黑素瘤細胞選殖而來。再者，Melan-A (J· Exp. Med.， ΙΜ:35， 1 9 94 )以另一途徑被鑑定出，其與MART - 1為同一 分子。

然而，該類腫瘤抗原蛋白質由於在黑素瘤以外之腫瘤中 未被發現，所以無法應用於廣泛種類腫瘤之治療及診斷。 第I I I類所含之腫瘤抗原蛋白質，係腫瘤特異性突變之 結果’為可被CTL識別之腫瘤抗原肽且已被表現之一群蛋 白質。做為該類腫瘤抗原蛋白質者，有經突變之CDK4 (Science, 26_9 1 2 8 1 - 1 2 8 4， 1 9 9 5 )、$ -卡天寧（卢 -catenin) (J. Exp· Med· ， i^3:1185-1192, 1996)及

MUM-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ^2:7976-7980, 1995)。在CDK4及/5 -卡天寧之場合，藉著一個胺基酸變 異，肽之Μ H C第I類抗原結合親和性增加而可被τ細胞識 別。在MUM-1之場合，藉著突變使通常未被轉譯之内含子 部位被轉譯所生成之肽可被Τ細胞識別。然而，由於此等 突變之頻率低，無法應用於廣泛種類腫瘤之治療及診斷。 第I V類所含之腫瘤抗原蛋白質，在正常組織中亦被廣範 圍地發現’係可被CTL識別之蛋白質，pi5(J. Immunol, :5944 - 5955， 1995)可從黑素瘤細胞中鑑定出。 -

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_案號 87120187 五、發明說明（4) 至目前為止已知之腫瘤抗原蛋白質 如下文所述進行。 貝或腫瘤抗原肽之鑑定· 首先，準備腫瘤細胞及攻擊該鈿胞 細胞及同一患者之淋巴球建立）所纟且 C T L (通常從腫瘤 該套組之細胞直接鑑定腫瘤抗原狀，之套組。接著，用 原蛋白質之基因，然後鑑定對應的腫二^決定編碼腫瘤抗 關於直接鑑定腫瘤抗原肽之方法，$抗原肽。 MHC第I類抗原之腫瘤抗原肽於酸性條件結合至腫瘤細胞之 用高速液體層析法分離之種種肽脈^ ^萃取出，藉著將 但未表現腫瘤抗原蛋白質之細胞（例如，'現MHC第1類抗原 等）中，以及研究CTL之反應，而鑑定同一患者之B細胞 質譜測定法決定序列。藉著該方法，^抗原狀’並使用 子之Pme 1 1 7之腫瘤抗原肽從黑素瘤細 及來自同一分 (klence，^^716_ 7 1 9, 1 9 94 )眉、··田胞被鑑定出 ^於決定編碼腔瘤抗原蛋白質之基因並鑑定對應腫瘤抗 原肽之方法，有一種以分子生物學的手法選殖編碼腫瘤抗 原蛋白質之基因之方法。從腫瘤細胞調製cDNA，將該cDNA 與MHC第I類抗原基因一起轉染至未表現腫瘤抗原蛋白質之 細胞（例如C OS細胞等）中並使之一起表現，根據c T L對其之 反應性反覆進行筛選，然後單離編碼腫瘤抗原蛋白質之基 因。猎此方法’可以選殖上述之MAGE、赂胺酸酶、 MART-1、gp 1 0 0、gp7 5 之基因。 松 從所得腫瘤抗原基因之資料，可以推定實際上結合至 Μ HC第I類抗原（HL A抗原）上且被提示之腫瘤抗原肽。為了 鑑定，使用下述之方法。首先，藉著P C R、胞外核酸酶及

O:\56\56214-910709.ptc 第8頁 518340 _案號87120187 年月日_^_ 五、發明說明（5) 限制酶等製作編碼腫瘤抗原蛋白質之基因之各種尺寸片 -段，然後與MHC第I類抗原基因一起轉染至未表現腫瘤抗原 蛋白質之細胞（例如C0S細胞等）中並使之一起表現，根據 C T L之反應性而界定含腫瘤抗原肽之領域。繼而根據被界 定之領域合成各種肽，將此等肽脈衝至表現MHC第I類抗原 . 但未表現腫瘤抗原蛋白質之細胞中，用研究CTL之反應性 等方法鑑定腫瘤抗原肽（J. Exp. Med.， 176 : 1 4 5 3， ‘ 1992 ;J· Exp· Med·， 179:24， 759， 1994)。再者，關於 HLA-A1、-A 02 0 1、-A0 2 05、-All、-A24、-A31、-A6 8 0 1、 -B7、-B8、-B2 70 5、-B37、-Cw 040 1、-CwO 6 0 2 等之MHC 型，被結合及呈現之肽之序列之規則性已被判明 (Immunogenet i cs, ϋ:1 7 8 -2 28, 1 99 5 )，參考彼等及探究 腫瘤抗原肽之候選者，合成該肽並用上述同樣的方法加以 確認（Eur· J. Immunol·，M:7 59, 1 9 94 ;J· Exp· Med·， 180:347,1994)。 使用上述之方法進行種種腫瘤抗原蛋白質及腫瘤抗原肽 之鑑定。然而，如上所述，已知之腫瘤抗原蛋白質之任一-種，由於不是僅在有限的腫瘤中被發現，就是即使在多種 _ 腫瘤中被發現但僅在該腫瘤患者之少數人中被發現，所以 無法廣泛地應用於各種腫瘤之治療及診斷。 發明之說明 本發明之目的為得到一種在腫瘤之種類及對象上沒有限¢1 制而可被廣泛地一般性利用之腫瘤抗原肽衍生物，尤其是 得到一種可廣泛應用於治療及診斷具高發生率之扁平上皮 癌等之腫瘤抗原蛋白質，以及其對應之腫瘤抗原肽及其衍

O:\56\56214-910709.ptc 第9頁 518340 案號 87120187 -年 月 曰 修正 五、發明說明（6) 生物。亦即本發明之目的為提供來自黑素瘤以外之腫瘤 (更詳細言之’扁平上皮癌）之新穎腫瘤抗原肽衍生物，或 者用違腫瘤抗原肽竹生物治療、預防或診斷腫瘤之方法、 組成物及套組等。本發明之目的亦為提供一種具HLA-A2 4 拘束性之腫瘤抗原肽衍生物，其中HL A - A 2 4為廣泛人類對 象所保有_之儿八抗原。 ” ---- 為了達成上述的目的’本發明者建立來自食道癌之扁平 上皮癌細胞株KE-4(以下，稱為食道癌細胞株KE—4，或簡 單稱為KE-4)，又建立能識別被HLA-A 2 6 0 1、HLA-A240 2等 拘束之腫瘤抗原肽之CTL(以下稱為KE-4CTL)，其中 HLA-A2601及HLA-A2402為在該KE-4中發現之HLA抗原 (Cancer· Res·,拉：4248-4253， 1995)。 接下來，將從KE-4製作之CDNA庫之重組質體與 HLA-A2601 cDNA庫之重組質體同時轉染至纖維母細胞株 VA-1 3細胞中，在該轉形體中使KE-4CTL作用，然後藉著 IF N- r之產量測定KE-4 CTL是否被活性化，並筛選編碼新 穎腫瘤抗原蛋白質之基因。結果初次從黑素瘤以外之腫瘤 細胞成功選殖編碼新穎腫瘤抗原蛋白質之新穎基因。被選 殖基因之核苷酸序列被示於序列編號：2中，以及推定的 胺基酸序列被示於序列編號：1中。 本發明者繼而嘗試在上述腫瘤抗原蛋白質之胺基酸序列 中，鑑定實際上具有腫瘤抗原肽機能之部分，而鑑定出被¥ HLA-A26及HLA-A24等拘束之種種腫瘤抗原肽部分。 其中，做為HLA-A24拘束性腫瘤抗原肽者，鑑定出具有 序列編號1所記載之胺基酸序列之第6 9 0位〜第6 9 8位之胺基

O:\56\56214-910709.ptc 第10頁 518340 案號 87120187 曰 修正 五、發明說明（7) 酸序列之肽（序列編號：3 )。接下來，本發明者製作將序 列編號·· 3所記載之HLA-A24拘束性腫瘤抗原肽之胺基酸殘 基改變之種種肽衍生物及測定是否有活性，以明瞭此等衍 生物是否也有做為腫瘤抗原肽之活性。 本發明基於以上之發現而完成。 亦即本發明之要旨為提供一種腫瘤抗原肽衍生物，其含 有將序列編號：3記載之胺基酸序列之1至數個胺基酸殘基 改變之胺基酸序列之全部或一部份，且可與HLA-A24抗原 結合而被細胞傷害性T細胞識別。 圖式之簡單說明 圖1為電泳之照片，其顯示使用重組質體6 D I之插入序列 部分（編碼從食道癌細胞株KE-4選殖之腫瘤抗原蛋白質）做 為D N A探針，並藉著北方氏吸潰雜交法調查在種種細胞株 (a )及種種組織（b )[心臟、腦、胎盤、肺臟、肝臟、骨骼 肌、腎臟、胰臟、脾臟、胸線、前列腺、睪丸、子宮、小 腸、結腸（黏膜内層）及末梢血液白血球]中，腫瘤抗原蛋 白質之mRNA之表現分布。 圖la)中，KE - 4、KE - 3、TE - 8及TE - 9表不食道癌細胞 株，Kuma- 1表示頭頸部癌細胞株，HSC-4表示口腔癌細胞 株，B e c _ 1表示B細胞株，K M G - A表示膽囊癌細胞株，R - 2 7 表示乳癌細胞株，KIM-1、KYN-1及HAK-3表示肝癌細胞 株，以及M3 6及M37表示黑素瘤細胞株。從圖1可以明白被 純株6DI編碼之腫瘤抗原蛋白質之mRNA在各種癌細胞及正 常組織中廣被範圍地表現。 圖2顯示序列編號：5、序列編號：6及序列編號：7記載

O:\56\56214-910709.ptc 第11頁 518340 —----MM 87120187_年月日_^ 五、發明說明（8) 之胺基酸序列組成之肽在試管中具I F N - r產生誘導活性。 亦即’用上述肽衍生物刺激HLA—A24陽性之健康人末梢血 液淋巴球’於表現腫瘤抗原之HLA_A24陽性之KE-4細胞存 在下’測定從被其刺激之淋巴球產生之I ρ N - T量。從圖2 可以明白j著序列編號：5、序列編號：6及序列編號：7 之各肽衍生物，CTL被誘導。 實施發明之最佳形態

在本說明書中，本發明之「腫瘤抗原肽衍生物」係指具 有所謂「含有將序列編號：3記載之胺基酸序列之1個或以 上（較佳1至數個）胺基酸殘基改變之胺基酸序列之全部或 一部份’且可與HLA-A24抗原結合而被CTL識別」之腫瘤抗 原肽之活性者。其中，序列編號：3記載之胺基酸序列組 成之肽為H L A - A 2 4拘束性之腫瘤抗原肽，以及為在序列編 號：1記載之腫瘤抗原蛋白質之胺基酸序列之第6 9 〇位至第 6 9 8位之腫瘤抗原肽。 因此，具有所謂「含有將序列編號：3記載之胺基酸序 列之1個或以上胺基酸殘基改變之胺基酸序列之全部或一 部份，且可與HLA-A 24抗原結合而被CTL識別」之腫瘤抗原 肽之活性者’全部包含在本發明之腫瘤抗原狀衍生物之範 圍内。 在本發明中，所謂「可與HLA-A24抗原結合而被CTL識 別」係指腫瘤抗原肽衍生物可與HLA-A24抗原結合形成複 合體’該複合體可被CTL識別。 在本發明中胺基酸殘基之「改變」意指胺基酸殘基之取 代、刪除及插入’以胺基酸之取代為較佳。以下雖主要呈

O:\56\56214-910709.ptc 第12頁 518340 _案號 87120187__年月日_修正___ 五、發明說明（9) 體說明胺基酸殘基之取代，但該說明亦適用於胺基酸殘基· 之刪除及插入。 本發明之腫瘤抗原肽衍生物，例如藉著合成候選肽[該 候選肽含有序列編號：3記載之胺基酸序列之1個以上（較 佳一至數^@ )胺基酸殘基用其他胺基酸殘基取代之胺基酸 序列之全部或一部份]，以及測定該候選肽與HLA-A24T充原 之複合體是否可被C T L識別而予以鑑定。 被取代之胺基酸殘基之數目及位置，雖然只要能維持腫 瘤抗原肽活性皆為任意，但由於序列編號·· 3之肽片段為9 個胺基酸殘基’所以較佳在1至數個之範圍内。 狀之合成 | 肽之合成通常按照使用肽化學之方法之進行。該公知之 方法例如文獻[肽合成，Interscience，New York, 1 9 6 6 ;蛋白質，Vol. 2， Academic Press Inc.， New York, 1 9 7 6 ;肽合成，丸善股份有限公司，1 9 75 ;肽合成 之基礎與實驗，丸善股份有限公司，1 9 8 5 ;醫藥品之開發 續篇，第1 4卷，肽合成，廣川書店，1 9 9 1 ]等記載之方法。X 藉HLA抗原拘束性之CTL識別 合成之候選肽與HLA-A24抗原結合後是否可被CTL識別， 例如可以下述之方法調查。 (1)依照 J· Immunol·, 154，p2257，1995 記載之方法，在 自H L A _ A 2 4抗原為陽性之人類單離末梢淋巴球，並於試管 ^ 中添加候選肽以進行刺激之場合，調查在被脈衝輸送該_ 選肽之HLA-A24陽性細胞中，具特異性識別能力之CTL是否 被誘導出。其中，CTL誘導之有無，例如藉用酵素免疫-剛

O:\56\56214-910709.ptc 第13頁 518340 案號 87120187 年 月 曰 修正 五、發明說明（10) 定法（ELISA)等測定CTL與抗原肽呈現細胞反應所產生之種 種細胞刺激素（例如I F N - r )之量而調查。或者藉著測定 C T L對於被51 c r標記之抗原肽呈現細胞之傷害性之方法（η c r 釋出測定法，Int. J· Cancer, 58: ρ· 317, 1994)而調 查。㈤述J則定所用之H L Α - A 2 4陽性細胞，例如為s κ G - I I I a 細胞（J C R B 0 2 3 2 )等一般人可以得到之細胞。 (2)再者，藉著將HLA-A24 cDNA表現載體導入C0S-7細胞 (ATCC No· CRL 1651)及VA-13細胞（理化學研究所細胞銀 行）’將前述候選肽脈衝至所得之細胞，使其與為HL A - A 2 4 拘束性CTL株之KE-4CTL反應，以及測定KE-4CTL產生之種 種細胞刺激素（例如I F N - γ )之量而調查。 如上述之種種測定法之具體例被記載在後述之參考例之 7及8以及實例2中。 又’對於腫瘤抗原肽衍生物之H L A - A 2 4抗原之結合親和 性’藉著該衍生物及被放射同位素標記之標準肽（序列編 號：3 )對H L A抗原之結合之競爭阻礙測定，可以在無細胞 系統中容易地測定（R· T· Kubo等人，J. Immunol ·， 152:3913,1994)。 本發明之腫瘤抗原肽衍生物之長度，只要能與HLA-A24 抗原結合且可被CTL識別，餘則無特別之限定。就本發明 之目的言之，本發明之腫瘤抗原肽衍生物，不僅其自身可 做為肽片段，與HLA-A24抗原結合而在抗原呈現細胞表面 被呈現，而且亦包含在適當的標的細胞内被片段化而提供 適當長度之肽片段之肽衍生物，其中該適當長度之肽片段 含有將序列編號：3記載之胺基酸序列之1至數個胺基酸殘

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基改變之胺基酸序列之全部或 原結合而被CTL識別。 一部份，且可與HLA-A24抗 自身與H L A - A 2 4抗原結合而被呈現之肽片段，以具有8至 2個胺基酸為較佳。亦即，就與胺基酸殘基之取代相關之 肽衍生物言之，例如為i )序列編號：3記載之胺基酸序列 之1至數個胺基酸殘基被取代成其他胺基酸殘基之酸 序列所組成之具9個胺基酸之肽；或者2)含有前述丨）之肽 之全部且為10至11個胺基酸長之肽，或前述丨）之肽之一部 份所組成之8個胺基酸之肽，例如具有所謂「可與hla_a24 抗原結合而被CTL識別」之腫瘤抗原活性之衍生物。

依照本說明書之記載’合成在序列編號：3之胺基酸序 列之任意位置胺基酸被改變之肽，然後依據其做為腫瘤抗 原肽之活性，篩選及獲得目的物腫瘤抗原肽衍生物。 結合至H L A抗原且被呈現之抗原肤之序列有規則性 (motif)，在HLA-A24抗原之場合，8〜11個胺基酸組成之肽 之中’已知從N端算起之第2個胺基酸為笨丙胺酸、路胺 酸、曱硫胺酸或色胺酸，C終端之胺基酸為苯丙胺酸、白 月女酸、異白胺酸、色胺酸或曱硫胺酸（Immunogenetics， 41:178, 1995 ；J. Immunol., 152:p39l3, 1994 ；J. I m m u η o 1 ·， 1 5 5 : 4 3 0 7， 1 9 9 4 )。又，可以得到如此規則性 之胺基酸用保持類似性質之胺基酸取代所得之衍生物亦容 許做為HLA-A24抗原結合性肽。 因此，做為本發明之腫瘤抗原肽衍生物之例子者，例如 為含有序列編號：3記載之胺基酸序列中第2位及/或第9位 (C終端）之胺基酸殘基用其他胺基酸殘基取代而得之胺基

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^ 1列之全部或一部份，且保有所謂「可與HLA—A24抗原 、、’σ 5而被C T L識別」之活性之肽衍生物。 所以，本發明之一實施態樣為提供一種腫瘤抗原衍生 ’其含有序列編號：3記載之胺基酸序列之第2位及/或 皮位之胺基酸殘基用其他胺基酸殘基取代而得之胺基酸 列之全部或一部份，且可與^八^^抗原結合而^^識 在，佳之肽衍生物之中，序列編號：3記載之胺基酸序 f第2位及/或第9位之胺基酸殘基用符合上述規則性之

酸i ΐ殘基取代。'亦即’以含有序列編號：3記載之胺基 之第2位赂胺酸被取代成笨丙胺酸、甲硫胺酸或色 胺^及/或第9位苯丙胺酸被取代成白胺酸、显白 甲硫胺酸而得之胺基酸序列（序列編號4)之全部€ 1。°卩份，且以具有前述活性之腫瘤抗原肽衍生物為較 因 肽衍 或一 再 瘤抗 載之 酸或 原肽 酸被 腫瘤 其他 其含 且可 據前 生物 序列 酸而 ，序 苯丙 衍生 此，在 生物， 部份， 者，依 原肽衍 胺基酸 異白胺 衍生物 取代成 抗原肽 的實施態樣中，本發明提供 有序列編號：4記載之胺m腫瘤 私心妝基酸序列之全部 與HLA_A24抗原結合而被CTL識別。 述之規則性進行胺基酸殘 之較佳例子，例如為取代所得之腫 々贫g a #工★ 巧各有序列編號：3記 之第9位本丙胺酸被取- 得之胺基酸序列之全部代Λ色胺酸、白胺 列編號：3記載之胺基部份之腫瘤抗 胺酸而得之胺基酸序基列\序八列，，2位路胺 T N之全部痠一邬价之 物，或者為此等取代之知人1 2 〇丨伤之 叭夂組合之腫瘤抗原肽

)18340 修正 曰 案號 87120187 五、發明說明（13) 衍生物。 因此，本發明之一較佳實施態樣為提供一種含有序列編 $ · 3記載之胺基酸序列之第9位笨丙胺酸被取代成色胺 =、白胺酸或異白胺酸而得之胺基酸序列之全部或一部 I物且與HLA—A24抗原結合而可被ctl識別之腫瘤抗原肽衍 %又9 ’本發明之另一較佳實施態樣為提供一種含有序列編 =π記載之胺基酸序列之第2位酪胺酸被取代成苯丙胺酸 姓1之胺基酸序列之全部或一部份，且可與HLA-A24抗原 、、、口 5而被CTL識別之腫瘤抗原肽衍生物。 本發明之再一較佳實施態樣為提供一種含有序列編號： 。己 >載之胺基酸序列之第9位之苯丙胺酸被取代成色胺酸、 ，酸或異白胺酸以及第2位之酪胺酸被取代成苯丙胺酸 而传之胺基酸序列之全部或一部份，且可與HLA_A24抗原 結合而被CTL識別之腫瘤抗原肽衍生物。 特佳之腫瘤抗原肽衍生物為含有序列編號：5記載之胺 基酸序列之全部或一部份者。 胃本發明之腫瘤抗原肽衍生物為一種結合至HLA_A24而被 提示之腫瘤抗原肽衍生物，其中HLA_A24為廣泛人類對象 所保有之H L A抗原（例如日本人中6 〇 %保有該抗原）。因此其 可一般性地適用於多數腫瘤患者，而且，由於其可廣泛應 用於發生頻率高之扁平上皮癌，所以可以期待其在做為新 穎抗腫瘤劑上有用。順便一提，扁平上皮癌被認為是人類 癌中最多的癌之一，尤其是食道癌及肺癌之扁平上皮癌已 知對現有的化學療法及放射線療法顯示較高之抵抗性。-

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在i ϊ ί ΐ ϊ ϊ i r ί月之腫瘤抗原肽衍生物在活體及· 因：：：：治療、預防及診斷等種種目的。 一案號 87j^〇i87 五、發明說明（14) 抗原肽衍生物之至少-種做為有效成Σ Γ p “ /〇療或預防為目的而使用之時，將本發明< Μ 瘤抗原肽衍生物之至少_種咬一種以、上^知腫

At i义底μ二原肽專之組合，投與至患者。若將本發明之 = ί預防劑投與至HLA-A24為陽性、且用來獲得 ίΓ Γί ί原肽衍生物之腫瘤抗原蛋白質…性之患 t，則腫瘤抗原肽衍生物將被高密度地呈現至抗原呈 之HLA-A24抗原上，因此對該被呈現之HLA —A24抗原複 具特異性之CTL將增殖而破壞腫瘤細胞。結果能治療 患者之腫瘤或者預防腫瘤之增殖或轉移。如前所述，由於 用來獲得本發明腫瘤抗原肽衍生物之腫瘤抗原蛋白質在食 返癌、肺癌等扁平上皮癌中被廣泛表現，所以本發明之腫 瘤治療劑或預防劑具有所謂適用範圍廣泛之優點。再者， Η述扁平上皮癌對化學療法及放射線療法顯示抗性者多， 藉著併用本發明之腫瘤治療劑可以提高治療效果。又，不 論癌發生部位為何均能治療亦為一大的有利點。 含有本發明之腫瘤抗原肽衍生物之腫瘤治療劑或預防 劑’為了達到細胞性免疫效果，一方面可與佐劑一起投 與’一方面可作成粒子狀之劑型投與。關於佐劑，可以使 用文獻（Clin· Microbiol· Rev·， 7:277-289， 1994)所記 載者。再者，也可以使用將外因性之抗原肽衍生物以高效 率抗原呈現給H L A抗原之製劑，諸如微脂粒製劑、結合·至

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直4呈士 劑等：微米之珠粒之粒子狀製劑、以及與脂質結合之製 靜脈、、主，投與方法，可考慮採用皮内投與、皮下投與、 可視沪、ί等。本發明之腫瘤抗原狀衍生物之投與量，雖然 通 $治療之疾病、患者之年齡及體重等適當地調整，但 ^〇·0 001毫克〜1000毫克，較佳為〇 〇〇1毫克〜1〇〇〇毫 佳為0 · 1毫克〜1 〇毫克，較佳數日至數月投與 f ^ ί二使用本發明之腫瘤抗原肽衍生物能在試管中誘導 几因提不細胞，如此之細胞在腫瘤之治療等上有用。 处此’本發明提供一種在單離自腫瘤患者之有抗原提示 ^ ^細胞之表面上，呈現HLA_A24抗原與本發明之前述 ;留抗原肽衍生物之複合體所形成之抗原呈現細胞。 八本發明又提供一種含有前述抗原提示細胞以做為有效成 为之腫瘤治療劑。 此處「有抗原呈現能力之細胞」，為將能夠呈現本發明 腫瘤抗原肽衍生物之HLA-A24抗原表現在細胞表面之細又 胞，其沒有特別之限制，不過以抗原呈現能力高之樹狀細 胞為特佳。 在調製如此之抗原呈現細胞時，單離來自腫瘤患者且有 抗原呈現能力之細胞，在體外將本發明之腫瘤抗原肽衍生 物脈衝至該細胞，而製作HLA-A 24抗原與前述肽衍生物之 複合體（Cancer Immunol. Immunother·， 46:82, 1998) 。 _ 含有前述抗原呈現細胞以做為有效成分之腫瘤治療劑， 為了使抗原呈現細胞維持安定，較佳含有生理食鹽水、碟 酸緩衝生理食鹽水（PBS)、及培養基等。投與方法例如為

O:\56\56214-910709.ptc 第19頁 518340 _案號87120187_4 t 日 修正 五、發明說明（16) ' 一" 靜脈内投與、皮下投與及皮内投與。若將上述腫瘤治療劑 送回患者之禮内’則在H L A - A 2 4為陽性、且用來獲得本發 明腫瘤抗原肽衍生物之腫瘤抗原蛋白質亦為陽性&之患者X之 體内’特異性CTL將被咼效率誘導，而能夠治療腫瘤並進 一步預防其轉移。 再者，關於本發明之腫瘤抗原肽衍生物在試管内^^用 法，例如可用於下述過繼性免疫療法中。 亦即’就黑素瘤言之’在將患者本人之腫瘤内浸潤之τ 細胞於體外大量培養，然後將其送回患者體内之過繼性免 疫療法中見到治療效果（J· Nat 1. Cancer. Inst.， 86:1159，1994)。又在小鼠之黑素瘤方面，藉著在試管中 用腫瘤抗原肽TRP-2刺激脾細胞，使對腫瘤抗原肽具特異 性之CTL增殖，以及將該CTL投與至移植有黑素瘤之小鼠， 可以見到轉移被抑制（J. Exp. Med·， 185:453，1997)。 此係基於能特異性識別抗原呈現細胞中HL A抗原與腫瘤抗 原肽之複合體之CTL在試管中被增殖之結果。用本發明之 腫瘤抗原肽衍生物在試管中刺激患者末梢血液淋巴球而使 腫瘤特異性CT L增殖後，將該CT L送回患者所組成之腫瘤治 療法被認為有用。

因此，本發明又提供一種能特異性識別HLA-A24抗原與 本發明之前述腫瘤抗原肽衍生物之複合體之細胞傷害性T 細胞。 再者，本發明提供一種含有前述細胞傷害性T細胞以做 為有效成分之腫瘤治療劑。 該治療劑，為了維持CTL安定，較佳含有生理食鹽水、

O:\56\562l4-910709.ptc 第20頁 518340 ^^^案號 87120187_年 月 日 修正 五、發明說明〜 "一"' " $酸緩衝生理食鹽水（PBS)及培養基等。投與方法例如為 ^ =内投與、皮下投與及皮内投與。藉著將上述治療劑送 二二者之體内，在HLA — A24為陽性、且用於獲得本發明腫 $几原肽衍生物之腫瘤抗原蛋白質亦為陽性之患者體内， 、、λ j促進CTL對腫瘤細胞之傷害作用，破壞腫瘤細胞，而 /σ療腫瘤並預防其之轉移。 一^一— 又’關於將本發明之腫瘤抗原肽衍生物用於腫瘤之診斷 面三例如按照一般方法調製對該腫瘤抗原肽衍生物之抗 者 1需要可予以適當地標記，然後用其檢定疑似腫瘤患 =檢體（例如血液、腫瘤組織等）中抗原之存在，藉此& 瘤之，無二再者，藉著用本發明之腫瘤抗原肽衍生‘ $為診斷藥，檢定前述血液或腫瘤組織等之檢體中抗 ' 存在，可以診斷腫瘤之有無。 f發明又提供一種治療、預防或診斷腫瘤之方法，其使 述之腫瘤抗原肽衍生物，呈現該腫瘤抗原肽衍生物之 J Λ二^現」細胞’以及特異性識別該腫瘤抗原肽衍生物與 _ \抗原之複合體之細胞傷害性Τ細胞。再者，本發明 之腫瘤抗原狀衍生物可做為本技術領域研究用試藥。 ^下’雖然藉著實例具體說明本發明，但 等實例所限。 &落 I考例.蛋白質cDNA之選殖以及HLA-A24抽 -~m lAii胞株之細胞傷害性τ細胞（ctl)之谨筮 依照中尾等人所著之Cancer Res·, 5 5 :4248-42 5 2 (1 9 9 5 )之記載’從患者之末梢血液單核球細胞構築針對組

O:\56\56214-910709.ptc 第21頁 518340 案號 87120187 年 月 曰 修正 五、發明說明（18)

織型被分類為爲平上皮癌之食道癌細胞株KE-4之CTL，| 將其命名為KE-4CTL而用於實驗。再者，依照前述中尾等 人之報告，訂定KE-4之HLA第I類分子之類型，確認為 HLA-A2402 、-A2601 、-B54 、 -B60 、-Cwl 及-Cw3 〇 2· HLA - A 2 6 0 1 cDNA 以及 HL A - A2 40 2 cDNA 之調製 依照中尾等人所著之Cancer Res.， 55 ·. 4248-42FP · (1 9 9 5 )之記載，從KE-4製作將HLA-A2 6 0 1之cDNA插入表現 . 載體pCR3 (INVITROGEN公司製）之重組質體。又，藉著同 樣的方法製作關於HLA-A24 0 2之重組質體。 3· 來自KE-4之cDNA庫之事作 使用來自KE-4之mRNA精製系統（法瑪西亞生物科技公司·_ 製）並依照隨附之方法說明，進行全RNA之分離以及聚（A) + mRNA藉募（dT)管柱之調製。使用來自mRNAiSuperScrip1： 質體系統（GIBCO BRL公司製）並依照隨附之方法說明，製 作將N 〇 t I接頭及S a 1 I接頭連結至兩端所成之c j) n A後，將該 cDNA藉枯合連結至表現載體之質體pSV-Sp〇RT B R L公司製）之限制酵素n 〇 t I及S a 1切斷部位而得到重組、 質體。使用基因脈衝裝置（Bi〇一Rad公司製）並在25 " F、 - 2.5kV之條件下’藉電氣脈衝導入大腸菌之eiectr〇max DH10B/p3TM細胞（GIBCO BRL公司製）中，在含安比西林 (Ampicillin， 50微克/毫升）之培養基（1%細菌蛋白 、 0.5°/。酵母菌萃取物、〇 5%“(：1，13117.3)中選擇已導入重〇 組質體之轉形體。 i,_堕瘤抗原蛋白皙I因之餘撰 如下述’從上述3所示之轉形體之約丨〇 〇個之匯集份囱收

O:\56\56214-910709.ptc 第22頁 518340 年 修正 月 曰 案號 87120187 五、發明說明（19)

重組質體DMA。亦即，在饋入含安比西林（5〇微克/毫升）之 匕8培養基之96穴ϋ形底顯微平皿中，每穴加入1〇〇個轉形體 並培養後，將其一部份移至另一每穴饋入〇· 25毫升TYGPN 培養基（F· Μ· Ausulbel 等人編，CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc·)之96 穴U 形底顯微一平孤中並於37 t培養48小時，其餘LB培養顯 微平皿則被凍結保存。在TYGPN培養基中培養之轉形體之 重組質體DNA，在顯微培養皿中藉鹼溶解法（F. M. Au sub el 等人編，CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY ， John Wi 1 ey & Sons, I nc·)調製。將用異丙醇沉澱所回收 之重組質體DNA懸浮在含5〇a1之20 ng/ml RNase之10 mM Tris，1 mM EDTA， pH 7·4 溶液中。 如下述，藉lipofectin法將KE_4 cDNA之重組質體與 HLA-A 2 6 0 1 cDNA之重組質體雙重轉染至纖維母細胞株之 V A - 1 3細胞中（理化學研究所細胞開發銀行，A η n. M e d.

Exp. Biol. Fenn·， 44:242-254， 1966)。亦即，將VA-13 細胞以每穴7 0 0 0個之量加到9 6穴平底顯微平jnL中，並在含 100^1 10% FCS之PRMI 1 6 40培養液中培養2日。使用 1 ipof ect in (GIBCO BRL公司製）試藥，將轉形體約100個 份之KE-4 cDNA之重組質體25 // 1，參考例之2所示之 HLA-A 2 6 0 1 cDNA之重組質體1〇# 1 ( 2 0 0 ng)及稀釋成35倍 之lipofectin試藥35 //1之混合液70 //1中之30 加到 VA-1 3細胞中以進行雙重轉染。轉形體平均接種2點。5小 時後，將含2 0 0 // 1 1 0 %FCS之培養液加到該轉形體中，於 3 7 °C培養7 2小時後，除去培養液’每穴加入1 0 0 0 0個 ’

O:\56\56214-910709.ptc 第23頁 518340 _案號 87120187 五、發明說明（20) 年 修正 KE-4 CTL 並在含1 〇〇 μ 培養2 4小 養上清液 株抗體吸 養液中於37 °C KE-4 CTL 在培 類I F N - τ鼠單 化抗體，並用牛血清白 培養上清液中之IFN- γ 之抗人類IFN-酸酶標記之抗 之對硝基苯基 r兔多株 兔免疫球 磷酸鹽反 10% FCS 時。回收 中產生之 附在9 6穴 蛋白封阻 結合至抗 抗體與之 蛋白山羊 應，加入 與25單位/毫升il-2之培 培養液，用ELISA法測定 1 F N — T量。亦即，將抗人 顯微培養皿上以做為固層 非特異性結合後，使前述 體。繼而使做為檢出抗體 結合，並再結合被鹼性磷 抗體後，與做為發色受質 等量的IN NaOH使反應停 止後，測定吸光度（ 4 0 5 nm)。藉著將其與用標準IFN_ r所 得之值比較而定量。 關於被認為IFN_ τ產量高之4群，使用與其相當之被 K E - 4 c D N A之重組質體轉形之被凍結保存之轉形體約1 〇 〇個 之匯集物，如下述再進行篩選。亦即將轉形體之匯集物接 種在含安比西林（50 //g/ml)之LB瓊脂培養基之平皿上而 得到純株，每群2 0 0個純株，合計8 0 0個純株，在每穴之轉 形體為1種之條件下用與上述同樣之方法培養，而調製 KE-4 cDNA之重組質體DNA。再用與上述同樣之方法，將 KE-4 cDNA 之重組質體與HLA-A 26 0 1 cDNA之重組質體轉染 至V A - 1 3細胞，繼而進行與K E - 4 C T L之混合培養’將 KE-4CTL反應而產生之培養液中之IFN- 7予以定量並選擇 陽性之質體。藉著該操作選擇KE-4 cDNA重組質體純株， 並被命名為6 D I。關於6 D I ，再一次重覆同樣的操作，用與 上述同樣的方法定量KE-4CTL細胞產生之IFN- τ量。將該

結果示於以下之表1中。

O:\56\56214-910709.ptc 第24頁 518340 ----- 案號87120187_年月曰 壯- 五、發明說明（21) 標的細胞 KE-4CTL產生之IFN- r之量 _________( pg/m 1 )_ V A - 1 3細瓦 〇 VA—1 3 細胞+ HLA-A26 0 1 1 · 8 VA—13 細胞+ 6DI 4. 3 VA—13 細胞+ HLA-A2 6 0 1 + 6DI 24. 0 VA—13 細胞+ HLA-A 0 2 0 11) 〇· 9 田胞 + HLA - A0 2 0 1 + 6DI1)_hi_ ⑩ 1 ):為了比較，轉染不同類型之HLA之場合 (轉染之DNA 量，HLA-A2601及HLA-A0201 為200 ng ，6DI 為 1 〇〇 ng之時之數據） 方氏雜交解析腫瘤抗原蛋白質基因之表現 從種種細胞株，用RNAzol B (TEL-TEST， INC·公司製） · 調製RNA。於甲醯胺、曱醛存在下使5 rnA變性，並進_ 行遭ϋ曰糖電泳後’轉寫於Hybond-N +尼龍膜（Amersham公司 製）上並固定。至於正常組織之RNA，使用固定mRNA之市售 膜（CL0NTECH公司製）。藉著muitiprime dna標記系統 (Amersham公司製），將在參考例之4中選殖之重組質體“丨· 之插入序列部分用32 P標記而製作D N a探針，依照公知之方 法（中山等人著，生物實驗圖解基因解柄夕其與 Ρ· 148-151，秀潤社’ 1 99 5年），使其與膜/之RNA雜交-

518340

案號 87120187 五、發明說明（22) ，二葬:自動放射照相圖檢測出本發明之腫瘤抗 因之mRNA。接下來，將用於檢測其 、蛋白貝基 二美护舻細^广由去、推祝列基因之mRNA之膜在〇· 5%十 -肌動蛋白做為探針，，同樣的方法在進7北中艮常 出mRNAw做為内部標準。將結果示於圖1中。從 在:二f !明之腫瘤抗原蛋白質基因^^ ί 5 kbf® υ 織中被廣範圍地表現，全長為約 R ^腫瘤抗原蛋白質株之選殖以万蛤其 座列之決定 --- 將上述3所示之來自KE-4之CDNA庫接種於含安比西林（50 “ g / m 1)之L B瓊脂培養基之皿上而得到純株後，依照 Hybond-N+尼龍膜（Amersham公司製）隨附之使用方法，轉 寫純株之DNA並固定之。使用與在參考例之5所用者相同之 6 D I ’在與參考例5同樣之條件下進行雜交及自動放射照 相’然後選擇具有腫瘤抗原蛋白質基因2CDNA被插入之重 組質體之轉形體純株。接下來，從被選擇之複數個純株回、 收重組質體’用限制酵素N 〇 t I及S a 1 I處理後，藉瓊脂糖_ 電泳確認被插入之cDNA之長度。選擇約2. 5 kb之cDNA被插 入之重組質體，並將其命名為K3。該質體κ 3，藉著使用染 料去氧終結子循環定序（Dyej)eoXy Terminator Cycle Sequencing )套組（帕金艾瑪公司製），決定cDNA部分之鹼# 基序列。將被決定之鹼基序列示於序列表之序列編號：2 中。該cDNA之全長為2527鹼基對。被序列編號：2之鹼基 序列編碼之胺基酸序列（8 〇 〇個胺基酸）被示於序列編號·： 1

O:\56\56214-910709.ptc 第26頁 518340 ____案號87120187_年月日 修正 五、發明說明（23) 中。 解析之結果，序列編號2之驗基序列，與來自黑素瘤之 已知腫瘤抗原蛋白質之基因非全然相異之基因。使用WWW E n t r e z資料庫進行序列編號：2所記載之鹼基序列之檢 索，結果該鹼基序列之一部份當藉WashU-Merck EST Pro j ect屏讀時，顯示與被登錄在GENBANK中之機能不明之 3種基因序列（即登錄編號為R89 1 6 3、R 6 2 8 9 0及R0 0 0 2 7者） 具9 0 %以上之高相同性。R 8 9 1 6 3號相當於序列編號：2之第 1893〜2267號，R62890相當於第2018〜2389號，R00027相當 於第2 0 2 4〜2 5 1 0號。但是，該3個序列由於係屬序列編號：

2記載之驗基序列之起始密碼子之3 ’側驗基序列，所以無 法決定胺基酸序列。 再者，在將正常人類組織（末梢血液淋巴球）之cDNA庫 (〇16(：0 6眈公司製）與前述同樣選殖之場合，插入約2.5 kb之cDNA之重組質體被選殖，決定該cDNA之驗基序列，與 序列編號：2之驗基序列之第8 1 2位（在正常人類組織中第 812位為T)不同外其餘皆相同之cDNA被單離。此顯示序列 編號：2記載之含有編碼腫瘤抗原蛋白質之基因之全長基 因，在癌細胞及正常人類組織中，為大致相同之基因。

接下來用與上述4 ·同樣的方法，將插入有新穎腫瘤抗原 蛋白質基因之cDNA之重組質體K3，與插入有HLA-A2601之 c D N A 之重組質體雙重轉染至V A - 1 3細胞所得之細胞做為標 的細胞，藉上述4·之方法定量KE-4CTL反應所產生之ιρί T之量。該結果被示於以下之表2中。

O:\56\56214-910709.ptc 第27頁 518340 案號 87120187 曰 修正 五、發明說明（24) 表2 標的細胞 VA-13 細胞+HLA-Α2601+Κ3 ΥΑ- 13 細月包+ HLA-Α 0 2 0 1 2) +Κ3 KE-4CTL 產生之IFN- γ 量η (Pg/m 1 ) 1439 10 1) :對抗各個HLA被轉染至VA-13細胞所得細胞之KE-4CTL 所產生之IFN- τ量被扣除。 2) :為了比較，轉染不同類型之HLA之場合 (轉染之DNA 量，HLA - A2 60 1 及 HLA-A02 0 1 為 2 0 0 ng，K3 為 100 ng之時之數據）。 從以上結果，確認所得之cDN A編碼腫瘤抗原蛋白質。 腫瘤抗原月女之鑑定 從在上述4.中插入有選殖之新穎腫瘤抗原蛋白質基因之 部分cDNA之重組質體6DI，利用千-序列用删除套組 (Kilo-Sequence用Deletion Kit，寶酒造公司製）並依照 隨附之方法說明，得到腫瘤抗原蛋白質基因之cDN A被刪除 各種長度之質體。將此等質體導入大腸菌之electro max DH1 0B/p3TM細胞（GIBCO BRL公司）中，在瓊脂培養基之皿上 培養，然後任意選擇50個純株。從該純株調製質體DNA， 藉著施行電泳，選擇5個有適當長度之質體之純株。 藉著上述4所記載之方法，將111^^2 6 0 1 〇0^與前述質體 DNA雙重轉染至VA-13細胞，繼而將該轉形體與KE-4CTL混 合培養，依照4 .所記載之方法，定量培養液中之I F N _ r

O:\56\56214-910709.ptc 第28頁 518340 J號一 87120187 年_月 曰 修正 五 '發明說明（25) 量。其結果為在序列編號：2之驗基序列之2 2 5 3位以下缺 失之質體之轉形體中，未見到來自KE-4CTL之IFN-r誘導 活性。因此，預測在具序列編號：1之胺基酸序列第7 3 9位 近旁以下之序列之肽中，有來自KE-4CTL之IFN-r誘導活 性。 接下來，將自序列編號：1之胺基酸序列之7 3 0位， 每次各移動3個胺基酸而合成2 1種1 0個胺基酸之肽。除了 將此等肽脈衝至轉染有HLA-A26 0 1 cDNA之VA-13細胞中而 進行抗原提示以外，用與前述同樣的方法定量培養液中之 I F N - 7 。結果在有序列編號：1之第7 3 6位〜7 4 5位 ( 7 3 6〜74 5 )、第748位〜7 57位（ 74 8〜7 57 )或第7 84位~7 93位 (7 8 4〜79 3 )之胺基酸序列之肽中，可見到IFN- r誘導活 性。 再者，就此3種肽而言，為了鑑定具有更強IFN- r誘導 活性之肽，合成將N終端或C終端截短1個胺基酸所成之9個 胺基酸殘基之肽，並同樣地測定I F N- r誘導活性’結果見 到序列編號：1之第7 3 6位〜744位（ 736〜744 )、第749位〜757 位（ 7 4 9〜7 5 7 )或第78 5位〜7 9 3位（ 78 5〜7 9 3 )之胺基酸序列之 肽具較強之I F N - r誘導活性。將其結果示於表3中。. Φ

O:\56\56214-910709.ptc 第29頁 518340 _案號87120187_年月日 修正 五、發明說明（26) 表3 被脈衝之細胞 肽 KE4-CTL細胞產生 之 I F N - r 量（D g / τη j/ VA-13/A26010 Γ736〜744 j 2 0 3 VA - 13/A 0 2 0 12) Γ736〜744 」 44 s VA-13/A2601 Γ 749 〜75 7」 183 VA- 13/A 0 2 0 1 Γ 749 〜75 7」 89 VA-13/A2601 Γ 7 85 〜79 3 j 394 VA-13/A 0 2 0 1 「785〜793 , 102 1) 將HLA-A 2 6 0 1 cDNA轉染至VA-13細胞之場合。 2) 將不同的HLA - A0201 cDNA轉染至VA-13細胞以做為對日、忍 之場合。 表3顯示此等肽具有H L A - A 2 6拘束性腫瘤抗原肽之機能。 接下來，如下述鑑定HLA-A26拘束性之腫瘤抗原肽。 亦即，結合至H L A抗原分子而被呈現之抗原肽之序列有 規則性（m 〇 t i f )，在H L A - A 2 4之場合，8〜1 1個胺基酸組成之 肽之中，已知從N終端算起之第2位胺基酸為苯丙胺酸、酪 胺酸、曱硫胺酸或色胺酸，C終端之胺基酸為苯丙胺酸、 白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸（Immunogenetics， 41:178, 1995 ；J. Immunol., 152:p3913, 1994 ；J.

Immunol·, 155:4307， 1994) o 其中，從序列編號：1記載之胺基酸序列合成與上述規 則性相當之第6 9 0〜6 9 8位（6 9 0〜6 9 8，序列編號：3 )之部分

O:\56\56214-910709.ptc 第30頁 518340 案號 87120187 年月曰 修正 五、發明說明（27) 組成之狀。然後將該狀脈衝至轉染有HLA-A2402 cDNA之 VA-1 3細胞中，用與前述同樣的方法調查來自KE-4CTL之 1 F N - r誘導活性。將結果示於表4中。 表4 被脈衝之細胞 肽 ΚΕ4-CTL細胞產生 之IFN- r 量（Ds/ml) VA- 1 3 Γ 6 9 0 〜6 9 8 j 157 VA-1 3/A24 0 21) Γ690〜698 j 269 νΑ-ΐ3/Αη?,ηι2) 「6 9 0 〜6 98 , 166 1) 將HLA-A24 0 2 cDNA轉染至VA-13細胞之場合。 2) 將不同的HLA-A0 2 0 1 cDNA轉染至VA-13細胞以做為對照 之場合。 表4顯示「6 9 0〜6 9 8 (序列編號：3 )」之肽具有做為腫瘤 抗原肽之機能。

8 > 藉腫瘤抗原狀從太梢血液淋巴球誘導C T L 使用在上述7 ·中所示之腫瘤抗原肽，在試管中刺激獲得 _ K E - 4之癌患者之末梢血液淋巴球，以檢討是否能誘導抗原 特異性CTL。所用之腫瘤抗原肽為在前述參考例之7·所得 之具有「736〜744」、「749〜757」或「690〜698」序列之 肽。將藉非克爾法從來自前述癌患者之末梢血液分離淋巴 球並將其凍結保存之末梢血液淋巴球予以賦活，然後移至 24穴之平皿中，每穴約2 X 106個細胞，在含有1〇 % FCS及

O:\56\56214-910709.ptc 第31頁 518340 ----案號87120187_年月日 倏正__ 五、發明說明（28) " IL 一 2 (1〇〇 U/ml)之PRMI 1640培養基中培養。將前述腫瘤· 抗原肽以1 0 // g/m 1之量加至培養液中，並刺激末梢血液淋 巴球。一星期後，同時加入經X光照射（5 〇 G y )之1 X 1 05個末 梢血液淋巴球以及1 〇 # g/m 1之前述腫瘤抗原肽，同時進行 2次之刺激。再一星期後，同樣重覆3次之刺激。 就具「7 3 6〜744」或「74 9〜75 7」序列之肽言之，IT次 刺激算起1星期後，回收末梢血液淋巴球，然後依照]).D. Kharkevitch 等人所著之 Int. J· Cancer，W :3 1 7 ( 1 9 9 4 ) 記載之方法，用以51Cr標記之KE-4、以及HLA-A部位為 A 2 4 0 2及A2之食道癌細胞株KE-3做為標的 傷害活性。將結果示於表5中。 細胞 ，測定細胞 € 表5 效果細胞 標的細胞 傷 害活性（°/〇 ) 用「7 3 6〜7 4 4」刺激 KE-4 22. 1 末梢血液淋巴球 KE-3 3. 7 用「7 49〜7 5 7」刺激 KE - 4 35. 9 末梢血液淋巴球 KE-3 24. 2 以具「7 3 6〜7 44」之序列之肽刺激之場合，雖然K E - 4被 強烈傷害，但做為陰性對照之KE-3未被傷害，此顯示KE-4 特異性CTL被誘導出。再者，以具「749〜7 5 7」之序列之肽Ο 刺激之場合，雖然見到對K E - 3之非特異性細胞傷害活性， 但見到對KE-4有更強之細胞傷害活性，此顯示KE-4特異性 CTL被誘導出。 -

O:\56\56214-910709.ptc 第 32 頁 518340

就具「6 9 0〜6 9 8 (序列編號：3 )」序列之肽言之 攸ό二又 刺激异起1星期後，回收末梢血液淋巴球，並在含 10%FCS、50% AIM-V (GIBCO BRL 公司製）及 IL — 2 (1〇〇 U/ml)之PRMI- 1 64 0培養基中繼續培養。然後依照與前述 同樣之方」去，用以51Cr標記之KE-4以及VA-13做為標的細 胞’測定細胞傷害活性。再者，從hla-a部位為A24h 物之健康人之末梢血液分離出淋巴球，用同樣的方法並 以51Cr標記之KE-4、以及HLA-A部位為A2 6 0 1之類似物之肺 癌細胞株QG-5 6細胞做為標的細胞，測定細胞傷害活。 將結果示於表6中。

表6 --m田胞__標的細胞 用「690〜698」刺激 KE-4 癌症患者末梢血液淋巴球 V A - 1 3 用「690〜698」刺激 KE-4 健康人末梢血液淋巴玻__qg- 56 藉著用具「6 9 0〜6 9 8 (序列編號：3 )」序列之 . 患者末梢血液淋巴球及健康人末梢血液淋巴球，、激癌症 對做為陰性對照之V A 1 3細胞及q g 5 6細胞具非特里可見到 害活性，但對KE-4具更強之細胞傷害活性。以^性細胞傷 示K E - 4特異性C T L被誘導出。 之結果顯‘

O:\56\56214-910709.pt 第33頁 518340 _案號87120187_年月曰 修正_ 五、發明說明（30) 實例1 腫瘤抗原肤衍生物之合成 如前述，結合至H L A抗原分子而被提示之抗原肚之序列 有規則性（mot i f )，在HLA-A24之場合，8〜1 1個胺基酸組成 之肽之中，已知從N終端算起之第2位胺基酸為苯丙胺酸、 酪胺酸、曱硫胺酸或色胺酸，C終端之胺基酸為苯丙胺 酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或曱硫胺酸 (Immunogenetics， 41:178， 1995 ; J. Immunol·， 152:p3913, 1994 ;J· Immunol·， 155:4307, 1994)〇 關 於在前述參考例之7.及8.中被鑑定為HLA-A24拘束性腫瘤 抗原肽之「6 9 0〜6 9 8 (序列編號：3 )」，將按照前述規則性 取代胺基酸之肽衍生物之胺基酸序列示於序列編號：4 中 〇 如此，依據前述之規則性，將序列編號：3記載之胺基 酸序列所組成之HLA-A24拘束性腫瘤抗原肽之第2位之胺基 酸殘基及/或第9位之胺基酸殘基予以改變，而作成種種腫 瘤抗原肽衍生物。 其之一例被示於下文。 a ) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp b ) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu c) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile d) Glu-Phe-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Phe e) Glu-Phe-Arg-Gly-Phe-Thr-Gin-Asp-Trp 此等肽，用進階化學科技公司（Advanced Chemtech社） 之MPS 3 5 0藉Fmoc法合成，之後藉HPLC精製（使用YMC - Pack 0 D S - A S Η - 3 6 3 - 5管柱）。精製純度皆在9 5 %以上。 '

O:\56\56214-910709.ptc 第34頁 I « 518340 _案號 87120187_年月日_修正 _ 五、發明說明（31) 肽衍生物之合成方法，以 (1)〇111-丁71'-人『运-〇17-？]16-1[111'-〇111-八30-116(序列編號： 5)、（2)6111-了71'-八厂运-617-？116-1']1]：-6111-八3口-乙611(序列編 號：6)及（3)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp(序 列編號：7 )為例，被詳述於下文。 、 (1) Glu_Tyr-Arg-Glv-Phe-Thr-Gin-Asp- lie(序列編號 * 5)之合成 · 樹脂係使用Fmoc - Ile-Alko樹脂（0.62 mmol/g、篩號 1 0 0 - 2 0 0 )。使用該樹脂1 〇 〇 mg，依照後述之時間表1 (表7 ) 開始合成。依次偶合Fmoc - Asp(OtBu) - OH 'Fmoc-Gln-OH、 F m 〇 c - Th r (t Bu ) -0 Η、F m oc - Ph e- OH、F m 〇 c - G 1 y - OH、 丨·

Fmoc-Arg(Pmc)-OH 、Fmoc-Tyr(tBu)-OH 、Fmoc-Glu(OtBu) -0 H。偶合後進行到時間表之步驟1。結果得到肽樹脂。 將2 m 1試劑K ( 5 %酚、5 %硫茴香醚、5 % H2 0、2 · 5 %乙烷 二硫醚/TFA溶液）加到該肽樹脂中，於室溫反應2· 5小時。 於冰冷卻下將1 〇 m 1乙醚加到反應液中並攪拌1 〇分鐘，過 濾後用1 0 m 1乙醚洗淨。將1 〇 m 1 乙酸水溶液加到濾出物 · 中並攪拌3 0分鐘後，濾出樹脂並用4 m 1 乙酸水溶液洗 _ 淨。將濾洗液凍結乾燥後，將所得之粗製肽溶於乙酸水溶 液，注入預先用0 · 1 %TF A水溶液平衡之逆相系統充填劑 YMC - Pack 0DS - A SH - 3 6 3 - 5 管柱（30φχ2 5 0 mm)，管柱用 0· 1%TFA水溶液洗淨，於2 0 0分鐘期間使乙腈濃度增加至 > 2 4 %，並用7 m 1 / m i η ·之流速溶出。於A 2 2 0 n m監測溶出 液，收集含有目的物之溶出份並予以；東結乾燥，得到 G1u-Tyr-Arg-G ly-Phe-Thr-GIn-Asp-I1e 47· 8 mg。 ·

O:\56\56214-910709.ptc 第35頁 518340 案號 87120187 曰 修正 五、發明說明（32) 戶斤得之 Glu - Tyr-Arg - Gly - Phe - Thr-Gln - Asp - lie，使用 逆相系統充填劑 YMC-PACK ODS-AM AM- 3 0 3 管柱（4.6^x250 mm)，在藉含0%至60%之0.1%TFA之乙腈之直線濃度梯度溶 出法之分析中，顯示滯留時間為1 9. 3分鐘，該胺基酸分析 值及質量分析值與理論值一致。 胺基酸分析 加水分解：1 %酚/ 6 N 鹽酸水溶液，於1 1 0 °C進行2 4小時； 分析法：茚三酮；* :標準胺基酸；（）内：理論值

As X 0· 94 (1) Th r 0. 91 (1) G1 X 1 . 94 (2) G1 y 0. 99 (1) *1 1 e :1 .00 (1 Ty r 0· 93 (1) Ph e 0· 98 (1) A r g 0· 95 (1) « 質量分析（FAB) : [M + H]+ : 1128 時間表1 步驟 時間（分） X處理次數

1 . (洗淨）DMF 1.2 ml 1 X 2. (脫保護） 50%六氫吡啶/DMF 12 X 3. (洗淨）DMF 1.2 ml 1 X ϋ國圓_画|| 1 圓_IB腿驪隱1 III _l層圓Hill O:\56\56214-910709.ptc 第36頁 518340 案號 87120187 年 月 曰 修正 五、發明說明（33) 4·(偶合）各胺基保護胺基酸（5當量）/NMP 溶液0.9 ml，DIC (5 當量）/NMP 溶液0.3 ml 30 X 1 5·(洗淨）DMF 1· 2 ml 1x2 6·(偶合）各胺基保護胺基酸（5當量）/ΝΜΡ 溶液 0.9 ml，DIC (5 當量）/ΝΜΡ 溶液 0.3 ml 30 X 1 7.(洗淨）DMF 1.2 ml_ 1 χ 4 — (2) Glu-Tvr-Arg-Glv-Phe-Thr-Gin-Asp-Leu(序列編號： 6 )之合成 如同前述之（1)，使用Fmoc-Leu-Alko樹脂（0.54 mmol/g 、篩號1〇〇-200)100 mg ，依次偶合Fmoc-Asp(OtBu) -OH 、Fmoc-Gln-〇H 、Fmoc-Thr(tBu)-OH 、Fmoc-Phe-OH 、 Fmoc-Gly-OH ' Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-0H、 Fmoc_Glu(OtBu) -OH，之後進行脫保護。將所得之粗製肽 溶於乙酸水溶液，注入預先用〇. 1 %TFA水溶液平衡之逆相 系統充填劑 YMC - Pack ODS-A SH - 3 6 3- 5 管柱（30^x250 mm)，管柱用〇· 1%TFA水溶液洗淨，於2 0 0分鐘期間使乙腈 濃度增加至25%，並用7 ml/min.之流速溶出。於A220 nm 監測溶出液，收集含有目的物之溶出份並予以凍結乾燥， 得到Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gin-Asp-Leu 52.5 mg 。 所得之Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gin-Asp-Leu，使用 逆相系統充填劑YMC - PACK 0DS - AM AM- 3 0 3 管柱（4. 6 p x2 5 0 mm)，在藉含〇%至60 %之〇· 1%T FA之乙腈之直線濃度梯度溶 出法之分析中，顯示滯留時間為1 9 · 6分鐘，該胺基酸分析 值及質量分析值與理論值一致。 -

O:\56\56214-910709.ptc 第37頁 518340 _案號87120187_年月日__ 五、發明說明（34) 胺基酸分析 · 加水分解：1%酚/6N 鹽酸水溶液，於1 1 0 °C進行24小時； 分析法：茚三酮；* :標準胺基酸；（）内：理論值 Asx ： 0. 97 (1 )

Thr : 0. 94 (1) _ G lx : 1· 98 (2)

Gly ： 1. 02 (1 ) · *Leu : 1. 00 ( 1)

Tyr : 0. 94 (1 )

Phe ： 1. 00 (1 )

Arg : 0· 97 (1) φ 質量分析（FAB) : [Μ+Η]+ ·· 1 128 (3) Glu — Tvr — Arg — Gly-Phe — Thr — Gin — Asp — Trp(序歹編號： 7)之合成 如同前述之（1)，使用Fmoc - Trp(Boc) - Alko樹脂（0· 65 mmol/g、筛號 100-200)100 mg，依次偶合Fmoc-Asp(OtBu) -OH 、 Fmoc-Gin-OH 、Fmoc-Thr(tBu)-0Η 、Fmoc-Phe-OH 、 F m o c - G 1 y - 〇 H、F m o c - A r g ( P m c ) - 0 H、F m o c - T y r ( t B u ) - 0 H、 Fmoc-Glu(OtBu) -OH，之後進行脫保護。將所得之粗製肽 溶於乙酸水溶液，注入預先用〇· 1%TFA水溶液平衡之逆相 系統充填劑 YMC-Pack 0DS - A SH-3 6 3- 5 管柱（30 p x250 mm)，管柱用〇· 1%TFA水溶液洗淨，於2 0 0分鐘期間使乙腈❶ 濃度增加至26%，並用7 ml/min.之流速溶出。於A220 nm 監測溶出液，收集含有目的物之溶出份並予以凍結乾燥， 得到Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gin-Asp-Trp 14.0 mg·。

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、，所得之Glu-丁yr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp ，使用* 逆相系統充填劑 YMC-PACK 0DS - AM AM - 3 0 3 管柱（4 :)’在藉含〇%至6〇%之〇.1%TFAi乙腈之直線濃度梯声/ 去之分析中，顯示滯留時間為2 〇 . 7分鐘，該胺基H 1 (無法檢出丁 rp)及質量分析值與理論值一致。 刀斤 2水分解：1 %酚/ 6 N鹽酸水溶液，於1 1 0 °c進行2 4小時· 刀析法·印三酮；* :標準胺基酸；（）内：理論值 、’

Asx : 〇· 67 (1)

Thr : 0· 96 (1)

Glx : 2·〇〇 (2) G1Y : 1. 02 (1) ψ

Tyr : 〇·96 (1) *phe : 1 · 〇〇 (1 )

Arg : 1· 01 (1) 質量分析（FAB) : [M + H]+ : 1202 ^——i瘤抗原肽衍生物之活目彳宏 使用在實例1中做成之肽，藉著調查參考例7記載 IFN- 7誘導活性或參考例8記載之CTL之誘導能力， 白此等肽具有做為腫瘤抗原肽之機能。以下為其—例^明 使用在前述實例！合成之3種腫瘤抗原肽衍生^ 1 ° 號：5〜7 )，在試管中以與參考例8相同之方法，用： H L A - A 2 4為陽性之健康人末梢血液淋巴球，並檢日: 導CTL。從藉肽3次刺激算起丨星期後，回收末梢血=誘 球’用表現腫瘤抗原之HLA-A24陽性ΚΕ-4細胞做為標

518340 案號 87120187 曰 修正 五、發明說明（36) 胞，用與參考例之4 ·之方法測定末梢血液淋巴球反應所產 生之IFN-τ量。再者，用HLA-A24為陰性之VA-13細胞做為 標的細胞，以同樣方法測定末梢血液淋巴球反應所產生之 I FN- 7量，以做為背景值。藉著將針對ΚΕ-4細胞所產生之 IFN- 7量扣除針對背景之VA-13細胞所產生之IFN- 7量， 算出抗原特異性CTL活性。將結果示於圖2中。可以H藉 著序列編號：5、序列編號：6及序列編號：7之各肽衍生 物，CTL被誘導出。更特定而言，序列編號：5之腫瘤抗原 肽衍生物顯示強IFN- r產生誘導活性。 又，使用市售之SKG-II la細胞（JCRB 0 2 3 2 )(其係做為腫 瘤抗原及H L A - A 2 4陽性標的細胞之K E - 4細胞之代表），以與 上述相同之方法進行活性測定。 產業上之利用可能性 本發明提供之新穎腫瘤抗原肽衍生物可用於廣範圍腫瘤 之預防、治療或診斷。 序列表中之可變動内容（free text) 序列編號：4記載之胺基酸序列之第2位之胺基酸為苯丙 胺酸、酪胺酸、曱硫胺酸或色胺酸，第9位之胺基酸為苯 丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或曱硫胺酸。

O:\56\56214-910709.ptc 第40頁 518340 案號 87120187 年 月 曰 修正 五、發明說明（37) 序列表 <110〉 ITOH, Kyogo <12〇> 腫瘤抗原肽衍生物 ______________ _________

<130> 661092 <160> 7 <210> 1 <211> 800 <2l2> PRT <213> X

<400> 1 ^

Met Gly Ser Ser Lys LysHis Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ala Gly Thr ， 5 Ϊ0: v 15

Thr Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala .Thr Glu Gin Pro Pro Arg His 20 25 30

Arg Glu His Lys Lys His Lys His Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 ;

Gly Gly Glu Arg： Arg Lys Arg Ser *Arg Glu Arg Gly Gly Glu Arg Gly 50 55 60

Ser Gly Arg Ar^ Gly Ala Glu Ala Glu Ala Arg Ser Ser Thr His Gly 65 70 75 80

Arg Glu Arg Ser Gin Ala Glu Pro Ser Glu Arg Arg Val Lys Arg Glu 85 1 90 95

Lys Arg Asp Asp Gly Tyr Glu Ala Ala Ala Ser Ser Lys Thr Ser Ser 100 105 110

Gly Asp Ala Ser Ser Leu Ser lie Glu Glu Thr Asn Lys Leu Arg Ala 115 120 125 __ll O:\56\56214-910709.ptc 第41頁 518340 修正 案號 87120187 五、發明說明（38) Lys Leu Gly Leu Lys Pro Leu Glu Val Asn Ala lie Lys Lys. Glu Ala

130 135 HO

Gly Thr Lys Glu Glu Pro Val Thr Ala Asp Val lie Asn^Pro Met Ala 145 150 155 160

Leu Arg Gin Arg Glu Glu Leu Arg Glu Lys Leu Ala Ala Ala Lys Glu!

I 165 …*170 175

Lys Arg Leu Leu Asn Gin Lys Leu Gly Lys He Lys Thr Leu Gly^GhT 180 185 . 190

Asp Asp ^ro Trp Leu Asp Asp Thr Ala Ala Trp lie Glu Arq Ser Arg 195 f 200 , 205

Gin Leu Gin Lys Glu Lys Asp Leu Ala Glu Lys Arg Ala Lys Leu Leu 210 215 220 ，

Glu Glu'Met Asp Gin Glu Phe Gly Val Ser Thr. Leu Val Glu Glu Glu 225! 230 235 240

Phe Gly Gin Arg Arg Gin Asp Leu Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gin Gly 1 . 245 250 255 ·

Leu Thr Val Glu His Ala lie Asp Ser Phe Arg Glu Gly Glu Thr Met 260 · 265 270

He Leu Thr Leu Lys Asp.Ly^s, Gly Val Leu Gin Glu Glu Glu Asp Val 275 ' 280 . 285

Leu Val Asn Val Asn Leu Val Asp Lys Glu Arg Ala Glu Lys Asn Val 290 295 300

Glu Leu Arg Lys Lys Lys Pro Asp Tyr Leu Pro Tyr Ala Glu Asp Glu 305 310 315 :320

Ser Val Asp Asp Leu Ala Gin Gin Lys Pro Arg Ser lie Leu Ser Lys 325 330 、 335

Tyr Asp Glu Glu Leu Glu Gly Glu Arg Pro His Ser Phe Arg Leu Glu 340 ^ 345 350

Gin Gly Gly Thr Ala Asp Gly Leu Arg Glu Arg Glu Leu Glu Glu lie

O:\56\56214-910709.ptc 第42頁 518340 案號 87120187 Λ_η a 修正 五、發明說明（39) 355 360 % 365

Arg Ala Lys Leu Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Ser Thr Val Gly Pro 370 375 380

Arg Leu Ala Ser Glu Tyr Leu Thr Pro Glu Glu Met Val· Thr Phe Lys 385 390 395 400

Lys Thr Lys Arg Arg Val Lys Lys^Ile Arg Lys Lys Glu Lys Glu Val • 405 410 ^ .· 4货——

Val Val Arg Ala Asp Asp Leu Leu Pro Leu Gly Asp Gin Thr Gin Asp 420 425 430

Gly Asp Phe Gly Ser Arg Leu Ar^g Gly Arg.Gly Arg Arg Arg Val Ser «5 440 445

Glu Val Glu Glu Glu Lys Glu Pro Val Pro Gin Pro Leu Pro Ser Asp ，450 455 46〇 、

Asp Tfir Arg Val Glu Asn Met Asp lie Ser Asp Glu Glu Glu Gly Gly 465 470 475 · 480

Ala Pro Pro Pro Gly Ser Pro Gin Val Leu Glu Glu Asp Glu Ala Glu 485 , 490 495 * '

Leu Glu Leu Gin Lys Gin Leu Glu Lys Gly Arg Arg Leu Arg Gin Leu • 500 · 505 , 510

Gin Gin Leu Gin Gin Leu Arg Asp Ser Gly Glu *Lys Val Val Glu lie 515 520 525

Val Lys Lys Leu Glu Ser Arg Gin Arg Gly Trp Glu Glu Asp Glu Asp

530 535 540

Pro Glu Arg Lys Gly Ala lie Val Phe Asn Ala Thr Ser Glu Phe Cys 545 550 555 560

Arg Thr Leu Gly Glu lie Pro Thr Tyr Gly Leu Ala. Gly Asn Arg Glu 565 570 575

Glu Gin Glu Glu Leu Met Asp Phe Glu Arg Asp Glu Glu Arg Ser Ala ___580__585 ____590_ 111· O:\56\56214-910709.ptc 第43頁 518340 修正 案號 87120187 五、發明說明（40) Asn Gly Gly Ser Glu Ser Asp Gly Glu.Glu Asn lie Gly Trp Ser Thr 595 600 605

Val Asn Leu Asp Glu Glu Lys Gin Gin Gin Asp Phe Ser Ala Ser Ser 610 615 j. 620 1

Thr Thr lie Leu Asp Glu Glu Pro lie Val Asn Arg Gly Leu Ala Ala 625 630 '， 635 ^ 640

Ala Leu Leu Leu Cys Gin Asn Lys Gly Leu Leu Glu Thr Thr Val Gin 645 650 655

Lys Val Ala Arg Val Lys Ala Pro Asn Lys Ser Leu Pro Ser Ala Val 660 665 670

Tyr Cys lie Glu Asp Lys Met Ala lie Asp Asp Lys Tyr Ser Arg Arg . 675 680 685

Glu Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gin Asp Phe Lys Glu Lys Asp Cly Tyr . 690 695 700 • *

Lys Pro Asp Val Lys lie Glu Tyr Val Asp Glu Thr Gly Arg Lys Leu 705 · * 710 715 720

Thr Pro Lys Glu Ala Phe Arg Gin Leu Ser His Arg Phe His Gly Lys 725 730 735

Gly Ser Gly Lys Met Lys Thr Glu Arg Arg Met Lys Lys Leu Asp Gl-u 740 * 745 750

Glu Ala Leu Leu Lys.Lys Met Ser Ser Ser Asp Thr Pro Leu Gly Thr 755 760 765 .

Val Ala Leu Leu Gin Glu Lys Gin Lys Ala Gin Lys Thr Pro Tyr lie 770 775 780

Val Leu Ser Gly Ser Gly Lys Ser Met Asn Ala Asn Thr lie Thr Lys 785 790 795 、 800 <210> 2 <211> 2527

O:\56\56214-910709.ptc 第44頁 518340 案號 87120187 年 月 曰 修正 五、發明說明（41) <212> DNA <213〉人 <220〉 <221〉5卬丁R <222>^α7；^. (38) <220〉

<221〉 CDS <222〉 （39)..,(2438)

<220〉 <221〉 3，UTR <222> (2439)... (2€06} ,......... ....... .................. <400> 2 ggttcggcgg cagccgggct cggagtggac gtgccactat ggggtcgtcc aagaagcatc gcggagagaa ggaggcggcc gggacgacgg cggcggccgg paccgggggt gccaccgagc agccgccgcg gcaccgggaa cacaaaaaac acaagcaccg gagtggcggc agtggcggta gcggtggcga acgacggaag cggagccggg aacgtggggg cgagcgcggg agcgggcggc 蠓 gcggggccga agctgaggcc cggagcagca cgcacgggcg ggagcgcagc caggcaga'gc « · cctccgagcg gcgcgtgaag cgggagaagc gcgatgacgg ctacgaggcc gctgccagct ♦ i •痛 ccaaaactag ctcaggcgat gcctcctcac tcagcatcga ggagactaac aaactccggg caaagttggg gctgaaaccc ttggag^gtta atgccatcaa gaaggaggcg ggcaccaagg aggagcccgt gacagctgat gtcatcaacc ctatggcctt .gcgacagcga gaggagctgc gggagaagct ggcggctgcc aaggagaagc gcctgctgaa ccaaaagctg gggaagataa agaccctagg agaggatgac ccctggctgg acgacactgc agcctggatc gagaggagcc ggcagctgca gaaggagaag gacctggcag agaagagggc caagttactg gaggagatgg accaagagtt tggtgtcagc actctggtgg aggaggagtt cgggcagagg cggcaggacc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 -600 660 720 780

O:\56\56214-910709.ptc 第45頁 518340 案號 87120187 #：_η 曰 修正 五、發明說明（42) tgtacagtgc ccgggacctg cagggcctca aaggggagac aatgattctt accctcaagg tgctggtgaa cgtgaacctg gtggataagg agaagaagcc tgactacctg ccctatgccg aaaaacctcg ctctatcctg tccaagtatg ccttccgctt ggagcagggc ggcacggctg ^ccgggccaa gcrgcggctg caggctcagt ccgaatacct cacgcctgag gagatggtga aaatccgcaa gaaggagaag gaggtagtag accagactca ggatggggac tttggttcca ccgaagtgga ggaggagaag gagcctgtgc tggagaacat ggacatcagt gatgaggagg aggtgctgga ggaggacgag gcggagctgg ggctgcgaca gttacagcag ctacagcagc ttgtgaagaa gctggagtct cgccagcggg ^agggggccat cgtgtLc.aac gccacgtccg cctacgggct ggctggcaat cgcgaggagc aggagcgctc agccaacggt ggctccgaat cggtgaacct ggacgaggag aagcagcagc tggacgagga accgatcgtg aatagggggc aagggctgct ggagaccaca gtgcagaagg. tgccctcagc cgtgtactgc atcgaggata t gggaggkata ccgaggcttc acacaggact ttaagatcga atacgtggaii gagacgggcc agctgtcgca ccgcttccat ggcaagggct agaagctgga cgaggaggcg ctcctgaaga ccgtggccct gctccaggag aagcagaagg gcagcggcaa gagcatgaac gcg'aacacca gccctgcctc aaccttcata ttaaataaag ccgtggagca acaaaggcgt agcgggca^a aggacgagag acgaagagct atggcctgcg ccctgagcac cctttaaaaa tgcgggcaga gactgcgggg ctcagcccct aaggtggagc agctgcagaa tgcgagacag gctgggagga agttctgccg aggaggagct w. ^ . ctgacgggga aggatttctc tggcagctgc tggcccgggt agatggccat tcaaggagaa ggaaactcac caggcaagat agatgagctc ctcagaagac* tcaccaagtg tgccattgat gctgcaggag gaaaaatgtg cgtggacgac tgaaggggag ggagcgggag c agtggg^ccc gaccaagcgg tgacttgctg acggggtcgc gccgtcggac tccaccgccg gcagctggag tggcgagaag ggatgaggat caccttgggg catggacttt ggagaacatc tgcttcctcc cctgctcctg gaaggccccc cgatgacaag ggacggctac acccaaggag gaagacagag cagcgacacg cccctacatc acagcgccct tccttccgag 哪gaggacg. gagctgcgga ctggcgcagc cggccacatt ctggaggaga cggctggcct agggtgaaga cctctcgggg cgccgagtgt gacacccgag gggtccccgc aagggacgcc gtggtggaga cccgagcgga gagatcccca gaacgggatg ggctggagca accaccatcc tgtcagaaca aacaagtcgc tacagccgga aaacccgacg gctttccggc cggcggatga cccctgggca gtgctcagcg cccgtagtcg 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 ctccctcctt atttttaaaa aaaaaaaaaa 2520,

O:\56\56214-910709.ptc 第46頁 518340 案號 87120187 曰 修正 五、發明說明（43) aaaaaaa <210〉 3 <211> 9 <212> PRT <213〉人 <400〉 3

Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gin Asp Phe <210〉 4 <2il> 9 <212〉 PRT <213〉人造序列 <220> <221〉變型 <222> 2 铲 * <223> Xaa is Phe, Tyr, Met or Trp. <220〉 ( * d21>變型 <222>* 9 <223〉Xaa is Phe, Leu, lie, Trp or Met· . * <400〉 4

Glu Xaa Arg Gly Phe Thr Gin Asp Xaa

<210> 5 <211〉 9 <212> PRT

O:\56\56214-910709.ptc 第47頁 518340 案號 87120187 年 月 日 修正 五、發明說明（44) <213〉人造序列 <220〉 <221〉變型 <400> 5

Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gin Asp lie 5 ' <210> 6 <211> 9 ， « <212> PRT <213> 人造序列 <220〉 <221〉變型 <400> 6

Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gin Asp Leu 5 <210> 7 <2U> 9 .

<·2ί2> PRT Φ <213〉人造序列 ， <220> <221〉.變型 <400> 7 *

Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gin Asp Trp

O:\56\56214-910709.ptc 第48頁 518340 案號87120187 年月日 修正

O:\56\56214-910709.ptc 第49頁

Claims (1)

1. 51834^k告I 號'm2 •種腫瘤抗原肽衍生物 胺基酸序列所構成者： 1 · 月 修正 其係由下列a )至e )之任 種 a) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp b) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu c) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-I le d)Glu-e ) G 1 u -一種誘 Phe-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Phe Phe-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp 2. 導細胞傷害性T細胞之醫藥組合物，其含有申 請專利範圍第1項之腫瘤抗原肽衍生物做為有效成分。 3 . —種結合有前述腫瘤抗原肽衍生物的抗原呈現細胞之 製造方法，其係使申請專利範圍第1項之腫瘤抗原肽衍生 物與具有抗原呈現能力之細胞在活體外接觸者。

   O:\56\56214-911106.ptc 第50頁