TW202428310A

TW202428310A - 用於預防和治療病毒感染的偶聯物及其用途

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Publication number: TW202428310A
Application number: TW112100103A
Authority: TW
Inventors: 彭程; 宋國偉; 宋治東; 袁帥; 淩煒康; 孟佳; 孫塔; 高照; 鄒罡; 海卿袁; 征鄔
Original assignee: 大陸商蘇州愛科百發生物醫藥技術有限公司
Priority date: 2023-01-03
Filing date: 2023-01-03
Publication date: 2024-07-16

Abstract

本發明關於用於預防和治療病毒感染的偶聯物及其用途，更具體地關於一種具有式I-1的蛋白-抗流感化合物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，該偶聯物具有藉由連接子(L¹和L²)連接到Fc單體、Fc結構域、Fc連接肽、白蛋白或者白蛋白連接肽(E)的抗流感病毒活性的小分子(D¹和D²)。本發明的偶聯物或中間化合物具有顯著的抗流感病毒活性，同時具有優異的體外/體內藥物代謝動力學性質和安全性，臨床應用前景高。

Description

用於預防和治療病毒感染的偶聯物及其用途

本發明關於針對流感(Flu)病毒的抗病毒藥物和抗體或其恆定區Fc的偶聯物(AVC)。具體的說，本發明關於包含與病毒表面蛋白抑制劑小分子或者抑制劑多肽藥物共價偶聯的抗體或其恆定區Fc的化合物及其中間化合物，並關於包含這些化合物的醫藥組成物或藥物，以及其用於預防和/或治療相關病毒感染的用途。

流感病毒(Influenza virus)每年在全球造成將近三百萬至五百萬例的嚴重感染病例，死亡人數在500,000左右(Luliano等人，2018，Lancet391：1285-1300)。雖然大多數健康人群在感染該病毒後會在一到兩週內自動恢復，但是對於老年人、患有慢性疾病以及免疫系統低下的人，流感病毒感染會發展成危及生命的嚴重感染以及併發症，例如肺炎。

開發對抗流感病毒的治療方法是人類面臨的一項持續的挑戰。雖然目前市面上已經有抗流感病毒的藥物和預防性疫苗獲批，然而抗流感的小分子藥物通常需要在感染後症狀出現的48小時內使用才能具有臨床的獲益。另外，由於流感病毒具有高度變異性，目前已經發現出現了針對此類常用藥物的耐藥性病毒株。因此，需要開發更加有效和長效的治療和/或預防流感病毒的有效療法。

流感病毒是一類負鏈、分段的RNA病毒，屬正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，包括A，B和C型流感病毒屬(Influenzavirus A,B,and C)，其中，對於人類，以A和B型流感病毒感染為主。流感病毒感染呼吸道上皮細胞。該過程的第一步是藉由病毒的表面受體結合蛋白(對於流感蛋白而言是血球凝集素蛋白，HA蛋白)介導的宿主細胞的吸附過程。隨後，在血球凝集素蛋白的作用下，病毒的包膜和細胞膜進行融合，流感病毒的基因組片段和病毒的RNA依賴的RNA聚合酶複合體隨後釋放進入細胞內。病毒的RNA依賴的RNA聚合酶複合體以基因組片段為模板，在細胞內合成新的子代病毒顆粒。新和成的病毒顆粒藉由細胞裂解或者出芽的形式被釋放到細胞外。對於流感病毒而言，子代病毒的完全釋放需要依賴神經胺酸酶NA切割細胞表面的唾液酸殘基。針對流感病毒的神經胺酸酶為藥物靶標以減少病毒擴散的神經胺酸酶抑制劑已有獲批臨床，包括奧司他韋(oseltamivir)(Tamiflu^TM)、紮那米韋(zanamivir)(Relenza^TM)以及帕拉米韋(peramivir)(Rapivab^TM)。

接受器官移植的患者或者癌症患者由於免疫系統被抑制而不能有效的清除病毒，在感染流感病毒之後容易延長病毒在體內複製的時間，從而增加產生耐藥性毒株的可能性。目前在臨床上已有該類發現。因此，需要更為有效的治療流感的新方法和治療劑。

一方面，本發明提供了一種具有式I-1的偶聯物，其包含與蛋白偶聯的抗流感病毒小分子化合物(也稱為“蛋白-抗流感化合物偶聯物”)，具有顯著的抗流感病毒生物活性。

具體而言，本發明的蛋白-抗流感化合物偶聯物具有藉由連接子(L¹和L²)連接到抗體或者其抗體片段、Fc單體、Fc結構域、Fc連接肽、白蛋白或者白蛋白連接肽(E)的抗流感病毒活性的小分子(D¹和D²)。本發明的蛋白-抗流感化合物偶聯物具有顯著的抗流感病毒活性，同時具有優異的體外/體內藥物代謝動力學性質和安全性，半衰期長，臨床應用前景高。

本發明提供了以下實施方案：

本發明提供一種具有式I-1的偶聯物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，

其中，

m為1或2；

n為1至20的整數，較佳1至10的整數，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且兩個n是相同的；

D¹和D²為抗流感病毒小分子藥物，各自獨立地選自式D-1-1至D-1-8所示的具有抗流感病毒活性的化合物：

R₁選自OH、NH₂、-NH(=NH)NH₂和-NHC(=NH)NHR₆；R₂和R₃各自獨立地選自H、OH、F、Cl和Br；R₄選自-COOH、-P(=O)(OH)₂、-SO₃H；

R₅選自-COC_1-6烷基、-COC_1-6鹵烷基、-SO₂C_1-6烷基和-SO₂C_1-6鹵烷基；較佳選自-COCH₃、-COCF₃和-SO₂CH₃；

X選自O或S；

R₆選自如下基團：

Y選自如下的基團，其中“(連接L¹)”指明基團Y的連接到L¹的末端，當N畫在環內時，表明N為環內原子：

其中，A環選自C₃-C₂₀環烷基、取代的C₃-C₂₀環烷基、C₃-C₂₀環烯基、取代的C₃-C₂₀環烯基、C₆-C₁₅芳基、3-20員雜環烷基、取代的3-20員雜環烷基、取代的C₆-C₁₅芳基、取代的5-15員雜芳基；

R基團各自獨立地選自H、氘、視需要取代的C₁-C₂₀烷基、視需要取代的C₂-C₂₀鏈烯基、視需要取代的C₃-C₂₀環烷基、視需要取代的3-20員雜環烷基、視需要取代的C₆-C₁₅芳基、視需要取代的5-15員雜芳基；

q為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

L¹為連接藥物(D¹或D²)和L²的連接子，包括但不限於以下結構：

應當理解，其中下面結構的左右兩端的鍵與連接藥物的氧原子相連接，中間的波浪線所標記的鍵與L²相連接；

其中

W選自O、S、NR^b、CH_2-或不存在；

R^a和R^b各自獨立地選自H、視需要取代的C₁-C₂₀烷基、視需要取代的C₂-C₂₀烯基；

y¹、y²各自獨立地是0、1、2、3、4、5或6；

q¹和q²各自獨立地選自1、2、3、4、5或6；

或者

L¹選自以下結構：

L²為連接L¹和E(Fc單體、Fc結構域、Fc連接肽、白蛋白或者白蛋白連接肽)的連接子，其具有式L2-1至L2-15的結構，其中(L¹)和(E)分別指代與L¹和E連接的L²的末端：

其中，

Z為NR、S和O；

R基團各自獨立地選自氫、氘、視需要取代的C₁-C₂₀烷基、視需要取代的C₂-C₂₀鏈烯基、視需要取代的C₃-C₂₀環烷基、視需要取代的3-20員雜環烷基、視需要取代的C₆-C₁₅芳基和視需要取代的5-15員雜芳基；

s和t為1-20的整數；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；

y為0或1；

Q為N或CH；

p為0、1、2、3、4、5、6、7或8；

E為抗體或者其抗體片段、Fc結構域單體、Fc結構域、Fc結合肽、白蛋白或者白蛋白連接肽，其包括SEQ ID No.1-68中的任一個所述的胺基酸序列或與其具有至少95%同一性的序列；在一實施方案中，具有式I-1結構的化合物中，E單結構域二聚化形成Fc結構域。

進一步的，提供一種具有式I-1的偶聯物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，

其中，

m為1或2；

n為1至20的整數，較佳1至10的整數；

D¹和D²各自獨立的選自上面式D-1-1至D-1-8所示的具有抗流感病毒活性的化合物；

D¹和D²與L¹共價連接在一起，L¹藉由共價鍵和L²連接，L²藉由共價鍵與E連接；

E選自如上所定義的Fc結構域單體、Fc結構域、Fc結合肽、白蛋白或者白蛋白連接肽。

在一些實施方案中，具有式I-1的偶聯物具有式I-1-1至式I-1-8的結構：

其中各變量(例如R¹-R⁵、X、Y、E、L¹、L²、m和n)如上文所定義。

在一些實施方案中，具有式I-1-1至I-1-8的化合物較佳選自具有式I-1-A至式I-1-D的結構：

其中各變量(例如E、L¹、L²、m和n)如上文所定義。

在一些實施方案中，具有式I-1結構的偶聯物，較佳選自C-1至C-115的偶聯物：

其中n如上文所定義；Protein是上文所定義的E。

在一些實施方案中，在式I-1的結構中，n和m的比值為1至20，較佳選自2至10，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些實施方案中，該偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物具有在0.5與10.0之間的平均DAR。

在一些實施方案中，E是抗體或者抗體片段、Fc結構域單體，Fc結構域，和/或Fc結合肽。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID No.1-68中的任一所述的胺基酸序列具有至少95%同一性的序列或由其組成。在一些實施方案中，抗體片段是抗原結合片段，例如

在一些實施方案中，該抗體或者抗體片段為人類、小鼠、駱駝科、山羊、綿羊、兔、雞、豚鼠、倉鼠、馬或者大鼠的抗體或者抗體片段。

在一些實施方案中，該抗體或者抗體片段為IgG、IgA、IgD、IgE或者IgM型的抗體或抗體片段。

在一些實施方案中，該抗體片段包括scFv、sdAb、Fab、Fab’、Fab’2、F(ab’)2、Fd、Fv、Feb或者SMIP。

在一些實施方案中，該抗體或者抗體片段能夠識別病毒表面抗原，例如CR6261、CR8020、MEDI8897、帕利珠單抗(Palivizumab)、SD38等。

在一些實施方案中，Fc結構域單體可以是來自任何一種免疫球蛋白的抗體亞型(例如，IGHG1*01(例如G1m(za))、IGHG1*07(例如G1m(zax))、IGHG1*04(例如G1m(zav))、IGHG1*03(G1m(f))、IGHG1*08(例如G1m(fa))、IGHG2*01、IGHG2*02、IGHG2*06、IGHG3*01、IGHG3*04、IGHG3*05、IGHG3*09、IGHG3*10、IGHG3*11、IGHG3*12、IGHG3*06、IGHG3*07、IGHG3*08、IGHG3*13、IGHG3*03、IGHG3*14、IGHG3*15、IGHG3*16、IGHG3*17、IGHG3*18、IGHG3*19、IGHG2*04、IGHG4*01、IGHG4*02、IGHG4*03)(如Vidarsson等人，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector function.Frontiers in Immunology.5(520)：1-17(2014))的Fc結構域單體。Fc結構域單體可以含有一個或者多個非自然胺基酸序列，作為小分子藥物的定點偶聯位點。Fc結構域單體可以含有一個或者多個經過定點改造的溶劑暴露的半胱胺酸或者賴胺酸殘基，用以提供額外的小分子藥物偶聯位點。

在一些實施方案中，E中的Asn胺基酸殘基被替換為Ala胺基酸殘基，以避免該位點被偶聯。

在一些實施方案中，E包含額外的Cys胺基酸殘基，以增加偶聯位點而不影響抗體蛋白質的空間三維結構。

在一些實施方案中，E的末端含有額外的胺基酸序列，例如蛋白純化標簽(例如六個組胺酸標簽)，或者是信號肽序列(例如人類白介素2的信號肽序列)或MVRS胺基酸序列或ISAMVRS胺基酸序列)。

在一些實施方案中，蛋白純化標簽位於E的C末端。在一些實施方案中，信號肽序列位於E的N末端。

在一些實施方案中，蛋白純化標簽選自六組胺酸標簽或c-Myc標簽。在一些實施方案中，信號肽選自人IL-2信號肽序列(例如MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO：69))、人類血清白蛋白信號序列(例如MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO：70))、小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(例如MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：71))。

在一些實施方案中，E的N末端還包含鉸鏈區或部分鉸鏈區。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：1-68中任一項的胺基酸序列，或由其組成。

在一些是實施方案中，E包含與SEQ ID NO：1-68中任一項的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列或由其組成。

在一些實施方案中，E包含如下胺基酸序列或由如下胺基酸序列組成，該胺基酸序列

(i)與SEQ ID NO：1-68中任一項的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性；且

(ii)包含在本揭露“序列SEQ ID NO：1-68以及其描述”部分的針對每一SEQ ID NO：所描述的N末端添加序列、突變和/或C端添加序列等。

在一些實施方案中，E還包含連接體。在一個實施方案中，連接體是指由胺基酸組成的短胺基酸序列，例如單獨或組合使用的甘胺酸(G)和/或絲胺酸(S)和/或蘇胺酸殘基(T)。在一個實施方案中，連接體包含胺基酸序列(G4S)n，其中n是等於或大於1的整數，例如，n是1、2、3、4、5、6或7的整數。在一個實施方案中，連接體是GGGGS。在一個實施方案中，連接體包含胺基酸序列TS(G4S)n，其中n是等於或大於1的整數，例如，n是2、3、4、5、6或7的整數。在一個實施方案中，連接體包含胺基酸序列G(G4S)n，其中n是等於或大於1的整數，例如，n是2、3、4、5、6或7的整數。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：1中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：1的胺基酸序列具有至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有IL2信號序列。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：2中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：3中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有IL2信號序列以及N端MVRS胺基酸序列。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：4中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：4的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有有MVRS胺基酸序列。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：5中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：5的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端有IL2信號序列並且C端有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：6中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：6的胺基酸序列具有至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其C端有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：7中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：7的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端有IL2信號序列和MVRS胺基酸序列而且C端有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：8中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：8的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有MVRS胺基酸序列而且C端具有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：9中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：9的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有IL2信號序列和MVRS胺基酸序列，鉸鏈區具有兩個外加的半胱胺酸(對應於SEQ ID NO：9的*位置)而且C端具有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：10中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：10的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有MVRS胺基酸序列，鉸鏈區含有兩個外加的半胱胺酸(對應於SEQ ID NO：10的*位置)而且C端具有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：11中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：11的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有MVRS胺基酸序列，鉸鏈區含有兩個外加的半胱胺酸(對應於SEQ ID NO：11的*位置)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：12中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：12的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有IL2信號序列和Asn至Ala取代((對應於SEQ ID NO：12的*位置))而且C端具有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：13中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：13的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其含有Asn至Ala取代(對應於SEQ ID NO：13的*位置)而且C端具有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：14中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：14的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有IL2信號序列和MVRS胺基酸序列，含有Asn至Ala取代(對應於SEQ ID NO：14的*位置)而且C端具有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：15中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：15的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有MVRS胺基酸序列，含有Asn至Ala取代(對應於SEQ ID NO：15的*位置)而且C端具有六個組胺酸標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：16中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：16的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列而且具有N端ISAMVRS胺基酸序列。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：17中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：17的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列而且具有N端ISAMVRS胺基酸序列，含有C端G4S連接體和C端c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：18中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：18的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有ISAMVRS胺基酸序列，C端具有G4S連接體而且C端具有c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：19中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：19的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，而且含有賴胺酸至絲胺酸改變(對應於SEQ ID NO：19的*位置)以防止該位點偶聯。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：20中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：20的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有ISAMVRS胺基酸序列而且含有賴胺酸至絲胺酸(對應於SEQ ID NO：20的*位置)改變以防止該位點偶聯。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：21中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：21的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，含有賴胺酸至絲胺酸改變(對應於SEQ ID NO：21的*位置)以防止該位點偶聯，而且C端具有G4S連接體和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：22中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：22的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有ISAMVRS胺基酸序列，含有賴胺酸至絲胺酸改變(對應於SEQ ID NO：22的*位置)以防止該位點偶聯，而且C端具有G4S連接體和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：23中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：23的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，含有Asn至Ala改變(對應於SEQ ID NO：23的*位置)，而且C端具有G4S連接體和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：24中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：24的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有ISAMVRS胺基酸序列，含有Asn至Ala改變(對應於SEQ ID NO：24的*位置)而且C端具有G4S連接體和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：25中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：25的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，含有H310A和H435A改變以防止FcRn結合，而且C端具有G4S連接體和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：26中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：26的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有ISAMVRS胺基酸序列，含有H310A和H435A改變以防止FcRn結合，而且C端具有G4S連接體和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：27中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：27的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，而且C端具有G4S連接體和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，對應於SEQ ID NO：27的粗體位置)和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：28中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：28的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有ISAMVRS胺基酸序列而且C端具有G4S連接體和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，對應於SEQ ID NO：28的粗體位置)和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：29中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：29的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列和 ISAMVRS胺基酸序列，含有Asn至Ala取代而且C端具有G4S連接體和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，對應於SEQ ID NO：29的粗體位置)和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：30中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：30的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有ISAMVRS胺基酸序列，含有Asn至Ala取代(對應於SEQ ID NO：30的*位置)而且C端具有G4S連接體和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，對應於SEQ ID NO：30的粗體位置)和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：31中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：31的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列，具有同種異型G1m(fa)，而且C端具有G4S連接體和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，對應於SEQ ID NO：31的粗體位置)和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：32中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：32的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列，且具有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：33中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：33的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有MVRS胺基酸序列而且含有YTE三重突變。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：34中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：34的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列，含有成熟人類Fc-IgG1的鉸鏈區EPKSS胺基酸序列，而且含有半胱胺酸至絲胺酸改變(對應於SEQ ID NO：34的#位置)以及同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：35中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：35的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有鼠科動物IgG信號序列，去除掉成熟人類Fc-IgG的鉸鏈區EPKSSD胺基酸序列，而且具有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：36中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：36的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端去除掉成熟人類Fc-IgG的鉸鏈區EPKSSD胺基酸序列，具有同種異型G1m(fa)而且含有YTE三重突變。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：37中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：37的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端去除掉成熟人類Fc-IgG的鉸鏈區EPKSSD胺基酸序列，具有LS雙突變而且具有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：38中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：38的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有人類血清白蛋白信號序列，含有YTE三重突變，具有同種異型G1m(fa)而且C端具有G4S連接體和c-Myc標簽。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：39中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：39的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其在對應於SEQ ID NO：39所示的X位置具有SEQ ID NO：39在該位置定義的胺基酸。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：40中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其在對應於SEQ ID NO：40所示的X位置具有SEQ ID NO：40在該位置定義的胺基酸。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：41中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：41的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有YTE三重突變，且在對應於SEQ ID NO：41所示的X位置具有SEQ ID NO：41在該位置定義的胺基酸。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：42中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：42的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有YTE三重突變而且具有同種異型G1m(fa)

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：43中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：43的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有YTE三重突變而且具有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：44中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有LS雙重突變，且在對應於SEQ ID NO：44所示的X位置具有SEQ ID NO：44在該位置定義的胺基酸。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：45中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：45的胺基酸序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有LS雙重突變而且具有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：46中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：46的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有LS雙重突變而且具有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：47中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：47的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：47的#位置)，且在對應於SEQ ID NO：47所示的X位置具有SEQ ID NO：47在該位置定義的胺基酸。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：48中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：48的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：48的#位置)，而且含有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：49中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：49的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：49的#位置)，而且含有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：50中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：50的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：50的#位置)，具有M428L和N434S突變，而且含有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：51中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：51的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：51的#位置)，具有M428L和N434S突變，而且含有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：52中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：52的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：52的#位置)，具有YTE三重突變，而且含有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：53中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：53的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：53的#位置)，具有YTE三重突變，而且含有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：54中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，具有M428L，N434S突變，C端具有G4S連接體和c-Myc標簽，而且含有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：55中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：55的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，具有M428L，N434S突變，C端具有G4S連接體和c-Myc標簽，而且含有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：56中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：56的胺基酸序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，具有YTE三重突變，C端具有G4S連接體和c-Myc標簽而且含有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：57中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：57的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列和ISAMVRS胺基酸序列，具有YTE三重突變，C端具有G4S連接體和c-Myc標簽而且含有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：58中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：58的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#位置)，C端具有G4S連接體和IgA肽標簽而且含有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：59中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：59的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其N端具有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：59的#位置)，具有 M428L、N434S突變，C端具有G4S連接體和IgA肽標簽而且含有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：60中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：60的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其在對應於SEQ ID NO：60所示的Z或X位置具有SEQ ID NO：60在該位置定義的胺基酸。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：61中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：61的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：61的#位置)，且在對應於SEQ ID NO：61所示的X位置具有SEQ ID NO：61在該位置定義的胺基酸。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：62中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：62的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：62的#位置)，且在對應於SEQ ID NO：62所示的X位置具有SEQ ID NO：62在該位置定義的胺基酸

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：63中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：63的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：63的#位置)且具有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：64中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：64的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：64的#位置)且具有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：65中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：65的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：65的#位置)，M428L、N343S突變，且具有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：66中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：66的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：66的#位置)，M428L、N343S突變，且具有同種異型G1m(f)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：67中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：67的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：67的#位置)和YTE三重突變，且具有同種異型G1m(fa)。

在一些實施方案中，E包括SEQ ID NO：68中的胺基酸序列。在一些實施方案中，E包括與SEQ ID NO：68的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及視需要地，其具有半胱胺酸至絲胺酸改變(在對應於SEQ ID NO：68的#位置)和YTE三重突變，且具有同種異型G1m(f)。

在本文所述的任何一個實施方案中，其中E包括Fc結構域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-68中任意者的序列)包括對應於M252Y/S254T/T265E(YTE)的三重突變。熟悉此項技術者將理解“對應於”藉由使用序列分析軟體(例如但不僅限於DNA Star、Vector NTI等等)進行序列同源性比對之後得到的特定相應位置的胺基酸位點。例如，SEQ ID NO：1-68中任意者可以包含包括YTE的突變。

在本文所述的任何一個實施方案中，其中E包括Fc結構域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-68中任意者的序列)，其包括對應於M428L/N434S(LS)的雙重突變型。熟悉此項技術者將理解“對應於”藉由使用序列分析軟體(例如但不僅限於DNA Star、Vector NTI等等)進行序列同源性比對之後得到的特定相應位置的胺基酸位點。例如，SEQ ID NO：1-68中任意者可以包含包括LS的突變。

在本文所述的任何一個實施方案中，其中E包括Fc結構域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-68中任意者的序列)，其包括對應於N434H的雙重突變型。熟悉此項技術者將理解“對應於”藉由使用序列分析軟體(例如但不僅限於DNA Star、Vector NTI等等)進行序列同源性比對之後得到的特定相應位置的胺基酸位點。例如，SEQ ID NO：1-68中任意者可以包含包括N434H的突變。

在本文所述的任何一個實施方案中，其中E包括Fc結構域單體(例如，具有SEQ ID NO：1-68中任意者的序列)，其包括對應於C220S的雙重突變型。熟悉此項技術者將理解“對應於”藉由使用序列分析軟體(例如但不僅限於DNA Star、Vector NTI等等)進行序列同源性比對之後得到的特定相應位置的胺基酸位點。例如，SEQ ID NO：1-68中任意者可以包含包括C220S的突變。

在本文所述的任何一個實施方案中，其中E包括Fc結構域單體的片段(例如，來自SEQ ID NO：1-68中任意者的序列的Fc結構域單體的片段)，且是該Fc結構域單體(例如來自SEQ ID NO：1-68中任意者的序列的Fc結構域單體)中至少25個(例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或者更多)、至少50個(例如51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75個或者更多)或至少75個(75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個或者更多)連續的胺基酸片段。

在一個實施方案中，該偶聯物具有如下的結構：

其中n如上所定義。

在一方面，本發明提供具有式I-2結構的化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，

其中L¹、D¹和D²如上面式I-1中所定義；

L³選自以下結構：

其中各變量例如Z、R、Q、s、y、p如上面對L²所定義。

在一些實施方案中，式I-2化合物較佳具有式C-Inter-1至式C-Inter-115的結構：

另一方面，本發明提供了醫藥組成物，其包含如上所述的式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，以及視需要的一種或多種其它治療劑，例如化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫檢查點抑制劑或激動劑)，以及視需要的藥學上可接受的賦形劑。

另一方面，本發明提供了用於預防或治療病毒感染患者或者可能具有被病毒感染風險的患者的方法，其包括向患者施用例如注射有效劑量的任何一種如上所述的式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物的步驟。

如上所述的式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物在製備藥物中的用途，其中該藥物用於預防或治療病毒感染患者或者可能具有被病毒感染風險的患者的病毒感染。

在一些實施方案中，該病毒感染是流感病毒或者副流感病毒引發的感染。

在一些實施方案中，該病毒感染是流感病毒A、B或者C、或者副流感病毒引發的感染。

在一些實施方案中，該被病毒感染或者可能具有被病毒感染風險的患者可以是具有免疫系統缺陷的患者。

在一些實施方案中，該被病毒感染或者可能具有被病毒感染風險的患者可以是接受或者將要接受免疫抑制劑治療的患者。

在一些實施方案中，該被病毒感染或者可能具有被病毒感染風險的患者可以是被診斷出患有引起免疫抑制疾病的患者。

在一些實施方案中，該被診斷出患有引起免疫抑制疾病的患者患有癌症或者獲得性免疫缺陷綜合症。

在一些實施方案中，該被診斷出患有引起免疫抑制的癌症疾病的患者患有白血病、淋巴癌、體液免疫缺乏症、T細胞缺乏症、補體缺乏症或者多發性骨髓瘤。

在一些實施方案中，該患者是正在接受或者將要接受造血幹細胞移植的患者。

在一些實施方案中，該患者是正在接受或者將要接受造器官移植的患者。

在一些實施方案中，該患者可能有二次感染風險。

用於預防患者的由流感病毒感染引發的二次感染風險的方法，藉由向患者體內施用例如注射有效劑量的任何如上所述的式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物。

在一些實施方案中，該二次感染是呼吸道感染。

在一些實施方案中，該二次感染是與肺炎有關。

在一些實施方案中，該二次感染是細菌性，或者病毒性，或者是真菌性的感染。

在一些實施方案中，該細菌性感染是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的感染。

在一些實施方案中，該細菌性感染是肺炎鏈球菌引起的感染。

在一些實施方案中，該式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物可以藉由肌肉注射、靜脈注射、皮內注射、動脈內注射、腹腔注射、病灶內注射、顱內注射、關節內注射、胸膜內注射、氣管內注射、前列腺內注射、鼻腔內注射、玻璃體內注射、陰道內注射、直腸內注射、局部的、腫瘤內注射、腹膜內注射、皮下注射、結膜下注射、囊內注射、黏膜注射、心包內注射、臍內注射、眼內注射、口服、局部吸入、注射或者輸液來施用。

在一些實施方案中，該式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物與另外的治療藥物聯合施用或聯合用於製備藥物。

在一些實施方案中，該另外的治療藥物是抗病毒藥物。

在一些實施方案中，該抗病毒藥物是巴洛沙韋(baloxavir)、吡莫地韋(pimodivir)、奧司他韋(oseltamivir)、紮那米韋(zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)、拉尼米韋(laninamivir)、安曼他丁(amantadine)、MEDI8852或者里曼他丁(rimantadine)。

在一些實施方案中，該患者使用的另外一種藥物是抗病毒的疫苗。

在一些實施方案中，該抗病毒藥物和式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物依次施用例如注射給患者。

在一些實施方案中，該抗病毒藥物和式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物同時施用例如注射給患者。

發明的效果：

本發明的式I-1偶聯物或式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物具有如下優勢：

具有顯著的高抗病毒活性，

對耐藥性病毒株具有高的活性；和/或

具有優異的體外/體內藥物代謝動力學性質和安全性，例如具有長的半衰期，可以減少給藥頻率和增加患者順應性，臨床應用前景高。

本發明的偶聯物的製備

其中各變量包括D¹、D²、E、L¹、L²、L³、t、m和n如上文所定義；

一方面，本發明提供了製備式I-1的偶聯物的方法，該方法包括：

使式II-1化合物

其中各變量如上文所定義；

與式I-2化合物反應，

得到式I-1化合物

在一些實施方案中，式II-1化合物藉由以下方法製備：

使式II-2化合物

其t如上文(例如L²定義中)所定義；

與

(其中E如上文所定義，-NH₂為E上的胺基)反應，

得到

式II-1化合物

其中各變量如上文所定義。

醫藥組成物

在一些實施方案中，本發明提供包含式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物的醫藥組成物。為了簡便起見，可以將式I-1的偶聯物、式I-2化合物，或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物簡稱為“本發明化合物”。在一個實施方案中，該組成物還包含藥學上可接受的賦形劑。在一個實施方案中，醫藥組成物包含本發明化合物，以及一種或多種其它治療劑的組合。

如本文所用，“藥學上可接受的賦形劑”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。

對於藥學上可接受的賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第八版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。

本發明的醫藥組成物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、散劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。

可以藉由將具有所需純度的本發明的化合物與一種或多種視需要的藥學上可接受的賦形劑混合來製備包含本發明化合物的藥物，較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。

定義：

以下對本發明的涉及的術語進行了定義，另外，所屬技術領域具有通常知識者還可以結合現有技術對以下術語進行理解。對於未定義的術語，其與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常的理解具有相同的含義。

本文所用的術語“抑制神經胺酸酶活性”是指小於或者等於1000nM的IC₅₀。例如根據本文的實施例中的神經胺酸酶抑制實驗方法所測定。在一些實施方案中，抑制神經胺酸酶活性小於或者等於100nM或者小於或者等於10nM的IC₅₀表示抑制神經胺酸酶活性的化合物。

本文所用的術語“抑制病毒生長’，是指小於或者等於1000nM的EC₅₀。例如根據本文的實施例中的流感病毒介導的細胞病變抑制活性實驗方法所測定。在一些實施方案中，抑制病毒生長活性小於或者等於100nM或者小於或者等於10nM的IC₅₀表示抑制病毒生長活性的化合物。

本文所用的術語“Fc結構域單體”是指具有如下特徵的多肽鏈或者其功能片段(例如能夠和另外一個Fc結構域單體形成二聚體以及結合於Fc受體的片段)，該多肽鏈包括第二及第三抗體恆定區(CH2及CH3)以及可選地第四抗體恆定區，在一些情況下，Fc結構域單體還包含至少一個鉸鏈區或者部分鉸鏈區。該Fc結構域單體可以為任何免疫球蛋白抗體類型，包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD。另外，該Fc結構域單體可以是任何IgG亞型(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4)。例如，在天然抗體中，免疫球蛋白Fc結構域包含源自IgG、IgA和IgD類抗體的兩條重鏈的第二和第三恆定結構域(CH2結構域和CH3結構域)；或者包含源自IgM和IgE類抗體的兩條重鏈的第二、第三和第四恆定結構域(CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域)。除非本文中另外規定，否則該IgG或者Fc結構域單體中的胺基酸編號依據抗體的EC編號系統(該系統也稱之為Kabat EU，或EU編號系統，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Services,National Institute of Health,Bethesda,MD 1991中該)。Fc結構域單體可以是任何物種來源，例如合成的、人類、小鼠、大鼠、駝羊等。Fc結構域單體可以含有一個或者多個非自然胺基酸序列，作為小分子藥物的定點偶聯位點。Fc結構域單體可以含有一個或者多個經過定點改造的溶劑暴露的半胱胺酸或者賴胺酸殘基，用以提供額外的小分子藥物偶聯位點。

本文所用的術語“Fc結構域”是指由兩個Fc結構域單體藉由鉸鏈區，和/或CH2，和/或CH3抗體恆定區之間的相互作用形成的二聚體。在一些實施方案中，二聚體的單體之間具有一個或者多個二硫鍵。Fc結構域可以是任何物種來源，例如合成的、人類、小鼠、大鼠、駝羊等。Fc結構域可以含有一個或者多個非自然胺基酸序列，作為小分子藥物的定點偶聯位點。Fc結構域可以含有一個或者多個經過定點改造的溶劑暴露的半胱胺酸或者賴胺酸殘基，用以提供額外的小分子藥物偶聯位點。

本文所用的術語“共價連接”是指結合物中由共價鍵彼此連接的兩個部分，該共價鍵形成於連接結合物的兩部分中的兩個原子之間。

本文所用的術語“Fc結合肽”是指具有5至50個(例如5至40個、5至30個、5至20個、5至15個、5至10個10至50個、10至40個、10至30個或者10至20個)連續的胺基酸序列所構成的多肽，並且其對Fc結構域(例如本文該任何Fc結構域)具有親和力且具有結合該Fc結構域的功能。Fc結合肽可以為任何物種來源，例如合成的、人類、小鼠、大鼠、駝羊等。Fc結合肽可以含有一個或者多個非自然胺基酸序列，作為小分子藥物的定點偶聯位點。Fc結合肽可以含有一個或者多個經過定點改造的溶劑暴露的半胱胺酸或者賴胺酸殘基，用以提供額外的小分子藥物偶聯位點。

本文所用的術語“溶劑暴露”是指如下胺基酸殘基，其周圍具有圍繞該蛋白質或多肽的溶劑分子。溶劑暴露的胺基酸分子可以是天然存在的，也可以是人工改造的(包括天然胺基酸和非天然胺基酸)。在一些實施方案中，該位點改造不影響蛋白質的空間三維結構。

本文所用的術語“%同一性”是指蛋白質或者多肽序列中的胺基酸殘基的百分比，該胺基酸殘基在比對序列必要時引入間隙以實現最大百分比同一性之後與參考序列的胺基酸殘基一致(亦即，可在該等候選及參考序列中之一或者兩者中引入間隙以進行最佳比對，且出於比較目的可忽略非同源序列)。用於達成序列比對百分比同一性的目的的比對可在該技術的技能內由多種方式實現，例如但不僅限於公開可獲取的電腦軟體，如BLAST、ALIGN、MegAlign(DNA Star)軟體等。

本文所用的術語“治療”或者“用以治療”是指個體感染病毒之後的治療性治療。在一些實施方案中，治療性治療可以減慢病毒感染的進程，減輕個體的症狀，和/或消除病毒的感染。

術語“有效量”或“有效劑量”指本發明的抗體或片段或組成物或組合的這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在需要治療或預防的患者中產生預期效果。

單獨的或者組合(例如C₁-C₂₀烷基芳基)中的術語“C₁-C₂₀烷基”表示包含1-20個、例如1-15個、1-10個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子)、特別是1-6個碳原子的飽和直鏈或支鏈的烷基，包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、二級丁基、異丁基、三級丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、正己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3,-二甲基-2-丁基等。較佳地，“C_1-20烷基”是甲基、乙基、異丙基、三級丁基中的任一種。

術語“C₂-C₂₀鏈烯基”表示如上所定義的直鏈或支鏈的烷基，但其含有1個或多個例如1-10個例如1、2、3、4或5個雙鍵，但其不包含炔基。示例性鏈烯基包括乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、二級丁烯基、異丁烯基、正戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、正己烯基、2-己烯基、3-己烯基、2-甲基-2-戊烯基等。

單獨的或者組合(例如C₃-C₂₀環烷基芳基)中的術語“C_3-20環烷基”表示具有3-20個、例如3-15個、3-10個(例如3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子)、特別是3-6個碳原子的飽和環烷基，包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基等。特別的“C₃-₇環烷基”是環丙基、環戊基、環己基等。

術語“C₃-C₂₀環烯基”表示具有3-20個、例如3-15個、3-10個(例如3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子)、特別是3-6個碳原子的環烷基，其包含1個或多個例如1-10個例如1、2、3、4或5個雙鍵，但其不包含炔基，且不為芳香族基團。示例性環烯基包括環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基等。特別的“C₃-₇環烯基”是環丙烯基、環戊烯基、環己烯基等。

單獨的或者組合中的術語“鹵素”表示氟、氯、溴或碘，特別的是氟、氯或溴。

單獨的或者組合中的術語“鹵烷基”是指被一個或多個(例如1、2、3、4或5個)鹵素取代的上面定義的烷基。

單獨的或者組合中的術語“胺基”表示一級胺基(-NH₂)、二級胺基(-NH-)或三級胺基。

術語“羰基”，又稱“-C(=O)-”，是指二價的基團，其僅由一個碳原子和一個氧原子構成，碳原子和氧原子之間藉由雙鍵連接，並且自身結構中的碳原子還分別藉由單鍵連接至其他兩個片段。

術語“雜環烷基”，又稱“雜環基”，指由碳原子與氮、氧或硫等雜原子組成的飽和或部分不飽和(包含1或2個雙鍵)的非芳香環狀基團，此環狀基團可以是單環或雙環基團。在本發明中，雜環烷基可以為3-20員雜環烷基例如3-15員、3-10員、3-7員、3-6員、5-7員、4-6員雜環烷基。雜環烷基中的碳原子個數可以為2-16個例如2-11個，雜原子個數可以為1個或多個，較佳為1、2、3或4個，雜環烷基中的氮、碳或硫原子可視需要地被氧化。“雜環烷基”上的氫原子獨立視需要地被一個或多個本發明所描述的取代基所取代。“雜環烷基”可以藉由環上任意的環原子鏈接到母體分子上。術語“3-6員雜環烷基”和“3-7員雜環烷基”分別是指包含3-6個和 3-7個環成員(其選自碳原子和雜原子或雜原子基團)的飽和或部分不飽和單環或多環雜環烷基，該雜原子或雜原子基團選自N、O、S(O)_m(其中m是0至2中的任一整數)；例如吖丙啶基、吖丁啶基、氧雜環丁基、四氫吡咯基、側氧吡咯烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、哌啶基、嗎啉基、哌嗪基、硫嗎啉基、四氫吡喃基、1,1-二氧化硫嗎啉基等。

術語“芳基”表示任何穩定的6-15員例如6-10員單環或雙環芳香族碳環烴基，包括苯基、萘基、四氫萘基、2,3-二氫化節基或聯苯基等。“芳基”上的氫原子獨立視需要地被一個或多個本發明所描述的取代基所取代。

術語“雜芳基”或“雜環芳基”表示環上的碳原子被至少一個選自硫、氧或氮的雜原子置換形成的芳香環基團。此芳香環基團可以是5-15員環，例如5-7員或5-6員單環或7-12雙環基團，包括但不限於5、6、7、8、9或12員雜芳基。在本發明中，雜芳基中的雜原子個數較佳為1、2、3或4。示例性雜芳基例如選自噻吩基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、吡啶-2(1H)-酮基、吡啶-4(1H)-酮基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、咪唑基、四氮唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基等。“雜芳基”上的氫原子獨立視需要地被一個或多個本發明所描述的取代基所取代。

術語“C_6-15芳基”表示具有6-15個碳原子的芳基，其中“芳基”如以上所定義。

術語“5-15員雜芳基”表示具有5-15個環原子的芳雜基，其中“雜芳基”如以上所定義。

術語“氰基”表示基團-CN。

術語“羧基”表示基團-COOH。

術語“羥基”表示基團-OH。

術語“取代的”指具有被一個或多個取代基諸如1-25、1-20、1-10或1-5個例如1、2、3、4、5個取代基取代。取代基包括但不限於烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、醯基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基、雜烯基、雜炔基、雜烷芳基、鹵素、側氧、氰基、硝基、胺基、烷胺基、羥基、烷氧基、烷醯基、羰基、胺甲醯基、胍基、脲基、脒基，以及上述基團或部分的組合。取代基包括但不限於F、Cl、甲基、苯基、苯甲基、OR、NR₂、SR、SOR、SO₂R、OCOR、NRCOR、NRCONR₂、NRCOOR、OCONR₂、RCO、COOR、烷基-OOCR、SO₃R、CONR₂、SO₂NR₂、NRSO₂NR₂、CN、CF₃、OCF₃、SiR₃及NO₂，其中R各自獨立地為H、烷基、烯基、芳基、雜烷基、雜烯基或雜芳基，且其中同一或相鄰原子上的兩個視需要存在的取代基可接合以形成含有3-8個成員的稠合、視需要取代的芳族或非芳族、飽和或不飽和環，或同一原子上的兩個視需要存在的取代基可接合以形成含有3-8個成員的視需要取代的芳族或非芳族、飽和或不飽和環。

術語“視需要”表示其後的事情或情形等可以發生/存在或不發生/不存在。例如，“視需要取代的”表示所涉及的基團可以被取代或不被取代。

術語“包括”還涵蓋由所涉及的特徵或元素組成的情形或基本上由所涉及的特徵或元素組成的情形。

術語“立體異構體”包含所有的同分異構形式，包括對映異構體、非對映異構體和幾何異構體(順反異構體)。因此，本發明中所設計的化合物的單個立體化學異構體或其對映異構體、非對映異構體、或幾何異構體(或順反異構體)的混合物都屬本發明的範圍。

術語“藥學上可接受的鹽”表示本發明的化合物以它們的藥用鹽的形式存在，包括酸加成鹽和鹼加成鹽。在本發明中，藥學上可接受的無毒的酸加成鹽表示本發明中的化合物與有機或無機酸形成的鹽，有機或無機酸包括但不限於鹽酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硝酸、高氯酸、乙酸、草酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、苯磺酸、甲磺酸、水楊酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、丙酸、苯甲酸、對甲苯磺酸、蘋果酸等。藥學上可接受的無毒的鹼加成鹽表示本發明中的化合物與有機或無機鹼所形成的鹽，包括但不限於鹼金屬鹽，例如鋰、鈉或鉀鹽；鹼土金屬鹽，例如鈣或鎂鹽；有機鹼鹽，例如藉由與含N基團的有機鹼形成的銨鹽或N⁺(C_1-6烷基)₄鹽。

術語“溶劑化物”表示一個或多個溶劑分子與本發明中的化合物所形成的締合物。形成溶劑化物的溶劑包括但不限於水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、N,N-二甲基甲醯胺、二甲亞碸等。

術語“水合物”是指水與本發明中的化合物形成的締合物。

術語“前藥”表示作為本發明的化合物的化學衍生物，該衍生物在體內藉由發生化學反應轉換成通式I-1或I-2所表示的化合物。

術語“同位素標記物”表示通式I-1和式I-2中的1個或多個例如1、2、3、4或5個氫原子被氘原子所替換得到的同位素標記物、碳原子被1個或多個例如1-3個碳14原子(¹⁴C)所替換得到的同位素標記物。

術語“藥物：抗體比率”或“DAR”是指綴合於本文所述的E部分(例如抗體、Fc結構域或白蛋白)的小分子藥物部分(D¹和D²)與E部分的比例。在本文所述的一些實施方案中，DAR是由式I-1中的n：m表示，為1至20，較佳自2至10，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。DAR也可被計算為產品中分子群體的平均DAR，即藉由檢測方法(例如藉由MS法)測得的產品中綴合於本文所述的E部分(例如抗體、Fc結構域或白蛋白)的小分子藥物部分(D¹和D²)與E部分的總體比例，此DAR在文中稱為平均DAR。在一些實施方案中，本發明偶聯物的平均DAR值是在0.5與10.0之間，例如1.0-8.0，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0，或以這些數值中的兩個作為端點的範圍。

序列SEQ ID NO：1-68以及其描述

SEQ ID NO：1：N端(粗體)具有IL2信號序列(粗體)的鼠科動物Fc-IgG2a

SEQ ID NO：2：成熟鼠科動物Fc-IgG2a

SEQ ID NO：3：N端(粗體)具有IL2信號序列且添加有N端MVRS胺基酸序列(下劃線)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：4：N端添加有MVRS胺基酸序列(下劃線)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：5：N端添加有IL2信號序列(粗體)並且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的鼠科動物Fc-IgG2a

SEQ ID NO：6：C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的成熟鼠科動物Fc-IgG2a

SEQ ID NO：7：N端添加有IL2信號序列(粗體)和MVRS胺基酸序列(下劃線)而且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：8：N端添加有MVRS胺基酸序列(下劃線)而且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的人類成熟Fc-IgG1

SEQ ID NO：9：N端添加有IL2信號序列(粗體)和MVRS胺基酸序列(下劃線)，鉸鏈區具有兩個外加的半胱胺酸(*)而且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：10：N端添加有MVRS胺基酸序列(下劃線)，鉸鏈區含有兩個外加的半胱胺酸(*)而且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：11：N端添加有MVRS胺基酸序列(下劃線)，鉸鏈區含有兩個外加的半胱胺酸(*)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：12：N端添加有IL2信號序列(粗體)和Asn至Ala取代(*)而且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的鼠科動物Fc-IgG2a

SEQ ID NO：13：含有Asn至Ala取代(*)而且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的鼠科動物Fc-IgG2a

SEQ ID NO：14：N端添加有IL2信號序列(粗體)和MVRS胺基酸序列(下劃線)，含有Asn至Ala取代(*)而且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：15：N端添加有MVRS胺基酸序列(下劃線)，含有Asn至Ala取代(*)而且C端添加有六個組胺酸標簽(斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：16：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)而且添加有N端ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：17：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)而且添加有N端ISAMVRS胺基酸系列(下劃線)，含有C端G4S連接體(斜體)和C端c-Myc標簽(下劃線，斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：18：N端添加有ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，C端添加有G4S連接體(斜體)而且C端添加有c-Myc標簽(下劃線，斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：19：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，而且含有賴胺酸至絲胺酸改變(*)以防止該位點偶聯的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：20：N端添加有ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)而且含有賴胺酸至絲胺酸改變(*)以防止該位點偶聯的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：21：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，含有賴胺酸至絲胺酸改變(*)以防止該位點偶聯，而且C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線，斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：22：N端添加有ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，含有賴胺酸至絲胺酸改變(*)以防止該位點偶聯，而且C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線，斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：23：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，含有Asn至Ala改變(*)，而且C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線，斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：24：N端添加有ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，含有Asn至Ala改變(*)而且C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線，斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：25：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，含有H310A(*)和H435A(*)改變以防止FcRn結合，而且C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線，斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：26：N端添加有ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，含有H310A(*)和H435A(*)改變以防止FcRn結合，而且C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線，斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：27：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，而且C端添加有G4S連接體(斜體)和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，粗體)c-Myc標簽(下劃線，斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：28：N端添加有ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)而且C端添加有G4S連接體(斜體)和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，粗體)c-Myc標簽(下劃線，斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：29：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，含有Asn至Ala取代(*)而且C端添加有G4S連接體(斜體)和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，粗體)c-Myc標簽(下劃線，斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：30：N端添加有ISAMVRS胺基酸序列(下劃線)，含有Asn至Ala取代(*)而且C端添加有G4S連接體(斜體)和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，粗體)c-Myc標簽(下劃線，斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：31：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)，具有同種異型G1m(fa)(粗斜體)，而且C端添加有G4S連接體(斜體)和突變型(賴胺酸至苯丙胺酸，粗體)c-Myc標簽(下劃線，斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：32：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)，具有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：33：N端添加有MVRS胺基酸序列(下劃線)而且含有YTE三重突變(粗體，下劃線)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：34：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)，含有成熟人類Fc-IgG1的鉸鏈區EPKSS胺基酸序列(下劃線)，而且含有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)以及同種異型G1m(fa)(粗斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：35：N端添加有鼠科動物IgG信號序列(粗體)，去除掉成熟人類Fc-IgG的鉸鏈區EPKSSD胺基酸序列，而且具有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：36：N端去除掉成熟人類Fc-IgG的鉸鏈區EPKSSD胺基酸序列，具有同種異型G1m(fa)(粗斜體)而且含有YTE三重突變(粗體，下劃線)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：37：N端去除掉成熟人類Fc-IgG的鉸鏈區EPKSSD胺基酸序列，具有LS雙突變(粗體，下劃線)而且具有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：38：N端添加有人類血清白蛋白信號序列(粗體)，含有YTE三重突變(粗體，下劃線)，具有同種異型G1m(fa)(粗斜體)而且C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線)的人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：39：成熟人類Fc-IgG1，其中X₁為Met或Trp，X₂為Ser或Thr，X₃為Thr或Glu，X₄為Asp或Glu，且X₅為Leu或Met，X₆為Met或Leu，且X₇為Asn或Ser

SEQ ID NO：40：成熟人類Fc-IgG1，其中X₄為Asp或Glu，且X₅為Leu或Met

SEQ ID NO：41：具有YTE三重突變(粗體，下劃線)的成熟人類Fc-IgG1，而且其中X₄為Asp或Glu，且X₅為Leu或Met

SEQ ID NO：42：具有YTE三重突變(粗體，下劃線)而且具有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：43：具有YTE三重突變(粗體，下劃線)而且具有同種異型G1m(f)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：44：具有LS雙重突變(粗體，下劃線)的成熟人類Fc-IgG1，而且其中X₄為Asp或Glu，且X₅為Leu或Met

SEQ ID NO：45：具有LS雙重突變(粗體，下劃線)而且具有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：46：具有LS雙重突變(粗體，下劃線)而且具有同種異型G1m(f)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：47：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)的成熟人類Fc-IgG1，其中X₁為Met或Trp，X₂為Ser或Thr，X₃為Thr或Glu，X₄為Asp或Glu，且X₅為Leu或Met，X₆為Met或Leu，且X₇為Asn或Ser

SEQ ID NO：48：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，而且含有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：49：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，而且含有同種異型G1m(f)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：50：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，具有M428L和N434S突變(粗體，下劃線)，而且含有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：51：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，具有M428L和N434S突變(粗體，下劃線)，而且含有同種異型G1m(f)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：52：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，具有YTE三重突變(粗體，下劃線)，而且含有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：53：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，具有YTE三重突變(粗體，下劃線)，而且含有同種異型G1m(f)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：54：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(斜體)，具有M428L、N434S突變(粗體，下劃線)，C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線)，而且含有同種異型G1m(f)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：55：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(斜體)，具有M428L、N434S突變(粗體，下劃線)，C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線)，而且含有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：56：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(斜體)，具有YTE三重突變(粗體，下劃線)，C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線)而且含有同種異型G1m(f)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：57：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)和ISAMVRS胺基酸序列(斜體)，具有YTE三重突變(粗體，下劃線)，C端添加有G4S連接體(斜體)和c-Myc標簽(下劃線)而且含有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：58：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，C端添加有G4S連接體(斜體)和IgA肽標簽(下劃線)而且含有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：59：N端添加有小鼠重鏈MIgG Vh信號序列(粗體)，具有半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，具有M428L、N434S突變(粗體，下劃線)，C端添加有G4S連接體(斜體)和IgA肽標簽(下劃線)而且含有同種異型G1m(fa)(粗斜體)的成熟人類Fc-IgG1

SEQ ID NO：60：成熟人類Fc-IgG1，Z₁為Cys或Ser，且其中X₁為Met或Trp，X₂為Ser或Thr，X₃為Thr或Glu，X₄為Asp或Glu，且X₅為Leu或Met，X₆為Met或Leu，且X₇為Asn或Ser

SEQ ID NO：61：成熟人類Fc-IgG1，半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，且其中X₁為Met或Trp，X₂為Ser或Thr，X₃為Thr或Glu，X₄為Asp或Glu，且X₅為Leu或Met，X₆為Met或Leu，且X₇為Asn或Ser

SEQ ID NO：62：成熟人類Fc-IgG1，半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，且其中X₄為Asp或Glu，且X₅為Leu或Met

SEQ ID NO：63：成熟人類Fc-IgG1，半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，同種異型G1m(f)(粗斜體)

SEQ ID NO：64：成熟人類Fc-IgG1，半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，同種異型G1m(fa)(粗斜體)

SEQ ID NO：65：成熟人類Fc-IgG1，半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，M428L、N343S突變(粗體，下劃線)，同種異型G1m(fa)(粗斜體)

SEQ ID NO：66：成熟人類Fc-IgG1，半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，M428L、N343S突變(粗體，下劃線)，同種異型G1m(f)(粗斜體)

SEQ ID NO：67：成熟人類Fc-IgG1，半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，YTE三重突變(粗體，下劃線)，同種異型G1m(fa)(粗斜體)

SEQ ID NO：68：成熟人類Fc-IgG1，半胱胺酸至絲胺酸改變(#)，YTE三重突變(粗體，下劃線)，同種異型G1m(f)(粗斜體)

圖1為偶聯物1的SEC-HPLC圖。

圖2為偶聯物2的SEC-HPLC圖。

圖3為偶聯物3的SEC-HPLC圖。

圖4為偶聯物4的SEC-HPLC圖。

圖5為偶聯物5的SEC-HPLC圖。

圖6為偶聯物6的SEC-HPLC圖。

圖7為偶聯物7的SEC-HPLC圖。

圖8為偶聯物8的SEC-HPLC圖。

圖9為偶聯物9的SEC-HPLC圖。

圖10為偶聯物1的LCMS圖。

圖11為偶聯物2的LCMS圖。

圖12為偶聯物3的LCMS圖。

圖13為偶聯物4的LCMS圖。

圖14為偶聯物5的LCMS圖。

圖15為偶聯物6的LCMS圖。

圖16為偶聯物7的LCMS圖。

圖17為偶聯物8的LCMS圖。

圖18為偶聯物9的LCMS圖。

圖19為偶聯物1的殘留游離藥物含量圖。

圖20為偶聯物2的殘留游離藥物含量圖。

圖21為偶聯物3的殘留游離藥物含量圖。

圖22為偶聯物4的殘留游離藥物含量圖。

圖23為偶聯物5的殘留游離藥物含量圖。

圖24為偶聯物6的殘留游離藥物含量圖。

圖25為偶聯物7的殘留游離藥物含量圖。

圖26為偶聯物8的殘留游離藥物含量圖。

圖27為偶聯物9的殘留游離藥物含量圖。

本發明的上述以及其它方面和實施方案示例於以下實施例中。上文以及整個本申請中所論述的任何或所有特徵可以在本發明的各種實施方案中組合。以下實施例進一步說明本發明，然而，應理解實施例以說明而非限定的方式來描述，並且所屬技術領域具有通常知識者可以進行多種修改。

實施例1：Fc部分的製備

將蛋白質胺基酸序列(SEQ ID Nos：1-68)反向翻譯並且合成對應的核苷酸序列。將該核苷酸序列兩端帶上合適的酶切位點(XbaI+SalI)，然後選殖進入pWX4.1表達載體(藥明生物技術有限公司，上海)。每個構建的載體或帶有人白介素2的信號肽序列或者是人的血清白蛋白的信號肽序列。將pWX4.1質粒轉染進入大腸桿菌Top10株(Life Technologies)以擴增DNA，並試用PURELINK® HiPURE Plasmid Filter Maxiprep Kit(Life Technologies)純化。然後使用EXPIFECTAMINE^TM 293 Transfection Kit(Life Technologies)將質粒轉染進入CHO細胞(ATCC)。將轉染後的細胞進行培養7天，之後離心沉澱，過濾，收取上清，用MabSelect Sure Resin(GE Healthcare,Chicago,IL,USA)進行純化，獲得純化的h-IgG Fc。所純化後的樣品進行4-12% Bis Tris SDS-PAGE電泳，上樣1-2μg，然後使用考馬斯亮藍染色。每個樣品同時進行還原(R)和非還原(NR)處理。

實施例2：h-IgG1 Fc-PEG4-疊氮化物的通用合成方法

在0℃條件下，將PEG-疊氮-NHS酯(1至20當量)溶於DMF/PBS的溶液中，並將該溶液加入到實施例1製備的h-IgG1 Fc的PBS溶液中。反應在室溫下攪拌反應1至10小時，採用離心機濃縮。PBS溶液洗滌，採用製備色譜製備目標h-IgG1 Fc-PEG4-疊氮化物。

實施例3：偶聯物的通用製備方法

h-IgG1 Fc-PEG4-疊氮化物溶於PBS的溶液中，加入到末端炔基化合物、硫酸銅、三(3-羥丙基三唑基甲基)-胺和抗壞血酸鈉的PBS溶液中，反應液反應至少12個小時，PBS稀釋反應液，採用離心機濃縮。 PBS溶液洗滌，採用製備色譜製備目標偶聯物。採用MS分析偶聯物的平均DAR(藥物/抗體比例)。

實施例4：藥物中間體(INT-DRUG)的合成

第1步，INT-DRUG-2的合成

在反應瓶中加入INT-DRUG-1(3.0g,6.57mmol)，再加入四氫呋喃(30mL)，三苯基磷(1.9g,7.23mmol)，反應在30℃下攪拌2小時。反應結束後再加入一水合氫氧化鋰(28mg)和水(1.5mL)，在30℃下繼續攪拌16h。TLC監測反應結束後，再加入N,N'-二-Boc-1H-1-胍基吡唑(2.1g,6.91mmol)，在30℃下攪拌48h。反應結束後濃縮反應液，用矽膠管柱層析分離純化(乙酸乙酯/石油醚=1：1)。純化得到INT-DRUG-2(2.2g)無色油狀物。LCMS：[M+1]⁺觀察值673.40

第2步，INT-DRUG-3的合成

在反應瓶中加入INT-DRUG-2(2.19g,3.25mmol)，並用氮氣保護，再加入乾燥的甲醇鈉(0.65mmol)的甲醇(8mL)溶液，在室溫下攪拌10分鐘，用HC1(0.4N，1,4-二噁烷溶液，2.5mL)淬滅反應。濃縮反應液，用矽膠管柱層析分離純化(乙酸乙酯/石油醚，70%~100%)，純化得到INT-DRUG-3(1.15g)白色固體。LCMS：[M+1]⁺觀察值547.33.

第3步，INT-DRUG-4的合成

在反應瓶中加入INT-DRUG-3(386.9mg,0.71mmol)，乙腈(10mL)，CDI(160.8mg，0.99mmol)，DMAP(302.7mg，2.47mmol)。反應在室溫下攪拌16小時。反應結束後濃縮反應液，用矽膠管柱層析純化分離(乙酸乙酯/石油醚，0%~45%)得到INT-DRUG-4(242.8mg)白色固體。LCMS：[M+1]⁺觀察值573.35。

第4步，INT-DRUG-5的合成

在反應瓶中加入INT-DRUG-4(403mg，0.7mmol)，DMAP(1.37g，11.2mmol)，吡啶(60mL)，對硝基氯甲酸苯酯(2.11g，10.5mmol)，氮氣置換後在40℃下攪拌4h，LCMS檢測反應>90%的轉化後，加水(20mL)淬滅反應(不能久置)，反向管柱分離(乙腈/水0%~90%)，凍乾得到INT-DRUG(173mg)白色固體。LCMS：[M+1]⁺觀察值738.33。

實施例5：中間體A(inter A)的合成

第1步：中間體2的合成

將化合物1(150g，1.43mol)和三乙胺(289g，2.85mol)加入反應瓶中，再加入四氫呋喃(1L)，氮氣置換後在0℃下攪拌。將CbzCl(243g，1.43mol)溶於四氫呋喃(500mL)中，再滴入反應液中。反應液在室溫下攪拌過夜。反應結束後，加入水(3L)淬滅反應，再用乙酸乙酯(300mL x 2)萃取。合併有機相用飽和食鹽水洗滌，再用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(二氯甲烷/甲醇，20/1)得到黃色油狀化合物2(255g)。

第2步：中間體3的合成

將化合物2(245g，1.02mol)和四溴化碳(509g，1.54mol)加入反應瓶中，再加入二氯甲烷(2L)，氮氣置換後在0℃下攪拌。將三苯基磷(403g，1.54mol)溶於二氯甲烷(500mL)中，再滴入反應液中。反應液在室溫下攪拌1.5h。反應結束後濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(二氯甲烷/甲醇，20/1)得到黃色油狀化合物3(200g，粗品)。

第3步：中間體4的合成

將化合物3(200g，粗品)加入反應瓶中，再加入N,N-二甲基甲醯胺(2L)。將卞胺(28.3g，264mmol)和碳酸鈉(73.0g，528mmol)加入反應液中。反應液在60℃下攪拌過夜。反應結束後，將溫度降至室溫，再加入水(3L)，再用乙酸乙酯(300mL x 2)萃取。合併有機相用飽和食鹽水洗滌，再用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(二氯甲烷/甲醇，20/1)得到黃色油狀化合物4(45g)。

第4-5步：中間體6的合成

將化合物4(43.0g，78.2mmol)和四氫呋喃(450mL)加入反應瓶中，氮氣置換後在0℃下攪拌。將LiAlH₄(23.7g，62.6mmol)加入反應液中。反應液在室溫下攪拌1.5h，然後再升溫至回流繼續攪拌6h。反應結束後降溫至0℃，再加入十水合硫酸鈉(90g)淬滅反應。反應液在室溫下攪拌1h。將三乙胺(31.7g，31.3mmol)和Boc酸酐(68.3g，31.3mmol)加入反應液中，在室溫下攪拌過夜。反應結束後，加入水(2L)，再用乙酸乙酯(300mL x 2)萃取。合併有機相用飽和食鹽水洗滌，再用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(二氯甲烷/甲醇，30/1)得到黃色油狀化合物6(20g)。LCMS：[M+1]⁺觀察值510.2。

第6步：inter A的合成

在氮氣環境下將化合物6(19g，3.73mmol)，鈀碳(2g)和甲醇(400mL)加入反應瓶中。用氫氣置換數次。反應液在室溫下攪拌過夜。反應結束後將反應液過濾，濾餅用甲醇(50mL)沖洗，濾液濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(二氯甲烷/甲醇，15/1)得到黃色油狀中間體A(14g)。LCMS：[M+1]⁺觀察值420.2。

實施例6：linker 1的合成

第1步：化合物9的合成

將化合物8(1.5g，6.51mmol)和三乙胺(1.97g,19.5mmol)溶於二氯甲烷(30mL)中，氮氣置換後在0℃下攪拌。將對硝基氯甲酸苯酯(1.31g，6.51mol)溶於二氯甲烷(3mL)中，再用注射器滴入反應液中。反應液在室溫下攪拌6h。反應結束後濃縮得到粗品化合物9。

第2步：化合物10的合成

將粗品化合物9(1.47mmol)和三乙胺(1.97g,19.5mmol)溶於二氯甲烷(20mL)中，在室溫下攪拌。將中間體A(2.71g，1.47mol)溶於二氯甲烷(2mL)中，再加入反應液中。反應液在室溫下攪拌過夜。反應結束後濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯，1/1)得到黃色油狀化合物10(1.6g)。

第3步：linker 1的合成

將化合物10(1.8g，2.66mmol)溶於1,4-二噁烷(10mL)中，再加入HCl(4M，1,4-二噁烷溶液，10mL)在室溫下攪拌2h。反應結束後濃縮得到粗品黃色油狀linker1(1.6g)。LCMS：[M+1]⁺觀察值478.2。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ 9.50(s,4H),4.23(s,4H),3.86-3.62(m,18H),3.17(s,3H),2.81(s,5H),2.48(s,1H),1.73(s,6H)。

實施例7：Linker 2的合成

第1步：化合物L2-2的合成

將化合物L2-1(2.00g，8.6mmol)和三乙胺(2.61g,26mmol)溶於二氯甲烷(20mL)中，氮氣置換後在0℃下攪拌。將對硝基氯甲酸苯酯 (1.73g，8.6mol)溶於二氯甲烷(3mL)中，再用注射器滴入反應液中。反應液在30℃下攪拌6h。反應結束後，加入水，再用乙酸乙酯萃取。合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯，100/1~20/1)得到黃色油狀化合物L2-2(1.3g)。

第2步：化合物L2-3的合成

將化合物2(1.3g，3.2mmol)和N,N-二異丙基乙胺DIEA(0.83g,6.4mmol)溶於乙腈(15mL)中，在室溫下攪拌。將中間體A(1.34g，3.2mmol)溶於乙腈(5mL)中，再加入反應液中。反應液在80℃下攪拌過夜。反應結束後，加入水(20mL)，再用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(二氯甲烷/甲醇，20/1)得到黃色油狀化合物L2-3(1.2g)。

第3步：Linker 2的合成

將化合物L2-3(1.2g，1.8mmol)溶於1,4-二噁烷(10mL)中，再加入HCl(4M，1,4-二噁烷溶液，10mL)在室溫下攪拌2h。反應結束後濃縮得到粗品棕色油狀Linker 2(0.93g)。LCMS：[M+1]⁺觀察值477.3。

¹H NMR(400MHz,DMSO_d ₆)8.94(s,4H),6.41(m,1H),4.14(s,2H),3.65-3.67(m,4H),3.54(m,6H),3.51(m,4H),3.44-3.34(m,11H),3.16-3.18(m,2H),3.06(m,4H),2.54(s,6H)。

實施例8：Linker 4的合成

第1步：L4-2的合成

將氯甲酸三氯甲酯(539mg，1.02mol)溶於乾燥的四氫呋喃(5mL)中，氮氣置換後在0℃下攪拌。將化合物L4-1(500mg，2.27mmol)和DIEA溶於四氫呋喃(5mL)中，再滴入反應液中。反應液在0℃下攪拌1h。反應結束後用矽藻土過濾得到濾液，濃縮得到粗品化合物L4-2。未經純化直接用於下一步。

第2步：L4-3的合成

將中間體A(300mg，0.715mmol)和DIEA(277mg,2.15mmol)溶於二氯甲烷(2mL)中，在0℃下攪拌。將粗品化合物L4-2溶於二氯甲烷(1mL)中，再滴入反應液中。反應液在室溫下攪拌過夜。反應結束後，用1N的鹽酸將pH調至7，用二氯甲烷(2x1mL)萃取。合併有機相，濃縮得到粗品。粗品用製備矽膠板純化得到黃色油狀化合物L4-3(150mg)。LCMS：[M+1]⁺觀察值666.4。

第3步：L4-4的合成

在氮氣環境下將化合物L4-3(3g，4.51mmol)，氫氧化鈀/碳(0.3g)和甲醇(60mL)加入反應瓶中。用氫氣置換數次。反應液在室溫下攪拌過夜。反應結束後將反應液過濾，濾餅用甲醇(10mL)沖洗，濾液濃縮得到粗品黃色油狀物化合物L4-4(2.4g)。LCMS：[M+1]⁺觀察值532.3。

第4步：L4-5的合成

將化合物L4-4(2.4g，4.51mmol)和DIEA(1.74g,13.4mmol)和中間體C(3.08g，9.02mmol)溶於DMF(20mL)中，氮氣置換後在80℃下攪拌過夜。反應結束後降至室溫，加入水(100mL)，再用乙酸乙酯(2x20mL)萃取。合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化(二氯甲烷/甲醇，20/1)得到粗品。再用製備矽膠板純化3次得到黃色油狀化合物L4-5(350mg)，LCMS：[M+1]⁺觀察值702.3。

第5步：Linker 4的合成

將化合物L4-5(350mg，2.66mmol)溶於1,4-二噁烷(3mL)中，再加入HCl(4M，1,4-二噁烷溶液，5mL)在室溫下攪拌2h。反應結束後濃縮得到粗品黃色油狀Linker 4(310mg)。LCMS：[M+1]⁺觀察值502.3，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ 12.19-12.17(m,1H),9.53-9.48(m,4H),4.26-4.22(m,2H),4.06-4.15(m,31H),3.07-2.70(m,9H),2.53-2.27(m,6H),2.18(s,1H),1.27-1.24(m,4H)。

實施例9：Linker 5的合成

第1步：L5-2的合成

將N-Boc-4-羥基哌啶(5.0g，14.6mmol)和DMF(50mL)加入反應瓶中，氮氣置換後在0℃下攪拌。將鈉氫(0.64g，16mmol)加入反應液中。反應液在室溫下攪拌0.5h，然後再加入化合物1(3.2g，16mmol)加入反應液中繼續室溫攪拌2h。反應結束後將反應液加入至冰水中，再用乙酸乙酯萃取。合併有機相用飽和食鹽水洗滌，再用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品化合物L5-2(4.5g)。

第2步：L5-3的合成

將化合物L5-2(4.5g，12.1mmol)溶於乙酸乙酯(30mL)中，再加入HCl(4M，乙酸乙酯，30mL)在室溫下攪拌2h。反應結束後濃縮得到粗品化合物L5-3(5.0g)。LCMS：[M+1]⁺觀察值272.2。

第3步：L5-4的合成

將化合物L5-3(5.00g，粗品)和三乙胺(5.6g,55.2mmol)溶於二氯甲烷(50mL)中，氮氣置換後在室溫下攪拌。將對硝基氯甲酸苯酯(5.6g，27.6mmol)溶於二氯甲烷(10mL)中，再用注射器滴入反應液中。反應液在室溫下攪拌2h。反應結束後，加入冰水，再用二氯甲烷萃取。合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化得到黃色油狀化合物L5-4(5.2g，粗品)。LCMS：[M+1]⁺觀察值437.1。

第4步：L5-5的合成

將化合物L5-4(5.2g，粗品)和碳酸鉀(1.91g,13.8mmol)溶於二甲基甲醯胺DMF(20mL)中，在室溫下攪拌。將中間體A(1.94g，4.6mmol)溶於DMF(5mL)中，再加入反應液中。反應液在130℃下攪拌48h。反應結束後，加入水(200mL)，再用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗品。粗品用矽膠管柱層析純化得到黃色油狀化合物L5-5(0.8g)。LCMS：[M+1]⁺觀察值717.5。

第5步：Linker 5的合成

將化合物L5-5(0.8g，1.1mmol)溶於乙酸乙酯(10mL)中，再加入HCl(4M，乙酸乙酯，10mL)在室溫下攪拌2h。反應結束後濃縮得到粗品化合物Linker 5(0.61g)。LCMS：[M+1]⁺觀察值517.3。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ 9.63(s,4H),4.23(d,2H),3.95(s,4H),3.75(s,3H),3.73-3.65(m,17H),3.26-3.14(m,6H),2.79(m,9H),2.48(s,1H),2.02(d,2H),1.72(s,2H).

實施例10：中間體Inter B的合成

第1步：IB-2的合成

將2-(2-BOC-胺基乙氧基)乙醇(IB-1，9.03g,44.0mmol)和咪唑(6.58g,96.8mmol)溶於二氯甲烷(100mL)中，逐滴加入三級丁基二甲基氯矽烷(7.30g,48.4mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液，室溫攪拌16小時，反應完畢後加入二氯甲烷(100mL)，並依次用用稀鹽酸(0.5M,200 mL*2)和飽和碳酸氫鈉(200mL*2)洗，有機相經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮並用矽膠管柱層析(PE：EA=3：1)純化得白色固體IB-2(13.5g)。

第2步：IB-3的合成

將IB-2(13.5g,42.3mmol)溶於DMF(100mL)中，冰浴下加入鈉氫(6.77g,169mmol)，攪拌20分鐘後加入碘甲烷(13mL,212mmol)，隨後室溫攪拌16小時。反應完畢後加入水(100mL)和乙酸乙酯(200mL)，有機相經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得IB-3粗品(17.0g)，直接進行下一步反應。

第3步：IB-4的合成

將IB-3(17.0g，按42.3mmol計算)和三水合四丁基氟化銨(29.34g,93.0mmol)溶於四氫呋喃(100mL)中，室溫攪拌1小時。反應完畢後加入水(200mL)，用乙酸乙酯萃取(100mL*3)，隨後用飽和食鹽水洗(100mL*2)，有機相經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後用矽膠管柱層析(PE：EA=2：1)純化得棕色油狀物IB-4(5.6g)。LCMS[M-100]⁺：120.15

第4步：Inter B的合成

將IB-4(13.0g,59.32mmol)和四溴化碳(29.5g,88.98mmol)溶於二氯甲烷(50mL)中，冰浴下逐滴加入三苯基膦(23.34g,88.98mmol)的二氯甲烷溶液(20mL)，室溫攪拌24小時。反應完畢後減壓濃縮，用矽膠管柱層析(PE：EA=2：1)純化得無色油狀物IB-4(6.5g)。LCMS[M-100]⁺：182.17。

實施例11：Linker 8的合成

第1步：L8-2的合成

在丙炔基-三聚乙二醇(L8-1，5.0g,26.56mmol)溶於二氯甲烷(50mL)中，加入N,N-二異丙基乙胺(6.87g,53.13mmol)和對甲苯磺醯氯(5.57g,29.22mmol)，室溫攪拌10小時。反應完畢後用水(50mL)洗，有機相經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後得L8-2粗品(11.0g)，直接進行下一步反應。LCMS[M+1]⁺：343.23。

第2步：L8-3的合成

將L8-2(11.0g，按26.56mmol計算)溶於四氫呋喃(50mL)中，加入4-三級丁氧羰基胺基哌啶(5.3g,26.56mmol)和N,N-二異丙基乙胺(6.9g,53.12mmol)，70^℃攪拌24小時。反應完畢後減壓濃縮，經矽膠管柱層析(EA)純化得棕色油狀物L8-3(5.1g)。LCMS[M+1]⁺：371.40

第3步：L8-4的合成

將L8-3(3.43g,9.27mmol)置於鹽酸乙酸乙酯溶液(30ml)中室溫攪拌1小時，反應結束後濃縮得粗品L8-4(2.5g)，直接進行下一步反應。LCMS[M+1]⁺：271.30

第4步：L8-6的合成

將L8-4粗品(2.5g，按9.27mmol計算)溶於DMF(50ml)中，加入L8-5(6.5g,23.1mmol)和DIEA(2.4g,18.5mmol)，75℃攪拌24小時。減壓濃縮，經矽膠管柱層析(DCM：MeOH=10：1)和反向HPLC製備得L8-6(90mg)。LCMS[M+1]⁺：673.60。

第5步：Linker 8的製備

將L8-6(90mg,0.15mmol)置於鹽酸1,4-二噁烷溶液(5ml)中室溫攪拌1小時，反應結束後濃縮得Linker 8粗品(80mg)。

實施例12：Linker 9的合成

第1步：L9-2的合成

將L9-1(3.2g，9.17mmol)加入反應瓶中，再加入甲胺的甲醇溶液(10mL)和KI(304mg，1.83mmol)在室溫下攪拌過夜。反應結束後，旋蒸去除溶劑得到粗品L9-2，直接進行下一步反應。

第2步：L9-3的合成

將化合物L9-2粗品(1.9g，9.18mmol)溶於四氫呋喃：水(20mL：10mL)的混合溶劑中，再加入碳酸氫鈉(1.5g，18.36mmol)、二碳酸二三級丁酯(2.2g，10.1mmol)室溫攪拌過夜。反應結束後，加水淬滅 (30mL)，乙酸乙酯萃取(50mL*3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮有機相過管柱純化(PE：EA，EA=30%)得無色液體化合物L9-3(1.5g)。

第3步：L9-4的合成

將化合物L9-3(1.5g，4.88mmol)溶於四氫呋喃(15mL)中，0攝氏度下加入氫化鈉(290mg，7.33mmol，60%)，0攝氏度攪拌30分鐘，加入溴丙炔(700mg，5.86mmol)，室溫反應過夜，反應結束後加水(20mL)淬滅，乙酸乙酯(50mL*3)萃取，無水硫酸鈉乾燥後濃縮，過管柱純化(PE：EA，EA=40%)得無色黏稠狀產品L9-4(1.0g)。

第4步：L9-5的合成

將化合物L9-4(600mg，1.73mmol)溶於二氯甲烷(5mL)中，加入鹽酸二噁烷溶液(5mL，4M於二噁烷中)，室溫反應1h，反應結束後，直接濃縮得粗品鹽酸鹽L9-5，直接進行下一步反應。

第5步：L9-6的合成

將三光氣(300mg，0.98mmol)溶於四氫呋喃(15mL)中，氮氣環境冰水浴下加入吡啶(250mg，2.94mmol)的四氫呋喃溶液(2mL)，冰水浴攪拌30分鐘，加入化合物L9-5(550mg，1.96mmol)、三乙胺(300mg，2.94mmol)的四氫呋喃溶液(2mL)，室溫反應3h。反應結束後加水 (10mL)淬滅，乙酸乙酯(30mL*3)萃取，無水硫酸鈉乾燥後濃縮得粗品L9-6，直接進行下一步反應。

第6步：L9-7的合成

將化合物L9-6溶於四氫呋喃(15mL)中，加入Inter A(500mg，1.17mmol)的四氫呋喃溶液(2mL)，三乙胺(300mg，2.94mmol)、4-二甲胺基吡啶(20mg，0.16mmol)的四氫呋喃溶液(2mL)，60攝氏度反應4h，然後室溫攪拌過夜，反應結束後加水(10mL)淬滅，乙酸乙酯(30mL*3)萃取，無水硫酸鈉乾燥後濃縮，經製備得化合物L9-7(530mg)。

第7步：L9-8的合成

將化合物L9-7(100mg，0.14mmol)溶於二氯甲烷(5mL)中，加入鹽酸二噁烷溶液(5mL，4M in dioxane)，室溫反應1h，直接濃縮得粗品鹽酸鹽Linker 9，直接進行下一步反應。LCMS[M+1]⁺：491.3。

實施例13：Linker 10的合成

第1步：L10-2的合成

將氯磺醯異氰酸酯(400mg,2.83mmol)溶於二氯甲烷(10mL)中，氮氣保護，並在0℃攪拌。逐滴加入溴乙醇(353mg,2.83mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，0℃下攪拌1小時，再滴加L10-1(2.83mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，0℃下攪拌1小時。反應完畢後加入二氯甲烷(10mL)，再用稀鹽酸(1M,20mL)洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥，旋蒸除去溶劑並用矽膠管柱層析(PE：EA=1：1)純化得黃色油狀物粗品L10-2(800mg)。

第2步：L10-3的合成

將粗品L10-2(800mg)溶於二氯甲烷(10mL)中，加入三乙醇胺TEA(2mL)，室溫攪拌16小時。反應完畢後加入二氯甲烷(10mL)，再用稀鹽酸(1M,20mL)洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥，旋蒸除去溶劑並用矽膠管柱層析(PE：EA=1：3)純化得黃色油狀物L10-3(670mg)。

第3步：L10-4的合成

將L10-3(300mg,0.79mmol)，Inter A(330mg,0.79mmol)和TEA(160mg,1.60mmol)溶於乙腈(10mL)中，80℃下攪拌10小時。反應完畢後旋蒸除去溶劑，用反相管柱層析(乙腈/水)純化得黃色油狀物L10-4(190mg)。

第4步：Linker 10的合成

將L10-4(107mg,0.15mmol)置於鹽酸1,4-二噁烷溶液(5ml)中室溫攪拌1小時，反應結束後濃縮得粗品Linker 10，直接進行下一步反應。MS[M+1]⁺：513.51。

實施例14：Linker 11的合成

第1步：L11-4的合成

將L11-1(360mg,0.86mmol)，L11-2(238mg，0.86mmol)，L11-3(230mg，0.9mmol)和三乙胺(93mg，0.9mmol)溶於二氯甲烷(10mL)中，氮氣保護，並在室溫下攪拌3h攪拌。反應完畢後，旋蒸除去溶劑並用矽膠管柱層析(PE：EA=1：1)純化，得無色油狀物L11-4(830mg)。

第2步：L11-6的合成

將L11-4(406mg，0.62mmol)，L11-5(150mg，0.80mmol)，三苯基磷(241mg，0.92mmol)溶於四氫呋喃(10mL)中，氮氣保護，在0℃下攪拌10分鐘，再滴加DIAD(250mg，1.24mmol)的四氫呋喃溶液(2mL)，升溫至80℃攪拌12小時。反應完畢後，旋蒸除去溶劑並用矽膠管柱層析(PE：EA=1：1)純化得無色油狀物L11-6(190mg)。

第3步：Linker 11的合成

將L11-6(85mg,0.1mmol)置於TFA(5ml)中室溫攪拌3小時，反應結束後濃縮得粗品Linker 11，直接進行下一步反應。LCMS[M+1]⁺：432.41

實施例15：偶聯中間體C-Inter-1的合成

第1步：C-Inter-1-1的合成

將Linker 1(65mg，0.13mmol)加入反應瓶中，再加入DMF(10mL)和DIEA(2mL)在室溫下攪拌。再將INT-DRUG(200mg，0.27mmol)溶解在二氯甲烷(5mL)中，將溶液滴入反應中，在室溫下攪拌過夜。反應結束後，旋蒸去除溶劑得到粗品，用反向管柱純化(水/乙腈)，凍乾得產品C-Inter-1-1(216mg)。

第2步：C-Inter-1-2的合成

將化合物C-Inter-1-1(216mg，0.13mmol)溶於甲醇(2mL)中再加入氫氧化鋰水溶液(0.65mmol，2mL)，室溫攪拌1小時。反應結束後旋蒸除去溶劑得到粗品化合物C-Inter-1-2，直接用於下一步。

第3步：C-Inter-1的合成

將化合物C-Inter-1-2溶於三氟乙酸中，室溫攪拌10分鐘，旋蒸除去溶劑，得到粗品C-Inter-1。用反相管柱層析純化(0.1%TFA水溶液/0.1%TFA乙腈)，凍乾得到C-Inter-1(47mg)。LCMS：[M+1]⁺觀察值1166.53。

實施例16：偶聯中間體C-Inter-2的合成

第1步：C-Inter-2-1的合成

將Linker 2(100mg,0.20mmol)溶於DMF(1ml)中並加入DIEA(0.1g,1.23mmol)，INT-DRUG(300mg,0.41mmol)溶於DCM(2ml)後滴入混合液中室溫攪拌16小時，隨後減壓濃縮並用反向管柱層析製備得C-Inter-2-1(230mg)。

第2步：C-Inter-2-2的合成

將C-Inter-2-1(230mg,0.14mmol)溶於甲醇(5ml)並加入氫氧化鋰水溶液(30mg,1ml)，室溫攪拌1小時後減壓濃縮得C-Inter-2-2粗品(300mg)，直接進行下一步反應。

第3步：C-Inter-2的合成

將C-Inter-2-2粗品(300mg，按0.14mmol計算)溶於TFA(5ml)中，室溫攪拌5分鐘後減壓濃縮，反相製備HPLC純化得到C-Inter-2(72mg)。LCMS[M+1]⁺：1194.00。

實施例17：偶聯中間體C-Inter-3的合成

第1步：C-Inter-3-1的合成

將Linker 8粗品(80mg，按0.15mmol計算)溶於DMF(1ml)中並加入DIEA(0.6g,4.5mmol)，INT-DRUG(210mg,0.3mmol)溶於DCM(2ml)後滴入混合液中室溫攪拌16小時，隨後減壓濃縮得C-Inter-3-1粗品(300mg)，直接進行下一步反應。

第2步：C-Inter-3-2的合成

將C-Inter-3-1粗品(300mg，按0.15mmol計算)溶於甲醇(5ml)並加入氫氧化鋰水溶液(30mg,1ml)，室溫攪拌1小時後減壓濃縮得C-Inter-3-2粗品(350mg)，直接進行下一步反應。

第3步：C-Inter-3的合成

將C-Inter-3-2粗品(350mg，按0.15mmol計算)溶於TFA(5ml)中，室溫攪拌5分鐘後減壓濃縮，反向HPLC製備得C-Inter-3(20mg)。LCMS[M+1]⁺：1189.50。

實施例18：偶聯中間體C-Inter-4的合成

第1步：C-Inter-4-1的合成

將linker 4(70mg，0.14mmol)加入反應瓶中，再加入DMF(10mL)和DIEA(2mL)在室溫下攪拌。再將INT-DRUG(180mg，0.24mmol)溶解在二氯甲烷(5mL)中，將溶液滴入反應中，在室溫下攪拌過夜。反應結束後，旋蒸去除溶劑得到粗品，用反向管柱純化(水/乙腈)，凍乾得產品C-Inter-4-1(210mg)。

第2步：C-Inter-4-2的合成

將化合物C-Inter-4-1(210mg，0.12mmol)溶於甲醇(2mL)中再加入氫氧化鋰水溶液(0.65mmol，2mL)，室溫攪拌1小時。反應結束後旋蒸除去溶劑得到粗品化合物C-Inter-4-2，直接用於下一步。

第3步：C-Inter-4的合成

將C-Inter-4-2粗品(350mg，按0.15mmol計算)溶於TFA(5ml)中，室溫攪拌5分鐘後減壓濃縮，製備型HPLC(P-HPLC)色譜製備得C-Inter-4(20mg)。LCMS[M+1]⁺：1189.50。

實施例19：偶聯中間體C-Inter-5的合成

第1步：C-Inter-5-1的合成

將Linker 5粗品(86mg)溶於DMF(1ml)中並加入DIEA(0.5mL)，INT-DRUG(230mg,0.32mmol)溶於DCM(2ml)後滴入上述混合液中室溫攪拌16小時，隨後減壓濃縮得C-Inter-5-1粗品，反向管柱層析純化得到目標產物170mg。

第2步：C-Inter-5-2的合成

將C-Inter-5-1(170mg)溶於甲醇(5ml)並加入氫氧化鋰水溶液(21mg,1ml)，室溫攪拌1小時後減壓濃縮得C-Inter-5-2粗品，直接進行下一步反應。

第3步：C-Inter-5的合成

將C-Inter-5-2粗品(350mg)溶於TFA(5ml)中，室溫攪拌5分鐘後減壓濃縮，製備型HPLC(P-HPLC)色譜製備得C-Inter-5(72mg)。LCMS[M/2+1]⁺：617.45。

實施例20：C-Inter-6的合成

第1步：C-Inter-6-2的合成

將化合物Linker 9(80mg，0.15mmol)加入反應瓶中，再加入DMF(4mL)和DIEA(2mL)在室溫下攪拌。再將INT-DRUG(220mg，0.3mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，將溶液滴入反應中，在室溫下攪拌過夜。反應結束後，旋蒸去除溶劑得到粗品，用反向管柱純化(水/乙腈)，凍乾得產品C-Inter-6-2(190mg)。

第2步：C-Inter-6-3的合成

將化合物C-Inter-6-2(110mg，0.065mmol)溶於甲醇(5mL)中。再加入氫氧化鋰一水合物(12mg，0.28mmol)的水溶液(1.5mL)，室溫攪拌4小時。反應結束後旋蒸除去溶劑得到粗品化合物C-Inter-6-3，直接用於下一步。

第3步：C-Inter-6-3的合成

將化合物C-Inter-6-3溶於三氟乙酸(3mL)中，室溫攪拌15分鐘，旋蒸除去溶劑，得到粗品。用反向管柱層析純化(0.1%TFA水溶液/0.1%TFA乙腈)，凍乾得到C-Inter-6(53mg)。LCMS：[M+1]⁺觀察值1207.2，

實施例21：C-Inter-7的合成

第1步：C-Inter-7-1的合成

將Linker 10(按0.15mmol計算)溶於DMF(2ml)中並加入DIEA(0.6g,4.5mmol)，INT-DRUG(210mg,0.3mmol)溶於DCM(2ml)後滴入混合液中室溫攪拌16小時，隨後減壓濃縮得粗品，用反相管柱層析 (乙腈/水)純化，凍乾得到白色固體C-Inter-7-1(180mg)。LCMS[M/2+1]⁺：855.5

第2步：C-Inter-7-2的合成

將C-Inter-7-1(180mg,0.11mmol)溶於甲醇(5ml)並加入氫氧化鋰水溶液(0.55mmol,1ml)，室溫攪拌1小時後加入乙酸(0.3mL)旋蒸得C-Inter-7-2粗品，直接進行下一步反應。

第3步：C-Inter-7的合成

將C-Inter-7-2粗品置於三氟乙酸(1ml)中室溫攪拌30分鐘，反應結束後旋蒸除去溶劑得粗品，反向管柱純化(乙腈/0.1%TFA水溶液)凍乾得C-Inter-7(77mg)。LCMS[M+1]⁺：1229.5。

實施例22：C-Inter-10的合成

第1步：C-Inter-10-1的合成

將Linker 11(按0.1mmol計算)溶於DMF(2ml)中並加入DIEA(0.4g,3mmol)，INT-DRUG(147mg,0.2mmol)溶於DCM(2ml)後滴入混合液中室溫攪拌16小時，隨後減壓濃縮得粗品，用反相管柱層析(乙腈/水)純化，凍乾得到白色固體C-Inter-10-1(70mg)。LCMS[M/2+1]⁺：865.4

第5步：C-Inter-10-2的合成

將C-Inter-10-1(70mg,0.043mmol)溶於甲醇(2ml)並加入氫氧化鋰水溶液(0.22mmol,1ml)，室溫攪拌1小時後加入乙酸(0.3mL)旋蒸得C-Inter-10-2粗品，直接進行下一步反應。LCMS[M/2+1]⁺：775.0

第6步：C-Inter-10的合成

將C-Inter-10-2粗品置於三氟乙酸(1ml)中室溫攪拌30分鐘，反應結束後旋蒸除去溶劑得粗品，反向管柱純化(乙腈/0.1%TFA水溶液)凍乾得C-Inter-10。LCMS[M+1]⁺：1148.5。

實施例23：體外抗流感病毒活性(神經胺酸酶活性抑制實驗)

1.實驗目的：

驗證不同神經胺酸酶抑制劑對不同的神經胺酸酶活力的影響。

2.實驗試劑和耗材：

3.實驗準備

1)Assay buffer配置：50mM Tris,5mM CaCl₂,200mM NaCl,pH 7.5.

稱量6.05g的Tris、0.56g的CaCl₂和11.69g的NaCl溶解在800ml的超純水中，調解pH至7.5，加水至1L，0.22微米的濾膜過濾。分裝，50ml/管，保存在4℃。

2)神經胺酸酶受質儲存液：將神經胺酸酶受質4-甲基傘型酮基-N-乙醯基-α-D-神經胺酸鈉鹽水合物用水溶解至20mM，分裝，110μl/管，避光保存在-20℃。

3)不同的神經胺酸酶按試劑說明書溶解，並分裝，10U/管。保存在-80℃。

4)待測的神經胺酸酶抑制劑用無菌水溶解至5mM，分裝50μl/管，保存在-80℃。

4.實驗步驟

1)將不同的神經胺酸酶用Assay buffer稀釋至4U/ml(4×)，終濃度為1U/ml。

2)在96孔板列2~列12中加入25μL稀釋後的神經胺酸酶溶液，列1加入25μL Assay buffer。

3)先將不同神經胺酸酶抑制劑稀釋至4μM，終濃度為1μM。按下表將神經胺酸酶抑制劑進行梯度稀釋。

4)在列2~列11依次加入25μl表4中濃度1~10的神經胺酸酶抑制劑，列1和列12加入25μl Assay buffer。

5)用封板膜將96孔板蓋上，室溫孵育20min。

6)打開酶標儀，將酶標儀預熱至37℃。並設置相關參數。激發波長選擇365nm，波寬9nm；發射波長選擇450nm，波寬為20nm；增益選擇60。

7)將神經胺酸酶受質稀釋至400μM，加入96孔板中，50μl/孔，37℃孵育20min後放入酶標儀中進行讀數。

8)使用GraphPad Prism 8進行數據分析。

5.數據分析：

1)背景值計算：列1中background平均螢光值。

2)神經胺酸酶酶活力計算：列12中不同神經胺酸酶1U/ml的平均螢光值，並減去背景值。

3)不同濃度神經胺酸酶抑制劑的酶活力計算：列2~列11中，每孔螢光值減去背景值。

4)不同濃度神經胺酸酶抑制劑對酶活力的影響：不同濃度神經胺酸酶抑制劑的酶活力/神經胺酸酶酶活力*100%。

5)在GraphPad Prism 8軟體中，橫坐標是抑制劑濃度，縱坐標是用不同濃度神經胺酸酶抑制劑對酶活力的影響。使用非線性曲線擬合(non-linear curve fitting)計算IC50。

6.數據匯總：

測試化合物均體現了較高的神經胺酸酶抑制活性，並沒有因為linker基團的加入而失去太多活性。對H1N1和H3N2毒株蛋白的抑制活性也均達到了nM級別，顯示了進一步開發的價值。

實施例24：流感病毒介導的細胞病變抑制活性

1.實驗方法

基於細胞病變的體外抗IAV/IBV活性測定是指使用MDCK細胞系來量化檢測化合物對IAV/IBV誘導的細胞病變。

2.實驗材料

3.實驗步驟

1)將MDCK細胞消化，用含2% FBS，1% P/S的DME培養基稀釋為2×10⁵/mL，每孔50μL接種於96孔板中，置於培養箱過夜培養。

2)首先將化合物稀釋至2μM，然後從2μM進行三倍稀釋，共8個稀釋度。每孔加入5μL稀釋好的化合物，置於培養箱1h。

3)用含2% FBS，1% P/S和4μg/mL TPCK處理的胰蛋白酶的DMEM培養基稀釋流感病毒至2222pfu/mL，每孔加入病毒45μL。同時設置不加化合物但加病毒的對照以及不加化合物和病毒的細胞對照。置於培養箱培養4天。

4)每孔加入50μL的Cell-titer Glo，用酶標儀檢測化學發光。

4.數據分析：計算化合物的病毒抑制率。

抑制率=(所測樣品數值-病毒對照組平均值)/(細胞對照組平均值-病毒對照組平均值)

將所計算的抑制率，用GraphPad Prism 8軟體非線性回歸(曲線擬合)函數中的log(抑制劑)相對於回應--可變斜率(四參數)擬合抑制曲線，計算EC50值。

5.結果匯總

測試化合物體現了優異的體外細胞抗流感活性。與紮那米韋陽性分子相比，活性均有了近100倍或者100倍以上的提高。體外細胞抗流感活性顯示了列表中分子強大的抗流感活性，顯示了進一步開發的巨大價值。

實施例25：化合物細胞毒性檢測

1.實驗方法

使用MDCK細胞系來量化檢測化合物對MDCK細胞的毒性。

2.實驗材料

3.實驗步驟

2)首先將化合物稀釋至2mM，然後從2mM進行三倍稀釋，共8個稀釋度。每孔加入5μL稀釋好的化合物，置於培養箱1h。

3)每孔補加含2% FBS，1% P/S和4μg/mL TPCK處理的胰蛋白酶的DMEM培養基45μL。同時設置不加化合物的細胞對照。置於培養箱培養4d。

4)每孔加入50μL的Cell-titer Glo，用酶標儀檢測化學發光。

4.數據分析：化合物對於細胞生長的抑制率

抑制率=(細胞對照組平均值-所測樣品的數值)/細胞對照組平均值

將所計算的抑制率，用GraphPad Prism 8軟體非線性回歸(曲線擬合)函數中的log(抑制劑)相對於回應--可變的斜率(四參數)擬合抑制曲線，計算CC50值。

5.結果匯總

測試化合物體現了優異的體外細胞安全性。與紮那米韋Zanamivir陽性分子相似，細胞毒性均在100μM以上。體外細胞毒性實驗顯示了列表中分子優異的安全性，顯示了進一步開發的巨大價值。

實施例26：hIgG1-Fc的表達與純化

1.實驗材料

2.hIgG1-Fc的表達

1)轉染前一天(第-1天)，將細胞稀釋至最終密度3-4×10⁶個活細胞/mL，並使細胞過夜生長。

2)轉染當天，細胞密度應為5-6×10⁶個/mL。細胞存活率必須>95%。

3)按照每毫升細胞轉染0.8μg表達hIgG1-Fc的pcDNA3.1質粒，將0.8μg稀釋於40μL OptiPRO^TM SFM培養基(4℃)中，輕輕混合。

4)用37μL的OptiPRO^TM SFM培養基(4℃)稀釋3.2μL ExpiFectamine^TMCHO，輕輕混合。

5)將稀釋的ExpiFectamine^TMCHO試劑加入稀釋的DNA中，輕輕混合，並在室溫下孵育1-5min。

6)向每個搖瓶中緩慢加入上述複合物。

7)將細胞放入37℃，8% CO₂的搖床，設置轉速為125rpm。

8)孵育細胞20小時後，按照每毫升細胞合併10μL ExpiCHO轉染增強劑和400μL ExpiCHO feed的比例將二者混勻，再加入各個培養瓶。

9)培養八天收穫細胞上清。

3.hIgG1 Fc的純化

1)上清收集

將轉染達到收穫條件的Fc蛋白發酵液，轉移到已標記好順序和名稱的50ml離心管中，10000rpm/min離心5min。將離心後上清倒入新的標記好名稱的50ml離心管中，直至同一個Fc發酵液都經過離心並收集好上清。

2)預處理

重力管柱於0.5M NaOH溶液中浸泡處理。將Pro A填料溶液加入到空重力管柱中。待重力管柱裡溶液滴完，取0.1M NaOH溶液加入到管柱中。待重力管柱裡溶液滴完，取純水加入到管柱中。

3)平衡上樣

使用5-10個管柱體積Pro A平衡緩衝液加入到Pro A管柱中平衡管柱。將離心處理待純化的上清加入到Pro A管柱中，將流穿過的上清液收集到乾淨的250ml搖瓶中。所有上清都經過管柱後加入5-10個管柱體積的Pro-A平衡緩衝液，直至所有平衡緩衝液都在底部流出。

4)蛋白沖提

將經過管柱洗的管柱底部使用乾淨的堵頭密封好。在經過管柱洗後並在底部密封好的管柱中加入2-3個管柱體積的Pro-A/G沖提緩衝液，使用移液器將加入沖提緩衝液的管柱中填料充分懸浮並靜止5min。準備沖提，準備一個新的收集管並加入一定比例的Tris中和液進行中和防止蛋白變性，打開堵頭收集液體至收集管中。並測定蛋白濃度，凍存於-80℃冰箱。

4.hIgG1 Fc的表徵

根據本文描述的Fc的序列信息，按照本實施例的表達純化步驟，獲得目標Fc。

實施例27：偶聯物1的合成與表徵

1)偶聯物1的合成與表徵

第一步：將含Fc(SEQ ID NO：64)(45.4mg)的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。向試管中加入反應緩衝液(PBS，pH 7.4)使Fc的最終濃度為14.97mg/mL。然後再加入活性酯(疊氮-PEG4-C2-PFP酯)使活性酯/Fc的比值為9.95。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應2小時。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)除去多餘的活性酯，將修飾好的Fc(SEQ ID NO：64)-Azide置換到緩衝液(PBS，pH 7.4)中。

第二步：將含Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、20當量(本文中未明確指明且與上下文不矛盾時，當量指莫耳當量)的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和12當量的C-Inter-1(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)純化得到偶聯物1，UV測定濃度16.37mg/mL，實際重量24.5mg，LC-MS測定DAR值4.34，SEC-HPLC測定單體含量99.25%，殘留的游離藥物含量小於2%，內毒素小於0.098EU/mg。

2)表徵方法

Amicon Ultra離心過濾器純化方法

Amicon Ultra離心過濾器按照如下步驟使用：

1)用氫氧化鈉溶液(0.5M)清洗Amicon管。將管子靜置15分鐘。

2)先用雙蒸水沖洗管子三遍，然後再加入配方緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)。

3)離心然後丟棄濾過的液體。

4)將樣品加入離心管中，離心然後丟棄濾過的液體，重複5次。

5)將Amicon管中剩餘的溶液轉移到新的收集管中。

UF/DF系統純化方法

UF/DF系統純化方法按照如下步驟進行：

1)用氫氧化鈉溶液(0.2M)清洗系統。讓氫氧化鈉溶液流動5分鐘。重複這個步驟一次。

2)用雙蒸水沖洗收集器兩遍。

3)用配好的緩衝液沖洗收集器兩次直到濾液的pH值和緩衝液一致。

4)將樣品加入收集器中並置換緩衝液至少10倍滲透體積。

5)收集收集器中的溶液。

偶聯物產品的濃度測定

Nanodrop分光光度計的UV-Vis模式用來測定過程中樣品和最終偶聯物的濃度。

1)750nM被設置為基線。

2)基於比爾-朗伯定律的計算方法A=E*c*l

A₂₈₀=E ^Fc ₂₈₀*[mAb]*l+E ^LD ₂₈₀*[LD]* l

A₂₅₂=E ^Fc ₂₅₂*[mAb]*l+E ^LD ₂₅₂*[LD]* l

E：莫耳吸光係數；

c：莫耳濃度；

l：光路(Nanodrop：0.1cm)

SEC-HPLC測定聚合度

使用Agilent 1260系列HPLC系統和TSK凝膠G3000SWXL體積排阻色譜管柱(7.8×300mm，5μm)在25℃下進行體積排阻層析。流動相由78mM KH₂PO₄、122mM K₂HPO₄、250mM KCl、15%IPA組成，pH 7.0±0.1。流速設定為0.75mL/min。每次進樣量為40~50μg。用UV檢測器在280nm處檢測樣品。基於其相對分子量記錄聚集峰的保留時間。聚集水平由峰的相對面積決定。

LC-MS測定DAR值

LC-MS為Agilent 6224系列HPLC系統、TOF質譜儀和Agilent PLRP-S 1000A色譜管柱(8μm，50 x 2.1mm)在25℃下運行。使用0.05%的三氟乙酸的雙蒸水溶液作為流動相A，使用0.05%的三氟乙酸的乙腈作為流動相B。流速設定為0.5~0.4mL/min。樣品進樣量為2μg。DAR值是根據反褶積質量的峰值豐度計算的。

測定DAR值的LC-MS方法：

LC-MS測定殘留的游離藥物

藉由LC-MS測定殘餘游離藥物水平(mol/mol，游離藥物/結合藥物)。先準備含有游離藥物和Fc的兩種標準品(2% & 5%)，藉由與偶聯物樣品中殘留游離藥物對比EIC信號峰面積來確定游離藥物百分比。

兩個標準品是根據以下的步驟準備的：

C_Fc(1mg/mL)、DAR、MW_Fc、MW_Drug是已知的。

M_Fc=1/MW_Fc

M_{Total drug}

DAR/MW_Fc

a)2%標準品的莫耳數

DAR * M_Fc * 2%

b)5%標準品的莫耳數

DAR * M_Fc * 5%

C=分光光度計測定的濃度(mg/mL)

DAR=LC-MS測定的藥物和抗體莫耳數比值

MW=莫耳質量

以2%的偶聯物5標準品為例。

C_Fc：1mg/mL；DAR：4.13；MW_mAb：58160g/mol；MW_Drug：1150.2g/mol

M_Fc=1/58160mol/L

M_{Total drug}

1/58160 * DAR mol/L=4.13/58160mol/L

M_{2% standard drug}=2% * 4.13/58160mol/L=1.42umol/L

LP amount of 100uL 2% standard：1.42umol/L*10^-4L*1150.2g/mol=0.1633ug C-Inter-7

將0.1633ug C-Inter-7溶解在100uL 1mg/mL Fc(SEQ ID NO：64)溶液中，這樣就製備成了2%的標準品。

測定殘留的游離藥物的LC-MS方法：

內毒素的測定

樣品內毒素水平藉由Endosafe^®-PTS^TM(Charles River,MCS150K)內毒素檢測儀測定。在PTS檢測儀的四個儲液器中分別移入25μL樣品。除了LAL試劑加上陽參對照外，讀取器在樣品通道中提取樣品並將樣品與LAL試劑混合。將樣品與顯色受質結合，然後孵育。混合後，根據內部存檔的標準曲線測量並分析孔的光密度。

本申請實施例的偶聯物的內毒素數據如下表所示。

實施例28：偶聯物2的合成與表徵

第一步：將含Fc(SEQ ID NO：64)(140.0mg)的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。向試管中加入反應緩衝液(PBS，pH 7.4)使Fc的最終濃度為14.97mg/mL。然後再加入活性酯(疊氮-PEG4-C2-PFP酯)使活性酯/Fc的比值為9.4。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應2小時。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)除去多餘的活性酯，將修飾好的Fc(SEQ ID NO：64)-Azide置換到緩衝液(PBS，pH 7.4)中。

第二步：將含Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、20當量的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和12當量的C-Inter-2(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)純化得到偶聯物2。

參照實施例27的檢測分析方法，測得偶聯物2的數據如下：

UV測定濃度18.6mg/mL，實際重量37.2mg，LC-MS測定DAR值4.04，SEC-HPLC測定單體含量99.07%，殘留的游離藥物含量小於2%，內毒素0.332EU/mg。

實施例29：偶聯物3的合成與表徵

第一步：將含Fc(SEQ ID NO：64)(46.5mg)的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。向試管中加入反應緩衝液(PBS，pH 7.4)使Fc的最終濃度為14.97mg/mL。然後再加入活性酯(疊氮-PEG4-C2-PFP酯)使活性酯/Fc的比值為5.4/6.2。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應2小時。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)除去多餘的活性酯，將修飾好的Fc(SEQ ID NO：64)-Azide置換到緩衝液(PBS，pH 7.4)中。

第二步：將含Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、20當量的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和12當量的C-Inter-3(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)純化得到偶聯物3。

參照實施例27的檢測分析方法，測得偶聯物3的數據如下：

UV測定濃度8.56mg/mL，實際重量30.7mg，LC-MS測定DAR值4.31，SEC-HPLC測定單體含量99.10%，殘留的游離藥物含量小於5%，內毒素小於0.150EU/mg。

實施例30：偶聯物4的合成與表徵

第一步：將含Fc(SEQ ID NO：64)(234.2mg)的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。向試管中加入反應緩衝液(PBS，pH 7.4)使Fc的最終濃度為14.97mg/mL。然後再加入活性酯(疊氮-PEG4-C2-PFP酯)使活性酯/Fc的比值為5.7。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應2小時。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)除去多餘的活性酯，將修飾好的Fc(SEQ ID NO：64)-Azide置換到緩衝液(PBS，pH 7.4)中。

第二步：將含Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、 20當量的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和12當量的C-Inter-6(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)純化得到偶聯物4。

參照實施例27的檢測分析方法，測得偶聯物4的數據如下：

UV測定濃度21.69mg/mL，實際重量39.0mg，LC-MS測定DAR值4.24，SEC-HPLC測定單體含量99.32%，殘留的游離藥物含量小於2%，內毒素小於0.069EU/mg。

實施例31：偶聯物5的合成與表徵

參照實施例27偶聯物合成的第一步，得到Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的原始緩衝液。

將含Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、20當量的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和12當量的C-Inter-7(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)純化得到偶聯物5。

參照實施例27的檢測分析方法，測得偶聯物5的數據如下：

UV測定濃度21.74mg/mL，實際重量47.8mg，LC-MS測定DAR值4.16，SEC-HPLC測定單體含量99.24%，殘留的游離藥物含量小於2%，內毒素0.186EU/mg。

實施例32：偶聯物6的合成與表徵

將含Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、20當量的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和12當量的C-Inter-10(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：64)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)純化得到偶聯物6。

參照實施例27的檢測分析方法，測得偶聯物6的數據如下：

UV測定濃度19.67mg/mL，實際重量39.3mg，LC-MS測定DAR值4.21，SEC-HPLC測定單體含量99.31%，殘留的游離藥物含量小於2%，內毒素小於0.092EU/mg。

實施例33：偶聯物7的合成與表徵

第一步：將含Fc(SEQ ID NO：67)(378.9mg)的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。向試管中加入反應緩衝液(PBS，pH 7.4)使mAb的最終濃度為14.97mg/mL。然後再加入活性酯(疊氮-PEG4-C2-PFP酯)使活性酯/Fc的比值為8.8。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應2小時。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)除去多餘的活性酯，將修飾好的Fc(SEQ ID NO：67)-Azide置換到緩衝液(PBS，pH 7.4)中。

第二步：將含Fc(SEQ ID NO：67)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、20當量的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和18當量的C-Inter-1(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：67)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)純化得到偶聯物7。

參照實施例27的檢測分析方法，測得偶聯物7的數據如下：

UV測定濃度15.53mg/mL，實際重量74.0mg，LC-MS測定DAR值5.79，SEC-HPLC測定單體含量98.77%，殘留的游離藥物含量小於2%，內毒素小於0.071EU/mg。

實施例34：偶聯物8的合成與表徵

參照實施例33偶聯物7的合成的第一步，得到含Fc(SEQ ID NO：67)-Azide的原始緩衝液。

將含Fc(SEQ ID NO：67)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至50mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、20當量的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和18當量的C-Inter-10(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：67)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用Amicon ultra離心式過濾器(10K，15mL)純化得到偶聯物8。

參照實施例27的檢測分析方法，測得偶聯物8的數據如下：

UV測定濃度13.59mg/mL，實際重量54.0mg，LC-MS測定DAR值5.92，SEC-HPLC測定單體含量98.88%，殘留的游離藥物含量小於2%，內毒素0.088EU/mg。

實施例35：偶聯物9的合成與表徵

第一步：將含Fc(SEQ ID NO：67)(3240mg)的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至150mL反應瓶中。向反應瓶中加入反應緩衝液(PBS，pH 7.4)使Fc的最終濃度為14.97mg/mL。然後再加入活性酯(疊氮-PEG4-C2-PFP酯)使活性酯/Fc的比值為8.0/8.2。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應2小時。反應結束後，將反應液用UF/DF膜過濾系統除去多餘的活性酯，將修飾好的Fc(SEQ ID NO：67)-Azide置換到緩衝液(PBS，pH 7.4)中。

第二步：將含Fc(SEQ ID NO：67)-Azide的原始緩衝液(PBS，pH 7.4)移液至150mL試管中。再將反應緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)、20當量的THPTA(三(3-羥丙基三唑甲基)胺)(100mM)、30當量的抗壞血酸鈉(100mM)、20當量的硫酸銅(101mM)和18當量的C-Inter-7(20mg/mL)加入到試管中使Fc(SEQ ID NO：67)-Azide的最終濃度為11.99mg/mL。將反應小瓶放置在搖床培養箱中，在22℃和60轉每分鐘的狀態下反應30分鐘。反應結束後，將反應液用UF/DF膜過濾系統純化得到偶聯物9。

參照實施例27的檢測分析方法，測得偶聯物9的數據如下：

UV測定濃度16.77mg/mL，實際重量3220mg，LC-MS測定DAR值5.86，SEC-HPLC測定單體含量98.75%，殘留的游離藥物含量小於2%，內毒素小於0.116EU/mg。

實施例36：偶聯物體外抗流感病毒活性(流感病毒H1N1介導的細胞病變抑制實驗)

1.實驗方法

使用基於細胞病變的體外抗IAV/IBV活性測定，其使用MDCK細胞系來量化檢測化合物對IAV/IBV誘導的細胞病變。

2.實驗材料

3.實驗步驟

1)將MDCK細胞消化，用含2% FBS，1% P/S的DMEM培養基稀釋為2×10⁵/mL，每孔50μL接種於96孔板中，置於培養箱過夜培養。

4)每孔加入50μL的Cell-titer Glo，用酶標儀檢測化學發光。

4.數據分析：計算化合物的病毒抑制率。

抑制率=(所測樣品數值-病毒對照組平均值)/(細胞對照組平均值-病毒對照組平均值)*100%

將所計算的抑制率，用GraphPad Prism 8軟體非線性回歸(曲線擬合)函數中的log(抑制劑)相對於回應--可變的斜率(四參數)擬合抑制曲線，計算EC50值。

參照分子A和參照分子B分別按照專利WO2021046549A1中Example 156(Conjugate 45b)和Example 188(Conjugate 46)的具體操作製備得到。

參照分子A純度為99.2%%(SEC-HPLC)，DAR值為4.26。

參照分子B純度為98.8%(SEC-HPLC)，DAR值為5.87。

5.結果匯總：

由數據可以看出，測試的偶聯物分子與紮那米韋Zanamivir相比，活性有76-652倍的提升。體現了卓越的體外抗H1N1病毒活性。

DAR值在4.2左右時，本申請中的化合物均體現出更優的抗病毒活性，EC50更低。偶聯物5與參照分子A相比，活性有66倍的提升。

DAR值在5.8左右時，本申請中的化合物均體現出更優的抗病毒活性，EC50更低。偶聯物7和9與參照分子B相比，活性也有接近6倍的提升。

更高的體外抗病毒活性，預示著偶聯物分子具有更為優異的動物體內和臨床人體中的抗病毒活性。

實施例37：偶聯物體外抗流感病毒活性(H5N1，H7N9，Yamagata和Victoria流感病毒)

1.實驗材料

2.實驗步驟

1)將MDCK細胞消化，用含2% FBS，1% P/S的DMEM培養基將2.5×10⁴ MDCK接種於96孔板中，過夜培養。

2)將細胞上清棄掉，用0.0025 MOI的劑量的病毒感染細胞，培養箱靜置1小時。

3)棄去未吸附於細胞的病毒，將各化合物三倍稀釋(起始濃度見下表)，共八個梯度，加入稀釋好的化合物，培養72小時。同時需設置不加化合物的病毒對照組。

4)藉由血凝實驗檢測各孔病毒複製的效應，最後根據Reed-Muench法計算病毒滴度，藉由病毒滴度計算各化合物EC₅₀。血凝試驗方法與判定標準參照WHO流感病毒診斷標準進行。

3.數據處理：計算化合物的病毒抑制率。

1)抑制率=(1-所測樣品組病毒滴度/病毒對照組平均值*100%

2)將所計算的抑制率，用GraphPad Prism 8軟體非線性回歸(曲線擬合)函數中的log(抑制劑)相對於回應--可變的斜率(四參數)擬合抑制曲線，計算EC50值。

4.結果匯總

從結果可以看出，偶聯物5和偶聯物9在所測的流感毒株中，均體現出比陽性參照分子更高的活性。同時，也展現出所測的偶聯物分子廣譜抗流感病毒的特點，具有極大的臨床應用價值。

實施例38：偶聯物體外抗流感病毒活性(臨床耐藥株和其它耐藥株)

1.實驗材料

2.實驗步驟

MDCK細胞以每孔15000個細胞，每孔100μL的密度接種到96孔細胞培養板中並於5% CO2、37℃培養箱中培養過夜。第二天每孔加入50μL梯度稀釋的化合物(3倍系列稀釋、8個濃度點、雙複孔)和50μL病毒。病毒感染時，實驗培養液中添加終濃度為2.5μg/ml的胰酶。培養液總體積為每孔200μL。細胞在5% CO₂、35℃或37℃條件下繼續培養5天，直至無化合物的病毒感染對照孔內顯示出明顯的細胞病變。然後使用細胞活力檢測試劑CellTiter-Glo檢測每孔細胞活力。如化合物測試孔的細胞活力較病毒感染對照孔高，即CPE減弱，則表明化合物對所測病毒有抑制作用。

3.數據處理：

首先計算化合物的病毒抑制率。

抑制率(%)=(測試孔讀值-病毒對照平均值)/(細胞對照平均值-病毒對照平均值)×100

將所計算的抑制率，用GraphPad Prism 8軟體非線性回歸(曲線擬合)函數中的log(抑制劑)相對於回應--可變的斜率(四參數)擬合抑制曲線，計算EC₅₀值。

4.數據匯總

從結果可以看出，偶聯物5和偶聯物9在所測的流感毒株中，均體現出很高的抗病毒活性，EC₅₀均在10nM以內。同時，也展現出所測的偶聯物分子廣譜抗流感病毒的特點，尤其對於臨床耐藥株依然保持很高的抗病毒活性，具有極大的臨床應用價值。

實施例39：偶聯物5在小鼠中的藥物代謝動力學研究

1.實驗信息

採用雄性CD-1(ICR)小鼠進行藥物代謝動力學研究。ELISA分析方法進行血液樣本分析，具體實驗信息與設計如下表。

2.關鍵實驗物料

3.檢測步驟

方法簡介：採用ELISA法測定CD-1小鼠血漿中偶聯物的濃度。偶聯物的定量下限(LLOQ)為50.0ng/mL，而定量上限(ULOQ)則為3000ng/mL。具體步驟如下：

1)按照設定的時間點取血，EDTA-K2作為抗凝劑，製備相應的檢測樣品。

2)在96孔微孔板中加入100μL塗層溶液，密封，使用前在2~8℃下孵育過夜。

3)用清洗緩衝液洗滌板5次。(300μL/孔)。

4)藉由向每個孔中添加300μL阻斷緩衝液來阻斷板。密封並在室溫下孵育2小時，不搖動。

5)重複步驟2。

6)向每個孔中加入100μL標準溶液和檢測樣品。密封並在室溫振盪450RPM下孵育2小時±10分鐘。

7)重複步驟2。

8)向每個孔中加入100μL HRP溶液。密封並在室溫振盪450RPM下孵育1小時±10分鐘。

9)重複步驟2。

10)向每個孔中加入100μL TMB。室溫下培養5-20分鐘。

11)向每個孔中加入100μL停止溶液。

12)在450nm和630nm波長範圍內，使用SpectraMax M5e/M5/Plus 384酶標儀在30分鐘內讀取平板。

13)根據標準溶液讀數，轉化為偶聯物對應濃度。

14)數據處理使用Watson LIMS V7.6或SoftMax Pro GxP 7.0.3和Microsoft Excel 2007或更高版本。

4.結果匯總

從小鼠藥物代謝動力學數據可以看出，偶聯物5具有較長的半衰期，三種給藥方式半衰期均達到了100小時以上。同時，三種給藥方式均有很好的體內暴露量。以上數據預示著偶聯物5在臨床中具有較長的半衰期和較高暴露量，可能具有極優異的抗病毒活性。

實施例40：偶聯物9在大鼠中的藥物代謝動力學

使用雄性SD大鼠進行偶聯物藥物代謝動力學研究。ELISA分析方法進行血液樣本分析，具體實驗信息與設計如下表。

2.關鍵物料

未提供詳細信息的材料可參見實施例39。

3.檢測步驟

2)在96孔微孔板中加入100μL塗層溶液，密封並在使用前在2~8℃下孵育過夜。

3)5.2用清洗緩衝液洗滌板3次。(300μL/孔)。

4)藉由向每個孔中添加300μL封閉緩衝液來封閉板。密封並在室溫下孵育2小時，不搖動。

5)重複步驟2。

6)向每個孔中加入100μL標準品/QC和樣品。密封並在室溫下搖動(450rpm)孵育1小時±10分鐘。

7)重複步驟2。

8)向每個孔中加入100μL HRP溶液。密封並在室溫下搖動(450rpm)孵育1小時±10分鐘。

9)重複步驟2。

10)向每個孔中加入100μL TMB。在室溫下培養5-20分鐘。

11)添加100μL 2N H₂SO₄進入每個孔。

12)在30分鐘內用SpectraMax M5e/M5/Plus 384酶標儀讀取450nm處的吸光度。

13)根據標準溶液讀數，轉化為偶聯物對應濃度。

4.結果匯總

從大鼠藥物代謝動力學數據可以看出，偶聯物9具有較長的半衰期，IV給藥在兩個劑量條件下半衰期均達到了150小時以上。同時，兩個劑量暴露量以劑量依賴的方式增加，均有很好的體內暴露量。以上數據預示著偶聯物9在臨床中具有較長的半衰期和較高暴露量，可能具有極優異的抗病毒活性。

實施例41. 小鼠血清半衰期(t _1/2 )

藥物代謝動力(PK)研究採用CD-1小鼠(Charles River Laboratories)，體重為20-22克之間。小鼠尾部靜脈注射50mg/kg待測物(10ml/kg劑量體積)。所有動物都處於IACUC標準的實驗條件下。給藥後不同時間，將小鼠處死，取血(EDTA抗凝血試管)。全血離心(2000 x g,10分鐘)後取血漿分析待測物的濃度。

藉由夾心法ELISA測量血漿中待測物的濃度：用AVC化合物針對的病毒的表面蛋白(流感神經胺酸酶，呼吸道合胞病毒F蛋白，艾滋病毒表面糖蛋白gp120/gp41)包被ELISA板，2%牛血清PBS室溫封閉1小時，然後加入系列稀釋的血漿樣品，用辣根過氧化物酶標記的抗人IgG- Fc的二抗進行檢測，加TMB受質進行顯色20分鐘，加同等體積的反應終止液，在OD450nm讀取吸光度值。藉由4參數方程繪製S型曲線進行擬合計算待測物的濃度。

實施例42. 致死劑量流感病毒的小鼠預防性模型

H1N1模型：使用致死劑量流感病毒株H1N1 A/Texas/36/91感染雌性6-8週的BALB/c小鼠。第0天，接種1 x LD₉₀的劑量，滴鼻接種。接種前4小時靜脈給藥。口服奧司他韋Oseltamivir作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg，每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後第四天取部分小鼠的肺部組織，勻漿，檢測肺部病毒滴度。感染後15天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

H3N2模型：使用致死劑量流感病毒株H3N2 A/HongKong/1/68感染雌性6-8週的BALB/c小鼠。第0天，接種1 x LD₉₀的劑量，滴鼻接種。接種前4小時靜脈給藥。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg，每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後第四天取部分小鼠的肺部組織，勻漿，檢測肺部病毒滴度。感染後15天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

B模型：使用致死劑量流感病毒株B/Malaysia/2506/04感染雌性6-8週的BALB/c小鼠。第0天，接種1 x LD₉₀的劑量，滴鼻接種。接種前4小時靜脈給藥。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg，每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後第四天取部分小鼠的肺部組織，勻漿，檢測肺部病毒滴度。感染後15天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

實施例43. 致死劑量流感病毒的小鼠治療性模型

H1N1模型：使用致死劑量流感病毒株H1N1 A/Texas/36/91感染雌性6-8週的BALB/c小鼠。第0天，接種1 x LD₉₀的劑量，滴鼻接種。接種後4小時靜脈給藥。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg，每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後第四天取部分小鼠的肺部組織，勻漿，檢測肺部病毒滴度。感染後15天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

H3N2模型：使用致死劑量流感病毒株H3N2 A/HongKong/1/68感染雌性6-8週的BALB/c小鼠。第0天，接種1 x LD₉₀的劑量，滴鼻接種。接種後4小時靜脈給藥。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg，每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後第四天取部分小鼠的肺部組織，勻漿，檢測肺部病毒滴度。感染後15天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

B模型：使用致死劑量流感病毒株B/Malaysia/2506/04感染雌性6-8週的BALB/c小鼠。第0天，接種1 x LD₉₀的劑量，滴鼻接種。接種後4小時靜脈給藥。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg，每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後第四天取部分小鼠的肺部組織，勻漿，檢測肺部病毒滴度。感染後15天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

實施例44. 待測化合物在致命流感病毒感染免疫缺陷型小鼠模型中的活性

使用致死劑量流感病毒毒株A/Puerto Rico/08/1934感染6-8週大的免疫缺陷型(SCID)小鼠(Jackson Laboratories,Stock#001803)。第0天，接種3 x LD95的劑量，滴鼻接種。接種前4小時靜脈給藥(0.3,1.0,3.0mg/kg劑量)。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg，每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後第四天取部分小鼠的肺部組織，勻漿，檢測肺部病毒滴度。感染後35天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

實施例45. 待測物體內毒性

14天大鼠劑量範圍研究。在第0和7天，大鼠靜脈注射5mpk、20mpk或者50mpk的待測化合物。監測大鼠的體重變化，器官重量變化，攝食變化，並和對照組比較。血液待測化合物暴露量採用上面實施例39中的夾心法ELISA檢測。

實施例46. 待測物對具有奧司他韋抗藥性的流感病毒株的體內藥效

流感病毒株H1N1/A/Perth/261/2009是經過小鼠傳代的同時含有H275Y突變的奧司他韋抗藥性的流感病毒株。第0天，接種1 x LD₉₀的劑量，滴鼻接種。接種前4小時靜脈給藥。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg，每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後15天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

實施例47. 延遲治療時間的致命流感病毒感染的小鼠模型

將待測化合物於感染後不同時間(感染前2小時、感染後2小時、感染後24小時、48小時、72小時、96小時)藉由靜脈給藥方式注射小鼠。感染時間為第0天，所有小鼠接種2 x LD₉₅的H1N1 A/Texas/36/91，滴鼻接種。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後15天每天監測小鼠的體重變化，存活情況。

實施例48. 化合物和其他抗病毒藥物的組合療效

流感病毒：將待測化合物以0.001-100nM的濃度範圍內以10被系列稀釋，另一種抗流感病毒的化合物為已知的臨床或批准的藥物，例如巴洛沙韋(baloxivir)、吡莫地韋、奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、拉尼米韋、安曼他丁、MEDI8852或者里曼他丁，在濃度1-1000nM區間進行交叉混合，然後加入到MDCK細胞中過夜。第二天加入感染指數為0.001-1的流感病毒有H1N1/A/PR8/34。感染4天後，用結晶紫染料進行細胞染色，讀取595nm的吸光度。藥物協同效果藉由MacSynergy分析實驗數據。

實施例49：28天大鼠靜脈給藥或皮下給藥的藥物代謝動力學研究

大鼠靜脈或者皮下給藥5mg/kg的待測化合物(5ml/kg給藥體積)。在給藥後不同時間點(24小時，3天，7天，14天，28天)取血(EDTA抗凝血試管)。全血離心(2000 x g,10分鐘)後取血漿分析待測物的濃度。血液待測化合物暴露量採用上面實施例39中的ELISA檢測。

實施例50：28天非人靈長類藥物代謝動力學研究(靜脈給藥)

4.5~8歲的食蟹猴體重在2.5~6.5kg，靜脈給藥5mg/kg或者20mg/kg的待測化合物(5ml/kg劑量體積)。所有動物都處於IACUC標準的實驗條件下。在給藥後不同時間點(24小時，3天，7天，14天，28天)取血(EDTA 抗凝血試管)。全血離心(2000 x g,10分鐘)後取血漿分析待測物的濃度。血液待測化合物暴露量採用上面實施例39中的ELISA檢測。

實施例51：小鼠肺部組織分佈藥物代謝動力學研究(靜脈給藥)

6週大的CD-1小鼠藉由尾部靜脈注射10mg/kg(5ml/kg劑量體積)。所有動物都處於IACUC標準的實驗條件下。給藥後不同時間，將小鼠安樂死，取血(EDTA抗凝血試管)和肺。全血離心(2000 x g,10分鐘)後取血漿分析待測物的濃度。肺部放置於離心管中，稱重，勻漿100μL。調整體積至1mL，放置冰上20分鐘，混勻。離心勻漿液(8000 x g 10分鐘)取上清分析待測物的濃度。採用上面實施例39中的ELISA檢測。

實施例52：單劑量大鼠體內毒性研究

Sprague-Dawley大鼠給藥100mg/kg、200mg/kg或400mg/kg，皮下注射，5ml/kg給藥體積。給藥後15天內觀察動物的健康狀況，進食情況，體重變化，勝利指標等。第15天取血，檢查血生化指標並且進行各個組織病理檢查。

實施例53：體外穩定性

小鼠和人的新鮮提取的血漿和肝微粒體中的代謝穩定性研究。將待測化合物和血漿或者肝微粒體共同溫育37℃ 24小時後，用MALDI-TOF質譜檢測待測化合物DAR的變化情況。該方法可以識別待測化合物中代謝穩定性差的結構部分。

實施例54：體外FcγR結合活性研究

將重組FcγR(I、IIA、IIC、III)蛋白(1μg/mL)包被ELISA板過夜，第二天用2%牛血清PBS室溫封閉1小時。將系列稀釋的待測物(0.01-1000nM)加入室溫溫育1小時。用辣根過氧化物酶標記的抗人IgG-Fc的二抗進行檢測，加TMB受質進行顯色20分鐘，加同等體積的反應終止液，在OD450nm讀取吸光度值。

實施例55：抗體依賴的細胞毒性

流感病毒AVC化合物：以感染係數0.001-10的範圍的A/PR/8/1934(H1N1)、A/HK/1/1968(H3N2)或者B/Malaysia/2506/2004(Victoria)感染MDCK細胞18-24小時，37℃，5% CO₂。然後加入待測化合物，使用PROMEGA試劑盒檢測ADCC活性。格迪伏單抗(Gedivumab)(Genentech)作為該實驗的陽性對照。Fc-N297A作為該實驗的陰性對照。

實施例56：抗體依賴的細胞吞噬

流感病毒AVC化合物：以感染係數0.001-10的範圍的A/PR/8/1934(H1N1)、A/HK/1/1968(H3N2)或者B/Malaysia/2506/2004(Victoria)感染MDCK細胞18-24小時，37℃，5% CO₂。然後加入待測化合物，使用PROMEGA試劑盒檢測ADCP活性。格迪伏單抗(Genentech)作為該實驗的陽性對照。Fc-N297A作為該實驗的陰性對照。

實施例57：預防病毒感染引發的二次感染

流感病毒感染引發的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染模型：6-8週的BALB/c小鼠鼻內接種(亞致死劑量)H1N1 A/CA/07/2009pdm流感病毒。感染後2小時靜脈注射待測化合物(0.3-3mg/kg)。感染後第6天，小鼠鼻內接種亞致死劑量(5x10⁷CFU)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)TCH1516。24小時後，取肺部組織檢測細菌載量。肺部組織用1mm直徑的玻璃珠在PBS溶液中勻漿，然後以10倍系列稀釋後塗於LA平板上，37℃孵育1天。CFU最後換算成每g肺組織重量細菌載量。感染後14天每天監測小數的體重變化，存活情況。

流感病毒感染引發的肺炎鏈球菌感染模型：6-8週的BALB/c小鼠鼻內接種(亞致死劑量)H1N1 A/CA/07/2009pdm流感病毒。感染後2小時靜脈注射待測化合物(0.3-3mg/kg)。感染後第6天，小鼠鼻內接種亞致死劑量(1x10⁵CFU)的肺炎鏈球菌6301。24小時後，取肺部組織檢測細菌載量。肺部組織用1mm直徑的玻璃珠在PBS溶液中勻漿，然後以10倍系列稀釋後塗於LA平板上，37℃孵育1天。CFU最後換算成每g肺組織重量細菌載量。感染後14天每天監測小數的體重變化，存活情況。

實施例58：人FcRn轉基因小鼠病毒感染模型

流感病毒感染：6-8週的雌性B6.Cg-Fcgrttm1 Dcr Tg(GCGRT)32Dcr/DcrJ小鼠(Jackson Labs#014565)表達人的胎兒FcRn受體。含由YTE Fc結構的待測化合物可以在該模型中顯示其半衰期增長的效果。鼻內接種3 x LD95致死劑量的H1N1/A/CA/07/2009流感病毒。感染前7天，小鼠靜脈給藥待測化合物(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0mg/kg、5ml/kg劑量體積)。口服奧司他韋作為實驗的陽性對照(感染後8小時給藥，50mg/kg每天兩次，給藥5天)，人Fc片段作為實驗的陰性對照。感染後15天每天監測小數的體重變化，存活情況。和不帶YTE Fc的化合物相比，YTE在同樣劑量下可以更有效地預防病毒感染和動物的死亡。

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Claims

一種具有式I-1的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，

其中，

m為1或2；

n為1至20的整數，較佳為1至10的整數，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且兩個n是相同的；

D¹和D²為抗流感病毒小分子藥物，各自獨立地選自式D-1-1至D-1-8所示的具有抗流感病毒活性的化合物：

R₁選自OH、NH₂、-NH(=NH)NH₂和-NHC(=NH)NHR₆；

R₂和R₃各自獨立地選自H、OH、F、Cl和Br；

R₄選自-COOH、-P(=O)(OH)₂和-SO₃H；

R₅選自-COC_1-6烷基、-COC_1-6鹵烷基、-SO₂C_1-6烷基和-SO₂C_1-6鹵烷基；較佳選自-COCH₃、-COCF₃和-SO₂CH₃；

X選自O或S；

R₆選自如下基團：

Y選自如下的基團，其中“(連接L¹)”指明基團Y的連接到L¹的末端，當N畫在環內時，表明N為環內原子：

其中，A環選自C₃-C₂₀環烷基、取代的C₃-C₂₀環烷基、C₃-C₂₀環烯基、取代的C₃-C₂₀環烯基、C₆-C₁₅芳基、3-20員雜環烷基、取代的3-20員雜環烷基、取代的C₆-C₁₅芳基和取代的5-15員雜芳基；

R基團各自獨立地選自H、氘、視需要取代的C₁-C₂₀烷基、視需要取代的C₂-C₂₀鏈烯基、視需要取代的C₃-C₂₀環烷基、視需要取代的3-20員雜環烷基、視需要取代的C₆-C₁₅芳基和視需要取代的5-15員雜芳基；

q為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

L¹為連接藥物(D¹或D²)和L²的連接子，包括但不限於以下結構：

應當理解，其中下面結構的左右兩端的鍵與藥物的氧原子相連接，中間的波浪線所標記的鍵與L²相連接；

其中，

W選自O、S、NR^b、CH_2-或不存在；

R^a和R^b各自獨立地選自H、視需要取代的C₁-C₂₀烷基、視需要取代的C₂-C₂₀烯基；

y¹、y²各自獨立地選自0、1、2、3、4、5或6；

q¹和q²各自獨立地選自1、2、3、4、5或6；

或者

該L¹選自以下結構：

L²為連接L¹和E(Fc單體、Fc結構域、Fc連接肽、白蛋白或者白蛋白連接肽)的連接子，其具有式L2-1至L2-15的結構，其中(L¹)和(E)分別指明與L¹和E連接的L²的末端：

其中，

Z為NR、S和O；

R基團各自獨立地選自氫、氘、視需要取代的C₁-C₂₀烷基、視需要取代的C₂-C₂₀鏈烯基、視需要取代的C₃-C₂₀環烷基、視需要取代的3-20員雜環烷基、視需要取代的C₆-C₁₅芳基和視需要取代的5-15員雜芳基；

s和t為1-20的整數；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；

y為0或1；

Q為N或CH；

p為0、1、2、3、4、5、6、7或8；

E為抗體或者其抗體片段、Fc結構域單體、Fc結構域、Fc結合肽、白蛋白或者白蛋白連接肽，其包括SEQ ID No.1-68中的任一個所述的胺基酸序列或與其具有至少95%同一性的序列。
如請求項1所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，

其中，

m為1或2；

n為1至10的整數；

D¹和D²各自獨立地選自上面式D-1-1至D-1-8所示的具有抗流感病毒活性的化合物；

D¹和D²與L¹共價連接在一起，L¹藉由共價鍵和L²連接，L²藉由共價鍵與E連接；

E選自如上所定義的Fc結構域單體、Fc結構域、Fc結合肽、白蛋白或者白蛋白連接肽。
如請求項1或2所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，其中，該偶聯物具有式I-1-1至式I-1-8的結構：

其中各變量如請求項1或2中所定義。
如請求項1至3中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，其中，該偶聯物選自具有式I-1-A至式I-1-D的結構：

其中，各變量如請求項1至3中任一項所定義。
如請求項1至4中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，其中，該偶聯物選自具有式C-1至式C-115的結構：

其中n如請求項1至4中任一項所定義；Protein是如請求項1至4中任一項所定義的E。
如請求項1至5中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，其中，n和m的比值為1至20，較佳選自2至10，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。
如請求項1至6中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，其具有在0.5與10.0之間的平均DAR。
如請求項1至5中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，其中，該E包括Fc結構域單體或包含該Fc結構域單體的Fc結構域，其中，該Fc結構域單體包含SEQ ID No.1-68中的任一者所述的胺基酸序列，或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
如請求項1至8中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，其中，該E能夠識別病毒表面抗原，例如CR6261、CR8020、MEDI8897、帕利珠單抗(Palivizumab)、SD38等；或者

Fc結構域單體可以是任何一種免疫球蛋白的抗體亞型(例如，IGHG1*01(例如G1m(za))、IGHG1*07(例如G1m(zax))、IGHG1*04(例如G1m(zav))、IGHG1*03(G1m(f))、IGHG1*08(例如G1m(fa))、IGHG2*01、IGHG2*02、IGHG2*06、IGHG3*01、IGHG3*04、IGHG3*05、IGHG3*09、IGHG3*10、IGHG3*11、IGHG3*12、IGHG3*06、IGHG3*07、IGHG3*08、IGHG3*13、IGHG3*03、IGHG3*14、IGHG3*15、IGHG3*16、IGHG3*17、IGHG3*18、IGHG3*19、IGHG2*04、IGHG4*01、IGHG4*02、IGHG4*03)的Fc結構域單體。
如請求項1所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，其中該偶聯物具有如下的結構：

其中n如請求項1中所定義。
一種具有式I-2結構的化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，

其中L¹、D¹和D²如請求項1至4中任一項的式I-1中所定義；

L³選自以下結構：

其中，各變量例如Z、R、Q、s、y、p如請求項1至4中任一項對L²所定義；
如請求項11所述的式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，該化合物具有式C-Inter-1至式C-Inter-115的結構：
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至10中任何一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物、或如請求項11或12所述的式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，以及視需要的一種或多種其它治療劑，例如化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫檢查點抑制劑或激動劑)，以及視需要的藥學上可接受的賦形劑。
一種用於預防或治療病毒感染患者或者可能具有被病毒感染風險的患者的方法，其包括向患者施用例如注射有效劑量的任何一種如請求項1至10中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物、或如請求項11或12所述的式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物的步驟。
一種如請求項1至10中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物、或如請求項11或12所述的式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物在製備藥物中的用途，其中該藥物用於預防或治療病毒感染患者或者可能具有被病毒感染風險的患者的病毒感染；

較佳地，該病毒感染是流感病毒或者副流感病毒引發的感染；

較佳地，該病毒感染是流感病毒A、B或者C、或者副流感病毒引發的感染；

較佳地，該被病毒感染或者可能具有被病毒感染風險的患者可以是具有免疫系統缺陷的患者；

較佳地，該被病毒感染或者可能具有被病毒感染風險的患者可以是接受或者將要接受免疫抑制劑治療的患者；較佳地，該被病毒感染或者可能具有被病毒感染風險的患者可以是被診斷出患有引起免疫抑制疾病的患者；

較佳地，該被診斷出患有引起免疫抑制疾病的患者患有癌症或者獲得性免疫缺陷綜合症；

較佳地，該被診斷出患有引起免疫抑制的癌症疾病的患者患有白血病、淋巴癌、體液免疫缺乏症、T細胞缺乏症、補體缺乏症或者多發性骨髓瘤；

較佳地，該患者是正在接受或者將要接受造血幹細胞移植的患者；

較佳地，該患者是正在接受或者將要接受造器官移植的患者；和/或較佳地，該患者可能有二次感染風險；
一種用於預防患者的由流感病毒感染引發的二次感染風險的方法，藉由向患者體內施用例如注射有效劑量的任何如請求項1至10中任一項所述的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物、或如請求項11或12所述的式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物，

較佳地，該二次感染是呼吸道感染；

較佳地，該二次感染是與肺炎有關；

較佳地，該二次感染是細菌性，或者病毒性，或者是真菌性的感染；

較佳地，該細菌性感染是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的感染；較佳地，該細菌性感染是肺炎鏈球菌引起的感染；

較佳地，該式I-1的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物、式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物可以藉由肌肉注射、靜脈注射、皮內注射、動脈內注射、腹腔注射、病灶內注射、顱內注射、關節內注射、胸膜內注射、氣管內注射、前列腺內注射、鼻腔內注射、玻璃體內注射、陰道內注射、直腸內注射、局部的、腫瘤內注射、腹膜內注射、皮下注射、結膜下注射、囊內注射、黏膜注射、心包內注射、臍內注射、眼內注射、口服、局部吸入、注射或者輸液來施用；

較佳地，該式I-1的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物、式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物與另外的治療藥物聯合施用或聯合用於製備藥物；

較佳地，該另外的治療藥物是抗病毒藥物；

較佳地，該抗病毒藥物是巴洛沙韋、吡莫地韋、奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、拉尼米韋、安曼他丁、MEDI8852或者里曼他丁；

較佳地，該患者使用的另外一種藥物是抗病毒的疫苗；

較佳地，該抗病毒藥物和式I-1的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物、式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物依次施用例如注射給患者；和/或

較佳地，該抗病毒藥物和式I-1的偶聯物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物、式I-2化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、異構體、溶劑化物、前藥或同位素標記物同時施用例如注射給患者。