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TW202425990A - 包含ｃｆｔｒ調節劑化合物之點眼用組成物 - Google Patents

包含ｃｆｔｒ調節劑化合物之點眼用組成物 Download PDF

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Publication number
TW202425990A
TW202425990A TW112142207A TW112142207A TW202425990A TW 202425990 A TW202425990 A TW 202425990A TW 112142207 A TW112142207 A TW 112142207A TW 112142207 A TW112142207 A TW 112142207A TW 202425990 A TW202425990 A TW 202425990A
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TW
Taiwan
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eye
active ingredient
composition
compound
concentration
Prior art date
Application number
TW112142207A
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English (en)
Inventor
吳昌穆
李雪熙
林多美
鄭日智
尹洪哲
朴俊泰
安敬美
李政祐
Original Assignee
南韓商日東製藥股份有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明提供了一種用於治療、預防或改善乾眼病或乾眼病相關疾病之點眼用組成物，該組成物包含濃度為0.01%(w/v)至0.3%(w/v)的由以下化學式1表示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物作為活性成分，且每天向眼內滴入1-7次，每次每隻眼睛1-3滴。

Description

包含CFTR調節劑化合物之點眼用組成物
本申請案主張基於2022年11月2日申請之韓國專利申請案第10-2022-0144645號之優先權，且相應申請案之說明書及圖式中揭示之全部內容皆併入本申請案中。本發明係關於一種點眼用組成物，且更特定言之，係關於一種包含囊腫纖維化跨膜傳導調節蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)調節劑之點眼用組成物。
乾眼病(dry eye disease, DED)係一種因淚液缺乏而對眼睛造成刺激之淚膜疾病，且係指组分失衡且眼表受損並出現眼花眼且感覺刺激症狀諸如刺激、異物感及乾燥感之眼部疾病。乾眼病之原因多種多樣，包括淚液分泌不足、淚液過度蒸發、淚液產生器官發炎、伴隨性系統性疾病之病例諸如捨格倫症候群(Sjogren syndrome)、Steven Johnson症候群、及類天皰瘡及類似者，且係最廣泛傳播眼部疾病之一，但治療選項有限。最普遍的治療方法係滴人工淚液，此可能會堵塞淚點以減少淚液量、減輕眼表炎症、或增強淚液/黏蛋白分泌。短期內潤滑眼表之人工淚液被廣泛優先使用，但該人工淚液之局限性在於它僅係暫時緩解作用，而非根本性治療方法。作為下一步，研究了針對眼表發炎、淚液分泌、瞼板腺功能障礙之策略。然而，到目前為止，抑制T細胞活化及細胞激素產生之藥物僅為環孢素及利非斯特(Lifitegrast)兩種。最近，作為下一代DED治療劑，P2Y2受體促效劑地誇磷索(diquafosol)已得到討論，在眼上皮中表現並參與黏蛋白分泌之離子通道正在成為開發DED治療劑之新靶點。
另一方面，囊腫纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)作為刺激眼表體液分泌之主要氯離子通道，可以為DED開闢一條新治療策略之路。CFTR係指由CFTR基因編碼之膜蛋白及氯離子(Cl -)通道。CFTR係位於細胞膜上之蛋白質，起到氯離子通道之作用，並經由氯離子轉運誘導眼表體液分泌。當存在於細胞膜中之CFTR經活化時，CFTR可以治療由CFTR功能喪失或惡化引起之許多疾病。例如，活化該CFTR之物質可以藉由活化氯離子(Cl -)通道並增加淚液量來矯正乾眼病所示之異常淚膜。
本發明之發明人研究了使用CFTR調節劑治療乾眼病之方法，從而完成本發明。
技術問題
本發明有待解決之問題係提供一種點眼用組成物，該組成物包含囊腫纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)調節劑，較佳為能夠充當CFTR活化劑之化學式1之化合物。另外，本發明有待解決之另一個問題係提供本發明之點眼劑之較佳使用量、使用方法、處方量及類似者。
本發明之一個實施例具有減少因乾眼病引起之淚液分泌量、顯著抑制角膜結膜炎及角膜類型之變化、恢復受損角膜或增加淚液分泌量之優異效果，因此，它提供點眼用組成物之較佳使用量、使用方法、處方量及類似者，其可用於開發安全且有效的乾眼病或乾眼病相關疾病之治療劑。本發明之範圍不受此等效果之限制。
本發明有待解決之問題不限於上文所提及之問題，熟悉本發明所屬技藝者自下文描述中將清楚地理解未提及之其他技術問題。 技術解決方案
為了解決上述問題，經由本發明之各個態樣提供了以下內容。
本發明之一個態樣提供了一種用於治療、預防或改善乾眼病或乾眼病相關疾病之點眼用組成物，該組成物包含濃度為0.01%(w/v)至0.3%(w/v)的由以下化學式1表示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物作為活性成分，且每天向眼內滴入1-7次，每次每隻眼睛1-3滴。 [化學式1]
本發明之另一個態樣係一種用於治療或改善個體之乾眼病或乾眼病相關疾病之方法，該方法包含以下步驟：以0.01%(w/v)至0.3%(w/v)之濃度向有需要之個體投與由以下化學式1表示之化合物或醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物作為活性成分，其中該投與係每天向眼內滴入1-7次，每次每隻眼睛1-3滴。 [化學式1]
本發明之另一態樣提供一種濃度為0.01%(w/v)至0.3%(w/v)的由以下化學式1表示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物的用途，該用途係使用治療劑治療、預防或改善乾眼病或乾眼病相關疾病，且在該治療劑中，每天向眼內滴入活性成分1-7次，每次每隻眼睛1-3滴。 [化學式1]
在下文中將進行更詳細的描述。
本發明之一個態樣提供了一種點眼用組成物，該組成物包含可充當CFTR活化劑之以下化學式1之化合物。 ＜化學式1＞
化學式1之IUPAC名稱為(S)-(4-苯甲醯基-3-甲基哌嗪-1-基)(7-(3,4-二甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)甲酮。該化合物可以藉由國際專利公開案第WO 2022/084741 A1號中所揭示之方法獲得。化學式1之化合物為吡唑并[1,5-α]嘧啶衍生物，且該吡唑并[1,5-α]嘧啶衍生物化合物含有吡唑并[1,5-α]嘧啶核，且可以藉由以下方式獲得：在核心結構之位置2處經任何經取代芳基、任何經取代雜芳基及任何經取代雜環取代基取代，在核心結構之位置5處經鹵素取代，在核心結構之位置6處經鹵素、任何經取代芳基、任何經取代(C1-C10)烷基及任何經取代(C1-C10)烷氧基取代基取代，且在核心結構之位置7處經任何經取代芳基、任何經取代雜芳基及任何經取代雜環取代。本說明書中所描述之化合物不僅可以結晶形式、粉末形式及非晶質形式存在，例如此等化合物之多形體、假多形體、溶劑合物、水合物、非溶劑化多形體(包括酸酐)、形態多晶型及非晶質形式之化合物，而且亦以包含醫藥學上可接受之鹽(包含其混合物)之各種形式存在。本說明書中所描述之化合物可以作為溶劑合物，特別為水合物存在，且除非另外提及，否則旨在包括所有此等溶劑合物及水合物。水合物可以在化合物或包含該化合物之組成物之製備過程中形成，或者水合物可以由於化合物之吸濕性而隨著時間形成。本說明書之化合物可以作為有機溶劑合物存在，特別包括DMF、醚及醇溶劑合物。任何特定溶劑合物之鑑定及製備均係熟悉合成有機化學或醫學化學領域技術者之技術範圍內。在一些實施例中，本說明書中所描述之化合物以溶劑合物形式存在。在一些實施例中，當溶劑合物之溶劑組分係水時，本說明書中所描述之化合物以水合物形式存在。本發明之化合物可包含不對稱或掌性中心，且因此該化合物可以不同的立體異構物形式存在。本發明之化合物之所有立體異構物形式，諸如非鏡像異構物、鏡像異構物及外消旋混合物，被認為構成本發明之一些部分。在本說明書中，「醫藥學上可接受之鹽」係指製藥工業中常用之鹽，此等實例包括用鈣、鉀、鈉及鎂及類似者製備之無機離子鹽；用鹽酸、硝酸、磷酸、溴酸、碘酸、高氯酸、酒石酸及硫酸及類似者製備之無機酸鹽；用乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、酒石酸、富馬酸、扁桃酸、丙酸、檸檬酸、乳酸、乙醇酸、葡萄糖酸、半乳醣醛酸、麩胺酸、戊二酸、葡萄醣醛酸、天門冬胺酸、抗壞血酸、碳酸、香草酸、氫碘酸及類似者製備之有機酸鹽，用甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對-甲苯磺酸及萘磺酸及類似者製備之磺酸鹽，及用甘胺酸、精胺酸、離胺酸及類似者製備之胺基酸鹽；以及用三甲胺、三乙胺、氨、吡啶、甲基吡啶及類似者製備之胺鹽，但不限於此。
在包含點眼用組成物之眼用藥物之發現中，水溶性係影響眼睛及眼用製劑之生物可用度的主要因素之一。根據Gukasyan開發之眼用藥物及類似者之經驗法則(ROx)，有效眼用藥物之最佳溶解度計算值應為1 μM或更高。本發明之發明人進行了研究，以藉由提高溶解度同時保持CFTR之功效來提供優異點眼劑，且因此，他們完成了本發明。
具體地，本發明之發明人進行了研究，以提供一種最佳點眼方法，該方法可以提供諸如增加淚液量之效果、改善角膜糜爛之效果、及抑制炎症之效果及類似者的功效，且可以良好地分佈於包括角膜及結膜之靶組織中。另外，他們確認了較佳點眼方法、點眼劑之劑量及類似者，從而完成本發明。
對於化學式1之化合物，在淚液量減少模型中，確認了改善淚液量之效果，且確認了優異溶解度、改善角膜糜爛之效果、減少存在於角膜及結膜中之各種促炎性細胞介素之表現之效果及類似者。化學式1之化合物可用於治療、預防或改善乾眼病或乾眼病相關疾病。乾眼病相關疾病可包括因淚液量減少引起或惡化之疾病，或藉由淚液量增加預防或改善之眼部疾病。例如，該眼部疾病可包括結膜炎、瞼板腺功能障礙、因乾眼病導致之眼表損傷(較佳角膜損傷)、灼熱感、搔癢、異物感或粗糙感或類似者。乾眼病之原因無特別限制。
本發明之組成物可包含濃度為0.01%(w/v)至0.3%(w/v)之活性成分，以便達成預期效果，或顯示在製劑中達成穩定溶解度。此外，為了提供本文所提供之各個態樣之優點，適用於以該濃度投與活性成分之投與方法係每天提供1-7次，每次每隻眼睛1-3滴。
在一個具體實施例中，本發明之一個態樣提供了一種用於治療、預防或改善乾眼病或乾眼病相關疾病之點眼用組成物，該組成物包含濃度為0.01%(w/v)至0.3%(w/v)的由以下化學式1表示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物作為活性成分，且每天向眼內滴入1-7次，每隻眼睛1-3滴。
另一方面，在本發明中，「%(w/v)」意指100mL本發明之點眼劑或點眼用組成物中所包含之靶標組分之質量(g)。在本發明中，當含有化學式1之化合物之鹽時，該值係該化合物之鹽之含量。另外，在本發明中，當化學式1之化合物或其鹽與水合物或溶劑合物形式混合時，該值係化學式1之化合物或其鹽之水合物或溶劑合物之含量。
根據一個實施例之本發明之醫藥組成物可包含基於總組成物0.5%(w/v)或更少之CFTR活化劑作為活性成分。在一個實施例中，可包含基於總組成物0.01%(w/v)至0.3%(w/v)、0.04%(w/v)至0.25%(w/v)、0.05%(w/v)至0.2%(w/v)、0.01%(w/v)至0.25 %(w/v)、0.01%(w/v)至0.2 %(w/v)、0.03%(w/v)至0.3 %(w/v)、0.03%(w/v)至0.07%(w/v)、0.04%(w/v)至0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.08%(w/v)至0.12%(w/v)、0.09%(w/v)至0.11%(w/v)、0.1%(w/v)、0.018%(w/v)至0.22%(w/v)、0.19%(w/v)至0.21%(w/v)、0.1%(w/v)的化學式1之化合物。
在一個實施例中，醫藥組成物可包含濃度為0.4-3mg/ml之活性成分。作為更具體之實例，本發明之組成物可包含濃度為0.45-2.5mg/ml、0.43-2.3mg/ml之活性成分。
當在每隻眼睛一次點眼期間投與約50 uL時，在每隻眼睛點眼期間向眼內滴入之活性成分之量可以係約3mg或更少、約2.5mg或更少、約2.2mg或更少、約2mg或更少、約0.01至約3mg、約0.015至約2.8mg、約0.018至約2.5mg、約0.02至約2.4mg、約0.05至約2.3mg、約0.08至約2.28mg、約0.09至約2.25mg、約0.095至約2.2mg、約0.01至約2mg、約0.015至約1.8mg、約0.018至約1.5mg、約0.02至約1.4mg、約0.05至約1.3mg、約0.08至約1.28mg、約0.09至約1.25mg、約0.095至約1.2mg、約0.095至約1.1mg、約0.01至約1mg、約0.015至約0.8mg、約0.018至約0.5mg、約0.02至約0.4mg、約0.05至約0.3mg、約0.08至約0.28mg、約0.09至約0.25mg、約0.095至約0.2mg、約0.095至約0.15mg，且例如可向眼內滴入0.025mg、0.05mg、0.075mg、0.1mg、0.125 mg、0.15mg、0.175 mg、0.2mg、0.225mg、0.25mg、0.3mg、0.35 mg、0.375mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.525 mg、0.6mg、0.7 mg、0.75mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.05 mg、1.2mg、1.4 mg、1.5mg、1.8mg、2.0mg或2.1 mg之活性成分。
本發明之點眼劑可以每天分1至7次向眼內滴入，每隻眼睛一次1滴至3滴。本發明之點眼劑之點眼間隔可係至少一小時或更長。一滴通常可係約10至100μl、20至80μl、30至70μl、40至60μl，且例如可係50μl。
內容物之活性成分可藉由每次滴注1〜5滴、1〜4滴、或1〜3滴來投與，以便達成本發明之目的或效果，諸如調配物之穩定性、在眼表上之分佈程度、減少角膜糜爛之效果及類似者。另外，組成物之使用可以每天施用一次至多次，且作為一個實例，組成物可每天1〜7次、每天1〜6次、每天1〜5次、每天1〜4次、每天1~3次、每天1~2次、每天一次施用，或視需要頻繁或不定期施用。
在一個具體實施例中，治療或改善包括在至少一個連續2週期間每天投與治療劑。在該治療療法中，點眼用組成物可以每天投與一次，例如每天2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。在一具體實施例中，治療療法可以包括在連續3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週或更長時間期間每日投與治療劑。
本發明之點眼劑所含之活性成分之含量、濃度或點眼劑量令人驚訝地顯示出穩定的藥效表現，因為活性成分附著在角膜表面上。此外，活性成分可以在眼表(靶部位)上達成效果。具有該含量範圍或濃度範圍之活性成分允許提供具有優異溶解度之點眼用組成物。
令人驚訝的是，已證實當根據本發明之組成物藉由限定劑量及/或投與療法用於治療乾眼病或乾眼病相關疾病時，可以獲得各種效果諸如分佈程度、減少角膜糜爛及減少眼部炎症及類似者之效果。
本發明之組成物可進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。在一個實施例中，點眼用組成物可係液體組成物或半固體組成物。在一個實施例中，點眼用組成物可係點眼劑、軟膏劑、凝膠劑、乳膏劑、洗劑、乳液、混懸劑或噴霧劑形式。本發明之點眼用組成物可經調配為與經該組成物治療之眼睛及/或其他組織具有相容性。對於局部施用於眼睛，本發明之組成物可經調配為無菌水性組成物(例如懸浮液、溶液、乳液等)，且可包含通常可以包含之純化水，例如至少70w/v%，更常見80w/v%，及更常見至少90或95w/v%之純化水。點眼用組成物可旨在用於直接施用於眼睛之角膜表面，且通常經調配為具有與眼睛相容之pH及等滲性。在組成物中，通常，pH可具有4至9、較佳5.5至8.5且最佳5.5至8.0之範圍。例如，pH範圍可係6.0至7.8，且更具體地係6.4至7.6。點眼用組成物可係例如點眼劑或眼膏劑形式。根據一個實施例之點眼用組成物的一大優點在於其使用對受試者而言係容易且方便的。點眼劑可係溶液型點眼劑或懸浮液型點眼劑。此外，組成物可以人工淚液或眼睛清潔溶液形式提供。由於該組成物可以滲透眼睛之角膜、結膜或內部區域，因此它可在醫藥學上可接受之眼用媒劑中遞送，以便與眼表接觸足夠時間並保持。根據一個實施例之點眼用組成物可根據此項技術中熟知之方法製備。熟知此項技藝者可根據調配物之類型容易地確定適當賦形劑及/或載劑及其量。
點眼用組成物可藉由容納在由各種材料製成之容器中來保存。例如，容器可係包括低密度聚乙烯(LDPE)及類似者在內的聚乙烯、聚丙烯及類似者之容器，或係玻璃容器，且當本發明組成物係點眼劑時，它可容納在點眼劑容器中，且更具體地，它可容納在多劑量點眼劑容器或單位劑量點眼劑容器中。
多劑量點眼劑容器係指配備有容器主體及可安裝在容器主體上之蓋的點眼劑容器，係能夠自由地打開及重新密封蓋之點眼劑容器。在多劑量點眼劑容器中，通常多次容納點眼劑以供一定時間使用。單位劑量點眼劑容器係指在瓶口處熔合蓋且形成袋狀之點眼劑容器，其目的係為了在使用期間破開及打開蓋與瓶體之熔合部。在單位劑量點眼劑容器中容納供一次或多次使用之點眼劑。本發明之點眼用組成物可包含潤滑劑(例如羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素(CMC)、液體多元醇諸如聚乙烯醇、丙二醇及聚乙二醇)，且可含有用於促進癒合之添加劑(例如，透明質酸)或用於促進天然淚膜之模擬電解質組成物或組成物保留在眼表上之添加劑(例如，膠凝劑，諸如卡波姆)。
本發明之一個態樣提供了一種用於治療或改善個體之乾眼病或乾眼病相關疾病之方法，且具體地，提供了一種用於治療或改善乾眼病或乾眼病相關疾病之方法，該方法包含以下步驟：向有需要之個體投與濃度為0.01%(w/v)至0.3%(w/v)的由以下化學式1表示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物作為活性成分，其中投與係每天向眼內滴入1-7次，每次每隻眼1-3滴 [化學式1] 。
用於治療或改善之方法可用作乾眼病或乾眼病相關疾病之治療療法。藉由該治療療法，向個體眼內滴入本發明之組成物的個體可表現出淚液量之增加、改善角膜糜爛之效果及存在於角膜及結膜中之各種炎性細胞介素之表現減少。化學式1之化合物可以用於治療、預防或改善乾眼病或乾眼病相關疾病之治療療法。乾眼病相關疾病可包括因淚液量減少引起或惡化之疾病，或藉由淚液量增加預防或改善之眼部疾病。例如，該眼部疾病可包括結膜炎、瞼板腺功能障礙、因乾眼病導致之眼表損傷(較佳角膜損傷)、灼熱感、搔癢、異物感或粗糙感或類似者。乾眼病之原因無特別限制。
在本發明之治療療法中，為了達成本發明之期望效果，活性成分可以在一次投與期間以0.01%(w/v)至0.3%(w/v)之濃度向個體投與。此外，為了提供本文所提供之各個態樣之優點，適用於以上述濃度投與活性成分之投與方法可係每天提供1-7次，每次每隻眼睛1-3滴。
在一具體實施例中，本發明之一個態樣提供一種用於治療或改善乾眼病或乾眼病相關疾病之方法及治療或改善方法，該方法係向有需要之個體投與濃度為0.01%(w/v)至0.3%(w/v)的由以下化學式1表示之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物作為活性成分，且每天向眼內滴入1-7次，每次每隻眼睛1-3滴。
另一方面，在本發明中，「%(w/v)」與組成物中所描述者相同。
根據一個實施例之方法可在個體中在每隻眼睛一次點眼期間包含基於總組成物0.5%(w/v)或更少之CFTR活化劑作為活性成分。作為一個實施例，可包含基於總組成物0.01%(w/v)至0.3%(w/v)、0.04%(w/v)至0.25%(w/v)、0.05%(w/v)至0.2%(w/v)、0.01%(w/v)至0.25 %(w/v)、0.01%(w/v)至0.2 %(w/v)、0.03%(w/v)至0.3 %(w/v)、0.03%(w/v)至0.07%(w/v)、0.04%(w/v)至0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.08%(w/v)至0.12%(w/v)、0.09%(w/v)至0.11%(w/v)、0.1%(w/v)、0.018%(w/v)至0.22%(w/v)、0.19%(w/v)至0.21%(w/v)、0.1%(w/v)的化學式1之化合物。
根據一個實施例之方法可在個體中在每隻眼睛一次點眼期間包含濃度為0.4-3mg/ml之活性成分。作為更具體之實例，本發明之方法可在每隻眼睛一次點眼期間包含濃度為0.45-2.5mg/ml或0.43-2.3mg/ml之活性成分。
當在每隻眼睛一次點眼期間投與約50 uL時，在每隻眼睛點眼期間向眼內滴入之活性成分之量可係約3mg或更少、約2.5mg或更少、約2.2mg或更少，且可係約0.01至約3mg、約0.015至約2.8mg、約0.018至約2.5mg、約0.02至約2.4mg、約0.05至約2.3mg、約0.08至約2.28mg、約0.09至約2.25mg、約0.095至約2.2mg、約0.01至約2mg、約0.015至約1.8mg、約0.018至約1.5mg、約0.02至約1.4mg、約0.05至約1.3mg、約0.08至約1.28mg、約0.09至約1.25mg、約0.095至約1.2mg、約0.095至約1.1mg、約0.01至約1mg、約0.015至約0.8mg、約0.018至約0.5mg、約0.02至約0.4mg、約0.05至約0.3mg、約0.08至約0.28mg、約0.09至約0.25mg、約0.095至約0.2mg、約0.095至約0.15mg，且例如可向眼內滴入0.025mg、0.05mg、0.075mg、0.1mg、0.125 mg、0.15mg、0.175 mg、0.2mg、0.225mg、0.25mg、0.3mg、0.35 mg、0.375mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.525 mg、0.6mg、0.7 mg、0.75mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.05 mg、1.2mg、1.4 mg、1.5mg、1.8mg、2.0mg或2.1 mg之活性成分。
本發明之點眼劑可以每天分1至7次向眼內滴入，每隻眼睛一次1滴至3滴。本發明之點眼劑之點眼間隔可係至少一小時或更長。一滴通常可係約10至100μl、20至80μl、30至70μl、40至60μl，例如50μl。
內容物之活性成分可每次滴注1〜5滴、1〜4滴、或1〜3滴來投與點眼劑，以達成本發明之目的或效果，諸如調配物之穩定性、在眼表上之分佈程度、減少角膜糜爛之效果及類似者。另外，組成物之使用可以每天施用一次至多次，且作為一個實例，組成物可每天1〜7次、每天1〜6次、每天1〜5次、每天1〜4次、每天1~3次、每天1~2次、每天一次施用，或視需要頻繁或不定期施用。
在一個具體實施例中，治療或改善包括每天投與治療劑達至少連續2週。在該治療療法中，點眼用組成物可以每天投與一次，例如每天2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。在一具體實施例中，治療療法可包括每日投與治療劑達連續3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週或更長時間。
本說明書中定義之「治療」及「改善」意指將症狀之嚴重程度降低到一定程度。在本說明書中所描述之眼睛疾病之乾眼病或乾眼病相關疾病的治療或改善之情況下，其可意指淚液增加、淚液保存、淚液蒸發減少、淚液產生增加、眼表發炎減少及類似者。本文所使用之術語「治療」及「改善」不旨在作為絕對術語。治療可係指延遲開始、改善症狀、改善患者生活品質及類似者。治療效果可與未經治療之個體或個體組或在治療前或治療期間之不同時間點之同一患者進行比較。
術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指治療患者例如哺乳動物(特別為人類或動物)之疾病或醫學病狀或其治療，且包括改善疾病或醫學病狀，亦即去除或停止患者之疾病或醫學病狀；抑制疾病或醫學病狀，亦即延遲或停止患者之疾病或醫學病狀；或減輕患者之疾病或醫學病狀之至少一種症狀。該術語涵蓋用於預防或降低特定疾病或病狀發生或進展之風險或預防或降低復發風險的疾病或病症之預防性治療。
本說明書中使用之「個體」或「患者」不僅可包括人類，而且可包括其他動物，例如其他靈長類動物、囓齒類動物、狗、貓、馬、羊、豬及類似者，且較佳地，其可包括人類。
除非本說明書特別說明，否則顯然劑量均以一隻眼點眼一次為基礎。
本發明之點眼用組成物具有顯著抑制因乾眼病引起之淚液量減少及角膜結膜炎及角膜形態變化、恢復受損角膜、或增加淚液量之優異效果，因此該組成物可用於開發安全有效的用於乾眼病或乾眼病相關疾病之治療劑。當然，本發明之範圍不受此等效果之限制。 有益效果
根據本發明之點眼劑、點眼用組成物及點眼方法不僅提供增加淚液分泌量之效果，而且提供角膜損傷恢復及眼部發炎減輕之效果。
本發明之點眼用組成物可以良好分佈至眼睛之靶組織，包括角膜及結膜。
本發明之點眼劑俱有足夠溶解度，以便用作眼部點眼劑製劑。
最佳模式
之後，將藉由實例更詳細地描述本發明。然而，此等實例僅用於說明目的，且本發明之範圍不限於此等實例。 所使用之縮寫
若下文未定義縮寫，則其具有普遍接受之含義。 aq.=水溶液；AUC =曲線下面積；CFTR =囊腫纖維化跨膜傳導調節蛋白；CHO=中國倉鼠卵巢；DCM=二氯甲烷；DIPEA = N,N-二異丙基乙胺；DMF=二甲基甲醯胺；EA=乙酸乙酯；HBT =3-[雙(二甲胺基)甲基鎓基]-3H-苯并三唑-1-氧化物六氟磷酸鹽；HRMS =高分辨率質譜儀；MeOH=甲醇；MPLC=中壓液相層析；NMR=核磁共振；PBS=磷酸鹽緩衝鹽水；PCR =聚合酶鏈式反應；PK =藥物動力學；r.t.=室溫；SAR =結構活性關係；SPR=結構-性能關係；TBAF =四-正丁基氟化銨；TBDM=三級丁基二甲基氯矽烷；TEA=三乙胺；TFA=三氟乙酸；THF=四氫呋喃；UPLC=超高效液相層析；YFP =黃色螢光蛋白。 1. 方法
(1) YFP 螢光猝滅檢定法。將表現具有鹵化物感測器YFP-H148Q/I152L之野生型人類CFTR的CHO-K1細胞以2×10 4個細胞/孔之密度鋪種於96孔微孔板中。將CHO-CFTR-YFP細胞在37℃下孵育48小時。使用FLUOstar Omega微板讀取器(BMG labtech，Allmendgrün，Ortenberg，Germany)及MARS資料分析軟體(BMG labtech)進行檢定。簡言之，將96孔板之各孔在PBS中洗滌三次(200 µL/洗滌)。然後，向各孔中添加100 µL PBS。將測試化合物(1 µL)添加到各孔中，終濃度為25 µM。10分鐘後，將96孔板轉移至預加熱至37℃之微板讀取器上以進行螢光檢定。藉由連續記錄螢光(每點400 ms)達2 s(基線)來單獨檢定各孔之經CFTR介導之I -流入。然後，在2 s時添加100 µL 140 mM I -溶液，然後記錄YFP螢光達14 s。在輸注碘離子後藉由非線性迴歸由初始螢光下降斜率確定初始碘離子流入速率。
(2) 溶解度測試方案。藉由將81% 0.0667M Na 2HPO 4及19% 0.0667M NaH 2PO 4混合來製備磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，pH 7.5)，並添加NaCl來調節等滲性。然後，將測試化合物以0.5 mg/mL溶解於PBS (pH 7.5)中，並渦旋90分鐘，然後將溶解於PBS中之化合物溶液依次經由0.45、1.2、5.0 μm注射器過濾器(Minisart NML，CA)過濾。使用Agilent 1290 Infinity UPLC與Sciex三重四極桿5500系統結合，對樣品進行適當稀釋，藉由LC-MS/MS量測經過濾之測試化合物之濃度。為了量化測試化合物之濃度，所有校準曲線由至少六個校準劑濃度、空白樣品(有內標)及雙空白樣品(無內標)組成。藉由分析物與內標之峰面積比對比實際濃度之加權線性或二次迴歸方法(1/x)建立校準曲線。藉由將經過濾測試化合物之分析物與內標之峰面積比代入校準曲線來反算測試化合物之溶解度。
(3) 烏辛室實驗。將含有表現CFTR之FRT細胞及經原代培養之人類結膜上皮細胞的Snapwell (Corning Inc., NY, USA)插入物安裝在烏辛室(Ussing chamber)中。為了量測FRT-CFTR細胞之頂膜電流，向頂浴中填充半Cl -溶液且向基底外側浴中填充HCO 3 -緩衝溶液，以產生跨上皮Cl -梯度(頂側，64 mM；基底外側，129 mM)，且將基底外側膜用250 µg/mL兩性黴素B透化。對於經原代培養之人類結膜上皮細胞之短路電流量測，向頂側及基底外側浴中填充HCO 3 -緩衝溶液。將細胞浸泡20分鐘穩定期，並在37℃下用95% O 2/5% CO 2充氣。將毛喉素、化學式1之化合物及CFTR inh-172依序添加到頂側及基底外側浴溶液中。使用EVC4000多通道V/I鉗(World Precision Instruments，Sarasota，FL)量測頂膜電流及短路電流，並使用PowerLab 4/35 (AD Instruments，Colorado Springs，CO，USA)記錄。使用Labchart Pro 7軟體(AD Instruments)收集並分析資料。取樣率為4 Hz。
(4) 藥物動力學及眼組織分佈研究。本研究之目的係測定化學式1之化合物在以50 μL/眼(0.1 mg/眼)之容量局部滴注至單純雄性新西蘭白兔之右眼後的血漿藥物動力學及眼組織分佈。在血漿及眼組織(來自一隻眼睛)中監測化學式1之化合物長達72小時。將此實驗中所用之化學式1之化合物溶解於磷酸鈉緩衝液中之5%聚乙二醇35蓖麻油中。藉由以0.1 mg/眼單次局部滴注投與來向動物投與含有化學式1之化合物之點眼劑。
在給藥後0.5、1、4、8、12、24、48及72小時收集血漿、淚液、角膜、結膜、及視網膜樣品。藉由液相層析-串聯質譜(LC-MS/MS)方法測定血漿、淚液、角膜勻漿、結膜勻漿及視網膜勻漿樣品中化學式1之化合物之濃度。藉由使用Phoenix WinNonlin軟體(6.3或以上版本，Pharsight)對研究動物中化學式1之化合物之血漿、淚液、角膜、結膜、及視網膜濃度進行非隔間藥物動力學分析。應用線性/對數梯形規則來獲得PK參數。低於定量下限(LLOQ)之淚液、角膜、結膜、視網膜、房水、及淚腺濃度值被排除在PK參數計算之外。
(5) 角膜及結膜上皮細胞毒性測試。將永生化人類角膜上皮細胞及結膜上皮細胞(Innoprot，Bizkaia，Spain)鋪種於96孔微孔板上。孵育24 h後，將細胞用30 μM候選化合物或0.01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)處理，然後將它們孵育兩天。將等量的DMSO添加到對照組中。每12 h更換一次培養基及化合物。為了在與化合物孵育48 h後評定細胞增殖情況，將細胞與MTS再孵育1h。藉由使用infinite M200微板讀取器(Infinite M200 Pro，Tecan Group Ltd.，Grödig，Austria)量測490nm處之吸光度，對由MTS細胞還原所產生之可溶性甲臢進行定量。使用CellTiter 96 Aqueous One Solution細胞增殖檢定套組(Promega，Madison，WI，USA)進行MTS檢定。
(6) 全細胞膜片鉗。在表現CFTR之CHO-K1細胞上進行全細胞膜片鉗記錄。浴溶液含有(以mM計) 140 NMDG-Cl、1 CaCl 2、1 MgCl 2、10 Tris-ATP、及10 HEPES (pH 7.4)。移液管溶液含有(以mM計) 130 CsCl、0.5 EGTA、1 MgCl 2、1 Tris-ATP、及10 HEPES (pH 7.2)。移液管由硼矽酸鹽玻璃拉製而成，且在火拋光後，電阻為3-5 MΩ。密封電阻在3至10 GΩ之間。在建立全細胞構型後，CFTR被毛喉素及/或化學式1之化合物活化。藉由施加電壓脈衝超極化及去極化，自0 mV維持電位到-80 mV至+80 mV之間的電位(步長為20 mV)來引發全細胞電流。使用Axopatch-200B (Axon instruments，Foster City，CA，USA)在室溫下進行記錄。使用Digidata 1440A轉換器(Molecular Devices Co.，Union City，CA USA)對電流進行數位化，以5 kHz進行濾波，並以1 kHz進行取樣。
(7) ANO1 活性量測。將含有表現人類ANO1之FRT細胞之Snapwell插入物安裝在烏辛室中。向頂浴中填充半Cl -溶液且向基底外側浴中填充HCO 3緩衝溶液，以產生跨上皮Cl梯度(頂側，64mM；基底外側，129mM)，且將基底外側膜用250 µg/mL兩性黴素B透化。將細胞浸泡20分鐘穩定期，並在37℃下用95% O 2/5% CO 2充氣。將ATP應用於頂浴溶液以誘導細胞內鈣增加。將化學式1之化合物或Ani9添加到頂側及基底外側浴溶液中。在ANO1活化前20分鐘，使用EVC4000多通道V/I鉗及PowerLab 4/35量測頂膜電流。使用Labchart Pro 7分析資料。取樣率為4 Hz。
(8) VRAC 活性量測。將HeLa細胞用YFP-F46L/H148Q/I152L(鹵化物感測器YFP)穩定轉染。在將細胞在96孔微孔板上孵育48小時後，將96孔板之各孔在PBS中洗滌3次(200 μL/洗滌)，並用50 μL/孔以下等滲溶液(以mM計)填充孔：140 NaCl、5 KCl、20 HEPES (310 mOsm；使用NaOH得到pH 7.4)。在各孔中，藉由添加50 μL以下低滲壓溶液(以mM計)刺激細胞上表現之容量調節陰離子通道(VRAC)：5 KCl、20 HEPES、90甘露醇(120 mOsm/kg)。將測試化合物(1 μL)以劑量依賴性方式添加到各孔中。5分鐘後，將96孔板轉移至板讀取器以進行螢光檢定。每個孔均單獨檢測VRAC介導之I -藉由連續記錄螢光(每點400 ms)達7.6 s來單獨檢定各孔之經VRAC介導之I -流入。記錄0.4 s YFP螢光作為基線，然後在0.4 s時添加100 μL 140 mM I -溶液，觀測螢光變化。在輸注碘離子後藉由非線性迴歸由初始螢光下降斜率確定初始碘離子流入速率。
(9) 細胞內 cAMP 量測。將在12孔培養板上生長之CHO-K1細胞用PBS洗滌3次，然後在含有100 µM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)之PBS中在37℃下孵育5分鐘。將細胞用化學式1之化合物或毛喉素處理並在37℃下孵育10分鐘。在孵育10分鐘後，用冷PBS洗滌細胞，並使用cAMP免疫檢定套組(參數cAMP免疫檢定套組；R&D Systems，Minneapolis，MN)根據製造商之方案量測胞質cAMP。
(10) 動物。所有動物之使用及照顧均嚴格遵守ARVO關於眼科及視力研究中動物使用之聲明。本研究已獲得延世醫學院世福蘭斯醫院(Severance Hospital, Yonsei College of Medicine)(韓國首爾)機構審查委員會之批准及審查(IRB號：2019-0166)。
(11) 經莨菪鹼誘導之乾眼病小鼠模型及點眼劑之施用。使用獲自Orientbio (Gyeonggi-do，South Korea)之八週大雌性C57BL/6J小鼠。進行乾眼病小鼠模型評估。實驗期共進行24天，且在實驗期期間在乾燥室(溫度：22℃，濕度：12%)中飼養。為了誘導乾眼病模型，皮下注射0.5 mg/0.1 ml氫溴酸莨菪鹼，每天3次(11:00 am，2:00 pm，5:00pm)，達14天。在誘導乾眼病小鼠模型後，每隻眼睛滴入0.3%地誇磷索鈉(Diquas，眼用溶液solution Santen Pharmaceutical Co. Ltd.，Osaka，Japan)、媒劑(磷酸鈉緩衝液中之5%聚乙二醇35蓖麻油)或化學式1之化合物(2060 µM，磷酸鈉緩衝液中之5%聚乙二醇35蓖麻油)，每天施用3次(11:00 am、2:00 pm、5:00pm)，達10天，且同時在治療期前8天皮下注射0.5mg/0.1ml氫溴酸莨菪鹼。在雙眼內進行點眼劑施用，每隻眼睛5 ul，且維持30秒。
(12) 野生型小鼠中點眼劑之施用。使用獲自Orient Bio (Seongnam，South Korea)之八週大雌性C57BL/6J小鼠。馴化7天後，施用一次包含 化學式 1 之化合物之各點眼劑。在雙眼內進行點眼劑施用，每隻眼睛2.5µl，且維持30秒。本實驗採用不同濃度之 化學式 1 之化合物(1μM、10μM、100μM、1000μM)及媒劑進行。
(13) 淚液量量測。使用酚紅線(Showa Yakuhin Kako Co. Ltd, Tokyo, Japan)，藉由使用鑷子將酚紅線塗抹在正常或乾眼病模型處理之氫溴酸莨菪鹼小鼠之外眥區域達15秒來量測淚液量，並藉由遊標卡尺進行量測以在顯微鏡下檢查濕線之長度。在乾眼病模型小鼠中實施三次量測；在誘導乾眼病前、誘導乾眼病後、點眼劑施用後10天。在使用正常小鼠之實驗中，隨著時間推移，使用酚紅線量測淚液量四次，即在施用點眼劑之前(0小時，基線)及在施用點眼劑之後1小時、3小時及6小時。
(14) 角膜糜爛分級。為了評估角膜上皮糜爛，每次治療10天後，將5μL 1%螢光素染料及0.5%丙美卡因施用在小鼠眼表上。使用顯微鏡內置數位相機在鈷藍色濾光下拍攝眼前節之像片。根據牛津方案(Oxford scheme)，對每次角膜糜爛進行評分，自0至5。
(15) 定量 PCR 分析。使用Tri-RNA試劑(FAVORGEN, Ping-Tung, Taiwan)分離總RNA，並根據製造商方案，使用RNA至cDNA EcoDryTM預混物(TaKaRa, Shiga, Japan)使用1 μg總RNA合成cDNA。在ViiA7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中使用SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)評估相對mRNA水準。將靶基因表現標準化為管家基因甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)之表現。所用引子序列如下：GAPDH，有義(5-AACGACCCCTTCATTGACCT-3，Seq.ID NO.1)及反義(5-ATGTTAGTGGGGTCTCGCTC-3，Seq.ID NO.2)，PCR產物大小為155個鹼基對；IL-1β，有義(5-ACTCATTGTGGCTGTGGAGA-3，Seq.ID NO.3)及反義(5-TTGTTCATCTCGGAGCCTGT-3，Seq.ID NO.4)，PCR產物大小為199個鹼基對；IL-6，有義(5-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3，Seq.ID NO.5)及反義(5-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3，Seq.ID NO.6)，PCR產物大小為131個鹼基對；IL-17，有義(5-GCTGACCCCTAAGAAACCCC-3，Seq.ID NO.7)及反義(5- GAAGCAGTTTGGGACCCCTT-3，Seq.ID NO.8)，PCR產物大小為162個鹼基對；TNF-α，有義(5-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3，Seq.ID NO.9)及反義(5-CGATCACCCCGAAGTTCAGT-3，Seq.ID NO.10)，PCR產物大小為166個鹼基對；MMP-2，正義(5-CGATGTCGCCCCTAAAACAG-3，Seq.ID NO.11)及反義(5- GCATGGTCTCGATGGTGTTC-3，Seq.ID NO.12)，PCR產物大小為176個鹼基對；及MMP-9，有義(5-AAAACCTCCAACCTCACGGA-3，Seq.ID NO.13)及反義(5-GTGGTGTTCGAATGGCCTTT-3，Seq.ID NO.14)，PCR產物大小為190個鹼基對。
統計分析。使用學生t檢驗評估差異之顯著性且 p＜ 0.05被認為係顯著的。 2. 結果 (1) YFP 螢光及溶解度分析結果
在已知具有CFTR活化作用之式A與本發明之化學式1之化合物(本文為16d)之間進行比較。EC 50無顯著差異，但化學式1之化合物之溶解度值被證實為134,489 nM，證實其具有優異溶解度。在本文中，溶解度係指在PBS (pH 7.5)中之溶解度。 表1
化合物 R EC 50(nM) a 溶解度(nM) b 溶解度/ YFP比 cLogD 7.4 c
A (Cact-3 ) 18 59 3 2.61
16d 23 134,489 5,847 1.73
a藉由YFP猝滅檢定在表現人類野生型CFTR之CHO-K1細胞中量測CFTR通道活性。結果表示為三次重複之平均值。 b在PBS中渦旋90分鐘後化合物之濃度。 c藉由ACD/Percepta軟體(ACD/Labs, Toronto, Canada)計算cLogD 7.4值。
式1之化合物在CFTR活化劑中具有特別優異的溶解度及高效力。已證實本發明之式1之化合物適合用作點眼劑調配物。 (2) 化學式 1 之化合物對 CFTR 氯離子通道活性之影響
為了研究 化學式 1 之化合物對CFTR氯離子通道活性之影響，在表現人類CFTR之FRT細胞中量測頂膜電流。 化學式 1 之化合物以劑量依賴性方式有效活化CFTR氯離子通道，其中IC 50為342 nM，且 經化學式 1 之化合物誘導之CFTR氯電流被有效選擇性CFTR抑制劑CFTR inh-172完全阻斷(第1A、1B圖)。為了進一步表徵 化學式 1 之化合物對CFTR之活化，對表現人類CFTR之CHO-K1細胞進行全細胞膜片鉗分析。施用30 μM 化學式 1 之化合物強烈活化之CFTR電流表現出線性電流/電壓關係，如同經毛喉素誘導之CFTR活化一樣，且經 化學式 1 之化合物誘導之CFTR電流被CFTR inh-172完全抑制( 第 1C-1E 圖)。 (3) 化學式 1 之化合物之活體外表徵
為了研究 化學式 1 之化合物對其他氯離子通道之影響，觀測到 化學式 1 之化合物對經鈣活化之氯離子通道TMEM16A/Anoctamin 1 (ANO1)及容量調節陰離子通道(VRAC)之影響。在表現人類ANO1之FRT細胞中量測ANO1頂膜電流，並在表現鹵化物感測器YFP-F46L/H148Q/I152L之LN215細胞中使用YFP螢光猝滅檢定量測VRAC活性。高濃度(30 μM) 化學式 1 之化合物不影響ANO1及VRAC之通道活性，但ANO1及VRAC分別被Ani9及VI-116完全阻斷( 第 2A 、 2B 圖)。CFTR被cAMP傳訊途徑活化。
因此，觀測到化學式1之化合物對細胞內cAMP濃度之影響。與對照組相比，化學式1之化合物稍微增加cAMP水準，但並不像毛喉素那樣強烈地增加cAMP水準(第2圖)。
為了觀測化學式1之化合物之細胞毒性，在角膜上皮(CorE)及結膜上皮(ConjE)細胞中評估化學式1之化合物對細胞活力之影響。化學式1之化合物在30 μM時不會影響CorE及ConjE之細胞活力(第2D圖)。
為了研究化學式1之化合物是否可活化人類眼上皮中之內源性CFTR通道，在經原代培養之人類結膜上皮細胞中量測短路電流。有趣的是，化學式1之化合物以劑量依賴性方式有效地增加CFTR依賴性氯離子電流，且經化學式1之化合物誘導之CFTR電流被10 μM CFTR inh-172完全抑制。此等結果表明化學式1之化合物可以有效且選擇性地活化人類CFTR，而對眼上皮無細胞毒性。 (4) 化學式 1 之化合物之眼部分佈及血漿藥物動力學。
在研究化學式1之化合物的活體內功效之前，在雄性新西蘭白兔中局部眼部投與化學式1之化合物後評估眼組織分佈及血漿藥物動力學(PK)。在PK研究期間未觀測到化學式1之化合物的副作用。如第3圖及表2所示，淚液、角膜及結膜中化學式1之化合物之濃度維持超過342 nM (166 ng/mL)之EC 50值達8小時。對於化學式1之化合物之平均血漿濃度，未測定PK參數，因為除了在投與後0.5小時外，它們在長達72小時內均低於定量下限。此等結果指示，化學式1之化合物很好地分佈於表現CFTR之靶組織(角膜及結膜)中，維持很長一段時間，且具有可忽略的全身暴露。 表2
在以0.1mg/眼單次局部滴注化學式1之化合物點眼劑後，化學式1之化合物在兔中之藥物動力學參數(n＝3)
PK參數 平均值 血漿 平均值 結膜 平均值 角膜 平均值 視網膜 平均值 眼淚
C max(ng/mL或ng/g) ND a 793.0 7840.0 ND a 749.0
T max(h) ND a 0.5 0.5 ND a 8.0
T 1/2(h) ND a *40.6 *23.1 ND a *29.8
T last(h) ND a 72.0 72.0 ND a 72.0
AUC 0-last(ng·h/mL或ng·h/g) ND a 9819.0 28349.0 ND a 16573.0
AUC 0-24(ng·h/mL或ng·h/g) ND a 4734.0 19409.0 ND a 7952.0
AUC 0-inf(ng·h/mL或ng·h/g) ND a 13741.0 35802.0 ND a 18750.0
aND：未測定(由於終末消除階段定義不充分，未測定參數) *：終末階段時濃度值之經調整線性迴歸係數小於0.9，T 1/2可能無法準確估計 PK參數計算中使用複合平均濃度。
(5) 在 CFTR 活化劑中，它顯示出特別快速的作用及更高的最大功效。
為了研究化學式1之化合物(16d)與化合物A (Cact-3)相比之藥理優勢，觀測到16d及Cact-3對野生型(正常)小鼠淚液量之影響。Cact-3之最大溶解度為72 μM，因此Cact-3之投與多達72 μM。在16d之情況下，最大溶解度大於2 mM，且16d之投與多達1 mM。如第4圖所示，16d及Cact-3兩者之治療顯示淚液量呈現劑量依賴性增加，且16d之E max高於Cact-3，16d在投與後1小時達到最大淚液量，而Cact-3在投與後3小時顯示最大淚液量。因此，與Cact-3相比，16d具有溶解度更高、最大功效更高及作用更快之優點。 (6) 增加 DED 小鼠之淚液量並減少角膜糜爛。
為了研究 化學式 1 之化合物對DED小鼠淚液量之影響，在乾眼病小鼠模型中藉由酚紅線測試評估經莨菪鹼誘導之淚液量。如 第 5A 圖所示，與對照組相比，皮下注射莨菪鹼顯著減小未治療組及媒劑治療組之線潤濕長度。然而， 化學式 1 之化合物之治療顯著且幾乎完全恢復了經莨菪鹼誘導之淚液量減少，且地誇磷索亦顯示出DED小鼠淚液量之顯著恢復。為了研究 化學式 1 之化合物是否改善DED小鼠之眼表損傷，在使用媒劑、 化學式 1 之化合物或地誇磷索治療之經莨菪鹼誘導之乾眼病小鼠模型中觀測到角膜糜爛變化。每滴點眼劑施用於每隻眼睛，每天三次，達10天。與對照組相比， 化學式 1 之化合物顯著減少角膜糜爛( 第 5B 、 5C 圖)。此等結果表明 化學式 1 之化合物增強DED小鼠之淚液分泌並減少角膜糜爛，其功效等於或大於地誇磷索。 (7) DED 小鼠眼上皮中促炎性細胞介素及 MMP2 之 mRNA 表現之減少。
已知DED小鼠之眼表表現出高水準之感染性細胞介素，諸如IL-1β、IL-6、IL-17及TNF-α，以及基質金屬蛋白酶(MMP)-2及MMP-9。在正常或DED小鼠之角膜及結膜中，在媒劑、化學式1之化合物及地誇磷索存在或不存在下藉由即時PCR研究MMP-2、MMP-9及促發炎細胞介素(包括IL-1β、IL-6、IL-17及TNF-α)之mRNA表現水準。當用化學式1之化合物處理時，角膜及結膜中IL-1β、IL-17、TNF-α及MMP-2之mRNA表現水準顯著降低(第6圖)。其中，地誇磷索亦顯著降低IL-17、TNF-α及MMP-2之mRNA表現水準。此等結果表明，化學式1之化合物降低DED小鼠角膜及結膜中IL-1β、IL-17、TNF-α及MMP-2之mRNA表現水準，其功效等於或大於地誇磷索之功效。 3. 結論
本研究之目的係提供具有優異溶解度之點眼劑，以達成高眼部生物可用度並減少眼表損傷。
電生理學研究表明，化學式1之化合物有效且選擇性地活化CFTR氯離子通道，而對角膜及結膜上皮細胞無細胞毒性。另外，化學式1之化合物在兔之角膜及結膜中分佈良好並維持很長一段時間(＞8小時)，且全身暴露忽略不計。在以下活體內實驗中，化學式1之化合物與地誇磷索相當，顯著增強經莨菪鹼誘導之乾眼病小鼠之淚液量恢復並改善角膜糜爛。化學式1之化合物亦顯著降低經莨菪鹼誘導之乾眼病小鼠之角膜及結膜中MMP2及促炎性細胞介素(包括IL-1β、IL-17及TNF-α)之mRNA表現水準。 4. 點眼劑之投與
根據以下眼科投與方案向哺乳動物個體(小鼠、兔及狗)投與眼用組成物。此眼用組成物係藉由將式1之化合物與界面活性劑(聚山梨醇酯80)、PEG 40-硬脂酸酯及聚乙二醇-35蓖麻油調配在一起而製備之組成物，且該組成物可以藉由韓國專利申請案第10-2022-0049160號中揭示之方法獲得。
組成物中所含之式1之化合物以不同的濃度及投與時間投與，且當以本發明之投與濃度及投與頻率滴入眼中時，達到本發明之目的效果，例如增加淚液量及抑制炎症。 表3
式 1 之化合物之濃度 (mg/ml)
投與排程 0.5 1.0 2.0
1滴1次 0.025 mg 0.05 mg 0.1 mg
2滴1次 0.05 mg 0.1 mg 0.2 mg
3滴1次 0.075 mg 0.15 mg 0.3 mg
1滴2次 0.05 mg 0.1 mg 0.2 mg
2滴2次 0.1 mg 0.2 mg 0.4 mg
3滴2次 0.15 mg 0.3 mg 0.6 mg
1滴3次 0.075 mg 0.15 mg 0.3 mg
2滴3次 0.15 mg 0.3 mg 0.6 mg
3滴3次 0.225 mg 0.45 mg 0.9 mg
1滴4次 0.1 mg 0.2 mg 0.4 mg
2滴4次 0.2 mg 0.4 mg 0.8 mg
3滴4次 0.3 mg 0.6 mg 1.2 mg
1滴5次 0.125 mg 0.25 mg 0.5 mg
2滴5次 0.25 mg 0.5 mg 1 mg
3滴5次 0.375 mg 0.75 mg 1.5 mg
1滴6次 0.15 mg 0.3 mg 0.6 mg
2滴6次 0.3 mg 0.6 mg 1.2 mg
3滴6次 0.45 mg 0.9 mg 1.8 mg
1滴7次 0.175 mg 0.35 mg 0.525 mg
2滴7次 0.35 mg 0.7 mg 1.05 mg
3滴7次 0.7 mg 1.4 mg 2.1 mg
具有上述投與(點眼劑)排程之本發明之眼用組成物在乾眼症候群或乾眼病相關疾病之治療及改善方面優異。
上述對本發明之描述係出於說明目的，且熟悉此項技藝者將理解，本發明可以容易地修改為其他具體形式而不改變其技術範圍或基本特徵。因此，上述實施例在所有方面均應被理解為說明性的而非限制性的。例如，以單一形式描述之本發明之各組分的範圍由下述發明申請專利範圍指示，且自發明申請專利範圍及其等同概念之含義及範圍推導出的所有改變或修改形式均應被解釋為包括在本發明之範圍內。 工業應用
本發明提供了點眼劑。本發明可用於治療及/或改善乾眼病。
無
第1圖顯示化學式1之化合物(亦即16d)對CFTR氯離子通道之活化。(A)顯示表現人類CFTR之FRT細胞中頂膜電流之代表性跡線。CFTR在50nM毛喉素(FSK)存在下被指定濃度的化學式1之化合物活化，且被10μM CFTR inh-172抑制。(B) CFTR活化總結(平均值±S.E.，n=3)。(C)在表現人類CFTR之CHO-K1細胞中，以0mV之維持電位記錄全細胞電流，並以±80mV (20mV單位)之間的電壓進行脈衝。CFTR被20 μM毛喉素或30 μM化學式1之化合物活化，並被20 μM CFTR inh-172抑制。(D)各電壓脈衝中間之平均電流之電流/電壓圖。(E)顯示在+80mV下電流密度之總和(平均值±S.E.，n=3)。
第2圖顯示化學式1之化合物之特性及在經原代培養之人類結膜上皮細胞中對CFTR活性之影響。(A)在表現ANO1之FRT細胞中量測頂膜電流。ANO1被100 μM ATP活化並被10 μM ANO1抑制劑Ani9抑制。將細胞用化學式1之化合物(30 μM)及Ani9預處理10分鐘。(B)在表現YFP-F46L/H148Q/I152L之HeLa細胞中觀測到化學式1之化合物對VRAC氯離子通道活性之影響。將細胞在低滲壓溶液中用化學式1之化合物處理(30 μM) 5分鐘。VRAC被10 μM VRAC抑制劑VI-116抑制。(C)將CHO-K1細胞在IBMX (100 μM)存在下用化學式1之化合物(30 μM)及毛喉素(10 μM)處理10分鐘，然後測定cAMP水準(平均值± S.E.，n = 3)。(D)將角膜上皮(CorE)及結膜上皮(ConjE)細胞用化學式1之化合物處理48小時，並藉由MTS檢定法測定細胞活力(平均值± SE，n = 3)。(E)顯示在經原代培養之人類結膜上皮細胞中短路電流之代表性跡線。CFTR被所示濃度之化學式1之化合物活化，並被10 μM CFTR inh-172阻斷。
第3圖顯示在兔中在以0.1mg/眼單次局部滴注化學式1之化合物之點眼劑後，化學式1之化合物之平均濃度-時間曲線。
第4圖顯示野生型小鼠中化學式1之化合物及Cact-3對淚液量之影響。(A)在用不同濃度之化學式1之化合物處理的各組中藉由酚紅線測試量測淚液量(平均值±S.E.，n = 6)。(B)在用不同濃度之Cact-3處理的各組中藉由酚紅線測試量測淚液量(平均值±S.E.，n = 6)。將小鼠用2.5 μl媒劑(磷酸鈉緩衝液中之5%聚乙二醇35蓖麻油)之點眼劑、化學式1之化合物及Cact-3治療。* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001。
第5圖顯示在經莨菪鹼誘導之乾眼病小鼠模型中化學式1之化合物對淚液量及眼表損傷之影響。(A)用酚紅線測試量測各組之淚液量(平均值±S.E.，n = 5)。(B)藉由螢光素染色以五點量表量測各組之角膜糜爛等級(平均值±S.E.，n = 5)。(C)角膜經螢光素染色之小鼠眼睛之代表性圖像。將小鼠用5 μl媒劑(磷酸鈉緩衝液中之5%聚乙二醇35蓖麻油)之點眼劑、化學式1之化合物(2,060 µM，磷酸鈉緩衝液中之5%聚乙二醇35蓖麻油)及地誇磷索治療，每日三次，達10天，同時維持乾眼病。NT：不治療；Diquas：地誇磷索；ns：不顯著。* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01。
第6圖顯示化學式1之化合物對角膜及結膜中炎性細胞介素及MMP之mRNA表現水準之影響。(A-F)顯示角膜及結膜中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MMP2、MMP9之mRNA表現水準。將小鼠用5 μl媒劑(磷酸鈉緩衝液中之5%聚乙二醇35蓖麻油)之點眼劑、化學式1之化合物(2,060 µM，磷酸鈉緩衝液中之5%聚乙二醇35蓖麻油)及地誇磷索治療，每日三次，達10天，同時維持乾眼病(平均值± S.E., n = 5)。NT：不治療；Diquas：地誇磷索；ns：不顯著。* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001。
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Claims (17)

  1. 一種用於治療、預防或改善乾眼病或乾眼病相關疾病之點眼用組成物，包含一濃度為0.01%(w/v)至0.3%(w/v)的由以下化學式1表示之一化合物或其一醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物作為活性成分，且每天向眼內滴入1-7次，每次每隻眼睛1-3滴 [化學式1] 。
  2. 如請求項1所述之點眼用組成物，其中包含一濃度為0.04%(w/v)至0.25%(w/v)之該活性成分。
  3. 如請求項1所述之點眼用組成物，其中包含一濃度為0.05%(w/v)至0.2%(w/v)之該活性成分。
  4. 如請求項1所述之點眼用組成物，其中包含一濃度為0.05%(w/v)、0.1%(w/v)、或0.2%(w/v)之該活性成分。
  5. 如請求項1所述之點眼用組成物，其中該組成物包含一濃度為0.4-3mg/ml之該活性成分。
  6. 如請求項1所述之點眼用組成物，其中該組成物之特徵在於在向眼內滴注期間向眼內滴入基於50uL的0.025mg、0.05mg、0.075mg、0.1mg、0.125 mg、0.15mg、0.175mg、0.2mg、0.225mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.375mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.525mg、0.6mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.05 mg、1.2mg、1.4mg、1.5mg、1.8mg、2.0mg或2.1mg之該活性成分，每隻眼睛一次。
  7. 如請求項1所述之點眼用組成物，其中該活性成分每天向眼內滴入1、2、3、4、5、6或7次。
  8. 如請求項1至請求項7中任一項所述之點眼用組成物，其中該組成物進一步包含一醫藥學上可接受之賦形劑。
  9. 如請求項8所述之點眼用組成物，其中該賦形劑包含一界面活性劑、一等滲劑或一緩衝劑。
  10. 如請求項1至請求項7中任一項所述之點眼用組成物，其中該組成物為點眼劑溶液、軟膏劑、凝膠劑、乳膏劑、洗劑、乳液、混懸劑、或噴霧劑之一形式。
  11. 一種用於治療或改善個體之乾眼病或乾眼病相關疾病之方法，包含以下步驟：以0.01%(w/v)至0.3%(w/v)之濃度向有需要之個體投與由以下化學式1表示之一化合物或一醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前驅藥或立體異構物作為一活性成分， 其中該投與係每日向眼內滴入1-7次，每次每隻眼睛1-3滴 [化學式1] 。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該活性成分以0.04%(w/v)至0.25%(w/v)之一濃度滴入眼中。
  13. 如請求項11所述之方法，其中該活性成分以0.05%(w/v)至0.2%(w/v)之一濃度滴入眼中。
  14. 如請求項11所述之方法，其中該活性成分以0.05%(w/v)、0.1%(w/v)、或0.2%(w/v)之一濃度滴入眼中。
  15. 如請求項11所述之方法，其中該活性成分以0.4-3mg/ml之一濃度滴入眼中。
  16. 如請求項11所述之方法，其中該方法之特徵在於在向眼內滴注期間向眼內滴入基於50uL的0.025mg、0.05mg、0.075mg、0.1mg、0.125 mg、0.15mg、0.175mg、0.2mg、0.225mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.375mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.525mg、0.6mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.05mg、1.2mg、1.4mg、1.5mg、1.8mg、2.0mg或2.1mg之該活性成分，每隻眼睛一次。
  17. 如請求項11所述之方法，其中該活性成分每天向眼內滴入1、2、3、4、5、6或7次。
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