TW202417630A - 經修飾的cmv類病毒粒子與ngf抗原之獸醫組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於包含經修飾之黃瓜嵌紋病毒（CMV）類病毒粒子（VLP）的組成物，且特定言之，係關於與神經生長因子（NGF）抗原連接的經修飾之CMV之VLP，該等經修飾之CMV之VLP包含含有一段連續的帶負電胺基酸的嵌合CMV多肽，該等連續胺基酸選自天冬胺酸或麩胺酸；以及其醫藥組成物，該等組成物較佳充當用於產生免疫反應、尤其是抗體反應的疫苗平台，該等免疫反應係針對與經修飾之CMV之VLP連接的該等NGF抗原。
Description
本發明係關於包含經修飾之黃瓜嵌紋病毒（CMV）類病毒粒子（VLP）的獸醫組成物，且特定言之，係關於與神經生長因子（NGF）抗原連接的經修飾之CMV之VLP，該等經修飾之CMV之VLP包含含有一段連續的帶負電胺基酸的嵌合CMV多肽，該等連續胺基酸選自天冬胺酸或麩胺酸；以及其醫藥組成物，該等組成物較佳充當用於產生免疫反應、尤其是抗體反應的疫苗平台，該等免疫反應係針對與經修飾之CMV之VLP連接的該等NGF抗原。
類病毒粒子（VLP）已成為已確立且接受的疫苗技術，特別是作為免疫學運載體用於誘導針對所結合之抗原的強免疫反應（Zeltins A, Mol Biotechnol (2013) 53:92-107；Jennings GT及Bachmann MF, Annu Rev Pharmacol Toxicol (2009) 49:303-26；Jennings GT及Bachmann MF, Biol Chem (2008) 389:521-536）。
最近，已描述一種疫苗平台，其基於黃瓜嵌紋病毒（CMV，雀麥花葉病毒科（
Bromoviridae），黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus））類病毒粒子（CMV之VLP），且利用化學連接子偶合技術呈遞不同抗原，包括自體抗原，諸如其表面上的細胞介素，且引發有效的中和抗體反應。此等可溶性及穩定的CMV之VLP充當了極佳的平台，原因在於其固有的特性，諸如將目標抗原反覆呈遞至B細胞受體、奈米級尺寸及幾何形狀。以及經由TLR活化及提供T細胞幫助而將先天性免疫活化（WO2016/062720；Zeltins A等人, Vaccines 2 (2017) 30; Bachmann MF等人, Frontiers in Microbiology第9卷，論文2522, 2018年10月；von Loga IS等人, Ann. Rheum Dis 2019, 78:672-675；WO2021/260131）。
儘管此等基於VLP之通用疫苗的開發過程取得進展，但仍有挑戰及要求須加以考慮，特別是最終臨床試驗測試、產品登記、市場投放及商業供應需求方面的挑戰及要求。在此，特別要提及控制性的產品特徵，諸如穩定性、儲存期限、溶解度、可製造性，包括可擴展性、安全、效力、生物利用率及其他藥理學特性，且該等產品特徵係化學處理、製造及控制（CMC）製程的關鍵要素，為低成本高效益地足量提供此等產品用於此類最終臨床試驗測試、產品登記、市場投放及商業供應需求所必需的（Pham NG, Int J Pharm, 2020, 585:119523）。特定而言，與此等VLP平台及基於VLP之疫苗的穩定性（甚至在有效CMC製程所必需的各種條件下）相關。不利地影響產物特徵的另一個非預期事件及問題分別為生物藥劑及疫苗的聚集（Roberts CJ, Current Opinion in Biotechnology, 2014, 30:211-217）。雖然聚集的疫苗仍能夠引發免疫反應（倘若其原生結構得以維持），且即使其因此仍可適用於一些實驗室研究，但就為了臨床研究及市場而製得的GMP產物而言，其不可接受。
因此，儘管此等基於VLP之通用疫苗的開發過程取得進展，但仍需要開發經修飾的VLP系統，其經調適可解決可能產生的挑戰且滿足最終產品登記及市場投放的要求。
發現神經生長因子（NGF）為發育中之神經系統中用於感覺及交感神經神經元發育及維持的關鍵因子。其充當可溶性信號傳導蛋白，該信號傳導蛋白經由結合至以下兩種不同細胞表面受體（NGFR）來介導其活性：高親和力NGF特異性原肌凝蛋白受體激酶A（TrkA）與低親和力p75神經滋養素受體（p75NTR）。已鑑別出犬科動物或貓科動物神經生長因子及來自其他動物物種之相應異種同源物的胺基酸序列且該等胺基酸序列已為熟習此項技術者所知。
吾等已驚人地發現，包含與NGF抗原連接之經修飾之CMV之VLP的本發明組成物不僅免疫原性高而在試管內誘導高效價的針對NGF抗原之中和抗體，而且本發明的CMV之VLP-NGF結合物保持其穩定性及結構完整性。此特別令人驚訝的原因在於，在形成VLP的蛋白質內包含額外負電荷，諸如插入根據本發明的選自麩胺酸及天冬胺酸之連續的帶負電胺基酸的區段，可能對VLP的形成產生有害效應。相比之下，此等連續的帶負電胺基酸區段的特定插入不僅改良所得經修飾之CMV之VLP在高溫及較高離子濃度條件下的穩定性（相較於先前技術CMV之VLP），而且在NGF抗原連接後，本發明的CMV之VLP-NGF結合物在溶液中不形成聚集體且保持穩定，然而先前技術的CMV之VLP在此類連接後形成大聚集體且沈澱。所結合之CMV之VLP發生的此類聚集及聚集體形成係藥物開發及產品登記非常不期望的，而本發明組成物非常有益於大幅減少或避免此類非期望的聚集。另外，在較高鹽溶液中因CMV之VLP表面電荷修飾而引起的穩定性改良額外地有益於其可處理性及離子交換層析法（尤其是陰離子交換層析）純化或甚至是必不可少的，從而進一步有利地允許可容易擴大本發明組成物的製造。
因此，在第一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及
(ii) 包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基，
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
本發明的其他態樣及具體實例將隨著本說明書的繼續描述而變得顯而易見。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。本文所述及所揭示的具體實例、較佳具體實例及/或極佳具體實例應適用於所有態樣及其他具體實例、較佳具體實例及/或極佳具體實例，不論是否再次具體提及或不論是否為了簡潔而避免其重複。如本文所用，冠詞「一（a/an）」係指冠詞之一個或超過一個（亦即，至少一個）文法對象。除非上下文另有明確指示，否則如本文所用之術語「或」應理解為意謂「及/或」。
類病毒粒子（VLP）：如本文所用，術語「類病毒粒子(VLP)」係指無複製性或無感染性的粒子，較佳為無複製性及無感染性的病毒粒子，或係指無複製性或無感染性的結構，較佳為類似於病毒粒子的無複製性及無感染性結構，較佳為病毒蛋白殼。如本文所用，術語「無複製性」係指不能複製VLP所含的基因體。如本文所用，術語「無感染性」係指不能輸入宿主細胞內。根據本發明的類病毒粒子由於缺乏病毒基因體或基因體功能的全部或一部分而無複製性且無感染性。根據本發明的類病毒粒子可含有不同於其基因體之核酸。重組產生的類病毒粒子典型地含有宿主細胞源RNA。根據本發明之類病毒粒子的典型及較佳具體實例為由本發明之多肽構成的病毒蛋白殼。類病毒粒子典型地為由病毒外殼蛋白構成的大分子組裝體，該外殼蛋白典型地包含每個類病毒粒子60、120、180、240、300、360或超過360個蛋白質亞單元。典型地且較佳地，此等亞單元的相互作用引起具有內在重複性組織之病毒蛋白殼或類病毒蛋白殼結構的形成。類病毒粒子的一個特徵為其高度有序及其亞單元的重複性排列。
經修飾的CMV類病毒粒子（VLP）：術語「經修飾的CMV類病毒粒子」係指包含至少一種如本文所定義及所述之嵌合CMV多肽的類病毒粒子。典型地且較佳地，經修飾的CMV之VLP類似於CMV蛋白殼的結構。經修飾的CMV之VLP無複製性且/或無感染性，且至少缺乏編碼CMV複製機器的一或多種基因，且典型地亦缺乏編碼負責病毒附接至宿主或進入宿主中之一或多種蛋白質的一或多種基因。此定義亦包括經修飾的類病毒粒子，其中前述一或多種基因仍存在，但無活性。較佳地，無複製性及/或無感染性的經修飾之類病毒粒子係藉由重組基因技術獲得且典型地且較佳地不包含病毒基因體。較佳地，經修飾的CMV之VLP為由根據本發明修飾之CMV多肽構成的大分子組裝體，且典型地且較佳地，每個VLP分別包含180個此類蛋白質亞單元及嵌合多肽。因此，在一較佳具體實例中，該經修飾之黃瓜嵌紋病毒（CMV）類病毒粒子（VLP）包含180種嵌合CMV多肽。
多肽：如本文所用，術語「多肽」係指由胺基酸單體構成的聚合物，該等胺基酸單體藉由醯胺鍵（亦稱為肽鍵）呈線性連接。其指胺基酸分子鏈，而非指特定長度的產物。因此，多肽的定義內包括肽、二肽、三肽、寡肽及蛋白質。如本文所用，典型地且較佳地，術語「多肽」亦應指如之前所定義的多肽，且涵蓋修飾，諸如轉譯後修飾，包括但不限於糖基化。在一較佳具體實例中，如本文所用，術語「多肽」應指如之前所定義之多肽且不涵蓋修飾，諸如轉譯後修飾，諸如糖基化。特定而言，具有生物活性的該等肽隨後甚至可在活體內發生該等修飾，諸如該等糖基化，例如藉由細菌發生。
黃瓜嵌紋病毒（CMV）多肽、CMV多肽：如本文所用，術語「黃瓜嵌紋病毒（CMV）多肽」係指包含或較佳由以下者組成的多肽：(i)黃瓜嵌紋病毒（CMV）之外殼蛋白的胺基酸序列；或(ii)突變胺基酸序列，其中CMV的該突變胺基酸序列與該外殼蛋白顯示至少90%、較佳至少91%、92%、93%或94%、更佳至少95%的序列一致性，又更佳至少98%且進一步更佳至少99%的序列一致性。典型地且較佳地，CMV多肽能夠在表現後藉由自組裝形成CMV類病毒粒子。
黃瓜嵌紋病毒（CMV）的外殼蛋白（CP）：如本文所用，術語「黃瓜嵌紋病毒（CMV）的外殼蛋白（CP）」係指自然界中存在的黃瓜嵌紋病毒之外殼蛋白。由於黃瓜嵌紋病毒的宿主範圍極其廣泛，因此已知CMV的許多不同病毒株及分離株。該等病毒株及分離株的外殼蛋白序列已測定且已為熟習此項技術者所知。CMV之該等外殼蛋白（CP）的序列描述於中且可檢索於已知數據庫中，諸如Genbank，www.dpvweb.net，或www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/。CMV之CP的特定實例描述於WO 2016/062720第12頁第8行至第13頁第25行中，其揭示內容以引用的方式明確併入本文中。CMV外殼蛋白的極佳實例及具體實例提供於SEQ ID NO:39中。因此，較佳地，如本文所用，術語「黃瓜嵌紋病毒（CMV）的外殼蛋白」係指CMV外殼蛋白的胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:39，或與SEQ ID NO:39具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、又更佳至少90%、又更佳至少91%、92%、93%或94%、又更佳至少95%、仍更佳至少96%或97%、仍更佳至少98%且仍又更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列。
值得注意的是，此等病毒株及分離株在不同蛋白域（包括外殼蛋白的N端）具有高度相似的外殼蛋白序列。特定而言，完整定序的所有CMV分離株中98.1%在其外殼蛋白序列的前28個胺基酸享有超過85%序列一致性，且完整定序的所有CMV分離株中仍有79.5%在其外殼蛋白序列的前28個胺基酸內享有超過90%序列一致性。
經修飾的CMV多肽：如本文所用，術語「經修飾的CMV多肽」係指包含或較佳由CMV多肽及輔助性T細胞抗原決定基組成的CMV多肽。典型地，經修飾的CMV多肽能夠在表現後藉由自組裝形成CMV類病毒粒子。較佳地，經修飾的CMV多肽為重組修飾的CMV多肽且能夠在大腸桿菌中表現後藉由自組裝形成CMV類病毒粒子。
嵌合CMV多肽：如本文所用，術語「嵌合CMV多肽」係指如本文所定義且根據本發明的多肽，且包含、較佳由CMV多肽組成，其中該CMV多肽如本文所定義及描述經修飾以包含含有、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，且視情況進一步包含輔助性T細胞抗原決定基，該等連續胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，所有組分如本文所定義及描述。典型地且較佳地，嵌合CMV多肽能夠在表現後藉由自組裝形成經修飾的CMV類病毒粒子。因此，在一較佳具體實例中，該嵌合CMV多肽能夠藉由自組裝形成經修飾的CMV類病毒粒子，典型地且較佳地在表現後藉由自組裝形成。較佳地，嵌合CMV多肽為重組修飾的CMV多肽且能夠在大腸桿菌中表現後藉由自組裝形成CMV類病毒粒子。典型地且較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域，該CMV多肽的該被置換N端區域係由5至15個連續胺基酸組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域，且其中該CMV多肽的該被置換N端區域係由5至15個連續胺基酸組成，較佳由9至14個、9至13個或10至13個連續胺基酸組成，更佳由11至13個連續胺基酸組成，且最佳由11、12或13個連續胺基酸組成。
CMV多肽的N端區域：如本文所用，術語「CMV多肽的N端區域」係指該CMV多肽的N端，且特定言之，係指CMV外殼蛋白的N端，或該CMV多肽或CMV之該外殼蛋白的N端區域，但若該CMV多肽或該外殼蛋白包含N端甲硫胺酸殘基，則該該N端區域始於該CMV多肽或CMV之該外殼蛋白之N端的第二個胺基酸。較佳地，在該CMV多肽或該外殼蛋白包含N端甲硫胺酸殘基的情況下，從實用的觀點看，編碼甲硫胺酸的起始密碼子通常將缺失且添加至輔助性T細胞抗原決定基的N端。更佳地，所述甲硫胺酸與Th細胞抗原決定基之間可視情況插入一個、兩個或三個其他胺基酸，較佳插入一個胺基酸，用於選殖目的。
重組多肽：在本發明之上下文中，術語「重組」當在多肽之上下文中使用時，係指藉由包含重組DNA技術之至少一個步驟的方法獲得的多肽。典型地且較佳地，重組多肽係在原核表現系統中產生。對於技術人員顯而易見的是，原核表現系統(諸如大腸桿菌)中表現的重組產生之多肽可包含N端甲硫胺酸殘基。在重組多肽成熟期間，N端甲硫胺酸殘基典型地使重組多肽在表現宿主中分裂。然而，N端甲硫胺酸的分裂可能不完全。因此，重組多肽的製備可包含具有N端甲硫胺酸殘基與不具有N端甲硫胺酸殘基之在其他方面相同之多肽的混合物。典型地且較佳地，重組多肽製劑包含小於10%、更佳小於5%且仍更佳小於1%的具有N端甲硫胺酸殘基之重組多肽。
重組修飾的類病毒粒子：在本發明之上下文中，術語「重組修飾的類病毒粒子」係指藉由包含重組DNA技術之至少一個步驟的方法獲得的經修飾之類病毒粒子（VLP）。
突變胺基酸序列：術語「突變胺基酸序列」係指藉由將一組經定義之突變引入待突變之胺基酸序列中而獲得的胺基酸序列。在本發明之上下文中，待突變的該胺基酸序列典型地且較佳地為CMV外殼蛋白的胺基酸序列。因此，突變胺基酸序列與CMV外殼蛋白的胺基酸序列存在至少一個胺基酸殘基的差異，其中該突變胺基酸序列與待突變的該胺基酸序列顯示至少90%的序列一致性。典型地且較佳地，該突變胺基酸序列與待突變的該胺基酸序列顯示至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。較佳地，該突變胺基酸序列與待突變的該序列存在至多11、10、9、8、7、6、4、3、2或1個胺基酸殘基的差異，其中更佳地，該差異係選自插入、缺失及胺基酸交換。較佳地，突變胺基酸序列與CMV外殼蛋白的胺基酸序列存在至少一個胺基酸的差異，其中較佳地，該差異為胺基酸交換。
術語「對應(corresponding/correspond/corresponds)」當在本文中用於分別描述多肽及胺基酸序列內之胺基酸殘基之特定位置的關係時，係指胺基酸序列內的胺基酸殘基位置對應於另一胺基酸序列中指定的特定胺基酸殘基，此可藉由序列比對加以鑑別，典型地且較佳地藉由使用BLASTP演算法、最佳使用標準設置來鑑別。典型且較佳的標準設置為：期望臨限值：10；字長：3；查詢範圍內的最多匹配：0；矩陣：BLOSUM62；空位成本：存在11，延伸1；組成性調整：有條件的組成性評分矩陣調整。
序列一致性：所指定之兩個胺基酸序列的序列一致性係基於兩個序列的比對來測定。用於測定序列一致性的演算法可供技術人員使用。較佳地，兩個胺基酸序列的序列一致性係使用可公開獲得的電腦同源性程式測定，諸如「BLAST」程式（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）或「CLUSTALW」（http://www.genome.jp/tools/clustalw/），且在此較佳藉由NCBI主頁http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi所提供的「BLAST」程式、使用其中所提供的預設設置來測定。典型且較佳的標準設置為：期望臨限值：10；字長：3；查詢範圍內的最多匹配：0；矩陣：BLOSUM62；空位成本：存在11，延伸1；組成性調整：有條件的組成性評分矩陣調整。
胺基酸交換：術語胺基酸交換係指胺基酸序列中之指定胺基酸殘基與具有不同化學結構之任何其他胺基酸殘基、較佳與另一個蛋白型胺基酸殘基交換。因此，與胺基酸的插入或缺失相比，胺基酸交換不改變該胺基酸序列的胺基酸總數。
如本文所用，縮寫為pI的術語「等電點」係指分子不攜帶淨電荷或經由統計方式呈電中性時的pH。特定而言，術語「等電點」在本文中用於指本發明中所用且由胺基酸構成之抗原不攜帶淨電荷或經由統計方式呈電中性時的pH。在pH低於其pI時，此類抗原攜帶淨正電荷；在pH高於其pI時，其攜帶淨負電荷。典型地且較佳地，當提及pI值時，且特定言之，當提及本發明之抗原及本揭示案內之抗原的pI值時，該等pI值係藉由將特定蛋白質及抗原的一級胺基酸序列分別輸入Gasteiger等人所述的ExPASy Compute pI/MW工具中來測定（Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D., 及Bairoch, A., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, (In) John M. Walker (編): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)）。因此，本文中提及的ExPASy Compute pI/MW工具係指Gasteiger等人所述的工具。該工具計算所指明之Swiss-Prot/TrEMBL條目或使用者輸入之胺基酸序列的理論等電點pI及Mw。蛋白質pI係利用Bjellqvist等人所述的胺基酸pK值計算，其藉由檢查多肽在含有9.2M及9.8M尿素之固定pH梯度凝膠環境中、在pH 4.5至7.3之間、在15℃或25℃下的遷移來界定（Bjellqvist, B.等人, 1993, Electrophoresis 14:1023-1031；Bjellqvist, B.等人, 1994, Electrophoresis 15:529-539）。
抗原決定基：術語抗原決定基係指多肽或抗原的連續或不連續部分，其中該等部分可被抗體或被MHC分子之背景內的T細胞受體特異性結合。就抗體而言，特異性結合排除非特異性結合，但不一定排除交叉反應性。抗原決定基典型地在抗原位點獨有的空間構形中包含5至20個胺基酸。
T輔助(Th)細胞抗原決定基：如本文所用且可互換使用的術語「輔助性T細胞抗原決定基或Th細胞抗原決定基」係指能夠被輔助Th細胞識別的抗原決定基。典型地且較佳地，如本文所用，術語「Th細胞抗原決定基」係指能夠結合至至少一種、較佳超過一種II類MHC分子的Th細胞抗原決定基。測定肽序列是否為Th細胞抗原決定基的最簡單方式係量測該肽結合至個別II類MHC分子的能力。此可根據肽與已知Th細胞抗原決定基肽競爭結合II類MHC分子的能力來量測。HLA-DR分子的代表性選擇描述於例如Alexander J等人, Immunity (1994) 1:751-761中。Th細胞抗原決定基對II類MHC分子的親和力至少應為10
-5M。存在於不同個體中的一組代表性II類MHC分子明示於Panina-Bordignon P等人, Eur J Immunol (1989) 19:2237-2242中。因此，如本文所用，術語「Th細胞抗原決定基」較佳係指在免疫接種及增強免疫後產生可量測之T細胞反應的Th細胞抗原決定基。此外，且又更佳地，如本文所用，術語「Th細胞抗原決定基」較佳係指能夠以至少500 nM的親和力結合至至少一種、較佳至少兩種且甚至更佳至少三種DR對偶基因的Th細胞抗原決定基，該等DR對偶基因選自DR1、DR2w2b、DR3、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DR52a、DRw53、DR2w2a；並且較佳選自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a（如Alexander J等人, Immunity (1994) 1:751-761及其中所引用的參考文獻中所述）；評估該等親和力的較佳結合分析係Sette A等人, J Immunol (1989) 142:35-40所述的結合分析。在甚至又更佳的方式中，如本文所用，術語「Th細胞抗原決定基」係指能夠以至少500 nM的親和力結合至至少一種、較佳至少兩種且甚至更佳至少三種DR對偶基因的Th細胞抗原決定基，該等DR對偶基因選自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a（如Alexander J等人, Immunity (1994) 1:751-761及其中引用的參考文獻中所述）；評估該等親和力的較佳結合分析係Sette A等人, J Immunol (1989) 142:35-40所述的結合分析。Th細胞抗原決定基已有描述且已為熟習此項技術者所知，諸如Alexander J等人, Immunity (1994) 1:751-761；Panina-Bordignon P等人, Eur J Immunol (1989) 19:2237-2242；Calvo-Calle JM等人, J Immunol (1997) 159:1362-1373；及Valmori D等人, J Immunol (1992) 149:717-721。
胺基酸連接子：如本文所用，術語「胺基酸連接子」係指完全由胺基酸殘基組成的連接子。胺基酸連接子的胺基酸殘基係由此項技術中已知的天然存在之胺基酸或非天然胺基酸、所有L型或所有D型或其混合物構成。胺基酸連接子的胺基酸殘基較佳為天然存在之胺基酸、所有L型或所有D型或其混合物。在一較佳具體實例中，該胺基酸連接子係由天然存在之α胺基酸（皆呈其L-組態）組成。
G連接子：如本文所用，術語「G連接子」係指僅由甘胺酸胺基酸殘基組成的胺基酸連接子。根據本發明的G連接子包含至少兩個甘胺酸殘基及至多十個甘胺酸殘基。
GS連接子：如本文所用，術語「GS連接子」係指僅由甘胺酸及絲胺酸胺基酸殘基組成的胺基酸連接子。根據本發明的GS連接子包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸殘基。典型地且較佳地，GS連接子具有至多30個胺基酸的長度。
GS*連接子：如本文所用，術語「GS*連接子」係指胺基酸連接子，其包含至少一個甘胺酸、至少一個絲胺酸及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸殘基。典型地且較佳地，GS*連接子具有至多30個胺基酸的長度。
如本文所用，術語「胺基酸」係指含有官能基胺（-NH
2）及羧酸（-COOH）及其兩性離子且典型地且較佳地，含有各胺基酸所特有之側鏈的有機化合物。術語「胺基酸」典型地且較佳地包括天然存在之胺基酸，諸如蛋白型胺基酸（藉由RNA轉譯產生）、非蛋白型胺基酸（藉由其他代謝機制產生，例如轉譯後修飾）、標準或正規胺基酸（直接由遺傳密碼的密碼子編碼）及非標準或非正規胺基酸（不直接由遺傳密碼編碼）。天然存在之胺基酸包括非真核及真核胺基酸。如本文所用，術語「胺基酸」亦包括化學合成的非天然胺基酸；alpha-（α-）、beta-（β-）、gamma-（γ-）及delta-（δ-）等胺基酸以及任何比率的其混合物；以及若適用，諸如alpha-（α-）胺基酸、胺基酸的任何異構體形式，亦即，其D-立體異構體及L-立體異構體（替代地根據(R)及(S)命名法闡述）以及任何比率（包括1:1的外消旋比率）的其混合物。術語「D-立體異構體」、「L-立體異構體」、「D-胺基酸」或「L-胺基酸」係指胺基酸的手性α碳。在一較佳具體實例中，術語胺基酸係指α胺基酸，較佳係指天然存在之α胺基酸，更佳係指天然存在之呈L-組態的α胺基酸。
相關：如本文所用，術語「相關」或「相關性」係指兩個分子藉以接合在一起的所有可能方式，較佳為化學相互作用。化學相互作用包括共價及非共價相互作用。非共價相互作用之典型實例為離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價相互作用例如基於共價鍵，諸如酯、醚、磷酸酯、碳-磷鍵、碳-硫鍵，諸如硫醚，或醯亞胺鍵。
第一連接位點：如本文所用，片語「第一連接位點」係指天然存在於類病毒粒子或人工添加至類病毒粒子中且可與第二連接位點連接的元件。第一連接位點較佳為蛋白質、多肽、胺基酸、肽、糖、聚核苷酸、天然或合成聚合物、次級代謝物或化合物，諸如生物素、螢光素、視黃醇、地高辛（digoxigenin）、金屬離子、苯基甲基磺醯氟，或化學反應性基團，諸如胺基、羧基、氫硫基（sulfhydryl group）、羥基、胍基、組胺醯基或其組合。作為第一連接位點之化學反應性基團的一較佳具體實例為胺基酸殘基的胺基，較佳為離胺酸殘基之側鏈的胺基。第一連接位點典型地位於表面上，且較佳位於VLP的外表面上。多個第一連接位點存在於表面上，較佳存在於VLP的外表面上，典型地呈重複性組態。在一較佳具體實例中，第一連接位點經由至少一個共價鍵、較佳經由至少一個肽鍵與VLP締合。在另一較佳具體實例中，第一連接位點天然存在於VLP。或者，在一較佳具體實例中，第一連接位點係人工添加至VLP中。在一極佳具體實例中，該第一連接位點係該VLP多肽之胺基酸序列之離胺酸殘基的胺基。
第二連接位點：如本文所用，片語「第二連接位點」係指天然存在於抗原或人工添加至抗原中且可與第一連接位點連接的元件。抗原的第二連接位點較佳為蛋白質、多肽、肽、胺基酸、肽、糖、聚核苷酸、天然或合成聚合物、次級代謝物或化合物，諸如生物素、螢光素、視黃醇、地高辛、金屬離子、苯基甲基磺醯氟，或化學反應性基團，諸如胺基、羧基、氫硫基、羥基、胍基、組胺醯基或其組合。作為第二連接位點之化學反應性基團的一較佳具體實例為氫硫基，較佳為半胱胺酸殘基中的氫硫基。因此，術語「具有至少一個第二連接位點的抗原」係指包含抗原及至少一個第二連接位點的構築體。然而，特別是對於天然不存在於抗原內的第二連接位點而言，此類構築體典型地且較佳地進一步包含「連接子」。在另一較佳具體實例中，第二連接位點經由至少一個共價鍵、較佳經由至少一個肽鍵與抗原締合。在另一具體實例中，第二連接位點天然存在於抗原內。在另一更佳具體實例中，第二連接位點經由連接子人工添加至抗原中，其中該連接子包含半胱胺酸或替代地由半胱胺酸組成。較佳地，連接子與抗原藉由肽鍵融合。
連接：如本文所用，術語「連接（linked/linkage）」係指至少一個第一連接位點與至少一個第二連接位點藉以接合在一起的所有可能方式，較佳為化學相互作用。化學相互作用包括共價及非共價相互作用。非共價相互作用之典型實例為離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價相互作用例如基於共價鍵，諸如酯、醚、磷酸酯、碳-磷鍵、碳-硫鍵，諸如硫醚，或醯亞胺鍵。在某些較佳具體實例中，第一連接位點與第二連接位點係經由至少一個共價鍵、較佳經由至少一個非肽鍵且甚至更佳經由完全的非肽共價鍵連接。然而，如本文所用，術語「連接」不僅應指至少一個第一連接位點與至少一個第二連接位點的直接連接，而且替代地且較佳地係指至少一個第一連接位點與至少一個第二連接位點經由中間分子且在此典型地且較佳地藉由使用至少一個、較佳一個異雙官能交聯劑達成的間接連接。在其他具體實例中，第一連接位點與第二連接位點係經由至少一個共價鍵、較佳經由至少一個肽鍵且甚至更佳經由完全的肽鍵連接。
連接子：如本文所用，「連接子」使第二連接位點與抗原締合或已包含或由第二連接位點組成。較佳地，如本文所用，「連接子」已包含第二連接位點，典型地且較佳地作為一個胺基酸殘基，較佳地作為半胱胺酸殘基。較佳連接子為含有至少一個胺基酸殘基的連接子，或甚至更佳為完全由胺基酸殘基組成的連接子。連接子的胺基酸殘基較佳由此項技術中已知的天然存在之胺基酸或非天然胺基酸、所有L型或所有D型或其混合物構成。根據本發明之連接子的更佳具體實例為包含氫硫基或半胱胺酸殘基的分子且因此，本發明內亦涵蓋此類分子。適用於本發明的其他連接子為包含C1-6烷基-、環烷基（諸如環戊基或環己基）、環烯基、芳基或雜芳基部分的分子。此外，較佳包含C1-C6烷基-、環烷基-（C5、C6）、芳基-或雜芳基-部分及其他胺基酸的連接子亦可用作本發明的連接子且應涵蓋於本發明之範圍內。連接子與抗原較佳藉助於至少一個共價鍵、更佳藉助於至少一個肽鍵締合。
抗原：如本文所用，術語「抗原」係指能夠被抗體或T細胞受體（TCR）結合的分子（若被MHC分子呈遞）。抗原另外能夠被免疫系統識別及/或能夠誘導引起B淋巴球及/或T淋巴球活化之體液免疫反應及/或細胞免疫反應。抗原可具有一或多個抗原決定基（例如B抗原決定基及T抗原決定基）。如本文所用，抗原亦可為若干個別抗原之混合物。
有序及重複性抗原陣列：如本文所用，術語「有序及重複性抗原陣列」係指抗原的一種重複模式，典型地且較佳地，其特徵為抗原的空間排列相對於經修飾的CMV之VLP而言呈高階均一性。在本發明之一個具體實例中，重複模式可為幾何模式。本發明之某些具體實例（諸如與經修飾之CMV之VLP連接的抗原）為適合的有序及重複性抗原陣列之典型及較佳實例，此外，其具有嚴格重複的抗原副晶序，較佳地，間距為1至30奈米、較佳為2至15奈米、甚至更佳為2至10奈米、甚至又更佳為2至8奈米且進一步更佳為1.6至7奈米。
偶合效率：類病毒粒子與特定抗原的偶合效率係藉由對偶合反應進行SDS-PAGE來測定。與偶合反應之組分對應的庫馬斯藍染色譜帶強度係藉由密度測定法測定且用於計算偶合效率。偶合效率定義為(i)與該抗原偶合之VLP多肽之量相對於(ii)VLP多肽之總量的比率。典型地且較佳地，該偶合效率為至少5%、10%、較佳為至少15%、更佳為至少20%、25%或至少30%，且又更佳為至少35%或至少40%。偶合效率亦可用與經修飾之CMV之VLP連接之抗原的總數目表示。偶合效率可依賴於抗原的性質，且與經修飾之CMV之VLP連接之抗原的總數典型地且較佳地為至少5個、至少7個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個及至少50個抗原。
神經生長因子（NGF）：如本文所用且當提及本發明組成物中之抗原時，術語「神經生長因子（NGF）」係指包含、較佳由犬科動物或貓科動物神經生長因子或來自任何其他物種、較佳來自非人類動物之相應異種同源物的胺基酸序列組成的多肽，或者係指與犬科動物或貓科動物神經生長因子或來自任何其他物種、較佳來自非人類動物之相應異種同源物的胺基酸序列具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%且再更佳至少98%序列一致性的多肽。術語「NGF抗原」在此可互換地使用。來自各種動物物種的較佳NGF抗原為犬科動物NGF（cNGF）、貓科動物NGF（fNGF）、馬科動物NGF（eNGF）、牛科動物NGF（bNGF）及豬科動物NGF（pNGF），較佳為犬科動物NGF（cNGF）或貓科動物NGF（fNGF），且該等NGF抗原包含以下者、較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58的多肽，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%且再更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列。NGF抗原典型地且較佳包含生物活性，較佳在細胞增殖分析中包含生物活性。此外，NGF抗原當以本發明組成物形式投予動物時，典型地且較佳地能夠誘導該動物產生抗NGF抗體，其中該等抗NGF抗體較佳能夠在試管內分析中中和NGF生物活性，如本文所述（參見實施例6）。如本文所用及當提及NGF抗原時，術語「生物活性」係指NGF抗原在細胞增殖分析中的活性，其中較佳地，該細胞增殖分析係基於NGF依賴性人類紅白血病TF-1細胞系，其中仍更佳地，該細胞增殖分析係在基本上如本文實施例6中所述的條件下進行。
佐劑：如本文所用，術語「佐劑」係指免疫反應的刺激劑及/或典型地允許在宿主中產生儲槽的物質，其當與本發明之組成物、疫苗或醫藥組成物分別組合時，可達成更強的免疫反應。具有不同作用機制的不同類型之佐劑已有描述且能夠增強抗原特異性抗體反應（Pulendran B等人, 2021, Nature Reviews Drug Discovery 20:454-475）。典型且較佳的佐劑為礦物質鹽（例如氫氧化鋁、磷酸鋁）、微晶酪胺酸、乳液、微粒、皂素（Quil A）、細胞介素、免疫增強劑、微生物組分/產品、脂質體、複合物及黏膜佐劑，其已為人知且描述於例如Adjuvant Compendium NIAID and VAC（nih.gov）或Aguilar等人（Aguilar JC等人, 2007, Vaccine 25:3752-3762）、Gerdts（Gerdts V, 2015, Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 128:456-463)及Pasquale等人（Pasquale等人, 2015, Vaccines 3:320-343）。如本文所用，術語「佐劑」亦可包含佐劑之混合物。類病毒粒子有時描述為佐劑。然而，如本申請案之上下文內所用，術語「佐劑」係指並非本發明之經修飾之類病毒粒子的佐劑。相反，「佐劑」係指本發明組成物、疫苗或醫藥組成物中的另一種不同組分。
免疫刺激物質：如本文所用，術語「免疫刺激物質」係指能夠誘導及/或增強免疫反應的物質。如本文所用，免疫刺激物質包括但不限於鐸樣受體活化物質及誘導細胞介素分泌的物質。鐸樣受體活化物質包括但不限於免疫刺激核酸、肽聚醣、脂多醣、脂磷壁酸（lipoteichonic acid）、咪唑并喹啉化合物、鞭毛蛋白（flagellin）及免疫刺激有機物質，諸如紫杉醇。
免疫刺激核酸（ISS-NA）：如本文所用，術語免疫刺激核酸係指能夠誘導及/或增強免疫反應的核酸。免疫刺激核酸包含核糖核酸及尤其去氧核糖核酸，其中核糖核酸與去氧核糖核酸均可為雙股或單股的。較佳的ISS-NA為去氧核糖核酸，其中更佳地，該去氧核糖核酸為單股的。較佳地，免疫刺激核酸含有至少一個包含未甲基化C的CpG模體。極佳的免疫刺激核酸包含至少一個CpG模體，其中該至少一個CpG模體包含或較佳由至少一個、較佳一個CG二核苷酸組成，其中C未甲基化。較佳但非必要地，該CG二核苷酸為回文序列之一部分。術語免疫刺激核酸亦指含有經修飾之鹼基（較佳為4-溴-胞嘧啶）的核酸。在本發明之上下文中，特別較佳為能夠刺激樹突狀細胞產生IFN-α的ISS-NA。適用於本發明之目的的免疫刺激核酸描述於例如WO2007/068747A1中。
寡核苷酸：如本文所用，術語「寡核苷酸」係指包含兩個或更多個核苷酸、較佳約6至約200個核苷酸且更佳20個至約100個核苷酸且最佳20至40個核苷酸的核酸序列。寡核苷酸為聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸且較佳選自(a)未修飾之RNA或DNA，及(b)經修飾之RNA或DNA。修飾可包含主鏈或核苷酸類似物。寡核苷酸較佳選自由以下者組成之群：(a)單股及雙股DNA；(b)作為單股與雙股區域之混合物的DNA；(c)單股及雙股RNA；(d)單股與雙股區域之混合物的RNA；及(e)包含DNA及RNA的雜交分子，該DNA及RNA為單股的或更佳為雙股的或單股與雙股區域之混合物。較佳的核苷酸修飾/類似物選自由以下者組成之群：(a)肽核酸、(b)肌苷、(c)三苯甲基化鹼基、(d)硫代磷酸酯、(e)烷基硫代磷酸酯、(f) 5-硝基吲哚去氧核糖呋喃酮醯基、(g) 5-甲基去氧胞嘧啶及(h) 5,6-二氫-5,6-二羥基去氧胸苷。硫代磷酸酯化核苷酸經保護以防止在細胞或生物體中降解且因此為較佳的核苷酸修飾。完全由磷酸二酯結合之核苷酸組成的未修飾之寡核苷酸典型地比經修飾之核苷酸具有更大活性且因此在本發明之上下文中通常較佳。最佳為完全由磷酸二酯結合之寡核苷酸組成的寡核苷酸，其中更佳地，該等寡核苷酸為單股的。更佳為能夠刺激細胞、較佳樹突狀細胞產生IFN-α的寡核苷酸。能夠刺激細胞產生IFN-α的極佳寡核苷酸係選自A型CpG及C型CpG。更佳為不具有Cap的RNA分子。
CpG模體：如本文所用，術語「CpG模體」係指核苷酸的一種模式，包括未甲基化的中心CpG，亦即，未甲基化的CpG二核苷酸，其中C未甲基化；該中心CpG被側接於中心CpG（側接於該中心CpG的3'及5'側）的至少一個鹼基（較佳一或兩個核苷酸）包圍。典型地且較佳地，如本文所用，CpG模體包含或替代地由未甲基化CpG二核苷酸及位於其5'及3'端的兩個核苷酸組成。不受理論束縛，側接CpG的鹼基將活性的有效部分賦予CpG寡核苷酸。
含有未甲基化CpG之寡核苷酸：如本文所用，術語「含有未甲基化CpG之寡核苷酸」或「CpG」係指含有至少一個CpG模體的寡核苷酸，較佳係指寡去氧核苷酸。因此，CpG含有至少一個未甲基化胞嘧啶、鳥嘌呤二核苷酸。較佳的CpG刺激/活化（例如產生促有絲分裂功效）或誘導或增加脊椎動物骨髓源細胞對細胞介素的表現。舉例而言，CpG可適用於活化B細胞、NK細胞及抗原呈遞細胞，諸如樹突狀細胞、單核球及巨噬細胞。較佳地，CpG係指含有未甲基化胞嘧啶及其3'後之鳥苷的寡去氧核苷酸，較佳係指單股寡去氧核苷酸，其中該未甲基化胞嘧啶與該鳥苷藉由磷酸酯鍵連接，其中較佳地，該磷酸酯鍵為磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵，且其中更佳地，該磷酸酯鍵為磷酸二酯鍵。CpG可包括核苷酸類似物，諸如含有硫代磷酸酯鍵的類似物，且可為雙股或單股的。一般而言，雙股分子在活體內更穩定，而單股分子具有增強的免疫活性。較佳地，如本文所用，CpG為長度至少約十個核苷酸且包含至少一個CpG模體的寡核苷酸，其中更佳地，該CpG的長度為10至60個、更佳15至50個、仍更佳20至40個、仍更佳約30個且最佳恰好30個核苷酸。CpG可由甲基化核苷酸及/或未甲基化核苷酸組成，其中該至少一個CpG模體包含至少一個CG二核苷酸，其中C未甲基化。CpG亦可包含甲基化及未甲基化序列段，其中該至少一個CpG模體包含至少一個CG二核苷酸，其中C未甲基化。極佳地，CpG係指單股寡去氧核苷酸，其含有未甲基化胞嘧啶及其3'後的鳥苷，其中該未甲基化胞嘧啶與該鳥苷藉由磷酸二酯鍵連接。CpG可包括核苷酸類似物，諸如含有硫代磷酸酯鍵的類似物，且可為雙股或單股的。一般而言，磷酸二酯CpG為如下文所示的A型CpG，而硫代磷酸酯穩定化CpG為B型CpG。在本發明之上下文中，較佳的CpG寡核苷酸為A型CpG。
A型CpG：如本文所用，術語「A型CpG」或「D型CpG」係指包含至少一個CpG模體的寡去氧核苷酸（ODN）。A型CpG優先刺激T細胞的活化及樹突狀細胞的成熟且能夠刺激IFN-α產生。在A型CpG中，至少一個CpG模體的核苷酸係藉由至少一個磷酸二酯鍵連接。A型CpG包含至少一個經磷酸二酯鍵結的CpG模體，該CpG模體可藉由硫代磷酸酯鍵結的核苷酸側接於其5'端及/或較佳側接於其3'端。較佳地，CpG模體，及在此較佳地，包含至少一個、較佳兩個核苷酸的CG二核苷酸及其緊鄰側接區域，係由磷酸二酯核苷酸構成。較佳的A型CpG完全由磷酸二酯（PO）鍵結的核苷酸組成。典型地且較佳地，聚G模體包含或替代地由至少一個鳥苷（G's）組成，較佳為至少三個、至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個G's，最佳為至少10個G's。較佳地，本發明之A型CpG包含或替代地由回文序列組成。
封裝：如本文所用，術語「封裝」係指聚陰離子巨分子或免疫刺激物質分別相對於核心粒子及VLP而言的狀態。如本文所用，術語「封裝」包括共價結合，例如化學偶合；或非共價結合，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。該術語亦包括聚陰離子巨分子的圍封或部分圍封。因此，聚陰離子巨分子或免疫刺激物質可在實際結合不存在的情況下、尤其是共價結合不存在的情況下被VLP圍封。在較佳具體實例中，VLP內部封裝至少一種聚陰離子巨分子或免疫刺激物質，最佳以非共價方式。在該等免疫刺激物質為核酸（較佳為DNA）的情況下，術語封裝意指該核酸係核酸酶水解不可及的，較佳係去氧核糖核酸酶水解（例如去氧核糖核酸酶I或全能核酸酶）不可及的，其中較佳地，該可及性係如WO2003/024481A2之實施例11-17中所述加以分析。
有效量：如本文所用，術語「有效量」係指實現所需生物功效所必需的量或足以實現所需生物功效的量。組成物（或替代地，醫藥組成物）的有效量為達成此選擇結果的量，且此類量可由熟習此項技術者按常規測定。有效量可依據所投予的特定組成物及個體的體型而變化。一般技術者憑經驗而無需過度實驗便可確定本發明之特定組成物的有效量。較佳地，術語「有效量」係指一種量，其(i)治療或預防本文所述之特定疾病或病症；(ii)減輕、改善或消除本文所述之特定疾病或病症的一或多種症狀；或(iii)預防或延遲本文所述之特定疾病或病症之一或多種症狀的發作。
動物：如本文所用且作為需要投予包含經修飾之CMV之VLP之本發明組成物的個體，術語「動物」係指非人類動物，包括脊椎動物、哺乳動物、嚙齒動物（例如天竺鼠、倉鼠）、犬科動物（例如犬）、貓科動物（例如貓）、豬科動物（例如豬）、馬科動物（例如馬）或靈長類動物。較佳地，個體為非人類哺乳動物（諸如犬、貓、馬、綿羊、牛或豬）。在一較佳具體實例中，該個體為選自犬、貓、馬、綿羊、牛或豬的非人類哺乳動物。
獸醫組成物：如本文所用，術語「獸醫組成物」係指適用於非人類動物的組成物。
治療：如本文所用，術語「治療（treatment/treat/treated/treating）」係指防治及/或治療。在一個具體實例中，術語「治療（treatment/treat/treated/treating）」係指治療性治療。在另一具體實例中，術語「治療（treatment/treat/treated/treating）」係指防治性治療。較佳地，該治療的有益或所需臨床結果包括但不限於症狀緩解、疾病或病症程度減輕、疾病或病症狀態穩定（亦即，不惡化）、疾病或病症進展延遲或減緩、疾病或病症狀態改善或緩和。
在第一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及
(ii) 包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基，
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其包含至少一個第一連接位點；
(b) 至少一種神經生長因子（NGF）抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點；
其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，且其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及
(ii) 包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基；且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
在一較佳具體實例中，該嵌合CMV多肽進一步包含輔助性T細胞抗原決定基，其中較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域，且其中更佳地，該CMV多肽的該N端區域對應於SEQ ID NO:39的胺基酸2-12，且其中再更佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，其中極佳地，該Th細胞抗原決定基包含、再更佳地由胺基酸序列SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42組成。在另一極佳具體實例中，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%且再更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及
(ii) 包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基，及
(iii) 輔助性T細胞抗原決定基，其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域；以及
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含、較佳由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2組成。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；及
(ii) 包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電的胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基，且其中該段連續的帶負電胺基酸包含、較佳由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2組成；
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；
(ii) 包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電的胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽之任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基，且其中該段連續的帶負電胺基酸包含、較佳由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2組成；及
(iii) 輔助性T細胞抗原決定基，其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域；以及
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自由以下者組成之群：(a.)聚甘胺酸連接子（G連接子），其具有長度為n=2-10的胺基酸序列(Gly)
n；(b.)甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及(c.)胺基酸連接子（GS*連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），其中該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*連接子）。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:8組成。在另一極佳具體實例中，該第二胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9組成。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成。在另一極佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置84及位置85的胺基酸殘基。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；及
(ii) 包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電的胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基，且其中該多肽包含、較佳由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成，並且其中較佳地，該多肽係插入該CMV多肽的胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置84及位置85的胺基酸殘基；以及
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；
(ii) 包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電的胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基，且其中該多肽包含、較佳由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成，並且其中較佳地，該多肽係插入該CMV多肽的胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置84及位置85的胺基酸殘基；
(iii) 輔助性T細胞抗原決定基，其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域；以及
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
在另一極佳具體實例中，該CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；
(ii) 包含一段連續的帶負電胺基酸的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基；並且
其中該CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48組成，且其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間；以及
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：
(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；
(ii) 包含一段連續的帶負電胺基酸的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基；
(iii) 輔助性T細胞抗原決定基，其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域；並且
其中該CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48組成，且其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間；以及
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。
本文所述及所揭示的具體實例、較佳具體實例及極佳具體實例應適用於所有態樣及其他具體實例、較佳具體實例及/或極佳具體實例，不論是否再次具體提及或不論是否為了簡潔而避免其重複。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含、較佳由CMV外殼蛋白的胺基酸序列或突變胺基酸序列組成，其中該突變胺基酸序列與該CMV外殼蛋白顯示至少90%、較佳至少91%、92%、93、94%或95%、更佳至少96%、97%或98%且再次更佳至少99%的序列一致性；其中較佳地，該突變胺基酸序列與待突變的該胺基酸序列差異在於至少一個且至多11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個胺基酸殘基，且其中更佳地，此等差異係選自(i)插入、(ii)缺失、(iii)胺基酸交換，及(iv) (i)至(iii)之任何組合。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少85%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少92%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少93%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少96%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少97%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少98%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少80%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少85%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少92%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少93%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少96%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少97%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少98%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%、較佳85%序列一致性的胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列。在一較佳具體實例中，該CMV多肽為具有SEQ ID NO:39的CMV外殼蛋白。在一較佳具體實例中，該CMV外殼蛋白包含SEQ ID NO:39。在一較佳具體實例中，該CMV外殼蛋白由SEQ ID NO:39組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白。在一較佳具體實例中，該CMV多肽由CMV外殼蛋白組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白，其中該CMV外殼蛋白包含SEQ ID NO:39。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白，其中該CMV外殼蛋白由SEQ ID NO:39組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽由CMV外殼蛋白組成，其中該CMV外殼蛋白由SEQ ID NO:39組成。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少75%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少80%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少85%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少90%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少95%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少98%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少99%序列一致性。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含或較佳由以下者組成：(i) CMV外殼蛋白的胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含或較佳由SEQ ID NO:39組成；或(ii)與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；且其中如(i)或(ii)中所定義的該胺基酸序列包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少90%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含或較佳由以下者組成：(i) CMV外殼蛋白的胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含或較佳由SEQ ID NO:39組成；或(ii)與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；且其中如(i)或(ii)中所定義的該胺基酸序列包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區域，其中該胺基酸序列區域與SEQ ID NO:40具有至少95%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含或較佳由以下者組成：(i) CMV外殼蛋白的胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含或較佳由SEQ ID NO:39組成；或(ii)與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；且其中如(i)或(ii)中所定義的該胺基酸序列包含SEQ ID NO:40。
在一較佳具體實例中，該N端區域的胺基酸置換數目等於或低於由該輔助性T細胞抗原決定基組成之胺基酸的數目。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該N端置換區域係由5至15個連續胺基酸組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該N端置換區域係由9至14個連續胺基酸組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該N端置換區域係由11至13個連續胺基酸組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該N端區域對應於SEQ ID NO:39的胺基酸2至12。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該N端區域包含SEQ ID NO:39的胺基酸2至12。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該N端區域係由SEQ ID NO:39的胺基酸2至12組成。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基由至多20個胺基酸組成。
在本發明之一較佳具體實例中，Th細胞抗原決定基選自TT 830-843（SEQ ID NO:41）、PADRE（SEQ ID NO:42）、HA 307-319（SEQ ID NO:43）、HBVnc 50-69（SEQ ID NO:44）、CS 378-398（SEQ ID NO:45）、MT 17-31（SEQ ID NO:46）及TT 947-967（SEQ ID NO:47）。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素的Th細胞抗原決定基或為PADRE序列。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基來源於人類疫苗。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素的Th細胞抗原決定基。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基為PADRE序列。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基包含胺基酸序列SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42。在一極佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基由胺基酸序列SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42組成。在一極佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基包含胺基酸序列SEQ ID NO:41。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基由胺基酸序列SEQ ID NO:41組成。在一極佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基包含胺基酸序列SEQ ID NO:42。在一極佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基由胺基酸序列SEQ ID NO:42組成。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含或較佳由CMV外殼蛋白的胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列包含或較佳由SEQ ID NO:39或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列組成；且其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO:40，且其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域，且其中該CMV多肽的該N端置換區域由11至13個連續胺基酸組成，較佳由11個連續胺基酸組成，且其中更佳地，該CMV多肽的該N端區域對應於SEQ ID NO:39的胺基酸2至12。在一較佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:5組成，其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:48，其中該該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基。
在一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至10個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至9個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至8個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至9個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至8個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4、5、6、7或8個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4或8個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有5個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有6個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有7個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有8個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有9個胺基酸的長度。
在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該天冬胺酸或該麩胺酸在各場合中獨立地選自其L-組態或其D-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態或D-組態的天冬胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態的天冬胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈D-組態的天冬胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態或D-組態的麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態的麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈D-組態的麩胺酸。
在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態的天冬胺酸及至少一個呈L-組態的麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由皆呈L-組態的天冬胺酸及麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由皆呈L-組態的天冬胺酸或麩胺酸組成。
在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個天冬胺酸或至少一個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少兩個天冬胺酸或至少兩個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少三個天冬胺酸或至少三個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個天冬胺酸或至少四個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個天冬胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少五個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少六個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少七個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少八個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸僅由天冬胺酸組成。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。
在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個天冬胺酸或至少一個麩胺酸，其中該至少一個天冬胺酸或該至少一個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少兩個天冬胺酸或至少兩個麩胺酸，其中至少兩個天冬胺酸或至少兩個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少三個天冬胺酸或至少三個麩胺酸，其中該至少三個天冬胺酸或該至少三個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個天冬胺酸或至少四個麩胺酸，其中該至少四個天冬胺酸或該至少四個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個天冬胺酸，其中該至少四個天冬胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個麩胺酸，其中該至少四個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少五個麩胺酸，其中該至少五個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少六個麩胺酸，其中該至少六個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少七個麩胺酸，其中該至少七個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少八個麩胺酸，其中該至少八個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸僅由天冬胺酸組成，其中該天冬胺酸呈L-組態。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。
在一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至10個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至9個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至9個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4、5、6、7或8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4、5、6、7或8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4或8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有5個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有6個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有7個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有9個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。
在一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至10個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至9個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3至8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至9個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4、5、6、7或8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4、5、6、7或8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4或8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有3個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有5個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有6個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有7個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有8個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有9個胺基酸的長度，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。
在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2組成。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由SEQ ID NO:1組成。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:2。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由SEQ ID NO:2組成。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端或C端。在一較佳具體實例中，該多肽進一步包含第一胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第二胺基酸連接子。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端。
在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多30個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多20、19、18、17或16個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多15個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多14個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多13個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多12個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多11個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多10個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多9個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多8個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多7個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多6個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多5個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多4個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多3個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有至多2個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子由一個胺基酸組成。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多30個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多20、19、18、17或16個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多15個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多14個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多13個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多12個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多11個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多10個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多9個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多8個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多7個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多6個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多5個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多4個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多3個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子具有至多2個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子由一個胺基酸組成。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端或C端，且其中該第一胺基酸連接子選自由以下者組成之群：(a.)長度為n=2-10的聚甘胺酸連接子(Gly)
n；(b.)甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及(c.)胺基酸連接子（GS*連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第二胺基酸連接子，其中該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端或C端，且其中該第二胺基酸連接子選自由以下者組成之群：(a.)長度為n=2-10的聚甘胺酸連接子(Gly)
n；(b.)甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及(c.)胺基酸連接子（GS*連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一及該第二胺基酸連接子獨立地選自由以下者組成之群：(a.)聚甘胺酸連接子（G連接子），其具有長度為n=2-10的胺基酸序列(Gly)
n；(b.)甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及(c.)胺基酸連接子（GS*連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一及該第二胺基酸連接子獨立地選自包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），其中該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*連接子）。
在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為長度n=2-10的聚甘胺酸連接子(Gly)
n。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子）。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），且其中該第一胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser。在另一較佳具體實例中，該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1。在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=3或4，t=1、2或3，且u=0或1。在另一較佳具體實例中，該GS連接子具有至多15、14、13、12、11個、較佳10、9、8、7個胺基酸的長度，且更佳至多6個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），且該GS連接子具有胺基酸序列SEQ ID NO:8。在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有胺基酸序列SEQ ID NO:8。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為胺基酸連接子（GS*連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。
在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為長度n=2-10的聚甘胺酸連接子(Gly)
n。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為由至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸組成的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子）。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），且其中該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser。在另一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=3或4，t=1、2或3，u=0或1。在另一較佳具體實例中，該GS連接子具有至多15、14、13、12、11個、較佳10、9、8、7個胺基酸的長度，且更佳至多6個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），且該GS連接子具有胺基酸序列SEQ ID NO:9。
在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為胺基酸連接子（GS*連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少Cys的胺基酸連接子（GS*連接子）。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少Cys的胺基酸連接子（GS*連接子），且該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser。在另一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子（GS*連接子）具有至多15、14、13、12、11個、較佳10、9個胺基酸的長度，且更佳至多7或6個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為胺基酸連接子（GS*連接子），且該GS*連接子具有胺基酸序列SEQ ID NO:4。
在一較佳具體實例中，該第一及該第二胺基酸連接子獨立地為長度n=2-10的聚甘胺酸連接子(Gly)
n。在一較佳具體實例中，該第一及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子）。在一較佳具體實例中，該第一及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*連接子），且其中該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser。在另一較佳具體實例中，該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1。在另一較佳具體實例中，該第一及該第二胺基酸連接子獨立地為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），該GS連接子具有(GS)
r(G
sS)
t(GS)
u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=2、3或4，t=1、2或3，u=0或1。
在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子及/或該第二胺基酸連接子包含、較佳由選自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9的胺基酸序列組成。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:8組成。在另一極佳具體實例中，該第二胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9組成。在另一極佳具體實例中，該第二胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:4組成。在另一極佳具體實例中，該第二胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:9組成。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:8組成該第二胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9組成。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:8組成且該第二胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:4組成。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:8組成且該第二胺基酸連接子包含、較佳由SEQ ID NO:9組成。
在一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽具有至多30個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多25、24、23、22或21個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多20個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多19個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多18個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多17個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多16個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多15個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多14個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多13個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多12個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多11個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多10個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多9個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多8個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多7個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多6個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多5個胺基酸的長度。在一較佳具體實例中，該多肽具有至多4個胺基酸的長度。在另一極佳具體實例中，該多肽由該段連續的帶負電胺基酸組成。
在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:49。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:50。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:49組成。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:50組成。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:51組成。
在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75及位置76的胺基酸殘基。在另一極佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置76及位置77的胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置77及位置78的胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置78及位置79的胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置79及位置80的胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置80及位置81的胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:82之位置75及位置81的胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置82及位置83的胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置83及位置84的胺基酸殘基。在另一極佳具體實例中，包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的該多肽係插入該CMV多肽之胺基酸殘基之間，該等胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置84及位置85的胺基酸殘基。
在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88（Ser）與位置89（Thr）的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84（Ser）與位置85（Thr）的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86（Ser）與位置87（Thr）的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:39，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:48，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:5組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:39組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:48組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88（Ser）與位置89（Thr）的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84（Ser）與位置85（Thr）的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86（Ser）與位置87（Thr）的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:39，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:48，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:5組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:39組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:48組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5且包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入SEQ ID NO:5之胺基酸殘基88（Ser）與胺基酸殘基89（Thr）之間，且包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一及第二胺基酸連接子，其中該第一及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子）或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*連接子），其中該第一及/或該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser序列。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5且包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入SEQ ID NO:5之胺基酸殘基88（Ser）與胺基酸殘基89（Thr）之間，且包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一及第二胺基酸連接子，其中該第一及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子）或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*連接子），其中該第一及/或該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser序列。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:10。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:11。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:12。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:11組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:12組成。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾之CMV之VLP，其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成；
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個非肽共價鍵連接。在具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:10。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:11。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:12。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:11組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:12組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP包含180個相同嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP包含180個相同嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP包含180個相同嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:11組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP包含180個相同嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:12組成。
本發明之經修飾的CMV之VLP可表現於原核或真核表現系統中。較佳系統為大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞以及哺乳動物細胞系。極佳地，該經修飾之CMV之VLP係藉由將該嵌合CMV多肽表現於大腸桿菌中而獲得，且其中較佳地，該表現係在10℃至25℃之間的溫度下、較佳在20℃的溫度下實現。如上文所指明，重組產生的多肽可包含N端甲硫胺酸殘基。在一個具體實例中，該嵌合CMV多肽因此包含N端甲硫胺酸殘基。然而，典型地且較佳地，該嵌合CMV多肽在該N端甲硫胺酸殘基處分裂。
在另一較佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP進一步包含至少一種免疫刺激物質。在一極佳具體實例中，該免疫刺激物質被封裝至本發明之經修飾之VLP中。在另一較佳具體實例中，將免疫刺激物質與本發明之經修飾之VLP混合。適用於本發明之免疫刺激性物質在此項技術中通常已知且尤其揭示於WO2003/024481中。
在本發明之另一具體實例中，該免疫刺激物質由非真核來源的DNA或RNA組成。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激物質選自由以下者組成之群：(a)免疫刺激核酸；(b)肽聚醣；(c)脂多醣；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑并喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；以及(h) (a)至(g)中之至少一種物質的任何混合物。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激物質為免疫刺激核酸，其中該免疫刺激核酸選自由以下者組成之群：(a)核糖核酸；(b)去氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；以及(d) (a)、(b)及/或(c)之任何混合物。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激核酸為核糖核酸，且其中該核糖核酸為細菌源RNA。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激核酸為聚(IC）或其衍生物。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激核酸為去氧核糖核酸，其中該去氧核糖核酸為含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
在一極佳具體實例中，該免疫刺激物質為含有未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一較佳具體實例中，該含有未甲基化CpG之寡核苷酸為A型CpG。在另一較佳具體實例中，該A型CpG包含回文序列。在另一較佳具體實例中，該回文序列在其5'端及3'端側接鳥苷實體。在另一較佳具體實例中，該回文序列在其5'端側接至少3個且至多15個鳥苷實體，且其中該回文序列在其3'端側接至少3個且至多15個鳥苷實體。
在另一較佳具體實例中，該免疫刺激物質為含有未甲基化CpG之寡核苷酸，且其中較佳地，該含有未甲基化CpG之寡核苷酸包含回文序列，且其中更佳地，該含有未甲基化CpG之寡核苷酸的CpG模體為回文序列的一部分，且其中再次更佳地，該回文序列為SEQ ID NO:52。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激核酸為由SEQ ID NO:53組成的含有未甲基化CpG之寡核苷酸，其中該含有未甲基化CpG之寡核苷酸完全由磷酸二酯結合的核苷酸組成。
在另一態樣中，本發明提供一種組成物，其包含(a)本文中所定義的經修飾之CMV之VLP，其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一個第一連接位點；以及(b)至少一種NGF抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點；其中(a)與(b)經由該至少一個第一及該至少一個第二連接位點連接，典型地且較佳地經由至少一個共價非肽鍵連接。經由該第一及該第二連接位點將該經修飾之VLP與該等抗原連接的方法描述於例如WO2002/056905、WO2004/084940及WO2016/062720中。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，其包含(a)經修飾之CMV之VLP，其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一個第一連接位點；以及(b)至少一種NGF抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點；其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點連接，典型地且較佳地經由至少一個共價非肽鍵連接，且其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及(ii)包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基。
在一極佳具體實例中，該至少一個第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，所有該等第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該至少一個第一連接位點不構成或不是該段連續的帶負電胺基酸的一部分。在一極佳具體實例中，所有該等第一連接位點不構成或不是該段連續的帶負電胺基酸的一部分。在一極佳具體實例中，該第一連接位點與該第二連接位點僅經由一或多個共價鍵連接。在一極佳具體實例中，該至少一種抗原與該經修飾之CMV之VLP僅經由一或多個共價鍵連接。在一極佳具體實例中，所有該等抗原與該經修飾之CMV之VLP僅經由一或多個共價鍵連接。
在另一較佳具體實例中，該第一連接位點與該第二連接位點經由至少一個共價非肽鍵連接。在另一較佳具體實例中，所有該等第一連接位點與該等第二連接位點經由至少一個共價非肽鍵連接。在另一極佳具體實例中，該第一連接位點為胺基，較佳為離胺酸之胺基。在另一極佳具體實例中，所有該等第一連接位點為胺基，較佳為離胺酸之胺基。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾之CMV之VLP，其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成；
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且
其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個共價非肽鍵連接；且其中該至少一個第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分；且其中較佳地，該第一連接位點為胺基，在此較佳為離胺酸的胺基，且其中更佳地，該第二連接位點為氫硫基，較佳為半胱胺酸殘基的氫硫基或已化學連接至NGF抗原的氫硫基。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:10。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:11。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:12。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:11組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:12組成。
經修飾之類病毒粒子與抗原之間藉由二硫鍵達成的連接典型地不穩定，尤其是含有氫硫基部分的分子，且另外，在血清中的穩定性低於例如硫醚連接（Martin FJ.及Papahadjopoulos D. (1982) J. Biol. Chem. 257: 286-288）。因此，在本發明之另一極佳具體實例中，經修飾之CMV之VLP與至少一種抗原的締合或連接不包含雙硫鍵。在此，更佳地，至少一個第二連接位點包含或較佳為氫硫基。較佳地，所有該等第二連接位點包含或較佳為氫硫基。在另一較佳具體實例中，該至少一個第一連接位點不是或不包含氫硫基。在另一較佳具體實例中，所有該等第一連接位點不是或不包含氫硫基。在一較佳具體實例中，該至少一個第一連接位點不是或不包含半胱胺酸的氫硫基。在一較佳具體實例中，所有該等第一連接位點不是或不包含半胱胺酸的氫硫基。在另一極佳具體實例中，該第二連接位點為氫硫基，較佳為半胱胺酸的氫硫基。在另一極佳具體實例中，所有該等第二連接位點為氫硫基，較佳為半胱胺酸的氫硫基。
在一極佳具體實例中，至少一個第一連接位點為胺基，較佳為離胺酸殘基的胺基，且至少一個第二連接位點為氫硫基，較佳為半胱胺酸殘基的氫硫基或已化學連接至抗原的氫硫基。在一極佳具體實例中，所有該等第一連接位點為胺基，較佳為離胺酸殘基的胺基，且第二連接位點為氫硫基，較佳為半胱胺酸殘基的氫硫基或已化學連接至抗原的氫硫基。在另一較佳具體實例中，該等第二連接位點中僅有一個位點與該第一連接位點經由至少一個非肽共價鍵締合，從而使該抗原與該經修飾之CMV之VLP的結合達成單一且均勻的類型，其中與該第一連接位點締合的該唯一第二連接位點為氫硫基，且其中該抗原與該經修飾之CMV之VLP經由該締合發生相互作用以形成有序且重複的抗原陣列。
在本發明之一個較佳具體實例中，抗原與經修飾之CMV之VLP藉由化學交聯達成連接，典型地且較佳地使用異雙官能交聯劑連接。因此，在一較佳具體實例中，NGF抗原與經修飾之CMV之VLP經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個共價非肽鍵、藉由化學交聯連接，典型地且較佳地藉由異雙官能交聯劑連接。在較佳具體實例中，異雙官能交聯劑含有可與經修飾之CMV之VLP之較佳第一連接位點反應（較佳與胺基、更佳與離胺酸殘基的胺基反應）的官能基，以及可與較佳第二連接位點（亦即，氫硫基，較佳為抗原固有的半胱胺酸殘基之氫硫基，或人工添加至抗原中的氫硫基）反應且視情況亦可供還原反應用的另一種官能基。若干異雙官能交聯劑在此項技術中已知。此等交聯劑包括較佳交聯劑丁二醯亞胺基-6-(b-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺)己酸酯（SMPH）（Pierce）、磺酸基-MBS、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMPB、磺酸基-SMCC、磺酸基-KMUS SVSB、SIA，及可獲自例如Pierce化學公司且具有一個對胺基具有反應性之官能基及一個對氫硫基具有反應性之官能基的其他交聯劑。與胺基反應且與氫硫基達成硫醚鍵聯之後，上述交聯劑皆引起醯胺鍵形成。在一極佳具體實例中，該異雙官能交聯劑為SMPH。因此，在一較佳具體實例中，NGF抗原與經修飾之CMV之VLP藉由化學交聯連接，典型地且較佳地藉由異雙官能交聯劑、經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個共價非肽鍵連接，且其中該異雙官能交聯劑為SMPH。適於實施本發明之另一類交聯劑的特徵為偶合後，抗原與經修飾之VLP之間引入二硫鍵。屬於此類別的較佳交聯劑包括例如SPDP及磺酸基-LC-SPDP（Pierce）。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾之CMV之VLP，其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成；
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；及
其中(a)與(b)藉由異雙官能交聯劑、經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個共價非肽鍵連接，其中該異雙官能交聯劑為SMPH，且其中該至少一個第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分，且其中該至少一個第一連接位點為胺基，在此較佳為離胺酸的胺基，且其中該至少一個第二連接位點為氫硫基，在此較佳為半胱胺酸殘基的氫硫基或已化學連接至NGF抗原的氫硫基。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:10。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:11。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:12。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:11組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:12組成。
使用異雙官能交聯劑使抗原與經修飾之CMV之VLP連接允許抗原與經修飾之CMV之VLP以定向方式連接。使抗原與經修飾之CMV之VLP連接的其他方法包括使用碳化二亞胺EDC及NHS使抗原與經修飾之CMV之VLP交聯的方法。抗原亦可首先經由與SATA、SATP或亞胺基硫雜環戊烷的反應而發生硫醇化。抗原在必要時脫除保護基之後，接著可與經修飾之CMV之VLP如下偶合。分離過量的硫醇化試劑之後，使抗原與經修飾之CMV之VLP反應，該經修飾之CMV之VLP預先經包含半胱胺酸反應性部分的異雙官能交聯劑活化且且因此呈現至少一個或若干個對半胱胺酸殘基具有反應性的官能基，該等官能基可與硫醇化抗原發生反應，諸如上文所述。反應混合物中視情況包括少量的還原劑。在其他方法中，使用同雙官能交聯劑，諸如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3（Pierce）或其中官能基對經修飾之VLP之胺基或羧基具有反應性的其他已知同雙官能交聯劑，將抗原連接至經修飾之CMV之VLP。
在本發明之極佳具體實例中，抗原經由已添加至抗原之N端或C端的半胱胺酸殘基或抗原內的天然半胱胺酸殘基連接至經修飾之CMV之VLP的離胺酸殘基。在一較佳具體實例中，本發明之組成物進一步包含連接子，其中該連接子使該抗原與該第二連接位點締合，且其中較佳地，該連接子包含或替代地由該第二連接位點組成。
在抗原上工程設置第二連接位點係藉由連接子的締合來達成，根據本發明之揭示內容，該連接子典型地且較佳地含有至少一個適用作第二連接位點的胺基酸。因此，在本發明之一較佳具體實例中，連接子與抗原藉由至少一個共價鍵締合，較佳藉由至少一個、較佳一個肽鍵締合。較佳地，連接子包含或由第二連接位點組成。在另一較佳具體實例中，連接子包含氫硫基，較佳為半胱胺酸殘基的氫硫基。在另一較佳具體實例中，連接子包含或為半胱胺酸殘基。在本發明的另一較佳具體實例中，連接子由胺基酸組成，其中更佳地，連接子由至多15個胺基酸組成。在本發明之再一較佳具體實例中，此類胺基酸連接子含有1至10個胺基酸。
在又另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾之CMV之VLP，其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成；
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；及
其中(a)與(b)藉由異雙官能交聯劑、經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個共價非肽鍵連接，其中該異雙官能交聯劑為SMPH，且其中該至少一個第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分，且其中該至少一個第一連接位點為胺基，在此較佳為離胺酸的胺基，且其中該至少一個第二連接位點為氫硫基，在此較佳為已化學連接至NGF抗原的氫硫基。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP包含180個相同嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP包含180個相同嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。
在另一較佳具體實例中，該抗原為神經生長因子（NGF），其選自人類NGF、犬科動物NGF（cNGF）、貓科動物NGF（fNGF）、馬科動物NGF（eNGF）、牛科動物NGF（bNGF）及豬科動物NGF（pNGF），較佳選自犬科動物NGF（cNGF）或貓科動物NGF（fNGF），且其中更佳地，該抗原為犬科動物NGF（cNGF）。在一較佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：選自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%、再更佳至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含4、6、8或10個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含4個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含4個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含由SEQ ID NO:34組成之6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含由SEQ ID NO:34組成之6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含8個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含8個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含10個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。
在一替代性實施例中，該抗原為人類NGF。在另一具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:54或與SEQ ID NO:54具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:54。在另一具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:54組成。
在另一極佳具體實例中，該抗原為犬科動物NGF。在一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或與SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SED ID NO:33具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33組成。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:31或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:31。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:31組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:33或與SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:33。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:33組成。
在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含由SEQ ID NO:34組成之至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基、較佳4、6、8或10個連續組胺酸殘基、更佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳地位於NGF抗原的C端。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含由SEQ ID NO:34組成之4、6、8或10個連續組胺酸殘基、較佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含由SEQ ID NO:34組成之6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由組成：SEQ ID NO:30或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含由SEQ ID NO:34組成、位於NGF抗原N端之6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基、較佳4、6、8或10個連續組胺酸殘基、更佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且較佳位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且位於NGF抗原的N端。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30組成。
在另一極佳具體實例中，該抗原為貓科動物NGF。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:55或與SEQ ID NO:55具有至少90%或至少91%、較佳92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性且再更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:55。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:55組成。
在另一較佳具體實例中，該抗原為馬科動物NGF。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:56或與SEQ ID NO:56具有至少90%或至少91%、較佳92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性且再更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:56。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:56組成。
在另一較佳具體實例中，該抗原為牛科動物NGF。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:57或與SEQ ID NO:57具有至少90%或至少91%、較佳92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性且再更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:57。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:57組成。
在另一極佳具體實例中，該抗原為豬科動物NGF。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:58或與SEQ ID NO:58具有至少90%或至少91%、較佳92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性且再更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:58。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:58組成。
在不受約束的情況下，吾等咸信對具有較高等電點的抗原而言且從而對處於用於結合之條件下將整體帶有正電荷的抗原而言，尤其可減少及避免所結合之CMV之VLP發生非所需的聚集及形成聚集體。因此，在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有高於6.5的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有高於6.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有高於6.5的等電點，如藉由Gasteiger等人所述的ExPASy Compute pI/MW工具所測定（Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D.及Bairoch, A., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, (存在於) John M. Walker (編): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)）。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有高於6.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由Gasteiger等人所述的ExPASy Compute pI/MW工具所測定（Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D.及Bairoch, A., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, (存在於) John M. Walker (編): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)）。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有高於6.6、6.7、6.8或6.9的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有高於6.6、6.7、6.8或6.9且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有高於6.6、6.7、6.8或6.9的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有高於6.6、6.7、6.8或6.9且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.0且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.0且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.1、7.2、7.3或7.4的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.1、7.2、7.3或7.4且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.1、7.2、7.3或7.4的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.1、7.2、7.3或7.4且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.5的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.5的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.6、7.7、7.8或7.9的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.6、7.7、7.8或7.9且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.6、7.7、7.8或7.9的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於7.6、7.7、7.8或7.9且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.0且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.0且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.1、8.2、8.3或8.4的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.1、8.2、8.3或8.4且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.1、8.2、8.3或8.4的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.1、8.2、8.3或8.4且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.5的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.5的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原具有等於或高於8.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0的等電點，如藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。
在一極佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:49。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:50。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:49組成。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:50組成。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:51組成。
在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88（Ser）與位置89（Thr）的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84（Ser）與位置85（Thr）的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86（Ser）與位置87（Thr）的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:39，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:48，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:5組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:39組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:48組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88（Ser）與位置89（Thr）的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84（Ser）與位置85（Thr）的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86（Ser）與位置87（Thr）的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:39，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:48，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:5組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:39組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:48組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5且包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入SEQ ID NO:5之胺基酸殘基88（Ser）與胺基酸殘基89（Thr）之間，且包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一及第二胺基酸連接子，其中該第一及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子）或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*連接子），其中該第一及/或該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser序列。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:5且包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入SEQ ID NO:5之胺基酸殘基88（Ser）與胺基酸殘基89（Thr）之間，且包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一及第二胺基酸連接子，其中該第一及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子）或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*連接子），其中該第一及/或該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser序列。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:10。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:11。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:12。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:11組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:12組成。
在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:10之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:11之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:12之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含由胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12組成之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含由胺基酸序列SEQ ID NO:11組成之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含由胺基酸序列SEQ ID NO:12組成之該嵌合CMV多肽的180個複本。
在另一極佳具體實例中，該抗原為犬科動物NGF。在一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33，或與SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
在又另一態樣中，本發明提供一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含
(a) 經修飾之CMV之VLP，其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾之CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成；
(b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；且其中該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33，或與SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；並且
其中(a)與(b)藉由異雙官能交聯劑、經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個共價非肽鍵連接，其中該異雙官能交聯劑為SMPH，且其中該至少一個第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分，且其中該至少一個第一連接位點為胺基，在此較佳為離胺酸的胺基，且其中該至少一個第二連接位點為氫硫基，在此較佳為已化學連接至NGF抗原的氫硫基。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP包含180個相同嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含、較佳由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV之VLP包含180個相同嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽由胺基酸序列SEQ ID NO:10組成。
在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33組成。在另一極佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:31或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:31。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:31組成。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:33組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:33或與SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:33。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:33組成。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之該嵌合CMV多肽的至少一個複本，較佳180個複本，且該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33，或與SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:10之該嵌合CMV多肽的至少一個複本，較佳180個複本，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:11之該嵌合CMV多肽的至少一個複本，較佳180個複本，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:10之該嵌合CMV多肽的至少一個複本，較佳180個複本，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:31，或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:11之該嵌合CMV多肽的至少一個複本，較佳180個複本，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:31，或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:12之該嵌合CMV多肽的至少一個複本，較佳180個複本，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾的CMV之VLP包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:12之該嵌合CMV多肽的至少一個複本，較佳180個複本，該抗原包含或較佳由以下者組成：SEQ ID NO:31，或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且再更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一連接位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。
本發明之經修飾的VLP可製備於原核或真核表現系統中。較佳系統為大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞以及哺乳動物細胞系。極佳地，該經修飾之CMV之VLP或該CMV之VLP係藉由將該嵌合CMV多肽表現於大腸桿菌中而獲得，且其中較佳地，該表現係在10℃至35℃之間的溫度下實現。
因此，在另一態樣中，本發明提供組成物，其包含(a)經修飾的黃瓜嵌紋病毒（CMV）類病毒粒子（VLP），其包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及(ii)包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基；以及(b)至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；且其中(a)與(b)經由該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點、經由至少一個共價非肽鍵連接，且其中該經修飾的CMV之VLP係藉由將該嵌合CMV多肽表現於大腸桿菌中來獲得，且其中較佳地，該表現係在10℃至35℃之間的溫度下實現。
在另一態樣中，本發明提供一種用於產生本發明組成物的方法，其包含自表現該經修飾之黃瓜嵌紋病毒（CMV）類病毒粒子（VLP）的重組細菌宿主中純化該經修飾之CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成：(i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及(ii)包含、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該多肽係插入該CMV多肽的任何胺基酸殘基之間，該任何胺基酸殘基對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基；且其中該方法包含以下步驟：(a)溶解該細菌宿主；(b)將藉由該溶解獲得的溶解物澄清；(c)藉由陰離子交換層析（AEX）自經澄清的溶解物中純化該經修飾的CMV之VLP；其中該等步驟依給定順序進行。
在一較佳具體實例中，該組成物包含佐劑。典型且較佳的佐劑為礦物質鹽（例如氫氧化鋁、磷酸鋁）、微晶酪胺酸、乳液、微粒、皂素（Quil A）、細胞介素、免疫增強劑、微生物組分/產品、脂質體、複合物及黏膜佐劑，其已為人知且描述於例如Adjuvant Compendium NIAID and VAC（nih.gov）或Aguilar等人（Aguilar JC等人, 2007, Vaccine 25:3752-3762）、Gerdts（Gerdts V, 2015, Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 128:456-463)及Pasquale等人（Pasquale等人, 2015, Vaccines 3:320-343）。在一較佳具體實例中，該組成物包含佐劑，其中該佐劑為氫氧化鋁。在另一較佳具體實例中，該組成物缺乏佐劑。
在另一態樣中，本發明提供一種疫苗，其包含或替代地由以下者組成：如本文所述的包含該經修飾之CMV之VLP及至少一種NGF抗原的本發明組成物。涵蓋如下疫苗，其中本發明組成物包含單獨或呈任何可能組合的本文所揭示之任一種技術特徵。在一較佳具體實例中，疫苗進一步包含佐劑。在一較佳具體實例中，該疫苗包含佐劑，其中該佐劑為氫氧化鋁。在另一較佳具體實例中，該疫苗缺乏佐劑。在一較佳具體實例中，該疫苗包含有效量的本發明組成物。
在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含：(a)如本文所述的本發明組成物，或如本文所述的本發明疫苗；及(b)醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑。該稀釋劑包括無菌的水性（例如生理食鹽水）或非水性溶液及懸浮液。本發明之醫藥組成物可採取的形式含有鹽、緩衝液、佐劑或改良結合物功效所需之其他物質。在一較佳具體實例中，該醫藥組成物包含有效量的本發明疫苗。在一較佳具體實例中，該醫藥組成物包含佐劑。
本發明之另一態樣為一種免疫接種方法，其包含向動物投予如本文所述的本發明組成物、如本文所述的本發明疫苗，或如本文所述的醫藥組成物，其中較佳地，該動物為犬或貓，更佳地，其中該動物為犬。在一較佳具體實例中，該方法包含向動物投予如本文所述的本發明組成物、如本文所述的本發明疫苗或如本文所述的醫藥組成物，其中該動物為犬或貓，較佳地，其中該動物為犬。在一較佳具體實例中，該方法包含向該動物投予有效量的本發明組成物、該疫苗或該醫藥組成物，其中較佳地，該動物為犬或貓，更佳地，其中該動物為犬。
在另一態樣中，本發明提供如本文所述的經修飾之CMV之VLP、如本文所述的本發明組成物、如本文所述的本發明疫苗或如本文所述的醫藥組成物，其用於免疫接種動物或人類的方法中，其中較佳地，該動物為犬或貓，更佳地，其中該動物為犬，其中該方法包含向該動物投予有效量的該經修飾之CMV之VLP、本發明組成物、該疫苗或該醫藥組成物，其中較佳地，該動物為犬或貓，更佳地，其中該動物為犬。
本發明之另一態樣為一種誘導動物產生針對NGF之中和抗體的方法，其包含將如本文所述的本發明組成物、如本文所述的本發明疫苗或如本文所述的醫藥組成物投予該動物，其中較佳地，該動物為犬或貓，更佳地，其中該動物為犬。在一較佳具體實例中，該方法包含將如本文所述的本發明組成物、如本文所述的本發明疫苗或如本文所述的醫藥組成物投予動物，其中該動物為犬或貓，較佳地，其中該動物為犬。在一較佳具體實例中，該方法包含將有效量的本發明之該組成物、該疫苗或該醫藥組成物投予該動物，其中較佳地，該動物為犬或貓，更佳地，其中該動物為犬。
在另一態樣中，本發明提供如本文所述的經修飾之CMV之VLP、如本文所述的本發明組成物、如本文所述的本發明疫苗或如本文所述的醫藥組成物，其用於免疫接種動物的方法中，其中較佳地，該動物為犬或貓，更佳地，其中該動物為犬，其中該方法包含將有效量的該經修飾之CMV之VLP、本發明之該組成物、該疫苗或該醫藥組成物投予該動物，其中較佳地，該動物為犬或貓，更佳地，其中該動物為犬。
實施例
實施例1
構築及產生表面電荷經修飾之 CMV 之 VLP
製備根據本發明的不同嵌合CMV多肽，且隨後加以表現，產生本發明的經修飾之CMV之VLP。
為此，製備嵌合CMV多肽，其尤其包含連續的帶負電胺基酸的不同多肽，亦即，由4、8或12個麩胺酸殘基組成的多肽（「E4」 - SEQ ID NO:1；「E8」 - SEQ ID NO:2；「E12」 - SEQ ID NO: 3），以便將該等麩胺酸殘基插入經修飾之CMV多肽CMV-Ntt830（SEQ ID NO:5）的胺基酸殘基Ser(88)與Tyr(89)之間。該經修飾之CMV多肽CMV-Ntt830包含來源於破傷風類毒素TT830的輔助性T細胞抗原決定基（SEQ ID NO:6）。編碼該經修飾之CMV多肽CMV-Ntt830的相應核酸序列（SEQ ID NO:7）如WO2016/062720A1實施例3中所述製備。
所製備之嵌合CMV多肽進一步包含在兩端側接所引入之E4、E8及E12多肽的連接子。詳言之，該等所製備的嵌合CMV多肽包含直接位於所引入之E4、E8及E12多肽之N端的GGS連接子或GGGS連接子（SEQ ID NO:8），及直接位於所引入之E4、E8及E12多肽之C端的GGGSGS連接子（SEQ ID NO:9）或CGGGSGS連接子（SEQ ID NO:4）。
該等所製備之嵌合CMV多肽的所得胺基酸序列命名為「CMV-Ntt830-E4」、「CMV-Ntt830-E8」、「CMV-Ntt830-E8*」及「CMV-Ntt830-E12」且具有如下胺基酸序列：
「CMV-Ntt830-E4」： SEQ ID NO:10；
「CMV-Ntt830-E8」： SEQ ID NO:11；
「CMV-Ntt830-E8*」： SEQ ID NO:12；
「CMV-Ntt830-E12」： SEQ ID NO:13。
該等較佳嵌合CMV多肽之相應核苷酸序列如下：
「CMV-Ntt830-E4」： SEQ ID NO:14；
「CMV-Ntt830-E8」： SEQ ID NO:15；
「CMV-Ntt830-E8*」： SEQ ID NO:16；
「CMV-Ntt830-E12」： SEQ ID NO:17。
首先，製備嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-E8*。在此及在第一步驟中，利用PCR誘變將包括側接型連接子之E8編碼序列併入經修飾之CMV中。使用以下寡核苷酸，利用兩步驟PCR擴增編碼E8序列的PCR片段，包括側接型連接子以及經修飾之CMV的3'端片段：
正向： E8*-1F（SEQ ID NO:18）
正向： E8*-2F（SEQ ID NO:19）
反向： CMcpR（SEQ ID NO:20）。
因此，使用E8*-1F/CMcpR寡核苷酸及pET-CMV-Ntt830質體作為模板來執行PCR反應。模板pET-CMV-Ntt830如WO2016/062720A1之實施例3中所述製備。使用寡核苷酸E8*-2F/CMcpR及得自第一次PCR的PCR產物進行第二次PCR之後，獲得目標PCR產物。將所得PCR產物選殖入輔助載體pTZ57（InsTAclone PCR選殖套組，Fermentas #K1214）。在大腸桿菌XL1-Blue細胞中擴增含有PCR產物的質體，且將質體DNA純化且使用BigDye循環定序套組及ABI Prism 3100基因分析儀（Applied Biosystems）進行定序。結果，在PCR不出錯的情況下獲得輔助質體pTZ-CMV-E8*。
作為下一步驟，使用相同限制位點，將pTZ-CMV-E8*的BamHI/HindIII片段選殖回至pET-CMV-Ntt830B輔助載體中，得到表現載體pET-CMVB2-Ntt-E8C（圖1）。
輔助載體pET-CMV-Ntt830B係用於將編碼包含一段連續的帶負電胺基酸之多肽的DNA序列引入CMV-Ntt830的相應CMV DNA序列中，含有BamHI位點的序列係在相應位置引入以便隨後選殖。編碼CMV-Ntt830的核酸序列如WO2016/062720A1之實施例3中所述製備且對應於WO2016/062720A1之SEQ ID NO:14。
BamHI位點係藉由兩步PCR誘變、使用下文列舉的寡核苷酸及先前構築的pET-CMV-Ntt830作為模板來引入。如所指示，模板pET-CMV-Ntt830如WO2016/062720A1之實施例3中所述製備。
第1次PCR：正向 - pET-90引子（黏接pET28a+）（SEQ ID NO:21）
反向 - RGSYrev（SEQ ID NO:22）
第2次PCR 正向 - RGSYdir（SEQ ID NO:23）
反向 - CMV-AgeR（SEQ ID NO:24）
兩種PCR產物均純化之後，執行下一次PCR以將PCR片段接合（不使用引子進行5個循環，接著使用引子pET-90及CMV-AgeR進行25個循環）。
擴增基因之後，將所得PCR產物直接選殖入pTZ57R/T載體（InsTAclone PCR選殖套組，Fermentas #K1214）。大腸桿菌XL1-Blue細胞作為宿主用於選殖及質體擴增。
為了避免RT-PCR錯誤，使用BigDye循環定序套組及ABI Prism 3100基因分析儀（Applied Biosystems）將含有CMV-Ntt830基因的若干pTZ57質體純系定序。定序之後，使用NcoI及AgeI酶切割序列未出錯的pTZ-質體純系，該純系經由所引入的BamHI位點而含有CMV-Ntt830B基因。接著將片段次選殖入pET-CMV-Ntt830的NcoI/AgeI位點，得到輔助載體pET-CMV-Ntt830B。
在大腸桿菌C2566細胞中產生CMV-Ntt830-E8* VLP（New England Biolabs, USA）。如下使用大腸桿菌細胞培養、生物質處理及純化方法產生VLP：
1)將3 g生物質懸浮於20 ml的50 mM檸檬酸鈉、5 mM硼酸鈉、5 mM EDTA、5 mM巰基乙醇pH 9.0中，用超音波處理懸浮液（Hielscher音波處理器UP200S，16分鐘，波幅70%，循環0.5）；
2)在+4℃下，以11000 rpm將溶解物離心20分鐘；
3)在35 ml管中，在含有50 mM檸檬酸鈉、5 mM硼酸鈉、2 mM EDTA、0.5% TX-100之緩衝液中製備蔗糖梯度（20-60%）；
4)將5 ml VLP樣品覆蓋於蔗糖梯度上；
5)使用SW32轉子Beckman（25000 rpm，在+18℃下）離心6小時；
6)將各梯度管的內容物分成6 ml溶離份。合併相應溶離份；
7)在SDS上分析梯度溶離份。
蔗糖梯度純化之後，對VLP進行的SDS-PAGE分析展現均質CMV-Ntt830-E8*外殼蛋白單體（圖2A）且電子顯微影像顯示完整VLP（圖2B）。
相應地且如下製備嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8及CMV-Ntt830-E12。第一步驟係利用PCR誘變將包括側接型連接子的聚麩胺酸編碼序列併入經修飾之CMV中。使用以下各對寡核苷酸與質體pET-CMVB2-Ntt-E8*作為模板，藉由PCR擴增編碼聚麩胺酸序列的PCR片段，包括側接型連接子以及經修飾之CMV的3'端片段：
1) 正向： E4-F（SEQ ID NO:25）
逆向： CMcpR（SEQ ID NO:20）；
2) 正向： E8-F（SEQ ID NO:26）
逆向： CMcpR（SEQ ID NO:20）；
3) 正向： E12-F（SEQ ID NO:27）
逆向： CMcpR（SEQ ID NO:20）。
將所得PCR產物選殖入輔助載體pTZ57（InsTAclone PCR選殖套組，Fermentas #K1214）。在大腸桿菌XL1-Blue細胞中擴增含有PCR產物的質體，且將質體DNA純化且使用BigDye循環定序套組及ABI Prism 3100基因分析儀（Applied Biosystems）進行定序。從而在PCR不出錯的情況下獲得輔助質體pTZ-CMV-E4、pTZ-CMV-E8及pTZ-CMV-E12。
隨後，利用相同的限制位點，將pTZ-CMV-E4、pTZ-CMV-E8及pTZ-CMV-E12的BamHI/HindIII消化片段選殖回至pET-CMV-Ntt830B（參見上文）。從而獲得表現載體pET-CMVB2-Ntt-E4（圖3）、pET-CMVB2-Ntt-E8（圖4）及pET-CMVB2-Ntt-E12（圖5）。將表現載體轉型為大腸桿菌C2566細胞（New England Biolabs, USA）。利用上文關於CMV-Ntt830-E8* VLP所述的大腸桿菌細胞培養、生物質處理及純化方法產生VLP。蔗糖梯度純化之後，對VLP進行的SDS-PAGE分析展現所有3種聚麩胺酸構築體均獲得近似均質的CMV外殼蛋白單體（圖6、圖7、圖8）。然而，瓊脂糖凝膠分析顯示，僅CMV-Ntt830-E4及CMV-Ntt830-E8形成完整粒子，而CMV-E12則未形成完整粒子（圖6、圖7、圖8）。電子顯微影像顯示，CMV-Ntt830-E4及CMV-Ntt830-E8形成完整VLP（圖9、圖10）。
實施例2
相較於先前技術的CMV之VLP，本發明之表面電荷經修飾之CMV之VLP的穩定性改良
熱穩定性
藉由量測先前技術CMV-Ntt830 VLP（如WO2016/062720A1之實施例3及實施例4中所述製備）及本發明CMV-Ntt830-E4 VLP隨著溫度升高而發生的變性且測定對應的解鏈溫度來證明本發明之表面電荷經修飾之CMV之VLP的熱穩定性增強。
出於此目的，使用涉及溫度誘導變性的熱轉移分析及螢光染料SYPRO®橙（Sigma, Saint Louis, USA）。該染料天然地在溶液中淬滅，但隨著VLP在溫度升高時變性，SYPRO®橙與暴露的疏水性胺基酸及核心發生相互作用且發射螢光信號，該螢光信號藉由螢光測定法量測。根據所得解鏈曲線（螢光信號相對於溫度）確定解鏈峰值曲線及解鏈溫度。使用即時PCR系統MJ Mini（Bio-Rad, Hercules, USA），利用DNA解鏈溫度測定程式，對含有0.5 mg/ml經蔗糖密度梯度純化（如以上實施例1中所述）之CMV-Ntt830 VLP或CMV-Ntt830-E4 VLP於5 mM磷酸鈉、2 mM EDTA pH 7.5中的溶液進行分析。使用Opticon監測軟體分析數據且在四參數的平滑設置下處理解鏈曲線。圖11顯示經純化之CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP的解鏈峰值曲線。
對應的解鏈溫度經估算為51℃及57℃，證明根據本發明之表面電荷經修飾之CMV之VLP的熱穩定性相較於先前技術CMV-Ntt830 VLP增強。
離子強度/鹽穩定性
離子強度對蛋白殼穩定性具有重要作用。溶液中的鹽與外殼蛋白及VLP表面上帶有電荷的殘基發生相互作用，影響水殼層且不利於疏水性暴露，且從而影響總體VLP穩定性。
藉由在室溫下、在不同的NaCl濃度下培育經純化之VLP（0.5 mg/ml，於5 mM磷酸鈉、2 mM EDTA pH 7.5中）來測試CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP對NaCl的相對穩定性。在20 mM NaCl存在下經歷2小時之後，CMV-Ntt830 VLP變得相對不穩定且形成眼睛可見且天然凝膠電泳可展現的大比例聚集體（圖12）。相比之下，CMV-Ntt830-E4 VLP即使在高達0.4 M的NaCl濃度下，亦無聚集體形成的證據（圖12）。
本發明之經修飾之CMV之VLP的表面電荷修飾在較高鹽溶液中引起的穩定性改良對如實施例3中所述之離子交換層析法的可處理性具有重要作用。
實施例3
相較於先前技術的CMV之VLP，本發明之表面電荷經修飾之CMV之VLP的純化潛力改良
如先前技術中（諸如WO2016/062720A1之實施例2至4中）所述用於實驗室規模CMV之VLP製造方法中以及用於製備如以上實施例1中所述之本發明經修飾之CMV之VLP的蔗糖梯度/緩衝超離心純化步驟提供適合產量和純度的CMV之VLP，用於後續結合、疫苗製造和臨床前評估。然而，此方法無法簡單地以及成本有效地用於產生供商業目的用的疫苗。
離子交換層析（IEX）典型地可容易擴大且在下游製程中用於生物製劑的商業生產。其係基於溶液中帶電荷的分子/大分子與固著的帶相反電荷之層析樹脂之間的可逆離子相互作用。實例是陰離子交換層析（AEX），其中固定相（樹脂）是帶正電及帶負電的分子，諸如所結合的蛋白質。樹脂與樣品的相互作用可藉由施加相對離子（諸如Cl
-）來破壞。IEX通常以結合/溶離方式使用，以提供所需樣品的快速捕捉、高解析度純化及濃縮。其可在下游製程的初始階段（例如溶解物澄清之後）、中間階段或次末階段中使用。
為了IEX有效地結合及溶離CMV之VLP，CMV之VLP在結合及溶離階段期間所遇到的離子環境中必需穩定。離子交換樹脂與溶離鹽上的電荷均促成離子環境。
先前技術的CMV-Ntt830 VLP以及本發明的經修飾之CMV之VLP（諸如CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8及CMV-Ntt830-E8*）在約pH 9及更低pH下帶有淨負電荷，如其在NAGE中向帶正電的電極遷移所表明。因此，陰離子交換層析（AIX）為預期已對兩種CMV之VLP粒子發揮作用的技術。
然而，情況並非如此，原因在於如上文在實施例2中所述的CMV-Ntt830 VLP在溶液中、在已達20 mM的NaCl存在下相對不穩定且形成聚集體而沈澱。相比之下，本發明的經修飾之CMV之VLP，諸如CMV-Ntt830-E4 VLP，在最高0.4 M的NaCl濃度下不形成聚集體（圖12，圖塊B）。對VLP進行表面電荷修飾而引起的在較高鹽溶液中之穩定性改良係離子交換層析法對其的可處理性必不可少的。
改良陰離子交換層析法（AEX）的純化
為了測試陰離子交換層析法（AEX）對先前技術CMV-Ntt830 VLP的可處理性，如WO2016/062720A1的實施例2至4中所述製備蔗糖梯度純化的VLP。將5 ml的CMV-Ntt830 VLP（1 mg/ml）在5 mM硼酸鈉pH 9中緩衝交換且負載至經相同緩衝液平衡的1.0 ml Macro-Prep DEAE Bio-Rad陰離子交換濾筒上。負載步驟之後，逐步增加溶離緩衝液中的NaCl濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0及2.0 M）。收集溶離份且使用量測蛋白質的Nanodrop分光光度計、在260 nm量測，且進行原生瓊脂糖凝膠電泳（NAGE）。
針對相應溶離份繪製的蛋白質溶離及NaCl濃度之所得層析圖（圖13，圖塊A）顯示CMV-Ntt830 VLP不作為單峰溶離，此為AIX所特有的。相反，CMV-Ntt830 VLP在負載（在0 M NaCl下）及後續溶離步驟（在一系列NaCl濃度下，主要為0.2至0.8 M）期間以寬泛的非特異性方式溶離。關鍵是，自管柱溶離之後，含有VLP的溶離份為混濁的且含有顯著比例的VLP聚集體，如NAGE之後、負載孔中存在溴化乙錠染色的VLP所表明（圖13，圖塊B）。CMV-Ntt830 VLP以非離散方式聚集且溶離的傾向妨礙了此方法隨時用於按比例擴大的製造。
相比之下，使用AEX可容易自粗溶解物純化非聚集的CMV-Ntt830-E4 VLP。將由表現CMV-Ntt830-E4 VLP之大腸桿菌製備的經澄清溶解物（如實施例1中所述）於50 mM檸檬酸鹽、5 mM硼酸鹽緩衝液pH 9.0中負載至經相同緩衝液平衡之XK 26/20管柱中的60 ml Fracto-DEAE（Merck）上，且使用相同緩衝液、藉由施加0至1.0 M連續NaCl梯度進行溶離。在A260 nm監測溶離液以量測蛋白質且量測電導率以監測鹽濃度。收集經澄清的溶解物、流過物及溶離份且進行NAGE及SDS-PAGE。
所得層析圖、SDS-PAGE及NAGE分析（圖14）顯示，CMV-Ntt830-E4 VLP不存在於流過物中且完全結合至Fracto-DEAE。隨後在0.2至0.5 M NaCl的相對較窄濃度範圍內溶離VLP。此外，沒有證據表明，原生瓊脂糖凝膠的負載孔中存在VLP聚集體。庫馬斯藍染色的SDS-聚丙烯醯胺凝膠顯示，自粗細菌溶解物獲得高純度VLP外殼蛋白。
實施例4
重組成熟NGF的選殖、表現及純化
重組NGF的選殖
重新合成cDNA構築體（SEQ ID NO:28）且選殖入pBHA載體（BIONEER公司）中，該cDNA構築體由貓科動物全長NGF前肽序列、犬科動物成熟NGF序列及C端甘胺酸-半胱胺酸-甘胺酸模體組成。對犬科動物NGF序列進行密碼子優化。貓科動物全長NGF前肽的所得胺基酸序列提供於包含SEQ ID NO:30之犬科動物成熟NGF序列的SEQ ID NO:29中。與該C端甘胺酸-半胱胺酸-甘胺酸模體連接的犬科動物成熟NGF胺基酸序列提供於SEQ ID NO:31中。
類似地，重新合成cDNA構築體（SEQ ID NO:32）且選殖入pBHA載體（BIONEER公司）中，該cDNA構築體由貓科動物全長NGF前肽序列、犬科動物成熟NGF序列、C端甘胺酸-半胱胺酸-甘胺酸模體及his標籤組成。所包括的his標籤未實現用於純化的任何作用，但其存在增加了下游過程中的再摺疊效率。所得胺基酸序列提供於包含SEQ ID NO:30之犬科動物成熟NGF序列以及His6標籤（SEQ ID NO:34）的SEQ ID NO:33中。
藉由PCR將構築體次選殖入表現載體中。簡言之，NGF-pBHA質體用作模板，其中NGF正向引子（SEQ ID NO:35）及NGF反向引子（SEQ ID NO:36）分別含有XbaI及HindIII位點。
NGF PCR產物在TAE緩衝液中進行1%瓊脂糖凝膠電泳且接著使用GeneJet DNA溶離套組（Thermo Fisher Scientific）、根據製造商方案萃取NGF片段。根據製造商方案，在1x FastDigest緩衝液中、在+37℃下用FastDigest XbaI及HindIII（Thermo Fisher Scientific）限制酶消化NGF片段30分鐘。以相同方式消化pET42a質體（Novagen）。利用瓊脂糖凝膠電泳對NGF及載體消化的DNA片段進行分析且如上所述萃取。根據製造商方案，在室溫下，利用T4連接酶使NGF片段在pET42a載體中接合隔夜。
藉由熱休克方法將NGF-pET42a構築體轉型於化學勝任型大腸桿菌DH5α細胞中。將細胞懸浮於1 ml LB培養基中且在+37℃下、在振盪下培育1小時且接種於含有60 μg/ml康黴素(kanamycin)的LB瓊脂上且在37℃下培育隔夜。將個別群落接種於含有30 μg/ml康黴素的LB培養基中且在+37℃下、在振盪下培育隔夜。使用GeneJet質體小規模純化套組（Thermo Fisher Scientific），根據製造商方案自個別純系培養物中萃取DNA。
使用BigDye Terminator v3.1循環定序套組（Thermo Fisher Scientific），根據製造商方案，藉由桑格定序來證實SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:32之NGF構築體的正確序列。
重組犬科動物成熟NGF的表現及純化
將NGF-pET42a質體轉型於化學勝任型大腸桿菌BL21-DE3（Sigma-Aldrich）細胞中。將細胞懸浮於1 ml LB培養基中且在+37℃下、在振盪下培育1小時。將細胞接種於含有60 μg/ml康黴素的LB瓊脂上且在37℃下培育隔夜。將NGF-pET42轉型之BL21-DE3細胞的若干群落接種於含有30 μg/ml康黴素的LB培養基中且在37℃下培育隔夜且接著添加至含有30 μg/ml康黴素的2 x TY培養基中且在37℃下、在振盪下培養直至達到0.7個單位的OD
540nm為止。藉由添加IPTG直至最終濃度為1 mM來誘導重組蛋白質表現且在37℃下、在振盪下再培養細胞4小時。藉由以5000 g離心15分鐘來收集生物質，冷凍且在-70℃下儲存。
將生物質懸浮於溶解緩衝液（40 mM Tris-HCl（pH 8.0）、200 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM DTT及1% Triton X-100）中且使用UP200S（Hielscher）超音波裝置、藉由音波溶解細胞。所得音波處理物以15 557 g離心40分鐘。捨棄上清液且將溶解緩衝液添加至離心塊中，藉由音波再次懸浮。懸浮液以15 557 g離心15分鐘且再次捨棄上清液。此洗滌步驟重複三次以上。最後用50%溶解緩衝液及3.5 M尿素洗滌離心塊。再懸浮及離心之後，用8 M鹽酸胍及0.1 M二硫蘇糖醇溶解離心塊。懸浮液藉由音波均質化10分鐘，接著以15 557 g離心25分鐘。收集上清液（含有溶解的變性NGF）且使用45 μm過濾器過濾，接著在7℃下、在恆定攪拌下逐滴添加至再摺疊緩衝液（0.75 M L-精胺酸、0.1 M Tris、1 mM EDTA、5 mM還原麩胱甘肽及0.5 mM氧化麩胱甘肽pH 9.5）中，直至最終濃度為5 ml NGF溶液/100 ml再摺疊緩衝液。隔夜培育之後，再摺疊溶液以10 000 g離心10分鐘且收集上清液且在+7℃下培育一週。溶液用去離子水稀釋三倍，升溫至室溫且用將pH調節至6.8。溶液接著在室溫下以7 000 g離心10分鐘以移除沈澱物且負載於預先經50 mM磷酸鈉緩衝液（pH 6.5）平衡的5 ml Capto S陽離子交換管柱上。接著在50 mM磷酸鈉緩衝液（pH 6.5）中，經由0-1 M NaCl的梯度溶離蛋白質。使用SDS-PAGE分析所溶離的溶離份且將含有proNGF的溶離份混合且經由超濾濃縮至2-3 mg/ml。複性的proNGF在室內、以30:1體積比、用TrypZean（Sigma - Aldrich，目錄號T3449）胰蛋白酶溶液消化4小時。藉由添加PMSF直至最終濃度為1 mM來終止反應，接著負載於經0.5 M NaCl及30 mM磷酸鹽（pH 6.8）平衡的Superdex 200 10/300 GL尺寸排阻管柱上。
收集溶離份且使用SDS-PAGE進行分析（圖15A；圖示為SEQ ID NO:28之cDNA構築體及SEQ ID NO:29之貓科動物全長NGF前肽的所得胺基酸序列）且將含有成熟NGF的溶離份混合且藉由超濾濃縮至2 mg/ml之濃度。
利用生物分析來證實犬科動物重組成熟NGF的純正性，其顯示犬科動物成熟NGF與小鼠成熟NGF（由R&D systems商業生產）具有相似的誘導神經突之活性（圖15B：圖示為SEQ ID NO:28的cDNA構築體及SEQ ID NO:29之貓科動物全長NGF前肽的所得胺基酸序列）；正確摺疊且具有生物活性之成熟NGF的已知功能。
實施例5
犬科動物重組成熟NGF與經修飾之CMV之VLP的偶合
使包含犬科動物成熟NGF（SEQ ID NO:30）的各種NGF抗原共價連接至如上文所述製備的各種經修飾之CMV之VLP。根據Schmitz N等人, J Exp Med (2009) 206: 1941-1955中所述之方法實現連接。
簡言之，將經純化的CMV-Ntt830、CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8或CMV-Ntt830-E8* VLP稀釋至1.5 mg/ml且在室溫（RT）下與異雙官能化學交聯劑丁二醯亞胺基-6-(b-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺)己酸酯（SMPH）反應1小時。SMPH含有與VLP表面上的離胺酸反應的NHS酯。SMPH的添加量相較於一個VLP外殼蛋白單體過量約5倍莫耳濃度。與VLP不反應的交聯劑係使用Amicon-Ultra-0.5, 100K離心過濾器（Merck-Millipore，#UFC910024）、藉由離心移除。SMPH衍生化的VLP接著用5 mM Na2HPO4、2 mM EDTA（pH 7.5）洗滌3次。
詳言之，且針對具有SEQ ID NO:33之cNGF抗原與CMV-Ntt830-E4 VLP的偶合所述：使用蛋白質濃度為7.43 mg/ml的BCA蛋白質分析套組（TFS，目錄號23225），在50 ml管（Sarstedt，無菌，目錄號62.559.001）中，使用5 mM NaHPO4 pH 7.5、2 mM EDTA pH 8.0、以3x 44 ml樣品體積將CMV-Ntt830-E4 VLP於5 mM NaHPO4 pH 7.5、2 mM EDTA中的溶液稀釋至1.5 mg/ml的工作濃度，因此，用於衍生化的總體積為132 ml。50 mM（19 mg/ml）SMPH的DMSO溶液在臨用前製備。
為了用SMPH將CMV-Ntt830-E4 VLP衍生化，將264 μl 50 mM SMPH的DMSO溶液添加至先前製備之三個管中的每一者中，該等管含有44 ml CMV-Ntt830-E4 VLP。將混合物渦旋5秒且在室溫下培育1小時。為了移除過量SMPH，將混合物在Eppendorf 5810R離心機中、在Amicon-Ultra-15 100K單元（Merck-Millipore，目錄號UFC910024）上、以3214 g進一步離心7分鐘。藉由3次以上的離心運作，使用相同參數將緩衝液與5 mM NaHPO4 pH 7.5、2 mM EDTA進行交換。最後一次離心運作之後，將總體積調節至132 ml（與衍生化之前相同）。量測260nm UV吸收且衍生化CMV-Ntt830-E4 VLP的濃度經估算為1.5 mg/ml。
簡言之，隨後，在振盪的同時，在室溫下，典型地歷時3小時將cNGF抗原以約0.5:1至1:1莫耳比添加至VLP（相對於對應的嵌合CMV多肽單體、相對於預先經SMPH衍生化的表面電荷經修飾之CMV之VLP）。cNGF抗原的工程化自由半胱胺酸與結合至VLP之交聯劑SMPH中的順丁烯二醯亞胺發生反應以形成穩定的共價鍵聯。
詳言之，且針對具有SEQ ID NO:33之cNGF抗原與CMV-Ntt830-E4 VLP的偶合所述：在六個50 ml管（Sarstedt，無菌，目錄號62.559.001）中進行偶合反應。在各管中，將22 ml衍生化CMV-Ntt830-E4 VLP（1.5 mg/ml，60 μM，相對於CMV單體）與3.82 ml經緩衝液交換的cNGF SEQ ID NO:33（2.33 mg/ml，172.6 μM）混合。由此產生CMV單體 : NGF單體 = 1:0.5的莫耳比。反應混合物在室溫下藉由用DSG Titertek（Flow Laboratories）翻滾旋轉來培育。在Superdex 200管柱上藉由凝膠過濾（運作緩衝液20 mM NaHPO4 pH 7.5、2 mM EDTA）來移除未偶合的cNGF。將10 ml包含cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的溶液負載於經20 mM NaHPO4 pH 7.5、2 mM EDTA平衡的HiLoad 26/600 Superdex 200製備級管柱上。將含有cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的溶離份混合且經由0.2 μm過濾器（Sarstedt，目錄號83.1826.001）過濾。凝膠過濾之後收集的樣品體積為280 ml。藉由Amicon-Ultra-15, 100K（Merck-Millipore，目錄號UFC910024）將樣品進一步濃縮至230 ml且經由0.2 μm過濾器（Sarstedt，目錄號83.1826.001）過濾。藉由Qubit量測濃度且用無菌的20 mM NaHPO4 pH 7.5、2 mM EDTA緩衝液將最終濃度調節至0.7 mg/ml。量測260 nm UV吸光度（A230=6.628及A260=3.722）。
為了展現cNGF抗原與VLP共價結合，藉由SDS-PAGE分析偶合反應。在cNGF與CMV-Ntt830、CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8及CMV-Ntt830-E8* VLP發生化學偶合之後，觀測到顯著的結合譜帶（圖16A及圖16B）。然而，cNGF-CMV-Ntt VLP形成大聚集體（1400-1700 nm）（圖16C）且自溶液中快速且完全沈澱。
相比之下，在cNGF與CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8及CMV-Ntt830-E8* VLP共價結合之後，所得經修飾之VLP結合物保持可溶性且不會自溶液中沈澱。藉由動態光散射（DLS）（圖16D、圖16E及圖16F）及電子顯微法（圖16G及圖16H）的分析顯示，經修飾之VLP結合物在溶液中不聚集且具有穩定性。
實施例6
藉由免疫接種犬科動物成熟NGF與經修飾之CMV之VLP偶合之本發明各種結合物來誘導中和抗體
小鼠免疫接種
將Balb/c小鼠分成兩組（n = 4/組）。第一組免疫接種150 µl犬科動物成熟NGF-CMV-Ntt830-E8* VLP兩次，間隔14天，該VLP在20 mM NaP、2 mM EDTA pH 7.5中調配至100 µg/ml之濃度。第二組類似地用20 mM NaP、2 mM EDTA pH 7.5中調配至100 µg /ml濃度的犬科動物成熟NGF-CMV-Ntt830-E8* VLP及100 µg/ml Quil-A佐劑（InvivoGen vac-quil）處理。每次免疫接種之前以及第一次疫苗接種之後的第21、28、35及42天獲取血液。藉由將血液樣品在血清管中以10,000 x g離心10分鐘來製備血清。血清在約-20℃下儲存直至分析為止。
犬的免疫接種
將首次給藥時年齡為22至26個月的六隻雄性比格犬（Beagles）（獲自Marshall US）隨機分成2組（n=3/組）。第一組免疫接種1.0 ml經磷酸鈉緩衝液pH 7.5調配至250 µg/ml濃度的cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP三次。第二組類似地用磷酸鈉緩衝液pH 7.5中調配至250 µg/ml濃度之cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP及100 µg/ml Quil-A
®佐劑（vivoGen vac-quil）處理。第一次（第0天）、第二次（第21天）及第三次（第42天）免疫接種之前的24小時，使用一次性針及注射器自各動物抽取血液試樣。亦在第63天、第84天及第105天抽血。在惰性管中收集6 ml血液樣品且在環境溫度下擱置。凝血塊形成之後，將管離心且將血清收集至惰性管中且在約-20℃下儲存，直至進行IgG純化及/或分析為止。
在另一研究中，將納入時9月齡的10隻成年比格犬分成2組。免疫接種係使用包含SEQ ID NO:33之cNGF抗原的cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP。因此，第一組的5隻犬用與1.7 mg氫氧化鋁一起調配的每劑量250 µg cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP處理，而第二組的5隻犬用不含氫氧化鋁的每次劑量250 µg cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP處理。在研究第0天及第21天的兩個時間皮下投予犬。在整個研究期間，在第42天、第71天及第91天，亦收集血清樣品。
量測NGF及CMV-VLP特異性IgG抗體
對於免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP的小鼠及犬而言，藉由ELISA量測血清中的抗NGF-及CMV-Ntt830-E8*-VLP特異性IgG抗體。對於免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的犬而言，藉由ELISA量測血清中的抗NGF特異性IgG抗體。
如關於免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP所詳述，Maxisorp ELISA盤在4℃下用濃度為1 μg/ml、存在於0.1 M碳酸鈉緩衝液pH 9.6中的犬科動物重組成熟NGF蛋白質或CMV-Ntt830-E8*-VLP塗覆隔夜。洗盤且在室溫下歷時2小時添加SuperBlock
TM（PBS）阻斷緩衝液（Thermo Fisher/Life Technologies Europe），接著再次洗滌。血清樣品在含有2% BSA、0.05% Tween 20的PBS中1:9或1:100預稀釋，轉移至ELISA盤中且進行十次3倍連續稀釋。在室溫下培育2小時且洗滌之後，添加經辣根過氧化酶（HRP）標記、具有Fcγ片段特異性的山羊抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch歐洲有限公司）或經HRP標記的兔抗犬IgG（H+L）-HRP（Jackson ImmunoResearch歐洲有限公司），其分別在含有2% BSA、0.05% Tween-20的PBS（PBS pH 7.4（1x）Gibco）中以1:2000或1:2500稀釋。培育及洗滌之後，使用Pierce
TMTMB受質套組（Thermo Fisher/Life Technologies歐洲公司）進行比色顯影。藉由添加5% H
2SO
4終止酶反應且使用ELISA讀取器（Tecan Spark 10）、藉由分光測光學量測450 nm吸光度。OD50效價係描述稀釋度的倒數，其達到最大OD值的一半。
PC12細胞的中和分析.
利用試管內分析測定重組產生之犬科動物成熟NGF的生物活性且評估藉由免疫接種小鼠所誘導之抗體的中和能力，該試管內分析係量測成熟NGF在大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞培養物（PC-12）中介導的神經突過度生長。將存在於分析培養基中的每孔5×10
4PC-12個細胞雙重複接種於經I型膠原蛋白（Thermo Fisher/Life Technologies歐洲公司）（10 µg/ml）塗覆的24孔組織培養盤中，該分析培養基包含RPMI 1640（Sigma-Aldrich，瑞士）、2 mM L-麩醯胺酸（Gibco）、2.4 g/L HEPES（AppliChem德國有限公司）、2.5 g/L葡萄糖（Sigma-Aldrich，瑞士）且進一步補充有10%熱滅活胎牛血清（FBS Premium，PAN Biotech，德國）、10%馬血清（瑞士Evax友情提供）、1x抗生素-抗黴菌素（A/A）（Gibco, Thermo Fisher/Life Technologies歐洲公司）及1mM丙酮酸鈉（Sigma-Aldrich，瑞士）；且在37℃、5% CO
2下培育隔夜。次日，用分析培養基（RPMI 1640、1x A/A、1 mM丙酮酸鈉、2 mML-麩醯胺酸、0.5% FBS）置換孔中的培養基，該分析培養基含有最終濃度為12.5 ng/ml的小鼠成熟NGF（R&D, 1156-NG-100）、人類成熟NGF（R&D, 256-GF-100/CF）或重組產生的犬科動物成熟NGF，以及人類成熟NGF多株抗體（R&D AF-256-NA）、人類成熟NGF單株抗體（R&D MAB256-500）或自接種疫苗之小鼠純化的IgG。陰性對照孔（單獨的饑餓培養基）中省去NGF且陽性對照孔（含有12.5 ng/ml NGF的饑餓培養基）中省去抗體。5天之後，細胞用0.05% w/v結晶紫溶液染色且藉由顯微法檢查。在倒置式顯微鏡Leica DM IL LED（Leica Microsystems（UK）有限公司）、HI PLAN I 20x物鏡上，使用Q-Capture Pro 7軟體捕捉若干視野的亮視野影像。對存在及不存在神經突過度生長（定義為細胞體寬度延長）的細胞進行計數且測定每次處理時的神經突陽性細胞之比例。
TF-1細胞的中和分析
利用生物活性分析測定免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP及cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP之犬之血清的中和能力，該生物活性分析涉及量測TF-1紅血球母細胞瘤細胞系（美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）, Manassas, VA）的增殖。
為了免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP，收集TF-1細胞，用PBS（PBS pH 7.4（1x）Gibco）洗滌三次且在饑餓培養基（補充有熱滅活10% FBS、1x A/A的RPMI 1640培養基（ATCC修飾））中以每毫升10
5個細胞的細胞密度培養隔夜。將10
4個TF-1細胞接種於平底96孔盤的每孔總共100 µl分析培養基（不含苯酚紅的RPMI，該RPMI含有10% FBS、2 mM格魯塔瑪（GlutaMax）、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500 mg/L葡萄糖、1500 mg/L碳酸氫鈉、100 U/mL青黴素、100 µg/mL鏈黴素、25 µg/mL兩性黴素B）中。
為了測試藉由免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP而產生之抗體的試管內中和活性，收集免疫接種之犬的血清且使用用於小鼠IgG純化的Invitrogen Dynabeads
TM蛋白質G（Thermo Fisher/Life Technologies歐洲公司）及用於犬的Pierce蛋白質A磁性珠粒（Thermo Fisher/Life Technologies歐洲公司），根據製造商說明書純化總IgG。藉由將恆定濃度的5 ng/ml人類成熟NGF（R&D，256-GF-100/CF）與濃度增加的經純化之犬總IgG（625-20000 ng/mL）、人類成熟NGF多株抗體（R&D AF-256-NA）或人類成熟NGF單株抗體（R&D MAB256-500）一起在室溫下培育1小時來測試經純化之總IgG中和NGF生物活性的能力。接著將NGF-抗體溶液添加至饑餓隔夜的10
4個TF-1細胞中且使用基於BrdU的細胞增殖ELISA（Roche）定量總共72小時培育時間之最後24小時時段內的細胞增殖。遵循製造商說明書且使用5%硫酸終止顯色。使用690 nm的參照波長，量測450 nm吸光度。
相對於在基線時、在感染之前（第0天）收集之血清純化之IgG所量測的增殖，計算對應於各IgG稀釋度的增殖百分比。數據表示為增殖百分比對IgG濃度。使用GraphPad Prism（Windows 8.0.0版, GraphPad Software, San Diego, California USA, www.graphpad.com）擬合反曲4PL曲線，以測定為了對增殖達成50%抑制所需之IgG濃度（50%中和效價NT50）。
免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP之後，如下測定犬中的NGF中和抗體：收集TF-1細胞且用PBS洗滌3次，隨後以每毫升2×10
5個細胞的細胞密度再懸浮於饑餓培養基（不含苯酚紅的RPMI（Sigma），該RPMI含有10% HI-FBS、2 mM格魯塔瑪（Gibco）、10 mM HEPES（Sigma）、1 mM丙酮酸鈉（Sigma）、4500 mg/L葡萄糖（Gibco）、1500 mg/L碳酸氫鈉、100 U/mL青黴素、100 µg/mL鏈黴素、25 µg/mL兩性黴素B（100x抗抗Gibco））。將血清樣品在56℃下熱滅活30分鐘，接著在饑餓培養基中1:25稀釋（1:100最終濃度的4倍）且進行2倍連續稀釋。將hNGF稀釋至20 ng/mL（5 ng/mL最終濃度的4倍）且添加25 µL至含有25 µL預稀釋血清或25 µL饑餓培養基的孔（陽性對照孔）中。代替hNGF，將50 µL饑餓培養基添加至陰性對照孔中。hNGF-血清/抗體混合物在室溫下培育1小時。收集血清饑餓的TF-1細胞，且以平底96孔盤每孔1×10
4個細胞的細胞密度添加50 µL細胞懸浮液。每個盤的最終樣品體積為每孔100 µL。細胞培養盤在5% CO
2細胞培育箱中、在+37℃下培育約68小時。藉由Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution細胞增殖分析（Promega）定量細胞生存率。每孔添加20 µL CellTiter 96® Aqueous One Solution試劑。培養盤在加濕的5% CO
2培育箱中、在+37℃下培育7小時。以700 nm為參照波長，記錄490 nm吸光度。為了測定IC50值，藉由使用GraphPad prism軟體（Windows的GraphPad Prism 8版及9版, GraphPad Software, San Diego, California USA）將血清樣品的OD值相對於稀釋因數作圖來產生調定曲線。使用4-PL回歸曲線擬合模型測定IC50值，對應於半最大OD值的稀釋因數。定義樣品在不同時間點的血清效價且描繪為曲線擬合的IC50值。
結果
鼠類實驗
對於免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP與Quil A的小鼠而言，偵測自第14天起收集之血清中的cNGF特異性IgG抗體（圖17A）。第21天（第14天投予第二次注射之後的第7天）血清中的抗體效價經量測進一步增加。高效價保持至第42天實驗終止為止。在缺乏佐劑的情況下兩次免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP疫苗之後，在自第21天起分離的血清中偵測到NGF特異性IgG抗體。Quil A佐劑的共投予具有增強免疫的功效且將特異性抗體反應增強約10倍。
為了測試藉由免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP而誘導的抗NGF IgG抗體是否具有中和性，在基於PC12的生物分析中測試其，其中NGF充當誘導分化及神經突過度生長的神經營養因子。自免疫接種之前收集的混合血清中純化IgG（初始ms pIgG）且自cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP/QuilA增強免疫之後的第21、28及35天收集的混合血清中純化IgG（ms pIgG NGF vacc）。圖17B顯示自免疫血清純化的IgG中和NGF，而來自初始小鼠的IgG不中和NGF。
犬科動物實驗
就接受cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP、但未接受佐劑之動物而言，在單次投予疫苗之後的第21天（圖18A）收集的血清中觀測到可偵測的抗NGF IgG效價。第42天（第二次投予疫苗之後的第3週）血清中的NGF特異性IgG效價最高。第42天進行第三次注射之後，所有動物的效價保持恆定地高直至第63天且隨後逐漸下降。抗CMV IgG效價的量值類似於針對犬科動物成熟NGF所量測的彼等量值，但反應動力學存在略微差異（圖18C）。抗CMV IgG抗體存在某種程度的延遲且唯一明確的是可在第二次免疫接種之後第42天起偵測到，且在第三次免疫接種之後的第63天血清中量測到峰值效價，隨後效價下降。
對於免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP與佐劑Quil A組合的動物而言，首先在第0天單次投予疫苗之後的第21天血清中偵測到抗NGF IgG抗體（圖18B）。第二次及第三次劑量的疫苗使三隻動物中之兩隻的效價增加，其中在第63天收集的血清中量測到峰值效價。第三隻動物在第42天達成其峰值效價，表明第三次劑量的疫苗可能不增加抗體反應。抗CMV IgG抗體效價的動力學及量值類似於針對犬科動物成熟NGF所量測的彼等值（圖18D）。
就接受cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP、但未接受佐劑之動物而言，在5隻研究動物的4隻中，在單次投予疫苗之後的第21天（圖18E）收集的血清中觀測到可偵測的抗NGF IgG效價。第42天投予第二次劑量之後的第21天觀測到最高效價。
就免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP與氫氧化鋁組合的動物而言，第0天單次投予疫苗之後的第3週偵測到所有動物出現抗NGF IgG抗體（圖18F）。第二次劑量的疫苗增加平均群組效價。
使用生物分析，基於NGF介導的TF-1細胞增殖來分析作為對接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP的反應而誘導之抗NGF IgG抗體的中和能力。自免疫接種之犬純化的IgG抗體以濃度依賴性方式抑制成熟NGF誘導的增殖，而自相同動物之免疫前血清純化的IgG抗體則不然（圖19A）。接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP誘導高中和效價，疫苗與Quil A佐劑共投予可進一步增加中和效價（圖19B）。此觀測結果反映上述此等犬中的抗NGF ELISA IgG效價。觀測到抗NGF效價與中和能力之間明確相關（圖19C）。相對於對NGF介導之TF-1細胞增殖的抑制，自具有高疫苗特異性效價之血清純化的IgG具有增加的效力。
接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP誘導中和性抗NGF抗體效價。第42天，在自兩次免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E4（在氫氧化鋁存在下）之犬收集的血清中觀測到高含量的中和性抗NGF抗體（圖19D）。
此等結果顯示，犬科動物成熟NGF與根據本發明之包含嵌合CMV多肽之經修飾之VLP偶合的結合物在犬（目標物種）中能夠克服針對內源目標抗原的免疫耐受性且誘導NGF特異性IgG抗體。此外，此等抗體能夠有效地在試管內中和犬科動物成熟NGF活性。
無
[圖1]： 具有單切限制酶位點之pET-CMVB2-Ntt-E8*質體圖譜的描述。
[圖2A]： 對VLP純化進行的SDS-PAGE凝膠分析，該VLP來源於CMV-Ntt830-E8*的表現。M - 蛋白質尺寸標記PageRuler（Thermo Fisher Scientific，#26620）；S - 大腸桿菌C2566之細胞萃取物中的可溶性蛋白質/pET-CMVB2-Ntt-E8*；P - 細胞萃取物中的不溶性蛋白質；1 - 蔗糖梯度之後的不溶性蛋白質（管底部）；2 - 6-蔗糖梯度溶離份（管底部之60%至頂部之0%）。圖內的星號（*）表示相應CMV-Ntt830-E8*嵌合CMV多肽在SDS/PAGE凝膠中的相對位置。
[圖2B]： 經純化之CMV-Ntt830-E8* VLP的電子顯微影像。水平比例尺對應於500 nm。
[圖3]： 具有單切限制酶位點之pET-CMVB2-Ntt-E4質體圖譜的描述。
[圖4]： 具有單切限制酶位點之pET-CMVB2-Ntt-E8質體圖譜的描述。
[圖5]： 具有單切限制酶位點之pET-CMVB2-Ntt-E12質體圖譜的描述。
[圖6]： 對VLP純化進行的SDS-PAGE（左）及瓊脂糖凝膠（右）分析，該VLP來源於CMV-Ntt830-E4的表現。M1 - 蛋白質尺寸標記PageRuler（Thermo Fisher Scientific，#26620）；M2 - DNA尺寸標記（Thermo Fisher Scientific，# SM0311）；T - 在20℃下培養18小時之後，大腸桿菌C2566細胞中的總蛋白質；S - 細胞破裂之後，蔗糖梯度（20-60%）之前，細胞萃取物中的可溶性蛋白質；P - 不溶性蛋白質；1-6 - 蔗糖梯度溶離份（管底部之60%至頂部之0%）。圖內的星號（*）表示相應CMV-Ntt830-E4嵌合CMV多肽在SDS/PAGE凝膠中的相對位置及典型VLP信號在瓊脂糖凝膠中的相對位置。
[圖7]： 對VLP純化進行的SDS-PAGE（左）及瓊脂糖凝膠（右）分析，該VLP來源於CMV-Ntt830-E8的表現。M1 - 蛋白質尺寸標記PageRuler（Thermo Fisher Scientific，#26620）；M2 - DNA尺寸標記（Thermo Fisher Scientific，# SM0311）；T - 在20℃下培養18小時之後，大腸桿菌C2566細胞中的總蛋白質；S - 細胞破裂之後，蔗糖梯度（20-60%）之前，細胞萃取物中的可溶性蛋白質；P - 不溶性蛋白質；1-6 - 蔗糖梯度溶離份（管底部之60%至頂部之0%）。圖內的星號（*）表示相應CMV-Ntt830-E8嵌合CMV多肽在SDS/PAGE凝膠中的相對位置及典型VLP信號在瓊脂糖凝膠中的相對位置。
[圖8]： 對VLP純化進行的SDS-PAGE（左）及瓊脂糖凝膠（右）分析，該VLP來源於CMV-Ntt830-E12的表現。M1 - 蛋白質尺寸標記PageRuler（Thermo Fisher Scientific，#26620）；M2 - DNA尺寸標記（Thermo Fisher Scientific，# SM0311）；T - 在20℃下培養18小時之後，大腸桿菌C2566細胞中的總蛋白質；S - 細胞破裂之後，蔗糖梯度（20-60%）之前，細胞萃取物中的可溶性蛋白質；P - 不溶性蛋白質；1-6 - 蔗糖梯度溶離份（管底部之60%至頂部之0%）。圖內的星號（*）表示相應CMV-Ntt830-E12嵌合CMV多肽在SDS/PAGE凝膠中的相對位置。在瓊脂糖凝膠中未觀測到與完整VLP對應的清楚明晰譜帶。
[圖9]： 經純化之CMV-Ntt830-E4 VLP的電子顯微影像。水平比例尺對應於200 nm。
[圖10]： 經純化之CMV-Ntt830-E8 VLP的電子顯微影像。水平比例尺對應於200 nm。
[圖11]： CMV-Ntt830 VLP與CMV-Ntt830-E4 VLP之熱穩定性的比較。使用DNA解鏈溫度測定程式及即時PCR系統，監測CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP在寶石橙染料（Sypro-Orange dye）存在下的結構變化。曲線1為CMV-Ntt830-E4 VLP，曲線2為CMV-Ntt830 VLP且曲線3為緩衝液對照（5 mM磷酸鈉、2 mM EDTA，pH 7.5）。對應的57℃及51℃解鏈溫度用箭頭指示。
[圖12]： CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP在溶液中、在不同濃度之NaCl存在下的穩定性。0.5 mg/ml CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP樣品在5 mM磷酸鈉、2 mM EDTA（pH 7.5）中、在不同濃度之NaCl（各樣品中的NaCl莫耳濃度指示於凝膠底部）存在下、在室溫下培育長達2小時。藉由原生瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙錠染色來分析樣品。圖A及B分別顯示CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP樣品的NAGE分析。M顯示負載有GeneRuler 1kb DNA梯（SM0311，TFS）的泳道。黑色箭頭指示凝膠內之負載孔的位置以及各孔及凝膠內之VLP的位置。電泳之後的負載孔中存在CMV-Ntt830 VLP（圖A）係由於形成了VLP聚集體，該等聚集體太大而無法進入凝膠。未聚集的完整VLP遷移至凝膠中。
[圖13]： 對經歷陰離子交換層析之CMV-Ntt830 VLP的分析。將5 ml含有1 mg/ml CVMtt-VLP的5 mM硼酸鈉緩衝液pH 9.0負載至經5 mM硼酸鈉緩衝液平衡的1.0 ml Macro-Prep DEAE Bio-Rad陰離子交換濾筒上且在濃度遞增的NaCl（0.1、0.2、0.3、0.4。0.5、0.8、1.0及2.0 M）存在下逐步溶離。收集溶離份且藉由nanodrop 260 nm（針對蛋白質濃度）及原生瓊脂糖凝膠電泳加以分析。圖A顯示針對各別溶離份（1-25）繪製的NaCl濃度及260 nm吸光度值。B圖為含有最高蛋白質濃度之主要溶離份的NAGE分析（溴化乙錠染色）。M顯示負載有GeneRuler 1kb DNA梯（SM0311，TFS）的泳道。黑色箭頭指示凝膠內之負載孔的位置以及各孔及凝膠內之VLP的位置。電泳之後的負載孔中存在CMV-Ntt830 VLP係由於形成了VLP聚集體，該等聚集體太大而無法進入凝膠。未聚集的完整VLP遷移至凝膠中。
[圖14]： 對經歷陰離子交換層析之CMV-Ntt830-E4 VLP的分析。將表現CMV-Ntt830-E4 VLP之大腸桿菌細胞的生物質再懸浮於50 mM檸檬酸鹽、5 mM硼酸鹽緩衝液pH 9.0中，且使用微流化器LM-20溶解細胞。藉由離心澄清可溶性部分且負載至60 ml Fracto-DEAE（XK 26/20）上。以連續梯度方式施加包含50 mM檸檬酸鹽、5 mM硼酸鹽及1 M NaCl的溶離緩衝液，以將所結合的VLP溶離。圖A顯示分別藉由A260nm（mAU）及電導率（mS/cm）量測的蛋白質溶離及NaCl濃度梯度。X軸顯示溶離體積及溶離份編號（4-11）。自Fracto-DEAE管柱收集的溶離份係藉由NAGE（圖B）及SDS-PAGE（圖C）分析。在圖B中，M指示負載有GeneRuler 1kb DNA梯（SM0311，TFS）的泳道，L為負載至Fracto DEAE上之前的大腸桿菌溶解物樣品，FT為自0至150 ml收集的流過物且4-10代表溶離期間所收集的溶離份編號。黑色箭頭自上而下分別指示負載孔的位置、完整CMV-Ntt830-E4 VLP在凝膠內的位置及來自經澄清之細菌溶解物之污染核酸的位置。在圖C中，FT為自0至150 ml收集的流過物且4-10代表溶離份編號。黑色箭頭顯示庫馬斯藍（Coomassie blue）染色之CMV-Ntt830-E4外殼蛋白的位置。
[圖15A]： 重組犬科動物成熟NGF之純化及純正性。對NGF純化過程的SDS-PAGE分析。M - 標記，其譜帶分子量以kDa顯示；A - 表現之後的總細胞溶解物；B - 再摺疊及部分純化之後，含有pro-NGF的混合溶離份；C - 胰蛋白酶消化及最終純化之後的成熟NGF。箭頭指示泳道A及B中的pro-NGF及泳道C中的成熟NGF。
[圖15B]： PC12細胞與小鼠骨髓瘤細胞所產生的重組人類成熟NGF（R&D systems）（黑色方形）一起或與如本文所述之大腸桿菌所產生的犬科動物成熟NGF一起（灰色圓形）培養5天。細胞在100、50、25、12.5及6.25 ng/ml重組NGF存在下培養且測定出現所定義之神經突（neurite）過度生長之細胞的百分比。
[圖16A]： SEQ ID NO:31之重組成熟犬科動物NGF（cNGF）與CMV-Ntt830及CMV-Ntt830-E8* VLP偶合的SDS-PAGE分析。
M - PageRuler™ Plus預染色蛋白質梯，10至250 kDa（Thermo Fisher Scientific，# 26620）蛋白質尺寸標記；1 - 相應的經純化之CMV-Ntt830及CMV-Ntt830-E8* VLP；2 - 用5 x SMPH衍生化且移除SMPH的CMV之VLP；3 - 與等莫耳量之cNGF偶合的CMV之VLP；4 - CMV-Ntt830-E8*與cNGF在未發生SMPH衍生化之情況下的混合樣品；5 - 經純化之cNGF。星號表示可觀測到之CMV之VLP-NGF結合物譜帶的定位。
[圖16B]： SEQ ID NO:31之重組成熟犬科動物NGF（cNGF）與CMV-Ntt830-E4及CMV-Ntt830-E8 VLP偶合的SDS-PAGE分析。
M - PageRuler™ Plus預染色蛋白質梯，10至250 kDa（Thermo Fisher Scientific，# 26620）蛋白質尺寸標記；1 - 相應的經純化之CMV-Ntt830-E4及CMV-Ntt830-E8 VLP；2 - 用5 x SMPH衍生化且移除SMPH之後的CMV之VLP；3 - 與等莫耳量之cNGF偶合的CMV之VLP；4 - CMV-Ntt830-E4或CMV-Ntt830-E8與cNGF在不發生SMPH衍生化之情況下的混合樣品；5 - 經純化之cNGF。星號表示可觀測到之CMV之VLP-cNGF結合物譜帶的定位。
[圖16C]： cNGF-CMV-Ntt830 VLP的動態光散射分析。由於疫苗沈澱，因此無法進行EM分析。
[圖16D]： 包含SEQ ID NO:31之cNGF抗原之cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的動態光散射分析。
[圖16E]： 包含SEQ ID NO:33之cNGF抗原之cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的動態光散射分析
[圖16F]： cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP的動態光散射分析。
[圖16G]： cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的電子顯微影像。
[圖16H]： cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP的電子顯微影像。
[圖17A]： 評估小鼠血清中的抗NGF IgG抗體，該等小鼠經cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫。藉由ELISA量測小鼠的抗NGF IgG效價，該等小鼠經15 μg存在或不存在Quil A佐劑（分別為閉圓及空心圓）的cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫兩次（第0天及第14天，用箭頭指示）。
[圖17B]： 為了測試小鼠中所產生的中和IgG抗體，在12.5 ng/ml人類成熟NGF存在下（或不存在，作為陰性對照）、在所示濃度的抗人類NGF多株抗體（得自BioTechne）或經純化之IgG存在下培養PC12細胞5天，該經純化之IgG來自空白小鼠（naive mice，ms pIgG NAIVE）或經所示濃度之cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫的小鼠（來自研究第21天、第28天及第35天的混合血清，ms pIgG NGF vacc）。數據點代表樣品複本。
[圖18A]： 評估犬血清中的抗NGF IgG抗體，該等犬經cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫。接受疫苗但未接受佐劑之第1組犬的抗NGF IgG效價。箭頭指示第0天、第21天及第42天注射投予疫苗。
[圖18B]： 評估犬血清中的抗NGF IgG抗體，該等犬經cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫。接受疫苗與佐劑QuilA®之第2組3隻犬的抗NGF IgG效價。箭頭指示第0天、第21天及第42天注射投予疫苗。
[圖18C]： 評估經cNGF-CMV-Ntt830-E8*VLP免疫之犬血清的抗CMV IgG效價。接受疫苗但未接受佐劑之第1組犬的抗CMV IgG效價。箭頭指示第0天、第21天及第42天注射投予疫苗。
[圖18D]： 評估經cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫之犬血清的抗CMV IgG效價。接受疫苗與佐劑QuilA®之第2組犬的抗CMV IgG效價。箭頭指示第0天、第21天及第42天注射投予疫苗。
[圖18E]： 評估在佐劑不存在下經cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP免疫之犬血清中的抗NGF IgG抗體。5隻犬在第0天及第21天給予cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP。藉由ELISA評估第0天、第21天、第42天、第71天及第91天所收集之血清中的NGF特異性抗體。
[圖18F]： 評估在氫氧化鋁存在下經cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP免疫之犬血清中的抗NGF IgG抗體。5隻犬在第0天及第21天給予cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP與氫氧化鋁。藉由ELISA測定第0天、第21天、第42天、第71天及第91天的NGF特異性抗體。
[圖19A]： 接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP誘導犬產生NGF中和抗體。在第0天、第21天及第42天，在佐劑QuilA存在或不存在下，將250 μg cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫接種犬（3隻犬/組）。收集血清且使用基於TF-1的NGF生物活性分析來測試中和抗體的存在。一隻犬之滴定曲線圖示，以測定犬血清的中和能力及50%中和效價（NT50）。將5 ng/mL人類成熟NGF與濃度遞增的IgG一起預培育，該IgG係自疫苗首次投予之後的指定日期所收集的血清中純化。使用4PL的S形曲線擬合模型測定NT50值，亦即，對細胞增殖引起50%抑制的IgG濃度。
[圖19B]： 接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP誘導犬產生NGF中和抗體。在第0天、第21天及第42天，在佐劑QuilA存在或不存在下，將250 μg cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫接種犬（3隻犬/組）。收集血清且使用基於TF-1的NGF生物活性分析來測試中和抗體的存在。自犬血清純化總IgG。利用生物分析評估20 μg/mL經純化之總IgG中和5 ng/mL人類成熟NGF的能力。條柱代表群組平均值與標準差且符號代表個別犬（雙重複分析的平均值）。使用GraphPad Prism進行雙因子變異數分析及杜凱氏多重比較檢驗（Tukey's multiple comparisons test），以比較群組平均值。* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001。
[圖19C]： 接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP誘導犬產生成熟NGF中和抗體。在第0天、第21天及第42天，在佐劑QuilA存在或不存在下，將250 μg cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫接種犬（3隻犬/組）。收集血清且使用基於TF-1的NGF生物活性分析來測試中和抗體的存在。將NT50值相對於抗NGF IgG血清效價的OD50值作圖。自NGF特異性抗體濃度較高之血清純化的總IgG在抑制NGF介導的TF-1細胞增殖方面比自抗NGF效價較低之犬血清純化之總IgG更強。符號代表個別犬及取樣時間點。不同符號賦予不同犬。閉合的符號代表在佐劑存在下接種疫苗的動物，而空心符號代表在佐劑不存在下接種疫苗的動物。
[圖19D]： 接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP誘導犬產生NGF中和抗體。第0天及第21天，將cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP與氫氧化鋁投予5隻犬。第42天收集血清且使用基於TF-1的NGF生物活性分析來測試中和抗體的存在。條柱代表群組平均值與標準差且符號代表個別犬。點線指示分析的偵測極限。
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Claims (18)
- 一種組成物，較佳為獸醫組成物，其包含 (a) 經修飾的CMV之VLP，其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一個第一連接位點，且其中該經修飾的CMV之VLP包含至少一種嵌合CMV多肽，其中該至少一種嵌合CMV多肽包含以下者、較佳由以下者組成 (i) CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及 (ii) 包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由一段連續的帶負電胺基酸組成的多肽，其中所述帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該多肽係插入在該CMV多肽的任何對應於SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基的胺基酸殘基之間， (b) 至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二連接位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）；並且 其中(a)與(b)透過該至少一個第一連接位點及該至少一個第二連接位點經由至少一個非肽共價鍵連接。
- 如請求項1之組成物，其中該嵌合CMV多肽進一步包含輔助性T細胞抗原決定基，其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區域，其中該CMV多肽的該N端區域對應於SEQ ID NO:39的胺基酸2至12。
- 如請求項2之組成物，其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，且其中較佳地，該Th細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之CMV組成物，其中該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之組成物，其中該CMV多肽包含SEQ ID NO:5的胺基酸序列，較佳由SEQ ID NO:5的胺基酸序列組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽係插入在該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。
- 如前述請求項中任一項之CMV組成物，其中該段連續的帶負電胺基酸具有3至10個胺基酸的長度。
- 如前述請求項中任一項之CMV組成物，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。
- 如前述請求項中任一項之CMV組成物，其中包含該段連續的帶負電胺基酸的該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自由以下者組成之群： (a.) 聚甘胺酸連接子（G連接子），其具有長度n=2-10的胺基酸序列(Gly) n； (b.) 甘胺酸-絲胺酸連接子（GS連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS) r(G sS) t(GS) u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；及 (c.) 胺基酸連接子（GS*連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。
- 如前述請求項中任一項之組成物，其中該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51，較佳由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成。
- 如請求項1之組成物，其中該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的胺基酸序列，較佳由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的胺基酸序列組成。
- 如前述請求項中任一項之組成物，其中該至少一個第一連接位點並未包含在包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽中，或並非包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽的一部分。
- 如前述請求項中任一項之組成物，其中該第一連接位點為胺基，較佳為離胺酸殘基的胺基，且其中該至少一個第二連接位點為氫硫基（sulfhydryl group），較佳為半胱胺酸殘基的氫硫基。
- 如前述請求項中任一項之組成物，其中該抗原係選自犬科動物NGF（cNGF）、貓科動物NGF（fNGF）、馬科動物NGF（eNGF）、牛科動物NGF（bNGF）及豬科動物NGF（pNGF），其中較佳地，該抗原為犬科動物NGF（cNGF）或貓科動物NGF（fNGF），且其中更佳地，該抗原為犬科動物NGF（cNGF）。
- 如前述請求項中任一項之組成物，該抗原包含以下者或較佳由以下者組成：選自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者具有至少90%、較佳至少95%序列一致性的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之組成物，該抗原包含以下者或較佳由以下者組成：選自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:55中之任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:55中之任一者具有至少90%、較佳至少95%序列一致性的胺基酸序列。
- 一種如前述請求項中任一項之組成物，其用於在動物中誘導針對NGF之中和抗體的方法。
- 如請求項16所使用的組成物，其中該動物為犬科動物。
- 如請求項16所使用的組成物，其中該動物為貓科動物。
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