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TW202417481A - 人類cd33抗體及糖皮質激素結合物 - Google Patents

人類cd33抗體及糖皮質激素結合物 Download PDF

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TW202417481A
TW202417481A TW112123456A TW112123456A TW202417481A TW 202417481 A TW202417481 A TW 202417481A TW 112123456 A TW112123456 A TW 112123456A TW 112123456 A TW112123456 A TW 112123456A TW 202417481 A TW202417481 A TW 202417481A
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約司華 雷恩 可雷頓
羅斯 愛德華 費洛斯
波 馬
唐鷹
賈桂林 瑪莉 伍爾斯特
皮埃 亞奇
喬雯 楊
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美商美國禮來大藥廠
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Abstract

本發明提供人類CD33抗體及抗體糖皮質激素受體促效劑結合物，以及使用該等結合物治療骨髓細胞相關之疾病之方法。

Description

人類CD33抗體及糖皮質激素結合物
本發明提供人類CD33抗體及抗體糖皮質激素受體促效劑結合物、使用該等結合物用於治療骨髓細胞相關之疾病之方法、用於製備該等結合物之方法以及包含人類CD33抗體糖皮質激素結合物之醫藥組合物。
先前已描述抗人類CD33抗體及結合物。許多抗體為調節CD33介導之反應的骨髓細胞耗乏性抗體。舉例而言，林妥珠單抗(lintuzumab)為一種人源化抗體，據報導其經由ADCC及CDC活性耗乏骨髓細胞且調節CD33介導之細胞介素反應，由於缺乏功效而終止作為AML中之單一療法；他立林-伐達妥昔單抗(vadastuximab talirine)為一種林妥珠單抗結合物，其由於安全性問題而被終止且林妥珠單抗Ac225當前處於AML中之I/II期中。(Perl, A., Hematology Am Soc Hematol Educ Program., (1):54-65, 2017；Bothell, Wash. (BUSINESS WIRE)., 6月19日, 2017；Abedin, S., Blood., 136(Supplement 1): 9-10, 2020)。其他此類抗人類CD33抗體療法包括BI 836858，其在I期AML研究中未能展示臨床活性但正在與AML中之其他化合物組合評估；IMGN779，其當前處於AML中之I期試驗中；及吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，其為唯一經批准之用於治療AML的抗人類CD33抗體結合物。(Vasu S等人, Haematologica., 107(3):770-773, 2022；Mol. Cancer Ther., 17(6):1271-1279, 2018)。AL003為據報導調節CD33介導之反應的人源化CD33抗體，其係在用於治療阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)之II期試驗中。(Alector, Inc., GlobeNewswire, 11月10日, 2021)。
WO2017/210471揭示適用於治療發炎性疾病之某些糖皮質激素受體促效劑(GC)及其免疫結合物。WO2018/089373揭示新穎類固醇、其蛋白質結合物以及用於治療疾病、病症及病狀之方法，該等方法包含投與該等類固醇及結合物。迄今為止，尚無經批准之用於治療包括骨髓細胞相關之疾病的疾病的人類CD33 GC結合物。
本發明提供結合人類CD33、不耗乏骨髓細胞(「非耗乏性抗人類CD33抗體」)、內化至骨髓細胞中、不調節CD33介導之反應(例如細胞介素表現、發炎反應)且不會顯著降解CD33 (「非降解性抗人類CD33抗體」)的某些新穎的完全人類CD33抗體。本發明進一步提供包含此類抗人類CD33抗體之組合物及使用此類抗人類CD33抗體及組合物之方法。此類抗人類CD33抗體可與治療劑(例如發炎劑、糖皮質激素、細胞毒性劑、siRNA、saRNA、肽、小分子、抗體及其結合片段)結合以用於將治療劑靶向遞送至表現人類CD33之骨髓細胞中以治療骨髓細胞相關之疾病。此外，本發明之某些抗人類CD33抗體不會顯著影響細胞表面上CD33受體之可用性，且因此可將治療劑重複CD33靶向遞送至骨髓細胞中。本發明進一步提供某些新穎的完全人類CD33抗體糖皮質激素(GC)結合物，其中抗體結合於人類CD33。本發明進一步提供包含新穎抗人類CD33抗體GC結合物之組合物及使用此類抗人類CD33抗體GC結合物及其組合物之方法。本發明進一步提供某些新穎的抗人類CD33 GC結合物，其適用於治療類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、異位性皮膚炎、牛皮癬、發炎性腸道疾病、多發性硬化症、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、纖維化疾病(諸如硬皮病)及巨噬細胞活化症候群。因此，本文所提供之某些抗人類CD33抗體及/或抗人類CD33抗體GC結合物具有以下特性中之一或多者：1)以理想的結合親和力及/或結合速率及解離速率結合人類CD33及石蟹獼猴(cynomolgus monkey) CD33，2)在結合於CD33時內化至骨髓細胞中，3)不耗乏骨髓細胞，4)不會引起效應功能活性(例如ADCC)，5)不會降解細胞表面或細胞內CD33，6)不會顯著影響骨髓細胞上CD33細胞表面受體之可用性，7)活體外調節糖皮質激素受體促效劑介導之細胞介素反應(例如抑制IL-6及TNFα)，8)活體內調節靶特異性糖皮質激素受體促效劑介導之反應(例如抑制靶部位特異性組織炎症及基因表現，例如FKBP5)，9)低免疫原性風險，10)活體外抑制漿細胞樣樹突狀細胞分化及IFNα產生，及/或11)良好的可開發性特徵，例如可接受之穩定性、溶解度、黏度、低聚集性、疏水性及/或良好的藥物動力學特徵以促進開發、製造及/或調配。
因此，在一些實施例中，本文提供一種結合人類CD33之抗體(「抗人類CD33抗體」)，其中抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 3，LCDR1包含SEQ ID NO: 4，LCDR2包含SEQ ID NO: 5且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 7之VH及包含SEQ ID NO: 8之VL。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 9之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈(LC)。
在一些實施例中，本文提供一種結合人類CD33之抗體，其中抗體包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 3，LCDR1包含SEQ ID NO: 13，LCDR2包含SEQ ID NO: 5且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 7之VH及包含SEQ ID NO: 14之VL。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 9之HC及包含SEQ ID NO: 15之LC。
在一些實施例中，本文提供一種結合人類CD33之抗體，其中抗體包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 3，LCDR1包含SEQ ID NO: 26，LCDR2包含SEQ ID NO: 5且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在此類實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 7之VH及包含SEQ ID NO: 8或14之VL。在其他實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 9之HC及包含SEQ ID NO: 10或15之LC。
在一些實施例中，本文提供一種結合人類CD33之抗體，其中抗體包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 17，LCDR1包含SEQ ID NO: 18，LCDR2包含SEQ ID NO: 5且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之VH及包含SEQ ID NO: 20之VL。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 21之HC及包含SEQ ID NO: 22之LC。
在一些實施例中，抗人類CD33抗體為完全人類抗體。在一些實施例中，抗人類CD33抗體為內化抗體。在其他實施例中，抗人類CD33抗體具有人類IgG1或人類IgG4同型。
在其他實施例中，抗人類CD33抗體具有經修飾之人類IgG1 Fc區，該人類IgG1 Fc區包含L234A、L235A及P329A (EU編號)，亦稱為IgG1AAA，其已減少或消除與Fcγ受體及C1q受體之結合。在此類實施例中，具有IgG1AAA修飾之Fc區的抗人類CD33抗體具有降低或消除之Fc效應功能活性，諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC) (所有殘基根據EU編號而編號)。此類抗體稱為「IgG1-效應子無效型(IgG1-effector null)」抗體。在此類實施例中，具有IgG1AAA修飾之Fc區的抗人類CD33抗體不耗乏表現CD33之細胞(例如骨髓細胞)。在此類實施例中，抗人類CD33抗體為非耗乏性抗體。在其他實施例中，具有IgG1AAA主鏈之抗人類CD33抗體在與IgG1相比時顯著減少及/或消除CD33受體之降解。在此類實施例中，抗人類CD33抗體為非降解性抗體。
在一些實施例中，本文提供結合人類CD33之抗體片段(例如Fab或scFv)，其中抗體片段包含VH及VL，其中VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 3，LCDR1包含SEQ ID NO: 4，LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 7之VH及包含SEQ ID NO: 8之VL。
在一些實施例中，本文提供結合人類CD33之抗體片段(例如Fab或scFv)，其中抗體片段包含VH及VL，其中VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 3，LCDR1包含SEQ ID NO: 13，LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 7之VH及包含SEQ ID NO: 14之VL。
在一些實施例中，本文提供結合人類CD33之抗體片段(例如Fab或scFv)，其中抗體片段包含VH及VL，其中VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 17，LCDR1包含SEQ ID NO: 18，LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，抗人類CD33抗體包含有包含SEQ ID NO: 19之VH及包含SEQ ID NO: 20之VL。
在一些實施例中，抗人類CD33抗體具有經修飾之人類IgG1或人類IgG4恆定域，該恆定域包含經工程改造之半胱胺酸殘基以用於產生抗體結合物化合物(亦稱為生物結合物) (參見WO 2018/232088 Al)。更特定言之，在此類實施例中，抗人類CD33抗體包含胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸，或胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸；或胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸及胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸。
在一些實施例中，本發明提供編碼結合抗人類CD33之新穎抗體之HC或LC或VH或VL的核酸，或包含此類核酸之載體。
在一些實施例中，本發明提供包含SEQ ID NO: 11、12、16、23或24之序列的核酸。
在一些實施例中，提供編碼結合抗人類CD33之抗體之重鏈或輕鏈的核酸。在一些實施例中，提供包含編碼SEQ ID NO: 9、10、15、21或22之序列的核酸。在一些實施例中，提供包含編碼抗體重鏈之序列的核酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 9或21。舉例而言，核酸可包含SEQ ID NO: 11或23之序列。在一些實施例中，提供包含編碼抗體輕鏈之序列的核酸，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 10、15或22。舉例而言，核酸可包含SEQ ID NO: 12、16或24之序列。
在本發明之一些實施例中，提供編碼抗人類CD33抗體之VH或VL的核酸。在一些實施例中，提供包含編碼SEQ ID NO: 7、8、14、19或20之序列的核酸。在一些實施例中，提供包含編碼抗體VH之序列的核酸，該抗體VH包含SEQ ID NO: 7或19。在一些實施例中，提供包含編碼抗體VL之序列的核酸，該抗體VL包含SEQ ID NO: 8、14或20。
本發明之一些實施例提供包含編碼抗體重鏈或輕鏈之核酸序列的載體。舉例而言，此類載體可包含編碼SEQ ID NO: 9或21之核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 10、15或22之核酸序列。
本文亦提供包含編碼抗體VH或VL之核酸序列的載體。舉例而言，此類載體可包含編碼SEQ ID NO: 7或19之核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 8、14或20之核酸序列。
本文亦提供包含編碼抗體重鏈之第一核酸序列及編碼抗體輕鏈之第二核酸序列的載體。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 9或21之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、15或22之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 9之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 9之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 15之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 21之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 22之第二核酸序列。
本文亦提供包含第一載體及第二載體之組合物，該第一載體包含編碼抗體重鏈之核酸序列，該第二載體包含編碼抗體輕鏈之核酸序列。在一些實施例中，組合物包含第一載體，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 9或21之核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、15或22之第二核酸序列。在一些實施例中，組合物包含第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 9之核酸序列，該第二載體包含編碼SEQ ID NO: 10之核酸序列。在一些實施例中，組合物包含第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 9之核酸序列，該第二載體包含編碼SEQ ID NO: 15之核酸序列。在一些實施例中，組合物包含第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 21之核酸序列，該第二載體包含編碼SEQ ID NO: 22之核酸序列。
本文亦提供包含載體之組合物，該載體包含編碼抗體重鏈之核酸序列及編碼抗體輕鏈之核酸序列。在一些實施例中，組合物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 9或21之核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、15或22之第二核酸序列。
本發明之核酸可例如在核酸已可操作地連接至表現控制序列之後在宿主細胞中表現。能夠表現與其可操作地連接之核酸的表現控制序列為此項技術中熟知的。表現載體可包括編碼一或多個信號肽之序列，該一或多個信號肽促進一或多個多肽自宿主細胞分泌。含有所關注之核酸(例如編碼抗體之重鏈或輕鏈之核酸)的表現載體可藉由熟知方法(例如穩定或短暫之轉染、轉型、轉導或感染)轉移至宿主細胞中。另外，表現載體可含有一或多種選擇標記物(例如四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶)以輔助偵測經所需核酸序列轉型之宿主細胞。
在另一態樣中，本文提供包含本文所描述之核酸、載體或核酸組合物之細胞，例如宿主細胞。宿主細胞可為經表現本文所描述之抗體之全部或一部分的一或多種表現載體穩定或短暫地轉染、轉型、轉導或感染的細胞。在一些實施例中，宿主細胞可經表現本發明抗體之HC及LC多肽的表現載體穩定或短暫地轉染、轉型、轉導或感染。在一些實施例中，宿主細胞可經表現本文所描述之抗體之HC多肽的第一載體及表現本文所描述之抗體之LC多肽的第二載體穩定或短暫地轉染、轉型、轉導或感染。此類宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞可表現結合如本文所描述之抗人類CD33之抗體。已知能夠表現抗體之哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞、HEK293細胞、COS細胞及NS0細胞。
在一些實施例中，例如宿主細胞之細胞包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 9或21之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、15或22之第二核酸序列。
在一些實施例中，例如宿主細胞之細胞包含第一載體及第二載體，該第一載體包含編碼SEQ ID NO: 9或21之核酸序列，該第二載體包含編碼SEQ ID NO: 10、15或22之核酸序列。
在一些實施例中，例如宿主細胞之細胞包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 9或21之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、15或22之第二核酸序列。在一些實施例中，例如宿主細胞之細胞包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 9之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10之第二核酸序列。在一些實施例中，例如宿主細胞之細胞包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 9之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 15之第二核酸序列。在一些實施例中，例如宿主細胞之細胞包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 21之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 22之第二核酸序列。
本發明進一步提供一種產生結合本文所描述之人類CD33之抗體的方法，其藉由在表現抗體之條件下培養上文所描述之宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)及自培養基回收經表現之抗體來進行。可藉由習知技術純化其中已分泌抗體之培養基。可採用各種蛋白質純化方法，且此類方法為此項技術中已知的且描述於例如Deutscher，Method in Enzymology 182:83-89 (1990)及Scopes，Protein Purification:Principles and Practice，第3版，Springer，NY(1994)中。
本發明進一步提供藉由任何本文中所描述之方法所產生之抗體或其抗原結合片段。
在另一態樣中，本文提供包含本文所描述之抗體、核酸或載體之醫藥組合物。此類醫藥組合物亦可包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。醫藥組合物可藉由此項技術中熟知之方法(例如 Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 第22版(2012), A. Loyd等人, Pharmaceutical Press)製備。
鑒於本文所描述之抗人類CD33抗體不耗乏骨髓細胞，故其在治療骨髓細胞相關免疫疾病方面提供優於耗乏骨髓細胞之抗體的優勢，例如避免有問題的併發性免疫功能不全、長期免疫抑制、由骨髓細胞耗乏引起之其他併發症及增強/誘發表現CD33之骨髓細胞之免疫調節功能。此外，如下文所示，本文所描述之抗人類CD33抗體內化至骨髓細胞中。因此，本文所描述之抗人類CD33抗體可與治療劑結合以將治療劑靶向遞送至人類骨髓細胞中以藉由治療劑引發免疫調節或其他治療效果，從而治療骨髓細胞相關之疾病。此外，本文所描述之抗人類CD33抗體不會顯著降解細胞表面或細胞內CD33，亦不會顯著影響細胞表面上CD33受體之可用性，且因此，本文所描述之抗人類CD33抗體可將治療劑重複CD33靶向遞送至骨髓細胞中以用於治療骨髓細胞相關之疾病。
在一些實施例中，本文提供治療有需要之個體(例如人類患者)中之骨髓細胞相關之疾病(例如免疫疾病、神經退化性疾病或骨髓細胞相關癌症)的方法，其係藉由向個體投與有效量之與治療劑結合的抗人類CD33抗體或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明提供一種與本文所揭示之治療劑結合的抗人類CD33抗體或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於療法中。在一個實施例中，本發明提供一種與本文所揭示之治療劑結合的抗人類CD33抗體或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療骨髓細胞相關之疾病。在一個實施例中，本發明提供與本文所揭示之治療劑結合的抗人類CD33抗體或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療骨髓細胞相關之疾病之藥劑。本文所描述之結合物、核酸、載體或醫藥組合物可藉由非經腸途徑(例如皮下及靜脈內)投與。在一些實施例中，本發明提供一種將治療劑遞送至表現CD33之骨髓細胞中以治療骨髓細胞相關之疾病的方法，其中治療劑與本發明之抗人類CD33抗體結合，其中治療劑引發免疫調節或其他治療效果。
因此，在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物： 其中Ab為結合人類CD33之抗體(「抗人類CD33抗體」)，其中 為： ， 且n為1至5。
在另一實施例中，本發明提供一種式I之結合物： 其中Ab為抗人類CD33，其中Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3或17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、13、18或26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6； 其中 為： ， 且n為1至5。
在另一實施例中，本發明提供一種式I之結合物： 其中Ab為抗人類CD33抗體，其中Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3或17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、13、18或26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6； 其中 為： ， 且n為1至5。
在另一實施例中，本發明提供一種式I之結合物： 其中Ab為抗人類CD33抗體，其中Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3或17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、13、18或26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6； 其中 為： ， 且n為1至5。
在另一實施例中，本發明提供一種式I之結合物： 其中Ab為抗人類CD33抗體，其中Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3或17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、13、18或26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6； 其中 為： ， 且n為1至5。
在另一實施例中，本發明提供一種式I之結合物： 其中Ab為抗人類CD33抗體，其中Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3或17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、13、18或26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6； 其中 為： ， 且n為1至5。
在另一實施例中，本發明提供一種式I之結合物： 其中Ab為抗人類CD33抗體，其中Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3或17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、13、18或26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6； 其中 為： ， 且n為1至5。
在另一實施例中，本發明提供一種式I之結合物： 其中Ab為抗人類CD33抗體，其中Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3或17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、13、18或26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6； 其中 為： ， 且n為1至5。
在一個實施例中，n為2至5。
在一個實施例中，n為3至5。
在一個實施例中，n為3至4。
在一個實施例中，n為4。
在一個實施例中，n為3。
在一個實施例中，n為2。
在一些實施例中，式1之結合物中之Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 3，LCDR1包含SEQ ID NO: 4，LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，Ab包含有包含SEQ ID NO: 7之VH及包含SEQ ID NO: 8之VL。在一些實施例中，Ab為Ab2，其中Ab2包含有包含SEQ ID NO: 9之HC及包含SEQ ID NO: 10之LC。
在一些實施例中，式1之結合物中之Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 3，LCDR1包含SEQ ID NO: 13，LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，Ab包含有包含SEQ ID NO: 7之VH及包含SEQ ID NO: 14之VL。在一些實施例中，Ab為Ab3，其中Ab3包含有包含SEQ ID NO: 9之HC及包含SEQ ID NO: 15之LC。
在一些實施例中，式1之結合物中之Ab包含VH及VL，其中VH包含重鏈互補決定區(HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且VL包含輕鏈互補決定區(LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 1，HCDR2包含SEQ ID NO: 2，HCDR3包含SEQ ID NO: 17，LCDR1包含SEQ ID NO: 18，LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，Ab包含有包含SEQ ID NO: 19之VH及包含SEQ ID NO: 20之VL。在一些實施例中，Ab為Ab1，其中Ab1包含有包含SEQ ID NO: 21之HC及包含SEQ ID NO: 22之LC。
如本文所用，下式中之「GC」： 係指適合之糖皮質激素受體促效劑有效負載，其中GC為下式IIa、IIb或IIc中之一者： ， ，及 。
如本文所用，下式中之「L」 係指將Ab連接至GC之適合連接子基團。一般技術者已知之適合連接子包括例如可裂解連接子及不可裂解連接子。更特定言之，適合連接子「L」為以下式IIIa至IIIf中之一者： ， ， ， ， ，及 。
在一個實施例中，本發明提供一種式IV之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： . 。
在一個實施例中，本發明提供一種式IVa之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一個實施例中，本發明提供一種式IVb之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一個實施例中，本發明提供式一種式IVc之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一個實施例中，本發明提供一種式IVd之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一個實施例中，本發明提供一種式V之結合物： 。
在另一實施例中，本發明提供一種式Va之結合物： 。
在一些實施例中，式I之結合物調節CD33靶特異性糖皮質激素受體促效劑介導之反應。在此類實施例中，式I之結合物調節CD33靶特異性糖皮質激素受體促效劑介導之反應，諸如發炎反應、細胞介素表現及/或糖皮質激素受體促效劑介導之基因表現。
由於骨髓細胞在調節免疫反應中之關鍵作用，骨髓細胞之失調係與多種骨髓細胞相關之免疫疾病相關聯，包括自體免疫性/發炎性疾病，該等疾病係由骨髓細胞及淋巴細胞之異常活化(促發炎細胞介素增加)所引起。骨髓細胞相關之免疫疾病之實例包括類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、巨大細胞動脈炎、風濕性多肌痛、牛皮癬性關節炎、異位性皮膚炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、皮肌炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、休格連氏症候群、巨噬細胞活化症候群及纖維化疾病(諸如硬皮病)。
在一個實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體中之骨髓細胞相關之疾病的方法，其包含向個體(例如人類患者)投與有效量之包含與本文所揭示之治療劑結合之抗人類CD33抗體的結合物，例如式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病、神經退化性疾病或癌症。在某些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病，例如類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、巨大細胞動脈炎、風濕性多肌痛、牛皮癬性關節炎、異位性皮膚炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、皮肌炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、休格連氏症候群、巨噬細胞活化症候群或纖維化疾病(諸如硬皮病)。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之類風濕性關節炎的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之全身性紅斑性狼瘡症的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之狼瘡性腎炎的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之皮膚狼瘡的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之巨大細胞動脈炎的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之風濕性多肌痛的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之牛皮癬性關節炎的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之異位性皮膚炎的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之牛皮癬的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之潰瘍性結腸炎的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之克羅恩氏病的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之皮肌炎的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之幼年特發性關節炎的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之多發性硬化症的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之休格連氏症候群的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之巨噬細胞活化症候群的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之纖維化疾病(諸如硬皮病)的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為神經退化性疾病(例如阿茲海默氏病)。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之阿茲海默氏病的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為骨髓細胞相關癌症(例如AML)。在一個實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體中之AML的方法，其包含向個體投與有效量之式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在一個實施例中，本發明進一步提供一種包含與本文所揭示之治療劑結合之抗人類CD33抗體的結合物(例如式I之結合物)或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於療法中。在一個實施例中，本發明提供一種包含與本文所揭示之治療劑結合之抗人類CD33抗體的結合物(例如式I之結合物)或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療骨髓細胞相關之疾病。在某些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病、神經退化性疾病或癌症。在某些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病，例如類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、巨大細胞動脈炎、風濕性多肌痛、牛皮癬性關節炎、異位性皮膚炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、皮肌炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、休格連氏症候群、巨噬細胞活化症候群及纖維化疾病(諸如硬皮病)。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療類風濕性關節炎。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療全身性紅斑性狼瘡症。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療狼瘡性腎炎。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療皮膚狼瘡。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療巨大細胞動脈炎。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療風濕性多肌痛。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療牛皮癬性關節炎。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療異位性皮膚炎。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療牛皮癬。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療潰瘍性結腸炎。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療克羅恩氏病。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療皮肌炎。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療幼年特發性關節炎。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療多發性硬化症。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療休格連氏症候群。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療巨噬細胞活化症候群。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療纖維化疾病(諸如硬皮病)。在一些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為神經退化性疾病(例如阿茲海默氏病)。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療阿茲海默氏病。在一些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為骨髓細胞相關癌症(例如AML)。在一個實施例中，本發明提供一種式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療AML。
在一個實施例中，本發明亦提供包含與本文所揭示之治療劑結合之抗人類CD33抗體的結合物(例如式I之結合物)或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療骨髓細胞相關之疾病之藥劑。在某些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病、神經退化性疾病或癌症。在某些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病，例如類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、巨大細胞動脈炎、風濕性多肌痛、牛皮癬性關節炎、異位性皮膚炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、皮肌炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、休格連氏症候群、巨噬細胞活化症候群及纖維化疾病(諸如硬皮病)。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療類風濕性關節炎之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療全身性紅斑性狼瘡症之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療狼瘡性腎炎之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療皮膚狼瘡之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療巨大細胞動脈炎之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療風濕性多肌痛之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療牛皮癬性關節炎之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療異位性皮膚炎之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療牛皮癬之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療潰瘍性結腸炎之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療克羅恩氏病之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療皮肌炎之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療幼年特發性關節炎之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療多發性硬化症之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療休格連氏症候群之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療巨噬細胞活化症候群之藥劑。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療纖維化疾病(諸如硬皮病)之藥劑。在一些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為神經退化性疾病(例如阿茲海默氏病)。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療阿茲海默氏病之藥劑。在一些實施例中，骨髓細胞相關之疾病為骨髓細胞相關癌症(例如AML)。在一個實施例中，本發明提供式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療AML之藥劑。
本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使本發明之化合物與抗人類CD33抗體結合。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使本發明之化合物與抗人類CD33抗體或其抗原結合片段結合。
本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IV之化合物與抗人類CD33抗體結合。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IVa之化合物與抗人類CD33抗體結合。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IVb之化合物與抗人類CD33抗體結合。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IVc之化合物與抗人類CD33抗體結合。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IVd之化合物與抗人類CD33抗體結合。
在一些實施例中，產生之結合物為式I之結合物。
本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含以下步驟： (a) 用還原劑還原抗人類CD33抗體以產生經還原之抗人類CD33抗體，其中該抗人類CD33抗體包含一或多個經工程改造之半胱胺酸殘基； (b) 用氧化劑氧化該經還原之抗人類CD33抗體以產生經氧化之抗人類CD33抗體；及 (c) 使該經氧化之抗人類CD33抗體與本發明之化合物接觸以產生結合物。
本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含以下步驟： (a) 用還原劑還原抗人類CD33抗體以產生經還原之抗人類CD33抗體，其中該抗人類CD33抗體包含一或多個經工程改造之半胱胺酸殘基； (b) 用氧化劑氧化該經還原之抗人類CD33抗體以產生經氧化之抗人類CD33抗體；及 (c) 使該經氧化之抗人類CD33抗體與具有下式之化合物接觸 以產生該結合物。
在一些實施例中，還原劑為二硫蘇糖醇。在一些實施例中，氧化劑為去氫抗壞血酸。在一些實施例中，還原劑為二硫蘇糖醇且氧化劑為去氫抗壞血酸。
在一個實施例中，本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含與本文所揭示之治療劑結合的抗人類CD33抗體或其醫藥學上可接受之鹽或本文所描述之抗體、核酸或載體以及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一個實施例中，本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一個實施例中，本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含式I之結合物及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一個實施例中，本發明進一步提供一種製備醫藥組合物之方法，其包含將式I之結合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑摻合。在一個實施例中，本發明亦涵蓋用於合成式I之結合物的新穎中間物及方法。
本申請案根據35 U.S.C. §119(e)主張2022年6月22日申請之美國臨時申請案第63/354,445號之權利；其揭示內容以引用之方式併入本文中。
除非另外陳述，否則如本文所用之術語「CD33」或「CD33受體」係指人類骨髓細胞表面抗原CD33 (亦稱為唾液酸結合Ig樣凝集素3、SIGLEC-3、SIGLEC3 FLJ00391或p67)，其屬於免疫球蛋白超家族唾液酸結合Ig樣凝集素(SIGLEC)家族。該術語亦包括天然存在之CD33之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。人類CD33之胺基酸序列為此項技術中已知的，例如NCBI參考序列XP_011525833.1 (SEQ ID NO: 25)。石蟹獼猴CD33之胺基酸序列為此項技術中已知的，例如序列XP_045235686.1 (SEQ ID NO: 27)。本文所用之術語「CD33」統指所有已知之人類CD33同功異型物及多晶型形式。
如本文所用，術語「骨髓細胞相關之疾病」係指與表現CD33之骨髓細胞相關之疾病。此類骨髓細胞相關之疾病可例如包括免疫疾病、神經退化性疾病或骨髓細胞相關之癌症。骨髓細胞相關之免疫疾病可為例如類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、巨大細胞動脈炎、風濕性多肌痛、牛皮癬性關節炎、異位性皮膚炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、皮肌炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、休格連氏症候群、巨噬細胞活化症候群或纖維化疾病(諸如硬皮病)。骨髓細胞相關之神經退化性疾病可為例如阿茲海默氏病。骨髓細胞相關之癌症可為例如急性骨髓性白血病(AML)。
如本文所用，術語「抗體」係指結合抗原之免疫球蛋白分子。抗體之實施例包括單株抗體、多株抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性或多特異性抗體，或結合抗體。抗體可具有任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)及任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。本發明之實施例亦包括抗體片段或抗原結合片段，術語「抗體片段或抗原結合片段」包含保持與抗原相互作用之能力的抗體之至少一部分，該抗原諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、scFab、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、Fd片段或線性抗體，其可例如融合至Fc區或IgG重鏈恆定區。
例示性抗體為免疫球蛋白G (IgG)型抗體，其包含四條多肽鏈：經由鏈間二硫鍵交聯之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)。四條多肽鏈中之各者之胺基端部分包括具有約100至125個或更多個胺基酸之主要負責抗原識別的可變區。四條多肽鏈中之各者之羧基端部分含有主要負責效應功能的恆定區。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區係指抗體之包含抗體重鏈之Fc區及CH1域的區。各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區。IgG同型可進一步分為子類(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。恆定區中之胺基酸殘基之編號係基於如Kabat中之EU索引。Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Bethesda, MD：U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991)。術語EU索引編號或EU編號在本文中可互換使用。
VH區及VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間穿插有稱為構架區(FR)之更保守的區。CDR暴露於蛋白質之表面上且為抗體實現抗原結合特異性的重要區。各VH及VL係由自胺基端至羧基端按以下次序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重鏈之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」且輕鏈之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有與抗原形成特異性相互作用之大部分殘基。將胺基酸殘基分配至CDR可根據熟知流程進行，包括描述於以下中之流程：Kabat (Kabat等人, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))、Chothia (Chothia等人, 「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987))；Al-Lazikani等人, 「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))、North (North等人, 「A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations」, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))，或IMGT (可在www.imgt.org獲取國際免疫遺傳學資料庫(international ImMunoGeneTics database)；參見Lefranc等人, Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212)。North CDR定義係用於如本文所描述之例示性抗人類CD33抗體。
本發明之抗體之例示性實施例亦包括抗體片段或抗原結合片段，其包含保持與抗原特異性相互作用之能力的抗體之至少一部分，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、scFab、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、Fd片段或線性抗體，其可例如融合至Fc區或IgG重鏈恆定區。
如本文所用，術語「Fc區」係指抗體之包含抗體重鏈之CH2域及CH3域的區。視情況地，Fc區可包括抗體重鏈之鉸鏈區的一部分或整個鉸鏈區。諸如效應功能之生物活性可歸因於Fc區，其隨抗體同型變化。抗體效應功能之實例包括：Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)、C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。
術語「Fc受體」或「FcR」描述與抗體之Fc區結合的受體。在一些實施例中，FcR為天然序列人類FcR。「Fc γ受體」或「FcγR」為結合IgG抗體之FcR且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其具有主要在其細胞質域方面不同之胺基酸序列。FcR在Ravetch及Kinet, Ann . Rev . Immunol., 9:457-92 (1991)；25 Capel等人, Immunomethods, 4:25-34 (1994)；及de Haas等人, J . Lab . Clin . Med., 126:330-41 (1995)中綜述。
如本文所用，術語「非耗乏性抗體」係指與治療之前的骨髓細胞數目相比，在治療後個體中不顯著減少表現CD33之細胞(例如骨髓細胞)數目的抗體。骨髓細胞數目及活力可使用熟知分析法(諸如錐蟲藍染色細胞計數器及Vi-細胞計數器)量測。非耗乏性抗體通常不誘發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)或骨髓細胞之細胞凋亡。
如本文所用，術語「受體可用性」係指細胞表面上之CD33受體表現。CD33細胞表面受體表現可指CD33受體在細胞表面上及/或CD33受體之重新表現，該CD33受體內化後再循環至細胞表面。
如本文所用，術語「非降解性抗體」係指不顯著降低細胞表面上之CD33受體表現及/或不顯著減少細胞內(內化)CD33的抗體。舉例而言，如本文所用，非降解性CD33抗體不會顯著影響受體可用性。
如本文所用，術語「調節」及其類似術語係指改變或變換可量測值且包括向上改變或變換此類可量測值(亦即，上調(upmodulate)或上調(upmodulating))或向下改變或變換此類可量測值(亦即，下調(downmodulate)或下調(downmodulating))。
除非另外指示，否則如本文所用之術語「結合(bind)」及「結合(binds)」欲意謂蛋白質或分子與另一蛋白質或分子形成化學鍵或吸引相互作用之能力，此導致藉由此項技術中已知之常用方法所測定之兩種蛋白質或分子接近。
如本文所用，術語「治療劑」係指治療組合物，諸如抗炎劑、糖皮質激素、細胞毒性劑、siRNA、saRNA、肽、寡核苷酸、小分子、奈米粒子、脂質奈米粒子、胞外體、抗體或其片段或其組合，其可與本文所揭示之抗人類CD33抗體結合以形成結合物(例如抗體藥物結合物)。在一些實施例中，此類結合物藉由如本文所揭示之抗人類CD33抗體特異性靶向骨髓細胞上之CD33受體及隨後將治療劑遞送至骨髓細胞中來引發免疫調節或其他治療效果，以用於治療骨髓細胞相關之疾病。
此外，治療劑可以多種方式及在抗體之不同位置或部分與本文所揭示之抗人類CD33抗體結合，使得此類鍵聯不干擾抗體與CD33受體之結合，且在結合時不干擾治療劑之治療特性。如本文中可互換使用之術語「鏈接」及「結合」係指第一分子或化合物(例如抗體或其片段)與第二分子或化合物(例如如本文所描述之治療劑)結合、附接、連接、共價鏈接或連接或以其他方式接合。
如本文所用，術語「核酸」係指核苷酸之聚合物，包括含有單股及/或雙股核苷酸之分子，諸如併入天然、經修飾之核苷酸及/或核苷酸之類似物的DNA、cDNA及RNA分子。本發明之聚核苷酸亦可包括例如藉由DNA或RNA聚合酶或合成反應併入其中之受質。
本發明之實施例包括結合物，其中多肽(例如抗人類CD33抗體)與一或多個藥物部分，諸如2個藥物部分、3個藥物部分、4個藥物部分、5個藥物部分或更多個藥物部分結合。如本文所描述，藥物部分可在多肽中之一或多個部位處與多肽結合。在某些實施例中，結合物之平均藥物與抗體比率(DAR) (莫耳比)在2至5、或3至5或3至4之範圍內。在某些實施例中，結合物之平均DAR為3至4。在某些實施例中，結合物之平均DAR為約3。在某些實施例中，結合物之平均DAR為約4。
如本文所用，熟習此項技術者應瞭解，式I之結合物亦可稱為抗人類CD33抗體糖皮質激素結合物(「抗人類CD33 Ab GC結合物」)。
本發明之抗人類CD33結合物，例如抗人類CD33抗體GC結合物可調配為藉由任何使得結合物生物可利用之途徑投與(包括例如靜脈內或皮下投與)的醫藥組合物。此類醫藥組合物可使用此項技術中已知之技術及方法(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Adejare, Editor, 第23版, 2020年出版, Elsevier Science)製備。
如本文所用，術語「治療(treating)」、「治療(treatment)」或「治療(to treat)」包括限制、減緩、停止、控制、延遲或逆轉現有症狀或病症之進展或嚴重程度，或改善現有症狀或病症，但不必指示現有症狀或病症完全消除。治療包括投與蛋白質或核酸或載體或組合物以用於治療患者，尤其人類中之症狀或病症。
如本文所用，術語「抑制(inhibits)」或「抑制(inhibiting)」係指例如生物反應或活性之減低、降低、減慢、減少、停止、中斷、消除、拮抗或阻斷，但未必指示生物反應完全消除。
如本文所用，術語「個體」係指哺乳動物，包括(但不限於)人類、黑猩猩、猿、猴、牛、馬、綿羊、山羊、豬、兔、犬、貓、大鼠、小鼠、天竺鼠(guinea pig)及其類似動物。個體較佳為人類。
如本文所用，術語「有效量」係指本發明之結合物或其醫藥學上可接受之鹽在向個體單次或多次劑量投與後在診斷或治療下之個體中提供期望效果的量或劑量。如本文所用，術語「有效量」進一步係指本發明之結合物或其醫藥學上可接受之鹽將引發個體之所期望生物或醫學反應(例如降低或抑制蛋白質活性或改善症狀、緩解病狀、減緩或延遲疾病進展或預防疾病等)的量或劑量。在一個非限制性實施例中，術語「有效量」係指本發明之結合物或其醫藥學上可接受之鹽向個體投與時可有效至少部分地緩解、抑制、預防及/或改善病狀或病症或疾病以實現所期望治療結果的必需量(在投與劑量及投與時段以及投與方式下)或劑量。有效量亦為本發明之結合物或本發明之其醫藥學上可接受之鹽的治療有益效果超過其任何有毒或有害的效果或劑量。
有效量可由熟習此項技術者利用已知技術及根據類似情形下所得的觀測結果來確定。確定患者之有效量時，護理診斷醫師考慮多種因素，包括(但不限於)：患者之種類；其體型、年齡及一般健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；疾病或病症之涉及程度或嚴重程度；個別患者之反應；所投與之特定結合物；投與模式；所投與之製劑之生物可利用性特徵；所選擇之給藥方案；伴隨藥品之使用；及其他相關情況。
本發明之範疇內包括式I之結合物的醫藥學上可接受之鹽。本發明之結合物的醫藥學上可接受之鹽，諸如式I之結合物可在此項技術中已知之標準條件下形成。參見例如Berge, S.M. 等人, 「Pharmaceutical Salts」, Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)。 表 1 ：縮寫及定義
術語 定義
ACN 乙腈
aq 水溶液
cP 厘泊
DCM 二氯甲烷
DIPEA N,N-二異丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲醯胺
DMSO 二甲亞碸
dppf 1,1´-雙(二苯基膦基)二茂鐵
ES/MS 電噴質譜法
EtOAc 乙酸乙酯
HATU 六氟磷酸氮雜苯并三唑四甲脲鎓
HPLC 高效液相層析法
LDA 二異丙基胺基鋰
MeOH 甲醇
MS 質譜法
MTBE 甲基三級丁基醚
m/z 質荷比
NMR 核磁共振
Pet ether 石油醚
rt 室溫
satd 飽和
THF 四氫呋喃
本發明之結合物或其鹽可藉由一般技術者已知的多種程序容易地製備，其中一些結合物或其鹽在以下製備及實例中加以說明。一般技術者認識到，所描述之各途徑中之特定合成步驟可以不同方式組合，或與不同流程之步驟結合以製備本發明之結合物或其鹽。各步驟之產物可藉由此項技術中熟知之習知方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析法、過濾、濕磨及結晶。除非另外指示，否則所有取代基如先前所定義。試劑及起始材料為一般技術者容易獲得的。以下製備、實例及分析進一步說明本發明，但不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。
製備 16-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲醛 平行進行兩個反應。在-78℃下經30分鐘向4-溴-2-氟-1-甲氧基苯(250 g，1.2 mol)於THF (1500 mL)中之溶液中緩慢添加LDA (2 M，730 mL)。再過30分鐘後，在-78℃下經30分鐘緩慢添加DMF (140 mL，1.8 mol)。1小時後，將兩種反應物組合，且將混合物用檸檬酸水溶液(2000 mL)稀釋且用EtOAc (1500 mL × 2)萃取。將經組合之有機層用飽和NaCl水溶液(1000 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到殘餘物。將殘餘物在室溫下用石油醚(1000 mL)濕磨12小時，得到標題化合物(382 g，67%產率)。ES/MS m/z 233.9 (M+H)。
製備 22-氟-3-甲氧基-6-甲基苯甲醛 平行進行三個反應。將6-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲醛(120 g，5.3 mol)、甲基硼酸(methylboronic acid) (47 g，7.9 mol)、Pd(dppf)Cl 2(12 g，0.02 mol)及Cs 2CO 3(340 g，1.1 mol)添加至1,4-二㗁烷(600 mL)及水(120 mL)之混合物中。在120℃攪拌混合物。12小時後，將三種反應物組合，且將混合物用飽和NH 4Cl水溶液(1000 mL)稀釋且用MTBE (1500 mL × 2)萃取。將經組合之有機層用飽和NaCl水溶液(1000 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到殘餘物。殘餘物藉由矽膠層析法進行純化，用40:1石油醚:EtOAc溶離，得到標題化合物(180 g，59%)。ES/MS m/z 169.3 (M+H)。
製備 32-氟-3-羥基-6-甲基苯甲醛 將2-氟-3-甲氧基-6-甲基苯甲醛(175 g，1.0 mol)添加至DCM (1050 mL)中。在0℃下將BBr 3(200 mL，2.1 mol)緩慢添加至溶液中。在室溫下攪拌反應物。1小時後，將混合物用飽和NaHCO 3水溶液(1000 mL)稀釋直至pH=7至8，且隨後用MTBE (1500 mL × 2)萃取。將經組合之有機層用飽和NaCl水溶液(1000 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到標題化合物(110 g，68%) ES/MS m/z 154.9 (M+H)。
製備 4N-[3-[(2-氟-3-甲醯基-4-甲基-苯氧基)甲基]苯基]胺基甲酸三級丁酯 在室溫下將2-氟-3-羥基-6-甲基苯甲醛(130 g，0.84 mol)、(3-(溴甲基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(200 g，0.70 mol)及碳酸鉀(350 g，2.5 mol)添加於乙腈(780 mL)中，且隨後加熱至50℃。5小時之後，將反應物用水(600 mL)稀釋且用EtOAc (800 mL×2)萃取。將經合併之有機層用飽和NaCl水溶液(800 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到殘餘物。將殘餘物藉由矽膠層析法進行純化，用50:1石油醚:EtOAc溶離，得到粗產物。將粗產物在室溫下用MTBE (500 mL)濕磨30分鐘，得到標題化合物(103 g，32%)。ES/MS m/z 382.1 (M+Na +)。
製備 5(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-((3-胺基苯甲基)氧基)-2-氟-6-甲基苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-酮 在-10℃下將過氯酸(水中70%，4.8 mL)添加至(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羥基-17-(2-羥基乙醯基)-10,13-二甲基-7,8,9,11,12,14,15,16-八氫-6H-環戊[a]菲-3-酮(4.4 g，12 mmol，亦稱為「16α-羥基普賴蘇穠(hydroxyprednisolone)」)及含N-[3-[(2-氟-3-甲醯基-4-甲基-苯氧基)甲基]苯基]胺基甲酸三級丁酯(4.0 g，11 mmol，製備4)之乙腈(110 mL)的懸浮液中且升溫至室溫。1小時後，在室溫下將DMF (10 mL)添加至懸浮液中。18小時後，將反應物用飽和NaHCO 3水溶液淬滅且用9:1 DCM:異丙醇萃取。將有機層合併，經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。將殘餘物藉由逆相層析法進行純化，用1:1 NH 4HCO 3水溶液(10 mM + 5% MeOH):ACN溶離，得到標題化合物，峰1 (1.72 g，25%)。ES/MS m/z 618.6 (M+H)。 1H NMR (400.13 MHz, DMSO- d 6) δ 0.93-0.87 (m, 6H), 1.40 (s, 3H), 1.71-1.60 (m, 1H), 1.89-1.76 (m, 4H), 2.18-2.12 (m, 2H), 2.29 (s, 4H), 4.23-4.17 (m, 1H), 4.32-4.30 (m, 1H), 4.50-4.43 (m, 1H), 4.81 (d, J= 3.2 Hz, 1H), 4.98-4.95 (m, 3H), 5.16-5.10 (m, 3H), 5.61 (s, 1H), 5.95 (s, 1H), 6.18-6.15 (m, 1H), 6.53-6.48 (m, 2H), 6.58 (s, 1H), 6.90-6.86 (m, 1H), 6.99 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.12 (t, J= 8.5 Hz, 1H), 7.33-7.30 (m, 1H)。
製備 6(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-((3-胺基苯甲基)氧基)-2-氟-6-甲基苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-酮(在本文中亦稱為「GC1」) 根據製備5，將殘餘物藉由逆相層析法進行純化，用1:1 NH 4HCO 3水溶液(10 mM + 5% MeOH):ACN溶離，得到標題化合物，峰2 (1.24 g，18%)。ES/MS m/z 618.6 (M+H)。 1H NMR (400.13 MHz, d 6-DMSO) δ 0.88 (s, 3H), 1.24-1.12 (m, 2H), 1.40 (s, 3H), 1.69-1.56 (m, 1H), 1.91-1.76 (m, 4H), 2.08-2.01 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 2.39-2.29 (m, 1H), 3.18 (d, J= 5.2 Hz, 1H), 4.12-4.00 (m, 1H), 4.37-4.30 (m, 2H), 4.79 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 5.00-4.93 (m, 2H), 5.10-5.06 (m, 3H), 5.31 (d, J= 6.7 Hz, 1H), 5.95 (s, 1H), 6.18 (dd, J= 1.8, 10.1 Hz, 1H), 6.34 (s, 1H), 6.53-6.48 (m, 2H), 6.58 (s, 1H), 6.87 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.99 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.09 (t, J= 8.5 Hz, 1H), 7.33 (d, J= 10.1 Hz, 1H)。
製備 7(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸 向3-順丁烯二醯亞胺丙酸N-丁二醯亞胺酯(5.0 g，19 mmol)及含L-丙胺醯基-L-丙胺酸(3.4 g，21 mmol)於DMF (25 mL)中之溶液中添加DIPEA (3.1 mL，18 mmol)且將混合物在室溫下攪拌隔夜。將反應混合物在減壓下濃縮，得到殘餘物，將該殘餘物藉由矽膠層析法進行純化，用含2%乙酸之EtOAc溶離，得到標題化合物(4.0 g，69%)。ES/MS m/z 312.3 (M+H)。
製備8  3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-((2-氟-3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-10-基)-4-甲基苯氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丙醯胺(在本文中亦稱為「GC-L」) 向經冷卻至0至5℃的(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-((3-胺基苯甲基)氧基)-2-氟-6-甲基苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-酮(24 g，39 mmol，參見製備6)及含3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸(15 g，47 mmol，參見製備7)於DMF(250 mL)中之溶液中添加2,6-二甲基吡啶(11 mL，97 mmol)，接著添加HATU (17 g，43 mmol)。將混合物在0至5℃下攪拌5分鐘，隨後移除冷卻浴，且將混合物攪拌2小時。將混合物用EtOAc稀釋。將有機溶液用三份水、一份飽和NaCl水溶液洗滌，經Na 2SO 4乾燥(添加MeOH以幫助溶解)，過濾且蒸發，得到粗產物。將粗產物藉由矽膠層析法使用含1至10% MeOH之DCM之梯度純化，得到標題化合物(24 g，68%)。ES/MS m/z 911.4 (M+H)。 1H NMR (400.13 MHz, DMSO): δ 9.88 (s, 1H), 8.20 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 8.11 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.60-7.58 (m, 1H), 7.34-7.29 (m, 2H), 7.14-7.09 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.89 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 6.34 (s, 1H), 6.18 (dd, J= 1.8, 10.0 Hz, 1H), 5.95 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 5.31 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 5.13-5.04 (m, 3H), 4.78 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 4.41-4.30 (m, 4H), 4.10-4.00 (m, 1H), 3.61 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.42-2.31 (m, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.11-2.01 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 5H), 1.40 (s, 3H), 1.31 (d, J= 7.2 Hz, 3H), 1.19-1.11 (m, 5H), 0.88 (s, 3H)。
製備9  3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-((2-氟-3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-10-基)-4-甲基苯氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丙醯胺 以與製備8中所描述之程序類似的方式，製備9之化合物係由(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-((3-胺基苯甲基)氧基)-2-氟-6-甲基苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-酮(參見製備5)及3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸(參見製備7)製備。ES/MS m/z 911.4 (M+H)。 1H NMR (500.11 MHz, DMSO): δ 9.88 (s, 1H), 8.23-8.20 (m, 1H), 8.11 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.59 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.33-7.28 (m, 2H), 7.15-7.08 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.91-6.89 (m, 1H), 6.17 (dd, J= 1.7, 10.1 Hz, 1H), 5.94 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 5.16-5.12 (m, 3H), 4.98-4.96 (m, 1H), 4.81 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 4.49-4.36 (m, 6H), 3.61 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.41 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.30-2.29 (m, 4H), 2.17-2.15 (m, 2H), 1.88-1.77 (m, 4H), 1.69-1.61 (m, 1H), 1.40 (s, 3H), 1.31 (d, J= 7.2 Hz, 3H), 1.18 (d, J= 7.2 Hz, 3H), 0.93-0.87 (m, 6H)。
實例 實例 1 . 例示性抗人類 CD33 抗體 GC 結合物之產生 實例 1a ： 抗人類 CD33 抗體之產生及工程改造。 抗體產生 ： 如本文所描述之抗人類CD33抗體係使用針對人類CD33之Fc標記之細胞外域(hCD33-Fc)的溶液淘選自噬菌體呈現Fab庫中發現的。簡言之，首先針對人類IgG Fc淘選庫以移除Fc結合物。在3輪淘選之後富集人類CD33特異性結合物，且藉由針對his標記之hCD33的單點噬菌體ELISA篩選來鑑別。在轉化為IgG形式及純化之後，分別使用人類及石蟹獼猴PBMC藉由螢光活化細胞分選(FACS)分析確認結合於表現CD33之骨髓細胞的抗體。
針對表現CD33之骨髓細胞上之內化活性篩選由以上方法產生之抗體。抗體經pHrodo™紅色標記，與人類PBMC一起培育且藉由FACS分析。在內化至溶酶體中之後，pHrodo標記之抗體在低pH環境中產生紅色螢光信號。針對特異性結合於骨髓細胞上之人類及石蟹獼猴CD33及高效內化而選擇抗體。
對抗人類 CD33 抗體進行工程改造 ：進行顯著工程改造，包括抗體序列生殖系化、親和力成熟、胺基酸修飾及可開發性研究以產生如本文所描述之抗人類CD33抗體。工程改造克服挑戰以實現及平衡對人類及石蟹獼猴CD33之所需親和力，且改良抗體之功能特徵(例如減少受體降解及細胞耗乏特性)，改良免疫原性風險概況、黏度及皮下投與之可開發性。
如本文所描述之抗人類CD33抗體之VH及Vκ序列與人類生殖系高度同源。在親本抗體之輕鏈構架區中鑑別出四個構架殘基(A12、S18、S22及A40(Kabat編號))且將其轉化成生殖系殘基而不影響對人類CD33之特異性及親和力，從而產生具有高百分比之人類生殖系一致性的抗體(Ab1)，此可能降低免疫原性風險，從而提供經改良之可開發性特徵。
使用噬菌體表現平台技術將Ab1進一步工程改造為Fab (Anal Biochem. 1998 256(2):169-77)。發現HCDR3 E95T(Kabat編號)處之胺基酸殘基取代對於改良對人類CD33之親和力、減少與Ig耦合之層析管柱之相互作用、及改良高濃度下之抗體的黏度至關重要。另外，鑑別HCDR3 E95T及LCDR1 D28P殘基取代且將其工程改造以改良抗人類CD33抗體GC結合物之等電點。
Ab1證明對人類CD33 (3.4E-09)及石蟹獼猴CD33 (2.41E-05)之親和力存在顯著差異(參見表4)。超過10倍親和力差異可使臨床前毒理學研究及資料說明具有挑戰性。使用Ab1作為模板，使用抗體結構資訊、CDR突變掃描及石蟹獼猴CD33細胞外域(ECD)之計算模型化，設計靶向突變誘發庫來篩選突變，以改良對石蟹獼猴CD33之親和力。在LCDR1中鑑別四個胺基酸殘基(D28、V29、F30及R31 (Kabat編號))為對於增加石蟹獼猴CD33結合同時維持對人類CD33之所需結合親和力而言有關鍵性。如上文所鑑別之HCDR3 E95T胺基酸殘基取代及4個LCDR1胺基酸殘基取代之組合顯著改良對石蟹獼猴CD33之結合親和力(參見表4)且顯著將人類CD33與石蟹獼猴CD33之間的親和力差異降至最低，同時維持對人類CD33之所需結合親和力。此等經工程改造之殘基的組合導致Ab2及Ab3產生(表2a、表2b及表3)。
主鏈之選擇 ：抗體胺基酸殘基取代L234A、L235A及P329A (EU編號)併入IgG1 Fc區(IgG1AAA)，此減弱抗體與Fcγ受體及C1q之結合且因此減弱諸如ADCC及CDC之效應功能活性。此外，如下文所示，IgG1AAA主鏈顯著減少CD33抗體對CD33受體之降解。
抗體進一步包含IgG1 HC恆定區中之胺基酸殘基取代S124C及A378C (EU編號)，用於與治療劑(例如糖皮質激素)特異性結合。
人類CD33 ECD之胺基酸序列係由SEQ ID NO: 28提供，石蟹獼猴CD33 ECD之胺基酸序列係由SEQ ID NO: 29提供。 表 2a ： 例示性抗人類 CD33 抗體之 CDR 胺基酸序列
CDR 序列
HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
Ab1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
Ab2 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
Ab3 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
表 2b ： 例示性抗人類 CD33 抗體之 CDR 胺基酸共通序列
CDR 共通序列
LCDR1 SEQ ID NO: 26 QASQPTXaa 7Xaa 8IYLN 其中Xaa 7為苯丙胺酸或酪胺酸，且Xaa 8為天冬醯胺酸或異白胺酸
表 3 ：例示性抗人類 CD33 抗體之胺基酸序列
VH VL HC LC
Ab1 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22
Ab2 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
Ab3 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 15
實例 1b ： 抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物之產生 ， 其中 n 為 4 其中n為4；且 Ab為Ab2。
首先將例示性抗人類CD33抗體Ab2 (參見表2及表3)在40倍莫耳過量之二硫蘇糖醇(DTT)存在下在37℃下還原2小時或在約21℃下還原＞16小時。此初始還原步驟用於移除各種封端基團，包括在表現期間結合至重鏈之124及378位置處的經工程改造之半胱胺酸的半胱胺酸及麩胱甘肽。在還原步驟後，樣品經由去鹽管柱純化以移除未結合之端帽以及還原劑。隨後在室溫(約21℃)下，在10倍莫耳過量之去氫抗壞血酸(DHAA)存在下進行2小時氧化步驟，以重新形成輕鏈與重鏈之間的天然鏈間二硫化物以及鉸鏈二硫化物對。2小時氧化步驟之後，使用溶解於DMSO中之10 mM儲備溶液添加4至8莫耳當量之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子(「GC-L」)，即製備8中所製備之3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-((2-氟-3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-10-基)-4-甲基苯氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丙醯胺。隨後將樣品在室溫下培育30至60分鐘以使GC-L與經工程改造之半胱胺酸有效結合。隨後使用諸如尺寸排阻層析法(SEC)或切向流過濾(TFF)之後續拋光步驟以將樣品緩衝交換至適當的調配緩衝液中且移除DMSO及任何過量的連接子-有效負載。
藥物與抗體比率 (DAR) 評估： 為評估最終結合物上存在之連接子-有效負載之平均數目，使用兩種分析方法：1)逆相(RP) HPLC及2)飛行時間(TOF)質譜法。兩種方法均需要初始樣品還原步驟，其包括添加二硫蘇糖醇(DTT)達至約10 mM之最終濃度，接著在42℃下培育5分鐘。
逆相 HPLC 方法 ： 將10至30 µg之經還原之抗人類CD33抗體Ab2 GC結合物樣品注射於苯基5PW，4.6 mm × 7.5 cm，10 µm管柱(Tosh Part# 0008043)上。A緩衝液係由含0.1%三氟乙酸(TFA)之水製成，而B緩衝液包含含0.1%三氟乙酸(TFA)之乙腈(ACN)。在樣品注射之前將管柱在20% B緩衝液中平衡，接著在約8.5管柱體積內進行自28% B至40% B之梯度。平均DAR係藉由自分數百分比乘以各貢獻物種之DAR數目來計算各個別DAR物種之貢獻來測定。由於此值係基於部分經還原之樣品且僅表示分子之一半，因此隨後將數目乘以2以解釋完整抗體GC結合物。實例1b之例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物的DAR計算提供於表4中。 表 4 ：使用來自部分經還原之樣品中各 DAR 物種的分數百分比對例示性抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物之平均 DAR 進行 定量。
DAR 峰 % DAR 貢獻
0 23.6 0.00
1 0.75 0.03
總 LC % 24.35 0.03
   LC 平均 DAR 0.03 (來自LC之DAR貢獻)
        
0 0.33 0.00
1 19.5 0.26
2 41.07 1.09
3 14.76 0.59
4      
總 HC % 75.66   
   HC 平均 DAR 1.93 (來自HC之DAR貢獻)
(HC+LC)2 最終平均 DAR 3.92
飛行時間質譜法 ： 將8 µg之部分經還原之樣品注射於Poroshell 300sb-C3 2.1 × 12.5 mm，5 µm管柱(Agilent Part# 821075-924)上。緩衝液A係由含0.1%三氟乙酸(TFA)之水製成，而緩衝液B包含含0.1%三氟乙酸(TFA)之乙腈(ACN)。在樣品注射之前將管柱在0% B緩衝液中平衡，接著在約28管柱體積內進行自10% B至80% B之梯度。平均DAR係藉由自分數百分比乘以各貢獻物種之DAR數目來計算各個別DAR物種之貢獻來測定。由於此值係基於部分經還原之樣品且僅表示分子之一半，因此隨後將數目乘以2以解釋完整抗體GC結合物。實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物的DAR計算提供於表5中。 表 5 ： 使用基於來自飛行時間質譜法分析之總離子計數的分數百分比對例示性抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物之平均 DAR 進行 定量。
DAR 離子計數 DAR 貢獻
0 32926 0.00
1 0 0.00
總 LC % 32926   
   LC 平均 DAR 0.00 (來自LC之DAR貢獻)
        
0 0 0.00
1 17838 0.05
2 301109 1.82
3 12436 0.11
4 0 0.00
總 HC % 331383   
   HC 平均 DAR 1.97 (來自HC之DAR貢獻)
(HC+LC)2 最終平均 DAR 3.97
實例 1c . 抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物之產生 ， 其中 n 為 3 其中n為3；且 Ab為Ab2。
以與實例1b中所描述之程序類似的方式，使用4:1之GC-L:Ab2之莫耳比，及在約21℃下培育20分鐘，產生約3之最終DAR來製備實例1c之結合物。
實例 1d . 硫代琥珀醯亞胺水解 ： 式Ia結合物之硫代琥珀醯亞胺環可在此項技術中熟知之條件下水解，如下文所示(參見例如WO 2017/210471，段落001226)，得到式Ib之開環產物。
另外，以上式Ia結合物之硫代琥珀醯亞胺環可在活體內及在標準或熟知之調配條件下經歷至少部分水解，得到式Ib之開環產物。
實例 2 . 結合活性 實例 2a . 結合親和力 ：例示性抗人類CD33抗體對人類及石蟹獼猴CD33 ECD 18-232-His蛋白質之親和力及結合動力學係藉由表面電漿子共振使用Biacore 8K (GE Healthcare)來測定。簡言之，根據儀器手冊，在Biacore 蛋白質A晶片上捕獲抗體，接著將CD33 ECD在PBS-P20-BSA (0.005%界面活性劑P20，0.1 mg/mL BSA)中以2倍連續稀釋自200 nM流動降至0.782 nM。所有量測均在37℃下進行。在各樣品注射之後，在單獨循環中使用運行各分析物濃度的多循環動力學設定使表面再生。使再生最佳化以在各循環之間維持一致的表面特性。各循環以10微升/分鐘流動速率注射3分鐘0.1 μg/mL抗體開始，接著以50微升/分鐘流動速率注射3分鐘抗原，且在PBS-P20-BSA中進行15分鐘解離階段。隨後以50微升/分鐘流動速率注射30秒pH 1.5，10 mM甘胺酸緩衝液三次，使晶片表面再生。將資料擬合至1:1結合模型中以導出k a及k d，且計算K D。
表3中之結果展示實例1b之例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物與對人類及石蟹獼猴CD33之未結合抗人類CD33 Ab2維持類似結合親和力。此外，Ab1、Ab2及Ab3以理想的親和力結合人類CD33，而Ab1及Ab2已改良與石蟹獼猴之結合。 表 3 . 實例 1b 之例示性抗人類 CD33 抗體 GC 結合物、 Ab1 、 Ab2 及 Ab3 對人類及石蟹獼猴 CD33 ECD 之結合親和力及動力學
   物種 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
Ab1 人類 3.46E+05 1.18E+05 3.4E-09
石蟹獼猴 2.55E+03 6.15E-02 2.41E-05
Ab2 人類 4.54E+05 5.16E-04 1.14E-09
石蟹獼猴 6.53E+05 2.79E-03 4.28E-09
Ab3 人類 5.70E+05 4.86E-04 8.54E-10
石蟹獼猴 1.34E+06 1.08E-03 8.12E-10
Ab2 GC 結合物 人類 4.39E+05 6.45E-04 1.47E-09
石蟹獼猴 1.03E+06 4.78E-03 4.65E-09
實例 2b . 細胞表面結合效力： 在螢光活化細胞分選(FACS)分析中測試例示性抗人類CD33抗體及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物對人類單核球之結合效力。藉由標準Ficoll-Paque TMplus (GE HEALTHCARE)密度梯度離心方法自人類血液樣品分離人類PBMC。將新分離之細胞PBMC以2×10 6個細胞/毫升再懸浮且使其在室溫下靜置15分鐘，隨後將其以100微升/孔塗佈於圓底96孔盤(COSTAR ®)中且用FACS緩衝液(來自Corning ®含有2%胎牛血清之PBS)洗滌。根據製造商之方案(Thermo Fisher Scientific)將例示性抗人類CD33抗體及與Alexa Fluor ®647結合之各別對照IgG抗體添加至孔中且一式兩份稀釋4倍。隨後將等體積之2×抗體混合液添加至各孔中，該混合液含有：PE-Cy5抗人類CD14抗體(殖株M5E2)、Per-CP抗人類CD45抗體(殖株H130)、FITC抗人類CD11b (殖株ICRF44)及Alexa Fluor-647抗人類CD66b (G10F5)。將細胞在4℃下培育30分鐘，用FACS緩衝液洗滌兩次，且再懸浮於最終體積為100 μL之FACS緩衝液中。添加存活染料、Live/Dead黃色(Thermo Fisher Scientific，L34968)且經由流式細胞儀(LSRFortessa TMX-20；BD BIOSCIENCES)分析樣品。使用FlowJo軟體進行資料分析且使用GraphPad Prism 9進行統計分析。資料表示來自單核球或嗜中性白血球之表現CD33之細胞的平均螢光強度(MFI)。
圖1A至圖1B中之結果展示實例1b之例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物及Ab2以理想的結合效力結合單核球細胞表面上所表現的人類CD33。圖1B展示Ab3與單核球細胞表面之結合。
實例 3 ：功能活性 實例 3a . 抗體內化 ： 例示性抗人類CD33抗體經pHrodo™紅色、胺反應性染料(Thermo Fisher，P36014)標記。pH敏感性染料在細胞外部時為非螢光的，但在酸性低pH溶酶體中發出明亮螢光。此特性允許藉由流式細胞分析技術對抗體之內化進行可視化及鑑定。將人類PBMC (500K/孔)在FACS緩衝液中在冰上培育30分鐘，以停止基線內化。將細胞用pHrodo標記之抗體(10 µg/mL)在FACS緩衝液中在冰上染色1小時，隨後轉移至37℃持續2小時。隨後將細胞用表面偵測標記物之剩餘組：CD45 mAb (殖株HI30)；CD11b (殖株ICRF44)；CD14 (殖株M5E2)進行染色。
表4中之結果展示實例1b之例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物及Ab2中之約＞80%在與細胞表面CD33結合之約2小時內內化至初代人類單核球細胞中。反之，僅約50%之吉妥珠單抗(Gemtuzumab) (hIgG4PAA)在與細胞表面CD33結合之約2小時內內化至初代人類單核球細胞中。實例1b之例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物及Ab2進入單核球細胞中的較快及/或增加之內化速率表明Ab2可有效將與其連接之治療劑遞送至表現CD33之細胞中。 表 4 . 實例 1b 之例示性抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物、 Ab2 及吉妥珠單抗之內化
   內化 %
hIgG1AAA 同型對照 2.26 ± 0.693
hIgG4PAA 同型對照 3.49 ± 1.626
Ab2 86.545 ± 4.589
Ab2 GC 結合物 86.55 ± 6.859
吉妥珠單抗 50.55 ± 2.899
實例 3b . 內化後 CD33 細胞表面受體可用性： 評估與例示性抗人類CD33抗體結合時內化之後單核球上之CD33細胞表面受體可用性。簡言之，將自PBMC分離之人類單核球以2×10 4個細胞/孔接種於96孔盤中且在冰上培育60分鐘以阻礙內化。將例示性抗人類CD33抗體(30 µg/mL)添加至細胞中且使其在冰上結合30分鐘。隨後將100 µL培養基添加至細胞中且將盤置放於培育箱中，在37℃下持續3.5、24、48、72及96小時的時間點。基線樣品立即染色表示在內化之前例示性抗人類CD33抗體表面結合。將細胞進行Fc封閉20分鐘，隨後用Alexa Fluor-647標記之抗人類CD33例示性抗體、Alexa Fluor-700抗人類CD45 (HI30)及Brilliant Violet-605抗人類CD11b (ICRF44)在冰上染色30分鐘。藉由流式細胞分析技術分析細胞。
表5中之結果展示內化後單核球細胞上之細胞表面CD33可用性在約3.5小時至約96小時之時程內自基線分別增加約1.1%至高達約31.9%。表面CD33可來自重新CD33表現及/或再循環至細胞表面之內化CD33。此等結果指示人類單核球細胞上之再生CD33可潛在地結合額外抗人類CD33抗體，用於將CD33抗體或與CD33抗體連接的治療劑重複遞送至表現CD33之細胞中。 表 5 . 用例示性 Ab1 處理之後內化後 CD33 細胞表面可用性
內化後細胞表面 CD33 陽性細胞 %
基線 1.1 ± 0.481
3 . 5 小時 1.06 ± 0.339
24 小時 1.935 ± 0.884
48 小時 9.195 ± 1.260
72 小時 14.185 ± 1.335
96 小時 31.9 ± 2.183
實例 3c . CD33 受體降解 ： 藉由蛋白質免疫墨點分析評估例示性抗人類CD33 Ab2對細胞內CD33降解之影響。藉由標準Ficoll-Paque TMplus (GE HEALTHCARE)密度梯度離心方法自人類血液樣品分離人類PBMC。將新分離之PBMC以1×10 7個細胞/5毫升/孔接種於24孔細胞培養盤中之培養基中。在37℃細胞培育箱中用抗人類CD33 Ab2及hIgG1 (效應子無效型)陰性對照抗體處理細胞隔夜。此步驟允許測定內化CD33受體之降解。第二天收集細胞且用含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之RIPA溶解緩衝液溶解。
藉由二喹啉甲酸(BCA)分析對細胞溶解產物蛋白質進行定量，且針對蛋白質免疫墨點分析之負載進行標準化。使用非競爭性抗CD33抗體(AbCam殖株EPR4423)來偵測CD33含量。
圖2A至圖2B中之結果展示例示性抗人類CD33 Ab2在結合及內化時不降解CD33，因為CD33含量與同型對照相當。
實例 3d . 促發炎細胞介素調節及免疫細胞耗乏 ： 評估實例1b之例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物及抗人類CD33 Ab2對人類PBMC中促發炎細胞介素調節的影響。使用PBMC模擬活體內條件。簡言之，將例示性抗人類CD33 Ab2或實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物與人類PBMC以2×10 6個細胞/孔在37℃培育箱中在96孔盤中一起培育1小時。隨後用LPS (Sigma目錄號L2880)以100 pg/mL在37℃培育箱中刺激細胞24小時。收集培養物上清液以量測指定細胞介素(促發炎組II (人類) 4-Plex套組，MSD，K15053D-2)。
圖3A至圖3D及表6a中之結果展示與單獨GC1類似，實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物顯著調節(抑制)促發炎細胞介素IL-6及TNFα反應。未結合之抗人類CD33 Ab2不調節促發炎細胞介素IL-6及TNFα之CD33介導之表現，指示藉由例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物觀測到的細胞介素反應係由糖皮質激素調節。
表6b展示與同型對照相比，用實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物及抗人類CD33 Ab2處理不誘發PBMC免疫細胞耗乏。 表 6a . 實例 1b 之例示性抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物對促發炎細胞介素之調節
200 nM 時之人類 IL - 6 分泌之抑制 % 200 nM 時之人類 TNFa 分泌之抑制 %
同型 1.638±1.565 3.214±0.264
Ab2 12.045±1.887 5.978±0.548
Ab2 GC 結合物 78.604±0.836 80.469±2.579
GC1 83.908±2.815 85.126±3.278
表 6b . 實例 1b 之例示性抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物及抗人類 CD33 Ab2 不誘發免疫細胞耗乏
   總活細胞計數
   無處理 同型 Ab2 Ab2 GC 結合物
LPS 刺激 1.75 ± 0.3 1.54 ± 0.15 1.64 ± 0.12 1.57 ± 0.16
無 LPS 1.79 ± 0.27 1.51 ± 0.23 1.43 ± 0.33 1.61 ± 0.07
活細胞計數 ( ×10 6 個細胞 / 毫升 )
實例 3e . 漿細胞樣樹突狀細胞分析 ： 在漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)分化分析中評估例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物調節人類pDC之能力。已知表現CD33之pDC為產生1型干擾素之初代細胞，該1型干擾素係與狼瘡發病機制相關聯。簡言之，在抗人類CD33 Ab2或實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物或單獨GC1存在下，在IL-3補充培養基中培養人類PBMC，同時刺激CpG (含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷之免疫刺激DNA)。藉由流式細胞分析技術來量測pDC之分化。藉由I型IFN (IFNα)產生來量測pDC之功能效應。
表6c中之結果展示與單獨GC1類似，實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物顯著調節(抑制) pDC之分化且抑制細胞介素IFNα分泌。未結合之抗人類CD33 Ab2不影響pDC分化及IFNα分泌，指示使用例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物觀測到的細胞介素反應之抑制係由糖皮質激素調節。因此，結果表明實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物特異性靶向pDC之功能活性。 表 6c . 藉由實例 1b 之例示性抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物抑制 pDC 及 IFN α
pDC 細胞分化之抑制 % 人類 IFNα 分泌之抑制 %
同型 0.92 ± 0.06 0.83 ± 0.21
Ab2 0.97 ± 0.39 1.25 ± 0.19
Ab2 GC 結合物 91.89 ± 6.37 95.62 ± 1.57
GC1 95.50 ± 8.32 97.18 ± 2.95
實例 4 . 效應功能活性 抗體依賴性細胞毒性 ( ADCC ) ： 用基於報導基因之ADCC分析評估例示性抗體之活體外ADCC分析。使用作為靶細胞株之表現人類CD33及人類CD20的CHO細胞及作為效應細胞株之表現功能FcγRIIIa (V158)-NFAT-Luc的Jurkat細胞(Eli Lilly及Company)。所有測試抗體及細胞均稀釋於含有RPMI-1640 (無酚紅)且具有0.1 mM非必需胺基酸(NEAA)、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-麩醯胺酸、500 U/mL青黴素-鏈黴素及0.1% w/v BSA之分析培養基中。將測試抗體首先稀釋至3×濃度之3.3 µg/mL，且隨後以1:4比率連續稀釋7次。將50微升/孔之各抗體一式兩份地等分於白色不透明底96孔盤(Costar, #3917)中。將CD20抗體用作陽性對照。隨後以5×10 4個細胞/孔，以50 µL等分試樣將CHO靶細胞添加至盤中，且在37℃下培育1小時。隨後，以150,000個細胞/孔，以50 µL等分試樣將Jurkat V158細胞添加至各孔中且在37℃下培育4小時，接著添加100微升/孔之One-Glo螢光素酶受質(Promega, #E8130)。使用盤振盪器以低速混合盤之內含物，在室溫下培育5分鐘，且使用0.2 cp整合在BioTek微量盤讀取器(BioTek Instruments)上讀取發光信號。使用GraphPad Prism 9分析資料且以抗體濃度對比相對發光單位(RLU)之散射格式標繪各抗體濃度之RLU。
具有效應子無效型IgG1AAA主鏈之例示性抗人類CD33抗體不誘導ADCC活性(結果未示出)，表明例示性抗體具有低的經由ADCC介導之殺死耗乏表現CD33之細胞的機率。
實例 5 . 生物物理學特性評估例示性抗人類CD33抗體之生物物理學特性的可開發性。
來自細胞培養物之聚集 ： 例示性抗人類CD33抗體短暫表現於CHO細胞中。蛋白質A親和力層析法純化之後抗體效價及高分子量物種之百分比(HMW%)展示於表7中且指示Ab1、Ab2及Ab3具有低聚集性，從而提供良好的可開發性特徵。
黏度 ： 例示性抗人類CD33抗體Ab1、Ab2、Ab3及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物在pH 6下之5 mM組胺酸基質中濃縮至約125 mg/mL。使用VROC ®initium (RheoSense)在15℃下使用9次重複量測之平均值量測各自之黏度。表7中之結果展示例示性抗人類CD33抗體Ab1、Ab2、Ab3及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物具有良好的可開發性黏度特徵。
熱穩定性 ： 使用微差掃描熱量法(DSC)評估例示性抗人類CD33抗體Ab1、Ab2、Ab3及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物針對熱變性之穩定性。表7中之結果展示例示性抗人類CD33抗體Ab1、Ab2、Ab3及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物在pH 7.2下之PBS中具有可接受之可開發性熱熔融溫度。
在溫度應力時聚集 ： 在常見5 mM組胺酸pH 6.0緩衝液中以約100 mg/mL評估例示性抗人類CD33抗體Ab2、Ab3及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物隨時間推移之溶液穩定性。將濃縮樣品分別在5℃及35℃下培育4週之時段。在培育之後，用尺寸排阻層析法(SEC)分析樣品的高分子量物種之百分比(HMW%)。表7中之結果展示例示性抗人類CD33抗體Ab2、Ab3及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物在熱應力下具有良好的穩定性。 表 7 . 例示性抗人類 CD33 抗體及實例 1b 之 Ab2 GC 結合物的生物物理學特性
Ab1 Ab2 Ab3 Ab2 GC 結合物
蛋白質 A 層析法之後的 HMW 物種 % 2.67 1.10 1.39 NA
sCHO 效價 (g /L ) 1.7 4.7 4.6 NA
黏度 (cP ) 5.5 6.5 7.7 7.3
T 起始 ( ℃ )    64.4 64.6 57.8
Tm 1 ( ℃ )    71.8 70.93 64.0
Tm 2 ( ℃ ) 79 77.5 79.68 77.0
在5 ℃下培育4 週之後的HMW% ND* ＜0.1 ＜0.1 0.95
在35 ℃下培育4 週之後的HMW% ND* 0.86 1.58 3.08
*ND=未經測定
實例 6 . 免疫原性評估 MS 血清蛋白質結合： 評估例示性抗人類CD33抗體與血清蛋白質的脫靶結合。將例示性抗人類CD33抗體Ab1、Ab2及Ab3以及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物塗佈於Maxisorp微量盤上。將盤封閉且向各孔中添加人類血清，且將盤培育隔夜。將結合之蛋白質溶離、還原、烷基化及消化。藉由質譜儀分析肽。肽及蛋白標識係藉由內部蛋白質體學管線使用胰蛋白酶之搜尋演算法及隨附測試抗體序列之人類資料庫生成。藉由內部蛋白質體學工具(Chrom-Alignment、Metaconsense及Quant)定量離子，且在JMP中使用單向分析/比較平均值/所有對，即圖基HSD檢驗法(Tukey HSD)分析離子。在研究中，將P-值＜0.05及FC＞2的具有＞30%離子的蛋白質(與同型對照相比)視為富集的。
表8中之結果展示在與Ab1相比時，例示性抗人類CD33抗體Ab2及Ab3以及實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物與血清蛋白質之結合顯著減少，且因此與Ab1相比潛在地具有更低的免疫原性風險。 表 8 ： 例示性抗人類 CD33 抗體及實例 1b 之抗人類 CD33 Ab2 GC 結合物的 MS 血清蛋白質分析
mAb 用抗體鑑別之血清蛋白質 ( ＞ 5 倍富集 )
Ab1 鑑別出一些血清蛋白質
Ab2 未鑑別出血清蛋白質
Ab2 GC 結合物 與Ab2相比未觀測到額外脫靶結合
Ab3 妊娠區域蛋白質富集
實例 7 ：活體內表徵 臨床前接觸過敏性模型： 使用接觸過敏之人源化小鼠模型(HuNOG-EXL)活體內評估實例1b之例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物及抗人類CD33抗體Ab2。在單獨研究中類似地評估Ab1。向HuNOG-EXL投與㗁唑啉酮(一種過敏性接觸性皮膚炎誘導劑)誘發局部促發炎細胞介素反應及皮膚發炎。此允許活體內詢問例示性分子之抗炎及免疫調節效應。
簡言之，在6週齡用自人類臍帶血分離之人類CD34+造血幹細胞移植huNOG-EXL小鼠。在幹細胞投與之後20至24週評估小鼠之人類CD45移植(血液中＞25%)且進行㗁唑啉酮誘導之接觸過敏性方案。在第0天，將小鼠按體重分組(N=7-8隻/組)且以10、1及0.1 mg/kg皮下給藥實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物或10 mg/kg抗人類CD33 Ab1或Ab2或非結合同型對照。投與後24小時(第1天)，用5%異氟醚麻醉小鼠，將其腹部刮毛，且用100 µL含3%㗁唑啉酮之乙醇(施加至刮毛區域)致敏。如上所述在第4天、第11天及第16天再次對小鼠給藥，且在各劑量後48小時(第6天-攻擊1、第13天-攻擊2及第18天-攻擊3)用含2%㗁唑啉酮之乙醇在兩個耳朵(10微升/側/耳)上攻擊。對於單獨GC1組，在致敏之前1小時及在各攻擊之前向小鼠給藥3 mg/kg SC。在最終攻擊後，處死小鼠，且收集耳組織及腓腸肌用於分析GC調節之基因的靶選擇性及非靶選擇性組織表現。
表9a及圖4A至圖4C中之結果展示實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物在所有3個攻擊中顯著抑制活體內㗁唑啉酮誘導之皮膚發炎。表9a中之結果進一步展示在與10 mg/kg之未結合之Ab2相比時，實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物在攻擊3中在10 mg/kg下抑制57%的㗁唑啉酮誘導之皮膚發炎及在1 mg/kg下抑制34%的㗁唑啉酮誘導之皮膚發炎。在單獨研究中，Ab1之效應亦展示與同型對照無統計學上顯著之差異(資料未示出)。
表9b中之結果展示實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物調節靶組織特異性(耳)糖皮質激素受體促效劑介導之FKBP5基因表現但不調節非靶組織(腓腸肌)FKBP5基因表現。反之，全身性高劑量糖皮質激素(GC1)治療之小鼠在靶組織及非靶組織中均展示糖皮質激素促效劑受體介導之基因誘導。
累積地，此等資料展示實例1b之例示性抗人類CD33 Ab2 GC結合物將糖皮質激素特異性遞送至靶細胞，該等靶細胞隨後調節組織特異性GC促效劑受體介導之反應。 表 9a . 例示性抗人類 CD33 Ab2 及實例 1b 之抗人類 CD33 Ab GC 結合物在 IV 型過敏性人源化小鼠模型中之活體內活性 ； 來自攻擊 3 之資料。
   攻擊3 Δ 耳部厚度 (mm )
   平均值 SEM
10 mg /kg 之同型 0.091 0.006
10 mg/kg 之Ab2 0.067 0.009
10 mg /kg 之 Ab2 GC 結合物 0.029*^ 0.006
1 mg / kg 之 Ab2 GC 結合物 0.044* 0.008
0 . 1 mg / kg 之 Ab2 GC 結合物 0.068 0.004
3 mg /kg 之GC1 0.018*^ 0.004
* 與同型相比p＜0.0002；ANOVA圖基； ^與Ab2相比p＜0.005；ANOVA圖基 表 9b . 在 IV 型過敏性人源化小鼠模型中 ， 實例 1b 之 CD33 Ab2 GC 結合物及 Ab2 在靶向組織 ( 耳 ) 及非靶向組織 ( 腓腸肌 ) 中之人類糖皮質激素反應性基因誘導
   與同型相比 FKBP5 基因表現之倍數增加
   耳 腓腸肌
平均值 SEM 平均值 SEM
Ab2 1.549 0.020 1.076 0.096
10 mg /kg 之 Ab2 GC 結合物 9.011 2.351 0.789 0.445
1 mg / kg 之 Ab2 GC 結合物 5.278 1.767 1.176 0.491
0 . 1 mg / kg 之 Ab2 GC 結合物 1.930 0.934 1.149 0.390
3 mg /kg 之GC1 4.505 0.928 3.958 1.445
序列表 Ab1 Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 1 HCDR1 ( North )AASGFTFSSYAMS Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 2 HCDR2 ( North )AISGSGGSTY Ab1 之 SEQ ID NO : 17 HDCR3 ( North )AREYSNYDY Ab1 之 SEQ ID NO : 18 LCDR1 ( North )QASQDVFRYLN Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 5 LCDR2 ( North )YDASNLQT Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 6 LCDR3 ( North )QQYEDLPT Ab1 之 SEQ ID NO : 19 VHEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYSNYDYWGQGTLVTVSS Ab1 之 SEQ ID NO : 20 VLDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVFRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYEDLPTFGPGTKVDIK Ab1 之 SEQ ID NO : 21 HCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYSNYDYWGQGTLVTVSSASTKGPCVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDICVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Ab1 之 SEQ ID NO : 22 LCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVFRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYEDLPTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Ab1 之 SEQ ID NO : 23 HC DNAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGGGAATATAGTAATTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCACTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGCCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCTGCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA Ab1 之 SEQ ID NO : 24 LC DNAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACGTTTTCAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGAGGATCTCCCTACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC Ab2 Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 1 HCDR1 ( North )AASGFTFSSYAMS Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 2 HCDR2 ( North )AISGSGGSTY Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 3 HDCR3 ( North )ARTYSNYDY Ab2 之 SEQ ID NO : 4 LCDR1 ( North )QASQPTFNYLN Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 5 LCDR2 ( North )YDASNLQT Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 6 LCDR3 ( North )QQYEDLPT Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 7 VHEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYSNYDYWGQGTLVTVSS Ab2 之 SEQ ID NO : 8 VLDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQPTFNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYEDLPTFGPGTKVDIK Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 9 HCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYSNYDYWGQGTLVTVSSASTKGPCVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDICVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Ab2 之 SEQ ID NO : 10 LCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQPTFNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYEDLPTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 11 HC DNAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGGACTTATAGTAATTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCACTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGCCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCTGCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA Ab2 之 SEQ ID NO : 12 LC DNAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGCCGACGTTCAATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGAGGATCTCCCTACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC Ab3 Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 1 HCDR1 ( North )AASGFTFSSYAMS Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 2 HCDR2 ( North )AISGSGGSTY Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 3 HDCR3 ( North )ARTYSNYDY Ab3 之 SEQ ID NO : 13 LCDR1 ( North )QASQPTYIYLN Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 5 LCDR2 ( North )YDASNLQT Ab1 、 Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 6 LCDR3 ( North )QQYEDLPT Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 7 VHEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYSNYDYWGQGTLVTVSS Ab3 之 SEQ ID NO : 14 VLDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQPTYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYEDLPTFGPGTKVDIK Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 9 HCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYSNYDYWGQGTLVTVSSASTKGPCVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDICVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Ab3 之 SEQ ID NO : 15 LCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQPTYIYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYEDLPTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Ab2 及 Ab3 之 SEQ ID NO : 11 HC DNAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGGACTTATAGTAATTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCACTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCGCCGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCTGCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA Ab3 之 SEQ ID NO : 16 LC DNAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGCCTACGTATATCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGAGGATCTCCCTACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC SEQ ID NO : 25 人類 CD33MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ SEQ ID NO : 26 LCDR1 共通序列QASQPTXaa 7Xaa 8IYLN 其中Xaa 7為苯丙胺酸或酪胺酸，且Xaa 8為天冬醯胺酸或異白胺酸 SEQ ID NO : 27 石蟹獼猴 CD33MPLLLLPLLWAGALAMDPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGEGSGRKARKQGVVQGAIGGAGVTVLLALCLCLIFFTVKTHRRKAARTAVGRIDTHPATGPTSSKHQKKSKLHGATETSGCSGTTLTVEMDEELHYASLNFHGMNPSEDTSTEYSEVRTQ SEQ ID NO : 28 人類 CD33 細胞外域DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVT SEQ ID NO : 29 石蟹獼猴 CD33 細胞外域DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTERTIQLNVS
圖 1A - 圖 1B展示在螢光活化細胞分選(FACS)分析中抗人類CD33 Ab2及實例1b之Ab2 GC結合物(1A)以及Ab3 (1B)與人類單核球上之細胞表面CD33結合。 圖 2A - 圖 2B展示Ab2結合於表現CD33之細胞相對於hIgG1陰性對照(2A)不會降解細胞表面或細胞內CD33 (2B)。 圖 3A - 圖 3D展示用實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物治療調節人類PBMC中之IL-6 (3A)及TNFα (3B)細胞介素表現且反應由GC而非由Ab2 (3A-3B)或Ab3 (3C-3D)調節。 圖 4A - 圖 4C展示在隨後㗁唑啉酮攻擊(攻擊1-4A、攻擊2-4B及攻擊3-4C)中，用實例1b之抗人類CD33 Ab2 GC結合物治療以劑量依賴性方式顯著調節(抑制)㗁唑啉酮誘導之皮膚發炎且抑制由GC而非由Ab2驅動。
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Claims (67)

  1. 一種結合人類CD33之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  2. 一種結合人類CD33之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 13； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  3. 一種結合人類CD33之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO: 7且該VL包含SEQ ID NO: 8或14。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC包含SEQ ID NO: 9且該LC包含SEQ ID NO: 10或15。
  6. 一種結合人類CD33之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 18； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  7. 如請求項6之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO: 19且該VL包含SEQ ID NO: 20。
  8. 如請求項6至7中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC包含SEQ ID NO: 21且該LC包含SEQ ID NO: 22。
  9. 如請求項1至4或6至7中任一項之抗體，其中該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該重鏈包含： 胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸； 胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸；或 胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸及胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸。
  10. 如請求項1至4或6至7中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC為人類IgG1同型。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體，其中該抗體為內化抗體。
  12. 如請求項1至10中任一項之抗體，其中該抗體為非耗乏性抗體。
  13. 如請求項1至10中任一項之抗體，其中該抗體為非降解性抗體。
  14. 一種核酸，其包含編碼SEQ ID NO: 9、10、15、21或22之序列。
  15. 一種載體，其包含如請求項14之核酸。
  16. 如請求項15之載體，其中該載體包含編碼SEQ ID NO: 9或21之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、15或22之第二核酸序列。
  17. 一種組合物，其包含有包含編碼SEQ ID NO: 9或21之核酸序列的第一載體及包含編碼SEQ ID NO: 10、15或22之核酸序列的第二載體。
  18. 一種細胞，其包含如請求項15至16中任一項之載體。
  19. 如請求項18之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  20. 一種用於產生抗體之方法，其包含在表現該抗體之條件下培養如請求項18至19之細胞及自該培養基回收該經表現之抗體。
  21. 一種抗體，其藉由如請求項20之方法產生。
  22. 一種結合物，其包含與治療劑結合之如請求項1至13或21中任一項之抗體。
  23. 如請求項22之結合物，其中該治療劑包含細胞毒性劑、siRNA、saRNA、肽、寡核苷酸、小分子、奈米粒子、脂質奈米粒子、胞外體、抗體或其抗原結合片段或其組合。
  24. 一種結合物，其具有下式： 其中Ab為結合人類CD33之抗體， 其中 為： ，或 ， 且n為1至5。
  25. 如請求項24之結合物，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3或17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、13、18或26； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  26. 如請求項24之結合物，其中 為： 。
  27. 如請求項24之結合物，其中 為： 。
  28. 如請求項24或26之結合物，其中 為： 。
  29. 如請求項24或27之結合物，其中 為： 。
  30. 如請求項24或26之結合物，其中 為： 。
  31. 如請求項24或26之結合物，其中 為： 。
  32. 如請求項24或27之結合物，其中 為： 。
  33. 如請求項24或27之結合物，其中 為： 。
  34. 如請求項24至33中任一項之結合物，其中該Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1， 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2， 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3， 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4， 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5，及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  35. 如請求項34之結合物，其中該VH包含SEQ ID NO: 7且該VL包含SEQ ID NO: 8。
  36. 如請求項34至25中任一項之結合物，其中該Ab包含有包含SEQ ID NO: 9之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈(LC)。
  37. 如請求項24至33中任一項之結合物，其中該Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 13； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5； 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  38. 如請求項37之結合物，其中該VH包含SEQ ID NO: 7且該VL包含SEQ ID NO: 14。
  39. 如請求項37至38中任一項之結合物，其中該Ab包含有包含SEQ ID NO: 9之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈(LC)。
  40. 如請求項24至33中任一項之結合物，其中該Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 17； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 18； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5，及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  41. 如請求項40之結合物，其中該VH包含SEQ ID NO: 19且該VL包含SEQ ID NO: 20。
  42. 如請求項40至41中任一項之結合物，其中該Ab包含有包含SEQ ID NO: 21之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 22之輕鏈(LC)。
  43. 如請求項24至35、37至38、40至41中任一項之結合物，其中該Ab包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含： 胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸； 胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸；或 胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸及胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸。
  44. 如請求項24至35、37至38、40至41中任一項之結合物，其中該Ab包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC為人類IgG1同型。
  45. 如請求項44之結合物，其中該人類IgG1同型為效應子無效型。
  46. 如請求項24至45中任一項之結合物，其中n為2至5。
  47. 如請求項24至45中任一項之結合物，其中n為3至5。
  48. 如請求項24至45中任一項之結合物，其中n為3至4。
  49. 如請求項24至45中任一項之結合物，其中n為4。
  50. 如請求項24至45中任一項之結合物，其中n為3。
  51. 如請求項24至45中任一項之結合物，其中n為2。
  52. 一種醫藥組合物，其包含如請求項22至51中任一項之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  53. 一種治療有需要之個體中之骨髓細胞相關之疾病的方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項22至51之結合物或如請求項52之醫藥組合物。
  54. 如請求項53之方法，其中該骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病、神經退化性疾病或癌症。
  55. 如請求項54之方法，其中該免疫疾病為類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、巨大細胞動脈炎、風濕性多肌痛、牛皮癬性關節炎、異位性皮膚炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、皮肌炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、巨噬細胞活化症候群或纖維化疾病。
  56. 如請求項55之方法，其中該免疫疾病為類風濕性關節炎。
  57. 如請求項22至51中任一項之結合物，其係用於療法中。
  58. 如請求項22至51中任一項之結合物或如請求項29之醫藥組合物，其係用於治療骨髓細胞相關之疾病。
  59. 如請求項58之結合物或醫藥組合物，其中該骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病、神經退化性疾病或癌症。
  60. 如請求項59之結合物或醫藥組合物，其中該免疫疾病係選自類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、巨大細胞動脈炎、風濕性多肌痛、牛皮癬性關節炎、異位性皮膚炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、皮肌炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、休格連氏症候群、巨噬細胞活化症候群或纖維化疾病。
  61. 如請求項60之結合物或醫藥組合物，其中該免疫疾病為類風濕性關節炎。
  62. 一種如請求項22至51中任一項之結合物或如請求項52之醫藥組合物的用途，其係用於製造用以治療骨髓細胞相關之疾病之藥劑。
  63. 如請求項62之用途，其中該骨髓細胞相關之疾病為免疫疾病、神經退化性疾病或癌症。
  64. 如請求項64之用途，其中該免疫疾病係選自類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡、巨大細胞動脈炎、風濕性多肌痛、牛皮癬性關節炎、異位性皮膚炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、皮肌炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、休格連氏症候群、巨噬細胞活化症候群或纖維化疾病。
  65. 如請求項65之用途，其中該免疫疾病為類風濕性關節炎。
  66. 一種產生結合物之方法，其包含以下步驟： (a)    用還原劑還原抗人類CD33抗體以產生經還原之抗人類CD33抗體，其中該抗人類CD33抗體包含一或多個經工程改造之半胱胺酸殘基； (b)    用氧化劑氧化該經還原之抗人類CD33抗體以產生經氧化之抗人類CD33抗體；及 (c)    使該經氧化之抗人類CD33抗體與具有下式之化合物接觸 以產生該結合物。
  67. 如請求項66之方法，其中該還原劑為二硫蘇糖醇且該氧化劑為去氫抗壞血酸。
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