TW202340240A - 多特異性抗體及其藥物用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種多特異性抗體及其藥物用途。具體而言，本發明所述多特異性抗體至少包含三個部分：（A）靶向抗原結合部分，（B）半衰期延長部分，和（C）T細胞接合部分。多特異性抗體透過同時結合兩個及兩個以上標靶，能夠同時發揮多種功能，以達到預防和/或治療增生性疾病的作用。

Description

多特異性抗體及其藥物用途

本發明涉及生物醫藥領域，具體而言，涉及多特異性抗體及其藥物用途。

多特異性抗體的概念可追溯至二十世紀60年代，由Nisonoff和他的團隊首先提出以抗體為基礎的分子可以同時結合不同的抗原。發展至今，已有超過百種以上的多特異性抗體結構被研發出來，其中以雙特異性抗體為主要研發重點。

由於各種疾病的病理機制十分複雜，單獨靶向一種抗原的單株抗體在實際臨床治療中存在一定的侷限和不足，因此，多特異性抗體的研發近年來趨於火熱。多特異性抗體透過同時結合兩個及兩個以上標靶，能夠同時發揮多種功能，以達到單株抗體聯用所不能達到的作用。

本發明公開提供一種多特異性抗體、編碼所述多特異性抗體的核酸片段、載體、細胞、組合物、及其製備方法、製藥用途和治療方法。

第一態樣，本發明提供一種多特異性抗體，所述多特異性抗體至少包含三個部分：（A）靶向抗原結合部分，（B）半衰期延長部分，和（C）T細胞接合部分； （A）靶向抗原結合部分：較佳靶向抗原結合抗體或靶向抗原結合配體；所述靶向抗原結合抗體可選自任何抗原結合片段； （B）半衰期延長部分：較佳抗HSA抗體； （C）T細胞接合部分：其中T細胞接合部分較佳抗CD3抗體或抗原結合片段； 所述抗原結合片段較佳Fd、Fv、scFv、雙抗體（diabody）或單域抗體（VHH）； （A）、（B）、（C）三個部分的各片段之間可以透過連接子連接，也可以不透過連接子直接相連。

在一個具體實施方式中，所述多特異性抗體其中（A）靶向抗原結合部分或（C）T細胞接合部分可重複出現或包含多個部分；

在一些實施方案中，多特異性抗體同時包含A1和A2兩個靶向抗原結合部分，A1和A2可以相同，也可以不同；在一些實施方案中，A1和A2結合不同的抗原標靶；在一些實施方案中，A1和A2結合相同抗原標靶的不同決定位。

在一些實施方案中，(C)部分為結合CD3的scFv；更在一些實施方案中，(C)部分為結合人CD3的scFv。

在一個具體實施方式中，所述多特異性抗體，由N端至C端的結構順序為： （1）A(VHH) - B(VHH) - C(VH) - C(VL) （2）A(VHH) - B(VHH) - C(VL) - C(VH) （3）A1(VL) - A1(VH) - A2(VHH) - B(VHH) - C(VH) - C(VL) （4）A1(VL) - A1(VH) - A2(VHH) - B(VHH) - C(VL) - C(VH) （5）A1(VHH) – A2(VL) - C(VH) - C(VL) – A2(VH) - B(VHH) （6）A1(VHH) – A2(VH) - C(VL) - C(VH) – A2(VL) - B(VHH) （7）B(VHH) – A2(VL) - C(VH) - C(VL) – A2(VH) – A1(VHH) （8）B(VHH) – A2(VH) - C(VL) - C(VH) – A2(VL) – A1(VHH)。

在一個具體實施方式中，所述多特異性抗體 (C) T細胞接合部分包含選自如下抗體的互補決定區（CDRs）：OKT3、TRX4、MGA031、Nuvion、SP34、X35、VIT3、BMA030、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、S004-2-03、S004-2-06、S004-2-08、S004-2-10、S004-2-18、6-35.22-hu、1-22.6-1-hu、7-35.6-hu、和6-44.5-hu 。

在一些實施方案中，所述(C) T細胞接合部分包含選自如下的重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs： 重鏈CDR1如SEQ ID NO. 34、39、42、47所示； 重鏈CDR2如SEQ ID NO. 35、40、43、45、48所示； 重鏈CDR3如SEQ ID NO. 36、37、38、41、44、46、49所示； 輕鏈CDR1如SEQ ID NO. 50、55、58、61、64所示； 輕鏈CDR2如SEQ ID NO. 51、56、59、62、65所示； 輕鏈CDR3如SEQ ID NO.52、53、54、57、60、63、66 所示。

在一些實施方案中，所述(C) T細胞接合部分包含與上述重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs具有99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%同一性的序列。在一個具體實施方式中，所述多特異性抗體 (A)部分所述靶向抗原可選自如下的群組：CD19、BCMA、HER2、EGFR、VEGF、MSLN、CD33、CD70、CD5、CD20、CD40、CD47、CD38、CD137、TNF-alpha、HER3、CD27、EphA2、EpCAM、MUC1、MUC17、CEA、Claudin18.2、葉酸受體、Claudin6、WT1、NY-ESO-1、MAGE3、ASGPR1、CDH16、GPRC5D、DLL3、ROR1或GUCY2C。

在一些實施方案中，多特異性抗體同時包含A1和A2兩個靶向抗原結合部分，A1和A2分別結合MSLN的不同決定位；例如MLSN-R1決定位或MSLN-R3決定位。

在一些實施方案中，多特異性抗體同時包含A1和A2兩個靶向抗原結合部分，A1和A2分別結合靶向抗原CD70和CD33。

在一些實施方案中，所述靶向抗原結合部分包含選自如下片段的互補決定區（CDRs）：SEQ ID NO.18-28、103-106。

在一些實施方案中，所述(A)靶向抗原結合部分包含選自如下的重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs： 重鏈CDR1如SEQ ID NO.76、80、89、92、110、113、116所示； 重鏈CDR2如SEQ ID NO.77、79、81、90、93、111、114、117所示； 重鏈CDR3如SEQ ID NO. 78、82、91、94、112、115、118所示； 輕鏈CDR1如SEQ ID NO. 83、86、107所示； 輕鏈CDR2如SEQ ID NO. 84、87、108所示； 輕鏈CDR3如SEQ ID NO.85、88、109所示。

在一些實施方案中，所述(A)靶向抗原結合部分包含與上述重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs具有99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%同一性的序列。

在一個具體實施方式中，所述多特異性抗體 (B)部分包含選自如下片段的互補決定區（CDRs）：SEQ ID NO.15-17。

在一些實施方案中，所述(B)部分包含選自如下的CDRs： CDR1如SEQ ID NO. 67、70、73所示； CDR2如SEQ ID NO. 68、71、74所示；和 CDR3如SEQ ID NO. 69、72、75所示；

在一些實施方案中，所述(B)部分包含與上述CDRs具有99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%同一性的序列。

在一個具體實施方式中，所述多特異性抗體使用連接子連接（A）、（B）、（C）三個部分的各個片段；所述連接子各自獨立地選自：(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n、(GGGGS)n或(GGGGS)n (GGGS)n，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些實施方案中，連接子為GGGGS（Linker1）、GGGGSGGGS（Linker2）、GGGGSGGGGS（Linker3）、GGGGSGGGGSGGGGS（Linker4）、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（Linker5）。

在一些實施方案中，所述多特異性抗體，由N端至C端的結構順序為： （1）A(VHH)-linker2-B(VHH)-linker2-C(VH)-linker4-C(VL) （2）A(VHH)-linker2-B(VHH)-linker2-C(VL)-linker4-C(VH) （3）A1(VL)-linker4-A1(VH)-linker2-A2(VHH)-linker2-B(VHH)-linker2-C(VH)-linker4-C(VL) （4）A1(VL)-linker4-A1(VH)-linker2-A2(VHH)-linker2-B(VHH)-linker2-C(VL)-linker4-C(VH) （5）A1(VHH)-linker3-A2(VL)-linker1-C(VH)-linker5-C(VL)-linker1-A2(VH)-linker3-B(VHH) （6）A1(VHH)-linker3-A2(VH)-linker1-C(VL)-linker5-C(VH)-linker1-A2(VL)-linker3-B(VHH) （7）B(VHH)-linker3-A2(VL)-linker1-C(VH)-linker5-C(VL)-linker1-A2(VH)-linker3-A1(VHH) （8）B(VHH)-linker3-A2(VH)-linker1-C(VL)-linker5-C(VH)-linker1-A2(VL)-linker3-A1(VHH)。

在一個具體實施方式中，多特異性抗體中使用的所述抗體或抗原結合片段為： （1）嵌合抗體或其片段； （2）人源化抗體或其片段；或， （3）全人抗體或其片段；

在一些實施方案中，所述多特異性抗體包含SEQ ID NO. 97、98、99、119、120、121、或122所示序列，或與上述序列具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%同一性的序列。

第二態樣，本發明提供一種分離的核酸片段，所述核酸片段編碼本發明第一態樣所述的多特異性抗體。

第三態樣，本發明提供一種載體（vector），所述載體包含本發明第二態樣所述的核酸片段。

第四態樣，本發明提供一種宿主細胞，所述宿主細胞包含本發明第三態樣所述的載體；在一些實施方案中，所述細胞為原核細胞或真核細胞，例如細菌（大腸桿菌）、真菌（酵母）、昆蟲細胞或哺乳動物細胞（CHO細胞株或293T細胞株）。

第四態樣，本發明提供一種製備本發明所述多特異性抗體的方法，其中，所述方法包括培養第四態樣所述細胞，以及分離所述細胞表現的多特異性抗體。

第五態樣，本發明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發明第一態樣所述的多特異性抗體，或本發明第二態樣所述的核酸片段，或本發明第三態樣所述載體；或本發明第四態樣所述方法製備獲得的產品；可選地，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的運載體（carrier）、稀釋劑或助劑；可選地，所述藥物組合物還包含額外的抗腫瘤劑。

第六態樣，本發明提供一種預防和/或治療增生性疾病、腫瘤疾病、發炎疾病、免疫性病症、自體免疫疾病、傳染性疾病、病毒性疾病、變態反應、寄生蟲反應、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的本發明第一態樣所述的多特異性抗體，或本發明第二態樣所述的核酸片段，或本發明第三態樣所述載體，或本發明第四態樣所述方法製備獲得的產品或本發明第五態樣所述藥物組合物；

在一個具體實施方式中，所述腫瘤疾病為表現MSLN、CD70和/或CD33的實體瘤或表現MSLN、CD70和/或CD33的血液瘤；在一些實施方式中，所述腫瘤疾病為間皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胸膜癌、膽管癌、子宮頸癌、胃癌、白血病、組織細胞淋巴瘤、或腎癌；在一些實施方式中，所述腫瘤疾病為上皮樣惡性胸膜間皮瘤、肺腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、單核細胞白血病、組織細胞淋巴瘤、腎透明細胞腺癌、T淋巴細胞白血病或急性骨髓性白血病。

第七態樣，本發明提供一種第一態樣所述的多特異性抗體，或本發明第二態樣所述的核酸片段，或本發明第三態樣所述載體，或本發明第四態樣所述方法製備獲得的產品或本發明第五態樣所述藥物組合物在製備預防和/或治療疾病的藥物中的用途；所述疾病包含增生性疾病、腫瘤疾病、發炎疾病、免疫性病症、自體免疫疾病、傳染性疾病、病毒性疾病、變態反應、寄生蟲反應、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。

在一個具體實施方式中，所述腫瘤疾病為表現MSLN、CD70和/或CD33的實體瘤或表現MSLN、CD70和/或CD33的血液瘤；在一些實施方式中，所述腫瘤疾病為間皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胸膜癌、膽管癌、子宮頸癌、胃癌、白血病、組織細胞淋巴瘤、或腎癌；在一些實施方式中，所述腫瘤疾病為上皮樣惡性胸膜間皮瘤、肺腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、單核細胞白血病、組織細胞淋巴瘤、腎透明細胞腺癌、T淋巴細胞白血病或急性骨髓性白血病。

相關申請案的交叉引用： 本申請案請求以下2件中國發明專利申請案的權益和優先權，在此將它們的全部內容以援引的方式整體併入本文中：2021年11月17日向中國國家知識產權局提交的第202111361168.1號專利申請案；以及2022年11月02日向中國國家知識產權局提交的第202211362184.7號專利申請案。

除非本文另外定義，本文所有術語均具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的含義。

此外，除非本文另有說明，本文單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。更具體地，如在本說明書和所附請求項中所使用的，除非另外明確指出，否則單數形式「一種」和「這種」包括複數指示物。

本文術語「包括」、「包含」和「具有」之間可互換使用，旨在表示方案的包含性，意味著所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同時應當理解，在本文中使用「包括」、「包含」和「具有」描述，也提供「由……組成」方案。示例性地，「一種組合物，包括A和B」，應當理解為以下技術方案：由A和B組成的組合物，以及除A和B外，還含有其他組分的組合物，均落入前述「一種組合物」的範圍內。

術語「和/或」在本文使用時，包括「和」、「或」和「由所屬術語連接的要素的全部或任何其他組合」的含義。

本文術語「特異性結合」是指抗原結合分子（例如抗體）通常以高親和力特異性結合抗原和實質上相同的抗原，但不以高親和力結合不相關抗原。親和力通常以平衡解離常數（equilibrium dissociation constant，KD）來反映，其中較低KD表示較高親和力。以抗體為例，高親和力通常指具有約10 ^-7M或更低、約10 ^-8M或更低、約1×10 ^-9M或更低、約1×10 ^-10M或更低、1×10 ^-11M或更低或1×10 ^-12M或更低的KD。KD計算方式如下：KD = Kd/Ka，其中Kd表示解離速率，Ka表示結合速率。可採用本領域習知的方法測量平衡解離常數KD，如表面電漿共振（例如Biacore）或平衡透析法測定。

本文術語「抗原結合分子」按最廣義使用，是指特異性結合抗原的分子。示例性地，抗原結合分子包括但不限於抗體或抗體模擬物。「抗體模擬物」是指能夠與抗原特異性結合，但與抗體結構無關的有機化合物或結合域，示例性地，抗體模擬物包括但不限於affibody、affitin、affilin、經設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin)、核酸適體或Kunitz型結構域肽。

本文術語「抗體」按最廣義使用，是指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區的足夠序列和/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區的足夠序列，從而能夠特異性結合至抗原的多肽或多肽組合。本文「抗體」涵蓋各種形式和各種結構，只要它們展現出期望的抗原結合活性。本文「抗體」包括具有移植的互補決定區(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白質支架或人工支架。此類支架包括抗體衍生的支架(其包含引入例如穩定化抗體三維結構的突變)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。參見，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此類支架還可以包括非抗體衍生的支架，例如本領域已知可用於移植CDR的支架蛋白，包括但不限於肌腱蛋白、纖連蛋白、肽適體等。

本文「抗體」包括一種典型的「四鏈抗體」，其屬於由兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC）組成的免疫球蛋白；重鏈是指這樣的多肽鏈，其在N端到C端的方向上由重鏈可變區(VH)、重鏈恆定區CH1結構域、鉸鏈區(HR)、重鏈恆定區CH2結構域、重鏈恆定區CH3結構域組成；並且，當所述全長抗體為IgE同種型時，任選地還包括重鏈恆定區CH4結構域；輕鏈是在N端到C端方向上由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成的多肽鏈；重鏈與重鏈之間、重鏈與輕鏈之間透過二硫鍵連接，形成「Y」字型結構。由於免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將本文「免疫球蛋白」分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分為IgA1和IgA2。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

本文「抗體」還包括 「抗原結合片段」或「抗體片段」，本文「抗原結合片段」和「抗體片段」在本文中可互換使用，其不具備完整抗體的全部結構，僅包含完整抗體的局部或局部的變體，所述局部或局部的變體具備結合抗原的能力。包括但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2、Fd、Fv、scFv、雙抗體（diabody）和單域抗體。

完整抗體的木瓜蛋白酶消化生成兩個同一的抗原結合片段，稱作「Fab」片段，每個含有重和輕鏈可變域，還有輕鏈的恆定域和重鏈的第一恆定域(CH1)。如此，本文術語「Fab片段」指包含輕鏈的VL域和恆定域(CL)的輕鏈片段，和重鏈的VH域和第一恆定域(CH1)的抗體片段。Fab’片段因在重鏈CH1域的羧基末端增加少數殘基而與Fab片段不同，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH是其中恆定域的半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基團的Fab’片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合點位(兩個Fab片段)和Fc區的一部分的F(ab’)2片段。

本文術語「Fd」是指由VH和CH1結構域組成的抗體。本文術語「Fv」是指由單臂VL和VH結構域組成的抗體片段。Fv片段通常被認為是，能形成完整的抗原結合點位的最小抗體片段。一般認為，六個CDR賦予抗體的抗原結合特異性。然而，即便是一個可變區(例如Fd片段，其僅僅含有三個對抗原特異的CDR)也能夠識別並結合抗原，儘管其親和力可能低於完整的結合點位。

本文術語「scFv」（single-chain variable fragment）是指包含VL和VH結構域的單個多肽鏈，其中所述VL和VH透過接頭(linker)相連(參見，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore編，Springer-Verlag，紐約，第269-315頁(1994))。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(GGGGS)4的接頭，但也可使用其變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情況下，scFv的VH與VL之間還可以存在二硫鍵，形成二硫鍵連接的Fv（dsFv）。

本文術語「雙抗體（diabody）」，其VH和VL結構域在單個多肽鏈上表現，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合部位(參見，例如，Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。

本文術語「單域抗體」(single domain antibody,sdAb)、「VHH」和「奈米抗體(nanobody)」具有相同的含義並可互換使用，指複製抗體重鏈的可變區，構築僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體，它是具有完整功能的最小的抗原結合片段。通常先獲得天然缺失輕鏈和重鏈恆定區1(CH1)的抗體後，再複製抗體重鏈的可變區，構築僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體。單域抗體可以衍生自駱駝科重鏈抗體或軟骨綱魚類IgNAR。

本文「抗體」還包括不包含輕鏈的抗體，例如，由單峰駝(Camelus dromedarius)、雙峰駝(Camelus bactrianus)、大羊駝(Lama glama)、原駝(Lama guanicoe)和羊駝(Vicugna pacos)等產生的重鏈抗體（heavy-chain antibodies, HCAbs）以及在鯊等軟骨魚綱中發現的免疫球蛋白新抗原受體（Ig new antigen receptor, IgNAR）。

本文「抗體」可以來源於任何動物，包括但不限於人和非人動物，所述非人動物可選自靈長類動物、哺乳動物、齧齒動物和脊椎動物，例如駱駝科動物、大羊駝、原鴕、羊駝、羊、兔、小鼠、大鼠或軟骨魚綱（例如鯊）。

本文「抗體」包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體的片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。

本文術語「單株抗體」是指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即，除了可能的變異體(例如含有天然存在的突變或在製劑的生產過程中產生，此類變體通常以少量存在)之外，包含所述群體的各個抗體是相同的和/或結合相同的決定位。與通常包括針對不同決定簇(決定位)的不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑中的每種單株抗體針對抗原上的單一決定簇。本文修飾語「單株」不應解釋為需要透過任何特定方法產生所述抗體或抗原結合分子。舉例來說，單株抗體可透過多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤技術、重組DNA方法、噬菌體庫展示技術和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉殖基因動物的方法和其它本領域已知的方法。

本文術語「天然抗體」是指透過多細胞生物體的免疫系統製造和配對的抗體。本文術語「工程化抗體」的抗體是指透過基因工程、抗體工程等技術獲得的非天然抗體，示例性地，「工程化抗體」包括人源化抗體、小分子抗體（例如scFv等）、雙特異性抗體等等。

本文術語「單特異性」是指表示具有一個或多個結合點位，其中每個結合點位結合相同抗原的相同決定位。

本文術語「多特異性抗體」是指具有至少兩個抗原結合點位，所述至少兩個抗原結合點位中的每一個抗原結合點位與相同抗原的不同決定位或與不同抗原的不同決定位結合。因此，諸如「雙特異性」、「三特異性」、「四特異性」等術語是指抗體/抗原結合分子可以結合的不同決定位的數目。

本文術語「價」表示抗體/抗原結合分子中規定數目的結合點位的存在。因此，語「單價」、「二價」、「四價」和「六價」分別表示抗體/抗原結合分子中一個結合點位、兩個結合點位、四個結合點位和六個結合點位的存在。

本文「全長抗體」、「完好抗體」和「完整抗體」在本文中可互換使用，是指具有基本上與天然抗體結構相似的結構。

本文術語「裸抗體」是指不與治療劑或示蹤劑綴合的抗體；術語「綴合抗體」是指與治療劑或示蹤劑綴合的抗體。

本文術語「嵌合抗體(Chimeric antibody)」是指，這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一部分源自一個抗體(其可以源自某一特定物種或屬於某一特定抗體類或亞類)，且輕鏈或/和重鏈的另一部分源自另一個抗體(其可以源自相同或不同的物種或屬於相同或不同的抗體類或亞類)，但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。例如，術語「嵌合抗體」可包括這樣的抗體(例如人鼠嵌合抗體)，其中抗體的重鏈和輕鏈可變區來自第一抗體(例如鼠源抗體)，而抗體的重鏈和輕鏈恆定區來自第二抗體(例如人抗體)。

本文術語「人源化抗體」是指，經基因工程改造的非人源抗體，其胺基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體(供體抗體)，全部或部分的非CDR區(例如，可變區FR和/或恆定區)來自於人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留或部分保留了供體抗體的預期性質，包括但不限於，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫應答的能力等。

本文術語「全人抗體」是指具有其中FR和CDR二者都源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。此外，如果抗體包含恆定區，則恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本文全人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，透過體外隨機或點位特異性誘變或透過體內體細胞突變引入的突變)。然而，本文「全人抗體」不包括其中來源於另一個哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。

本文術語「可變區」是指抗體重鏈或輕鏈中牽涉使抗體結合抗原的區域，「重鏈可變區」與「VH」、「HCVR」可互換使用，「輕鏈可變區」與「VL」、「LCVR」可互換使用。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別是VH和VL)一般具有相似的結構，每個域包含四個保守的框架區(FR)和三個高度變異區(HVR)。參見例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。本文術語「互補決定區」與「CDR」可互換使用，通常指重鏈可變區（VH）或輕鏈可變區（VL）的高度變異區（HVR），該部位因在空間結構上可與抗原決定位形成精密的互補，故又稱為互補決定區，其中，重鏈可變區CDR可縮寫為HCDR，輕鏈可變區CDR可縮寫為LCDR。本術語「構架區」或「FR區」可互換，是指抗體重鏈可變區或輕鏈可變區中除CDR以外的那些胺基酸殘基。通常典型的抗體可變區由4個FR區和3個CDR區按以下順序組成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

對於CDR的進一步描述，參考Kabat等人, J. Biol. Chem.,252:6609-6616 (1977)；Kabat等人, 美國衛生與公共服務部，「Sequences of proteins of immunological interest 」（1991）; Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Al-Lazikani B.等人, J.Mol. Biol., 273: 927-948 (1997); MacCallum 等人, J. Mol.Biol. 262:732-745 (1996); Abhinandan和Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Lefranc M.P.等人, Dev. Comp.Immunol., 27: 55-77 (2003); 以及Honegger和Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)。本文「CDR」可由本領域習知的方式加以標註和定義，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統或IMGT編號系統，使用的工具網站包括但不限於AbRSA網站（http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php）、abYsis網站（www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi）和IMGT網站（http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results）。本文CDR包括不同定義方式的胺基酸殘基的重疊（overlap）和子集。

本文術語「Kabat編號系統」通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比對及編號系統(參見，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。

本文術語「Chothia編號系統」通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白編號系統，其是基於結構環區的位置鑒定CDR區邊界的經典規則(參見，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878- 883)。

本文術語「IMGT編號系統」通常是指基於由Lefranc等人發起的國際免疫遺傳學資訊系統(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的編號系統，可參閱Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。

本文術語「重鏈恆定區」是指抗體重鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出效應子功能，諸如與Fc受體的相互作用，其相對於抗體的可變結構域具有更保守的胺基酸序列。「重鏈恆定區」至少包含：CH1結構域，鉸鏈區，CH2結構域，CH3結構域，或其變體或片段。「重鏈恆定區」包括「全長重鏈恆定區」和「重鏈恆定區片段」，前者具有基本上與天然抗體恆定區基本相似的結構，而後者僅包括「全長重鏈恆定區的一部分」。示例性地，典型的「全長抗體重鏈恆定區」由CH1結構域-鉸鏈區-CH2結構域-CH3結構域組成；當抗體為IgE時，其還包括CH4結構域；當抗體為重鏈抗體時，則其不包括CH1結構域。示例性地，典型的「重鏈恆定區片段」可選自CH1、Fc或CH3結構域。

本文術語「輕鏈恆定區」是指抗體輕鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，所述輕鏈恆定區可選自恆定κ結構域或恆定λ結構域。

本文術語「Fc」是指完整抗體經木瓜蛋白酶水解而成的抗體羧基端部分，典型地，其包含抗體的CH3和CH2結構域。Fc區包括例如天然序列Fc區、重組Fc區和變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可以略微變化，但是人IgG重鏈的Fc區通常被定義為從Cys226位置的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。Fc區的C末端離胺酸(根據Kabat編號系統的殘基447)可以例如在抗體的產生或純化過程中，或透過對編碼抗體重鏈的核酸重組工程化而除去，因此，Fc區可包括或不包括Lys447。

本文術語「保守胺基酸」通常是指屬於同一類或具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性、親水性、主鏈構象和剛性）的胺基酸。示例性地，下述每組內的胺基酸屬於彼此的保守胺基酸殘基，組內胺基酸殘基的替換屬於保守胺基酸的替換： 示例性地，以下六組是被認為是互為保守性置換的胺基酸的實例： （1）丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)； （2）天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)； （3）天門冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)； （4）精胺酸(R)、離胺酸(K)、組胺酸（H）； （5）異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；和 （6）苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。

本文術語「同一性」可透過以下方式計算獲得：為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的「同一性」百分數，將所述序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則所述分子在這個位置處是相同的。

考慮到為最佳比對這兩個序列而需要引入的空位的數目和每個空位的長度，兩個序列之間的同一性百分數隨所述序列共有的相同位置變化而變化。

可以利用數學演算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。例如，使用已經集成至GCG軟體包的GAP程式中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)演算法(在www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。又例如，使用GCG軟體包中的GAP程式(在www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別在一些實施方案中參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum62評分矩陣。

還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12、空位罰分4，利用已經併入ALIGN程式(2.0版)的E.Meyers和W.Miller演算法((1989)CABIOS,4:11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。

額外地或備選地，可以進一步使用本發明所述的核酸序列和蛋白質序列作為「查詢序列」以針對公共資料庫執行檢索，以例如鑒定其他家族成員序列或相關序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程式(版本2.0)執行此類檢索。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程式、評分=100、字長度=12執行，以獲得與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程式、評分=50、字長度=3執行，以獲得與本發明蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了出於比較目的獲得帶空位的比對結果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那樣使用空位BLAST。當使用BLAST和空位BLAST程式時，可以使用相應程式(例如，XBLAST和NBLAST)的默認參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。

本文術語「CD3」（cluster of differention 3），是指來源於任何脊椎動物來源的分化簇3蛋白，包括哺乳動物，如靈長類動物(例如人、猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)。在哺乳動物中，CD3分子是六條鏈的多蛋白質複合體，包括：CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩條CD3ε鏈和CD3ζ鏈的同源二聚體，其中CD3ζ鏈是CD3分子的細胞內尾巴，並且CD3γ鏈、CD3δ鏈和CD3ε鏈全部含有表現在T細胞表面上的胞外域(ECD)。人CD3的示例性的序列包括人CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000724或NCBI：AAH49847.1)、人CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000723)和人CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000064)。非人CD3的示例性的序列包括食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3ε蛋白(NCBIRef Seq No.NP_001270544)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3δ蛋白(NCBI Ref SeqNo.NP_001274617)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001270839)；小鼠CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_031674)、小鼠CD3δ蛋白(NCBI Ref SeqNo.NP_038515)、小鼠CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.AAA37400)；褐家鼠(大鼠)CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001101610)、褐家鼠(大鼠)CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_037301)、褐家鼠(大鼠)CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001071114)。

本文術語「CD3ε」旨在包含任何形式的CD3ε亞基，例如，1)天然未經加工的CD3ε分子，「全長」CD3ε鏈或天然存在的CD3ε變體，包括例如剪接變體或等位基因變體；2)由在細胞中的加工產生的任何形式的CD3ε；或3)透過重組方法產生的CD3ε亞單位的全長、片段(例如截短的形式、胞外域/跨膜域)或修飾的形式(例如突變的形式、糖基化/聚乙二醇化的、組胺酸-標記/免疫螢光融合的形式)。

本文術語「HSA」是指人血清白蛋白，分子量為67kD。HSA蛋白內部存在17個二硫鍵，使得整個蛋白具有很好的穩定性，HSA具有延長半衰期、促進藥物通過血腦屏障等優點，不易通過腎小球，在血漿中的半衰期長達2周，在體內分佈廣泛且沒有免疫原性，是一種比較理想的蛋白藥物載體。

本文術語「CD70」，又名「TNFSF7」或「CD27L」，其為TNF配體家族成員，是CD27（又稱TNFRSF27）的配體。本文「CD70」包括成熟或未成熟的全長野生型CD70蛋白或其突變體（例如點突變、插入突變或缺失突變）、剪切變體（splice variant）、直系同源物（Orthologs）以及前述CD70的片段。本文「CD70」可以來源於人、靈長類動物，如猴（例如恆河猴、食蟹猴）和齧齒類動物，例如小鼠和大鼠。示例性地，人CD70胺基酸序列可參見UniProt號：P32970，恆河猴CD70胺基酸序列可參見UniProt號：F7GPA5。

本文術語「CD33」是唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素(涎免凝集素，sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin，Siglec)家族的最小成員。分子量為67 kDa，由364個胺基酸組成的I型跨膜受體蛋白。其N-端位於胞外，末端胺基酸組成一個保守的V-set免疫球蛋白樣結構域和一個可變的C2-set結構域，其中V-set與唾液酸特異性識別並結合；胞質尾端有一個免疫受體酪胺酸抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)和一個ITIM樣結構，透過與酪胺酸磷酸酶結合向胞內傳遞抑制性訊號，從而達到調節細胞生長的目的。CD33分子中的ITIM序列與其他Siglec不同，其酪胺酸前面的疏水胺基酸被白胺酸和蘇胺酸取代。對其一級結構分析可知，各種生物中CD33分子具有高度保守性。術語「 CD33」包括任何人類和非人類動物物種的CD33蛋白，並且具體地包括人類CD33以及非人類哺乳動物的CD33。

本文術語「MSLN」是指間皮素（Mesothelin，MSLN），是一種存在於正常間皮細胞上的分化抗原，可表現於正常胸膜、心包和腹膜的間皮細胞中。在正常組織中表現有限，但MSLN被發現高表現在上皮樣惡性胸膜間皮瘤、肺腺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺腫瘤和卵巢癌等細胞上。術語「MSLN」包括任何人類和非人類動物物種的MSLN蛋白，並且具體地包括人類MSLN以及非人類哺乳動物的MSLN。

本文術語「核酸」包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物質。每個核苷酸由鹼基，特別是嘌呤或嘧啶鹼基(即胞嘧啶(C)、鳥糞嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即去氧核糖或核糖)和磷酸基團組成。通常，核酸分子由鹼基的序列描述，由此所述鹼基代表核酸分子的一級結構(線性結構)。鹼基的序列通常表示為5′至3′。在本文中，術語核酸分子涵蓋去氧核糖核酸(DNA)，包括例如互補DNA(cDNA)和基因組DNA、核糖核酸(RNA)，特別是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含兩種或更多種這些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是線性的或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義股和反義股二者，以及單股和雙股形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架鍵合或化學修飾的殘基的修飾的核苷酸鹼基。核酸分子還涵蓋DNA和RNA分子，其適合作為載體用於在體外和/或體內，例如在宿主或患者中，直接表現本發明的抗體。此類DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)載體可以是未修飾的或修飾的。例如，可以對mRNA進行化學修飾以增強RNA載體的穩定性和/或被編碼分子的表現，從而可以將mRNA注入到受試者內以在體內產生抗體(參見例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。本文「分離的」核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括在下述細胞中含有的核酸分子，所述細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。

本文術語「載體」是指能夠擴增與其連接的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製型核酸結構的載體以及整合入已引入該載體的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與它們可操作連接的核酸的表現。這樣的載體在本文中稱為「表現載體」。

本文術語「宿主細胞」是指細胞中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括「轉化體」和「經轉化的細胞」，其包括初代的經轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮繼代的次數。後代在核酸內容物上可能與親代細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括具有與在初始轉化的細胞中篩選或選擇的功能相同的功能或生物學活性的突變體後代。

本文術語「藥物組合物」是指這樣的製劑，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不含有對施用所述藥物組合物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。

本文術語「治療」是指外科手術或藥物處理（surgical or therapeutic treatment），其目的是預防、減緩（減少）治療對象中不希望的生理變化或病變，如癌症、自體免疫性疾病和病毒感染的進展。有益的或所希望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定（即，未惡化）、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解（無論是部分緩解或完全緩解），無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療的對象包括已患有病症或疾病的對象以及易於患上病症或疾病的對象或打算預防病症或疾病的對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時，其含義也包括消除、消失、不發生等情況。

本文術語「受試者」是指接受對如本發明所述的特定疾病或病症的治療的生物體。對象和患者的實例包括接受疾病或病症治療的哺乳動物，如人、靈長類動物（例如，猴）或非靈長類哺乳動物。

本文術語「有效量」指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或對象時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。「有效量」還指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩解這些病症的速度增加的化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單指該成分。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無論是組合、連續或同時給予。

本文術語「自體免疫性疾病」是指對象對其自體的細胞、組織和/或器官產生免疫反應而引起的細胞、組織和/或器官損傷的病症。

本文術語「癌症」指向或描述哺乳動物中典型地以不受調節的細胞生長為特徵的生理狀況。此定義中包括良性和惡性癌症。本文術語「腫瘤」或「瘤」是指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語「癌症」和「腫瘤」在本文中提到時並不互相排斥。

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以透過市售購買獲得的常規產品。

本發明實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。

實施例1 多特異性抗體的構築和製備 1.1 多特異性抗體的結構設計 本發明所述多特異性抗體可以為三特異性（tri-specific）或四特異性（tetra-specific）抗體，所述特異性可以指結合不同的抗原標靶，也可以指結合同一抗原標靶的不同決定位。多特異性抗體結構示意請見圖式圖1A-1B和表1，所述多特異性抗體至少包含三個部分：（A）靶向抗原結合部分，（B）半衰期延長部分，和（C）T細胞接合部分。 所述（A）靶向抗原結合部分可選擇靶向抗原結合抗體或靶向抗原結合配體，所述靶向抗原結合抗體可選自任何抗原結合片段，較佳Fd、Fv、scFv、雙抗體（diabody）或單域抗體（VHH）。所述（B）半衰期延長部分較佳抗HSA抗體。所述（C）T細胞接合部分，其中T細胞接合部分較佳抗CD3抗體或抗體片段。 所述多特異性抗體的（A）、（B）、（C）三個部分可以有多種排列或連接方式，如圖1A所示，其中（A）靶向抗原結合部分或（C）T細胞接合部分可重複出現或包含多個部分（例如多特異性抗體同時包含A1和A2兩個靶向抗原結合部分，A1和A2可以相同，也可以不同）。多特異性抗體各個部分之間的連接可以透過linker，也可以不透過linker直接相連。 表1. 多特異性抗體結構示意

結構編號 Format No.	多特異性抗體結構 (N端至C端，各個部分之間的連接可以透過或不透過linker相連)
1	A(VHH) - B(VHH) - C(VH) - C(VL)
2	A(VHH) - B(VHH) - C(VL) - C(VH)
3	A1(VL) - A1(VH) - A2(VHH) - B(VHH) - C(VH) - C(VL)
4	A1(VL) - A1(VH) - A2(VHH) - B(VHH) - C(VL) - C(VH)
5	A1(VHH) – A2(VL) - C(VH) - C(VL) – A2(VH) - B(VHH)
6	A1(VHH) – A2(VH) - C(VL) - C(VH) – A2(VL) - B(VHH)
7	B(VHH) – A2(VL) - C(VH) - C(VL) – A2(VH) – A1(VHH)
8	B(VHH) – A2(VH) - C(VL) - C(VH) – A2(VL) – A1(VHH)

1.2 多特異性抗體的製備 按照1.1所述多特異性抗體結構構築多特異性抗體，其中使用到的（A）靶向抗原結合部分，（B）半衰期延長部分，（C）T細胞接合部分，和/或linker，可選自以下表2所示序列，表2所示抗體序列的CDR區劃分可採用本領域通用的IMGT、Kabat、Chothia、AbM、Contact等編號規則或定義方法，表3僅示例性的展示Kabat方式定義劃分的CDRs，但不作為限制： 表2.抗原結合片段序列資訊

序列名稱	序列編號	胺基酸序列
CD3-VH1	SEQ ID NO.1	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFN TYAMNWVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVR HGNFGNAYISYWAYWGQGTLVTVSS
CD3-VH2	SEQ ID NO.2	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFN TYAMNWVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVR HSNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
CD3-VH3	SEQ ID NO.3	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFN TYAMNWVRQAPGKGLEWVA RIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVR HGNFGNSYISYWAHWGQGTLVTVSS
CD3-VH4	SEQ ID NO.4	EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFT DYYMSWVRQAPGKGLEWVA MSRNKAKGHTIEYSSSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DTYESYDGYFDVWGQGTTVTVSS
CD3-VH5	SEQ ID NO.5	EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKTSGYTFT SYGMSWVRQAPGQGLEWMG WINTYSGVPTYAQDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR LKNNPFVWGQGTTVTVSS
CD3-VH6	SEQ ID NO.6	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFN TYAMNWVRQASGKGLEWVG RIRSKINNYATYYGDSVKDRFTISRDDSKNTFYLQMNSLKTEDTAVYYCVI HENYGSISWFAYWGQGTLVTVSS
CD3-VH7	SEQ ID NO.7	EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGHTFS SHIMHWVRQAPGQGLEWMG YINPNNDRTEYSEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAG EAYYSNSLYAMDYWGQGTTVTVSS
CD3-VL1	SEQ ID NO.8	QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC SSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIG GTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC VLWFSNRWVFGGGTKLTVL
CD3-VL2	SEQ ID NO.9	QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC SSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIG GTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC SLWYSNRWVFGGGTKLTVL
CD3-VL3	SEQ ID NO.10	QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC SSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIG GTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWTFGGGTKLTVL
CD3-VL4	SEQ ID NO.11	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLFNSRSRKNYLAWYQQKPGQTPKLLIY WASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC KQSYYLYTFGQGTKLEIK
CD3-VL5	SEQ ID NO.12	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RSSQLILHSSGNTYLEWYQQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC FQGSHFPWTFGGGTKVEIK
CD3-VL6	SEQ ID NO.13	ETVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFTGLIG GTNNRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC ALWYSNHWVFGGGTKLTVL
CD3-VL7	SEQ ID NO.14	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYYLRTFGGGTKVEIK
HSA-VHH1	SEQ ID NO.15	ELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFS KFGMAWVRQAPGKGLEWVS RINSDGDTTMYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSI GGGSPSGQGTMVTVSS
HSA-VHH2	SEQ ID NO.16	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN YYAMSWFRQAPGKGLEWVS SVSMLGGGTTYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCRQ GGRDALGSRPRGRGTLVTVSS
HSA-VHH3	SEQ ID NO.17	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVDFR LTTMSWVRQAPGKGLEWVS SISMLGGDTRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKFEDMAVYYCVQ GFGASNPRIKSPPGQGTMVTVSS
MSLN-VH1	SEQ ID NO.18	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYNMDWVRQAPGQGLEWMG DINPSTGGTIYNQKFQGRVTMTEDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR RRIGTGYFDVWGQGTTVTVSS
MSLN-VH2	SEQ ID NO.19	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYNMDWVRQAPGQGLEWMG DINPSTGGTIYNQKFNGRVTMTEDKSASTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR RRIGTGYFDVWGQGTTVTVSS
MSLN-VH3	SEQ ID NO.20	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NYWMHWVRQAPGQGLEWMG NINPSSGDSYYNERFMSRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGGLWLAFWGQGTLVTVSS
MSLN-VH4	SEQ ID NO.21	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NYWMHWVRQAPGQGLEWMG NINPSSGDSYYNERFMSRVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGGLWLAFWGQGTLVTVSS
MSLN-VL1	SEQ ID NO.22	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC SASSSVISSYLSWYQQKPDQSPKLLIY RTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC HQWSSFPYTFGGGTKVEIK
MSLN-VL2	SEQ ID NO.23	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQTLLNSVSQNNYLAWYQQKPGQSPTLLIY FASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQHYRTPYTFGGGTKVEIK
MSLN-VL3	SEQ ID NO.24	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQTLLNSVSQNNYLAWYQQKPGQSPKLLIY FASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQHYRTPYTFGGGTKVEIK
MSLN-VHH1	SEQ ID NO.25	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASESGFS ANYMGWYRQAPGKERELVA TINRFGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCRI MRPGNWYWGQGTMVTVSS
MSLN-VHH2	SEQ ID NO.26	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASESGFS ANYMGWYRQAPGKERELVA TINRFGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCRI MRPGNWYWGQGTMVTVSS
MSLN-VHH3	SEQ ID NO.27	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASESGFS ANYMGWYRQAPGKERELVA TINRFGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCRI MRPGNWYWGQGTMVTVSS
MSLN-VHH4	SEQ ID NO.28	EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSIFS GNAVAWYRQAPGKEREAVA VITRDGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCNT ARGAAVDSWGQGTMVTVSS
CD70-VL	SEQ ID NO.103	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC HASQGINSNIGWLLQKPGQSFQGLIY HGTNLEDGVPDRFSGSGSGTDYTLKISRVEAEDVGVYYC VQYAQFPYTFGGGTKVEIK
CD70-VH	SEQ ID NO.104	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYNMNWVRQAPGQRLEWMG IINPYNAGTIYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR QHYYAMDYWGQGTTVTVSS
CD33-VHH1	SEQ ID NO.105	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFT SQDMDYAMGWYRQAPGKQREWVA TITSDEDTNYVDSVKGRFTISRDNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCFA NVRSDRSSLYRNYWGQGTMVTVSS
CD33-VHH2	SEQ ID NO.106	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFV INAAWYRQAPGKQRELVA SISYGGSTNYADRVAGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCRL DPGLALNNRPLYYWGQGTMVTVSS
Linker1	SEQ ID NO.29	GGGGS
Linker2	SEQ ID NO.30	GGGGSGGGS
Linker3	SEQ ID NO.31	GGGGSGGGGS
Linker4	SEQ ID NO.32	GGGGSGGGGSGGGGS
Linker5	SEQ ID NO.33	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的配對
抗體名稱	序列配對	抗體名稱	序列配對
S004-2-03	CD3-VH1+ CD3-VL1	F7.44.20-H5	MSLN-VH1 + MSLN-VL1
S004-2-06	CD3-VH2+ CD3-VL2	F7.44.20-H9	MSLN-VH2 + MSLN-VL1
S004-2-08	CD3-VH2 + CD3-VL1	F2.39.3-H2	MSLN-VH3 + MSLN-VL2
S004-2-10	CD3-VH2 + CD3-VL3	F2.39.3-H5	MSLN-VH4 + MSLN-VL3
S004-2-18	CD3-VH3 + CD3-VL1
6-35.22-hu	CD3-VH4 + CD3-VL4
1-22.6-1-hu	CD3-VH5 + CD3-VL5
7-35.6-hu	CD3-VH6 + CD3-VL6
6-44.5-hu	CD3-VH7 + CD3-VL7

表3.CDR序列資訊

序列名稱	CDR1	CDR2	CDR3
CD3-VH1	TYAMN （SEQ ID NO.34）	RIRSKYNSYATYYADSVKD （SEQ ID NO.35）	HGNFGNAYISYWAY （SEQ ID NO.36）
CD3-VH2	TYAMN （SEQ ID NO.34）	RIRSKYNSYATYYADSVKD （SEQ ID NO. 35）	HSNFGNSYISYWAY （SEQ ID NO.37）
CD3-VH3	TYAMN （SEQ ID NO.34）	RIRSKYNSYATYYADSVKD （SEQ ID NO. 35）	HGNFGNSYISYWAH （SEQ ID NO.38）
CD3-VH4	DYYMS （SEQ ID NO.39）	MSRNKAKGHTIEYSSSVKG （SEQ ID NO.40）	DTYESYDGYFDV （SEQ ID NO.41）
CD3-VH5	SYGMS （SEQ ID NO.42）	WINTYSGVPTYAQDFKG （SEQ ID NO.43）	LKNNPFV （SEQ ID NO.44）
CD3-VH6	TYAMN （SEQ ID NO.34）	RIRSKINNYATYYGDSVKD （SEQ ID NO.45）	HENYGSISWFAY （SEQ ID NO.46）
CD3-VH7	SHIMH （SEQ ID NO.47）	YINPNNDRTEYSEKFKG （SEQ ID NO.48）	EAYYSNSLYAMDY （SEQ ID NO.49）
CD3-VL1	SSSTGAVTSGNYPN （SEQ ID NO.50）	GTKFLSP （SEQ ID NO.51）	VLWFSNRWV （SEQ ID NO.52）
CD3-VL2	SSSTGAVTSGNYPN （SEQ ID NO.50）	GTKFLSP （SEQ ID NO.51）	SLWYSNRWV （SEQ ID NO.53）
CD3-VL3	SSSTGAVTSGNYPN （SEQ ID NO.50）	GTKFLSP （SEQ ID NO.51）	VLWYSNRWT （SEQ ID NO.54）
CD3-VL4	KSSQSLFNSRSRKNYLA （SEQ ID NO.55）	WASIRES （SEQ ID NO.56）	KQSYYLYT （SEQ ID NO.57）
CD3-VL5	RSSQLILHSSGNTYLE（SEQ ID NO.58）	KVSNRFS （SEQ ID NO.59）	FQGSHFPWT （SEQ ID NO.60）
CD3-VL6	RSSTGAVTTSNYAN （SEQ ID NO.61）	GTNNRAP （SEQ ID NO.62）	ALWYSNHWV （SEQ ID NO.63）
CD3-VL7	KSSQSLFNSRTRKNYLA （SEQ ID NO.64）	WASTRES （SEQ ID NO.65）	KQSYYLRT （SEQ ID NO.66）
HSA-VHH1	KFGMA （SEQ ID NO.67）	RINSDGDTTMYADSAKG （SEQ ID NO.68）	GGGSP （SEQ ID NO.69）
HSA-VHH2	YYAMS （SEQ ID NO.70）	SVSMLGGGTTYADSVKG （SEQ ID NO.71）	GGRDALGSRP （SEQ ID NO.72）
HSA-VHH3	LTTMS （SEQ ID NO.73）	SISMLGGDTRYADSVKG （SEQ ID NO.74）	GFGASNPRIKSP （SEQ ID NO.75）
MSLN-VH1	DYNMD （SEQ ID NO.76）	DINPSTGGTIYNQKFQG （SEQ ID NO.77）	RRIGTGYFDV （SEQ ID NO.78）
MSLN-VH2	DYNMD （SEQ ID NO.76）	DINPSTGGTIYNQKFNG （SEQ ID NO.79）	RRIGTGYFDV （SEQ ID NO.78）
MSLN-VH3	NYWMH （SEQ ID NO.80）	NINPSSGDSYYNERFMS （SEQ ID NO.81）	SGGLWLAF （SEQ ID NO.82）
MSLN-VH4	NYWMH （SEQ ID NO.80）	NINPSSGDSYYNERFMS （SEQ ID NO.81）	SGGLWLAF （SEQ ID NO.82）
MSLN-VL1	SASSSVISSYLS （SEQ ID NO.83）	RTSNLAS （SEQ ID NO.84）	HQWSSFPYT （SEQ ID NO.85）
MSLN-VL2	KSSQTLLNSVSQNNYLA （SEQ ID NO.86）	FASTRES （SEQ ID NO.87）	QQHYRTPYT （SEQ ID NO.88）
MSLN-VL3	KSSQTLLNSVSQNNYLA （SEQ ID NO.86）	FASTRES （SEQ ID NO.87）	QQHYRTPYT （SEQ ID NO.88）
MSLN-VHH1	ANYMG （SEQ ID NO.89）	TINRFGSTNYADSVKG （SEQ ID NO.90）	MRPGNWY （SEQ ID NO.91）
MSLN-VHH2	ANYMG （SEQ ID NO.89）	TINRFGSTNYADSVKG （SEQ ID NO.90）	MRPGNWY （SEQ ID NO.91）
MSLN-VHH3	ANYMG （SEQ ID NO.89）	TINRFGSTNYADSVKG （SEQ ID NO.90）	MRPGNWY （SEQ ID NO.91）
MSLN-VHH4	GNAVA （SEQ ID NO.92）	VITRDGDTYYADSVKG （SEQ ID NO.93）	ARGAAVDS （SEQ ID NO.94）
CD70-VL	HASQGINSNIG （SEQ ID NO.107）	HGTNLED （SEQ ID NO.108）	VQYAQFPYT （SEQ ID NO.109）
CD70-VH	DYNMN （SEQ ID NO.110）	IINPYNAGTIYNQKFKG （SEQ ID NO.111）	QHYYAMDY （SEQ ID NO.112）
CD33-VHH1	SQDMDYAMG （SEQ ID NO.113）	TITSDEDTNYVDSVKG （SEQ ID NO.114）	NVRSDRSSLYRNY （SEQ ID NO.115）
CD33-VHH2	INAA （SEQ ID NO.116）	SISYGGSTNYADRVAG （SEQ ID NO.117）	DPGLALNNRPLYY （SEQ ID NO.118）

將含有編碼多特異性抗體胺基酸序列（請見表4）的核苷酸序列分別構築重組質體。多特異性抗體結構示意如圖1B中所示。質體構築及抗體的表現純化工作均由泰州市百英生物科技有限公司完成。在多特異性抗體大規模篩選階段，為了方便小體積的抗體表現和純化，以及快速檢測，在多特異性抗體的C端加入了標籤His tag（HHHHHH）；初步篩選出候選抗體後，採用無His tag的抗體序列，最佳化了抗體表現和純化的方法。用於動物實驗的多特異性抗體序列如表4所示，C端無His tag。將質體和轉染試劑 （Thermofisher，貨號：A29133 ）加入OptiPRO SFM（Thermofisher，貨號：12309019）中混勻後靜置5分鐘，加入ExpiCHO-S™細胞（廠家：Thermofisher，貨號：A29127）中，放入5% CO ₂，120rpm，37℃ 搖床培養。轉染第二天，加入補料，並將搖床溫度調至32℃繼續培養。轉染第9天，收集細胞上清。將細胞表現上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將置換後的上清樣品放上管柱結合，用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰。收集的洗脫產物濃縮後可用凝膠層析Superdex200（GE）進一步純化，流動相為PBS，去除聚體及雜蛋白峰，收集目的產物洗脫峰。所得到的蛋白經電泳，SEC-HPLC鑒定後分裝備用。

1.3 控制組抗體的製備 Anti-MSLN的陽性控制組抗體和陰性控制組抗體的序列來自專利US20180327508A1的SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:99，分別命名為MB001和MB060（序列參見表4），均為三特異性抗體，結構示意如圖1B中所示。陽性控制組抗體和陰性控制組抗體均由泰州市百英生物科技有限公司完成質體構築及抗體的生產純化，具體方法參見實施例1.2。 表4. 多特異性抗體序列資訊

多特異性抗體編號	序列編號	胺基酸序列
MB001	SEQ ID NO.95	QVQLVESGGGVVQAGGSLTLSCAASGSTFSIRAMRWYRQAPGTERDLVAVIYGSSTYYADAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNADTIGTARDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLHHHHHH
MB060	SEQ ID NO.96	QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLHHHHHH
MB048	SEQ ID NO.97	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASESGFSANYMGWYRQAPGKERELVATINRFGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCRIMRPGNWYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGSELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSKFGMAWVRQAPGKGLEWVSRINSDGDTTMYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSIGGGSPSGQGTMVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNAYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCSSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWFSNRWVFGGGTKLTVL (MSLN-VHH1)-Linker2-(HSA-VHH1)-Linker2-(CD3-VH1)-Linker4-(CD3-VL1)
MB065	SEQ ID NO.98	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSVISSYLSWYQQKPDQSPKLLIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQWSSFPYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPSTGGTIYNQKFQGRVTMTEDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIGTGYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASESGFSANYMGWYRQAPGKERELVATINRFGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCRIMRPGNWYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGSELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSKFGMAWVRQAPGKGLEWVSRINSDGDTTMYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSIGGGSPSGQGTMVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNAYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCSSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWFSNRWVFGGGTKLTVL (MSLN-VL1)-Linker4-(MSLN-VH1)-Linker2-(MSLN-VHH1)-Linker2-(HSA-VHH1)- Linker2-(CD3-VH1)- Linker4-(CD3-VL1)
MB069	SEQ ID NO.99	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASESGFSANYMGWYRQAPGKERELVATINRFGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCRIMRPGNWYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSEIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSVISSYLSWYQQKPDQSPKLLIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQWSSFPYTFGGGTKVEIKGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNAYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCSSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWFSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGDINPSTGGTIYNQKFQGRVTMTEDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIGTGYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSKFGMAWVRQAPGKGLEWVSRINSDGDTTMYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSIGGGSPSGQGTMVTVSS (MSLN-VHH1)-Linker3-(MSLN-VL1)-Linker1-(CD3-VH1)-Linker5-(CD3-VL1) -Linker1-(MSLN-VH1) -Linker3-(HSA-VHH1)
1# （同BDD20-09-1#）	SEQ ID NO.119	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCHASQGINSNIGWLLQKPGQSFQGLIYHGTNLEDGVPDRFSGSGSGTDYTLKISRVEAEDVGVYYCVQYAQFPYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMNWVRQAPGQRLEWMGIINPYNAGTIYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQHYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFTSQDMDYAMGWYRQAPGKQREWVATITSDEDTNYVDSVKGRFTISRDNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCFANVRSDRSSLYRNYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGSELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSKFGMAWVRQAPGKGLEWVSRINSDGDTTMYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSIGGGSPSGQGTMVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHSNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCSSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWFSNRWVFGGGTKLTVL (CD70-VL)-Linker4-(CD70-VH)-Linker2-(CD33-VHH1)-Linker2-(HSA-VHH1)- Linker2-(CD3-VH2)- Linker4-(CD3-VL1)
2# （同BDD20-09-2#）	SEQ ID NO.120	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCHASQGINSNIGWLLQKPGQSFQGLIYHGTNLEDGVPDRFSGSGSGTDYTLKISRVEAEDVGVYYCVQYAQFPYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMNWVRQAPGQRLEWMGIINPYNAGTIYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQHYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFVINAAWYRQAPGKQRELVASISYGGSTNYADRVAGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCRLDPGLALNNRPLYYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGSELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSKFGMAWVRQAPGKGLEWVSRINSDGDTTMYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSIGGGSPSGQGTMVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHSNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCSSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWFSNRWVFGGGTKLTVL (CD70-VL)-Linker4-(CD70-VH)-Linker2-(CD33-VHH2)-Linker2-(HSA-VHH1)- Linker2-(CD3-VH2)- Linker4-(CD3-VL1)
9# （同BDD20-09-9#）	SEQ ID NO.121	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFVINAAWYRQAPGKQRELVASISYGGSTNYADRVAGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCRLDPGLALNNRPLYYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGSELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSKFGMAWVRQAPGKGLEWVSRINSDGDTTMYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSIGGGSPSGQGTMVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHSNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCSSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWFSNRWVFGGGTKLTVL (CD33-VHH2)-Linker2-(HSA-VHH1)-Linker2-(CD3-VH2)-Linker4-(CD3-VL1)
15# （同BDD20-09-15#）	SEQ ID NO.122	ELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSKFGMAWVRQAPGKGLEWVSRINSDGDTTMYADSAKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSIGGGSPSGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCHASQGINSNIGWLLQKPGQSFQGLIYHGTNLEDGVPDRFSGSGSGTDYTLKISRVEAEDVGVYYCVQYAQFPYTFGGGTKVEIKGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNSYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHSNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCSSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLSPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWFSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMNWVRQAPGQRLEWMGIINPYNAGTIYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQHYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFVINAAWYRQAPGKQRELVASISYGGSTNYADRVAGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCRLDPGLALNNRPLYYWGQGTMVTVSS (HSA-VHH1)-Linker3-(CD70-VL)-Linker1-(CD3-VH2)-Linker5-(CD3-VL1) -Linker1-(CD70-VH) -Linker3-(CD33-VHH2)

實施例2 Anti-MSLN多特異性抗體與蛋白或細胞的結合能力鑒定 2.1酵素結合免疫吸附實驗（ELISA）檢測抗體與人血清白蛋白的結合 為檢測Anti-MSLN多特異性抗體與人血清白蛋白的結合活性，將人血清白蛋白（HSA，購自成都蓉生，貨號：國藥准字S10940024）、猴血清白蛋白（CSA，購自：Abcam，貨號：ab184894）、小鼠血清白蛋白（MSA，購自：Alpha Diagnist，貨號：ALB14-N-10）用PBS稀釋到終濃度4µg/mL，然後以50µl/孔加到96孔ELISA盤，用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用PBST洗盤2次，加入阻斷液[PBS +2%（w/w）BSA]室溫阻斷2小時。倒掉阻斷液，PBST洗盤2次，按50µl/孔加入起始濃度100nM或者200nM，1:3梯度稀釋的待測抗體或控制組抗體。37℃孵育1小時後，用PBST洗盤3次。加入HRP（山葵過氧化酶）標記的Anti-his二級抗體（購自Genscript，貨號：A00612），37℃孵育半小時後，用PBST洗盤5次。按50µl/孔加入TMB受質，室溫孵育10~15分鐘後，加入50µl/孔的終止液（1.0N HCl）。用ELISA讀盤機（Multimode Plate Reader，EnSight，購自Perkin Elmer）讀取OD450nm數值。實驗結果如圖2A~2C和表5-7所示。其中MB060為陰性控制組；MB001為陽性控制組。表中的數據為OD450nm值。結果說明，所有Anti-MSLN多特異性抗體與人血清白蛋白均有結合活性，且與猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白有交叉結合活性。 表5 Anti-MSLN多特異性抗體與HSA的結合

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
2.00E+02	3.20	3.03	3.07	3.06	2.99
2.22E+01	3.02	2.86	2.89	2.99	2.82
7.41E+00	2.78	2.79	2.70	2.85	2.61
2.47E+00	2.21	2.20	2.01	2.33	1.76
8.23E-01	0.92	1.10	1.06	1.31	0.72
2.74E-01	0.27	0.30	0.33	0.51	0.21
9.14E-02	0.10	0.10	0.10	0.18	0.10
3.05E-02	0.07	0.06	0.06	0.09	0.07
1.02E-02	0.06	0.06	0.06	0.07	0.06
3.39E-03	0.06	0.06	0.06	0.07	0.07
0	0.07	0.06	0.06	0.06	0.06

表6 Anti-MSLN多特異性抗體與CSA的結合

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
2.00E+02	3.10	2.86	2.82	2.90	2.75
6.67E+01	2.95	2.88	2.76	2.86	2.79
2.22E+01	2.97	2.77	2.74	2.80	2.68
7.41E+00	2.67	2.68	2.55	2.75	2.35
2.47E+00	1.99	2.11	1.93	2.27	1.58
8.23E-01	0.87	1.08	0.96	1.30	0.61
2.74E-01	0.26	0.30	0.30	0.48	0.19
9.14E-02	0.10	0.11	0.11	0.17	0.09
3.05E-02	0.07	0.07	0.08	0.09	0.07
1.02E-02	0.07	0.07	0.07	0.07	0.07
3.39E-03	0.07	0.07	0.07	0.07	0.07
0	0.07	0.07	0.07	0.06	0.06

表7 Anti-MSLN多特異性抗體與MSA的結合

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
2.00E+02	2.90	2.81	2.70	2.85	2.73
6.67E+01	2.46	2.59	2.51	2.72	2.58
2.22E+01	1.80	2.46	2.16	2.57	1.68
7.41E+00	0.97	2.18	1.46	2.23	0.77
2.47E+00	0.29	1.35	0.63	1.51	0.25
8.23E-01	0.10	0.52	0.19	0.69	0.11
2.74E-01	0.07	0.14	0.08	0.21	0.08
9.14E-02	0.06	0.07	0.06	0.08	0.07
3.05E-02	0.06	0.05	0.05	0.06	0.06
1.02E-02	0.06	0.06	0.05	0.05	0.06
3.39E-03	0.06	0.06	0.05	0.05	0.06
0	0.07	0.06	0.06	0.06	0.06

2.2酵素結合免疫吸附實驗（ELISA）檢測多特異性抗體同時結合MSLN蛋白和CD3蛋白的能力 將人MSLN膜外段蛋白（296-580, GenBank: AAH09272.1，His-tag，自行表現）用PBS稀釋到終濃度2µg/mL，然後以50µl/孔加到96孔ELISA盤，用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用PBST洗盤2次，加入阻斷液[PBS +2%（w/w）BSA]室溫封閉2小時。倒掉阻斷液，PBST洗盤2次，按50µl/孔加入起始濃度100nM或者200nM，1:3梯度稀釋的待測抗體或控制組抗體。37℃孵育1小時後，用PBST洗盤3次。稀釋人CD3蛋白（購自Sino Biological，貨號：10977-H03H）和猴CD3蛋白（購自：Acro，貨號：CDE-C5254）至2µg/mL，按50µl/孔加入到96孔ELISA盤。37℃孵育1小時後，用PBST洗盤3次。加入HRP（山葵過氧化酶）標記的Anti-hFc二級抗體（購自Merck，貨號：AP113P），37℃孵育半小時後，用PBST洗盤5次。按50µl/孔加入TMB受質，室溫孵育10~15分鐘後，加入50µl/孔的終止液（1.0N HCl）。用ELISA讀盤機（Multimode Plate Reader，EnSight，購自Perkin Elmer）讀取OD450nm數值。實驗結果如圖3A~3B和表8-9所示。其中MB060為陰性控制組；MB001為陽性控制組。表中的數據為OD450nm值。結果說明，所有Anti-MSLN多特異性抗體具備同時結合MSLN蛋白和CD3蛋白的能力；且與猴CD3蛋白有交叉結合活性。 表8 Anti-MSLN多特異性抗體與人CD3蛋白的結合

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
2.00E+02	2.62	1.84	1.88	2.03	0.09
6.67E+01	2.30	1.69	1.74	1.87	0.08
2.22E+01	2.20	1.61	1.65	2.01	0.07
7.41E+00	2.29	1.47	1.56	1.77	0.07
2.47E+00	2.28	1.17	1.17	1.37	0.07
8.23E-01	1.60	0.82	0.76	0.82	0.07
2.74E-01	0.96	0.29	0.18	0.30	0.07
9.14E-02	0.45	0.11	0.09	0.11	0.07
3.05E-02	0.15	0.08	0.07	0.08	0.07
1.02E-02	0.09	0.07	0.08	0.08	0.07
3.39E-03	0.08	0.07	0.07	0.07	0.07
0	0.07	0.07	0.08	0.07	0.08

表9 Anti-MSLN多特異性抗體與猴CD3蛋白的結合

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
2.00E+02	2.85	1.94	1.96	2.11	0.07
6.67E+01	2.48	1.99	1.97	2.16	0.06
2.22E+01	2.25	1.80	2.02	2.21	0.06
7.41E+00	2.17	1.92	1.90	2.09	0.07
2.47E+00	2.26	1.64	1.72	1.90	0.06
8.23E-01	1.87	0.94	1.10	1.33	0.06
2.74E-01	1.18	0.37	0.31	0.43	0.06
9.14E-02	1.03	0.21	0.10	0.12	0.06
3.05E-02	0.14	0.07	0.07	0.07	0.07
1.02E-02	0.08	0.06	0.06	0.06	0.06
3.39E-03	0.07	0.07	0.06	0.06	0.06
0	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06

2.3 流式細胞實驗（FACS）檢測抗體與腫瘤細胞的結合 實驗中使用MSLN高表現的人卵巢癌細胞株OVCAR3（購自ATCC，貨號：HTB-161）、MSLN中表現的人子宮頸癌細胞株Hela和人胰腺癌細胞株Hs766T（購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心）、MSLN低表現的人肺癌細胞株NCI-H292（購自ATCC，貨號： CRL-1848）以及不表現人MSLN 蛋白的人皮膚癌細胞株A431。 將所需細胞在T175細胞培養瓶中擴大培養至對數生長期，吸除培養基，用PBS緩衝液洗滌2次，用胰蛋白酶消化細胞，然後用完全培養基終止消化，並吹打細胞至單細胞懸液。細胞計數後，離心，細胞沉澱用PBS洗滌2次，將細胞沉澱用FACS緩衝液（PBS +2%胎牛血清）重懸至2×10 ⁶細胞/mL，按每孔50 µl加入到96孔FACS反應盤中，按50µl/孔加入待測抗體或控制組抗體（200nM為起始濃度，3倍或者5倍梯度稀釋），與細胞懸液混勻，4℃孵育1小時。用PBS緩衝液離心洗滌3次，加入每孔50 µl iFluor 647標記的Anti-His二級抗體（購自Genscript，貨號：A01802-100），4℃孵育1小時。用PBS緩衝液離心洗滌3次，100 µl PBS重懸後用FACS（FACS Canto ^TM，購自BD公司）檢測和分析結果。透過軟體（CellQuest）進行數據分析，得到細胞的平均螢光密度（MFI）。再透過軟體（GraphPad Prism8）分析，進行數據擬合，計算EC50。分析結果如圖4A~4E以及表10所示，其中MB060為陰性控制組；MB001為陽性控制組。結果可見Anti-MSLN多特異性抗體與不同表現程度的腫瘤細胞均有結合活性，且與不表現人MSLN蛋白的A431細胞無結合活性，表明Anti-MSLN多特異性抗體可特異性的結合表現人MSLN蛋白的腫瘤細胞。 表10 Anti-MSLN多特異性抗體與腫瘤細胞的結合反應

抗體名稱	MSLN表現量	檢測值	MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
OVCAR3	+++	最大_MFI	2322	1715	2109	1503	97
EC50 (nM)	4.76	2.67	1.26	1.39	不結合
Hela	++	最大_MFI	1224	929	1131	1069	109
EC50 (nM)	0.14	0.09	0.16	0.14	不結合
Hs766T	++	最大_MFI	771	534	749	638	97
EC50 (nM)	0.03	0.03	0.12	0.11	不結合
NCI-H292	+	最大_MFI	211	189	201	196	112
EC50 (nM)	1	0.27	0.22	0.21	不結合
A431	-	最大_MFI	86	83	86	86	87
EC50 (nM)	不結合	不結合	不結合	不結合	不結合

2.4 流式細胞實驗（FACS）檢測抗體與HEK293T-hMSLN-R3的結合 表現人MSLN-R3蛋白的重組HEK293T細胞株HEK293T-hMSLN-R3的製備方法請參見PCT/CN2021/136419（編碼人MSLN-R3胺基酸序列（NCBI：AAH09272.1的Met487-Ser606）的核苷酸序列被複製到pcDNA3.1載體並製備質體。對HEK293T細胞株（購自ATCC）進行質體轉染(Lipofectamine® 3000 Transfection Kit，購自Invitrogen，貨號：L3000-015)後，使用嘌呤黴素和選擇性培養2周，分選陽性單株細胞到96孔盤並選擇部分單株孔進行擴增。對擴增後的複製體用特異性抗體經FACS流式細胞儀檢測和分析，選擇生長趨勢較好、螢光強度較高的細胞株繼續擴大培養並液態氮凍存。檢測顯示經過嘌呤黴素加壓篩選後的HEK293T-hMSLN-R3具有相對單一的陽性峰）。檢測細胞和待測抗體的準備以及檢測方法參照實施例2.3。分析結果如圖5以及表11所示。結果可見MB065和MB069與表現人MSLN-R3蛋白的重組細胞有結合活性，表明Anti-MSLN單株抗體組合成多特異性抗體後保留了單株抗體的特性；而MB001不與表現人MSLN-R3蛋白的重組細胞結合。 表11 Anti-MSLN多特異性抗體與HEK293T-hMSLN-R3的結合反應

抗體名稱	HEK293T-hMSLN-R3
最大_MFI	EC50 (nM)
MB065	9674	3.67
MB069	14800	4.22
MB001	519	不結合

2.5 流式細胞實驗（FACS）檢測抗體與HEK293T-猴MSLN的交叉結合 表現猴MSLN蛋白的重組HEK293T細胞株HEK293T-猴MSLN的製備方法請參見PCT/CN2021/136419（編碼猴MSLN全長胺基酸序列（NCBI：XP_028696439.1）的核苷酸序列被複製到pcDNA3.1載體並製備質體。對HEK293T細胞株(購自ATCC)進行質體轉染(Lipofectamine® 3000 Transfection Kit，購自Invitrogen，貨號：L3000-015)後，使用嘌呤黴素和選擇性培養2周，分選陽性單株細胞到96孔盤並選擇部分單株孔進行擴增。對擴增後的複製體用特異性抗體經FACS流式細胞儀檢測和分析，選擇生長趨勢較好、螢光強度較高的細胞株繼續擴大培養並液態氮凍存。檢測顯示經過嘌呤黴素加壓篩選後的HEK293T-猴 MSLN具有相對單一的陽性峰）。檢測細胞和待測抗體的準備以及檢測方法參照實施例2.3。分析結果如圖6A~6B以及表12所示，其中MB060為陰性控制組。結果可見所有Anti-MSLN多特異性抗體均與表現猴MSLN蛋白的重組細胞有特異性的結合活性。 表12 Anti-MSLN多特異性抗體與HEK293T-猴MSLN的結合反應

抗體名稱	HEK293T-猴MSLN	HEK293T
最大_MFI	EC50 (nM)	最大_MFI	EC50 (nM)
MB001	4803	1.16	650	不結合
MB048	4735	1.74	557	不結合
MB065	6322	1.66	516	不結合
MB069	3760	1.17	489	不結合
MB060	168	不結合	545	不結合

2.6 流式細胞實驗（FACS）檢測抗體與表現CD3蛋白的人T細胞的結合 將人PBMC細胞（採購於澳賽爾斯生物技術（上海）有限公司）按照T Cell Activation/Expansion Kit, human（購自美天旎，貨號：130-091-441）的說明書描述完成T細胞的分離和體外活化擴增實驗。當細胞培養至14天時，離心棄去培養基上清，細胞沉澱用PBS洗滌2次。用SP34抗體作為一級抗體，Alexa647標記的二級抗體（購自Jackson Immuno，貨號：109-605-098）進行FACS（FACS CantoTM，購自BD公司）檢測，結果表明人T細胞經擴增有較高的CD3蛋白表現。 上述檢測細胞和待測抗體的準備以及檢測方法參照實施例2.3。分析結果如圖7A~7B以及表13所示。結果可見所有Anti-MSLN多特異性抗體均與表現人CD3蛋白的人T細胞有結合活性，且與表現猴CD3蛋白的猴T細胞有交叉結合活性。 表13 Anti-MSLN多特異性抗體與表現CD3蛋白的細胞的結合反應

抗體名稱	MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
人T細胞	最大_MFI	10273	3002	1442	1639	9415
EC50 (nM)	8.54	31.85	97.52	88.89	17.94
猴T細胞	最大_MFI	8867	2079	747	650	8578
EC50 (nM)	19.96	93.74	265	64.69	20.04

實施例3 Anti-MSLN多特異性抗體報導基因實驗 為檢測Anti-MSLN多特異性抗體是否能夠活化T細胞內的NFAT訊號通路，特別建立該報導基因的實驗方法。多特異性抗體可以同時結合Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16a細胞（購自：Promega，CD3陽性）和表現MSLN的腫瘤細胞（OVCAR3、Hela、Hs766T、NCI-H292），從而引起Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16a細胞內NFAT相關訊號通路活化，螢光素酶表現程度上升，加入受質後即可檢測到螢光訊號。螢光訊號的強度可以表示訊號通路活化的強度。 腫瘤細胞的準備過程參照實施例2.3，調整細胞密度至4×10 ⁵細胞/ml，按每孔100 µl加入到96孔細胞培養盤中，放置細胞培養箱培養過夜。棄除細胞培養基，並用PBS清洗兩遍後，按50µl/孔加入待測抗體或控制組抗體（60nM為起始濃度， 5倍梯度稀釋，10~12個稀釋點），再加入50µl/孔的Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16a細胞（密度為1×10 ⁶細胞/ml），混合均勻後放置細胞培養箱培養6小時。取出靜置到室溫後，加入50µl/孔的Bright-Glo™ Luciferase Assay System（購自Promega，貨號：E2620），震盪、避光反應5分鐘後，轉移混懸液至檢測板中（購自Costar，貨號：3610），用EnSight（購自：Perkin Elmer）檢測，再透過軟體（GraphPad Prism8）分析，進行數據擬合，計算EC50。分析結果如圖8A~8D以及表14-17所示，其中MB060為陰性控制組，MB001為陽性控制組。結果可見所有Anti-MSLN多特異性抗體均可活化Jurkat-NFAT-Luciferase-CD16a細胞內NFAT相關訊號通路。 表14 Anti-MSLN多特異性抗體報導基因實驗（OVCAR3）

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
3.00E+01	2669780	2978410	3031250	2928470	467360
6.00E+00	2859040	3030520	3088000	2903260	449640
1.20E+00	2817120	3040160	3188030	2880810	219530
2.40E-01	2846900	2830030	3100560	2857610	36710
4.80E-02	2507910	2017310	2399640	2202880	26660
9.60E-03	1827120	1077920	979840	1310840	25220
1.92E-03	1099460	531840	220610	582660	24690
3.84E-04	662990	435600	74030	299550	24540
7.68E-05	363140	255920	62160	145620	24660
1.54E-05	208200	178430	39010	119200	25160

表15 Anti-MSLN多特異性抗體報導基因實驗（Hela）

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
3.00E+01	1624850	1371380	1457630	1445790	412000
6.00E+00	1560890	1513810	1474420	1462710	437920
1.20E+00	1563880	1477800	1533790	1563470	325430
2.40E-01	1603960	1454290	1539750	1531740	93810
4.80E-02	1566340	1347460	1410610	1434700	30510
9.60E-03	1452180	1042220	892750	1173970	22740
1.92E-03	1285340	755810	375140	789530	22200
3.84E-04	1133150	585890	275830	637690	21940
7.68E-05	848650	389790	97380	387040	23190
1.54E-05	643670	318190	50600	292920	20890
3.07E-06	528710	236070	38100	205550	22480
6.14E-07	461280	227070	35280	190000	21700

表16 Anti-MSLN多特異性抗體報導基因實驗（Hs766T）

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
3.00E+01	1136130	683640	736940	723940	386320
6.00E+00	1114530	785650	745140	752060	407940
1.20E+00	1127870	819140	775390	803680	277220
2.40E-01	1127160	806510	793190	813700	81930
4.80E-02	1151880	724150	729440	784540	27860
9.60E-03	1132410	567440	536400	698180	21360
1.92E-03	1040140	406470	247870	476560	21720
3.84E-04	922670	329930	182260	387210	21730
7.68E-05	665330	205550	68120	203440	20930
1.54E-05	515340	168390	42830	148290	20920
3.07E-06	423660	138360	35050	121850	19580
6.14E-07	357560	115560	27850	102790	22120

表17 Anti-MSLN多特異性抗體報導基因實驗（NCI-H292）

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
3.00E+01	650420	391250	430310	397540	241360
6.00E+00	761410	499590	495150	484630	239490
1.20E+00	825780	518760	499220	518500	124810
2.40E-01	834800	482590	515440	537080	28000
4.80E-02	775860	375410	421330	516290	19830
9.60E-03	570130	200470	186370	308240	19240
1.92E-03	340460	95230	46000	151120	19270
3.84E-04	225070	75680	26770	90840	17810
7.68E-05	131330	46280	24740	47240	19710
1.54E-05	78220	34700	21220	35820	18030

實施例4 Anti-MSLN多特異性抗體對CA125結合的阻斷 CA125被證實可與MSLN結合，結合位置在遠膜端的R1區域。為證實針對R1決定位的抗體能夠阻斷CA125與MSLN蛋白的結合，同時在蛋白和細胞程度上進行評估。ELISA和FACS的主要實驗流程可分別參照實施例2.1和2.3。ELISA和FACS一級抗體準備說明：按50µl/孔加入待測抗體或控制組抗體（400nM為起始濃度，3倍梯度稀釋，11個稀釋點），室溫孵育30分鐘，再加入50µl/孔的0.4µg/ml的CA125溶液（購自百英，貨號：B475601），混合均勻後繼續室溫孵育1小時。ELISA二級抗體為山葵過氧化酶耦合的Streptavidin（購自Sigma，貨號：S2438），FACS二級抗體為APC耦合的Streptavidin（購自Biolegend，貨號：405243）。 分析結果如圖9~10以及表18~19所示，其中MB060為陰性控制組。結果在蛋白和OVCAR3細胞程度上均顯示Anti-MSLN多特異性抗體可阻斷CA125與人MSLN蛋白的結合。 表18 ELISA檢測Anti-MSLN多特異性抗體對CA125結合的阻斷情況

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
2.00E+02	0.05	0.05	0.05	0.05	1.81
6.67E+01	0.96	0.98	0.96	1.54	1.73
2.22E+01	1.82	1.74	1.78	1.86	1.76
7.41E+00	1.82	1.77	1.80	1.89	1.81
2.47E+00	1.79	1.79	1.79	1.94	1.81
8.23E-01	1.79	1.80	1.80	1.90	1.81
2.74E-01	1.76	1.79	1.79	1.92	1.84
9.14E-02	1.72	1.78	1.78	1.88	1.83
3.05E-02	1.76	1.73	1.77	1.83	1.77
1.02E-02	1.72	1.68	1.72	1.81	1.70
3.39E-03	1.73	1.65	1.63	1.70	1.63
0	1.77	1.70	1.67	1.75	1.69

表19 FACS檢測Anti-MSLN多特異性抗體對CA125結合的阻斷情況

抗體濃度 (nM)	抗體名稱
MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
2.00E+02	96	107	121	98	467
6.67E+01	106	116	99	109	494
2.22E+01	104	113	99	115	477
7.41E+00	139	110	125	110	431
2.47E+00	186	151	159	141	462
8.23E-01	275	238	264	262	465
2.74E-01	372	383	431	340	465
9.14E-02	449	457	501	428	464
3.05E-02	457	439	457	432	489
1.02E-02	502	458	540	465	462
3.39E-03	506	461	449	457	436
1.13E-03	476	452	485	465	472

實施例5 Anti-MSLN雙決定位多特異性抗體的結合情況 為了驗證雙決定位多特異性抗體的兩個MSLN結合片段是否同時結合表現人MSLN蛋白的OVCAR3腫瘤細胞，在多特異性抗體與細胞結合的體系中加入高濃度的針對R1決定位的單株抗體（NB149-95）或者針對R3決定位的單株抗體（F7.44.20），目的是檢測阻斷或者減弱多特異性抗體中的一個決定位的抗體結合後，另一個決定位的抗體是否有結合活性。 NB149-95，SEQ ID NO.100 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASESGFSANYMGWYRQEAPGKERELVATINRFGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTGVYYCRIMRPGNWYWGQGTQVTVSS F7.44.20-VH，SEQ ID NO.101 EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPSTGGTIYNQKFNGKATLTEDKSASTVYMEFRSLTSDDTAVYYCARRRIGTGYFDVWGTGTTVTVSS F7.44.20-VL，SEQ ID NO.102 QIVLTQSPALMSASPGEKVTLTCSASSSVISSYLSWYQQKPGSSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSFPYTFGGGTKLEIK 主要實驗流程可參照實施例2.3。一級抗體準備說明：按50µl/孔加入待測抗體或控制組抗體（200nM為起始濃度，5倍梯度稀釋，8個稀釋點），再加入50µl/孔的500nM的單株抗體溶液，混合均勻。分析結果如圖11A~11D以及表20所示。結果可見MB001和MB048在高濃度NB149-95單株抗體存在時結合活性下降，而MB065（MSLN R1/R3）和MB069（MSLN R1/R3）在不同決定位的單株抗體存在時，結合活性無顯著降低，證明靶向兩個決定位（MSLN R1/R3）的抗體可同時結合MSLN膜蛋白。 表20 FACS檢測Anti-MSLN雙決定位多特異性抗體的結合情況

抗體濃度 (nM)	競爭抗體濃度 (250nM)	100	20	4	0.8	0.16	0.032	0.0064	0.00128
MB001	/	3292	2764	2086	1061	517	339	281	220
NB149-95	1397	927	501	277	182	183	160	163
F7.44.20	3464	3119	2280	1039	483	289	227	211
MB048	/	2325	2158	1651	862	447	307	337	272
NB149-95	1849	1471	901	455	284	214	191	181
F7.44.20	2358	2327	1855	955	520	319	296	240
MB065	/	2850	2728	2646	1305	511	256	203	177
NB149-95	2765	2679	2232	1217	474	260	179	191
F7.44.20	2683	2623	2245	1055	423	256	184	155
MB069	/	2047	1867	1587	1028	488	318	240	228
NB149-95	1892	1628	1384	813	376	231	186	202
F7.44.20	2225	2063	1812	1060	508	301	230	232

實施例6 Anti-MSLN多特異性抗體的內噬活性 OVCAR3細胞準備和檢測方法參照實施例2.3。一級抗體準備和內噬條件說明：按50µl/孔加入待測抗體或控制組抗體（200nM為起始濃度，10倍梯度稀釋，3個稀釋點），混合均勻後放置4℃孵育1小時， PBS洗3遍後棄除上清。加入50µl/孔的FACS緩衝液，重懸細胞，一份放置4℃繼續孵育1小時，另一份放置37℃孵育1小時。離心棄上清後加入稀釋的二級抗體。 分析結果如圖12A~12C以及表21-22所示。結果可見MB065和MB069均有內噬活性，且均弱於陽性控制組抗體MB001的內噬活性，其中MB065內噬活性最弱。如果CD3多特異性抗體與腫瘤細胞結合後大部分抗體快速內噬，則會減少與T細胞結合的機率，從而導致T細胞活化和腫瘤殺傷活性大大減弱。 表21 FACS檢測Anti-MSLN多特異性抗體的內噬情況

		抗體名稱
孵育溫度	抗體濃度 (nM)	MB001	MB048	MB065	MB069	MB060
4℃	100	3836	2900	3483	2501	174
10	3183	2655	3663	2294	204
1	1683	1318	2005	1517	195
37℃	100	2061	1713	3141	1507	217
10	1419	1287	2951	1257	163
1	666	591	1458	836	160

表22 FACS檢測Anti-MSLN多特異性抗體的內噬率

	抗體放置37℃1小時的內噬率
抗體濃度 (nM)	MB001	MB048	MB065	MB069
100	46%	41%	10%	40%
10	55%	52%	19%	45%
1	60%	55%	27%	45%

內噬率=(4℃_MFI-37℃_MFI)/ 4℃_MFI*100%

實施例7 由多特異性抗體介導的T淋巴細胞體外活化狀態檢測 CD69分子是T細胞活化的早期標誌物，靜息狀態培養的T細胞很少表現CD69分子，T 淋巴細胞一旦被活化，CD69 的表現即發生顯著上調，它是檢測 T 淋巴細胞是否被有效誘導活化的標誌物。 從健康供體的PBMC中使用T細胞分離套組 （購自STEMCELL technologies，貨號17951，使用方法參照套組說明書）分離富集初代T細胞，過夜培養。用胰蛋白酶消化NCI-H292細胞，製備單細胞懸液。用完全培養基將腫瘤細胞密度調整為2×10 ⁵個/ml，將T細胞密度調整為1×10 ⁶個/ml。分別取50 μl調整後的NCI-H292細胞和50 μl初代T細胞等體積混合均勻，用微量移液器加入到平底96孔盤各孔中，細胞混合液體積為100 μl/孔（每孔腫瘤細胞和T細胞數目分別為1×10 ⁴個和5×10 ⁴個）。將抗體分別用完全培養基進行梯度稀釋（抗體起始濃度為2nM，6倍稀釋，8個濃度梯度），每孔分別加入100 μl不同濃度的抗體稀釋液，使得每孔終體積為200 μl。培養箱體外培養24小時。離心去上清，用流式緩衝液重懸，加入APC-anti-human CD3 (購自Biolegend，貨號300312) ，FITC-anti-human CD69 (購自Biolegend，貨號317408) ，避光反應30 分鐘後，使用流式細胞儀測定不同濃度抗體處理後，表現CD69+CD3+T細胞比例變化。結果採用GraphPad Prism 9 .0軟體計算並製圖，參見圖13。 MB001由於採用了高親和力的CD3抗體，所以T細胞活化活性最強，而採用了低親和力CD3的MB048、MB065和MB069則T細胞活化活性較弱；MB060陰性控制組由於不能結合MSLN，因此沒有T細胞活化活性。

實施例8 多特異性抗體介導的T細胞對腫瘤細胞的體外殺傷活性及細胞激素釋放的檢測 本實驗選用了三種腫瘤細胞株作為T細胞體外殺傷實驗的靶向細胞，其中OVCAR3 為MSLN高表現的人卵巢癌細胞，NCI-H292為MSLN低表現的人肺癌細胞，A431為不表現MSLN的人皮膚鱗狀細胞癌細胞，作為陰性控制組。從健康供體的PBMC中使用T細胞分離套組（購自STEMCELL technologies，貨號17951，使用方法參照套組說明書）分離初代T細胞，過夜培養。 第二日，用胰蛋白酶消化OVCAR3、NCI-H292或A431細胞，製備成單細胞懸液。用完全培養基將腫瘤細胞密度調整為2×10 ⁵個/ml，將T細胞密度調整為1×10 ⁶個/ml。分別取50 μl調整後的OVCAR3、NCI-H292或A431細胞和50 μl初代T細胞等體積混合均勻（每孔腫瘤細胞和T細胞數目分別為1×10 ⁴個和5×10 ⁴個），用微量移液器加入到平底96孔盤各孔中，細胞混合液體積為100 μl/孔。將抗體分別用完全培養基進行梯度稀釋（抗體起始濃度為25nM，6倍稀釋，8個梯度），每孔分別加入100 μl不同濃度的抗體稀釋液，使得每孔終體積為200 μl。培養24小時後，取上清用ELISA方法檢測T細胞IFNγ、TNFα和IL-6細胞激素的產生（套組購自BD，貨號分別為555142、555212和555220，使用方法參照套組說明書），用CellTiter-Glo套組（購自Promega，貨號G9243，使用方法參照產品說明書）檢測細胞活力。定義只有T細胞的孔為殺傷100%的陽性控制組，將抗體濃度為0的孔定義為空白陰性控制組，細胞殺傷率＝(空白孔讀值-樣品孔讀值)/(空白孔讀值-陽性控制組孔讀值)× 100％。結果採用GraphPad Prism 9 .0軟體計算並製圖，參見圖14。 結合細胞殺傷實驗的結果和細胞激素釋放程度的結果可以看出，無論是MSLN高表現的OVCAR3細胞，還是MSLN低表現的NCI-H292細胞，MB069都表現出最強的T細胞活化和體外腫瘤細胞殺傷活性，而MB048和MB065 的T細胞活化和體外腫瘤細胞殺傷活性與MB001相當。MB001、MB048、MB065和MB069對於MSLN陰性的A431細胞，均沒有殺傷作用，表明CD3多特異性抗體的殺傷作用具有良好的靶向抗原特異性，對於不表現靶向抗原的正常組織不會產生非特異性殺傷。細胞激素的釋放程度反映了多特異性抗體的活性高低，一般與T細胞的活化程度以及體外殺傷活性和體內抑瘤活性正相關。同時多特異性抗體的T細胞活化活性越強，進入人體後產生細胞激素風暴（CRS）的風險也會更高。

實施例9 多特異性抗體在人卵巢癌OVCAR-3（MSLN高表現）異種移植模型中的體內抗腫瘤活性 9.1 多特異性抗體在人PBMC重建的人卵巢癌OVCAR-3（MSLN高表現）異種移植模型中的體內抗腫瘤活性 該實施例透過尾靜脈注射將人PBMC細胞注入免疫缺陷型NPG小鼠（5-6 w，雌性，北京維通利華實驗動物技術有限公司），從而得到人PBMC重建模型，然後在此動物模型中分別建立MSLN高表現的人卵巢癌OVCAR-3異種移植模型（xenograft model）和MSLN低表現的人肺癌NCI-H292異種移植模型（xenograft model），並分別在這兩種模型中驗證多特異性抗體的體內抗腫瘤活性。 將OVCAR-3細胞（美國模式培養物集存庫，ATCC）在T-300細胞培養瓶中擴大培養至所需數量，並在其對數生長期（匯合度80 %左右；接種前一天需給細胞更換新鮮培養基）開始收集。首先，將細胞培養瓶中的培養基去除，磷酸鹽緩衝液（PBS，賽默飛世爾科技有限公司，Hyclone，29588138）洗滌2次，然後加入適量0.25 %胰蛋白酶消化液（賽默飛世爾科技有限公司，Gibco，#25200-072/219085），搖晃瓶底，使胰蛋白酶消化液均勻覆蓋於細胞表面，37 ℃消化5分鐘，加入含20 % 胎牛血清（Fetal Bovine serum，FBS，賽默飛世爾科技有限公司，Gibco, #10099-141C/2261480CP）的完全培養基終止消化反應，並將黏附在瓶底的細胞輕柔吹離培養瓶，消化好的細胞懸液收集至50 mL離心管，350 g，5分鐘離心，吸取適量無血清RPMI-1640培養基（賽默飛世爾科技有限公司，Gibco, #61870-036/2192781）重懸細胞，並經70 μm篩網過濾，取500 μL細胞懸液於細胞計數儀進行計數，最後根據細胞計數結果，使用無血清培養基調整細胞密度為1×10 ⁷個/mL，置於冰上，透過傳遞窗傳遞至SPF動物房進行接種建模。接種前將上述細胞懸液與Matrigel基質膠（康寧生物科技有限公司，# 356237）等比例混合，於每隻小鼠右側腋窩皮下接種200 μL上述細胞混合液。 上述腫瘤細胞接種第二天，復甦相應數量人源周邊血單個核細胞（PBMC，上海賽笠生物科技有限公司，#200256），70 μm篩網過濾，取100 μL細胞懸液，加入400 μL RPMI-1640無血清培養基計數，並根據計數結果，使用RPMI-1640無血清培養基調整PBMC細胞濃度為2.5×10 ⁷個/mL，置於冰上，透過傳遞窗傳遞至SPF動物房進行接種建模，每隻小鼠尾靜脈接種200 μL上述細胞懸液進行免疫重建。接種之後，監測腫瘤生長，當整體瘤體積在50-100 mm ³左右，眼窩採血進行人源免疫系統重建檢測，選擇瘤體積及免疫重建結果均合適的小鼠進行分組（n=5）並給予多特異性抗體藥物治療，給藥方案如表23所示，其中MB060為陰性控制組，MB001為陽性控制組，MB048、MB065和MB069為待測抗體。給藥劑量以陽性分子MB001單位體重給藥莫耳量為基準，每千克小鼠給藥質量按照公式m=n*M將單位體重給藥莫耳量換算成單位體重給藥質量，最終得到單位體重小鼠給藥質量，其中m為給藥質量，n為給藥莫耳量，M為藥物分子量，本文給藥劑量均以此原則計算。 表23 人源化卵巢癌荷瘤小鼠體內藥效給藥方案

分組	多特異性抗體	給藥劑量（mg/kg）	給藥劑量（nmol/kg）	給藥 頻率
組1	MB060	3	56.60	1天1次，共計15次
組2	MB001	1	18.87
組3	MB048	2.94	56.60
組4	MB065	1.47	18.87
組5	MB069	1.47	18.87

結果如圖15所示，MB065（抑瘤率=69.98 %）展示出好於MB048（抑瘤率=42.56% ）和陽性分子MB001（抑瘤率=47.05 %）的抑瘤活性，但三者均顯著弱於MB069（抑瘤率=106.85 %）。抑瘤率計算方式如下，抑瘤率（%）=（1-(Vn(實驗組)-V0(實驗組))/ (Vn(同型控制組)-V0(同型控制組))）*100%，其中Vn為測量當天瘤體積，V0為分組當天瘤體積，本文抑瘤率均以此公式計算。

9.2 多特異性抗體在人PBMC與人卵巢癌細胞OVCAR-3（MSLN高表現）皮下混合接種成瘤的異種移植模型中的體內抗腫瘤活性 OVCAR-3細胞的處理方法與9.1相同，使用無血清培養基調整細胞密度為12×10 ⁷個/mL，置於冰上備用。同時，PBMC的處理方法與9.1相同，使用RPMI-1640無血清培養基調整PBMC細胞濃度為3×10 ⁷個/mL，置於冰上，透過傳遞窗將上述各細胞懸液及Matrigel基質膠（康寧生物科技有限公司，#356237）傳遞至SPF動物房進行接種建模，按照表24在SPF動物房的超淨台中進行混合，然後於每隻小鼠右側腋窩皮下接種200 μL上述細胞混合液。接種之後，監測腫瘤生長，當整體瘤體積在50-100 mm ³左右進行分組（n=5）並給予多特異性抗體藥物治療，給藥方案如表23所示，其中MB060為陰性控制組，MB001為陽性控制組，MB048、MB065和MB069為待測抗體。 表24 OVCAR-3與PBMC混合皮下接種細胞混合方案

OVCAR-3 母液	OVCAR-3取用量	PBMC母液	PBMC 取用量	Matrigel
12 × 10 7個/mL	5 mL	3 × 10 7個/mL	1 mL	6 mL

結果如圖16所示，MB048（抑瘤率=101.37 %）、MB065（抑瘤率=106.60 %）和MB069（抑瘤率=106.97 %）均展示出好於陽性分子MB001（抑瘤率=89.09 %）的抑瘤活性。

實施例10 多特異性抗體在人PBMC重建的人肺癌NCI-H292（MSLN低表現）異種移植模型中的體內抗腫瘤活性 該實施例選擇MSLN低表現的人源肺癌細胞NCI-H292進行小鼠（NPG，5-6 w，雌性，北京維通利華實驗動物技術有限公司）體內模型建立，並在此模型上驗證多特異性抗體體內抗腫瘤活性。 將人源肺癌細胞NCI-H292（美國模式培養物集存庫，ATCC）按照實施例9.1所述方法進行處理（終止消化的完全培養基含10 % 胎牛血清），最後根據細胞計數結果，使用無血清培養基調整細胞密度為5×10 ⁷個/mL，置於冰上，透過傳遞窗傳遞至SPF動物房進行接種建模，於每隻小鼠右側腋窩皮下接種200 μL上述細胞懸液。 上述腫瘤細胞接種第二天，PBMC的處理方法與9.1相同，使用RPMI-1640無血清培養基調整PBMC細胞濃度為2.5×10 ⁷個/mL，置於冰上，透過傳遞窗傳遞至SPF動物房進行接種建模，每隻小鼠尾靜脈接種200 μL上述細胞懸液進行免疫重建。接種之後，監測腫瘤生長，當整體瘤體積在100 mm ³左右，眼窩採血進行人源免疫系統重建檢測，選擇瘤體積及免疫重建結果均合適的小鼠進行分組（n=8）並給予多特異性抗體藥物治療，給藥方案如表25所示，其中MB060為陰性控制組，MB001為陽性控制組，MB048、MB065和MB069為待測抗體。 表25 人源化肺癌荷瘤小鼠體內藥效給藥方案

分組	候選抗體	給藥劑量（mg/kg）	給藥劑量（nmol/kg）	給藥 頻率
組1	MB060	9	169.79	1天1次，共計22次
組2	MB001	0.3	5.66
組3	MB001	1.00	18.87
組4	MB001	3.00	56.60
組5	MB048	0.98	18.87
組6	MB048	2.94	56.60
組7	MB048	8.83	169.79
組8	MB065	0.44	5.66
組9	MB065	1.47	18.87
組10	MB065	4.42	56.60
組11	MB069	0.44	5.66
組12	MB069	1.47	18.87
組13	MB069	4.42	56.60

結果如圖17所示，低劑量組：MB048（抑瘤率=48.18 %）和MB065（抑瘤率=62.57 %）展示出優於陽性分子MB001（抑瘤率=3.69 %）的抑瘤活性，但三者均顯著弱於MB069（抑瘤率=80.25 %）；中劑量組：MB001（抑瘤率=57.94 %）、MB048（抑瘤率=54.74 %）和MB065（抑瘤率= 49.39%）抑瘤率相當，且均顯著弱於MB069（抑瘤率=80.21 %）；高劑量組：MB001（抑瘤率=40.48 %）、MB048（抑瘤率=37.35 %）和MB065（抑瘤率= 54.48%）抑瘤率基本相當，均顯著弱於MB069（抑瘤率=84.05 %），且MB048顯著弱於MB065。

實施例11 多特異性抗體在食蟹猴體內的藥物代謝動力學實驗 7隻3-5周齡食蟹猴，體重3.7-5.7kg，按不同供試品及劑量分組，藥物用製劑溶媒稀釋，不同個體分別單次靜脈注射給予MB001、MB069和MB065，比較其藥物代謝動力學差異。後肢靜脈採集血液樣本，採血時間點為給藥前、給藥後0.25小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時、72小時、120小時、168小時、240小時、336小時、504小時、672小時和744小時。血液樣本採集後，置於冰上保存用於血液樣本分離。然後1500×g，4℃，離心10 分鐘分離血清至低吸附離心管中，標明化合物代號及時間點，在進行分析前凍存於-80℃。血液樣本收集至離心後凍存應在2小時內完成。包被hMSLN-FL-his蛋白，採用間接酵素結合免疫吸附法測定血清中本發明中各控制組和試驗組化合物的濃度。藥物代謝動力學參數基於每隻動物在不同時間點的血藥濃度進行計算。從結果可以看出，MB001、MB069和MB065的半衰期均可以支持臨床一周給藥一次。 表26 食蟹猴體內藥物代謝動力學檢測

實施例12 多特異性抗體在人血清和食蟹猴血清中的穩定性實驗 12.1 多特異性抗體在人血清中的穩定性實驗 PBMC細胞的培養和處理與實施例7相同；Hela細胞的培養和處理與實施例7中NCI-H292細胞處理方式相同。抗體處理分成兩種：1.抗體未預處理；2. 將抗體預先置於人血清中37℃孵育兩天。將不同處理的抗體分別用完全培養基進行梯度稀釋（抗體起始濃度為25nM，6倍稀釋，10個濃度梯度）。每孔分別加入100μl不同濃度的抗體稀釋液，使得每孔終體積為200μl。體外細胞毒活性實驗處理分成兩種：1.體外殺傷實驗在10%FBS完全培養基中進行；2. 體外殺傷實驗體系中額外添加20%人血清。 培養24小時後，用CellTiter-Glo套組（購自Promega，使用方法參照產品說明書）測定細胞活力，檢測人血清對於多特異性抗體介導的T細胞體外細胞毒活性的影響，結果參見圖19A。在人血清中37℃孵育兩天後，MB001和MB048的活性下降較多，而MB065和MB069的活性幾乎沒有下降。但是比較在無人血清體系和20%人血清體系中的殺傷活性就可以看出，20%人血清的加入，會顯著減弱多特異性抗體的殺傷活性，特別是MB065和MB069，EC50提高了幾十倍。可能是由於多特異性抗體中的anti-HSA與人血清中的HSA蛋白結合後，空間構象發生變化，從而導致多特異性抗體與腫瘤細胞和T細胞的結合活性發生變化，從而導致T細胞活化活性減弱。根據該實驗結果推斷，MB065和MB069進入人體後，T細胞活化活性會低於目前體外測試的結果。因此MB065和MB069將來進入臨床後的CRS風險有可能降低。

12.2 多特異性抗體在食蟹猴血清中的穩定性實驗 實驗方法與12.1相同，僅將其中人血清部分替換為食蟹猴血清。培養24小時後，用CellTiter-Glo套組（購自Promega，使用方法參照產品說明書）測定細胞活力，結果參見圖19B。在食蟹猴血清中37℃孵育兩天後，MB001和MB048的活性略有下降，而MB065和MB069的活性幾乎沒有下降。但是比較在無食蟹猴血清體系和20%食蟹猴血清體系中的殺傷活性就可以看出，20%食蟹猴血清的加入，對MB001影響不大，但是會顯著減弱MB048、MB065和MB069多特異性抗體的殺傷活性，EC50的升高超過了十倍。可能是由於多特異性抗體中的anti-HSA與猴血清中的CSA蛋白結合後，空間構象發生變化，從而導致多特異性抗體與腫瘤細胞和T細胞的結合活性發生變化，從而導致T細胞活化活性減弱。根據該實驗結果推斷，MB065和MB069進入猴子後，T細胞活化活性會低於目前體外測試的結果。

實施例13 Anti-CD33×CD70多特異性抗體與蛋白或細胞的結合能力鑒定 13.1 流式細胞實驗（FACS）檢測多特異性抗體與腫瘤細胞的結合 實驗中使用腫瘤細胞THP-1（購自中科院細胞庫，貨號：TCHu 57）、U937（購自ATCC，貨號：CRL-1593.2）、786-O（購自ATCC，貨號： CRL-1932）、Jurkat（購自中科院細胞庫，貨號： TCHU123）。將所需細胞在T-175細胞培養瓶中擴大培養至對數生長期，吸除培養基，用PBS緩衝液洗滌2次，用胰蛋白酶消化細胞，然後用完全培養基終止消化，並吹打細胞至單細胞懸液。細胞計數後，離心，細胞沉澱用PBS洗滌2次，將細胞沉澱用FACS緩衝液（PBS +2%胎牛血清）重懸至2×10 ⁶細胞/mL，按每孔50 µl加入到96孔FACS反應盤中，按50µl/孔加入待測抗體（400nM或100nM為起始濃度，3倍或者5倍梯度稀釋），與細胞懸液混勻，4℃孵育1小時。用PBS緩衝液離心洗滌3次，加入每孔50 µl iFluor 647標記的Anti-His二級抗體（購自Genscript，貨號：A01802-100），4℃孵育1小時。用PBS緩衝液離心洗滌3次，100 µl PBS重懸後用FACS（FACS CantoTM，購自BD公司）檢測和分析結果。透過軟體（CellQuest）進行數據分析，得到細胞的平均螢光密度（MFI）。再透過軟體（GraphPad Prism8）分析，進行數據擬合，計算EC50。分析結果如圖20A~20D以及表27所示，其中MB060為陰性控制組；結果可見Anti-CD33×CD70多特異性抗體與不同表現程度的腫瘤細胞均有結合活性，表明Anti-CD33×CD70多特異性抗體可特異性的結合表現人CD33蛋白的腫瘤細胞。 表27 CD33×CD70多特異性抗體與腫瘤細胞的結合反應

抗體名稱	1#	2#	9#	15#	Mab060
THP-1	最大_MFI	1571	1096	1281	982	130
EC50 (nM)	2.59	1.12	25.11	1.04	不結合
U937	最大_MFI	393	330	357	307	112
EC50 (nM)	12.55	20.14	3.40	18.10	不結合
786-O	最大_MFI	1224	1181	74	1212	71
EC50 (nM)	24.57	20.61	不結合	83.73	不結合
Jurkat	最大_MFI	1242	1442	1121	1507	805
EC50 (nM)	4.37	4.88	3.78	5.02	3.28

13.2 流式細胞實驗（FACS）檢測抗體與CHO-K1-人CD33的結合 表現人CD33蛋白的重組細胞株CHO-K1-人CD33的製備方法請參見PCT/CN2022/075621，編碼人CD33全長胺基酸序列(NCBI：XP_011525834.1)的核苷酸序列被複製到pcDNA3.1載體並製備質體（由通用生物系統（安徽）有限公司完成）。對CHO-K1細胞株（購自中國科學院上海生命科學研究院）進行質體轉染(Lipofectamine® 3000 Transfection Kit，購自Invitrogen，貨號：L3000-015)後，使用puromycin進行壓力篩選。選擇生長趨勢較好、螢光強度較高、單株的細胞株B8繼續擴大培養並液態氮凍存。檢測細胞和待測抗體的準備以及檢測方法參照實施例13.1。分析結果如圖21所示，其中MB060為陰性控制組。結果可見Anti-CD33×CD70多特異性抗體與表現人CD33蛋白的重組細胞有結合活性，表明Anti-CD33單株抗體組合成多特異性抗體後保留了單株抗體的特性。

13.3 流式細胞實驗（FACS）檢測抗體與CHO-K1-人CD70的交叉結合 表現人CD70蛋白的重組細胞株CHO-K1-人CD70購自康源博創（KC-1267）檢測細胞，並且待測抗體的準備以及檢測方法參照實施例13.1。分析結果如圖22所示，其中MB060為陰性控制組，BDD20-09-9#僅有CD33單株抗體無CD70單株抗體。結果可見Anti-CD33×CD70多特異性抗體與表現人CD70蛋白的重組細胞有結合活性，表明Anti-CD70單株抗體組合成多特異性抗體後保留了單株抗體的特性。

實施例14 不同format 多株抗體介導對腫瘤細胞和表現CD33的正常細胞殺傷活性的差異 本實驗選用高表現CD33的AML3細胞株Molm13加入健康供體PBMC中，模擬AML病人體內環境，驗證不同format多株抗體介導腫瘤細胞和表現CD33的正常細胞（周邊血中主要為CD14+ 單核細胞）殺傷活性差異。 復甦凍存的健康供體PBMC細胞，用CellTrace™ Violet染劑對復甦的PBMC細胞進行標記，用完全培養基將Molm13腫瘤細胞調整為2.5×10 ⁶個/ml，將PBMC細胞密度調整為1×10 ⁶個/ml。分別取50 μl調整後的單核細胞或Molm13細胞和50 μl初代T細胞等體積混合均勻（每孔Molm13細胞和PBMC細胞數目分別為1.25×10 ⁵個 和5×10 ⁴個），用微量移液器加入到平底96孔盤各孔中，細胞混合液體積為100 μl/孔。將抗體分別用完全培養基進行梯度稀釋（抗體起始濃度為5 μg/ml，20倍稀釋，8個梯度），每孔分別加入100 μl不同濃度的抗體稀釋液，使得每孔終體積為200 μl。培養48小時後，離心去上清，用流式緩衝液重懸，加入Fc Receptor Blocking Solution（購自Biolegend， 貨號422302）室溫阻斷15分鐘後，對細胞進行CD14-PerCPCy5.5（購自Biolegend， 貨號367110）染色，避光反應30分鐘後，離心去上清，用流式緩衝液洗兩次後，向細胞中加入PI（購自Thermo Fisher，貨號P3566），孵育5分鐘後，進行流式檢測（FACS Canto Plus，購自BD公司），測定CellTrace™ Violet+CD14+雙陽性細胞中PI+細胞比例以及 CellTrace™ Violet陰性細胞中PI+細胞比例分別為不同format 多株抗體對表現CD33的正常細胞和腫瘤細胞的殺傷活性，結果採用GraphPad Prism 9 .0軟體計算並製圖。結果如圖23-24所示，不同format抗體對於腫瘤細胞和單核細胞均有殺傷活性，但BDD20-09-15#對於腫瘤細胞殺傷活性優於BDD20-09-09#。

無

圖1A~1B. 多特異性抗體結構示意。 圖2A~2C. ELISA檢測MSLN多特異性抗體與白蛋白的結合反應：2A.HAS；2B.CSA；2C.MSA。 圖3A~3B. ELISA檢測MSLN多特異性抗體同時結合MSLN蛋白和CD3蛋白的結合反應：3A. 人CD3；3B.猴CD3。 圖4A~4E. FACS檢測MSLN多特異性抗體與腫瘤細胞的結合反應：4A.OVCAR3；4B.Hela；4C.Hs766T；4D.NCI-H292；4E.A431。 圖5. FACS檢測MSLN多特異性抗體與HEK293T-hMSLN-R3細胞的結合反應。 圖6A. FACS檢測MSLN多特異性抗體與HEK293T-猴MSLN細胞的結合反應； 圖6B. FACS檢測MSLN多特異性抗體與HEK293T細胞的結合反應。 圖7A. FACS檢測MSLN多特異性抗體與人T細胞的結合反應； 圖7B. FACS檢測MSLN多特異性抗體與猴T細胞的結合反應。 圖8A~8D. MSLN多特異性抗體reporter assay：8A.OVCAR3；8B.Hela；8C.Hs766T；8D.NCI-H292。 圖9. ELISA檢測CA125對MSLN多特異性抗體結合活性的影響。 圖10. FACS檢測CA125對MSLN多特異性抗體結合活性的影響。 圖11A ~11D. 雙決定位MSLN多特異性抗體的結合情況。 圖12A. 100nM MSLN多特異性抗體的內噬活性； 圖12B. 10nM MSLN多特異性抗體的內噬活性； 圖12C. 1nM MSLN多特異性抗體的內噬活性。 圖13. MSLN多特異性抗體介導的T淋巴細胞體外活化狀態檢測。 圖14. MSLN多特異性抗體介導T細胞體外腫瘤細胞殺傷活性及細胞激素檢測。 圖15.多特異性抗體抑制人源化卵巢癌腫瘤生長曲線。 圖16.多特異性抗體抑制卵巢癌細胞OVCAR-3與PBMC混合皮下模型腫瘤生長曲線。 圖17.多特異性抗體抑制人源化肺癌腫瘤生長曲線。 圖18.多特異性抗體在食蟹猴體內的藥物代謝動力學比較。 圖19A.多特異性抗體在人血清中的穩定性檢測。 圖19B.多特異性抗體在食蟹猴血清中的穩定性檢測。 圖20A. FACS檢測CD33×CD70多特異性抗體與THP-1細胞的結合反應。 圖20B. FACS檢測CD33×CD70多特異性抗體與U937細胞的結合反應。 圖20C. FACS檢測CD33×CD70多特異性抗體與786-O細胞的結合反應。 圖20D. FACS檢測CD33×CD70多特異性抗體與Jurkat細胞的結合反應。 圖21. FACS檢測CD33×CD70多特異性抗體與CHO-K1-人CD33細胞的結合反應。 圖22. FACS檢測CD33×CD70多特異性抗體與CHO-K1-人CD70細胞的結合反應。 圖23. 不同format抗體對於腫瘤細胞的殺傷活性實驗。 圖24. 不同format抗體對於單核細胞的殺傷活性實驗。

無

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Claims (14)

1. 一種多特異性抗體，其特徵在於，所述多特異性抗體至少包含三個部分：（A）靶向抗原結合部分，（B）半衰期延長部分，和（C）T細胞接合部分； （A）靶向抗原結合部分：較佳靶向抗原結合抗體或靶向抗原結合配體；所述靶向抗原結合抗體可選自任何抗原結合片段； （B）半衰期延長部分：較佳抗HSA抗體； （C）T細胞接合部分：其中T細胞接合部分較佳抗CD3抗體或抗原結合片段； 所述抗原結合片段較佳Fd、Fv、scFv、雙抗體（diabody）或單域抗體（VHH）； （A）、（B）、（C）三個部分的各片段之間可以透過連接子連接，也可以不透過連接子直接相連。
2. 如請求項1所述的多特異性抗體，其中，其中（A）靶向抗原結合部分或（C）T細胞接合部分可重複出現或包含多個部分； 較佳的，多特異性抗體同時包含A1和A2兩個靶向抗原結合部分，A1和A2可以相同，也可以不同；較佳的，A1和A2結合不同的抗原標靶；較佳的，A1和A2結合相同抗原標靶的不同決定位； 較佳的，(C)部分為結合CD3的scFv； 更佳的，(C)部分為結合人CD3的scFv。
3. 如請求項1所述的多特異性抗體，其中，所述多特異性抗體由N端至C端的結構順序為： （1）A(VHH) - B(VHH) - C(VH) - C(VL) （2）A(VHH) - B(VHH) - C(VL) - C(VH) （3）A1(VL) - A1(VH) - A2(VHH) - B(VHH) - C(VH) - C(VL) （4）A1(VL) - A1(VH) - A2(VHH) - B(VHH) - C(VL) - C(VH) （5）A1(VHH) – A2(VL) - C(VH) - C(VL) – A2(VH) - B(VHH) （6）A1(VHH) – A2(VH) - C(VL) - C(VH) – A2(VL) - B(VHH) （7）B(VHH) – A2(VL) - C(VH) - C(VL) – A2(VH) – A1(VHH) （8）B(VHH) – A2(VH) - C(VL) - C(VH) – A2(VL) – A1(VHH)。
4. 如請求項1-3中任一項所述的多特異性抗體，其中，(C) T細胞接合部分包含選自如下抗體的互補決定區（CDRs）：OKT3、TRX4、MGA031、Nuvion、SP34、X35、VIT3、BMA030、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、S004-2-03、S004-2-06、S004-2-08、S004-2-10、S004-2-18、6-35.22-hu、1-22.6-1-hu、7-35.6-hu、和6-44.5-hu ； 較佳地，所述(C) T細胞接合部分包含選自如下的重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs： 重鏈CDR1如SEQ ID NO. 34、39、42、47所示； 重鏈CDR2如SEQ ID NO. 35、40、43、45、48所示； 重鏈CDR3如SEQ ID NO. 36、37、38、41、44、46、49所示； 輕鏈CDR1如SEQ ID NO. 50、55、58、61、64所示； 輕鏈CDR2如SEQ ID NO. 51、56、59、62、65所示； 輕鏈CDR3如SEQ ID NO.52、53、54、57、60、63、66 所示； 較佳地，所述(C) T細胞接合部分包含與上述重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs具有99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%同一性的序列。
5. 如請求項1-3中任一項所述的多特異性抗體，其中，(A)部分所述靶向抗原可選自如下的群組：CD19、BCMA、HER2、EGFR、VEGF、MSLN、CD33、CD70、CD5、CD20、CD40、CD47、CD38、CD137、TNF-alpha、HER3、CD27、EphA2、EpCAM、MUC1、MUC17、CEA、Claudin18.2、葉酸受體、Claudin6、WT1、NY-ESO-1、MAGE3、ASGPR1、CDH16、GPRC5D、DLL3、ROR1或GUCY2C； 較佳地，所述靶向抗原結合部分包含選自如下片段的互補決定區（CDRs）：SEQ ID NO.18-28、103-106； 較佳地，所述(A)靶向抗原結合部分包含選自如下的重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs： 重鏈CDR1如SEQ ID NO.76、80、89、92、110、113、116所示； 重鏈CDR2如SEQ ID NO.77、79、81、90、93、111、114、117所示； 重鏈CDR3如SEQ ID NO. 78、82、91、94、112、115、118所示； 輕鏈CDR1如SEQ ID NO. 83、86、107所示； 輕鏈CDR2如SEQ ID NO. 84、87、108所示； 輕鏈CDR3如SEQ ID NO.85、88、109所示； 較佳地，所述(A)靶向抗原結合部分包含與上述重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs具有99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%同一性的序列。
6. 如請求項1-3中任一項所述的多特異性抗體，其中，(B)部分包含選自如下片段的互補決定區（CDRs）：SEQ ID NO.15-17； 較佳地，所述(B)部分包含選自如下的CDRs： CDR1如SEQ ID NO. 67、70、73所示； CDR2如SEQ ID NO. 68、71、74所示；和 CDR3如SEQ ID NO. 69、72、75所示； 較佳地，所述(B)部分包含與上述CDRs具有99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%同一性的序列。
7. 如請求項1-3中任一項所述的多特異性抗體，其中，使用連接子連接（A）、（B）、（C）三個部分的各個片段；所述連接子各自獨立地選自：(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n、(GGGGS)n或(GGGGS)n (GGGS)n，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； 較佳地，連接子為GGGGS、GGGGSGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
8. 如請求項1-7中任一項所述的多特異性抗體，其中，所述抗體或抗原結合片段為： （1）嵌合抗體或其片段； （2）人源化抗體或其片段；或， （3）全人抗體或其片段； 較佳地，所述多特異性抗體包含SEQ ID NO. 97、98、99、119、120、121、或122所示序列，或與上述序列具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%同一性的序列。
9. 一種分離的核酸片段，其特徵在於，所述核酸片段編碼如請求項1-8中任一項所述的多特異性抗體。
10. 一種載體（vector），其特徵在於，所述載體包含如請求項9所述的核酸片段。
11. 一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞包含如請求項10所述的載體；較佳地，所述細胞為原核細胞或真核細胞，例如細菌（大腸桿菌）、真菌（酵母）、昆蟲細胞或哺乳動物細胞（CHO細胞株或293T細胞株）。
12. 一種製備如請求項1-8中任一項所述的多特異性抗體的方法，其中，所述方法包括培養如請求項11所述的細胞，以及分離所述細胞表現的多特異性抗體。
13. 一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含如請求項1-8中任一項所述的多特異性抗體，或如請求項9所述的核酸片段，或如請求項10所述的載體；或如請求項12所述的方法製備獲得的產品；可選地，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的運載體（carrier）、稀釋劑或助劑；可選地，所述藥物組合物還包含額外的抗腫瘤劑。
14. 一種預防和/或治療增生性疾病、腫瘤疾病、發炎疾病、免疫性病症、自體免疫疾病、傳染性疾病、病毒性疾病、變態反應、寄生蟲反應、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的請求項1-8任一項所述的多特異性抗體，或請求項9所述的核酸片段，或請求項10所述載體，或請求項12所述方法製備獲得的產品或請求項13所述藥物組合物； 所述腫瘤疾病較佳表現MSLN、CD70和/或CD33的實體瘤或表現MSLN、CD70和/或CD33的血液瘤； 更佳間皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胸膜癌、膽管癌、子宮頸癌、胃癌、白血病、組織細胞淋巴瘤、或腎癌； 更佳上皮樣惡性胸膜間皮瘤、肺腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、單核細胞白血病、組織細胞淋巴瘤、腎透明細胞腺癌、T淋巴細胞白血病或急性骨髓性白血病。

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