TW202329985A - 用於治療cag重複序列疾病之組合物及方法 - Google Patents
用於治療cag重複序列疾病之組合物及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202329985A TW202329985A TW111137904A TW111137904A TW202329985A TW 202329985 A TW202329985 A TW 202329985A TW 111137904 A TW111137904 A TW 111137904A TW 111137904 A TW111137904 A TW 111137904A TW 202329985 A TW202329985 A TW 202329985A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- seq
- substitution
- mismatch
- double
- strand
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 49
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 32
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 500
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 356
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 1137
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 1136
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 823
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 610
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 293
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 288
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 202
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 202
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 201
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 claims description 135
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 claims description 135
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 134
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 132
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 claims description 130
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 claims description 130
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 99
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 98
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 98
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 80
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 48
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 26
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 26
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 25
- 208000011641 Spinocerebellar disease Diseases 0.000 claims description 21
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 17
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 17
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 8
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 7
- 108091081013 MiR-33 Proteins 0.000 claims description 7
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 claims description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 6
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 claims description 5
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 4
- 102100032187 Androgen receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 3
- 101000775732 Homo sapiens Androgen receptor Proteins 0.000 claims 1
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 claims 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 133
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 81
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 35
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 33
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 30
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 29
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 21
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 18
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 18
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 18
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 17
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 16
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 15
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 15
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 14
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 13
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 12
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 10
- 102000007372 Ataxin-1 Human genes 0.000 description 10
- 108010032963 Ataxin-1 Proteins 0.000 description 10
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 10
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 10
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 10
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 10
- 108091026821 Artificial microRNA Proteins 0.000 description 9
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 9
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 9
- 102000007371 Ataxin-3 Human genes 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 8
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 101000596543 Homo sapiens THAP domain-containing protein 11 Proteins 0.000 description 7
- 208000002569 Machado-Joseph Disease Diseases 0.000 description 7
- 102100035063 THAP domain-containing protein 11 Human genes 0.000 description 7
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 7
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 102000007370 Ataxin2 Human genes 0.000 description 6
- 108010032951 Ataxin2 Proteins 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 6
- 102100038913 E1A-binding protein p400 Human genes 0.000 description 6
- 101000959489 Homo sapiens Protein AF-9 Proteins 0.000 description 6
- 101000957337 Homo sapiens Putative nucleotidyltransferase MAB21L1 Proteins 0.000 description 6
- 102000016304 Origin Recognition Complex Human genes 0.000 description 6
- 108010067244 Origin Recognition Complex Proteins 0.000 description 6
- 102100039686 Protein AF-9 Human genes 0.000 description 6
- 102100038753 Putative nucleotidyltransferase MAB21L1 Human genes 0.000 description 6
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 6
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 6
- 102100025368 Runt-related transcription factor 2 Human genes 0.000 description 6
- 208000009415 Spinocerebellar Ataxias Diseases 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 108010032953 Ataxin-7 Proteins 0.000 description 5
- 102000007368 Ataxin-7 Human genes 0.000 description 5
- 108010024682 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Proteins 0.000 description 5
- 101000882371 Homo sapiens E1A-binding protein p400 Proteins 0.000 description 5
- 101001005667 Homo sapiens Mastermind-like protein 2 Proteins 0.000 description 5
- 101001057193 Homo sapiens Membrane-associated guanylate kinase, WW and PDZ domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000572986 Homo sapiens POU domain, class 3, transcription factor 2 Proteins 0.000 description 5
- 101000702559 Homo sapiens Probable global transcription activator SNF2L2 Proteins 0.000 description 5
- 101000807591 Homo sapiens UBAP1-MVB12-associated (UMA)-domain containing protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000935117 Homo sapiens Voltage-dependent P/Q-type calcium channel subunit alpha-1A Proteins 0.000 description 5
- 101000744900 Homo sapiens Zinc finger homeobox protein 3 Proteins 0.000 description 5
- 208000027747 Kennedy disease Diseases 0.000 description 5
- 102100025130 Mastermind-like protein 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100021070 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 12 Human genes 0.000 description 5
- 102100027240 Membrane-associated guanylate kinase, WW and PDZ domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 102100026459 POU domain, class 3, transcription factor 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100037864 Probable E3 ubiquitin-protein ligase IRF2BPL Human genes 0.000 description 5
- 102100031021 Probable global transcription activator SNF2L2 Human genes 0.000 description 5
- 208000036834 Spinocerebellar ataxia type 3 Diseases 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 102100037215 UBAP1-MVB12-associated (UMA)-domain containing protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100039966 Zinc finger homeobox protein 3 Human genes 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000004424 eye movement Effects 0.000 description 5
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 108010032947 Ataxin-3 Proteins 0.000 description 4
- 102100024507 BMP-2-inducible protein kinase Human genes 0.000 description 4
- 102000014817 CACNA1A Human genes 0.000 description 4
- 206010008748 Chorea Diseases 0.000 description 4
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 4
- 101000762370 Homo sapiens BMP-2-inducible protein kinase Proteins 0.000 description 4
- 101000749829 Homo sapiens Connector enhancer of kinase suppressor of ras 3 Proteins 0.000 description 4
- 101001005668 Homo sapiens Mastermind-like protein 3 Proteins 0.000 description 4
- 101000614988 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 12 Proteins 0.000 description 4
- 101000599816 Homo sapiens Probable E3 ubiquitin-protein ligase IRF2BPL Proteins 0.000 description 4
- 102100025134 Mastermind-like protein 3 Human genes 0.000 description 4
- 208000002740 Muscle Rigidity Diseases 0.000 description 4
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 101710156592 Putative TATA-binding protein pB263R Proteins 0.000 description 4
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 description 4
- 101710145783 TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 208000012601 choreatic disease Diseases 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 4
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 3
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 3
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 3
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 3
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 3
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 3
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 3
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 3
- 102100020741 Atrophin-1 Human genes 0.000 description 3
- 208000020925 Bipolar disease Diseases 0.000 description 3
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 3
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 3
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 3
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 101000785083 Homo sapiens Atrophin-1 Proteins 0.000 description 3
- 101000869796 Homo sapiens Microprocessor complex subunit DGCR8 Proteins 0.000 description 3
- 101000915806 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 2A 55 kDa regulatory subunit B beta isoform Proteins 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 102100032459 Microprocessor complex subunit DGCR8 Human genes 0.000 description 3
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 3
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 3
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 102100029014 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 55 kDa regulatory subunit B beta isoform Human genes 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 3
- 206010029864 nystagmus Diseases 0.000 description 3
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 239000013609 scAAV vector Substances 0.000 description 3
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 3
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 108091006108 transcriptional coactivators Proteins 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033647 Activity-regulated cytoskeleton-associated protein Human genes 0.000 description 2
- -1 Atrophin Proteins 0.000 description 2
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 208000003164 Diplopia Diseases 0.000 description 2
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 2
- 208000001308 Fasciculation Diseases 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000695522 Homo sapiens Synaptophysin Proteins 0.000 description 2
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 2
- 102000016252 Huntingtin Human genes 0.000 description 2
- 201000006347 Intellectual Disability Diseases 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 208000015592 Involuntary movements Diseases 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 2
- 102100022437 Myotonin-protein kinase Human genes 0.000 description 2
- 208000029726 Neurodevelopmental disease Diseases 0.000 description 2
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100029534 Nuclear receptor subfamily 2 group E member 1 Human genes 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 2
- 108010058956 Protein Phosphatase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000006478 Protein Phosphatase 2 Human genes 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101000599815 Rattus norvegicus Probable E3 ubiquitin-protein ligase IRF2BPL Proteins 0.000 description 2
- 206010040030 Sensory loss Diseases 0.000 description 2
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 2
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 2
- 102000006467 TATA-Box Binding Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010044281 TATA-Box Binding Protein Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 2
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 101150084233 ago2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 102000050055 human SYP Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 2
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000017311 musculoskeletal movement, spinal reflex action Effects 0.000 description 2
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 2
- 206010030875 ophthalmoplegia Diseases 0.000 description 2
- 201000004481 ossifying fibromyxoid tumor Diseases 0.000 description 2
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OFNXOACBUMGOPC-HZYVHMACSA-N 5'-hydroxystreptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O OFNXOACBUMGOPC-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 208000036443 AIPL1-related retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000007876 Acrospiroma Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010003658 Atrial Fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 102000004321 Atrophin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000806 Atrophin-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000017785 Autosomal dominant epilepsy with auditory features Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 208000024400 Blepharophimosis-intellectual disability syndrome, Ohdo type Diseases 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006100 Bradykinesia Diseases 0.000 description 1
- 206010068597 Bulbospinal muscular atrophy congenital Diseases 0.000 description 1
- 101150041164 Cacna1a gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 208000015879 Cerebellar disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008754 Choreoathetosis Diseases 0.000 description 1
- 208000037051 Chromosomal Instability Diseases 0.000 description 1
- 108010060434 Co-Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008169 Co-Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 208000019505 Deglutition disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012239 Delusion Diseases 0.000 description 1
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 206010013887 Dysarthria Diseases 0.000 description 1
- 206010013952 Dysphonia Diseases 0.000 description 1
- 101710202499 E1A-binding protein p400 Proteins 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000004678 Exoribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010002700 Exoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000003727 FG syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000033890 FG syndrome type 1 Diseases 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000714174 Feline sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 230000006370 G0 arrest Effects 0.000 description 1
- 230000037057 G1 phase arrest Effects 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102100022901 Histone acetyltransferase KAT2A Human genes 0.000 description 1
- 102100022103 Histone-lysine N-methyltransferase 2A Human genes 0.000 description 1
- 108050002855 Histone-lysine N-methyltransferase 2A Proteins 0.000 description 1
- 101001046967 Homo sapiens Histone acetyltransferase KAT2A Proteins 0.000 description 1
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000633503 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 2 group E member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000780643 Homo sapiens Protein argonaute-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000857682 Homo sapiens Runt-related transcription factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100421722 Homo sapiens SMARCA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 101150010142 IRF2BPL gene Proteins 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000001242 Lujan-Fryns syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 1
- 101710179284 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 12 Proteins 0.000 description 1
- 201000008468 Meier-Gorlin syndrome 1 Diseases 0.000 description 1
- 201000008466 Meier-Gorlin syndrome 2 Diseases 0.000 description 1
- 206010027374 Mental impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000034819 Mobility Limitation Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057269 Mucoepidermoid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101100144701 Mus musculus Drosha gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 description 1
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000000737 Nicolaides-Baraitser syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710088761 Nuclear receptor subfamily 2 group E member 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 201000003048 Ohdo syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102100030030 Origin recognition complex subunit 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710201850 Origin recognition complex subunit 4 Proteins 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 206010034620 Peripheral sensory neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 206010034719 Personality change Diseases 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710178065 Probable E3 ubiquitin-protein ligase IRF2BPL Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 description 1
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 description 1
- 102100034207 Protein argonaute-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 208000025535 REM sleep behavior disease Diseases 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000005793 Restless legs syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010081750 Reticulin Proteins 0.000 description 1
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 1
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 201000001542 Schneiderian carcinoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 206010046798 Uterine leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 description 1
- 102100025330 Voltage-dependent P/Q-type calcium channel subunit alpha-1A Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008335 axon cargo transport Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 230000014461 bone development Effects 0.000 description 1
- 230000034127 bone morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 1
- 206010071135 branchio-oto-renal syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008777 canonical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000021617 central nervous system development Effects 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000006726 chronic neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 201000006754 cone-rod dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000806 cranial fontanelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000868 delusion Toxicity 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 208000029444 double vision Diseases 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000001936 exophthalmos Diseases 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 201000000079 gynecomastia Diseases 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 201000005133 hidradenoma Diseases 0.000 description 1
- OFNXOACBUMGOPC-UHFFFAOYSA-N hydroxystreptomycin Natural products CNC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(C=O)(O)C(CO)OC1OC1C(N=C(N)N)C(O)C(N=C(N)N)C(O)C1O OFNXOACBUMGOPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003933 intellectual function Effects 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- OKPOKMCPHKVCPP-UHFFFAOYSA-N isoorientaline Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(CC2C3=CC(OC)=C(O)C=C3CCN2C)=C1 OKPOKMCPHKVCPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003445 large cell neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 231100000875 loss of motor control Toxicity 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 230000036630 mental development Effects 0.000 description 1
- 108091007426 microRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- 208000008275 microscopic colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 208000001491 myopia Diseases 0.000 description 1
- 230000004379 myopia Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007472 neurodevelopment Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008193 neuromotor development Effects 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000006555 post-translational control Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 208000026526 progressive weakness Diseases 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004461 rapid eye movement Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- JTQHYPFKHZLTSH-UHFFFAOYSA-N reticulin Natural products COC1CC(OC2C(CO)OC(OC3C(O)CC(OC4C(C)OC(CC4OC)OC5CCC6(C)C7CCC8(C)C(CCC8(O)C7CC=C6C5)C(C)O)OC3C)C(O)C2OC)OC(C)C1O JTQHYPFKHZLTSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001711 saccadic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 201000005572 sensory peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 230000006403 short-term memory Effects 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022925 sleep disturbance Diseases 0.000 description 1
- 208000026473 slurred speech Diseases 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000009752 translational inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 201000007954 uterine fibroid Diseases 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
- C12N2330/51—Specially adapted vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Psychology (AREA)
- Virology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本揭示案係關於用於產生抑制性雙股RNA之組合物及方法,以及其治療用途。
Description
本發明係關於用於治療CAG重複序列疾病之組合物及方法。
重複序列擴增病症係由DNA重複序列之擴增引起的體染色體顯性遺傳病症。DNA重複序列可由單一核苷酸至十二聚體或更長構成。重複序列擴增成為症狀之臨限值隨特定疾病而異。有超過50種不同疾病係由重複序列擴增而引起。重複序列擴增可發生在基因之編碼區或非編碼區中。重複序列擴增可引起基因編碼蛋白質之缺陷;改變基因表現之調控;產生有毒RNA;或導致染色體不穩定。
抑制含重複序列基因之突變型及野生型表現可誘導顯著之副作用。因此,抑制突變型重複序列擴增等位基因係針對重複序列擴增病症之期望治療策略。目前針對突變型等位基因特異性抑制之策略包括利用反義寡核苷酸或RNA干擾劑靶向疾病相關之單核苷酸多型性(SNP)或缺失。然而,鑑別與重複序列擴增突變相關之SNP需要在較大臨床群組中進行詳細的群體特異性遺傳研究。此外,端視於靶標SNP之頻率或在突變型重複序列擴增等位基因上之位置而定,某些受影響之個體或群體可能被排除在外。
本揭示案提供雙股RNA,其包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一股包含:i)與該靶標CAG重複序列區之第一失配;及ii)與該靶標CAG重複序列區之至少第二失配。本揭示案提供DNA分子,其包含編碼該雙股RNA之該第一股之核苷酸序列,其中該核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能之啟動子。本揭示案提供重組核酸,其包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架;本揭示案亦提供重組表現載體,其包含編碼此一重組核酸之核苷酸序列。本揭示案提供DNA分子,其包含編碼重組核酸之核苷酸序列,該重組核酸包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架;本揭示案亦提供包含此一DNA分子之重組表現載體。本揭示案提供包含本揭示案之重組表現載體之病毒及非病毒遞送運載體;及包含此等遞送運載體之醫藥組合物。本揭示案提供用於選擇性地減少含疾病相關CAG重複序列之RNA的轉譯之方法。
在一些實施例中,本揭示案提供雙股RNA,其自5’至3’包含:(a) 5’前導序列;(b) 5’莖,其包含隨從序列或引導序列;(c) 1-6個鹼基之5’連接體;(d)末端環;(e) 1-6個鹼基之3’連接體;(f) 3’莖,其包含:(i)引導序列,若該5’莖包含隨從序列;或(ii)隨從序列,若該5’莖包含引導序列;及(g) 3’尾曳序列;其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA (例如mRNA或前mRNA)之CAG重複序列區,且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。
交叉引用
本申請案主張2021年10月6日提出申請之美國臨時專利申請案第63/253,070號及2022年5月6日提出申請之美國臨時專利申請案第63/339,363號之權益,該等申請案係以全文引用的方式併入本文中。
以電子方式提交材料之引用併入
序列表在此提供為序列表XML,「IRIS-001WO_SEQ_LIST」,其創建於2022年10月4日且大小為1,298 KB。序列表XML之內容係以全文引用的方式併入本文中。
重複序列擴增病症對於相對於正常等位基因選擇性抑制疾病等位基因造成顯著障礙。本揭示案提供雙股RNA,其可利用重複序列數目之差異且達成對含重複序列之蛋白質的等位基因選擇性抑制。該等雙股RNA靶向含重複序列之靶標RNA分子(例如mRNA或前mRNA)之重複序列區,且在引導序列之8-16位(例如8、9、10、11、12、13、14、15或16)相對於靶標mRNA或前mRNA中之重複序列區含有1-5個(例如1、2、3、4或5個)核鹼基失配,此增強雙股RNA相對於野生型選擇性地抑制突變型蛋白質表現之能力。靶向含重複序列之靶標mRNA或前mRNA之重複序列區且在引導序列之8-16位相對於該重複序列區包含1-5個失配的載體編碼雙股RNA之標準設計揭示5’裂解位點加工中之位置移位。由於加工中之移位,引導序列中失配之位置亦移位,此將其置於偏移或不期望之位置。在偏移或不期望之位置處具有失配之雙股RNA可能不具有期望功能。已針對載體表現對本揭示案之雙股RNA之設計進行修改,此增強正確加工,以在期望位置置入失配且提供更可預測之5’裂解位點。
在更詳細地陳述本揭示案之前,提供在本文中使用的某些術語之定義可有助於理解本揭示案。其他定義在整個本揭示案中予以陳述。
在本說明書中,除非另有指示,否則任一濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任一整數值及(在適當時)其分數部分(諸如整數之十分之一及百分之一)。同樣,除非另有指示,否則本文中所列舉之關於任何物理特徵(諸如聚合物亞單元、大小或厚度)之任一數值範圍應理解為包括所列舉範圍內之任一整數。除非另有指示,否則如本文所用,術語「約」意指所指示範圍、值或結構之± 20%。應理解,如本文所用之術語「一(a及an)」係指「一或多種」所列舉之組分。替代方案(例如「或」)之使用應理解為意指該等替代方案中之任一者、兩者或其任何組合。如本文所用,術語「包括」、「具有」及「包含」同義地使用,該等術語及其變異體意欲解釋為具有非限制性。
如本文所用,術語「核酸」或「多核苷酸」係指由共價連接之核苷酸亞單元構成之任何核酸聚合物,諸如多去氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸。核酸之實例包括RNA及DNA。
如本文所用,「RNA」係指包含一或多個核糖核苷酸之分子,且包括雙股RNA、單股RNA、經分離RNA、合成RNA、重組RNA以及藉由添加、缺失、取代及/或改變一或多個核苷酸而與天然RNA不同的經修飾之RNA。RNA分子之核苷酸可包含標準核苷酸或非標準核苷酸,諸如非天然核苷酸或化學合成之核苷酸。
如本文所用,「DNA」係指包含一或多個去氧核糖核苷酸之分子,且包括雙股DNA、單股DNA、經分離DNA、合成DNA、重組DNA以及藉由添加、缺失、取代及/或改變一或多個核苷酸而與天然DNA不同的經修飾之DNA。DNA分子之核苷酸可包含標準核苷酸或非標準核苷酸,諸如非天然核苷酸或化學合成之核苷酸。
如本文所用,「核苷」意指包含核鹼基部分及糖部分之化合物。核苷包括(但不限於)天然核苷(如在DNA及RNA中所發現)及經修飾之核苷。核苷可連接至磷酸酯部分。
如本文所用,「核苷酸」意指進一步包含磷酸酯連接基團之核苷。如本文所用,「連接之核苷」可由或可不由磷酸酯鍵聯連接,且因此包括(但不限於)「連接之核苷酸」。如本文所用,「連接之核苷」係以鄰接序列相連結之核苷(亦即,在彼等連接之核苷之間不存在其他核苷)。
如本文所用,「核鹼基」或「鹼基」意指可連接至糖部分以產生能夠併入至寡核苷酸中之核苷之原子群,且其中該原子群能夠與另一寡核苷酸或核酸之互補天然核鹼基鍵結。核鹼基可為天然的或可經修飾。
如本文所用,「寡核苷酸」意指包含複數個連接核苷之化合物。在一些實施例中,寡核苷酸包含一或多個未經修飾之核糖核苷(RNA)及/或未經修飾之去氧核糖核苷(DNA)及/或一或多個經修飾之核苷。
如本文所用,「寡聚化合物」意指包含兩個或更多個亞結構之聚合結構。在某些實施例中,寡聚化合物包含寡核苷酸。在某些實施例中,寡聚化合物包含一或多個結合基團及/或末端基團。在某些實施例中,寡聚化合物由寡核苷酸組成。寡聚化合物亦包括天然核酸。
如本文所用,「單股」意指不與其互補序列雜交且缺乏足夠的自補性以形成穩定自身雙鏈體之寡聚化合物。
如本文所用,「雙股」意指與其互補序列部分或完全雜交以形成穩定雙鏈體分子之寡聚化合物。雙股寡聚化合物可由彼此雜交之互補寡聚化合物之兩個單獨股或具有足夠的自補性以形成穩定自身雙鏈體之單一寡聚化合物構成。穩定自身雙鏈體可含有莖-環結構及/或凸起。
「經分離」係指已與其天然環境分離或人工產生之物質。如本文關於細胞所用,「經分離」係指已與其天然環境(例如個體、器官、組織或體液)分離之細胞。如本文關於核酸所用,「經分離」係指已自其天然環境(例如細胞、細胞器或細胞質)分離出或純化、重組產生、擴增或合成之核酸。在實施例中,經分離核酸包括載體內所含之核酸。
如本文所用,術語基因之「野生型」或「非突變型」形式係指編碼與正常或非致病活性相關之蛋白質(例如沒有突變之蛋白質,該突變諸如導致神經退化性疾病發生、發作或進展之更高風險的重複序列區擴增)之核酸。
如本文所用,術語「突變」係指基因結構(例如基因序列)之任何變化,其產生基因之改變形式,該改變形式可傳遞至後續世代(遺傳性突變)或可不傳遞至後續世代(體細胞突變)。基因突變包括DNA中單一鹼基之取代、插入或缺失,或基因或染色體之多個鹼基或更大區段之取代、插入、缺失或重排,包括重複序列擴增。
如本文所用,術語「抑制性核酸」係指包含與靶標核酸(例如靶標RNA、mRNA或前mRNA)之至少一部分雜交且抑制其表現或活性之引導股序列的核酸。抑制性核酸可靶向靶標核酸之蛋白質編碼區(例如外顯子)或非編碼區(例如5’UTR、3’UTR、內含子等)。在一些實施例中,抑制性核酸係單股或雙股分子。抑制性核酸可在單獨股(例如雙股雙鏈體)上或在同一股(例如單股自退火雙鏈體結構)中進一步包含隨從股序列。在一些實施例中,抑制性核酸為RNA分子,諸如siRNA、shRNA、初級miRNA、前miRNA或miRNA。在一些實施例中,抑制性核酸為雙股RNA (dsRNA),諸如初級miRNA、前miRNA、miRNA或shRNA。
如本文所用,「微小RNA」或「miRNA」係指能夠藉由靶標mRNA之裂解、靶標mRNA之轉譯抑制、靶標mRNA降解或其組合介導靶標基因沈默之小的非編碼RNA分子。通常,miRNA轉錄為髮夾或莖-環(例如具有自補性單股骨架)雙鏈體結構,稱為初級miRNA (初級miRNA (pri-miRNA)),其被酶促加工(例如由Drosha、DGCR8、Pasha等)成前miRNA。前miRNA被輸出至細胞質中,在此其經Dicer酶促加工以與隨從股一起產生miRNA雙鏈體,且接著產生單股成熟miRNA分子,其隨後加載至RNA誘導之沈默複合物(RISC)中。對miRNA之提及可包括合成或人工miRNA。
如本文所用,「合成miRNA」或「人工miRNA」或「amiRNA」或「小結合RNA」 (sbRNA)係指內源性、經修飾或合成之初級miRNA或前miRNA (例如miRNA骨架或支架),其中莖序列內之內源性miRNA引導序列及隨從序列已經引導所靶向基因之高效RNA沈默之異源性引導序列及異源性隨從序列替代(例如,參見Eamens等人,(2014), Methods Mol. Biol. 1062:211-224)。在一些實施例中,引導及隨從序列之互補性性質(例如鹼基數目、失配位置、凸起類型等)可與構築合成miRNA之內源性miRNA骨架中之引導及隨從序列之互補性性質類似或不同。
如本文所用,術語「微小RNA骨架」、「miR骨架」、「微小RNA支架」或「miR支架」係指初級miRNA或前miRNA支架,其中莖序列經所關注之異源性RNA替代,且能夠產生在由所關注之miRNA靶向之基因處引導RNA沈默之功能性成熟miRNA。在一些情形中,miR骨架包含5’側接區(在本文中亦稱為「5’側接多核苷酸」或「5’前導序列」)、環基元區(在本文中亦稱為「環多核苷酸」)及3’側接區(在本文中亦稱為「3’側接多核苷酸」或「3’尾曳序列」)。在一些情形中,miR骨架包含5’側接區及3’側接區(且不包括環基元區)。miR骨架可完全或部分地源自野生型miRNA支架,或為完全人工序列。
如本文所用,術語「短髮夾RNA」或「shRNA」包括習知莖-環shRNA,其形成前體miRNA (前miRNA)。「shRNA」亦包括嵌入微小RNA之shRNA (基於miRNA之shRNA),其中miRNA雙鏈體之引導股及隨從股併入至現有(或天然) miRNA中或併入至經修飾或合成(設計)之miRNA中。在轉錄時,習知shRNA形成初級miRNA (初級miRNA)或與天然初級miRNA極類似之結構。初級miRNA隨後由Drosha及其輔因子加工成前miRNA。因此,術語「shRNA」包括初級miRNA分子及前miRNA分子。
「莖-環結構」係指具有二級結構之核酸,該二級結構包括已知或預計形成雙股或自身雙鏈體之核苷酸區(莖部分),其在一側由主要為單股核苷酸之區(末端環部分)連接。術語「髮夾」、「自身雙鏈體」及「回摺」結構在本文中亦用於指莖-環結構。此等結構為此項技術中所熟知,且該術語之使用與其在此項技術中之已知含義一致。如此項技術中所已知,二級結構不需要準確鹼基配對。因此,莖可包括一或多個鹼基失配或凸起。或者,鹼基配對可為準確的,亦即不包括任何失配。
如本文所用,術語抑制性核酸之「引導股序列」係指與靶向進行沈默之mRNA或前mRNA之約10-50個核苷酸(例如約15-30個、16-25個、18-23個或19-22個核苷酸)之區實質上互補(例如至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%互補)的序列。引導序列與靶標mRNA序列充分互補,以引導靶標特異性沈默,例如藉由RNAi機制或過程觸發靶標mRNA之破壞或減少靶標mRNA之轉譯。在一些實施例中,引導股序列係指在由Dicer裂解後剩餘之成熟引導序列。
如本文所用,術語抑制性核酸之「隨從股序列」係指與靶標mRNA或前mRNA同源,且與抑制性核酸之引導股序列部分或完全互補之序列。抑制性核酸之引導股序列與隨從股序列雜交形成雙鏈體結構(例如形成雙股雙鏈體或單股自退火雙鏈體結構)。在一些實施例中,引導股序列及隨從股序列係指在由Dicer裂解後剩餘之成熟序列。
如本文所用,術語「5’臂」或「5’莖」係指雙股RNA (例如shRNA、前miRNA、初級mRNA)之一部分,其包含引導股或隨從股。
如本文所用,術語「3’臂」或「3’莖」係指雙股RNA之一部分,其包含5’莖引導股之隨從股或5’莖隨從股之引導股。
如本文所用,「雙鏈體」在關於抑制性核酸使用時係指兩個核酸股(例如引導股及隨從股)雜交在一起形成雙鏈體結構。雙鏈體可由兩個單獨核酸股形成,或由具有自補性區(例如髮夾或莖-環)之單一核酸股形成。
如本文所用,「靶標核酸」意指反義化合物與之雜交之核酸分子。靶標核酸可為由靶標基因編碼之mRNA (靶標mRNA)或前mRNA (靶標前mRNA)。
如本文所用,「靶向」或「靶向至」意指反義化合物與特定靶標核酸分子或靶標核酸分子之特定區之締合。若雙股RNA與靶標核酸充分互補以容許在生理條件下雜交,則其靶向該靶標核酸。
如本文所用,術語「互補」係指多核苷酸彼此形成鹼基對之能力。鹼基對通常由反向平行多核苷酸股中或單一自退火多核苷酸股中核苷酸亞單元之間的氫鍵形成。互補多核苷酸股可以沃森-克里克方式(Watson-Crick manner)(例如A對T、A對U、C對G),或以容許形成雙鏈體之任何其他方式形成鹼基對。在一些實施例中,互補核苷酸包括G及U (搖擺鹼基對)。如對熟習此項技術者顯而易見的是,當使用RNA而非DNA時,尿嘧啶而非胸腺嘧啶係視為與腺苷互補之鹼基。此外,除非另有說明,否則當在本發明之上下文中指示「U」時,應理解其能夠取代「T」。互補性亦涵蓋未經修飾與經修飾核鹼基(例如5-甲基胞嘧啶取代胞嘧啶)之間的沃森-克里克鹼基配對。兩個多核苷酸股之間的全互補性、完全互補性或100%互補性係一個多核苷酸股之每一核苷酸可與第二多核苷酸股之核苷酸單元形成氫鍵之情形。互補性%係指核酸分子中與對齊參考序列(例如靶標mRNA、隨從股)互補之鄰接核苷酸序列之核苷酸數除以核苷酸總數且乘以100。在此一對齊中,不形成鹼基對之核鹼基/核苷酸稱為失配。在計算鄰接核苷酸序列之互補性%時不允許插入及缺失。熟習此項技術者應理解,在計算互補性時,只要保留核鹼基之沃森-克里克鹼基配對能力,則不考慮對核鹼基之化學修飾(例如出於計算互補性%之目的,5-甲基胞嘧啶視為與胞嘧啶相同)。
如本文所用,關於核鹼基之「非互補」意指彼此不形成氫鍵之一對核鹼基。
如本文所用,「失配」意指當將第一與第二寡聚化合物對齊時,第一寡聚化合物中不能與第二寡聚化合物之相應位置處之核鹼基配對之核鹼基。第一及第二寡聚化合物中之任一者或全部兩者可為寡核苷酸。不會鹼基配對之核苷酸包括自配對核苷酸(A-A、T-T、U-U、C-C及G-G)、A及C、C及U、C及T、A及G。在一些實施例中,失配不包括G-U搖擺鹼基對。
兩個或更多個核酸序列之間的「一致性百分比」係指核酸分子中鄰接核苷酸序列之核苷酸由參考序列所共享之比例(亦即,一致性% =對齊區(例如鄰接核苷酸序列)中之一致核苷酸數/核苷酸總數× 100)。在計算鄰接核苷酸序列之一致性%時不允許插入及缺失。熟習此項技術者應理解,在計算一致性時,只要保留核鹼基之沃森-克里克鹼基配對能力,則不考慮對核鹼基之化學修飾(例如出於計算一致性%之目的,5-甲基胞嘧啶視為與胞嘧啶相同)。
如本文所用,術語「雜交(hybridizing或hybridize)」係指兩個核酸股在反向平行股上之鹼基對之間形成氫鍵,藉此形成雙鏈體。雖然不限於特定機制,但最常見的配對機制涉及互補核鹼基之間的氫鍵結,其可為沃森-克里克、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氫鍵結。兩個核酸股之間的雜交強度可由熔融溫度(T
m)描述,其定義為在給定離子強度及pH下,50%之靶標序列與互補多核苷酸雜交之溫度。
如本文所用,「異源性」係指未在天然(native、naturally occurring)核酸中發現之核酸。舉例而言,相對於微小RNA之組件(例如5’側接多核苷酸、環多核苷酸、3’側接多核苷酸),異源性引導序列及異源性隨從序列包含在自然界中與微小RNA不相關之核苷酸序列。如本文所用,「引導序列」可與雙股RNA之「第一股」(或「靶向股」,其中該「靶向股」與靶標RNA雜交)互換,而與定向無關。
如本文所用,「表現盒」係指含有核酸(例如轉殖基因)之任何類型之遺傳構築體,其中部分或全部核酸編碼序列能夠被轉錄。在一些實施例中,表現包括核酸之轉錄,例如自轉錄基因產生生物活性多肽產物或抑制性RNA (例如siRNA、shRNA、miRNA)。在一些實施例中,轉殖基因可操作地連接至表現控制序列。
如本文所用,術語「轉殖基因」係指已天然地或藉由遺傳工程手段轉移至另一細胞中且能夠轉錄並視情況轉譯之外源性核酸。
如本文所用,術語「基因表現」係指核酸自核酸分子轉錄且通常轉譯成肽或蛋白質之過程。該過程可包括轉錄、轉錄後控制、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後控制、轉譯後修飾或其任何組合。對「基因表現」之量測之提及可指量測轉錄產物(例如RNA或mRNA)或轉譯產物(例如肽或蛋白質)。
如本文所用,術語「抑制基因之表現」意指減少、下調、抑制、阻斷、降低或終止該基因之表現。基因之表現產物可為自該基因轉錄之RNA分子(例如mRNA)或自該基因轉錄之mRNA轉譯之多肽。mRNA水準之降低導致自其轉譯多肽之水準降低。在一些實施例中,抑制表現降低多肽之水準,而不實質上影響編碼mRNA之產生。可使用用於量測mRNA或蛋白質之標準技術來測定表現水準。
如本文所用,「載體」係指能夠在細胞之間轉運核酸分子(例如編碼抑制性核酸之轉殖基因),且在該核酸分子可操作地連接至適宜表現控制序列時實現其表現之遺傳構築體。表現控制序列可包括轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列;高效RNA加工信號,諸如剪接及多聚腺苷酸化(聚A)信號;穩定細胞質mRNA之序列;增強轉譯效率之序列(亦即Kozak共有序列);增強蛋白質穩定性之序列;及在期望時,增強編碼產物分泌之序列。載體可為質體、噬菌體顆粒、轉位子、黏粒、噬粒、染色體、人工染色體、病毒、病毒粒子、脂質奈米顆粒等。一旦轉型至適宜宿主細胞中,載體即可獨立於宿主基因體複製並發揮作用,或在一些情況中可整合至基因體自身中。
如本文所用,「宿主細胞」係指含有或能夠含有所關注組合物(例如抑制性核酸)之任何細胞。在實施例中,宿主細胞為哺乳動物細胞,諸如齧齒類動物細胞(例如小鼠或大鼠)或靈長類動物細胞(例如猴、黑猩猩或人類)。在實施例中,宿主細胞可在活體外或活體內。在實施例中,宿主細胞可來自已確立之細胞株或原代細胞。在實施例中,宿主細胞可自患有或疑似患有重複序列擴增疾病或病症之患者獲得。在實施例中,宿主細胞為非CNS細胞,諸如纖維母細胞。在實施例中,宿主細胞為CNS細胞,諸如神經元、神經膠質細胞、星狀細胞或小神經膠質細胞。
如本文所用,「含擴增重複序列之基因」或「含擴增重複序列之RNA」係指突變型基因或由突變型基因編碼之RNA分子(例如前mRNA或mRNA),其具有包括重複序列區(例如CAG重複序列)之鹼基序列,其中該重複序列區擴增超出通常存在於「正常」含擴增重複序列之基因或由該基因編碼之RNA中的預定數目或範圍之鹼基重複序列。重複序列區之存在或長度可影響RNA或所編碼蛋白質之正常加工、功能或活性,且引起「重複序列擴增」或「擴增重複序列」疾病或病症。擴增之重複序列可為在連續世代中改變大小之不穩定(動態)突變。擴增之重複序列可為二核苷酸重複序列、三核苷酸重複序列、四核苷酸重複序列、五核苷酸重複序列、六核苷酸重複序列等。在一些實施例中,重複序列為CAG重複序列或聚麩醯胺酸。含擴增重複序列之基因或由該含擴增重複序列之基因編碼之RNA亦可稱為「病理性等位基因」或「致病性等位基因」。在一些實施例中,含CAG重複序列之基因或由該基因編碼之RNA之病理性或致病性等位基因具有≥ 30個連續CAG重複序列。
「重複序列擴增疾病或病症」或「擴增重複序列疾病或病症」係指由鹼基重複序列之擴增超出通常存在於「正常」含擴增重複序列之基因或由該基因編碼之RNA中的預定數目或範圍之鹼基重複序列所引起的疾病或病症。端視於重複序列擴增之大小而定,重複序列擴增疾病或病症可表現為明顯不同的表型。重複序列擴增疾病或病症主要為神經退化性疾病。一些重複序列擴增疾病為眼科疾病。在一些實施例中,重複序列擴增疾病或病症為聚麩醯胺酸疾病。
如本文所用,「神經退化性疾病」或「神經退化性病症」係指展現出神經細胞死亡作為病理狀態之疾病或病症。神經退化性疾病可展現出慢性神經退化,例如經若干年時期緩慢、進行性神經細胞死亡,或急性神經退化,例如突然發作或神經細胞死亡。慢性神經退化性疾病之實例包括阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、亨庭頓氏病(Huntington’s disease)、1-8型脊髓小腦性失調症(SCA1-8)、額顳葉失智症(FTD)及肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。神經退化性疾病可展現出主要一種類型之神經元或多種類型之神經元之死亡。
如本文所用,「個體(subject)」、「患者」及「個體(individual)」在本文中可互換使用,且係指選擇用於治療或療法之活生物體(例如哺乳動物)。個體之實例包括人類及非人類哺乳動物,諸如靈長類動物(猴、黑猩猩)、牛、馬、綿羊、狗、貓、大鼠、小鼠、天竺鼠、豬及其基因轉殖物種。
A. 雙股RNA
本揭示案提供人工雙股RNA,其起人工微小RNA或shRNA之作用。本揭示案之雙股RNA調節靶標RNA (例如mRNA或前mRNA)轉錄本之表現。雙股RNA包括前體分子,其在調節前在細胞內部經加工。雙股RNA可在質體、載體、基因體或其他核酸表現載體中編碼以供遞送至細胞。
在一些實施例中,人工雙股RNA自5’至3’包含:(a) 5’前導序列;(b) 5’莖,其包含或實質上包含隨從序列或引導序列;(c) 1-6個鹼基之5’連接體;(d)末端環;(e) 1-6個鹼基之3’連接體;(f) 3’莖,其包含或實質上包含:(i)引導序列,若該5’莖包含或實質上包含隨從序列;或(ii)隨從序列,若該5’莖包含或實質上包含引導序列;及(g) 3’尾曳序列;其中該引導序列靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區,且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。
在一些實施例中,雙股RNA係指具有至少部分自補性以形成穩定自身雙鏈體之單一RNA寡核苷酸化合物。除非另有規定,否則雙股RNA中核苷酸位置之編號係自單一RNA股上之5’至3’方向計數。類似地,除非另有規定,否則核苷酸序列係自單一RNA股上之5’至3’方向讀取。
本揭示案之人工雙股RNA包含5’前導序列,亦稱為5’側接序列。5’前導序列可全部或部分地源自或獲自野生型微小RNA序列,或全部或部分地為人工的。在一些實施例中,5’前導序列全部或部分地源自或獲自野生型前miRNA支架或初級miRNA支架之側接序列。
5’前導序列與包含或實質上包含隨從或引導序列之5’莖鄰接連接。5’前導序列可為任何長度。在一些實施例中,5’前導序列之長度為約1個核苷酸至約1,000個核苷酸、約1個核苷酸至約900個核苷酸、約1個核苷酸至約800個核苷酸、約1個核苷酸至約700個核苷酸、約1個核苷酸至約600個核苷酸、約1個核苷酸至約500個核苷酸、1個核苷酸至約400個核苷酸、約1個核苷酸至約300個核苷酸、約1個核苷酸至約200個核苷酸、約1個核苷酸至約100個核苷酸、約1個核苷酸至約75個核苷酸、約1個核苷酸至約50個核苷酸、約1個核苷酸至約25個核苷酸、約1個核苷酸至約20個核苷酸、約1個核苷酸至約15個核苷酸或長度為約1個核苷酸至約10個核苷酸。
在一些實施例中,5’前導序列包含5’凸起序列。如本文所用,術語「凸起序列」係指與雙鏈體中同其相對之核酸非互補之核酸區。舉例而言,雙鏈體可含有互補核酸區,接著為非互補核酸區,之後為第二個互補核酸區。互補核酸區將彼此結合,而中心非互補區將不結合,藉此形成「凸起」。在一些實施例中,定位在該兩個互補區之間的兩股核酸將具有不同長度,藉此形成「凸起」。
本揭示案之人工雙股RNA包含3’尾曳序列,亦稱為3’側接序列。3’尾曳序列可全部或部分地源自或獲自野生型微小RNA序列,或全部或部分地為人工的。在一些實施例中,3’尾曳序列全部或部分地源自或獲自野生型前miRNA支架或初級miRNA支架之側接序列。
3’尾曳序列與包含或實質上包含引導或隨從序列之3’莖鄰接連接。3’尾曳序列可為任何長度。在一些實施例中,3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約1,000個核苷酸、約1個核苷酸至約900個核苷酸、約1個核苷酸至約800個核苷酸、約1個核苷酸至約700個核苷酸、約1個核苷酸至約600個核苷酸、約1個核苷酸至約500個核苷酸、1個核苷酸至約400個核苷酸、約1個核苷酸至約300個核苷酸、約1個核苷酸至約200個核苷酸、約1個核苷酸至約100個核苷酸、約1個核苷酸至約75個核苷酸、約1個核苷酸至約50個核苷酸、約1個核苷酸至約25個核苷酸、約1個核苷酸至約20個核苷酸、約1個核苷酸至約15個核苷酸或長度為約1個核苷酸至約10個核苷酸。在一些實施例中,3’尾曳序列包含3’凸起序列。
在一些實施例中,3’尾曳序列包含聚U (聚尿苷)尾。在一些實施例中,3’尾曳序列包含3-6個尿苷,例如3個尿苷、4個尿苷、5個尿苷或6個尿苷。在一些實施例中,聚U尾緊鄰3’莖中之引導序列或隨從序列。在一些實施例中,使用Pol III啟動子表現具有包含聚U尾之3’尾曳序列之人工雙股RNA。
在一些實施例中,3’尾曳序列包含多聚腺苷酸化(pA)信號序列。適宜多聚腺苷酸化信號包括(但不限於) SV40晚期pA信號、BGH pA信號及諸如此類。在一些實施例中,使用Pol II啟動子表現具有包含pA信號序列之3’尾曳序列之人工雙股RNA。
在一些實施例中,5’前導序列與3’尾曳序列具有相同數目之核苷酸。在一些實施例中,5’前導序列與3’尾曳序列具有不同長度。
在一些實施例中,5’前導序列與3’尾曳序列全部或部分地獲自或源自相同的miRNA支架,例如相同的野生型前miRNA支架或相同的初級miRNA支架。在一些實施例中,5’前導序列與3’尾曳序列二者均全部或部分地獲自或源自miR-33支架。在一些實施例中,5’前導序列與3’尾曳序列二者均全部或部分地獲自或源自初級miR-33支架。在一些實施例中,5’前導序列與3’尾曳序列二者均全部或部分地獲自或源自前miR-33支架。在一些實施例中,5’前導序列及3’尾曳序列選自表E。
在一些實施例中,5’前導序列不與3’尾曳序列互補。在一些實施例中,5’前導序列與3’尾曳序列部分互補。在一些實施例中,5’前導序列含有一個、兩個或更多個與3’尾曳序列中之聚U尾中尿苷之C失配(或對於編碼雙股RNA之DNA序列含有C-T失配)。
在一些實施例中,5’前導序列及3’尾曳序列含有容許由Drosha識別並裂解之序列。哺乳動物中miRNA生物發生之典型路徑由Drosha-DGCR8 (狄喬治症候群(DiGeorge syndrome)關鍵區基因8)複合物(微處理器)啟動,該複合物將長的初級miRNA (初級miRNA)加工成約60-nt之前miRNA,其由Dicer進一步加工成約22 nt長之雙鏈體。在一些實施例中,用作5’前導序列及/或3’尾曳序列或作為其一部分之初級miRNA序列可引導雙股RNA之Drosha裂解。美國專利公開案第2008/0226553號及Liu等人,(2008) Nucleic Acids Res. 36:2811-24中提供使用前體miRNA作為支架以供選擇性表現引導:隨從雙鏈體之方法,該等文獻各自係以全文引用的方式併入。
在一些實施例中,人工雙股RNA藉由Drosha非依賴性/Dicer依賴性路徑加工。在一些實施例中,剪接、3'-5'核糖核酸外切酶或pol III終止可取代Drosha裂解。
在一些實施例中,人工雙股RNA藉由Drosha依賴性/Dicer非依賴性路徑加工。初級miR-451提供Drosha依賴性/ Dicer非依賴性路徑加工之實例,其經Drosha加工,產生前miR-451,接著該前miR-451由Ago2 (亞古爾蛋白2 (argonaute 2))裂解成
ac- 前 mir-451,其由尚不知曉之機制進一步切除,產生成熟miR-451。
在一些實施例中,5’前導序列及/或3’尾曳序列包含表A中所示之核苷酸序列或由其組成。在一些實施例中,人工雙股RNA包含含有或由CCGG組成之5’前導序列及含有或由UUUUUG組成之3’尾曳序列。在一些實施例中,人工雙股RNA包含含有或由CC組成之5’前導序列及含有或由UUUUUG組成之3’尾曳序列。在一些實施例中,人工雙股RNA包含含有或由GCUG組成之5’前導序列及含有或由ga uuuuug組成之3’尾曳序列。在一些實施例中,人工雙股RNA包含含有或由SEQ ID NO:7組成之5’前導序列及含有或由SEQ ID NO:13組成之3’尾曳序列。
在一些實施例中,雙股RNA之5’莖(或5’臂)包含隨從序列,有時亦稱為有義序列。隨從序列與靶標mRNA轉錄本具有一致性。隨從序列之長度可為約15-30個核苷酸,例如長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中,隨從序列之長度可為約19-24個核苷酸。
在一些實施例中,雙股RNA之3’莖(或3’臂)包含引導序列,有時亦稱為反義序列。引導序列與靶標mRNA轉錄本具有互補性。引導股之長度可為約15-30個核苷酸,例如長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中,引導序列之長度可為約19-24個核苷酸。
在一些實施例中,5’莖包含雙股RNA之引導序列,而3’莖包含隨從序列。
引導序列與隨從序列具有足夠的互補性,以在宿主細胞中加工後形成雙股siRNA分子,其作為RNA干擾機制之適宜受質,使得源自3’莖(或5’莖)之引導序列由RISC複合物識別且靶向其特異性mRNA轉錄本。在一些實施例中,引導序列與隨從序列具有100%互補性。在一些實施例中,引導序列與隨從序列彼此實質上互補,例如約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%互補。在一些實施例中,隨從序列可包含一至十個或一至五個鹼基失配或凸起。
引導序列可包含種子序列,其與靶標mRNA序列具有完全或接近完全之沃森-克里克互補性,相對於引導股之第一個5’核苷酸位於引導序列之1-7位、2-7位、1-8位或2-8位。種子區對於雙股RNA之高效基因沈默係重要的。
引導序列靶向含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區,且相對於該CAG重複序列區包含1-5個失配,其中該等鹼基失配位於引導序列之8-16位。失配包括自配對核苷酸(A-A、U-U、T-T、C-C及G-G)、A與C配對、C與U配對、C與T配對及A與G配對。在一些實施例中,失配包含嘌呤失配,諸如將腺苷鹼基引入至引導股中。
在一些實施例中,靶向CAG重複序列區之引導序列相對於含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區包含約1-5個鹼基失配。在一些實施例中,靶向CAG重複序列區之引導序列相對於含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區包含約1-4個鹼基失配、約1-3個鹼基失配、約1-2個鹼基失配、約2-5個鹼基失配、約3-4個鹼基失配、約3-5個鹼基失配或約4-5個鹼基失配。在一些實施例中,靶向CAG重複序列區之引導序列相對於含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區包含約一個失配、約兩個失配、約三個失配、約四個失配或約五個失配。
在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之至少一個失配(1、2、3、4或5個)可位於引導序列之8-12位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之至少一個失配(1、2或3個)可位於引導序列之9-11位。在一些實施例中,位於引導序列之8-16位的相對於CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的或彼此毗鄰的。在一些實施例中,位於8-16位的相對於CAG重複序列區之至少一個失配不與位於8-16位之另一失配毗鄰。
在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之單一失配位於引導序列之8位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之單一失配位於引導序列之9位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之單一失配位於引導序列之10位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之單一失配位於引導序列之11位。
在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之8位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之9-16位中之任一者處。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之9位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之10-16位中之任一者處。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之10位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之11-16位中之任一者處。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之11位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之12-16位中之任一者處。
在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之8位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之9位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之10-16位中之任一者處。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之9位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之10位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之11-16位中之任一者處。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之10位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之11位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之12-16位中之任一者處。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之11位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之12位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之13-16位中之任一者處。
在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之8位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之9位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之12-16位中之任一者處,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於14位、15位或16位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之9位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之10位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之11-16位中之任一者處,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於15位或16位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之9位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之11位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之12-16位中之任一者處,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於13位、14位、15位或16位。
在一些實施例中,在靶向CAG登記段(register)中之CAG重複序列區之引導序列中,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之9位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之10位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之11位,相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之15位,且相對於CAG重複序列區之一個失配位於引導序列之16位。在一些實施例中,9位、10位及11位處之失配分別為A、A及A,且15位及16位處之失配為AA、AU、UA或UU。
在一些實施例中,靶向UGC登記段中之CAG重複序列區之引導序列相對於該CAG重複序列區包含一個位於引導序列9位之失配、一個相對於該CAG重複序列區位於引導序列10位之失配、一個相對於該CAG重複序列區位於引導序列12位之失配、一個相對於該CAG重複序列區位於引導序列15位之失配及一個相對於該CAG重複序列區位於引導序列16位之失配。在一些實施例中,9位、10位及12位處之失配分別為A、C及A,且15位及16位處之失配為AA、UA或UU。
在一些實施例中,靶向GCU登記段中之CAG重複序列區之引導序列相對於該CAG重複序列區包含一個位於引導序列9位之失配、一個相對於該CAG重複序列區位於引導序列10位之失配、一個相對於該CAG重複序列區位於引導序列11位之失配、一個相對於該CAG重複序列區位於引導序列15位之失配及一個相對於該CAG重複序列區位於引導序列16位之失配。在一些實施例中,9位、10位及11位處之失配分別為A、U及A,且15位及16位處之失配為AA或AU。
在一些實施例中,靶向CAG重複序列區之引導序列包含選自表B1-表B2之任一序列或由其組成。在一些實施例中,雙股RNA包含選自表B1-表B2之引導序列及與該引導序列完全互補之相應隨從序列,或與所選引導序列相比具有一至十個或一至五個失配或凸起。
引導序列中相對於含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區之核苷酸失配呈粗體且加下劃線。
在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區的引導序列之特異性或選擇性隨相對於該CAG重複序列區之鹼基失配數而增加,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。引導序列之特異性(或靶外活性(off-target activity))可藉由偵測人類未剪接轉錄體(Ensembl資料庫,版本100)中之潛在靶外匹配來測定。舉例而言,對於與種子序列(自5’端之核苷酸1-7)中之CAG重複序列(或AGC或GCA,若使用靶向不同登記段中之重複序列之引導序列)具有完全互補性且在引導序列之8位、9位、10位或11位具有失配的靶向CAG重複序列之21 mer引導序列,可使用以下步驟來量測靶外活性:量測與引導序列具有完全匹配之靶外基因之頻率;量測與引導序列在1-21位內具有完全17 mer匹配之靶外基因之頻率;量測與引導序列匹配且在8位與21位之間(包括端值)具有0、1、2、3或4個失配之靶外基因之頻率。可記錄以下之靶外頻率:完全匹配、1-21位內之完全17 mer匹配、與引導序列具有0個失配之匹配、與引導序列具有1個失配之匹配、與引導序列具有2個失配之靶外匹配、與引導序列具有3個失配之靶外匹配、與引導序列具有4個失配之靶外匹配。
在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區的引導序列之特異性隨相對於該CAG重複序列區之2-5個鹼基失配而增加,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區的引導序列之特異性隨相對於該CAG重複序列區之3-5個鹼基失配而增加,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。
在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區具有1、2、3、4或5個鹼基失配之引導序列(其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位)具有0個預測完全匹配之靶外轉錄本。
在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區具有1、2、3、4或5個鹼基失配之引導序列(其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位)具有0-1個在1-21位內具有完全17 mer匹配之預測靶外轉錄本。
在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區具有1、2、3、4或5個鹼基失配之引導序列(其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位)具有0-2個具有一個失配之預測靶外轉錄本。
在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區具有1、2、3、4或5個鹼基失配之引導序列(其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位)具有0-2個在1-21位內具有完全17 mer匹配之預測靶外轉錄本。
在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區具有1、2、3、4或5個鹼基失配之引導序列(其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位)具有0-66個具有一個失配之預測靶外轉錄本。
表B4顯示針對來自表B3之靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區的引導序列之靶外活性之例示性過濾準則。在一些實施例中,靶向含CAG重複序列之mRNA或前mRNA之CAG重複序列區的引導序列之特異性係根據表B4中設定之臨限值中之任一者或其組合。
在一些實施例中,人工雙股RNA中存在連接體,其將人工雙股RNA之莖與環接合。在一些實施例中,5’連接體將人工雙股RNA之5’莖與環接合。在一些實施例中,3’連接體將人工雙股RNA之3’莖與環接合。在一些實施例中,5’連接體將人工雙股RNA之5’莖與環接合,且3’連接體將人工雙股RNA之3’莖與環接合。在一些實施例中,5’連接體及/或3’連接體具有約1-6個核苷酸、1-5個核苷酸、1-4個核苷酸、1-3個核苷酸、1-2個核苷酸、2-6個核苷酸、3-6個核苷酸、4-6個核苷酸、5-6個核苷酸、2-5個核苷酸或2-4個核苷酸。在一些實施例中,5’連接體及/或3’連接體具有約1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸或6個核苷酸。在一些實施例中,5’連接體與3’連接體具有相同數目之核苷酸。在一些實施例中,5’連接體與3’連接體100%互補。在一些實施例中,5’連接體包含核苷酸序列CAGC或由其組成,及/或3’連接體包含核苷酸序列GCUG或由其組成。在一些情形中,本揭示案之sbRNA不包括連接體。
在一些實施例中,5’連接體及3’連接體各自包含至少4個核苷酸,視情況其中至少75%之5’連接體核苷酸與3’連接體核苷酸互補。
表C中提供5’及3’連接體之實例。在一些實施例中,雙股RNA具有SEQ ID NO:15之5’連接體及SEQ ID NO:23之3’連接體。
在一些實施例中,末端環將人工雙股RNA之5’連接體與3’連接體分開。末端環序列可具有任何長度,或具有約4個核苷酸至約1,000個核苷酸、約4個核苷酸至約900個核苷酸、約4個核苷酸至約800個核苷酸、約4個核苷酸至約700個核苷酸、約4個核苷酸至約600個核苷酸、約4個核苷酸至約500個核苷酸、約4個核苷酸至約400個核苷酸、約4個核苷酸至約300個核苷酸、約4個核苷酸至約200個核苷酸、約4個核苷酸至約100個核苷酸、約4個核苷酸至約90個核苷酸、約4個核苷酸至約80個核苷酸、約4個核苷酸至約70個核苷酸、約4個核苷酸至約50個核苷酸、約4個核苷酸至約40個核苷酸、約4個核苷酸至約30個核苷酸、約4個核苷酸至約20個核苷酸、約4個核苷酸至約15個核苷酸或約4個核苷酸至約10個核苷酸。在一些實施例中,末端環序列具有約4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸或15個核苷酸。在一些實施例中,末端環包含迴文序列。在一些實施例中,末端環包含不對稱序列。在一些實施例中,末端環包含ACCUGC之核苷酸序列或由其組成。表D中提供環序列之實例。
表E中提供5’前導序列、3’尾曳序列及末端環序列之其他實施例。在一些實施例中,雙股RNA係人工miRNA,其自5’至3’包含:5’前導序列、隨從序列或引導序列、末端環、引導序列或隨從序列及3’尾曳序列,其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。在一些實施例中,人工miRNA之5’前導序列、3’尾曳序列及末端環選自表E。在一些實施例中,引導序列選自表B1-表B2。
在一些實施例中,表E之5’前導序列在5’末端延伸有4個核苷酸及/或表E之相應3’尾曳序列在3’末端延伸有4個核苷酸,該4個核苷酸與相應5’前導序列5’末端之4個核苷酸不互補,用於改進加工。在一些實施例中,表E之5’前導序列在5’末端延伸有4個U及/或表E之相應3’尾曳序列在3’末端延伸有4個U,用於改進加工。
應理解,包含靶向含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區的引導序列之本揭示案之雙股RNA亦包括包含靶向含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區之不同讀框(亦稱為登記段)的引導序列之雙股RNA。因此,靶向CAG重複序列包括在讀框中對靶標AGC重複序列具有+1移位或在讀框中對靶標GCA重複序列具有+2移位,但仍靶向相同的含CAG重複序列之mRNA轉錄本之引導序列。
在一些實施例中,Drosha及/或Dicer裂解定義自雙股RNA產生的siRNA之序列及功能。在一些實施例中,雙股RNA在5’前導序列及/或3’尾曳序列內由Drosha裂解,以產生包含引導序列及隨從序列之shRNA。在一些實施例中,shRNA由Dicer裂解,以產生siRNA。siRNA加載至RNA誘導之沈默複合物(RISC)上。在一些實施例中,雙股RNA係初級miRNA樣分子,其由Drosha裂解以產生前miRNA。前miRNA分子係shRNA樣分子,其隨後可由Dicer加工,以產生siRNA樣雙鏈體。在一些實施例中,雙股RNA之裂解係Dicer非依賴性的(例如由Ago2裂解)。在一些實施例中,自雙股RNA產生之shRNA具有5’懸突及/或3’懸突,例如1-6個核苷酸。在一些實施例中,自雙股RNA產生之shRNA在5’端及/或3’端具有2-3個核苷酸懸突。在一些實施例中,自雙股RNA產生之shRNA在5’端及/或3’端具有二核苷酸懸突。在一些實施例中,自雙股RNA產生之shRNA具有約38至300個核苷酸、38至250個核苷酸、38至200個核苷酸、38至150個核苷酸、38至100個核苷酸、38至75個核苷酸或38至50個核苷酸。
在一些實施例中,哺乳動物細胞中由雙股RNA產生或加工之siRNA在引導序列之8-16位內之預測位置相對於CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配。在引導序列之8-16位內之預測位置相對於CAG重複序列區存在1-5個鹼基失配可反映引導股之正確5’加工。在一些實施例中,哺乳動物細胞中由雙股RNA產生或加工且在引導序列之8-16位內之預測位置相對於CAG重複序列區具有1-5個鹼基失配之siRNA與由相同雙股RNA產生或加工之其他siRNA相比,在哺乳動物細胞(活體外或活體內)中之豐度為至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%或更多。
引導股以序列特異性方式將RISC引導至同源靶標mRNA。在一些實施例中,引導股誘導靶標mRNA轉錄本之裂解。在一些實施例中,引導股經由mRNA衰減誘導轉譯阻遏及/或後部阻遏。
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一股包含:i)與該靶標CAG重複序列區之第一失配;及ii)與該靶標CAG重複序列區之至少第二失配,其中:1)當該第一失配基於SEQ ID NO:743(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))、SEQ ID NO:745 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位時, 該第二失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處;2)當該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))或SEQ ID NO:745 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745)之編號位於9位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處;3)當該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))之編號位於10位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處;及4)當該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))之編號位於11位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過2個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過3個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,引導序列包含SEQ ID NO:298-375中之任一者(參見表6;圖22)且長度為21個核苷酸。在一些情形中,藉由用不同的核苷酸取代核苷酸(例如存在於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)中之核苷酸、存在於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)中之核苷酸或存在於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)中之核苷酸)來產生每一失配。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。
位於 8 位之第一失配; 2 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一股包含:i)與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))或SEQ ID NO:745(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745)之編號位於8位;及ii)與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過2個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過3個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:317-324之核苷酸序列。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCAACUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:317;表6中「CUG_NA_B」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCAGAUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:318;表6中「CUG_NA_C」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCAGCAGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:319;表6中「CUG_NA_D」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCAGCUACUGCUGCUG (SEQ ID NO:320;表6中「CUG_NA_E」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCAGCUGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:321;表6中「CUG_NA_F」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCAGCUGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:322;表6中「CUG_NA_G」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCAGCUGCUACUGCUG (SEQ ID NO:323;表6中「CUG_NA_H」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCAGCUGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:324;表6中「CUG_NA_I」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:804-819之核苷酸序列(如表8中所繪示;圖24)。
位於 8 位之第一失配; 3 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,且其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,且其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過3個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。
位於 8 位之第一失配; 4 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:867 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:867))或SEQ ID NO:866 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:866))之編號位於8位;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。
位於 9 位之第一失配; 2 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一股包含:i)與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))、SEQ ID NO:745 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867
(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位;及ii)與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列
CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於9位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過2個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:298-304之核苷酸序列。
位於 9 位之第一失配; 3 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))、SEQ ID NO:745
(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))、(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC(SEQ ID NO:867))之編號位於9位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於9位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過3個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:325-332及336-338之核苷酸序列。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUAAAGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:325;表6中「CUG_307」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUAAUACUGCUGCUG (SEQ ID NO:326;表6中「CUG_334」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUAAUGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:327;表6中「CUG_361」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUAAUGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:328;表6中「CUG_388」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUAAUGCUACUGCUG (SEQ ID NO:329;表6中「CUG_415」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUACAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:330;表6中「CUG_631」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUACAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:331;表6中「CUG_658」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUACAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:332;表6中「CUG_712」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUAAUGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:336;表6中「CUG_442」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUACAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:337;表6中「CUG_604」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUACAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:338;表6中「CUG_685」之RNA引導股序列)。
位於 9 位之第一失配; 4 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))、SEQ ID NO:745 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))、(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於9位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:341-344及347-367之核苷酸序列。
位於 10 位之第一失配; 2 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一股包含:i)與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))、SEQ ID NO:745 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))、(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位;及ii)與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,且其中該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,且其中該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,且其中該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過2個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過3個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:305-310之核苷酸序列。
位於 10 位之第一失配; 3 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))之編號位於10位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過3個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:333-335、339及340之核苷酸序列。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGAAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:333;表6中「CUG_2116」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGAAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:334;表6中「CUG_2143」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGAAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:335;表6中「CUG_2170」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGAAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:339;表6中「CUG_2089」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGAAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:340;表6中「CUG_2197」之RNA引導股序列)。
位於 10 位之第一失配; 4 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))、SEQ ID NO:745 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))、(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於11位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:345、346及368-375之核苷酸序列。
位於 11 位之第一失配; 2 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一股包含:i)與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))、(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))、(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於11位;及ii)與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,且該第二取代產生第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過2個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過3個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:311-315之核苷酸序列。在一些情形中,第一股包含選自SEQ ID NO:793-803之核苷酸序列(如表8中所繪示;圖24)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGCAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:311);表6中「CUG_217」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGCAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:312;表6中「CUG_226」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGCAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:313;表6中「CUG_235」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGCAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:314;表6中「CUG_244」之RNA引導股序列)。在一些情形中,第一股包含以下核苷酸序列:CUGCUGCUGCAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:315;表6中「CUG_253」之RNA引導股序列)。
位於 11 位之第一失配; 3 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))之編號位於11位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於11位,其中該第二取代產生第二失配且該第三取代產生第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過3個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。
位於 11 位之第一失配; 4 個失配
在一些情形中,本揭示案之雙股RNA包含:a)第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及b)第二股,其與該第一股雜交,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:744
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:744))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:745))之編號位於11位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於11位,其中該第二取代產生第二失配,該第三取代產生第三失配,且該第四取代產生第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。在一些情形中,第一股包含不超過4個與靶標CAG重複序列區之失配。在一些情形中,第二股與第一股100%互補。在一些情形中,第二股包含1至10個與第一股之失配(例如1至4、3至5、5至7或5至10個失配)。在一些情形中,第二股包含1至4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1、2、3或4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過1個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過2個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過3個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過4個與第一股之失配。在一些情形中,第二股包含不超過5個與第一股之失配。在一些情形中,雙股RNA之長度為18個核苷酸至25個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為20個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為21個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為22個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為23個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為24個核苷酸。在一些情形中,雙股RNA之長度為25個核苷酸。在一些情形中,藉由獨立地選自以下之取代來產生每一失配:a)用A、U或C取代G;b)用A、G或C取代U;及c)用A、U或G取代C。
B. 靶標核酸
本揭示案之雙股RNA可靶向含有所靶向重複序列區之任何基因或核酸構築體。在一些實施例中,靶向編碼人類或靈長類動物蛋白質之基因(DNA或mRNA)。在一些實施例中,靶向非編碼基因。在一些實施例中,靶向基因之編碼區。在一些實施例中,靶向基因之非編碼區。
在一些實施例中,本揭示案之雙股RNA靶向含CAG重複序列(聚麩醯胺酸)之基因。在一些實施例中,含CAG重複序列之基因選自
HTT、
共濟失調蛋白 1 、共濟失調蛋白 2 、共濟失調蛋白 3 、 CACNA1A 、共濟失調蛋白 7 、 PPP2R2B 、 TBP 、雄激素受體、 Atrophin 、 MLLT3 、 BMP2K 、 THAP11 、 ZFHX3 、 POU3F2 、 MAML2 、 SMARCA2 、 MAML3 、 ORC4 、 RUNX2 、 MED12 、 EP400 、 MAGI1 、 UMAD1 、 DM1-AS 、 AC007161.3 、 IRF2BPL及
MAB21L1。CAG重複序列之擴增與多種顯性遺傳病症相關,該等遺傳病症稱為聚麩醯胺酸(聚Q)疾病。儘管含CAG重複序列之蛋白質在全身中遍在表現,但聚麩醯胺酸疾病之病理學主要出現在(但不限於)神經元組織中。因此,如本文所用,術語聚麩醯胺酸疾病係指與CAG重複序列擴增相關之任何疾病或病症,包括(但不限於)神經退化性疾病。
亨庭頓蛋白基因 (huntingtin, HTT)亦稱為
令人感興趣之轉錄本 15(
IT15),其係指編碼亨庭頓蛋白之基因。亨庭頓蛋白之確切功能未知,但其參與軸突轉運。NCBI參考序列NM_002111.8 (SEQ ID NO:820)提供亨庭頓蛋白轉錄本序列之實例。通常,亨庭頓蛋白之聚麩醯胺酸束具有10-35個CAG重複序列。聚麩醯胺酸束擴增至36至120個以上之CAG重複序列引起亨庭頓氏病。早期徵象及症狀可包括易怒、抑鬱、微小不隨意運動、協調不力以及學習新的資訊或做決定困難。許多患有亨庭頓氏病之人出現不隨意之抽搐或顫搐運動,稱為舞蹈症。隨著疾病進展,該等運動變得更加明顯。受影響之個體可出現行走、言語及吞嚥困難。患有此病症之人亦經歷個性變化,且思考及推理能力下降。
共濟失調蛋白 1(
ATXN1)亦稱為
1 型脊髓小腦性失調症(
SCA1),係指編碼含聚麩醯胺酸之蛋白質之基因,該蛋白質主要在細胞核中表現,在此其結合染色質且起轉錄抑制子之作用。NCBI參考序列NM_001128164.2 (SEQ ID NO:821)提供
ATXN1轉錄本序列之實例。含有擴增至通常約40-83個重複序列之聚麩醯胺酸束之共濟失調蛋白-1突變型形式在小腦中經由毒性功能獲得型機制引起運動障礙1型脊髓小腦性失調症(SCA1)。小腦功能障礙係進行性及永久性的。患有此疾患之人最初經歷協調及平衡問題(共濟失調)。SCA1之其他徵象及症狀包括言語及吞嚥困難、肌肉僵硬(痙攣狀態),及控制眼運動之肌肉無力(眼肌麻痺)。眼肌無力導致快速、不隨意眼運動(眼球震顫)。患有SCA1之個體可能在處理、學習及記憶資訊方面存在困難(認知損害)。隨著時間推移,患有SCA1之個體可能出現手臂及腿部麻木、麻刺感或疼痛(感覺神經病變);不受控之肌肉繃緊(肌張力障礙);肌肉消瘦(萎縮);及肌肉顫搐(束顫)。在已受影響多年之人中罕見報導有強直、顫抖及不隨意抽搐運動(舞蹈症)。
共濟失調蛋白 2(
ATXN2)亦稱為
2 型脊髓小腦性失調症(
SCA2),係指編碼含聚麩醯胺酸之RNA結合蛋白之基因,該蛋白靶向3' UTR中之順式調控元件以穩定mRNA之子集且增加蛋白質表現。NCBI參考序列NM_001372574.1 (SEQ ID NO:822)提供
ATXN2轉錄本序列之實例。
ATXN2中之聚麩醯胺酸重複序列擴增(例如通常約33或更多個重複序列)可引起2型脊髓小腦性失調症(SCA2)之徵象及症狀。患有SCA2之人最初經歷協調及平衡問題(共濟失調)。SCA2之其他早期徵象及症狀包括其他運動問題、言語及吞嚥困難以及控制眼運動之肌肉無力(眼肌麻痺)。眼肌無力導致不隨意之前後眼運動(眼球震顫)及降低之快速眼運動能力(掃視減緩)。隨著時間推移,患有SCA2之個體可出現感覺缺失及四肢無力(周圍神經病變)、肌肉消瘦(萎縮)、不受控之肌肉繃緊(肌張力障礙)及不隨意之抽搐運動(舞蹈症)。一些患有SCA2之人出現一組稱為帕金森症(parkinsonism)之運動異常,其包括異常緩慢運動(運動徐緩)、不隨意之震顫(顫抖)及肌肉僵硬(強直)。患有SCA2之個體可能在短時記憶、計劃及解決問題方面存在問題,或經歷智力功能之全面下降(失智症)。
ATXN2中之中間聚麩醯胺酸擴增(27-33個CAG重複序列)亦增加肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)之風險。ALS係一種神經退化性神經肌肉疾病,其導致控制隨意肌之運動神經元之進行性損失。ALS之早期症狀包括僵硬肌、肌肉顫搐以及逐漸加重之虛弱及肌肉消瘦。肢體發病型ALS始於手臂或腿部無力,而延髓發病型ALS始於言語或吞嚥困難。半數患有ALS之人出現至少輕度的思考及行為困難,且約有15%出現額顳葉失智症。大多數人經歷疼痛。運動神經元損失持續,直至進食、言語、運動之能力及最終呼吸能力喪失。ALS最終引起癱瘓及早期死亡,通常由呼吸衰竭引起。
共濟失調蛋白 3(
ATXN3)亦稱為
3 型脊髓小腦性失調症(
SCA3),係指編碼含聚麩醯胺酸之去泛素化酶之基因。NCBI參考序列NM_004993.6 (SEQ ID NO:823)提供ATXN3轉錄本序列之實例。聚麩醯胺酸重複序列自正常13-36個擴增至50個以上引起馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease, MJD),亦稱為馬查多-約瑟夫病亞速爾病(Machado-Joseph Azorean disease)、馬查多氏病(Machado's disease)、約瑟夫氏病(Joseph's disease)或3型脊髓小腦性失調症(SCA3)。患有此疾患之人最初經歷協調及平衡問題(共濟失調)。SCA3之其他早期徵象及症狀包括言語困難、不受控之肌肉繃緊(肌張力障礙)、肌肉僵硬(痙攣狀態)、強直、顫抖、眼球突出及複視。患有此疾患之人可能經歷睡眠障礙,諸如不寧腿症候群或REM睡眠行為障礙。隨著時間推移,患有SCA3之個體可出現感覺缺失及四肢無力(周圍神經病變)、肌肉痙攣、肌肉顫搐(束顫)及吞嚥困難。患有SCA3之個體可能在記憶、計劃及解決問題方面存在問題。
鈣電壓閘控通道亞單元 α1 A (CACNA1A)亦稱為
6 型脊髓小腦性失調症(
SCA6),其編碼神經元鈣通道P/Q之α1A成孔亞單元。NCBI參考序列NM_000068.4 (SEQ ID NO:824)提供
CACNA1A轉錄本序列之實例。CACNA1A基因中聚麩醯胺酸束擴增至通常19-33個重複序列引起6型脊髓小腦性失調症(SCA6)。患有此疾患之人最初經歷協調及平衡問題(共濟失調)。SCA6之其他早期徵象及症狀包括言語困難、不隨意之眼運動(眼球震顫)及複視。隨著時間推移,患有SCA6之個體可能出現手臂協調性喪失、顫抖及不受控之肌肉繃緊(肌張力障礙)。
共濟失調蛋白 7(
ATXN7)亦稱為
7 型脊髓小腦性失調症(
SCA7),其編碼含聚麩醯胺酸之蛋白質,該蛋白質係組織蛋白乙醯基轉移酶(HAT)複合物之含GCN5 (廣泛控制胺基酸合成-5;KAT2A)之SAGA家族之組成亞單元。NCBI參考序列NM_001377405.1 (SEQ ID NO:825)提供ATXN7轉錄本序列之實例。ATXN7中之聚麩醯胺酸擴增引起7型脊髓小腦性失調症(SCA7),其特徵在於進行性小腦共濟失調、因錐體桿體營養不良而引起的視網膜變性或失明,以及輕度感覺或反射變化。後期症狀包括運動控制喪失、言語不清(發音困難)及吞嚥困難(difficulty swallowing、dysphagia)。
蛋白質磷酸酶 2 調控性亞單元 Bβ(
PPP2R2B)亦稱為
12 型脊髓小腦性失調症(
SCA12),其編碼蛋白質磷酸酶2 (一種絲胺酸/蘇胺酸磷酸酶)之B調控性亞單元。NCBI參考序列NM_181674.3 (SEQ ID NO:826)提供PPP2R2B轉錄本序列之實例。聚麩醯胺酸重複序列自通常約7-28個之正常範圍擴增至約55-78個引起12型脊髓小腦性失調症(SCA12)。SCA12症狀之發病年齡範圍為8至55歲,但最常見於四十多歲。症狀通常以顫抖開始,且進展至小腦共濟失調。亦已報導失智症之徵象與SCA12相關。
TATA 盒結合蛋白(
TBP)亦稱為
17 型脊髓小腦性失調症(
SCA17),其編碼TATA結合蛋白,該結合蛋白係轉錄因子IID (TFIID)之組分。NCBI參考序列NM_003194.5 (SEQ ID NO:827)提供TBP轉錄本序列之實例。TBP通常具有25-42個聚麩醯胺酸重複序列,擴增至45-66個重複序列與17型脊髓小腦性失調症(SCA17)相關。患有此疾患之人通常經歷諸如以下等症狀:共濟失調、失智症及不隨意運動(諸如舞蹈症及肌張力障礙)、強直及錐體束徵(諸如痙攣狀態、虛弱、快速交替運動減緩及反射過強)。
雄激素受體(
AR)編碼類固醇激素活化之轉錄因子。NCBI參考序列NM_000044.6 (SEQ ID NO:828)提供AR轉錄本序列之實例。聚麩醯胺酸重複序列自通常9-34個重複序列擴增至38-62個重複序列引起脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA),其亦稱為肯尼迪氏病(Kennedy's disease)。SBMA之特徵在於隨時間推移惡化之肌無力及萎縮,導致痛性痙攣以及行走、吞嚥及言語困難。SBMA亦可導致男性女乳症及不孕症。
Atrophin 1(
ATN1)編碼假定為轉錄輔助抑制子之蛋白質,該蛋白質募集核受體亞家族2組E成員1 (NR2E1)以抑制轉錄。NCBI參考序列NM_001007026.2 (SEQ ID NO:829)提供
ATN1轉錄本序列之實例。齒狀紅核蒼白球萎縮症(DRPLA)係一種罕見的神經退化性病症,其與ATN1中之聚麩醯胺酸重複序列自通常7-35個拷貝擴增至49-93個拷貝有關。當DRPLA在約20歲之前出現時,其通常與肌陣攣、共濟失調、癲癇發作、行為改變及智力殘疾相關。當其在約20歲之後出現時,其與共濟失調、舞蹈手足徐動症、妄想及失智症相關。
易位至染色體 3 之骨髓樣 / 淋巴樣或混合譜系白血病(
MLLT3)亦稱為AF-9,其編碼超延伸複合物(SEC)之組分,該複合物係增加RNA聚合酶II轉錄之催化速率所必需的。NCBI參考序列NM_004529.4 (SEQ ID NO:830)提供MLLT3轉錄本序列之實例。MLLT3包括不穩定之聚麩醯胺酸重複序列,且涉及MLLT3之遺傳畸變與白血病及神經運動發育延遲、小腦共濟失調及癲癇相關。
骨形態發生蛋白 2 誘導型激酶(
BMP2K)編碼與骨骼發育及塑造有關之蛋白質。NCBI參考序列NM_198892.2 (SEQ ID NO:831)提供BMP2K轉錄本序列之實例。BMP2K包括聚麩醯胺酸重複序列,且與近視及癌症相關,特定而言與癌症相關之基因誤調控。
含 THAP 結構域 11(
THAP11)編碼與胚胎形成相關之轉錄抑制子。NCBI參考序列NM_020457.3 (SEQ ID NO:832)提供THAP11轉錄本序列之實例。THAP11包括通常為約29個拷貝之聚麩醯胺酸重複序列,但範圍為20至超過40個拷貝。聚麩醯胺酸重複序列之數目增加(例如38個拷貝)與神經退化性疾病相關。THAP11中聚麩醯胺酸之擴增亦與THAP11之細胞內聚集、細胞毒性、生長抑制、G0/G1阻滯及轉錄活性抑制相關。
鋅指同源異形盒 3(
ZFHX3)編碼調控肌原性及神經元分化之轉錄因子。其在若干種癌症中亦起腫瘤抑制因子之作用,且與心房震顫相關。NCBI參考序列NM_006885.4 (SEQ ID NO:833)提供ZFHX3轉錄本序列之實例。ZFHX3包括聚麩醯胺酸重複序列。與具有較少重複序列(例如17個拷貝)之彼等個體相比,具有擴增之聚麩醯胺酸重複序列(例如具有19個拷貝)之個體與冠心病、高血壓、糖尿病或異常血脂症相關。
POU 3 類同源異形盒 2(
POU3F2)編碼與神經元分化有關之轉錄因子。NCBI參考序列NM_005604.4 (SEQ ID NO:834)提供POU3F2轉錄本序列之實例。POU3F2包括聚麩醯胺酸束,且與雙極性障礙、肥胖症、發育遲滯及智力殘疾相關。
指導樣轉錄共活化因子 2(
Mastermind Like Transcriptional Coactivator 2, MAML2)編碼NOTCH蛋白之轉錄共活化因子,且促進β-連環蛋白周轉。NCBI參考序列NM_032427.4 (SEQ ID NO:835)提供MAML2轉錄本序列之實例。MAML2包括觀察到可變性之聚麩醯胺酸束,且與癌症相關,諸如黏液表皮樣癌、汗腺腺瘤、B細胞源性淋巴瘤及慢性淋巴球性白血病。
指導樣轉錄共活化因子 3(
MAML3)編碼NOTCH蛋白之轉錄共活化因子。NCBI參考序列NM_018717.5 (SEQ ID NO:836)提供MAML3轉錄本序列之實例。MAML3包括聚麩醯胺酸束,且與癌症相關,諸如施奈德癌(schneiderian carcinoma)及骨化性纖維黏液樣瘤。
SWI/SNF 有關之基質相關性、肌動蛋白依賴性染色質調控因子亞家族 A 成員 2(
SMARCA2)編碼藉由染色質重塑參與轉錄調控之SWI/SNF複合物之組分。SMARCA2亦參與神經發育。NCBI參考序列NM_003070.5 (SEQ ID NO:837)提供SMARCA2轉錄本序列之實例。SMARCA2包括多型性聚麩醯胺酸束,且與諸如尼-巴二氏症候群(Nicolaides-Baraitser syndrome)及瞼裂狹小-智力發育受損症候群等疾患相關。
SMARCA2基因亦位於與精神分裂症及雙極性障礙相關之染色體區域上。
起點識別複合物亞單元 4(
ORC4)編碼DNA複製起始所必需的六個亞單元起點識別複合物(ORC)之組分。NCBI參考序列NM_001190879.3 (SEQ ID NO:838)提供ORC4轉錄本序列之實例。ORC4包括位於編碼序列上游之多型性三核苷酸CAG重複序列區域,且與邁爾-格林症候群1 (Meier-Gorlin syndrome 1)及邁爾-格林症候群2相關。
RUNX 家族轉錄因子 2(
RUNX2)編碼參與骨母細胞分化及骨骼形態發生之核蛋白。NCBI參考序列NM_001024630.4 (SEQ ID NO:839)提供RUNX2轉錄本序列之實例。RUNX2包括聚麩醯胺酸束及聚丙胺酸束。聚麩醯胺酸束自例如通常23個殘基擴增至例如27-30個殘基引起顱骨鎖骨發育不良、骨礦物質密度降低及RUNX2反式活化能力降低。顱骨鎖骨發育不良(CCD)係一種影響顱骨、骨骼及牙齒之病症。徵象及症狀包括鎖骨缺失或發育不全、顱骨囟門閉合延遲、牙齒異常、身材矮小、骨密度降低、聽力損失及其他骨異常。
介體複合物亞單元 12(
MED12)編碼參與控制轉錄起始之前起始複合物之組分。NCBI參考序列NM_005120.3 (SEQ ID NO:840)提供MED12轉錄本序列之實例。MED12具有聚麩醯胺酸束,且與奧皮茨-卡維吉症候群(Opitz-Kaveggia syndrome)、魯揚-弗萊斯症候群(Lujan-Fryns syndrome)、X性聯奧多症候群(Ohdo syndrome, X-linked)及腫瘤形成(例如子宮平滑肌瘤)相關。
E1A 結合蛋白 P400 (EP400)編碼參與轉錄活化之NuA4組織蛋白乙醯基轉移酶複合物之組分。NCBI參考序列NM_015409.5 (SEQ ID NO:841)提供EP400轉錄本序列之實例。EP400通常含有約32個CAG重複序列。EP400與骨化性纖維黏液樣瘤及家族性顳葉癲癇1型相關。
膜相關鳥苷酸激酶,含 WW 及 PDZ 結構域 1(
MAGI1)編碼在細胞間接觸區域參與多蛋白複合物組裝之蛋白質。NCBI參考序列NM_015520.2 (SEQ ID NO:842)提供MAGI1轉錄本序列之實例。MAGI1含有多型性聚麩醯胺酸束,且與諸如子宮頸大細胞神經內分泌癌及顯微鏡下結腸炎等疾患相關。
含 UBAP1-MVB12 相關 (UMA) 結構域 1(
UMAD1)係一種蛋白質編碼基因。NCBI參考序列NM_001302348.2 (SEQ ID NO:843)提供UMAD1轉錄本序列之實例。UMAD1包括起始密碼子上游之多型性三核苷酸CAG重複序列區域,且與色素性視網膜炎相關。
DM1基因座反義RNA (DM1-AS)係一種RNA基因。NCBI參考序列NR_147193.1 (SEQ ID NO:844)提供DM1-AS RNA序列之實例。DM1-AS在內含子中包括多型性三核苷酸CAG重複序列區域,且與肌強直性營養不良1及鰓耳腎發育不良症候群2相關。
AC007161.3亦稱為ENSG00000283549,其係一種RNA基因且含有CAG重複序列。
干擾素調控因子 2 結合蛋白樣(
IRF2BPL)編碼與中樞神經系統發育及神經元維持以及調控女性生殖功能相關之轉錄因子。NCBI參考序列NM_024496.4 (SEQ ID NO:845)提供IRF2BPL轉錄本序列之實例。IRF2BPL包括聚麩醯胺酸束,且與神經問題相關,諸如伴有退化之神經發育障礙、異常運動、言語喪失及癲癇發作以及Irf2bpl相關之退化性神經發育障礙-肌張力障礙-癲癇發作症候群。
Mab-21 樣 1(
MAB21L1)編碼與眼睛及小腦發育相關之蛋白質。NCBI參考序列NM_005584.5 (SEQ ID NO:846)提供MAB21L1轉錄本序列之實例。MAB21L1與小腦、眼部、顱面以及生殖症候群及眼積水相關。MAB21L1在該基因之5’非轉譯部分中包括多型性三核苷酸CAG重複序列,其與諸如雙極性障礙等精神病學疾患相關。
在一些實施例中,含CAG重複序列之基因或由該含CAG重複序列之基因編碼的RNA之致病性或病理性等位基因含有至少約30個連續CAG重複序列。
C. 表現盒及載體
在一些實施例中,本揭示案之雙股RNA由核酸分子(例如DNA序列)編碼。藉由用胸腺嘧啶「T」鹼基替代每一尿嘧啶鹼基「U」,可將本文所提供之雙股RNA序列轉化成DNA形式。
在一些實施例中,編碼該雙股RNA之核酸分子(例如DNA)含於表現盒內。
在一些實施例中,表現盒進一步包含一或多個與轉殖基因可操作地連接之表現控制序列(調控序列)。「可操作地連接」之序列包括與轉殖基因鄰接或反式作用或與轉殖基因相距一定距離以控制其表現之表現控制序列。表現控制序列之實例包括轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列、增強子序列、抑制子序列、剪接位點序列、多聚腺苷酸化(聚A)信號序列或其任何組合。
在一些實施例中,啟動子為內源性啟動子、合成啟動子、雜合啟動子、組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子(例如CNS特異性)或細胞特異性啟動子(神經元、神經膠質細胞或星狀細胞)。組成型啟動子之實例包括勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV) LTR啟動子(視情況具有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(視情況具有CMV增強子)、SV40啟動子及二氫葉酸還原酶啟動子。誘導型啟動子之實例包括鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone, Dex)誘導型小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統、蛻皮素昆蟲啟動子、四環素阻遏型系統、四環素誘導型系統、RU486誘導型系統及雷帕黴素(rapamycin)誘導型系統。可用啟動子之其他實例包括(例如)雞β-肌動蛋白啟動子(CBA啟動子)、CAG啟動子、H1啟動子、CD68啟動子、JeT啟動子、突觸蛋白啟動子、RNA pol II啟動子或RNA pol III啟動子(例如U6、H1等)。
在一些實施例中,啟動子為RNA pol II啟動子。pol II啟動子之實例包括PGK、CBA、U1、CMV、EIF1α、EF1α、CAG或突觸素啟動子。在一些實施例中,啟動子為組織特異性RNA pol II啟動子。在一些實施例中,組織特異性RNA pol II啟動子源自展現神經元特異性表現之基因。在一些實施例中,表現盒包含pol II啟動子及聚(A)尾,例如,編碼雙股RNA之DNA序列在5’端側接pol II啟動子且在3’端側接聚(A)尾。
在一些實施例中,啟動子為神經元特異性啟動子。神經元特異性啟動子之實例包括來自神經元特異性烯醇酶(NSE)、人類突觸蛋白1、人類突觸蛋白2啟動子、caMK激酶及微管蛋白之彼等啟動子。
在一些實施例中,啟動子為RNA pol III啟動子。pol III啟動子之實例包括U6、H1、7SK、Y、RPR、MRP及硒代半胱胺酸tRNA。在一些實施例中,表現盒包含pol III啟動子及聚(T)尾,例如,編碼雙股RNA之DNA序列在5’端側接pol III啟動子且在3’端側接聚(T)尾。
在一些實施例中,啟動子為RNA pol I啟動子。在一些實施例中,表現盒包含pol I啟動子及3’-盒,例如,編碼雙股RNA之DNA序列在5’端側接pol I啟動子且在3’端側接3’-盒。
雙股RNA之表現盒為此項技術中所已知,例如,參見ter Brake等人,Mol. Ther. (2008) 16:557;Maczuga等人,BMC Biotechnol. (2012) 12:42;以及Bofill-De Ros及Gu (2016) 103:157。
在一些實施例中,編碼本揭示案之雙股RNA之DNA序列定位於表現盒之非轉譯區中。在一些實施例中,編碼本揭示案之抑制性核酸之序列定位於表現盒之內含子、5'非轉譯區(5 'UTR)或3'非轉譯區(3'UTR)中。在一些實施例中,編碼本揭示案之抑制性核酸之序列定位於啟動子下游及表現基因上游之內含子中。
在一些實施例中,編碼本揭示案之雙股RNA之DNA序列在表現盒內側接有兩個AAV反向末端重複序列(ITR) (例如5’ ITR及3’ ITR)。在一些實施例中,每一AAV ITR係全長ITR (例如長度為大約145 bp,且含有功能性Rep結合位點(RBS)及末端解鏈位點(trs))。在一些實施例中,該等ITR中之一者係截短的(例如縮短或不為全長的)。在一些實施例中,截短之ITR缺少功能性末端解鏈位點(trs),且用於產生自補性AAV載體(scAAV載體)。
在一些實施例中,本文所闡述之雙股RNA可由諸如質體、非病毒載體或病毒載體等載體編碼。使用用於表現本揭示案之雙股RNA之載體可容許雙股RNA在個體中連續或受控表現,而不是給予個體多個劑量之雙股RNA。本揭示案提供載體,其包含含有編碼本文所闡述之雙股RNA之表現盒的經分離核酸。
病毒載體包括(但不限於)疱疹病毒(HSV)載體、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體及諸如此類。
在一些實施例中,編碼本揭示案之雙股RNA之載體為反轉錄病毒載體。在一些實施例中,反轉錄病毒載體係小鼠幹細胞病毒、鼠類白血病病毒(例如莫洛尼鼠類白血病病毒載體(Moloney murine leukemia virus vector))、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒或禽網狀內皮細胞增生症病毒載體。在一些實施例中,編碼本揭示案之雙股RNA之載體為慢病毒或基於慢病毒之載體。在一些實施例中,慢病毒載體係HIV (人類免疫缺失病毒,包括1型HIV及2型HIV)、馬傳染性貧血病毒、貓免疫缺失病毒(FIV)、牛免疫缺失病毒(BIV)及猿猴免疫缺失病毒(SIV)、馬傳染性貧血病毒或梅迪-維斯納病毒載體(Maedi-Visna viral vector)。使用慢病毒工程化細胞表現shRNA之方法為此項技術中所已知,例如,Stegmeier等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2005) 102:13212-13217;Klinghoffer等人,RNA (2010) 16:879-884。複製缺陷型重組慢病毒之產生可例如藉由使用市售包裝細胞株(諸如TLA-HEK293TM)及包裝質體(Thermo Scientific/Open Biosystems, Huntsville, AL)共轉染表現載體及包裝質體來達成。
在一些實施例中,編碼本揭示案之雙股RNA之載體為腺相關病毒(AAV)載體,諸如重組rAAV載體,其藉由重組方法產生。AAV係一種單股無包膜之DNA病毒,其具有編碼複製蛋白(rep)及衣殼(Cap)之基因體,側接兩個ITR,該等ITR作為病毒基因體之複製起點。AAV亦含有包裝序列,其容許將病毒基因體包裝至AAV衣殼中。在一些實施例中,AAV載體包含編碼本揭示案之雙股RNA之表現盒,其側接有兩個順式作用AAV ITR (5’ ITR及3’ ITR)。功能性ITR序列用於拯救、複製及包裝AAV病毒顆粒。因此,AAV載體在本文中定義為至少包括病毒複製及包裝所需之彼等順式序列(例如一或兩個功能性ITR及包裝序列)。在一些實施例中,每一AAV ITR係全長ITR (例如長度為大約145 bp,且含有功能性Rep結合位點(RBS)及末端解鏈位點(trs))。在一些實施例中,該等ITR中之一者或全部兩者經修飾,例如插入、缺失或取代,條件係該等ITR提供功能性拯救、複製及包裝。在一些實施例中,經修飾之ITR缺少功能性末端解鏈位點(trs),且用於產生自補性AAV載體(scAAV載體)。在一些實施例中,ITR選自以下血清型中之任一者:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11及其變異體。在一些情形中,ITR來自AAV2。
rAAV載體中可存在其他表現控制序列,其可操作地連接至編碼雙股RNA之DNA序列,包括以下中之一或多者:轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列、增強子序列、抑制子序列、剪接位點序列、多聚腺苷酸化(聚A)信號序列或其任何組合。
rAAV載體可具有一或多個全部或部分缺失之AAV野生型基因。在一些實施例中,rAAV載體係複製缺陷的。在一些實施例中,rAAV載體缺少功能性Rep蛋白及/或衣殼蛋白。
使用宿主細胞培養將重組AAV載體包裝至AAV衣殼中之方法為此項技術所已知。在一些實施例中,用於包裝rAAV載體之一或多種所需組分(例如Rep序列、cap序列及/或附屬功能)可由經工程化以含有該一或多種所需組分(例如藉由載體)之穩定宿主細胞提供。用於AAV包裝之所需組分之表現可處於宿主包裝細胞中之誘導型或組成型啟動子之控制下。通常使用AAV輔助載體以提供AAV rep及/或cap基因之瞬時表現,其以反式起作用,以補充AAV複製所必需之缺失的AAV功能。在一些實施例中,AAV輔助載體缺少AAV ITR,且其既不能複製,亦不能包裝自身。AAV輔助載體可呈質體、噬菌體、轉位子、黏粒、病毒或病毒粒子之形式。
本揭示案之重組AAV載體可經AAV衣殼包裹以形成rAAV顆粒。「rAAV顆粒」或「rAAV病毒粒子」係指一種傳染性複製缺陷型病毒,其包括AAV蛋白殼,該蛋白殼包裹在兩側側接有AAV ITR之所關注轉殖基因。在適宜宿主細胞中產生rAAV顆粒,該宿主細胞具有引入其中之指定rAAV載體、AAV輔助功能及附屬功能之序列,以使宿主細胞能夠編碼AAV多肽,該等AAV多肽係將rAAV載體(含有所關注之轉殖基因序列)包裝成傳染性rAAV顆粒以供後續基因遞送至靶細胞中所必需的。
在一些實施例中,可使用三重轉染方法產生rAAV顆粒(例如,參見美國專利第6,001,650號,其係以全文引用的方式併入本文中)。在此方法中,藉由用待包裝成rAAV顆粒之rAAV載體(包含轉殖基因)、AAV輔助載體及附屬功能載體轉染宿主細胞來產生rAAV顆粒。在一些實施例中,AAV輔助功能載體支持高效AAV載體產生,而不產生任何可偵測到之野生型AAV病毒粒子(例如含有功能性rep及cap基因之AAV病毒粒子)。附屬功能載體編碼AAV複製所依賴(例如「附屬功能」)之非AAV源性病毒及/或細胞功能之核苷酸序列。附屬功能包括AAV複製所需之彼等功能,包括(但不限於)參與AAV基因轉錄活化、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、cap表現產物合成及AAV衣殼組裝之彼等部分。基於病毒之附屬功能可源自已知輔助病毒中之任一者,諸如腺病毒、疱疹病毒(除1型單純疱疹病毒以外)及牛痘病毒。在一些實施例中,使用雙重轉染方法產生rAAV顆粒,其中將AAV輔助功能及附屬功能選殖在單一載體上。
AAV衣殼係決定rAAV顆粒之組織特異性之重要元件。因此,可選擇具有特定衣殼組織特異性之rAAV顆粒。在一些實施例中,rAAV顆粒包含自選自以下之AAV血清型中選擇之衣殼:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV。Rh10、AAV11及其變異體。在一些實施例中,AAV衣殼選自能夠穿過血腦障壁之血清型,例如AAV9、AAVrh.10或其變異體。在一些實施例中,AAV衣殼係嵌合AAV衣殼。
在一些實施例中,rAAV載體係哺乳動物血清型AAV載體(例如AAV基因體及源自哺乳動物血清型AAV之ITR),包括靈長類動物血清型AAV載體或人類血清型AAV載體。在一些實施例中,AAV載體源自以下血清型中之任一者:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11及其變異體。在一些實施例中,AAV載體係嵌合AAV載體。在一些實施例中,rAAV載體可為包含AAV基因體及源自同一AAV血清型之AAV衣殼的載體。在一些實施例中,rAAV載體係假型的,此意味著rAAV載體包含源自一種AAV血清型之AAV基因體及至少部分地源自不同AAV血清型之AAV衣殼。
在一些實施例中,rAAV載體為AAV9血清型。在一些實施例中,rAAV包含AAV9衣殼蛋白(例如美國專利第7,198,951號之SEQ ID NO:2)、AAV9 rep蛋白(例如美國專利第7,198,951號之SEQ ID NO:3)或該兩者。在一些實施例中,rAAV包含:(i) AAV9衣殼蛋白(例如美國專利第7,198,951號之SEQ ID NO:2),及(ii) AAV2 ITR。
在一些實施例中,rAAV顆粒能夠轉導中樞神經系統(CNS)之細胞。在一些實施例中,rAAV顆粒能夠轉導CNS之非神經元細胞或神經元細胞。在一些實施例中,CNS細胞係神經元、神經膠質細胞、星狀細胞或小神經膠質細胞。
在一些實施例中,rAAV載體係自補性AAV (scAAV)載體。scAAV載體含有兩個互補性DNA股,其呈二聚體反向重複序列基因體之形式。二聚體反向重複序列基因體內之該兩個互補股退火在一起以形成一個雙股DNA,其即可進行直接複製及轉錄,由此繞過對宿主細胞DNA合成之需求。自補性AAV載體闡述於美國專利第7,465,583號;第7,790,154號;第8,361,457號;及第8,784,799號中。
本揭示案亦提供宿主細胞,其經包含編碼本文所闡述之雙股RNA之DNA序列之rAAV轉染。在一些實施例中,宿主細胞係原核細胞或真核細胞。在一些實施例中,宿主細胞係哺乳動物細胞(例如HEK293T、COS細胞、HeLa細胞、KB細胞)、細菌細胞(大腸桿菌(E. coli))、酵母細胞、昆蟲細胞(Sf9、Sf21、果蠅、蚊子)等。在一些實施例中,宿主細胞獲自或源自人類個體。在一些實施例中,宿主細胞係纖維母細胞。
編碼雙股 RNA 之一股或兩股之 DNA 分子
本揭示案提供DNA分子,其包含編碼本揭示案之雙股RNA之第一股的核苷酸序列。在一些情形中,編碼第一股之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些情形中,編碼第一股之核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。本揭示案提供DNA分子,其包含編碼以下各項之核苷酸序列:i)本揭示案之雙股RNA之第一股;及ii)本揭示案之雙股RNA之第二股。在一些情形中,編碼第一股及第二股之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些情形中,啟動子為PolII啟動子。在一些情形中,啟動子為U6啟動子。在一些情形中,啟動子為CAG啟動子。在一些情形中,啟動子為CBA啟動子。在一些情形中,啟動子為CMV啟動子。在一些情形中,啟動子為EF1α啟動子。在一些情形中,啟動子為H1啟動子。在一些情形中,本揭示案之DNA分子包含編碼SEQ ID NO:295-375中之任一者之核苷酸序列。
重組 RNA 分子
本揭示案提供重組核酸(例如重組RNA;其可稱為「人工微小RNA」或「小結合RNA」(sbRNA)),其包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「5’前導序列」)、環多核苷酸及3’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「3’尾曳序列」),其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第一股;iii)該環多核苷酸;(iv)該雙股RNA之第二股;及iii)該3’尾曳序列多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。本揭示案提供重組核酸(例如重組RNA),其包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸,其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第二股;iii)該環多核苷酸;(iv)該雙股RNA之第一股;及iii)該3’側接多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。在一些情形中,5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸源自miR33。
本揭示案提供重組核酸(例如重組RNA;其可稱為「人工微小RNA」或「小結合RNA」(sbRNA)),其包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「5’前導序列」)及3’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「3’尾曳序列」),其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第一股;iii)該雙股RNA之第二股;及iv)該3’尾曳序列多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。本揭示案提供重組核酸(例如重組RNA),其包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸,其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第二股;iii)該雙股RNA之第一股;及iv)該3’側接多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。在一些情形中,5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸源自miR451。
編碼重組 RNA 分子之盒
本揭示案提供DNA分子(例如「盒」,其可插入至表現載體中以產生重組表現載體),其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列(其中該重組RNA分子可稱為「人工微小RNA」或「sbRNA」),其中該重組RNA分子包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「5’前導序列」)、環多核苷酸及3’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「3’尾曳序列」),其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第一股;iii)該環多核苷酸;(iv)該雙股RNA之第二股;及iii)該3’尾曳序列多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。本揭示案提供DNA分子(例如「盒」,其可插入至表現載體中以產生重組表現載體),其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列(其中該重組RNA分子可稱為「人工微小RNA」或「sbRNA」),其中該重組RNA分子包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸,其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第二股;iii)該環多核苷酸;(iv)該雙股RNA之第一股;及iii)該3’側接多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。在一些情形中,5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸源自miR33。在一些情形中,盒包括Pol3轉錄序列;例如,在一些情形中,盒在編碼3’尾曳序列多核苷酸之核苷酸序列之3’包括核苷酸序列TTTTTG。在一些情形中,盒在編碼3’尾曳序列多核苷酸之核苷酸序列之3’包括核苷酸序列T
n,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,盒長度為約110個核苷酸至約150個核苷酸。在一些情形中,盒包括Pol II轉錄序列;例如,在一些情形中,盒在編碼3’側接多核苷酸之核苷酸序列之3’包括多聚腺苷酸化序列。
本揭示案提供DNA分子(例如「盒」,其可插入至表現載體中以產生重組表現載體),其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列(其中該重組RNA分子可稱為「人工微小RNA」或「sbRNA」),其中該重組RNA分子包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「5’前導序列」)及3’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「3’尾曳序列」),其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第一股;iii)該雙股RNA之第二股;及iv)該3’尾曳序列多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。本揭示案提供DNA分子(例如「盒」,其可插入至表現載體中以產生重組表現載體),其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列(其中該重組RNA分子可稱為「人工微小RNA」或「sbRNA」),其中該重組RNA分子包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸,其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第二股;iii)該雙股RNA之第一股;及iv)該3’側接多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。在一些情形中,5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸源自miR451。在一些情形中,盒包括Pol3轉錄序列;例如,在一些情形中,盒在編碼3’尾曳序列多核苷酸之核苷酸序列之3’包括核苷酸序列TTTTTG。在一些情形中,盒在編碼3’尾曳序列多核苷酸之核苷酸序列之3’包括核苷酸序列T
n,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,盒長度為約110個核苷酸至約650個核苷酸(例如110個核苷酸(nt)至115 nt、115 nt至120 nt、500 nt至600 nt或600 nt至610 nt)。在一些情形中,盒包括Pol II轉錄序列;例如,在一些情形中,盒在編碼3’側接多核苷酸之核苷酸序列之3’包括多聚腺苷酸化序列。
在一些情形中,盒中編碼5’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列tgcacacctcctggcgggcagctctg (SEQ ID NO:738)。在一些情形中,盒中編碼環多核苷酸之部分包含核苷酸序列tgttctggcaatacctg (SEQ ID NO:739)。在一些情形中,盒中編碼3’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列gggaggcctgccctgactgcccac (SEQ ID NO:740)。在一些情形中,盒包括Pol3轉錄序列;例如,在一些情形中,盒在編碼3’尾曳序列多核苷酸之核苷酸序列之3’包括核苷酸序列TTTTTG。在一些情形中,盒長度為約110個核苷酸至約150個核苷酸。在一些情形中,盒包括Pol II轉錄序列;例如,在一些情形中,盒在編碼3’側接多核苷酸之核苷酸序列之3’包括多聚腺苷酸化序列。
在一些情形中,盒中編碼5’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列acctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:854)。在一些情形中,盒中編碼3’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaac (SEQ ID NO:855)。在一些情形中,盒中編碼5’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列acctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:854);且盒中編碼3’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaac (SEQ ID NO:855)。
在一些情形中,盒中編碼5’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列
gctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattaagggcgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggcgctatgcttcctgtgcccccagtggggccctggctgggatTtcatcatatactgtaagtttgcgatgagacactacagtatagatgatgtactagtccgggcacccccagctctggagcctgacaaggaggacaggagagatgctgcaagcccaagaagctctctgctcagcctgtcacaacctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:856)。在一些情形中,盒中編碼3’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaactcaggaccctgaagcagactactggaagggagactccagctcaaacaaggcaggggtgggggcgtgggattgggggtaggggagggaatagatacattttctctttcctgttgtaaagaaataaagataagccaggcacagtggctcacgcctgtaatcccaccactttcagaggccaaggcgctggatccagatctcgagcggccgcccg (SEQ ID NO:857)。在一些情形中,盒中編碼5’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列gctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattaagggcgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggcgctatgcttcctgtgcccccagtggggccctggctgggatTtcatcatatactgtaagtttgcgatgagacactacagtatagatgatgtactagtccgggcacccccagctctggagcctgacaaggaggacaggagagatgctgcaagcccaagaagctctctgctcagcctgtcacaacctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:856);且盒中編碼3’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaactcaggaccctgaagcagactactggaagggagactccagctcaaacaaggcaggggtgggggcgtgggattgggggtaggggagggaatagatacattttctctttcctgttgtaaagaaataaagataagccaggcacagtggctcacgcctgtaatcccaccactttcagaggccaaggcgctggatccagatctcgagcggccgcccg (SEQ ID NO:857)。
在一些情形中,盒中編碼5’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列
gctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattaagggcgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggcgctatgcttcctgtgcccccagtggggccctggctgggatAtcatcatatactgtaagtttgcgatgagacactacagtatagatgatgtactagtccgggcacccccagctctggagcctgacaaggaggacaggagagatgctgcaagcccaagaagctctctgctcagcctgtcacaacctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:858)。在一些情形中,盒中編碼3’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaactcaggaccctgaagcagactactggaagggagactccagctcaaacaaggcaggggtgggggcgtgggattgggggtaggggagggaatagatacattttctctttcctgttgtaaagaaataaagataagccaggcacagtggctcacgcctgtaatcccaccactttcagaggccaaggcgctggatccagatctcgagcggccgccc (SEQ ID NO:859)。在一些情形中,盒中編碼5’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列gctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattaagggcgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggcgctatgcttcctgtgcccccagtggggccctggctgggatAtcatcatatactgtaagtttgcgatgagacactacagtatagatgatgtactagtccgggcacccccagctctggagcctgacaaggaggacaggagagatgctgcaagcccaagaagctctctgctcagcctgtcacaacctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:858);且盒中編碼3’側接多核苷酸之部分包含核苷酸序列tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaactcaggaccctgaagcagactactggaagggagactccagctcaaacaaggcaggggtgggggcgtgggattgggggtaggggagggaatagatacattttctctttcctgttgtaaagaaataaagataagccaggcacagtggctcacgcctgtaatcccaccactttcagaggccaaggcgctggatccagatctcgagcggccgccc (SEQ ID NO:859)。
以下為盒之非限制性實例。在以下盒中:(i) tgcacacctcctggcgggcagctctg (SEQ ID NO:738)編碼5’前導序列多核苷酸;(ii)第一個大寫字母序列編碼雙股RNA之第一股;(iii) tgttctggcaatacctg (SEQ ID NO:739)編碼環多核苷酸;(iv)第二個大寫字母序列編碼雙股RNA之第二股;(v) gggaggcctgccctgactgcccac (SEQ ID NO:740)編碼3’尾曳序列多核苷酸;且(vi) TTTTTG為Pol3轉錄終止序列。在一些情形中,盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,盒包括核苷酸序列TTTTT代替3’ TTTTTG序列。
1) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:579;表7中之「CUG-10」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。
2) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:580;表7中之「CUG_19」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
3) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:581;表7中之「CUG_28」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
4) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:582;表7中之「CUG_37」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
5) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:583;表7中之「CUG_46」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
6) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:584;表7中之「CUG_55」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
7) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:585;表7中之「CUG_64」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
8) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:586;表7中之「CUG_118」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
9) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:587;表7中之「CUG_127」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
10) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:588;表7中之「CUG_136」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
11) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:589;表7中之「CUG_145」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
12) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:590;表7中之「CUG_154」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
13) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:591;表7中之「CUG_163」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
14) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:592;表7中之「CUG_217」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
15) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:593;表7中之「CUG_226」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
16) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:594;表7中之「CUG_235」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
17) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:595;表7中之「CUG_244」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
18) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:596;表7中之「CUG_253」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
19) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:597;表7中之「CUG_NA-A」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
20) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAACTGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:598;表7中之「CUG_NA_B」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
21) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGATGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:599;表7中之「CUG_NA_C」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
22) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCAGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:600;表7中之「CUG_NA_D」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
23) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:601;表7中之「CUG_NA_E」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
24) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:602;表7中之「CUG_NA_F」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
25) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:603;表7中之「CUG_NA_G」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
26) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:604;表7中之「CUG_NA_H」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
27) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:605;表7中之「CUG_NA_I」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
28) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:606;表7中之「CUG_307」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
29) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:607;表7中之「CUG_334」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
30) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:608;表7中之「CUG_361」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
31) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:609;表7中之「CUG_388」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
32) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:610;表7中之「CUG_415」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
33) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:611;表7中之「CUG_631」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
34) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:612;表7中之「CUG_658」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
35) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:613;表7中之「CUG_712」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
36) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:614;表7中之「CUG_2116」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
37) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:615;表7中之「CUG_2143」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
38) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:616;表7中之「CUG_2170」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
39) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:617;表7中之「CUG_442」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
40) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:618;表7中之「CUG_604」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
41) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:619;表7中之「CUG_685」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
42) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:620;表7中之「CUG_2089」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
43) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:621;表7中之「CUG_2197」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
44) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:622;表7中之「CUG_4870」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
45) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGAAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:623;表7中之「CUG_9973」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
46) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGATGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:624;表7中之「CUG_1013」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
47) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCAGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:625;表7中之「CUG_1070」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
48) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGATACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:626;表7中之「CUG_2341」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
49) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCAACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:627;表7中之「CUG_2398」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
50) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:628;表7中之「CUG_4789」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
51) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:629;表7中之「CUG_4951」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
52) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:630;表7中之「CUG_5032」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
53) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:631;表7中之「CUG_5113」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
54) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATAATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAAAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:632;表7中之「CUG_5599」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
55) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATACAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:633;表7中之「CUG_5680」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
56) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATACTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:634;表7中之「CUG_5761」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
57) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATACTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:635;表7中之「CUG_5842」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
58) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGAAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:636;表7中之「CUG_6328」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
59) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGATACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:637;表7中之「CUG_6409」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
60) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGATGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:638;表7中之「CUG_6490」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
61) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCAACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:639;表7中之「CUG_6976」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
62) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCAGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:640;表7中之「CUG_7057」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
63) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCTAATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAAAAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:641;表7中之「CUG_7543」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
64) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAAATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAAAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:642;表7中之「CUG_9244」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
65) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAACAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:643;表7中之「CUG_9325」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
66) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAACTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:644;表7中之「CUG_9406」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
67) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAACTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:645;表7中之「CUG_9487」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
68) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGATACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:646;表7中之「CUG_10054」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
69) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCAACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:647;表7中之「CUG_10621」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
70) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCTAATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAAAAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:648;表7中之「CUG_11188」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
71) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAAATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAAAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:649;表7中之「CUG_222609」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
72) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAACAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:650;表7中之「CUG_22690」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
73) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAACTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:651;表7中之「CUG_22771」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
74) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAACTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:652;表7中之「CUG_22852」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
75) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGAAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:653;表7中之「CUG_233338」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
76) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGATGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:654;表7中之「CUG_23500」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
77) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCAGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:655;表7中之「CUG_24067」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列;
78) 在一些情形中,盒包含核苷酸序列:tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCTAATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAAAAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:656;表7中之「CUG_24553」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。
以下為盒之非限制性實例。在以下盒中:5’側接及3’側接多核苷酸對包括:i) SEQ ID NO:854及SEQ ID NO:855;ii) SEQ ID NO:856及SEQ ID NO:857;及iii) SEQ ID NO:858及SEQ ID NO:859。在一些情形中,盒包括3’ TTTTTG轉錄終止序列。在一些情形中,盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,盒在3’端包括核苷酸序列T
n,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,盒在3’端包括核苷酸序列TTTTT。非限制性實例包括圖25中所示之盒。
1) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:379;iii)與SEQ ID NO: 379互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 379之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 379;iii)與SEQ ID NO: 379互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 379之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 379;iii)與SEQ ID NO: 379互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 379之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
2) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:380;iii)與SEQ ID NO: 380互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 380之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 380;iii)與SEQ ID NO: 380互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 380之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 380;iii)與SEQ ID NO: 380互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 380之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
3) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:381;iii)與SEQ ID NO: 381互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 381之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 381;iii)與SEQ ID NO: 381互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 381之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 381;iii)與SEQ ID NO: 381互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 381之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
4) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:382;iii)與SEQ ID NO: 382互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 382之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 382;iii)與SEQ ID NO: 382互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 382之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 382;iii)與SEQ ID NO: 382互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 382之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
5) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:383;iii)與SEQ ID NO: 383互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 383之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 383;iii)與SEQ ID NO: 383互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 383之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 383;iii)與SEQ ID NO: 383互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 383之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
6) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:384;iii)與SEQ ID NO: 384互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 384之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 384;iii)與SEQ ID NO: 384互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 384之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 384;iii)與SEQ ID NO: 384互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 384之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
7) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:385;iii)與SEQ ID NO: 385互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 385之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 385;iii)與SEQ ID NO: 385互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 385之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 385;iii)與SEQ ID NO: 385互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 385之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
8) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:386;iii)與SEQ ID NO: 386互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 386之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 386;iii)與SEQ ID NO: 386互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 386之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 386;iii)與SEQ ID NO: 386互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 386之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
9) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:387;iii)與SEQ ID NO: 387互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 387之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 387;iii)與SEQ ID NO: 387互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 387之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 387;iii)與SEQ ID NO: 387互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 387之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
10) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:388;iii)與SEQ ID NO: 388互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 388之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 388;iii)與SEQ ID NO: 388互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 388之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 388;iii)與SEQ ID NO: 388互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 388之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
11) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:389;iii)與SEQ ID NO: 389互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 389之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 389;iii)與SEQ ID NO: 389互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 389之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 389;iii)與SEQ ID NO: 389互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 389之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
12) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 390;iii)與SEQ ID NO: 309互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
13) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
14) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
15) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
16) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:392;iii)與SEQ ID NO: 392互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 392之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 392;iii)與SEQ ID NO: 392互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 392之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 392;iii)與SEQ ID NO: 392互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 392之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
17) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:393;iii)與SEQ ID NO: 393互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 393之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 393;iii)與SEQ ID NO: 393互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 393之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 393;iii)與SEQ ID NO: 393互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 393之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
18) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:394;iii)與SEQ ID NO: 394互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 394之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 394;iii)與SEQ ID NO: 394互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 394之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 394;iii)與SEQ ID NO: 394互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 394之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
19) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:395;iii)與SEQ ID NO: 395互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 395之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 395;iii)與SEQ ID NO: 395互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 395之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 395;iii)與SEQ ID NO: 395互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 395之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
20) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:396;iii)與SEQ ID NO: 396互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 396之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 396;iii)與SEQ ID NO: 396互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 396之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 396;iii)與SEQ ID NO: 396互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 396之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
21) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:397;iii)與SEQ ID NO: 397互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 397之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 397;iii)與SEQ ID NO: 397互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 397之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 397;iii)與SEQ ID NO: 397互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 397之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
22) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:398;iii)與SEQ ID NO: 398互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 398之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 398;iii)與SEQ ID NO: 398互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 398之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 398;iii)與SEQ ID NO: 398互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 398之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
23) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:399;iii)與SEQ ID NO: 399互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 399之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 399;iii)與SEQ ID NO: 399互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 399之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 399;iii)與SEQ ID NO: 399互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 399之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
24) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:400;iii)與SEQ ID NO: 400互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 400之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 400;iii)與SEQ ID NO: 400互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 400之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 400;iii)與SEQ ID NO: 400互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 400之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
25) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:401;iii)與SEQ ID NO: 401互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 401之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 401;iii)與SEQ ID NO: 401互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 401之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 401;iii)與SEQ ID NO: 401互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 401之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
26) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:402;iii)與SEQ ID NO: 402互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 402之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 402;iii)與SEQ ID NO: 402互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 402之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 402;iii)與SEQ ID NO: 402互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 402之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
27) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:403;iii)與SEQ ID NO: 403互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 403之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 403;iii)與SEQ ID NO: 403互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 403之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 403;iii)與SEQ ID NO: 403互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 403之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
28) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:404;iii)與SEQ ID NO: 404互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 404之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 404;iii)與SEQ ID NO: 404互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 404之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 404;iii)與SEQ ID NO: 404互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 404之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
29) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:405;iii)與SEQ ID NO: 405互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 405之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 405;iii)與SEQ ID NO: 405互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 405之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 405;iii)與SEQ ID NO: 405互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 405之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
30) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:406;iii)與SEQ ID NO: 406互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 406之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 406;iii)與SEQ ID NO: 406互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 406之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 406;iii)與SEQ ID NO: 406互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 406之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
31) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:407;iii)與SEQ ID NO: 407互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 407之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 407;iii)與SEQ ID NO: 407互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 407之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 407;iii)與SEQ ID NO: 407互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 407之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
32) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:408;iii)與SEQ ID NO: 408互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 408之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 408;iii)與SEQ ID NO: 408互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 408之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 408;iii)與SEQ ID NO: 408互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 408之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
33) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:409;iii)與SEQ ID NO: 409互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 409之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 409;iii)與SEQ ID NO: 409互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 409之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 409;iii)與SEQ ID NO: 409互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 409之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
34) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:410;iii)與SEQ ID NO: 410互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 410之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 410;iii)與SEQ ID NO: 410互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 410之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 410;iii)與SEQ ID NO: 410互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 410之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
35) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:411;iii)與SEQ ID NO: 411互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 411之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 411;iii)與SEQ ID NO: 411互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 411之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 411;iii)與SEQ ID NO: 411互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 411之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
36) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:412;iii)與SEQ ID NO: 412互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 412之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 412;iii)與SEQ ID NO: 412互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 412之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 412;iii)與SEQ ID NO: 412互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 412之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
37) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:413;iii)與SEQ ID NO: 413互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 413之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 413;iii)與SEQ ID NO: 413互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 413之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 413;iii)與SEQ ID NO: 413互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 413之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
38) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:414;iii)與SEQ ID NO: 414互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 414之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 414;iii)與SEQ ID NO: 414互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 414之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 414;iii)與SEQ ID NO: 414互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 414之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
39) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:415;iii)與SEQ ID NO: 415互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 415之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 415;iii)與SEQ ID NO: 415互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 415之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 415;iii)與SEQ ID NO: 415互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 415之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
40) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:416;iii)與SEQ ID NO: 416互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 416之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 416;iii)與SEQ ID NO: 416互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 416之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 416;iii)與SEQ ID NO: 416互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 416之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
41) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:417;iii)與SEQ ID NO: 417互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 417之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 417;iii)與SEQ ID NO: 417互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 417之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 417;iii)與SEQ ID NO: 417互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 417之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
42) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:418;iii)與SEQ ID NO: 418互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 418之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 418;iii)與SEQ ID NO: 418互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 418之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 418;iii)與SEQ ID NO: 418互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 418之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
43) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:419;iii)與SEQ ID NO: 419互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 419之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 419;iii)與SEQ ID NO: 419互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 419之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 419;iii)與SEQ ID NO: 419互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 419之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
44) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:420;iii)與SEQ ID NO: 420互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 420之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 420;iii)與SEQ ID NO: 420互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 420之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 420;iii)與SEQ ID NO: 420互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 420之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
45) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:421;iii)與SEQ ID NO: 421互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 421之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 421;iii)與SEQ ID NO: 421互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 421之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 421;iii)與SEQ ID NO: 421互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 421之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
46) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:422;iii)與SEQ ID NO: 422互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 422之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 422;iii)與SEQ ID NO: 422互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 422之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 422;iii)與SEQ ID NO: 422互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 422之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
47) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:423;iii)與SEQ ID NO: 423互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 423之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 423;iii)與SEQ ID NO: 423互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 423之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 423;iii)與SEQ ID NO: 423互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 423之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
48) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:424;iii)與SEQ ID NO: 424互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 424之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 424;iii)與SEQ ID NO: 424互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 424之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 424;iii)與SEQ ID NO: 424互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 424之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
49) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:425;iii)與SEQ ID NO: 425互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 425之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 425;iii)與SEQ ID NO: 425互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 425之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 425;iii)與SEQ ID NO: 425互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 425之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
50) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:426;iii)與SEQ ID NO: 426互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 426之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 426;iii)與SEQ ID NO: 426互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 426之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 426;iii)與SEQ ID NO: 426互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 426之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
51) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:427;iii)與SEQ ID NO: 427互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 427之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 427;iii)與SEQ ID NO: 427互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 427之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 427;iii)與SEQ ID NO: 427互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 427之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
52) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:428;iii)與SEQ ID NO: 428互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 428之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 428;iii)與SEQ ID NO: 428互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 428之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 428;iii)與SEQ ID NO: 428互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 428之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
53) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:429;iii)與SEQ ID NO: 429互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 429之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 429;iii)與SEQ ID NO: 429互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 429之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 429;iii)與SEQ ID NO: 429互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 429之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
54) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:430;iii)與SEQ ID NO: 430互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 430之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 430;iii)與SEQ ID NO: 430互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 430之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 430;iii)與SEQ ID NO: 430互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 430之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
55) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:431;iii)與SEQ ID NO: 431互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 431之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 431;iii)與SEQ ID NO: 431互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 431之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 431;iii)與SEQ ID NO: 431互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 431之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
56) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:432;iii)與SEQ ID NO: 432互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 432之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 432;iii)與SEQ ID NO: 432互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 432之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 432;iii)與SEQ ID NO: 432互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 432之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
57) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:433;iii)與SEQ ID NO: 433互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 433之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 433;iii)與SEQ ID NO: 433互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 433之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 433;iii)與SEQ ID NO: 433互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 433之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
58) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:434;iii)與SEQ ID NO: 434互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 434之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 434;iii)與SEQ ID NO: 434互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 434之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 434;iii)與SEQ ID NO: 434互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 434之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
59) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:435;iii)與SEQ ID NO: 435互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 435之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 435;iii)與SEQ ID NO: 435互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 435之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 435;iii)與SEQ ID NO: 435互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 435之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
60) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:436;iii)與SEQ ID NO: 436互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 436之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 436;iii)與SEQ ID NO: 436互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 436之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 436;iii)與SEQ ID NO: 436互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 436之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
61) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:437;iii)與SEQ ID NO: 437互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 437之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 437;iii)與SEQ ID NO: 437互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 437之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 437;iii)與SEQ ID NO: 437互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 437之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
62) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:438;iii)與SEQ ID NO: 438互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 438之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 438;iii)與SEQ ID NO: 438互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 438之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 438;iii)與SEQ ID NO: 438互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 438之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
63) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:439;iii)與SEQ ID NO: 439互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 439之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 439;iii)與SEQ ID NO: 439互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 439之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 439;iii)與SEQ ID NO: 439互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 439之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
64) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:440;iii)與SEQ ID NO: 440互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 440之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 440;iii)與SEQ ID NO: 440互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 440之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 440;iii)與SEQ ID NO: 440互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 440之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
65) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:441;iii)與SEQ ID NO: 441互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 441之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 441;iii)與SEQ ID NO: 441互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 441之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 441;iii)與SEQ ID NO: 441互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 441之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
66) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:442;iii)與SEQ ID NO: 442互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 442之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 442;iii)與SEQ ID NO: 442互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 442之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 442;iii)與SEQ ID NO: 442互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 442之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
67) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:443;iii)與SEQ ID NO: 443互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 443之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 443;iii)與SEQ ID NO: 443互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 443之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 443;iii)與SEQ ID NO: 443互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 443之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
68) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:444;iii)與SEQ ID NO: 444互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 444之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 444;iii)與SEQ ID NO: 444互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 444之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 444;iii)與SEQ ID NO: 444互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 444之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
69) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:445;iii)與SEQ ID NO: 445互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 445之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 445;iii)與SEQ ID NO: 445互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 445之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 445;iii)與SEQ ID NO: 445互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 445之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
70) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:446;iii)與SEQ ID NO: 446互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 446之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 446;iii)與SEQ ID NO: 446互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 446之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 446;iii)與SEQ ID NO: 446互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 446之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
71) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:447;iii)與SEQ ID NO: 447互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 447之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 447;iii)與SEQ ID NO: 447互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 447之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 447;iii)與SEQ ID NO: 447互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 447之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
72) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:448;iii)與SEQ ID NO: 448互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 448之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 448;iii)與SEQ ID NO: 448互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 448之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 448;iii)與SEQ ID NO: 448互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 448之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
73) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:449;iii)與SEQ ID NO: 449互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 449之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 449;iii)與SEQ ID NO: 449互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 449之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 449;iii)與SEQ ID NO: 449互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 449之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
74) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:450;iii)與SEQ ID NO: 450互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 450之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 450;iii)與SEQ ID NO: 450互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 450之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 450;iii)與SEQ ID NO: 450互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 450之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
75) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:451;iii)與SEQ ID NO: 451互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 451之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 451;iii)與SEQ ID NO: 451互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 451之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 451;iii)與SEQ ID NO: 451互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 451之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
76) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:452;iii)與SEQ ID NO: 452互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 452之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 452;iii)與SEQ ID NO: 452互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 452之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 452;iii)與SEQ ID NO: 452互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 452之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
77) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:453;iii)與SEQ ID NO: 453互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 453之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 453;iii)與SEQ ID NO: 453互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 453之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 453;iii)與SEQ ID NO: 453互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 453之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
78) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:454;iii)與SEQ ID NO: 454互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 454之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 454;iii)與SEQ ID NO: 454互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 454之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 454;iii)與SEQ ID NO: 454互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 454之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
79) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:455;iii)與SEQ ID NO: 455互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 455之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 455;iii)與SEQ ID NO: 455互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 455之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 455;iii)與SEQ ID NO: 455互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 455之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
80) 在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:456;iii)與SEQ ID NO: 456互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 456之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 456;iii)與SEQ ID NO: 456互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 456之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 456;iii)與SEQ ID NO: 456互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 456之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。
編碼 sbRNA 之重組表現載體
本揭示案提供重組表現載體,其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列(其中該重組RNA分子可稱為「人工微小RNA」或「sbRNA」)。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,重組表現載體包含5’腺相關病毒(AAV)反向末端重複(ITR)序列序列及3’ AAV ITR序列。
本揭示案提供重組表現載體,其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列,其中該重組RNA分子包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「5’前導序列」)、環多核苷酸及3’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「3’尾曳序列」),其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第一股;iii)該環多核苷酸;(iv)該雙股RNA之第二股;及iii)該3’尾曳序列多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。本揭示案提供重組表現載體,其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列,其中該重組RNA分子包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸,其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第二股;iii)該環多核苷酸;(iv)該雙股RNA之第一股;及iii)該3’側接多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。在一些情形中,5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸源自miR33。
本揭示案提供重組表現載體,其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列,其中該重組RNA分子包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「5’前導序列」)及3’側接多核苷酸(在本文中亦稱為「3’尾曳序列」),其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第一股;iii)該雙股RNA之第二股;及iv)該3’尾曳序列多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。本揭示案提供重組表現載體,其包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列,其中該重組RNA分子包含:a)本揭示案之雙股RNA;及b)微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸,其中該重組核酸包含:i)該5’側接多核苷酸;ii)該雙股RNA之第二股;iii)該雙股RNA之第一股;及iv)該3’側接多核苷酸;且其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。在一些情形中,5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸源自miR451。
包含盒之重組表現載體
本揭示案提供包含本揭示案之盒(「DNA分子」)之重組表現載體,其中該盒包含編碼本揭示案之重組RNA分子之核苷酸序列(其中該重組RNA分子可稱為「人工微小RNA」或「sbRNA」)。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,編碼該重組RNA分子之核苷酸序列可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,重組表現載體包含5’腺相關病毒(AAV)反向末端重複(ITR)序列序列及3’ AAV ITR序列。
以下為包含本揭示案之盒的重組表現載體之非限制性實例。
1) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:579;表7中之「CUG-10」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
2) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:580;表7中之「CUG_19」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
3) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:581;表7中之「CUG_28」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
4) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:582;表7中之「CUG_37」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
5) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:583;表7中之「CUG_46」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
6) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:584;表7中之「CUG_55」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
7) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACTGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:585;表7中之「CUG_64」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
8) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:586;表7中之「CUG_118」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
9) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:587;表7中之「CUG_127」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
10) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:588;表7中之「CUG_136」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
11) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:589;表7中之「CUG_145」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
12) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:590;表7中之「CUG_154」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
13) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGATGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:591;表7中之「CUG_163」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
14) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:592;表7中之「CUG_217」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
15) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:593;表7中之「CUG_226」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
16) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:594;表7中之「CUG_235」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
17) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:595;表7中之「CUG_244」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
18) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGCAGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:596;表7中之「CUG_253」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
19) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:597;表7中之「CUG_NA-A」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
20) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAACTGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:598;表7中之「CUG_NA_B」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
21) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGATGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:599;表7中之「CUG_NA_C」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
22) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCAGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:600;表7中之「CUG_NA_D」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
23) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:601;表7中之「CUG_NA_E」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
24) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:602;表7中之「CUG_NA_F」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
25) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:603;表7中之「CUG_NA_G」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
26) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:604;表7中之「CUG_NA_H」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
27) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCAGCTGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:605;表7中之「CUG_NA_I」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
28) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGCTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:606;表7中之「CUG_307」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
29) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:607;表7中之「CUG_334」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
30) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:608;表7中之「CUG_361」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
31) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:609;表7中之「CUG_388」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
32) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:610;表7中之「CUG_415」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
33) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:611;表7中之「CUG_631」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
34) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:612;表7中之「CUG_658」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
35) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:613;表7中之「CUG_712」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
36) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:614;表7中之「CUG_2116」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
37) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:615;表7中之「CUG_2143」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
38) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:616;表7中之「CUG_2170」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
39) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:617;表7中之「CUG_442」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
40) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:618;表7中之「CUG_604」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
41) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:619;表7中之「CUG_685」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
42) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:620;表7中之「CUG_2089」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
43) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:621;表7中之「CUG_2197」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
44) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:622;表7中之「CUG_4870」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
45) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGAAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:623;表7中之「CUG_9973」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
46) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGATGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:624;表7中之「CUG_1013」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
47) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCAGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:625;表7中之「CUG_1070」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
48) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGATACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:626;表7中之「CUG_2341」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
49) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCAACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:627;表7中之「CUG_2398」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
50) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAACTGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:628;表7中之「CUG_4789」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
51) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGCAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:629;表7中之「CUG_4951」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
52) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGCTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:630;表7中之「CUG_5032」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
53) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAAAGCTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:631;表7中之「CUG_5113」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
54) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATAATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAAAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:632;表7中之「CUG_5599」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
55) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATACAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:633;表7中之「CUG_5680」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
56) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATACTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:634;表7中之「CUG_5761」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
57) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATACTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGAAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:635;表7中之「CUG_5842」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
58) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGAAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:636;表7中之「CUG_6328」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
59) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGATACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:637;表7中之「CUG_6409」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
60) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGATGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAACAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:638;表7中之「CUG_6490」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
61) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCAACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:639;表7中之「CUG_6976」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
62) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCAGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:640;表7中之「CUG_7057」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
63) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTAATGCTAATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAAAAGCAAAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:641;表7中之「CUG_7543」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
64) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAAATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAAAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:642;表7中之「CUG_9244」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
65) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAACAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:643;表7中之「CUG_9325」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
66) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAACTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:644;表7中之「CUG_9406」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
67) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAACTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGAAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:645;表7中之「CUG_9487」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
68) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGATACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAACAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:646;表7中之「CUG_10054」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
69) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCAACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:647;表7中之「CUG_10621」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
70) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTACAGCTAATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAAAAGCAGAAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:648;表7中之「CUG_11188」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
71) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAAATGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAAAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:649;表7中之「CUG_222609」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
72) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAACAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:650;表7中之「CUG_22690」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
73) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAACTACTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGAAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:651;表7中之「CUG_22771」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
74) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAACTGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGAAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:652;表7中之「CUG_22852」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
75) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGAAGCTGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAGCAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:653;表7中之「CUG_233338」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
76) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGATGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAACAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:654;表7中之「CUG_23500」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
77) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCAGATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:655;表7中之「CUG_24067」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
78) 在一些情形中,重組表現載體包含含有如下核苷酸序列之盒:
tgcacacctcctggcgggcagctctgCTGCTGCTGAAGCTAATGCTGtgttctggcaatacctgCAGCAAAAGCAACAGCAGCAGCAgggaggcctgccctgactgcccacTTTTTG (SEQ ID NO:656;表7中之「CUG_24553」;圖23)。在一些情形中,該盒不包括3’ TTTTTG序列。在一些情形中,該盒包括核苷酸序列T
n代替3’ TTTTTG序列,其中n為5至10之整數(例如n為5、6、7、8、9或10)。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
以下為包含本揭示案之盒的重組表現載體之其他非限制性實例。
1) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:379;iii)與SEQ ID NO: 379互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 379之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 379;iii)與SEQ ID NO: 379互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 379之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 379;iii)與SEQ ID NO: 379互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 379之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
2) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:380;iii)與SEQ ID NO: 380互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 380之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 380;iii)與SEQ ID NO: 380互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 380之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 380;iii)與SEQ ID NO: 380互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 380之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
3) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:381;iii)與SEQ ID NO: 381互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 381之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 381;iii)與SEQ ID NO: 381互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 381之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 381;iii)與SEQ ID NO: 381互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 381之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
4) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:382;iii)與SEQ ID NO: 382互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 382之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 382;iii)與SEQ ID NO: 382互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 382之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 382;iii)與SEQ ID NO: 382互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 382之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
5) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:383;iii)與SEQ ID NO: 383互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 383之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 383;iii)與SEQ ID NO: 383互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 383之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 383;iii)與SEQ ID NO: 383互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 383之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
6) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:384;iii)與SEQ ID NO: 384互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 384之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 384;iii)與SEQ ID NO: 384互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 384之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 384;iii)與SEQ ID NO: 384互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 384之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
7) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:385;iii)與SEQ ID NO: 385互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 385之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 385;iii)與SEQ ID NO: 385互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 385之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 385;iii)與SEQ ID NO: 385互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 385之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
8) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:386;iii)與SEQ ID NO: 386互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 386之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 386;iii)與SEQ ID NO: 386互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 386之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 386;iii)與SEQ ID NO: 386互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 386之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
9) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:387;iii)與SEQ ID NO: 387互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 387之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 387;iii)與SEQ ID NO: 387互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 387之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 387;iii)與SEQ ID NO: 387互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 387之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
10) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:388;iii)與SEQ ID NO: 388互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 388之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 388;iii)與SEQ ID NO: 388互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 388之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 388;iii)與SEQ ID NO: 388互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 388之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
11) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:389;iii)與SEQ ID NO: 389互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 389之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 389;iii)與SEQ ID NO: 389互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 389之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 389;iii)與SEQ ID NO: 389互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 389之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
12) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 390;iii)與SEQ ID NO: 309互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
13) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
14) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 390;iii)與SEQ ID NO: 390互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 390之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
15) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 391;iii)與SEQ ID NO: 391互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 391之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
16) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:392;iii)與SEQ ID NO: 392互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 392之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 392;iii)與SEQ ID NO: 392互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 392之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 392;iii)與SEQ ID NO: 392互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 392之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
17) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:393;iii)與SEQ ID NO: 393互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 393之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 393;iii)與SEQ ID NO: 393互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 393之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 393;iii)與SEQ ID NO: 393互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 393之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
18) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:394;iii)與SEQ ID NO: 394互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 394之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 394;iii)與SEQ ID NO: 394互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 394之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 394;iii)與SEQ ID NO: 394互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 394之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
19) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:395;iii)與SEQ ID NO: 395互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 395之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 395;iii)與SEQ ID NO: 395互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 395之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 395;iii)與SEQ ID NO: 395互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 395之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
20) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:396;iii)與SEQ ID NO: 396互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 396之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 396;iii)與SEQ ID NO: 396互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 396之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 396;iii)與SEQ ID NO: 396互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 396之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
21) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:397;iii)與SEQ ID NO: 397互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 397之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 397;iii)與SEQ ID NO: 397互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 397之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 397;iii)與SEQ ID NO: 397互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 397之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
22) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:398;iii)與SEQ ID NO: 398互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 398之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 398;iii)與SEQ ID NO: 398互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 398之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 398;iii)與SEQ ID NO: 398互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 398之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
23) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:399;iii)與SEQ ID NO: 399互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 399之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 399;iii)與SEQ ID NO: 399互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 399之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 399;iii)與SEQ ID NO: 399互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 399之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
24) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:400;iii)與SEQ ID NO: 400互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 400之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 400;iii)與SEQ ID NO: 400互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 400之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 400;iii)與SEQ ID NO: 400互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 400之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
25) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:401;iii)與SEQ ID NO: 401互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 401之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 401;iii)與SEQ ID NO: 401互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 401之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 401;iii)與SEQ ID NO: 401互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 401之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
26) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:402;iii)與SEQ ID NO: 402互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 402之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 402;iii)與SEQ ID NO: 402互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 402之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 402;iii)與SEQ ID NO: 402互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 402之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
27) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:403;iii)與SEQ ID NO: 403互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 403之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 403;iii)與SEQ ID NO: 403互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 403之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 403;iii)與SEQ ID NO: 403互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 403之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
28) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:404;iii)與SEQ ID NO: 404互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 404之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 404;iii)與SEQ ID NO: 404互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 404之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 404;iii)與SEQ ID NO: 404互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 404之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
29) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:405;iii)與SEQ ID NO: 405互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 405之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 405;iii)與SEQ ID NO: 405互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 405之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 405;iii)與SEQ ID NO: 405互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 405之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
30) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:406;iii)與SEQ ID NO: 406互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 406之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 406;iii)與SEQ ID NO: 406互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 406之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 406;iii)與SEQ ID NO: 406互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 406之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
31) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:407;iii)與SEQ ID NO: 407互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 407之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 407;iii)與SEQ ID NO: 407互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 407之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 407;iii)與SEQ ID NO: 407互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 407之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
32) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:408;iii)與SEQ ID NO: 408互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 408之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 408;iii)與SEQ ID NO: 408互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 408之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 408;iii)與SEQ ID NO: 408互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 408之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
33) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:409;iii)與SEQ ID NO: 409互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 409之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 409;iii)與SEQ ID NO: 409互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 409之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 409;iii)與SEQ ID NO: 409互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 409之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
34) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:410;iii)與SEQ ID NO: 410互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 410之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 410;iii)與SEQ ID NO: 410互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 410之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 410;iii)與SEQ ID NO: 410互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 410之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
35) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:411;iii)與SEQ ID NO: 411互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 411之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 411;iii)與SEQ ID NO: 411互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 411之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 411;iii)與SEQ ID NO: 411互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 411之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
36) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:412;iii)與SEQ ID NO: 412互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 412之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 412;iii)與SEQ ID NO: 412互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 412之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 412;iii)與SEQ ID NO: 412互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 412之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
37) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:413;iii)與SEQ ID NO: 413互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 413之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 413;iii)與SEQ ID NO: 413互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 413之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 413;iii)與SEQ ID NO: 413互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 413之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
38) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:414;iii)與SEQ ID NO: 414互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 414之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 414;iii)與SEQ ID NO: 414互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 414之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 414;iii)與SEQ ID NO: 414互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 414之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
39) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:415;iii)與SEQ ID NO: 415互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 415之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 415;iii)與SEQ ID NO: 415互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 415之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 415;iii)與SEQ ID NO: 415互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 415之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
40) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:416;iii)與SEQ ID NO: 416互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 416之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 416;iii)與SEQ ID NO: 416互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 416之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 416;iii)與SEQ ID NO: 416互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 416之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
41) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:417;iii)與SEQ ID NO: 417互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 417之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 417;iii)與SEQ ID NO: 417互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 417之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 417;iii)與SEQ ID NO: 417互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 417之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
42) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:418;iii)與SEQ ID NO: 418互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 418之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 418;iii)與SEQ ID NO: 418互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 418之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 418;iii)與SEQ ID NO: 418互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 418之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
43) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:419;iii)與SEQ ID NO: 419互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 419之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 419;iii)與SEQ ID NO: 419互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 419之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 419;iii)與SEQ ID NO: 419互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 419之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
44) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:420;iii)與SEQ ID NO: 420互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 420之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 420;iii)與SEQ ID NO: 420互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 420之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 420;iii)與SEQ ID NO: 420互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 420之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
45) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:421;iii)與SEQ ID NO: 421互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 421之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 421;iii)與SEQ ID NO: 421互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 421之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 421;iii)與SEQ ID NO: 421互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 421之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
46) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:422;iii)與SEQ ID NO: 422互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 422之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 422;iii)與SEQ ID NO: 422互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 422之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 422;iii)與SEQ ID NO: 422互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 422之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
47) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:423;iii)與SEQ ID NO: 423互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 423之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 423;iii)與SEQ ID NO: 423互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 423之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 423;iii)與SEQ ID NO: 423互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 423之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
48) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:424;iii)與SEQ ID NO: 424互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 424之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 424;iii)與SEQ ID NO: 424互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 424之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 424;iii)與SEQ ID NO: 424互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 424之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
49) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:425;iii)與SEQ ID NO: 425互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 425之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 425;iii)與SEQ ID NO: 425互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 425之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 425;iii)與SEQ ID NO: 425互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 425之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
50) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:426;iii)與SEQ ID NO: 426互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 426之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 426;iii)與SEQ ID NO: 426互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 426之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 426;iii)與SEQ ID NO: 426互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 426之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
51) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:427;iii)與SEQ ID NO: 427互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 427之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 427;iii)與SEQ ID NO: 427互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 427之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 427;iii)與SEQ ID NO: 427互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 427之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
52) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:428;iii)與SEQ ID NO: 428互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 428之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 428;iii)與SEQ ID NO: 428互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 428之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 428;iii)與SEQ ID NO: 428互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 428之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
53) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:429;iii)與SEQ ID NO: 429互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 429之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 429;iii)與SEQ ID NO: 429互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 429之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 429;iii)與SEQ ID NO: 429互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 429之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
54) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:430;iii)與SEQ ID NO: 430互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 430之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 430;iii)與SEQ ID NO: 430互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 430之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 430;iii)與SEQ ID NO: 430互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 430之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
55) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:431;iii)與SEQ ID NO: 431互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 431之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 431;iii)與SEQ ID NO: 431互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 431之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 431;iii)與SEQ ID NO: 431互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 431之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
56) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:432;iii)與SEQ ID NO: 432互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 432之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 432;iii)與SEQ ID NO: 432互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 432之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 432;iii)與SEQ ID NO: 432互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 432之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
57) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:433;iii)與SEQ ID NO: 433互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 433之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 433;iii)與SEQ ID NO: 433互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 433之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 433;iii)與SEQ ID NO: 433互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 433之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
58) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:434;iii)與SEQ ID NO: 434互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 434之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 434;iii)與SEQ ID NO: 434互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 434之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 434;iii)與SEQ ID NO: 434互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 434之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
59) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:435;iii)與SEQ ID NO: 435互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 435之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 435;iii)與SEQ ID NO: 435互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 435之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 435;iii)與SEQ ID NO: 435互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 435之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
60) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:436;iii)與SEQ ID NO: 436互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 436之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 436;iii)與SEQ ID NO: 436互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 436之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 436;iii)與SEQ ID NO: 436互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 436之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
61) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:437;iii)與SEQ ID NO: 437互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 437之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 437;iii)與SEQ ID NO: 437互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 437之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 437;iii)與SEQ ID NO: 437互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 437之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
62) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:438;iii)與SEQ ID NO: 438互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 438之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 438;iii)與SEQ ID NO: 438互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 438之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 438;iii)與SEQ ID NO: 438互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 438之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
63) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:439;iii)與SEQ ID NO: 439互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 439之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 439;iii)與SEQ ID NO: 439互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 439之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 439;iii)與SEQ ID NO: 439互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 439之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
64) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:440;iii)與SEQ ID NO: 440互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 440之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 440;iii)與SEQ ID NO: 440互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 440之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 440;iii)與SEQ ID NO: 440互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 440之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
65) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:441;iii)與SEQ ID NO: 441互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 441之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 441;iii)與SEQ ID NO: 441互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 441之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 441;iii)與SEQ ID NO: 441互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 441之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
66) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:442;iii)與SEQ ID NO: 442互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 442之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 442;iii)與SEQ ID NO: 442互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 442之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 442;iii)與SEQ ID NO: 442互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 442之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
67) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:443;iii)與SEQ ID NO: 443互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 443之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 443;iii)與SEQ ID NO: 443互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 443之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 443;iii)與SEQ ID NO: 443互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 443之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
68) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:444;iii)與SEQ ID NO: 444互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 444之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 444;iii)與SEQ ID NO: 444互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 444之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 444;iii)與SEQ ID NO: 444互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 444之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
69) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:445;iii)與SEQ ID NO: 445互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 445之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 445;iii)與SEQ ID NO: 445互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 445之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 445;iii)與SEQ ID NO: 445互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 445之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
70) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:446;iii)與SEQ ID NO: 446互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 446之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 446;iii)與SEQ ID NO: 446互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 446之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 446;iii)與SEQ ID NO: 446互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 446之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
71) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:447;iii)與SEQ ID NO: 447互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 447之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 447;iii)與SEQ ID NO: 447互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 447之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 447;iii)與SEQ ID NO: 447互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 447之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
72) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:448;iii)與SEQ ID NO: 448互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 448之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 448;iii)與SEQ ID NO: 448互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 448之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 448;iii)與SEQ ID NO: 448互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 448之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
73) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:449;iii)與SEQ ID NO: 449互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 449之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 449;iii)與SEQ ID NO: 449互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 449之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 449;iii)與SEQ ID NO: 449互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 449之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
74) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:450;iii)與SEQ ID NO: 450互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 450之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 450;iii)與SEQ ID NO: 450互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 450之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 450;iii)與SEQ ID NO: 450互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 450之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
75) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:451;iii)與SEQ ID NO: 451互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 451之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 451;iii)與SEQ ID NO: 451互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 451之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 451;iii)與SEQ ID NO: 451互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 451之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
76) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:452;iii)與SEQ ID NO: 452互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 452之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 452;iii)與SEQ ID NO: 452互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 452之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 452;iii)與SEQ ID NO: 452互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 452之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
77) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:453;iii)與SEQ ID NO: 453互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 453之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 453;iii)與SEQ ID NO: 453互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 453之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 453;iii)與SEQ ID NO: 453互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 453之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
78) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:454;iii)與SEQ ID NO: 454互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 454之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 454;iii)與SEQ ID NO: 454互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 454之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 454;iii)與SEQ ID NO: 454互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 454之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
79) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:455;iii)與SEQ ID NO: 455互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 455之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 455;iii)與SEQ ID NO: 455互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 455之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 455;iii)與SEQ ID NO: 455互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 455之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
80) 在一些情形中,重組表現載體包含以下盒中之一者。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:854;ii) SEQ ID NO:456;iii)與SEQ ID NO: 456互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 456之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:855。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:856;ii) SEQ ID NO: 456;iii)與SEQ ID NO: 456互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 456之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:857。在一些情形中,盒按5’至3’之順序包含:i) SEQ ID NO:858;ii) SEQ ID NO: 456;iii)與SEQ ID NO: 456互補之序列,其中該序列可包含0至10個與SEQ ID NO: 456之失配(非互補核苷酸);及iv) SEQ ID NO:859。在一些情形中,該盒可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶II啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至RNA聚合酶III啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CAG啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CBA啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至CMV啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至U6啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至EF1α啟動子。在一些情形中,該盒可操作地連接至H1啟動子。在一些情形中,該重組表現載體包含5’ AAV ITR序列及3’ AAV ITR序列。在一些情形中,AAV ITR為AAV9 ITR。在一些情形中,AAV ITR為AAV2 ITR。
遞送運載體
本揭示案之重組表現載體可存在於遞送運載體中。因此,本揭示案提供包含本揭示案之重組表現載體之遞送運載體。在一些情形中,遞送運載體為非病毒遞送運載體。在一些情形中,遞送運載體為脂質奈米顆粒。在一些情形中,遞送運載體為病毒遞送運載體。在一些情形中,病毒遞送運載體為重組AAV病毒粒子。適宜AAV病毒粒子包括具有AAV2衣殼、AAV9衣殼及諸如此類之彼等病毒粒子。
適宜脂質奈米顆粒可包括(例如)一或多種陽離子脂質、經聚(乙二醇)修飾之脂質(「聚乙二醇化脂質」)及諸如此類。適宜陽離子脂質包括(但不限於) XTC (2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷)、MC3 ((6Z,9Z,28Z,31Z)-4-(二甲基胺基)丁酸三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯)、ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((92,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊[d] [1,3]二氧雜環戊烯-5-胺)、NC98-5 (4,7,13-參(3-側氧基-3-(十一烷基胺基)丙基)-N1,N16-雙十一烷基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1,16-二醯胺)、DODAP (1,2-二油烯基-3-二甲基銨丙烷)、HGT4003、ICE、HGT5000、順式或反式HGT5001、DOTAP (1,2-二油烯基-3-三甲基銨丙烷)、DOTMA (1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷)、DLinDMA、DLin-KC2-DMA及C12-200。可包括在脂質奈米顆粒中之其他適宜脂質包括(但不限於) DSPC (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DPPC (1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DOPE (1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE (1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE (1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG (1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油))及膽固醇。適宜聚乙二醇化脂質包括(例如) PEG-DSG (與例如PEG-1000、PEG-2000、PEG-5000及諸如此類結合之1,2-二硬脂醯基-
外消旋 -甘油-3-甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG (與PEG結合之1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油)及PEG-神經醯胺。
D. 醫藥組合物
本揭示案提供醫藥組合物,其包含編碼本文所闡述之雙股RNA之核酸(例如DNA)、表現盒或載體以及醫藥學上可接受之載劑。如本文所用,術語「醫藥學上可接受」係指在合理醫學判斷範圍內適用於與細胞及/或組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症且與合理益處/風險比相稱之彼等化合物、材料、組合物及/或劑型。
如本文所用,術語「醫藥學上可接受之載劑」意指醫藥學上可接受之材料、組合物或載劑,諸如液體或固體填充劑、穩定劑、分散劑、懸浮劑、稀釋劑、賦形劑、增稠劑、溶劑或囊封材料,其涉及將本發明中有用之化合物攜載或轉運至患者體內或攜載或轉運給患者,使得該化合物可執行其預期功能。每一載劑在與調配物之其他成分相容且不損害所接觸之細胞或組織的意義上必須為「可接受」的。可包括在用於實踐本發明之醫藥組合物中之其他成分為此項技術中所已知,且闡述於(例如) Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro編輯,Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)中,其係以引用的方式併入本文中。
如醫學技術中所熟知,針對任一患者之劑量取決於許多因素,包括患者之體型、重量、體表面積、年齡、達成治療效應所需之抑制性RNA表現之表現水準、抑制性核酸之穩定性、所治療之具體疾病、疾病階段、性別、投與時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。
在一些實施例中,如本文所闡述之rAAV係以如下量投與給個體:每名個體約1×10
6VG (病毒基因體)至約1×10
16VG,或約1×10
6、2×10
6、3×10
6、4×10
6、5×10
6、6×10
6、7×10
6、8×10
6、9×10
6、1×10
7、2×10
7、3×10
7、4×10
7、5×10
7、6×10
7、7×10
7、8×10
7、9×10
7、1×10
8、2×10
8、3×10
8、4×10
8、5×10
8、6×10
8、7×10
8、8×10
8、9×10
8、1×10
9、2×10
9、3×10
9、4×10
9、5×10
9、6×10
9、7×10
9、8×10
9、9×10
9、1×10
10、2×10
10、3×10
10、4×10
10、5×10
10、6×10
10、7×10
10、8×10
10、9×10
10、1×10
11、2×10
11、2.1×10
11、2.2×10
11、2.3×10
11、2.4×10
11、2.5×10
11、2.6×10
11、2.7×10
11、2.8×10
11、2.9×10
11、3×10
11、4×10
11、5×10
11、6×10
11、7×10
11、7.1×10
11、7.2×10
11、7.3×10
11、7.4×10
11、7.5×10
11、7.6×10
11、7.7×10
11、7.8×10
11、7.9×10
11、8×10
11、9×10
11、1×10
12、1.1×10
12、1.2×10
12、1.3×10
12、1.4×10
12、1.5×10
12、1.6×10
12、1.7×10
12、1.8×10
12、1.9×10
12、2×10
12、3×10
12、4×10
12、4.1×10
12、4.2×10
12、4.3×10
12、4.4×10
12、4.5×10
12、4.6×10
12、4.7×10
12、4.8×10
12、4.9×10
12、5×10
12、6×10
12、7×10
12、8×10
12、8.1×10
12、8.2×10
12、8.3×10
12、8.4×10
12、8.5×10
12、8.6×10
12、8.7×10
12、8.8×10
12、8.9×10
12、9×10
12、1×10
13、2×10
13、3×10
13、4×10
13、5×10
13、6×10
13、6.7×10
13、7×10
13、8×10
13、9×10
13、1×10
14、2×10
14、3×10
14、4×10
14、5×10
14、6×10
14、7×10
14、8×10
14、9×10
14、1×10
15、2×10
15、3×10
15、4×10
15、5×10
15、6×10
15、7×10
15、8×10
15、9×10
15或1×10
16VG/個體。在一些實施例中,如本文所闡述之rAAV顆粒係以如下量投與給個體:約1×10
6VG/kg至約1×10
16VG/kg,或約1×10
6、2×10
6、3×10
6、4×10
6、5×10
6、6×10
6、7×10
6、8×10
6、9×10
6、1×10
7、2×10
7、3×10
7、4×10
7、5×10
7、6×10
7、7×10
7、8×10
7、9×10
7、1×10
8、2×10
8、3×10
8、4×10
8、5×10
8、6×10
8、7×10
8、8×10
8、9×10
8、1×10
9、2×10
9、3×10
9、4×10
9、5×10
9、6×10
9、7×10
9、8×10
9、9×10
9、1×10
10、2×10
10、3×10
10、4×10
10、5×10
10、6×10
10、7×10
10、8×10
10、9×10
10、1×10
11、2×10
11、2.1×10
11、2.2×10
11、2.3×10
11、2.4×10
11、2.5×10
11、2.6×10
11、2.7×10
11、2.8×10
11、2.9×10
11、3×10
11、4×10
11、5×10
11、6×10
11、7×10
11、7.1×10
11、7.2×10
11、7.3×10
11、7.4×10
11、7.5×10
11、7.6×10
11、7.7×10
11、7.8×10
11、7.9×10
11、8×10
11、9×10
11、1×10
12、1.1×10
12、1.2×10
12、1.3×10
12、1.4×10
12、1.5×10
12、1.6×10
12、1.7×10
12、1.8×10
12、1.9×10
12、2×10
12、3×10
12、4×10
12、4.1×10
12、4.2×10
12、4.3×10
12、4.4×10
12、4.5×10
12、4.6×10
12、4.7×10
12、4.8×10
12、4.9×10
12、5×10
12、6×10
12、7×10
12、8×10
12、8.1×10
12、8.2×10
12、8.3×10
12、8.4×10
12、8.5×10
12、8.6×10
12、8.7×10
12、8.8×10
12、8.9×10
12、9×10
12、1×10
13、2×10
13、3×10
13、4×10
13、5×10
13、6×10
13、6.7×10
13、7×10
13、8×10
13、9×10
13、1×10
14、2×10
14、3×10
14、4×10
14、5×10
14、6×10
14、7×10
14、8×10
14、9×10
14、1×10
15、2×10
15、3×10
15、4×10
15、5×10
15、6×10
15、7×10
15、8×10
15、9×10
15或1×10
16VG/kg。
醫藥組合物可以如熟習醫學技術者所確定適於欲治療(或預防)之疾病或疾患之方式投與。投與組合物之適當劑量以及適宜持續時間及頻率將由諸如以下等因素決定:患者之健康狀況、患者之體型(亦即重量、質量或身體面積)、患者疾病之類型及嚴重程度、活性成分之特定形式及投與方法。一般而言,適當劑量及治療方案以足以提供治療及/或預防益處(如本文所闡述,包括改善之臨床結果,諸如更常見之完全或部分緩解、或更長之無病存活期及/或總存活期或症狀嚴重程度之減輕)之量提供組合物。對於預防性使用,劑量應足以預防與疾病或病症相關之疾病、延遲其發作或減輕其嚴重程度。根據本文所闡述之方法投與的組合物之預防益處可藉由實施臨床前(包括活體外及活體內動物研究)及臨床研究並藉由適當統計學、生物學以及臨床方法及技術分析由此獲得之數據來確定,所有該等研究、方法及技術均可由熟習此項技術者容易地實踐。
組合物(例如醫藥組合物)可藉由任何途徑投與,包括腸內(例如經口)、非經腸、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、軟膜下、實質內、紋狀體內、顱內、腦池內、大腦內、大腦室內、眼內、室內、腰內、皮下、經皮、皮內、經直腸、陰道內、腹膜內、外用(如藉由粉末、軟膏劑、乳霜及/或滴劑)、經黏膜、經鼻、經頰、舌下;藉由氣管內滴入、支氣管滴入,及/或吸入;及/或作為口腔噴霧、鼻噴霧及/或氣溶膠。一般而言,最適當之投與途徑將取決於多種因素,包括劑之性質(例如其在胃腸道環境中之穩定性)及/或個體之疾患。在一些實施例中,組合物直接注射至個體之CNS中。在一些實施例中,直接注射至CNS中為大腦內注射、大腦室內注射、實質內注射、鞘內注射、紋狀體內注射、軟膜下注射或其任何組合。在一些實施例中,直接注射至CNS中為直接注射至個體之腦脊髓液(CSF)中,視情況其中該直接注射為腦池內注射、室內注射及/或腰內注射。在一些實施例中,藉由直接注射至CNS中與不直接注射至CNS中之途徑(例如靜脈內)之組合投與組合物。
在一些實施例中,調配包含rAAV顆粒之醫藥組合物以減少rAAV顆粒之聚集,特定而言在存在高rAAV顆粒濃度之情形下(例如約10
13VG/ml或更大)。減少rAAV顆粒聚集之方法為此項技術中所熟知,且包括(例如)添加表面活性劑、調整pH、調整鹽濃度等(例如,參見Wright F R等人,Molecular Therapy (2005) 12:171-178,其係以全文引用的方式併入本文中)。
D. 套組
在一些實施例中,本文所提供之組合物可組裝成醫藥或研究套組,以促進其在治療或研究用途中之使用。套組可包括一或多個容器,該(等)容器包含:(a)編碼如本文所闡述之雙股RNA之表現盒或載體;(b)使用說明書;及視情況(c)用於將套組組分(a)轉導至宿主細胞中之試劑。在一些實施例中,套組組分(a)可呈適用於特定用途及投與模式之醫藥調配物及劑量。舉例而言,套組組分(a)可以單位劑量或多劑量容器呈遞,諸如密封安瓿或小瓶。套組組分可能需要在使用之前將一或多種組分混合,或可以預混狀態製備。套組組分可呈液體或固體形式,且可能需要添加溶劑或進一步稀釋。套組組分可為無菌的。說明書可呈書面或電子形式,且可與套組相關聯(例如書寫插頁、CD、DVD),或經由網際網路或基於網路之通訊提供。套組可以冷藏或冷凍溫度運輸並儲存。
E. 使用方法
本揭示案提供用於治療方法中之核酸(例如DNA)、表現盒、包含盒之重組表現載體、編碼雙股RNA之重組表現載體或本文所闡述之醫藥組合物。
本揭示案提供用於選擇性地減少患有CAG重複序列擴增病症之個體的含疾病相關CAG重複序列之RNA的轉譯之方法,該方法包括向該個體投與有效量之本揭示案之重組表現載體、本揭示案之遞送運載體、本揭示案之病毒顆粒或本揭示案之醫藥組合物。在一些情形中,重複序列擴增病症為亨庭頓氏病、1型脊髓小腦性失調症、2型脊髓小腦性失調症、3型脊髓小腦性失調症、6型脊髓小腦性失調症、7型脊髓小腦性失調症、12型脊髓小腦性失調症、17型脊髓小腦性失調症、脊髓及延髓肌肉萎縮、齒狀紅核蒼白球萎縮症或顱骨鎖骨發育不良。在一些情形中,該投與包含直接注射至個體之中樞神經系統中。在一些情形中,直接注射為大腦內注射、大腦室內注射、實質內注射、鞘內注射、紋狀體內注射、丘腦內注射、大池內注射、軟膜下注射或其任何組合。在一些情形中,該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率大於1.0。在一些情形中,該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率為1.1至1.8 (例如1.1至1.4、1.4至1.6或1.6至1.8)。在一些情形中,該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率大於1.8 (例如2.0、2.0至2.2、2.2至2.4、2.4至2.6、2.6至2.8、2.8至3.0)。
本揭示案提供用於減少或抑制哺乳動物細胞中含CAG重複序列之RNA (例如mRNA或前mRNA)之表現的方法,其包括向該哺乳動物細胞中引入雙股RNA,該雙股RNA自5’至3’包含:
(a) 5’前導序列;
(b) 5’莖,其包含或實質上包含隨從序列;
(c) 5’連接體;
(d) 末端環;
(e) 3’連接體;
(f) 3’莖,其包含或實質上包含引導序列;及
(g) 3’尾曳序列;
其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA (例如mRNA或前mRNA)之CAG重複序列區;且其中該雙股RNA由該哺乳動物細胞裂解,以產生包含該引導序列及該隨從序列之siRNA,其中該siRNA之引導序列相對於CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,該等鹼基失配位於該siRNA之引導序列之8-16位。
在一些實施例中,抑制含CAG重複序列之mRNA之表現包含抑制由含CAG重複序列之mRNA編碼的含聚麩醯胺酸之蛋白質的表現,諸如藉由結合至含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區並阻斷含CAG重複序列之蛋白質的轉譯,而不是藉由降解含CAG重複序列之mRNA。
在一些實施例中,該方法減少或抑制含CAG重複序列之RNA之病理性或致病性等位基因之表現。在一些實施例中,與含CAG重複序列之RNA之正常等位基因的表現相比,該方法選擇性地減少或抑制含CAG重複序列之RNA之病理性或致病性等位基因的表現。
在一些實施例中,雙股RNA含於前miRNA支架、初級miRNA支架或shRNA內。在一些實施例中,雙股RNA由哺乳動物細胞中之DROSHA及/或DICER裂解以產生siRNA。
在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之至少一個失配位於siRNA引導序列之8-12位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之至少一個失配位於siRNA引導序列之9-11位。在一些實施例中,位於siRNA引導序列之8-16位的相對於CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的。在一些實施例中,位於siRNA引導序列之8-16位的相對於CAG重複序列區之至少一個失配不與位於siRNA引導序列之8-16位的另一失配毗鄰。
在一些實施例中,5’前導序列不與3’尾曳序列互補。在一些實施例中,5’前導序列與3’尾曳序列部分互補。在一些實施例中,3’尾曳序列包含聚U尾。在一些實施例中,聚U尾具有3至6個尿苷。
在一些實施例中,5’前導序列及/或3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約500個核苷酸。在一些實施例中,5’前導序列及/或3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約400個核苷酸、約1個核苷酸至約300個核苷酸、約1個核苷酸至約200個核苷酸、約1個核苷酸至約100個核苷酸、約1個核苷酸至約75個核苷酸、約1個核苷酸至約50個核苷酸、約1個核苷酸至約25個核苷酸、約1個核苷酸至約20個核苷酸、約1個核苷酸至約15個核苷酸或約1個核苷酸至約10個核苷酸。
在一些實施例中,引導序列具有約15至約30個核苷酸。在一些實施例中,引導序列具有約19至約24個核苷酸。在一些實施例中,引導序列具有表B1-表B2中所示之核苷酸序列。在一些實施例中,隨從序列與引導序列100%互補。在一些實施例中,隨從序列與引導序列部分互補。在一些實施例中,隨從序列相對於引導序列包含一至十個或一至五個鹼基失配或凸起。
在一些實施例中,5’連接體與3’連接體100%互補。
在一些實施例中,末端環具有約4個核苷酸至約1,000個核苷酸、約4個核苷酸至約900個核苷酸、約4個核苷酸至約800個核苷酸、約4個核苷酸至約700個核苷酸、約4個核苷酸至約600個核苷酸、約4個核苷酸至約500個核苷酸、約4個核苷酸至約400個核苷酸、約4個核苷酸至約300個核苷酸、約4個核苷酸至約200個核苷酸、約4個核苷酸至約100個核苷酸、約4個核苷酸至約90個核苷酸、約4個核苷酸至約80個核苷酸、約4個核苷酸至約70個核苷酸、約4個核苷酸至約50個核苷酸、約4個核苷酸至約40個核苷酸、約4個核苷酸至約30個核苷酸、約4個核苷酸至約20個核苷酸、約4個核苷酸至約15個核苷酸或約4個核苷酸至約10個核苷酸。本文闡述雙股RNA之其他特徵。
在一些實施例中,該方法包括將包含編碼雙股RNA之核酸的載體引入至哺乳動物細胞中。在一些實施例中,編碼雙股RNA之核酸可操作地連接至啟動子。在一些實施例中,啟動子為RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子。
在一些實施例中,哺乳動物細胞中由雙股RNA產生且相對於CAG重複序列區具有1-5個鹼基失配(位於引導序列8-16位內之預測位置)之siRNA的豐度為哺乳動物細胞中由雙股RNA產生之siRNA的豐度之至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。可藉由獲得具有正確加工之5’端且與含參考CAG重複序列區之參考轉錄本對齊之RNA序列讀段數,且除以與含參考CAG重複序列區之參考轉錄本對齊的siRNA之RNA序列讀段總數來量測由雙股RNA正確加工之siRNA之豐度%。
在一些實施例中,含CAG重複序列之mRNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。在一些實施例中,含CAG重複序列之mRNA含有擴增數目之重複序列。
在一些實施例中,哺乳動物細胞為CNS細胞。在一些實施例中,哺乳動物細胞為CNS之非神經元細胞或神經元細胞。在一些實施例中,CNS之非神經元細胞為神經膠質細胞、星狀細胞或小神經膠質細胞。在一些實施例中,哺乳動物細胞在活體外。在一些實施例中,哺乳動物細胞為非CNS細胞。在一些實施例中,哺乳動物細胞為纖維母細胞。在一些實施例中,哺乳動物細胞來自患有聚麩醯胺酸疾病之一或多種症狀或疑似患有聚麩醯胺酸疾病或具有聚麩醯胺酸疾病傾向之個體。
本揭示案提供減少或抑制有需要之個體中含CAG重複序列之mRNA之表現的方法,其包括向該個體投與編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子(例如DNA)、包含編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子的表現盒;包含編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子的載體;或其醫藥組合物。
在一些實施例中,抑制含CAG重複序列之mRNA之表現包含抑制由含CAG重複序列之mRNA編碼的含聚麩醯胺酸之蛋白質的表現,諸如藉由結合至含CAG重複序列之mRNA之CAG重複序列區並阻斷或阻遏含CAG重複序列之蛋白質的轉譯,而不是藉由降解含CAG重複序列之mRNA。
在一些實施例中,含CAG重複序列之mRNA或前mRNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
在一些實施例中,含CAG重複序列之mRNA或前mRNA含有擴增數目之重複序列。在一些實施例中,個體患有聚麩醯胺酸疾病,此意味著展現出聚麩醯胺酸疾病之症狀。在一些實施例中,個體處於發生聚麩醯胺酸疾病之風險下,但尚未顯示出聚麩醯胺酸疾病之徵象。在一些實施例中,聚麩醯胺酸疾病與以下相關:HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。在一些實施例中,聚麩醯胺酸疾病為神經退化性疾病。在一些實施例中,個體患有亨庭頓氏病、1型脊髓小腦性失調症、2型脊髓小腦性失調症、3型脊髓小腦性失調症、6型脊髓小腦性失調症、7型脊髓小腦性失調症、12型脊髓小腦性失調症、17型脊髓小腦性失調症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、脊髓延髓肌肉萎縮、齒狀紅核蒼白球萎縮症、顱骨鎖骨發育不良、色素性視網膜炎、肌強直性營養不良1或鰓耳腎發育不良症候群2,或處於發生亨庭頓氏病、1型脊髓小腦性失調症、2型脊髓小腦性失調症、3型脊髓小腦性失調症、6型脊髓小腦性失調症、7型脊髓小腦性失調症、12型脊髓小腦性失調症、17型脊髓小腦性失調症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、脊髓延髓肌肉萎縮、齒狀紅核蒼白球萎縮症、顱骨鎖骨發育不良、色素性視網膜炎、肌強直性營養不良1或鰓耳腎發育不良症候群2之風險下,但尚未顯示出疾病徵象。
本揭示案亦提供治療患有聚麩醯胺酸疾病或處於發生聚麩醯胺酸疾病之風險下的個體之方法,其包括向該個體投與編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子(例如DNA)、包含編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子的表現盒;包含編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子的載體;或其醫藥組合物。
如本文所用,術語「治療」係指預防或延遲聚麩醯胺酸疾病之發作;降低聚麩醯胺酸疾病之嚴重程度;減少或預防聚麩醯胺酸疾病之特徵性症狀之發展;預防聚麩醯胺酸疾病之特徵性症狀之惡化;或其任何組合。在一些實施例中,對個體之治療涉及患有聚麩醯胺酸疾病或處於發生聚麩醯胺酸疾病之風險下但尚未顯示出聚麩醯胺酸疾病徵象之個體。
在一些實施例中,本揭示案之治療方法包括作為單一療法或與一或多種用於治療聚麩醯胺酸疾病之其他療法組合投與。組合療法可意指與一或多種其他療法同時、在其之前、在其之後向個體投與本揭示案之組合物(例如編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子(例如DNA)、包含編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子的表現盒;包含編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子的載體或其醫藥組合物)。組合療法之同時投與可意指本揭示案之組合物(例如編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子(例如DNA)、包含編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子的表現盒;包含編碼本揭示案之雙股RNA之核酸分子的載體或其醫藥組合物)及其他療法經調配以供以相同劑型投與或以單獨劑型投與。
本揭示案亦提供增加細胞中靶向含CAG重複序列之RNA的經加工人工miRNA之豐度的方法,其中該人工miRNA由病毒載體編碼,該等方法包括向該細胞投與:
(a) 編碼根據本文所闡述任一實施例之雙股RNA之病毒載體;或(b)編碼根據本文所闡述任一實施例之人工miRNA之病毒載體,其中該人工miRNA包含引導序列、隨從序列及視情況末端環,其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。
在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之至少一個失配位於引導序列之8-12位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之至少一個失配位於引導序列之9-11位。在一些實施例中,位於引導序列之8-16位的相對於CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的。
在一些實施例中,引導序列包含選自表B1-表B2之序列或由其組成。
在一些實施例中,人工miRNA進一步包含5’前導序列及3’尾曳序列。在一些實施例中,人工miRNA包含選自表E之5’前導序列、3’尾曳序列及環序列。
在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA為mRNA或前mRNA轉錄本。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
在一些實施例中,經加工人工miRNA之豐度為至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多。可藉由獲得具有正確加工之5’端且與含參考CAG重複序列區之參考轉錄本對齊之RNA序列讀段數,且除以與含參考CAG重複序列區之參考轉錄本對齊的人工miRNA之RNA序列讀段總數來量測正確加工之人工miRNA之豐度%。
在一些實施例中,經加工之人工miRNA靶向含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因。在一些實施例中,與含CAG重複序列之RNA之正常等位基因相比,經加工之人工miRNA選擇性地靶向含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因含有至少30個連續CAG重複序列。
在一些實施例中,細胞在個體體內。在一些實施例中,個體為人類。在一些實施例中,個體患有或疑似患有CAG重複序列擴增病症。
本揭示案亦提供抑制細胞中含CAG重複序列之RNA之表現的方法,其包括向該細胞投與:(a)編碼根據本文所闡述任一實施例之雙股RNA之病毒載體;或 (b)編碼人工miRNA之病毒載體,其中該人工miRNA包含引導序列、隨從序列及視情況末端環,其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。
在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之至少一個失配位於引導序列之8-12位。在一些實施例中,相對於CAG重複序列區之至少一個失配位於引導序列之9-11位。在一些實施例中,位於引導序列之8-16位的相對於CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的。在一些實施例中,引導序列相對於CAG重複序列區包含3、4或5個鹼基失配。
在一些實施例中,引導序列包含選自表B1-表B2之序列或由其組成。
在一些實施例中,C1(b)之人工miRNA進一步包含5’前導序列及3’尾曳序列。在一些實施例中,人工miRNA包含選自表E之5’前導序列、3’尾曳序列及環序列。
在一些實施例中,經加工之人工miRNA靶向含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因。在一些實施例中,與含CAG重複序列之RNA之正常等位基因相比,經加工之人工miRNA選擇性地靶向含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因含有至少30個連續CAG重複序列。
在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA為mRNA或前mRNA轉錄本。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
在一些實施例中,人工miRNA之引導序列具有0個預測完全匹配之靶外轉錄本。在一些實施例中,人工miRNA之引導序列具有0-1個在引導序列之1-21位內具有完全17 mer匹配之預測靶外轉錄本。在一些實施例中,人工miRNA之引導序列具有0個預測完全匹配之靶外轉錄本。在一些實施例中,人工miRNA之引導序列具有0-4個在引導序列之1-21位內具有完全17 mer匹配之預測靶外轉錄本。在一些實施例中,具有一個取代之人工miRNA之引導序列具有0-2個預測之靶外轉錄本。在一些實施例中,人工miRNA之引導序列具有如表B4中所示之預測靶外轉錄本特徵。
在一些實施例中,細胞在個體體內。在一些實施例中,個體為人類。在一些實施例中,個體患有或疑似患有CAG重複序列擴增病症。
在一些實施例中,以本文所闡述之任一方法治療之個體為哺乳動物(例如小鼠、大鼠)、較佳靈長類動物(例如猴、黑猩猩)或人類。
在本文所闡述之任一治療方法中,可藉由鞘內、軟膜下、實質內、紋狀體內、顱內、腦池內、大腦內、大腦室內、眼內、室內、腰內、眼內、非經腸、靜脈內、肌內、動脈內、皮下、經皮、皮內、經直腸、陰道內、腹膜內、黏膜投與或其任何組合向個體投與本揭示案之組合物(例如根據本揭示案之編碼雙股RNA之核酸或表現盒、載體或醫藥組合物)。
在一些實施例中,將本揭示案之組合物(例如抑制性核酸、包含編碼抑制性核酸之表現盒的經分離核酸、載體、rAAV顆粒、醫藥組合物)直接注射至個體之CNS中。在一些實施例中,直接注射至CNS中為大腦內注射、實質內注射、鞘內注射、軟膜下注射或其任何組合。在一些實施例中,直接注射至CNS中為大腦室內注射。在一些實施例中,直接注射至CNS中為直接注射至個體之腦脊髓液(CSF)中,視情況其中該直接注射為腦池內注射、室內注射、腰內注射或其任何組合。在一些實施例中,藉由直接注射至CNS中與不直接注射至CNS中之途徑(例如靜脈內)之組合來完成對個體之投與。
在一些實施例中,與未與雙股RNA接觸之細胞中含CAG重複序列之mRNA之表現水準相比,本揭示案之方法將細胞中含CAG重複序列之RNA之表現或活性降低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或更多。在一些實施例中,與未與雙股RNA接觸之細胞中含CAG重複序列之mRNA之表現水準相比,本揭示案之方法將細胞中含CAG重複序列之mRNA之表現或活性降低10%-20%、10%-30%、10%-40%、10%-50%、10%-60%、10%-70%、10%-80%、10%-90%、10%-95%、20%-30%、20%-40%、20%-50%、20%-60%、20%-70%、20%-80%、20%-90%、20%-95%、20%-100%、30%-40%、30%-50%、30%-60%、30%-70%、30%-80%、30%-90%、30%-95%、30%-100%、40%-50%、40%-60%、40%-70%、40%-80%、40%-90%、40%-95%、40%-100%、50%-60%、50%-70%、50%-80%、50%-90%、50%-95%、50%-100%、60%-70%、60%-80%、60%-90%、60%-95%、60%-100%、70%-80%、70%-90%、70%-95%、70%-100%、80%-90%、80%-95%、80%-100%、90%-95%、90%-100%。在一些實施例中,本揭示案之方法降低含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因的表現或活性。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因含有至少30個連續CAG重複序列。
在一些實施例中,與未經治療個體之CNS中含CAG重複序列之mRNA之表現水準相比,本揭示案之方法在CNS中將個體CNS中含CAG重複序列之RNA之表現或活性降低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更多。在一些實施例中,與未經治療個體之CNS中含CAG重複序列之mRNA之表現水準相比,本揭示案之方法將個體CNS中含CAG重複序列之mRNA之表現或活性降低10%-20%、10%-30%、10%-40%、10%-50%、10%-60%、10%-70%、10%-80%、10%-90%、10%-95%、20%-30%、20%-40%、20%-50%、20%-60%、20%-70%、20%-80%、20%-90%、20%-95%、20%-100%、30%-40%、30%-50%、30%-60%、30%-70%、30%-80%、30%-90%、30%-95%、30%-100%、40%-50%、40%-60%、40%-70%、40%-80%、40%-90%、40%-95%、40%-100%、50%-60%、50%-70%、50%-80%、50%-90%、50%-95%、50%-100%、60%-70%、60%-80%、60%-90%、60%-95%、60%-100%、70%-80%、70%-90%、70%-95%、70%-100%、80%-90%、80%-95%、80%-100%、90%-95%、90%-100%。在一些實施例中,本揭示案之方法降低個體CNS中含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因的表現或活性。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因含有至少30個連續CAG重複序列。
在一些實施例中,本揭示案之方法用於選擇性降低含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因(在細胞中具有擴增之CAG重複序列)的表現或活性。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因含有至少30個連續CAG重複序列。在一些實施例中,與含CAG重複序列之RNA之正常(野生型)等位基因表現之降低相比,含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因的選擇性降低為至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍或更多。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA選自
HTT 、共濟失調蛋白 1 、共濟失調蛋白 2 、共濟失調蛋白 3 、 CACNA1A 、共濟失調蛋白 7 、 PPP2R2B 、 TBP 、雄激素受體、 Atrophin 、 MLLT3 、 BMP2K 、 THAP11 、 ZFHX3 、 POU3F2 、 MAML2 、 SMARCA2 、 MAML3 、 ORC4 、 RUNX2 、 MED12 、 EP400 、 MAGI1 、 UMAD1 、 DM1-AS 、 AC007161.3 、 IRF2BPL及
MAB21L1 。
在一些實施例中,本揭示案之方法用於選擇性降低個體CNS中含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因的表現或活性。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA之致病性或病理性等位基因含有至少30個連續CAG重複序列。在一些實施例中,與含CAG重複序列之RNA之正常(野生型)等位基因相比,含CAG重複序列之RNA(具有擴增之CAG重複序列)之選擇性降低為至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍或更多。在一些實施例中,個體患有或疑似患有CAG重複序列擴增疾病或病症。在一些實施例中,含CAG重複序列之RNA選自
HTT 、共濟失調蛋白 1 、共濟失調蛋白 2 、共濟失調蛋白 3 、 CACNA1A 、共濟失調蛋白 7 、 PPP2R2B 、 TBP 、雄激素受體、 Atrophin 、 MLLT3 、 BMP2K 、 THAP11 、 ZFHX3 、 POU3F2 、 MAML2 、 SMARCA2 、 MAML3 、 ORC4 、 RUNX2 、 MED12 、 EP400 、 MAGI1 、 UMAD1 、 DM1-AS 、 AC007161.3 、 IRF2BPL及
MAB21L1 。 本揭示案之非限制性態樣之實例 態樣集 A
上文所闡述之本發明標的物之態樣(包括實施例)單獨或與一或多個其他態樣或實施例組合可為有益的。在不限制前述說明之情形下,下文提供本揭示案之某些非限制性態樣。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案後將顯而易見,可使用個別編號之態樣中之每一者或與之前或之後個別編號之態樣中之任一者組合。此意欲為態樣之所有此等組合提供支持,且不限於下文所明確提供之態樣之組合:
態樣1. 一種雙股RNA,其自5’至3’包含:
(a) 5’前導序列;
(b) 5’莖,其包含隨從序列或引導序列;
(c)具有1-6個鹼基之5’連接體;
(d)末端環;
(e)具有1-6個鹼基之3’連接體;
(f) 3’莖,其包含:
(i) 引導序列,若該5’莖包含隨從序列;或
(ii) 隨從序列,若該5’莖包含引導序列;及
(g) 3’尾曳序列;
其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區,且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。
態樣2. 如態樣1之雙股RNA,其中該雙股RNA含於前miRNA支架、初級miRNA支架或shRNA內,視情況其中該前miRNA支架或該初級miRNA支架為mir-155支架、mir-33支架、mir-E支架或表E中所示支架中之任一者。
態樣3. 如態樣1或2之雙股RNA,其中該5’前導序列不與該3’尾曳序列互補。
態樣4. 如態樣1或2之雙股RNA,其中該5’前導序列與該3’尾曳序列部分互補。
態樣5. 如態樣1至4中任一項之雙股RNA,其中該3’尾曳序列包含聚U尾。
態樣6. 如態樣5之雙股RNA,其中該聚U尾具有3至6個U。
態樣7. 如態樣1至6中任一項之雙股RNA,其中該5’前導序列及/或該3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約500個核苷酸。
態樣8. 如態樣7之雙股RNA,其中該5’前導序列及/或該3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約400個核苷酸、約1個核苷酸至約300個核苷酸、約1個核苷酸至約200個核苷酸、約1個核苷酸至約100個核苷酸、約1個核苷酸至約75個核苷酸、約1個核苷酸至約50個核苷酸、約1個核苷酸至約25個核苷酸、約1個核苷酸至約20個核苷酸、約1個核苷酸至約15個核苷酸或約1個核苷酸至約10個核苷酸。
態樣9. 如態樣1至8中任一項之雙股RNA,其中:
(i) 該5’莖包含隨從序列且該5’前導序列包含該隨從序列5’端之一部分,及/或該3’莖包含引導序列且該3’尾曳序列包含該引導序列3’端之一部分;或
(ii) 該5’莖包含引導序列且該5’前導序列包含該引導序列5’端之一部分,及/或該3’莖包含隨從序列且該3’尾曳序列包含該隨從序列3’端之一部分。
態樣10. 如態樣1至9中任一項之雙股RNA,其中該引導序列具有約15至約30個核苷酸。
態樣11. 如態樣10之雙股RNA,其中該引導序列具有約19至約24個核苷酸。
態樣12. 如態樣1至11中任一項之雙股RNA,其中該引導序列具有選自表B1-表B2之核苷酸序列。
態樣13. 如態樣1至12中任一項之雙股RNA,其中該隨從序列與該引導序列100%互補。
態樣14. 如態樣1至12中任一項之雙股RNA,其中該隨從序列與該引導序列部分互補。
態樣15. 如態樣14之雙股RNA,其中該隨從序列相對於該引導序列包含一至五個鹼基失配或凸起。
態樣16. 如態樣1至15中任一項之雙股RNA,其中該5’連接體與該3’連接體100%互補。
態樣17. 如態樣1至16中任一項之雙股RNA,其中該末端環具有約4個核苷酸至約1,000個核苷酸、約4個核苷酸至約900個核苷酸、約4個核苷酸至約800個核苷酸、約4個核苷酸至約700個核苷酸、約4個核苷酸至約600個核苷酸、約4個核苷酸至約500個核苷酸、約4個核苷酸至約400個核苷酸、約4個核苷酸至約300個核苷酸、約4個核苷酸至約200個核苷酸、約4個核苷酸至約100個核苷酸、約4個核苷酸至約90個核苷酸、約4個核苷酸至約80個核苷酸、約4個核苷酸至約70個核苷酸、約4個核苷酸至約50個核苷酸、約4個核苷酸至約40個核苷酸、約4個核苷酸至約30個核苷酸、約4個核苷酸至約20個核苷酸、約4個核苷酸至約15個核苷酸或約4個核苷酸至約10個核苷酸。
態樣18. 如態樣1至17中任一項之雙股RNA,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該引導序列之8-12位。
態樣19. 如態樣17之雙股RNA,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該引導序列之9-11位。
態樣20. 如態樣1至19中任一項之雙股RNA,其中位於該引導序列之8-16位的相對於該CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的。
態樣21. 如態樣1至19中任一項之雙股RNA,其中位於8-16位的相對於該CAG重複序列區之至少一個失配不與位於8-16位之另一失配毗鄰。
態樣22. 如態樣1至21中任一項之雙股RNA,其中該引導序列中之1-5個鹼基失配不藉由沃森-克里克鹼基配對或藉由搖擺鹼基配對與該含CAG重複序列之mRNA之靶向CAG重複序列區的相應核苷酸鹼基配對。
態樣23. 如態樣1至22中任一項之雙股RNA,其中該雙股RNA經裂解以產生包含該引導序列及該隨從序列之shRNA。
態樣24. 如態樣23之雙股RNA,其中該雙股RNA由DROSHA裂解以產生該shRNA。
態樣25. 如態樣1至24中任一項之雙股RNA,其中該雙股RNA經裂解以產生包含該引導序列及該隨從序列之小干擾RNA (siRNA)。
態樣26. 如態樣25之雙股RNA,其中該雙股RNA由DROSHA及DICER裂解以產生該siRNA。
態樣27. 如態樣25或26之雙股RNA,其中該siRNA之該引導序列相對於該CAG重複序列區包含1-5個位於該引導序列之8-16位的鹼基失配。
態樣28. 如態樣23或24之雙股RNA,其中shRNA在其5’端或在其3’端具有懸突。
態樣29. 如態樣23或24之雙股RNA,其中該5’懸突或該3’懸突為約1-6個核苷酸。
態樣30. 如態樣23或24之雙股RNA,其中該shRNA不具有5’懸突或3’懸突。
態樣31. 如態樣23或24之雙股RNA,其中該shRNA具有約38至約50個核苷酸。
態樣32. 如態樣1至31中任一項之雙股RNA,其中該含CAG重複序列之RNA為mRNA或前mRNA轉錄本。
態樣33. 如態樣1至32中任一項之雙股RNA,其中該含CAG重複序列之RNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
態樣34. 一種雙股RNA,其包含:
A) 自5’至3’:
(a) 5’前導序列;
(b) 5’莖,其包含隨從序列或引導序列;
(c) 5’連接體;
(d) 末端環;
(e) 3’連接體;
(f) 3’莖,其包含:
(i) 引導序列,若該5’莖包含隨從序列;或
(ii) 隨從序列,若該5’莖包含引導序列;及
(g) 3’尾曳序列;
其中:
(i) 該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區,且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,且
(ii) 該雙股RNA經裂解以產生包含該引導序列及該隨從序列之小干擾RNA (siRNA),其中該siRNA之該引導序列相對於該CAG重複序列區包含1-5個位於該siRNA之該引導序列之8-16位的鹼基失配;或
B) 自5’至3’包含:
(i) 引導序列,其靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配;及
(ii) 隨從序列,其與該引導序列實質上互補,
其中
該雙股RNA經裂解以產生包含該引導序列及該隨從序列之siRNA,其中該siRNA之該引導序列相對於該CAG重複序列區包含1-5個位於該siRNA之該引導序列之8-16位的鹼基失配。
態樣35. 如態樣34之雙股RNA,其中該雙股RNA包含在前miRNA支架、初級miRNA支架或shRNA中,視情況其中該前miRNA支架或該初級miRNA支架為mir-155支架、mir-33支架、mir-E支架或表E中所示支架中之任一者。
態樣36. 如態樣34之雙股RNA,其中該雙股RNA由DROSHA及DICER裂解以產生該siRNA。
態樣37. 如態樣34或35之雙股RNA,其中該5’前導序列不與該3’尾曳序列互補。
態樣38. 如態樣34或35之雙股RNA,其中該5’前導序列與該3’尾曳序列部分互補。
態樣39. 如態樣34至38中任一項之雙股RNA,其中該3’尾曳序列包含聚T尾。
態樣40. 如態樣39之雙股RNA,其中該聚T尾具有3至6個T。
態樣41. 如態樣34至40中任一項之雙股RNA,其中該5’前導序列及/或該3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約500個核苷酸。
態樣42. 如態樣41之雙股RNA,其中該5’前導序列及/或該3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約400個核苷酸、約1個核苷酸至約300個核苷酸、約1個核苷酸至約200個核苷酸、約1個核苷酸至約100個核苷酸、約1個核苷酸至約75個核苷酸、約1個核苷酸至約50個核苷酸、約1個核苷酸至約25個核苷酸、約1個核苷酸至約20個核苷酸、約1個核苷酸至約15個核苷酸或約1個核苷酸至約10個核苷酸。
態樣43. 如態樣34至42中任一項之雙股RNA,其中:
(i) 該5’莖包含隨從序列且該5’前導序列包含該隨從序列5’端之一部分,及/或該3’莖包含引導序列且該3’尾曳序列包含該引導序列3’端之一部分;或
(ii) 該5’莖包含引導序列且該5’前導序列包含該引導序列5’端之一部分,及/或該3’莖包含隨從序列且該3’尾曳序列包含該隨從序列3’端之一部分。
態樣44. 如態樣34至43中任一項之雙股RNA,其中該引導序列具有約15至約30個核苷酸。
態樣45. 如態樣44之雙股RNA,其中該引導序列具有約19至約24個核苷酸。
態樣46. 如態樣34至45中任一項之雙股RNA,其中該引導序列具有選自表B1-表B2之核苷酸序列。
態樣47. 如態樣34至46中任一項之雙股RNA,其中該隨從序列與該引導序列100%互補。
態樣48. 如態樣34至46中任一項之雙股RNA,其中該隨從序列與該引導序列部分互補。
態樣49. 如態樣48之雙股RNA,其中該隨從序列相對於該引導序列包含一至五個鹼基失配或凸起。
態樣50. 如態樣34至49中任一項之雙股RNA,其中該5’連接體具有1-6個鹼基及/或該3’連接體具有1-6個鹼基。
態樣51. 如態樣34至50中任一項之雙股RNA,其中該5’連接體與該3’連接體100%互補。
態樣52. 如態樣34至51中任一項之雙股RNA,其中該末端環具有約4個核苷酸至約1,000個核苷酸、約4個核苷酸至約900個核苷酸、約4個核苷酸至約800個核苷酸、約4個核苷酸至約700個核苷酸、約4個核苷酸至約600個核苷酸、約4個核苷酸至約500個核苷酸、約4個核苷酸至約400個核苷酸、約4個核苷酸至約300個核苷酸、約4個核苷酸至約200個核苷酸、約4個核苷酸至約100個核苷酸、約4個核苷酸至約90個核苷酸、約4個核苷酸至約80個核苷酸、約4個核苷酸至約70個核苷酸、約4個核苷酸至約50個核苷酸、約4個核苷酸至約40個核苷酸、約4個核苷酸至約30個核苷酸、約4個核苷酸至約20個核苷酸、約4個核苷酸至約15個核苷酸或約4個核苷酸至約10個核苷酸。
態樣53. 如態樣34至52中任一項之雙股RNA,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該siRNA之該引導序列之8-12位。
態樣54. 如態樣53之雙股RNA,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該siRNA之該引導序列之9-11位。
態樣55. 如態樣34至54中任一項之雙股RNA,其中位於該siRNA之該引導序列之8-16位的相對於該CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的。
態樣56. 如態樣34至54中任一項之雙股RNA,其中位於該siRNA之該引導序列之8-16位的相對於該CAG重複序列區之至少一個失配不與位於該siRNA之該引導序列之8-16位的另一失配毗鄰。
態樣57. 如態樣34至56中任一項之雙股RNA,其中該siRNA之該引導序列中之1-5個鹼基失配不藉由沃森-克里克鹼基配對或藉由搖擺鹼基配對與該含CAG重複序列之mRNA之靶向CAG重複序列區的相應核苷酸鹼基配對。
態樣58. 如態樣34至57中任一項之雙股RNA,其中該含CAG重複序列之RNA為mRNA或前mRNA轉錄本。
態樣59. 如態樣34至58中任一項之雙股RNA,其中該含CAG重複序列之mRNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
態樣60. 一種核酸,其編碼如態樣1至59中任一項之雙股RNA。
態樣61. 一種包含如態樣60之核酸之表現盒,其可操作地連接至啟動子。
態樣62. 如態樣61之表現盒,其中該啟動子為RNA聚合酶啟動子。
態樣63. 如態樣62之表現盒,其中該RNA聚合酶啟動子為RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子。
態樣64. 如態樣63之表現盒,其中該RNA聚合酶III啟動子為U6、H1或7SK啟動子。
態樣65. 如態樣63之表現盒,其中該RNA聚合酶II啟動子為U1、CMV、PGK、CAG、EIF1α或突觸素啟動子。
態樣66. 如態樣61至65中任一項之表現盒,其中該表現盒側接5’腺相關病毒(AAV)反向末端重複(ITR)序列及3’ AAV ITR序列或其變異體。
態樣67. 如態樣66之表現盒,其中該等ITR序列中之一者缺少功能性末端解鏈位點。
態樣68. 如態樣66或67之表現盒,其中該5’ITR及該3’ ITR源自選自由以下組成之群的AAV血清型:AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRh10、AAV11及其變異體。
態樣69. 一種載體,其包含如態樣60之核酸分子或如態樣61至68中任一項之表現盒。
態樣70. 如態樣79之載體,其中該載體為腺相關病毒(AAV)載體。
態樣71. 如態樣70之AAV載體,其進一步包含衣殼蛋白,視情況其中該衣殼蛋白為AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRh10或AAV11衣殼蛋白。
態樣72. 如態樣70或71之AAV載體,其中該AAV載體為自補性AAV載體。
態樣73. 一種醫藥組合物或單位劑型,其包含如態樣60之核酸、如態樣61至68中任一項之表現盒或如態樣69至72中任一項之載體以及醫藥學上可接受之載劑。
態樣74. 一種降低有需要之個體中含CAG重複序列之RNA之表現的方法,其包括向該個體投與如態樣60之核酸、如態樣61至68中任一項之表現盒、如態樣69至72中任一項之載體或如態樣73之醫藥組合物。
態樣75. 如態樣74之方法,其中抑制含CAG重複序列之RNA之表現包含抑制由該含CAG重複序列之RNA編碼的含聚麩醯胺酸之蛋白質之表現。
態樣76. 如態樣74或75之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為mRNA或前mRNA轉錄本。
態樣77. 如態樣74至76中任一項之方法,其中該個體患有或疑似患有聚麩醯胺酸疾病,視情況其中該聚麩醯胺酸疾病與以下相關:HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
態樣78. 如態樣77之方法,其中該聚麩醯胺酸疾病為亨庭頓氏病、1型脊髓小腦性失調症、2型脊髓小腦性失調症、3型脊髓小腦性失調症、6型脊髓小腦性失調症、7型脊髓小腦性失調症、12型脊髓小腦性失調症、17型脊髓小腦性失調症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、脊髓延髓肌肉萎縮、齒狀紅核蒼白球萎縮症、顱骨鎖骨發育不良、色素性視網膜炎、肌強直性營養不良1或鰓耳腎發育不良症候群2。
態樣79. 如態樣74至78中任一項之方法,其中該投與包含直接注射至該個體之中樞神經系統(CNS)中。
態樣80. 如態樣79之方法,其中該直接注射為大腦內注射、實質內注射、鞘內注射、紋狀體內注射、軟膜下注射或其任何組合。
態樣81. 如態樣74至78中任一項之方法,其中該投與包含眼內、非經腸、靜脈內、肌內、動脈內、皮下、經皮、皮內、經直腸、陰道內、腹膜內或黏膜投與。
態樣82. 一種抑制哺乳動物細胞中含CAG重複序列之RNA之表現的方法,其包括向該哺乳動物細胞中引入雙股RNA,其自5’至3’包含:
(a) 5’前導序列;
(b) 5’莖,其包含隨從序列;
(c) 5’連接體;
(d) 末端環;
(e) 3’連接體;
(f) 3’莖,其包含引導序列;及
(g) 3’尾曳序列;
其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區;且
其中該雙股RNA由該哺乳動物細胞裂解以產生包含該引導序列及該隨從序列之siRNA,其中該siRNA之該引導序列相對於該CAG重複序列區包含1-5個位於該siRNA之該引導序列之8-16位的鹼基失配。
態樣83. 如態樣82之方法,其中抑制含CAG重複序列之mRNA之表現包含抑制由該含CAG重複序列之mRNA編碼的含聚麩醯胺酸之蛋白質之表現。
態樣84. 如態樣82之方法,其中該雙股RNA包含在前miRNA支架、初級miRNA支架或shRNA中。
態樣85. 如態樣82至84之方法,其中該雙股RNA由該哺乳動物細胞中之DROSHA及DICER裂解以產生該siRNA。
態樣86. 如態樣82至85中任一項之方法,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該siRNA之該引導序列之8-12位。
態樣87. 如態樣86之方法,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該siRNA之該引導序列之9-11位。
態樣88. 如態樣82至87中任一項之方法,其中位於該siRNA之該引導序列之8-16位的相對於該CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的。
態樣89. 如態樣82至88中任一項之方法,其中位於該siRNA之該引導序列之8-16位的相對於該CAG重複序列區之至少一個失配不與位於該siRNA之該引導序列之8-16位的另一失配毗鄰。
態樣90. 如態樣82至89中任一項之方法,其中該5’前導序列不與該3’尾曳序列互補。
態樣91. 如態樣82至89中任一項之方法,其中該5’前導序列與該3’尾曳序列部分互補。
態樣92. 如態樣82至91中任一項之方法,其中該3’尾曳序列包含聚U尾。
態樣93. 如態樣92之方法,其中該聚U尾具有3至6個尿苷。
態樣94. 如態樣82至93中任一項之方法,其中該5’前導序列及/或該3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約500個核苷酸。
態樣95. 如態樣94之方法,其中該5’前導序列及/或該3’尾曳序列之長度為約1個核苷酸至約400個核苷酸、約1個核苷酸至約300個核苷酸、約1個核苷酸至約200個核苷酸、約1個核苷酸至約100個核苷酸、約1個核苷酸至約75個核苷酸、約1個核苷酸至約50個核苷酸、約1個核苷酸至約25個核苷酸、約1個核苷酸至約20個核苷酸、約1個核苷酸至約15個核苷酸或約1個核苷酸至約10個核苷酸。
態樣96. 如態樣82至95中任一項之方法,其中該引導序列具有約15至約30個核苷酸。
態樣97. 如態樣82至95中任一項之方法,其中該引導序列具有約19至約24個核苷酸。
態樣98. 如態樣82至97中任一項之方法,其中該引導序列具有選自表B1-表B2之核苷酸序列集。
態樣99. 如態樣82至98中任一項之方法,其中該隨從序列與該引導序列100%互補。
態樣100. 如態樣82至98中任一項之方法,其中該隨從序列與該引導序列部分互補。
態樣101. 如態樣100之方法,其中該隨從序列相對於該引導序列包含一至五個鹼基失配或凸起。
態樣102. 如態樣82至101中任一項之方法,其中該5’連接體與該3’連接體100%互補。
態樣103. 如態樣82至102中任一項之方法,其中該末端環具有約4個核苷酸至約1,000個核苷酸、約4個核苷酸至約900個核苷酸、約4個核苷酸至約800個核苷酸、約4個核苷酸至約700個核苷酸、約4個核苷酸至約600個核苷酸、約4個核苷酸至約500個核苷酸、約4個核苷酸至約400個核苷酸、約4個核苷酸至約300個核苷酸、約4個核苷酸至約200個核苷酸、約4個核苷酸至約100個核苷酸、約4個核苷酸至約90個核苷酸、約4個核苷酸至約80個核苷酸、約4個核苷酸至約70個核苷酸、約4個核苷酸至約50個核苷酸、約4個核苷酸至約40個核苷酸、約4個核苷酸至約30個核苷酸、約4個核苷酸至約20個核苷酸、約4個核苷酸至約15個核苷酸或約4個核苷酸至約10個核苷酸。
態樣104. 如態樣82至103中任一項之方法,其包括將包含編碼該雙股RNA之核酸的載體引入至該哺乳動物細胞中。
態樣105. 如態樣104之方法,其中編碼該雙股RNA之該核酸可操作地連接至啟動子。
態樣106. 如態樣105之方法,其中該啟動子為RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子。
態樣107. 如態樣82至106中任一項之方法,其中該哺乳動物細胞中由該雙股RNA產生且相對於該CAG重複序列區具有1-5個位於引導序列之8-16位內的預測位置之鹼基失配之該等siRNA的豐度為由該哺乳動物細胞中之該雙股RNA產生的siRNA之豐度的至少10%。
態樣108. 如態樣82至107中任一項之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為mRNA或前mRNA轉錄本。
態樣109. 如態樣82至108中任一項之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
態樣110. 一種增加細胞中靶向含CAG重複序列之RNA的經加工人工miRNA之豐度的方法,其中該人工miRNA由病毒載體編碼,該方法包括向該細胞投與:
(a) 編碼如態樣1至59中任一項之雙股RNA之病毒載體;或
(b) 編碼該人工miRNA之病毒載體,其中該人工miRNA包含引導序列、隨從序列及視情況末端環,其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。
態樣111. 如態樣110之方法,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該引導序列之8-12位。
態樣112. 如態樣110之方法,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該引導序列之9-11位。
態樣113. 如態樣110至112中任一項之方法,其中位於該引導序列之8-16位的相對於該CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的。
態樣114. 如態樣110至113中任一項之方法,其中該引導序列包含選自表B1-表B2之序列或由其組成。
態樣115. 如態樣110至114中任一項之方法,其中態樣110(b)之該人工miRNA進一步包含5’前導序列及3’尾曳序列。
態樣116. 如態樣110至115中任一項之方法,其中該人工miRNA包含選自表E之5’前導序列、3’尾曳序列及環序列。
態樣117. 如態樣110至116中任一項之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為mRNA或前mRNA轉錄本。
態樣118. 如態樣110至117中任一項之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為含CAG重複序列之基因的病理性等位基因。
態樣119. 如態樣118之方法,其中該含CAG重複序列之基因的該病理性等位基因含有至少30個連續CAG重複序列。
態樣120. 如態樣110至119中任一項之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
態樣121. 如態樣110至120中任一項之方法,其中該經加工人工miRNA之豐度為至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多。
態樣122. 如態樣110至121中任一項之方法,其中該細胞在個體體內。
態樣123. 如態樣122之方法,其中該個體為人類。
態樣124. 如態樣123之方法,其中該個體患有CAG重複序列擴增病症。
態樣125. 一種抑制細胞中含CAG重複序列之RNA之表現的方法,其包括向該細胞投與:
(a) 編碼如態樣1至59中任一項之雙股RNA之病毒載體;或
(b) 編碼人工miRNA之病毒載體,其中該人工miRNA包含引導序列、隨從序列及視情況末端環,其中該引導序列靶向含CAG重複序列之RNA之CAG重複序列區且相對於該CAG重複序列區包含1-5個鹼基失配,其中該等鹼基失配位於該引導序列之8-16位。
態樣126. 如態樣125之方法,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該引導序列之8-12位。
態樣127. 如態樣125之方法,其中相對於該CAG重複序列區之至少一個失配位於該引導序列之9-11位。
態樣128. 如態樣125至127中任一項之方法,其中位於該引導序列之8-16位的相對於該CAG重複序列區之兩個或更多個失配係鄰接的。
態樣129. 如態樣125至128中任一項之方法,其中該引導序列相對於該CAG重複序列區包含3、4或5個鹼基失配。
態樣130. 如態樣125至129中任一項之方法,其中該引導序列包含選自表B1-表B2之序列或由其組成。
態樣131. 如態樣125至130中任一項之方法,其中C1(b)之該人工miRNA進一步包含5’前導序列及3’尾曳序列。
態樣132. 如態樣125至131中任一項之方法,其中該人工miRNA包含選自表E之5’前導序列、3’尾曳序列及環序列。
態樣133. 如態樣125至132中任一項之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為mRNA或前mRNA轉錄本。
態樣134. 如態樣125至133中任一項之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為含CAG重複序列之基因的病理性等位基因。
態樣135. 如態樣134之方法,其中該含CAG重複序列之基因的該病理性等位基因含有至少30個連續CAG重複序列。
態樣136. 如態樣125至135中任一項之方法,其中該含CAG重複序列之RNA為HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
態樣137. 如態樣125至136中任一項之方法,其中該人工miRNA之引導序列具有0個預測完全匹配之靶外轉錄本。
態樣138. 如態樣125至137中任一項之方法,其中該人工miRNA之引導序列具有0-1個在1-21位內具有完全17 mer匹配之預測靶外轉錄本。
態樣139. 如態樣125至138中任一項之方法,其中該人工miRNA之引導序列具有0-2個具有一個失配之預測匹配之靶外轉錄本。
態樣140. 如態樣125至139中任一項之方法,其中該人工miRNA之引導序列具有如表B4中所示之預測靶外轉錄本特徵。
態樣141. 如態樣125至140中任一項之方法,其中該細胞在個體體內。
態樣142. 如態樣141之方法,其中該個體為人類。
態樣143. 如態樣142之方法,其中該個體患有CAG重複序列擴增病症。
態樣144. 一種治療有需要之個體的聚麩醯胺酸擴增疾病之方法,其包括向該個體投與如態樣60之核酸、如態樣61至68中任一項之表現盒、如態樣69至72中任一項之載體或如態樣73之醫藥組合物。
態樣145. 如態樣144之方法,其中該聚麩醯胺酸擴增疾病與以下相關:HTT、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、CACNA1A、共濟失調蛋白7、PPP2R2B、TBP、雄激素受體、Atrophin、MLLT3、BMP2K、THAP11、ZFHX3、POU3F2、MAML2、SMARCA2、MAML3、ORC4、RUNX2、MED12、EP400、MAGI1、UMAD1、DM1-AS、AC007161.3、IRF2BPL或MAB21L1。
態樣146. 如態樣144之方法,其中該聚麩醯胺酸擴增疾病為亨庭頓氏病、1型脊髓小腦性失調症、2型脊髓小腦性失調症、3型脊髓小腦性失調症、6型脊髓小腦性失調症、7型脊髓小腦性失調症、12型脊髓小腦性失調症、17型脊髓小腦性失調症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、脊髓延髓肌肉萎縮、齒狀紅核蒼白球萎縮症、顱骨鎖骨發育不良、色素性視網膜炎、肌強直性營養不良1或鰓耳腎發育不良症候群2。
態樣147. 如態樣144至146中任一項之方法,其中該投與包含直接注射至該個體之中樞神經系統(CNS)中。
態樣148. 如態樣147之方法,其中該直接注射為大腦內注射、實質內注射、鞘內注射、紋狀體內注射、軟膜下注射或其任何組合。
態樣149. 如態樣144至146中任一項之方法,其中該投與包含眼內、非經腸、靜脈內、肌內、動脈內、皮下、經皮、皮內、經直腸、陰道內、腹膜內或黏膜投與。
態樣集 B
上文所闡述之本發明標的物之態樣(包括實施例)單獨或與一或多個其他態樣或實施例組合可為有益的。在不限制前述說明之情形下,下文提供本揭示案之某些非限制性態樣。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案後將顯而易見,可使用個別編號之態樣中之每一者或與之前或之後個別編號之態樣中之任一者組合。此意欲為態樣之所有此等組合提供支持,且不限於下文所明確提供之態樣之組合:
態樣1. 一種雙股RNA,其包含
a) 第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及
b) 第二股,其與該第一股雜交,
其中該第一股包含:
i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配;及
ii) 與該靶標CAG重複序列區之至少第二失配,
其中:
i) 當該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處;
ii) 當該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867
(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處;
iii) 當該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處;且
iv) 當該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於11位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣2. 如態樣1之雙股RNA,其中每一失配由獨立地選自以下之取代產生:
a) 用A、U或C取代G;
b) 用A、G或C取代U;
c) 用A、U或G取代C。
態樣3. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含:
i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位;及
ii) 與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣4. 如態樣1至3中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣5. 如態樣1至3中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣6. 如態樣1至3中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣7. 如態樣3至6中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過2個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣8. 如態樣3至6中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣9. 如態樣3至6中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣10. 如態樣3或態樣4之雙股RNA,其中該第一股包含選自以下之核苷酸序列:
i) CUGCUGCAACUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:317) (CUG_NA_B);
ii) CUGCUGCAGAUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:318) (CUG_NA_C);
iii) CUGCUGCAGCAGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:319) (CUG_NA_D);
iv) CUGCUGCAGCUACUGCUGCUG (SEQ ID NO:320) (CUG_NA_E);
v) CUGCUGCAGCUGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:321) (CUG_NA_F);
vi) CUGCUGCAGCUGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:322) (CUG_NA_G);
vii) CUGCUGCAGCUGCUACUGCUG (SEQ ID NO:323) (CUG_NA_H);及
viii) CUGCUGCAGCUGCUGAUGCUG (SEQ ID NO: 324) (CUG_NA_I)。
態樣11. 如態樣3或態樣4之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:804-819之核苷酸序列。
態樣12. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位;其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣13. 如態樣1、2及12中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣14. 如態樣1、2及12中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,且其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣15. 如態樣1、2及12中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,且其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣16. 如態樣12至15中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣17. 如態樣12至15中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣18. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位;其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣19. 如態樣1、2及18中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣20. 如態樣1、2及18中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣21. 如態樣1、2及18中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
態樣22. 如態樣18至21中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣23. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含:
i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位,及
ii) 與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣24. 如態樣1、2及23中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於9位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣25. 如態樣1、2及23中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣26. 如態樣1、2及23中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣27. 如態樣23之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:298-304之核苷酸序列。
態樣28. 如態樣23至27中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過2個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣29. 如態樣23至27中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣30. 如態樣23至27中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣31. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣32. 如態樣1、2及31中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣33. 如態樣1、2及31中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣34. 如態樣1、2及31中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣35. 如態樣31至34中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣36. 如態樣31至34中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣37. 如態樣31之雙股RNA,其中該第一股包含選自以下之核苷酸序列:
i) CUGCUGCUAAAGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:325) (CUG_307);
ii) CUGCUGCUAAUACUGCUGCUG (SEQ ID NO:326) (CUG_334);
iii) CUGCUGCUAAUGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:327) (CUG_361);
iv) CUGCUGCUAAUGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:328) (CUG_388);
v) CUGCUGCUAAUGCUACUGCUG (SEQ ID NO:329) (CUG_415);
vi) CUGCUGCUACAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:330) (CUG_631);
vii) CUGCUGCUACAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:331) (CUG_658);
viii) CUGCUGCUACAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:332) (CUG_712);
ix) CUGCUGCUAAUGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:336) (CUG_442);
x) CUGCUGCUACAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:337) (CUG_604);及
xi) CUGCUGCUACAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:338) (CUG_685)。
態樣38. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣39. 如態樣1、2及38中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO: 743)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣40. 如態樣1、2及38中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣41. 如態樣1、2及38中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
態樣42. 如態樣38至41中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣43. 如技術方案38之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:341-344之核苷酸序列。
態樣44. 如技術方案38之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:347-367之核苷酸序列。
態樣45. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含:
i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位;及
ii) 與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣46. 如態樣1、2或45中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,且其中該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣47. 如態樣1、2或45中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,且其中該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣48. 如態樣1、2或45中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,且其中該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣49. 如態樣45至48中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過2個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣50. 如態樣45至48中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣51. 如態樣45至48中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣52. 如態樣45之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:305-310之核苷酸序列。
態樣53. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣54. 如態樣1、2或53中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣55. 如態樣1、2或53中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣56. 如態樣1、2或53中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣57. 如態樣53至56中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣58. 如態樣53至56中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣59. 如態樣53之雙股RNA,其中該第一股包含選自以下之核苷酸序列:
i) CUGCUGCUGAAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:333) (CUG_2116);
ii) CUGCUGCUGAAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:334) (CUG_2143);
iii) CUGCUGCUGAAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:335) (CUG_2170);
iv) CUGCUGCUGAAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:339) (CUG_2089);及
v) CUGCUGCUGAAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:340) (CUG_2197)。
態樣60. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣61. 如態樣1、2或60之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣62. 如態樣1、2或60之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣63. 如態樣1、2或60之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
態樣64. 如態樣60至63中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣65. 如態樣60之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:345、346及368-375之核苷酸序列。
態樣66. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含:
i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743
(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於11位;及
ii) 與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣67. 如態樣1、2及66中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列
CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣68. 如態樣1、2及66中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣69. 如態樣1、2及66中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列
UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於11位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣70. 如態樣66至69中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過2個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣71. 如態樣66至69中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣72. 如態樣66至69中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣73. 如態樣66之雙股RNA,其中該第一股包含選自以下之核苷酸序列:
i) CUGCUGCUGCAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:311) (CUG_217);
ii) CUGCUGCUGCAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:312) (CUG_226);
iii) CUGCUGCUGCAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:313) (CUG_235);
iv) CUGCUGCUGCAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:314) (CUG_244);及
v) CUGCUGCUGCAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:315) (CUG_253)。
態樣74. 如態樣66之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:793-803之核苷酸序列。
態樣75. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於11位;且其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣76. 如態樣1、2及75中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列
CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣77. 如態樣1、2及75中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列
GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣78. 如態樣1、2及75中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列
UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣79. 如態樣75至78中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣80. 如態樣75至78中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣81. 如態樣1或態樣2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配位於11位(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866
(GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)),其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣82. 如態樣1、2及81中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列
CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣83. 如態樣1、2及81中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列
GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣84. 如態樣1、2及81中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列
UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
態樣85. 如態樣81至84中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
態樣86. 如態樣1至85中任一項之雙股RNA,其中該第二股與該第一股100%互補。
態樣87. 如態樣1至85中任一項之雙股RNA,其中該第二股包含與該第一股之1至10個失配、3至5個失配、4至7個失配或5至10個失配。
態樣88. 如態樣1至85中任一項之雙股RNA,其中該雙股RNA之長度為18個鹼基至25個核苷酸、19至25個核苷酸、19至23個核苷酸或19至21個核苷酸。
態樣89. 如態樣1至85中任一項之雙股RNA,其中該雙股RNA之長度為21個核苷酸至25個核苷酸。
態樣90. 一種DNA分子,其包含編碼如態樣1至89中任一項中所陳述之第一股的核苷酸序列,其中該核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。
態樣91. 一種重組核酸,其包含:
a1) 如態樣1至89中任一項之雙股RNA;及
b1) 微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸,
其中該重組核酸包含:
i) 該5’側接多核苷酸;
ii) 該雙股RNA之該第一股;
iii) 該環多核苷酸;
iv) 該雙股RNA之該第二股;及
iv) 該3’側接多核苷酸;
其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源;或
a2) 如態樣1至89中任一項之雙股RNA;及
b2) 微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸,
其中該重組核酸包含:
i) 該5’側接多核苷酸;
ii) 該雙股RNA之該第二股;
iii) 該環多核苷酸;
iv) 該雙股RNA之該第一股;及
v) 該3’側接多核苷酸;
其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源;或
a3) 如態樣1至89中任一項之雙股RNA;及
b3) 微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸,
其中該重組核酸包含:
i) 該5’側接多核苷酸;
ii) 該雙股RNA之該第一股;
iii) 該雙股RNA之該第二股;及
iv) 該3’側接多核苷酸;
其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源;或
a4) 如態樣1至89中任一項之雙股RNA;及
b4) 微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸,
其中該重組核酸包含:
i) 該5’側接多核苷酸;
ii) 該雙股RNA之該第二股;
iii) 該雙股RNA之該第一股;及
iv) 該3’側接多核苷酸;
其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。
態樣92. 如態樣91之重組核酸,其中該重組核酸包含:
a) 該5’側接多核苷酸;
b) 該雙股RNA之該第一股;
c) 該環多核苷酸;
d) 該雙股RNA之該第二股;及
e) 該3’側接多核苷酸。
態樣93. 如態樣91或態樣92之重組核酸,其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸源自miR33。
態樣94. 如態樣91之重組核酸,其中該重組核酸包含:
a) 該5’側接多核苷酸;
b) 該雙股RNA之該第一股;
c) 該雙股RNA之該第二股;及
d) 該3’側接多核苷酸。
態樣95. 如態樣91或態樣94之重組核酸,其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸源自miR451。
態樣96. 一種DNA分子,其包含編碼如態樣91至95中任一項之重組核酸之核苷酸序列。
態樣97. 如態樣96之DNA分子,其中該5’側接多核苷酸係由核苷酸序列tgcacacctcctggcgggcagctctg (SEQ ID NO:738)編碼。
態樣98. 如態樣96或態樣97之DNA分子,其中該環多核苷酸係由核苷酸序列tgttctggcaatacctg (SEQ ID NO:739)編碼。
態樣99. 如態樣96至98中任一項之DNA分子,其中該3’側接多核苷酸係由核苷酸序列gggaggcctgccctgactgcccac (SEQ ID NO:740)編碼。
態樣100. 如態樣96至99中任一項之DNA分子,其包含SEQ ID NO:579-656中之任一者中所示之核苷酸序列。
態樣101. 如態樣96之DNA分子,其中該5’側接多核苷酸係由核苷酸序列acctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:854)編碼。
態樣102. 如態樣96或態樣101之DNA分子,其中該3’側接多核苷酸係由核苷酸序列
tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaac (SEQ ID NO:855)編碼。
態樣103. 如態樣96之DNA分子,其中:
i) 該5’側接多核苷酸係由核苷酸序列
acctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:854)編碼;
ii) 該3’側接多核苷酸係由核苷酸序列
tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaac (SEQ ID NO:855)編碼;且
iii) 該第一股或該第二股係由SEQ ID NO:379-456中之任一者中所示之核苷酸序列編碼。
態樣104. 如態樣96之DNA分子,其中該5’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:856中所示之核苷酸序列編碼。
態樣105. 如態樣96或態樣104之DNA分子,其中該3’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:857中所示之核苷酸序列編碼。
態樣106. 如態樣96之DNA分子,其中:
i) 該5’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:856中所示之核苷酸序列編碼;
ii) 該3’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:857中所示之核苷酸序列編碼;且
iii) 該第一股或該第二股係由SEQ ID NO:379-456中之任一者中所示之核苷酸序列編碼。
態樣107. 如態樣96之DNA分子,其中該5’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:858中所示之核苷酸序列編碼。
態樣108. 如態樣96或態樣107之DNA分子,其中該3’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:859中所示之核苷酸序列編碼。
態樣109. 如態樣96之DNA分子,其中:
i) 該5’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:858中所示之核苷酸序列編碼;
ii) 該3’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:859中所示之核苷酸序列編碼;且
iii) 該第一股或該第二股係由SEQ ID NO:379-456中之任一者中所示之核苷酸序列編碼。
態樣110. 一種重組表現載體,其包含如態樣96至109中任一項之DNA分子。
態樣111. 如態樣110之重組表現載體,其中該核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。
態樣112. 如態樣111之重組表現載體,其中該啟動子為RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子。
態樣113. 如態樣111或態樣112之重組表現載體,其中該啟動子為CAG啟動子、CBA啟動子、CMV啟動子、U6啟動子、EF1α啟動子或H1啟動子。
態樣114. 如態樣110至113中任一項之重組表現載體,其中該重組表現載體包含5’腺相關病毒(AAV)反向末端重複(ITR)序列及3’ AAV ITR序列。
態樣115. 一種重組表現載體,其包含編碼如態樣91至95中任一項之重組核酸之核苷酸序列。
態樣116. 如態樣115之重組表現載體,其中該核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。
態樣117. 如態樣116之重組表現載體,其中該啟動子為RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子。
態樣118. 如態樣116或態樣117之重組表現載體,其中該啟動子為CAG啟動子、CBA啟動子、CMV啟動子、U6啟動子、EF1α啟動子或H1啟動子。
態樣119. 如態樣115至118中任一項之重組表現載體,其中該重組表現載體包含5’腺相關病毒(AAV)反向末端重複(ITR)序列及3’ AAV ITR序列。
態樣120. 一種遞送運載體,其包含如態樣110至119中任一項之重組表現載體。
態樣121. 如態樣120之遞送運載體,其中該遞送運載體為非病毒遞送運載體。
態樣122. 如態樣121之遞送運載體,其中該遞送運載體為脂質奈米顆粒。
態樣123. 如態樣120之遞送運載體,其中該遞送運載體為病毒顆粒。
態樣124. 一種病毒顆粒,其包含如態樣110至119中任一項之重組表現載體。
態樣125. 如態樣126之病毒顆粒,其中該病毒顆粒為腺相關病毒(AAV)顆粒。
態樣126. 如態樣125之病毒顆粒,其中該AAV顆粒包含AAV9衣殼。
態樣127. 如態樣125之病毒顆粒,其中該AAV顆粒包含AAV2衣殼。
態樣128. 一種組合物,其包含:
a) 如態樣110至119中任一項之重組表現載體;及
b) 醫藥學上可接受之賦形劑。
態樣129. 一種組合物,其包含:
a)如態樣120至123中任一項之遞送運載體;及
b)醫藥學上可接受之賦形劑。
態樣130. 一種組合物,其包含:
a) 病毒顆粒,其包含如態樣124至127中任一項之重組表現載體;及
b) 醫藥學上可接受之賦形劑。
態樣131. 一種選擇性地減少患有CAG重複序列擴增病症之個體的含疾病相關CAG重複序列之RNA之轉譯的方法,該方法包括向該個體投與有效量的如態樣110至119中任一項之表現載體、如態樣120至123中任一項之遞送運載體、如態樣124至127中任一項之病毒顆粒或如態樣128至130中任一項之醫藥組合物。
態樣132. 如態樣131之方法,其中該重複序列擴增病症為亨庭頓氏病、1型脊髓小腦性失調症、2型脊髓小腦性失調症、3型脊髓小腦性失調症、6型脊髓小腦性失調症、7型脊髓小腦性失調症、12型脊髓小腦性失調症、17型脊髓小腦性失調症、脊髓及延髓肌肉萎縮、齒狀紅核蒼白球萎縮症或顱骨鎖骨發育不良。
態樣133. 如態樣131或態樣132之方法,其中該投與包含直接注射至該個體之中樞神經系統中。
態樣134. 如態樣133之方法,其中該直接注射為大腦室內注射、實質內注射、鞘內注射、紋狀體內注射、丘腦內注射、大池內注射、軟膜下注射或其任何組合。
態樣135. 如態樣131至134中任一項之方法,其中該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率大於1.0。
態樣136. 如態樣131至134中任一項之方法,其中該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率為1.1至1.8。
態樣137. 如態樣131至134中任一項之方法,其中該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率大於1.8。
實例
材料及方法:
CAG 重複序列靶向 shRNA 表現載體之選殖
慢病毒pLKO.1-TRC shRNA表現載體係自Addgene (10878)獲得,且EGFP插入在嘌呤黴素(puromycin)抗性基因之上游,由T2A多肽連接體隔開。另外,使shRNA選殖位點下游之XhoI限制位點發生突變。隨後用EcoRI及AgeI消化此定製載體pxTRC-EGFP-puro,以釋放1.9 kb填充序列,用FastAP (Thermo Fisher)處理以去磷酸化,接著進行凝膠純化。接著使用線性化且經純化之載體添加shRNA插入序列,該等shRNA插入序列係以單股形式購自Integrated DNA Technologies (IDT)且退火成雙鏈體。雙鏈體經設計以在每一端上具有額外16 bp,其在緊鄰AgeI及EcoRI限制酶切位點上游及下游與pxTRC-EGFP-puro載體匹配,以使得能夠利用In-Fusion (Takara Bio)進行基於重組之選殖。
將連接之質體轉型至NEB穩定之化學感受態細胞(New England Biolabs)中,且在30℃下在LB-瓊脂-卡本西林(carbenicillin)板上生長。使個別群落在30℃下於LB-卡本西林中之液體培養中生長,用標準小量製備或中量製備程序提取,且藉由Sanger測序確認陽性純系。
所表現 shRNA 之下一代測序
利用Neon轉染系統(Invitrogen)將shRNA表現載體(500 ng)電穿孔至30-40,000個細胞中,且在37℃下於5% CO
2中生長84 h。使人類胚腎(HEK) 293T細胞(ATCC)在補充有1×非必需胺基酸(NEAA) (Thermo Fisher)、5%胎牛血清(FBS)及5%加強型小牛血清(CCS)之伊格爾氏最低必需培養基(Eagle’s minimum essential medium, EMEM)中生長,而使患者源性纖維母細胞(Coriell Cell Repository, GM04281)在補充有20% FBS、1 mM丙酮酸鈉及1× NEAA之EMEM中生長。藉由胰蛋白酶化收穫細胞,且使用
mirVana miRNA分離套組(Invitrogen),遵循製造商之推薦方案進行處理以提取小RNA。利用Nanodrop儀器藉由UV分光光度法對RNA進行定量,且送往核心機構進行測序。在利用TruSeq小RNA文庫套組製備後,藉由Illumina對小RNA進行測序。藉由定製生物資訊學工作流程對小RNA測序結果進行分析。簡言之,首先將資料轉化成fastq檔案,且使用以下命令行經由Trimmomatic運行:
java -jar trimmomatic-0.39.jar SE -threads 12 -trimlog shC9-2_trimlog.txt /.fastq ILLUMINACLIP:QIAseq.fa:2:30: 10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:15
為所設計shRNA之第一半及第二半(稱為A股(5'臂)及B股(3'臂))創建參考FASTA檔案。每一shRNA臂序列之該等參考序列包括高達10個額外之側接序列核苷酸。將參考FASTA檔案分配至其各別股目錄中,且將經修整之fastq插入至每一股資料夾中。在每一參考資料夾中使用命令bowtie-build -r reference_list.fasta reference_list,以為每一股創建三個參考FASTA檔案。在每一股目錄中使用命令行bowtie -S -p 12 -v 1 -a --best ref trim_.fastq > sam_trim_fastq.sam以創建.sam檔案。使用Tablet軟體以自每一股創建tablet檔案,其係藉由打開新的組譯碼且將.sam檔案與參考FASTA檔案對齊來實施。每一樣品均獲得A股及B股二者之Tablet.txt檔案。
創建定製excel檔案以分析每一tablet檔案。在excel之單獨分頁中分析每一股。將tablet檔案黏貼至excel中,在此讀取所報導之每一shRNA之起始位置、終止位置及長度。自tablet檔案創建讀段長度及總讀段之表。創建條形圖,以報告所列出之每一讀段長度之讀段佔所報告之讀段總數之百分比。接著創建表格,以構建潛在shRNA讀段,其自參考序列之起始位置1開始且終止於參考股長度可能的最終起始位置。創建類似表格,其使用來自tablet檔案之終止位置列示潛在shRNA讀段。接著創建表格,以分析具有確切起始及終止位置之具體shRNA讀段。
產生用於含 CAG 重複序列之基因表現的基於螢光素酶之模型細胞
為創建用於量測亨庭頓蛋白(HTT)野生型(wt)及突變型(mut)蛋白質表現之相對敲低之快速替代分析,自患者源性纖維母細胞(GM04281)之cDNA中選殖wt及mut mRNA之HTT外顯子1片段。該等片段含有CAG重複序列上游之外顯子1序列、CAG重複序列自身,之後為該重複序列下游之外顯子1序列短片段。經由PCR將該等純系設計成在wt及mut變異體上含有不同的肽標籤(HA及FLAG標籤),且接著選殖至pINC3G載體中mCherry報告蛋白上游之載體中且符合mCherry報告蛋白之讀框。將誘導型Tet-on啟動子替換為CMV啟動子,且經由T2A連接體將螢火蟲螢光素酶基因插入在mCherry基因下游且符合mCherry基因之讀框。所有載體均藉由Sanger測序進行確認。
shRNA 活性之螢光素酶活性分析
藉由在24孔板上用50.0 ng HTT wt或mut螢光素酶、5.0 ng RSV-Renilla (Promega)及12.5 ng所指示之shRNA表現構築體共轉染HEK293T細胞確立並實施螢光素酶分析。轉染後48小時,實施雙螢光素酶報告基因分析以測定所設計shRNA之敲低效率。首先以Renilla螢光素酶值對螢火蟲螢光素酶值作正規化,且接著與亂序shRNA對照進行比較。實施至少3次螢光素酶實驗,且使用二因子ANOVA、之後Tukey事後檢定實施統計分析。
患者源性細胞中突變型及野生型亨庭頓蛋白敲低之西方墨點分析
基本上如先前所報導(Hu等人,2009;Gagnon等人,2010)實施西方墨點分析。簡言之,藉由胰蛋白酶化收穫細胞,利用細胞溶解緩衝液提取蛋白質並離心,且藉由BCA或Bradford分析對蛋白質進行量化。使用Novex Tris-乙酸鹽SDS運行緩衝液(Invitrogen),藉由SDS-PAGE在5% (50:1丙烯醯胺:雙丙烯醯胺) tris-乙酸鹽凝膠上分離蛋白質樣品(12-15 ug)。通常在100-120伏特下在4℃-10℃下將凝膠拆分6-8 h。將HTT蛋白轉移至Hybond-C Extra (Amersham Biosciences)硝化纖維素上持續2.5-3 h。利用1:5000稀釋度之抗HTT一級抗體(MAB2166, Chemicon)及1:5000稀釋度之抗小鼠HRP結合抗體(Jackson Immunoresearch)偵測HTT蛋白條帶。經由標準程序在單獨凝膠上實施微管蛋白加載對照。藉由化學發光在iBright成像儀(Thermo Fisher)上或藉由曝光於膠片而使蛋白質可視化。首先以微管蛋白加載對照水準對總HTT蛋白水準作正規化,接著在作圖前以處理對照作正規化。利用ImageJ實施量化,且利用Prism軟體使用希爾圖方程繪製數據。
shRNA 慢病毒及腺相關病毒 (AAV) 顆粒之包裝
為產生慢病毒顆粒,用CMV-VSV-G (Addgene編號8454)、CMV-dR8.2 dvpr (Addgene編號8454)及pLKO1 shRNA慢病毒構築體轉染100 mm板上之HEK293T細胞(約60%鋪滿)。轉染後48小時,自細胞中去除含慢病毒顆粒之培養基,過濾以去除細胞碎片,且以70,000 × g離心2小時以濃縮慢病毒顆粒。將慢病毒顆粒懸浮於PBS中且儲存在-80℃下。為產生AAV顆粒,使用PCR將U6啟動子驅動之shRNA亞選殖在pAAV-CAG-Emerald質體(質體骨架pAAV-MCS,Takara)中bGH聚A信號之下游。用pHelper (Takara)、pAAV-DJ (Cell Biolabs Inc.)及所指示之shRNA表現pAAV CAG-Emerald質體轉染HEK293T細胞。轉染後72小時,使用AAVpro提取溶液(Takara)自細胞中提取AAV顆粒。使用擴增具有ITR之區域的引子,藉由qPCR測定病毒基因體含量。
實例1:最佳化CAG重複序列靶向shRNA之表現及加工
遵循先前所報導方案(Moffat等人,2006)之修改形式將shRNA選殖至U6啟動子驅動之表現載體中。藉由在嘌呤黴素抗性基因上游納入EGFP基因客製化表現載體,以幫助根據螢光監測轉染效率,此產生載體pxTRC-EGFP-puro (
圖 1A)。使用原初pxTRC-EGFP-puro載體之表現及加工支架選殖兩個shRNA (Moffat等人,2006)。該等shRNA為shHD1及shHD1-L,其分別設計成與靶標完美匹配或含有三個中心失配(10-12位)。亦選殖靶向內源性PARP1 (shPARP)、CAG重複序列外之HTT蛋白(shHD2.4)及針對mCherry之非靶向shRNA (shMChry)之對照shRNA (
表 1)。
粗體大寫序列匹配用於基於重組之選殖之靶標選殖載體。斜體序列代表成熟雙鏈體RNA之預期成熟引導股及隨從股。加下劃線之序列代表與潛在靶標相比之失配序列或與重複序列之偏差。小寫序列代表shRNA髮夾之內部環。僅顯示雙鏈體DNA插入序列之有義股。
在進行實驗性靶標敲低研究之前,在將shPARP、shHD1及shHD1L轉染至患者源性亨庭頓氏病(HD)纖維母細胞中之後實施下一代小RNA測序。測序揭示shRNA之不完全加工使所有三種shRNA之引導股(3' shRNA髮夾臂)之預期5'端向朝向3'端之種子區中移位3個核苷酸(
圖 1B)。儘管此有可能產生完全匹配靶標如PARP-1之功能性shRNA,但其將shHD1-L之失配置於7-9位而非10-12位。由於裝載至亞古爾蛋白酶中之小RNA之種子區範圍在1-8位,故此將部分地破壞種子配對及與靶向CAG重複序列之有效結合。另外,完全匹配之shHD1揭示成熟引導股之豐度極低(
表 2)。在Drosha加工期間,shHD1髮夾之重複性質及高GC含量有可能由於髮夾結構之不明確移位而干擾精確加工且因此影響加工登記段。該等結果表明,在髮夾中引入獨特的非重複序列(諸如添加以在shHD1-L之靶標結合期間產生失配之三個串聯腺苷)藉由產生可預測之RNA髮夾摺疊及加工登記段而係有益的。
為校正CAG重複序列靶向shRNA中之移位引導RNA加工模式,設計兩種新的shRNA,亦即shHD1-1及shHD1L-1。該等設計調整側接序列以適應Drosha及Dicer之隱含裂解及加工模式。調整髮夾臂上游及下游之前幾個核苷酸,使得其不配對(C-T失配),在每一臂與內部環之間添加短的4核苷酸連接體,且將環變成預測產生明確定義之6核苷酸環之不對稱序列(
圖 1C)。此外,將shRNA轉染至HEK 293T細胞中,其提供更高之小RNA產率以供測序。該等變化似乎在很大程度上校正加工缺陷,且產生具有期望裂解模式之相對豐富之成熟shRNA。對於shHD1L-1 shRNA,約97%之引導股被精確加工,在1-8位具有完全互補之種子區且適當置入中心失配(經設計在9-11位) (
圖 1D、
表 2)。然而,對於shHD1-1,儘管具有正確移位之加工模式,但引導股之豐度仍較低(
表 2)。因此,富含GC之重複shRNA由於其穩定性及使配對登記段在兩個髮夾臂之間移位之能力而可能對Drosha或Dicer加工帶來挑戰。
為探索新的基於此經修飾支架之設計,選殖四種額外CAG重複序列靶向shRNA,亦即shHD1L-1a至shHD1L-1d (
表 1)。除改變環及交換髮夾臂序列以外,該等設計亦包括在shRNA髮夾自身中心處之有意失配,以產生更天然之miRNA樣結構。shHD1L-1a設計用原初設計中所用之迴文環替代不對稱環。測序揭示,原初不對稱環係低產率及不正確加工之潛在來源,此乃因此設計在引導股之5'端產生異質性且降低總體豐度(
表 2)。因此,對於shHD1L-1b及shHD1L-1c,分別用天然miR30及miR33環替代內部環。該兩種設計均將加工拯救回至高豐度及極高之加工精度(
表 2)。最終,設計出shHD1L-1d以供自髮夾之5'臂加工引導股。此臂交換導致與shHD1L-1a所見類似之加工缺陷,諸如加工可預測性差、豐度降低及常見的向引導股3'端之1核苷酸移位。
許多治療性shRNA被設計成嵌入在天然miRNA支架內。因此,選擇miR33支架用於中心失配CAG重複序列靶向shRNA (Xie等人,2020) (
圖 2A- 圖 2B)。設計包括部分miR33側接支架(shHD-33部分)、具有髮夾扭結之部分支架(shHD-33部分-3'k)、全miR33側接支架(shHD-33全)及具有經設計以亦模擬miR33之髮夾結構之髮夾結構的全支架(shHD-33全-模擬) (
表 3)。所有設計均係為了在shRNA髮夾結構中產生凸起或扭結而產生,且引導股係自5'髮夾臂而非3'臂加工。shHD-33部分及shHD-33部分-3'k設計為部分miR33支架,缺少全miR33 5'前導序列及3'尾曳序列側接序列。兩種設計均展現極差之豐度及低的引導股加工可預測性(
表 2)。相比之下,shHD-33全及shHD-33全-模擬在引導股之5'端以高精度(85%-90%)加工,且達到相對較高之豐度(
表 2)。該等設計模擬miR33 miRNA結構,其中shHD33-全-模擬產生與miR33極類似之中央凸起(
圖 2C)。因此,miR33支架設計藉由產生可預測之5'端加工產物、中心失配之精確置入及相對較高之成熟引導股豐度而提供強勁加工。
粗體大寫序列匹配用於基於重組之選殖之靶標選殖載體。斜體序列代表成熟雙鏈體RNA之預期成熟引導股及隨從股。加下劃線之序列代表與潛在靶標相比之失配序列或與重複序列之偏差。小寫序列代表shRNA髮夾之內部環。僅顯示雙鏈體DNA插入序列之有義股。
實例2:在基於螢光素酶之模型系統中,利用CAG重複序列靶向shRNA選擇性降低CAG重複序列擴增基因表現。
為評估CAG重複序列靶向shRNA之效率及等位基因選擇性,在HEK 293T細胞中利用基於螢光素酶之報告基因分析。在螢火蟲螢光素酶框內及上游選殖來自wt (含有17個CAG重複序列)或mut (含有68個CAG重複序列) mRNA之HTT外顯子1片段。利用wt或mut螢光素酶報告基因質體與對照或CAG重複序列靶向之shRNA共轉染HEK293T (
圖 3A)。相對於對照亂序shRNA設定每一shRNA之螢光素酶活性。對於wt (CAG17)及mut (CAG68)二者,陽性對照shMchry及shHD1 shRNA展示出50%-60%之螢光素酶活性降低。當將wt與mut比較時,未觀察到HD1L-1、HD1L-1a、HD1L-1b、HD1L-d或HD-33部分-3’k之螢光素酶活性顯著降低。觀察到HD1L-1c、HD-33部分、HD-33全及HD-33全-模擬之mut活性相對於wt顯著降低。
實例3:利用CAG重複序列靶向shRNA敲低亨庭頓蛋白基因表現。
先前已證明靶向CAG重複序列且具有中心失配之小干擾RNA (siRNA)選擇性地敲低內源性突變型HTT等位基因(Hu等人,2009)。為確認吾人之系統對siRNA之反應類似,在患者源性纖維母細胞(GM04281)中轉染四種對照siRNA (
表 4)。當藉由西方墨點分析時,靶向重複序列外部之對照siRNA (siHD2.4)及以完全配對直接靶向CAG重複序列之對照siRNA (siHD-3)二者均類似地敲低蛋白質表現(
圖 3B)。如所預期,該等siRNA並未展現出強烈的等位基因選擇性抑制,尤其siHD2.4。相反,siHD-3-p9及siHD-3-p9-11二者分別在9位及9-11位引入與靶標之中心失配,提供等位基因選擇性敲低窗。當藉由西方墨點分析HTT表現時,在一定濃度範圍內,相對於wt HTT等位基因,每一者所引起之突變型HTT減少更大(
圖 3B)。該等結果與使用siRNA之先前報導(Hu等人,2009)相關聯。
為確定CAG重複序列靶向shRNA是否可產生對內源性mut HTT之等位基因選擇性抑制,將自miR33支架表現之shRNA (包括sh亂序、shHD2.4、shHD-33全及shHD-33全-模擬)包裝至慢病毒顆粒中且轉導患者源性纖維母細胞。基於對GFP之顯微鏡檢查,細胞以大於90%之效率經穩定感染。7天後,收穫細胞且藉由西方墨點分析HTT表現。與sh亂序轉導之患者源性纖維母細胞相比,HD2.4顯著降低wt及mut HTT二者。與sh亂序轉導之患者源性纖維母細胞相比,等位基因選擇性shRNA顯著地減少經shHD-33全及shHD33-全模擬轉導之細胞中的mut-HTT之表現(圖5)。
將shRNA表現盒電穿孔至GM04281纖維母細胞中。3.5天後,藉由西方墨點分析細胞之HTT表現。藉由西方墨點分析,吾人發現,若干shRNA (包括shHD1-1、shHD1L-1及shHD1L-1a至shHD1L-1d)不產生HTT表現之實質性降低。使用此轉染方案,量測EGFP表現之顯微鏡檢查及流式細胞術通常揭示30%-40%之效率。對自miR33支架表現之shRNA (基於小RNA測序,其加工良好)之進一步測試亦不提供強勁之敲低。該等結果表明,在患者源性纖維母細胞中,shRNA表現可能沒有達成高水準。
實例4:失配相對於完全匹配引導序列之SHRNA豐度
可藉由獲得具有正確加工之5’端且與含參考CAG重複序列區之參考轉錄本對齊之RNA序列讀段數,且除以與含參考CAG重複序列區之參考轉錄本對齊的人工miRNA之RNA序列讀段總數來量測正確加工之人工miRNA之豐度%。
如表5及
圖 4中所示,與完全匹配之引導序列相比,在靶向HTT mRNA之CAG重複序列區之引導序列的8-16位存在失配改良豐度或病毒編碼之shRNA。不同髮夾環及細胞類型之間的結果係一致的。
實例5:活體內敲低
將表現構築體U6-shHD33-全-模擬選殖至AAV9載體骨架中,且使用三重轉染至哺乳動物細胞中產生AAV9,且藉由雙CsCl密度梯度超離心、去鹽及過濾滅菌(Signagen Laboratories)進行純化。經由定量聚合酶鏈式反應(qPCR)對AAV載體進行滴定。作為陰性對照,亦使用相同的製造製程將亂序shRNA包裝至AAV9中(AAV9-shScr)。所有表現盒均含有綠色螢光蛋白(GFP)編碼序列,以評價轉導效率。
使用立體定位注射經由雙側紋狀體注射將載體製劑投與給4週齡經麻醉之雄性zQ175 HET小鼠(B6J.129S1- Htt
tm1Mfc/190ChdiJ)中。zQ175小鼠表現人類HTT外顯子1序列,其中一個等位基因中有約190 CAG重複序列束且在另一等位基因中有正常小鼠HTT。Menalled等人(2012)
PLoS ONE7:e49838。將2.0 uL體積之檢品以0.1 uL/分鐘之速率泵送。小鼠接受AAV9-shScr (8.0E9 vg/小鼠)或AAV9-shHD33-全-模擬(8.0E9 vg/小鼠)。
注射後六週,收穫腦組織,且藉由組織學分析GFP分佈。DARPP32及GFP染色之共定位證明zQ175紋狀體之轉導(
圖 6)。野生型(WT)及mut HTT蛋白表現之西方墨點分析顯示,相對於AAV9-shScr治療組,AAV9-shHD33-全-模擬治療組中之mut HTT顯著敲低(
圖 7)。此外,AAV9-shHD33-全-模擬顯示,相對於WT HTT等位基因,優先敲低mut HTT等位基因。
實例6:亨庭頓氏病之ZQ175小鼠模型中之等位基因選擇性敲低
材料及方法
將表現構築體U6-shHD33-全-模擬(Iris sbRNA)選殖至AAV9載體骨架中,且使用三重轉染至哺乳動物細胞中產生AAV9,且藉由雙CsCl密度梯度超離心、去鹽及過濾滅菌(Signagen Laboratories)進行純化。將病毒調配於PBS加0.005% Pluronic F‐68中。表現盒含有GFP以評價轉導效率。經由qPCR對AAV載體進行滴定。作為陰性對照,將調配物運載體遞送給一組基因轉殖小鼠及一組野生型同窩出生仔畜。
使用立體定位注射經由雙側紋狀體注射將載體製劑投與給4週齡之經麻醉雄性zQ175基因轉殖小鼠(B6J.129S1- Htt
tm1Mfc/190ChdiJ)及野生型同窩出生仔畜。將2.0 μL體積之檢品以0.1 μL/分鐘之速率泵送。小鼠接受如表9中所概述之檢品。
「Iris sbRNA」係指包含編碼sbRNA之核苷酸序列SEQ ID NO:606之重組AAV,其在細胞內加工時產生雙股RNA,該雙股RNA包含為SEQ ID NO:325之第一股及為SEQ ID NO:555之第二股(表6之CUG_307)。Iris sbRNA在本文中亦稱為「shHD33全模擬」。
在基線時量測動物之體重,以確保治療組之間的均勻分佈。接著每週評價一次重量直至收集組織時(在收集前對動物稱重)。
注射後六週,收穫腦組織。使每組一隻動物(總計6隻動物)經異氟醚麻醉,且經心臟灌注PBS,直至肝臟變清,之後用大約50 mL 4% PFA灌注。收穫全腦且置入含有4% PFA之25 mL小瓶中,並在4℃下儲存24小時。24小時後,將腦轉移至於PBS中之30%蔗糖中,且在4℃下儲存。對於每一組中剩餘之4隻動物(總計24隻動物),經由快速斷頭使動物安樂死,且自顱骨切除腦,並於冷卻之0.9%無菌鹽水中沖洗以去除過量血液。在不含RNA酶之條件下,在一片置於裝在濕冰中之玻璃皮氏培養皿(petri dish)上之預先潤濕(0.9%鹽水)之清潔(不含DNA及RNA)濾紙上按區域對腦進行顯微解剖。解剖以下結構:紋狀體、皮質及小腦。將每一組織樣品置入個別1.5 mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)中,且在液氮中快速冷凍。
使紋狀體組織樣品在來自miRvana miRNA分離套組(Invitrogen)之溶解緩衝液中均質化。使用All Prep DNA/RNA套組(Qiagen)提取DNA,且使用miRvana miRNA分離套組提取單獨的小RNA及總RNA部分。藉由每個反應加載100 ng DNA與TaqMan Universal PCR混合母液II (Applied Biosystems)且使用靶向GFP之引子/探針集(正向:GGAGCGCACCATCTTCTT (SEQ ID NO:860),反向:ATGTTGCCGTCCTCCTTG (SEQ ID NO:861),探針:AAGGACGACGGCAACTACAAGACC (SEQ ID NO:862))及小鼠GAPDH (正向:TCACCTGGCCTACAGGATAAA (SEQ ID NO:863),反向:GCAAACGGGAAGGAAATGAATG (SEQ ID NO:864),探針:ACCCAGCCGAGAGGAATGAGGTTA (SEQ ID NO:865))實施qPCR。反應在Quantstudio 7 Pro (Applied Biosystems)上運行。
將全腦安裝在滑動切片機上並用乾冰冷凍。切割冠狀切片(30 μm),每8個切片收集一次用於免疫螢光染色。將腦在12孔培養皿中以浮動切片形式進行染色。將組織切片在PBS中洗滌兩次,每次5分鐘,接著在室溫下在含有5%驢血清及0.3% Triton X-100之PBS溶液中封阻2小時。封阻後,使組織切片與兔單株抗DARPP32 (1:100, Abcam, ab40801)一級抗體一起在4℃下培育隔夜。將組織切片在含0.3% Triton X-100之PBS中再洗滌三次,每次15分鐘。使組織切片與Alexa Fluor 594山羊抗兔二級抗體(1:500, Life Technologies, A11012)一起在室溫下培育2小時。將組織切片在含0.3% Triton X-100之PBS中再洗滌三次,每次15分鐘,之後在室溫下用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色劑(Abcam)染色20分鐘。將組織切片在PBS中洗滌兩次,接著安裝至載玻片上並蓋上蓋玻片。使用Axioscan Z (Zeiss)顯微鏡拍攝切片影像。
使紋狀體組織樣品在溶解緩衝液(150 mM NaCl、50 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA、1% Triton X-100及1%蛋白酶抑制劑)中均質化。使用Micro BCA蛋白質分析套組(ThermoFisher)對總蛋白質進行定量。將35 μg/孔之蛋白質加載至5.5% Tris-乙酸鹽聚丙烯醯胺凝膠中以進行西方墨點分析。將凝膠在Tris-乙酸鹽運行緩衝液中以70 V運行15分鐘,接著以120 V運行3小時。電泳後,將蛋白質轉移至NC膜(Bio-Rad)上。將膜分別在含5%乳之PBST及TBST中在室溫下封阻1小時。使膜與對小鼠單株抗HTT (1:1,000, Sigma Aldrich, MAB2166)及兔單株抗黏著斑蛋白(1:10,000, Abcam, ab129002)具有特異性之一級抗體一起在4℃培育隔夜。將膜在PBST/TBST中洗滌三次,每次5分鐘,接著與相應AffiniPure過氧化酶結合之二級抗體驢抗小鼠IgG (H+L) (1:4000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, 715-035-150)、驢抗兔IgG (H+L) (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, 711-035-152)一起在室溫下培育1.5小時。將膜在PBST/TBST中再洗滌三次,每次10分鐘。接著使膜與SuperSignal West Pico化學發光受質(Thermo Scientific)一起在室溫下培育3分鐘。在iBright 1500 (Invitrogen)上獲取影像,且使用ImageJ對條帶強度進行定量。
結果
所有動物均在4週齡時進行手術,且存活至10週齡組織收集時,亦即劑量投與後6週。在整個研究期間未注意到異常,且未有過早死亡報導。經8e9 vg亂序shRNA對照或8e9 vg Iris sbRNA治療之zQ175基因轉殖動物之體重顯著低於用運載體治療之zQ175基因轉殖動物,在8週齡時開始且持續至研究之其餘時間。
藉由qPCR對病毒基因體進行定量,且證明紋狀體之劑量依賴性sbRNA基因體定位(圖8,右圖)。藉由免疫螢光分析GFP分佈。DARPP32及GFP染色之共定位證明zQ175紋狀體之劑量依賴性轉導(圖8,左圖)。WT及mut HTT蛋白表現之西方墨點分析顯示,在8e8 vg及4e9 vg之劑量下,相對於運載體組,Iris sbRNA治療組中之mut HTT顯著敲低(圖9)。此外,Iris sbRNA顯示,相對於WT HTT等位基因,優先敲低mut HTT等位基因。
實例7:SCA2之ATXN2小鼠模型中之等位基因選擇性敲低
材料及方法
將表現構築體U6-shHD33-全-模擬選殖至AAV9載體骨架中,且使用三重轉染至哺乳動物細胞中產生AAV9,且藉由雙CsCl密度梯度超離心、去鹽及過濾滅菌(Signagen Laboratories)進行純化。將病毒調配於PBS加0.005% Pluronic F‐68中。表現盒含有GFP以評價轉導效率。經由qPCR對AAV載體進行滴定。作為陰性對照,將調配物運載體遞送給一組基因轉殖小鼠及一組野生型同窩出生仔畜。
使用立體定位注射經由單側(右半球)大腦室內注射將載體製劑投與給8週齡之經麻醉雄性ATXN2-Q127基因轉殖小鼠(C57BL6/J x DBA/2J雜合背景)及野生型同窩出生仔畜。ATXN2-Q127小鼠含有在Pcp2 (Purkinje細胞特異性)啟動子控制下編碼127個麩醯胺酸重複序列(Q127)之完整人類共濟失調蛋白-2 cDNA (Hansen等人(2013)
Hum Mol Genet.22:271)。將10.0 μL體積之檢品以1 μL/分鐘之速率泵送。小鼠接受如表10中所概述之檢品。
在基線時量測動物之體重,以確保治療組之間的均勻分佈。接著每週評價一次重量直至收集組織時(在收集前對動物稱重)。
注射後六週,收穫腦組織。使每組一隻動物(總計6隻動物)經異氟醚麻醉,且經心臟灌注PBS,直至肝臟變清,之後用大約50 mL 4% PFA灌注。收穫全腦且置入含有4% PFA之25 mL小瓶中,並在4℃下儲存24小時。24小時後,將腦轉移至於PBS中之30%蔗糖中,且在4℃下儲存。對於每一組中剩餘之4隻動物(或對於野生型組中為3隻動物)(總計19隻動物),經由快速斷頭使動物安樂死,且自顱骨切除腦,並於冷卻之0.9%無菌鹽水中沖洗以去除過量血液。在不含RNA酶之條件下,在一片置於裝在濕冰中之玻璃皮氏培養皿上之預先潤濕(0.9%鹽水)之清潔(不含DNA及RNA)濾紙上按區域對腦進行顯微解剖。解剖以下結構:紋狀體、皮質及小腦。將每一組織樣品置入個別1.5 mL埃彭道夫管中,且在液氮中快速冷凍。
使小腦組織樣品在來自miRvana miRNA分離套組(Invitrogen)之溶解緩衝液中均質化。使用All Prep DNA/RNA套組(Qiagen)提取DNA,且使用miRvana miRNA分離套組提取單獨的小RNA及總RNA部分。藉由每個反應加載400 ng DNA與TaqMan Universal PCR混合母液II (Applied Biosystems)且使用靶向GFP之引子/探針集(正向:GGAGCGCACCATCTTCTT (SEQ ID NO:860),反向:ATGTTGCCGTCCTCCTTG (SEQ ID NO:861),探針:AAGGACGACGGCAACTACAAGACC (SEQ ID NO:862))及小鼠GAPDH (正向:TCACCTGGCCTACAGGATAAA (SEQ ID NO:863),反向:GCAAACGGGAAGGAAATGAATG (SEQ ID NO:864),探針:ACCCAGCCGAGAGGAATGAGGTTA (SEQ ID NO:865))實施qPCR 。反應在Quantstudio 7 Pro (Applied Biosystems)上運行。
將全腦安裝在滑動切片機上並用乾冰冷凍。切割矢狀切片(60 μm),每8個切片收集一次用於免疫螢光染色。將腦在12孔培養皿中以浮動切片形式進行染色。將組織切片在PBS中洗滌三次,每次5分鐘,接著在室溫下在含有5%驢血清及0.3% Triton X-100之溶液中封阻2小時。封阻後,使組織切片與小鼠單株抗鈣結合蛋白(1:100, Sigma Aldrich, SAB4200543)一級抗體一起在4℃下培育隔夜。將組織切片在含0.3% Triton X-100之PBS中再洗滌三次,每次15分鐘。使組織切片與Alexa Fluor 594山羊抗小鼠二級抗體(1:500, Life Technologies, A11005)一起在室溫下培育2小時。將組織切片在含0.3% Triton X-100之PBS中再洗滌三次,每次15分鐘,之後在室溫下用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色劑(Abcam)染色20分鐘。將組織切片在PBS中洗滌兩次,接著安裝至載玻片上並蓋上蓋玻片。使用Axioscan Z (Zeiss)顯微鏡拍攝切片影像。
使小腦組織樣品在提取緩衝液(25 mM Tris-HCl pH 7.6、300 mM NaCl、0.5% Nonidet P-40、2 mM EDTA、2 mM MgCl
2、0.5 M尿素及蛋白酶抑制劑)中均質化。將均質化組織離心,且收集上清液。將等體積之蛋白質加載至十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠中以進行西方墨點分析。將凝膠在運行緩衝液(25 mM Tris、192 mM甘胺酸、0.1% SDS,pH 8.3)中以40 mA及最大電壓運行2小時。電泳後,使用半乾轉移系統(Bio-Rad),在轉移緩衝液(25 mM Tris、192 mM甘胺酸、20% (v/v)甲醇,pH 8.3)中,將蛋白質在20 V及最大安培數下轉移至Hybond PVDF膜(Amersham Bioscience)上持續1.5小時。將膜在含4%脫脂乳之0.1% Tween 20/PBS中在4℃下封阻2小時。使膜與以下一級抗體一起在4℃下培育隔夜:小鼠抗共濟失調蛋白-2抗體(1:4,000, BD Biosciences, 611378)、小鼠單株抗GFP抗體(1:2,000, Santa Cruz, sc-9996)、小鼠單株抗鈣結合蛋白-D-28K抗體(1:7,000, Sigma-Aldrich, C9848)、兔多株抗RGS8抗體(1:5,000, Novus Biologicals, NBP2-20153)、小鼠單株抗PCP-2抗體(1:2,000, Santa Cruz, sc-137064)、兔單株抗GAPDH (1:5,000, Cell Signaling Technology, 2118)、小鼠單株抗β-肌動蛋白-過氧化酶抗體(1:30,000, Sigma-Aldrich, A3854)、兔多株抗共濟失調蛋白-1抗體(1:4,000, Cell Signaling Technology, 2177)、兔多株抗AAK1抗體(1:4,000, Cell Signaling Technology, 79832)、兔單株抗Brn2/POU3F2 (1:4,000, Cell Signaling Technology, 12137)、兔多株抗TBP抗體(1:5,000, Cell Signaling Technology, 8515)、兔多株抗AF9多株抗體(1:4,000, Proteintech, 12825-1-AP)。將膜在0.1% Tween 20/PBS中洗滌三次,每次10分鐘,接著在含4%脫脂乳之0.1% Tween 20/PBS中與相應過氧化酶結合之二級抗體一起在4℃下培育2小時:山羊抗兔IgG (H + L)抗體(1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, 111-035-144)、驢抗小鼠IgG (H+L) (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, 715-035-150)及馬抗小鼠IgG (H+L)抗體(1:5,000, Vector laboratories, PI-2000)。將膜在0.1% Tween 20/PBS中再洗滌三次,每次10分鐘。接著使膜與Immobilon西方化學發光HRP受質(EMD Millipore)一起根據製造商之方案培育。在ChemiDoc MP成像儀(Bio-Rad)上獲取影像,且使用ImageJ對條帶強度進行定量。
結果
所有動物均在8週齡時進行手術,且存活至14週齡組織收集時(劑量投與後6週),除發現一隻經運載體治療之野生型動物在14週齡組織收集當日死亡。
藉由qPCR對病毒基因體進行定量,且證明小腦之可偵測之sbRNA基因體定位(圖10,右圖)。藉由免疫螢光分析GFP分佈。鈣結合蛋白及GFP染色之共定位證明ATXN2-Q127小腦之劑量依賴性轉導(圖10,左圖)。WT及mut ATXN2蛋白質表現之西方墨點分析顯示,在5e10 vg之劑量下,相對於運載體組,Iris sbRNA治療組中之mut ATXN2顯著敲低(圖11,左圖)。另外,Iris sbRNA顯示,相對於WT ATXN2等位基因,優先敲低mut ATXN2等位基因。用Iris sbRNA治療使得關鍵小腦基因Calb1、Rgs8及Pcp2之表現部分恢復,此係因mut ATXN2敲低而引起的下游改善之分子證明(圖11,右圖)。此外,對含有內源性CAG重複序列之其他基因(ATXN1、AF-9、AAK-1、TBP及Brn2)之表現的西方墨點(WB)分析證明,靶向ATXN2基因中擴增之CAG重複序列之sbRNA不影響含有相同重複序列之健康轉錄本之轉譯(圖12)。
實例8:登記段不影響CAG重複序列之敲低效率
如上文材料及方法部分中所闡述產生慢病毒shRNA表現質體及慢病毒顆粒。使HD纖維母細胞感染表現所指示shRNA/miRNA序列之慢病毒顆粒。如上文材料及方法部分中所闡述,在感染後5天使用抗HTT及抗黏著斑蛋白實施WB。所有評估之序列均觀察到mHTT之敲低(圖13A-圖13C)。該等資料證明1)雙股RNA之第一股與第二股之間的不同失配組合(例如「Iris sbRNA」中之3個失配及「Iris sbRNA-nb」慢病毒樣品中之0個失配)及2)雙股RNA之第一股內的不同失配(例如「Iris-sbRNA-UAC」中之TAC失配及「Iris sbRNA」慢病毒樣品中之AAA失配)能夠有效敲低mHTT及等位基因選擇性。
圖 13A- 圖 13C.圖13A. 額外引導股、環及隨從股序列之設計。30lp:miR-30環;30lp2:miR-30環之變異體;cb:雙股RNA之第一股與第二股之間的3個失配;nb:無凸起(雙股RNA之第一股與第二股之間無失配);frm2:在環之3’端具有2個失配之讀框2 (登記段2);UAC:中心失配為TAC (而非AAA)。圖13B. HD患者源性纖維母細胞經編碼2D中所闡述之miRNA變異體之慢病毒轉導。圖13C. 對圖13D中之西方墨點資料之量化。
如上文材料及方法部分中所闡述產生慢病毒shRNA表現質體及慢病毒顆粒。該等顆粒包括容許對相同miRNA支架進行比較之樣品,該支架含有代表第1登記方式(表示為HD33FM)、第2登記方式(表示為「TGC」)或第3登記方式(表示為「GCT」)之第一股序列。HD患者源性纖維母細胞經表現所指示sbRNA之慢病毒顆粒以10 MOI轉導。在轉導後7天藉由西方墨點評估HTT表現水準,且以亂序33全wtHTT或mHTT作正規化。在收集之前,評價GFP螢光以確認感染。HD33FM、TGC與GCT慢病毒樣品之間的mHTT敲低水準及wtHTT表現水準係類似的(圖13D及圖13E)。該等資料證明,在重複序列內之三個可能的核苷酸中之任一者處起始之序列(例如以C (第1登記方式)、U (第2登記方式)或G (第3登記方式)開始之第一股序列)能夠有效敲低mHTT及等位基因選擇性。
實例9:在基於螢光素酶之模型系統中,利用CAG重複序列靶向miRNA對CAG重複序列擴增蛋白質表現進行等位基因選擇性降低。
產生候選引導序列以系統地評估失配之數量及位置以及引導序列在重複序列內之起始位置(亦即C、U或G)之影響。產生在8位、9位、10位及11位含有單一失配之引導序列。產生含有雙失配之引導序列,其中至少一個失配位於8位、9位、10位或11位,且第二失配位於8-16位內。亦包括三失配及四失配,其中至少兩個失配位於8位、9位、10位或11位,且其餘失配位於8-16位內。
為評估引導序列之起始位置,產生含有三個失配之序列,其中至少兩個失配位於8位、9位、10位或11位,且其餘失配位於8-16位內。該等序列起始於重複序列內三個可能的核苷酸(亦即C、U或G)中之任一者處。
進行電腦模擬分析以移除具有潛在有害靶外效應之引導序列。若滿足以下針對靶外基因之準則,則合成序列:
• 含有與引導序列1-21位完全互補序列之靶外基因為0
• 在引導序列1-21位內含有完全互補17 mer之靶外基因≤ 2
• 若靶外基因含有完全互補17 mer,則:
• 靶外基因不能為腫瘤抑制基因
• 相對於全腦或相對於所有其他組織,靶外基因不能在尾核或殼核中具有高表現
• 若完全互補17 mer含有完全互補種子序列(引導序列2-8位),則:
• 相對於其他基因,靶外基因不能在尾核或殼核中高度表現
•
將通過電腦模擬分析之124個候選引導序列嵌入mir-33支架(SEQ ID NO:X)內,合成,且選殖至定製哺乳動物表現質體中,該質體含有驅動miRNA之U6啟動子及驅動GFP-T2A-嘌呤黴素之人類PGK啟動子。
為評估CAG重複序列靶向miRNA之效率及等位基因選擇性,將來自野生型(含有17個CAG重複序列)或突變型(含有68個CAG重複序列) mRNA之HTT外顯子1之片段選殖在螢火蟲螢光素酶框內及上游(圖14)。使用磷酸鈣轉染方法,藉由在96孔板(40,000個細胞/孔)上用6.0 ng野生型(wt)或突變型(mut) HTT螢光素酶質體、0.9 ng CMV-Renilla質體(Promega)及0.75 ng所指示之miRNA表現質體共轉染HEK293T細胞確立並實施螢光素酶分析。轉染後48小時,使細胞在25 μL 1×被動溶解緩衝液(Promega)中溶解40 min,且使用10 μL溶解物實施雙螢光素酶報告基因分析(Hampf及Gossen (2006)
Anal. Biochem. 356:94-99)以測定所設計miRNA之敲低效率。首先以Renilla螢光素酶值對螢火蟲螢光素酶值作正規化,且接著以亂序miRNA對照作正規化。實施至少3次螢光素酶實驗,且使用比較每一miRNA之wt與mut正規化螢光素酶活性之多重t檢定實施統計分析。陽性對照miRNA HD1-1構築體(靶向CAG重複序列而無失配)使得wt及mut HTT構築體二者之螢光素酶活性降低約70%。在所評估之124個引導序列中,有27個觀察到mut HTT表現降低>50%。在所評估之124個引導序列中,有55個觀察到wt HTT表現之相對保留(< 20%敲低) (圖16)。在所評估之124個引導序列中,有26個觀察到針對mut HTT之等位基因選擇性(定義為wt HTT/mut HTT表現比率> 1.4)。在所測試之124個miRNA中,有19個觀察到mut HTT活性相對於wt HTT顯著降低(p < 0.05)。
對於含有單一失配之引導序列,與位於10位或11位之失配相比,位於8位或9位之失配顯示出改善的對mut HTT之敲低及針對mut HTT之等位基因選擇性(圖18)。對於含有三個或四個失配之引導序列,未觀察到與起始失配位置或失配之間的距離相關之強烈趨勢(圖20)。類似地,對於含有三個失配之引導序列,未觀察到與引導序列在重複序列內之起始位置(亦即C、U或G)相關之強烈趨勢(圖21)。
總之,含有兩個失配之引導序列顯示出mut HTT敲低與針對mut HTT之等位基因選擇性之最佳組合(圖17)。在含有兩個失配之引導序列中,對於在8位、9位、10位或11位具有初始失配之所有序列,已證明mut HTT之敲低及針對mut HTT之等位基因選擇性。mut HTT敲低及針對mut HTT之等位基因選擇性之水準隨失配之間的距離增加而增加(圖19)。
基於以下準則,將九個引導序列鑑別為最佳候選序列:1) mut HTT活性相對於wt HTT顯著降低(p < 0.05),2)對mut HTT具有等位基因選擇性(定義為wt HTT/mut HTT表現比率> 1.4),3) mut HTT表現降低>50%,及4) wt HTT表現相對保留(< 20%敲低)。經該9個引導序列轉染後之mut HTT及wt HTT表現水準示於(圖15)中。
上文所闡述之各個實施例可組合以提供其他實施例。本說明書中所提及及/或申請資料表中所列示之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利出版物均係以全文引用的方式併入本文中。若有必要,可修改實施例之態樣,以採用各種專利、申請案及公開案之概念,從而提供其他實施例。
根據以上詳述說明,可對實施例作出該等及其他改變。一般而言,在以下申請專利範圍中,所用術語不應解釋為將申請專利範圍限於說明書及申請專利範圍中所揭示之具體實施例,而應解釋為包括所有可能的實施例以及此等申請專利範圍所授權之等同物之全部範圍。因此,申請專利範圍不受本揭示案限制。
本專利或申請案檔案含有至少一個有色圖式。在要求並支付必要費用之後,專利事務局將提供本專利或專利申請公開案帶彩圖之複本。
[
圖 1A- 圖 1D]
:自定製U6啟動子驅動之構築體表現之shRNA之選殖及設計。(
圖 1A)客製化pxTRC-EGFP-puro之質體圖譜。(
圖 1B)初始shRNA表現盒(SEQ ID NO:760)。(
圖 1C) shRNA構築體修飾,以改良shRNA加工精度及豐度(SEQ ID NO:761)。(
圖 1D) shHD1L-1設計(SEQ ID NO:762)。在圖1B-圖1D中,綠色標記顯示5’前導序列及3’尾曳序列上之Drosha裂解以及5’上部莖及3’上部莖處之Dicer裂解;且引導股中之失配位置用紫色框標出。
[
圖 2A- 圖 2C]
:用於shRNA表現之miRNA miR33支架設計。(
圖 2A) miR33 miRNA結構及序列元件(SEQ ID NO:763)。(
圖 2B)用於shRNA選殖及表現之通用miR33支架(SEQ ID NO:764)。(
圖 2C) shHD-33全-模擬設計(SEQ ID NO:765)。在圖2A-圖2C中,綠色標記顯示5’前導序列及3’尾曳序列上之Drosha裂解以及5’上部莖及3’上部莖處之Dicer裂解;且引導股中之失配位置用紫色框標出。
[
圖 3A- 圖 3B]
:靶向HTT之CAG重複序列擴增之選定shRNA的基於細胞之評估。(
圖 3A)若干靶向CAG重複序列之shRNA之HEK 293T螢光素酶分析結果。指示野生型(wt)及突變型(mut)構築體,且以亂序shRNA對照對螢光素酶活性百分比作正規化。顯示兩個獨立重複之平均值。誤差係平均值之標準誤差(S.E.M.)。統計顯著性以小於0.05 (*)或0.01 (**)之p值指示。(
圖 3B)藉由西方墨點(Western blot)分析患者源性細胞中HTT wt及mut蛋白質之定量敲低且擬合至希爾圖(Hill plot)方程。顯示單個重複或兩個重複之平均值。誤差為S.E.M.
[
圖 4]係比較具有與
HTTmRNA之CAG重複序列區完全匹配之引導序列的病毒編碼之shRNA與具有相對於
HTTmRNA之CAG重複序列區包含失配之引導序列的病毒編碼之shRNA的shRNA豐度之圖表,其中該等失配位於引導序列之8-16位。
[
圖 5]係顯示與正常HTT等位基因相比,編碼等位基因選擇性shRNA之慢病毒構築體顯著地降低經shHD-33全及shHD33-全模擬轉導之纖維母細胞中的致病性HTT等位基因(mut-HTT)表現之圖表。
[
圖 6]繪示DARP32及GFP染色在zQ175小鼠紋狀體中之共定位。
[
圖 7A- 圖 7B]繪示相對於AAV9-shScr治療組,AAV9-shHD33-全-模擬治療組之zQ175小鼠紋狀體中野生型(WT)及mut HTT蛋白之西方墨點分析。
[
圖 8]繪示紋狀體中之劑量依賴性AAV遞送及GFP表現。
[
圖 9]繪示利用經由重組AAV載體遞送之小結合RNA (sbRNA)在活體內之等位基因選擇性敲低。
[
圖 10]繪示在ICV投與包含編碼sbRNA之重組AAV之重組AAV病毒粒子後小腦中之轉導效率。
[
圖 11]繪示在SCA2小鼠模型中利用經由重組AAV載體遞送之小結合RNA (sbRNA)在活體內之等位基因選擇性敲低(左圖),及在ATXN2-Q127小鼠中作為病理學分子標記物之關鍵小腦基因之表現的部分恢復(右圖)。
[
圖 12]繪示sbRNA對ATXN2-Q127小鼠中之野生型(WT)基因表現保持之效應。含有CAG重複序列之非靶標基因之蛋白質水準未改變。
[
圖 13A- 圖 13E]繪示登記方式(registry)對敲低之效應(圖13(A)引導股欄,自上而下分別為SEQ ID No:406、873、406、406、406、874、875;環欄,自上而下分別為SEQ ID No:876、876、877、878、876、879、876;隨從股欄,自上而下分別為SEQ ID No:881、880、880、880、880、882、883、884) (圖13(E),自上而下分別為SEQ ID No:868、869、870、871及872)。
[
圖 14]係引導序列篩選系統之示意圖。
[
圖 15]繪示使用各種引導序列之敲低及等位基因選擇性。
[
圖 16]繪示引導序列篩選及等位基因選擇性。
[
圖 17]繪示與靶標CAG重複序列區失配之數目對敲低及等位基因選擇性之效應。
[
圖 18]繪示單一失配對敲低及等位基因選擇性之效應,其中該失配位於8位、9位、10位或11位。
[
圖 19]繪示當第一失配位於8位、9位、10位或11位時,第一失配與第二失配之間的距離對敲低及等位基因選擇性之效應。
[
圖 20]繪示與靶標CAG具有三個失配(左圖)或三個失配(右圖)之引導序列中失配之間的距離對敲低及等位基因選擇性之效應。
[
圖 21]繪示與靶標CAG具有三個失配之引導序列中失配之間的距離對敲低及等位基因選擇性之效應,其中第一失配位於9位、10位或11位。
[
圖 22]提供表6。
[
圖 23]提供表7。
[
圖 24]提供表8。
[
圖 25]提供包含miR451 5’及3’側接多核苷酸之sbRNA之核苷酸序列。
TW202329985A_111137904_SEQL.xml
Claims (137)
- 一種雙股RNA,其包含 a) 第一股,其與含CAG重複序列之RNA之靶標CAG重複序列區雜交;及 b) 第二股,其與該第一股雜交, 其中該第一股包含: i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配;及 ii) 與該靶標CAG重複序列區之至少第二失配, 其中: i) 當該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處; ii) 當該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處; iii) 當該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處;且 iv) 當該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於11位時,該第二失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1之雙股RNA,其中每一失配由獨立地選自以下之取代產生: a) 用A、U或C取代G; b) 用A、G或C取代U; c) 用A、U或G取代C。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含: i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位;及 ii) 與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1至3中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1至3中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1至3中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項3至6中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過2個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項3至6中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項3至6中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項3或4之雙股RNA,其中該第一股包含選自以下之核苷酸序列: i) CUGCUGCAACUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:317) (CUG_NA_B); ii) CUGCUGCAGAUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:318) (CUG_NA_C); iii) CUGCUGCAGCAGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:319) (CUG_NA_D); iv) CUGCUGCAGCUACUGCUGCUG (SEQ ID NO:320) (CUG_NA_E); v) CUGCUGCAGCUGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:321) (CUG_NA_F); vi) CUGCUGCAGCUGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:322) (CUG_NA_G); vii) CUGCUGCAGCUGCUACUGCUG (SEQ ID NO:323) (CUG_NA_H);及 viii) CUGCUGCAGCUGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:324) (CUG_NA_I)。
- 如請求項3或4之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:804-819之核苷酸序列。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位;其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1、2及12中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1、2及12中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,且其中該第一取代產生該第一失配且基於 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1、2及12中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,且其中該第一取代產生該第一失配且基於 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項12至15中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項12至15中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於8位;其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1、2及18中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1、2及18中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項1、2及18中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於8位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至8個鹼基處。
- 如請求項18至21中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含: i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位,及 ii) 與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及23中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於9位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及23中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及23中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項23之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:298-304之核苷酸序列。
- 如請求項23至27中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過2個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項23至27中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項23至27中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及31中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及31中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及31中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項31至34中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項31至34中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項31之雙股RNA,其中該第一股包含選自以下之核苷酸序列: i) CUGCUGCUAAAGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:325) (CUG_307); ii) CUGCUGCUAAUACUGCUGCUG (SEQ ID NO:326) (CUG_334); iii) CUGCUGCUAAUGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:327) (CUG_361); iv) CUGCUGCUAAUGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:328) (CUG_388); v) CUGCUGCUAAUGCUACUGCUG (SEQ ID NO:329) (CUG_415); vi) CUGCUGCUACAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:330) (CUG_631); vii) CUGCUGCUACAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:331) (CUG_658); viii) CUGCUGCUACAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:332) (CUG_712); ix) CUGCUGCUAAUGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:336) (CUG_442); x) CUGCUGCUACAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:337) (CUG_604);及 xi) CUGCUGCUACAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:338) (CUG_685)。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或SEQ ID NO:867 (UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於9位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及38中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO: 743)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及38中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項1、2及38中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於9位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至7個鹼基處。
- 如請求項38至41中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項38之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:341-344之核苷酸序列。
- 如請求項38之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:347-367之核苷酸序列。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含: i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位;及 ii) 與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或45中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,且其中該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或45中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,且其中該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或45中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,且其中該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項45至48中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過2個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項45至48中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項45至48中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項45之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:305-310之核苷酸序列。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或53中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或53中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或53中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項53至56中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項53至56中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項53之雙股RNA,其中該第一股包含選自以下之核苷酸序列: i) CUGCUGCUGAAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:333) (CUG_2116); ii) CUGCUGCUGAAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:334) (CUG_2143); iii) CUGCUGCUGAAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:335) (CUG_2170); iv) CUGCUGCUGAAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:339) (CUG_2089);及 v) CUGCUGCUGAAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:340) (CUG_2197)。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於10位,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或60之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或60之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:866)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項1、2或60之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於10位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至6個鹼基處。
- 如請求項60至63中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項60之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:345、346及368-375之核苷酸序列。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含: i) 與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於11位;及 ii) 與該靶標CAG重複序列區之第二失配,其中該第二失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及66中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及66中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及66中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代及第二取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於11位,且該第二取代產生該第二失配且位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項66至69中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過2個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項66至69中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項66至69中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項66之雙股RNA,其中該第一股包含選自以下之核苷酸序列: i) CUGCUGCUGCAACUGCUGCUG (SEQ ID NO:311) (CUG_217); ii) CUGCUGCUGCAGAUGCUGCUG (SEQ ID NO:312) (CUG_226); iii) CUGCUGCUGCAGCAGCUGCUG (SEQ ID NO:313) (CUG_235); iv) CUGCUGCUGCAGCUACUGCUG (SEQ ID NO:314) (CUG_244);及 v) CUGCUGCUGCAGCUGAUGCUG (SEQ ID NO:315) (CUG_253)。
- 如請求項66之雙股RNA,其中該第一股包含選自SEQ ID NO:793-803之核苷酸序列。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配基於SEQ ID NO:743 (CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867))之編號位於11位;且其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配及第三失配,且其中該第二失配及該第三失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及75中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及75中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及75中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代及第三取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配且該第三取代產生該第三失配,且其中該第二取代及該第三取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項75至78中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過3個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項75至78中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項1或2之雙股RNA,其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第一失配,其中該第一失配位於11位(CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743))、SEQ ID NO:866 (GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866))或(UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)),其中該第一股包含與該靶標CAG重複序列區之第二失配、第三失配及第四失配,且其中該第二失配、該第三失配及該第四失配位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及81中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 CUGCUGCUGCUGCUGCUGCUG (SEQ ID NO:743)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及81中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU (SEQ ID NO:866)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項1、2及81中任一項之雙股RNA,其中該第一股為包含核苷酸序列 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之至少第一取代、第二取代、第三取代及第四取代之變異體,其中該第一取代產生該第一失配且基於 UGCUGCUGCUGCUGCUGCUGC (SEQ ID NO:867)之編號位於11位,其中該第二取代產生該第二失配,該第三取代產生該第三失配,且該第四取代產生該第四失配,且其中該第二取代、該第三取代及該第四取代位於該第一失配3’之1至5個鹼基處。
- 如請求項81至84中任一項之雙股RNA,其中該第一股包含不超過4個與該靶標CAG重複序列區之失配。
- 如請求項1至85中任一項之雙股RNA,其中該第二股與該第一股100%互補。
- 如請求項1至85中任一項之雙股RNA,其中該第二股包含與該第一股之1至10個失配、3至5個失配、4至7個失配或5至10個失配。
- 如請求項1至85中任一項之雙股RNA,其中該雙股RNA之長度為18個鹼基至25個核苷酸、19至25個核苷酸、19至23個核苷酸或19至21個核苷酸。
- 如請求項1至85中任一項之雙股RNA,其中該雙股RNA之長度為21個核苷酸至25個核苷酸。
- 一種DNA分子,其包含編碼如請求項1至89中任一項中所陳述之第一股的核苷酸序列,其中該核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。
- 一種重組核酸,其包含: a1) 如請求項1至89中任一項之雙股RNA;及 b1) 微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸, 其中該重組核酸包含: i) 該5’側接多核苷酸; ii) 該雙股RNA之該第一股; iii) 該環多核苷酸; iv) 該雙股RNA之該第二股;及 iv) 該3’側接多核苷酸; 其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源;或 a2) 如請求項1至89中任一項之雙股RNA;及 b2) 微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸、環多核苷酸及3’側接多核苷酸, 其中該重組核酸包含: i) 該5’側接多核苷酸; ii) 該雙股RNA之該第二股; iii) 該環多核苷酸; iv) 該雙股RNA之該第一股;及 v) 該3’側接多核苷酸; 其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之至少一者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源;或 a3) 如請求項1至89中任一項之雙股RNA;及 b3) 微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸, 其中該重組核酸包含: i) 該5’側接多核苷酸; ii) 該雙股RNA之該第一股; iii) 該雙股RNA之該第二股;及 iv) 該3’側接多核苷酸; 其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源;或 a4) 如請求項1至89中任一項之雙股RNA;及 b4) 微小RNA支架,其包含5’側接多核苷酸及3’側接多核苷酸, 其中該重組核酸包含: i) 該5’側接多核苷酸; ii) 該雙股RNA之該第二股; iii) 該雙股RNA之該第一股;及 iv) 該3’側接多核苷酸; 其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸中之一者或兩者與該雙股RNA之該第一股及/或該第二股異源。
- 如請求項91之重組核酸,其中該重組核酸包含: a) 該5’側接多核苷酸; b) 該雙股RNA之該第一股; c) 該環多核苷酸; d) 該雙股RNA之該第二股;及 e) 該3’側接多核苷酸。
- 如請求項91或92之重組核酸,其中該5’側接多核苷酸、該環多核苷酸及該3’側接多核苷酸源自miR33。
- 如請求項91之重組核酸,其中該重組核酸包含: a) 該5’側接多核苷酸; b) 該雙股RNA之該第一股; c) 該雙股RNA之該第二股;及 d) 該3’側接多核苷酸。
- 如請求項91或94之重組核酸,其中該5’側接多核苷酸及該3’側接多核苷酸源自miR451。
- 一種DNA分子,其包含編碼如請求項91至95中任一項之重組核酸之核苷酸序列。
- 如請求項96之DNA分子,其中該5’側接多核苷酸係由核苷酸序列tgcacacctcctggcgggcagctctg (SEQ ID NO:738)編碼。
- 如請求項96或97之DNA分子,其中該環多核苷酸係由核苷酸序列tgttctggcaatacctg (SEQ ID NO:739)編碼。
- 如請求項96至98中任一項之DNA分子,其中該3’側接多核苷酸係由核苷酸序列 gggaggcctgccctgactgcccac (SEQ ID NO:740)編碼。
- 如請求項96至99中任一項之DNA分子,其包含SEQ ID NO:579-656中之任一者中所示之核苷酸序列。
- 如請求項96之DNA分子,其中該5’側接多核苷酸係由核苷酸序列 acctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:854)編碼。
- 如請求項96或101之DNA分子,其中該3’側接多核苷酸係由核苷酸序列 tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaac (SEQ ID NO:855)編碼。
- 如請求項96之DNA分子,其中: i) 該5’側接多核苷酸係由核苷酸序列 acctactgactgccagggcacttgggaatggcaagg (SEQ ID NO:854)編碼; ii) 該3’側接多核苷酸係由核苷酸序列 tcttgctatacccagaaaacgtgccaggaagagaac (SEQ ID NO:855)編碼;且 iii) 該第一股或該第二股係由SEQ ID NO:379-456中之任一者中所示之核苷酸序列編碼。
- 如請求項96之DNA分子,其中該5’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:856中所示之核苷酸序列編碼。
- 如請求項96或104之DNA分子,其中該3’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:857中所示之核苷酸序列編碼。
- 如請求項96之DNA分子,其中: i) 該5’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:856中所示之核苷酸序列編碼; ii) 該3’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:857中所示之核苷酸序列編碼;且 iii) 該第一股或該第二股係由SEQ ID NO:379-456中之任一者中所示之核苷酸序列編碼。
- 如請求項96之DNA分子,其中該5’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:858中所示之核苷酸序列編碼。
- 如請求項96或107之DNA分子,其中該3’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:859中所示之核苷酸序列編碼。
- 如請求項96之DNA分子,其中: i) 該5’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:858中所示之核苷酸序列編碼; ii) 該3’側接多核苷酸係由SEQ ID NO:859中所示之核苷酸序列編碼;且 iii) 該第一股或該第二股係由SEQ ID NO:379-456中之任一者中所示之核苷酸序列編碼。
- 一種重組表現載體,其包含如請求項96至109中任一項之DNA分子。
- 如請求項110之重組表現載體,其中該核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。
- 如請求項111之重組表現載體,其中該啟動子為RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子。
- 如請求項111或112之重組表現載體,其中該啟動子為CAG啟動子、CBA啟動子、CMV啟動子、U6啟動子、EF1α啟動子或H1啟動子。
- 如請求項110至113中任一項之重組表現載體,其中該重組表現載體包含5’腺相關病毒(AAV)反向末端重複(ITR)序列及3’ AAV ITR序列。
- 一種重組表現載體,其包含編碼如請求項91至95中任一項之重組核酸之核苷酸序列。
- 如請求項115之重組表現載體,其中該核苷酸序列可操作地連接至在真核細胞中具有功能性之啟動子。
- 如請求項116之重組表現載體,其中該啟動子為RNA聚合酶II啟動子或RNA聚合酶III啟動子。
- 如請求項116或117之重組表現載體,其中該啟動子為CAG啟動子、CBA啟動子、CMV啟動子、U6啟動子、EF1α啟動子或H1啟動子。
- 如請求項115至118中任一項之重組表現載體,其中該重組表現載體包含5’腺相關病毒(AAV)反向末端重複(ITR)序列及3’ AAV ITR序列。
- 一種遞送運載體,其包含如請求項110至119中任一項之重組表現載體。
- 如請求項120之遞送運載體,其中該遞送運載體為非病毒遞送運載體。
- 如請求項121之遞送運載體,其中該遞送運載體為脂質奈米顆粒。
- 如請求項120之遞送運載體,其中該遞送運載體為病毒顆粒。
- 一種病毒顆粒,其包含如請求項110至119中任一項之重組表現載體。
- 如請求項126之病毒顆粒,其中該病毒顆粒為腺相關病毒(AAV)顆粒。
- 如請求項125之病毒顆粒,其中該AAV顆粒包含AAV9衣殼。
- 如請求項125之病毒顆粒,其中該AAV顆粒包含AAV2衣殼。
- 一種組合物,其包含: a) 如請求項110至119中任一項之重組表現載體;及 b) 醫藥學上可接受之賦形劑。
- 一種組合物,其包含: a) 如請求項120至123中任一項之遞送運載體;及 b) 醫藥學上可接受之賦形劑。
- 一種組合物,其包含: a) 病毒顆粒,其包含如請求項124至127中任一項之重組表現載體;及 b) 醫藥學上可接受之賦形劑。
- 一種選擇性地減少患有CAG重複序列擴增病症之個體的含疾病相關CAG重複序列之RNA之轉譯的方法,該方法包括向該個體投與有效量的如請求項110至119中任一項之表現載體、如請求項120至123中任一項之遞送運載體、如請求項124至127中任一項之病毒顆粒或如請求項128至130中任一項之醫藥組合物。
- 如請求項131之方法,其中該重複序列擴增病症為亨庭頓氏病(Huntington’s disease)、1型脊髓小腦性失調症、2型脊髓小腦性失調症、3型脊髓小腦性失調症、6型脊髓小腦性失調症、7型脊髓小腦性失調症、12型脊髓小腦性失調症、17型脊髓小腦性失調症、脊髓及延髓肌肉萎縮、齒狀紅核蒼白球萎縮症或顱骨鎖骨發育不良。
- 如請求項131或132之方法,其中該投與包含直接注射至該個體之中樞神經系統中。
- 如請求項133之方法,其中該直接注射為大腦室內注射、實質內注射、鞘內注射、紋狀體內注射、丘腦內注射、大池內注射、軟膜下注射或其任何組合。
- 如請求項131至134中任一項之方法,其中該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率大於1.0。
- 如請求項131至134中任一項之方法,其中該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率為1.1至1.8。
- 如請求項131至134中任一項之方法,其中該投與所提供之由含非疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽與由含疾病相關CAG重複序列之RNA編碼之多肽的比率大於1.8。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202163253070P | 2021-10-06 | 2021-10-06 | |
US63/253,070 | 2021-10-06 | ||
US202263339363P | 2022-05-06 | 2022-05-06 | |
US63/339,363 | 2022-05-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202329985A true TW202329985A (zh) | 2023-08-01 |
Family
ID=85804745
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW111137904A TW202329985A (zh) | 2021-10-06 | 2022-10-05 | 用於治療cag重複序列疾病之組合物及方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240425856A1 (zh) |
EP (1) | EP4413137A1 (zh) |
JP (1) | JP2024543782A (zh) |
AU (1) | AU2022358732A1 (zh) |
CA (1) | CA3232737A1 (zh) |
IL (1) | IL311638A (zh) |
TW (1) | TW202329985A (zh) |
WO (1) | WO2023060104A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024211376A2 (en) * | 2023-04-05 | 2024-10-10 | Iris Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating cag repeat diseases |
US20240360443A1 (en) * | 2023-04-09 | 2024-10-31 | Dystrogen Gene Therapies Inc. | Nucleic acid molecule and use of the nucleic acid molecule in therapy of diseases induced by expansion of trinucleotide cag repeats |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL243776B1 (pl) * | 2013-09-02 | 2023-10-09 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG |
WO2017060317A1 (en) * | 2015-10-05 | 2017-04-13 | Proqr Therapeutics Ii B.V. | Use of single-stranded antisense oligonucleotide in prevention or treatment of genetic diseases involving a trinucleotide repeat expansion |
WO2018152523A1 (en) * | 2017-02-20 | 2018-08-23 | Northwestern University | Use of trinucleotide repeat rnas to treat cancer |
-
2022
- 2022-10-05 IL IL311638A patent/IL311638A/en unknown
- 2022-10-05 EP EP22879440.0A patent/EP4413137A1/en active Pending
- 2022-10-05 TW TW111137904A patent/TW202329985A/zh unknown
- 2022-10-05 WO PCT/US2022/077572 patent/WO2023060104A1/en active Application Filing
- 2022-10-05 CA CA3232737A patent/CA3232737A1/en active Pending
- 2022-10-05 JP JP2024521180A patent/JP2024543782A/ja active Pending
- 2022-10-05 AU AU2022358732A patent/AU2022358732A1/en active Pending
- 2022-10-05 US US18/699,523 patent/US20240425856A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4413137A1 (en) | 2024-08-14 |
AU2022358732A1 (en) | 2024-04-11 |
CA3232737A1 (en) | 2023-04-13 |
JP2024543782A (ja) | 2024-11-26 |
US20240425856A1 (en) | 2024-12-26 |
WO2023060104A1 (en) | 2023-04-13 |
IL311638A (en) | 2024-05-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110914427B (zh) | 调节性多核苷酸 | |
CN109831916B (zh) | 治疗亨廷顿氏舞蹈病的组合物和方法 | |
US9523093B2 (en) | Huntington's disease therapeutic compounds | |
US20200123574A1 (en) | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) | |
ES2739804T3 (es) | Compuestos terapéuticos | |
CN111108198A (zh) | 治疗亨廷顿病的组合物和方法 | |
JP7565218B2 (ja) | 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療 | |
KR20190051020A (ko) | 안 질환 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드 | |
US9074207B2 (en) | Modified human U1snRNA molecule, a gene encoding for the modified human U1snRNA molecule, an expression vector including the gene, and the use thereof in gene therapy | |
EP4454654A2 (en) | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) | |
TW202329985A (zh) | 用於治療cag重複序列疾病之組合物及方法 | |
US20220010314A1 (en) | Rnai induced reduction of ataxin-3 for the treatment of spinocerebellar ataxia type 3 | |
JP2023532864A (ja) | 導入遺伝子発現系 | |
AU2019414608A1 (en) | Oligomeric nucleic acid molecule and application thereof | |
US20200248204A1 (en) | Methods of treating genetic hearing loss | |
JP2023520730A (ja) | 筋萎縮性側索硬化症を治療するためのアンチセンス配列 | |
US20240093189A1 (en) | Vectors comprising stuffer polynucleotide sequences | |
WO2024211376A2 (en) | Compositions and methods for treating cag repeat diseases | |
WO2024145474A2 (en) | Compositions and methods for regulating mapt | |
Deutsch et al. | AAV-Mediated CRISPRi and RNAi Based Gene Silencing in Mouse Hippocampal Neurons. Cells 2021, 10, 324 | |
EP4165194A2 (en) | Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss | |
JP2024517710A (ja) | 蝸牛に形質導入するためのアデノ随伴ウイルスベクター |