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TW202328195A - 特異性結合ｐｄ－１的蛋白及其醫藥用途 - Google Patents

特異性結合ｐｄ－１的蛋白及其醫藥用途 Download PDF

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TW202328195A
TW202328195A TW111134965A TW111134965A TW202328195A TW 202328195 A TW202328195 A TW 202328195A TW 111134965 A TW111134965 A TW 111134965A TW 111134965 A TW111134965 A TW 111134965A TW 202328195 A TW202328195 A TW 202328195A
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王寶輝
林�源
林侃
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Abstract

本揭露關於特異性結合PD-1的蛋白及其醫藥用途。具體而言，本揭露提供了一種特異性結合PD-1的蛋白、特異性結合PD-1/PVRIG/TIGIT的蛋白及其用於治療疾病(例如癌症)的用途。

Description

特異性結合PD-1的蛋白及其醫藥用途
本揭露要求2021年09月15日提交的中國專利申請(申請號CN202111078222.1)的優先權。
本揭露關於生物醫藥領域，具體關於特異性結合PD-1的蛋白、特異性結合PD-1/PVRIG/TIGIT的蛋白及其用於治療癌症的方法和製藥用途。
免疫治療是癌症治療領域的熱點，以抗PD-1抗體為代表的免疫途徑治療藥物已經在臨床上體現出高有效性和高安全性。
PD-1(Programmed Cell death-1)屬於CD28受體家族，是免疫抑制性受體(Riley等人2009，Immunol.Rev.29：114-25)。該家族還包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。PD-1是I型跨膜蛋白，與CTLA-4結構很相似，但PD-1缺失了與B7-1和B7-2結合的MYPPPY序列。PD-1主要表達在活化的B細胞、T細胞和骨髓細胞(Chen等人2013，Nat.Rev.Immunol.13：227-42)。
PD-1有兩種細胞表面的糖蛋白配體，分別是PD配體1(PD-L1，又名CD274，B7-H1)和PD配體2(PD-L2，又名B7-DC)。PD-L1和PD-L2均不與其它CD28受體家族成員結合。PD-L1廣泛表達於淋巴細胞(例如CD4+ T細胞和CD8+ T細胞、巨噬細胞等)以及如外周組織、各種腫瘤細胞和病毒感染細胞等。PD-L2主要表達於活化的樹突狀細胞和巨噬細胞(Dong等人1999，Nat.Med.5：1365-9)。PD-1與其配體PD-L1或PD-L2結合後，會下調T細胞的功能，包括降低T細胞的活化、分化增殖和細胞因子的分泌等。
關於PVRIG(Poliovirus receptor-related Ig domain containing protein)又名CD112R，與TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)、CD96和CD226等同屬B7/CD28超家族，在免疫系統中起重要作用。當PVRIG的配體PVRL2(又名CD112)結合PVRIG時，會活化PVRIG胞內區的ITIM結構域，使PVRIG起到免疫抑制的作用。PVRIG主要表達在CD4+T細胞，CD8+T細胞和NK細胞的表面。PVRIG和其配體PVRL2在多種實體瘤中高表達，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌等。PVRIG在這些癌症中的表達與TIGIT和PD-1有高度相關性。與PD-1和TIGIT相似，PVRIG陽性的T細胞也會呈現Eomes陽性和Tbet陰性，表明PVRIG與T細胞的耗竭有關。因此，PVRIG可能代表了除了PD-1和TIGIT之外的有一個新的免疫檢查點，並起到冗餘(redundancy)的作用。體外細胞實驗和小鼠模型中顯示，對小鼠PVRIG的剔除或抑制，可以有效抑制癌症的生長，並與PD-1和TIGIT抑制劑發生協同作用。TIGIT在淋巴細胞上高度表達，包括浸潤不同類型癌症的癌症浸潤淋巴細胞(TIL)和Treg。已經證明TIGIT與其同源配體PVR(又名 CD155)的結合藉由其細胞質ITIM結構域直接抑制NK細胞的細胞毒性。PVR也在癌症中廣泛表達，表明TIGIT-PVR信號軸可能是癌症的主要免疫逃逸機制。抑制性受體TIGIT、PVRIG與激活型受體DNAM-1結合同樣的配體CD155與CD112，但抑制性受體的親和力更高(Y.Zhu等人2016，J Exp Med.213：167-176)。腫瘤患者體內分離的NK細胞DNAM-1表達下調，導致NK細胞更易受到TIGIT或PVRIG的抑制，阻斷TIGIT與PVRIG的結合，能夠激活NK細胞的細胞殺傷功能(L.Martinet等人2015，Cell Reports.11：85-97)。
雖然PD-1/PD-L1抗體是目前臨床最成功的免疫檢查點抑制劑單抗，但T細胞表面其他免疫檢查點的表達上調會限制其療效。TIGIT和PVRIG除了調控T細胞的功能，還調控NK細胞活性，提示與PD-1/PD-L1在NK細胞中的功能可能產生協同。文獻報導TIGIT與PVRIG的配體CD155與CD112在肺癌、卵巢癌、結直腸癌、黑色素瘤中的高表達與PD-1/PD-L1治療不良預後顯著相關。如CD155表達高的患者對抗PD-1抗體響應差，而CD155表達低的患者對PD-1響應好(S.Whelan等人2019，Cancer Immunol Res.7：257-268；A.Lepletier等人2020，Clin Cancer Res.26：3671-3681)。
尚未有任何PVRIG抗體、抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體藥物上市。Compugen公司的COM701是全球首個獲FDA批准進入臨床的抗PVRIG人源化抗體，目前處於I期臨床階段，用於治療癌症。Surface Oncology也有抗PVRIG抗體SRF-813在開發。抗TIGIT抗體有Genentech的tiragolumab、Ono Pharmaceutical與BMS合作開發的BMS-986207、 默沙東的MK-7684、iTeos Therapeutics的EOS-884448、ArcusBiosciences的AB-154，均在臨床II期階段。
因此，本揭露提供新結構的抗PD-1抗體及相關的抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體，有望增強T細胞和NK細胞激活、克服PD-1/PD-L1耐藥、拓展應答患者人群，從而提高癌症免疫治療的效果。此外，抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體可同時結合同一細胞表面的多個免疫檢查點，潛在具有親和力效應(avidity effect)，因此有潛力在臨床提供比現有PD-1、TIGIT、PVRIG抗體藥物或其聯用更佳的療效。
本揭露提供了PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白，其編碼核酸、載體、宿主細胞、醫藥組成物、其用於治療或預防癌症的方法和相關製藥用途。
PD-1結合蛋白
本揭露提供PD-1結合蛋白，其包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：
SEQ ID NO：3、13-15、17-35任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，或
SEQ ID NO：2、16任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，
該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。該免疫球蛋白單一可變結構是特異性結合PD-1抗原或其片段的。
一些實施方案中，該PD-1結合蛋白包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構。
一些實施方案中，提供PD-1結合蛋白，包含上述CDR1、CDR2和CDR3中的任意一個或其任意組合。
一些實施方案中，提供PD-1結合蛋白，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別
如SEQ ID NO：7、36、37所示，或
如SEQ ID NO：4、5、6所示。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：8、38-40、101任一所示，CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：9、41、42任一所示。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、38、41所示。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域為人源化的、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺和/或降低抗體異構化改造的。一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域經過親和力成熟獲得的，其在一個或多個CDR中具有一個或多個變化，該變化導致對PD-1的親和力相比於親本免疫球蛋白單一可變結構域有所增加。
一些具體實施方案中，人源化改造過程使用人種系模板的重鏈框架區IGHV3-23*01或IGHV3-23*04。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白中該免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、13-15、17-35任一所示，或如SEQ ID NO：2、16任一所示，或與前述序列任一具有至少80%序列同一性。
本揭露中，“至少90%(序列)同一性”涵蓋至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性；“至少80%(序列)同一性”涵蓋至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白中包含或為特異性結合PD-1或其片段的抗體或其抗原結合片段。該抗體或其抗原結合片段例如為駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。該抗體或其抗原結合片段例如為重組抗體或其片段。
一些具體實施方案中，該抗原結合片段為線性抗體、單鏈抗體、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)和四抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域是VHH。
一些實施方案中，本揭露提供PD-1結合蛋白，其包含一個或多個(例如2、3、4、5、6個)前述免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域可以是相同或不同的，可以形成二聚體或多聚體分子。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區；例如，該Fc區是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc區。該Fc區可以具有突變，示例性突變是選自以下任一項或組合：
IgG1上的L234A/L235A；
IgG1上的S267E/L328F；
IgG1上的L234F/L235E/D265A；
IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S；
IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M；
IgG2上的V234A/G237A；
IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S；
IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S；
IgG4上的F234A/L235A；
IgG4上的S228P/F234A/L235A；
IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S；
IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S；以及
IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A。
還可使用雜合IgG2/4Fc域，例如具有來自IgG2的殘基117-260和來自IgG4的殘基261-447的Fc。一些具體的實施方案中，該人IgG4的Fc區具有228P、234A、235A和/或447A突變。
在本文中Fc區所包含的突變的上下文中，“/”表示“和”，例如，“F234A/L235A”表示“F234A和L235A，即，Fc中包含F234A和L235A突變；突變的胺基酸位置是根據EU編號系統編號的。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白中包含的Fc區可以使該結合蛋白形成二聚體分子，延長該結合蛋白的體內半衰期。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白中免疫球蛋白單一可變結構域與Fc區直接或藉由連接子連接。該連接子可以是1-20個或更多個胺基酸長、無二級以上結構的非功能性胺基酸序列。例如，該連接子是柔性連接子，例如G4S、GS、GAP、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、ASGS等。
一些實施方案中，本揭露的PD-1結合蛋白為抗PD-1抗體或其抗原結合片段，或包含該抗體、抗原結合片段的綴合物、融合蛋白。
一些實施方案中，前述PD-1結合蛋白，具有選自以下至少一項的活性：
(a)以
Figure 111134965-A0202-12-0008-214
10-7的KD值與人PD-1或其表位結合；
(b)抑制PD-1與PD-L1的結合；
(c)抑制PD-1與PD-L2的結合；
(d)誘導CD4+T細胞分泌IFN-γ；
(e)增強PBMC的活化；
(f)增強T細胞的活化；
(g)抑制腫瘤生長。
一些實施方案中，本揭露的前述PD-1結合蛋白結合PD-1的KD值可以
Figure 111134965-A0202-12-0008-215
1×10-7M，例如
Figure 111134965-A0202-12-0008-216
1×10-8M，或
Figure 111134965-A0202-12-0008-217
1×10-9M，或
Figure 111134965-A0202-12-0008-218
1×10-10M。
一些實施方案中，本揭露的PD-1結合蛋白能夠特異性結合人PD-1並阻斷PD-1和PD-L1的相互作用，和/或阻斷PD-1和PD-L2的相互作用。
一些實施方案中，本揭露的前述PD-1結合蛋白能夠抑制腫瘤生長至少約10%，例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%。
一些實施方案中，本揭露的前述PD-1結合蛋白涵蓋變體，該變體與SEQ ID NO：2-3、13-35任一相比有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸突變；該胺基酸突變可以是保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加；該胺基酸突變可以發生在CDR區和/或FR區。
一些實施方案中，提供抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其與前述本揭露的PD-1結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域結合或競爭結合相同的表位。
一些實施方案中，提供抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其阻斷前述本揭露的PD-1結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域與PD-1(例如人PD-1)的結合。
一些實施方案中，提供抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其與PD-1(例如人PD-1)的結合被前述本揭露的PD-1結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域阻斷。
一些實施方案中，前述本揭露的PD-1結合蛋白使PD-1與PD-L1和/或PD-L2的結合降低至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或以上。
一些實施方案中，提供蛋白或分子，其包含前述本揭露任意一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)PD-1結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域是相同的或 不同的。例如，該蛋白或分子為綴合物，該綴合物例如可包含任意可檢測標記。
PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白
本揭露提供PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域、特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域和特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域，能同時或分別特異性結合PD-1、PVRIG和TIGIT。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含或為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中的各抗原結合結構域選自Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體或由其任意組合組成。在具體的實施方案中，特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域包含或為VHH、特異性結合PVRI+G的第二抗原結合結構域包含或為VHH、特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域為Fab或F(ab’)2。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白為人源化的、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺和/或降低抗體異構化改造的。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白為重組抗體、駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域包含(至少一個)免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：
SEQ ID NO：3、13-15、17-35任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，
SEQ ID NO：2、16任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，
該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。
一些實施方案中，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別：
如SEQ ID NO：7、36、37所示，或
如SEQ ID NO：4、5、6所示。
一些具體實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：8、38-40、101任一所示，CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：9、41、42任一所示。
一些具體實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、38、41所示。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域包含(至少一個)免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：
SEQ ID NO：45、62-66、95-96任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，或
SEQ ID NO：44、57-61任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。
一些具體實施方案中，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別：
如SEQ ID NO：49、50、51所示，或
如SEQ ID NO：46、47、48或99所示。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，
該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：73、74和75所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：76、77和78所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域包含如：
SEQ ID NO：3、13-15、17-35任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列；
SEQ ID NO：2、16任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域包含如：
SEQ ID NO：45、62-66、95-96任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列；或
SEQ ID NO：44、57-61任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，
該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：79-81中任一所示或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列，
該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：82或83所示或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域包含全長重鏈(HC)和全長輕鏈(LC)。
例如，該全長重鏈為IgG1、IgG2或IgG4同種型，該全長輕鏈為Kappa同種型；
又例如，該重鏈序列為SEQ ID NO：67所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列，該輕鏈序列為SEQ ID NO：68所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中，特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域、特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域、特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接。例如，該連接子為具有如(G4S)x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地 選自1-20的整；又例如，該連接子為(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4所示的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，特異性結合PD-1的抗原結合結構域位於特異性結合PVRIG的抗原結合結構域的N端或C端。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，特異性結合PD-1的抗原結合結構域位於特異性結合TIGIT的抗原結合結構域的N端或C端。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，特異性結合PVRIG的抗原結合結構域位於特異性結合TIGIT的抗原結合結構域的N端或C端。
一些實施方案中，第一抗原結合結構域、第二抗原結合結構域、第三抗原結合結構域彼此在一條多肽鏈上，或不在一條多肽鏈上。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中如選自以下的結構所示：
(I)第一多肽鏈：[特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域]-[連接子1]a-[特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和第二多肽鏈：[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或
(II)第一多肽鏈：[特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和第二多肽鏈：[特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域]-[連接子3]c-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或
(III)第一多肽鏈：[特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc-[連接子4]d-[特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域]，和第二多肽鏈：[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或
(IV)第一多肽鏈：[特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和第二多肽鏈：[特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域的VL]-Cκ-[連接子5]e-[特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域]。
以上第一、第二多肽鏈均是從N端到C端順序。
其中，-表示肽鍵，連接子為能夠實現連接功能的多肽，連接子1、連接子2、連接子3、連接子4、連接子5可以相同，也可以不同；a、b、c、d、e可以視需要獨立地為0或1。
例如，各連接子獨立地為EPKSS或為(GxS)y連接子，其中，x選自1-5的整數(例如，1、2、3、4、5)，y選自1-6的整數(例如，1、2、3、4、5、6)。
當連接子為(GxS)y連接子時，例如為(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4任一所示的連接子。
一些實施方案中，提供PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：87、68所示的胺基酸序列；
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：84、88所示的胺基酸序列；
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：89、68所示的胺基酸序列；
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：84、90所示的胺基酸序列；或
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：91、68所示的胺基酸序列；
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：85、92所示的胺基酸序列；
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：93、68所示的胺基酸序列；
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：85、94所示的胺基酸序列；
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：97、68所示的胺基酸序列；
該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：98、68所示的胺基酸序列；
或與前述任一的第一、第二多肽鏈均具有至少80%或均具有至少90%序列同一性的胺基酸序列組合。
一些實施方案中，前述本揭露的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含兩條相同或不同的第一多肽鏈，包含兩條相同或不同的第二多肽鏈。
一些具體實施方案中，PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。
一些實施方案中，本揭露PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白因為包含本揭露的特異性結合PD-1的抗原結合結構域，而具有其所有或任意的性質和功能。
PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白因為包含PVRIG/TIGIT結合結構域，還有具有下述特徵中的至少一個：
(a)以小於1×10-7M的KD值結合人PVRIG；
(b)阻斷PVRIG與其配體(例如，PVRL2)的相互作用；
(c)解除樹突狀細胞(DC)對T細胞的抑制作用，活化T細胞；
(d)解除腫瘤細胞對NK細胞的抑制作用。
一些實施方案中，本揭露的前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白能夠抑制腫瘤生長至少約10%，例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%。
一些實施方案中，本揭露的前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白涵蓋變體，該變體與前述第一多肽鏈和第二多肽鏈的任一組合相比有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸突變；該胺基酸突變可以是保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加。該突變可以發生在特異性結合PD-1的抗原結合結構域、特異性結合PVRIG的抗原結合結構域、特異性結合TIGIT的抗原結合結構域(例如CDR區和/或FR區)。
一些實施方案中，提供了一種PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其與前述本揭露的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白結合或競爭結合相同的PD-1、PVRIG和/或TIGIT或其表位；或阻斷前述本揭露的前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白與PD-1、PVRIG和/或TIGIT的結合；或其與 PD-1、PVRIG和/或TIGIT的結合被前述本揭露的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白阻斷。
PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白
本揭露提供PD-1/PVRIG結合蛋白，其包含特異性結合PD-1的抗原結合結構域、特異性結合PVRIG的抗原結合結構域，能同時或分別特異性結合PD-1、PVRIG。
本揭露提供PD-1/TIGIT結合蛋白，其包含特異性結合PD-1的抗原結合結構域、特異性結合TIGIT的抗原結合結構域，能同時或分別特異性結合PD-1、TIGIT。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白包含或為抗PD-1/PVRIG雙特異性抗體，前述PD-1/TIGIT結合蛋白包含或為抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白中的各抗原結合結構域選自Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體或由其任意組合組成。
一些實施方案中，特異性結合PD-1的抗原結合結構域包含或為VHH、特異性結合PVRIG的抗原結合結構域包含或為VHH、特異性結合TIGIT的抗原結合結構域為Fab或F(ab’)2。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白為人源化的、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺和/或降低抗體異構化改造的。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白為重組抗體、駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。
一些實施方案中，PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PD-1的抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：
SEQ ID NO：3、13-15、17-35任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，
SEQ ID NO：2、16任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，
該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。
一些實施方案中，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別：
如SEQ ID NO：7、36、37所示，
如SEQ ID NO：4、5、6所示。
一些具體實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：8、38-40、101任一所示，CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：9、41、42任一所示。
一些具體實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、38、41所示。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白中，該特異性結合PVRIG的抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：
SEQ ID NO：45、62-66、95-96任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，或
SEQ ID NO：44、57-61任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。
一些具體實施方案中，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別：
如SEQ ID NO：49、50、51所示，
如SEQ ID NO：46、47、48或99所示。
一些實施方案中，前述PD-1/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合TIGIT的抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，
該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：73、74和75所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：76、77和78所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合PD-1的抗原結合結構域包含如
SEQ ID NO：3、13-15、17-35任一所示胺基酸序列；或
SEQ ID NO：2、16任一所示胺基酸序列；或
與該序列任一具有至少80%、至少85%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白中，該特異性結合PVRIG的抗原結合結構域包含如：
SEQ ID NO：45、62-66、95-96任一所示的胺基酸序列；或
SEQ ID NO：44、57-61任一所示的胺基酸序列；或
與該序列任一具有至少80%、至少85%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述PD-1/TIGIT結合蛋白中，該特異性結合TIGIT的抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，
該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：79-81中任一所示或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列，
該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：82或83所示或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域包含全長重鏈(HC)和全長輕鏈(LC)。
例如，該全長重鏈為IgG1、IgG2或IgG4同種型，該全長輕鏈為Kappa同種型。
又例如，該重鏈序列為SEQ ID NO：67所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列，該輕鏈序列為SEQ ID NO：68所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白中，不同抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接；例如，該連接子獨立地為具有如(G4S)x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20(例如，1、2、3、4、5、6、7、8)的整；又例如，該連接子獨立地為(G4S)2、(G4S)3所示的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白，特異性結合PD-1的抗原結合結構域位於特異性結合PVRIG的抗原結合結構域的N端或C端。
一些實施方案中，前述PD-1/TIGIT結合蛋白，特異性結合PD-1的抗原結合結構域位於特異性結合TIGIT的抗原結合結構域的N端或C端。
一些實施方案中，前述PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區；例如，該Fc區是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc區。該Fc區可以具有突變，示例性突變為S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。一些實施方案中，Fc區可以使該結合蛋白形成二聚體分子，延長該結合蛋白的體內半衰期。
一些實施方案中，本揭露PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白因為具有本揭露的特異性結合PD-1的抗原結合結構域而具有其所有或任意的性質和功能。
一些實施方案中，本揭露的前述PD-1/PVRIG結合蛋白能夠抑制腫瘤生長至少約10%，例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或以上。
一些實施方案中，本揭露的PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白涵蓋變體，該變體與前述PD-1/PVRIG結合蛋白、PD- 1/TIGIT結合蛋白相比有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸突變；該胺基酸突變可以是保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加；該突變可以發生在特異性結合PD-1的抗原結合結構域、特異性結合PVRIG的抗原結合結構域、特異性結合TIGIT的抗原結合結構域的CDR區和/或FR區。
一些實施方案中，提供PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白，其與前述本揭露的PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白結合或競爭結合相同的PD-1、PVRIG和/或TIGIT或其表位；或阻斷前述本揭露的前述PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白與PD-1、PVRIG和/或TIGIT的結合；或其與PD-1、PVRIG和/或TIGIT的結合被前述本揭露的PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白阻斷。
一些實施方案中，提供PVRIG結合蛋白，其包含前述PD-1/PVRIG結合蛋白中的特異性結合PVRIG的抗原結合結構域。
本揭露中，涉及PVRIG結合蛋白或特異性結合PVRIG的抗原結合結構域，其均可包含或選自WO2016134333、WO2016134335、WO2018033798、WO2018220446、WO2019079777、WO2019232484、WO2020018879、WO2021021837、WO2021097294、WO2021091605、WO2021113831、中的PVRIG抗體。例如，PVRIG抗體可以為CPA.7.002、CPA.7.005、CPA.7.021和CPA.7.050中的任一種(參見WO2016134333)。此處全文引入上述專利。
一些實施方案中，提供TIGIT結合蛋白，其包含前述PD-1/TIGIT結合蛋白中的特異性結合TIGIT的抗原結合結構域。
本揭露中，涉及TIGIT結合蛋白或特異性結合TIGIT的抗原結合結構域，其均可包含或選自WO2019062832、WO2009126688、 WO2014089113、WO2015009856、WO2015143343、WO2015174439、WO2016028656、WO2016106302、WO2017053748、WO2017030823、US20160176963、US20130251720、WO2019232484、WO2019062832中的TIGIT抗體。例如，TIGIT抗體可以為CPA.9.083.H4(S241P)、CPA.9.086.H4(S241P)、CHA.9.547.7.H4(S241P)和CHA.9.547.13.H4(S241P)中的任一種(参见WO2019232484)。此處全文引入上述專利。
一些實施方案中，提供PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含前述PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白中的特異性結合TIGIT的抗原結合結構域和特異性結合PVRIG的抗原結合結構域。
多核苷酸和載體
本揭露提供編碼本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白的多核苷酸。本揭露的多核苷酸可為RNA、DNA或cDNA。根據本揭露的一些實施方案，本揭露的多核苷酸是基本上分離的多核苷酸。
本揭露的多核苷酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供PD-1結合蛋白體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的多核苷酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達，對該元件及其序列進行選擇為本領域技術人員的常識。對本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白的表達有用或必需的調控元件及 其他元件，例如為啟動子、增強子、終止子、整合因子、選擇標記物、前導序列、報告基因。
本揭露的多核苷酸可基於本揭露的多肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。
宿主細胞
本揭露提供表達或能夠表達一種或多種本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白和/或含有本揭露的核酸或載體的重組宿主細胞。一些實施方案中，宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。
真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。
哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。
然而，本揭露也可使用兩栖類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。
本揭露的細胞不能發育成完成的植株或動物個體。
生產或製備方法
本揭露提供製備本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白的方法，該方法通常包含以下步驟：
- 在允許表達本揭露的結合蛋白的條件下培養本揭露的宿主細胞；及
- 從培養物回收由該宿主細胞表達的結合蛋白；及
- 視需要地，包括進一步純化和/或修飾本揭露的結合蛋白。
本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白可在如上所述細胞中以細胞內方式(例如在細胞質中、在周質中或在包涵體中)產生，接著從宿主細胞分離且視需要進一步純化；或其可以細胞外方式(例如在培養宿主細胞的培養基中)產生，接著自培養基分離且視需要進一步純化。
用於重組產生多肽的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本揭露的結合蛋白或抗體的分離及純化技術為本領域技術人員所公知。生產和純化抗體的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。本揭露工程 化的抗體也可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。表達載體可以穩定地轉染細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。也可以用常規方法去除可溶的混合物和多聚體，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
然而，本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白也可以藉由本領域已知的其它產生蛋白質的方法獲得，例如化學合成，包括固相或液相合成。
組成物/醫藥組成物
本揭露提供組成物，包含前述PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白和/或TIGIT結合蛋白。
例如，提供醫藥組成物，其含有對癌症治療、緩解或預防有效量的如上所述的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白和/或PD-1/TIGIT結合蛋白和至少一種可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白和/或PD-1/TIGIT結合蛋白，或醫藥組成物單位劑量中 含PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白和/或PD-1/TIGIT結合蛋白的量為0.1-2000mg，在一些具體實施方式中為1-1000mg。
一些實施方案中，提供產品或藥盒，其含有至少一個容器，各自獨立地包含前述PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白和/或PD-1/TIGIT結合蛋白。可選地，藥盒包含容器和標簽。容器例如瓶、注射器和試管。容器容納有效於治療病症的組成物。容器上或與容器相連的標簽表明該組成物用於治療所選病症。組成物中含有前述PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白和/或PD-1/TIGIT結合蛋白。
一些實施方案中，提供醫藥組成物，包含本揭露的PD-1結合蛋白和PVRIG結合蛋白。另一些醫藥組成物，包含本揭露的PD-1結合蛋白和TIGIT結合蛋白。另一些醫藥組成物，包含本揭露的PD-1結合蛋白、TIGIT結合蛋白和PVRIG結合蛋白。該PD-1結合蛋白、TIGIT結合蛋白和/或PVRIG結合蛋白可以治療或緩解疾病(例如癌症)有效量的形式存在，醫藥組成物中還可以包含至少一種可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
示例性地，提供組成物、產品或藥盒，其含有以下任一項或其組合：
本揭露提供的任意PD-1結合蛋白；
本揭露提供的任意PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；
本揭露提供的任意PD-1/PVRIG結合蛋白；
本揭露提供的任意PD-1/TIGIT結合蛋白；
本揭露提供的任意PD-1結合蛋白和本揭露提供的任意PVRIG/TIGIT結合蛋白；
本揭露提供的任意PD-1結合蛋白和本揭露提供的任意PVRIG結合蛋白；
本揭露提供的任意PD-1結合蛋白和本揭露提供的任意TIGIT結合蛋白；或
本揭露提供的任意PD-1結合蛋白、本揭露提供的任意PVRIG結合蛋白和本揭露提供的任意TIGIT結合蛋白。
可選地，當組成物為醫藥組成物時，還含有至少一種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
治療疾病的方法和製藥用途
本揭露提供前述PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白、多核苷酸、組成物(包括醫藥組成物)用於治療、緩解、預防、診斷疾病或病症的方法。
一些實施方案中，提供改善、緩解、治療或預防疾病的方法，包括向受試者施用改善、緩解、治療或預防有效量的前述PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白、多核苷酸或組成物(包括醫藥組成物)。
一些實施方案中，提供本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白或PVRIG/TIGIT結合蛋白在製備改善、緩解、治療或預防疾病的藥物的用途。
一些實施方案中，提供本揭露的PD-1結合蛋白與PVRIG結合蛋白聯合在製備改善、緩解、治療或預防疾病的藥物的用途。
一些實施方案中，提供本揭露的PD-1結合蛋白與TIGIT結合蛋白聯合在製備改善、緩解、治療或預防疾病的藥物的用途。
一些實施方案中，提供本揭露的PD-1結合蛋白、PVRIG結合蛋白和TIGIT結合蛋白聯合在製備改善、緩解、治療或預防疾病的藥物的用途。
一些實施方案中，提供本揭露的PD-1結合蛋白與PVRIG/TIGIT結合蛋白聯合在製備改善、緩解、治療或預防疾病的藥物的用途。
一些實施方案中，提供本揭露的PD-1結合蛋白用於改善、緩解、治療或預防疾病，聯合PVRIG結合蛋白和/或TIGIT結合蛋白，或聯合PVRIG/TIGIT結合蛋白。
一些實施方案中，提供本揭露的PD-1結合蛋白改善、緩解、治療或預防疾病的方法，進一步包括施用PVRIG結合蛋白和/或TIGIT結合蛋白，或進一步包括施用PVRIG/TIGIT結合蛋白。
一些實施方案中，提供本揭露的PVRIG結合蛋白和/或TIGIT結合蛋白改善、緩解、治療或預防疾病的方法，進一步包括施用本揭露的PD-1結合蛋白。
一些實施方案中，提供本揭露的PVRIG/TIGIT結合蛋白改善、緩解、治療或預防疾病的方法，進一步包括施用本揭露的PD-1結合蛋白。
一些實施方案中，前述疾病為增殖性疾病或者任何特徵在於不受控細胞生長的其它疾病或病症(例如癌症，本揭露中，癌症和腫瘤可互相替代使用)，例如為PD-L1超量表達或與PVRIG、TIGIT異常表達相關的相關疾病(例如癌症)。
一些實施方案中，前述癌症為實體瘤或血液腫瘤。
一些實施方案中，前述癌症為晚期或轉移性的。
一些實施方案中，前述癌症選自以下或其組合：前列腺癌、肝癌(HCC)、結直腸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌、胃(stomach/gastric)癌、宮頸癌、頭頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌(鱗狀和基底細胞癌)、神經膠質瘤、腎癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、間皮瘤、食道癌、默克細胞癌(Merkel Cells cancer)、高MSI癌、KRAS突變腫瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生異常綜合症(MDS)。例如，選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症或者任何特徵在於不受控細胞生長的其它疾病或病症。
一些實施方案中，前述受試者具有與PVRIG和/或TIGIT相關的病況。一些具體方案中，受試者病況包括表達或不表達PVRIG的癌症並且進一步包括非轉移性或非浸潤性以及浸潤性或轉移性癌症，其中免疫細胞、基質細胞或發生病變的細胞的PVRIG表達抑制抗腫瘤反應和抗浸潤性免疫反應。本揭露的方法例如適合於治療血管化癌症。
一些實施方案中，提供治療或預防受試者感染或膿毒症的方法，包括向該受試者施用治療或預防有效量的前述PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白、多核苷酸、組成物(包括醫藥組成物)。一些具體方案中，該感染是病原體感染，以病毒特異性T細胞反應的 不同程度的功能性障礙為特徵，如HIV、HCV、HBV。一些具體方案中，該膿毒症包括重度膿毒症、膿毒性休克、全身炎症反應綜合症(SIRS)、菌血症、敗血症、毒血症、膿毒性綜合症。
一些實施方案中，提供活化受試者的細胞毒性T細胞(CTL)的方法，提供活化受試者的NK細胞的方法，提供活化受試者的γδT細胞的方法，提供活化受試者的Th1細胞的方法，提供活化、減少或消除受試者體內的調節性T細胞(Treg)中的至少一種的細胞數量和/或活性的方法，提供增加受試者體內的IFN-γ產生和/或促炎性細胞因子分泌的方法，提供抑制受試者體內的PVRIG和PVRL2的相互作用的方法，提供阻斷或抑制受試者體內PD-1與PD-L1/PD-L2的相互作用的方法，均包括向該受試者施用有效量的前述PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白、多核苷酸、組成物(包括醫藥組成物)。
檢測和試劑盒
本揭露提供PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白、多核苷酸、組成物的檢測用途。本揭露還提供用於體內或體外檢測PD-1、PVRIG、TIGIT的方法、系統或裝置，其包括用本揭露的前述結合蛋白、多核苷酸、組成物處理樣品。
一些實施方案中，體外檢測方法、系統或裝置可能例如包括：
(l)使樣品與PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、PVRIG結合蛋白、TIGIT結合蛋白、多核苷酸、組成物接觸；
(2)檢測在前述結合蛋白、多核苷酸和樣品之間形成的複合物；和/或
(3)使參比樣品(例如，對照樣品)與結合蛋白、核酸接觸；和
(4)藉由與參比樣品比較，確定複合物形成的程度。如與對照樣品或受試者中相比，樣品或受試者中複合物形成的變化(例如，統計學上的顯著變化)表示樣品中存在PD-1、PVRIG、TIGIT。
另一些實施方案中，體內檢測方法、系統或裝置可以包括：
(1)向受試者施用前述結合蛋白、多核苷酸；和
(2)檢測在結合前述結合蛋白、多核苷酸和受試者之間複合物的形成。
檢測可以包括確定形成複合物的位置或時間。用可檢測物質對前述結合蛋白、多核苷酸標記，藉由對該標記檢測以實現對能結合的蛋白、多核苷酸的物質(例如PD-1、PVRIG、TIGIT)的檢測。合適的可檢測物質包括多種酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射性物質。可以藉由測量與PD-1、PVRIG、TIGIT結合或不結合的物質或使其可視化，檢測結合蛋白、多核苷酸與PD-1、PVRIG、TIGIT的複合物形成。可以使用常規檢測測定法，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織免疫組織化學。出於檢測目的，本揭露的結合蛋白、多核苷酸可以用螢光團發色團標記。一些實施方案中，還提供包含上述多核苷酸、結合蛋白的診斷試劑，以及提供相關診斷用途。
一些實施方案中，還提供試劑盒，該試劑盒包含前述結合蛋白、多核苷酸，還可以包含診斷使用說明。試劑盒還可以含有至少一種額外的試劑，如標記物或額外的診斷劑。對於體內使用，該結合蛋白可以配製為醫藥組成物。
圖1A至圖1B為PD-1/PD-L1 NFAT報告基因系統檢測抗PD-1奈米抗體的活性結果。使用Pembrolizumab作為陽性對照，hIgG4作為陰性對照；其中，圖1A為A6_IgG4和A17_IgG4結果。圖1B為A17h1_IgG4、A17m09_hIgG4、A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4、A17m0903_hIgG4、A17m0905_hIgG4的結果。
圖2為藉由DC細胞：T細胞混合淋巴反應中細胞因子的釋放檢測A17m09_hIgG4對T細胞激活程度，使用Pembrolizumab作為陽性對照，hIgG4作為陰性對照。
圖3A至圖3B為A17m09_hIgG4抑制小鼠MC38結腸癌腫瘤生長的體內藥效試驗結果，圖3A為小鼠腫瘤體積結果圖，圖3B為小鼠體重圖，使用Pembrolizumab作為陽性對照，PBS作為陰性對照。
圖4為抗PVRIG奈米抗體30、151的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗結果，使用Tab5作為陽性對照，hIgG4作為陰性對照。
圖5為抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體1708-151H8的MLR實驗結果，同時檢測151H8、1708、hIgG4、Tab5、Pembrolizumab作為對照。
圖6A至圖6B為抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體1708-151、1708和151的聯用在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤結果。圖6B為對應的小鼠體重圖。
圖7A至圖7B為抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體1708-151H7和1708-30H2在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤結果。圖7B為對應的小鼠體重圖。
圖8為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的4種抗體構型示意圖。
圖9A至圖9B分別為A17h1-1708-30H2、A17h1-1708-151H7各自4種構型的抗體結合TIGIT抗原的檢測結果。
圖10A至圖10B分別為A17h1-1708-30H2、A17h1-1708-151H7各自4種構型的抗體結合PVRIG抗原的檢測結果。
圖11A、圖11B、圖11C分別為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體中PVRIG序列優化後與過表達PVRIG、TIGIT、PD-1抗原的細胞的結合能力。
圖12A至圖12B分別為A17h1-1708-30H2、A17h1-1708-151H7各自4種構型的抗體在PD-1/PD-L1 NFAT報告基因系統中對PD-L1/PD-1結合的阻斷。
圖13A至圖13B分別為A17h1-1708-30H2、A17h1-1708-151H7各自4種構型的抗體的MLR檢測結果。
圖14A至圖14B分別為兩個受試者中A17m0902-1708-30H2-C的MLR檢測結果。
圖15A至圖15B分別為A17h1-1708-30H2、A17h1-1708-151H7各自4種構型的抗體的NK細胞殺傷功能實驗結果。
圖16A至圖16B抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在PD-1單抗響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中抗腫瘤作用評估。
圖17A至圖17B抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在PD-1單抗不響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中抗腫瘤作用評估。
術語定義
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本揭露中另有明確定義，本揭露使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“程序性死亡1”、“細胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PDCD1”和“hPD-1”可互換使用，且包括人PD-1的變體、同種型、物種同源物、以及與PD-1具有至少一個共同表位的類似物。完整的PD-1序列可以從GenBank登錄號U64863找到。“程序性死亡配體-1(PD-L1)”是PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體之一(另一種為PD-L2)，它在與PD-1結合時下調T細胞活化和細胞因子分泌。如本文中使用的“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的變體、同種型、和種間同源物，以及與hPD-L1具有至少一個共同表位的類似物。完整的hPD-L1序列可以用GenBank登錄號Q9NZQ7查到。
“PVRIG”或“PVRIG蛋白質”或“PVRIG多肽”可以視需要地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型PVRIG，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異 體或同工型，並且尤其是PVRIG的可溶性胞外域(ECD)片段。此處ECD的定義如專利WO2016134333所述。完整的人類PVRIG序列可以GenBank登錄號AAH73861.1找到。
“TIGIT”或“TIGIT蛋白質”或“TIGIT多肽”可以視需要地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型TIGIT，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型。完整的TIGIT序列可以GenBank登錄號AAI01289.1找到。
“與PD-1結合”，指能與PD-1或其表位相互作用，該PD-1或其表位可以是人源的。“與PVRIG結合”，指能與PVRIG或其表位相互作用，該PVRIG或其表位可以是人源的。“與TIGIT結合”，指能與TIGIT或其表位相互作用，該TIGIT或其表位可以是人源的。“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本揭露抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
“PD-1結合蛋白”涵蓋任何能夠特異性結合PD-1的蛋白或其表位的任何分子。PD-1結合蛋白可以包括針對PD-1的如本揭露定義的抗體、其抗原結合片段或其綴合物。PD-1結合蛋白還涵蓋免疫球蛋白超家族抗體(IgSF)或CDR移植分子。本揭露的“PD-1結合蛋白”可以包含至少一個結合PD-1的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)。在一些實施方案中，“PD-1結合蛋白”可以包含2、3、4或更多個結合PD-1的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)。本揭露的PD-1結合蛋白除包含PD-1的免疫球蛋白單一可變結構域外，也可包含連接子和/或具有效應功能的部分，例如半衰期延長部分(如結合血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域)、和/或融合配偶體(如血清白蛋白)和/或綴合的聚合物(如PEG)和/或Fc區。在一些實施方案中，本揭露的“PD-1結合蛋白”還涵蓋雙/多特異性抗體，其含有結合不同抗原的免疫球蛋白(如結合第一抗原(如PD-1)的第一抗體和結合第 二抗原(如PVRIG)的第二抗體，視需要包括結合第三體原(如TIGIT)的第三特異性抗體，進一步可選的，包括結合第四抗原的第四抗體。“PD-1結合蛋白”涵蓋“PD-1/PVRIG結合蛋白”、“PD-1/TIGIT結合蛋白”、“PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白”。
本揭露的“PD-1結合蛋白”或“抗PD-1抗體”可以例如綴合的方式包含一個或多個效應分子。該“效應分子”包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、其它抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素，特別地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金屬、奈米顆粒和報導基團例如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜分析檢測的化合物。當效應分子是聚合物時，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如視需要地取代的直鏈或支鏈聚亞(伸)烷基、聚亞(伸)烯基或聚氧化亞(伸)烷基聚合物或分支多糖或未分支多糖，例如同聚或異聚多糖。可存在於上述合成聚合物上的具體的視需要取代基包括一個或多個羥基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具體實例包括視需要地取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特別地視需要地取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具體的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。在一個實施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。聚合物與PD-1結合蛋白或抗PD-1抗體的綴合方式可以藉由常規方法實現。
“細胞因子”是由一個細胞群體釋放的、作為細胞間介質作用於其它細胞的蛋白質的一般術語。這樣的細胞因子的例子包括淋巴因子、單核因子、趨化因子和傳統的多肽激素。示例性的細胞因子包括：人IL-2、IFN-γ、IL-6、TNFα、IL-17和IL-5。
“抗體”涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。抗體可以指免疫球蛋白，是由兩條重鏈和兩條輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的框架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
“抗原結合片段”涵蓋單鏈抗體(即全長重鏈和輕鏈)；Fab、修飾的Fab、Fab’、修飾的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單結構域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二價或三價或四價抗體、Bis-scFv、 雙抗體(diabody)、三抗體(tribody、triabody)、四抗體(tetrabody)和上述任意一種的表位結合片段(參見例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3)209-217)。
產生和製備這些抗原結合片段的方法在本領域是公知的(參見例如Verma等人，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首先公開於WO2009/040562，其二硫鍵穩定化形式Fab-dsFv首先公開於WO2010/035012。本揭露的抗原結合片段還包括描述於WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中的Fab和Fab’片段。多價抗體可包含多特異性例如雙特異性或可以是單特異性的(參見例如WO92/22583和WO05/113605)，後者的一個示例是描述於WO92/22583中的Tri-Fab(或TFM)。
“雙特異性抗體”涵蓋對兩個不同抗原或同一抗原的兩個或至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。現有技術已公開了各種結構的雙特異性抗體。根據IgG分子的完整性，可分為IgG樣雙特異性抗體和抗體片段型雙特異性抗體。根據抗原結合區域的數量，可分為二價、三價、四價或更多價的雙特異性抗體。根據結構左右是否對稱，可分為對稱結構雙特異性抗體和不對稱結構雙特異性抗體。其中，基於抗體片段的雙特異性抗體，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其藉由將2個或多個Fab片段結合在一個分子中形成雙特異性抗體，其具有較低的免疫原性，且分子量小，具有較高的腫瘤組織滲透性，該類型的典型的抗體結構如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab等雙特異性抗體。 IgG樣雙特異性抗體(例如具有Fc片段)，這類抗體相對分子量較大，Fc片段有助於抗體後期的純化，並提高其溶解性、穩定性，Fc部分還可能會與受體FcRn結合，增加抗體血清半衰期。典型的雙特異性抗體結構模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、Fc△Adp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等雙特異性抗體(參見Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019：4516041)。
“三特異性抗體”指能特異性結合三個或至少三個不同抗原表位，可以是不同抗原的抗原表位或同一抗原的不同抗原表位。
對於CDR的確定或定義，能夠藉由分辨抗體的結構和/或分辨抗體-配體複合物的結構，來完成對CDR的確定性描繪和對結合位點的殘基的鑑定。這可藉由本領域技術人員已知的各種技術中的任一種，例如X射線晶體學來實現。多種分析方法可用於鑑定CDR，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統、AbM編號系統、IMGT編號系統、接觸定義、構象定義。
Kabat編號系統是用於編號抗體中殘基的標準並且通常用於鑑定CDR區域(參見例如Johnson&Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28：214-8)。Chothia編號系統與Kabat編號系統類似，但Chothia編號系統考 慮了某些結構環區域的位置。(參見例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM編號系統使用建模抗體結構的由Oxford Molecular Group生產的計算機程序集成套件(參見例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM編號系統使用知識數據庫和從頭開始方法的組合，從基本序列建模抗體的三級結構(參見Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接觸定義基於可用複雜晶體結構的分析(參見例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。構象定義中，CDR的位置可鑑定為對抗原結合做出焓貢獻的殘基(參見例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍然與Kabat CDR的至少一部分重疊。根據特定殘基或殘基組不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果，CDR的邊界可縮短或延長。如本揭露使用的，CDR可指藉由本領域已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。各種編號系統之間的對應關係是本領域技術人员熟知的，示例性地，如下表1中所示。
Figure 111134965-A0202-12-0043-1
本揭露的抗體的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號系統。
本揭露的抗體可以是多株的、單株的、異種的、同種異體的、同基因的或其經過修飾的形式，其中單株抗體尤其適用於多個實施例中。一般來說，本揭露的抗體是重組抗體。
如本文所用的“重組”泛指例如細胞或核酸、蛋白質或載體等產品，表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已經藉由引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而加以修飾。例如，重組細胞表達天然(非重組)細胞形式內不存在的基因或表達原本異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。
多肽或蛋白的“結構域”是指折疊蛋白結構，其能夠獨立於蛋白的其餘部分維持其三級結構。一般而言，結構域負責蛋白的單個功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其它蛋白而不損失蛋白的其餘部分和/或結構域的功能。
“免疫球蛋白結構域”是指抗體鏈的球形區域。免疫球蛋白結構域的特徵在於其維持抗體分子的折疊特徵。
“免疫球蛋白可變結構域”是指基本上由“框架區1”或“FR1”、“框架區2”或“FR2”、“框架區3”或“FR3”、及“框架區4”或“FR4”的四個“框架區”、“互補決定區1”或“CDR1”、“互補決定區2”或“CDR2”、及“互補決定區3”或“CDR3”的三個“互補決定區”或“CDR”組成的免疫球蛋白結構域。因此，免疫球蛋白可變結構域的一般結構或序列可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域因具有抗原結合位點而賦予其對抗原的特異性。
“抗體框架(FR)”，是指可變結構域的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。
“免疫球蛋白單一可變結構域”通常用於指可以在不與其他可變結構域相互作用的情況下(例如在沒有如常規四鏈單株抗體的VH和VL結構域之間所需要的VH/VL相互作用的情況下)，形成功能性抗原結合位點的免疫球蛋白可變結構域(其可以是重鏈或輕鏈結構域，包括VH、VHH或VL結構域)。“免疫球蛋白單一可變結構域”的實例包括奈米抗體(包括VHH、人源化VHH和/或駱駝化VH，例如駱駝化人VH)、IgNAR、結構域、作為VH結構域或衍生自VH結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)和作為VL結構域或衍生自VL結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)。基於和/或衍生自重鏈可變結構域(諸如VH或VHH結構域)的免疫球蛋白單一可變結構域通常是較佳的。免疫球蛋白單一可變結構域的一個具體實例為如下文定義的“VHH結構域”(或簡稱為“VHH”)。
“VHH結構域”，亦稱為重鏈單域抗體、VHH、VHH結構域、VHH抗體片段、VHH抗體、奈米抗體，是稱為“重鏈抗體”(即“缺乏輕鏈的抗體”)的抗原結合免疫球蛋白的可變結構域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用術語“VHH結構域”以將該VHH與存在於常規四肽鏈結構抗體中的VH以及VL進行區分。VHH結構域特異性結合表位而無需其他抗原結合結構域(然而，常規四肽鏈結構抗體中，表位由VL結構域與VH結構域一起識別)。VHH結構域為由單一免疫球蛋白結構域形成的小型穩定及高效的抗原識別單元。術語“重鏈單域抗體”、“VHH結構域”、“VHH”、“VHH結構域”、“VHH抗體片段”、“VHH抗體”、“Nanobody®”以及“Nanobody®結構域”(“Nanobody”為Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商標)可互換使用。“VHH結構域”包括但不限於經駱駝科動物產生的天然抗體，也可以是駱駝科動物產生的抗體後再經人源化的，也可以是經噬菌體體展示技術篩選獲得的。VHH結構域中的胺基酸殘基的總數將通常在110至120範圍內，常常介於112與115之間。然而應注意較小及較長序列也可適於本揭露所述的目的。獲得結合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公開於以下文獻中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。
如本領域中對於VH結構域及VHH結構域所公知的，各CDR中的胺基酸殘基的總數可能不同，且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數(即根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被佔據，或實際序列可能含有多於Kabat編號所允許數目的胺基酸殘基)。這意味著一般而言，根據Kabat的編號可能對應或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。VHH的其它編號系統或編碼規則包括Chothia、IMGT、AbM。
“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜带大量非人蛋白成分，從而誘導的强烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該全人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。“人源化”的例子包括：在和常規四肽鏈結構抗體VH結構域中相應位置處，將源自駱駝科的VHH結構域藉由存在的一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基而“人源化”(本揭露中亦稱為“序列優化”，除人源化外，“序列優化”也可涵蓋藉由提供VHH改良性質的一個或多個突變對序列進行的其它修飾，例如移除潛在的轉譯後修飾位點)。人源化VHH結構域可含有一個或多個完全人框架區序列。在一些具體實施方案中，可含IGHV3的人框架區序列。“人源化”的又一例子包括將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜带大量異源蛋白成分，從而誘導的强烈的抗體可變抗體反應。人源化方法例如蛋白表面胺基酸人源化(resurfacing)及抗體人源化通用框架移植法(CDR grafting to a universal framework)，即將CDR“移植”於其它“支架”(包括但不限於人支架或非免疫球蛋白支架)上。適於該CDR移植的支架及技術在本領域中是已知的。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。本揭露的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。此外，為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。
“親和力成熟的”抗體指與親本抗體相比，在一個或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體，此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。例如，“親和力成熟”的PD-1結合蛋白或PD-1抗體，在一個或多個CDR中具有一個或多個變化，該變化導致對抗原的親和力相比於其親本抗體有所增加。親和力成熟的抗體可藉由例如由以下所述的本領域中已知的方法來製備：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。
“全人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本揭露的全人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基 酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。“全人抗體”不包括“人源化抗體”。
通常，“特異性結合”、“選擇性結合”是指結合蛋白與抗原上的表位結合。本揭露的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白、PD-1/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白將以如於Biacore或KinExA或Fortibio測定中測量的較佳10-7至10-10莫耳/升(M)、更佳10-8至10-10莫耳/升、甚至更佳10-9至10-10或更低的解離常數(KD)，和/或以至少10-7M、較佳至少10-8M、更佳至少10-9M，更佳至少10-10M的締合常數(KA)結合所要結合的抗原(即PD-1、PVRIG和/或TIGIT)或其表位。任何大於10-4M的KD值一般都視為指示非特異性結合。結合蛋白對抗原或表位的特異性結合可以以已知的任何適合方式來測定，包括例如本揭露所述的表面電漿共振術(SPR)測定、Scatchard測定和/或競爭性結合測定(例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)及夾心式競爭性測定)。
“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定表位與給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本揭露所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
“結合親和力”或“親和力”在本揭露中用作兩個分子(例如抗體或其部分與抗原)之間的非共價相互作用的強度量度。兩個分子之間的結 合親和力可藉由確定解離常數(KD)來量化。可藉由使用例如表面電漿共振(SPR)方法(Biacore)測量複合物形成和解離的動力學來確定KD。對應於單價複合物的結合和解離的速率常數分別被稱為結合速率常數ka(或kon)和解離速率常數kd(或koff)。KD藉由方程KD=kd/ka與ka和kd有關。解離常數的值可藉由眾所周知的方法直接確定，並且甚至可藉由例如Caceci等人(1984，Byte 9：340-362)中該那些方法對於複雜混合物進行計算。例如，可使用雙重過濾硝化纖維素濾器結合測定如Wong & Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)中公開的那種來確定KD。評估抗體針對靶抗原的結合能力的其它標準測定是本領域已知的，包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和流式細胞術分析、以及本揭露例舉的其它測定。抗體的結合動力學和結合親和力也可藉由本領域已知的標準測定，例如表面電漿共振(SPR)，例如藉由使用BiacoreTM系統或KinExA來評價。可藉由比較各個抗體/抗原複合物的KD值來比較與不同分子相互作用相關的結合親和力，例如，不同抗體對於給定抗原的結合親和力的比較。類似地，相互作用的特異性可藉由確定和比較目的相互作用(例如抗體和抗原之間的特異性相互作用)的KD值與非目的相互作用(例如已知不結合PD-1的對照抗體)的KD值進行評價。
“保守性置換”指置換為具有與原始胺基酸殘基相似的特性的另一個胺基酸殘基。例如，賴胺酸、精胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有鹼性側鏈，並且天冬胺酸和谷胺酸具有相似的特性，在於它們具有酸性側鏈。此外，甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸和色胺酸具有相似的特性，在於它們具有不帶電荷極性側 鏈，並且丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸和甲硫胺酸具有相似的特性，在於它們具有非極性側鏈。另外，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有芳族側鏈。因此，本領域技術人員將顯而易見，甚至當置換如上文所述的顯示相似特性的組中的胺基酸殘基時，它將不顯示特性的特定變化。
“同源性”、“同一性”或“序列同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同核苷酸或胺基酸單體佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被相同核苷酸佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
“核酸”或“多核苷酸”在本文可互換使用，指的是單鏈或雙鏈的任何DNA分子或RNA分子以及在單鏈的情況下，它的互補序列的分子，較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“可操作連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子可操作地連接至該編碼序列。
“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物，其可為或已是用於摻入多核苷酸插入片段的載體的接受者。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然、偶然或有意的突變，子代不一定與親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本揭露的多核苷酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用， 並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是，由於有意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。該術語包括與最初轉化中篩選的細胞具有相同的功能或生物學活性的突變後代。
“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
“阻止…的生長”或“生長抑制”是指抑制細胞的生長或增殖。
“增殖性疾病”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。在一個實施方案中，增殖性病症指癌症。
“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。“癌症”、“癌性”、“增殖性病症”和“腫瘤”在本揭露中提到時並不互相排斥。
“預防癌症”是指在受試者中延遲、抑制或防止癌症發作，該受試者中癌症發生或腫瘤發生的起始尚未得到證實，但是藉由例如遺傳篩查或其它方法確定，已鑑定了癌症易感性。該還包括治療具有癌變前病症的受試者以終止該癌變前病症向惡性腫瘤的進展或導致其消退。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸，例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種結合蛋白或其醫藥組成物作為治療劑，該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種增殖性疾病或其症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床能測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或產品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。本揭露的受試者可以是動物或人類受試者。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。“和/或”應視 為特定揭示兩種指定特徵或組分中的每一者具有或不具有另一者。因此，諸如本揭露中“A和/或B”的詞組中所用的術語“和/或”包括“A及B”、“A或B”、“A”(單獨)及“B”(單獨)。除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和請求項申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。
本揭露的“受試者”、“患者”意指哺乳動物，尤其靈長類動物，尤其是人。
實施例
以下結合實施例用於進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制本揭露的範圍。
本揭露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 抗PD-1奈米抗體的篩選、製備和功能驗證
本實施例使用帶有His標簽的人PD-1作為免疫抗原，使用帶有生物素標記的人PD-1和食蟹猴PD-1作為篩選抗原，以上均購自AcroBiosystems公司。
實施例1-1. 抗PD-1奈米抗體的篩選和製備
1.免疫抗原、篩選抗原序列和製備
Figure 111134965-A0202-12-0054-2
人PD-1蛋白(NP_005009.2)序列如下，其中下劃線為胞外區域序列，胺基酸起止Leu25-Gln 167。
>人PD-1胺基酸序列
Figure 111134965-A0202-12-0054-3
Figure 111134965-A0202-12-0054-5
(SEQ ID NO：1)。
2.羊駝免疫、奈米抗體酵母展示文庫構建和抗體篩選
1)羊駝免疫
對2隻健康羊駝(alpaca)進行免疫。第0天初次免疫，將0.25mg人PD-1抗原與弗氏完全佐劑(CFA)1ml混勻後皮下注射。第21、42、63天，將0.125mg人PD-1抗原與弗氏不完全佐劑(IFA)1ml混勻後皮下 注射。分別在第28天、49天、70天採血10ml、50ml、50ml。檢測血清滴度，符合建庫標準的羊駝外周淋巴細胞用於構建奈米抗體酵母展示文庫。
2)酵母庫構建
分別採集2隻羊駝第三次和第四次免疫後50mL外周血，分離出外周血中的PBMC，提取PBMC中的RNA，反轉錄，獲取總cDNA。將cDNA作為巢氏PCR第一輪反應模板。經過兩輪巢式PCR擴增，第二輪巢氏PCR產物片段與酵母文庫載體(酵母文庫載體pYDN3)連接，將連接產物電擊轉化進入酵母感受態細胞。採用菌落PCR方法驗證插入率和文庫多樣性。依據庫轉化子數、庫插入率和文庫多樣性分析測序結果表明，一隻羊駝文庫庫容為9.28×107，另一隻羊駝文庫庫容為1.54×108。
3)奈米抗體(VHH)篩選
對此酵母展示系統採用流式細胞(FACS)分選，以及文庫篩選與鑑定進行抗體的篩選。分選採用兩輪分選步驟：第一輪分選採用生物素標記人PD-1蛋白(Avitag-His Tag)磁珠富集，第二輪採用生物素標記猴PD-1蛋白(His,Avitag)流式分選儀進行分選(流式抗體為：Mouse anti-HA tag Dylight 488；streptavidin Dylight 650)。兩輪分選結束後經過單株鑑定、測序、序列分析獲得人、猴PD-1抗原交叉結合的18條VHH獨特序列。以下示出其中的A6和A17序列。
>A6可變區
Figure 111134965-A0202-12-0055-6
Figure 111134965-A0202-12-0055-7
(SEQ ID NO：2)
>A17可變區
Figure 111134965-A0202-12-0056-8
Figure 111134965-A0202-12-0056-9
(SEQ ID NO：3)。
Figure 111134965-A0202-12-0056-10
將上述序列分別連接到人IgG4 Fc(包含鉸鏈區，且帶有S228P，根據Eu編號系統)片段上，構建成VHH-Fc抗體。構建質粒，瞬轉HEK293細胞，表達，使用protein A管柱純化，PBS洗管柱，0.1M甘胺酸緩衝液沖提，pH 2.5。透析至PBS pH7.4緩衝液中。其中人IgG4 Fc(包含鉸鏈區)以及基於A6和A17的VHH-Fc抗體序列如下：
>hIgG4
Figure 111134965-A0202-12-0056-11
Figure 111134965-A0202-12-0057-12
(SEQ ID NO：10)；
>A6_hIgG4
Figure 111134965-A0202-12-0057-13
Figure 111134965-A0202-12-0057-14
(SEQ ID NO：11)；
>A17_hIgG4
Figure 111134965-A0202-12-0057-15
(SEQ ID NO：12)。
實施例1-2. 抗PD-1奈米抗體與抗原PD-1的親和力鑑定
1. ELISA
使用PBS溶解人PD-1蛋白(his tag)至1μg/mL，100uL/孔加入到96孔板中，4℃過夜，包被抗原。使用PBST(PBS+0.05% tween20)溶液洗三次。加入PBST/1%BSA溶液，37℃孵育1h，進行封閉。PBST溶液洗三次後加入不同濃度的候選PD-1 VHH-Fc抗體(PBST/1% BSA溶液稀釋)，37℃孵育1.5小時。PBST溶液洗三次。加入100μL HRP偶聯的抗人IgG4 Fc的二抗(Thermo)溶液，37℃孵育1小時。PBST溶液洗三次後，加入100μL/孔TMB溶液，室溫反應5min後，加入50μL終止液，而後使用酶標儀讀取450nM值，計算EC50，
結果如表4，顯示A6_hIgG4和A17_hIgG4均與PD-1抗原有較強的結合力。
Figure 111134965-A0202-12-0058-16
2. FACS
為檢測抗PD-1奈米抗體與細胞膜上表達的PD-1的結合能力，將不同濃度的候選抗PD-1 VHH-Fc抗體加入到105/孔過表達人PD-1的Jurkat細胞(Cat：J1250，Promega)中，室溫孵育20min後，PBS洗兩次後，加入100μL抗人IgG Fc的螢光二抗(Biolegend)，室溫孵育20min 後，PBS洗兩次，250μL PBS重新懸浮，使用FACS檢測螢光信號，計算EC50。
使用Pembrolizumab(購自百英生物)作為對照，結果如表5所示。並且，A17_hIgG4的EC50值為0.3568nM，顯著優於同步篩選獲得的其它抗體(結果未出示)。
Figure 111134965-A0202-12-0059-17
實施例1-3. 抗PD-1奈米抗體的序列改造
1.抗PD-1奈米抗體的人源化和回復突變
抗體人源化藉由CDR-grafting方法進行。藉由IMGT或NCBI網站，將親本抗PD-1抗體與IMGT或NCBI/igblast數據庫中的全人源胚系基因進行比對，選擇與PD-1奈米抗體高度同源的人胚系基因IGHV 3-23(IGHV3-23*01；IGHV3-23*04)作為人源化模板。移植CDR，保留奈米抗體的FR2中的4個關鍵殘基(Y37、E44、R45、L47)，並對接近CDR區的關鍵核心殘基，以及與CDR相互作用的Vernier位置殘基進行回復突變，獲得人源化抗體A17h1、A17h2、A17h3、A6h1。
>A17h1可變區
Figure 111134965-A0202-12-0060-18
(SEQ ID NO：13)；
>A17h2可變區
Figure 111134965-A0202-12-0060-19
Figure 111134965-A0202-12-0060-20
(SEQ ID NO：14)；
>A17h3可變區
Figure 111134965-A0202-12-0060-21
Figure 111134965-A0202-12-0060-23
(SEQ ID NO：15)；
>A6h1可變區
Figure 111134965-A0202-12-0060-24
Figure 111134965-A0202-12-0060-25
(SEQ ID NO：16)。
2.去除TCE(T細胞表位)、降低抗體脫醯胺、降低抗體異構化改造
為降低抗體潛在的免疫原性風險，進行去除TCE改造。為提高抗體的成藥性，進行抗體脫醯胺、抗體異構化位點的改造。獲得如下序列：
>A17m01可變區
Figure 111134965-A0202-12-0061-26
Figure 111134965-A0202-12-0061-27
(SEQ ID NO：17)
>A17m02可變區
Figure 111134965-A0202-12-0061-28
Figure 111134965-A0202-12-0061-29
(SEQ ID NO：18)
>A17m03可變區
Figure 111134965-A0202-12-0061-30
Figure 111134965-A0202-12-0061-31
(SEQ ID NO：19)
>A17m04可變區
Figure 111134965-A0202-12-0061-32
Figure 111134965-A0202-12-0061-33
(SEQ ID NO：20)
>A17m05可變區
Figure 111134965-A0202-12-0061-34
Figure 111134965-A0202-12-0061-35
(SEQ ID NO：21)
>A17m06可變區
Figure 111134965-A0202-12-0061-36
Figure 111134965-A0202-12-0061-37
(SEQ ID NO：22)
>A17m07可變區
Figure 111134965-A0202-12-0062-38
Figure 111134965-A0202-12-0062-39
(SEQ ID NO：23)
>A17m08可變區
Figure 111134965-A0202-12-0062-40
Figure 111134965-A0202-12-0062-41
(SEQ ID NO：24)
>A17m09可變區
Figure 111134965-A0202-12-0062-42
Figure 111134965-A0202-12-0062-44
(SEQ ID NO：25)
>A17m10可變區
Figure 111134965-A0202-12-0062-45
Figure 111134965-A0202-12-0062-46
(SEQ ID NO：26)
>A17m11可變區
Figure 111134965-A0202-12-0062-47
Figure 111134965-A0202-12-0062-48
(SEQ ID NO：27)
>A17m12可變區
Figure 111134965-A0202-12-0063-49
Figure 111134965-A0202-12-0063-50
(SEQ ID NO：28)
>A17m13可變區
Figure 111134965-A0202-12-0063-51
Figure 111134965-A0202-12-0063-52
(SEQ ID NO：29)
>A17m14可變區
Figure 111134965-A0202-12-0063-53
Figure 111134965-A0202-12-0063-54
(SEQ ID NO：30)
>A17m15可變區
Figure 111134965-A0202-12-0063-55
Figure 111134965-A0202-12-0063-56
(SEQ ID NO：31)。
並且，進一步選擇A17m09對抗體序列胚系化改造，以提高人源化程度，獲得如下序列：
>A17m0901可變區
Figure 111134965-A0202-12-0063-57
Figure 111134965-A0202-12-0063-219
(SEQ ID NO：32)
>A17m0902可變區
Figure 111134965-A0202-12-0064-59
Figure 111134965-A0202-12-0064-60
(SEQ ID NO：33)
>A17m0903可變區
Figure 111134965-A0202-12-0064-61
Figure 111134965-A0202-12-0064-62
(SEQ ID NO：34)
>A17m0905可變區
Figure 111134965-A0202-12-0064-63
Figure 111134965-A0202-12-0064-64
(SEQ ID NO：35)。
即，本揭露的A17具有如下的通式序列：
CDR1：DYSMS(SEQ ID NO：7)
CDR2：IISGSGX1X2X3HYVDSVKG，其中，X1選自V或G，X2選自I或S，X3選自T或A(SEQ ID NO：36)
CDR3：VSDWX4X5Y，其中，X4選自D或E，X5選自D或E(SEQ ID NO：37)。
具體地，CDR2可以為：
IISGSGVIAHYVDSVKG(SEQ ID NO：8)
IISGSGVITHYVDSVKG(SEQ ID NO：38)
IISGSGGIAHYVDSVKG(SEQ ID NO：39)
IISGSGVSAHYVDSVKG(SEQ ID NO：40)
IISGSGGITHYVDSVKG(SEQ ID NO：101)
具體地，CDR3可以為：
VSDWDDY(SEQ ID NO：9)
VSDWEDY(SEQ ID NO：41)
VSDWDEY(SEQ ID NO：42)。
實施例1-4. PD-1/PD-L1報告基因系統檢測抗PD-1奈米抗體對PD-L1結合PD-1的阻斷
使用PD-1/PD-L1 NFAT基因報告系統(Cat：J1250，Promega)，可以檢測抗PD-1抗體在細胞層面的生物學活性功能。該系統由兩個基因工程細胞系組成：過表達PD-1的效應細胞Jurkat(內含NFAT報告基因螢光素酶)和過表達PD-L1的抗原遞呈細胞CHO-K1細胞。當這兩種細胞共培養時，PD-1/PD-L1相互作用會抑制TCR介導的NFAT活化，進而抑制NFAT報告基因螢光素酶的表達。當PD-1/PD-L1相互作用被破壞時，TCR激活會藉由NFAT通路誘導螢光素酶的表達，可以藉由添加Bio-Glo試劑和使用光度計進行螢光定量檢測，從而測定效應細胞活化程度以及抗體的生物學活性。
將過表達PD-L1的CHO-K1細胞稀釋到4×105/mL，在96孔板中，每孔加入100μL，培養過夜。吸出培養基後，迅速加入40μL 1.25×106/mL的PD-1 Jurkat細胞以及不同濃度的40μL抗PD-1奈米抗體溶液(1640+2%FBS溶液稀釋)。37℃培養6小時，恢復至室溫，每孔加入40μL Bright-glo試劑(Cat：E2620，promega)，350rpm避光震盪5min，避光，室溫靜置5min後，使用酶標儀讀取螢光值，計算IC50。
使用Pembrolizumab和hIgG4 isotype作為對照。如圖1A和表6所示，A17_hIgG4的生物學功能活性IC50值為1.199nM，顯著優於本揭露同步篩選的其它抗體(例如A3_hIgG4為7.62，A13_hIgG4為3.208；A3_hIgG4和A13_hIgG4未示出序列)。
Figure 111134965-A0202-12-0066-65
採用如上方法，對人源化的抗PD-1奈米抗體進行功能驗證，參見圖1B和表7，A17h1_hIgG4的IC50活性與陽性抗體Pembrolizumab相似。經序列改造的候選分子中，A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4抗體的生物學活性IC50值分別為0.5307nM、0.4352nM，優於Pembrolizumab。
Figure 111134965-A0202-12-0067-66
實施例1-5. 經改造的抗PD-1奈米抗體與抗原PD-1的結合親和力鑑定
使用Biacore 8k(GE Healthcare)儀器，採用表面電漿共振技術(surface plasmon resonance，SPR)檢測抗PD-1奈米抗體與PD-1抗原的親和力。實驗選用CM5傳感器芯片，流動相採用HBS-EP+緩衝溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05% surfactant P20)。將抗人IgG(Fc)抗體用10mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.0)，配製成30μg/mL溶液，選擇Immobilization程序自動進行抗人IgG(Fc)抗體通道胺基偶聯固定。用HBS-EP+緩衝溶液分別配製各待測抗體作為配體，用芯片通道上的抗人IgG(Fc)抗體進行捕獲。將人或食蟹猴PD-1抗原蛋白(Sino Biological，10377-H08H；90311-C08H)作為分析物，用HBS-EP+緩衝溶液進行配製，分析物進行2倍梯度稀釋，在30μL/min的流速下流過實驗通道和參比通 道，結合1min，解離15min。再生緩衝液10mM Glycine pH 1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)在10μl/min的流速下運行30s，計算結合速率Ka和解離速率Kd，以及解離常數(即親和力KD)。結果參見表8和表9。
Figure 111134965-A0202-12-0068-67
Figure 111134965-A0202-12-0068-68
結合人PD-1抗原結果顯示，人源化抗體A17h1_hIgG4及後續改造優化的抗體A17m09_hIgG4、A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4與Pembrolizumab具有相似的KD值。A17h1_hIgG4、A17m09_hIgG4、A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4均比Pembrolizumab的解離速率慢。 A17h1_hIgG4、A17m09_hIgG4、A17m0901_hIgG4、A17m0902_hIgG4抗體交叉結合猴PD-1，抗體與人和猴PD-1具有相似的親和力。
實施例1-6. DC：T混合淋巴反應(Mix Lymphocyte Reaction，MLR)檢驗經改造的抗PD-1奈米抗體的體外藥效
成熟的樹突細胞(Dendritic cells，DC)與異體T細胞共培養，可以激活T細胞，促進T細胞分泌細胞因子。該過程受PD-1/PD-L1信號抑制，使用抗PD-1抗體可以解除抑制，促進T細胞活化。因此，使用DC：T混合淋巴反應實驗，可以檢驗抗PD-1抗體的體外藥效。
使用分選試劑盒(cat：19359，stemcell)從一個健康人的新鮮外周血(PBMC)中分選出單核細胞。使用DC細胞誘導試劑盒(cat：10985，stemcell)，培養七天後，誘導單核細胞分化為成熟DC細胞。而後使用分選試劑盒(cat：17951，stemcell)從另一個健康人的新鮮PBMC中分選出異體T細胞。將5000個成熟DC細胞與50000個異體T細胞共培養，並加入相應濃度的候選抗體，共培養六天後，吸取細胞上清，使用Cisbio-HTRF IFN-γ檢測試劑盒(Cat：62HIFNGPEH，Perkinelmer)檢測IFN-γ濃度，計算EC50。
如圖2所示，A17m09_hIgG4在MLR實驗中，顯示出與Pembrolizumab基本一致的體外藥效。其中，A17m09_hIgG4的EC50為0.2931nM，Pembrolizumab的EC50為0.3271nM。
實施例1-7. 抗PD-1奈米抗體抑制小鼠結腸癌模型中腫瘤生長
本實施例在人源化PD-1 C57BL/6小鼠的MC38腫瘤模型上，驗證抗PD-1抗體的體內抗腫瘤藥效。
使用DMEM培養基(10% FBS)培養MC38小鼠結腸癌細胞系，將5×105個MC38細胞接種於人源化PD-1 C57BL/6雌鼠(集萃藥康)皮下，待小鼠平均腫瘤體積達到80mm3左右時，隨機分組，每組8隻，給予腹腔注射抗體或對照，每週兩次測量腫瘤體積，稱體重，記錄數據。實驗分組與給藥方案參見表10。考慮到A17m09_hIgG4的分子量約75kDa，只有正常IgG分子量的一半，故給藥劑量調整為Pembrolizumab的一半，以實現等莫耳數劑量。
如圖3A和圖3B所示，在同等莫耳劑量下，A17m09_hIgG4的體內抗腫瘤藥效與Pembrolizumab一致。腫瘤體積與腫瘤抑制率參見表11。
Figure 111134965-A0202-12-0070-69
Figure 111134965-A0202-12-0071-70
實施例2. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體
本實施例中，帶his標簽的人PVRIG(h-PVRIG-his)重組蛋白、帶小鼠IgG2a的Fc標簽的人PVRIG(h-PVRIG-mIgG2a Fc)重組蛋白、帶人IgG1的Fc標簽的小鼠PVRIG(m-PVRIG-hIgG1 Fc)購自Acrobiosystems公司。帶his標簽的PVRL2購自AcroBiosystem(PV2-H52E2)。
實施例2-1. 抗PVRIG奈米抗體的篩選和製備
1.免疫抗原、篩選抗原的序列和製備
Figure 111134965-A0202-12-0072-71
帶his標簽的食蟹猴PVRIG(cyno-PVRIG-his)重組蛋白序列如下：
Figure 111134965-A0202-12-0072-72
Figure 111134965-A0202-12-0072-73
(SEQ ID NO：43)。
2.羊駝免疫、奈米抗體噬菌體展示文庫構建和抗體篩選
參照實施例1-1的方法，使用帶his標簽的人PVRIG重組蛋白(h-PVRIG-his)免疫羊駝。從第56天的駱駝外周血中分離PBMC，提取RNA，反轉錄成cDNA，構建抗人PVRIG奈米抗體的噬菌體文庫。經過3輪篩選，對400個純株測序，其中2株的可變區序列如下所示，CDR如表13所示。
>30可變區
Figure 111134965-A0202-12-0072-74
Figure 111134965-A0202-12-0072-75
(SEQ ID NO：44)
>151可變區
Figure 111134965-A0202-12-0073-76
Figure 111134965-A0202-12-0073-77
(SEQ ID NO：45)。
Figure 111134965-A0202-12-0073-78
將上述抗體可變區與人IgG4重鏈Fc區域連接，重鏈Fc區域包括鉸鏈(hinge)區，並帶有S228P、F234A、L235A、K447A突變(Eu命名系統)，構建全長抗體。
>hIgG4 Fc(S228P/F234A/L235A/K447A)
Figure 111134965-A0202-12-0073-79
(SEQ ID NO：52)。
>30全長
Figure 111134965-A0202-12-0074-80
Figure 111134965-A0202-12-0074-81
(SEQ ID NO：53)；
>151全長
Figure 111134965-A0202-12-0074-82
Figure 111134965-A0202-12-0074-83
(SEQ ID NO：54)。
WO2016134333中所示的抗PVRIG抗體CPA.7.021篩選自抗體噬菌體庫，其亞型為IgG1，能與人PVRIG較好結合，對食蟹猴PVRIG則無結合。將CPA.7.021的重鏈和輕鏈可變區，分別與人IgG4重鏈恆定區(帶有S228P、F234A、L235A、K447A突變)和人Kappa輕鏈恆定區連接，構建陽性抗體Tab5。
>Tab5重鏈全長
Figure 111134965-A0202-12-0075-84
Figure 111134965-A0202-12-0075-212
(SEQ ID NO：55)
>Tab5輕鏈全長
Figure 111134965-A0202-12-0075-86
Figure 111134965-A0202-12-0075-87
(SEQ ID NO：56)。
將表達上述胺基酸序列的核酸序列選殖到pcDNA3.1表達載體，按常規方法進行抗體表達和純化，經檢測，獲得目的抗體。
實施例2-2. 抗PVRIG奈米抗體與抗原PVRIG的親和力鑑定
1. ELISA
用直接包被帶his標簽的PVRIG重組蛋白，加入抗體後，藉由加入二抗(HRP偶聯的抗一抗Fc的抗體)和HRP受質TMB檢測抗體與抗原結合的活性。
人、食蟹猴或小鼠PVRIG蛋白包被96孔板，按1μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。洗液洗三遍。加入300μL/孔封閉液(PBS+0.05% Tween20+1% BSA)室溫孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加100μL用稀釋液稀釋好的抗PVRIG待測抗體。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL HRP標記的抗人IgG二抗(Sigma，A8667)。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL TMB，避光反應15分鐘。加入50mL/孔的0.16M硫酸。Thermo MμLtiSkanFc酶標儀讀取OD450，計算抗PVRIG抗體對PVRIG重組蛋白的結合EC50值。表14中所有抗體均對人或食蟹猴的PVRIG重組蛋白有較強的結合能力，但不結合小鼠PVRIG重組蛋白。
Figure 111134965-A0202-12-0076-88
2. FACS檢測
製備獲得表達人或食蟹猴PVRIG基因的HEK293穩轉細胞株。在96孔板中每孔接種2x105個細胞。300g離心5分鐘，去上清，加入100μL待測抗體，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次，加入100μL 1：500稀釋的用Alexa Fluor 488標記的抗人IgG二抗(Invitrogen，A-11013)，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次。用100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD FACS Calibur或BD FACS Canto_II)檢測。所有抗體均 對細胞表面表達的人或食蟹猴的PVRIG有較強的結合能力，明顯強於陽性抗體Tab5，而Tab5甚至完全不結合食蟹猴PVRIG。
Figure 111134965-A0202-12-0077-89
3. Fortebio檢測
將Protein A生物傳感器(Fortebio，#18-5010)浸泡在200μL的KB緩衝液(PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA)中60秒，進行濕潤處理。然後，用KB緩衝液將抗PVRIG抗體稀釋到10μg/mL，將傳感器置於200μL該溶液中，待讀數為1.2nm時停止。將傳感器浸泡於KB緩衝液中100秒，以沖提多餘的抗體。將帶有his標簽的人PVRIG用KB緩衝液以2倍梯度稀釋至64nM-4nM之間。將傳感器置於該溶液中結合300秒，再置於KB緩衝液中解離600秒。採用動態1：1結合方式擬合，則抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力如表16所示。
結果顯示，所有檢測抗體均具有與人PVRIG的高親和力。
Figure 111134965-A0202-12-0078-90
實施例2-3. 抗PVRIG奈米抗體的功能和活性驗證
1.抗PVRIG奈米抗體阻斷PVRIG和PVRL2結合實驗
人PVRIG重組蛋白(h-PVRIG-mIgG2a Fc)包被96孔板，按1μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。洗液洗三遍。加入300μL/孔封閉液室溫孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加50μL稀釋好的抗PVRIG待測抗體和50μL帶his標簽的配體PVRL2，37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL按1：2000倍稀釋的用HRP標記的抗his標簽的二抗(Genscrpit)。37℃孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL TMB，避光反應15分鐘。加入50μL每孔的0.16M硫酸。Thermo MμLtiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算抗PVRIG抗體對PVRIG與PVRL2結合阻斷的IC50值。
表17結果顯示，所檢測抗體均可以強烈抑制人PVRIG與人PVRL2的結合。
Figure 111134965-A0202-12-0079-91
2.抗PVRIG奈米抗體報告基因細胞活性實驗
首先，構建plvx-OS8(G418抗性)質粒，轉染293F細胞，G418篩選，用流式細胞儀檢測純株細胞OS8的表達同時檢測OS8對Jurkat細胞的激活，選擇激活程度中等的純株，得到293F-OS8細胞株；構建plvx-PVRL2質粒，用它感染293F-OS8細胞，用流式細胞儀篩選出PVRL2表達量最高的純株，從而得到293F-OS8-PVRL2細胞株。
其次，構建plvx-NFAT-Luc(Hygromycin抗性)，包裝成慢病毒，感染Jurkat E6.1細胞，加Hygromycin篩選出有抗性的純株，用OKT3去刺激純株，篩選出Luciferase信號中等的純株，得到Jurkat-NFAT-Luc細胞系；構建plvx-PVRIG(Puromycin抗性)載體，包裝成慢病毒，感染Jurkat-NFAT-Luc細胞，經流式細胞儀篩選出PVRIG表達量最高的純株，從而得到Jurkat-NFAT-Luc-PVRIG細胞株。
將1E4個Jurkat-NFAT-Luc-PVRIG細胞與待測抗體在37℃孵育20分鐘。加入1E5個293F-OS8-PVRL2細胞，37℃孵育5小時。離心去除上清，加入Luciferase緩衝液(Promega，E6130)裂解細胞，檢測螢光值。計算EC50值評價抗PVRIG抗體的體外細胞活性。實驗結果如表18所示。
結果顯示，所檢測抗體有較強的激活Jurkat細胞中Luciferase的能力，活性是陽性抗體的至少10倍以上，證明這些抗體可以結合PVRIG並阻斷PVRL2與PVRIG的結合。
Figure 111134965-A0202-12-0080-92
3.抗PVRIG奈米抗體的NK細胞殺傷實驗
PVRIG在NK細胞上表達，而PVRL2在很多腫瘤細胞(包括K562細胞)中表達。抗PVRIG抗體可以藉由阻斷PVRL2與PVRIG的結合，解除腫瘤細胞對NK細胞活性的抑制作用。
在96孔板中每孔加入50μL(總計1×105個)人惡性非霍奇金淋巴瘤NK92細胞。加入50μL 20nM或100nM待測抗體，37℃孵育30分鐘。用洗液洗滌兩次，重新懸浮至2×105個/mL的密度。加入50μL(總計1×104個)的人慢性髓系白血病K562細胞，使得NK92細胞與K562細胞個數的比例為10：1。37℃孵育4小時。使用CytoTox-Glo細胞毒性系統(Promega，G9292)對殺傷活性進行測量。首先加入50μL AAF-Glo試劑，室溫孵育15分鐘，測量被NK92細胞殺死的K562細胞的螢光。再加入50μL裂解液，室溫孵育15分鐘，裂解細胞，測量所有細胞的螢光。準備三種對照組，分別是只包括培養液的樣品(對照組一)，只包括NK92細 胞的樣品(對照組二)，只包括K562細胞的樣品(對照組三)，進行同樣的操作。
根據如下公式，計算殺傷活性：
殺傷活性(%)={[(R-BG)-(T-BG)-(E-BG)]/[(TL-BGL)-(T-BG)]}×100；
其中，R為加入AAF-Glo後的螢光值，BG為對照組一在加入AAF-Glo的螢光值，E為對照組二在加入AAF-Glo的螢光值，T為對照組三在加入AAF-Glo的螢光值；TL為對照組三在加入裂解液後的螢光值，BGL為對照組一再加入裂解液後的螢光值。
實驗結果如表19所示，表明所有檢測的抗PVRIG抗體均可以明顯的激活NK92細胞、殺傷K562細胞。
Figure 111134965-A0202-12-0081-93
4.抗PVRIG奈米抗體的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗
PVRIG在T細胞上表達，而PVRL2在DC細胞上表達。抗PVRIG抗體可以藉由阻斷PVRL2與PVRIG的結合，解除DC細胞對T細胞的抑制，活化T細胞。
從第一個體來源的外周血中分離PBMC，將細胞培養於含10% FBS的RPMI 1640培養基中，以50ng/mL GM-CSF(Peprotech，300-03-100UG)和50ng/mL IL-4(Peprotech，200-04-100UG)的終濃度添加，每2-3天添加含細胞因子的新鮮培養基；培養6天後，加入1μg/mL LPS(Sigma，L2880-25MG)孵育24小時，收集分化成熟得到的DC細胞。從第二個體來源的外周血中分離PBMC，使用EasySep人CD3+T細胞分離試劑盒(Stemcell，17952)從中分離CD3+ T細胞。調整CD3+ T細胞和DC細胞的密度，使得每孔加入1×105個CD3+T細胞和2×104個DC細胞。加入待測抗體，37℃孵育120小時，取上清，用ELISA試劑盒(R&D，DY202)檢測上清中的IFNγ含量。
如表20和圖4所示，相比對照抗體IgG4，所有檢測抗PVRIG抗體均可以明顯的激活T細胞分泌IFNγ。並且，在低劑量(如4nM、20nM)時，本揭露的抗體30和151較之陽性對照Tab5的效果更優。
Figure 111134965-A0202-12-0082-94
實施例2-4. 抗PVRIG奈米抗體的序列改造
藉由對選定的抗PVRIG抗體分子進行三維結構同源建模，將抗PVRIG抗體序列與抗體GermLine數據庫比較，獲得同源性高的人種系 模板IGHV3-7*01。將CDR移植到相應的人源模板中。對移植後的奈米抗體再次進行三維結構模擬並分析，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對可變區的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，產生一系列人源化奈米抗體。各個奈米抗體的人種系模板以及人源化抗體重鏈可變區序列如下所示。
>30H1可變區
Figure 111134965-A0202-12-0083-95
Figure 111134965-A0202-12-0083-96
(SEQ ID NO：57)
>30H2可變區
Figure 111134965-A0202-12-0083-97
Figure 111134965-A0202-12-0083-98
(SEQ ID NO：58)
>30H3可變區
Figure 111134965-A0202-12-0083-99
Figure 111134965-A0202-12-0083-100
(SEQ ID NO：59)
>30H4可變區
Figure 111134965-A0202-12-0083-101
Figure 111134965-A0202-12-0083-102
(SEQ ID NO：60)
>30H5可變區
Figure 111134965-A0202-12-0084-103
Figure 111134965-A0202-12-0084-104
(SEQ ID NO：61)。
經人源化後，抗體30H1至30H5包含如GDCMG(SEQ ID NO：46)所示的CDR1，如TIDNAGRIKYADSVKG(SEQ ID NO：47)所示的CDR2，如GWTFGGQCSPAD(SEQ ID NO：99)所示的CDR3。
>151H2可變區
Figure 111134965-A0202-12-0084-105
Figure 111134965-A0202-12-0084-106
(SEQ ID NO：62)
>151H4可變區
Figure 111134965-A0202-12-0084-107
Figure 111134965-A0202-12-0084-108
(SEQ ID NO：63)
>151H7可變區
Figure 111134965-A0202-12-0084-109
Figure 111134965-A0202-12-0084-110
(SEQ ID NO：64)
>151H8可變區
Figure 111134965-A0202-12-0084-111
Figure 111134965-A0202-12-0085-112
(SEQ ID NO：65)
>151H9可變區
Figure 111134965-A0202-12-0085-113
Figure 111134965-A0202-12-0085-114
(SEQ ID NO：66)。
將上述人源化抗體重鏈可變區與人IgG4重鏈Fc區域連接，構造形成全長抗PVRIG抗體。其中重鏈Fc區域包括鉸鏈(hinge)區，並帶有S228P/F234A/L235A/K447A，或S228P/K447A突變。按常規方法進行抗體的表達和純化，經檢測，得到目的抗體。
實施例2-5. 人源化抗PVRIG抗體的活性和功能驗證
1.人源化抗PVRIG抗體與表達PVRIG的細胞結合實驗
依照實施例2-2的方法，FACS檢測抗PVRIG抗體與人或食蟹猴PVRIG的結合。實驗結果如表21所示。
Figure 111134965-A0202-12-0086-115
2.人源化抗PVRIG抗體與PVRIG的親和力測定
依照實施例2-2的Fortebio檢測方法，檢測人源化抗PVRIG抗體與人PVRIG蛋白的親和力。如表22所示，所有抗體均具有與人PVRIG蛋白的高親和力。
Figure 111134965-A0202-12-0086-116
3.人源化抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗
依照實施例2-3的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體在報告基因細胞中的活性。實驗結果如表23所示。表中列出的抗體均具有激活Jurkat細胞的能力。
Figure 111134965-A0202-12-0087-117
4.人源化抗PVRIG抗體的活化NK細胞殺傷能力實驗
依照實施例2-3的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體對NK細胞的活化能力。實驗結果如表24和表25所示。結果顯示，所測抗體都有明顯的活化NK細胞的能力，促進NK細胞對於靶細胞K562的殺傷。
Figure 111134965-A0202-12-0087-119
Figure 111134965-A0202-12-0088-120
實施例2-6. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的製備
為探索不同構造的抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對抗體功能的影響，將抗PVRIG奈米抗體151藉由GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：100)連接子與抗TIGIT抗體1708的重鏈或輕鏈的N端或C端相連。形成4個抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體，命名為1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4，分別對應151被連接在1708的重鏈N端、重鏈C端、輕鏈N端和輕鏈C端。抗TIGIT抗體1708採用人IgG4亞型，並帶有S228P(Eu命名系統)的突變。抗TIGIT抗體1708和其與151形成的雙特異性抗體序列如下表26所示。抗TIGIT抗體序列信息如表27和表28所示。TIGIT抗體已經在WO2019062832A中公開，藉由引用全文併入。
Figure 111134965-A0202-12-0089-121
Figure 111134965-A0202-12-0090-122
Figure 111134965-A0202-12-0091-123
Figure 111134965-A0202-12-0092-124
Figure 111134965-A0202-12-0092-125
將不同的人源化抗PVRIG抗體可變區(30H2、151H7、151H8)連接到抗TIGIT抗體1708的重鏈N端，即採用1708-151-1類似的雙特異性抗體構造，構建雙特異性抗體。以下序列中雙下劃線為連接子序列。
>1708-30H2第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0093-126
Figure 111134965-A0202-12-0093-127
(SEQ ID NO：84)
>1708-151H7第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0093-128
Figure 111134965-A0202-12-0094-129
Figure 111134965-A0202-12-0094-130
(SEQ ID NO：85)
>1708-151H8第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0094-131
Figure 111134965-A0202-12-0094-132
(SEQ ID NO：86)。
1708-30H2、1708-151H7、1708-151H8的第二多肽鏈均與1708的輕鏈相同(SEQ ID NO：68)。
按常規方法進行抗體的瞬時轉染、表達和純化，經鑑定，得到本揭露的全長抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體，其均顯示了良好的表達量和純度。
實施例2-7. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的活性和功能驗證
1.雙特異性抗體與人PVRIG的結合及對配體PVRL2的阻斷
依照實施例2-2和2-3的方法，進行實驗。結果表明，不同構型的雙特異性抗體1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4，與人PVRIG重組蛋白和過表達人PVRIG細胞的結合，以及對PVRL2結合PVRIG的阻斷，無統計學顯著差異。
2.雙特異性抗體與人TIGIT的結合及對配體PVR的阻斷
依照實施例2-2和2-3的方法(相應的受體和配體換為人TIGIT和人PVR)，進行實驗，結果如表29所示。結果表明，不同構型的雙特異性抗體1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4和抗TIGIT抗體，與人TIGIT重組蛋白和過表達人TIGIT細胞的結合，以及對TIGIT結合其配體PVR的阻斷，無統計學顯著差異。
可見，抗PVRIG抗體無論是連接到抗TIGIT抗體的重、輕鏈的N端或C端，都保持了對PVRIG和TIGIT的結合和配體的阻斷，並且都顯示了良好的表達量、純度。
3.人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與PVRIG和TIGIT的結合以及對相應配體的阻斷
依照實施例2-2和2-3的方法，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對人和食蟹猴PVRIG的結合，對人PVRIG的配體阻斷。結果如表29所示。結果表明，各雙特異性抗體均可以結合人PVRIG，阻斷PVRIG結合PVRL2。
Figure 111134965-A0202-12-0096-133
與實施例2-2和2-3類似地，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對人和食蟹猴TIGIT的結合，對人TIGIT與配體結合的阻斷，其中將PVRIG蛋白替換為TIGIT，並將PVRL2替換為PVR。結果如表30所示。結果表明，各雙特異性抗體均可以結合人的TIGIT，阻斷TIGIT結合PVR。
Figure 111134965-A0202-12-0096-134
利用Biacore檢測雙特異性抗體與人PVRIG、與人TIGIT的親和力。將人源化雙特異性抗體捕獲於Biacore儀器(Biacore X100，GE)的Protein A生物傳感芯片(GE lifesciences，29127557)上，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的人PVRIG抗原(AcroBiosystem，PVG-H52H4)或人TIGIT抗原(AcroBiosystem，TIT-H52H3)，獲得結合和解離曲線。結果見表31。
Figure 111134965-A0202-12-0097-135
4.抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗
依照實施例2-3第4部分的方法，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對T細胞的活化能力。實驗結果如圖5和表32所示。結果顯示，人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體1708-151H8具有明顯的活化T細胞的能力，促進T細胞分泌IFNγ。重要的是，雙特異性抗體的活性強於單用抗PVRIG抗體151H8，單用抗TIGIT抗體1708。
Figure 111134965-A0202-12-0098-136
實施例2-8. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體體在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤作用評估
為進一步探究雙特異性抗體亞型在動物藥效中的作用，進行動物藥效試驗。其中，1708-IgG1的重鏈可變區與1708相同，只是重鏈恆定區亞型換為IgG1；1708-IgG1的輕鏈全長和1708-151-IgG1的第二多肽鏈均與與1708的輕鏈相同。
NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。所有的NCG小鼠按照SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件培養。
A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中。收集指數生長期的A375細胞，HBSS重新懸浮至適合濃度用於NCG小鼠皮下腫瘤接種。共培養所用的A375細胞需經過Mitomycin C處理2h後，PBS洗三次。取正常人外周血，用密度梯度離心法分離人PBMC，計數。然後用RPMI1640培養基(含IL2和10% FBS)將PBMC重新懸浮至3×106 個/mL的濃度，與Mitomycin C處理後的A375細胞共培養。共培養6天後，收取PBMC，同時收取新鮮消化下來的A375細胞。每隻老鼠接種：PBMC 5×105個，A375細胞4×106個；接種體積：0.2mL/隻(含50% Matrigel)；接種於雌性NCG小鼠右側皮下。根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表33，分組給藥當天為第0天。由於抗PVRIG抗體和抗TIGIT抗體的分子量不同，該給藥劑量保證了抗PVRIG抗體與抗TIGIT抗體擁有同樣的起始莫耳濃度。
Figure 111134965-A0202-12-0099-138
給藥開始後，小鼠每週2次測量腫瘤體積及體重。實驗結果分別見表34和圖6A、圖6B。
Figure 111134965-A0202-12-0100-139
實驗結束時(給藥後第26天)，與對照組相比，抗PVRIG抗體151-IgG4單藥組沒有明顯差異。抗TIGIT抗體1708-IgG1單藥組，抗PVRIG抗體151-IgG4與抗TIGIT抗體1708-IgG1聯用組，腫瘤體積下降。而1708-151-IgG4雙特異性抗體組甚至可以完全抑制腫瘤的生長，與其它組間具有顯著性差異(見圖6A)。
根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表35，分組給藥當天為第0天。
Figure 111134965-A0202-12-0101-140
給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。實驗結果分別見表36和圖7A-圖7B。
Figure 111134965-A0202-12-0101-220
實驗結束時(給藥後第28天)，與對照組相比，1708-30H2與1708-151H7雙特異性抗體組均可以在低劑量下有效抑制腫瘤生長，與對照組間具有顯著性差異(見圖7A、圖7B)。
實施例3. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體
實施例3-1. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的設計和製備
四種類型的三特異性抗體分為A、B、C、D四種類型，示意如圖8。
A型：抗PD-1奈米抗體藉由連接子(如GGGGSGGGGS)連接抗PVRIG奈米抗體，再經連接子連接在抗TIGIT抗體的重鏈N端(圖8的A)。
B型：抗PVRIG抗體經連接子連接在TIGIT IgG分子的重鏈N端，而抗PD-1抗體經連接子連接在抗TIGIT抗體的輕鏈N端(圖8的B)。
C型：抗PVRIG抗體經連接子連接在TIGIT IgG分子的重鏈N端。抗PD-1抗體經連接子(GGGGSGGGGS)連接在抗TIGIT抗體的重鏈C端(圖8的C)。
D型：抗-PVRIG抗體經連接子連接在TIGIT IgG分子的重鏈N端。抗PD-1抗體經連接子連接在抗TIGIT抗體輕鏈C端(圖8的D)。
本揭露中三特異性抗體命名如表37。例如A17m0902-1708-30H2-A，代表使用的抗PD-1、TIGIT和PVRIG抗體的純株分別為A17m0902、1708和30H2，三特異性抗體類型為A型。
Figure 111134965-A0202-12-0103-142
表37中A17h1相關分子，均為在對應的A17m0902相關分子的基礎上，將A17m0902(SEQ ID NO：33)序列替換為A17h1(SEQ ID NO：13)序列。
序列如下(下劃線為連接子，斜體為Fc或輕鏈Cκ)：
>A17m0902-1708-30H2-A第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0103-143
Figure 111134965-A0202-12-0104-144
(SEQ ID NO：87)。
A17m0902-1708-30H2-A第二多肽鏈如SEQ ID NO：68所示。
A17m0902-1708-30H2-B第一多肽鏈如SEQ ID NO：84所示。
>A17m0902-1708-30H2-B第二多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0104-145
Figure 111134965-A0202-12-0104-146
(SEQ ID NO：88)。
>A17m0902-1708-30H2-C第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0105-147
Figure 111134965-A0202-12-0105-148
(SEQ ID NO：89)。
A17m0902-1708-30H2-C第二多肽鏈如SEQ ID NO：68所示。
A17m0902-1708-30H2-D第一多肽鏈如SEQ ID NO：84所示。
>A17m0902-1708-30H2-D第二多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0105-150
Figure 111134965-A0202-12-0106-151
Figure 111134965-A0202-12-0106-152
(SEQ ID NO：90)。
>A17m0902-1708-151H7-A第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0106-153
(SEQ ID NO：91)
A17m0902-1708-151H7-A第二多肽鏈如SEQ ID NO：68所示。
A17m0902-1708-151H7-B第一多肽鏈如SEQ ID NO：85所示。
>A17m0902-1708-151H7-B第二多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0107-154
Figure 111134965-A0202-12-0107-155
(SEQ ID NO：92)。
>A17m0902-1708-151H7-C第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0107-156
Figure 111134965-A0202-12-0108-157
(SEQ ID NO：93)
A17m0902-1708-151H7-C第二多肽鏈如SEQ ID NO：68所示。
A17m0902-1708-151H7-D第一多肽鏈如SEQ ID NO：85所示。
>A17m0902-1708-151H7-D第二多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0108-158
Figure 111134965-A0202-12-0108-159
(SEQ ID NO：94)。
經常規方法轉染細胞，表達，純化，檢測後能夠獲得目的抗體。
實施例3-2. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體與抗原的結合親和力
採用ELISA進行檢測。PBS溶解人TIGIT或PVRIG蛋白(his tag，Acrobiosystems，PVG-H52H4)至1μg/mL，將100μL/孔該溶液加入到96孔板中，4℃過夜，包被抗原。用PBST溶液洗三次。加入PBST/1% BSA溶液，37℃孵育1h，進行封閉。PBST溶液洗三次後加入不同濃度的三特異性抗體(PBST/1% BSA溶液稀釋)，37℃孵育1.5h。PBST溶液洗三次。加入100μL HRP耦聯的抗人IgG4 Fc的二抗(Thermo)溶液，37℃孵育1h。PBST溶液洗三次後，加入100μL/孔TMB溶液，室溫反應5min後，加入50μL終止液，使用酶標儀讀取OD450值，計算EC50。
1.與TIGIT的結合
四種構型的A17h1-1708-30H2、A17h1-1708-151H7三特異性抗體與TIGIT均有較強結合，結合能力差異較小，且與1708-30H2、1708-151H7雙特異性抗體對TIGIT的結合能力相似。結果參見圖9A、圖9B和表38。因此，所有三特異性抗體構型不影響其結合TIGIT的結合。
Figure 111134965-A0202-12-0110-160
2.與PVRIG的結合
四種構型的A17h1-1708-30H2、A17h1-1708-151H7三特異性抗體與PVRIG均有較強結合，結合能力差異較小，且與1708-30H2、1708-151H7雙特異性抗體對PVRIG的結合能力相似。參見表39和圖10A、圖10B。因此，所有三特異性抗體構型不影響其結合PVRIG的結合。
Figure 111134965-A0202-12-0111-161
實施例3-3：抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體中PVRIG序列優化
PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體A17m0902-1708-151H7-C設計中，原PVRIG抗體序列(151H7)的第一位胺基酸為組胺酸(單字母縮寫為H)，位於三特異性抗體分子序列N端的組胺酸在實際抗體生產過程中可能會發生磷酸吡哆醛的修飾和脫磷酸後的吡哆醛修飾，基於此問題的考慮需要對原PVRIG序列第一位組胺酸進行突變。由於谷胺酸(單字母縮寫為E)和穀胺醯胺(單字母縮寫為Q)為奈米抗體序列中第一位出現頻率最高的兩個胺基酸，因此將H突變為E或者Q。PVRIG抗體151H7的突變序列如下：
>151H7 H1E
Figure 111134965-A0202-12-0112-162
Figure 111134965-A0202-12-0112-163
(SEQ ID NO：95)。
>151H7 H1Q
Figure 111134965-A0202-12-0112-164
Figure 111134965-A0202-12-0112-165
(SEQ ID NO：96)。
將PVRIG抗體(151H7)序列第一位胺基酸由H變為E的三特異性抗體分子命名為A17m0902-1708-151H7-01-C；將PVRIG(151H7)序列第一位胺基酸由H變為Q的三特異性抗體分子命名為A17m0902-1708-151H7-02-C。
A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C分子類型為C型：即抗PVRIG抗體經連接子1連接在抗TIGIT抗體的重鏈N端。抗PD-1抗體經連接子2連接在抗TIGIT抗體的重鏈C端(圖8的C)。
A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C多肽鏈序列如下：
>A17m0902-1708-151H7-01-C第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0113-166
(SEQ ID NO：97)。
A17m0902-1708-151H7-01-C第二多肽鏈如SEQ ID NO：68所示。
>A17m0902-1708-151H7-02-C第一多肽鏈
Figure 111134965-A0202-12-0113-167
Figure 111134965-A0202-12-0114-168
(SEQ ID NO：98)。
A17m0902-1708-151H7-02-C第二多肽鏈如SEQ ID NO：68所示。
實施例3-4. 抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體中PVRIG序列優化後與抗原的結合親和力
分別使用表達人PVRIG基因的HEK293F穩轉細胞株，表達人TIGIT基因的CHO-K1穩轉細胞株和表達人PD-1的Jurkat細胞。在96孔板中每孔接種2x105個細胞。300g離心5分鐘，去上清，加入100μL待測抗體，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次，加入100μL 1：500稀釋的用Alexa Fluor 488標記的抗人IgG二抗(Invitrogen，A-11013)，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL 洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次。用100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD FACS Calibur或BD FACS Canto_II)檢測。
1.與PVRIG的結合
PVRIG抗體第一位胺基酸突變後的兩個三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C與突變前的三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-C和突變前的雙特異性抗體分子1708-151H7對細胞表面表達的人PVRIG有較一致的結合活性，EC50值相近，表明PVRIG抗體第一位胺基酸在經過突變後不影響三特異性抗體對於PVRIG的結合。結果參見表40和圖11A。
Figure 111134965-A0202-12-0115-213
2.與TIGIT的結合
兩個三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C與突變前的三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-C抗體對細胞表面表達的人TIGIT有較一致的結合活性，EC50相近，表明PVRIG抗體第一位胺基酸在經過突變後不影響三特異性抗體對於TIGIT的結合。結果參見表41和圖11B。
Figure 111134965-A0202-12-0116-170
3.與PD-1的結合
兩個三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C與突變前的A17m0902-1708-151H7-C抗體對細胞表面表達的人PD-1有相近的結合活性，EC50相近，表明PVRIG抗體第一位胺基酸在經過突變後不影響三特異性抗體對於PD-1的結合。結果參見表42和圖11C。
Figure 111134965-A0202-12-0116-171
總結上述結合活性實驗結果，PVRIG抗體第一位胺基酸突變後的兩個三特異性抗體分子A17m0902-1708-151H7-01-C和A17m0902-1708-151H7-02-C與細胞表面表達的PVRIG、TIGIT、PD-1抗原的親和力與母本A17m0902-1708-151H7-C抗體相當，這些突變不影響三特異性抗體對於PVRIG，TIGIT和PD-1的結合。
實施例3-5. PD-1/PD-L1報告基因系統檢測抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體對PD-1的阻斷
採用實施例1-4中的方法進行檢測。如圖12A、圖12B和表43，A17h1作為PD-1端組成的四種構型的三特異性抗體均能實現對PD-1阻斷，但B型和C型三特異性抗體的報告基因活性相對更好。
Figure 111134965-A0202-12-0117-172
實施例3-6. MLR檢測抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體對T細胞的活化
按實施例1-6的方法，將來自人受試者的細胞進行DC：T混合淋巴反應實驗，結果參見圖13A、圖13B和表44。結果顯示，4種構型的三特異性抗體均能有效促進T細胞活化，解除PD-1/PD-L1的抑制，促進T細胞分泌細胞因子，均具有較強的體外藥效活性。
Figure 111134965-A0202-12-0118-173
選擇效果較優構型的A17m0902-1708-30H2-C進一步進行DC：T混合淋巴反應實驗驗證。參見圖14A-圖14B和表45、表46，結果顯示，在100nM的抗體濃度下，A17m0902-1708-30H2-C三特異性抗體遠優於雙特異性抗體1708-30H2對T細胞的激活，優於抗PD-1單抗Ab 464，略優於抗PD-1單抗A17m0902_hIgG4對T細胞的激活。
Figure 111134965-A0202-12-0119-174
Figure 111134965-A0202-12-0119-175
實施例3-7. NK92殺傷檢測抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體對NK細胞的活化
使用NK細胞殺傷實驗，可以檢驗抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的體外藥效。使用NK92細胞作為效應細胞，K562細胞作為靶細胞，進行細胞殺傷實驗。先將不同濃度的候選抗體與NK92細胞在37℃共孵育30分鐘，再將經過抗體預孵育的NK92細胞按照10：1的效靶比與 經過CTV(Cat：C34557，Thermo)標記的K562細胞進行混合，培養條件為1640+10%FBS+10ng/mL IL-2，37℃共孵育4小時。離心去上清後，使用10μg/mL碘化丙啶溶液重新懸浮細胞，進行死細胞染色標記。室溫標記10分鐘後，FACS檢測CTV標記的K562細胞中，死細胞(PI陽性)的比例，計算殺傷活性。
如圖15A、圖15B所示，三特異性抗體保留了抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體促進NK細胞殺傷的生物學功能，並且各構型的IC50值相似，參見表47。
Figure 111134965-A0202-12-0120-176
實施例3-8.抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在對PD-1單抗響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤作用評估
本實施例在對PD-1單抗響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC體內腫瘤模型上，驗證PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的體內藥效。
NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g(小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司)。小鼠放置在SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件下飼養。
從凍存PBMC中篩選獲得在體內藥效模型中響應PD-1單抗的供體PBMC，計數。用含IL-2和10% FBS的RPMI 1640培養液重新懸浮PBMC到一定的濃度。將PBMC加入經Mitomycin C處理2h後的A375細胞中。與A375共培養5天後，收取PBMC。A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中，收取新鮮消化下來的A375細胞。每隻鼠接種：PBMC 5×105個，A375細胞4×106個；接種體積為0.2ml/隻(含50% Matrigel)；接種於NCG小鼠右側皮下。接種當天為第0天，第1天時根據小鼠體重隨機進行分組給藥。
考慮到A17m0902_hIgG4分子量為76kDa；1708-151H7分子量為173.5kDa；A17m0902-1708-151H7-C分子量為200kDa。設計等莫耳濃度的給藥方案。詳細的給藥方案、給藥劑量和給藥途徑見表48。
Figure 111134965-A0202-12-0122-177
給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。
給藥第21天後，與對照組相比，1708-151H7(11.5mg/kg)給藥組、A17m0902_hIgG4(5mg/kg)給藥組、A17m0902-1708-151H7-C(13.3mg/kg)給藥組和1708-151H7(11.5mg/kg)+A17m0902_hIgG4(5mg/kg)給藥組的腫瘤生長抑制率(TGI)分別為7.05%、79.91%、91.63%和88.25%。三特異性抗體A17m0902-1708-151H7-C給藥組的藥效明顯優於抗PD-1單抗A17m0902_hIgG4給藥組，以及優於PVRIG/TIGIT雙特異性抗體+PD-1單抗聯用的組。
給藥後第21天後結束實驗，對所有小鼠實行安樂死，剝離其腫瘤並稱重拍照，計算瘤重TGI，與瘤體積TGI趨勢一致，結果也顯示三特異性抗體A17m0902-1708-151H7-C給藥組的藥效明顯優於PD-1單抗A17m0902_hIgG4給藥組，以及優於PVRIG/TIGIT雙特異性抗體+PD-1單抗聯用的組。實驗結果分別見表49和圖16A、圖16B。
Figure 111134965-A0202-12-0123-178
實施例3-9.抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體在PD-1單抗不響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤作用評估
本實施例在抗PD-1單抗不響應的人黑色素瘤A375混合人PBMC體內腫瘤模型上，驗證抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體的體內藥效。
NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g(購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司)，放置在SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件下飼養。
從凍存PBMC中篩選獲得在體內藥效模型中不響應抗PD-1單抗的供體PBMC。實驗方案同實施例3-8描述的方法。小鼠實驗分組和給藥方案見表50。
Figure 111134965-A0202-12-0124-179
給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。
給藥第17天後，根據測定各組小鼠腫瘤平均體積，實驗組與IgG對照組相比，1708-151H7、A17m0902_hIgG4、A17m0902-1708-151H7-C、1708-151H7+A17m0902_hIgG4腫瘤生長抑制率(TGI%)分別為4.53%、20.75%、36.70%和31.95%。
給藥後第17天後結束實驗，對所有小鼠實行安樂死，剝離其腫瘤並稱重拍照。根據測定各組小鼠腫瘤重量，實驗組與IgG對照組相比，1708-151H7、A17m0902_hIgG4、A17m0902-1708-151H7-C、1708-151H7+A17m0902_hIgG4腫瘤生長抑制率(TGI%)瘤重TGI分別為0%、16.8%、38.2%和33.4%。瘤重TGI與瘤體積TGI趨勢一致。實驗結果分別見表51和圖17A、圖17B。
與IgG對照組相比，A17m0902-1708-151H7-C給藥組和1708-151H7+A17m0902_hIgG4給藥組的腫瘤體積與重量均顯著性減小 (圖17A，圖17B，P<0.05)，表現出顯著的抑瘤效果。本次實驗過程中，所有小鼠均未出現明顯的體重下降和行為異常，表明小鼠在該實驗條件下，對受試藥物具有較好的耐受性。
Figure 111134965-A0202-12-0126-180
TW202328195A_111134965_SEQL.xml

Claims (25)

  1. 一種PD-1結合蛋白，其包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：
    SEQ ID NO：33、3、13-15、17-32、34-35任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，或SEQ ID NO：2、16任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；
    較佳地，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、36、37所示，或如SEQ ID NO：4、5、6所示；
    更佳地，該CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：8、38-40、101任一所示，CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：41、42、9任一所示；
    最佳地，該CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、38、41所示。
  2. 如請求項1所述的PD-1結合蛋白，其中該免疫球蛋白單一可變結構域經過選自以下任一項的改造或其組合：人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體異構化；
    較佳地，該人源化改造使用的人種系模板的重鏈框架區為IGHV3-23*01或IGHV3-23*04。
  3. 如請求項1或2所述的PD-1結合蛋白，其中，該免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列：
    如SEQ ID NO：33、3、13-15、17-32、34-35任一所示或與之具有至少90%序列同一性；或
    如SEQ ID NO：2、16任一所示或與之具有至少90%序列同一性。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的PD-1結合蛋白，其還包含人免疫球蛋白Fc區；
    較佳地，該Fc區是人IgG1的Fc區或IgG4的Fc區；
    更佳地，該人IgG4的Fc區具有228P、234A、235A和/或447A突變。
  5. 如請求項1至4任一項所述的PD-1結合蛋白，其為抗PD-1抗體或其抗原結合片段；
    較佳地，該抗體或其抗原結合片段為駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。
  6. 一種PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含：
    特異性結合PD-1的第一抗原結合結構域、
    特異性結合PVRIG的第二抗原結合結構域、和
    特異性結合TIGIT的第三抗原結合結構域，
    該第一抗原結合結構域包含或是如請求項1所限定的免疫球蛋白單一可變結構域；
    較佳地，該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白為抗PD-1/PVRIG/TIGIT三特異性抗體。
  7. 如請求項6所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，
    該第二抗原結合結構域包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：
    SEQ ID NO：95-96、45、62-66任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，或SEQ ID NO：44、57-61任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；
    較佳地，該CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：49、50、51所示，或如SEQ ID NO：46、47、48或99所示。
  8. 如請求項6或7所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，
    該第三抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，
    該VH包含分別如SEQ ID NO：73、74和75所示胺基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含分別如SEQ ID NO：76、77和78所示胺基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  9. 如請求項6至8中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，
    該第一抗原結合結構域包含：
    如SEQ ID NO：33、3、13-15、17-32、34-35任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或如SEQ ID NO：2、16任一所示或與之具有至少90%序列同一性胺基酸序列；
    較佳為SEQ ID NO：33或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  10. 如請求項6至9中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，
    該第二抗原結合結構域包含：
    如SEQ ID NO：95-96、45、62-66任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；或如SEQ ID NO：44、57-61任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；
    較佳為SEQ ID NO：95-96、64任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  11. 如請求項6至10中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，
    該第三抗原結合結構域包含VH和VL，其中，
    該VH包含如SEQ ID NO：79-81中任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，
    該VL包含如SEQ ID NO：83或82所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；
    較佳為該VH包含SEQ ID NO：79或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：83或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  12. 如請求項11所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，該第三抗原結合結構域包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)；
    較佳地，該HC序列為SEQ ID NO：67所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該LC序列為SEQ ID NO：68所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  13. 如請求項6至12中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含：
    第一多肽鏈、和
    第二多肽鏈，
    其中，按從N端到C端順序：
    (I)第一多肽鏈是以下結構所示：[第一抗原結合結構域]-[連接子1]a-[第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和
    第二多肽鏈是以下結構所示：[第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或
    (II)第一多肽鏈是以下結構所示：[第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和
    第二多肽鏈是以下結構所示：[第一抗原結合結構域]-[連接子3]c-[第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或
    (III)第一多肽鏈是以下結構所示：[第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc-[連接子4]d-[第一抗原結合結構域]，和
    第二多肽鏈是以下結構所示：[第三抗原結合結構域的VL]-Cκ；或
    (IV)第一多肽鏈是以下結構所示：[第二抗原結合結構域]-[連接子2]b-[第三抗原結合結構域的VH]-CH1-Fc，和
    第二多肽鏈是以下結構所示：[第三抗原結合結構域的VL]-Cκ-[連接子5]e-[第一抗原結合結構域]；
    其中，-表示肽鍵，
    該連接子1、連接子2、連接子3、連接子4、連接子5可以相同，也可以不同；a、b、c、d、e視需要獨立地為0或1；
    較佳地，該連接子1、連接子2、連接子3、連接子4、連接子5獨立地為(GxS)y，其中，x選自1-5的整數，y選自1-6的整數；更佳地，獨立地為(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4任一所示的連接子。
  14. 如請求項6至13中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其選自以下的任一組：
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：97、68所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：98、68所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：87、68所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：84、88所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽-+鏈分別包含如SEQ ID NO：89、68所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：84、90所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：91、68所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：85、92所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：93、68所示的胺基酸序列；
    該第一、第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：85、94所示的胺基酸序列；
    或，與該第一、第二多肽鏈的分別具有至少90%序列同一性的胺基酸序列組合；
    較佳地，該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白具有兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。
  15. 一種PD-1/PVRIG結合蛋白，其包含：
    - 如請求項1至5中任一項所述的PD-1結合蛋白、和
    - 特異性結合PVRIG的抗原結合結構域；
    較佳地，該特異性結合PVRIG的抗原結合結構域為如請求項7或10所限定的第二抗原結合結構域；
    較佳地，該PD-1/PVRIG結合蛋白為抗PD-1/PVRIG雙特異性抗體。
  16. 一種PD-1/TIGIT結合蛋白，其包含：
    - 如請求項1至5中任一項所述的PD-1結合蛋白、和
    - 特異性結合TIGIT的抗原結合結構域；
    較佳地，該特異性結合TIGIT的抗原結合結構域為如請求項8或11所限定的第三抗原結合結構域；
    較佳地，該PD-1/TIGIT結合蛋白為抗PD-1/TIGIT雙特異性抗體。
  17. 一種多核苷酸，其編碼：
    如請求項1至5中任一項所述的PD-1結合蛋白、或
    如請求項6至14中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、或
    如請求項15所述的PD-1/PVRIG結合蛋白、或
    如請求項16所述的PD-1/TIGIT結合蛋白；
    較佳地，該多核苷酸為載體。
  18. 一種宿主細胞，其含有如請求項17所述的多核苷酸。
  19. 一種製備PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白或PD-1/TIGIT結合蛋白的方法，包括：
    1)培養如請求項18所述的宿主細胞，以及
    2)從該宿主細胞中分離所表達的PD-1結合蛋白、PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、PD-1/PVRIG結合蛋白或PD-1/TIGIT結合蛋白。
  20. 一種結合蛋白在製備治療癌症的藥物中的用途，其中該結合蛋白選自以下任一項或其組合：
    如請求項1至5中任一項所述的PD-1結合蛋白；
    如請求項6至14中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；
    如請求項15所述的PD-1/PVRIG結合蛋白；或
    如請求項16所述的PD-1/TIGIT結合蛋白；
    較佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症。
  21. 一種醫藥組成物，其含有：
    - 至少一種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體；以及
    - 選自以下任一項或其組合：
    如請求項1至5中任一項所述的PD-1結合蛋白；
    如請求項6至14中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白；
    如請求項15所述的PD-1/PVRIG結合蛋白；
    如請求項16所述的PD-1/TIGIT結合蛋白。
  22. 一種治療癌症的方法，包括步驟：
    向受試者施用治療有效量的如請求項1至5中任一項所述的PD-1結合蛋白、如請求項6至14中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、如請求項15所述的PD-1/PVRIG結合蛋白、如請求項16所述的PD-1/TIGIT結合蛋白或如請求項21所述的醫藥組成物；
    較佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌或血液系統癌症。
  23. 一種活化NK細胞、γδT細胞和/或Th1細胞的方法，包含步驟：
    向有需要的受試者施用有效量的請求項1至5任一項該PD-1結合蛋白、請求項6至14任一項該PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、請求項15該PD-1/PVRIG結合蛋白、請求項16該PD-1/TIGIT結合蛋白或請求項21的醫藥組成物。
  24. 一種增加受試者體內的IFN-γ產生和/或促炎性細胞因子分泌的方法，包括步驟：向有需要的受試者施用有效量的如請求項1至5中任一項所述的PD-1結合蛋白、如請求項6至14中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、如請求項15所述的PD-1/PVRIG結合蛋白、如請求項16所述的PD-1/TIGIT結合蛋白或如請求項21所述的醫藥組成物。
  25. 一種抑制受試者體內的PD-1活性和/或促進T細胞增殖的方法，包括步驟：
    向有需要的受試者施用有效量的如請求項1至5中任一項所述的PD-1結合蛋白、如請求項6至14中任一項所述的PD-1/PVRIG/TIGIT結合蛋白、如請求項15所述的PD-1/PVRIG結合蛋白、如請求項16所述的PD-1/TIGIT結合蛋白或如請求項21所述的醫藥組成物；
    較佳地，該受試者的PD-L1和/或PD-L2的表達是上調的；
    更佳地，該受試者患有癌症；
    最佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症。
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