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TW202239959A - 用於減少細胞中hla-a之組合物及方法 - Google Patents

用於減少細胞中hla-a之組合物及方法 Download PDF

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TW202239959A
TW202239959A TW110148217A TW110148217A TW202239959A TW 202239959 A TW202239959 A TW 202239959A TW 110148217 A TW110148217 A TW 110148217A TW 110148217 A TW110148217 A TW 110148217A TW 202239959 A TW202239959 A TW 202239959A
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hla
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蘇西 高爾
張勇
雷納德 麥克 雷斯卡里
布萊德利 安德魯 莫雷
斯里加尼 斯里哈爾
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美商英特利亞醫療公司
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Abstract

本發明係關於用於降低細胞中HLA-A蛋白表現之組合物及方法，包含基因修飾HLA-A以用於例如過繼細胞轉移療法中。

Description

用於減少細胞中HLA-A之組合物及方法
下調MHC I類之能力對於許多活體內及離體應用至關重要，例如，當使用同種異體細胞(源自供體)進行移植及/或例如，在活體外產生不活化T細胞的細胞群體時。特定言之，將同種異體細胞轉移至個體中係細胞治療領域非常有興趣的。同種異體細胞之使用由於接受個體之免疫細胞排斥問題而受到限制，其將移植細胞識別為外來的且發動攻擊。為避免免疫排斥問題，基於細胞之療法集中於自體方法，該等自體方法使用個體自身細胞作為療法之細胞來源，此為耗時且昂貴的方法。
通常，同種異體細胞之免疫排斥由供體與接受者之間的主要組織相容複合體(MHC)分子錯配產生。在人類群體內，MHC分子以各種形式存在，包括例如編碼不同形式之MHC蛋白質的任何給定MHC基因之許多基因變異體，亦即等位基因。MHC分子之主要類別稱為MHC I類及MHC II類。MHC I類分子(例如人類中之HLA-A、HLA-B及HLA-C)表現於所有有核細胞上且呈遞抗原以活化細胞毒性T細胞(CD8+ T細胞或CTL)。MHC II類分子(例如人類中之HLA-DP、HLA-DQ及HLA-DR)僅在某些細胞類型(例如B細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞)上表現且呈遞抗原以活化輔助T細胞(CD4+ T細胞或Th細胞)，進而向B細胞提供信號以產生抗體。
例如個體之間的MHC等位基因之微小差異，例如錯配會導致接受者中之T細胞變得活化。在T細胞發育期間，個體之T細胞庫對自身MHC分子具有耐受性，但識別另一個體的MHC分子之T細胞可在循環中持續存在且稱為同種異體反應性T細胞。同種異體反應性T細胞可例如藉由在體內存在另一個體的表現MHC分子之細胞變得活化，引起例如移植物抗宿主疾病及移植排斥。
雖然供體與接受者之間完全匹配HLA類型在理論上可能作為減少移植排斥之手段，但鑒於群體中HLA等位基因之多樣性以完全匹配，例如10個等位基因中的10個(亦即，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1各2個等位基因)，此類方法在邏輯上且實際上具有挑戰性。
用於降低同種異體細胞對排斥之易感性的方法及組合物係令人感興趣的，包括例如降低細胞之MHC蛋白表現以避免接受者T細胞反應。實務上，基因修飾同種異體細胞用於移植至個體中之能力受到多重基因編輯以減少所有MHC蛋白表現同時避免其他有害之接受者免疫反應之要求的妨礙。舉例而言，儘管耗盡MHC I類蛋白之策略可能會減少CTL活化，但表面上缺乏MHC I類的細胞易於由免疫系統之自然殺手(NK)細胞溶解，因為NK細胞活化係藉由MHC I類特異性抑制受體調節。因此，安全地降低或消除MHC I類之表現已被證實具有挑戰性。
耗盡MHC II類分子之基因編輯策略亦已證實係困難的，尤其在某些細胞類型中，原因包括低編輯效率及低細胞存活率，阻礙了作為細胞療法之實際應用。
因此，需要用於修飾同種異體細胞之改良方法及組合物以克服接受者免疫排斥問題及與產生更安全的移植細胞所需的多重基因修飾相關的技術困難。
本發明提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。本文所揭示之工程化人類細胞因此為同種異體細胞轉移及MHC I類相容性問題提供了「部分匹配」方法。使用除降低或消除細胞中HLA-A之表現外，對HLA-B及HLA-C為同型接合之細胞限制為提供涵蓋群體中大部分接受者之療法所必需的供體數目，因為所揭示之部分匹配方法僅需要一個匹配HLA-B等位基因(相對於兩個)及僅一個HLA-C等位基因(相對於兩個)。出人意料地，本文所揭示之相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現的工程化人類細胞展現出持久性且對NK介導之排斥具有保護作用，尤其與具有降低或消除之B2M表現的工程化細胞相比。本發明提供用於產生此類相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現之工程化人類細胞的方法及組合物，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，本發明提供工程化人類細胞，及用於產生工程化人類細胞之方法及組合物，其中細胞在細胞表面上進一步具有降低之MHC II類蛋白表現，例如其中細胞在CIITA基因中具有基因修飾。在一些實施例中，本發明提供對細胞之進一步工程化，包括降低或消除內源性T細胞受體蛋白(例如TRAC、TRBC)之表現，及引入例如編碼表現於細胞表面上之多肽或由細胞分泌之多肽的外源核酸。因此，本發明因此提供用於對人類細胞進行基因工程化以用於多種期望之過繼細胞治療目的之靈活平台。
本發明提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。亦提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6: 29942854-chr6: 29942913及chr6: 29943518-chr6: 29943619；其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。
本發明提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
本發明提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
本文提供一種製造工程化人類細胞之方法，該細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白之表面表現，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，該方法包含使細胞與包含以下之組合物接觸：(a) HLA-A引導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列；或(iv)結合至包含表2至5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或(v)與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之 (b)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
本文提供一種相對於未經修飾細胞降低人類細胞中HLA-A蛋白之表面表現的方法，其包含使細胞與包含以下之組合物接觸：(a) HLA-A引導RNA，其包含 (i)選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列；或(iv)結合至包含表2至5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或(v)與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之 (b)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
本文提供一種向有需要之接受個體投與工程化細胞的方法，該方法包含：(a)測定接受個體之HLA-B及HLA-C等位基因；(b)選擇如前述實施例中任一項之工程化細胞或細胞群體，或藉由如前述實施例中任一項之方法產生之工程化細胞或細胞群體，其中該工程化細胞包含與接受個體相同的HLA-B或HLA-C等位基因中之至少一者；(c)向該接受個體投與該所選擇之工程化細胞。
通篇在申請專利範圍及圖式中提供且描述其他實施例。
本申請案根據35 U.S.C. 119(e)主張2020年12月23日申請之美國臨時申請案第63/130,095號、2021年9月30日申請之美國臨時申請案第63/250,996號、2021年10月12日申請之美國臨時申請案第63/254,970號及2021年12月10日申請之美國臨時申請案第63/288,492號的權益，該等揭示案中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供工程化人類細胞，以及用於基因修飾人類細胞以製備適用於例如過繼細胞轉移(ACT)療法之工程化人類細胞的方法及組合物。本發明提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。因此，本文所揭示之工程化人類細胞為與同種異體細胞轉移相關之障礙提供「部分匹配」解決方案。
在一些實施例中，本發明提供由於HLA-A基因中之基因修飾而具有降低或消除之HLA-A表面表現的工程化人類細胞，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，本發明提供用於相對於未經修飾細胞降低或消除HLA-A蛋白之表現的組合物及方法以及降低細胞對免疫排斥之易感性的組合物及方法。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現的工程化人類細胞不易被NK細胞溶解，此為用降低或消除MHC I類蛋白表現之其他方法觀測到的問題。在一些實施例中，方法及組合物包含藉由用基因編輯系統基因修飾HLA-A及藉由基因修飾將編碼靶向受體或其他多肽(表現於細胞表面上或分泌)之外源核酸插入細胞中來降低或消除HLA-A蛋白之表面表現。藉由本文所揭示之方法產生的工程化細胞組合物具有所需特性，包括例如降低之HLA-A表現、降低之活體外及活體內免疫原性、增加之存活期及與更多移植個體之增加的基因相容性。
術語「約」或「大約」意謂如由一般熟習此項技術者所測定之特定值的可接受之誤差，其部分地取決於如何量測或測定該值、或變化程度不會實質上影響所述標的物之特性，或在此項技術中所接受之容限內，例如在10%、5%、2%或1%內。因此，除非有相反指示，否則以下說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。 A． 定義
除非另外說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：
如本文所用，術語「或其組合」係指在該術語前面所列項之所有排列及組合。舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下中之至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若在特定情況下順序為重要的，則亦包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。繼續此實例，明確地包括含有一或多個項目或術語之重複的組合，諸如BB、AAA、AAB、BBC、CBBA、CABA等等。熟習此項技術者應理解，除非另外自上下文顯而易知，否則通常不存在對任何組合中之項目或術語之數目的限制。
如本文所用，術語「套組」係指相關組分，諸如一或多種多核苷酸或組合物及一或多種相關材料，諸如遞送裝置(例如注射器)、溶劑、溶液、緩衝劑、說明書或乾燥劑之封裝組。
如本文所用，「同種異體」細胞係指源自與接受個體相同種類之供體個體的細胞，其中供體個體及接受個體具有基因相異性，例如一或多個基因座處的基因不一致。因此，例如細胞相對於待投與細胞之個體為同種異體的。如本文所用，自供體移出或分離、將不再引入至原始供體中之細胞視為同種異體細胞。
如本文所用，「自體」細胞係指源自同一個體的細胞，稍後將向其再引入材料。因此，例如，若細胞自個體移出且其隨後再引入至同一個體中，則其視為自體的。
如本文所使用，「β2M」或「B2M」係指「β-2微球蛋白」之核酸序列或蛋白質序列；人類基因具有寄存編號NC_000015 (範圍44711492..44718877)，參考GRCh38.p13。B2M蛋白與MHC I類分子締合為有核細胞表面上的異二聚體且為MHC I類蛋白表現所需。
如本文所使用，「 CIITA」或「CIITA」或「C2TA」係指「II類主要組織相容複合體轉活化子」之核酸序列或蛋白質序列；人類基因具有寄存編號NC_000016.10 (範圍10866208..10941562)，參考GRCh38.p13。細胞核中之CIITA蛋白充當MHC II類基因轉錄之正調節劑且為MHC II類蛋白表現所需。
如本文所用，「MHC」或「MHC分子」或「MHC蛋白質」或「MHC複合物」係指一個主要組織相容複合體分子(或多個)，且包括例如MHC I類及MHC II類分子。在人類中，MHC分子稱為「人類白血球抗原」複合物或「HLA分子」或「HLA蛋白質」。術語「MHC」及「HLA」之使用不意欲為限制性的；如本文所用，術語「MHC」可用於指人類MHC分子，亦即HLA分子。因此，術語「MHC」及「HLA」在本文中可互換使用。
如本文所用，HLA-A蛋白之上下文中的術語「HLA-A」係指MHC I類蛋白質分子，其為由重鏈(由HLA-A基因編碼)及輕鏈(亦即β-2微球蛋白)組成之異二聚體。如本文在核酸之上下文中所用的術語「HLA-A」或「HLA-A基因」係指編碼HLA-A蛋白分子之重鏈的基因。HLA-A基因亦稱為「HLA I類組織相容，A α鏈」；人類基因具有寄存編號NC_000006.12 (29942532..29945870)。已知HLA-A基因跨越群體具有HLA-A基因之數千種不同基因型 (且個體可接受HLA-A基因之兩種不同等位基因)。HLA-A等位基因之公共資料庫(包括序列資訊)可訪問IPD-IMGT/HLA:  www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/。HLA-A之所有等位基因均由術語「HLA-A」及「HLA-A基因」涵蓋。
如本文在核酸之上下文中所用的術語「HLA-B」係指編碼HLA-B蛋白分子之重鏈的基因。HLA-B基因亦稱為「HLA I類組織相容，B α鏈」；人類基因具有寄存編號NC_000006.12 (31353875..31357179)。
如本文在核酸之上下文中所用的術語「HLA-C」係指編碼HLA-C蛋白分子之重鏈的基因。HLA-C基因亦稱為「HLA I類組織相容，C α鏈」；人類基因具有寄存編號NC_000006.12 (31268749..31272092)。
如本文所用，術語「基因體座標內」包括給定基因體座標範圍的邊界。舉例而言，若給出chr6:29942854- chr6:29942913，則涵蓋座標chr6:29942854- chr6:29942913。在整個本申請案中，參考之基因體座標係基於來自基因體參考聯合會(Genome Reference Consortium)之人類基因體的GRCh38(亦稱為hg38)組裝中之基因體註釋，可在國家生物技術資訊中心網站上獲得。用於在一個組裝與另一組裝之間轉化基因體座標的工具及方法為此項技術中已知且可用於將本文中提供之基因體座標轉化為人類基因體之另一組裝中之對應座標，包括轉化為由同一機構或使用相同演算法產生之早期組裝(例如自GRCh38至GRCh37)，及轉化由不同機構或演算法產生之組裝(例如自GRCh38至NCBI33，藉由國際人類基因體定序聯合會(International Human Genome Sequencing Consortium)產生)。此項技術中已知之可用方法及工具包括(但不限於)可在國立生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information website)網站獲得的NCBI Genome Remapping Service、可在UCSC Genome Brower網站獲得的UCSC LiftOver及可在Ensembl.org網站獲得的Assembly Converter。
如本文所用，術語「同型接合的」係指具有特定基因之兩個相同等位基因。
如本文所用，HLA「等位基因」可以指命名的HLA-A、HLA-B或HLA-C基因，其中指定「HLA-A」、「HLA-B」或「HLA-C」之後名稱的前四個數字(或由冒號分隔開之前兩組數字，例如，HLA-A* 02:101 :01:02N，其中前兩組數字用粗體和斜體表示)。如此項技術中已知，前四個數位(或由冒號分隔開之前兩組數位)指定等位基因之蛋白質。舉例而言，HLA-A*02:01及HLA-A*01:02為相異的HLA-A等位基因。存在各等位基因之其他基因型，諸如HLA-A*02:01:02:01。認為給定等位基因之其他基因型係相同等位基因，例如HLA-A*02:01:02:01及HLA-A*02:01係相同等位基因。因此，當等位基因相同時(亦即當等位基因具有相同前四個數字或由冒號分隔開之相同前兩組數字時)，HLA等位基因係同型接合的。
「匹配」或「經匹配」係指供體與接受者之間的共有的等位基因，例如相同等位基因。
「多核苷酸(polynucleotide)」及「核酸(nucleic acid)」在本文中用以指包含含氮雜環鹼基或鹼基類似物沿主鏈連接在一起之核苷或核苷類似物的多聚化合物，其包括習知RNA、DNA、混合RNA-DNA及為其類似物之聚合物。核酸「主鏈(backbone)」可由多個鍵聯構成，其包括糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖，或具有取代基(例如2'甲氧基或2'鹵基取代基)之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾之尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他經修飾之尿苷)、肌核苷、嘌呤或嘧啶之衍生物(例如N 4-甲基去氧鳥苷、去氮嘌呤或氮雜嘌呤、去氮嘧啶或氮雜嘧啶、在5位或6位處具有取代基之嘧啶鹼基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2位、6位或8位處具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲胺基嘌呤、O 6-甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O 4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。對於一般論述，參見 The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams等人編, 第11版, 1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈在聚合物位置不包括含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習知組分與取代(例如具有2'甲氧基鍵聯之習知鹼基，或含有習知鹼基與一或多個鹼基類似物的聚合物)。核酸包括「鎖定核酸」(LNA)、含有一或多種LNA核苷酸單體之類似物，該等單體具有模擬糖構形之鎖定於RNA中的雙環呋喃醣單元，其會增強對互補RNA及DNA序列之雜合親和性(Vester及Wengel, 2004, Biochemistry43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分且不同之處可為在RNA中存在尿嘧啶或其類似物及在DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物。
「引導RNA」、「gRNA」及簡稱「引導物」可在本文中互換地用於指例如將經RNA引導之DNA結合劑導引至靶DNA的引導物，且可為單引導RNA或crRNA與trRNA (亦稱為tracrRNA)之組合。例示性gRNA包括經修飾或未經修飾形式之II類Cas核酸酶引導RNA。crRNA及trRNA可以單一RNA分子(單引導RNA，sgRNA)或以兩個獨立RNA股(雙引導RNA，dgRNA)形式締合。「引導RNA」或「gRNA」係指各類型。trRNA可為天然存在之序列或與天然存在之序列相比具有修飾或變異之trRNA序列。
如本文所用，「引導序列」係指引導RNA中與目標序列互補且用以藉由經RNA引導之DNA結合劑將引導RNA導引至目標序列以供結合或修飾(例如裂解)的序列。「引導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔序列」。引導序列之長度可為20個鹼基對，例如在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(亦即Spy Cas9)及相關Cas9同源物/異種同源物之情況下。較短或較長序列亦可用作例如長度為15、16、17、18、19、21、22、23、24或25個核苷酸之引導物。在一些實施例中，目標序列處於例如基因中或染色體上，且與引導序列互補。在一些實施例中，引導序列與其相應目標序列之間的互補性或一致性之程度可為約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，引導序列與目標區域可為100%互補或一致。在其他實施例中，引導序列與目標區域可含有至少一個錯配。舉例而言，引導序列及目標序列可含有1、2、3或4個錯配，其中目標序列之總長度為至少17、18、19、20個或更多個鹼基對。在一些實施例中，引導序列及目標區域可含有1至4個錯配，其中引導序列包含至少17、18、19、20個或更多個核苷酸。在一些實施例中，引導序列及目標區域可含有1、2、3或4個錯配，其中引導序列包含20個核苷酸。
經RNA引導之DNA結合劑之目標序列包括基因體DNA之正股與負股(亦即既定序列及序列之反向補體)，此係因為經RNA引導之DNA結合劑之核酸受質為雙股核酸。因此，在稱引導序列「與目標序列互補」之情況下，應理解，引導序列可將導引引導RNA結合至目標序列之反向補體。因此，在一些實施例中，在引導序列結合目標序列之反向補體之情況下，引導序列與目標序列(例如不包括PAM之目標序列)之某些核苷酸具有一致性，不同之處在於在引導序列中U取代T。
如本文所用，「經RNA引導之DNA結合劑(RNA-guided DNA-binding agent)」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，或此類複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性具有序列特異性且依賴於RNA之序列。例示性經RNA引導之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用，「Cas核酸酶」亦稱作「Cas蛋白」，其涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶。如本文所用，「2類Cas核酸酶」為具有經RNA引導之DNA結合活性的單鏈多肽。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A變異體)，其進一步具有經RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性，及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性未活化。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0)(例如K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1)(例如K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白質及其修飾。Cpf1蛋白(Zetsche等人, Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源且含有RuvC樣核酸酶域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用之方式併入。參見例如Zetsche，表S1及表S3。參見例如Makarova等人, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文所用，術語「編輯劑」係指包含能夠在DNA序列內進行修飾之多肽的試劑。在一些實施例中，編輯劑為裂解酶，諸如Cas9裂解酶。在一些實施例中，編輯劑能夠使DNA分子內之鹼基脫胺。在一些實施例中，編輯劑能夠使DNA中之胞嘧啶(C)脫胺。在一些實施例中，編輯劑為包含與胞苷脫胺酶融合之經RNA引導之切口酶的融合蛋白。在一些實施例中，編輯劑為包含與APOBEC3A脫胺酶(A3A)融合之經RNA引導之切口酶的融合蛋白。在一些實施例中，編輯劑包含與APOBEC3A脫胺酶(A3A)融合之Cas9切口酶。在一些實施例中，編輯劑為包含與胞苷脫胺酶域融合之經RNA引導之切口酶及UGI的融合蛋白。在一些實施例中，編輯劑缺乏UGI。
如本文所用，「胞苷脫胺酶」意謂能夠具有胞苷脫胺酶活性之多肽或多肽複合物，其催化胞苷或脫氧胞苷之水解脫胺作用，通常產生尿苷或脫氧尿苷。胞苷脫胺酶涵蓋胞苷脫胺酶超家族中之酶，且特定言之，APOBEC家族之酶(酶之APOBEC1、APOBEC2、APOBEC4及APOBEC3子組)、活化誘導之胞苷脫胺酶(AID或AICDA)及CMP脫胺酶。(參見例如Conticello等人, Mol. Biol. Evol. 22:367-77, 2005; Conticello, Genome Biol. 9:229, 2008; Muramatsu等人, J. Biol. Chem. 274: 18470-6, 1999); Carrington等人, Cells 9:1690 (2020))。
如本文所用，術語「APOBEC3」係指APOBEC3蛋白質，諸如由人類APOBEC3基因座之七個基因(A3A-A3H)中之任一者表現的APOBEC3蛋白質。APOBEC3可以具有催化DNA或RNA編輯活性。已描述APOBEC3A之胺基酸序列(UniPROT寄存ID: p31941)且作為SEQ ID NO: 40包括在本文中。在一些實施例中，APOBEC3蛋白質為人類APOBEC3蛋白質及/或野生型蛋白質。變異體包括具有與野生型APOBEC3蛋白質相差一個或若干個突變(亦即取代、缺失、插入)，諸如一個或若干個單點取代之序列的蛋白質。舉例而言，可使用縮短之APOBEC3序列，例如藉由使若干N-端或C-端胺基酸，較佳使序列C-端之一個至四個胺基酸缺失。如本文所用，術語「變異體」係指與APOBEC3參考序列同源的等位基因變異體、剪接變異體及天然或人工突變體。變異體為「功能性的」，因為其顯示DNA或RNA編輯之催化活性。在一些實施例中，APOBEC3(諸如人類APOBEC3A)具有野生型胺基酸位置57(如野生型序列中所編號)。在一些實施例中，APOBEC3(諸如人類APOBEC3A)在胺基酸位置57(如野生型序列中所編號)具有天冬醯胺。
如本文中所用，「切口酶」為在雙股DNA中產生單股斷裂(亦稱為「切口」)之酶，亦即切割DNA雙螺旋之一股但不切割另一股。如本文中所用，「經RNA引導之DNA切口酶」意謂具有DNA切口酶活性之多肽或多肽複合物，其中DNA切口酶活性為序列特異性的且取決於RNA之序列。例示性經RNA引導之DNA切口酶包括Cas切口酶。Cas切口酶包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶的切口酶形式。2類Cas切口酶包括變異體，其中兩個催化域中之僅一者失活，其具有經RNA引導之DNA切口酶活性。2類Cas切口酶包括例如Cas9(例如SpyCas9之H840A、D10A或N863A變異體)、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0)(例如K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1)(例如K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白質及其修飾。Cpf1蛋白質(Zetsche等人, Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源且含有RuvC樣蛋白質域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用之方式併入。參見例如Zetsche，表S1及表S3。「Cas9」涵蓋釀膿鏈球菌(Spy)Cas9、本文中所列的Cas9之變異體及其等效物。參見例如Makarova等人, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指包含來自至少兩種不同蛋白質之蛋白質域的雜合多肽。一種蛋白質可位於融合蛋白之胺基端(N端)部分或羧基端(C端)蛋白處，因此分別形成「胺基端融合蛋白」或「羧基端融合蛋白」。本文所提供之任一蛋白質可藉由此項技術中已知之任何方法產生。舉例而言，本文所提供之蛋白質可經由重組蛋白表現及純化來產生，其尤其適合於包含肽連接子之融合蛋白。重組蛋白表現及純化之方法為熟知的，且包括由Green及Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))描述之彼等方法，其全部內容以引用之方式併入本文中。
如本文所用之術語「連接子」係指連接兩個相鄰分子或部分之化學基團或分子。通常，連接子安置於兩個基團、分子或其他部分之間或由兩個基團、分子或其他部分側接，且經由共價鍵彼此連接。在一些實施例中，連接子為一個胺基酸或複數個胺基酸(例如肽或蛋白質)，諸如16-胺基酸殘基「XTEN」連接子或其變異體(參見例如實例；及Schellenberger等人，A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接子包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 900)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 901)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 902)。
如本文所用，術語「尿嘧啶醣苷酶抑制劑」或「UGI」係指能夠抑制尿嘧啶-DNA醣苷酶(UDG)鹼基切除修復酶之蛋白質。
如本文所用，基因之「開讀框」或「ORF」係指由一系列密碼子組成的序列，該等密碼子指定該基因編碼之蛋白質的胺基酸序列。ORF開始於起始密碼子(例如DNA中之ATG或RNA中之AUG)且以終止密碼子結束，例如DNA中之TAA、TAG或TGA或RNA中之UAA、UAG或UGA)。
如本文所用，「核糖核蛋白」(ribonucleoprotein，RNP)或「RNP複合物(RNP complex)」係指引導RNA以及經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA結合劑(例如Cas9)。在一些實施例中，引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9引導至目標序列，且該引導RNA與目標序列雜交且該結合劑結合至目標序列；在結合劑為裂解酶或切口酶之情況下，結合之後進行裂解或切口。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多之位置與第一序列匹配，則第一序列被視為「包含與第二序列具有至少X%一致性的序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，此係因為第二序列之全部三個位置均存在匹配，因此比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異(一般而言，尿苷交換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾之尿苷)的存在不會造成多核苷酸之間一致性或互補性的差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷)具有相同補體(例如對於胸苷、尿苷或經修飾之尿苷全體而言，為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，兩者具有鳥苷或經修飾之鳥苷作為補體)。因此，舉例而言，序列5'-AXG (其中X為任何經修飾之尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被視為與AUG 100%一致，因為兩者與同一序列(5'-CAU)完全互補。例示性比對演算法為所屬領域中熟知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)及尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)演算法。熟習此項技術者應理解對於待比對之給定序列對，選擇何種演算法及參數設置為適合的；對於具有一般類似長度及針對胺基酸之＞50%預期一致性或針對核苷酸之＞75%預期一致性的序列而言，由EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供的尼德曼-翁施演算法介面之具有默認設置的尼德曼-翁施演算法通常為適合的。
「mRNA」在本文中用於指多核苷酸且包含可轉譯成多肽之開讀框(亦即可充當用於藉由核糖體及胺基醯化tRNA進行之轉譯之受質)。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈，其包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。
如本文所用，「插入/缺失」係指由多種核苷酸組成之插入/缺失突變，該等核苷酸例如在目標核酸中之雙股斷裂(DSB)位點處插入/缺失。
如本文所用，細胞上蛋白質之表現「降低或消除」係指相對於未經修飾細胞而言，蛋白質之表現部分或完全喪失。在一些實施例中，藉由流動式細胞測量術量測細胞上蛋白質之表面表現，且相對於未經修飾細胞，具有「降低或消除之」表面表現，如藉由用針對蛋白質之相同抗體染色後螢光信號之減少所證明。藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞具有「降低或消除之」蛋白質表面表現的細胞可稱作對於彼蛋白質之表現為「陰性的」，如藉由類似於用同型對照抗體染色之細胞的螢光信號所證明。「降低或消除之」蛋白表現係利用熟習此項技術者已知之適當對照，藉由此項技術中之其他已知技術來量測。
如本文所用，「減弱」係指特定基因產物(例如蛋白質、mRNA或兩者)之表現降低，例如相較於未經編輯目標序列之表現。蛋白質之減弱可藉由偵測來自樣品，諸如所關注之組織、體液或細胞群體之蛋白質的總細胞量來量測。其亦可藉由量測蛋白質之替代物、標記或活性來量測。用於量測mRNA之減弱之方法為已知的，且包括對自所關注樣品分離之mRNA進行分析。在一些實施例中，「減弱」可指一些特定基因產物之表現缺失，例如經轉錄之mRNA的量下降或由細胞或細胞群體(包括活體內群體，諸如組織中所發現的彼等者)表現的蛋白質量下降。
如本文所用，「基因剔除(knockout)」係指細胞中之特定基因或特定蛋白質之表現缺失。基因剔除可導致表現降低至分析之偵測水準以下。基因剔除可藉由偵測細胞、組織或細胞群體中蛋白質之總細胞量來量測。
如本文所用，「目標序列」或「基因體目標序列」係指目標基因中與gRNA之引導序列具有互補性的核酸序列。目標序列與引導序列之相互作用導引經RNA引導之DNA結合劑在目標序列內結合，且可能切口或裂解(視試劑活性而定)。
如本文所用，「治療(treatment)」係指投與或施用用於個體之疾病或病症的治療劑，且包括抑制疾病、遏制其發展、減輕疾病之一或多種症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀，包括症狀復發。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例在附圖中加以說明。儘管本發明結合所說明之實施例加以描述，但應理解其不意欲將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋所有替代例、修改及等效物，其可包括於如隨附申請專利範圍及所包括之實施例所定義的本發明內。
在詳細描述本教示內容之前，應瞭解，本發明不限於特定組合物或方法步驟，因而可加以改變。應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。因此，舉例而言，提及「結合物(a conjugate)」包括複數個結合物且提及「細胞(a cell)」包括複數個細胞及其類似物。
數值範圍包括界定該範圍之數字。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，實測值及可量測值應理解為近似值。此外，「包含(comprise/comprises/comprising)」、「含有(contain/contains/containing)」及「包括(include/includes/including)」之使用不希望具有限制性。應理解，前述一般描述與詳細描述僅為例示性及解釋性的且並不限制教示內容。
除非說明書中具體指出，否則本說明書中敍述「包含」各種組分之實施例亦考慮為「由所敍述組分組成」或「基本上由所敍述組分組成」；本說明書中敍述「由各種組分組成」之實施例亦考慮為「包含」所敍述組分或「基本上由所敍述組分組成」；且本說明書中敍述「基本上由各種組分組成」之實施例亦考慮為「由所敍述組分組成」或「包含」所敍述組分(此互換性並不適用於此等術語在申請專利範圍中之使用)。除非上下文另外明確說明，否則術語「或(or)」以包括性意義使用，亦即等於「及/或(and/or)」。
本文所用之章節標題僅出於組織目的而不應解釋為以任何方式限制所需主題。在以引用的方式併入之任何材料與本說明書中所定義之任何術語或本說明書之任何其他表述內容相矛盾之情況下，以本說明書為準。儘管本發明之教示係與各種實施例結合描述，但並不意欲使本發明之教示限制於此類實施例。相反，如熟習此項技術者將瞭解，本教示內容涵蓋各種替代例、修改及等效物。 B． 經基因修飾之細胞 1. 工程化人類細胞組合物
本發明提供相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現的工程化人類細胞組合物，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，工程化人類細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，具有降低的HLA-A表現之工程化人類細胞適用於過繼細胞轉移療法。在一些實施例中，工程化人類細胞包含細胞基因體中之額外基因修飾(例如，降低或消除MHC II類蛋白，及/或降低或消除內源性T細胞受體(TCR)蛋白，及/或引入外源核酸以用於表現)以產生同種異體移植目的所需之細胞。
在一些實施例中，工程化人類細胞為同種異體細胞療法。在一些實施例中，將工程化人類細胞轉移至具有與工程化人類細胞相同的HLA-B等位基因的接受者。在一些實施例中，將工程化人類細胞轉移至具有與工程化人類細胞相同的HLA-C等位基因的接受者。在一些實施例中，將工程化人類細胞轉移至具有與工程化人類細胞相同的HLA-B及HLA-C等位基因的接受者。因此，本文所揭示之工程化人類細胞提供與接受者之部分HLA匹配，藉此降低不利免疫反應的風險。
在一些實施例中，提供工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6: 29942854-chr6: 29942913及chr6: 29943518-chr6: 29943619；其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，對於基因體座標之各給定範圍，範圍可涵蓋指定座標之任一端上的+/-10個核苷酸。舉例而言，若給出chr6:29942854-chr6:29942913，則在一些實施例中，基因體目標序列或基因修飾可落入chr6:29942844-chr6:29942923內。在一些實施例中，對於基因體座標之各給定範圍，範圍可涵蓋該範圍之任一端上的+/-5個核苷酸。
在一些實施例中，基因體座標之給定範圍可包含DNA之兩股(亦即，正(+)股及負(-)股)上之目標序列。
HLA-A基因中之基因修飾進一步描述於本文中。在一些實施例中，對HLA-A基因之基因修飾包含目標序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或脫胺中之任何一或多者。
本文所述之工程化人類細胞可包含HLA-A基因之任何HLA-A等位基因中的基因修飾。HLA基因位於染色體6中稱為HLA超基因座之基因體區域中；此項技術中已報導數百個HLA-A等位基因(參見例如Shiina等人, Nature 54:15-39 (2009)。HLA-A等位基因之序列為此項技術中可獲得的(參見例如用於檢索特定HLA-A等位基因之序列的IPD-IMGT/HLA資料庫https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html)。
在一些實施例中，細胞具有降低或消除之至少一種HLA-A等位基因的表現，該等位基因選自：HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11及HLA-A24。在一些實施例中，細胞具有降低或消除之HLA-A1表現。在一些實施例中，細胞具有降低或消除之HLA-A2表現。在一些實施例中，細胞具有降低或消除之HLA-A3表現。在一些實施例中，細胞具有降低或消除之HLA-A11表現。在一些實施例中，細胞具有降低或消除之HLA-A24表現。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29942864至chr6: 29942903內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943528至chr6: 29943609內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含以下基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含以下基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29942876-29942897內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943528至chr629943550內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含以下基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含以下基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29942864-29942884內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29942868-29942888內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29942876-29942896內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29942877-29942897內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29942883-29942903內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943126-29943146內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943528-29943548內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943529-29943549內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943530-29943550內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943537-29943557內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943549-29943569內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29943589-29943609內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含基因體座標chr6: 29944026-29944046內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942854-chr6:29942913及chr6:29943518- chr6: 29943619。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046，其中基因修飾包含基因體座標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046，其中基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046，其中基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標內之至少6個連續核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標內之至少7個連續核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標內之至少8個連續核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標內之至少9個連續核苷酸。在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，包含HLA-A基因中之基因修飾，其中基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046，其中基因修飾包含基因體座標內之至少一個C成為T之取代或至少一個A成為G之取代。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046、chr6:29934330-29934350、chr6:29943115-29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140-29943160、chr6:29943590-29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858-29943878、chr6:29944478-29944498及chr6:29944850-29944870。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29945290-29945310、chr6:29945296-29945316、chr6:29945297-29945317及chr6:29945300-29945320。在一些實施例中，由於等位基因多形性，目標序列可包含來自hg38之基因體序列的1、2或3個錯配。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29890117-29890137、chr6:29927058-29927078、chr6:29934330-29934350、chr6:29942541-29942561、chr6:29942542-29942562、chr6:29942543-29942563、chr6:29942543-29942563、chr6:29942550-29942570、chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897、chr6:29942883-29942903、chr6:29943062-29943082、chr6:29943063-29943083、chr6:29943092-29943112、chr6:29943115-29943135、chr6:29943118-29943138、chr6:29943119-29943139、chr6:29943120-29943140、chr6:29943126-29943146、chr6:29943128-29943148、chr6:29943129-29943149、chr6:29943134-29943154、chr6:29943134-29943154、chr6:29943135-29943155、chr6:29943136-29943156、chr6:29943140-29943160、chr6:29943142-29943162、chr6:29943143-29943163、chr6:29943188-29943208、chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550、chr6:29943536-29943556、chr6:29943537-29943557、chr6:29943538-29943558、chr6:29943549-29943569、chr6:29943556-29943576、chr6:29943589-29943609、chr6:29943590-29943610、chr6:29943590-29943610、chr6:29943599-29943619、chr6:29943600-29943620、chr6:29943601-29943621、chr6:29943602-29943622、chr6:29943603-29943623、chr6:29943774-29943794、chr6:29943779-29943799、chr6:29943780-29943800、chr6:29943822-29943842、chr6:29943824-29943844、chr6:29943857-29943877、chr6:29943858-29943878、chr6:29943859-29943879、chr6:29943860-29943880、chr6:29944026-29944046、chr6:29944077-29944097、chr6:29944078-29944098、chr6:29944458-29944478、chr6:29944478-29944498、chr6:29944597-29944617、chr6:29944642-29944662、chr6:29944643-29944663、chr6:29944772-29944792、chr6:29944782-29944802、chr6:29944850-29944870、chr6:29944907-29944927、chr6:29945024-29945044、chr6:29945097-29945117、chr6:29945104-29945124、chr6:29945105-29945125、chr6:29945116-29945136、chr6:29945118-29945138、chr6:29945119-29945139、chr6:29945124-29945144、chr6:29945176-29945196、chr6:29945177-29945197、chr6:29945177-29945197、chr6:29945180-29945200、chr6:29945187-29945207、chr6:29945188-29945208、chr6:29945228-29945248、chr6:29945230-29945250、chr6:29945231-29945251、chr6:29945232-29945252、chr6:29945308-29945328、chr6:29945361-29945381、chr6:29945362-29945382及chr6:31382543-31382563。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑，諸如釀膿鏈球菌Cas9或包含釀膿鏈球菌Cas9切口酶之鹼基編輯劑。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942815-29942835、chr6:29942816-29942836、chr6:29942817-29942837、chr6:29942817-29942837、chr6:29942828-29942848、chr6:29942837-29942857、chr6:29942885-29942905、chr6:29942895-29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899-29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29942905-29942925、chr6:29942912-29942932、chr6:29942913-29942933、chr6:29943490-29943510、chr6:29943497-29943517、chr6:29943498-29943518、chr6:29943502-29943522、chr6:29943502-29943522、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943566-29943586、chr6:29943569-29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573-29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605、chr6:29943589-29943609、chr6:29943568-29943588及chr6:29942815-29942835。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑，諸如釀膿鏈球菌Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942884-29942904、chr6:29943519-29943539、chr6:29942863-29942883。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑，諸如金黃色葡萄球菌(S. aureus)Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29943517-29943537及chr6:29943523-29943543。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑，諸如CasX。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942845-29942869、chr6:29942852-29942876、chr6:29942865-29942889、chr6:29942891-29942915、chr6:29942895-29942919、chr6:29942903-29942927、chr6:29942904-29942928、chr6:29943518-29943542、chr6:29943525-29943549、chr6:29943535-29943559、chr6:29943538-29943562、chr6:29943539-29943563、chr6:29943547-29943571、chr6:29943547-29943571、chr6:29943548-29943572、chr6:29943555-29943579、chr6:29943556-29943580、chr6:29943557-29943581、chr6:29943558-29943582、chr6:29943559-29943583、chr6:29943563-29943587、chr6:29943564-29943588、chr6:29943565-29943589、chr6:29943568-29943592、chr6:29943571-29943595、chr6:29943572-29943596、chr6:29943595-29943619、chr6:29943596-29943620及chr6:29943600-29943624。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑，諸如Nme2 Cas9。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942885-29942905、chr6:29942895-29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899-29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943529-29943549、chr6:29943566-29943586、chr6:29943568-29943588、chr6:29943569-29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573-29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605及chr6:29943589-29943609。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑，諸如包含脫胺酶及釀膿鏈球菌Cas9切口酶之鹼基編輯劑。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942469-29942489、chr6:29943058-29943078、chr6:29943063-29943083、chr6:29943080-29943100、chr6:29943187-29943207、chr6:29943192-29943212、chr6:29943197-29943217、chr6:29943812-29943832、chr6:29944349-29944369、chr6:29944996-29945016、chr6:29945018-29945038、chr6:29945341-29945361及chr6:29945526-29945546。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942854至chr6:29942913及chr6:29943518至chr6: 29943619。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標：chr6:29942876-29942897內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標：chr6:29943528-chr629943550內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942864-29942884內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942868-29942888內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942876-29942896內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942877-29942897內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942883-29942903內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943126-29943146內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943528-29943548內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943529-29943549內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943530-29943550內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943537-29943557內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943549-29943569內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943589-29943609內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29944026-29944046內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少17、19、18或20個連續核苷酸。
在一些實施例中，基因編輯系統包含類轉錄活化蛋白效應因子核酸酶(TALEN)。在一些實施例中，基因編輯系統包含鋅指核酸酶。在一些實施例中，基因編輯系統包含CRISPR/Cas系統，諸如2類系統。在一些實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
例示性經RNA引導之DNA結合劑展示於下 表 1A中。
表1A.例示性經RNA引導之DNA結合劑。
經 RNA 引導之 DNA 結合劑 PAM 引導物長度
來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶 NGG 20 bp
來自奈瑟氏腦膜炎菌( Neisseria meningitidis)之Cas9核酸酶 NNNNG[A/C]TT 20bp
來自嗜熱鏈球菌( Streptococcus thermophilus)之Cas9核酸酶 NNAGAAW 20bp
Cas9核酸酶係來自金黃色葡萄球( Staphylococcus aureus)菌() NNG(A/G)(A/G)T 20bp
來自新兇手弗朗西斯氏菌( Francisella novicida)之Cpf1核酸酶 TTTN 23bp
來自胺基酸球菌屬( Acidaminococcus sp.)之Cpf1核酸酶。 TTTV 23bp
來自毛螺科菌( Lachnospiraceae bacterium)之Cpf1核酸酶 TTTV 23bp
C成為T之鹼基編輯劑* NGG 20bp
A成為G之鹼基編輯劑* NGG 20bp
Cas12a 與Cpf1相同
CasX TTCN 20bp
NME2 NNNNCC 24bp
*基於脫胺酶-SpyCas9切口酶之例示性鹼基編輯劑。如顯而易見，鹼基編輯劑特異性(包括PAM)將隨其切口酶而變化。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸包含Cas9蛋白。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑係選自以下中之一者：釀膿鏈球菌Cas9、例如Nme2Cas9之奈瑟氏腦膜炎菌Cas9、嗜熱鏈球菌Cas9、金黃色葡萄球菌Cas9、新兇手弗朗西斯氏菌Cpf1、胺基酸球菌屬Cpf1、毛螺科菌Cpf1、C成為T之鹼基編輯劑、A成為G之鹼基編輯劑、Cas12a、Mad7核酸酶、ARCUS核酸酶及CasX。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含選自以下中之一者的多肽：釀膿鏈球菌Cas9、例如Nme2Cas9之奈瑟氏腦膜炎菌Cas9、嗜熱鏈球菌Cas9、金黃色葡萄球菌Cas9、新兇手弗朗西斯氏菌Cpf1、胺基酸球菌屬Cpf1、毛螺科菌Cpf1、C成為T之鹼基編輯劑、A成為G之鹼基編輯劑、Cas12a及CasX。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為奈瑟氏腦膜炎菌Cas9，例如Nme2Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為嗜熱鏈球菌Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為金黃色葡萄球菌Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為來自新兇手弗朗西斯氏菌( F.novicida)之Cpf1。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為來自胺基酸球菌屬之Cpf1。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為C成為T之鹼基編輯劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為A成為G之鹼基編輯劑。在一些實施例中，鹼基編輯劑包含脫胺酶及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸包含APOBEC3A脫胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之切口酶為SpyCas9切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之切口酶包含NmeCas9切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為Cas12a。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為CasX。
在任一以上實施例中，基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為鹼基編輯劑。在一些實施例中，鹼基編輯劑包含C成為T之脫胺酶及諸如釀膿鏈球菌Cas9切口酶之經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，鹼基編輯劑包含A成為G之脫胺酶及諸如釀膿鏈球菌Cas9切口酶之經RNA引導之切口酶。
在一些實施例中，當工程化細胞對HLA-B為同型接合時，HLA-B等位基因選自以下HLA-B等位基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02。
在一些實施例中，當工程化細胞對HLA-C為同型接合時，HLA-C等位基因選自以下HLA-C等位基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，HLA-B等位基因係選自以下HLA-B等位基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02；且HLA-C等位基因係選自以下HLA-C等位基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，工程化細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，工程化人類細胞的HLA-B及HLA-C等位基因係選自以下HLA-B及HLA-C等位基因中之任一者：HLA-B*07:02及HLA-C*07:02；HLA-B*08:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:02及HLA-C*05:01；HLA-B*35:01及HLA-C*04:01；HLA-B*40:01及HLA-C*03:04；HLA-B*57:01及HLA-C*06:02；HLA-B*14:02及HLA-C*08:02；HLA-B*15:01及HLA-C*03:03；HLA-B*13:02及HLA-C*06:02；HLA-B*44:03及HLA-C*16:01；HLA-B*38:01及HLA-C*12:03；HLA-B*18:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:03及HLA-C*04:01；HLA-B*51:01及HLA-C*15:02；HLA-B*49:01及HLA-C*07:01；HLA-B*15:01及HLA-C*03:04；HLA-B*18:01及HLA-C*12:03；HLA-B*27:05及HLA-C*02:02；HLA-B*35:03及HLA-C*04:01；HLA-B*18:01及HLA-C*05:01；HLA-B*52:01及HLA-C*12:02；HLA-B*51:01及HLA-C*14:02；HLA-B*37:01及HLA-C*06:02；HLA-B*53:01及HLA-C*04:01；HLA-B*55:01及HLA-C*03:03；HLA-B*44:02及HLA-C*07:04；HLA-B*44:03及HLA-C*07:01；HLA-B*35:02及HLA-C*04:01；HLA-B*15:01及HLA-C*04:01；及HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*07:02及HLA-C*07:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*08:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:02及HLA-C*05:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*35:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*40:01及HLA-C*03:04。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*57:01及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*14:02及HLA-C*08:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*15:01及HLA-C*03:03。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*13:02及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:03及HLA-C*16:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*38:01及HLA-C*12:03。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*18:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:03及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*51:01及HLA-C*15:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*49:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*15:01及HLA-C*03:04。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*18:01及HLA-C*12:03。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*27:05及HLA-C*02:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*35:03及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*18:01及HLA-C*05:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*52:01及HLA-C*12:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*51:01及HLA-C*14:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*37:01及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*53:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*55:01及HLA-C*03:03。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:02及HLA-C*07:04。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:03及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*35:02及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*15:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。
本文所揭示之HLA-B及HLA-C等位基因組合累積地覆蓋約88%之群體。HLA-B及HLA-C等位基因對之累積頻率展示於下 表 1B中。
表1B.群體中之HLA-B及HLA-C等位基因之累積頻率。
累積頻率 等位基因
0.194 HLA-B*07:02及HLA-C*07:02
0.33 HLA-B*08:01及HLA-C*07:01
0.413 HLA-B*44:02及HLA-C*05:01
0.483 HLA-B*35:01及HLA-C*04:01
0.534 HLA-B*40:01及HLA-C*03:04
0.594 HLA-B*57:01及HLA-C*06:02
0.62 HLA-B*14:02及HLA-C*08:02
0.648 HLA-B*15:01及HLA-C*03:03
0.671 HLA-B*13:02及HLA-C*06:02
0.696 HLA-B*44:03及HLA-C*16:01
0.717 HLA-B*38:01及HLA-C*12:03
0.734 HLA-B*18:01及HLA-C*07:01
0.751 HLA-B*44:03及HLA-C*04:01
0.766 HLA-B*51:01及HLA-C*15:02
0.776 HLA-B*49:01及HLA-C*07:01
0.787 HLA-B*15:01及HLA-C*03:04
0.798 HLA-B*18:01及HLA-C*12:03
0.809 HLA-B*27:05及HLA-C*02:02
0.815 HLA-B*35:03及HLA-C*04:01
0.827 HLA-B*18:01及HLA-C*05:01
0.838 HLA-B*52:01及HLA-C*12:02
0.845 HLA-B*51:01及HLA-C*14:02
0.856 HLA-B*37:01及HLA-C*06:02
0.865 HLA-B*53:01及HLA-C*04:01
0.872 HLA-B*55:01及HLA-C*03:03
0.876 HLA-B*44:02及HLA-C*07:04
0.881 HLA-B*44:03及HLA-C*07:01
0.884 HLA-B*35:02及HLA-C*04:01
0.888 HLA-B*15:01及HLA-C*04:01
在一些實施例中，提供一種相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現的工程化人類細胞，其對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，進一步具有降低或消除之MHC II類蛋白表面表現。在一些實施例中，工程化人類細胞在降低或消除MHC II類表面表現之基因中具有基因修飾。在一些實施例中，工程化人類細胞具有CIITA基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化人類細胞具有HLA-DR基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化人類細胞具有HLA-DQ基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化人類細胞具有HLA-DP基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化人類細胞具有RFX基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化人類細胞具有CREB基因中之基因修飾。在一些實施例中，工程化人類細胞具有核因子(NF)-γ基因中之基因修飾。
在一些實施例中，提供一種相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現的工程化人類細胞，其對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，進一步具有降低或消除之TRAC蛋白表面表現。在一些實施例中，提供一種相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現的工程化人類細胞，其對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，進一步具有降低或消除之TRBC蛋白表面表現。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528至chr6:29943609內的至少一個核苷酸，且其中該工程化細胞進一步在降低或消除MHC II類表面表現之基因中包含基因修飾。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528至chr6:29943609內的至少一個核苷酸，其中該工程化細胞進一步包含CIITA基因中之基因修飾。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528至chr6:29943609內的至少一個核苷酸，其中該工程化細胞進一步包含TRAC基因中之基因修飾。在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528至chr6:29943609內的至少一個核苷酸，其中該工程化細胞進一步包含TRBC基因中之基因修飾。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528至chr6:29943609內的至少一個核苷酸，其中該工程化細胞進一步包含外源核酸。在一些實施例中，工程化細胞包含編碼表現於工程化細胞之表面上之靶向受體的外源核酸。在一些實施例中，靶向受體為CAR或通用CAR。在一些實施例中，靶向受體為TCR。在一些實施例中，靶向受體為WT1 TCR。在一些實施例中，靶向受體為受體之配位體。在一些實施例中，靶向受體為雜合CAR/TCR。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別域(例如，癌症抗原識別域)及TCR之次單元。在一些實施例中，靶向受體為細胞介素受體。在一些實施例中，靶向受體為趨化因子受體。在一些實施例中，靶向受體為B細胞受體(BCR)。在一些實施例中，工程化細胞進一步包含編碼由工程化細胞分泌之多肽(亦即可溶性多肽)的外源核酸。在一些實施例中，外源核酸編碼治療性多肽。在一些實施例中，經分泌多肽為抗體。在一些實施例中，經分泌多肽為酶。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體編碼細胞介素。在一些實施例中，外源核酸編碼趨化因子。在一些實施例中，外源核酸編碼融合蛋白。
工程化人類細胞可為本文所揭示之例示性細胞類型中之任一者。此外，因為MHC I類分子表現於所有有核細胞上，所以工程化人類細胞可為任何有核細胞。在一些實施例中，工程化細胞為免疫細胞。在一些實施例中，工程化細胞為幹細胞，諸如造血幹細胞(HSC)。在一些實施例中，工程化細胞為誘導性富潛能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，工程化細胞為間質幹細胞(MSC)。在一些實施例中，工程化細胞為神經幹細胞(NSC)。在一些實施例中，工程化細胞為角膜緣幹細胞(LSC)。在一些實施例中，工程化細胞為先驅細胞，例如內皮先驅細胞或神經先驅細胞。在一些實施例中，工程化細胞為組織特異性初生細胞。在一些實施例中，工程化細胞係選自：軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。在一些實施例中，工程化細胞為單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞或粒細胞。在一些實施例中，工程化細胞為單核球。在一些實施例中，工程化細胞為巨噬細胞。在一些實施例中，工程化細胞為肥大細胞。在一些實施例中，工程化細胞為樹突狀細胞。在一些實施例中，工程化細胞為粒細胞。在一些實施例中，工程化細胞為淋巴球。在一些實施例中，工程化細胞為T細胞。在一些實施例中，工程化細胞為CD4+ T細胞。在一些實施例中，工程化細胞為CD8+ T細胞。在一些實施例中，工程化細胞為記憶T細胞。在一些實施例中，工程化細胞為B細胞。在一些實施例中，工程化細胞為漿B細胞。在一些實施例中，工程化細胞為記憶B細胞。在一些實施例中，工程化細胞為巨噬細胞。
在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之工程化人類細胞中之任一者。在一些實施例中，醫藥組合物包含本文所揭示之任一種工程化細胞的群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少65% HLA-A陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少70% HLA-A陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少80% HLA-A陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少90% HLA-A陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少91%陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少92% HLA-A陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少93% HLA-A陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少94% HLA-A陰性之工程化細胞群體。
在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少95%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少至少97%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少98%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少99%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含如藉由流動式細胞測量術所量測至少至少99.5%內源性TCR蛋白陰性之工程化細胞群體。
在一些實施例中，提供用於向有需要之個體投與本文所揭示之工程化人類細胞或醫藥組合物的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之工程化人類細胞或醫藥組合物作為ACT療法的方法。在一些實施例中，提供用於向個體投與本文所揭示之工程化人類細胞或醫藥組合物作為癌症治療的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之工程化人類細胞或醫藥組合物作為自體免疫疾病治療的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之工程化人類細胞或醫藥組合物作為傳染病治療的方法。 C. 用於降低或消除HLA-A之表面表現的方法及組合物
本發明提供藉由基因修飾HLA-A基因相對於未經修飾細胞降低或消除HLA-A蛋白之表面表現的方法及組合物。所得經基因修飾之細胞在本文中亦稱為工程化細胞。在一些實施例中，已經基因修飾之(或工程化)細胞可為使用本文所提供之方法或組合物進行進一步基因修飾之起始細胞。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，具有降低的HLA-A表現之細胞適用於過繼細胞轉移療法。在一些實施例中，HLA-A基因之編輯與額外基因修飾組合以產生同種異體移植目的所需之細胞。
在一些實施例中，方法包含相對於未經修飾細胞降低人類細胞中HLA-A蛋白之表面表現，其包含使細胞與包含以下之組合物接觸：a)HLA-A引導RNA，其包含：i. 選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或ii. 選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或iii. 與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；或iv. 結合至包含 表 2 至 5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或v. 與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或vi. 與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之 b)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。在一些實施例中，方法進一步包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑係選自以下中之一者：釀膿鏈球菌Cas9、例如Nme2Cas9之奈瑟氏腦膜炎菌Cas9、嗜熱鏈球菌Cas9、金黃色葡萄球菌Cas9、新兇手弗朗西斯氏菌Cpf1、胺基酸球菌屬Cpf1、毛螺科菌Cpf1、C成為T之鹼基編輯劑、A成為G之鹼基編輯劑、Cas12a及CasX。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含選自以下中之一者的多肽：釀膿鏈球菌Cas9、例如Nme2Cas9之奈瑟氏腦膜炎菌Cas9、嗜熱鏈球菌Cas9、金黃色葡萄球菌Cas9、新兇手弗朗西斯氏菌Cpf1、胺基酸球菌屬Cpf1、毛螺科菌Cpf1、C成為T之鹼基編輯劑、A成為G之鹼基編輯劑、Cas12a及CasX。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含脫胺酶域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A脫胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為奈瑟氏腦膜炎菌Cas9，例如Nme2Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為嗜熱鏈球菌Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為金黃色葡萄球菌Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為來自胺基酸球菌屬之Cpf1。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為C成為T之鹼基編輯劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為A成為G之鹼基編輯劑。在一些實施例中，鹼基編輯劑包含脫胺酶及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A脫胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之切口酶為SpyCas9切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之切口酶包含NmeCas9切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas12a。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為CasX。在一些實施例中，HLA-A蛋白在細胞(亦即工程化細胞)表面上之表現藉此降低。
在一些實施例中，方法包含製造相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白表面表現之工程化人類細胞，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，該方法包含使細胞與包含以下之組合物接觸：a)HLA-A引導RNA，其包含：i. 選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或ii. 選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或iii. 與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；或iv. 結合至包含 表 2 至 5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或v.與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或vi. 與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之 b)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。在一些實施例中，方法進一步包含使該細胞與經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸接觸。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含脫胺酶域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A脫胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，藉此降低HLA-A蛋白在細胞(亦即工程化細胞)表面上之表現。
在一些實施例中，降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現的方法包含使細胞與本文所揭示之HLA-A引導RNA中之任何一或多者接觸。在一些實施例中，CIITA引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列。
在一些實施例中，提供包含以下之組合物：a)HLA-A引導RNA，其包含：i. 選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或ii. 選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或iii. 與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；或iv. 結合至包含 表 2 至 5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或v. 與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或vi. 與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之 b)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。在一些實施例中，組合物進一步包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。在一些實施例中，組合物包含經RNA引導之DNA結合劑，該結合劑為Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA引導RNA為釀膿鏈球菌Cas9引導RNA。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含脫胺酶域。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A脫胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。
在一些實施例中，組合物進一步包含尿嘧啶醣苷酶抑制劑(UGI)。在一些實施例中，組合物包含經RNA引導之DNA結合劑，該經RNA引導之DNA結合劑藉由HLA-A基因體目標序列產生胞嘧啶(C)形成胸腺嘧啶(T)之轉化。在一些實施例中，組合物包含經RNA引導之DNA結合劑，該經RNA引導之DNA結合劑藉由HLA-A基因體目標序列產生腺苷(A)形成鳥嘌呤(G)之轉化。
在一些實施例中，提供由本文所述之方法產生之工程化人類細胞。在一些實施例中，由本文所述之方法及組合物產生之工程化人類細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，方法產生包含具有降低或消除的HLA-A表現之工程化人類細胞之組合物。在一些實施例中，相比於未經修飾細胞，由本文所揭示之方法產生之工程化人類細胞自CD8+ T細胞引發之反應降低，如在含有CD8+ T細胞之活體外細胞培養分析中所量測。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，提供由包含醫藥學上可接受之載劑的本文所揭示之組合物產生之細胞。在一些實施例中，提供包含本文所揭示之細胞的組合物。 1.  HLA-A引導RNA
本文所提供之方法及組合物揭示適用於降低或消除人類細胞表面上HLA-A蛋白之表現的引導RNA。在一些實施例中，此類引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至HLA-A基因體目標序列，且可在本文中稱為「HLA-A引導RNA」。在一些實施例中，HLA-A引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑導引至人類HLA-A基因體目標序列。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含本文所述之HLA-A引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
在一些實施例中，提供一種包含HLA-A單引導RNA(sgRNA)之組合物，該HLA-A單引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含本文所述之HLA-A sgRNA及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
在一些實施例中，提供一種包含HLA-A雙引導RNA(dgRNA)之組合物，該HLA-A雙引導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含本文所述之HLA-A dgRNA及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 1-211中之任一者的引導序列。例示性HLA-A引導序列展示於下 表 2中(SEQ ID NO: 1-95與對應相應引導RNA序列SEQ ID NO: 249-343及344-438)、 表 3(SEQ ID NO: 96-128與對應引導RNA序列SEQ ID NO: 439-471及472-504)、 表 4(SEQ ID NO: 129-182)及 表 5(SEQ ID NO:183-211與對應引導RNA序列SEQ ID NO: 505-532及533-560)。
表 2 . 例示性 HLA-A 引導 RNA
引導物ID 引導序列之SEQ ID NO 引導序列 例示性引導 RNA 全序列 (SEQ ID NO: 249-343) 例示性引導RNA 經修飾序列(四個末端U殘基視情況存在且可包括0、1、2、3、4或更多個U) (SEQ ID NO: 344-438) 基因體座標 (hg38)
G018983 1 UGGAGGGCCUGAUGUGUGUU UGGAGGGCCUGAUGUGUGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mG*AGGGCCUGAUGUGUGUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945290-29945310 (與hg38之錯配=2)
G018984 2 GCCUGAUGUGUGUUGGGUGU GCCUGAUGUGUGUUGGGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mC*UGAUGUGUGUUGGGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945296-29945316 (與hg38之錯配=2)
G018985 3 CCUGAUGUGUGUUGGGUGUU CCUGAUGUGUGUUGGGUGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mU*GAUGUGUGUUGGGUGUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945297-29945317 (與hg38之錯配=1)
G018986 4 CCCAACACCCAACACACAUC CCCAACACCCAACACACAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mC*AACACCCAACACACAUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945300-29945320 (與hg38之錯配=1)
G018965 5 UCAGGAAACAUGAAGAAAGC UCAGGAAACAUGAAGAAAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mA*GGAAACAUGAAGAAAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29890117-29890137
G019018 6 AGGCGCCUGGGCCUCUCCCG AGGCGCCUGGGCCUCUCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mG*mG*CGCCUGGGCCUCUCCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29927058-29927078
G018937 7 CGGGCUGGCCUCCCACAAGG CGGGCUGGCCUCCCACAAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mG*GCUGGCCUCCCACAAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29934330-29934350
G018990 8 ACGGCCAUCCUCGGCGUCUG ACGGCCAUCCUCGGCGUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mC*mG*GCCAUCCUCGGCGUCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942541-29942561
G018991 9 GACGGCCAUCCUCGGCGUCU GACGGCCAUCCUCGGCGUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mC*GGCCAUCCUCGGCGUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942542-29942562
G018992 10 GACGCCGAGGAUGGCCGUCA GACGCCGAGGAUGGCCGUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mC*GCCGAGGAUGGCCGUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942543-29942563
G018993 11 UGACGGCCAUCCUCGGCGUC UGACGGCCAUCCUCGGCGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mA*CGGCCAUCCUCGGCGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942543-29942563
G018994 12 GGCGCCAUGACGGCCAUCCU GGCGCCAUGACGGCCAUCCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*GCCAUGACGGCCAUCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942550-29942570
G018995 13 ACAGCGACGCCGCGAGCCAG ACAGCGACGCCGCGAGCCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mC*mA*GCGACGCCGCGAGCCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942864-29942884
G018996 14 CGACGCCGCGAGCCAGAGGA CGACGCCGCGAGCCAGAGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mA*CGCCGCGAGCCAGAGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942868-29942888
G018997 15 CGAGCCAGAGGAUGGAGCCG CGAGCCAGAGGAUGGAGCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mA*GCCAGAGGAUGGAGCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942876-29942896
G018998 16 CGGCUCCAUCCUCUGGCUCG CGGCUCCAUCCUCUGGCUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mG*CUCCAUCCUCUGGCUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942876-29942896
G018999 17 GAGCCAGAGGAUGGAGCCGC GAGCCAGAGGAUGGAGCCGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mG*CCAGAGGAUGGAGCCGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942877-29942897
G019000 18 GCGCCCGCGGCUCCAUCCUC GCGCCCGCGGCUCCAUCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mG*CCCGCGGCUCCAUCCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942883-29942903
G019001 19 GCCCGUCCGUGGGGGAUGAG GCCCGUCCGUGGGGGAUGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mC*CGUCCGUGGGGGAUGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943062-29943082
G019002 20 UCAUCCCCCACGGACGGGCC UCAUCCCCCACGGACGGGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mA*UCCCCCACGGACGGGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943063-29943083
G019003 21 AUCUCGGACCCGGAGACUGU AUCUCGGACCCGGAGACUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mU*mC*UCGGACCCGGAGACUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943092-29943112
G019004 22 GGGGUCCCGCGGCUUCGGGG GGGGUCCCGCGGCUUCGGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mG*GUCCCGCGGCUUCGGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943115-29943135
G019005 23 CUCGGGGUCCCGCGGCUUCG CUCGGGGUCCCGCGGCUUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mC*GGGGUCCCGCGGCUUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943118-29943138
G019006 24 UCUCGGGGUCCCGCGGCUUC UCUCGGGGUCCCGCGGCUUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mU*CGGGGUCCCGCGGCUUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943119-29943139
G019007 25 GUCUCGGGGUCCCGCGGCUU GUCUCGGGGUCCCGCGGCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mU*mC*UCGGGGUCCCGCGGCUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943120-29943140
G019008 26 GCAAGGGUCUCGGGGUCCCG GCAAGGGUCUCGGGGUCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mA*AGGGUCUCGGGGUCCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943126-29943146
G019009 27 GGACCCCGAGACCCUUGCCC GGACCCCGAGACCCUUGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mA*CCCCGAGACCCUUGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943128-29943148
G019010 28 GACCCCGAGACCCUUGCCCC GACCCCGAGACCCUUGCCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mC*CCCGAGACCCUUGCCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943129-29943149
G019011 29 CGAGACCCUUGCCCCGGGAG CGAGACCCUUGCCCCGGGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mA*GACCCUUGCCCCGGGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943134-29943154
G019012 30 CUCCCGGGGCAAGGGUCUCG CUCCCGGGGCAAGGGUCUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mC*CCGGGGCAAGGGUCUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943134-29943154
G019013 31 UCUCCCGGGGCAAGGGUCUC UCUCCCGGGGCAAGGGUCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mU*CCCGGGGCAAGGGUCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943135-29943155
G019014 32 CUCUCCCGGGGCAAGGGUCU CUCUCCCGGGGCAAGGGUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mC*UCCCGGGGCAAGGGUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943136-29943156
G019015 33 CCUUGCCCCGGGAGAGGCCC CCUUGCCCCGGGAGAGGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mU*UGCCCCGGGAGAGGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943140-29943160
G019016 34 CUGGGCCUCUCCCGGGGCAA CUGGGCCUCUCCCGGGGCAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mG*GGCCUCUCCCGGGGCAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943142-29943162
G019017 35 CCUGGGCCUCUCCCGGGGCA CCUGGGCCUCUCCCGGGGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mU*GGGCCUCUCCCGGGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943143-29943163
G019019 36 UUUAGGCCAAAAAUCCCCCC UUUAGGCCAAAAAUCCCCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mU*mU*AGGCCAAAAAUCCCCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943188-29943208
G021208 37 CGCUGCAGCGCACGGGUACC CGCUGCAGCGCACGGGUACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mC*UGCAGCGCACGGGUACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943528-29943548
G021209 38 GCUGCAGCGCACGGGUACCA GCUGCAGCGCACGGGUACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mU*GCAGCGCACGGGUACCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943529-29943549
G021210 39 CUGCAGCGCACGGGUACCAG CUGCAGCGCACGGGUACCAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mG*CAGCGCACGGGUACCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943530-29943550
G018932 40 CGCACGGGUACCAGGGGCCA CGCACGGGUACCAGGGGCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mC*ACGGGUACCAGGGGCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943536-29943556
G018933 41 GCACGGGUACCAGGGGCCAC GCACGGGUACCAGGGGCCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mA*CGGGUACCAGGGGCCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943537-29943557
G018934 42 CACGGGUACCAGGGGCCACG CACGGGUACCAGGGGCCACGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mA*mC*GGGUACCAGGGGCCACGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943538-29943558
G018935 43 GGGAGGCGCCCCGUGGCCCC GGGAGGCGCCCCGUGGCCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mG*AGGCGCCCCGUGGCCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943549-29943569
G018936 44 GCGAUCAGGGAGGCGCCCCG GCGAUCAGGGAGGCGCCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mG*AUCAGGGAGGCGCCCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943556-29943576
G021211 45 UCCUUGUGGGAGGCCAGCCC UCCUUGUGGGAGGCCAGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mC*UUGUGGGAGGCCAGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943589-29943609
G018938 46 CUCCUUGUGGGAGGCCAGCC CUCCUUGUGGGAGGCCAGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mC*CUUGUGGGAGGCCAGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943590-29943610
G018939 47 GGCUGGCCUCCCACAAGGAG GGCUGGCCUCCCACAAGGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*UGGCCUCCCACAAGGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943590-29943610
G018940 48 UUGUCUCCCCUCCUUGUGGG UUGUCUCCCCUCCUUGUGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mU*mG*UCUCCCCUCCUUGUGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943599-29943619
G018941 49 CCACAAGGAGGGGAGACAAU CCACAAGGAGGGGAGACAAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mA*CAAGGAGGGGAGACAAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943600-29943620
G018942 50 CACAAGGAGGGGAGACAAUU CACAAGGAGGGGAGACAAUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mA*mC*AAGGAGGGGAGACAAUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943601-29943621
G018943 51 CAAUUGUCUCCCCUCCUUGU CAAUUGUCUCCCCUCCUUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mA*mA*UUGUCUCCCCUCCUUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943602-29943622
G018944 52 CCAAUUGUCUCCCCUCCUUG CCAAUUGUCUCCCCUCCUUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mA*AUUGUCUCCCCUCCUUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943603-29943623
G018945 53 AUCCCUCGAAUACUGAUGAG AUCCCUCGAAUACUGAUGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mU*mC*CCUCGAAUACUGAUGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943774-29943794
G018946 54 AACCACUCAUCAGUAUUCGA AACCACUCAUCAGUAUUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mA*mC*CACUCAUCAGUAUUCGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943779-29943799
G018947 55 GAACCACUCAUCAGUAUUCG GAACCACUCAUCAGUAUUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mA*CCACUCAUCAGUAUUCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943780-29943800
G018948 56 GAGGAAAAGUCACGGGCCCA GAGGAAAAGUCACGGGCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mG*GAAAAGUCACGGGCCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943822-29943842
G018949 57 GGCCCGUGACUUUUCCUCUC GGCCCGUGACUUUUCCUCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*CCGUGACUUUUCCUCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943824-29943844
G018950 58 UGCUUCACACUCAAUGUGUG UGCUUCACACUCAAUGUGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mC*UUCACACUCAAUGUGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943857-29943877
G018951 59 GCUUCACACUCAAUGUGUGU GCUUCACACUCAAUGUGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mU*UCACACUCAAUGUGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943858-29943878
G018952 60 CUUCACACUCAAUGUGUGUG CUUCACACUCAAUGUGUGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mU*CACACUCAAUGUGUGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943859-29943879
G018953 61 UUCACACUCAAUGUGUGUGG UUCACACUCAAUGUGUGUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mU*mC*ACACUCAAUGUGUGUGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943860-29943880
G018954 62 UUGAGAAUGGACAGGACACC UUGAGAAUGGACAGGACACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mU*mG*AGAAUGGACAGGACACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944026-29944046
G021205 63 AGGCAUUUUGCAUCUGUCAU AGGCAUUUUGCAUCUGUCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mG*mG*CAUUUUGCAUCUGUCAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944077-29944097
G021206 64 CAGGCAUUUUGCAUCUGUCA CAGGCAUUUUGCAUCUGUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mA*mG*GCAUUUUGCAUCUGUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944078-29944098
G018955 65 AGGGGCCCUGACCCUGCUAA AGGGGCCCUGACCCUGCUAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mG*mG*GGCCCUGACCCUGCUAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944458-29944478
G018956 66 UGGGAAAAGAGGGGAAGGUG UGGGAAAAGAGGGGAAGGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mG*GAAAAGAGGGGAAGGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944478-29944498
G018957 67 UGGAGGAGGAAGAGCUCAGG UGGAGGAGGAAGAGCUCAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mG*AGGAGGAAGAGCUCAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944597-29944617
G018958 68 UGAGAUUUCUUGUCUCACUG UGAGAUUUCUUGUCUCACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mA*GAUUUCUUGUCUCACUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944642-29944662
G018959 69 GAGAUUUCUUGUCUCACUGA GAGAUUUCUUGUCUCACUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mG*AUUUCUUGUCUCACUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944643-29944663
G018960 70 UAAAGCACCUGUUAAAAUGA UAAAGCACCUGUUAAAAUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mA*mA*AGCACCUGUUAAAAUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944772-29944792
G018961 71 AAUCUGUCCUUCAUUUUAAC AAUCUGUCCUUCAUUUUAACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mA*mU*CUGUCCUUCAUUUUAACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944782-29944802
G018962 72 GUCACAGGGGAAGGUCCCUG GUCACAGGGGAAGGUCCCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mU*mC*ACAGGGGAAGGUCCCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944850-29944870
G018964 73 AAACAUGAAGAAAGCAGGUG AAACAUGAAGAAAGCAGGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mA*mA*CAUGAAGAAAGCAGGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944907-29944927
G018966 74 UGUCCUGUGAGAUACCAGAA UGUCCUGUGAGAUACCAGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mU*CCUGUGAGAUACCAGAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945024-29945044
G018967 75 AUGAAGGAGGCUGAUGCCUG AUGAAGGAGGCUGAUGCCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mU*mG*AAGGAGGCUGAUGCCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945097-29945117
G018968 76 AGGCUGAUGCCUGAGGUCCU AGGCUGAUGCCUGAGGUCCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mG*mG*CUGAUGCCUGAGGUCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945104-29945124
G018969 77 GGCUGAUGCCUGAGGUCCUU GGCUGAUGCCUGAGGUCCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*UGAUGCCUGAGGUCCUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945105-29945125
G018970 78 CACAAUAUCCCAAGGACCUC CACAAUAUCCCAAGGACCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mA*mC*AAUAUCCCAAGGACCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945116-29945136
G018971 79 GGUCCUUGGGAUAUUGUGUU GGUCCUUGGGAUAUUGUGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mU*CCUUGGGAUAUUGUGUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945118-29945138
G018972 80 GUCCUUGGGAUAUUGUGUUU GUCCUUGGGAUAUUGUGUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mU*mC*CUUGGGAUAUUGUGUUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945119-29945139
G018973 81 CUCCCAAACACAAUAUCCCA CUCCCAAACACAAUAUCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mC*CCAAACACAAUAUCCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945124-29945144
G018974 82 UCCUCUAGCCACAUCUUCUG UCCUCUAGCCACAUCUUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mC*UCUAGCCACAUCUUCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945176-29945196
G018975 83 ACAGAAGAUGUGGCUAGAGG ACAGAAGAUGUGGCUAGAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mC*mA*GAAGAUGUGGCUAGAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945177-29945197
G018976 84 CCUCUAGCCACAUCUUCUGU CCUCUAGCCACAUCUUCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mU*CUAGCCACAUCUUCUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945177-29945197
G018977 85 CCCACAGAAGAUGUGGCUAG CCCACAGAAGAUGUGGCUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mC*ACAGAAGAUGUGGCUAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945180-29945200
G018978 86 GUCAGAUCCCACAGAAGAUG GUCAGAUCCCACAGAAGAUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mU*mC*AGAUCCCACAGAAGAUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945187-29945207
G018979 87 AUCUUCUGUGGGAUCUGACC AUCUUCUGUGGGAUCUGACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mU*mC*UUCUGUGGGAUCUGACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945188-29945208
G018980 88 CCCAGGCAGUGACAGUGCCC CCCAGGCAGUGACAGUGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mC*AGGCAGUGACAGUGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945228-29945248
G018981 89 CUGGGCACUGUCACUGCCUG CUGGGCACUGUCACUGCCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mG*GGCACUGUCACUGCCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945230-29945250
G018982 90 CCUGGGCACUGUCACUGCCU CCUGGGCACUGUCACUGCCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mU*GGGCACUGUCACUGCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945231-29945251
G021207 91 CCCUGGGCACUGUCACUGCC CCCUGGGCACUGUCACUGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mC*UGGGCACUGUCACUGCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945232-29945252
G018987 92 UUGGGUGUUGGGCGGAACAG UUGGGUGUUGGGCGGAACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mU*mG*GGUGUUGGGCGGAACAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945308-29945328
G018988 93 UGGAUGUAUUGAGCAUGCGA UGGAUGUAUUGAGCAUGCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mG*AUGUAUUGAGCAUGCGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945361-29945381
G018989 94 GGAUGUAUUGAGCAUGCGAU GGAUGUAUUGAGCAUGCGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mA*UGUAUUGAGCAUGCGAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945362-29945382
G018963 95 AACAUGAAGAAAGCAGGUGU AACAUGAAGAAAGCAGGUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mA*mC*AUGAAGAAAGCAGGUGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:31382543-31382563
表 3. 其他例示性釀膿鏈球菌 HLA-A 引導 RNA
引導物ID 引導序列之SEQ ID NO 引導序列 具有PAM 之 例示性引導 RNA 全序列(SEQ ID NO: 439-471) 例示性引導RNA 經修飾序列(四個末端U殘基視情況存在且可包括0、1、2、3、4或更多個U ) (SEQ ID NO: 472-504) Genomic Coordinates
G021885 96 UAGCCCACGGCGAUGAAGCG UAGCCCACGGCGAUGAAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mA*mG*CCCACGGCGAUGAAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942815-29942835
G021886 97 GUAGCCCACGGCGAUGAAGC GUAGCCCACGGCGAUGAAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mU*mA*GCCCACGGCGAUGAAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942816-29942836
G021887 98 CGUAGCCCACGGCGAUGAAG CGUAGCCCACGGCGAUGAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mU*AGCCCACGGCGAUGAAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942817-29942837
G021888 99 CUUCAUCGCCGUGGGCUACG CUUCAUCGCCGUGGGCUACGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mU*CAUCGCCGUGGGCUACGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942817-29942837
G021889 100 CGUGUCGUCCACGUAGCCCA CGUGUCGUCCACGUAGCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mU*GUCGUCCACGUAGCCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942828-29942848
G021890 101 UGGACGACACGCAGUUCGUG UGGACGACACGCAGUUCGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mG*ACGACACGCAGUUCGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942837-29942857
G021891 102 GGAUGGAGCCGCGGGCGCCG GGAUGGAGCCGCGGGCGCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mA*UGGAGCCGCGGGCGCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942885-29942905
G021892 103 GCGGGCGCCGUGGAUAGAGC GCGGGCGCCGUGGAUAGAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mG*GGCGCCGUGGAUAGAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942895-29942915
G021893 104 UGCUCUAUCCACGGCGCCCG UGCUCUAUCCACGGCGCCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mC*UCUAUCCACGGCGCCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942896-29942916
G021894 105 GGCGCCGUGGAUAGAGCAGG GGCGCCGUGGAUAGAGCAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*GCCGUGGAUAGAGCAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942898-29942918
G021895 106 GCGCCGUGGAUAGAGCAGGA GCGCCGUGGAUAGAGCAGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mG*CCGUGGAUAGAGCAGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942899-29942919
G021896 107 CGCCGUGGAUAGAGCAGGAG CGCCGUGGAUAGAGCAGGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mC*CGUGGAUAGAGCAGGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942900-29942920
G021897 108 GUGGAUAGAGCAGGAGGGGC GUGGAUAGAGCAGGAGGGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mU*mG*GAUAGAGCAGGAGGGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942904-29942924
G021898 109 GGCCCCUCCUGCUCUAUCCA GGCCCCUCCUGCUCUAUCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*CCCUCCUGCUCUAUCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942905-29942925
G021899 110 AGCAGGAGGGGCCGGAGUAU AGCAGGAGGGGCCGGAGUAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mG*mC*AGGAGGGGCCGGAGUAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942912-29942932
G021900 111 GCAGGAGGGGCCGGAGUAUU GCAGGAGGGGCCGGAGUAUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mA*GGAGGGGCCGGAGUAUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942913-29942933
G021901 112 GGAGUGGCUCCGCAGAUACC GGAGUGGCUCCGCAGAUACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mA*GUGGCUCCGCAGAUACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943490-29943510
G021902 113 CUCCGCAGAUACCUGGAGAA CUCCGCAGAUACCUGGAGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mC*CGCAGAUACCUGGAGAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943497-29943517
G021903 114 UCCGCAGAUACCUGGAGAAC UCCGCAGAUACCUGGAGAACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mC*GCAGAUACCUGGAGAACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943498-29943518
G021904 115 CAGAUACCUGGAGAACGGGA CAGAUACCUGGAGAACGGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mA*mG*AUACCUGGAGAACGGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943502-29943522
G021905 116 UCCCGUUCUCCAGGUAUCUG UCCCGUUCUCCAGGUAUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mC*CGUUCUCCAGGUAUCUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943502-29943522
G021906 117 GCGUCUCCUUCCCGUUCUCC GCGUCUCCUUCCCGUUCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mG*UCUCCUUCCCGUUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943511-29943531
G021907 118 GAAGGAGACGCUGCAGCGCA GAAGGAGACGCUGCAGCGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mA*GGAGACGCUGCAGCGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943520-29943540
G021908 119 AAGGAGACGCUGCAGCGCAC AAGGAGACGCUGCAGCGCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mA*mG*GAGACGCUGCAGCGCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943521-29943541
G021909 120 AGAUCUACAGGCGAUCAGGG AGAUCUACAGGCGAUCAGGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mG*mA*UCUACAGGCGAUCAGGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943566-29943586
G021910 121 UGAUCGCCUGUAGAUCUCCC UGAUCGCCUGUAGAUCUCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mA*UCGCCUGUAGAUCUCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943569-29943589
G021911 122 GGGAGAUCUACAGGCGAUCA GGGAGAUCUACAGGCGAUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mG*AGAUCUACAGGCGAUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943569-29943589
G021912 123 CGGGAGAUCUACAGGCGAUC CGGGAGAUCUACAGGCGAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mG*GAGAUCUACAGGCGAUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943570-29943590
G021913 124 CGCCUGUAGAUCUCCCGGGC CGCCUGUAGAUCUCCCGGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mC*CUGUAGAUCUCCCGGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943573-29943593
G021914 125 GGCCAGCCCGGGAGAUCUAC GGCCAGCCCGGGAGAUCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*CAGCCCGGGAGAUCUACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943578-29943598
G021915 126 UCCCGGGCUGGCCUCCCACA UCCCGGGCUGGCCUCCCACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mC*CGGGCUGGCCUCCCACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943585-29943605
G021916 127 GGGCUGGCCUCCCACAAGGA GGGCUGGCCUCCCACAAGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mG*CUGGCCUCCCACAAGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943589-29943609
G021917 128 CUGAUCGCCUGUAGAUCUCC CUGAUCGCCUGUAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mG*AUCGCCUGUAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943568-29943588
* 此表中所揭示之引導序列可未經修飾、經表中所示之例示性修飾模式修飾或經本文中所揭示或此項技術中可用之不同修飾模式修飾。
表 4. 例示性 HLA-A 引導序列
SEQ ID NO 引導序列 PAM 經 RNA 引導之 DNA 結合劑 基因體座標 (hg38)
129 AGGAUGGAGCCGCGGGCGCC GTGGAT 金黃色葡萄球菌Cas9 chr6:29942884-29942904
130 GGAAGGAGACGCUGCAGCGC ACGGGT 金黃色葡萄球菌Cas9 chr6:29943519-29943539
131 GACAGCGACGCCGCGAGCCA GAGGAT 金黃色葡萄球菌Cas9 chr6:29942863-29942883
132 CGGGAAGGAGACGCUGCAGC TTCT CasX chr6:29943517-29943537
133 CCGUGCGCUGCAGCGUCUCC TTCC CasX chr6:29943523-29943543
134 ACGCAGUUCGUGCGGUUCGACAGC NNNNCC NME2 chr6:29942845-29942869
135 UCGUGCGGUUCGACAGCGACGCCG NNNNCC NME2 chr6:29942852-29942876
136 CAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGAU NNNNCC NME2 chr6:29942865-29942889
137 GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCU NNNNCC NME2 chr6:29942891-29942915
138 UCCUGCUCUAUCCACGGCGCCCGC NNNNCC NME2 chr6:29942895-29942919
139 CCGGCCCCUCCUGCUCUAUCCACG NNNNCC NME2 chr6:29942903-29942927
140 UCCGGCCCCUCCUGCUCUAUCCAC NNNNCC NME2 chr6:29942904-29942928
141 GGGAAGGAGACGCUGCAGCGCACG NNNNCC NME2 chr6:29943518-29943542
142 AGACGCUGCAGCGCACGGGUACCA NNNNCC NME2 chr6:29943525-29943549
143 GCGCACGGGUACCAGGGGCCACGG NNNNCC NME2 chr6:29943535-29943559
144 CACGGGUACCAGGGGCCACGGGGC NNNNCC NME2 chr6:29943538-29943562
145 ACGGGUACCAGGGGCCACGGGGCG NNNNCC NME2 chr6:29943539-29943563
146 CAGGGGCCACGGGGCGCCUCCCUG NNNNCC NME2 chr6:29943547-29943571
147 CAGGGAGGCGCCCCGUGGCCCCUG NNNNCC NME2 chr6:29943547-29943571
148 UCAGGGAGGCGCCCCGUGGCCCCU NNNNCC NME2 chr6:29943548-29943572
149 CAGGCGAUCAGGGAGGCGCCCCGU NNNNCC NME2 chr6:29943555-29943579
150 ACAGGCGAUCAGGGAGGCGCCCCG NNNNCC NME2 chr6:29943556-29943580
151 UACAGGCGAUCAGGGAGGCGCCCC NNNNCC NME2 chr6:29943557-29943581
152 GGGCGCCUCCCUGAUCGCCUGUAG NNNNCC NME2 chr6:29943558-29943582
153 GGCGCCUCCCUGAUCGCCUGUAGA NNNNCC NME2 chr6:29943559-29943583
154 GAGAUCUACAGGCGAUCAGGGAGG NNNNCC NME2 chr6:29943563-29943587
155 GGAGAUCUACAGGCGAUCAGGGAG NNNNCC NME2 chr6:29943564-29943588
156 GGGAGAUCUACAGGCGAUCAGGGA NNNNCC NME2 chr6:29943565-29943589
157 CUGAUCGCCUGUAGAUCUCCCGGG NNNNCC NME2 chr6:29943568-29943592
158 AUCGCCUGUAGAUCUCCCGGGCUG NNNNCC NME2 chr6:29943571-29943595
159 UCGCCUGUAGAUCUCCCGGGCUGG NNNNCC NME2 chr6:29943572-29943596
160 UUGUCUCCCCUCCUUGUGGGAGGC NNNNCC NME2 chr6:29943595-29943619
161 AUUGUCUCCCCUCCUUGUGGGAGG NNNNCC NME2 chr6:29943596-29943620
162 CCCAAUUGUCUCCCCUCCUUGUGG NNNNCC NME2 chr6:29943600-29943624
163 GGAUGGAGCCGCGGGCGCCG NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29942885-29942905
164 GCGGGCGCCGUGGAUAGAGC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29942895-29942915
165 UGCUCUAUCCACGGCGCCCG NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29942896-29942916
166 GGCGCCGUGGAUAGAGCAGG NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29942898-29942918
167 GCGCCGUGGAUAGAGCAGGA NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29942899-29942919
168 CGCCGUGGAUAGAGCAGGAG NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29942900-29942920
169 GUGGAUAGAGCAGGAGGGGC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29942904-29942924
170 GCGUCUCCUUCCCGUUCUCC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943511-29943531
171 GAAGGAGACGCUGCAGCGCA NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943520-29943540
172 AAGGAGACGCUGCAGCGCAC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943521-29943541
173 GCUGCAGCGCACGGGUACCA NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943529-29943549
174 AGAUCUACAGGCGAUCAGGG NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943566-29943586
175 CUGAUCGCCUGUAGAUCUCC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943568-29943588
176 UGAUCGCCUGUAGAUCUCCC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943569-29943589
177 GGGAGAUCUACAGGCGAUCA NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943569-29943589
178 CGGGAGAUCUACAGGCGAUC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943570-29943590
179 CGCCUGUAGAUCUCCCGGGC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943573-29943593
180 GGCCAGCCCGGGAGAUCUAC NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943578-29943598
181 UCCCGGGCUGGCCUCCCACA NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943585-29943605
182 GGGCUGGCCUCCCACAAGGA NGG Spy+鹼基_編輯劑 chr6:29943589-29943609
* 此表中所揭示之引導序列可未經修飾，或經本文中所揭示或此項技術中可用之修飾模式修飾。
表 5. 額外例示性 HLA-A 引導序列。
引導物ID 引導序列之SEQ ID NO 引導序列 具有PAM 之 例示性引導 RNA 全序列(SEQ ID NO: 505-532) 例示性引導RNA 經修飾序列(四個末端U殘基視情況存在且可包括0、1、2、3、4或更多個U ) (SEQ ID NO: 533-560) 基因體座標 (hg38)
G021857 183 ACGACACUGAUUGGCUUCUC ACGACACUGAUUGGCUUCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mC*mG*ACACUGAUUGGCUUCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29942469-29942489
G021858 184 ACCCCUCAUCCCCCACGGAC ACCCCUCAUCCCCCACGGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mC*mC*CCUCAUCCCCCACGGACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943058-29943078
G021859 185 GGCCCGUCCGUGGGGGAUGA GGCCCGUCCGUGGGGGAUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*CCGUCCGUGGGGGAUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943063-29943083
G021860 186 GCCAGGUCGCCCACAGUCUC GCCAGGUCGCCCACAGUCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mC*AGGUCGCCCACAGUCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943080-29943100
G021861 187 GUUUAGGCCAAAAAUCCCCC GUUUAGGCCAAAAAUCCCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mU*mU*UAGGCCAAAAAUCCCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943187-29943207
G021862 188 GGCCAAAAAUCCCCCCGGGU GGCCAAAAAUCCCCCCGGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mG*mC*CAAAAAUCCCCCCGGGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943192-29943212
G021863 189 GACCAACCCGGGGGGAUUUU GACCAACCCGGGGGGAUUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mC*CAACCCGGGGGGAUUUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943197-29943217
G021864 190 CACGGGCCCAAGGCUGCUGC CACGGGCCCAAGGCUGCUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mA*mC*GGGCCCAAGGCUGCUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943812-29943832
G021865 191 ACCCUCAUGCUGCACAUGGC ACCCUCAUGCUGCACAUGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mC*mC*CUCAUGCUGCACAUGGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944349-29944369
G021866 192 CCUCUAGGACCUUAAGGCCC CCUCUAGGACCUUAAGGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mU*CUAGGACCUUAAGGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944996-29945016
G021867 193 GCUCCUUUCUGGUAUCUCAC GCUCCUUUCUGGUAUCUCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mU*CCUUUCUGGUAUCUCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945018-29945038
G021868 194 GCUAUGGGGUUUCUUUGCAU GCUAUGGGGUUUCUUUGCAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mU*AUGGGGUUUCUUUGCAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945341-29945361
G021869 195 GCCUUUGCAGAAACAAAGUC GCCUUUGCAGAAACAAAGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mC*UUUGCAGAAACAAAGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945526-29945546
G021870 196 UGGACCAACCGCCCUCCUGA UGGACCAACCGCCCUCCUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mG*ACCAACCGCCCUCCUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944880-29944900 (與hg38之錯配=2)
G021871 197 AGCCUCUCUGACCUUUAGCA AGCCUCUCUGACCUUUAGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mG*mC*CUCUCUGACCUUUAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU Na
G021872 198 CGCCCUCCUGAAGGUCCUCA CGCCCUCCUGAAGGUCCUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mG*mC*CCUCCUGAAGGUCCUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU Na
G021873 200 CCGCCCUCCUGAAGGUCCUC CCGCCCUCCUGAAGGUCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mC*mG*CCCUCCUGAAGGUCCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU Na
G021874 201 UGGUUCCCUUUGACACACAC UGGUUCCCUUUGACACACACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mG*UUCCCUUUGACACACACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29943794-29943814 (與hg38之錯配=3)
G021875 202 GACCCUGCUAAAGGUCAGAG GACCCUGCUAAAGGUCAGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mC*CCUGCUAAAGGUCAGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU na
G021876 203 AGGACCUUCAGGAGGGCGGU AGGACCUUCAGGAGGGCGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mG*mG*ACCUUCAGGAGGGCGGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU na
G021877 204 GCACACUUCUACCUGGGUCU GCACACUUCUACCUGGGUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mC*mA*CACUUCUACCUGGGUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944671-29944691 (與hg38之錯配=3)
G021878 205 GAGCCUCUCUGACCUUUAGC GAGCCUCUCUGACCUUUAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mG*CCUCUCUGACCUUUAGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU na
G021879 206 ACACUCCUCCAGCACACAUG ACACUCCUCCAGCACACAUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mA*mC*mA*CUCCUCCAGCACACAUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944054-29944074 (與hg38之錯配=2)
G021880 207 CUCUGACCUUUAGCAGGGUC CUCUGACCUUUAGCAGGGUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mU*mC*UGACCUUUAGCAGGGUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU na
G021881 208 CAAGAUAGCCACAUGUGUGC CAAGAUAGCCACAUGUGUGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mC*mA*mA*GAUAGCCACAUGUGUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944043-29944063 (與hg38之錯配=2)
G021882 209 UCUGACCUUUAGCAGGGUCA UCUGACCUUUAGCAGGGUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mC*mU*GACCUUUAGCAGGGUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944450-29944470 (與hg38之錯配=3)
G021883 210 UGUAAAGGUGAGAGCCUGGA UGUAAAGGUGAGAGCCUGGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mU*mG*mU*AAAGGUGAGAGCCUGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29945274-29945294 (與hg38之錯配=1)
G021884 211 GAAGGUCCCUGAGGACCUUC GAAGGUCCCUGAGGACCUUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU mG*mA*mA*GGUCCCUGAGGACCUUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU chr6:29944859-29944879 (與hg38之錯配=3)
* 此表中所揭示之引導序列可未經修飾、經表中所示之例示性修飾模式修飾或經本文中所揭示或此項技術中可用之不同修飾模式修飾。
在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 1-95中之任一者的引導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 7、13-18、22、26、31、33、37-41、43、45、47、57、59、62、66、87中之任一者的引導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 13-18、26、37-39、41、43、45、62中之任一者的引導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 13-18中之任一者的引導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 13-17中之任一者的引導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 37-39、41、43及45中之任一者的引導序列。在一些實施例中，HLA-A gRNA包含選自SEQ ID NO: 37-39中之任一者的引導序列。
在一些實施例中，gRNA包含選自SEQ ID NO: 1-211中之任一者的引導序列。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含引導序列，其為選自SEQ ID NO: 1-211之序列之至少17、18、19或20個連續核苷酸。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%一致的引導序列。
在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含引導序列，該引導序列包含 表 2 至 5中所列之基因體座標之至少10個連續核苷酸±10個核苷酸。如本文所用，基因體座標之至少10個連續核苷酸±10個核苷酸意謂例如基因體座標內之至少10個連續核苷酸，其中基因體座標包括在 表 2 至 5中所列之範圍之5'方向上的10個核苷酸及3'方向上的10個核苷酸。舉例而言，HLA-A引導RNA可包含基因體座標chr6:29942864至chr6:29942903內或chr6:29943528至chr6:29943609內之10個連續核苷酸，包括此等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含之引導序列為包含 表 1 至 2 及 5中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸，或與包含 表 4中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸之序列的至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含之引導序列與選自為包含 表 1 至 2 及 5中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸的序列之序列至少95%、90%或85%一致，或與包含 表 4中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸之序列的至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補。
在一些實施例中， 表 2 至 5引導RNA包含引導序列，該引導序列包含 表 2 至 5中所列之基因體座標之至少15個連續核苷酸±10個核苷酸。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含引導序列，該引導序列包含 表 2 至 5中所列之基因體座標之至少20個連續核苷酸±10個核苷酸。
在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 5。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 20。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 21。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 22。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 24。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 27。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 29。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 30。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 34。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 36。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 37。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 38。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 39。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 40。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 41。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 42。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 43。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 44。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 46。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 47。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 49。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 50。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 51。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 52。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 53。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 54。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 55。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 57。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 58。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 59。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 61。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 62。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 63。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 64。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 67。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 69。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 70。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 71。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 72。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 73。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 74。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 75。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 76。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 77。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 79。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 80。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 81。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 82。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 83。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 84。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 85。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 86。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 87。在一些實施例中，HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 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本文提供HLA-A引導RNA之額外實施例，包括例如對引導RNA之例示性修飾。 2. 對HLA-A之基因修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物對細胞中之HLA-A基因中的至少一個核苷酸進行基因修飾。基因修飾涵蓋由與基因編輯系統接觸而產生之修飾群體(例如，由Cas9及HLA-A引導RNA產生之編輯群體，或由BC22及HLA-A引導RNA產生之編輯群體)。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942854- chr6:29942913及chr6:29943518-chr6: 29943619。
在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr6:29942864-chr6:29942903內的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr6:29943528-chr6:29943609內的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，基因修飾包含以下基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。
在一些實施例中，基因修飾包含以下基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609。
在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr6:29942876-29942897內的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標chr6:29943528-chr629943550內的至少一個核苷酸。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896及chr6:29942877-29942897。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549及chr6:29943530-29943550。
在一些實施例中，基因修飾包含以下基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046、chr6:29934330-29934350、chr6:29943115-29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140-29943160、chr6:29943590-29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858-29943878、chr6:29944478-29944498及chr6:29944850-29944870。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29890117-29890137、chr6:29927058-29927078、chr6:29934330-29934350、chr6:29942541-29942561、chr6:29942542-29942562、chr6:29942543-29942563、chr6:29942543-29942563、chr6:29942550-29942570、chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897、chr6:29942883-29942903、chr6:29943062-29943082、chr6:29943063-29943083、chr6:29943092-29943112、chr6:29943115-29943135、chr6:29943118-29943138、chr6:29943119-29943139、chr6:29943120-29943140、chr6:29943126-29943146、chr6:29943128-29943148、chr6:29943129-29943149、chr6:29943134-29943154、chr6:29943134-29943154、chr6:29943135-29943155、chr6:29943136-29943156、chr6:29943140-29943160、chr6:29943142-29943162、chr6:29943143-29943163、chr6:29943188-29943208、chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550、chr6:29943536-29943556、chr6:29943537-29943557、chr6:29943538-29943558、chr6:29943549-29943569、chr6:29943556-29943576、chr6:29943589-29943609、chr6:29943590-29943610、chr6:29943590-29943610、chr6:29943599-29943619、chr6:29943600-29943620、chr6:29943601-29943621、chr6:29943602-29943622、chr6:29943603-29943623、chr6:29943774-29943794、chr6:29943779-29943799、chr6:29943780-29943800、chr6:29943822-29943842、chr6:29943824-29943844、chr6:29943857-29943877、chr6:29943858-29943878、chr6:29943859-29943879、chr6:29943860-29943880、chr6:29944026-29944046、chr6:29944077-29944097、chr6:29944078-29944098、chr6:29944458-29944478、chr6:29944478-29944498、chr6:29944597-29944617、chr6:29944642-29944662、chr6:29944643-29944663、chr6:29944772-29944792、chr6:29944782-29944802、chr6:29944850-29944870、chr6:29944907-29944927、chr6:29945024-29945044、chr6:29945097-29945117、chr6:29945104-29945124、chr6:29945105-29945125、chr6:29945116-29945136、chr6:29945118-29945138、chr6:29945119-29945139、chr6:29945124-29945144、chr6:29945176-29945196、chr6:29945177-29945197、chr6:29945177-29945197、chr6:29945180-29945200、chr6:29945187-29945207、chr6:29945188-29945208、chr6:29945228-29945248、chr6:29945230-29945250、chr6:29945231-29945251、chr6:29945232-29945252、chr6:29945308-29945328、chr6:29945361-29945381、chr6:29945362-29945382及chr6:31382543-31382563。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942815-29942835、chr6:29942816-29942836、chr6:29942817-29942837、chr6:29942817-29942837、chr6:29942828-29942848、chr6:29942837-29942857、chr6:29942885-29942905、chr6:29942895-29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899-29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29942905-29942925、chr6:29942912-29942932、chr6:29942913-29942933、chr6:29943490-29943510、chr6:29943497-29943517、chr6:29943498-29943518、chr6:29943502-29943522、chr6:29943502-29943522、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943566-29943586、chr6:29943569-29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573-29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605、chr6:29943589-29943609、chr6:29943568-29943588及chr6:29942815-29942835。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942884-29942904、chr6:29943519-29943539、chr6:29942863-29942883。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29943517-29943537及chr6:29943523-29943543。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942845-29942869、chr6:29942852-29942876、chr6:29942865-29942889、chr6:29942891-29942915、chr6:29942895-29942919、chr6:29942903-29942927、chr6:29942904-29942928、chr6:29943518-29943542、chr6:29943525-29943549、chr6:29943535-29943559、chr6:29943538-29943562、chr6:29943539-29943563、chr6:29943547-29943571、chr6:29943547-29943571、chr6:29943548-29943572、chr6:29943555-29943579、chr6:29943556-29943580、chr6:29943557-29943581、chr6:29943558-29943582、chr6:29943559-29943583、chr6:29943563-29943587、chr6:29943564-29943588、chr6:29943565-29943589、chr6:29943568-29943592、chr6:29943571-29943595、chr6:29943572-29943596、chr6:29943595-29943619、chr6:29943596-29943620、chr6:29943600-29943624。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942885-29942905、chr6:29942895-29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899-29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943529-29943549、chr6:29943566-29943586、chr6:29943568-29943588、chr6:29943569-29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573-29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605及chr6:29943589-29943609。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942469-29942489、chr6:29943058-29943078、chr6:29943063-29943083、chr6:29943080-29943100、chr6:29943187-29943207、chr6:29943192-29943212、chr6:29943197-29943217、chr6:29943812-29943832、chr6:29944349-29944369、chr6:29944996-29945016、chr6:29945018-29945038、chr6:29945341-29945361、chr6:29945526-29945546。
在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標：chr6:29942876-29942897內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896及chr6:29942877-29942897。
在一些實施例中，基因修飾包含基因體座標：chr6:29943528-chr629943550內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代。
在一些實施例中，基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549及chr6:29943530-29943550。
在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含目標序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或脫胺中之任何一或多者。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含目標序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含目標序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之缺失。在其他實施例中，對HLA-A之修飾包含目標序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之插入。在其他實施例中，對HLA-A之修飾包含目標序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含插入/缺失，其一般在此項技術中定義為小於1000個鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含引起目標序列中之讀框轉移突變的插入/缺失。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含目標序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之取代。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含由併入模板核酸產生的核苷酸插入、缺失或取代中之一或多者。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含目標序列中供體核酸之插入。在一些實施例中，對HLA-A之修飾並非暫時的。 3.  HLA-A引導RNA之功效
HLA-A引導RNA之功效可藉由此項技術中可用之技術測定，該等技術評定引導RNA之編輯效率及/或細胞表面上HLA-A蛋白的表現。在一些實施例中，細胞表面上HLA-A蛋白之降低或消除可藉由與未經修飾細胞比較(或「相對於未經修飾細胞」)來測定。工程化細胞或細胞群體亦可與未經修飾細胞群體進行比較。
「未經修飾細胞」(unmodified cell/unmodified cells)係指實驗或測試中相同細胞類型之對照細胞(control cell/control cells)，其中「未經修飾之」對照細胞尚未與HLA-A引導物接觸。因此，未經修飾細胞(unmodified cell/unmodified cells)可為尚未與引導RNA接觸之細胞，或已與不靶向HLA-A之引導RNA接觸之細胞。
在一些實施例中，HLA-A引導RNA之功效係藉由量測細胞表面上HLA-A蛋白之含量來測定。在一些實施例中，HLA-A蛋白含量係藉由流動式細胞測量術(例如使用針對HLA-A2/HLA-A3之抗體)來量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體經富集(例如藉由FACS或MACS)且為至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94%HLA-A陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體未經富集(例如藉由FACS或MACS)且為至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94%HLA-A陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少65% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少70% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少80% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少90% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少95% HLA-A類陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少100% HLA-A陰性。
在一些實施例中，有效的HLA-A引導RNA可藉由量測活體外或活體內免疫細胞(例如CD8+ T細胞)對經基因修飾目標細胞之反應來測定。舉例而言，CD8+ T細胞之反應降低指示有效的HLA-A引導RNA。CD8+ T細胞反應可藉由量測CD8+ T細胞活化反應(例如CD8+ T細胞增殖)、活化標記之表現及/或細胞介素產生(IL-2、IFN-γ、TNF-α)之分析(例如流動式細胞測量術、ELISA)來評估。CD8+ T細胞反應可在活體外或活體內評定。在一些實施例中，CD8+ T細胞反應可藉由在活體外共培養經基因修飾之細胞與CD8+ T細胞來評估。在一些實施例中，CD8+ T細胞活性可在活體內模型，例如嚙齒動物模型中評估。在活體內模型中，例如經基因修飾之細胞可與CD8+ T細胞一起投與；經基因修飾之細胞的存活指示能夠避免CD8+ T細胞溶解。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活超過1、2、3、4、5或6週或更多週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活至少一週至六週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活至少兩週至四週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活至少四週至六週。在一些實施例中，方法產生包含細胞之組合物，該細胞在CD8+ T細胞存在下活體內存活超過六週。
HLA-A引導RNA之功效亦可藉由編輯後細胞之存活期來評估。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少一週至六週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少兩週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少三週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少四週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少五週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少六週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少一週至十二週。經基因修飾之細胞之生存力可使用標準技術來量測，包括例如藉由量測細胞死亡、藉由流動式細胞測量術活/死染色或細胞增殖。
在一些實施例中，工程化細胞係藉由工程化人類細胞之持久性來評定，該細胞具有降低或消除之HLA-A表現且對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。如本文所用，「持久性」係指工程化細胞在存在反應性或反應T細胞及/或NK細胞之活體外及/或活體內環境中存在的能力，例如在轉移至接受者中之後活體內存在的能力。在一些實施例中，工程化人類T細胞對NK介導之排斥具有保護作用。在一些實施例中，如本文中所顯示，在轉移至接受者中之後至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天或至少90天，在NK細胞存在下活體內活的工程化細胞相對於在NK細胞不存在下活體內活的工程化細胞之比率為至少0.3: 1或更大。在一些實施例中，如本文中所顯示，在轉移至接受者中之後至少90天，在NK細胞存在下活體內活的工程化細胞相對於在NK細胞不存在下活體內活的工程化細胞之比率為至少0.4: 1或更大、0.5: 1或更大、0.6: 1或更大、0.7: 1或更大、0.8: 1或更大或0.9: 1或更大。在一些實施例中，工程化人類T細胞對CD8+T細胞介導之排斥具有保護作用。
在一些實施例中，工程化細胞可使用混合淋巴球反應(MLR)來評定。(參見例如DeWolf等人Transplantation 100:1639-1649 (2017)。在一些實施例中，將工程化人類細胞與經標記之未經編輯(非工程化)之反應T細胞混合，且MLR分析量測藉由同種異體識別(亦即，經由工程化人類細胞表面上之錯配HLA分子)活化之反應T細胞的增殖。 D. 用於減少或消除MHC II類之方法及組合物及額外修飾
在一些實施例中，可在細胞中進行多重基因編輯。在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上之HLA-A蛋白之表現，包含基因修飾HLA-A基因，包含使細胞與包含本文所揭示之HLA-A引導RNA；及視情況存在之經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸之組合物接觸，該方法進一步包含與一或多種選自以下之組合物接觸：(a)將經RNA引導之DNA結合劑導引至CIITA基因的引導RNA；(b)引導RNA，其將經RNA引導之DNA結合劑導引至細胞之基因體中除HLA-A或CIITA以外之基因座；及(c)用於插入細胞之基因體中之供體核酸。 1.  MHC II類基因剔除
在一些實施例中，提供藉由如本文所揭示地基因修飾HLA-A來降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現的方法，其中該等方法及組合物進一步提供用於相對於未經修飾細胞降低或消除細胞表面上MHC II類蛋白之表現。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由使細胞與CIITA引導RNA接觸而降低或消除。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，提供用於降低工程化人類細胞上MHC II類之表面表現的方法。MHC II類表現受多種蛋白質影響。(參見例如Crivello等人Journal Immunology 202:1895-1903 (2019)。)舉例而言，CIITA蛋白充當轉錄活化子(活化MHC II類啟動子)且對MHC II類蛋白表現至關重要。在一些具體例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾選自以下之基因而降低或消除：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB、及NF-YC。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾CIITA基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾HLA-DR基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾HLA-DQ基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾HLA-DP基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾RFX5基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾RFXB/ANK基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾RFXAP基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾CREB基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾NK-YA基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾NK-YB基因而降低或消除。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由基因修飾NK-YC基因而降低或消除。
在一些實施例中，提供製造相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白表現之工程化人類細胞的方法，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中MHC II類蛋白之表面表現。在一些實施例中，方法包含使細胞與CIITA引導RNA接觸。
在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效係藉由量測細胞中CIITA蛋白之含量來測定。CIITA蛋白之含量可藉由例如細胞溶解物及使用抗CIITA抗體之西方墨點來偵測。在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效係藉由量測細胞核中CIITA蛋白之含量來測定。在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效係藉由量測細胞中CIITA mRNA之含量來測定。CIITA mRNA之含量可藉由例如RT-PCR來偵測。在一些實施例中，相比於未經修飾細胞，目標細胞中CIITA蛋白及/或CIITA mRNA含量降低指示有效的CIITA引導RNA。
在一些實施例中，CIITA引導RNA之功效係藉由量測目標細胞之MHC II類蛋白表現的降低或消除來測定。CIITA蛋白充當活化MHC II類啟動子之轉活化子且對MHC II類蛋白之表現至關重要。在一些實施例中，可在目標細胞之表面上偵測MHC II類蛋白表現。在一些實施例中，MHC II類蛋白表現係藉由流動式細胞測量術量測。在一些實施例中，針對MHC II類蛋白之抗體(例如抗HLA-DR、-DQ、-DP)可用於例如藉由流動式細胞測量術來偵測MHC II類蛋白表現。在一些實施例中，相比於未經修飾細胞(或未經修飾細胞群體)，細胞(或細胞群體)表面上MHC II類蛋白的降低或消除指示有效的CIITA引導RNA。在一些實施例中，已與根據流動式細胞測量術對MHC II類蛋白呈陰性之特定CIITA引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑接觸的細胞(或細胞群體)指示有效的CIITA引導RNA。
在一些實施例中，使用本文所揭示之方法及組合物使細胞群體中之MHC II類蛋白表現降低或消除。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體經富集(例如藉由FACS或MACS)且為至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94%MHC II類陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。在一些實施例中，相對於未經修飾細胞群體，細胞群體未經富集(例如藉由FACS或MACS)且為至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94%MHC II類陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。
在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少65% MHC II陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少70% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少80% MHC II陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少90% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少91% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少92% MHC II陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少93% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流動式細胞測量術相對於未經修飾細胞群體所量測，細胞群體為至少94% MHC II類陰性。
在一些實施例中，細胞群體引發活體外或活體內免疫細胞(例如CD4+ T細胞)降低之反應。CD4+ T細胞反應可藉由量測CD4+ T細胞之活化反應(例如CD4+ T細胞增殖)、活化標記之表現及/或細胞介素產生(IL-2、IL-12、IFN-γ)之分析(例如流動式細胞測量術、ELISA)來評估。CD4+ T細胞之反應可在活體外細胞培養分析中評估，其中經基因修飾之細胞與包含CD4+ T細胞之細胞共培養。舉例而言，工程化細胞可例如與PBMC、包含CD4+ T細胞之經純化CD3+ T細胞、經純化CD4+ T細胞或CD4+ T細胞株共培養。由工程化細胞引發之CD4+ T細胞反應可與由未經修飾細胞引發之反應進行比較。
在一些實施例中，提供一種工程化人類細胞，其中該細胞在細胞表面上具有降低或消除之HLA-A及MHC II類蛋白的表現，其中細胞包含HLA-A基因中之基因修飾，其中細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，且其中細胞包含CIITA基因中之修飾。在一些實施例中，工程化細胞自CD4+ T細胞引發降低的反應且自CD8+ T細胞引發降低的反應。 2.外源核酸基因嵌入
在一些實施例中，本發明提供藉由如本文所揭示地基因修飾HLA-A來降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現的方法及組合物，其中該等方法及組合物進一步提供用於表現由外源核酸編碼之蛋白質(例如抗體、嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)、細胞介素或細胞介素受體、趨化因子或趨化因子受體、酶、融合蛋白或其他類型之細胞表面結合或可溶性多肽)。在一些實施例中，外源核酸編碼表現於細胞表面上之蛋白質。舉例而言，在一些實施例中，外源核酸編碼表現於細胞表面上之靶向受體(本文進一步描述)。在一些實施例中，經基因修飾之細胞可充當用於表現由外源核酸編碼之分泌多肽的「細胞工廠」，包括例如作為用於活體內連續產生多肽的來源(如本文中進一步描述)。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，方法包含降低細胞表面上HLA-A蛋白之表現，包含基因修飾HLA-A基因，包含使細胞與包含本文所揭示之HLA-A引導RNA的組合物接觸，該方法進一步包含使細胞與外源核酸接觸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現，包含用一或多種包含以下各者之組合物對細胞進行基因修飾：本文所揭示之HLA-A引導RNA、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白及MHC II類蛋白之表現，包含用一或多種包含以下各者之組合物對細胞進行基因修飾：本文所揭示之HLA-A引導RNA、CIITA引導RNA、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
在一些實施例中，外源核酸編碼表現於細胞表面上之多肽。在一些實施例中，外源核酸編碼可溶性多肽。如本文所用，「可溶性」多肽係指由細胞分泌之多肽。在一些實施例中，可溶性多肽為治療性多肽。在一些實施例中，可溶性多肽為抗體。在一些實施例中，可溶性多肽為酶。在一些實施例中，可溶性多肽為細胞介素。在一些實施例中，可溶性多肽為趨化因子。在一些實施例中，可溶性多肽為融合蛋白。
在一些實施例中，外源核酸編碼抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼抗體片段(例如Fab、Fab2)。在一些實施例中，外源核酸編碼全長抗體。在一些實施例中，外源核酸編碼單鏈抗體(例如，scFv)。在一些實施例中，抗體為IgG、IgM、IgD、IgA或IgE。在一些實施例中，抗體為IgG抗體。在一些實施例中，抗體為IgG1抗體。在一些實施例中，抗體為IgG4抗體。在一些實施例中，重鏈恆定區含有已知降低效應功能之突變。在一些實施例中，重鏈恆定區含有已知增強效應功能之突變。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體為單域抗體(例如，僅VH域之抗體)。
在一些實施例中，外源核酸編碼中和抗體。中和抗體中和其目標抗原之活性。在一些實施例中，抗體為針對病毒抗原之中和抗體。在一些實施例中，抗體中和目標病毒抗原，阻斷病毒感染細胞之能力。在一些實施例中，基於細胞之中和分析可用於量測抗體之中和活性。特定細胞及讀數將視中和抗體之目標抗原而定。抗體之半數最大有效濃度(EC 50)可在基於細胞之中和分析中量測，其中較低EC 50指示更有效的中和抗體。
在一些實施例中，外源核酸編碼結合至與疾病或病症(參見例如第IV部分中所述之疾病及病症)相關之抗原的抗體。
在一些實施例中，外源核酸編碼在細胞表面上表現之多肽(亦即細胞表面結合蛋白)。在一些實施例中，外源核酸編碼靶向受體。「靶向受體」為存在於細胞(例如T細胞)表面上之受體，以允許細胞結合至目標位點，例如生物體中之特定細胞或組織。在一些實施例中，靶向受體為CAR。在一些實施例中，靶向受體為通用CAR (UniCAR)。在一些實施例中，靶向受體為增殖誘導性配位體(APRIL)。在一些實施例中，靶向受體為TCR。在一些實施例中，靶向受體為TRuC。在一些實施例中，靶向受體為B細胞受體(BCR) (例如，表現於B細胞上)。在一些實施例中，靶向受體為趨化因子受體。在一些實施例中，靶向受體為細胞介素受體。
在一些實施例中，靶向受體包括嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)及經由內部信號傳導域中之至少一個跨膜域可操作地連接的細胞表面分子受體，該內部信號傳導域能夠在細胞外受體部分結合時活化T細胞。在一些實施例中，CAR係指細胞外抗原識別域，例如scFv、VHH、奈米抗體；可操作地連接至細胞內信號傳導域，其在抗原結合時活化T細胞。CAR由四個區域構成：抗原識別域、細胞外鉸鏈區、跨膜域及細胞內T細胞信號傳導域。此類受體為此項技術中熟知的(參見例如WO2020092057、WO2019191114、WO2019147805、WO2018208837)。亦涵蓋用於識別各種抗原之通用CAR (UniCAR) (參見例如EP 2 990 416 A1)及促進免疫細胞經由轉接子分子與目標細胞結合之反向通用CAR (RevCAR) (參見例如WO2019238722)。CAR可靶向可產生抗體之任何抗原且通常針對呈現於待靶向之細胞或組織之表面上的分子。在一些實施例中，靶向受體包含抗原識別域(例如，癌症抗原識別域及TCR(例如TRuC)之次單元。(參見Baeuerle等人Nature Communications 2087 (2019)。)
在一些實施例中，外源核酸編碼TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼經基因修飾之TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼對由癌細胞表現之多肽具有特異性之經基因修飾之TCR。在一些實施例中，外源核酸編碼對威爾姆斯氏腫瘤基因(Wilms’tumor gene，WT1)抗原具有特異性之靶向受體。在一些實施例中，外源核酸編碼WT1特異性TCR (參見例如WO2020/081613A1)。
在一些實施例中，外源性核酸經插入至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸係藉由同源重組(HR)整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸係藉由鈍端插入整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸係藉由非同源末端接合整合至目標細胞之基因體中。在一些實施例中，外源核酸整合至細胞基因體中之安全港基因座中。在一些實施例中，外源核酸整合至TRAC基因座、B2M基因座、AAVS1基因座及/或CIITA基因座中之一者中。在一些實施例中，外源核酸在脂質核酸組裝組合物中提供至細胞。在一些實施例中，脂質核酸組裝組合物為脂質奈米粒子(LNP)。
在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞具有降低或消除的HLA-A表現且包含外源核酸。在一些實施例中，方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞具有降低或消除的HLA-A表現且分泌及/或表現由整合至細胞基因體中之外源核酸編碼的多肽。在一些實施例中，該等方法產生包含工程化細胞之組合物，該工程化細胞具有降低或消除的HLA-A蛋白表現，及/或細胞核中之降低或消除之HLA-A含量，且具有降低之MHC II類蛋白表現，及分泌及/或表現由整合至細胞基因體中之外源核酸編碼的多肽。在一些實施例中，工程化細胞自CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞引發降低的反應。
在一些實施例中，提供同種異體細胞，其中細胞在細胞表面上具有MHC II類及HLA-A蛋白之降低或消除的表現，其中細胞包含如本文所揭示之HLA-A基因中的修飾，其中該細胞包含CIITA基因中之修飾，且其中該細胞進一步包含編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸。
在一些實施例中，本發明提供藉由如本文所揭示地基因修飾HLA-A來降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現的方法，其中該等方法進一步提供降低一或多個額外目標基因(例如TRAC、TRBC)之表現。在一些實施例中，額外基因修飾提供將經基因修飾之細胞用於過繼細胞轉移應用的其他優勢。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
在一些實施例中，方法包含降低或消除細胞表面上HLA-A蛋白之表現，包含用一或多種包含以下之組合物基因修飾該細胞：如本文所揭示之HLA-A引導RNA、CIITA引導RNA、編碼多肽(例如靶向受體)之外源核酸、將經RNA引導之DNA結合劑導引至位於另一基因中之目標序列的引導RNA，藉此降低或消除另一基因，及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸之表現。在一些實施例中，額外目標基因為TRAC。在一些實施例中，額外目標基因為TRBC。 E. 例示性細胞類型
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組合物對人類細胞進行基因修飾。在一些實施例中，細胞為同種異體細胞。在一些實施例中，經基因修飾之細胞稱為工程化細胞。工程化細胞係指包含工程化基因修飾之細胞(或細胞後代)，例如已與基因編輯系統接觸且經基因編輯系統基因修飾。術語「工程化細胞」及「經基因修飾之細胞」通篇可互換使用。工程化人類細胞可為本文所揭示之例示性細胞類型中之任一者。此外，因為MHC I類分子表現於所有有核細胞上，所以工程化人類細胞可為任何有核細胞。
在一些實施例中，當細胞對HLA-B為同型接合時，HLA-B等位基因選自以下HLA-B等位基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02。
在一些實施例中，當細胞對HLA-C為同型接合時，HLA-C等位基因選自以下HLA-C等位基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合且對HLA-C為同型接合的，且HLA-B等位基因選自以下HLA-B等位基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02；且HLA-C等位基因係選自以下HLA-C等位基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。在一些實施例中，工程化人類細胞的HLA-B及HLA-C等位基因係選自以下HLA-B及HLA-C等位基因中之任一者：HLA-B*07:02及HLA-C*07:02；HLA-B*08:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:02及HLA-C*05:01；HLA-B*35:01及HLA-C*04:01；HLA-B*40:01及HLA-C*03:04；HLA-B*57:01及HLA-C*06:02；HLA-B*14:02及HLA-C*08:02；HLA-B*15:01及HLA-C*03:03；HLA-B*13:02及HLA-C*06:02；HLA-B*44:03及HLA-C*16:01；HLA-B*38:01及HLA-C*12:03；HLA-B*18:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:03及HLA-C*04:01；HLA-B*51:01及HLA-C*15:02；HLA-B*49:01及HLA-C*07:01；HLA-B*15:01及HLA-C*03:04；HLA-B*18:01及HLA-C*12:03；HLA-B*27:05及HLA-C*02:02；HLA-B*35:03及HLA-C*04:01；HLA-B*18:01及HLA-C*05:01；HLA-B*52:01及HLA-C*12:02；HLA-B*51:01及HLA-C*14:02；HLA-B*37:01及HLA-C*06:02；HLA-B*53:01及HLA-C*04:01；HLA-B*55:01及HLA-C*03:03；HLA-B*44:02及HLA-C*07:04；HLA-B*44:03及HLA-C*07:01；HLA-B*35:02及HLA-C*04:01；HLA-B*15:01及HLA-C*04:01；及HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*07:02及HLA-C*07:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*08:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:02及HLA-C*05:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*35:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*40:01及HLA-C*03:04。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*57:01及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*14:02及HLA-C*08:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*15:01及HLA-C*03:03。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*13:02及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:03及HLA-C*16:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*38:01及HLA-C*12:03。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*18:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:03及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*51:01及HLA-C*15:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*49:01及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*15:01及HLA-C*03:04。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*18:01及HLA-C*12:03。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*27:05及HLA-C*02:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*35:03及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*18:01及HLA-C*05:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*52:01及HLA-C*12:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*51:01及HLA-C*14:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*37:01及HLA-C*06:02。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*53:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*55:01及HLA-C*03:03。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:02及HLA-C*07:04。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44:03及HLA-C*07:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*35:02及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*15:01及HLA-C*04:01。在一些實施例中，HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。
在一些實施例中，細胞為免疫細胞。如本文所用，「免疫細胞」係指免疫系統之細胞，包括例如淋巴球(例如T細胞、B細胞、自然殺手細胞(「NK細胞」及NKT細胞或iNKT細胞))、單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞或粒細胞(例如嗜中性球、嗜酸性球及嗜鹼性球)。在一些實施例中，細胞為初生免疫細胞。在一些實施例中，免疫系統細胞可選自CD3+、CD4+及CD8+ T細胞、調節T細胞(Treg)、B細胞、NK細胞及樹突狀細胞(DC)。在一些實施例中，免疫細胞為同種異體的。
在一些實施例中，該細胞為淋巴球。在一些實施例中，該細胞為適應性免疫細胞。在一些實施例中，該細胞為T細胞。在一些實施例中，細胞為B細胞。在一些實施例中，該細胞為NK細胞。在一些實施例中，細胞為巨噬細胞。在一些實施例中，淋巴球為同種異體的。
如本文所用，T細胞可定義為表現T細胞受體(「TCR」或「αβ TCR」或「γδ TCR」)之細胞，然而，在一些實施例中，T細胞之TCR可經基因修飾以降低其表現(例如藉由對TRAC或TRBC基因之基因修飾)，因此蛋白質CD3之表現可用作藉由標準流動式細胞測量術方法鑑別T細胞之標記。CD3為與TCR相關之多重次單元信號傳導複合物。因此，T細胞可稱為CD3+。在一些實施例中，T細胞為表現CD3+標記及CD4+或CD8+標記之細胞。在一些實施例中，T細胞為同種異體的。
在一些實施例中，T細胞表現醣蛋白CD8且因此根據標準流動式細胞測量術方法為CD8+，且可稱為「細胞毒性」T細胞。在一些實施例中，T細胞表現醣蛋白CD4且因此根據標準流動式細胞測量術方法為CD4+，且可稱為「輔助」T細胞。CD4+ T細胞可分化成亞群且可稱為Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、T調節(「Treg」)細胞或T濾泡性輔助細胞(「Tfh」)。各CD4+亞群釋放可具有促炎或消炎功能、存活或保護功能之特定細胞介素。T細胞可藉由CD4+或CD8+選擇方法，從個體中分離。
在一些實施例中，該T細胞為記憶T細胞。在體內，記憶T細胞遇到抗原。記憶T細胞可位於次級淋巴器官(中樞記憶T細胞)或最近感染之組織(效應記憶T細胞)中。記憶T細胞可為CD8+ T細胞。記憶T細胞可為CD4+ T細胞。
如本文所用，「中樞記憶T細胞」可定義為經歷抗原之T細胞，且例如可表現CD62L及CD45RO。中樞記憶T細胞可藉由亦表現CCR7之中樞記憶T細胞偵測為CD62L+及CD45RO+，因此可藉由標準流動式細胞測量術方法偵測為CCR7+。
如本文所用，「早期幹細胞記憶T細胞」 (或「Tscm」)可定義為表現CD27及CD45RA之T細胞，且因此藉由標準流動式細胞測量術方法為CD27+及CD45RA+。Tscm不表現CD45同功異型物CD45RO，因此若此同功異型物藉由標準流動式細胞測量術方法進行染色，則Tscm將進一步為CD45RO-。因此，CD45RO- CD27+細胞亦為早期幹細胞記憶T細胞。Tscm細胞進一步表現CD62L及CCR7，因此可藉由標準流動式細胞測量術方法偵測為CD62L+及CCR7+。已展示早期幹細胞記憶T細胞與細胞療法產品之持久性及治療功效增加相關。
在一些實施例中，細胞為B細胞。如本文所用，「B細胞」可定義為表現CD19及/或CD20，及/或B細胞成熟抗原(「BCMA」)之細胞，且因此B細胞藉由標準流動式細胞測量術方法為CD19+，及/或CD20+，及/或BCMA+。藉由標準流動式細胞測量術方法，B細胞對於CD3及CD56進一步為陰性的。B細胞可為漿細胞。B細胞可為記憶B細胞。B細胞可為未處理B細胞。B細胞可為IgM+，或具有類別轉換之B細胞受體(例如IgG+或IgA+)。在一些實施例中，B細胞為同種異體的。
在一些實施例中，細胞為單核細胞，諸如來自骨髓或周邊血液。在一些實施例中，細胞為周邊血液單核細胞(「PBMC」)。在一些實施例中，細胞為PBMC，例如淋巴球或單核球。在一些實施例中，細胞為周邊血液淋巴球 (「PBL」)。在一些實施例中，單核細胞為同種異體的。
包括ACT及/或組織再生療法中所用之細胞，諸如幹細胞、先驅細胞及初生細胞。舉例而言，幹細胞包括富潛能幹細胞(PSC)；誘導性富潛能幹細胞(iPSC)；胚胎幹細胞(ESC)；間葉幹細胞(MSC，例如自骨髓(BM)、周邊血液(PB)、胎盤、臍帶(UC)或脂肪分離)；造血幹細胞(HSC；例如與BM或UC分離)；神經幹細胞(NSC)；組織特異性先驅幹細胞(TSPSC)；及角膜緣幹細胞(LSC)。先驅細胞及初生細胞包括單核細胞(MNC，例如自BM或PB分離)；內皮先驅細胞(EPC，例如自BM、PB及UC分離)；神經先驅細胞(NPC)；及組織特異性初生細胞或自其衍生之細胞(TSC)，包括軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。亦包括用於器官或組織移植之細胞，諸如胰島細胞、心肌細胞、甲狀腺細胞、胸腺細胞、神經元細胞、皮膚細胞及視網膜細胞。
在一些實施例中，人類細胞自人類個體分離。在一些實施例中，細胞自人類供體PBMC或白血球採集物(leukopak)分離。在一些實施例中，細胞來自患有病狀、病症或疾病之個體。在一些實施例中，細胞來自具有埃-巴二氏病毒(「EBV」)之人類供體。
在一些實施例中，離體進行該等方法。如本文所用，「離體」係指活體外方法，其中細胞能夠轉移至個體中，例如作為ACT療法。在一些實施例中，離體方法為涉及ACT療法細胞或細胞群體之活體外方法。
在一些實施例中，細胞來自細胞株。在一些實施例中，細胞株衍生自人類個體。在一些實施例中，細胞株為類淋巴母細胞細胞株(「LCL」)。細胞可經冷凍保存及解凍。細胞可能先前尚未經冷凍保存。
在一些實施例中，細胞來自細胞庫。在一些實施例中，細胞經基因修飾且隨後轉移至細胞庫中。在一些實施例中，細胞自個體移出，離體進行基因修飾，且轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將經基因修飾之細胞群體轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將經基因修飾之免疫細胞群體轉移至細胞庫中。在一些實施例中，經基因修飾之免疫細胞群體包含第一及第二亞群，其中第一及第二亞群具有至少一個共同基因修飾且至少一個不同基因修飾被轉移至細胞庫中。 F. 例示性基因編輯系統
各種適合之基因編輯系統可用於製造本文所揭示之工程化細胞，包括但不限於CRISPR/Cas系統；鋅指核酸酶(ZFN)系統；及類轉錄活化蛋白效應因子核酸酶(TALEN)系統。一般而言，基因編輯系統涉及使用工程化裂解系統以誘導目標DNA序列中之雙股斷裂(DSB)或切口(例如單股斷裂或SSB)。裂解或切口可經由使用諸如工程化ZFN、TALEN之特異性核酸酶，或使用具有工程化引導RNA之CRISPR/Cas系統以引導目標DNA序列之特異性裂解或切口而發生。此外，基於阿爾古系統(Argonaute system)(例如來自嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)，稱為『TtAgo』，參見Swarts等人(2014) Nature 507(7491): 258-261)開發靶向核酸酶，該系統亦可具有用於基因編輯及基因療法中之潛力。
在一些實施例中，基因編輯系統為TALEN系統。類轉錄活化蛋白效應因子核酸酶(TALEN)為可經工程化以切割DNA之特定序列的限制酶。其藉由使TAL效應子DNA結合域與DNA裂解域(切割DNA股之核酸酶)融合而製得。類轉錄活化蛋白效應因子(TALE)可經工程化以結合至所需DNA序列，以促進特定位置之DNA裂解(參見例如Boch, 2011, Nature Biotech)。限制酶可引入至細胞中，用於基因編輯或用於原位基因編輯，一種稱為經工程化核酸酶進行基因編輯的技術。其中使用之此類方法及組合物為此項技術中已知的。參見例如WO2019147805、WO2014040370、WO2018073393，其內容特此全文併入。
在一些實施例中，基因編輯系統為鋅指系統。鋅指核酸酶(ZFN)為藉由將鋅指DNA結合域融合至DNA裂解域產生之人工限制酶。鋅指域可經工程化以靶向特定的所需DNA序列，從而使得鋅指核酸酶能夠靶向複雜基因體內的獨特序列。來自II型限制性核酸內切酶FokI之非特異性裂解域通常用作ZFN中之裂解域。裂解係藉由內源性DNA修復機制修復，允許ZFN精確改變高等生物之基因體。其中使用之此類方法及組合物為此項技術中已知的。參見例如WO2011091324，其內容特此全文併入。
在一些實施例中，基因編輯系統為CRISPR/Cas系統，包括例如包含引導序列及經RNA引導之DNA結合劑之CRISPR引導RNA，且在本文中進一步描述。 G.  CRISPR引導RNA
本文提供適用於修飾目標序列之引導序列，例如使用包含所揭示之引導序列的引導RNA與經RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)。
本文所揭示之引導序列中之每一者可進一步包含額外核苷酸以形成crRNA，例如在其3'端之引導序列後具有以下例示性核苷酸序列：呈5'至3'定向之GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO: 213)。在sgRNA之情況下，以上引導序列可進一步包含額外核苷酸(支架序列)以形成sgRNA，例如在引導序列之3'端之後具有以下例示性核苷酸序列：呈5'至3'定向之GUUUUAGAGCUAG AAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO: 214)或GUUUUAGAG CUAGAAAUAGCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 215，其為不具有四個末端U之SEQ ID NO: 214)。在一些實施例中，SEQ ID NO: 214之四個末端U不存在。在一些實施例中，僅存在SEQ ID NO: 214之四個末端U中之1、2或3者。
在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO: 1-211之引導序列中之任一者及額外核苷酸以形成crRNA，例如在其3'端之引導序列後具有以下例示性支架核苷酸序列：呈5'至3'定向之GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO: 216)。SEQ ID NO: 216參考野生型引導RNA：GUUUUAG AGCUAGAAAUAGCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 215)保守序列缺少8個核苷酸。其他例示性支架核苷酸序列提供於表6中。在一些實施例中，sgRNA包含表6中呈5'至3'定向之SEQ ID No: 1-211之引導序列及額外引導支架序列中之任一者，其包括如所示之支架序列之經修飾型式。
在一些實施例中，引導RNA為sgRNA，其包含 表 2(SEQ ID NO: 249-343及344-438)、 表 3(SEQ ID NO: 439-471及472-504)及 表 5(SEQ ID NO: 505-532及533-560)中所示之序列中之任一者。在一些實施例中，引導RNA為經化學修飾之引導RNA。在一些實施例中，引導RNA為經化學修飾之單引導RNA。經化學修飾之引導RNA可包含如 表 2 、 3 、 5 及 6中所示之修飾中之一或多者。經化學修飾之引導RNA可包含SEQ ID NO: 1003、1007-1009及1011-1014中之任一者之經修飾之核苷酸中的一或多者。
在一些實施例中，引導RNA為sgRNA，其包含具有至少一個本文所揭示之化學修飾的SEQ ID NO: 249-343、439-471及505-532中之任一者。在一些實施例中，引導RNA為sgRNA，其包含與具有至少一個本文所揭示之化學修飾的SEQ ID NO: 249-343、439-471及505-532中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的序列。
在一些實施例中，引導RNA為包含SEQ ID NO: 1013或1014中所示之修飾模式的sgRNA。在一些實施例中，引導RNA為sgRNA，其包含與SEQ ID NO: 344-438、472-504及533-560中之任一核酸至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的序列。
在一些實施例中，引導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1003中所示之修飾模式。在一些實施例中，引導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1003之經修飾之核苷酸，包括引導序列，該引導序列包含選自SEQ ID NO: 1-211之序列。在一些實施例中，引導RNA為sgRNA，其包含SEQ ID NO: 1016之序列或與SEQ ID NO:1016至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的序列。
在一些實施例中，引導RNA包含單引導RNA，其包含SEQ ID NO: 344-438、472-504及533-560及1016之序列中之任一者或與SEQ ID NO: 344-438、472-504及533-560及1016之序列中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的序列。
在一些實施例中，引導RNA包含引導序列，其包含SEQ ID NO: 13-18、26、37-39、41、43、45及62中之任一者。在一些實施例中，引導RNA包含單引導RNA，其包含SEQ ID NO: 356-361、369、380-382、384、386、388及405之序列中之任一者或與SEQ ID NO: 356-361、369、380-382、384、386、388及405之序列中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的序列。
引導RNA可進一步包含trRNA。在本文所描述之各組合物及方法實施例中，crRNA及trRNA可締合為單一RNA (sgRNA)或可處於單獨RNA (dgRNA)上。在sgRNA之情形下，crRNA與trRNA組分可例如經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵共價鍵聯。在一些實施例中，crRNA及/或trRNA序列可稱為引導RNA之「支架」或「保存部分」。
在本文所述之組合物、用途及方法實施例中之各者中，引導RNA可包含呈「雙引導RNA」或「dgRNA」形式之兩個RNA分子。dgRNA包含有包含crRNA之第一RNA分子，該crRNA包含例如 表 2 至 5中所示之引導序列；及包含trRNA之第二RNA分子。第一RNA分子及第二RNA分子可不共價鍵聯，但可經由crRNA與trRNA之部分之間的鹼基配對形成RNA雙螺旋體。
在本文中所描述之組合物、用途及方法實施例中之每一者中，引導RNA可包含呈「單引導RNA」或「sgRNA」形式之單個RNA分子。sgRNA可包含與trRNA共價鍵聯之crRNA (或其部分)，其包含 表 2 至 5中所示之引導序列。sgRNA可包含 表 2 至 5中所示之引導序列之17、18、19或20個連續核苷酸。在一些實施例中，crRNA及trRNA經由連接子共價鍵聯。在一些實施例中，sgRNA經由crRNA與trRNA之部分之間的鹼基配對形成莖-環結構。在一些實施例中，crRNA及trRNA經由一或多個不為磷酸二酯鍵之鍵共價鍵聯。
在一些實施例中，trRNA可包含來源於天然產生之CRISPR/Cas系統的trRNA序列之全部或一部分。在一些實施例中，trRNA包含經截短或經修飾之野生型trRNA。trRNA之長度視所用CRISPR/Cas系統而定。在一些實施例中，trRNA包含以下或由以下組成：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或超過100個核苷酸。在一些實施例中，trRNA可包含某些二級結構，諸如一或多種髮夾結構或莖-環結構或一或多種隆突結構。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含一或多個包含 表 2 至 5中之任一引導序列的引導RNA。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含一或多個包含 表 2 至 5中之任一引導序列的引導RNA，其中SEQ ID NO: 213-216之核苷酸在其3'端跟隨引導序列。在一些實施例中，根據SEQ ID NO: 1003、1007-1009及1011-1014中之任一者的修飾模式來修飾一或多個包含 表 2 至 5中之任一引導序列的引導RNA，其中SEQ ID NO: 213-216之核苷酸在其3'端跟隨引導序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含一或多個包含 表 2 至 5中之任一引導序列的引導RNA。在一個態樣中，提供包含一或多個gRNA之組合物，其包含與SEQ ID NO: 1-211中之任一核酸至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之引導序列。
在其他實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個，例如至少兩個包含引導序列之gRNA，該等引導序列選自 表 2 至 5中所示之引導序列中之任何兩者或更多者。在一些實施例中，組合物包含至少兩個gRNA，其各自包含與 表 2 至 5中所示之任一引導序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的引導序列。
在一些實施例中，本發明之引導RNA組合物經設計以識別(例如雜交至) HLA-A中之目標序列。舉例而言，HLA-A目標序列可藉由包含引導RNA之所提供Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，諸如Cas裂解酶之經RNA引導之DNA結合劑可藉由引導RNA導引至HLA-A中之目標序列，其中引導RNA之引導序列與目標序列雜交，且諸如Cas裂解酶之經RNA引導之DNA結合劑裂解目標序列。
在一些實施例中，一或多個引導RNA之選擇係基於HLA-A內之目標序列而確定。在一些實施例中，包含一或多個引導序列之組合物包含根據來自人類參考基因體hg38之座標與 表 2 至 5中所示之對應基因體區域互補的引導序列。其他實施例之引導序列可與HLA-A內任何 表 2 至 5中所列之基因體座標緊鄰的序列互補。舉例而言，其他實施例之引導序列可與包含 表 2 至 5中所列之基因體座標之10個連續核苷酸±10個核苷酸的序列互補。
不受任何特定理論束縛，目標基因之某些區域中之修飾(例如由於核酸酶介導之DSB而發生之插入/缺失所產生之框移突變)可能比其他區域中之突變更難以耐受，因此DSB之位置為可引起蛋白質量或類型減弱的重要因素。在一些實施例中，與目標基因內之目標序列互補或具有互補性之gRNA用於將經RNA引導之DNA結合劑導引至目標基因中之特定位置。
在一些實施例中，引導序列與存在於目標基因中之目標序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%或80%一致。在一些實施例中，引導序列與存在於人類 HLA-A基因中之目標序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%或80%一致。
在一些實施例中，目標序列可與引導RNA之引導序列互補。在一些實施例中，引導RNA之引導序列與其對應目標序列之間的互補性或一致性程度可為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，gRNA之目標序列及引導序列可為100%互補或一致。在其他實施例中，gRNA之目標序列及引導序列可含有至少一個錯配。舉例而言，gRNA之目標序列及引導序列可含有1、2、3或4個錯配，其中引導序列之總長度為20。在一些實施例中，gRNA之目標序列及引導序列可含有1-4個錯配，其中引導序列為20個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物或調配物包含mRNA，其包含編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如如本文所述之Cas核酸酶之開讀框(ORF)。在一些實施例中，提供、使用或投與mRNA，其包含編碼諸如Cas核酸酶之經RNA引導之DNA結合劑之ORF。 H. 經修飾之gRNA及mRNA
在一些實施例中，gRNA (例如，sgRNA、短sgRNA、dgRNA或crRNA)經修飾。在本文所述之gRNA的上下文中，術語「經修飾」或「修飾」包括上文所述之修飾，包括例如(a)末端修飾，例如5'端修飾或3'端修飾，包括5'或3'保護端修飾；(b)核鹼基(或「鹼基」)修飾，包括鹼基置換或移除；(c)糖修飾，包括2'、3'及/或4'位置處之修飾；(d)核苷間鍵聯修飾；及(e)主鏈修飾，其可包括磷酸二酯鍵聯及/或核糖之修飾或置換。核苷酸在指定位置之修飾包括緊接著核苷酸之糖之3'之磷酸二酯鍵聯的修飾或置換。因此，舉例而言，包含5'端之第一糖與第二糖之間之硫代磷酸酯的核酸視為包含位置1處的修飾。術語「經修飾之gRNA」通常指一種gRNA，其對鹼基、糖及磷酸二酯鍵聯或主鏈部分(包括核苷酸磷酸酯)中之一或多者之化學結構具有修飾，全部如本文中所詳述及例示。
其他描述及例示性修飾模式提供於2019年12月12日公開之WO2019/237069的表1中，其全部內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，gRNA包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多個YA位點處之修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶包含修飾(包括改變緊接嘧啶之糖之3'之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤包含修飾(包括改變緊接腺嘌呤之糖之3'之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包含修飾，諸如糖、鹼基或核苷間鍵聯修飾。YA修飾可為本文所闡述之任何類型的修飾。在一些實施例中，YA修飾包含硫代磷酸酯、2'-OMe或2'-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾包含嘧啶修飾，包含硫代磷酸酯、2'-OMe、2'-H、肌苷或2'-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾在含有一或多個YA位點的RNA雙螺旋區內包含雙環核糖類似物(例如LNA、BNA或ENA)。在一些實施例中，YA修飾在含有YA位點的RNA雙螺旋區內包含雙環核糖類似物(例如LNA、BNA或ENA)，其中YA修飾位於YA位點遠端。
在一些實施例中，gRNA之引導序列(或引導區)包含1、2、3、4、5或更多個可包含YA修飾之YA位點(「引導區YA位點」)。在一些實施例中，位於相對於5'末端之5'端之5端、6端、7端、8端、9端或10端的一或多個YA位點(其中「5端」等係指相對於引導區之3'端的位置5，亦即，引導區中最靠近3'的核苷酸)包含YA修飾。經修飾之引導區YA位點包含YA修飾。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸之20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內。舉例而言，若經修飾之引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸之10個核苷酸內且引導區具有20個核苷酸長度，則經修飾之引導區YA位點的經修飾核苷酸位於位置11至20中之任一位置。在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點位於相對於5'末端之5'端的核苷酸4、5、6、7、8、9、10或11處或其之後。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點不同於5'端修飾。舉例而言，sgRNA可包含如本文所描述之5'端修飾且進一步包含經修飾之引導區YA位點。替代地，sgRNA可包含未經修飾之5'端及經修飾之引導區YA位點。替代地，短sgRNA可包含經修飾之5'端及未經修飾之引導區YA位點。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸不包含的修飾。舉例而言，若核苷酸1至3包含硫代磷酸酯，核苷酸4僅包含2'-OMe修飾，且核苷酸5為YA位點之嘧啶且包含硫代磷酸酯，則經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸(核苷酸4)不包含的修飾(硫代磷酸酯)。在另一實例中，若核苷酸1至3包含硫代磷酸酯，且核苷酸4為YA位點之嘧啶且包含2'-OMe，則經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸(核苷酸1至3中之任一者)不包含的修飾(2'-OMe)。若未修飾之核苷酸位於經修飾之引導區YA位點5'，則亦始終滿足此條件。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點包含如上文針對YA位點所述的修飾。gRNA之引導區可根據任何實施例修飾，其包含本文所闡述之經修飾引導區。在可行的情況下，本發明在別處闡述的任何實施例可以與任一前述實施例組合。
在一些實施例中，gRNA之5'及/或3'末端區經修飾。
在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中，此修飾可稱為「3'端修飾」。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含以下中之任何一或多者：選自經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、經2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、倒轉無鹼基經修飾之核苷酸或其組合的經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含gRNA之3'端之1、2、3、4、5、6或7個核苷酸的修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含一個PS鍵聯，其中該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後三個核苷酸之間的兩個PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後四個核苷酸之間的四個PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後2、3、4、5、6或7個核苷酸中之任一者或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中，包含3'端修飾的gRNA包含或進一步包含3'尾，其中該3'尾包含存在於3'尾之任一個或多個核苷酸的修飾。在一些實施例中，3'尾經完全修飾。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10個核苷酸，視情況其中此等核苷酸中之任一者或多者經修飾。在一些實施例中，提供包含3'保護端修飾之gRNA。在一些實施例中，3'尾包含1至約20個核苷酸、1至約15個核苷酸、1至約10個核苷酸、1至約5個核苷酸、1至約4個核苷酸、1至約3個核苷酸，及1至約2個核苷酸。在一些實施例中，gRNA不包含3'尾。
在一些實施例中，5'末端區經修飾，例如gRNA中前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中，此修飾可以稱為「5'端修飾」。在一些實施例中，5'末端區中之最前面1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，5'端之末端(亦即，前)1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中的至少一者經修飾。在一些實施例中，gRNA之5'與3'末端區(例如端部)兩者均經修飾。在一些實施例中，僅gRNA之5'末端區經修飾。在一些實施例中，gRNA保守部分中僅3'末端區(加或減3'尾)經修飾。在一些實施例中，gRNA包含在gRNA之5'末端區之最前面7個核苷酸之1、2、3、4、5、6或7者處的修飾。在一些實施例中，gRNA包含在3'末端區之7個末端核苷酸中之1、2、3、4、5、6或7者處的修飾。在一些實施例中，5'末端區之最前面4個核苷酸中之2、3或4者，及/或3'末端區之末端4個核苷酸中之2、3或4者經修飾。在一些實施例中，5'末端區之最前面4個核苷酸中的2、3或4者經由硫代磷酸酯(PS)鍵鍵聯。在一些實施例中，對5'末端及/或3'末端之修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)或2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾。在一些實施例中，修飾包含對核苷酸之2'-氟(2'-F)修飾。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，修飾包含倒轉無鹼基核苷酸。在一些實施例中，修飾包含保護端修飾。在一些實施例中，修飾包含超過一個修飾，其選自保護端修飾、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-氟(2'-F)、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯，及倒轉無鹼基核苷酸。在一些實施例中，考慮等效修飾。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾及3'端修飾之gRNA。在一些實施例中，gRNA包含不在5'或3'端之經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含上莖修飾之sgRNA，其中上莖修飾包含對上莖區中之US1至US12中之任何一或多者的修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾之sgRNA，其中上莖修飾包含對上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾之sgRNA，其中上莖修飾包含YA位點中之1、2、3、4或5個YA修飾。在一些實施例中，上莖修飾包含經2'-OMe修飾之核苷酸、經2'-O-moe修飾之核苷酸、經2'-F修飾之核苷酸及/或其組合。本文所述之其他修飾，諸如5'端修飾及/或3'端修飾可與上莖修飾組合。
在一些實施例中，sgRNA包含髮夾區中之修飾。在一些實施例中，髮夾區修飾包含至少一個經修飾之核苷酸，其選自經2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸及/或其組合。在一些實施例中，髮夾區修飾處於髮夾1區中。在一些實施例中，髮夾區修飾處於髮夾2區中。在一些實施例中，髮夾修飾包含YA位點中之1、2或3個YA修飾。在一些實施例中，髮夾修飾包含至少1、2、3、4、5或6個YA修飾。本文所述之其他修飾，諸如上莖修飾、5'端修飾及/或3'端修飾可與髮夾區中之修飾組合。
在一些實施例中，gRNA包含經取代且視情況經縮短之髮夾1區，其中以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短之髮夾1中經沃森-克里克配對(Watson-Crick pairing)核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10及/或H1-4及H1-9。「沃森-克里克配對核苷酸」包括能夠形成沃森-克里克鹼基對的任何對，包括A-T、A-U、T-A、U-A、C-G及G-C對，及包括具有相同鹼基配對偏好之任一前述核苷酸的經修飾型式的對。在一些實施例中，髮夾1區缺乏H1-5至H1-8中之任一者或兩者。在一些實施例中，髮夾1區缺乏以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10及/或H1-4及H1-9。在一些實施例中，髮夾1區缺乏髮夾1區之1至8個核苷酸。在任一前述實施例中，缺乏核苷酸可使得經沃森-克里克配對核苷酸(H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9)取代之一或多個核苷酸對在gRNA中形成鹼基對。
在一些實施例中，gRNA進一步包含缺乏至少1個核苷酸之上莖區，例如美國申請案第62/946,905號之表7中指示的經縮短之上莖區中之任一者，該案之內容以全文引用之方式併入本文中或描述於本文中之其他地方，該等上莖區可與本文所述之經縮短或經取代之髮夾1區中之任一者組合。
在一些實施例中，本文所提供的sgRNA為短單引導RNA (短sgRNA)，例如包含含有髮夾區之sgRNA的保守部分，其中髮夾區缺乏至少5至10個核苷酸或6至10個核苷酸。在一些實施例中，5至10個核苷酸或6至10個核苷酸為鄰接的。
在一些實施例中，短sgRNA缺乏spyCas9 sgRNA之保守部分的至少核苷酸54至58 (AAAAA)。在一些實施例中，短sgRNA為缺乏與spyCas9保守部分之核苷酸54至58 (AAAAA)對應之核苷酸的非spyCas9 sgRNA，如藉由例如成對或結構比對所測定。
在一些實施例中，本文所描述之短sgRNA包含包含髮夾區之保守部分，其中髮夾區缺乏5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，缺乏核苷酸為5至10個缺乏核苷酸或6至10個缺乏核苷酸。在一些實施例中，缺乏核苷酸為鄰接的。在一些實施例中，缺乏核苷酸跨越至少髮夾1之一部分及髮夾2之一部分。在一些實施例中，5至10個缺乏核苷酸包含SEQ ID NO: 215之核苷酸54-58、54-61或53-60或由其組成。
在一些實施例中，本文中所描述之短sgRNA進一步包含聯結區，其中聯結區缺乏至少一個核苷酸(例如，聯結區中之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)。在一些實施例中，短sgRNA缺乏聯結區中之各核苷酸。
在一些實施例中，本文所描述之SpyCas9短sgRNA包含NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU (SEQ ID NO: 1002)之序列。
在一些實施例中，本文所描述之短sgRNA包含如SEQ ID NO: 1003：mN*mN*mN* NNNNNNNNN NNNNNNNNGUU UUAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU(SEQ ID NO:1003)中所示之修飾模式，其中除非另外規定，否則A、C、G 、U及N分別為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶及任何核糖核苷酸。m指示2'O-甲基修飾，且*指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
在某些實施例中，使用SEQ ID NO: 215 (「例示性SpyCas9 sgRNA-1」)作為實例，例示性SpyCas9 sgRNA-1進一步包括以下中之一或多者： A.     經縮短髮夾1區或經取代且視情況經縮短髮夾1區，其中 1.     以下核苷酸對中之至少一者在髮夾1中經沃森-克里克配對核苷酸取代: H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10，及/或H1-4及H1-9，且髮夾1區視情況缺乏 a.       H1-5至H1-8中之任一者或兩者， b.     以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10，及H1-4及H1-9，或 c.      髮夾1區之1至8個核苷酸；或 2.     經縮短之髮夾1區缺乏6至8個核苷酸，較佳6個核苷酸；及 a.      位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者缺失或相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO: 215)經取代，或 b.     位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO: 215)經取代；或 3. 該經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸，較佳地5至6個核苷酸，且位置N18、H1-12或n中之一或多者相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO: 215)經取代；或 B.     經縮短上莖區，其中該經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸且其中該經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO: 215)包括小於或等於4個取代；或 C.     在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一處或多處相對於例示性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO: 215)的取代，其中取代基核苷酸既不為隨後為腺嘌呤之嘧啶，亦不為在嘧啶之前的腺嘌呤；或 D.     具有上莖區之例示性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO: 215)，其中上莖修飾包含對上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾，其中 1.     經修飾之核苷酸視情況選自經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、經2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、倒轉無鹼基修飾之核苷酸，或其組合；或 2.     該經修飾之核苷酸視情況包括經2'-OMe修飾之核苷酸。
在某些實施例中，例示性SpyCas9 sgRNA-1或sgRNA(諸如包含例示性SpyCas9 sgRNA-1之sgRNA)進一步包括3'尾，例如1、2、3、4或更多個核苷酸之3'尾。在某些實施例中，尾部包括一或多個經修飾之核苷酸。在某些實施例中，經修飾之核苷酸係選自經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、經2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、倒轉無鹼基修飾之核苷酸，或其組合。在某些實施例中，該經修飾之核苷酸包括經2'-OMe修飾之核苷酸。在某些實施例中，經修飾之核苷酸包括核苷酸之間的PS鍵聯。在某些實施例中，經修飾之核苷酸包括經2'-OMe修飾之核苷酸及核苷酸之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，本文所述之gRNA進一步包含聯結區，其中該聯結區缺乏至少一個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA經化學修飾。包含一或多個經修飾之核苷或核苷酸之gRNA稱為「經修飾之」gRNA或「經化學修飾之」gRNA，用於描述代替或外加典型A、G、C及U殘基使用之一或多種非天然及/或天然存在之組分或組態的存在。經修飾之核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i)磷酸二酯主鏈鍵聯中之未鍵聯磷酸氧中之一者或兩者及/或鍵聯磷酸氧中之一或多者之更改，例如置換(例示性主鏈修飾)；(ii)例如核糖上之2'羥基之核糖組分之更改，例如置換(例示性糖修飾)；(iii)用「去磷」連接子批量置換磷酸部分(例示性主鏈修飾)；(iv)天然存在之核鹼基之修飾或置換，包括利用非典型核鹼基(例示性鹼基修飾)；(v)核糖-磷酸主鏈之置換或修飾(例示性主鏈修飾)；(vi)寡核苷酸之3'端或5'端之修飾，例如末端磷酸酯基之移除、修飾或置換，或部分、帽或連接子之結合(此類3'或5'帽修飾可包含糖及/或主鏈修飾)；及(vii)糖之修飾或置換(例示性糖修飾)。
化學修飾(諸如以上列出之彼等)可經組合以得到經修飾之gRNA，其包含可具有兩個、三個、四個或更多個修飾之核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)。舉例而言，經修飾之殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基。在一些實施例中，gRNA之每一鹼基經修飾，例如所有鹼基均具有諸如硫代磷酸酯基團之經修飾之磷酸酯基。在某些實施例中，gRNA分子之所有或實質上所有磷酸酯基經硫代磷酸酯基置換。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之5'端或其附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之3'端或附近包含至少一個經修飾之殘基。
在一些實施例中，gRNA包含一、二、三個或更多個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA中至少5% (例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)之位置為經修飾之核苷或核苷酸。
在主鏈修飾之一些實施例中，經修飾之殘基之磷酸酯基可藉由用不同取代基置換一或多個氧而經修飾。此外，經修飾之殘基，例如存在於經修飾之核酸中之經修飾之殘基可包括用如本文所描述之經修飾之磷酸酯基批量置換未經修飾之磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之主鏈修飾可包括產生不帶電連接子或具有不對稱電荷分佈之帶電連接子的變化。
經修飾之磷酸酯基的實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(borano phosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。
亦可構築可模擬核酸之支架，其中磷酸酯連接子及核糖經核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置換。此類修飾可包含主鏈修飾及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可藉由替代主鏈繫栓。實例可包括(但不限於) N-𠰌啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷替代物。
經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括針對糖基之一或多個修飾，亦即在糖修飾處如此。舉例而言，2'羥基(OH)可經修飾，例如經多個不同「氧基」或「去氧」取代基置換。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，因為羥基可不再被去質子化以形成2'-烷氧離子。2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH 2CH 2O) nCH 2CH 2OR，其中R可為例如H或視情況經取代之烷基，且n可為0至20之整數。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，該修飾用氟置換2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「鎖」核酸(LNA)，其中2'羥基可例如藉由C 1-6伸烷基或C 1-6伸雜烷基橋連接至同一核糖之4'碳，其中例示性橋可包括亞甲基、伸丙基、乙醚或胺基橋。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「解鎖」核酸(UNA)，其中核糖環缺乏C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(MOE)(OCH 2CH 2OCH 3，例如PEG衍生物)。
「去氧」2'修飾可包括氫(亦即，去氧核糖，例如在部分dsRNA之突出部分處)；鹵基(例如溴基、氯基、氟基或碘基)；胺基(其中胺基可為例如NH 2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳胺基、二雜芳胺基或胺基酸)；NH(CH 2CH 2NH) nCH 2CH 2-胺基(其中胺基可例如如本文所描述)、-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；及可視情況經例如如本文所描述之胺基取代的烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基。
糖修飾可包含亦可含有一或多個碳之糖基，該一或多個碳具有與核糖中之對應碳相反的立體化學組態。因此，經修飾之核酸可包括含有例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。經修飾之核酸亦可包括無鹼基糖。此等無鹼基糖亦可進一步在一或多個組成性糖原子處經修飾。經修飾之核酸亦可包括一或多種呈L形式之糖，例如L-核苷。
可併入至經修飾之核酸中之本文中所描述之經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括經修飾之鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括(但不限於)腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U))。此等核鹼基可經修飾或完全置換以得到可併入至經修飾之核酸中之經修飾之殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如鹼基的天然存在衍生物及合成衍生物。
在採用雙引導RNA之實施例中，crRNA及tracr RNA中之每一者可含有修飾。此類修飾可處於crRNA及/或tracr RNA之一端或兩端。在包含sgRNA之實施例中，sgRNA之一端或兩端之一或多個殘基可經化學修飾，或整個sgRNA可經化學修飾。某些實施例包含5'端修飾。某些實施例包含3'端修飾。在某些實施例中，gRNA分子之單股突出物中之一或多個或所有核苷酸為去氧核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA包含2018年6月14日公佈之WO2018/107028 A1中所揭示之修飾模式中之一者，該案之內容特此以全文引用之方式併入。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於指示經2'-O-Me修飾之核苷酸。術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於指示經2'-F取代之核苷酸。「*」可用於描述PS修飾。術語A*、C*、U*或G*可用於指示經PS鍵而鍵聯至後續(例如3')核苷酸之核苷酸。術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可用於指示已經2'-O-Me取代且經PS鍵而鍵聯至下一個(例如3')核苷酸之核苷酸。
例示性 spyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO: 215)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
G U U U U A G A G C U A G A A A U A G C A A G U U A A A A U
LS1-LS6 B1-B2 US1-US12 B2-B6 LS7-LS12
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
A A G G C U A G U C C G U U A U C A A C U U G A A A A A G U
聯結 H1-1至H1-12
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
G G C A C C G A G U C G G U G C
N H2-1至H2-15
I. 核糖核蛋白複合物
在一些實施例中，本發明提供包含一或多個gRNA之組合物，該一或多個gRNA包含來自 表 2 至 5之一或多個引導序列及經RNA引導之DNA結合劑，例如核酸酶，諸如Cas核酸酶，諸如Cas9。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑具有裂解酶活性，其亦可稱作雙股核酸內切酶活性。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas核酸酶。Cas9核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌( S. aureus)及其他原核生物(參見例如下一段中之清單)之II型CRISPR系統之彼等者及其經修飾(例如工程化或突變)型式。參見例如US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。Cas核酸酶之其他實例包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物，或其Cas10、Csm1或Cmr2次單元；及I型CRISPR系統之級聯複合物，或其Cas3次單元。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自IIA型、IIB型或IIC型系統。關於各種CRISPR系統及Cas核酸酶之論述，參見例如Makarova等人, NAT. REV. MICROBIOL. 9:467-477 (2011)；Makarova等人, NAT. REV. MICROBIOL, 13: 722-36 (2015)；Shmakov等人, MOLECULAR CELL, 60:385-397 (2015)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas切口酶。在一些實施例中，經RNA引導之切口酶經修飾或衍生自Cas蛋白質，諸如2類Cas核酸酶(其可例如為II型、V型或VI型Cas核酸酶)。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2及C2c3蛋白質及其修飾。
可衍生Cas核酸酶或Cas切口酶之非限制性例示性菌種包括釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)、嗜熱鏈球菌( Streptococcus thermophilus)、鏈球菌屬、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、無害李氏菌( Listeria innocua)、加氏乳桿菌( Lactobacillus gasseri)、新兇手弗朗西斯氏菌( Francisella novicida)、產琥珀酸沃廉菌( Wolinella succinogenes)、華德薩特菌( Sutterella wadsworthensis)、伽馬變形菌( Gammaproteobacterium)、奈瑟氏腦膜炎菌( Neisseria meningitidis)、空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)、多殺巴斯德菌( Pasteurella multocida)、產琥珀酸纖維桿菌( Fibrobacter succinogene)、深紅紅螺菌( Rhodospirillum rubrum)、達松維爾擬諾卡氏菌( Nocardiopsis dassonvillei)、始旋鏈黴菌( Streptomyces pristinaespiralis)、產綠色鏈黴菌( Streptomyces viridochromogenes)、產綠色鏈黴菌、粉紅鏈孢囊菌( Streptosporangium roseum)、粉紅鏈孢囊菌、嗜酸熱脂環桿菌( Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈狀芽孢桿菌( Bacillus pseudomycoides)、砷還原芽孢桿菌( Bacillus selenitireducens)、西伯利亞微小桿菌( Exiguobacterium sibiricum)、戴白氏乳桿菌( Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳桿菌( Lactobacillus salivarius)、布氏乳桿菌( Lactobacillus buchneri)、齒垢密螺旋體( Treponema denticola)、海洋微顫菌( Microscilla marina)、伯克霍爾德氏細菌( Burkholderiales bacterium)、食萘極地單胞菌( Polaromonas naphthalenivorans)、單胞菌屬( Polaromonas sp.)、瓦氏鱷球藻( Crocosphaera watsonii)、鱷球藻屬、銅綠微囊藻( Microcystis aeruginosa)、聚球藻屬( Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋桿菌( Acetohalobium arabaticum)、根制氨菌( Ammonifex degensii)、熱解纖維素菌( Caldicelulosiruptor becscii)、脫硫假絲酵母( Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌( Clostridium botulinum)、艱難梭菌( Clostridium difficile)、大芬戈爾德菌( Finegoldia magna)、嗜熱鹽鹼厭氧菌( Natranaerobius thermophilus)、嗜熱丙酸厭氧腸狀菌( Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜溫硫桿菌( Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌( Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色異著色菌( Allochromatium vinosum)、海桿菌屬( Marinobacter sp.)、嗜鹽亞硝化球菌( Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亞硝化球菌( Nitrosococcus watsoni)、浮游假交替單胞菌( Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纖線桿菌( Ktedonobacter racemifer)、發現甲烷耐鹽菌( Methanohalobium evestigatum)、變異念珠藻( Anabaena variabilis)、泡沫節球藻( Nodularia spumigena)、念珠藻屬( Nostoc sp.)、極大節旋藻( Arthrospira maxima)、鈍頂節旋藻( Arthrospira platensis)、節旋藻屬、螺旋藻屬( Lyngbya sp.)、原型微鞘藻( Microcoleus chthonoplastes)、顫藻屬( Oscillatoria sp.)、運動石袍菌( Petrotoga mobilis)、非洲高熱桿菌( Thermosipho africanus)、巴氏鏈球菌( Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌( Neisseria cinerea)、紅嘴鷗彎曲桿菌( Campylobacter lari)、食清潔劑細小棒菌( Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒狀桿菌( Corynebacterium diphtheria)、胺基酸球菌屬( Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌( Lachnospiraceae bacterium) ND2006及海洋無核氯菌( Acaryochloris marina)。
在一些實施例中，Cas核酸酶為來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自奈瑟氏腦膜炎菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他具體實例中，Cas核酸酶為來自以下之Cpf1核酸酶：土拉熱弗朗西絲菌( Francisella tularensis)、毛螺科菌、瘤胃溶纖維丁酸弧菌( Butyrivibrio proteoclasticus)、佩氏細菌( Peregrinibacteria bacterium)、帕庫氏菌( Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌( Smithella)、胺基酸球菌屬、白蟻甲烷支原體菌候選種( Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真桿菌( Eubacterium eligens)、牛眼莫拉菌( Moraxella bovoculi)、稻田鉤端螺旋體( Leptospira inadai)、狗口腔卟啉單胞菌( Porphyromonas crevioricanis)、解糖腖普雷沃菌( Prevotella disiens)或獼猴卟啉單胞菌( Porphyromonas macacae)。在某些實施例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌屬或毛螺科菌之Cpf1核酸酶。
在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶為來自奈瑟氏腦膜炎菌之Cas9核酸酶之切口酶形式。參見例如WO/2020081568，其描述Nme2Cas9 D16A切口酶融合蛋白。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas切口酶衍生自來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他實施例中，Cas切口酶衍生自來自以下之Cpf1核酸酶：土拉熱弗朗西絲菌、毛螺科菌、瘤胃溶纖維丁酸弧菌、佩氏細菌、帕庫氏菌、史密斯氏菌、胺基酸球菌屬、白蟻甲烷支原體菌候選種、挑剔真桿菌、牛眼莫拉菌、稻田鉤端螺旋體、狗口腔卟啉單胞菌、解糖腖普雷沃菌或獼猴卟啉單胞菌。在某些實施例中，Cas切口酶衍生自來自胺基酸球菌屬或毛螺菌科之Cpf1核酸酶。如其他地方所論述，切口酶可藉由使兩個催化域中之一者不活化而衍生自核酸酶，例如藉由使核溶解所必需之活性位點殘基(諸如Spy Cas9中之N863之D10、H840)突變。熟習此項技術者將熟悉容易地鑑別其他Cas蛋白中之對應殘基的技術，諸如序列比對及結構比對，其將在下文詳細論述。
在一些實施例中，gRNA連同經RNA引導之DNA結合劑一起稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas核酸酶。在一些實施例中，gRNA連同Cas核酸酶一起稱為Cas RNP。在一些實施例中，RNP包含I型、II型或III型組分。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白質。在一些實施例中，gRNA連同Cas9一起稱為Cas9 RNP。
野生型Cas9具有兩個核酸酶域：RuvC及HNH。RuvC域裂解非目標DNA股，且HNH域裂解目標DNA股。在一些實施例中，Cas9蛋白包含多於一個RuvC域及/或多於一個HNH域。在一些實施例中，Cas9蛋白質為野生型Cas9。在組合物、用途及方法實施例中之每一者中，Cas誘導目標DNA中之雙股斷裂。
在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中該蛋白質之一個域或區經不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas核酸酶域可經來自諸如Fok1之不同核酸酶的域置換。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾之核酸酶。
在其他實施例中，Cas核酸酶或Cas切口酶可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑具有單股切口酶活性，亦即可切割一個DNA股以產生單股斷裂，該單股斷裂亦稱為「切口」。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶為在dsDNA中產生切口，亦即切割DNA雙螺旋之一個股但不切割另一股之酶。在一些實施例中，Cas切口酶為其中例如藉由催化域中之一或多種變化(例如點突變)使核酸內切活性位點不活化之Cas核酸酶(例如上文所論述之Cas核酸酶)之型式。關於Cas切口酶及例示性催化域變化之論述，參見例如美國專利第8,889,356號。在一些實施例中，Cas切口酶，諸如Cas9切口酶具有非活性RuvC或HNH域。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑經修飾而僅含有一個功能核酸酶域。舉例而言，藥劑蛋白質可經修飾以使得核酸酶域中之一者經突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC域之切口酶。在一些實施例中，使用具有非活性RuvC域之切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH域之切口酶。在一些實施例中，使用具有非活性HNH域之切口酶。
在一些實施例中，Cas蛋白質核酸酶域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A(基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白質)。參見例如Zetsche等人 (2015) Cell10月22:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH樣核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A(基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白質)。參見例如Zetsche等人(2015)。其他例示性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A(基於新兇手弗朗西斯氏菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。
在一些實施例中，編碼切口酶之mRNA將與一對分別與目標序列之有義股及反義股互補之引導RNA組合提供。在此實施例中，引導RNA將切口酶導引至目標序列且藉由在目標序列之相對股上產生切口而引入DSB(亦即雙切口)。在一些實施例中，使用雙切口可改良特異性且減少脫靶效應。在一些實施例中，切口酶連同靶向DNA之相對股之兩個個別引導RNA使用以在目標DNA中產生雙切口。在一些實施例中，切口酶連同經選擇以非常接近之兩個個別引導RNA使用以在目標DNA中產生雙切口。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑缺乏裂解酶及切口酶活性。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽為dCas9多肽。在一些實施例中，缺乏裂解酶及切口酶活性之經RNA引導之DNA結合劑或dCas DNA結合多肽為其中例如藉由催化域之一或多種變化(例如點突變)，使核酸內切活性位點不活化的Cas核酸酶之型式(例如上文所論述之Cas核酸酶)。參見例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含一或多個異源功能域(例如為或包含融合多肽)。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3脫胺酶。在一些實施例中，APOBEC3脫胺酶為APOBEC3A (A3A)。在一些實施例中，A3A為人類A3A。在一些實施例中，A3A為野生型A3A。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含脫胺酶及經RNA引導之切口酶。在一些實施例中，mRNA進一步包含將定序編碼A3A與定序編碼經RNA引導之切口酶之序列連接的連接子。在一些實施例中，連接子為有機分子、基團、聚合物或化學部分。在一些實施例中，連接子為肽連接子。在一些實施例中，肽連接子為具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個或更多個胺基酸之任何胺基酸伸長段。在一些實施例中，肽連接子為16個殘基之「XTEN」連接子或其變異體(參見例如實例；及Schellenberger等人，A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接子包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 900)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 901)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 902)。
在一些實施例中，異源功能域可促進將經RNA引導之DNA結合劑輸送至細胞核中。舉例而言，異源功能域可為核定域信號(NLS)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與1-10個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情況下，NLS可在經RNA引導之DNA結合劑序列之N末端或C末端融合。其亦可插入經RNA引導之DNA結合劑序列內。在其他實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與多於一個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情形下，兩個NLS可相同(例如兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑與羧基末端之兩個NLS序列(例如SV40)融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個NLS連接在N末端且一個連接在C末端。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單聯(monopartite)序列，諸如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 600)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 601)。在一些實施例中，NLS可為諸如核質蛋白之NLS、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO: 602)之雙聯序列。在一特定實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 600) NLS可在經RNA引導之DNA結合劑之C末端融合。一或多個連接子視情況包括在融合位點處。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑包含編輯劑。例示性編輯劑為BC22n，其包括藉由XTEN連接子與釀膿鏈球菌-D10A Cas9切口酶融合之智人APOBEC3A，及編碼BC22n之mRNA。提供編碼BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 806)。
在一些實施例中，異源功能域可能夠修改經RNA引導之DNA結合劑的細胞內半衰期。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑之半衰期可得以提高。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑之半衰期可得以降低。在一些實施例中，異源功能域可能能夠增加經RNA引導之DNA結合劑的穩定性。在一些實施例中，異源功能域可能能夠降低經RNA引導之DNA結合劑的穩定性。在一些實施例中，異源功能域可充當蛋白質降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶，諸如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或鈣蛋白酶(calpain proteases)介導。在一些實施例中，異源功能域可包含PEST序列。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可藉由添加泛素或多泛素鏈來修飾。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白質(UBL)。泛素樣蛋白質之非限制性實例包括小泛素樣修飾因子(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦被稱作干擾素刺激基因-15 (ISG15))、泛素相關修飾因子-1 (URM1)、神經元-前驅細胞-細胞表現之發育下調蛋白-8 (NEDD8，在釀酒酵母中被稱作Rub1)、人類白血球抗原F相關(FAT10)、自噬-8 (ATG8)及自噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素摺疊修飾因子-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源功能域可為標記域。標記域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、抗原決定基標籤及報導基因序列。在一些實施例中，標記域可為螢光蛋白。適合之螢光蛋白之非限制實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、翡翠色(Emerald)、Azami綠(Azami Green)、單Azami綠(Monomeric Azami Green)、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、藍寶石色(Sapphire)、T-藍寶石色(T-sapphire))、青色螢光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi青(Midoriishi-Cyan))、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed單色、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed單色、HcRed串色、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙色螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira橙(Kusabira-Orange)、單Kusabira橙(Monomeric Kusabira-Orange)、mTangerine、tdTomato)或任何其他適合之螢光蛋白。在其他實施例中，標記域可為純化標籤及/或抗原決定基標籤。非限制性之例示性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、殼質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6×His、8×His、生物素羧基載體蛋白質(BCCP)、聚His及調鈣蛋白。非限制性之例示性報導基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在其他實施例中，異源功能域可將經RNA引導之DNA結合劑靶向至特定細胞器、細胞型、組織或器官。在一些實施例中，異源功能域可將經RNA引導之DNA結合劑靶向至粒線體。
在其他實施例中，異源功能域可為效應子域，諸如編輯域。當經RNA引導之DNA結合劑導引至其目標序列時，例如當Cas核酸酶藉由gRNA導引至目標序列時，效應子域(諸如編輯域)可修飾或影響目標序列。在一些實施例中，效應子域(諸如編輯域)可選自核酸結合域、核酸酶域(例如非Cas核酸酶域)、表觀遺傳修飾域、轉錄活化域或轉錄抑制子域。在一些實施例中，異源功能域為核酸酶，諸如FokI核酸酶。參見例如美國專利第9,023,649號。在一些實施例中，異源功能域為轉錄活化子或抑制子。參見例如Qi等人, 「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression」, Cell152:1173-83 (2013)；Perez-Pinera等人, 「RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors」, Nat. Methods10:973-6 (2013)；Mali等人, 「CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering」, Nat. Biotechnol.31:833-8 (2013)；Gilbert等人, 「CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes」, Cell154:442-51 (2013)。因此，經RNA引導之DNA結合劑基本上變成可使用引導RNA導引以結合所需目標序列之轉錄因子。 J. 測定引導RNA之功效
在一些實施例中，當與形成RNP之其他組分(例如，經RNA引導之DNA結合劑)一起遞送或表現時，測定引導RNA之功效。在一些實施例中，引導RNA與經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白，例如Cas9一起表現。在一些實施例中，將引導RNA遞送至已穩定表現經RNA引導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之細胞株中或在該細胞株中表現。在一些實施例中，引導RNA作為RNP之一部分遞送至細胞。在一些實施例中，將引導RNA與編碼經RNA引導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之mRNA一起遞送至細胞中。
如本文所述，使用本文所揭示之經RNA引導之DNA核酸酶及引導RNA可引起DSB、SSB及/或位點特異性結合，其導致DNA或前驅mRNA中之核酸修飾，在藉由細胞機制修復時，該核酸修飾可產生呈插入/缺失(insertion/deletion，indel)突變形式之誤差。歸因於插入/缺失之多種突變會改變閱讀框架、引入過早終止密碼子或誘導外顯子跳躍，且因此產生非功能性蛋白質。
在一些實施例中，基於活體外模型來測定特定引導RNA的功效。在一些實施例中，活體外模型為T細胞株。在一些實施例中，活體外模型為HEK293 T細胞。在一些實施例中，活體外模型為穩定地表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，活體外模型為類淋巴母細胞細胞株。在一些實施例中，活體外模型為初生人類T細胞。在一些實施例中，活體外模型為初生人類B細胞。在一些實施例中，活體外模型為初生人類周邊血液淋巴球。在一些實施例中，活體外模型為初生人類周邊血液單核細胞。
在一些實施例中，活體外模型中發生缺失或插入之脫目標位點數目係例如藉由分析來自經Cas9 mRNA及引導RNA活體外轉染之細胞之基因體DNA來測定。在一些實施例中，此類測定包含分析來自經Cas9 mRNA、引導RNA及供體寡核苷酸活體外轉染之細胞之基因體DNA。用於此類測定之例示性程序提供於以下工作實例中。
在一些實施例中，在用於引導RNA選擇過程之多個活體外細胞模型上測定特定gRNA之功效。在一些實施例中，與所選引導RNA針對細胞株的資料進行比較。在一些實施例中，使用多個細胞模型進行交叉篩選。
在一些實施例中，藉由中靶裂解效率來評估引導RNA之功效。在一些實施例中，藉由目標位置，例如HLA-A或CIITA處之編輯百分比量測引導RNA之功效。在一些實施例中，深度定序可用於鑑別藉由基因編輯引入之修飾(例如插入、缺失)的存在。插入/缺失百分比可根據次世代定序「NGS」計算。
在一些實施例中，引導RNA之功效係藉由目標細胞類型之基因體內之脫靶序列處之插入/缺失的數目及/或頻率來量測。在一些實施例中，提供有效引導RNA，其在細胞群體中及/或相對於目標位點處之插入/缺失產生頻率在脫靶位點以極低頻率(例如＜5%)產生插入/缺失。因此，本發明提供引導RNA，其並不展現目標細胞類型(例如T細胞或B細胞)中之脫靶插入/缺失形成，或其在細胞群體中及/或相對於目標位點處之插入/缺失產生頻率產生＜5%之脫靶插入/缺失形成頻率。在一些實施例中，本發明提供並不展現目標細胞類型(例如T細胞或B細胞)中之任何脫靶插入/缺失形成之引導RNA。在一些實施例中，例如如藉由一或多種本文所述方法所評估，提供在少於5個脫靶位點產生插入/缺失之引導RNA。在一些實施例中，例如如藉由一或多種本文所述方法所評估，提供在少於或等於4、3、2或1個脫靶位點產生插入/缺失之引導RNA。在一些實施例中，脫靶位點不出現在目標細胞(例如T細胞或B細胞)基因體中之蛋白質編碼區中。
在一些實施例中，線性擴增用於偵檢基因編輯事件，諸如目標DNA中插入/缺失(「插入/缺失(indel)」)突變、易位及同源定向修復(HDR)事件的形成。舉例而言，可使用具有獨特序列標籤之引子的線性擴增且分離該等加標籤之擴增產物(之後在本文中稱為「UnIT」，或「獨特識別符標籤化」方法)。
在一些實施例中，藉由目標細胞類型內之染色體重排之數目來量測引導RNA之功效。Kromatid dGH分析可用於偵測染色體重排，包括例如易位、相互易位、易位至脫靶染色體、缺失(亦即，由於編輯事件而在細胞複製週期中丟失片段之染色體重排)。在一些實施例中，目標細胞類型具有小於10、小於8、小於5、小於4、小於3、小於2或小於1個染色體重排。在一些實施例中，目標細胞類型不具有染色體重排。 K. gRNA組合物之遞送
脂質奈米粒子(LNP組合物)為用於遞送核苷酸及蛋白質負荷(cargo)之熟知手段，且可用於遞送本文所揭示之引導RNA、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP組合物遞送核酸、蛋白質、或核酸連同蛋白質一起。
在一些實施例中，本發明包含一種向個體遞送本文所揭示之任一種gRNA之方法，其中gRNA調配為LNP。在一些實施例中，LNP包含gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包含一種包含所揭示之任一種gRNA及LNP的組合物。在一些實施例中，組合物進一步包含Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，LNP組合物包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP組合物包含十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯(亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)或另一可離子化脂質。參見例如WO/2017/173054及其中所描述之參考文獻之脂質。在一些實施例中，LNP組合物包含莫耳比為約4.5、5.0、5.5、6.0或6.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)。在一些實施例中，在LNP脂質之情形下，術語陽離子及可離子化可互換，例如其中可離子化脂質視pH而定為陽離子型的。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA調配為LNP組合物以用於製備供治療疾病或病症用之藥劑。
電穿孔為遞送負荷之熟知手段，且任何電穿孔方法可用於遞送本文所揭示之任一種gRNA。在一些實施例中，電穿孔可用於遞送本文所揭示之任一種gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包含一種向離體細胞遞送本文所揭示之任一種gRNA之方法，其中gRNA調配為LNP或不調配為LNP。在一些實施例中，LNP包含gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，單獨或在一或多個載體上經編碼之本文所述之引導RNA組合物係在脂質奈米粒子中調配或經由脂質奈米粒子投與；參見例如WO/2017/173054及WO 2019/067992，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本發明包含DNA或RNA載體，其編碼包含本文所述之引導序列中之任一者或多者的任一種引導RNA。在一些實施例中，除了引導RNA序列以外，載體進一步包含不編碼引導RNA之核酸。不編碼引導RNA之核酸包括(但不限於)啟動子、增強子、調節序列及編碼經RNA引導之DNA核酸酶(其可為諸如Cas9之核酸酶)之核酸。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含一或多個核苷酸序列，該一或多個核苷酸序列編碼sgRNA及編碼經RNA引導之DNA核酸酶(其可為Cas核酸酶，諸如Cas9或Cpf1)之mRNA。在一些實施例中，載體包含一或多個核苷酸序列，該一或多個核苷酸序列編碼crRNA、trRNA及編碼經RNA引導之DNA核酸酶之mRNA，該DNA核酸酶可為Cas蛋白，諸如Cas9。在一個實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(亦即Spy Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA(其可為sgRNA)之核苷酸序列包含或由以下組成：藉由來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分側接的引導序列。包含或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA組成的核酸可進一步構成載體序列，其中該載體序列包含或由以下組成：不會與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起經天然發現的核酸。 L. 治療方法及用途
本文所述之任一工程化人類細胞及組合物可用於治療如本文所述之多種疾病及病症之方法中。在一些實施例中，經基因修飾之細胞(工程化細胞)及/或經基因修飾之細胞(工程化細胞)群體及組合物可用於治療多種疾病及病症之方法中。在一些實施例中，涵蓋治療本文所述之任一疾病或病症之方法，其包含投與本文所述之任何一或多種組合物。
在一些實施例中，本文所述之方法及組合物可用於治療需要遞送治療劑之疾病或病症。在一些實施例中，本發明提供一種在個體中提供免疫療法之方法，該方法包括向個體投與有效量之如本文所述之工程化細胞(或工程化細胞群體)，例如任何前述細胞態樣及實施例之細胞。
在一些實施例中，方法包含向個體投與組合物，該組合物包含在本文中描述為過繼細胞轉移療法之工程化細胞。在一些實施例中，工程化細胞為同種異體細胞。
在一些實施例中，方法包含向個體投與包含本文所述之工程化細胞的組合物，其中該細胞產生、分泌及/或表現適用於治療個體之疾病或病症的多肽(例如靶向受體)。在一些實施例中，細胞充當細胞工廠以產生可溶性多肽。在一些實施例中，細胞充當細胞工廠以產生抗體。在一些實施例中，細胞在活體內持續分泌多肽。在一些實施例中，細胞在活體內移植之後持續分泌多肽，持續至少1、2、3、4、5或6週。在一些實施例中，細胞在活體內移植之後持續分泌多肽，持續超過6週。在一些實施例中，可溶性多肽(例如抗體)由細胞以每天至少10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7或10 8個複本之濃度產生。在一些實施例中，多肽為抗體且由細胞以每天至少10 8個複本之濃度產生。
在該等方法之一些實施例中，方法包括在向個體投與有效量之如本文所述之工程化細胞，例如任何前述細胞態樣及實施例的細胞之前，投與淋巴球耗乏劑或免疫抑制劑。在另一態樣中，本發明提供一種製備工程化細胞(例如工程化細胞群體)之方法。
免疫療法為藉由活化或抑止免疫反應進行之疾病治療。經設計以引發或擴增免疫反應之免疫療法歸類為活化免疫療法。已表明基於細胞之免疫療法對於治療一些癌症有效。免疫效應細胞，諸如淋巴球、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、T輔助細胞、B細胞或其先驅細胞，諸如造血幹細胞(HSC)或誘導性富潛能幹細胞(iPSC)可經程式化以響應於腫瘤細胞表面上表現之異常抗原而起作用。因此，癌症免疫療法允許免疫系統之組分破壞腫瘤或其他癌細胞。亦已證明基於細胞之免疫療法有效地治療自體免疫疾病或移植排斥。免疫效應細胞，諸如調節T細胞(Treg)或間葉幹細胞可經程式化以響應於正常組織表面上所表現之自體抗原或移植抗原而起作用。
在一些實施例中，本發明提供一種製備工程化細胞(例如工程化細胞群體)之方法。工程化細胞群體可用於免疫療法。
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體的方法，其包括投與藉由本文所述之製備細胞的方法，例如任何前述細胞製備方法之態樣及實施例之方法製備的工程化細胞。
在一些實施例中，工程化細胞可用於治療癌症、傳染病、發炎性疾病、自體免疫疾病、心血管疾病、神經疾病、眼科疾病、腎病、肝病、肌肉骨胳疾病、紅血球疾病或移植排斥。在一些實施例中，工程化細胞可用於細胞移植，例如移植至心臟、肝臟、肺、腎臟、胰臟、皮膚或大腦。(參見例如Deuse等人, Nature Biotechnology 37:252-258 (2019)。)
在一些實施例中，工程化細胞可用作包含同種異體幹細胞療法之細胞療法。在一些實施例中，細胞療法包含誘導性富潛能幹細胞(iPSC)。iPSC可經誘導以分化為其他細胞類型，包括例如β胰島細胞、神經元及血細胞。在一些實施例中，細胞療法包含造血幹細胞。在一些實施例中，幹細胞包含可發育為骨、軟骨、肌肉及脂肪細胞之間葉幹細胞。在一些實施例中，幹細胞包含眼幹細胞。在一些實施例中，同種異體幹細胞移植包含同種異體骨髓移植。在一些實施例中，幹細胞包含富潛能幹細胞(PSC)。在一些實施例中，幹細胞包含誘導之胚胎幹細胞(ESC)。
本文所揭示之工程化人類細胞適用於進一步工程化，例如藉由引入其他經編輯或經修飾的基因或等位基因。本發明之細胞亦可適合於藉由引入編碼例如靶向受體(例如TCR、CAR、UniCAR)之外源核酸而進一步工程化。CAR亦稱為嵌合免疫受體、嵌合T細胞受體或人工T細胞受體。在一些實施例中，TCR為野生型或變異型TCR。
在一些實施例中，細胞療法為轉殖基因T細胞療法。在一些實施例中，細胞療法包含靶向威爾姆斯氏腫瘤1 (WT1)之轉殖基因T細胞。在一些實施例中，細胞療法包含市售T細胞療法，諸如CAR T細胞療法之靶向受體或編碼靶向受體之供體核酸。當前存在許多批准用於細胞療法之靶向受體。本文所提供之細胞及方法可與此等已知構築體一起使用。包括用作細胞療法之靶向受體構築體的商業批准細胞產品包括例如Kymriah® (替沙津魯(tisagenlecleucel))；Yescarta® (阿基侖賽(axicabtagene ciloleucel))；Tecartus™ (布萊奧妥(brexucabtagene autoleucel))；肽貝魯塞(Tabelecleucel) (Tab-cel®)；Viralym-M (ALVR105)；及Viralym-C。
在一些實施例中，方法提供用於向個體投與工程化細胞，其中該投與為注射。在一些實施例中，方法提供用於向個體投與工程化細胞，其中該投與為血管內注射或輸注。在一些實施例中，方法提供用於向個體投與工程化細胞，其中該投與為單次劑量。
在一些實施例中，方法提供用於減輕與用本文所揭示之組合物治療之個體疾病相關的病徵或症狀。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組合物治療具有持續超過一週的反應。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組合物治療具有持續超過兩週的反應。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組合物治療具有持續超過三週的反應。在一些實施例中，個體對用本文所揭示之組合物治療具有持續超過一個月的反應。
在一些實施例中，方法提供用於向個體投與工程化細胞，且其中該個體對所投與細胞具有反應，包含減輕與藉由細胞療法治療之疾病相關的病徵或症狀。在一些實施例中，個體具有持續超過一週的反應。在一些實施例中，個體具有持續超過一個月的反應。在一些實施例中，個體具有持續至少1-6週的反應。
表 6. 額外序列
描述 SEQ ID NO 序列
用於EMX1基因之例示性引導序列 230 GAGUCCGAGCAGAAGAAGAA
用於VEGFA基因之例示性引導序列 231 GACCCCCUCCACCCCGCCUC
用於RAG1B基因之例示性引導序列 232 GACUUGUUUUCAUUGUUCUC
用於TRAC基因之例示性引導序列 233 CUCUCAGCUGGUACACGGCA
用於CIITA基因之例示性引導序列 234 UGUGCAGACUCAGAGGUGAG
用於B2M基因之例示性引導序列 235 GGCCACGGAGCGAGACAUCU
用於CIITA基因之例示性引導物 236 CCCCCGGACGGUUCAAGCAA
   237-239 未使用
具有引導序列SEQ ID NO: 230之靶向EMX1之G000644引導RNA 240 mG*mA*mG*UCCGAGCAGAAGAAGAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
具有引導序列SEQ ID NO:231之靶向VEGFA的G000645引導RNA 241 mG*mA*mC*CCCCUCCACCCCGCCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
具有引導序列SEQ ID NO: 232之靶向RAG1B之G000646引導RNA 242 mG*mA*mC*UUGUUUUCAUUGUUCUCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
具有引導序列SEQ ID NO: 233之靶向TRAC之G013006引導RNA 243 mC*mU*mC*UCAGCUGGUACACGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
具有引導SEQ ID NO: 234之靶向CIITA之G018091 RNA 244 mU*mG*mU*GCAGACUCAGAGGUGAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
具有引導SEQ ID NO: 235之靶向B2M之G000529 RNA 245 mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
具有引導SEQ ID NO: 236之靶向CIITA之G013675 RNA 246 mC*mC*mC*CCGGACGGUUCAAGCAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
G016239 247 mG*mG*mC*CUCGGCGCUGACGAUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
G013676 248 mU*mG*mG*UCAGGGCAAGAGCUAUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
        
重組Cas9-NLS胺基酸序列 800 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
編碼Sp. Cas9之ORF 801 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG
編碼Sp. Cas9之ORF 802 ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
具有Hibit標籤之Cas9之開讀框 803 AUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUGA
BC22n之開讀框 804 AUGgaggccucccccgccuccggcccccggcaccugauggacccccacaucuucaccuccAACUUCAACAACggcAUCggccggCACAAGaccUACCUGUGCUACgagguggagcggCUGGACAACggcaccuccgugAAGAUGGACCAGCACcggggcUUCCUGCACAACCAGgccAAGAACCUGCUGUGCggcUUCUACggccggCACgccgagCUGcggUUCCUGGACCUGgugcccuccCUGCAGCUGGACcccgccCAGAUCUACcgggugaccUGGUUCAUCuccUGGucccccUGCUUCuccUGGggcUGCgccggcgaggugcgggccUUCCUGCAGgagAACaccCACgugcggCUGcggAUCUUCgccgcccggAUCUACGACUACGACcccCUGUACAAGgaggccCUGCAGAUGCUGcggGACgccggcgccCAGguguccAUCAUGaccUACGACgagUUCAAGCACUGCUGGGACaccUUCgugGACCACCAGggcUGCcccUUCCAGcccUGGGACggcCUGGACgagCACuccCAGgccCUGuccggccggCUGcgggccAUCCUGCAGAACCAGggcAACuccggcuccgagacccccggcaccuccgaguccgccacccccgaguccgacaagaaguacuccaucggccuggCcaucggcaccaacuccgugggcugggccgugaucaccgacgaguacaaggugcccuccaagaaguucaaggugcugggcaacaccgaccggcacuccaucaagaagaaccugaucggcgcccugcuguucgacuccggcgagaccgccgaggccacccggcugaagcggaccgcccggcggcgguacacccggcggaagaaccggaucugcuaccugcaggagaucuucuccaacgagauggccaagguggacgacuccuucuuccaccggcuggaggaguccuuccugguggaggaggacaagaagcacgagcggcaccccaucuucggcaacaucguggacgagguggccuaccacgagaaguaccccaccaucuaccaccugcggaagaagcugguggacuccaccgacaaggccgaccugcggcugaucuaccuggcccuggcccacaugaucaaguuccggggccacuuccugaucgagggcgaccugaaccccgacaacuccgacguggacaagcuguucauccagcuggugcagaccuacaaccagcuguucgaggagaaccccaucaacgccuccggcguggacgccaaggccauccuguccgcccggcuguccaagucccggcggcuggagaaccugaucgcccagcugcccggcgagaagaagaacggccuguucggcaaccugaucgcccugucccugggccugacccccaacuucaaguccaacuucgaccuggccgaggacgccaagcugcagcuguccaaggacaccuacgacgacgaccuggacaaccugcuggcccagaucggcgaccaguacgccgaccuguuccuggccgccaagaaccuguccgacgccauccugcuguccgacauccugcgggugaacaccgagaucaccaaggccccccuguccgccuccaugaucaagcgguacgacgagcaccaccaggaccugacccugcugaaggcccuggugcggcagcagcugcccgagaaguacaaggagaucuucuucgaccaguccaagaacggcuacgccggcuacaucgacggcggcgccucccaggaggaguucuacaaguucaucaagcccauccuggagaagauggacggcaccgaggagcugcuggugaagcugaaccgggaggaccugcugcggaagcagcggaccuucgacaacggcuccaucccccaccagauccaccugggcgagcugcacgccauccugcggcggcaggaggacuucuaccccuuccugaaggacaaccgggagaagaucgagaagauccugaccuuccggauccccuacuacgugggcccccuggcccggggcaacucccgguucgccuggaugacccggaaguccgaggagaccaucacccccuggaacuucgaggaggugguggacaagggcgccuccgcccaguccuucaucgagcggaugaccaacuucgacaagaaccugcccaacgagaaggugcugcccaagcacucccugcuguacgaguacuucaccguguacaacgagcugaccaaggugaaguacgugaccgagggcaugcggaagcccgccuuccuguccggcgagcagaagaaggccaucguggaccugcuguucaagaccaaccggaaggugaccgugaagcagcugaaggaggacuacuucaagaagaucgagugcuucgacuccguggagaucuccggcguggaggaccgguucaacgccucccugggcaccuaccacgaccugcugaagaucaucaaggacaaggacuuccuggacaacgaggagaacgaggacauccuggaggacaucgugcugacccugacccuguucgaggaccgggagaugaucgaggagcggcugaagaccuacgcccaccuguucgacgacaaggugaugaagcagcugaagcggcggcgguacaccggcuggggccggcugucccggaagcugaucaacggcauccgggacaagcaguccggcaagaccauccuggacuuccugaaguccgacggcuucgccaaccggaacuucaugcagcugauccacgacgacucccugaccuucaaggaggacauccagaaggcccagguguccggccagggcgacucccugcacgagcacaucgccaaccuggccggcucccccgccaucaagaagggcauccugcagaccgugaaggugguggacgagcuggugaaggugaugggccggcacaagcccgagaacaucgugaucgagauggcccgggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacucccgggagcggaugaagcggaucgaggagggcaucaaggagcugggcucccagauccugaaggagcaccccguggagaacacccagcugcagaacgagaagcuguaccuguacuaccugcagaacggccgggacauguacguggaccaggagcuggacaucaaccggcuguccgacuacgacguggaccacaucgugccccaguccuuccugaaggacgacuccaucgacaacaaggugcugacccgguccgacaagaaccggggcaaguccgacaacgugcccuccgaggagguggugaagaagaugaagaacuacuggcggcagcugcugaacgccaagcugaucacccagcggaaguucgacaaccugaccaaggccgagcggggcggccuguccgagcuggacaaggccggcuucaucaagcggcagcugguggagacccggcagaucaccaagcacguggcccagauccuggacucccggaugaacaccaaguacgacgagaacgacaagcugauccgggaggugaaggugaucacccugaaguccaagcugguguccgacuuccggaaggacuuccaguucuacaaggugcgggagaucaacaacuaccaccacgcccacgacgccuaccugaacgccguggugggcaccgcccugaucaagaaguaccccaagcuggaguccgaguucguguacggcgacuacaagguguacgacgugcggaagaugaucgccaaguccgagcaggagaucggcaaggccaccgccaaguacuucuucuacuccaacaucaugaacuucuucaagaccgagaucacccuggccaacggcgagauccggaagcggccccugaucgagaccaacggcgagaccggcgagaucgugugggacaagggccgggacuucgccaccgugcggaaggugcuguccaugccccaggugaacaucgugaagaagaccgaggugcagaccggcggcuucuccaaggaguccauccugcccaagcggaacuccgacaagcugaucgcccggaagaaggacugggaccccaagaaguacggcggcuucgacucccccaccguggccuacuccgugcuggugguggccaagguggagaagggcaaguccaagaagcugaaguccgugaaggagcugcugggcaucaccaucauggagcgguccuccuucgagaagaaccccaucgacuuccuggaggccaagggcuacaaggaggugaagaaggaccugaucaucaagcugcccaaguacucccuguucgagcuggagaacggccggaagcggaugcuggccuccgccggcgagcugcagaagggcaacgagcuggcccugcccuccaaguacgugaacuuccuguaccuggccucccacuacgagaagcugaagggcucccccgaggacaacgagcagaagcagcuguucguggagcagcacaagcacuaccuggacgagaucaucgagcagaucuccgaguucuccaagcgggugauccuggccgacgccaaccuggacaaggugcuguccgccuacaacaagcaccgggacaagcccauccgggagcaggccgagaacaucauccaccuguucacccugaccaaccugggcgcccccgccgccuucaaguacuucgacaccaccaucgaccggaagcgguacaccuccaccaaggaggugcuggacgccacccugauccaccaguccaucaccggccuguacgagacccggaucgaccugucccagcugggcggcgacggcggcggcucccccaagaagaagcggaaggugUgA
具有Hibit標籤之BC22n之開讀框 805 AUGgaggccucccccgccuccggcccccggcaccugauggacccccacaucuucaccuccAACUUCAACAACggcAUCggccggCACAAGaccUACCUGUGCUACgagguggagcggCUGGACAACggcaccuccgugAAGAUGGACCAGCACcggggcUUCCUGCACAACCAGgccAAGAACCUGCUGUGCggcUUCUACggccggCACgccgagCUGcggUUCCUGGACCUGgugcccuccCUGCAGCUGGACcccgccCAGAUCUACcgggugaccUGGUUCAUCuccUGGucccccUGCUUCuccUGGggcUGCgccggcgaggugcgggccUUCCUGCAGgagAACaccCACgugcggCUGcggAUCUUCgccgcccggAUCUACGACUACGACcccCUGUACAAGgaggccCUGCAGAUGCUGcggGACgccggcgccCAGguguccAUCAUGaccUACGACgagUUCAAGCACUGCUGGGACaccUUCgugGACCACCAGggcUGCcccUUCCAGcccUGGGACggcCUGGACgagCACuccCAGgccCUGuccggccggCUGcgggccAUCCUGCAGAACCAGggcAACuccggcuccgagacccccggcaccuccgaguccgccacccccgaguccgacaagaaguacuccaucggccuggCcaucggcaccaacuccgugggcugggccgugaucaccgacgaguacaaggugcccuccaagaaguucaaggugcugggcaacaccgaccggcacuccaucaagaagaaccugaucggcgcccugcuguucgacuccggcgagaccgccgaggccacccggcugaagcggaccgcccggcggcgguacacccggcggaagaaccggaucugcuaccugcaggagaucuucuccaacgagauggccaagguggacgacuccuucuuccaccggcuggaggaguccuuccugguggaggaggacaagaagcacgagcggcaccccaucuucggcaacaucguggacgagguggccuaccacgagaaguaccccaccaucuaccaccugcggaagaagcugguggacuccaccgacaaggccgaccugcggcugaucuaccuggcccuggcccacaugaucaaguuccggggccacuuccugaucgagggcgaccugaaccccgacaacuccgacguggacaagcuguucauccagcuggugcagaccuacaaccagcuguucgaggagaaccccaucaacgccuccggcguggacgccaaggccauccuguccgcccggcuguccaagucccggcggcuggagaaccugaucgcccagcugcccggcgagaagaagaacggccuguucggcaaccugaucgcccugucccugggccugacccccaacuucaaguccaacuucgaccuggccgaggacgccaagcugcagcuguccaaggacaccuacgacgacgaccuggacaaccugcuggcccagaucggcgaccaguacgccgaccuguuccuggccgccaagaaccuguccgacgccauccugcuguccgacauccugcgggugaacaccgagaucaccaaggccccccuguccgccuccaugaucaagcgguacgacgagcaccaccaggaccugacccugcugaaggcccuggugcggcagcagcugcccgagaaguacaaggagaucuucuucgaccaguccaagaacggcuacgccggcuacaucgacggcggcgccucccaggaggaguucuacaaguucaucaagcccauccuggagaagauggacggcaccgaggagcugcuggugaagcugaaccgggaggaccugcugcggaagcagcggaccuucgacaacggcuccaucccccaccagauccaccugggcgagcugcacgccauccugcggcggcaggaggacuucuaccccuuccugaaggacaaccgggagaagaucgagaagauccugaccuuccggauccccuacuacgugggcccccuggcccggggcaacucccgguucgccuggaugacccggaaguccgaggagaccaucacccccuggaacuucgaggaggugguggacaagggcgccuccgcccaguccuucaucgagcggaugaccaacuucgacaagaaccugcccaacgagaaggugcugcccaagcacucccugcuguacgaguacuucaccguguacaacgagcugaccaaggugaaguacgugaccgagggcaugcggaagcccgccuuccuguccggcgagcagaagaaggccaucguggaccugcuguucaagaccaaccggaaggugaccgugaagcagcugaaggaggacuacuucaagaagaucgagugcuucgacuccguggagaucuccggcguggaggaccgguucaacgccucccugggcaccuaccacgaccugcugaagaucaucaaggacaaggacuuccuggacaacgaggagaacgaggacauccuggaggacaucgugcugacccugacccuguucgaggaccgggagaugaucgaggagcggcugaagaccuacgcccaccuguucgacgacaaggugaugaagcagcugaagcggcggcgguacaccggcuggggccggcugucccggaagcugaucaacggcauccgggacaagcaguccggcaagaccauccuggacuuccugaaguccgacggcuucgccaaccggaacuucaugcagcugauccacgacgacucccugaccuucaaggaggacauccagaaggcccagguguccggccagggcgacucccugcacgagcacaucgccaaccuggccggcucccccgccaucaagaagggcauccugcagaccgugaaggugguggacgagcuggugaaggugaugggccggcacaagcccgagaacaucgugaucgagauggcccgggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacucccgggagcggaugaagcggaucgaggagggcaucaaggagcugggcucccagauccugaaggagcaccccguggagaacacccagcugcagaacgagaagcuguaccuguacuaccugcagaacggccgggacauguacguggaccaggagcuggacaucaaccggcuguccgacuacgacguggaccacaucgugccccaguccuuccugaaggacgacuccaucgacaacaaggugcugacccgguccgacaagaaccggggcaaguccgacaacgugcccuccgaggagguggugaagaagaugaagaacuacuggcggcagcugcugaacgccaagcugaucacccagcggaaguucgacaaccugaccaaggccgagcggggcggccuguccgagcuggacaaggccggcuucaucaagcggcagcugguggagacccggcagaucaccaagcacguggcccagauccuggacucccggaugaacaccaaguacgacgagaacgacaagcugauccgggaggugaaggugaucacccugaaguccaagcugguguccgacuuccggaaggacuuccaguucuacaaggugcgggagaucaacaacuaccaccacgcccacgacgccuaccugaacgccguggugggcaccgcccugaucaagaaguaccccaagcuggaguccgaguucguguacggcgacuacaagguguacgacgugcggaagaugaucgccaaguccgagcaggagaucggcaaggccaccgccaaguacuucuucuacuccaacaucaugaacuucuucaagaccgagaucacccuggccaacggcgagauccggaagcggccccugaucgagaccaacggcgagaccggcgagaucgugugggacaagggccgggacuucgccaccgugcggaaggugcuguccaugccccaggugaacaucgugaagaagaccgaggugcagaccggcggcuucuccaaggaguccauccugcccaagcggaacuccgacaagcugaucgcccggaagaaggacugggaccccaagaaguacggcggcuucgacucccccaccguggccuacuccgugcuggugguggccaagguggagaagggcaaguccaagaagcugaaguccgugaaggagcugcugggcaucaccaucauggagcgguccuccuucgagaagaaccccaucgacuuccuggaggccaagggcuacaaggaggugaagaaggaccugaucaucaagcugcccaaguacucccuguucgagcuggagaacggccggaagcggaugcuggccuccgccggcgagcugcagaagggcaacgagcuggcccugcccuccaaguacgugaacuuccuguaccuggccucccacuacgagaagcugaagggcucccccgaggacaacgagcagaagcagcuguucguggagcagcacaagcacuaccuggacgagaucaucgagcagaucuccgaguucuccaagcgggugauccuggccgacgccaaccuggacaaggugcuguccgccuacaacaagcaccgggacaagcccauccgggagcaggccgagaacaucauccaccuguucacccugaccaaccugggcgcccccgccgccuucaaguacuucgacaccaccaucgaccggaagcgguacaccuccaccaaggaggugcuggacgccacccugauccaccaguccaucaccggccuguacgagacccggaucgaccugucccagcugggcggcgacggcggcggcucccccaagaagaagcggaagguguccgaguccgccacccccgaguccguguccggcuggcggcuguucaagaagaucuccUgA
   806 未使用
UGI之開讀框 807 AUGGGACCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGGAGGAGGAAGCACAAACCUGUCGGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAUCGAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAUCGGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAUCGACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAUCGGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACUCGAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGUGA
UGI之開讀框 808 AUGACCAACCUGUCCGACAUCAUCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCUGGUGAUCCAGGAGUCCAUCCUGAUGCUGCCCGAGGAGGUGGAGGAGGUGAUCGGCAACAAGCCCGAGUCCGACAUCCUGGUGCACACCGCCUACGACGAGUCCACCGACGAGAACGUGAUGCUGCUGACCUCCGACGCCCCCGAGUACAAGCCCUGGGCCCUGGUGAUCCAGGACUCCAACGGCGAGAACAAGAUCAAGAUGCUGUCCGGCGGCUCCAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUGA
由SEQ ID No. 801-802編碼之Cas9之胺基酸序列 809 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
具有Hibit標籤之Cas9之胺基酸序列 810 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKVSESATPESVSGWRLFKKIS
BC22n之胺基酸序列 811 MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV*
具有Hibit標籤之BC22n之胺基酸序列 812 MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKVSESATPESVSGWRLFKKIS
   813 未使用
UGI之胺基酸序列 814 MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFESPKKKRKVE
   815 未使用
靶向B2M之G023519引導RNA 816 mA*mC*mU*CACGCUGGAUAGCCUCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU
Cas9之開讀框 817 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUG GUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG
BC22之開讀框 818 AUGGAAGCAAGCCCGGCAAGCGGACCGAGACACCUGAUGGACCCGCACAUCUUCACAAGCAACUUCAACAACGGAAUCGGAAGACACAAGACAUACCUGUGCUACGAAGUCGAAAGACUGGACAACGGAACAAGCGUCAAGAUGGACCAGCACAGAGGAUUCCUGCACAACCAGGCAAAGAACCUGCUGUGCGGAUUCUACGGAAGACACGCAGAACUGAGAUUCCUGGACCUGGUCCCGAGCCUGCAGCUGGACCCGGCACAGAUCUACAGAGUCACAUGGUUCAUCAGCUGGAGCCCGUGCUUCAGCUGGGGAUGCGCAGGAGAAGUCAGAGCAUUUCUGCAGGAAAACACACACGUCAGACUGAGAAUCUUCGCAGCAAGAAUCUAC GACUACGACCCGCUGUACAAGGAAGCACUGCAGAUGCUGAGAGACGCAGGAGCACAGGUCAGCAUCAUGACAUACGACGAAUUCAAGCACUGCUGGGACACAUUCGUCGACCACCAGGGAUGCCCGUUCCAGCCGUGGGACGGACUGGACGAACACAGCCAGGCACUGAGCGGAAGACUGAGAGCAAUCCUGCAGAACCAGGGAAACAGCGGAAGCGAAACACCGGGAACAAGCGAAAGCGCAACACCGGAAAGCGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCCAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUC GACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGAUCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACAGCGGAGGAAGCACAAACCUGAGCGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAAGCAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAAGCGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAAGCACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAAGCGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACAGCAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGAGCGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAA
UGI之開讀框 819 AUGGGACCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGGAGGAGGAAGCACAAACCUGUCGGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAUCGAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAUCGGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAUCGACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAUCGGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACUCGAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGUGA
   820-899, 903-971 未使用
編碼BC22n之mRNA 972 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編碼由EF1a啟動子表現之HLA-E的慢病毒基因體 1000 gcgatcgcagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTcgtttagtgaaccggggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttggctcccgatcgttgcgttacacacacaattactgctgatcgagtgtagccttcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcttgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatgtgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAtctagacgccaccATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTAGAGGCTGTTATGGCTCCGCGGACTTTAATTTTAGGTGGTGGCGGATCCGGTGGAGGCGGTTCTGGTGGAGGCGGCTCCATCCAGCGTACGCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGCGACATGGGTGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGCGGTAGTGGCGGCGGAGGAAGCGGTGGTGGCGGTTCCGGATCTCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTGCAGTGGATGCATGGCTGCGAGCTGGGGCCCGACAGGCGCTTCCTCCGCGGGTATGAACAGTTCGCCTACGACGGCAAGGATTATCTCACCCTGAATGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCGGTGGACACGGCGGCTCAGATCTCCGAGCAAAAGTCAAATGATGCCTCTGAGGCGGAGCACCAGAGAGCCTACCTGGAAGACACATGCGTGGAGTGGCTCCACAAATACCTGGAGAAGGGGAAGGAGACGCTGCTTCACCTGGAGCCCCCAAAGACACACGTGACTCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCTCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCAGGATGGGGAGGGCCATACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCTGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTACCCGAGCCCGTCACCCTGAGATGGAAGCCGGCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGATCTGTGGTCTCTGGAGCTGTGGTTGCTGCTGTGATATGGAGGAAGAAGAGCTCAGGTGGAAAAGGAGGGAGCTACTATAAGGCTGAGTGGAGCGACAGTGCCCAGGGGTCTGAGTCTCACAGCTTGTAAaagtagaagttgtctc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包括ITR之HD1 TCR插入 1001 ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctagatcttgccaacataccataaacctcccattctgctaatgcccagcctaagttggggagaccactccagattccaagatgtacagtttgctttgctgggcctttttcccatgcctgcctttactctgccagagttatattgctggggttttgaagaagatcctattaaataaaagaataagcagtattattaagtagccctgcatttcaggtttccttgagtggcaggccaggcctggccgtgaacgttcactgaaatcatggcctcttggccaagattgatagcttgtgcctgtccctgagtcccagtccatcacgagcagctggtttctaagatgctatttcccgtataaagcatgagaccgtgacttgccagccccacagagccccgcccttgtccatcactggcatctggactccagcctgggttggggcaaagagggaaatgagatcatgtcctaaccctgatcctcttgtcccacagatatccagaaccctgaccctgcggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcttgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatgtgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgatgcggccgccaccatgggatcttggacactgtgttgcgtgtccctgtgcatcctggtggccaagcacacagatgccggcgtgatccagtctcctagacacgaagtgaccgagatgggccaagaagtgaccctgcgctgcaagcctatcagcggccacgattacctgttctggtacagacagaccatgatgagaggcctggaactgctgatctacttcaacaacaacgtgcccatcgacgacagcggcatgcccgaggatagattcagcgccaagatgcccaacgccagcttcagcaccctgaagatccagcctagcgagcccagagatagcgccgtgtacttctgcgccagcagaaagacaggcggctacagcaatcagccccagcactttggagatggcacccggctgagcatcctggaagatctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttcgagccttctgaggccgagatcagccacacacagaaagccacactcgtgtgtctggccaccggcttctatcccgatcacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtcagcaccgatcctcagcctctgaaagagcagcccgctctgaacgacagcagatactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaaccccagaaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgatgagtggacccaggatagagccaagcctgtgacacagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgtggctttaccagcgagagctaccagcagggcgtgctgtctgccacaatcctgtacgagatcctgctgggcaaagccactctgtacgccgtgctggtgtctgccctggtgctgatggccatggtcaagcggaaggatagcaggggcggctccggtgccacaaacttctccctgctcaagcaggccggagatgtggaagagaaccctggccctatggaaaccctgctgaaggtgctgagcggcacactgctgtggcagctgacatgggtccgatctcagcagcctgtgcagtctcctcaggccgtgattctgagagaaggcgaggacgccgtgatcaactgcagcagctctaaggccctgtacagcgtgcactggtacagacagaagcacggcgaggcccctgtgttcctgatgatcctgctgaaaggcggcgagcagaagggccacgagaagatcagcgccagcttcaacgagaagaagcagcagtccagcctgtacctgacagccagccagctgagctacagcggcacctacttttgtggcaccgcctggatcaacgactacaagctgtctttcggagccggcaccacagtgacagtgcgggccaatattcagaaccccgatcctgccgtgtaccagctgagagacagcaagagcagcgacaagagcgtgtgcctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggacagcgacgtgtacatcaccgataagactgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgatttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagtcctgagagcagctgcgacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctcaaggtggccggcttcaacctgctgatgaccctgagactgtggtccagctaacctCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccactagtcgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccaggtaagggcagctttggtgccttcgcaggctgtttccttgcttcaggaatggccaggttctgcccagagctctggtcaatgatgtctaaaactcctctgattggtggtctcggccttatccattgccaccaaaaccctctttttactaagaaacagtgagccttgttctggcagtccagagaatgacacgggaaaaaagcagatgaagagaaggtggcaggagagggcacgtggcccagcctcagtctctagatctaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa
引導支架 1002 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU
引導支架 1003 mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU
   1004 未使用
編碼UGI之mRNA序列 1005 GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGACCAACCUGUCCGACAUCAUCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCUGGUGAUCCAGGAGUCCAUCCUGAUGCUGCCCGAGGAGGUGGAGGAGGUGAUCGGCAACAAGCCCGAGUCCGACAUCCUGGUGCACACCGCCUACGACGAGUCCACCGACGAGAACGUGAUGCUGCUGACCUCCGACGCCCCCGAGUACAAGCCCUGGGCCCUGGUGAUCCAGGACUCCAACGGCGAGAACAAGAUCAAGAUGCUGUCCGGCGGCUCCAAGCGGACCGCCGACGGCUCCGAGUUCGAGUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGUGAUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG
引導支架90聚體 1006 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC
具有修飾之引導支架90聚體 1007 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
具有修飾之引導支架90聚體 1008 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
具有修飾之引導支架88聚體 1009 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
引導支架88聚體 1010 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC
具有修飾之引導支架88聚體 1011 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
具有修飾之引導支架88聚體 1012 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
引導支架 1013 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
引導支架 1014 mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
G023523例示性91聚體全序列 1015 GCUGCAGCGCACGGGUACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU
G023523例示性91聚體經修飾序列 1016 mG*mC*mU*GCAGCGCACGGGUACCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU
* 此表中所揭示之引導序列可未經修飾、經表中所示之例示性修飾模式修飾或經本文中所揭示或此項技術中可用之不同修飾模式修飾。 IV. 實例
提供以下實例以說明某些所揭示實施例且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。 實例1.通用方法 1.1. 用於中靶裂解效率之次世代定序(「NGS」)及分析
根據製造商之方案，使用QuickExtract™ DNA提取溶液(Lucigen，目錄號QE09050)提取基因體DNA。
為了定量性測定基因體中目標位置之編輯效率，使用深度定序來鑑別藉由基因編輯引入之插入、缺失及取代的存在。圍繞所關注基因(例如，HLA-A)內之目標位點設計PCR引子，且擴增所關注基因體區域。按本領域中之標準進行引子序列設計。
根據製造商方案(Illumina)進行額外PCR，以對於定序添加化學作用。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子進行定序。在消除具有低品質評分之彼等讀段之後，將讀段與人類參考基因體(例如，hg38)進行比對。將與所關注目標區域重疊之讀段與局部基因體序列重新比對以改良該比對。接著計算野生型讀段之數目相對於含有C成為T之突變、C成為A/G之突變或插入/缺失之讀段之數目。在以所預測之Cas9裂解位點為中心的20 bp區中，對插入及缺失進行評分。插入/缺失百分比之定義為在20 bp評分區內插入或缺失一或多個鹼基之定序讀段之總數目除以定序讀段(包括野生型)之總數目。在包括20 bp sgRNA目標序列之上游10 bp及下游10 bp之40 bp區中對C成為T之突變或C成為A/G之突變進行評分。C成為T之編輯百分比之定義為在40 bp區內具有一或多個C成為T之突變之定序讀段之總數目除以定序讀段(包括野生型)之總數目。類似地計算C成為A/G之突變之百分比。 1.2. T 細胞培養基製備。
此處描述下文使用之T細胞培養基組合物。「X-VIVO基礎培養基」由X-VIVO™ 15培養基、1% Penstrep、50 µM β-巰基乙醇、10 mM NAC組成。除上文所提及之組分以外，使用之其他可變培養基組分為：1.血清(胎牛血清(FBS))；及2.細胞介素(IL-2、IL-7、IL-15)。 1.3. 製備脂質奈米粒子。
以各種莫耳比將脂質組分溶解於100%乙醇中。將RNA負荷(例如，Cas9 mRNA及sgRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽緩衝液、100 mM NaCl (pH 5.0)中，產生大致0.45 mg/mL之RNA負荷濃度。
脂質核酸組裝體含有莫耳比分別為50:38:9:3之可離子化脂質(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱為(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:1或1:2之gRNA與mRNA之比調配。
使用交叉流技術，利用含脂質之乙醇與兩個體積之RNA溶液及一個體積之水的衝擊射流混合來製備脂質奈米粒子(LNP組合物)。經由混合交叉使含脂質之乙醇與兩個體積之RNA溶液混合。經由線內T形管將第四水流與十字之出口流混合(參見WO2016010840圖2)。將LNP組合物在室溫(RT)下保持1小時且進一步用水稀釋(大約1:1 v/v)。LNP組合物在平板濾筒(Sartorius，100 kD MWCO)上使用切向流過濾濃縮，且隨後使用PD-10去鹽管柱(GE)將其緩衝液交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖，pH 7.5 (TSS)中。替代地，視情況使用100 kDa Amicon旋轉過濾器濃縮LNP，且使用PD-10去鹽管柱(GE)將其緩衝液交換至TSS中。所得混合物接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾。將最終LNP儲存於4℃或-80℃下直至進一步使用。 1.4. mRNA 之活體外轉錄 ( 「 IVT 」 )
含有N1-甲基假-U之封端及聚腺苷酸化mRNA係藉由使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶之活體外轉錄來產生。藉由在以下條件下與XbaI一起在37℃下培育2小時來線性化含有T7啟動子、轉錄序列及多腺苷酸化序列之質體DNA：200 ng/µL質體、2 U/µL XbaI (NEB)及1×反應緩衝液。藉由在65℃下加熱反應物20分鐘來使XbaI失活。由酶及緩衝鹽純化經線性化質體。用於產生經修飾mRNA之IVT反應係藉由在37℃下在以下條件下培育1.5-4小時來進行：50 ng/µL線性化質體；各2-5 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)；10-25 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/µL鼠類核糖核酸酶抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液。添加TURBO去氧核糖核酸酶(ThermoFisher)，至0.01 U/µL之最終濃度，且將反應物再培育30分鐘以移除DNA模板。根據製造商之方案使用MegaClear Transcription Clean-up套組(ThermoFisher)或RNeasy Maxi套組(Qiagen)純化mRNA。或者，經由沈澱方案(在一些情況下，其繼之以基於HPLC之純化)來純化mRNA。簡言之，在DNA酶消化之後，使用LiCl沈澱、乙酸銨沈澱及乙酸鈉沈澱來純化mRNA。對於經HPLC純化之mRNA而言，在LiCl沈澱及復原之後，藉由RP-IP HPLC純化mRNA (參見例如Kariko等人, Nucleic Acids Research, 2011, 第39卷, 第21期e142)。合併選擇用於彙集之溶離份且藉由如上文所描述之乙酸鈉/乙醇沈澱來去鹽。在另一替代方法中，mRNA用LiCl沈澱法純化，隨後藉由切向流過濾進一步純化。藉由量測260 nm處之吸光度(Nanodrop)測定RNA濃度，且藉由毛細電泳法用Bioanlayzer (Agilent)來分析轉錄物。
自編碼根據SEQ ID NO: 801-803之開讀框(參見 表 6中之序列)之質體DNA生成釀膿鏈球菌(「Spy」)Cas9 mRNA。自編碼根據SEQ ID NO: 804-805之開讀框之質體DNA產生BC22n mRNA。自編碼根據SEQ ID NO:807-808之開讀框之質體DNA產生UGI mRNA。當關於RNA在下文提及SEQ ID NO: 801-808時，應理解，T應經U置換(其為如上文所述之N1-甲基假尿苷)。實例中所用之信使RNA包括5'帽及3'多腺苷酸化區域，例如至多100 nt，且在 表 6中藉由SEQ ID NO: 801-808鑑別。 實例2：用Cas9篩選HLA-A引導RNA
藉由評定兩個等位基因型式之MHC I表面蛋白HLA-A2及HLA-A3之損失，篩選經設計用於破壞HLA-A基因之88種sgRNA在T細胞中的功效。供體具有A*02:01:01G及03:01:01G之HLA-A表型。在藉由用Cas9核糖核蛋白(RNP)及各測試引導物電穿孔在 HLA-A基因座處編輯之後，藉由流動式細胞測量術測定對於HLA-A2及A3呈雙陰性之T細胞百分比(「A2-/A3-%」)。一般而言，除非另外規定，否則在整個實例中使用之標識為「GXXXXXX」之引導RNA係指100 nt修飾之sgRNA型式，除非另外規定，諸如本文提供之表中所示彼等。 2.1.  T細胞之RNP電穿孔
使用Cas9核糖核蛋白(RNP)之電穿孔評定Cas9編輯活性。解凍後，將Pan CD3+ T(StemCell，HLA-A*02.01/A*03.01)細胞以0.5×10 6個細胞/毫升之密度在由RPMI 1640(Invitrogen, 目錄號22400-089)構成的T細胞RPMI培養基中塗鋪，該培養基含有5%(v/v)之胎牛血清、1×Glutamax(Gibco, 目錄號35050-061)、50 µM  2-巰基乙醇、100 μM非必需胺基酸(Invitrogen，目錄號11140-050)、1 mM丙酮酸鈉、10 mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈黴素及100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。細胞在RNP轉染之前在T細胞RPMI培養基中擴增72小時。
自其儲存板移除靶向HLA-A之sgRNA且在95℃下變性2分鐘，隨後在室溫下冷卻10分鐘。製備20 µM sgRNA及10 µM Cas9-NLS蛋白(SEQ ID NO: 800)之RNP混合物且在25℃下培育10分鐘。將5 µL RNP混合物與100,000個細胞在20 µL P3電穿孔緩衝液(Lonza)中組合。將22 μL RNP/細胞混合物轉移至Lonza shuttle 96孔電穿孔板之相應孔中。用製造商之脈衝碼對細胞一式兩份地電穿孔。電穿孔後立即將T細胞RPMI培養基添加至細胞中。隨後在編輯後2天如實例1中所描述培養且收集經電穿孔之T細胞用於NGS定序。 2.2. 流動式細胞測量術
編輯後第7天，藉由流動式細胞測量術對T細胞進行表型分型以測定HLA-A基因座編輯後之HLA-A蛋白表現。簡言之，將T細胞在靶向兩種等位基因型式之MHC I表面蛋白之抗體混合液中培育，該兩種等位基因型式對應於細胞供體基因型HLA-A2(eBioscience目錄號17-9876-42)及HLA-A3(eBioscience目錄號12-5754-42)。隨後洗滌細胞，在Cytoflex流動式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo套裝軟體進行分析。基於大小、形狀、生存力以及HLA-A2及HLA-A3表現對T細胞進行閘控。 表 7展示在HLA-A基因座處編輯之後對HLA-A2及HLA-A3呈雙陰性之細胞的平均百分比。
表 7- 在 HLA-A 基因座處編輯之後 HLA-A 陰性 ( 對 HLA-A2 及 HLA-A3 呈雙陰性 )T 細胞之平均百分比
引導物ID 平均A2-/A3-% SD A2-/A3-%
G018932 39.30 1.56
G018933 68.45 4.03
G018934 34.40 0.57
G018935 62.25 0.92
G018936 7.62 0.28
G018937 18.85 1.34
G018938 0.05 0.04
G018939 24.30 0.14
G018940 3.99 0.06
G018941 0.02 0.02
G018942 1.97 0.19
G018943 10.80 0.57
G018944 1.78 0.16
G018945 8.85 0.03
G018946 8.08 0.44
G018947 8.53 0.50
G018948 8.57 0.59
G018949 51.95 0.92
G018950 1.80 0.08
G018951 40.25 0.21
G018952 3.40 0.30
G018953 23.35 0.64
G018954 57.50 1.41
G018955 5.65 0.59
G018956 40.45 0.21
G018957 33.65 2.47
G018958 1.52 0.00
G018959 4.69 0.16
G018960 0.13 0.00
G018961 0.88 0.05
G018962 0.78 0.01
G018963 37.50 1.56
G018964 12.75 0.64
G018965 1.26 0.09
G018966 0.28 0.06
G018967 0.31 0.17
G018968 0.34 0.07
G018969 0.52 0.28
G018970 0.55 0.13
G018971 0.36 0.13
G018972 17.15 0.78
G018973 2.04 0.28
G018974 1.26 0.03
G018975 7.52 1.15
G018976 3.75 0.22
G018977 22.45 0.64
G018978 7.79 0.64
G018979 45.80 0.71
G018980 35.70 1.98
G018981 1.74 0.16
G018982 3.31 0.22
G018983 0.03 0.02
G018984 0.78 0.04
G018985 0.01 0.00
G018986 0.01 0.00
G018987 1.55 0.21
G018988 1.72 0.08
G018989 6.92 0.06
G018990 13.70 0.99
G018991 19.35 0.49
G018992 21.70 2.26
G018993 14.40 0.28
G018994 25.35 0.64
G018995 89.70 0.28
G018996 92.35 0.07
G018997 94.90 1.84
G018998 90.50 0.42
G018999 96.40 0.28
G019000 94.95 0.21
G019001 3.36 0.28
G019002 0.02 0.00
G019003 7.32 0.08
G019004 52.70 2.40
G019005 1.33 0.06
G019006 8.18 0.98
G019007 15.05 1.77
G019008 58.65 2.19
G019009 26.95 5.87
G019010 4.69 0.04
G019011 3.88 0.07
G019012 23.75 1.91
G019013 40.40 0.85
G019014 26.55 0.07
G019015 27.40 2.40
G019016 20.20 0.00
G019017 3.53 0.15
G019018 18.60 0.28
G019019 0.91 0.06
實例3：用BC22n及Cas9篩選HLA-A引導物
藉由評定HLA-A細胞表面表現之損失來篩選HLA-A引導RNA在T細胞中之功效。在藉由mRNA遞送進行HLA-A編輯之後，藉由流動式細胞測量術分析HLA-A2背景中對於HLA-A蛋白質呈陰性的T細胞之百分比(「% HLA-A2-」)。 3.1.  T細胞之mRNA電穿孔
使用如下所提供之編碼Cas9之mRNA (SEQ ID NO: 802)、編碼BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 806)或編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 807)之電穿孔來評定Cas9及BC22n編輯活性。在解凍之後，將Pan CD3+ T細胞(StemCell, HLA-A*02.01/ A*02.01)以1× 10 6個細胞/毫升之密度在由CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Thermofisher，目錄號A3705001)構成之TCGM中塗鋪，其補充有5%人類AB血清(Gemini，目錄號100-512)、1× GlutaMAX (Thermofisher，目錄號35050061)、10 mM HEPES (Thermofisher，目錄號15630080)、1×青黴素-鏈黴素，進一步補充有200 U/mL IL-2 (Peprotech，目錄號200-02)、10 ng/ml IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、10 ng/ml IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。細胞在mRNA電穿孔之前在37℃下在T細胞RPMI培養基中擴增72小時。
自其儲存板移除HLA-A sgRNA且在95℃下變性2分鐘，隨後在室溫下培育5分鐘。用P3緩衝液(Lonza)中之100,000個T細胞、200 ng編碼UGI之mRNA、200 ng編碼BC22n之mRNA及20 pmole sgRNA來製備BC22n電穿孔混合物。用P3緩衝液(Lonza)中之100,000個T細胞、200 ng編碼UGI之mRNA、200 ng編碼Cas9之mRNA及20 pmole sgRNA來製備Cas9電穿孔混合物。將每種混合物轉移至Lonza shuttle 96孔電穿孔板之對應孔中。使用Lonza shuttle 96w，使用製造商之脈衝碼對細胞重複兩次電穿孔。電穿孔後立即在無細胞介素之預溫熱TCGM中回收細胞且在37℃下培育15分鐘。經電穿孔之T細胞隨後在進一步補充有200 U/mL IL-2 (Peprotech，目錄號200-02)、10 ng/ml IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、10 ng/ml IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)之TCGM中培養且在編輯後8天收集用於流動式細胞測量術。 3.2. 流動式細胞測量術
編輯後第8天，藉由流動式細胞測量術對T細胞進行表型分型以測定HLA-A蛋白表現。簡言之，將T細胞與靶向HLA-A2之抗體(eBioscience目錄號17-9876-42)一起培育。隨後洗滌細胞，在Cytoflex流動式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo套裝軟體進行分析。基於大小、形狀、生存力及HLA-A2表現對T細胞進行閘控。表8展示在用BC22n或Cas9對HLA-A進行基因體編輯之後對於HLA-A表面蛋白呈陰性之細胞的百分比。
表 8- 在用 BC22n 或 Cas9 對 HLA-A 進行 基因體編輯之後對於 HLA-A 表面蛋白呈陰性之細胞的百分比。
BC22n Cas9
Intellia ID 平均A2-% SD A2-% 平均A2-% SD A2-%
G018932 20.15 2.76 43.30 1.70
G018933 10.35 1.20 74.00 0.57
G018934 0.50 0.14 15.30 1.56
G018935 0.00 0.00 69.30 0.28
G018936 0.10 0.00 29.65 2.62
G018937 0.15 0.07 50.50 0.71
G018938 0.00 0.00 0.00 0.00
G018939 0.00 0.00 44.90 1.27
G018940 0.00 0.00 12.00 0.42
G018941 0.00 0.00 2.65 0.35
G018942 0.10 0.00 2.15 0.07
G018943 0.00 0.00 16.20 0.42
G018944 0.00 0.00 3.00 0.28
G018945 0.05 0.07 3.20 0.42
G018946 0.00 0.00 2.30 0.14
G018947 0.00 0.00 1.55 0.49
G018949 0.00 0.00 47.10 0.57
G018950 0.00 0.00 0.30 0.00
G018951 0.00 0.00 13.30 0.28
G018952 0.00 0.00 0.50 0.00
G018953 0.00 0.00 3.65 0.64
G018955 0.20 0.14 5.20 0.28
G018958 0.00 0.00 1.30 0.28
G018959 0.00 0.00 3.70 0.14
G018960 0.00 0.00 0.35 0.07
G018961 0.00 0.00 0.40 0.00
G018962 0.00 0.00 2.90 0.42
G018963 0.00 0.00 12.50 0.14
G018964 0.00 0.00 6.45 0.64
G018965 0.00 0.00 0.90 0.00
G018966 0.00 0.00 1.30 0.14
G018968 0.10 0.00 0.10 0.00
G018969 0.00 0.00 0.80 0.14
G018970 0.00 0.00 0.95 0.07
G018971 0.00 0.00 0.10 0.00
G018972 0.05 0.07 3.40 0.28
G018973 0.00 0.00 1.35 0.07
G018974 0.00 0.00 0.45 0.07
G018976 0.05 0.07 2.45 0.07
G018977 0.00 0.00 12.45 1.06
G018978 0.00 0.00 1.75 0.07
G018979 0.05 0.07 37.40 0.71
G018980 0.05 0.07 32.40 2.40
G018981 0.00 0.00 17.45 0.35
G018982 0.00 0.00 26.35 0.92
G018983 0.00 0.00 0.25 0.07
G018984 0.00 0.00 0.65 0.07
G018986 0.00 0.00 1.85 0.21
G018987 0.00 0.00 2.25 0.07
G018988 0.00 0.00 0.15 0.07
G018989 0.00 0.00 1.85 0.07
G018990 0.25 0.07 17.45 1.06
G018991 0.20 0.00 23.15 0.92
G018992 0.20 0.14 38.15 0.07
G018993 0.15 0.07 12.15 1.34
G018994 4.35 0.35 23.75 0.49
G018995 0.55 0.07 94.27 0.30
G018996 0.85 0.07 92.39 0.83
G018997 97.80 0.08 95.03 1.87
G018998 74.75 7.71 93.33 0.18
G018999 98.26 0.30 96.05 2.27
G019000 9.05 0.35 94.67 0.74
G019001 0.05 0.07 4.05 0.64
G019002 0.00 0.00 0.05 0.07
G019003 0.00 0.00 11.10 0.00
G019004 0.00 0.00 30.70 0.00
G019005 0.00 0.00 1.65 0.35
G019006 0.00 0.00 4.75 0.49
G019007 0.00 0.00 5.35 0.78
G019008 0.00 0.00 55.20 3.54
G019009 0.00 0.00 19.55 2.19
G019010 0.05 0.07 5.40 0.14
G019011 0.00 0.00 4.40 0.85
G019012 0.05 0.07 22.90 2.55
G019013 0.00 0.00 30.60 2.40
G019014 0.05 0.07 14.65 0.49
G019015 0.00 0.00 44.70 1.70
G019016 0.00 0.00 13.95 0.35
G019017 0.00 0.00 2.35 0.35
G019018 0.00 0.00 19.90 0.00
G019019 0.00 0.00 3.20 0.14
G021205 0.00 0.00 0.00 0.00
G021206 0.00 0.00 4.10 0.28
G021207 0.00 0.00 2.80 0.28
G021208 84.75 2.05 58.50 0.28
G021209 97.96 0.16 83.35 1.77
G021210 71.45 2.90 75.20 1.70
G021211 0.10 0.00 67.80 1.70
實例4：NK細胞功能性殺死分析
測試以各種組合編輯以破壞CIITA、HLA-A或B2M或過度表現HLA-E之T細胞的抵抗自然殺手(NK)細胞介導之殺死的能力。 4.1. 工程化T細胞及純化
解凍後，將Pan CD3+ T(StemCell，HLA-A*02.01/A*03.01)細胞以0.5×10 6個細胞/毫升之密度在由RPMI 1640(Invitrogen, 目錄號22400-089)構成的T細胞RPMI培養基中塗鋪，該培養基含有5%(v/v)之胎牛血清、1×Glutamax(Gibco, 目錄號35050-061)、50 µM  2-巰基乙醇、100 μM非必需胺基酸(Invitrogen，目錄號11140-050)、1 mM丙酮酸鈉、10 mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈黴素及100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)。用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)活化T細胞。
如 表 9中所描述，活化後一天，T細胞經編輯以破壞B2M基因。簡言之，如 實例 1中所述調配含有Cas9 mRNA及靶向B2M之sgRNA G000529(SEQ ID NO: 245)的LNP組合物。LNP組合物在37℃下在補充有1 μg/ml重組人類ApoE3(Peprotech，目錄號350-02)之如上文所述具有細胞介素的基於RPMI之培養基中培育15分鐘。將LNP混合物添加至兩百萬經活化T細胞中，得到2.5 μg總LNP/mL之最終濃度。
表 9- 依序編輯及病毒轉導之次序
條件 第 1 天 第 2 天 第 3 天
未經編輯         
B2M - B2M LNP      
B2M -+ HLA-E B2M LNP    HLA-E慢病毒
HLA-A -MHC II -    CIITA LNP HLA-A LNP
HLA-A -       HLA-A LNP
活化後兩天，用LNP組合物編輯額外T細胞以破壞CIITA基因。如對於B2M編輯所述，使用含有Cas9 mRNA及靶向CIITA之sgRNA G013675(SEQ ID NO: 246)的LNP組合物進行此舉。用於此步驟之LNP組合物以莫耳比分別為50:38.5:10:1.5之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。
活化後三天，將所有經編輯及未經編輯之細胞再懸浮於無TransAct之新鮮培養基中。藉由在37℃下在1000 g下離心1小時以自EF1a啟動子(SEQ ID No. 1000)表現HLA-E之慢病毒來轉導B2M編輯之T細胞樣品，MOI為10。CIITA編輯之T細胞樣品進一步用LNP組合物編輯以破壞HLA-A基因。如上文針對B2M編輯所述使用含有Cas9 mRNA及靶向HLA-A之sgRNA G019000之LNP組合物進行編輯，該等LNP組合物分別以50: 38.5: 10: 1.5的莫耳比用脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。活化後四天，將所有細胞轉移至GREX板中(Wilson Wolf，目錄號80240M)用於擴增。
活化後七天，根據製造商的方案，使用生物素化抗HLA-E抗體(Biolegend)及抗生物素微珠(Miltenyi Biotec, 目錄號130-090-485)及磁性LS管柱(Miltenyi Biotec，目錄號130-042-401)針對HLA-E表現選擇經HLA-E感染之T細胞。
類似地，活化後九天，根據製造商的方案使用生物素化抗HLA II類抗體(Miltenyi, 目錄號130-104-823)、抗生物素微珠(Miltenyi Biotec,目錄號130-090-485)及磁性LS管柱(Miltenyi Biotec，目錄號130-042-401)，CIITA編輯之T細胞因缺乏MHC II表現而陰性選擇。 4.2 流動式細胞測量術
分析NK細胞介導之針對工程化T細胞的細胞毒性。為此，T細胞與HLA-B/C匹配的CTV標記NK細胞以10: 1、5: 1、2.5: 1、1.25: 1及0.625: 1之效應物:目標比率(E: T)共培養21小時。細胞用7AAD(BD Pharmingen，目錄號559925)染色，在Cytoflex流動式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo套裝軟體分析。基於CTV陰性、大小、及形狀與生存力對T細胞進行閘控。 表 10及 圖 2展示在NK細胞攻擊之後T細胞溶解之百分比。
表 10-NK 細胞攻擊工程化 T 細胞後之 T 細胞溶解百分比
Log(E:T) 未經編輯 HLA-A - HLA-A -MHC II - B2M - B2M -+ HLA-E n
平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD
Basal 12.0 1.9 15.5 0.2 8.2 0.4 11.1 0.1 18.1 2.5 2
-0.20 15.1 0.0 16.0 0.5 11.2 0.8 32.6 1.6 25.0 0.9 2
0.10 14.5 0.2 15.6 0.4 10.6 0.1 44.7 2.3 29.4 0.1 2
0.40 12.8 0.6 13.6 0.4 9.3 0.1 66.0 1.8 39.3 0.1 2
0.70 10.4 0.4 11.9 0.2 9.2 0.4 71.2 1.3 51.9 1.6 2
1.00 8.4 0.1 9.4 0.6 7.6 0.1 62.8 0.6 51.7 2.8 2
實例5：最佳HLA-A引導物之LNP劑量反應曲線 5.1  T細胞製備
將自白血球採集物(Hemacare)分離之經冷凍保存CD8/CD4+選擇的T細胞解凍且以1.5×10 6個細胞/毫升在由CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Thermofisher，目錄號A3705001)構成之T細胞生長培養基(TCGM)中靜置隔夜，該生長培養基補充有5%人類AB血清(Gemini，目錄號100-512)、1× GlutaMAX (Thermofisher，目錄號35050061)、10 mM HEPES (Thermofisher，目錄號15630080)、200 U/mL IL-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/ml IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/ml IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。
使用1: 50稀釋之T細胞TransAct TM(Miltenyi，目錄號130-111-160)活化T細胞且在37℃培育箱中培育48小時。在培育之後，細胞在Vi-cell上計數且再懸浮於如上文所描述但具有2.5%血清之TCGM中，直至0.5×10 6個細胞/毫升之最終濃度。24小時後，細胞在Vi-cell上計數，再懸浮於5%血清TCGM中且轉移至96孔板。同時，將APOE(Peprotech, 目錄號350-02)添加至無血清TCGM中，最終濃度10 µg/ml，且與滴定LNP總RNA濃度(10 µg/mL、5 µg/ml、2.5 µg/ml、1.25 µg/ml、0.625 µg/ml、0.3125 µg/ml、0.15625 µg/ml及0.078125 µg/ml)之不同HLA-A LNP組合物(參見表11)一起培育15分鐘。LNP組合物含有編碼Cas9之mRNA(SEQ ID NO: 802)及如表11中指定之引導物且分別用50: 39.5: 9: 1.5莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。在與APOE一起培育之後，以1: 1比率將LNP懸浮液添加至T細胞中且在37℃下培育24小時。在24小時之後，細胞在Vi-cell上計數且以1: 5比率分裂且培養96小時。在培育之後，獲取0.1-0.5×10 6個細胞之等分試樣用於流動式細胞測量術分析。 5.2 流動式細胞測量術
對於流動式細胞測量分析，將細胞在FACS緩衝液(PBS+2% FBS+2 mM EDTA)中洗滌且在4℃下與1: 200稀釋之APC結合之抗人類HLA-A2抗體(Biolegend®，343308)及PC5.5結合之CD3抗體(Biolegend®，目錄號317336)一起培育30分鐘。在培育之後，洗滌細胞，再懸浮於FACS緩衝液中且藉由流動式細胞測量術例如使用Beckman Coulter CytoflexS來處理，且使用FlowJo套裝軟體進行分析。 表 12及 圖 1A 至 1B展示在各LNP劑量下之編輯百分比。
表 11 HLA-A 靶向引導物之最大插入 / 缺失 % 及 EC50
sgRNA 最大值 EC50
G018933 90.71 0.3043
G018935 89.04 0.3906
G018954 87.68 0.5089
G018995 98.99 0.1665
G018996 98.61 0.2085
G018997 99.12 0.2196
G018998 98.64 0.2914
G018999 98.74 0.1724
G019000 98.61 0.1945
G019008 75.53 0.3322
G013006 TRAC      
G018091 CIITA 1.017 0.8941
表 12 在用各種引導物編輯之後的 HLA-A- 細胞百分比。
sgRNA LNP 濃度 (μg 總 RNA/ml) 平均HLA-A-% SD n
G018933 5 91.45 0.35 2
G018933 2.5 88.8 1.27 2
G018933 1.25 86.55 0.35 2
G018933 0.63 75 0.14 2
G018933 0.31 47 0.00 2
G018933 0.16 17.55 0.35 2
G018933 0.08 5.115 0.28 2
G018935 5 89.75 1.34 2
G018935 2.5 86.8 0.28 2
G018935 1.25 81.8 0.99 2
G018935 0.63 66.8 4.81 2
G018935 0.31 33.55 4.17 2
G018935 0.16 11.91 2.96 2
G018935 0.08 3.01 1.09 2
G018954 5 86.5 86.4 2
G018954 2.5 86 84 2
G018954 1.25 82 75 2
G018954 0.63 50.5 54.5 2
G018954 0.31 24.8 23 2
G018954 0.16 7.31 6.2 2
G018954 0.08 2.09 1.78 2
G018995 5 98.5 0.3 2
G018995 2.5 98.8 0.1 2
G018995 1.25 98.55 0.35 2
G018995 0.63 96 0 2
G018995 0.31 82.25 1.25 2
G018995 0.16 49.25 0.55 2
G018995 0.08 19 0.3 2
G018996 5 98.25 0.21 2
G018996 2.5 97.75 0.64 2
G018996 1.25 98.2 0.71 2
G018996 0.63 92.75 0.49 2
G018996 0.31 72.7 1.41 2
G018996 0.16 36.8 3.82 2
G018996 0.08 13.5 1.13 2
G018997 5 98.8 0.1 2
G018997 2.5 98.75 0.05 2
G018997 1.25 97.8 0.3 2
G018997 0.63 95.8 1.6 2
G018997 0.31 73.45 0.15 2
G018997 0.16 35.65 0.25 2
G018997 0.08 14.65 0.15 2
G018998 5 98.35 0.15 2
G018998 2.5 97.65 0.15 2
G018998 1.25 97.05 0.45 2
G018998 0.63 89.6 1.4 2
G018998 0.31 55.8 0.4 2
G018998 0.16 22.6 0.8 2
G018998 0.08 8.55 0.09 2
G018999 5 98.45 0.35 2
G018999 2.5 98.5 0.3 2
G018999 1.25 98.05 0.55 2
G018999 0.63 97.1 0.1 2
G018999 0.31 84 0.4 2
G018999 0.16 51.95 0.25 2
G018999 0.08 24.7 0.4 2
G019000 5 97.9 0 2
G019000 2.5 98.5 0.1 2
G019000 1.25 97.2 0.6 2
G019000 0.63 96.05 0.35 2
G019000 0.31 77 0.6 2
G019000 0.16 43.7 1.1 2
G019000 0.08 19.1 0.2 2
G019008 5 73.35 1.20 2
G019008 2.5 77.35 0.78 2
G019008 1.25 71.25 2.19 2
G019008 0.63 60.3 1.84 2
G019008 0.31 35.65 2.19 2
G019008 0.16 11.6 0.71 2
G019008 0.08 3.17 0.41 2
G018091 5 0.99 0.29 2
G018091 2.5 1.00 0.52 2
G018091 1.25 1.12 1.10 2
G018091 0.63 0.64 0.02 2
G018091 0.31 0.44 0.02 2
G018091 0.16 1.22 0.52 2
G018091 0.08 0.35 0.16 2
G013006 5 0.51 0.28 2
G013006 2.5 0.71 0.1 2
G013006 1.25 1.13 0.315 2
G013006 0.63 0.69 0.02 2
G013006 0.31 0.36 0.015 2
G013006 0.16 0.82 0.19 2
G013006 0.08 0.7 0.02 2
實例6：藉由依序LNP遞送來多重編輯WT1 T細胞
T細胞經一系列基因破壞及插入進行工程化。健康供體細胞依序用四種LNP組合物處理，各LNP以編碼Cas9之mRNA及靶向TRAC(G013006) (SEQ ID NO: 243)、TRBC(G016239) (SEQ ID NO: 247)、CIITA(G013676) (SEQ ID NO: 248)或HLA-A(G018995) (包含如表2中所示之SEQ ID NO: 13的sgRNA)之sgRNA共同調配。LNP組合物以莫耳比分別為50:38.5:10:1.5之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。靶向威爾姆氏腫瘤抗原之轉殖基因T細胞受體(WT1 TCR) (SEQ ID NO: 1001)係藉由使用AAV遞送同源定向修復模板而整合至TRAC切割位點中。 6.1. T 細胞製備
T細胞係自三個健康HLA-A2+供體之白細胞去除術產物(STEMCELL Technologies)分離得到。使用EasySep人類T細胞分離套組(STEMCELL Technologies，目錄號17951)遵循製造商之方案分離T細胞且使用Cryostor CS10 (STEMCELL Technologies，目錄號07930)冷凍保存。在開始T細胞編輯之前一天，細胞經解凍且在T細胞活化培養基(TCAM)：CTS OpTmizer (Thermofisher，目錄號A3705001)中靜置隔夜，該培養基補充有2.5%人類AB血清(Gemini，目錄號100-512)、1× GlutaMAX (Thermofisher，目錄號35050061)、10 mM HEPES (Thermofisher，目錄號15630080)、200 U/mL IL-2 (Peprotech，目錄號200-02)、IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。 6.2. T 細胞之 LNP 處理及擴增
每日在含ApoE之培養基中製備LNP組合物且遞送至T細胞中，如 表 13及下文中所述。
表 13-T 細胞工程化之編輯次序
組 第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天
1 未經編輯 未經編輯 未經編輯 未經編輯
2 TRBC CIITA TRAC HLA-A
3 TRBC HLA-A TRAC CIITA
4 TRBC    TRAC   
在第1天，如 表 13中所指示之LNP組合物在含有5 μg/mL rhApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之TCAM中以5 μg/mL之濃度培育。同時，T細胞經採集，洗滌，且以2×10 6個細胞/毫升之密度再懸浮於具有1:50稀釋之T細胞TransAct，人類試劑(Miltenyi，目錄號130-111-160)的TCAM中。T細胞及LNP-ApoE培養基以1:1比率混合且在培養瓶中塗鋪T細胞隔夜。
在第1天，如 表 13中所指示之LNP組合物在含有20 μg/mL rhApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之TCAM中以25 μg/mL之濃度培育。接著將LNP-ApoE溶液以1:10比率添加至適當培養物中。
在第3天，TRAC-LNP組合物在含有10 μg/mL rhApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之TCAM中以5 μg/mL之濃度培育。T細胞經採集，洗滌，且以1×10 6個細胞/毫升之密度再懸浮於TCAM中。T細胞及LNP-ApoE培養基以1:1比率混合且在培養瓶中塗鋪T細胞。接著將WT1 AAV以3×10 5個基因體複本/細胞之MOI添加至各組。
在第4天，如 表 13中所指示之LNP組合物在含有5 μg/mL rhApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之TCAM中以5 μg/mL之濃度培育。接著將LNP-ApoE溶液以1:1比率添加至適當培養物中。
在第5-11天：將T細胞轉移至24孔GREX板(Wilson Wolf，目錄號80192)之T細胞擴增培養基(TCEM)：CTS OpTmizer (Thermofisher，目錄號A3705001)，該培養基補充有5% CTS免疫細胞血清替代物(Thermofisher，目錄號A2596101)、1× GlutaMAX (Thermofisher，目錄號35050061)、10 mM HEPES (Thermofisher，目錄號15630080)、200 U/mL IL-2 (Peprotech，目錄號200-02)、IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)及IL-15 (Peprotech, 目錄號200-15)。根據製造商之方案擴增細胞。將T細胞擴增6天，每隔一天更換培養基。細胞係使用Vi-CELL細胞計數器(Beckman Coulter)來計數且藉由細胞產率除以起始物質來計算擴增倍數，如 表 14中所示。
表 14- 多重編輯 T 細胞工程化之後的擴增倍數
組 供體A 供體 B 供體 C 平均值 SD
1 331.40 362.24 533.18 408.94 108.69
2 61.82 72.15 116.13 83.37 28.84
3 64.08 76.29 157.75 99.37 50.92
4 無資料 146.78 331.67 239.22 130.74
6.3. 藉由流動式細胞測量術及 NGS 定量 T 細胞編輯
擴增後，藉由流動式細胞測量術分析經編輯T細胞以測定HLA-A2表現(HLA-A +)、減弱CIITA之後的HLA-DR-DP-DQ表現(MHC II +)、WT1-TCR表現(CD3 +Vb8 +)及殘餘內源性TCR表現(CD3 +Vb8 -)或錯配TCR表現(CD3 +Vb8 低)。將T細胞與靶向以下分子之抗體混合液一起培育：CD4 (Biolegend，目錄號300524)、CD8 (Biolegend，目錄號301045)、Vb8 (Biolegend，目錄號348106)、CD3 (Biolegend，目錄號300327)、HLA-A2 (Biolegend，目錄號343306)、HLA-DRDPDQ (Biolegend、Cat 361706)、CD62L (Biolegend，目錄號304844)、CD45RO (Biolegend，目錄號304230)。隨後洗滌細胞，在Cytoflex LX儀器(Beckman Coulter)上使用FlowJo套裝軟體進行分析。根據大小及CD4/CD8狀態對T細胞進行閘控，隨後測定編輯及插入標記之表現。依序T細胞工程化之後表現相關細胞表面蛋白之細胞的百分比展示於 表 15及 圖 3A 至 3F中(針對CD8 +T細胞)以及 表 16及 圖 4A 至 4F中(針對CD4 +T細胞)。經完全編輯CD4 +或CD8 +T細胞之百分比閘控為CD3 +Vb8 +HLA-A -MHC II -%。在經編輯樣品中觀測到高含量之HLA-A及MHC II減弱，以及WT1-TCR插入及內源性TCR KO。除流動式細胞測量術分析以外，如 實例 1中所述地製備基因體DNA且進行NGS分析，以測定各目標位點處之編輯率。 表 17及 圖 5A 至 5D展示CIITA、HLA-A及TRBC1/2基因座處編輯百分比的結果，其中跨組之模式與藉由流動式細胞測量術所鑑別的一致。在所有組中，TRBC1/2基因座經編輯至＞90-95%。
表 15: 在依序 T 細胞工程化之後具有細胞表面表型之 CD8+ 細胞的百分比
供體 組 HLA-A I +% MHC II +% WT1 TCR% 錯配TCR% 殘餘內源性 TCR% 經完全編輯%
HLA-A2 + HLA-DR-DP-DQ + CD3 +Vb8 + CD3 +Vb8 低 CD3 +Vb8 - CD3 +Vb8 +HLA-A2 -HLA-DR-DP-DQ -
A 1 未經編輯 100.0 60.9 6.7 0.8 93.2 0.0
B 99.7 71.0 3.4 0.6 96.1 0.2
C 99.7 52.2 5.7 0.8 94.0 0.0
A 2 2.7 1.2 68.9 1.3 0.4 66.7
B 1.3 21.0 50.4 3.1 4.5 43.3
C 1.8 2.9 62.2 2.6 2.7 60.3
A 3 1.3 0.8 66.0 1.4 0.3 64.4
B 1.4 2.2 56.8 2.2 2.0 55.1
C 1.2 5.7 63.3 1.0 0.9 60.6
B 4 99.8 64.8 62.3 2.0 2.5 0.1
C 99.0 51.5 71.0 1.0 0.5 0.4
表 16 ： 在依序 T 細胞工程化之後具有細胞表面表型之 CD4+ 細胞的百分比
HLA-A I +% MHC II +% WT1 TCR% 錯配TCR% 殘餘內源性 TCR% 經完全編輯%
供體 組 HLA-A2 + HLA-DR-DP-DQ + CD3 +Vb8 + CD3 +Vb8 低 CD3 +Vb8 - CD3 +Vb8 +HLA-A2 -HLA-DR-DP-DQ -
A 1 未經編輯 100.0 36.3 5.4 0.4 94.5 0.0
B 98.7 27.6 5.6 0.4 94.3 0.0
C 99.3 32.3 6.2 0.3 93.6 0.1
A 2 2.6 0.7 62.4 2.4 1.1 60.9
B 1.8 0.5 59.7 2.2 1.0 58.5
C 1.7 3.2 58.6 1.6 1.8 55.8
A 3 1.3 0.8 63.0 3.4 0.8 61.7
B 1.1 1.1 61.8 2.6 0.9 60.6
C 1.1 0.4 60.9 1.7 1.0 59.9
B 4 99.5 25.1 61.9 1.9 5.2 0.1
C 97.9 40.1 69.5 4.7 1.9 0.8
表 17 ： 在依序 T 細胞編輯之後 CIITA 、 HLA-A 、 TRBC1 及 TRBC2 處之插入 / 缺失百分比
CIITA (G013676) HLA-A (G018995) TRBC1 (G016239 ) TRBC2 (G016239 )
組 供體A 供體B 供體C 供體A 供體B 供體C 供體A 供體B 供體C 供體A 供體B 供體C
1 0.2 0.2 0.2 6.9 3.3 2.3 0.1 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3
2 98.2 81.8 93.8 94.1 90.2 90.6 97.6 89.9 91.4 98.7 86.8 94.9
3 98.9 98.1 98.9 97.2 86.4 93.1 98.6 94.4 94.7 98.6 94.2 96.6
4 0.1 0.2 0.6 7.6 2.7 3.2 98.9 94 95 98.6 93.2 97.4
實例7：HLA-A人類引導物之脫靶分析
對藉由靶向HLA-A之Cas9裂解的潛在脫靶基因體位點進行篩選。(參見例如Cameron等人,Nature Methods. 6, 600-606; 2017)。在此實驗中，使用自淋巴母細胞細胞株NA24385 (Coriell Institute)純化之基因體DNA篩選10種靶向人類HLA-A之sgRNA及三種具有已知脫靶概況的靶向EMX1、VEGFA及RAG1B之對照引導物。在生物化學分析中使用如表18中所示192 nM sgRNA及64 nM RNP之濃度的sgRNA偵測潛在脫靶位點數目。該分析鑑別用於所測試之sgRNA之潛在脫靶位點。
表 18 . 脫靶分析
gRNA ID 目標 引導序列(SEQ ID NO:) 脫靶位點計數
G018995 HLA-A ACAGCGACGCCGCGAGCCAG (SEQ ID NO: 13) 17
G018996 HLA-A CGACGCCGCGAGCCAGAGGA (SEQ ID NO: 14) 48
G018997 HLA-A CGAGCCAGAGGAUGGAGCCG (SEQ ID NO: 15) 1299
G018998 HLA-A CGGCUCCAUCCUCUGGCUCG (SEQ ID NO: 16) 250
G018999 HLA-A GAGCCAGAGGAUGGAGCCGC (SEQ ID NO: 17) 733
G019000 HLA-A GCGCCCGCGGCUCCAUCCUC (SEQ ID NO: 18) 386
G018933 HLA-A GCACGGGUACCAGGGGCCAC (SEQ ID NO: 41) 865
G018935 HLA-A GGGAGGCGCCCCGUGGCCCC (SEQ ID NO: 43) 258
G019008 HLA-A GCAAGGGUCUCGGGGUCCCG (SEQ ID NO: 26) 324
G018954 HLA-A UUGAGAAUGGACAGGACACC (SEQ ID NO: 62) 227
G000644 EMX1 GAGUCCGAGCAGAAGAAGAA (SEQ ID NO: 230) 253
G000645 VEGFA GACCCCCUCCACCCCGCCUC (SEQ ID NO: 231) 3856
G000646 RAG1B GACUUGUUUUCAUUGUUCUC (SEQ ID NO: 232) 62
在諸如在上文中使用之生物化學方法之已知脫靶偵測分析中，典型地藉由設計來恢復大量潛在脫靶位點以便為可在其他情形下，例如在所關注之初生細胞中驗證之潛在位點「廣泛撒網」。舉例而言，生物化學方法典型地高估潛在脫靶位點之數目，因為分析利用不含細胞環境之經純化之高分子量基因體DNA且視所使用之Cas9 RNP之劑量而定。因此，藉由此等方法識別之潛在脫靶位點可使用所識別之潛在脫靶位點之靶向定序來驗證。 實例 8 ： NK 細胞活體內殺死小鼠模型中之 HLA-A 及 CIITA 部分匹配
給雌性NOG-hIL-15小鼠移植1.5×10 6個初生NK細胞，隨後在4週後注射含有螢光素酶+/-HLA-A、CIITA或HLA-A/CIITA KO之工程化T細胞，以確定1)移植之NK細胞是否可容易溶解對照T細胞(B2M -/-)，及2)添加部分匹配編輯(HLA-A或CIITA)是否為NK細胞活體內溶解T細胞提供保護效應。 18.1. 製備含有螢光素酶 +/-HLA-A 、 CIITA 或 HLA-A/CIITA KO 之 T 細胞
T細胞自具有以下MHC I表型之健康人類供體的周邊血液分離：HLA-A*02：01: 01G、03: 01: 01G、HLA-B*07: 02: 01G、HLA-C*07: 02: 01G。簡言之，在氯化銨RBC溶解緩衝液(Stemcell Technologies；目錄號07800)中處理白細胞去除包(Stemcell Technologies)15分鐘以溶解紅血球。外周血單核細胞(PBMC)計數在溶解後測定，且根據製造商之方案使用EasySep人類T細胞分離套組(Stemcell Technologies，目錄號17951)進行T細胞分離。將分離之CD3+ T細胞再懸浮於Cryostor CS10培養基(Stemcell Technologies，目錄號07930)中且在液氮中冷凍，直至進一步使用。
冷凍的T細胞以1×10 6個細胞/毫升之細胞濃度解凍於由OpTmizer TCGM構成的T細胞生長培養基(TCGM)中，該培養基如實例3中所描述且進一步補充有100 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/mL IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。在37℃下使用1: 100稀釋之T細胞TransAct TM(Miltenyi Biotec，目錄號130-111-160)將細胞活化24小時。
活化後24小時，500 μl無細胞介素之新鮮TCGM中的1×10 6個T細胞在37℃下藉由150 μl螢光素酶慢病毒(Imanis Life Sciences, 目錄號LV050L)在1000xG下離心60分鐘而轉導。經轉導細胞在37℃下在24孔G-Rex板(Wilson Wolf, 目錄號80192M)中具有細胞介素之TCGM中擴增持續24小時。
活化後48小時，編輯經螢光素酶LV感染之T細胞以破壞B2M或HLA-A基因。簡言之，分別以50: 38.5: 10: 1.5莫耳比用脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配含有編碼cas9之mRNA(SEQ ID NO: 802)及靶向HLA-A之sgRNA G019000(SEQ ID NO: 18)的LNP組合物。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。如實例1中所述調配含有Cas9 mRNA及靶向B2M之sgRNA G000529(SEQ ID NO: 245)的LNP組合物。LNP組合物在37℃下在進一步補充有1 μg/ml重組人類ApoE3(Peprotech，目錄號350-02)的無血清或細胞介素之Optmizer TCGM中培育15分鐘。T細胞經洗滌且懸浮於具有細胞介素之TCGM中。將經預培育之LNP及T細胞混合以在具有5%人類AB血清、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)，5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)，5 ng/ml IL-15(Peprotech，目錄號200-15)的TCGM中產生0.5×10 6個T細胞/毫升及2.5 µg總RNA/毫升之LNP的最終濃度。用含有ApoE3但無LNP組合物之培養基模擬編輯另一組細胞。所有細胞在37℃下培育24小時。
活化後72小時，細胞經編輯以破壞CIITA，且在螢光素酶及HLA-A編輯之細胞或單獨的螢光素酶細胞上投與LNP。簡言之，細胞用如針對HLA-A編輯所述之含有Cas9 mRNA及sgRNA G013675(SEQ ID NO: 246)之LNP組合物轉導。靶向CIITA之LNP組合物以莫耳比分別為50:38.5:10:1.5之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。活化後96小時，洗滌細胞且轉移至24孔G-Rex。每2天更換具有新鮮細胞介素之培養基。活化後第15天，使用BD FACS Aria Flow Sorter在GFP+細胞上分選經編輯T細胞以富集表現螢光素酶之細胞。對於B2M KO螢光素酶組，在GFP +及MHC-I -上分選細胞。經分選細胞在具有細胞介素之TCGM培養基中在37℃培育箱中靜置隔夜。次日，T細胞用1: 100稀釋之T細胞TransAct TM再刺激24小時。再刺激後24小時，洗掉TransAct且將T細胞在G-Rex板中培養且保持15天，其中培養基及細胞介素定期更換。
再刺激後15天，如 實例 4中活體外分析NK細胞介導之針對工程化T細胞之細胞毒性，但有以下例外。使用具有100 µl /ml IL-2之OpTmizer TCGM進行分析。T細胞與HLA-B/C匹配的CTV標記之NK細胞以10: 1、5: 1、2.5: 1、1.25: 1及0.625: 1之效應物:目標比率(E: T)共培養隔夜。細胞與BrightGlo螢光素酶試劑(普洛麥格，目錄號E2620)一起培育且在ClarioStar中在CellTiter Glo程式上進行處理以基於螢光素酶信號測定NK細胞對T細胞之溶解。 表 19及 圖 6A展示在NK細胞攻擊之後T細胞溶解之百分比。活體外，B2M編輯細胞展示對NK殺死之敏感性，而HLA-A編輯、CIITA編輯及HLA-A,CIITA雙重編輯細胞展示對NK介導之溶解的保護作用。
表 19- 在 NK 細胞攻擊之後經螢光素酶轉導之 T 細胞之溶解百分比
無編輯 HLA-A KO CIITA KO HLA-A KO, CIITA KO B2M KO
E:T 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD 平均值 SD n
10 19.22 3.16 28.55 1.02 22.96 3.59 22.22 3.15 68.09 0.11 2
5 13.04 1.71 27.18 4.35 22.85 6.93 13.78 4.55 53.87 3.30 2
2.5 1.56 1.35 26.56 3.75 26.59 2.44 21.32 0.72 39.46 7.05 2
1.25 -0.26 1.94 19.78 3.24 19.91 5.38 12.86 0.54 25.79 7.96 2
0.625 8.67 6.81 25.44 0.23 18.32 4.28 19.80 7.20 29.31 2.67 2
0.3125 2.96 7.66 22.40 0.83 19.13 1.34 13.34 2.48 9.32 0.84 2
8.2. 保護 HLA-A 及 CIITA 雙重基因剔除 T 細胞免於 NK 殺死
對於活體內研究，藉由此項技術中已知之方法自白血球採集物分離之NK細胞用HBSS(Gibco, 目錄號14025-092)洗滌且以10×10 6個細胞/毫升再懸浮，用於注射到150 µL HBSS中。22隻雌性NOG-hIL-15小鼠(Taconic)藉由尾部靜脈注射1.5×10 6個分離之NK細胞給藥。另外27隻雌性NOG-hIL-15充當未NK注射之對照。
NK細胞注射之後28天，小鼠注射如 表 19中所描述之未經編輯或工程化T細胞。簡言之，在第二次活化後16天，在於PBS中洗滌且以6×10 6個細胞/150 µL之濃度再懸浮於HBSS溶液中之後，注射工程化T細胞。
進行活小鼠之IVIS成像以藉由IVIS光譜鑑別螢光素酶陽性T細胞。在T細胞注射之後6小時、24小時、48小時、8天、13天、18天及27天進行IVIS成像。根據製造商之建議，藉由以10 µL/g體重，每隻動物約150 µL腹膜內注射D-螢光素使小鼠準備進行成像。動物經麻醉且接著置於IVIS成像單元中。可視化係在曝光時間設定為自動、視野D、中等分格及F/stop設定為1之情況下進行。 表 20及 圖 6A展示在注射後不同時間點存在之表現螢光素酶之T細胞的輻射輝度(光子/s/cm2/sr)。 圖 6B展示27天後存在於不同小鼠組中之表現螢光素酶之T細胞的輻射輝度(光子/s/cm2/sr)。活體內，B2M編輯細胞展示對NK殺死之敏感性，而HLA-A編輯、CIITA編輯及HLA-A,CIITA雙重編輯細胞展示對NK介導之溶解作用的保護。出乎意料地，即使在三種高度多形性MHC I類蛋白之一(HLA-A)減少之後，細胞仍受保護免於NK介導之排斥。
表 20- 在 T 細胞注射之後 ， 每隔一段時間來自在經處理小鼠中表現螢光素酶之 T 細胞的輻射輝度 ( 光子 /s/cm2/sr) 。
T 細胞注射 時間點( 天) 無 NK 細胞注射 NK 細胞注射
平均值 SD n 平均值 SD n
無T細胞 0.25 5,065 474 2 6,010 651 2
1 5,225 431 2 5,150 467 2
4 4,715 403 2 4,860 57 2
6 5,145 884 2 5,110 226 2
11 5,230 382 2 4,700 99 2
13 6,920 948 2 6,735 35 2
18 5,055 148 2 5,570 28 2
27 4,740 311 2 5,185 290 2
無編輯 0.25 477,200 51,237 5 464,000 112,493 4
1 547,600 59,315 5 517,500 95,710 4
4 285,600 43,328 5 219,750 77,298 4
6 249,400 58,748 5 137,000 69,190 4
11 131,500 28,671 5 111,150 36,287 4
13 147,000 15,732 5 43,168 52,128 4
18 112,100 20,768 5 55,825 47,391 4
27 53,960 13,546 5 59,700 31,479 4
B2M KO 0.25 662,600 193,865 5 261,850 135,636 4
1 555,200 122,508 5 89,400 41,151 4
4 266,200 68,845 5 25,175 11,072 4
6 202,600 41,825 5 18,500 7,048 4
11 106,320 14,377 5 17,100 9,440 4
13 57,714 45,535 5 7,048 2,735 4
18 77,080 7,792 5 9,453 4,592 4
27 55,240 12,780 5 6,860 1,207 4
HLA-A KO 0.25 160,000 30,315 5 111,500 30,533 4
1 206,800 38,493 5 153,000 24,427 4
4 120,200 23,488 5 91,025 69,091 4
6 81,100 16,903 5 91,408 106,141 4
11 55,520 6,843 5 53,367 21,985 3
13 30,716 23,658 5 33,233 13,615 3
18 21,802 10,911 5 35,667 5,601 3
27 20,600 808 4 46,900 4,937 3
CIITA KO 0.25 121,400 19,680 5 116,350 82,606 4
1 168,200 32,760 5 120,225 43,535 4
4 93,600 23,187 5 76,450 31,056 4
6 71,298 40,161 5 52,500 35,590 4
11 59,100 13,805 5 73,500 77,242 4
13 43,870 22,810 5 31,760 30,831 4
18 28,422 14,019 5 35,000 7,902 3
27 18,780 3,505 5 69,067 31,194 3
HLA-A KO CIITA KO 0.25 259,250 59,824 4 363,000 113,731 4
1 456,750 69,188 4 481,500 142,778 4
4 170,500 26,665 4 200,750 70,415 4
6 108,950 11,046 4 98,633 27,450 3
11 97,350 19,982 4 93,867 32,173 3
13 85,708 58,720 4 68,357 54,428 3
18 20,923 22,172 4 98,633 27,450 3
27 37,375 10,602 4 31,733 2,593 3
實例 9 ： NK 細胞活體內殺死小鼠模型中之 HLA-A 及 CIITA 部分匹配
給雌性NOG-hIL-15小鼠移植1.5×10 6個初生NK細胞，隨後在4週後注射含有螢光素酶+/-HLA-A/CIITA KO與HD1 TCR之工程化T細胞，以確定1)移植之NK細胞是否可容易溶解對照T細胞(B2M -/-)，及2)添加部分匹配編輯(HLA-A&CIITA)是否為NK細胞活體內溶解具有外源HD1 TCR之T細胞提供保護效應。 9.1. 製備含有螢光素酶 +/-HLA-A/CIITA KO 及 HD1 TCR 之 T 細胞
T細胞自具有以下MHC I表型之健康人類供體的周邊血液分離：HLA-A*02：01: 01G、03: 01: 01G、HLA-B*07: 02: 01G、HLA-C*07: 02: 01G。簡言之，在氯化銨紅血球溶解緩衝液(Stemcell Technologies；目錄號07800)中處理白細胞去除包(Stemcell Technologies)15分鐘以溶解紅血球。外周血單核細胞(PBMC)計數在溶解後測定，且根據製造商之方案使用EasySep人類T細胞分離套組(Stemcell Technologies，目錄號17951)進行T細胞分離。將分離之CD3+ T細胞再懸浮於Cryostor CS10培養基(Stemcell Technologies，目錄號07930)中且在液氮中冷凍，直至進一步使用。
冷凍的T細胞以1.5x10 6個細胞/毫升之細胞濃度解凍於由OpTmizer TCGM構成的T細胞活化培養基(TCAM)中，該培養基如 實例 3中所描述且進一步補充有100 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/mL IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。將細胞在37℃下靜置24小時。
解凍後24小時，對T細胞進行計數且以2×10 6個細胞/毫升再懸浮於TCAM培養基中，且添加1: 50之Transact。混合細胞且在37℃下培育20至30分鐘。分別以50: 38.5: 10: 1.5莫耳比用脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配含有編碼cas9之mRNA(SEQ ID NO: 802)及靶向CIITA之sgRNA G013675(SEQ ID NO: 246)的LNP組合物。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。5 μg/ml之LNP組合物在37℃下在進一步補充有5 μg/ml重組人類ApoE3(Peprotech，目錄號350-02)的OpTmizer TCAM中培育15分鐘。將經預培育之LNP組合物及T細胞與Transact混合以在具有2.5%人類AB血清、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)，5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)，及5 ng/ml IL-15(Peprotech，目錄號200-15)的TCAM培養基中產生1×10 6個T細胞/毫升及2.5 µg總RNA/毫升之LNP的最終濃度。用含有ApoE3但無LNP組合物之培養基模擬編輯另一組細胞。所有細胞在37℃下培育24小時。
活化後48小時之後，所有組經EF1α-GFP-Luc慢病毒轉導。慢病毒自-80℃移出且在冰上解凍。按照組收集細胞且在500×g下離心5 min以洗去LNP組合物及培養基。細胞根據其組單獨地以2×10 6個細胞/毫升再懸浮TCAM培養基中。隨後將500 μl細胞懸浮液轉移至無菌埃彭道夫管(總共1×10 6個細胞)中，且添加100 μl慢病毒。細胞在37℃下以1000×G離心60分鐘。在離心之後，細胞根據其組組合且以1×10 6個細胞/毫升TCAM培養基再懸浮，該培養基含有最終濃度2.5%之人類AB血清、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)、5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)及5 ng/ml IL-15(Peprotech, 目錄號200-15)，接著在37℃下培育24小時。
活化後72小時，經螢光素酶轉導之T細胞用LNP組合物處理以破壞TRAC基因且進一步用HD1 AAV處理以將HD1 TCR在TRAC基因座插入。按照組收集細胞且在500×g下離心5 min以洗去慢病毒及培養基。接著將細胞以1×10 6個細胞/毫升再懸浮於TCAM培養基中。分別以50: 38.5: 10: 1.5莫耳比用脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配含有編碼cas9之mRNA(SEQ ID NO: 802)及靶向TRAC之sgRNA G013006(SEQ ID NO: 243)的LNP組合物。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。5 μg/ml之LNP組合物在37℃下在進一步補充有5 μg/ml重組人類ApoE3(Peprotech，目錄號350-02)的OpTmizer TCAM中培育15分鐘。將經預培育之LNP組合物及T細胞與Transact混合以在具有2.5%人類AB血清、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)，5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)，及5 ng/ml IL-15(Peprotech，目錄號200-15)的TCAM中產生1×10 6個T細胞/毫升及2.5 µg總RNA/毫升之LNP的最終濃度。在實驗台上將EF1α-HD1 AAV之小瓶解凍且以3×10 5GC/細胞添加至經TRAC LNP處理之細胞中。細胞接著在37℃下培育24小時。
隨後在活化後96小時處理細胞，用單獨TRBC LNP或與HLA-A LNP組合進行最後一輪編輯。B2M KO組用B2M LNP處理。按照組收集細胞且在500×g下離心5 min以洗去LNP組合物及培養基。接著將細胞以1×10 6個細胞/毫升再懸浮於TCAM培養基中。簡言之，如 實例 1中所述調配含有編碼Cas9之mRNA(SEQ ID NO:802)及靶向HLA-A之sgRNA G018995(包含SEQ ID NO: 13之sgRNA，如表2中所示)的LNP組合物。含有Cas9 mRNA及靶向B2M之sgRNA G000529 (SEQ ID NO:245)之LNP組合物及含有Cas9 mRNA及靶向TRBC之sgRNA G016239(SEQ ID NO: 247)的LNP組合物分別以50: 38.5: 10: 1.5莫耳比用脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。5 μg/ml之LNP組合物在37℃下在進一步補充有5 μg/ml重組人類ApoE3(Peprotech，目錄號350-02)的OpTmizer TCAM中培育15分鐘。將經預培育之LNP組合物及T細胞與Transact混合以在具有2.5%人類AB血清、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)，5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)，及5 ng/ml IL-15(Peprotech，目錄號200-15)的TCAM中產生1×10 6個T細胞/毫升及2.5 µg總RNA/毫升之LNP的最終濃度。對於同時TRBC及HLA-A編輯，以4×最終濃度調配LNP及ApoE3，隨後首先添加TRBC LNP至T細胞且在37℃下培育15分鐘。在培育之後，添加預調配之HLA-A LNP組合物，將細胞培育24小時。
在最後一輪編輯之後，細胞藉由在500×G下旋轉5 min來洗滌且再懸浮於含有5%人類AB血清、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)及5 ng/ml IL-15(Peprotech，目錄號200-15)之TCGM培養基中。
活化後第5天，使用BD FACS Aria Flow Sorter在GFP +細胞上分選經編輯T細胞以富集表現螢光素酶之細胞。經分選細胞在具有細胞介素之TCGM培養基中在37℃培育箱中靜置隔夜。次日，T細胞用1: 100稀釋之T細胞TransAct TM再刺激24小時。再刺激後24小時，洗掉TransAct TM且將T細胞在G-Rex板中培養且保持15天，其中培養基及細胞介素定期更換。
首次再刺激之後15天，經由流動式細胞測量術確認編輯水準，且洗滌細胞且再懸浮於HBSS緩衝液中用於注射。 9.2.  HLA-A 及 CIITA 雙重基因剔除 T 細胞展示對 NK 殺死之保護作用
對於活體內研究，藉由此項技術中已知之方法自白血球採集物分離之NK細胞用HBSS(Gibco, 目錄號14025-092)洗滌且以10×10 6個細胞/毫升再懸浮，用於注射到150 µL HBSS中。30隻雌性NOG-hIL-15小鼠(Taconic)藉由尾部靜脈注射1.5×10 6個分離之NK細胞給藥。另外25隻雌性NOG-hIL-15充當未NK注射之對照。
NK細胞注射之後28天，小鼠如 表 21中所描述注射未經編輯或工程化T細胞。簡言之，在第二次活化後16天，在於PBS中洗滌且以6.0×10 6個細胞/150 µL之濃度再懸浮於HBSS溶液中之後，注射0.2×10 6工程化T細胞。
進行活小鼠之IVIS成像以藉由IVIS光譜鑑別螢光素酶陽性T細胞。在T細胞注射之後24小時、48小時、72小時、6天、10天、13天、17天、20天、24天、27天、31天、34天、38天、42天、44天、48天、55天、63天、72天、77天、85天及91天時進行IVIS成像。根據製造商之建議，藉由以10 µL/g體重，每隻動物約150 µL腹膜內注射D-螢光素使小鼠準備進行成像。動物經麻醉且接著置於IVIS成像單元中。可視化係在曝光時間設定為自動、視野D、中等分格及F/stop設定為1之情況下進行。 表 22及 圖 7A展示在注射後不同時間點至91天存在之表現螢光素酶之T細胞的輻射輝度(光子/s/cm2/sr)。 圖 7B展示31天後存在於不同小鼠組中之表現螢光素酶之T細胞的輻射輝度(光子/s/cm2/sr)。活體內，B2M編輯細胞展示對NK殺死之敏感性，而HLA-A,CIITA雙重編輯細胞展示對NK介導之溶解的保護作用。
表 21-T 細胞工程化
組 第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第6天 第7天 第8天 第16天
HLA-A CIITA KO 解凍 CIITA GFP-Luc LV TRAC+AAV TRBC, HLA-A 流動&分選 再刺激  G-Rex中擴增 洗滌&注射
B2M對照 解凍 B2M GFP-Luc LV TRAC+AAV TRBC 流動&分選 再刺激  G-Rex中擴增 洗滌&注射
無編輯 解凍 - GFP-Luc LV - - 流動&分選 再刺激  G-Rex中擴增 洗滌&注射
表 22- 在 T 細胞注射之後 ， 每隔一段時間來自在經處理小鼠中表現螢光素酶之 T 細胞的總通量 ( 光子 /s) 。
T細胞注射 時間點(天) 無NK細胞注射 NK細胞注射
平均值 SD n 平均值 SD n
無T細胞 1 1170000 0 1 1060000 0 1
2 884000 0 1 728000 0 1
3 1090000 0 1 771000 0 1
6 1040000 0 1 888000 0 1
10 741000 0 1 799000 0 1
13 1350000 0 1 751000 0 1
17 1210000 0 1 709000 0 1
20 1530000 0 1 1190000 0 1
24 1280000 0 1 823000 0 1
27 1430000 0 1 577000 0 1
31 1310000 0 1 970000 0 1
34 1840000 0 1 800000 0 1
38 937000 0 1 750000 0 1
42 1450000 0 1 757000 0 1
44 1770000 0 1 797000 0 1
48 1850000 0 1 666000 0 1
55 1170000 0 1 723000 0 1
63 1680000 0 1 799000 0 1
72 1400000 0 1 840000 0 1
77 1570000 0 1 801000 0 1
85 1220000 0 1 770000 0 1
91 1580000 0 1 905000 0 1
無編輯 1 37560000 34014482.9 5 27882000 27141262.31 5
2 40698000 22307084.5 5 28640000 14568047.23 5
3 34210000 18847559.5 5 25692000 14362636.25 5
6 51440000 10855551.6 5 37700000 34510288.32 5
10 29460000 5028220.36 5 34060000 24420544.63 5
13 17350000 8731122.49 5 42864000 47552123.82 5
17 17380000 4065956.22 5 124180000 217126534.5 5
20 35860000 9912012.91 5 329720000 644006666.9 5
24 41400000 6393355.93 5 1784780000 3583692731 5
27 70500000 28116809.9 5 9112600000 19172106869 5
31 124260000 57196923 5 14383000000 27254468202 5
34 313000000 256943574 5 17450000000 24859612829 5
38 667800000 614512978 5 25316000000 26111305597 5
42 1727400000 1703225998 5 21084000000 16956611690 5
44 2101400000 2213844349 5 16975000000 13721121188 4
48 5068000000 4995313854 5 15106666667 11613532337 3
55 6386750000 5350377767 4 16303333333 11913187371 3
63 8105750000 6722716632 4         
72                  
77                  
85                  
91                  
B2M KO 1 96334000 62882587.3 5 7192000 6901425.215 5
2 138300000 57619007.3 5 7296000 2213194.524 5
3 117980000 43943736.8 5 7342000 2837475.991 5
6 104240000 34772230.3 5 7276000 2743998.907 5
10 81120000 19876921.3 5 6124000 1967035.841 5
13 45386000 24729233.3 5 5748000 3248448.861 5
17 50600000 19718899.6 5 4390000 902607.3343 5
20 38200000 12211470 5 2772000 947507.2559 5
24 32180000 17561520.4 5 4566000 1182742.576 5
27 35840000 15497354.6 5 3626000 1995903.304 5
31 41380000 12243243 5 3344000 1295812.486 5
34 40740000 13481394.6 5 3864000 506635.964 5
38 33980000 15116117.2 5 3468000 1330139.09 5
42 38840000 15452605 5 3504000 688534.676 5
44 35280000 19116929.7 5 3266000 910291.1622 5
48 31600000 17624982.3 5 3196000 726691.1311 5
55 38920000 30824779 5 2654000 475794.0731 5
63 29300000 22330584.4 5 2530000 274135.0032 5
72 19070000 13309188.6 5 2522000 437344.258 5
77 30680000 24960508.8 5 2650000 531554.3246 5
85 24738000 22937833.8 5 1816000 410524.0553 5
91 18234000 10913394.5 5 1736000 297707.9105 5
HLA-A KO CIITA KO 1 63960000 33085918.5 5 59320000 32265414.92 5
2 55412000 31461432.3 5 49560000 9862707.539 5
3 64686000 39918742.2 5 41264000 22521777.9 5
6 88440000 22053865.9 5 33442000 18099663.53 5
10 68320000 18250397.3 5 42040000 4585084.514 5
13 57880000 8452041.17 5 37028000 20443236.53 5
17 39320000 11283040.4 5 41400000 10968135.67 5
20 40480000 12259363.8 5 37540000 8371260.359 5
24 39900000 18287017.3 5 37740000 9070446.516 5
27 37800000 14406422.2 5 31840000 11387185.78 5
31 46160000 13751836.2 5 25020000 11377477.75 5
34 39820000 8990383.75 5 28980000 5348551.206 5
38 42620000 8249363.61 5 31000000 7146677.55 5
42 30740000 10083798.9 5 16928000 9138868.639 5
44 31740000 9619667.35 5 26580000 7343500.528 5
48 30740000 9147021.37 5 28620000 3141178.123 5
55 27600000 5482244.07 5 21340000 3673281.911 5
63 24820000 6599015.08 5 12428000 3646082.83 5
72 10918000 3813609.84 5 13094000 3349355.162 5
77 24840000 4728953.37 5 14200000 3801973.172 5
85 15520000 4283923.44 5 14580000 2920102.738 5
91 17260000 5452797.45 5 11256000 2456141.283 5
實例 10 ： HD1 T 細胞之 MHCI 及 MHCII KO 活體內功效
給雌性NOG-hIL-15小鼠移植0.2×10 6個人類急性淋巴母細胞白血病(ALL)細胞株697-Luc2，接著注射10×10 6個具有各種編輯的工程化T細胞以判定該等編輯是否提供特異性抗腫瘤效應。所研究的T細胞組包括：無編輯之T細胞對照組(僅697)；TRAC及TRBC具有編輯之T細胞(TCR KO)；TRAC及TRBC具有編輯且插入HD1之T細胞(TCR KO/WT1插入)；TRAC及TRBC具有編輯、插入HD1且破壞HLA-A之T細胞(HLA-A KO)；TRAC及TRBC具有編輯、插入HD1且HLA-A及CIITA具有編輯之T細胞(AlloWT1)；及TRAC及TRBC具有編輯且在DNA PKi化合物存在下插入HD1且HLA-A及CIITA具有編輯之T細胞(AlloWT1+PKi 化合物1)。 10.1. T 細胞製備
HLA-A2 +供體(110046967)之T細胞係自健康供體之白細胞去除術產物(STEMCELL Technologies)分離得到。使用EasySep人類T細胞分離套組(STEMCELL Technologies，目錄號17951)遵循製造商之方案分離T細胞且使用Cryostor CS10 (STEMCELL Technologies，目錄號07930)冷凍保存。在開始T細胞編輯之前一天，細胞經解凍且在T細胞活化培養基(TCAM)：CTS OpTmizer (Thermofisher，#A3705001)中靜置隔夜，該培養基補充有2.5%人類AB血清(Gemini，#100-512)、1× GlutaMAX (Thermofisher，#35050061)、10 mM HEPES (Thermofisher，#15630080)、200 U/mL IL-2 (Peprotech，#200-02)、IL-7 (Peprotech，#200-07)、IL-15 (Peprotech，#200-15)。 10.2. 藉由依序 LNP 遞送來多重編輯 T 細胞
T細胞藉由依序用四種LNP組合物處理健康供體細胞來製備，各LNP組合物與Cas9 mRNA及靶向TRAC、TRBC、CIITA及HLA-A之sgRNA共同調配。LNP組合物之脂質部分包括莫耳比分別為50:38.5:10:1.5之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。藉由使用 表 24中所示的AAV遞送同源定向修復模板，結合DNA依賴性蛋白激酶之小分子抑制劑，將靶向WT1之轉殖基因TCR位點特異性整合到TRAC切割位點，以提高tgTCR插入率。下文稱作「DNAPKI化合物1」之抑制劑為9-(4,4-二氟環己基)-7-甲基-2-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)胺基)-7,9-二氫-8H-嘌呤-8-酮，亦描繪為：
Figure 02_image001
。
DNAPKI化合物1製備如下：
一般資訊
所有試劑及溶劑係自商業供應商購買且按原樣使用或根據所引用之程序合成。所有中間物及最終化合物均使用矽膠急驟管柱層析來純化。將NMR光譜記錄在Bruker或Varian 400 MHz光譜儀上，且收集在環境溫度下CDCl3中之NMR資料。相對於CDCl3(7.26)以百萬分率(ppm)報告化學位移。1H NMR的資料報導如下：化學位移、多重性(br=寬峰，s=單重峰，d=二重峰，t=三重峰，q=四重峰，dd=二重峰之二重峰，dt=三重峰之二重峰，m=多重峰)、偶合常數及積分。MS資料記錄在具有電噴霧電離(ESI)來源之Waters SQD2質譜儀上。最終化合物之純度係由UPLC-MS-ELS，使用配備有SQD2質譜儀之Waters Acquity H-Class液相層析儀器測定，該SQD2質譜儀具有光電二極體陣列(PDA)及蒸發光散射(ELS)偵測器。
實例1-化合物1
中間物1a：(E)-N,N-二甲基-N'-(4-甲基-5-硝基吡啶-2-基)甲脒
Figure 02_image003
向4-甲基-5-硝基-吡啶-2-胺(5 g，1.0當量)於甲苯(0.3 M)中之溶液中添加DMF-DMA(3.0當量)。在110℃下攪拌混合物2 h。在減壓下濃縮反應混合物，得到殘餘物且藉由管柱層析純化，得到呈黃色固體狀之產物(59%)。 1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 8.82 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.21 (m, 6H)。
中間物1b：(E)-N-羥基-N'-(4-甲基-5-硝基吡啶-2-基)甲脒
Figure 02_image005
向中間物1a(4 g，1.0當量)於MeOH (0.2 M)中之溶液中添加NH 2OH·HCl (2.0當量)。在80℃下攪拌反應混合物1小時。過濾反應混合物，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。將殘餘物分配於H 2O與EtOAc之間，接著用EtOAc萃取2次。在減壓下濃縮有機相，得到殘餘物且藉由管柱層析純化，得到呈白色固體狀之產物(66%)。1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 10.52 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 10.08 (dd, J = 9.9, 3.7 Hz, 1H), 8.84 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.85 (dd, J = 9.7, 3.8 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 3.36 (s, 3 H)。
中間物1c：7-甲基-6-硝基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶
Figure 02_image007
在0℃下向中間物1b (2.5 g，1.0當量)於THF (0.4 M)中之溶液中添加三氟乙酸酐(1.0當量)。在25℃下攪拌混合物18小時。過濾反應混合物，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由管柱層析純化殘餘物，得到呈白色固體狀之產物(44%)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 9.53 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 2.78 (d, J = 1.0 Hz, 3H)。
中間物1d：7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-胺
Figure 02_image009
向Pd/C (10% w/w，0.2當量)於EtOH (0.1 M)中之混合物中添加中間物1c (1.0當量)及甲酸銨(5.0當量)。在105℃下加熱混合物2小時。過濾反應混合物，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由管柱層析純化殘餘物，得到呈淡棕色固體狀之產物。 1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 8.41 (s, 2H), 8.07 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.43 (s, 1H), 2.22 (s, 3H)。
中間物1e：8-亞甲基-1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷
Figure 02_image011
在-78℃下向溴化甲基(三苯基)鏻(1.15當量)於THF(0.6 M)中之溶液中逐滴添加n-BuLi(1.1當量)，且在0℃下攪拌混合物1小時。隨後，將1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-酮(50 g，1.0當量)添加至反應混合物。在25℃下攪拌混合物12小時。在0℃下將反應混合物倒入NH 4Cl水溶液中，用H 2O稀釋且用EtOAc萃取3次。在減壓下濃縮合併之有機層，得到殘餘物，且藉由管柱層析純化，得到呈無色油狀之產物(51%)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 4.67 (s, 1H), 3.96 (s, 4 H), 2.82 (t, J = 6.4 Hz, 4 H), 1.70 (t, J = 6.4 Hz, 4 H)。
中間物1f：7,10-二氧雜二螺[2.2.4 6.2 3]十二烷
Figure 02_image013
在-40℃下向中間物4a (5 g，1.0當量)於甲苯(3 M)中之溶液中逐滴添加ZnEt 2(2.57當量)且在-40℃下攪拌混合物1小時。隨後在-40℃下在N 2下將二碘甲烷(6.0當量)逐滴添加至混合物中。混合物接著在20℃下在N 2氛圍下攪拌17小時。在0℃下將反應混合物倒入NH 4Cl水溶液中且用EtOAc萃取2次。合併之有機相用鹽水(20 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾，且真空濃縮濾液。藉由管柱層析純化殘餘物，得到呈淡黃色油狀之產物(73%)。
中間物1g：螺[2.5]辛-6-酮
Figure 02_image015
向中間物4b(4 g，1.0當量)於1: 1 THF/H 2O(1.0 M)中之溶液中添加TFA(3.0當量)。在20℃下在N 2氛圍下攪拌混合物2小時。在減壓下濃縮反應混合物以移除THF，且用2 M NaOH (水溶液)將殘餘物調節至pH 7。將混合物倒入水中且用EtOAc萃取3次。合併之有機相用鹽水洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾，且真空濃縮濾液。藉由管柱層析純化殘餘物，得到呈淡黃色油狀之產物(68%)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 2.35 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.62 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 0.42 (s, 4H)。
中間物1h：N-(4-甲氧基苯甲基)螺[2.5]辛-6-胺
Figure 02_image017
向中間物4c (2 g，1.0當量)及(4-甲氧基苯基)甲胺(1.1當量)於DCM (0.3 M)中之混合物中添加AcOH (1.3當量)。在20℃下在N 2氛圍下攪拌混合物1小時。接著，在0℃下向混合物中添加NaBH(OAc) 3(3.3當量)，且在20℃下在N 2氛圍下攪拌混合物17小時。在減壓下濃縮反應混合物以移除DCM，且將所得殘餘物用H 2O稀釋且用EtOAc萃取3次。經合併之有機層用鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由管柱層析純化殘餘物，得到呈灰色固體狀之產物(51%)。 1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 7.15 - 7.07 (m, 2H), 6.77 - 6.68 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.54 (s, 2H), 2.30 (ddt, J = 10.1, 7.3, 3.7 Hz, 1H), 1.69 - 1.62 (m, 2H), 1.37 (td, J = 12.6, 3.5 Hz, 2H), 1.12 - 1.02 (m, 2H), 0.87 - 0.78 (m, 2H), 0.13 - 0.04 (m, 2H)。
中間物1i：螺[2.5]辛-6-胺
Figure 02_image019
向Pd/C (10% w/w，1.0當量)於MeOH (0.25 M)中之懸浮液中添加中間物4d (2 g，1.0當量)且在80℃下在50 Psi下在H 2氛圍中攪拌混合物24小時。過濾反應混合物，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物，其藉由管柱層析進行純化，得到呈白色固體狀之產物。 1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 2.61 (tt, J = 10.8, 3.9 Hz, 1H), 1.63 (ddd, J = 9.6, 5.1, 2.2 Hz, 2H), 1.47 (td, J = 12.8, 3.5 Hz, 2H), 1.21 - 1.06 (m, 2H), 0.82 - 0.72 (m, 2H), 0.14 - 0.05 (m, 2H)。
中間物1j：2-氯-4-(螺[2.5]辛-6-基胺基)嘧啶-5-甲酸乙酯
Figure 02_image021
在N 2下一次性向2,4-二氯嘧啶-5-甲酸乙酯(2.7 g，1.0當量)及中間物1i(1.0當量)於ACN(0.5-0.6 M)中之混合物中添加K 2CO 3(2.5當量)。在20℃下攪拌混合物12小時。過濾反應混合物，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由管柱層析純化殘餘物，得到呈白色固體狀之產物(54%)。 1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 8.64 (s, 1H), 8.41 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.33 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.08 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 1.90 (dd, J = 12.7, 4.8 Hz, 2H), 1.64 (t, J = 12.3 Hz, 2H), 1.52 (q, J = 10.7, 9.1 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.12 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 0.40 - 0.21 (m, 4H)。
中間物1k：2-氯-4-(螺[2.5]辛-6-基胺基)嘧啶-5-甲酸
Figure 02_image023
向中間物1j(2 g，1.0當量)於1: 1 THF/H 2O(0.3 M)中之溶液中添加LiOH(2.0當量)。在20℃下攪拌混合物12小時。過濾反應混合物，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由2 M HCl將殘餘物調節至pH 2，且藉由過濾收集沈澱物，用水洗滌，且在真空中乾燥。產物未經另外純化即直接用於下一步驟中(82%)。 1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 13.54 (s, 1H), 8.38 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 3.82 (qt, J = 8.2, 3.7 Hz, 1H), 1.66 (dq, J = 12.8, 4.1 Hz, 2H), 1.47 - 1.34 (m, 2H), 1.33 - 1.20 (m, 2H), 0.86 (dt, J = 13.6, 4.2 Hz, 2H), 0.08 (dd, J = 8.3, 4.8 Hz, 4H)。
中間物1l：2-氯-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7,9-二氫-8H-嘌呤-8-酮
Figure 02_image025
向中間物1k(1.5 g，1.0當量)及Et 3N(1.0當量)於DMF(0.3 M)中之混合物中添加DPPA(1.0當量)。在N 2氛圍下在120℃下攪拌混合物8小時。將反應混合物傾入水中。沈澱物係藉由過濾收集，用水洗滌，且在真空下乾燥，得到殘餘物，其未經另外純化即直接用於下一步驟中(67%)。 1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 11.68 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 4.26 (ddt, J = 12.3, 7.5, 3.7 Hz, 1H), 2.42 (qd, J = 12.6, 3.7 Hz, 2H), 1.95 (td, J = 13.3, 3.5 Hz, 2H), 1.82 - 1.69 (m, 2H), 1.08 - 0.95 (m, 2H), 0.39 (tdq, J = 11.6, 8.7, 4.2, 3.5 Hz, 4H)。
中間物1m：2-氯-7-甲基-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7,9-二氫-8H-嘌呤-8-酮
Figure 02_image027
向中間物1l(1.0 g，1.0當量)及NaOH(5.0當量)於1: 1 THF/H 2O(0.3-0.5 M)中之混合物中添加MeI(2.0當量)。在N 2氛圍下在20℃下攪拌混合物12小時。在減壓下濃縮反應混合物，得到殘餘物，藉由管柱層析對其進行純化，得到呈淡黃色固體狀之產物(67%)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.57 (s, 1H), 4.03 (tt, J = 12.5, 3.9 Hz, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.17 (qd, J = 12.6, 3.8 Hz, 2H), 1.60 (td, J = 13.4, 3.6 Hz, 2H), 1.47 - 1.34 (m, 2H), 1.07 (s, 1H), 0.63 (dp, J = 14.0, 2.5 Hz, 2H), -0.05 (s, 4H)。
化合物1：7-甲基-2-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)胺基)-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7,9-二氫-8H-嘌呤-8-酮
Figure 02_image029
將中間物1m (1.0當量)及中間物1d (1.0當量)、Pd(dppf)Cl 2(0.2當量)、XantPhos (0.4當量)及Cs 2CO 3(2.0當量)於DMF (0.2-0.3 M)中之混合物脫氣且用N 2吹掃3次且在130℃下在N 2氛圍下攪拌混合物12小時。隨後將混合物倒入水中且用DCM萃取3次。合併之有機相用鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾，且真空濃縮濾液。藉由管柱層析純化殘餘物，得到呈灰白色固體狀之產物。 1H NMR (400 MHz, (CD 3) 2SO) δ 9.09 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 4.21 (t, J = 12.5 Hz, 1H), 3.36 (s, 3H), 2.43 (s, 3H), 2.34 (dt, J = 13.0, 6.5 Hz, 2H), 1.93 - 1.77 (m, 2H), 1.77 - 1.62 (m, 2H), 0.91 (d, J = 13.2 Hz, 2H), 0.31 (t, J = 7.1 Hz, 2H). MS: 405.5 m/z [M+H]。
如 表 23中所說明，對各組進行依序編輯。
表23-T細胞工程化
組名 第1天 第2天 第3天 第4天
TCR KO TRBC TRAC
TCR KO/WT1 插入 TRBC TRAC/AAV
WT1/HLA-A HLA-A TRAC/AAV TRBC
AlloWT1 CIITA HLA-A TRAC/AAV TRBC
AlloWT1+DNA PKi化合物1 CIITA HLA-A TRAC/AAV +化合物1 (0.25 M) TRBC
10.3. T 細胞之 LNP 處理及擴增
LNP組合物調配於含ApoE之培養基中且如下遞送至T細胞：在第1天，如 表 24中所指示之LNP組合物在含有5 μg/mL rhApoE3(Peprotech 350-02)之TCAM中以5 μg/mL之濃度培育。同時，T細胞經採集，洗滌，且以2×10 6個細胞/毫升之密度再懸浮於具有1:50稀釋之T細胞TransAct，人類試劑(Miltenyi，130-111-160)的TCAM中。T細胞及LNP-ApoE培養基以1:1比率混合且在培養瓶中塗鋪T細胞隔夜。
在第2天，如 表 23中所指示之LNP組合物在含有20 μg/mL rhApoE3 (Peprotech，350-02)之TCAM中以25 μg/mL之濃度培育。接著將LNP-ApoE溶液以1:10比率添加至適當培養物中。
在第3天，TRAC-LNP組合物( 表 23)在含有10 μg/mL rhApoE3 (Peprotech 350-02)之TCAM中以5 μg/mL之濃度培育。同時，T細胞經採集，洗滌，且以1×10 6個細胞/毫升之密度再懸浮於TCAM中。T細胞及LNP-ApoE培養基以1:1比率混合且在培養瓶中塗鋪T細胞。接著以3×10 5個GC/細胞的MOI將WT1 AAV添加至相關組中。將化合物1添加至相關組中，最終濃度為0.25 μM。
在第4天，如 表 23中所指示之LNP組合物在含有5 μg/mL rhApoE3 (Peprotech 350-02)之TCAM中以5 μg/mL之濃度培育。藉由離心洗滌T細胞且以1×10 6個細胞/毫升LNP-ApoE溶液之密度再懸浮，隨後以1: 1比率添加至適當培養物中。
在第5天至第11天，將T細胞轉移至GREX板(Wilson Wolf)之T細胞擴增培養基(TCEM：CTS OpTmizer(Thermofisher #A3705001)中且擴增，該培養基補充有5%CTS免疫細胞血清替代物(Thermofisher #A2596101)、1×GlutaMAX(Thermofisher #35050061)、10 mM HEPES(Thermofisher #15630080)、200 U/mL IL-2(Peprotech #200-02)、IL-7(Peprotech #200-07)、IL-15(Peprotech #200-15)。簡言之，T細胞擴增6天，每隔一天補充新鮮細胞介素。細胞係使用Vi-CELL細胞計數器(Beckman Coulter)來計數且藉由細胞產率除以起始物質來計算擴增倍數。 10.4. 藉由流動式細胞測量術及 NGS 定量 T 細胞編輯
擴增後，經編輯T細胞在抗體混合液中染色以測定HLA-A2基因剔除(HLA-A2 -)、經由CIITA基因剔除之HLA-DR-DP-DQ減弱(HLA-DRDPDQ -)、WT1-TCR插入(CD3 +Vb8 +)及表現殘餘內源性(CD3 +Vb8 -)之細胞的百分比 隨後洗滌細胞，在Cytoflex LX儀器(Beckman Coulter)上使用FlowJo套裝軟體進行分析。根據大小及CD8+狀態對T細胞進行閘控，隨後測定編輯及插入率。編輯及插入率可見於 表 24及 圖 9A 至 9F中。表現WT1-TCR且基因剔除HLA-A及CIITA之經完全編輯之AlloWT1-T細胞的百分比閘控為CD3 +Vb8 +HLA-A -HLA-DRDPDQ -%。在經編輯樣品中觀測到高含量之HLA-A及CIITA基因剔除，以及WT1-TCR插入及內源性TCR KO。值得注意的是，接受DNA PK抑制劑化合物1之T細胞顯示改良之編輯效率。
進行活小鼠之IVIS成像以藉由IVIS光譜鑑別螢光素酶陽性腫瘤細胞。在T細胞注射之後2天、6天、9天、13天、16天及18天進行IVIS成像。根據製造商之建議，藉由以10 µL/g體重，每隻動物約150 µL腹膜內注射D-螢光素使小鼠準備進行成像。動物經麻醉且接著置於IVIS成像單元中。可視化係在曝光時間設定為自動、視野D、中等分格及F/stop設定為1之情況下進行。 表 25及 圖 10展示來自在注射後不同時間點至18天存在之表現螢光素酶之T細胞的輻射輝度(光子/s/cm2/sr)。
表 24-T 細胞編輯效率
CD8+ 內源性TCR+ WT1 TCR+ HLA- A2- HLA- DRDPDQ- AlloWT1+
未經編輯 26.9 95.4 4.39 0.66 35.7 0.00292
TCR KO 31.1 5.12 0.5 0.62 30.8 0.23
WT1 34.2 1.2 78.5 0.47 49.7 0.03
WT1/HLA-A 24.8 0.93 63.3 99.1 56.4 40.5
AlloWT1 28.8 0.51 69.3 98.7 96.2 66.1
AlloWT1+化合物1 29.2 0.23 89.8 99 96.5 86
表 25- 在 T 細胞注射之後 ， 每隔一段時間來自在經處理小鼠中表現螢光素酶之目標細胞的總通量 ( 光子 /s) 。
   平均值 SD n
IR 對照 2 668000 0 1
6 662000 0 1
9 802000 0 1
13 834000 0 1
16 799000 0 1
18 727000 0 1
僅 697 2 11695000 6766940.65 8
6 11756250 6759771.63 8
9 6542375000 4097940177 8
13 34156125000 19588932739 8
16 56000000000 14890936841 8
18      
TCR KO 2 8696250 3615004.20 8
6 8755000 3659211.47 8
9 1985750000 1311102671 8
13 39295000000 18556359711 8
16 50442857143 12082474518 7
18 35000000000 0 1
TCR KO/WT1 插入 2 1395750 651356.99 8
6 1418625 660585.66 8
9 13293750 10040193.42 8
13 416762500 340405656.90 8
16 987625000 637380114.80 8
18 2523750000 1518542699 8
HLA-A KO 2 1306375 514478.92 8
6 1323750 504219.55 8
9 1785000 691416.77 8
13 9851428.57 13794971.82 7
16 35832857.14 53937852.11 7
18 53608571.43 65167479.22 7
AlloWT1 2 1085625 137185.94 8
6 1100250 136031.25 8
9 12085000 20455051.77 8
13 43676250 87426018.67 8
16 146917500 310795920.60 8
18 31418750 33596200.65 8
AlloWT1+DNAPki 2 1138000 429877.06 8
6 1152750 420860.26 8
9 1720000 654391.77 8
13 3976250 5828721.83 8
16 39420000 97704137.36 8
18 80597500 162813409.10 8
10.5. 工程化 T 細胞細胞介素釋放
分析如實例10.1及10.2中所描述製備之工程化T細胞之細胞介素釋放概況。活體外OCI-AML3腫瘤細胞殺死分析係使用工程化T細胞分別進行(資料未示出)。使用來自腫瘤細胞殺死分析之上清液評估每種工程化T細胞之細胞介素釋放概況。
簡言之，將TCR KO T細胞、自體WT1 T細胞(TCR KO+ WT1 TCR插入)及同種異體WT1 T細胞(如 表 24中所指示)解凍且在補充有IL-2、IL-7及IL-15之TCGM中靜置隔夜。第二天，建立共培養分析，其中每一組工程化T細胞與OCI-AML3目標腫瘤共培養。首先，用不同濃度(500、50、5、0.5、0.05及0.005 nM)之VLD肽脈衝OCI-AML3目標腫瘤細胞1小時。接著，對來自各組之T細胞進行計數且再懸浮於無細胞介素之TCGM培養基中且與1: 1 E: T比率之脈衝OCI-AML3共培養。共培養物中之T細胞數標準化為插入率以保持不同組之間的E: T一致。在共培養24小時之後，將來自各共培養物樣品之上清液在來自U-PLEX免疫-腫瘤學第1組(hu)分析套組(MSD,目錄號K151AEL-2)之稀釋劑2中5倍稀釋。將來自各組之50 μL經稀釋樣品裝載於meso scale discovery(MSD)板上且培育1小時。
對於所量測之各細胞介素，根據套組之方案將來自U-PLEX免疫-腫瘤學第1組(hu)分析(MSD，目錄號K151AEL-2)之生物素化捕捉抗體添加至指定連接子。使抗體-連接子混合物渦旋且在室溫下培育30分鐘。培育後，洗滌、密封該板且儲存隔夜。
第二天，根據製造商說明書復原含有每一待分析細胞介素(IL-2及IFN-γ)之標準品的校準劑且稀釋以產生4倍標準曲線。
洗滌板，且將50 μL偵測抗體溶液(根據套組說明書製備)添加至MSD板之各孔中。將板培育1小時。
在培育之後，洗滌該板且立即在MSD儀器上讀取。細胞介素釋放展示於 表 26 至 27及 圖 11A 至 11B中。
表 26 ： IFN-γ
IFN-γ
Log[肽(nM)] TCR KO AutoWT1 AlloWT1
2.70 122.55 25.96 93417.51 7094.06 147620.65 9709.50
1.70 134.20 16.97 60680.24 2770.37 104018.15 10358.48
0.70 144.94 24.90 41863.52 1759.74 99896.25 7700.60
-0.30 146.14 58.09 4812.67 175.51 31820.97 1331.50
-1.30 155.20 11.49 77.72 23.65 1592.76 131.04
-2.30 110.63 22.03 69.41 3.27 351.29 23.17
表 27 ： IL-2
IL-2
Log[肽(nM)] TCR KO AutoWT1 AlloWT1
2.70 4.21 0.63 6031.67 373.56 7525.26 1116.85
1.70 4.17 0.76 3419.94 97.86 4450.71 861.82
0.70 5.28 0.25 1882.55 204.86 3780.66 381.75
-0.30 6.62 2.96 69.51 6.86 452.94 20.13
-1.30 5.87 1.47 4.88 1.07 10.91 2.80
-2.30 6.55 2.18 5.19 1.32 4.94 2.17
實例 11 ： 混合淋巴球反應分析
T細胞自具有以下MHC I表型之健康人類供體的周邊血液分離：HLA-A*02：01: 01G、03: 01: 01G、HLA-B*07: 02: 01G、HLA-C*07: 02: 01G。簡言之，在氯化銨RBC溶解緩衝液(Stemcell Technologies；目錄號07800)中處理白細胞去除包(Stemcell Technologies)15分鐘以溶解紅血球。外周血單核細胞(PBMC)計數在溶解後測定，且根據製造商之方案使用EasySep人類T細胞分離套組(Stemcell Technologies，目錄號17951)進行T細胞分離。將分離之CD3+ T細胞再懸浮於Cryostor CS10培養基(Stemcell Technologies，目錄號07930)中且在液氮中冷凍，直至進一步使用。
冷凍的T細胞以1.5×10 6個細胞/毫升之細胞濃度解凍於由OpTmizer TCGM構成的T細胞活化培養基(TCAM)中，該培養基如實例3中所描述且進一步補充有100 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/mL IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。細胞在37℃下靜置24小時。
在解凍後24小時，對T細胞進行計數且以2×10 6個細胞/毫升再懸浮於TCAM培養基中且添加1: 50 v/v之TransAct(Miltenyi Biotec目錄號30-111-160)。將1×10 6個細胞添加至24孔組織培養板之各孔中，各組保持2個孔進行工程化及2個孔作為未經編輯之對照(工程化組：未經編輯或WT、B2M KO(亦指示為HLA-I或HLA I類)、CIITA(亦指示為HLA II類或HLA-II) KO、B2M+ CIITA DKO、HLA-A KO、HLA-A+ CIITA DKO)。將該板轉移至37℃培育箱。分別以50: 38.5: 10: 1.5莫耳比用脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG調配含有編碼cas9之mRNA(SEQ ID NO: 802)及靶向CIITA之sgRNA G013675(SEQ ID NO: 236)的LNP組合物。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。5 μg/mL之LNP組合物在37℃下在進一步補充有5 μg/ml重組人類ApoE3(Peprotech，目錄號350-02)的OpTmizer TCAM中培育15分鐘。在12個孔之6個孔中，將經預培育之LNP及T細胞與Transact混合，以在具有2.5%人類AB血清、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)，5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)、5 ng/ml IL-15(Peprotech，目錄號200-15)的TCAM培養基中產生1×10 6個T細胞/毫升及2.5 µg總RNA/毫升之LNP的最終濃度 (此等為CIITA KO組之2個孔，HLA-A+ CIITA DKO組之2個孔及B2M+ CIITA DKO組之2個孔)。用含有ApoE3但無LNP組合物之培養基模擬編輯所有額外孔。所有細胞在37℃下培育24小時。
活化後24小時，2個預先未處理之孔及2個含有CIITA LNP之孔用B2M之LNP組合物處理(對於B2M KO及B2M+ CIITA DKO組)；且2個預先未處理之孔及2個含有CIITA LNP之孔用HLA-A之LNP組合物處理(對於HLA-A KO及HLA-A+ CIITA DKO組)。含有Cas9 mRNA及靶向B2M之sgRNA G000529(SEQ ID NO: 245)的LNP組合物及含有編碼cas9之mRNA(SEQ ID NO: 802)及靶向HLA-A之sgRNA G018995(包含SEQ ID NO: 13之sgRNA，如表2中所示)的LNP組合物調配莫耳比分別為50: 38.5: 10: 1.5之脂質A、膽固醇l、DSPC及PEG2k-DMG。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。25 μg/mL之LNP組合物在37℃下在進一步補充有20 μg/ml重組人類ApoE3(Peprotech，目錄號350-02)的OpTmizer TCAM中培育15分鐘。如上所述，將B2M及HLA-A LNP組合物添加至24孔板之合適孔中，在具有2.5%人類AB血清、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech, 目錄號200-02)，5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)，5 ng/ml IL-15(Peprotech，目錄號200-15)的TCAM培養基中產生2.5 µg總RNA/毫升之LNP的最終濃度。用含有ApoE3但無LNP組合物之培養基模擬編輯另一組細胞，以充當未經編輯或WT對照。所有細胞在37℃下培育24小時。
在第二輪編輯之後24小時，細胞藉由在500×G下旋轉5 min來洗滌且再懸浮於含有5% CTS™免疫細胞SR(Gibco目錄號A2596101)、100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/ml IL-7(Peprotech, 目錄號200-07)及5 ng/ml IL-15(Peprotech，目錄號200-15)之TCEM培養基中。細胞在培養基及細胞介素定期更換的G-Rex板中培養及保持7天，之後將其再懸浮於Cryostor CS10培養基(Stemcell Technologies，目錄號07930)中且在液氮中冷凍直至進一步使用。
將六組供體T細胞(野生型未經編輯，B2M KO，HLA-A KO，CIITA KO，HLA-A+ CIITA DKO，B2M+ CIITA DKO)解凍且以1×10 6個/mL再懸浮於TCGM+100 U/ml IL2，0.5 ng/mL IL-7 & IL-15(供體及宿主HLA基因型如下表 28中所示)中。將來自3個宿主(自體宿主、同種異體宿主(HLA-B及C匹配宿主)及陽性對照宿主(HLA-A、HLA-B及HLA-C錯配)之外周血液單核細胞(PBMC)解凍，以1×10 6個/mL再懸浮於TCGM+100 U/ml IL-2，0.5 ng/mL IL-7 & IL-15中。供體及宿主細胞在37℃培育箱中靜置隔夜。第二天，供體細胞燒瓶以4000 rad照射且短暫離心，且各組以1×10 6個/mL再懸浮於無細胞介素之TCGM中。使用CD56微珠(Miltenyi Biotec, 目錄號130-050-401)使來自兩個宿主之宿主PBMC耗盡CD56+細胞。將約1×10 6個來自各宿主之細胞保存於15 mL用於未標記之流動對照的試管中。為標記各宿主之18×10 6個細胞，使一瓶Cell Trace Violet(Thermo Fisher, 目錄號C34571)達到室溫且使用20 μL DMSO復原以產生5 mM CTV儲備液。宿主細胞以約1×10 6個/mL再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(Corning, 目錄號21-040-CV)中且轉移至另一50 mL錐形管。在添加18 μL CTV至管中以染色宿主細胞之後，將管轉移至37℃培育箱中15分鐘。在此之後，管用無細胞介素之TCGM注滿至40 mL以吸收任何未結合染料。經標記之宿主細胞接著在500×g下短暫離心5分鐘且以1×10 6個/mL再懸浮於無細胞介素之TCGM中。每孔塗鋪來自適當宿主之50,000個細胞/50 µL/孔宿主PBMC。在需要4倍宿主細胞之孔(對照樣品以標準化資料)中，每200 µL/孔塗鋪200,000個宿主細胞。在標記為「宿主+TransAct」(增殖陽性對照)宿主細胞中，接種50,000個細胞/50 µL/孔宿主PBMC，隨後添加1 µL之T細胞TransAct™，人類(Miltenyi Biotec，目錄號130-111-160)，且此等孔之體積用無細胞介素之TCGM補足至200 μL。經照射之供體細胞係根據板佈局以150,000個細胞/150 µL/孔塗鋪。對於流動對照，將來自一個供體及宿主之50,000個細胞一起塗鋪。所有孔中之體積用無細胞介素之TCGM填充至200 μL。
在共培養後第5天，來自各孔之一半培養基(約100 μL)用新鮮培養基(無細胞介素之TCGM)替換。
共培養後第8天，將分析板染色且藉由流動式細胞測量術分析。出於染色之目的，該板在600×g下旋轉3分鐘，輕擊以移除培養基，且將100 μL之Fc阻斷劑(Biolegend, 目錄號422302)在FACS緩衝液中的1: 100 v/v溶液添加至各孔中。將細胞再懸浮於Fc阻斷劑中，且在室溫下培育板5分鐘。製備抗體混合液以使得各抗體以1: 100 v/v稀釋度存在，且將100 μL此抗體混合物添加至各樣品孔中。藉由用鋁箔覆蓋來使該板避光，且在2至8℃下培育20至30分鐘。染色後，該板以600×g旋轉3分鐘，輕擊以移除培養基且用200 μL FACS緩衝液洗滌。再次洗滌該板，且使細胞集結粒再懸浮於70 μL生存力染料7-AAD(BD Pharmingen，目錄號51-68981E)之1: 200 v/v溶液中。未染色孔再懸浮於70 μL FACS緩衝液中。該板在Cytoflex流動式細胞儀上以快速模式(60秒/孔)運行。展示於 表 29A 及 29B及 圖 8A 及 8B(圖展示野生型、B2M KO及HLA-A+ CIITA DKO之資料子集)中之結果證實，HLA-A+ CIITA DKO細胞在同種異體宿主(HLA-B及C匹配)中引發最少CD4及CD8反應，其與B2M+ CIITA DKO細胞所引發之反應類似。對於相應宿主，各組之結果已標準化為4倍宿主組的增殖之結果。
表 28-T 細胞供體及 PBMC 宿主之基因型
HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DR HLA-DQ HLA-DP
T 細胞供體及自體宿主 A*02:01:01G, 03:01:01G B*07:02:01G C*07:02:01G DRB1*15:01:01G, DRB5*01:01:01G DQA1*01:02:01G, DQB1*06:02:01G DPA1*01:03:01G, 02:07:01G, DPB1*04:01:01G, 19:01:01G
B 、 C 匹配宿主 A*02:01:01G B*07:02:01G, 44:02:01G C*05:01:01G, 07:02:01G DRB1*13:01:01G, 15:01:01G, DRB3*01:01:02G, DRB5*01:01:01 DQB1*06:02:01G, 06:03:01G, DQA1*01:02:01G, 01:03:01G DPB1*02:01:02G, 04:02:01G, DPA1*01:03:01G
HLA 錯配宿主 A*11:01:01G, 24:02:01G B*40:01:01G C*03:04:01G DRB1*08:01:01G, 13:02:01G, DRB3*03:01:01G DQB1*04:02:01G, 06:04:01G DPB1*03:01:01G, 05:01:01G
表 29A- 宿主 CD4+ T 細胞 之增殖
組 自體宿主 同種異體宿主 陽性對照宿主
標準化增殖%平均值 標準化增殖%SD 標準化增殖%平均值 標準化增殖%SD 標準化增殖%平均值 標準化增殖%SD
WT -13.76 3.05 5.93 1.72 39.07 3.68
B2M KO -13.50 2.66 -3.22 5.10 42.47 3.20
CIITA KO -12.62 4.27 -7.00 5.54 -8.83 14.93
B2M+CIITA KO -11.98 2.76 -5.15 5.21 -14.20 4.64
HLA-A KO -9.14 7.96 7.67 12.41 41.83 5.01
HLA-A+CIITA KO -11.33 2.03 -3.00 4.47 -3.97 6.57
表 29B- 宿主 CD8+ T 細胞 之增殖
組 自體宿主 同種異體宿主 陽性對照宿主
標準化增殖%平均值 標準化增殖%SD 標準化增殖%平均值 標準化增殖%SD 標準化增殖%平均值 標準化增殖%SD
WT 7.53 6.95 35.71 12.28 74.00 1.42
B2M KO -8.87 3.75 20.41 0.95 31.97 11.70
CIITA KO 1.43 5.24 6.17 4.89 56.07 8.53
B2M + CIITA KO 9.63 14.50 -0.05 4.59 0.47 5.23
HLA-A KO 22.40 23.65 25.31 16.59 71.83 2.25
HLA-A + CIITA KO 17.57 12.00 5.14 2.88 58.13 7.02
實例 12 ： 用於多種基因破壞及插入之多種 LNP 組合物之依序遞送
T細胞經一系列基因破壞及插入進行工程化。健康供體細胞依序用四種LNP組合物處理，各LNP組合物用編碼Cas9(SEQ ID NO: 802)之mRNA及靶向TRAC(G013006) (SEQ ID NO: 243)、TRBC(G016239) (SEQ ID NO: 247)、CIITA(G013675) (SEQ ID NO: 246)或HLA-A(G018995)之sgRNA (包含表ID NO: 13之sgRNA，如表2中所示)共同調配。根據 表 3 0中所指示之組用指定劑量分別為35: 47.5: 15: 2.5莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG(第1組及第2組)或分別為50:35:10:1.5莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG(第3組)調配LNP組合物。第1組及第2組在LNP濃度方面不同。脂質核酸組裝體以約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配。藉由使用AAV遞送同源定向修復模板將靶向TCR之轉殖基因WT1位點特異性整合至TRAC切割位點中。每天製備LNP組合物且遞送至如 表 30中所述之T細胞。 12.1. T 細胞製備
來自三個HLA-A*02:01+血清型之T細胞係自兩個健康供體之白細胞去除術產物(STEMCELL Technologies)分離得到。使用EasySep人類T細胞分離套組(STEMCELL Technologies，目錄號17951)遵循製造商之方案分離T細胞且使用Cryostor CS10 (STEMCELL Technologies，目錄號07930)冷凍保存。在開始T細胞編輯之前一天，細胞經解凍且在T細胞活化培養基(TCAM：CTS OpTmizer ，Thermofisher，#A3705001)中靜置隔夜，該培養基補充有2.5%人類AB血清(Gemini，#100-512)、1× GlutaMAX (Thermofisher，#35050061)、10 mM HEPES (Thermofisher，#15630080)、200 U/mL IL-2 (Peprotech，#200-02)、IL-7 (Peprotech，#200-07)及IL-15 (Peprotech，#200-15)。 12.2. T 細胞之 LNP 處理及擴增
LNP組合物每日在含ApoE之培養基中解凍且稀釋，且如下遞送至T細胞。
表 30- 用於 T 細胞工程化之編輯順序
組 第 1 天編輯 (LNP 調配物& 最終濃度) 第 2 天編輯 (LNP 調配物& 最終濃度) 第 3 天編輯 (LNP 調配物& 最終濃度) 第 4 天編輯 (LNP 調配物& 最終濃度)
第1組 CIITA KO (脂質A：35:47.5:15:2.5, 0.65 μg/mL) HLA-A KO (脂質A：35:47.5:15:2.5, 0.65 μg/mL) TRAC KI (脂質A：35:47.5:15:2.5, 0.65 μg/mL) TRBC KO (脂質A：35:47.5:15:2.5, 0.65 μg/mL)
第2組 CIITA KO (脂質A：35:47.5:15:2.5, 2.5 μg/mL) HLA-A KO (脂質A：35:47.5:15:2.5, 2.5 μg/mL) TRAC KI (脂質A：35:47.5:15:2.5, 2.5 μg/mL) TRBC KO (脂質A：35:47.5:15:2.5, 2.5 μg/mL)
第3組 CIITA KO (脂質A：50:35.5:10:1.5, 2.5 μg/mL) HLA-A KO (脂質A：50:35.5:10:1.5, 2.5 μg/mL) TRAC KI (脂質A：50:35.5:10:1.5, 2.5 μg/mL) TRBC KO (脂質A：50:35.5:10:1.5, 2.5 μg/mL)
未經編輯 無 無 無 無
在第1天，如 表 30中所指示之LNP組合物在含有5 µg /ml rhApoE3(Peprotech 350-02)的TCAM中培育。同時，T細胞經採集，洗滌，且以2×10 6個細胞/毫升之密度再懸浮於具有1:50稀釋之T細胞TransAct，人類試劑(Miltenyi，130-111-160)的TCAM中。T細胞及LNP-ApoE培養基以1:1比率混合且在培養瓶中塗鋪T細胞隔夜。
在第2天，如 表 30中所指示之LNP組合物在含有20 μg/mL rhApoE3 (Peprotech，350-02)之TCAM中以25 μg/mL之濃度培育。接著將LNP-ApoE溶液以10:1比率添加至適當培養物中。
在第3天，如 表 30中所指示之TRAC-LNP組合物在含有5 µg/ml rhApoE3(Peprotech 350-02)的TCAM中培育。同時，T細胞經採集，洗滌，且以1×10 6個細胞/毫升之密度再懸浮於TCAM中。T細胞及LNP-ApoE培養基以1:1比率混合且在培養瓶中塗鋪T細胞。接著以3×10 5個GC/細胞的MOI將WT1 AAV添加至各組中。DNA-PK抑制劑「化合物1」以0.25 µM之濃度添加至各組。
在第4天，如 表 30中所指示之LNP組合物在含有5 µg/ml rhApoE3(Peprotech 350-02)的TCAM中培育。同時，T細胞經採集，洗滌，且以1×10 6個細胞/毫升之密度再懸浮於TCAM中。T細胞及LNP-ApoE培養基以1:1比率混合且在培養瓶中塗鋪T細胞。
在第5天至第13天，根據製造商的方案將T細胞轉移至24孔GREX板(Wilson Wolf，80192)之T細胞擴增培養基(TCEM：CTS OpTmizer(Thermofisher #A3705001)中，該培養基補充有5%人類AB血清(Gemini #100-512)、1×GlutaMAX(Thermofisher #35050061)、10 mM HEPES(Thermofisher #15630080)、200 U/mL IL-2(Peprotech #200-02)、IL-7(Peprotech #200-07)、IL-15(Peprotech #200-15)並且擴增。簡言之，T細胞擴增8天，每2至3天更換培養基。
擴增後，藉由流動式細胞測量術分析經編輯T細胞以測定HLA-A*02：01基因剔除，經由CIITA基因剔除之HLA-DR-DP-DQ減弱，WT1-TCR插入(CD3 +Vb8 +)，及表現殘餘內源性(CD3 +Vb8 -)之細胞的百分比。將T細胞與靶向以下分子之抗體混合液一起培育：Vb8(Biolegend, 目錄號348104)、HLA-A2(Biolegend, 目錄號343320)、HLA-DRDPDQ(Biolegend, 目錄號361712)、CD4(Biolegend, 目錄號300538)、CD8(Biolegend, 目錄號301046)、CD3(Biolegend, 目錄號317336)、CCR7(Biolegend, 目錄號353214)、CD62L(Biolegend, 目錄號304820)、CD45RA(Biolegend, 目錄號304134)、CD45RO(Biolegend, 目錄號304230)、CD56(Biolegend, 目錄號318328)及Viakrome(Beckman Coulter，目錄號C36628)。隨後洗滌細胞，在Cytoflex LX儀器(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo套裝軟體進行分析。根據大小及CD4/CD8狀態對T細胞進行閘控，隨後測定編輯及插入率。對於CD8+ T細胞，在依序T細胞工程化之後表現相關細胞表面蛋白之細胞的百分比分別展示於 表 31及 圖 12A中。具有所有預期編輯(插入WT1-TCR，結合HLA-A及CIITA之基因剔除)之T細胞的百分比閘控為CD3 +Vb8 +HLA-A-HLA-DRDPDQ-%且展示於 圖 12B中。在所有組之經編輯樣品中觀察到高含量之HLA-A及CIITA基因剔除，以及WT1-TCR插入，產生＞75%之經完全編輯之CD8+ T細胞。與脂質A 35: 15: 47.5: 2.5組合物一起使用之較低劑量(0.65 µg/mL)在編輯跨所有目標之T細胞方面展示出與較高劑量(2.5 µg/mL)之脂質A 50: 10: 35.5: 1.5調配物類似的效力。
表 31. CD8+ T 細胞 中之編輯率
第1組 第2組 第3組 未經編輯
編輯 平均值 SD N 平均值 SD N 平均值 SD N 平均值 SD N
經完全編輯 (Vb8+、CD3+、HLA-DRPDPDQ-、HLA-A*02:01-) 79.6 4.7 3.0 80.5 4.2 3.0 76.8 1.9 3.0 0.2 0.2 3.0
HLA-A KO (HLA-A*02:01-) 97.1 3.6 3.0 96.4 4.7 3.0 96.4 4.4 3.0 3.6 3.8 3.0
CIITA KO (HLA-DRDPDQ-) 99.3 0.4 3.0 97.7 2.1 3.0 98.7 0.9 3.0 na na na
TCR KO (CD3-) 99.3 0.1 3.0 99.7 0.1 3.0 98.7 1.1 3.0 1.8 1.4 3.0
WT1 TCR插入(Vb8+) 82.6 2.0 3.0 85.6 0.8 3.0 81.1 2.1 3.0 0.2 0.2 3.0
實例13：工程化T細胞之細胞毒性敏感性
當藉由自然殺手(NK)細胞靶向時，分析工程化T細胞之細胞毒性敏感性。
將NK細胞(Stemcell Technologies)解凍且以1×10 6個細胞/毫升之細胞濃度再懸浮於T細胞生長培養基(TCGM)中，該生長培養基由OpTmizer TCGM構成且進一步補充有100 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/mL IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。細胞在37℃下培育24小時。
解凍後24小時，NK細胞用0.5 μM Cell Trace Violet (CTV)標記如下：將一小瓶CTV (用於流動式細胞測量術的CellTrace™ Violet Cell Proliferation Kit，目錄號C34571)在來自套組之DMSO中復原以得到5 mM儲備濃度。用18 μL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (Corning，目錄號21-040-CV)稀釋2 μL CTV儲備液以獲得0.5 mM之濃度。NK細胞在500×g下離心5分鐘，抽吸培養基，且將細胞以1×10 6個細胞/毫升之濃度再懸浮於PBS中，使得CTV染料之最終濃度為0.5 μM。將細胞與CTV染料溶液混合，在37℃下培育20分鐘。藉由添加TCGM來淬滅未結合染料且培育5分鐘。將細胞以500×g離心5分鐘。細胞以2×10 6個細胞/毫升之濃度再懸浮於補充有100 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/mL IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)之TCGM中。為測試效應子:目標(E:T)比率範圍，將經CTV標記之NK細胞在6點、2倍連續稀釋之100 μL培養基中等分，其中最高數目之細胞為2×10 5個細胞。包括僅培養基樣本作為陰性對照。
使用靶向HLA-A之G023523(SEQ ID NO: 1016)作為測試樣品及靶向B2M之G023519(SEQ ID NO: 816)作為NK殺死陽性對照，使用BC22n及UGI mRNA工程化T細胞。
遵循製造商方案，使用EasySep人類T細胞分離套組(Stem Cell Technology，目錄號17951)自白血球去除產物製備T細胞。將T細胞冷凍保存於Cryostor CS10冷凍培養基(目錄號07930)中供將來使用。在解凍之後，T細胞以1.0×10 6個細胞/毫升之密度在由RPMI 1640 (Corning，目錄號10-040-CV)構成之T細胞R10培養基中塗鋪，該培養基含有10% (v/v)胎牛血清、2 mM Glutamax (Gibco，目錄號35050-061)、22 µM of 2-巰基乙醇、100 μM非必需胺基酸(Corning，目錄號25-025-Cl)、1 mM丙酮酸鈉、10 mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈黴素外加100 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)。用Dynabeads®人類T-活化子CD3/CD28 (Gibco，目錄號11141D)活化T細胞。細胞在mRNA轉染之前在T細胞培養基中擴增72小時。
在無菌水中製備含有編碼BC22n (SEQ ID NO: 972)或UGI (SEQ ID NO: 1005)之mRNA的溶液。將50 µM靶向CIITA自其儲存板移除，且在95℃下變性2分鐘，隨後在冰上冷卻。活化後72小時，採集T細胞，離心，且以12.5×10 6個T細胞/毫升之濃度再懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza)中。對於待電穿孔之各孔，將1×10 5個T細胞與200 ng編輯mRNA(BC22n)、200 ng UGI mRNA及20 pmol sgRNA在P3電穿孔緩衝液中混合，最終體積為20 µL。使用製造商的脈衝碼電穿孔此混合物。
分析未經編輯T細胞作為NK殺死之陰性對照。流動式細胞測量術之其他對照包括無T細胞之經CTV標記的NK細胞；組合未經標記之NK細胞與T細胞之「未染色」樣本；及未經標記之熱殺死及非熱殺死NK細胞與用7AAD染色之T細胞之1:1混合物。T細胞以2×10 5個細胞之密度再懸浮於TCGM中，其由OpTmizer TCGM構成且進一步補充有100 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/mL IL-15 (Peprotech，目錄號200-15)。將兩萬個T細胞添加至NK細胞及培養基對照之每一孔中。細胞在37℃下培育24小時。
在24小時之時，將來自LD熱殺死孔之一半體積之細胞熱殺死且轉移回至分析板中的相同孔。將細胞離心且再懸浮於80 μL之7-AAD (BD Biosciences，目錄號559925)於FACS緩衝液(PBS+2% FBS (Gibco，目錄號A31605-02)+2 mM EDTA (Invitrogen，目錄號15-575-020))之1:200 v/v溶液中。藉由流動式細胞測量術使用Cytoflex LX儀器(Beckman Coulter)獲取T細胞之比溶胞率資料且使用FlowJo套裝軟體進行分析。首先對CTV陰性群體設閘以清除NK細胞，接著針對單細胞進行閘控，其後對7-AAD陰性群體設閘以閘控活T細胞。藉由自100減去活細胞百分比來計算T細胞之溶解百分比。使用BC22n及HLA-A引導物G023523 (SEQ ID NO: 1016)編輯之T細胞受到保護，免受NK細胞介導之細胞毒性，如 表 32及 圖 13中所展示。
表 32- 暴露於 HLA-B 及 C 匹配 NK 細胞之工程化 T 細胞的平均溶解百分比
E:T 未經編輯 G023519 B2M G023523 HLA-A
平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n
10 19.65 2.33 2 69.60 4.81 2 22.23 1.10 3
5 18.80 1.59 3 61.10 0.85 2 21.35 0.49 2
2.5 22.27 6.62 3 47.95 0.49 2 22.10 1.27 2
1.25 18.47 1.27 3 39.20 2.98 3 21.00 0.81 3
0.63 19.30 0.66 3 30.20 NA 1 19.75 0.35 2
0.31 20.70 5.02 3 40.60 NA 1 20.27 1.67 3
0 19.77 2.01 3 26.57 2.73 3 18.30 1.41 3
實例 14 ： 用 BC22n 、 UGI 及 91 聚體 sgRNA 編輯人類 T 細胞
將藉由受體基因剔除評定之91聚體sgRNA之鹼基編輯功效與具有相同引導序列之100聚體sgRNA格式之鹼基編輯功效進行比較。
所測試之91聚體sgRNA包括20個核苷酸引導序列(如由N表示)及如下之引導物支架：mN*mN*mN* NNNNNNNN NNNNNNN NNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmUmGmC*mU (SEQ ID NO: 1003)，除非另外指示，否則其中A、C、G、U及N分別為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶及任何核糖核苷酸。m指示2'O-甲基修飾，且 *指示核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。引導物之未經修飾及經修飾型式提供於表6(序列表)中。 實例 14.1. T 細胞製備
健康人類供體血球分離術為自商品取得(Hemacare)，且細胞經洗滌、再懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄號130-070-525)中且在MultiMACS™ Cell 24 Separator Plus裝置(Miltenyi Biotec)中進行處理。使用Straight from Leukopak® CD4/CD8 MicroBead套組，人類(Miltenyi Biotec目錄號130-122-352)經由陽性選擇分離T細胞。將T細胞等分且冷凍保存於Cryostor® CS10(StemCell Technologies目錄號07930)中以供將來使用。
解凍後，將T細胞以1.0×10 6個細胞/毫升之密度在T細胞生長培養基(TCGM)中塗鋪，該培養基由CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充物(ThermoFisher目錄號A1048501)、5%人類AB血清(Gemini，目錄號100-512)、1×青黴素-鏈黴素、1×Glutamax、10 mM HEPES、200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/ml重組人類介白素7 (Peprotech，目錄號200-07)及5 ng/ml重組人類介白素15 (Peprotech，目錄號200-15)構成。T細胞在此培養基中靜置24小時，此時其經以1:100體積比添加之T Cell TransAct™人類試劑(Miltenyi，目錄號130-111-160)活化。T細胞在LNP處理之前活化48小時。 實例 14.2 . T 細胞 LNP 處理及擴增
活化後48小時，採集T細胞，在500 g下離心5分鐘，且以1×10 6個T細胞/毫升之濃度再懸浮於T細胞塗鋪培養基(TCPM)中，該培養基為一種無血清型式之TCGM，含有400 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄號200-02)、10 ng/ml重組人類介白素7 (Peprotech，目錄號200-07)及10 ng/ml重組人類介白素15 (Peprotech，目錄號200-15)。每孔添加50 µL存於TCPM中之T細胞(5×10 4個T細胞)，在平底96孔板中進行處理。
如實例1中所描述以35:47.5:15:2.5 (脂質A/膽固醇/DSPC/PEG2k-DMG)之比率製備LNP。用約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)莫耳比來調配LNP。LNP封裝單一RNA物種，即如 表 34中所描述之sgRNA、BC22n mRNA (SEQ ID No: 972)或UGI mRNA (SEQ ID No. 1005)。
表 33-100 聚體 及 91 聚體 sgRNA 。
基因目標 100 聚體 91 聚體
HLA-A G021209 (SEQ ID NO: 381) G023523 (SEQ ID NO: 1016)
在T細胞處理之前，封裝sgRNA之LNP在T細胞處理培養基(TCTM)中稀釋至6.64 µg/mL，該培養基為一種含有20 μg/mL rhApoE3，不存在介白素2、5或7的TCGM型式。此等LNP在37℃下培育15分鐘且使用TCTM以1:4連續稀釋，此產生6.64 µg/mL至零範圍內之8點稀釋系列。類似地，將具有BC22n mRNA (SEQ ID NO: 972)或UGI mRNA (SEQ ID NO: 1005)之單負荷LNP在TCTM中分別稀釋至3.32及1.67 µg/mL，在37℃下培育15分鐘，且按體積計以1:1與先前步驟中連續稀釋之sgRNA LNP混合。最後，將來自所得混合物之50 µL以1:1體積比添加至96孔板中之T細胞中。將T細胞在37℃下培育24小時，此時進行採集，在500 g下離心5分鐘，再懸浮於200 µL TCGM中，且返回至培育箱。 實例14.4.藉由流動式細胞測量術評估受體基因剔除
藉由流動式細胞測量術而非NGS評估靶向HLA-A基因之該組sgRNA，此係由於HLA-A基因座之超多態性質。
LNP處理後七天，藉由流動式細胞測量術分析T細胞以評估受體基因剔除。將T細胞與可固定生存力染料(Beckman Coulter，目錄號C36628)及靶向HLA-A2之抗體混合液(Biolegend, 目錄號343304)一起培育。隨後洗滌細胞，在Cytoflex LX儀器(Beckman Coulter)上使用FlowJo套裝軟體進行分析。在測定任何標記表現之前，根據大小、生存力及CD8陽性對T細胞進行閘控。所得資料繪製在GraphPad Prism v. 9.0.2上且使用可變斜率(四個參數)非線性回歸進行分析。
如 表 34 及 35及 圖 14中所示，所測試之91聚體sgRNA勝過100聚體型式。100聚體格式(HLA-A)效力較低(亦即較高EC50)之目標似乎自使用91聚體sgRNA中獲益最多。
表 34- 在分別 100 聚體 或 91 聚體 格式之靶向 HLA-A 之 sgRNA 處理 之 後對於 HLA-A2 表面受體呈陰性之 CD8+ T 細胞的平均百分比。
sgRNA (ng) HLA-A (HLA-A2-)
100 聚體 91 聚體
平均值 SD 平均值 SD
166.00 98.8 0.1 99.6 0.2
41.50 93.6 0.8 99.2 0.4
10.38 70.2 1.0 93.8 1.4
2.59 34.0 2.1 63.2 3.0
0.65 12.1 1.3 28.5 1.2
0.16 3.3 0.2 8.3 0.6
0.04 0.9 0.3 2.6 0.5
0.00 0.1 0.0 0.3 0.2
表 35- 導致 CD8+ T 細胞表面中受體表現之 50% 損失之 sgRNA 的量 (pmol) (EC50) 。 最右行展示當與具有相同引導序列之 100 聚體 相比時 ， 由 91 聚體 sgRNA 達成之效力的增加倍數。
基因目標 100 聚體 91 聚體 EC50 移位 ( 100 聚體 /91 聚體)
sgRNA ID EC50 (pmol) sgRNA ID EC50 (pmol)
HLA-A G021209 0.150 G023523 0.053 2.81
實例15：藉由NGS之HLA-A編輯與藉由流動式細胞測量術之蛋白質KO之間的相關性
將來自三個T細胞供體(第一個對於HLA-A*02:01:01G, 03:01:01G為異型接合的、第二個對於HLA-A*02:01:01G為同型接合的及第三個對於HLA-A*03:01:01G為同型接合的 )之冷凍T細胞以1.5×10 6個細胞/毫升之細胞濃度解凍至由CTS OpTmizer培養基(Gibco目錄號A10485-01)構成之T細胞生長培養基(TCGM)中，該培養基具有2.5% GemCell加人類AB血清(Gemini, 目錄號100-512)及各10 mL GlutaMAX 100X(Gibco目錄號35050061)、HEPES(Gibco，目錄號15630080)及Pen/Strep(Gibco，目錄號15140-122)，進一步補充有100 U/mL重組人類介白素-2(Peprotech，目錄號200-02)、5 ng/mL IL-7(Peprotech，目錄號200-07)、5 ng/mL IL-15(Peprotech，目錄號200-15)，且在37℃培育箱中靜置隔夜。
解凍後24小時，在37℃下使用1:100稀釋之T細胞TransActTM(Miltenyi Biotec，目錄號130-111-160)將細胞活化24小時。以1×10 5個細胞/100微升/孔塗鋪細胞，且隨後以LNP調配之引導物的連續稀釋液轉染，以5 μg/mL作為最高劑量開始且降至0.04 μg/mL。
轉染後第5天，旋轉來自各供體之細胞且收集用於NGS分析。使用QuickExtract DNA提取溶液提取基因體DNA。進行PCR1以擴增基因特異性序列，同時進行PCR2以擴增常見轉接子以進行定序(NEB目錄號N0494)。在藉由NGS定序之前使用AMPure XP珠粒(Beckman Coulter目錄號A63881)清潔PCR樣品。
轉染後第8天，將分析板染色且藉由流動式細胞測量術分析。出於染色之目的，該板在500×g下旋轉5分鐘，輕擊以移除培養基，且將100 μL之Fc阻斷劑(Biolegend, 目錄號422302)在FACS緩衝液中的1: 100 v/v溶液添加至各孔中。將細胞再懸浮於Fc阻斷劑中，且在室溫下培育板5分鐘。製備抗體混合液，使得各抗體(HLA-A2單株抗體(BB7.2)，APC，eBioscience，目錄號17-9876-42及HLA-A3單株抗體(GAP.A3)，PE，eBioscience，目錄號12-5754-42)以1:100 v/v稀釋液存在且將100μL此抗體混合物添加至各樣品孔中。藉由用鋁箔覆蓋來使該板避光，且在2至8℃下培育20至30分鐘。染色後，該板以600×g旋轉3分鐘，輕擊以移除培養基且用200 μL FACS緩衝液洗滌。再次洗滌該板，且使細胞集結粒再懸浮於100 μL FACS緩衝液中。該板在Cytoflex流動式細胞儀上以快速模式(60秒/孔)運行。資料分析在FlowJo上進行。
在全部三個供體中且對於三個獨特引子組觀測到蛋白質基因剔除與編輯之間的高相關性，如 表 36 至 38及 圖 15A 至 15C中所示。 表 36 ： 供體 A 中之 HLA-A 基因編輯與蛋白質基因剔除的相關性
LNP濃度 NGS引子1 (編輯%) NGS引子2 (編輯%) NGS引子3 (編輯%) 蛋白質KO
5 92.7 91.9 93.5 89.15
2.5 93.6 94.4 92.7 88.35
1.25 93.2 94 92.8 87.55
0.63 72.9 79.3 74.3 68.45
0.31 41.8 41.8 46.1 27.6
0.17 12.9 18.5 15.8 7.23
0.08 4.7 7.8 1.9 1.44
0.04 2 1.7 6.8 0.30
表 37 ： 供體 B 中之 HLA-A 基因編輯與蛋白質基因剔除的相關性
LNP濃度 NGS引子1 (編輯%) NGS引子2 (編輯%) NGS引子3 (編輯%) 蛋白質KO
5 97.9 97.5 97.9 92.3
2.5 97.2 96.9 97.2 92.6
1.25 96.4 96.1 96.5 91.25
0.63 82.1 81.9 82 71.35
0.31 42.4 43.6 44.7 24.5
0.17 20.3 20.2 21.2 5.65
0.08 7.4 8.6 8.4 0.94
0.04 2.1 2.7 2.3 0.15
表 38 ： 供體 C 中之 HLA-A 基因編輯與蛋白質基因剔除的相關性
LNP濃度 NGS引子1 (編輯%) NGS引子2 (編輯%) NGS引子3 (編輯%) 蛋白質KO
5 96.6 95.3 96.6 99.295
2.5 97.3 97.4 97.3 99.165
1.25 95.7 95.8 97.4 98.9
0.63 77.9 78.1 79.4 91
0.31 37.7 38.5 37.7 54.25
0.17 16.3 16 16.7 23.35
0.08 7 6.8 6.5 9.22
0.04 3.1 2.5 2.6 3.108
實例 16 . 額外實施例
以下經編號實施例提供對本文中之實施例之額外支援及描述。
實施例1為一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。
實施例2為一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：(a)chr6: 29942854-chr6: 29942913及(b)chr6: 29943518-chr6: 29943619；其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。
實施例3為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有降低或消除之至少一種選自以下之HLA-A等位基因的表現：HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11，及HLA-A24。
實施例4為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有降低或消除之HLA-A1表現。
實施例5為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有降低或消除之HLA-A2表現。
實施例6為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有降低或消除之HLA-A3表現。
實施例7為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有降低或消除之HLA-A11表現。
實施例8為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有降低或消除之HLA-A24表現。
實施例9為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29942864-chr6:29942903內之至少一個核苷酸。
實施例10為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528-chr6:29943609內之至少一個核苷酸。
實施例11為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。
實施例12為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609。
實施例13為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29942876-29942897內的至少一個核苷酸。
實施例14為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528-chr629943550內的至少一個核苷酸。
實施例15為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896，及chr6:29942877-29942897。
實施例16為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549及chr6:29943530-29943550。
實施例17為一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
實施例18為一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
實施例19為如實施例17至18中任一項之工程化細胞，其中該細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
實施例20為如實施例17至19中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個連續核苷酸，或其中該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。
實施例21為如實施例17至20中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。
實施例22為如實施例17至21中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標內的至少一個C成為T之取代或至少一個A成為G之取代。
實施例23為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：(a)chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046, chr6:29934330-29934350、chr6:29943115-29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140-29943160、chr6:29943590-29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858-29943878、chr6:29944478-29944498及chr6:29944850-29944870；(b)chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046；(c)chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609；(d)chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903；(e)chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609；(f)chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896及chr6:29942877-29942897；(g)chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549及chr6:29943530-29943550；(h)chr6:29945290-29945310、chr6:29945296-29945316及chr6:29945297-29945317、chr6:29945300-29945320；(i)chr6:29890117-29890137、chr6:29927058-29927078、chr6:29934330-29934350、chr6:29942541-29942561、chr6:29942542-29942562、chr6:29942543-29942563、chr6:29942543-29942563、chr6:29942550-29942570、chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897、chr6:29942883-29942903、chr6:29943062-29943082、chr6:29943063-29943083、chr6:29943092-29943112、chr6:29943115-29943135、chr6:29943118-29943138、chr6:29943119-29943139、chr6:29943120-29943140、chr6:29943126-29943146、chr6:29943128-29943148、chr6:29943129-29943149、chr6:29943134-29943154、chr6:29943134-29943154、chr6:29943135-29943155、chr6:29943136-29943156、chr6:29943140-29943160、chr6:29943142-29943162、chr6:29943143-29943163、chr6:29943188-29943208、chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550、chr6:29943536-29943556、chr6:29943537-29943557、chr6:29943538-29943558、chr6:29943549-29943569、chr6:29943556-29943576、chr6:29943589-29943609、chr6:29943590-29943610、chr6:29943590-29943610、chr6:29943599-29943619、chr6:29943600-29943620、chr6:29943601-29943621、chr6:29943602-29943622、chr6:29943603-29943623、chr6:29943774-29943794、chr6:29943779-29943799、chr6:29943780-29943800、chr6:29943822-29943842、chr6:29943824-29943844、chr6:29943857-29943877、chr6:29943858-29943878、chr6:29943859-29943879、chr6:29943860-29943880、chr6:29944026-29944046、chr6:29944077-29944097、chr6:29944078-29944098、chr6:29944458-29944478、chr6:29944478-29944498、chr6:29944597-29944617、chr6:29944642-29944662、chr6:29944643-29944663、chr6:29944772-29944792、chr6:29944782-29944802、chr6:29944850-29944870、chr6:29944907-29944927、chr6:29945024-29945044、chr6:29945097-29945117、chr6:29945104-29945124、chr6:29945105-29945125、chr6:29945116-29945136、chr6:29945118-29945138、chr6:29945119-29945139、chr6:29945124-29945144、chr6:29945176-29945196、chr6:29945177-29945197、chr6:29945177-29945197、chr6:29945180-29945200、chr6:29945187-29945207、chr6:29945188-29945208、chr6:29945228-29945248、chr6:29945230-29945250、chr6:29945231-29945251、chr6:29945232-29945252、chr6:29945308-29945328、chr6:29945361-29945381、chr6:29945362-29945382及chr6:31382543-31382563；(j)chr6:29942815-29942835、chr6:29942816-29942836、chr6:29942817-29942837、chr6:29942817-29942837、chr6:29942828-29942848、chr6:29942837-29942857、chr6:29942885-29942905、chr6:29942895-29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899-29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29942905-29942925、chr6:29942912-29942932、chr6:29942913-29942933、chr6:29943490-29943510、chr6:29943497-29943517、chr6:29943498-29943518、chr6:29943502-29943522、chr6:29943502-29943522、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943566-29943586、chr6:29943569-29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573-29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605、chr6:29943589-29943609、chr6:29943568-29943588及chr6:29942815-29942835. (k)chr6:29942884-29942904、chr6:29943519-29943539、chr6:29942863-29942883；(l)chr6:29943517-29943537及chr6:29943523-29943543；(m)chr6:29942845-29942869、chr6:29942852-29942876、chr6:29942865-29942889、chr6:29942891-29942915、chr6:29942895-29942919、chr6:29942903-29942927、chr6:29942904-29942928、chr6:29943518-29943542、chr6:29943525-29943549、chr6:29943535-29943559、chr6:29943538-29943562、chr6:29943539-29943563、chr6:29943547-29943571、chr6:29943547-29943571、chr6:29943548-29943572、chr6:29943555-29943579、chr6:29943556-29943580、chr6:29943557-29943581、chr6:29943558-29943582、chr6:29943559-29943583、chr6:29943563-29943587、chr6:29943564-29943588、chr6:29943565-29943589、chr6:29943568-29943592、chr6:29943571-29943595、chr6:29943572-29943596、chr6:29943595-29943619、chr6:29943596-29943620及chr6:29943600-29943624；(n)chr6:29942885-29942905、chr6:29942895-29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899-29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943529-29943549、chr6:29943566-29943586、chr6:29943568-29943588、chr6:29943569-29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573-29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605及chr6:29943589-29943609；或(o)chr6:29942469-29942489、chr6:29943058-29943078、chr6:29943063-29943083、chr6:29943080-29943100、chr6:29943187-29943207、chr6:29943192-29943212、chr6:29943197-29943217、chr6:29943812-29943832、chr6:29944349-29944369、chr6:29944996-29945016、chr6:29945018-29945038及chr6:29945341-29945361、chr6:29945526-29945546。
實施例24為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自chr6: 29942854-chr6: 29942913及chr6: 29943518-chr6: 29943619。
實施例25為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942876-29942897內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例26為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943528-chr629943550內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例27為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942864-29942884內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例28為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942868-29942888內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例29為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942876-29942896內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例30為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942877-29942897內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例31為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942883-29942903內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例32為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943126-29943146內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例33為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943528-29943548內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例34為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943529-29943549內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例35為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943530-29943550內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例36為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943537-29943557內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例37為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943549-29943569內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例38為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943589-29943609內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例39為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29944026-29944046內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
實施例40為如實施例23至39中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少10個連續核苷酸。
實施例41為如實施例23至40中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少15個連續核苷酸。
實施例42為如實施例23至41中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A基因體目標序列包含基因體座標內之至少17個、19個、18個或20個連續核苷酸。
實施例43為如實施例23至41中任一項之工程化細胞，其中該基因編輯系統包含類轉錄活化蛋白效應因子核酸酶(TALEN)。
實施例44為如實施例23至41中任一項之工程化細胞，其中該基因編輯系統包含經鋅指核酸酶。
實施例45為如實施例23至41中任一項之工程化細胞，其中基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
實施例46為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白。
實施例47為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為釀膿鏈球菌Cas9。
實施例48為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為奈瑟氏腦膜炎菌Cas9，視情況為Nme2Cas9。
實施例49為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為嗜熱鏈球菌Cas9。
實施例50為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為金黃色葡萄球菌Cas9。
實施例51為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1。
實施例52為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為來自胺基酸球菌屬之Cpf1。
實施例53為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1。
實施例54為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為C成為T之鹼基編輯劑。
實施例55為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為A成為G之鹼基編輯劑。
實施例56為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑包含APOBEC3A脫胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。
實施例57為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為Cas12a。
實施例58為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為CasX。
實施例59為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為Nme2Cas9。
實施例60為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為Mad7核酸酶。
實施例61為如實施例45之工程化細胞，其中經RNA引導之DNA結合劑或由核酸編碼之經RNA引導之DNA結合劑為ARCUS核酸酶。
實施例62為如實施例17至61中任一項之工程化細胞，其中該細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
實施例63為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中HLA-B等位基因係選自以下HLA-B等位基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02。
實施例64為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中HLA-C等位基因係選自以下HLA-C等位基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
實施例65為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中HLA-B等位基因係選自以下HLA-B等位基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02；HLA-C等位基因係選自以下HLA-C等位基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
實施例66為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中HLA-B及HLA-C等位基因係選自以下HLA-B及HLA-C等位基因中之任一者：HLA-B*07:02及HLA-C*07:02；HLA-B*08:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:02及HLA-C*05:01；HLA-B*35:01及HLA-C*04:01；HLA-B*40:01及HLA-C*03:04；HLA-B*57:01及HLA-C*06:02；HLA-B*14:02及HLA-C*08:02；HLA-B*15:01及HLA-C*03:03；HLA-B*13:02及HLA-C*06:02；HLA-B*44:03及HLA-C*16:01；HLA-B*38:01及HLA-C*12:03；HLA-B*18:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:03及HLA-C*04:01；HLA-B*51:01及HLA-C*15:02；HLA-B*49:01及HLA-C*07:01；HLA-B*15:01及HLA-C*03:04；HLA-B*18:01及HLA-C*12:03；HLA-B*27:05及HLA-C*02:02；HLA-B*35:03及HLA-C*04:01；HLA-B*18:01及HLA-C*05:01；HLA-B*52:01及HLA-C*12:02；HLA-B*51:01及HLA-C*14:02；HLA-B*37:01及HLA-C*06:02；HLA-B*53:01及HLA-C*04:01；HLA-B*55:01及HLA-C*03:03；HLA-B*44:02及HLA-C*07:04；HLA-B*44:03及HLA-C*07:01；HLA-B*35:02及HLA-C*04:01；HLA-B*15:01及HLA-C*04:01；及HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。
實施例67為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*07: 02及HLA-C*07: 02。
實施例68為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*08: 01及HLA-C*07: 01。
實施例69為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44: 02及HLA-C*05: 01。
實施例70為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*35: 01及HLA-C*04: 01。
實施例71為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞在細胞表面上具有降低之MHC II類蛋白表現。
實施例72為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有選自以下之基因之基因修飾：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。
實施例73為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有CIITA基因中之基因修飾。
實施例74為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞在細胞表面上具有降低之TRAC蛋白表現。
實施例75為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞在細胞表面上具有降低之TRBC蛋白表現。
實施例76為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞進一步包含外源核酸。
實施例77為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞包含編碼在該工程化細胞表面上表現之靶向受體或受體之配位體的外源核酸。
實施例78為如實施例77之工程化細胞，其中該靶向受體為CAR。
實施例79為如實施例77之工程化細胞，其中該靶向受體為TCR。
實施例80為如實施例77之工程化細胞，其中該靶向受體為WT1 TCR。
實施例81為如實施例77之工程化細胞，其中該工程化細胞包含受體之配位體。
實施例82為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞進一步包含編碼藉由該工程化細胞分泌之多肽的外源核酸。
實施例83為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為免疫細胞。
實施例84為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為初級細胞。
實施例85為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞或粒細胞。
實施例86為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為淋巴球。
實施例87為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞為T細胞。
實施例88為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞為CD8+ T細胞。
實施例89為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞為CD4+ T細胞。
實施例90為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞為B細胞。
實施例91為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞為自然殺手(NK)細胞。
實施例92為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞為巨噬細胞。
實施例93為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為B細胞。
實施例94為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為漿B細胞。
實施例95為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為記憶B細胞。
實施例96為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該細胞為幹細胞或先驅細胞。
實施例97為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該幹細胞或先驅細胞為HSC或iPSC。
實施例98為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為活化細胞。
實施例99為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為非活化細胞。
實施例100為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個連續核苷酸，或其中該基因修飾包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸。
實施例101為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中基因修飾包含基因體座標內之至少6、7、8、9或10個連續核苷酸。
實施例102為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含插入/缺失。
實施例103為如前述實施例中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標內的至少一個C成為T之取代或至少一個A成為G之取代。
實施例104為一種醫藥組合物，其包含如前述實施例中任一項之工程化細胞。
實施例105為一種細胞群體，其包含如前述實施例中任一項之工程化細胞。
實施例106為包含如實施例105之細胞群體的醫藥組合物。
實施例107為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少65% HLA-A陰性。
實施例107.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少65%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例108為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少70% HLA-A陰性。
實施例108.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少70%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例109為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少80% HLA-A陰性。
實施例109.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少80%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例110為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少90% HLA-A陰性。
實施例110.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少90%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例111為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少92% HLA-A陰性。
實施例111.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少92%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例112為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少93% HLA-A陰性。
實施例112.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少93%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例113為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少94% HLA-A陰性。
實施例113.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少94%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例114為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少95% HLA-A陰性。
實施例114.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少95%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例115為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少96% HLA-A陰性。
實施例115.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少96%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例116為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少97% HLA-A陰性。
實施例116.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少97%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例117為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少98% HLA-A陰性。
實施例117.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少98%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例118為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少99% HLA-A陰性。
實施例118.1為如實施例105之群體或如實施例106之醫藥組合物，其中如藉由次世代定序(NGS)所量測，至少99%之細胞群體包含HLA-A基因中之基因修飾。
實施例119為如實施例105至118中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少94% CIITA陰性。
實施例120為如實施例105至118中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少95% CIITA陰性。
實施例121為如實施例105至118中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少96% CIITA陰性。
實施例122為如實施例105至118中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少97% CIITA陰性。
實施例123為如實施例105至118中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少98% CIITA陰性。
實施例124為如實施例105至118中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少99% CIITA陰性。
實施例125為如實施例105至124中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少95%內源性TCR蛋白陰性。
實施例126為如實施例105至124中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少97%內源性TCR蛋白陰性。
實施例127為如實施例105至124中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少98%內源性TCR蛋白陰性。
實施例128為如實施例105至124中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少99%內源性TCR蛋白陰性。
實施例129為如實施例105至124中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少99.5%內源性TCR蛋白陰性。
實施例130為一種向有需要之個體投與如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物的方法。
實施例131為一種將如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物作為過繼細胞轉移(ACT)療法投與個體的方法。
實施例132為一種治療疾病或病症之方法，其包含向有需要之個體投與如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物。
實施例133為一種製造工程化人類細胞之方法，該細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白的表面表現，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，該方法包含使細胞與包含以下之組合物接觸：(a) HLA-A引導RNA，其包含 (i)選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列；或(iv)結合至包含表 2 至 5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或(v) 與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之(b)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
實施例134為一種相對於未經修飾細胞降低人類細胞中HLA-A蛋白之表面表現的方法，其包含使細胞與包含以下之組合物接觸：(a) HLA-A引導RNA，其包含(i)選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或(ii)選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或(iii)與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列；或(iv)結合至包含表 2 至 5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或(v)與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或(vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之(b)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
實施例135為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白。
實施例136為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為釀膿鏈球菌Cas9。
實施例137為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為奈瑟氏腦膜炎菌Cas9。
實施例138為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為嗜熱鏈球菌Cas9。
實施例139為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為金黃色葡萄球菌Cas9。
實施例140為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1。
實施例141為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為來自胺基酸球菌屬之Cpf1。
實施例142為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1。
實施例143為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為C成為T之鹼基編輯劑。
實施例144為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為A成為G之鹼基編輯劑。
實施例145為實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸包含APOBEC3A脫胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。
實施例146為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為Cas12a。
實施例147為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為CasX。
實施例148為如實施例133或134之方法，其中經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸為Nme2Cas9。
實施例149為如實施例133至148中任一項之方法，其進一步包含例如藉由使該細胞與基因編輯系統接觸來相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中MHC II類蛋白的表面表現，該基因編輯系統靶向選自以下之基因：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。
實施例150為如實施例133至149中任一項之方法，其進一步包含使該細胞與CIITA引導RNA接觸。
實施例151為如實施例133至150中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中TCR蛋白之表面表現。
實施例152為如實施例133至151中任一項之方法，其進一步包含使細胞與外源核酸接觸。
實施例153為如實施例152之方法，其進一步包含使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸。
實施例154為如實施例152之方法，其進一步包含使該細胞與編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸接觸。
實施例155為如實施例152之方法，其進一步包含使該細胞與DNA依賴性蛋白激酶抑制劑(DNAPKi)接觸。
實施例156為如實施例155之方法，其中該DNAPKi為化合物1。
實施例157為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為同種異體細胞。
實施例158為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為初生細胞。
實施例159為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為CD4+ T細胞。
實施例160為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為CD8+ T細胞。
實施例161為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為記憶T細胞。
實施例162為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為B細胞。
實施例163為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為漿B細胞。
實施例164為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為記憶B細胞。
實施例165為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為自然殺手(NK)細胞。
實施例166為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為巨噬細胞。
實施例167為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為幹細胞。
實施例168為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為富潛能幹細胞(PSC)。
實施例169為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為造血幹細胞(HSC)。
實施例170為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為誘導性富潛能幹細胞(iPSC)。
實施例171為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為間質幹細胞(MSC)。
實施例172    如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為神經幹細胞(NSC)。
實施例173為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為角膜緣幹細胞(LSC)。
實施例174為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為先驅細胞，例如內皮先驅細胞或神經先驅細胞。
實施例175為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為組織特異性初生細胞。
實施例176為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為選自：軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。
實施例177為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為活化細胞。
實施例178為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為非活化細胞。
實施例179為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中該經分泌多肽為抗體或抗體片段。
實施例180為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中經分泌多肽為全長IgG抗體。
實施例181為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中經分泌多肽為單鏈抗體。
實施例182為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中經分泌多肽為中和抗體。
實施例183為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中經分泌多肽為酶。
實施例184為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中經分泌多肽為細胞介素。
實施例185為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中經分泌多肽為融合蛋白。
實施例186為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由細胞分泌之多肽的外源核酸或使細胞與該外源核酸接觸，其中經分泌多肽包含可溶性受體。
實施例187為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體為T細胞受體(TCR)。
實施例188為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源性核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源性核酸接觸，其中靶向受體為經基因修飾之TCR。
實施例189為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體為WT1 TCR。
實施例190為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體為CAR。
實施例191為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源性核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源性核酸接觸，其中靶向受體為通用CAR。
實施例192為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源性核酸或使細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中靶向受體為增殖誘導性配位體(APRIL)。
實施例193為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該等細胞用基因編輯系統工程化。
實施例194為如實施例193之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因編輯系統包含類轉錄活化蛋白效應因子核酸酶(TALEN)。
實施例195為如實施例193之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因編輯系統包含鋅指核酸酶。
實施例196為如實施例193之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸，視情況其中該經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。
實施例197為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA在載體中提供至細胞。
實施例198為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中經RNA引導之DNA結合劑在載體中提供至該細胞，視情況在與HLA-A引導RNA相同之載體中。
實施例199為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該外源核酸在載體中提供至該細胞。
實施例200為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為病毒載體。
實施例201為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為非病毒載體。
實施例202為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為慢病毒載體。
實施例203為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為反轉錄病毒載體。
實施例204為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該載體為AAV。
實施例205為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中引導RNA在脂質核酸組裝組合物中，視情況在與RNA引導之DNA結合劑相同的脂質核酸組裝組合物中提供至細胞。
實施例206為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該外源核酸在脂質核酸組裝組合物中提供至該細胞。
實施例207為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中脂質核酸組裝組合物為脂質奈米粒子(LNP)。
實施例208為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中外源核酸整合至細胞之基因體中。
實施例209為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該外源核酸係藉由同源重組(HR)整合至該細胞之基因體中。
實施例210為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中外源核酸係整合至細胞基因體中之安全港基因座中。
實施例211為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 13或其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 14。
實施例212為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 15。
實施例213為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 16。
實施例214為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 17。
實施例215為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 18。
實施例216為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 26。
實施例217為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 37。
實施例218為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 38。
實施例219為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 39。
實施例220為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 41。
實施例221為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 43。
實施例222為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 45。
實施例223為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含SEQ ID NO: 62。
實施例224為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾。
實施例225為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其中該至少一個修飾包括經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
實施例226為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
實施例227為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其包含經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
實施例228為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其包含在引導RNA之5'端前五個核苷酸中之一或多處的修飾。
實施例229為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其包含在引導RNA之3'端後五個核苷酸中之一或多處的修飾。
實施例230為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其包含引導RNA之最前面四個核苷酸之間的PS鍵。
實施例231為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其包含引導RNA之最後面四個核苷酸之間的PS鍵。
實施例232為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其包含在引導RNA之5'端前三個核苷酸處的經2'-O-Me修飾之核苷酸。
實施例233為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中HLA-A引導RNA包含至少一個修飾，其包含在引導RNA之3'端後三個核苷酸處的經2'-O-Me修飾之核苷酸。
實施例234為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於表現對由癌細胞表現之多肽具有特異性的TCR。
實施例235為如前述實施例中任一者之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於作為過繼細胞轉移(ACT)療法投與個體。
實施例236為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於治療患有癌症之個體。
實施例237為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於治療患有傳染病之個體。
實施例238為如前述實施例中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於治療患有自體免疫疾病之個體。
實施例239為一種細胞庫，其包含：(a)如前述實施例中任一項之工程化細胞，或藉由如前述實施例中任一項之方法產生之工程化細胞；及(b)目錄，其包含記錄該細胞庫中之該等供體細胞之HLA-B及HLA-C等位基因的資訊。
實施例240為如實施例239之細胞庫，其中該細胞庫包含相較於該細胞庫中之其他供體細胞具有HLA-B及HLA-C等位基因之獨特組合的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40個供體細胞。
實施例241為一種向有需要之接受個體投與工程化細胞的方法，該方法包含：(a)測定接受個體之HLA-B及HLA-C等位基因；(b)選擇如前述實施例中任一項之工程化細胞或細胞群體，或藉由如前述實施例中任一項之方法產生之工程化細胞或細胞群體，其中該工程化細胞包含與接受個體相同的HLA-B或HLA-C等位基因中之至少一者；(c)向該接受個體投與該所選擇之工程化細胞。
實施例242為如實施例241之方法，其中該個體具有工程化細胞之HLA-B及HLA-C等位基因。
實施例243為如前述實施例中任一項之工程化細胞、組合物、醫藥組合物或方法，其用於向部分匹配之個體投與過繼細胞轉移(ACT)療法，其中該部分匹配之個體具有該工程化細胞或細胞群體之HLA-B及HLA-C等位基因。
實施例244為如實施例130至132、235至238、241至243中任一項之工程化細胞、組合物、醫藥組合物或方法，其中該工程化細胞或細胞群體包含與該個體共有之HLA-B及HLA-C等位基因。
實施例245為如前述實施例130至132、235至238、241至243中任一項之工程化細胞、組合物、醫藥組合物或方法，其中該工程化細胞或細胞群體的該等HLA-B及HLA-C等位基因包含該個體之一或多個HLA-B及HLA-C等位基因。
實施例246為如前述實施例130至132、235至238、241至243中任一項之工程化細胞、組合物、醫藥組合物或方法，其中該工程化細胞或細胞群體之該等HLA-B及HLA-C等位基因包含該個體之一或兩個HLA-B及/或一或兩個HLA-C等位基因。
圖1A及1B藉由流動式細胞測量術展示出對HLA-A2呈陰性之活化T細胞的百分比。圖1A展示出引導物(G018997、G018998、G018999、G019000、G019008、G013006)之資料。圖1B展示出引導物(G018091、G018933、G018935、G018954、G018995、G018996)之資料。
圖2展示出對NK-細胞介導殺死HLA-A基因剔除(HLA-B/C匹配)T細胞相對於B2M基因剔除T細胞(視情況包括外源HLA-E構築體)的抗性，以T細胞溶解百分比表示。比較HLA-A基因剔除、HLA-A、CIITA雙基因剔除、B2M基因剔除、B2M+HLA-E及野生型細胞。
圖3A至3F展示CD8+ T細胞中之依序編輯的結果。圖3A展示出HLA-A陽性細胞之百分比。圖3B展示出MHC II類陽性細胞之百分比。圖3C展示出WT1 TCR陽性CD3+，Vb8+細胞之百分比。圖3D展示出顯示錯配TCR之細胞的百分比。圖3E展示出僅顯示內源性TCR之CD3+，Vb8 -細胞的百分比。圖3F展示出對WT1 TCR呈陽性且對HLA-A及MHC II類呈陰性之CD3+，Vb8+的百分比。
圖4A至4F展示出CD4+ T細胞中之依序編輯的結果。圖4A展示出HLA-A陽性細胞之百分比。圖4B展示出MHC II類陽性細胞之百分比。圖4C展示出WT1 TCR陽性CD3+，Vb8+細胞之百分比。圖4D展示出顯示錯配TCR之細胞的百分比。圖4E展示出僅顯示內源性TCR之CD3+，Vb8 -細胞的百分比。圖4F展示出對WT1 TCR呈陽性且對HLA-A及MHC II類呈陰性之CD3+，Vb8+的百分比。
圖5A至5D展示出在T細胞中針對CIITA (圖5A)、HLA-A (圖5B)、TRBC1 (圖5C)及TRBC2 (圖5D)依序編輯T細胞之後的插入/缺失百分比。
圖6A至6B展示出向接種有人類自然殺手細胞之小鼠投與的B2M、CIITA、HLA-A或雙(HLA-A，CIITA)基因剔除人類T細胞的螢光素酶表現。圖6A展示出來自在注射後不同時間點存在之表現螢光素酶之T細胞的輻射輝度(光子/s/cm2/sr)。圖6B展示在第27天來自存在於不同小鼠組中之表現螢光素酶之T細胞的輻射輝度(光子/s/cm2/sr)。
圖7A至7B展示出投與接種有人類自然殺手細胞之小鼠的B2M及AlloWT1基因剔除人類T細胞的螢光素酶表現。圖7A展示出在注射後不同時間點存在之表現螢光素酶之T細胞的總通量(p/s)。圖7B展示出31天後存在於不同小鼠組中之表現螢光素酶之T細胞的總通量(p/s)。
圖8A至8B展示出宿主CD4(圖8A)或宿主CD8(圖8B)T細胞之標準化增殖百分比，該等T細胞係藉由HLA I類+HLA II類雙基因剔除或HLA-A及HLA II類雙基因剔除工程化自體或同種異體T細胞觸發。
圖9A至9F展示出一組百分比CD8+(圖9A)、內源性TCR(圖9B)、WT1 TCR+(圖9C)、HLA-A2基因剔除(圖9D)、HLA-DRDPDQ基因剔除(圖9E)及Allo WT1%(圖9F)。
圖10展示出在注射後不同時間點至18天存在之表現螢光素酶之T細胞的總通量(p/s)。
圖11A至11B分別展示出殺死分析之上清液中IFN-γ及IL-2的釋放，該分析含有Allo-WT1、Auto-WT1、TCR KO及野生型(WT)組的工程化T細胞與靶腫瘤細胞之共培養物。
圖12A至圖12B展示出三種條件下CD8+ T細胞中之CIITA、HLA-A、TRAC及TRBC編輯及WT1 TCR插入率。對於CD8+ T細胞，在依序T細胞工程化之後表現相關細胞表面蛋白之細胞的百分比展示於圖12A中。具有所有預期編輯(插入WT1-TCR，結合HLA-A及CIITA之基因剔除)之T細胞的百分比展示於圖12B中。
圖13展示出由以不同效應子：靶(E:T)比用sgRNA及鹼基編輯劑及UGI mRNA處理之NK細胞所靶向之T細胞的溶解百分比。
圖14展示出在用靶向HLA-A之100聚體或91聚體格式之sgRNA處理之後對於HLA-A表面受體呈陰性之CD8+ T細胞之平均百分比。
圖15A至15C分別展示HLA-A基因編輯與供體A至C中之蛋白質基因剔除之相關性。
 
                         
          <![CDATA[<110>  美商英特利亞醫療公司(INTELLIA THERAPEUTICS, INC.)]]>
          <![CDATA[<120>  用於減少細胞中HLA-A之組合物及方法]]>
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          gccugaugug uguugggugu                                                   20
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          ccugaugugu guuggguguu                                                   20
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          cccaacaccc aacacacauc                                                   20
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          ucaggaaaca ugaagaaagc                                                   20
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          aggcgccugg gccucucccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          cgggcuggcc ucccacaagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          acggccaucc ucggcgucug                                                   20
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          gacggccauc cucggcgucu                                                   20
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          gacgccgagg auggccguca                                                   20
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          ugacggccau ccucggcguc                                                   20
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          ggcgccauga cggccauccu                                                   20
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          acagcgacgc cgcgagccag                                                   20
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          cgacgccgcg agccagagga                                                   20
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          cgagccagag gauggagccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          cggcuccauc cucuggcucg                                                   20
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          gagccagagg auggagccgc                                                   20
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          gcgcccgcgg cuccauccuc                                                   20
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          gcccguccgu gggggaugag                                                   20
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          ucauccccca cggacgggcc                                                   20
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          aucucggacc cggagacugu                                                   20
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          ggggucccgc ggcuucgggg                                                   20
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          cucggggucc cgcggcuucg                                                   20
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          ucucgggguc ccgcggcuuc                                                   20
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          gucucggggu cccgcggcuu                                                   20
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          gcaagggucu cggggucccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          ggaccccgag acccuugccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          gaccccgaga cccuugcccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          cgagacccuu gccccgggag                                                   20
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          cucccggggc aagggucucg                                                   20
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          ucucccgggg caagggucuc                                                   20
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          cucucccggg gcaagggucu                                                   20
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          ccuugccccg ggagaggccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          cugggccucu cccggggcaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          ccugggccuc ucccggggca                                                   20
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          uuuaggccaa aaaucccccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          cgcugcagcg cacggguacc                                                   20
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          gcugcagcgc acggguacca                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  39]]>
          cugcagcgca cggguaccag                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          cgcacgggua ccaggggcca                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          gcacggguac caggggccac                                                   20
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          cacggguacc aggggccacg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          gggaggcgcc ccguggcccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          gcgaucaggg aggcgccccg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          uccuuguggg aggccagccc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          cuccuugugg gaggccagcc                                                   20
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          ggcuggccuc ccacaaggag                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          uugucucccc uccuuguggg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          ccacaaggag gggagacaau                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          cacaaggagg ggagacaauu                                                   20
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          caauugucuc cccuccuugu                                                   20
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          ccaauugucu ccccuccuug                                                   20
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          aucccucgaa uacugaugag                                                   20
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          aaccacucau caguauucga                                                   20
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          gaaccacuca ucaguauucg                                                   20
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          gaggaaaagu cacgggccca                                                   20
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          ggcccgugac uuuuccucuc                                                   20
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          ugcuucacac ucaaugugug                                                   20
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          gcuucacacu caaugugugu                                                   20
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          cuucacacuc aaugugugug                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          uucacacuca augugugugg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          uugagaaugg acaggacacc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          aggcauuuug caucugucau                                                   20
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          caggcauuuu gcaucuguca                                                   20
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          aggggcccug acccugcuaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          ugggaaaaga ggggaaggug                                                   20
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          uggaggagga agagcucagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          ugagauuucu ugucucacug                                                   20
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          gagauuucuu gucucacuga                                                   20
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          uaaagcaccu guuaaaauga                                                   20
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          aaucuguccu ucauuuuaac                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          gucacagggg aaggucccug                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          aaacaugaag aaagcaggug                                                   20
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          uguccuguga gauaccagaa                                                   20
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          augaaggagg cugaugccug                                                   20
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          aggcugaugc cugagguccu                                                   20
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          ggcugaugcc ugagguccuu                                                   20
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          cacaauaucc caaggaccuc                                                   20
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          gguccuuggg auauuguguu                                                   20
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          guccuuggga uauuguguuu                                                   20
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          cucccaaaca caauauccca                                                   20
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          uccucuagcc acaucuucug                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          acagaagaug uggcuagagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          ccucuagcca caucuucugu                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          cccacagaag auguggcuag                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          gucagauccc acagaagaug                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          aucuucugug ggaucugacc                                                   20
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          cccaggcagu gacagugccc                                                   20
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          ccugggcacu gucacugccu                                                   20
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          cccugggcac ugucacugcc                                                   20
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          uggauguauu gagcaugcga                                                   20
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          aacaugaaga aagcaggugu                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  98]]>
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  99]]>
          cuucaucgcc gugggcuacg                                                   20
          <![CDATA[<210>  100]]>
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          cgugucgucc acguagccca                                                   20
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          uggacgacac gcaguucgug                                                   20
          <![CDATA[<210>  102]]>
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          ggauggagcc gcgggcgccg                                                   20
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          gcgggcgccg uggauagagc                                                   20
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          ugcucuaucc acggcgcccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          ggcgccgugg auagagcagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          gcgccgugga uagagcagga                                                   20
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          cgccguggau agagcaggag                                                   20
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          guggauagag caggaggggc                                                   20
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          ggccccuccu gcucuaucca                                                   20
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          agcaggaggg gccggaguau                                                   20
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          gcaggagggg ccggaguauu                                                   20
          <![CDATA[<210>  112]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          ggaguggcuc cgcagauacc                                                   20
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          cuccgcagau accuggagaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          uccgcagaua ccuggagaac                                                   20
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          cagauaccug gagaacggga                                                   20
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          ucccguucuc cagguaucug                                                   20
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  117]]>
          gcgucuccuu cccguucucc                                                   20
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  118]]>
          gaaggagacg cugcagcgca                                                   20
          <![CDATA[<210>  119]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  119]]>
          aaggagacgc ugcagcgcac                                                   20
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          agaucuacag gcgaucaggg                                                   20
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  121]]>
          ugaucgccug uagaucuccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  122]]>
          gggagaucua caggcgauca                                                   20
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          cgggagaucu acaggcgauc                                                   20
          <![CDATA[<210>  124]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  124]]>
          cgccuguaga ucucccgggc                                                   20
          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          ggccagcccg ggagaucuac                                                   20
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          ucccgggcug gccucccaca                                                   20
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          gggcuggccu cccacaagga                                                   20
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          cugaucgccu guagaucucc                                                   20
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  129]]>
          aggauggagc cgcgggcgcc                                                   20
          <![CDATA[<210>  130]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  130]]>
          ggaaggagac gcugcagcgc                                                   20
          <![CDATA[<210>  131]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  131]]>
          gacagcgacg ccgcgagcca                                                   20
          <![CDATA[<210>  132]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  132]]>
          cgggaaggag acgcugcagc                                                   20
          <![CDATA[<210>  133]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  133]]>
          ccgugcgcug cagcgucucc                                                   20
          <![CDATA[<210>  134]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  134]]>
          acgcaguucg ugcgguucga cagc                                              24
          <![CDATA[<210>  135]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  135]]>
          ucgugcgguu cgacagcgac gccg                                              24
          <![CDATA[<210>  136]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  136]]>
          cagcgacgcc gcgagccaga ggau                                              24
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          gcucuaucca cggcgcccgc ggcu                                              24
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          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  138]]>
          uccugcucua uccacggcgc ccgc                                              24
          <![CDATA[<210>  139]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  139]]>
          ccggccccuc cugcucuauc cacg                                              24
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          <![CDATA[<400>  140]]>
          uccggccccu ccugcucuau ccac                                              24
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          <![CDATA[<211>  24]]>
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          <![CDATA[<400>  141]]>
          gggaaggaga cgcugcagcg cacg                                              24
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          <![CDATA[<400>  142]]>
          agacgcugca gcgcacgggu acca                                              24
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          gcgcacgggu accaggggcc acgg                                              24
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          cacggguacc aggggccacg gggc                                              24
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          acggguacca ggggccacgg ggcg                                              24
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
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          <![CDATA[<400>  150]]>
          acaggcgauc agggaggcgc cccg                                              24
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          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  151]]>
          uacaggcgau cagggaggcg cccc                                              24
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          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  152]]>
          gggcgccucc cugaucgccu guag                                              24
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          <![CDATA[<220>]]>
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          gagaucuaca ggcgaucagg gagg                                              24
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          ggagaucuac aggcgaucag ggag                                              24
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          ucgccuguag aucucccggg cugg                                              24
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          uugucucccc uccuuguggg aggc                                              24
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          <![CDATA[<211>  24]]>
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          auugucuccc cuccuugugg gagg                                              24
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          <![CDATA[<211>  24]]>
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  162]]>
          cccaauuguc uccccuccuu gugg                                              24
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
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          ggauggagcc gcgggcgccg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          gcgggcgccg uggauagagc                                                   20
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  165]]>
          ugcucuaucc acggcgcccg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          ggcgccgugg auagagcagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  167]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  167]]>
          gcgccgugga uagagcagga                                                   20
          <![CDATA[<210>  168]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  168]]>
          cgccguggau agagcaggag                                                   20
          <![CDATA[<210>  169]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  169]]>
          guggauagag caggaggggc                                                   20
          <![CDATA[<210>  170]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  170]]>
          gcgucuccuu cccguucucc                                                   20
          <![CDATA[<210>  171]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  171]]>
          gaaggagacg cugcagcgca                                                   20
          <![CDATA[<210>  172]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  172]]>
          aaggagacgc ugcagcgcac                                                   20
          <![CDATA[<210>  173]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  173]]>
          gcugcagcgc acggguacca                                                   20
          <![CDATA[<210>  174]]>
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  174]]>
          agaucuacag gcgaucaggg                                                   20
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          <![CDATA[<400>  175]]>
          cugaucgccu guagaucucc                                                   20
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          ugaucgccug uagaucuccc                                                   20
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  177]]>
          gggagaucua caggcgauca                                                   20
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  178]]>
          cgggagaucu acaggcgauc                                                   20
          <![CDATA[<210>  179]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  179]]>
          cgccuguaga ucucccgggc                                                   20
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          <![CDATA[<400>  180]]>
          ggccagcccg ggagaucuac                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  181]]>
          ucccgggcug gccucccaca                                                   20
          <![CDATA[<210>  182]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          gggcuggccu cccacaagga                                                   20
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          <![CDATA[<400>  183]]>
          acgacacuga uuggcuucuc                                                   20
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          <![CDATA[<400>  184]]>
          accccucauc ccccacggac                                                   20
          <![CDATA[<210>  185]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  185]]>
          ggcccguccg ugggggauga                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          gccaggucgc ccacagucuc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          guuuaggcca aaaauccccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  188]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  188]]>
          ggccaaaaau ccccccgggu                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  189]]>
          gaccaacccg gggggauuuu                                                   20
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  190]]>
          cacgggccca aggcugcugc                                                   20
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          acccucaugc ugcacauggc                                                   20
          <![CDATA[<210>  192]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          ccucuaggac cuuaaggccc                                                   20
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          gcuccuuucu gguaucucac                                                   20
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          gcuauggggu uucuuugcau                                                   20
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          gccuuugcag aaacaaaguc                                                   20
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          uggaccaacc gcccuccuga                                                   20
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          agccucucug accuuuagca                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  198]]>
          cgcccuccug aagguccuca                                                   20
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          <![CDATA[<400>  199]]>
          000
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          ccgcccuccu gaagguccuc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          ugguucccuu ugacacacac                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  202]]>
          gacccugcua aaggucagag                                                   20
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  203]]>
          aggaccuuca ggagggcggu                                                   20
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          acacuccucc agcacacaug                                                   20
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          caagauagcc acaugugugc                                                   20
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          ucugaccuuu agcaggguca                                                   20
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  600]]>
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          <![CDATA[<210>  601]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
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          <![CDATA[<400>  601]]>
          Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  602]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  602]]>
          Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<400>  603]]>
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          Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 
                          85                  90                  95      
          Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 
                      100                 105                 110         
          His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 
                  115                 120                 125             
          His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 
              130                 135                 140                 
          Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 
          145                 150                 155                 160 
          Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 
                          165                 170                 175     
          Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 
              210                 215                 220                 
          Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 
                          245                 250                 255     
          Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 
                      260                 265                 270         
          Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 
              290                 295                 300                 
          Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 
                      340                 345                 350         
          Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 
                  355                 360                 365             
          Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 
              370                 375                 380                 
          Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 
                          405                 410                 415     
          Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 
                      420                 425                 430         
          Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 
                  435                 440                 445             
          Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 
              450                 455                 460                 
          Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 
                          485                 490                 495     
          Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 
                      500                 505                 510         
          Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 
                  515                 520                 525             
          Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 
              530                 535                 540                 
          Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 
          545                 550                 555                 560 
          Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 
                          565                 570                 575     
          Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 
                      580                 585                 590         
          Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 
                  595                 600                 605             
          Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 
              610                 615                 620                 
          Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 
          625                 630                 635                 640 
          His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 
                      660                 665                 670         
          Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 
                  675                 680                 685             
          Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 
              690                 695                 700                 
          Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 
          705                 710                 715                 720 
          His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 
                          725                 730                 735     
          Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 
                      740                 745                 750         
          Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 
                  755                 760                 765             
          Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 
              770                 775                 780                 
          Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 
          785                 790                 795                 800 
          Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 
                          805                 810                 815     
          Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 
                      820                 825                 830         
          Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 
                  835                 840                 845             
          Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 
              850                 855                 860                 
          Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 
                          885                 890                 895     
          Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 
                      900                 905                 910         
          Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 
                  915                 920                 925             
          Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 
              930                 935                 940                 
          Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 
          945                 950                 955                 960 
          Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 
                          965                 970                 975     
          Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 
                      980                 985                 990         
          Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys  Tyr Pro Lys Leu Glu  Ser Glu Phe 
                  995                 1000                 1005             
          Val Tyr  Gly Asp Tyr Lys Val  Tyr Asp Val Arg Lys  Met Ile Ala 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Ser  Glu Gln Glu Ile Gly  Lys Ala Thr Ala Lys  Tyr Phe Phe 
              1025                 1030                 1035             
          Tyr Ser  Asn Ile Met Asn Phe  Phe Lys Thr Glu Ile  Thr Leu Ala 
              1040                 1045                 1050             
          Asn Gly  Glu Ile Arg Lys Arg  Pro Leu Ile Glu Thr  Asn Gly Glu 
              1055                 1060                 1065             
          Thr Gly  Glu Ile Val Trp Asp  Lys Gly Arg Asp Phe  Ala Thr Val 
              1070                 1075                 1080             
          Arg Lys  Val Leu Ser Met Pro  Gln Val Asn Ile Val  Lys Lys Thr 
              1085                 1090                 1095             
          Glu Val  Gln Thr Gly Gly Phe  Ser Lys Glu Ser Ile  Leu Pro Lys 
              1100                 1105                 1110             
          Arg Asn  Ser Asp Lys Leu Ile  Ala Arg Lys Lys Asp  Trp Asp Pro 
              1115                 1120                 1125             
          Lys Lys  Tyr Gly Gly Phe Asp  Ser Pro Thr Val Ala  Tyr Ser Val 
              1130                 1135                 1140             
          Leu Val  Val Ala Lys Val Glu  Lys Gly Lys Ser Lys  Lys Leu Lys 
              1145                 1150                 1155             
          Ser Val  Lys Glu Leu Leu Gly  Ile Thr Ile Met Glu  Arg Ser Ser 
              1160                 1165                 1170             
          Phe Glu  Lys Asn Pro Ile Asp  Phe Leu Glu Ala Lys  Gly Tyr Lys 
              1175                 1180                 1185             
          Glu Val  Lys Lys Asp Leu Ile  Ile Lys Leu Pro Lys  Tyr Ser Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Phe Glu  Leu Glu Asn Gly Arg  Lys Arg Met Leu Ala  Ser Ala Gly 
              1205                 1210                 1215             
          Glu Leu  Gln Lys Gly Asn Glu  Leu Ala Leu Pro Ser  Lys Tyr Val 
              1220                 1225                 1230             
          Asn Phe  Leu Tyr Leu Ala Ser  His Tyr Glu Lys Leu  Lys Gly Ser 
              1235                 1240                 1245             
          Pro Glu  Asp Asn Glu Gln Lys  Gln Leu Phe Val Glu  Gln His Lys 
              1250                 1255                 1260             
          His Tyr  Leu Asp Glu Ile Ile  Glu Gln Ile Ser Glu  Phe Ser Lys 
              1265                 1270                 1275             
          Arg Val  Ile Leu Ala Asp Ala  Asn Leu Asp Lys Val  Leu Ser Ala 
              1280                 1285                 1290             
          Tyr Asn  Lys His Arg Asp Lys  Pro Ile Arg Glu Gln  Ala Glu Asn 
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          auggacaaga aguacuccau cggccuggac aucggcacca acuccguggg cugggccgug       60
          aucaccgacg aguacaaggu gcccuccaag aaguucaagg ugcugggcaa caccgaccgg      120
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          cacuuccuga ucgagggcga ccugaacccc gacaacuccg acguggacaa gcuguucauc     1200
          cagcuggugc agaccuacaa ccagcuguuc gaggagaacc ccaucaacgc cuccggcgug     1260
          gacgccaagg ccauccuguc cgcccggcug uccaaguccc ggcggcugga gaaccugauc     1320
          gcccagcugc ccggcgagaa gaagaacggc cuguucggca accugaucgc ccugucccug     1380
          ggccugaccc ccaacuucaa guccaacuuc gaccuggccg aggacgccaa gcugcagcug     1440
          uccaaggaca ccuacgacga cgaccuggac aaccugcugg cccagaucgg cgaccaguac     1500
          gccgaccugu uccuggccgc caagaaccug uccgacgcca uccugcuguc cgacauccug     1560
          cgggugaaca ccgagaucac caaggccccc cuguccgccu ccaugaucaa gcgguacgac     1620
          gagcaccacc aggaccugac ccugcugaag gcccuggugc ggcagcagcu gcccgagaag     1680
          uacaaggaga ucuucuucga ccaguccaag aacggcuacg ccggcuacau cgacggcggc     1740
          gccucccagg aggaguucua caaguucauc aagcccaucc uggagaagau ggacggcacc     1800
          gaggagcugc uggugaagcu gaaccgggag gaccugcugc ggaagcagcg gaccuucgac     1860
          aacggcucca ucccccacca gauccaccug ggcgagcugc acgccauccu gcggcggcag     1920
          gaggacuucu accccuuccu gaaggacaac cgggagaaga ucgagaagau ccugaccuuc     1980
          cggauccccu acuacguggg cccccuggcc cggggcaacu cccgguucgc cuggaugacc     2040
          cggaaguccg aggagaccau cacccccugg aacuucgagg agguggugga caagggcgcc     2100
          uccgcccagu ccuucaucga gcggaugacc aacuucgaca agaaccugcc caacgagaag     2160
          gugcugccca agcacucccu gcuguacgag uacuucaccg uguacaacga gcugaccaag     2220
          gugaaguacg ugaccgaggg caugcggaag cccgccuucc uguccggcga gcagaagaag     2280
          gccaucgugg accugcuguu caagaccaac cggaagguga ccgugaagca gcugaaggag     2340
          gacuacuuca agaagaucga gugcuucgac uccguggaga ucuccggcgu ggaggaccgg     2400
          uucaacgccu cccugggcac cuaccacgac cugcugaaga ucaucaagga caaggacuuc     2460
          cuggacaacg aggagaacga ggacauccug gaggacaucg ugcugacccu gacccuguuc     2520
          gaggaccggg agaugaucga ggagcggcug aagaccuacg cccaccuguu cgacgacaag     2580
          gugaugaagc agcugaagcg gcggcgguac accggcuggg gccggcuguc ccggaagcug     2640
          aucaacggca uccgggacaa gcaguccggc aagaccaucc uggacuuccu gaaguccgac     2700
          ggcuucgcca accggaacuu caugcagcug auccacgacg acucccugac cuucaaggag     2760
          gacauccaga aggcccaggu guccggccag ggcgacuccc ugcacgagca caucgccaac     2820
          cuggccggcu cccccgccau caagaagggc auccugcaga ccgugaaggu gguggacgag     2880
          cuggugaagg ugaugggccg gcacaagccc gagaacaucg ugaucgagau ggcccgggag     2940
          aaccagacca cccagaaggg ccagaagaac ucccgggagc ggaugaagcg gaucgaggag     3000
          ggcaucaagg agcugggcuc ccagauccug aaggagcacc ccguggagaa cacccagcug     3060
          cagaacgaga agcuguaccu guacuaccug cagaacggcc gggacaugua cguggaccag     3120
          gagcuggaca ucaaccggcu guccgacuac gacguggacc acaucgugcc ccaguccuuc     3180
          cugaaggacg acuccaucga caacaaggug cugacccggu ccgacaagaa ccggggcaag     3240
          uccgacaacg ugcccuccga ggagguggug aagaagauga agaacuacug gcggcagcug     3300
          cugaacgcca agcugaucac ccagcggaag uucgacaacc ugaccaaggc cgagcggggc     3360
          ggccuguccg agcuggacaa ggccggcuuc aucaagcggc agcuggugga gacccggcag     3420
          aucaccaagc acguggccca gauccuggac ucccggauga acaccaagua cgacgagaac     3480
          gacaagcuga uccgggaggu gaaggugauc acccugaagu ccaagcuggu guccgacuuc     3540
          cggaaggacu uccaguucua caaggugcgg gagaucaaca acuaccacca cgcccacgac     3600
          gccuaccuga acgccguggu gggcaccgcc cugaucaaga aguaccccaa gcuggagucc     3660
          gaguucgugu acggcgacua caagguguac gacgugcgga agaugaucgc caaguccgag     3720
          caggagaucg gcaaggccac cgccaaguac uucuucuacu ccaacaucau gaacuucuuc     3780
          aagaccgaga ucacccuggc caacggcgag auccggaagc ggccccugau cgagaccaac     3840
          ggcgagaccg gcgagaucgu gugggacaag ggccgggacu ucgccaccgu gcggaaggug     3900
          cuguccaugc cccaggugaa caucgugaag aagaccgagg ugcagaccgg cggcuucucc     3960
          aaggagucca uccugcccaa gcggaacucc gacaagcuga ucgcccggaa gaaggacugg     4020
          gaccccaaga aguacggcgg cuucgacucc cccaccgugg ccuacuccgu gcugguggug     4080
          gccaaggugg agaagggcaa guccaagaag cugaaguccg ugaaggagcu gcugggcauc     4140
          accaucaugg agcgguccuc cuucgagaag aaccccaucg acuuccugga ggccaagggc     4200
          uacaaggagg ugaagaagga ccugaucauc aagcugccca aguacucccu guucgagcug     4260
          gagaacggcc ggaagcggau gcuggccucc gccggcgagc ugcagaaggg caacgagcug     4320
          gcccugcccu ccaaguacgu gaacuuccug uaccuggccu cccacuacga gaagcugaag     4380
          ggcucccccg aggacaacga gcagaagcag cuguucgugg agcagcacaa gcacuaccug     4440
          gacgagauca ucgagcagau cuccgaguuc uccaagcggg ugauccuggc cgacgccaac     4500
          cuggacaagg ugcuguccgc cuacaacaag caccgggaca agcccauccg ggagcaggcc     4560
          gagaacauca uccaccuguu cacccugacc aaccugggcg cccccgccgc cuucaaguac     4620
          uucgacacca ccaucgaccg gaagcgguac accuccacca aggaggugcu ggacgccacc     4680
          cugauccacc aguccaucac cggccuguac gagacccgga ucgaccuguc ccagcugggc     4740
          ggcgacggcg gcggcucccc caagaagaag cggaaggugu ccgaguccgc cacccccgag     4800
          uccguguccg gcuggcggcu guucaagaag aucuccuga                            4839
          <![CDATA[<210>  806]]>
          <![CDATA[<400>  806]]>
          000
          <![CDATA[<210>  807]]>
          <![CDATA[<211>  291]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  807]]>
          augggaccga agaagaagag aaaggucgga ggaggaagca caaaccuguc ggacaucauc       60
          gaaaaggaaa caggaaagca gcuggucauc caggaaucga uccugaugcu gccggaagaa      120
          gucgaagaag ucaucggaaa caagccggaa ucggacaucc ugguccacac agcauacgac      180
          gaaucgacag acgaaaacgu caugcugcug acaucggacg caccggaaua caagccgugg      240
          gcacugguca uccaggacuc gaacggagaa aacaagauca agaugcugug a               291
          <![CDATA[<210>  808]]>
          <![CDATA[<211>  324]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  808]]>
          augaccaacc uguccgacau caucgagaag gagaccggca agcagcuggu gauccaggag       60
          uccauccuga ugcugcccga ggagguggag gaggugaucg gcaacaagcc cgaguccgac      120
          auccuggugc acaccgccua cgacgagucc accgacgaga acgugaugcu gcugaccucc      180
          gacgcccccg aguacaagcc cugggcccug gugauccagg acuccaacgg cgagaacaag      240
          aucaagaugc uguccggcgg cuccaagcgg accgccgacg gcuccgaguu cgaguccccc      300
          aagaagaagc ggaaggugga guga                                             324
          <![CDATA[<210>  809]]>
          <![CDATA[<211>  1379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  809]]>
          Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 
                          85                  90                  95      
          Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 
                      100                 105                 110         
          His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 
                  115                 120                 125             
          His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 
              130                 135                 140                 
          Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 
          145                 150                 155                 160 
          Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 
                          165                 170                 175     
          Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 
              210                 215                 220                 
          Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 
                          245                 250                 255     
          Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 
                      260                 265                 270         
          Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 
              290                 295                 300                 
          Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 
                      340                 345                 350         
          Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 
                  355                 360                 365             
          Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 
              370                 375                 380                 
          Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 
                          405                 410                 415     
          Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 
                      420                 425                 430         
          Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 
                  435                 440                 445             
          Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 
              450                 455                 460                 
          Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 
                          485                 490                 495     
          Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 
                      500                 505                 510         
          Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 
                  515                 520                 525             
          Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 
              530                 535                 540                 
          Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 
          545                 550                 555                 560 
          Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 
                          565                 570                 575     
          Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 
                      580                 585                 590         
          Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 
                  595                 600                 605             
          Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 
              610                 615                 620                 
          Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 
          625                 630                 635                 640 
          His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 
                      660                 665                 670         
          Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 
                  675                 680                 685             
          Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 
              690                 695                 700                 
          Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 
          705                 710                 715                 720 
          His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 
                          725                 730                 735     
          Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 
                      740                 745                 750         
          Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 
                  755                 760                 765             
          Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 
              770                 775                 780                 
          Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 
          785                 790                 795                 800 
          Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 
                          805                 810                 815     
          Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 
                      820                 825                 830         
          Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 
                  835                 840                 845             
          Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 
              850                 855                 860                 
          Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 
                          885                 890                 895     
          Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 
                      900                 905                 910         
          Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 
                  915                 920                 925             
          Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 
              930                 935                 940                 
          Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 
          945                 950                 955                 960 
          Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 
                          965                 970                 975     
          Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 
                      980                 985                 990         
          Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys  Tyr Pro Lys Leu Glu  Ser Glu Phe 
                  995                 1000                 1005             
          Val Tyr  Gly Asp Tyr Lys Val  Tyr Asp Val Arg Lys  Met Ile Ala 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Ser  Glu Gln Glu Ile Gly  Lys Ala Thr Ala Lys  Tyr Phe Phe 
              1025                 1030                 1035             
          Tyr Ser  Asn Ile Met Asn Phe  Phe Lys Thr Glu Ile  Thr Leu Ala 
              1040                 1045                 1050             
          Asn Gly  Glu Ile Arg Lys Arg  Pro Leu Ile Glu Thr  Asn Gly Glu 
              1055                 1060                 1065             
          Thr Gly  Glu Ile Val Trp Asp  Lys Gly Arg Asp Phe  Ala Thr Val 
              1070                 1075                 1080             
          Arg Lys  Val Leu Ser Met Pro  Gln Val Asn Ile Val  Lys Lys Thr 
              1085                 1090                 1095             
          Glu Val  Gln Thr Gly Gly Phe  Ser Lys Glu Ser Ile  Leu Pro Lys 
              1100                 1105                 1110             
          Arg Asn  Ser Asp Lys Leu Ile  Ala Arg Lys Lys Asp  Trp Asp Pro 
              1115                 1120                 1125             
          Lys Lys  Tyr Gly Gly Phe Asp  Ser Pro Thr Val Ala  Tyr Ser Val 
              1130                 1135                 1140             
          Leu Val  Val Ala Lys Val Glu  Lys Gly Lys Ser Lys  Lys Leu Lys 
              1145                 1150                 1155             
          Ser Val  Lys Glu Leu Leu Gly  Ile Thr Ile Met Glu  Arg Ser Ser 
              1160                 1165                 1170             
          Phe Glu  Lys Asn Pro Ile Asp  Phe Leu Glu Ala Lys  Gly Tyr Lys 
              1175                 1180                 1185             
          Glu Val  Lys Lys Asp Leu Ile  Ile Lys Leu Pro Lys  Tyr Ser Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Phe Glu  Leu Glu Asn Gly Arg  Lys Arg Met Leu Ala  Ser Ala Gly 
              1205                 1210                 1215             
          Glu Leu  Gln Lys Gly Asn Glu  Leu Ala Leu Pro Ser  Lys Tyr Val 
              1220                 1225                 1230             
          Asn Phe  Leu Tyr Leu Ala Ser  His Tyr Glu Lys Leu  Lys Gly Ser 
              1235                 1240                 1245             
          Pro Glu  Asp Asn Glu Gln Lys  Gln Leu Phe Val Glu  Gln His Lys 
              1250                 1255                 1260             
          His Tyr  Leu Asp Glu Ile Ile  Glu Gln Ile Ser Glu  Phe Ser Lys 
              1265                 1270                 1275             
          Arg Val  Ile Leu Ala Asp Ala  Asn Leu Asp Lys Val  Leu Ser Ala 
              1280                 1285                 1290             
          Tyr Asn  Lys His Arg Asp Lys  Pro Ile Arg Glu Gln  Ala Glu Asn 
              1295                 1300                 1305             
          Ile Ile  His Leu Phe Thr Leu  Thr Asn Leu Gly Ala  Pro Ala Ala 
              1310                 1315                 1320             
          Phe Lys  Tyr Phe Asp Thr Thr  Ile Asp Arg Lys Arg  Tyr Thr Ser 
              1325                 1330                 1335             
          Thr Lys  Glu Val Leu Asp Ala  Thr Leu Ile His Gln  Ser Ile Thr 
              1340                 1345                 1350             
          Gly Leu  Tyr Glu Thr Arg Ile  Asp Leu Ser Gln Leu  Gly Gly Asp 
              1355                 1360                 1365             
          Gly Gly  Gly Ser Pro Lys Lys  Lys Arg Lys Val 
              1370                 1375                 
          <![CDATA[<210>  810]]>
          <![CDATA[<211>  1398]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  810]]>
          Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 
                          85                  90                  95      
          Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 
                      100                 105                 110         
          His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 
                  115                 120                 125             
          His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 
              130                 135                 140                 
          Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 
          145                 150                 155                 160 
          Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 
                          165                 170                 175     
          Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 
              210                 215                 220                 
          Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 
                          245                 250                 255     
          Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 
                      260                 265                 270         
          Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 
                  275                 280                 285             
          Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 
              290                 295                 300                 
          Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 
                      340                 345                 350         
          Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 
                  355                 360                 365             
          Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 
              370                 375                 380                 
          Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 
                          405                 410                 415     
          Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 
                      420                 425                 430         
          Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 
                  435                 440                 445             
          Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 
              450                 455                 460                 
          Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 
                          485                 490                 495     
          Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 
                      500                 505                 510         
          Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 
                  515                 520                 525             
          Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 
              530                 535                 540                 
          Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 
          545                 550                 555                 560 
          Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 
                          565                 570                 575     
          Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 
                      580                 585                 590         
          Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 
                  595                 600                 605             
          Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 
              610                 615                 620                 
          Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 
          625                 630                 635                 640 
          His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 
                      660                 665                 670         
          Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 
                  675                 680                 685             
          Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 
              690                 695                 700                 
          Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 
          705                 710                 715                 720 
          His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 
                          725                 730                 735     
          Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 
                      740                 745                 750         
          Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 
                  755                 760                 765             
          Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 
              770                 775                 780                 
          Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 
          785                 790                 795                 800 
          Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 
                          805                 810                 815     
          Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 
                      820                 825                 830         
          Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 
                  835                 840                 845             
          Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 
              850                 855                 860                 
          Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 
                          885                 890                 895     
          Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 
                      900                 905                 910         
          Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 
                  915                 920                 925             
          Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 
              930                 935                 940                 
          Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 
          945                 950                 955                 960 
          Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 
                          965                 970                 975     
          Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 
                      980                 985                 990         
          Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys  Tyr Pro Lys Leu Glu  Ser Glu Phe 
                  995                 1000                 1005             
          Val Tyr  Gly Asp Tyr Lys Val  Tyr Asp Val Arg Lys  Met Ile Ala 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Ser  Glu Gln Glu Ile Gly  Lys Ala Thr Ala Lys  Tyr Phe Phe 
              1025                 1030                 1035             
          Tyr Ser  Asn Ile Met Asn Phe  Phe Lys Thr Glu Ile  Thr Leu Ala 
              1040                 1045                 1050             
          Asn Gly  Glu Ile Arg Lys Arg  Pro Leu Ile Glu Thr  Asn Gly Glu 
              1055                 1060                 1065             
          Thr Gly  Glu Ile Val Trp Asp  Lys Gly Arg Asp Phe  Ala Thr Val 
              1070                 1075                 1080             
          Arg Lys  Val Leu Ser Met Pro  Gln Val Asn Ile Val  Lys Lys Thr 
              1085                 1090                 1095             
          Glu Val  Gln Thr Gly Gly Phe  Ser Lys Glu Ser Ile  Leu Pro Lys 
              1100                 1105                 1110             
          Arg Asn  Ser Asp Lys Leu Ile  Ala Arg Lys Lys Asp  Trp Asp Pro 
              1115                 1120                 1125             
          Lys Lys  Tyr Gly Gly Phe Asp  Ser Pro Thr Val Ala  Tyr Ser Val 
              1130                 1135                 1140             
          Leu Val  Val Ala Lys Val Glu  Lys Gly Lys Ser Lys  Lys Leu Lys 
              1145                 1150                 1155             
          Ser Val  Lys Glu Leu Leu Gly  Ile Thr Ile Met Glu  Arg Ser Ser 
              1160                 1165                 1170             
          Phe Glu  Lys Asn Pro Ile Asp  Phe Leu Glu Ala Lys  Gly Tyr Lys 
              1175                 1180                 1185             
          Glu Val  Lys Lys Asp Leu Ile  Ile Lys Leu Pro Lys  Tyr Ser Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Phe Glu  Leu Glu Asn Gly Arg  Lys Arg Met Leu Ala  Ser Ala Gly 
              1205                 1210                 1215             
          Glu Leu  Gln Lys Gly Asn Glu  Leu Ala Leu Pro Ser  Lys Tyr Val 
              1220                 1225                 1230             
          Asn Phe  Leu Tyr Leu Ala Ser  His Tyr Glu Lys Leu  Lys Gly Ser 
              1235                 1240                 1245             
          Pro Glu  Asp Asn Glu Gln Lys  Gln Leu Phe Val Glu  Gln His Lys 
              1250                 1255                 1260             
          His Tyr  Leu Asp Glu Ile Ile  Glu Gln Ile Ser Glu  Phe Ser Lys 
              1265                 1270                 1275             
          Arg Val  Ile Leu Ala Asp Ala  Asn Leu Asp Lys Val  Leu Ser Ala 
              1280                 1285                 1290             
          Tyr Asn  Lys His Arg Asp Lys  Pro Ile Arg Glu Gln  Ala Glu Asn 
              1295                 1300                 1305             
          Ile Ile  His Leu Phe Thr Leu  Thr Asn Leu Gly Ala  Pro Ala Ala 
              1310                 1315                 1320             
          Phe Lys  Tyr Phe Asp Thr Thr  Ile Asp Arg Lys Arg  Tyr Thr Ser 
              1325                 1330                 1335             
          Thr Lys  Glu Val Leu Asp Ala  Thr Leu Ile His Gln  Ser Ile Thr 
              1340                 1345                 1350             
          Gly Leu  Tyr Glu Thr Arg Ile  Asp Leu Ser Gln Leu  Gly Gly Asp 
              1355                 1360                 1365             
          Gly Gly  Gly Ser Pro Lys Lys  Lys Arg Lys Val Ser  Glu Ser Ala 
              1370                 1375                 1380             
          Thr Pro  Glu Ser Val Ser Gly  Trp Arg Leu Phe Lys  Lys Ile Ser 
              1385                 1390                 1395             
          <![CDATA[<210>  811]]>
          <![CDATA[<211>  1593]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  811]]>
          Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His 
          1               5                   10                  15      
          Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met 
                  35                  40                  45              
          Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys 
              50                  55                  60                  
          Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala 
                      100                 105                 110         
          Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg 
                  115                 120                 125             
          Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg 
              130                 135                 140                 
          Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp 
                          165                 170                 175     
          Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser 
                  195                 200                 205             
          Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala 
              210                 215                 220                 
          Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr 
                      260                 265                 270         
          Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg 
                  275                 280                 285             
          Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile 
                          325                 330                 335     
          Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu 
                      340                 345                 350         
          Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile 
                  355                 360                 365             
          Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile 
              370                 375                 380                 
          Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn 
                          405                 410                 415     
          Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys 
                      420                 425                 430         
          Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys 
                  435                 440                 445             
          Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro 
              450                 455                 460                 
          Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile 
                          485                 490                 495     
          Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp 
                      500                 505                 510         
          Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys 
                  515                 520                 525             
          Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln 
              530                 535                 540                 
          Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr 
                          565                 570                 575     
          Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro 
                      580                 585                 590         
          Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn 
                  595                 600                 605             
          Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile 
              610                 615                 620                 
          Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys 
                          645                 650                 655     
          Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly 
                      660                 665                 670         
          Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr 
                  675                 680                 685             
          Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser 
              690                 695                 700                 
          Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn 
                          725                 730                 735     
          Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala 
                      740                 745                 750         
          Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys 
                  755                 760                 765             
          Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys 
              770                 775                 780                 
          Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg 
          785                 790                 795                 800 
          Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys 
                          805                 810                 815     
          Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp 
                      820                 825                 830         
          Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu 
                  835                 840                 845             
          Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln 
              850                 855                 860                 
          Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe 
                          885                 890                 895     
          Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His 
                      900                 905                 910         
          Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser 
                  915                 920                 925             
          Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser 
              930                 935                 940                 
          Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu 
          945                 950                 955                 960 
          Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu 
                          965                 970                 975     
          Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg 
                      980                 985                 990         
          Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu  Gly Ile Lys Glu Leu  Gly Ser Gln 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Leu  Lys Glu His Pro Val  Glu Asn Thr Gln Leu  Gln Asn Glu 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Leu  Tyr Leu Tyr Tyr Leu  Gln Asn Gly Arg Asp  Met Tyr Val 
              1025                 1030                 1035             
          Asp Gln  Glu Leu Asp Ile Asn  Arg Leu Ser Asp Tyr  Asp Val Asp 
              1040                 1045                 1050             
          His Ile  Val Pro Gln Ser Phe  Leu Lys Asp Asp Ser  Ile Asp Asn 
              1055                 1060                 1065             
          Lys Val  Leu Thr Arg Ser Asp  Lys Asn Arg Gly Lys  Ser Asp Asn 
              1070                 1075                 1080             
          Val Pro  Ser Glu Glu Val Val  Lys Lys Met Lys Asn  Tyr Trp Arg 
              1085                 1090                 1095             
          Gln Leu  Leu Asn Ala Lys Leu  Ile Thr Gln Arg Lys  Phe Asp Asn 
              1100                 1105                 1110             
          Leu Thr  Lys Ala Glu Arg Gly  Gly Leu Ser Glu Leu  Asp Lys Ala 
              1115                 1120                 1125             
          Gly Phe  Ile Lys Arg Gln Leu  Val Glu Thr Arg Gln  Ile Thr Lys 
              1130                 1135                 1140             
          His Val  Ala Gln Ile Leu Asp  Ser Arg Met Asn Thr  Lys Tyr Asp 
              1145                 1150                 1155             
          Glu Asn  Asp Lys Leu Ile Arg  Glu Val Lys Val Ile  Thr Leu Lys 
              1160                 1165                 1170             
          Ser Lys  Leu Val Ser Asp Phe  Arg Lys Asp Phe Gln  Phe Tyr Lys 
              1175                 1180                 1185             
          Val Arg  Glu Ile Asn Asn Tyr  His His Ala His Asp  Ala Tyr Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Asn Ala  Val Val Gly Thr Ala  Leu Ile Lys Lys Tyr  Pro Lys Leu 
              1205                 1210                 1215             
          Glu Ser  Glu Phe Val Tyr Gly  Asp Tyr Lys Val Tyr  Asp Val Arg 
              1220                 1225                 1230             
          Lys Met  Ile Ala Lys Ser Glu  Gln Glu Ile Gly Lys  Ala Thr Ala 
              1235                 1240                 1245             
          Lys Tyr  Phe Phe Tyr Ser Asn  Ile Met Asn Phe Phe  Lys Thr Glu 
              1250                 1255                 1260             
          Ile Thr  Leu Ala Asn Gly Glu  Ile Arg Lys Arg Pro  Leu Ile Glu 
              1265                 1270                 1275             
          Thr Asn  Gly Glu Thr Gly Glu  Ile Val Trp Asp Lys  Gly Arg Asp 
              1280                 1285                 1290             
          Phe Ala  Thr Val Arg Lys Val  Leu Ser Met Pro Gln  Val Asn Ile 
              1295                 1300                 1305             
          Val Lys  Lys Thr Glu Val Gln  Thr Gly Gly Phe Ser  Lys Glu Ser 
              1310                 1315                 1320             
          Ile Leu  Pro Lys Arg Asn Ser  Asp Lys Leu Ile Ala  Arg Lys Lys 
              1325                 1330                 1335             
          Asp Trp  Asp Pro Lys Lys Tyr  Gly Gly Phe Asp Ser  Pro Thr Val 
              1340                 1345                 1350             
          Ala Tyr  Ser Val Leu Val Val  Ala Lys Val Glu Lys  Gly Lys Ser 
              1355                 1360                 1365             
          Lys Lys  Leu Lys Ser Val Lys  Glu Leu Leu Gly Ile  Thr Ile Met 
              1370                 1375                 1380             
          Glu Arg  Ser Ser Phe Glu Lys  Asn Pro Ile Asp Phe  Leu Glu Ala 
              1385                 1390                 1395             
          Lys Gly  Tyr Lys Glu Val Lys  Lys Asp Leu Ile Ile  Lys Leu Pro 
              1400                 1405                 1410             
          Lys Tyr  Ser Leu Phe Glu Leu  Glu Asn Gly Arg Lys  Arg Met Leu 
              1415                 1420                 1425             
          Ala Ser  Ala Gly Glu Leu Gln  Lys Gly Asn Glu Leu  Ala Leu Pro 
              1430                 1435                 1440             
          Ser Lys  Tyr Val Asn Phe Leu  Tyr Leu Ala Ser His  Tyr Glu Lys 
              1445                 1450                 1455             
          Leu Lys  Gly Ser Pro Glu Asp  Asn Glu Gln Lys Gln  Leu Phe Val 
              1460                 1465                 1470             
          Glu Gln  His Lys His Tyr Leu  Asp Glu Ile Ile Glu  Gln Ile Ser 
              1475                 1480                 1485             
          Glu Phe  Ser Lys Arg Val Ile  Leu Ala Asp Ala Asn  Leu Asp Lys 
              1490                 1495                 1500             
          Val Leu  Ser Ala Tyr Asn Lys  His Arg Asp Lys Pro  Ile Arg Glu 
              1505                 1510                 1515             
          Gln Ala  Glu Asn Ile Ile His  Leu Phe Thr Leu Thr  Asn Leu Gly 
              1520                 1525                 1530             
          Ala Pro  Ala Ala Phe Lys Tyr  Phe Asp Thr Thr Ile  Asp Arg Lys 
              1535                 1540                 1545             
          Arg Tyr  Thr Ser Thr Lys Glu  Val Leu Asp Ala Thr  Leu Ile His 
              1550                 1555                 1560             
          Gln Ser  Ile Thr Gly Leu Tyr  Glu Thr Arg Ile Asp  Leu Ser Gln 
              1565                 1570                 1575             
          Leu Gly  Gly Asp Gly Gly Gly  Ser Pro Lys Lys Lys  Arg Lys Val 
              1580                 1585                 1590             
          <![CDATA[<210>  812]]>
          <![CDATA[<211>  1612]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  812]]>
          Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His 
          1               5                   10                  15      
          Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met 
                  35                  40                  45              
          Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys 
              50                  55                  60                  
          Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala 
                      100                 105                 110         
          Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg 
                  115                 120                 125             
          Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg 
              130                 135                 140                 
          Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp 
                          165                 170                 175     
          Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser 
                  195                 200                 205             
          Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala 
              210                 215                 220                 
          Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr 
                      260                 265                 270         
          Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg 
                  275                 280                 285             
          Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile 
                          325                 330                 335     
          Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu 
                      340                 345                 350         
          Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile 
                  355                 360                 365             
          Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile 
              370                 375                 380                 
          Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn 
                          405                 410                 415     
          Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys 
                      420                 425                 430         
          Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys 
                  435                 440                 445             
          Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro 
              450                 455                 460                 
          Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile 
                          485                 490                 495     
          Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp 
                      500                 505                 510         
          Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys 
                  515                 520                 525             
          Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln 
              530                 535                 540                 
          Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr 
                          565                 570                 575     
          Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro 
                      580                 585                 590         
          Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn 
                  595                 600                 605             
          Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile 
              610                 615                 620                 
          Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys 
                          645                 650                 655     
          Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly 
                      660                 665                 670         
          Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr 
                  675                 680                 685             
          Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser 
              690                 695                 700                 
          Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn 
                          725                 730                 735     
          Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala 
                      740                 745                 750         
          Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys 
                  755                 760                 765             
          Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys 
              770                 775                 780                 
          Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg 
          785                 790                 795                 800 
          Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys 
                          805                 810                 815     
          Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp 
                      820                 825                 830         
          Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu 
                  835                 840                 845             
          Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln 
              850                 855                 860                 
          Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe 
                          885                 890                 895     
          Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His 
                      900                 905                 910         
          Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser 
                  915                 920                 925             
          Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser 
              930                 935                 940                 
          Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu 
          945                 950                 955                 960 
          Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu 
                          965                 970                 975     
          Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg 
                      980                 985                 990         
          Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu  Gly Ile Lys Glu Leu  Gly Ser Gln 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Leu  Lys Glu His Pro Val  Glu Asn Thr Gln Leu  Gln Asn Glu 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Leu  Tyr Leu Tyr Tyr Leu  Gln Asn Gly Arg Asp  Met Tyr Val 
              1025                 1030                 1035             
          Asp Gln  Glu Leu Asp Ile Asn  Arg Leu Ser Asp Tyr  Asp Val Asp 
              1040                 1045                 1050             
          His Ile  Val Pro Gln Ser Phe  Leu Lys Asp Asp Ser  Ile Asp Asn 
              1055                 1060                 1065             
          Lys Val  Leu Thr Arg Ser Asp  Lys Asn Arg Gly Lys  Ser Asp Asn 
              1070                 1075                 1080             
          Val Pro  Ser Glu Glu Val Val  Lys Lys Met Lys Asn  Tyr Trp Arg 
              1085                 1090                 1095             
          Gln Leu  Leu Asn Ala Lys Leu  Ile Thr Gln Arg Lys  Phe Asp Asn 
              1100                 1105                 1110             
          Leu Thr  Lys Ala Glu Arg Gly  Gly Leu Ser Glu Leu  Asp Lys Ala 
              1115                 1120                 1125             
          Gly Phe  Ile Lys Arg Gln Leu  Val Glu Thr Arg Gln  Ile Thr Lys 
              1130                 1135                 1140             
          His Val  Ala Gln Ile Leu Asp  Ser Arg Met Asn Thr  Lys Tyr Asp 
              1145                 1150                 1155             
          Glu Asn  Asp Lys Leu Ile Arg  Glu Val Lys Val Ile  Thr Leu Lys 
              1160                 1165                 1170             
          Ser Lys  Leu Val Ser Asp Phe  Arg Lys Asp Phe Gln  Phe Tyr Lys 
              1175                 1180                 1185             
          Val Arg  Glu Ile Asn Asn Tyr  His His Ala His Asp  Ala Tyr Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Asn Ala  Val Val Gly Thr Ala  Leu Ile Lys Lys Tyr  Pro Lys Leu 
              1205                 1210                 1215             
          Glu Ser  Glu Phe Val Tyr Gly  Asp Tyr Lys Val Tyr  Asp Val Arg 
              1220                 1225                 1230             
          Lys Met  Ile Ala Lys Ser Glu  Gln Glu Ile Gly Lys  Ala Thr Ala 
              1235                 1240                 1245             
          Lys Tyr  Phe Phe Tyr Ser Asn  Ile Met Asn Phe Phe  Lys Thr Glu 
              1250                 1255                 1260             
          Ile Thr  Leu Ala Asn Gly Glu  Ile Arg Lys Arg Pro  Leu Ile Glu 
              1265                 1270                 1275             
          Thr Asn  Gly Glu Thr Gly Glu  Ile Val Trp Asp Lys  Gly Arg Asp 
              1280                 1285                 1290             
          Phe Ala  Thr Val Arg Lys Val  Leu Ser Met Pro Gln  Val Asn Ile 
              1295                 1300                 1305             
          Val Lys  Lys Thr Glu Val Gln  Thr Gly Gly Phe Ser  Lys Glu Ser 
              1310                 1315                 1320             
          Ile Leu  Pro Lys Arg Asn Ser  Asp Lys Leu Ile Ala  Arg Lys Lys 
              1325                 1330                 1335             
          Asp Trp  Asp Pro Lys Lys Tyr  Gly Gly Phe Asp Ser  Pro Thr Val 
              1340                 1345                 1350             
          Ala Tyr  Ser Val Leu Val Val  Ala Lys Val Glu Lys  Gly Lys Ser 
              1355                 1360                 1365             
          Lys Lys  Leu Lys Ser Val Lys  Glu Leu Leu Gly Ile  Thr Ile Met 
              1370                 1375                 1380             
          Glu Arg  Ser Ser Phe Glu Lys  Asn Pro Ile Asp Phe  Leu Glu Ala 
              1385                 1390                 1395             
          Lys Gly  Tyr Lys Glu Val Lys  Lys Asp Leu Ile Ile  Lys Leu Pro 
              1400                 1405                 1410             
          Lys Tyr  Ser Leu Phe Glu Leu  Glu Asn Gly Arg Lys  Arg Met Leu 
              1415                 1420                 1425             
          Ala Ser  Ala Gly Glu Leu Gln  Lys Gly Asn Glu Leu  Ala Leu Pro 
              1430                 1435                 1440             
          Ser Lys  Tyr Val Asn Phe Leu  Tyr Leu Ala Ser His  Tyr Glu Lys 
              1445                 1450                 1455             
          Leu Lys  Gly Ser Pro Glu Asp  Asn Glu Gln Lys Gln  Leu Phe Val 
              1460                 1465                 1470             
          Glu Gln  His Lys His Tyr Leu  Asp Glu Ile Ile Glu  Gln Ile Ser 
              1475                 1480                 1485             
          Glu Phe  Ser Lys Arg Val Ile  Leu Ala Asp Ala Asn  Leu Asp Lys 
              1490                 1495                 1500             
          Val Leu  Ser Ala Tyr Asn Lys  His Arg Asp Lys Pro  Ile Arg Glu 
              1505                 1510                 1515             
          Gln Ala  Glu Asn Ile Ile His  Leu Phe Thr Leu Thr  Asn Leu Gly 
              1520                 1525                 1530             
          Ala Pro  Ala Ala Phe Lys Tyr  Phe Asp Thr Thr Ile  Asp Arg Lys 
              1535                 1540                 1545             
          Arg Tyr  Thr Ser Thr Lys Glu  Val Leu Asp Ala Thr  Leu Ile His 
              1550                 1555                 1560             
          Gln Ser  Ile Thr Gly Leu Tyr  Glu Thr Arg Ile Asp  Leu Ser Gln 
              1565                 1570                 1575             
          Leu Gly  Gly Asp Gly Gly Gly  Ser Pro Lys Lys Lys  Arg Lys Val 
              1580                 1585                 1590             
          Ser Glu  Ser Ala Thr Pro Glu  Ser Val Ser Gly Trp  Arg Leu Phe 
              1595                 1600                 1605             
          Lys Lys  Ile Ser 
              1610         
          <![CDATA[<210>  813]]>
          <![CDATA[<400>  813]]>
          000
          <![CDATA[<210>  814]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  814]]>
          Met Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val 
                      20                  25                  30          
          Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp 
                  35                  40                  45              
          Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu 
              50                  55                  60                  
          Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Lys Met Leu Ser Gly Gly Ser Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu 
                          85                  90                  95      
          Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  815]]>
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          <![CDATA[<210>  816]]>
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<223>  含有2'-O-Me及PS修飾，關於取代及較佳實施例的詳細描述參見提交之說明書]]>
          <![CDATA[<400>  816]]>
          acucacgcug gauagccucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc       60
          cguuaucacg aaagggcacc gagucggugc u                                      91
          <![CDATA[<210>  817]]>
          <![CDATA[<211>  4140]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  817]]>
          auggacaaga aguacagcau cggacuggac aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc       60
          aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga      120
          cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa      180
          gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc      240
          uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga      300
          cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga      360
          aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag      420
          aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac      480
          augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac      540
          gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg      600
          aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga      660
          agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac      720
          cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa      780
          gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca      840
          cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc      900
          cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc      960
          augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga     1020
          cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca     1080
          ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug     1140
          gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga     1200
          aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac     1260
          gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc     1320
          gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc     1380
          agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa     1440
          gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag     1500
          aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc     1560
          uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug     1620
          agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca     1680
          gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc     1740
          agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc     1800
          aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc     1860
          cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca     1920
          caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga     1980
          agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug     2040
          gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac     2100
          agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug     2160
          cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca     2220
          gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc     2280
          aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga     2340
          augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg     2400
          gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga     2460
          gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac     2520
          aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc     2580
          gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag     2640
          aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug     2700
          acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag     2760
          cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac     2820
          acaaaguacg acgaaaacga caagcugauc agagaaguca aggucaucac acugaagagc     2880
          aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac     2940
          uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag     3000
          uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag     3060
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          aggaccugau caucaagcug cccaaguacu cccuguucga gcuggagaac ggccggaagc     4320
          ggaugcuggc cuccgccggc gagcugcaga agggcaacga gcuggcccug cccuccaagu     4380
          acgugaacuu ccuguaccug gccucccacu acgagaagcu gaagggcucc cccgaggaca     4440
          acgagcagaa gcagcuguuc guggagcagc acaagcacua ccuggacgag aucaucgagc     4500
          agaucuccga guucuccaag cgggugaucc uggccgacgc caaccuggac aaggugcugu     4560
          ccgccuacaa caagcaccgg gacaagccca uccgggagca ggccgagaac aucauccacc     4620
          uguucacccu gaccaaccug ggcgcccccg ccgccuucaa guacuucgac accaccaucg     4680
          accggaagcg guacaccucc accaaggagg ugcuggacgc cacccugauc caccagucca     4740
          ucaccggccu guacgagacc cggaucgacc ugucccagcu gggcggcgac ggcggcggcu     4800
          cccccaagaa gaagcggaag guguccgagu ccgccacccc cgaguccgug uccggcuggc     4860
          ggcuguucaa gaagaucucc ugacuagcac cagccucaag aacacccgaa uggagucucu     4920
          aagcuacaua auaccaacuu acacuuuaca aaauguuguc ccccaaaaug uagccauucg     4980
          uaucugcucc uaauaaaaag aaaguuucuu cacauucucu cgagaaaaaa aaaaaaugga     5040
          aaaaaaaaaa acggaaaaaa aaaaaaggua aaaaaaaaaa auauaaaaaa aaaaaacaua     5100
          aaaaaaaaaa acgaaaaaaa aaaaacguaa aaaaaaaaaa cucaaaaaaa aaaaagauaa     5160
          aaaaaaaaaa ccuaaaaaaa aaaaauguaa aaaaaaaaaa gggaaaaaaa aaaaacgcaa     5220
          aaaaaaaaaa cacaaaaaaa aaaaaugcaa aaaaaaaaaa ucgaaaaaaa aaaaaucuaa     5280
          aaaaaaaaaa cgaaaaaaaa aaaacccaaa aaaaaaaaag acaaaaaaaa aaaauagaaa     5340
          aaaaaaaaag uuaaaaaaaa aaaacugaaa aaaaaaaaau uuaaaaaaaa aaaaucuag      5399
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          gggagaccca agcuggcuag cucccgcagu cggcguccag cggcucugcu uguucgugug       60
          ugugucguug caggccuuau ucggauccgc caccauggga ccgaagaaga agagaaaggu      120
          cggaggagga agcacaaacc ugucggacau caucgaaaag gaaacaggaa agcagcuggu      180
          cauccaggaa ucgauccuga ugcugccgga agaagucgaa gaagucaucg gaaacaagcc      240
          ggaaucggac auccuggucc acacagcaua cgacgaaucg acagacgaaa acgucaugcu      300
          gcugacaucg gacgcaccgg aauacaagcc gugggcacug gucauccagg acucgaacgg      360
          agaaaacaag aucaagaugc ugugauaguc uagacaucac auuuaaaagc aucucagccu      420
          accaugagaa uaagagaaag aaaaugaaga ucaauagcuu auucaucucu uuuucuuuuu      480
          cguuggugua aagccaacac ccugucuaaa aaacauaaau uucuuuaauc auuuugccuc      540
          uuuucucugu gcuucaauua auaaaaaaug gaaagaaccu cgagucuag                  589
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          gcgatcgcag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt       60
          tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac      120
          gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg      180
          ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag      240
          tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat      300
          gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat      360
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          tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga      480
          ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg      540
          gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgg ggtctctctg gttagaccag      600
          atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc      660
          ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga      720
          tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aacagggacc      780
          tgaaagcgaa agggaaacca gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca      840
          cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct      900
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          gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag     1080
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          gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag     1200
          acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac     1260
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          gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca     1380
          aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg     1440
          ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcctcaa tgacgctgac ggtacaggcc     1500
          agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg     1560
          caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg     1620
          gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa     1680
          ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag     1740
          atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta     1800
          atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg     1860
          gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat     1920
          ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta     1980
          ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc     2040
          ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac     2100
          agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggttaac ttttaaaaga     2160
          aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac     2220
          atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttgg ctcccgatcg     2280
          ttgcgttaca cacacaatta ctgctgatcg agtgtagcct tcccacagtc cccgagaagt     2340
          tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg     2400
          aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa     2460
          gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa     2520
          gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt     2580
          gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga     2640
          agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt     2700
          gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt     2760
          ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt     2820
          tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatg tgcacactgg tatttcggtt     2880
          tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg     2940
          ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct     3000
          ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg     3060
          tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca     3120
          aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg     3180
          gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg     3240
          cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt     3300
          tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac     3360
          ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag     3420
          cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgatc tagacgccac     3480
          catgtctcgc tccgtggcct tagctgtgct cgcgctactc tctctttctg gcctagaggc     3540
          tgttatggct ccgcggactt taattttagg tggtggcgga tccggtggag gcggttctgg     3600
          tggaggcggc tccatccagc gtacgccaaa gattcaggtt tactcacgtc atccagcaga     3660
          gaatggaaag tcaaatttcc tgaattgcta tgtgtctggg tttcatccat ccgacattga     3720
          agttgactta ctgaagaatg gagagagaat tgaaaaagtg gagcattcag acttgtcttt     3780
          cagcaaggac tggtctttct atctcttgta ctacactgaa ttcaccccca ctgaaaaaga     3840
          tgagtatgcc tgccgtgtga accatgtgac tttgtcacag cccaagatag ttaagtggga     3900
          tcgcgacatg ggtggtggcg gttctggtgg tggcggtagt ggcggcggag gaagcggtgg     3960
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          cctgcggacg ctgcgcggct actacaatca gagcgaggcc gggtctcaca ccctgcagtg     4260
          gatgcatggc tgcgagctgg ggcccgacag gcgcttcctc cgcgggtatg aacagttcgc     4320
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          cacggcggct cagatctccg agcaaaagtc aaatgatgcc tctgaggcgg agcaccagag     4440
          agcctacctg gaagacacat gcgtggagtg gctccacaaa tacctggaga aggggaagga     4500
          gacgctgctt cacctggagc ccccaaagac acacgtgact caccacccca tctctgacca     4560
          tgaggccacc ctgaggtgct gggctctggg cttctaccct gcggagatca cactgacctg     4620
          gcagcaggat ggggagggcc atacccagga cacggagctc gtggagacca ggcctgctgg     4680
          ggatggaacc ttccagaagt gggcagctgt ggtggtgcct tctggagagg agcagagata     4740
          cacgtgccat gtgcagcatg aggggctacc cgagcccgtc accctgagat ggaagccggc     4800
          ttcccagccc accatcccca tcgtgggcat cattgctggc ctggttctcc ttggatctgt     4860
          ggtctctgga gctgtggttg ctgctgtgat atggaggaag aagagctcag gtggaaaagg     4920
          agggagctac tataaggctg agtggagcga cagtgcccag gggtctgagt ctcacagctt     4980
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          ggctaattca ctcccaacga agacaagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt     5880
          tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc     5940
          aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta     6000
          actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt cctggccaac     6060
          gtgagcaccg tgctgacctc caaatatcgt taagctggag cctgggagcc ggcctggccc     6120
          tccgcccccc ccacccccgc agcccacccc tggtctttga ataaagtctg agtgagtggc     6180
          cgacagtgcc cgtggagttc tcgtgacctg aggtgcaggg ccggcgctag ggacacgtcc     6240
          gtgcacgtgc cgaggccccc tgtgcagctg caagggacag gcctagccct gcaggcctaa     6300
          ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgcct catggctgac     6360
          taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt     6420
          agtgaggacg cttttttgga ggccgaggct tttgcaaaga tcgaacaaga gacaggacct     6480
          gcaggttaat taaatttaaa tcatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa     6540
          aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa     6600
          tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc     6660
          ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc     6720
          cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag     6780
          ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga     6840
          ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc     6900
          gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac     6960
          agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg     7020
          cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca     7080
          aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa     7140
          aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa     7200
          ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt     7260
          aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag     7320
          ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat     7380
          agttgcattt aaatggccgg cctggcgcgc cgtttaaacc tagatattga tagtctgatc     7440
          ggtcaacgta taatcgagtc ctagcttttg caaacatcta tcaagagaca ggatcagcag     7500
          gaggctttcg catgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat     7560
          tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc     7620
          agttgggtgc gcgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga     7680
          gttttcgccc cgaagaacgc tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg     7740
          cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc     7800
          agaatgactt ggttgagtat tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag     7860
          taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc     7920
          tgacaacgat tggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg     7980
          taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg     8040
          acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa ccttgcgtaa actattaact ggcgaactac     8100
          ttactctagc ttcccggcaa cagttgatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac     8160
          cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg     8220
          agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg     8280
          tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg     8340
          agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aaccgattct aggtgcattg gcgcagaaaa     8400
          aaatgcctga tgcgacgctg cgcgtcttat actcccacat atgccagatt cagcaacgga     8460
          tacggcttcc ccaacttgcc cacttccata cgtgtcctcc ttaccagaaa tttatcctta     8520
          agatcccgaa tcgtttaaac                                                 8540
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          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<400>  1001]]>
          ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc       60
          cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg      120
          gccaactcca tcactagggg ttcctagatc ttgccaacat accataaacc tcccattctg      180
          ctaatgccca gcctaagttg gggagaccac tccagattcc aagatgtaca gtttgctttg      240
          ctgggccttt ttcccatgcc tgcctttact ctgccagagt tatattgctg gggttttgaa      300
          gaagatccta ttaaataaaa gaataagcag tattattaag tagccctgca tttcaggttt      360
          ccttgagtgg caggccaggc ctggccgtga acgttcactg aaatcatggc ctcttggcca      420
          agattgatag cttgtgcctg tccctgagtc ccagtccatc acgagcagct ggtttctaag      480
          atgctatttc ccgtataaag catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct      540
          tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat      600
          gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg cggctccggt      660
          gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc      720
          ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg      780
          tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc      840
          gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt      900
          tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacg      960
          cccctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag     1020
          ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcttgg     1080
          gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga     1140
          taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga     1200
          tagtcttgta aatgcgggcc aagatgtgca cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg     1260
          cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg     1320
          gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct     1380
          cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc     1440
          gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg     1500
          gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc     1560
          agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt     1620
          ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg cgatggagtt     1680
          tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga tgtaattctc     1740
          cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt     1800
          tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgatgcggc cgccaccatg ggatcttgga     1860
          cactgtgttg cgtgtccctg tgcatcctgg tggccaagca cacagatgcc ggcgtgatcc     1920
          agtctcctag acacgaagtg accgagatgg gccaagaagt gaccctgcgc tgcaagccta     1980
          tcagcggcca cgattacctg ttctggtaca gacagaccat gatgagaggc ctggaactgc     2040
          tgatctactt caacaacaac gtgcccatcg acgacagcgg catgcccgag gatagattca     2100
          gcgccaagat gcccaacgcc agcttcagca ccctgaagat ccagcctagc gagcccagag     2160
          atagcgccgt gtacttctgc gccagcagaa agacaggcgg ctacagcaat cagccccagc     2220
          actttggaga tggcacccgg ctgagcatcc tggaagatct gaagaacgtg ttcccacctg     2280
          aggtggccgt gttcgagcct tctgaggccg agatcagcca cacacagaaa gccacactcg     2340
          tgtgtctggc caccggcttc tatcccgatc acgtggaact gtcttggtgg gtcaacggca     2400
          aagaggtgca cagcggcgtc agcaccgatc ctcagcctct gaaagagcag cccgctctga     2460
          acgacagcag atactgcctg agcagcagac tgagagtgtc cgccaccttc tggcagaacc     2520
          ccagaaacca cttcagatgc caggtgcagt tctacggcct gagcgagaac gatgagtgga     2580
          cccaggatag agccaagcct gtgacacaga tcgtgtctgc cgaagcctgg ggcagagccg     2640
          attgtggctt taccagcgag agctaccagc agggcgtgct gtctgccaca atcctgtacg     2700
          agatcctgct gggcaaagcc actctgtacg ccgtgctggt gtctgccctg gtgctgatgg     2760
          ccatggtcaa gcggaaggat agcaggggcg gctccggtgc cacaaacttc tccctgctca     2820
          agcaggccgg agatgtggaa gagaaccctg gccctatgga aaccctgctg aaggtgctga     2880
          gcggcacact gctgtggcag ctgacatggg tccgatctca gcagcctgtg cagtctcctc     2940
          aggccgtgat tctgagagaa ggcgaggacg ccgtgatcaa ctgcagcagc tctaaggccc     3000
          tgtacagcgt gcactggtac agacagaagc acggcgaggc ccctgtgttc ctgatgatcc     3060
          tgctgaaagg cggcgagcag aagggccacg agaagatcag cgccagcttc aacgagaaga     3120
          agcagcagtc cagcctgtac ctgacagcca gccagctgag ctacagcggc acctactttt     3180
          gtggcaccgc ctggatcaac gactacaagc tgtctttcgg agccggcacc acagtgacag     3240
          tgcgggccaa tattcagaac cccgatcctg ccgtgtacca gctgagagac agcaagagca     3300
          gcgacaagag cgtgtgcctg ttcaccgact tcgacagcca gaccaacgtg tcccagagca     3360
          aggacagcga cgtgtacatc accgataaga ctgtgctgga catgcggagc atggacttca     3420
          agagcaacag cgccgtggcc tggtccaaca agagcgattt cgcctgcgcc aacgccttca     3480
          acaacagcat tatccccgag gacacattct tcccaagtcc tgagagcagc tgcgacgtga     3540
          agctggtgga aaagagcttc gagacagaca ccaacctgaa cttccagaac ctgagcgtga     3600
          tcggcttcag aatcctgctg ctcaaggtgg ccggcttcaa cctgctgatg accctgagac     3660
          tgtggtccag ctaacctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc     3720
          ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga     3780
          ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca     3840
          ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc     3900
          tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc actagtcgtg     3960
          taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat     4020
          tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg     4080
          ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct     4140
          gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc     4200
          agcccaggta agggcagctt tggtgccttc gcaggctgtt tccttgcttc aggaatggcc     4260
          aggttctgcc cagagctctg gtcaatgatg tctaaaactc ctctgattgg tggtctcggc     4320
          cttatccatt gccaccaaaa ccctcttttt actaagaaac agtgagcctt gttctggcag     4380
          tccagagaat gacacgggaa aaaagcagat gaagagaagg tggcaggaga gggcacgtgg     4440
          cccagcctca gtctctagat ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg     4500
          cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt     4560
          cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaa                   4607
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          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc       60
          cguuaucacg aaagggcacc gagucggugc u                                      91
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          <![CDATA[<223>  含有2'-O-Me及PS修飾，關於取代及較佳實施例的詳細描述參見提交之說明書]]>
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          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc       60
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          gggaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccggaucugc caccaugacc aaccuguccg       60
          acaucaucga gaaggagacc ggcaagcagc uggugaucca ggaguccauc cugaugcugc      120
          ccgaggaggu ggaggaggug aucggcaaca agcccgaguc cgacauccug gugcacaccg      180
          ccuacgacga guccaccgac gagaacguga ugcugcugac cuccgacgcc cccgaguaca      240
          agcccugggc ccuggugauc caggacucca acggcgagaa caagaucaag augcuguccg      300
          gcggcuccaa gcggaccgcc gacggcuccg aguucgaguc ccccaagaag aagcggaagg      360
          uggagugaua gcuagcacca gccucaagaa cacccgaaug gagucucuaa gcuacauaau      420
          accaacuuac acuuuacaaa auguuguccc ccaaaaugua gccauucgua ucugcuccua      480
          auaaaaagaa aguuucuuca cauucucucg agaaaaaaaa aaaauggaaa aaaaaaaaac      540
          ggaaaaaaaa aaaagguaaa aaaaaaaaau auaaaaaaaa aaaacauaaa aaaaaaaaac      600
          gaaaaaaaaa aaacguaaaa aaaaaaaacu caaaaaaaaa aaagauaaaa aaaaaaaacc      660
          uaaaaaaaaa aaauguaaaa aaaaaaaagg gaaaaaaaaa aaacgcaaaa aaaaaaaaca      720
          caaaaaaaaa aaaugcaaaa aaaaaaaauc gaaaaaaaaa aaaucuaaaa aaaaaaaacg      780
          aaaaaaaaaa aacccaaaaa aaaaaaagac aaaaaaaaaa aauagaaaaa aaaaaaaguu      840
          aaaaaaaaaa aacugaaaaa aaaaaaauuu aaaaaaaaaa aaucuag                    887
          <![CDATA[<210>  1006]]>
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          <![CDATA[<400>  1006]]>
          guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucacg aaagggcacc       60
          gagucggugc                                                              70
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          <![CDATA[<211>  70]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<223>  含有2'-O-Me及PS修飾，關於取代及較佳實施例的詳細描述參見提交之說明書]]>
          <![CDATA[<400>  1007]]>
          guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucacg aaagggcacc       60
          gagucggugc                                                              70
          <![CDATA[<210>  1008]]>
          <![CDATA[<211>  70]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<223>  含有2'-O-Me及PS修飾，關於取代及較佳實施例的詳細描述參見提交之說明書]]>
          <![CDATA[<400>  1008]]>
          guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucacg aaagggcacc       60
          gagucggugc                                                              70
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<223>  含有2'-O-Me及PS修飾，關於取代及較佳實施例的詳細描述參見提交之說明書]]>
          <![CDATA[<400>  1009]]>
          guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggcaccga       60
          gucggugc                                                                68
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          gucggugc                                                                68
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  1011]]>
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          gucggugc                                                                68
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          <![CDATA[<400>  1012]]>
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          gucggugc                                                                68
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          <![CDATA[<400>  1013]]>
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          ggcaccgagu cggugcuuuu                                                   80
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          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc       60
          cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu                            100
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          gcugcagcgc acggguacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc       60
          cguuaucacg aaagggcacc gagucggugc u                                      91
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          gcugcagcgc acggguacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc       60
          cguuaucacg aaagggcacc gagucggugc u                                      91
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Claims (96)

  1. 一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。
  2. 一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸： a.  chr6:29942854-chr6:29942913及 b.  chr6:29943518-chr6:29943619； 其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的。
  3. 如請求項1或2之工程化細胞，其中該細胞具有降低或消除之至少一種HLA-A等位基因的表現，該等位基因選自：HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11及HLA-A24。
  4. 如請求項1至3中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29942864-chr6:29942903內之至少一個核苷酸。
  5. 如請求項1至4中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528-chr6:29943609內之至少一個核苷酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903。
  7. 如請求項1至6中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609。
  8. 如請求項1至7中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29942876-29942897內之至少一個核苷酸。
  9. 如請求項1至8中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含基因體座標chr6:29943528-29943550內之至少一個核苷酸。
  10. 如請求項1至9中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896及chr6:29942877-29942897。
  11. 如請求項1至10中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之至少一個核苷酸：chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549及chr6:29943530-29943550。
  12. 一種工程化人類細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內的至少一個核苷酸：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
  13. 一種工程化細胞，其相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A表面表現，其包含HLA-A基因中之基因修飾，其中該基因修飾包含選自以下之基因體座標內之插入/缺失、C成為T之取代或A成為G之取代：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
  14. 如請求項12或13之工程化細胞，其中該細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
  15. 如請求項12至14中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含該等基因體座標內之至少5、6、7、8、9或10個連續核苷酸。
  16. 如請求項12至15中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含該等基因體座標內之至少一個C成為T之取代或至少一個A成為G之取代。
  17. 如請求項1至16中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自： a.  chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046、chr6:29934330-29934350、chr6:29943115-29943135、chr6:29943135-29943155、chr6:29943140-29943160、chr6:29943590-29943610、chr6:29943824-29943844、chr6:29943858-29943878、chr6:29944478-29944498及chr6:29944850-29944870； b.  chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046； c.  chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609； d.  chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；及chr6:29942883-29942903； e.  chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；及chr6:29943589-29943609； f.  chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896及chr6:29942877-29942897； g.  chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549及chr6:29943530-29943550； h.  chr6:29945290-29945310、chr6:29945296-29945316及chr6:29945297-29945317、chr6:29945300-29945320； i.  chr6:29890117-29890137、chr6:29927058-29927078、chr6:29934330-29934350、chr6:29942541-29942561、chr6:29942542-29942562、chr6:29942543-29942563、chr6:29942543-29942563、chr6:29942550-29942570、chr6:29942864-29942884、chr6:29942868-29942888、chr6:29942876-29942896、chr6:29942876-29942896、chr6:29942877-29942897、chr6:29942883-29942903、chr6:29943062-29943082、chr6:29943063-29943083、chr6:29943092-29943112、chr6:29943115-29943135、chr6:29943118-29943138、chr6:29943119-29943139、chr6:29943120-29943140、chr6:29943126-29943146、chr6:29943128-29943148、chr6:29943129-29943149、chr6:29943134-29943154、chr6:29943134-29943154、chr6:29943135-29943155、chr6:29943136-29943156、chr6:29943140-29943160、chr6:29943142-29943162、chr6:29943143-29943163、chr6:29943188-29943208、chr6:29943528-29943548、chr6:29943529-29943549、chr6:29943530-29943550、chr6:29943536-29943556、chr6:29943537-29943557、chr6:29943538-29943558、chr6:29943549-29943569、chr6:29943556-29943576、chr6:29943589-29943609、chr6:29943590-29943610、chr6:29943590-29943610、chr6:29943599-29943619、chr6:29943600-29943620、chr6:29943601-29943621、chr6:29943602-29943622、chr6:29943603-29943623、chr6:29943774-29943794、chr6:29943779-29943799、chr6:29943780-29943800、chr6:29943822-29943842、chr6:29943824-29943844、chr6:29943857-29943877、chr6:29943858-29943878、chr6:29943859-29943879、chr6:29943860-29943880、chr6:29944026-29944046、chr6:29944077-29944097、chr6:29944078-29944098、chr6:29944458-29944478、chr6:29944478-29944498、chr6:29944597-29944617、chr6:29944642-29944662、chr6:29944643-29944663、chr6:29944772-29944792、chr6:29944782-29944802、chr6:29944850-29944870、chr6:29944907-29944927、chr6:29945024-29945044、chr6:29945097-29945117、chr6:29945104-29945124、chr6:29945105-29945125、chr6:29945116-29945136、chr6:29945118-29945138、chr6:29945119-29945139、chr6:29945124-29945144、chr6:29945176-29945196、chr6:29945177-29945197、chr6:29945177-29945197、chr6:29945180-29945200、chr6:29945187-29945207、chr6:29945188-29945208、chr6:29945228-29945248、chr6:29945230-29945250、chr6:29945231-29945251、chr6:29945232-29945252、chr6:29945308-29945328、chr6:29945361-29945381、chr6:29945362-29945382及chr6:31382543-31382563； j.   chr6:29942815-29942835、chr6:29942816-29942836、chr6:29942817-29942837、chr6:29942817-29942837、chr6:29942828-29942848、chr6:29942837-29942857、chr6:29942885-29942905、chr6:29942895-29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899-29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29942905-29942925、chr6:29942912-29942932、chr6:29942913-29942933、chr6:29943490-29943510、chr6:29943497-29943517、chr6:29943498-29943518、chr6:29943502-29943522、chr6:29943502-29943522、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943566-29943586、chr6:29943569-29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573-29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605、chr6:29943589-29943609、chr6:29943568-29943588及chr6:29942815-29942835； k.  chr6:29942884-29942904、chr6:29943519-29943539、chr6:29942863-29942883； l.  chr6:29943517-29943537及chr6:29943523-29943543； m. chr6:29942845-29942869、chr6:29942852-29942876、chr6:29942865-29942889、chr6:29942891-29942915、chr6:29942895-29942919、chr6:29942903-29942927、chr6:29942904-29942928、chr6:29943518-29943542、chr6:29943525-29943549、chr6:29943535-29943559、chr6:29943538-29943562、chr6:29943539-29943563、chr6:29943547-29943571、chr6:29943547-29943571、chr6:29943548-29943572、chr6:29943555-29943579、chr6:29943556-29943580、chr6:29943557-29943581、chr6:29943558-29943582、chr6:29943559-29943583、chr6:29943563-29943587、chr6:29943564-29943588、chr6:29943565-29943589、chr6:29943568-29943592、chr6:29943571-29943595、chr6:29943572-29943596、chr6:29943595-29943619、chr6:29943596-29943620及chr6:29943600-29943624； n.  chr6:29942885-29942905、chr6:29942895-29942915、chr6:29942896-29942916、chr6:29942898-29942918、chr6:29942899-29942919、chr6:29942900-29942920、chr6:29942904-29942924、chr6:29943511-29943531、chr6:29943520-29943540、chr6:29943521-29943541、chr6:29943529-29943549、chr6:29943566-29943586、chr6:29943568-29943588、chr6:29943569-29943589、chr6:29943569-29943589、chr6:29943570-29943590、chr6:29943573-29943593、chr6:29943578-29943598、chr6:29943585-29943605及chr6:29943589-29943609；或 o.  chr6:29942469-29942489、chr6:29943058-29943078、chr6:29943063-29943083、chr6:29943080-29943100、chr6:29943187-29943207、chr6:29943192-29943212、chr6:29943197-29943217、chr6:29943812-29943832、chr6:29944349-29944369、chr6:29944996-29945016、chr6:29945018-29945038及chr6:29945341-29945361、chr6:29945526-29945546。
  18. 如請求項1至17中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自chr6: 29942854-chr6: 29942913及chr6: 29943518-chr6: 29943619。
  19. 如請求項1至18中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29942876-29942897內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
  20. 如請求項1至19中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標chr6:29943528-29943550內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列。
  21. 如請求項1至20中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A表現係藉由基因編輯系統降低或消除，該基因編輯系統結合至包含基因體座標內之至少5個連續核苷酸的HLA-A基因體目標序列，該等基因體座標選自：chr6:29942864-29942884；chr6:29942868-29942888；chr6:29942876-29942896；chr6:29942877-29942897；chr6:29942883-29942903；chr6:29943126-29943146；chr6:29943528-29943548；chr6:29943529-29943549；chr6:29943530-29943550；chr6:29943537-29943557；chr6:29943549-29943569；chr6:29943589-29943609；及chr6:29944026-29944046。
  22. 如請求項17至21中任一項之工程化細胞，其中該HLA-A基因體目標序列包含該等基因體座標內之至少10個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個連續核苷酸。
  23. 如請求項12至22中任一項之工程化細胞，其中該細胞對HLA-B為同型接合的且對HLA-C為同型接合的。
  24. 如請求項1至23中任一項之工程化細胞，其中該HLA-B等位基因係選自以下HLA-B等位基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02。
  25. 如請求項1至24中任一項之工程化細胞，其中該HLA-C等位基因係選自以下HLA-C等位基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
  26. 如請求項1至25中任一項之工程化細胞，其中該HLA-B等位基因係選自以下HLA-B等位基因中之任一者：HLA-B*07:02；HLA-B*08:01；HLA-B*44:02；HLA-B*35:01；HLA-B*40:01；HLA-B*57:01；HLA-B*14:02；HLA-B*15:01；HLA-B*13:02；HLA-B*44:03；HLA-B*38:01；HLA-B*18:01；HLA-B*44:03；HLA-B*51:01；HLA-B*49:01；HLA-B*15:01；HLA-B*18:01；HLA-B*27:05；HLA-B*35:03；HLA-B*18:01；HLA-B*52:01；HLA-B*51:01；HLA-B*37:01；HLA-B*53:01；HLA-B*55:01；HLA-B*44:02；HLA-B*44:03；HLA-B*35:02；HLA-B*15:01；及HLA-B*40:02；且該HLA-C等位基因係選自以下HLA-C等位基因中之任一者：HLA-C*07:02；HLA-C*07:01；HLA-C*05:01；HLA-C*04:01 HLA-C*03:04；HLA-C*06:02；HLA-C*08:02；HLA-C*03:03；HLA-C*06:02；HLA-C*16:01；HLA-C*12:03；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*15:02；HLA-C*07:01；HLA-C*03:04；HLA-C*12:03；HLA-C*02:02；HLA-C*04:01；HLA-C*05:01；HLA-C*12:02；HLA-C*14:02；HLA-C*06:02；HLA-C*04:01；HLA-C*03:03；HLA-C*07:04；HLA-C*07:01；HLA-C*04:01；HLA-C*04:01；及HLA-C*02:02。
  27. 如請求項1至26中任一項之工程化細胞，其中該等HLA-B及HLA-C等位基因係選自以下HLA-B及HLA-C等位基因中之任一者：HLA-B*07:02及HLA-C*07:02；HLA-B*08:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:02及HLA-C*05:01；HLA-B*35:01及HLA-C*04:01；HLA-B*40:01及HLA-C*03:04；HLA-B*57:01及HLA-C*06:02；HLA-B*14:02及HLA-C*08:02；HLA-B*15:01及HLA-C*03:03；HLA-B*13:02及HLA-C*06:02；HLA-B*44:03及HLA-C*16:01；HLA-B*38:01及HLA-C*12:03；HLA-B*18:01及HLA-C*07:01；HLA-B*44:03及HLA-C*04:01；HLA-B*51:01及HLA-C*15:02；HLA-B*49:01及HLA-C*07:01；HLA-B*15:01及HLA-C*03:04；HLA-B*18:01及HLA-C*12:03；HLA-B*27:05及HLA-C*02:02；HLA-B*35:03及HLA-C*04:01；HLA-B*18:01及HLA-C*05:01；HLA-B*52:01及HLA-C*12:02；HLA-B*51:01及HLA-C*14:02；HLA-B*37:01及HLA-C*06:02；HLA-B*53:01及HLA-C*04:01；HLA-B*55:01及HLA-C*03:03；HLA-B*44:02及HLA-C*07:04；HLA-B*44:03及HLA-C*07:01；HLA-B*35:02及HLA-C*04:01；HLA-B*15:01及HLA-C*04:01；以及HLA-B*40:02及HLA-C*02:02。
  28. 如請求項1至27中任一項之工程化細胞，其中該等HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*07: 02及HLA-C*07: 02。
  29. 如請求項1至28中任一項之工程化細胞，其中該等HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*08: 01及HLA-C*07: 01。
  30. 如請求項1至29中任一項之工程化細胞，其中該等HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*44: 02及HLA-C*05: 01。
  31. 如請求項1至30中任一項之工程化細胞，其中該等HLA-B及HLA-C等位基因為HLA-B*35: 01及HLA-C*04: 01。
  32. 如請求項1至31中任一項之工程化細胞，其中該細胞在該細胞表面上具有降低之MHC II類蛋白的表現。
  33. 如請求項1至32中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有選自以下之基因的基因修飾：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。
  34. 如請求項1至33中任一項之工程化細胞，其中該細胞具有該CIITA基因中之基因修飾。
  35. 如請求項1至34中任一項之工程化細胞，其中該細胞在該細胞表面上具有降低之TRAC蛋白或TRBC蛋白的表現。
  36. 如請求項1至35中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞包含編碼表現於該工程化細胞之表面上之靶向受體或該受體之配位體的外源核酸。
  37. 如請求項36之工程化細胞，其中該靶向受體為CAR或TCR。
  38. 如請求項1至37中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞進一步包含編碼由該工程化細胞分泌之多肽的外源核酸。
  39. 如請求項1至38中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為免疫細胞。
  40. 如請求項1至39中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為初生細胞。
  41. 如請求項1至40中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞或粒細胞。
  42. 如請求項1至41中任一項之工程化細胞，其中該工程化細胞為淋巴球。
  43. 如請求項1至42中任一項之工程化細胞，其中該細胞為T細胞。
  44. 如請求項1至43中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含該等基因體座標內之至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個連續核苷酸。
  45. 如請求項1至44中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含插入/缺失。
  46. 如請求項1至45中任一項之工程化細胞，其中該基因修飾包含該等基因體座標內之至少一個C成為T之取代或至少一個A成為G之取代。
  47. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至46中任一項之工程化細胞。
  48. 一種細胞群體，其包含如請求項1至47中任一項之工程化細胞。
  49. 一種醫藥組合物，其包含如請求項48之細胞群體。
  50. 如請求項48之群體或如請求項49之醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%HLA-A陰性。
  51. 如請求項48至50中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%CIITA陰性。
  52. 如請求項48至51中任一項之群體或醫藥組合物，其中如藉由流動式細胞測量術所量測，該細胞群體為至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%內源性TCR蛋白陰性。
  53. 一種向有需要之個體投與如請求項1至53中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物的方法。
  54. 一種向個體投與如請求項1至53中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物的方法，其係作為過繼細胞轉移(ACT)療法。
  55. 一種治療疾病或病症之方法，其包含向有需要之個體投與如請求項1至53中任一項之工程化細胞、細胞群體或醫藥組合物。
  56. 一種製造工程化人類細胞之方法，該細胞相對於未經修飾細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白表面表現，其中該細胞對於HLA-B為同型接合的且對於HLA-C為同型接合的，該方法包含使細胞與包含以下之組合物接觸： a.  HLA-A引導RNA，其包含 i.   選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或 ii.  選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列；或 iv. 結合至包含表2至5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或 v.  與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或 vi. 與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之 b.  經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
  57. 一種相對於未經修飾細胞降低人類細胞中HLA-A蛋白之表面表現的方法，其包含使細胞與包含以下之組合物接觸： a.  HLA-A引導RNA，其包含 i.   選自SEQ ID NO: 1-211之引導序列；或 ii.  選自SEQ ID NO: 1-211之序列的至少17、18、19或20個連續核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 1-211之序列至少95%、90%或85%一致之引導序列；或 iv. 結合至包含表2至5中所列之基因體區域之目標位點的引導序列；或 v.  與表1至2及5中所列之基因體區域之至少17、18、19或20個連續核苷酸互補的引導序列，或與表4中所列之基因體區域之至少17、18、19、20、21、22、23或24個連續核苷酸互補的引導序列；或 vi. 與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致的引導序列；及視情況存在之 b.  經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸。
  58. 如請求項56或57之方法，其中該經RNA引導之DNA結合劑包含Cas9蛋白。
  59. 如請求項56或57之方法，其中該經RNA引導之DNA結合劑或編碼該經RNA引導之DNA結合劑的核酸為釀膿鏈球菌( S. pyogenes)Cas9、奈瑟氏腦膜炎菌( N. meningitidis)Cas9、嗜熱鏈球菌( S. thermophilus)Cas9、金黃色葡萄球菌( S. aureus)Cas9、來自新兇手弗朗西斯氏菌( F. novicida)之Cpf1、來自胺基酸球菌屬( Acidaminococcus sp.)之Cpf1或來自毛螺科菌( Lachnospiraceae bacterium) ND2006之Cpf1。
  60. 如請求項56或57之方法，其中該經RNA引導之DNA結合劑或編碼該經RNA引導之DNA結合劑的核酸為C成為T之鹼基編輯劑、A成為G之鹼基編輯劑，或APOBEC3A脫胺酶(A3A)及經RNA引導之切口酶。
  61. 如請求項56至60中任一項之方法，其進一步包含藉由使該細胞與基因編輯系統接觸來相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中MHC II類蛋白的表面表現，該基因編輯系統靶向選自以下之基因：CIITA、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、RFX5、RFXB/ANK、RFXAP、CREB、NF-YA、NF-YB及NF-YC。
  62. 如請求項56至61中任一項之方法，其進一步包含使該細胞與CIITA引導RNA接觸。
  63. 如請求項56至62中任一項之方法，其進一步包含相對於未經修飾細胞降低或消除該細胞中TCR蛋白之表面表現。
  64. 如請求項56至63中任一項之方法，其進一步包含使該細胞與外源核酸接觸。
  65. 如請求項64之方法，其中該外源核酸編碼靶向受體或由該細胞分泌之多肽。
  66. 如請求項64之方法，其進一步包含使該細胞與DNA依賴性蛋白激酶抑制劑(DNAPKi)接觸，視情況其中該DNAPKi為化合物1。
  67. 如請求項1至66中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為同種異體細胞。
  68. 如請求項1至67中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為初生細胞。
  69. 如請求項1至68中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為T細胞，視情況其中該T細胞為CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或記憶T細胞。
  70. 如請求項1至68中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為B細胞，視情況其中該B細胞為漿B細胞或記憶B細胞。
  71. 如請求項1至68中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞為幹細胞，視情況其中該幹細胞為富潛能幹細胞(PSC)、造血幹細胞(HSC)、誘導性富潛能幹細胞(iPSC)、間質幹細胞(MSC)、神經幹細胞(NSC)或角膜緣幹細胞(LSC)。
  72. 如請求項1至71中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中該經分泌之多肽為抗體或抗體片段。
  73. 如請求項1至72中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中該經分泌之多肽為全長IgG抗體、單鏈抗體或中和抗體。
  74. 如請求項1至73中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼由該細胞分泌之多肽的外源核酸或使該細胞與該外源核酸接觸，其中該經分泌之多肽為細胞介素。
  75. 如請求項1至74中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其包含編碼靶向受體之外源核酸或使該細胞與編碼靶向受體之外源核酸接觸，其中該靶向受體為T細胞受體(TCR)、CAR或增殖誘導之配位體(APRIL)。
  76. 如請求項1至75中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該細胞用基因編輯系統工程化。
  77. 如請求項76之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因編輯系統包含類轉錄活化蛋白效應因子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸酶。
  78. 如請求項76之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該基因編輯系統包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸，視情況其中該經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。
  79. 如請求項56至78中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該HLA-A引導RNA、該經RNA引導之DNA結合劑及/或該外源核酸在載體中提供至該細胞，視情況其中該HLA-A引導RNA及該經RNA引導之DNA結合劑提供於同一載體中。
  80. 如請求項56至79中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該引導RNA或該外源核酸在脂質核酸組裝組合物中，視情況在與經RNA引導之DNA結合劑相同的脂質核酸組裝組合物中提供至該細胞。
  81. 如請求項80之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該脂質核酸組裝組合物為脂質奈米粒子(LNP)。
  82. 如請求項56至81中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該HLA-A引導RNA包含單引導RNA，該單引導RNA包含SEQ ID NO: 344-438、472-504、533-560及1016之序列中的任一者或與SEQ ID NO: 344-438、472-504、及533-560及1016之序列中的任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的序列。
  83. 如請求項56至82中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該HLA-A引導RNA包含引導序列，該引導序列包含SEQ ID NO: 13-18、26、37-39、41、43、45及62之序列中的任一者；或其中該HLA-A引導RNA包含單引導RNA，該單引導RNA包含SEQ ID NO: 356-361、369、380-382、384、386、388及405之序列中的任一者或與SEQ ID NO: 356-361、369、380-382、384、386、388及405之序列中的任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的序列。
  84. 如請求項56至83中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該HLA-A引導RNA包含至少一個修飾。
  85. 如請求項84之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該至少一個修飾包括(i)經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸，(ii)核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵，(iii)經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸，(iv)該引導RNA之5'端之最前面五個核苷酸中之一或多處之修飾，(v)該引導RNA之3'端之最後面五個核苷酸中之一或多處之修飾，(vi)該引導RNA之最前面四個核苷酸之間的PS鍵，(vii)該引導RNA之最後面四個核苷酸之間的PS鍵，(viii)該引導RNA之5'端之最前面三個核苷酸處之經2'-O-Me修飾之核苷酸，(ix)該引導RNA之3'端之最後面三個核苷酸處之經2'-O-Me修飾之核苷酸，或(i)至(ix)中之一或多者的組合。
  86. 如請求項1至85中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於表現對由癌細胞表現之多肽具有特異性之TCR。
  87. 如請求項1至85中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於作為過繼細胞轉移(ACT)療法向個體投與。
  88. 如請求項1至85中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於治療患有癌症、傳染病或自體免疫疾病之個體。
  89. 一種細胞庫，其包含： a.  如請求項1至46及67至88中任一項之工程化細胞，或藉由如請求項56及58至88中任一項之方法產生之工程化細胞；及 b.  目錄，其包含記錄該細胞庫中之該等供體細胞之HLA-B及HLA-C等位基因的資訊。
  90. 如請求項89之細胞庫，其中該細胞庫包含相較於該細胞庫中之其他供體細胞具有HLA-B及HLA-C等位基因之獨特組合的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40個供體細胞。
  91. 一種向有需要之接受個體投與工程化細胞的方法，該方法包含： a.  測定該接受個體之HLA-B及HLA-C等位基因； b.  選擇如1至46、48、50至52、及67至88中任一項之工程化細胞或細胞群體，或藉由如請求項56、及58至88中任一項之方法產生之工程化細胞，其中該工程化細胞包含與該接受個體相同的HLA-B或HLA-C等位基因中之至少一者； c.  向該接受個體投與該所選擇之工程化細胞。
  92. 如請求項91之方法，其中該個體具有該工程化細胞之該等HLA-B及HLA-C等位基因。
  93. 如請求項1至92中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其用於向部分匹配之個體投與，供進行過繼細胞轉移(ACT)療法，其中該部分匹配之個體具有該工程化細胞或細胞群體之該等HLA-B及HLA-C等位基因。
  94. 如請求項53至55、87至88、及91至93中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該工程化細胞或細胞群體包含與該個體共有之HLA-B及HLA-C等位基因。
  95. 如請求項53至55、87至88、及91至93中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該工程化細胞或細胞群體的該等HLA-B及HLA-C等位基因包含該個體之一或多個HLA-B及HLA-C等位基因。
  96. 如請求項53至55、87至88、及91至93中任一項之工程化細胞、細胞群體、醫藥組合物或方法，其中該工程化細胞或細胞群體之該等HLA-B及HLA-C等位基因包含該個體之一或兩個HLA-B等位基因及/或一或兩個HLA-C等位基因。
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