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TW202219273A - 靶向ｒｎａ結合蛋白位點之寡核苷酸 - Google Patents

靶向ｒｎａ結合蛋白位點之寡核苷酸 Download PDF

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TW202219273A
TW202219273A TW110127057A TW110127057A TW202219273A TW 202219273 A TW202219273 A TW 202219273A TW 110127057 A TW110127057 A TW 110127057A TW 110127057 A TW110127057 A TW 110127057A TW 202219273 A TW202219273 A TW 202219273A
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antisense oligonucleotide
tdp
5mec
seq
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TW110127057A
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馬汀 亞柏林
李美玲
克里斯蒂安 威勒
喬納斯 維克莎
王叢薇
拉斯 喬恩森
雷維 賈葛西亞
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瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
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Abstract

本發明涉及反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸與前驅 mRNA 轉錄本上的保守性 TDP-43 結合位點互補，該反義寡核苷酸能夠復原 TDP-43 耗盡細胞中多個獨立 mRNA 之加工過程中的 RNA 結合蛋白功能。

Description

靶向　RNA　結合蛋白位點之寡核苷酸
本發明係有關反義寡核苷酸，其與多個 RNA 上之 RNA 結合蛋白標靶位點，諸如多個 RNA 轉錄本上之 TDP-43 結合位點互補，諸如完全互補，且能夠復原多個 RNA 轉錄本之 RNA 結合蛋白功能性，諸如用於其中 RNA 結合蛋白功能性耗盡的病況及醫學適應症。
TAR DNA 結合蛋白 43 (TDP-43) 為涉及 RNA 相關代謝之多功能 RNA/DNA 結合蛋白。TDP-43 沉積物之失調表現為患有以下運動神經元疾病之患者之腦及脊髓中之包涵體：肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS) 及額顳葉變性 (FTLD) (Prasad et al., Front. Mol. Neurosci., 2019)。
TDP-43 主要位於細胞核中，但為了其某些功能亦穿梭於細胞質中 (Ayala 等人, 2008)。在疾病中，諸如在 ALS 及 FTLD 中，細胞質 TDP-43 濃度增加導致細胞質包涵體形成 (Neumann 等人, 2006；Winton 等人, 2008a)。細胞質錯誤定位可能與細胞核耗盡有關，導致 TDP-43 功能減弱或喪失。存在 TDP-43 突變，其導致 TDP-43 標靶 RNA 之異常剪接，從而導致廣泛的剪接異常 (參閱例如 Arnold 等人, PNAS 2013 110 E736 – 745 及 Yang 等人, PNAS.U.S.A.111, E1121–E1129)。
Klim 等人報導 TDP-43 功能減弱時 STMN2 喪失係由於 STMN2 剪接被改變，且建議復原 STMN2 作為 ALS 之治療策略。
TDP-43 耗盡表現於一系列疾病中，稱為 TDP-43 病變，且包括例如諸如以下之疾病：肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS)、額顳葉變性 (FTLD)、進行性核上神經麻痺症 (PSP)、原發性側索硬化症、進行性肌萎縮症、阿茲海默症 (Alzheimer’s disease)、帕金森氏症 (Parkinson’s disease)、自閉症、海馬迴硬化性失智症 (Hippocampal sclerosis dementia)、唐氏症 (Down syndrome)、亨汀頓氏舞蹈症 (Huntington’s disease)、多麩醯胺酸病 (諸如第三型脊髓小腦性失調症)、肌病變及慢性創傷性腦病變。
Tollervey 等人, Nature Neuroscience 2010, 452-458 報導在健康腦組織及來自 FTLD 患者之腦組織中，TDP-43 之 RNA 標靶及位置依賴性剪接調節的特徵。大多數 TDP-43 結合位點映射至內含子、長非編碼 RNA (lncRNA) 及基因間轉錄本，其針對該等轉錄本進行富集以獲得富含 UG 的模體。TDP-43 中之保守性 RNP 片段涉及與 TAR DNA 序列及具有 UG 重複序列之 RNA 序列的結合 (Ayala 等人, J. Mol. Biol. 2005;348:575–588)。細胞中之 TDP-43 耗盡 (諸如 TDP 病變中之 TDP-43 耗盡) 係與 TDP-43 與 TDP-43 RNA 標靶之 RNA 結合的喪失相關。
人類 RNA 中之 TDP-43 結合位點可線上獲自 RNA 結合蛋白及相關聯模體之 A 資料庫 – 參閱 https://attract.cnic.es/results/e9f29380-8921-406e-84a8-27ce9b9398b4#。所揭示之某些特徵化人類 RNA TDP-43 結合位點包括以下 RNA 序列：GUGAAUGA、GUUGUGC、UGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 20)、GAAUGG、UGUGUGUG、GAAUGA、UGUGUG、GUUGUUC 及 GUUUUGC。
Melamed 等人報導 STMN2 之早熟多腺苷酸化媒介之喪失為 TDP-43 神經系統退化症之標誌。WO2019/241648 揭示用於增加 STMN2 表現之 2’O-甲氧基乙基 ASO。
本發明人已鑒定出反義寡核苷酸，其與 TDP-43 核酸結合位點互補，諸如完全互補，且能夠復原且處理或調節 TDP-43 RNA 轉錄本標靶，例如 RNA 轉錄本之表現及剪接，該等 RNA 轉錄本在細胞中失調，展示 TDP-43 功能喪失，且由此提供復原 TDP-43 耗盡之細胞 ( 亦即TDP-43 功能喪失之細胞) 中之 TDP-43 功能性之新方法，以及治療 TDP-43 病變之新治療方法。
本發明涉及反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸與前驅 mRNA 轉錄本上的保守性 TDP-43 結合位點互補，該反義寡核苷酸能夠復原 TDP-43 耗盡細胞中多個獨立 mRNA 之加工過程中的 RNA 結合蛋白功能。
本發明提供用於復原起作用的 TDP-43 含量減少之細胞中之 RNA 結合蛋白功能性，諸如 TDP-43 功能性或 TDP-43 樣功能性的寡核苷酸。
本發明提供能夠在 RNA 處理或一個或多個 TDP-43 標靶 RNA 之表現時復原 TDP-43 之細胞核功能，且由此至少部分地復原或增強 TDP-43 標靶 RNA 之功能表型之寡核苷酸。該等寡核苷酸化合物在本文中稱為 RNA 結合蛋白擬態，諸如 TDP-43 擬態。
本發明提供與 TDP-43 結合位點互補之反義寡核苷酸以及其在療法中之用途，諸如用於治療 TDP-43 病變。
本發明進一步提供與多個 RNA 轉錄本， 亦即自不同基因座轉錄之 RNA 轉錄本上之 TDP-43 結合位點互補的寡核苷酸。多個 RNA 轉錄本可例如獨立地選自由以下所組成之群組：前驅 mRNA、mRNA 及 lncRNA。
本發明提供長度為 8 至 40 個核苷酸之反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，該反義寡核苷酸包含長度為至少 8 個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組的序列互補，諸如完全互補：(5’ – 3’) (UG)n、(GU)n、UGUGUGUG、UGUGUGUGU、UGUGUGUGUG (SEQ ID NO 37)、UGUGUGUGUGU (SEQ ID NO 38)、UGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 35)、UGUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO 39)、GUGUGUGU、GUGUGUGUG、GUGUGUGUGU (SEQ ID NO 40)、GUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 41)、GUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO 42)、GUGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 43) 及 GUGAAUGA，其中 n 為 4 至 20；其中該反義寡核苷酸能夠在 TDP-43 耗盡之細胞中，諸如表現異常 TDP-43 蛋白之細胞中復原一個或多個 TDP-43 標靶 RNA功能表型。
連續核苷酸序列可包含一個或多個經修飾之核苷。
如背景章節中所解釋，功能性 TDP-43 主要為一種細胞核定位之蛋白質，其可能存在於細胞質中。然而，稱為細胞質包涵體 (亦稱為異常 TDP-43) 的 TDP-43 在細胞質中之聚集與非功能性 TDP-43 相關，且該情形例如在處理許多前驅 mRNA 時與細胞核 TDP-43 功能性喪失相關。因此，在細胞質包涵體中表現 TDP-43 之細胞被視為 TDP-43 耗盡的。
反義寡核苷酸可為經分離之反義寡核苷酸或經純化之寡核苷酸。本發明之反義寡核苷酸為經製造 (人造) 之反義寡核苷酸。
功能表型可謂例如 RNA 處理事件，該等 RNA 處理事件由功能性 TDP-43 (亦即，非異常 TDP-43，通常為細胞核 TDP-43) 調節，或依賴於該功能性 TDP-43，及/或該等 RNA 處理事件之精準度依賴於功能性 TDP-43。藉由使用本發明之反義寡核苷酸增強 TDP-43 功能性可因此藉由評估 RNA 處理事件之精準度來評價，如例如本文中所說明，參考 STMN2、ARHGAP32、SLC5A7、CERT1、CAMK2B、KALRN 及 UNC13A RNA處理，該等 RNA 處理事件由功能性 TDP-43 調節，或依賴於該依賴性 TDP-43。
本發明提供長度為 8 至 40 個核苷酸之反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，該反義寡核苷酸包含長度為至少 8 個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組的序列至少 75% 互補，諸如至少 90% 互補或 100% 互補：(5’ – 3’) (UG)n、(GU)n、UGUGUGUG、UGUGUGUGU、UGUGUGUGUG (SEQ ID NO 37)、UGUGUGUGUGU(SEQ ID NO 38)、UGUGUGUGUGUG(SEQ ID NO 35)、UGUGUGUGUGUGU(SEQ ID NO 39)、GUGUGUGU、GUGUGUGUG、GUGUGUGUGU(SEQ ID NO 40)、GUGUGUGUGUGU(SEQ ID NO 42)、GUGUGUGUGUGUG(SEQ ID NO 43) 及 GUGAAUGA，其中 n 為 4 至 20；該反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽用於藥物。
連續核苷酸序列可包含一個或多個經修飾之核苷。
本發明提供長度為 8 至 40 個核苷酸之反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽，該反義寡核苷酸包含長度為至少 8 個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組的序列至少 75% 互補，諸如至少 90% 互補或 100% 互補：(5’ – 3’) (UG)n、(GU)n、UGUGUGUG、UGUGUGUGU、UGUGUGUGUG (SEQ ID NO 37)、UGUGUGUGUGU(SEQ ID NO 38)、UGUGUGUGUGUG(SEQ ID NO 35)、UGUGUGUGUGUGU(SEQ ID NO 39)、GUGUGUGU、GUGUGUGUG、GUGUGUGUGU(SEQ ID NO 40)、GUGUGUGUGUGU(SEQ ID NO 42)、GUGUGUGUGUGUG(SEQ ID NO 43) 及 GUGAAUGA，其中 n 為 4 至 20；該反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽用於治療由 TDP-43 病變表徵之疾病。
連續核苷酸序列可包含一個或多個經修飾之核苷。
有利地，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含至少 12 或至少 13 個連續核苷酸，其與序列 UGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 35)、或 GUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO 42)、或 UGUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO 39) 或 GUGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 43) 互補，諸如完全互補。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含至少 14 個連續核苷酸，其與序列 UGUGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 46) 或 GUGUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO 47) 互補，諸如完全互補。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含至少 18 個連續核苷酸，其與序列 (UG)n 或 (GU)n 互補，諸如完全互補，其中 n 為整數 6 - 20，諸如 7 - 9。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含至少 18 個連續核苷酸，其與序列 UGUGUGUGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 48) 或 GUGUGUGUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO 49) 互補，諸如完全互補。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 CACACACA 或 ACACACAC。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 CACACACACACA (SEQ ID NO 14) 或 ACACACACACAC (SEQ ID NO 5)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 CACACACACACAC (SEQ ID NO 15) 或 ACACACACACACA (SEQ ID NO 6)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 CACACACACACACACA (SEQ ID NO 16) 或 ACACACACACACACAC (SEQ ID NO 7)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 20)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 21)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 22)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 23)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 24)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 25)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 26)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 27)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 28)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 29)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 30)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 31)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 32)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 33)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 34)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 50)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 51)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 52)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 53)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 54)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 55)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 56)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 57)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 58)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 59)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 60)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 61)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 62)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 63)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 64)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 65)。
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在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 67)。
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在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 96)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 97)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 98)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 99)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 100)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 101)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 102)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (SEQ ID NO 103)。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含序列 (CA)n 或 (AC)n，其中 n 為整數 6 - 20，諸如 7- 9。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的序列或選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列由選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的序列或選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列組成。
本發明提供選自由化合物 ID 第 1 – 18 號所組成之群組的的反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。因此，本發明之寡核苷酸可為選自由化合物 ID 第 1 – 18 號所組成之群組的的反義寡核苷酸或其醫藥上可接受之鹽。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸之長度為至少 12 或至少 13 個核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之連續核苷酸序列之長度為至少 12 個核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 12 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 13 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 14 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 15 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 16 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 17 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 18 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 19 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 20 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 21 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 22 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 23 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 24 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 25 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 26 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 27 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 28 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 29 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 30 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 31 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之任何態樣的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之長度為至少 32 個連續核苷酸。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸與互補標靶 RNA 相比的反義寡核苷酸之吉布斯自由能 (Gibbs free energy) 低於約 -10ΔG，諸如低於約 -15 ΔG，諸如低於約 - 17 ΔG。有利地，該等反義寡核苷酸之連續核苷酸序列之長度為至少 12 個，諸如至少 13 個核苷酸。
有利地，本發明之反義寡核苷酸可包含一個或多個經修飾之核苷。
有利地，本發明之反義寡核苷酸可包含 LNA 核苷。連續核苷酸序列內之 LNA 核苷酸進一步為有利的。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸可包含 LNA 核苷及非 LNA 核苷，諸如 DNA 核苷。在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可包含 LNA 及 DNA 核苷。在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷獨立地選自 LNA 及 DNA 核苷。有利地，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列內存在之連續 DNA 核苷之長度受到限制，以防止導致標靶 RNA 降解之 RNaseH 募集。 適合地，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列不包含超過四個連續 DNA 核苷，更有利地不包含超過 3 個連續 DNA 核苷。
在使用時，有利地，根據本發明之反義寡核苷酸能夠調節兩個或更多個 TDP-43 標靶前驅 mRNA (標靶 RNA) 之剪接。舉例而言，兩個或更多個 TDP-43 標靶 RNA 可獨立地選自由以下所組成之群組：STMN2 前驅 mRNA、ARHGAP32 前驅 mRNA、SLC5A7 前驅 mRNA、CERT1 前驅 mRNA、CAMK2B 前驅 mRNA、KALRN 前驅 mRNA 及 UNC13A 前驅 mRNA。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸能夠調節兩個或更多個 TDP-43 標靶前驅 mRNA (標靶 RNA) 之剪接。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸能夠調節三個或更多個 TDP-43 標靶前驅 mRNA (標靶 RNA) 之剪接。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸能夠調節四個或更多個 TDP-43 標靶前驅 mRNA (標靶 RNA) 之剪接。
在一些實施例中，根據本發明之反義寡核苷酸能夠調節兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 TDP-43 標靶前驅 mRNA (標靶 RNA) 之剪接。
在一些實施例中，在向 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠增強 STMN2 (野生型) 之表現，且進一步能夠增強至少一個，諸如兩個或更多個選自由以下所組成之群組的前驅 mRNA 之前驅 mRNA 剪接之精準度：ARHGAP32 前驅 mRNA、SLC5A7 前驅 mRNA、CERT1 前驅 mRNA、CAMK2B 前驅 mRNA、KALRN 前驅 mRNA 及 UNC13A 前驅 mRNA。在一些實施例中，兩個或更多個所選前驅 mRNA 選自由以下所組成之群組：STMN2 及 ARHGAP32；STMN2 及 SLC5A7；STMN2 及 CERT1；ARHGAP32 及 SLC5A7；ARHGAP32 及 CERT1；以及 SLC5A7 及 CERT1。
在一些實施例中，在向 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠增強兩個或更多個選自由以下所組成之群組的前驅 mRNA 之前驅 mRNA 剪接之精準度：STMN2 前驅 mRNA、ARHGAP32 前驅 mRNA、SLC5A7 前驅 mRNA、CERT1 前驅 mRNA、CAMK2B 前驅 mRNA、KALRN 前驅 mRNA 及 UNC13A 前驅 mRNA。在一些實施例中，兩個或更多個所選前驅 mRNA 選自由以下所組成之群組：STMN2 及 ARHGAP32；STMN2 及 SLC5A7；STMN2 及 CERT1；ARHGAP32 及 SLC5A7；ARHGAP32 及 CERT1；以及 SLC5A7 及 CERT1。
在一些實施例中，在向 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠增強三個或更多個選自由以下所組成之群組的前驅 mRNA 之前驅 mRNA 剪接之精準度：STMN2 前驅 mRNA、ARHGAP32 前驅 mRNA、SLC5A7 前驅 mRNA、CERT1 前驅 mRNA、CAMK2B 前驅 mRNA、KALRN 前驅 mRNA 及 UNC13A 前驅 mRNA。
在一些實施例中，兩個或更多個所選前驅 mRNA 選自由以下所組成之群組：STMN2 及 ARHGAP32；STMN2 及 SLC5A7；以及 STMN2 及 CERT1 前驅 mRNA。
在一些實施例中，在向 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠增強 STMN2 前驅 mRNA、ARHGAP32 前驅 mRNA、SLC5A7 前驅 mRNA、CERT1 前驅 mRNA、CAMK2B 前驅 mRNA、KALRN 前驅 mRNA 及 UNC13A 前驅 mRNA 的前驅 mRNA 剪接之精準度。
在一些實施例中，在向表現 STMN2 前驅 mRNA 之 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠增加 STMN2 之表現。
在一些實施例中，在向表現 STMN2 前驅 mRNA 之 TDP-43 耗盡細胞投予時，相較於具有連續外顯子 1 /外顯子 2 連結之野生型 STMN2 成熟 mRNA，反義寡核苷酸能夠降低包含介於外顯子 1 與外顯子 2 之間的隱蔽性外顯子 (ce1) 之 STMN2 成熟 mRNA 的比例。
在一些實施例中，在向表現 ARHGAP32 前驅 mRNA 之 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠減少異常剪接之 ARHGAP32 成熟 mRNA 的量。
在一些實施例中，在向表現 SLC5A7 前驅 mRNA 之 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠降低 SLC5A7 mRNA 轉錄本中異常外顯子包含水平。
在一些實施例中，在向表現 CERT1 前驅 mRNA 之 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠降低 CERT1 mRNA 轉錄本中異常外顯子包含水平。
在一些實施例中，在向表現 CAMK2B 前驅 mRNA 之 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠降低 CAMK2B mRNA 轉錄本中異常外顯子包含水平。
在一些實施例中，在向表現 KALRN 前驅 mRNA 之 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠降低 KALRN mRNA 轉錄本中異常外顯子包含水平。
在一些實施例中，在向表現 UNC13A 前驅 mRNA 之 TDP-43 耗盡細胞投予時，反義寡核苷酸能夠降低 UNC13A mRNA 轉錄本中異常外顯子包含水平。
在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠校正 TDP-43 耗盡細胞中之 STMN2、CERT1、SLC5A7、ARHGAP32、CAMK2B、KALRN 及 UNC13A 前驅 mRNA 中之兩者或更多者之異常剪接。
在一些實施例中，反義寡核苷酸不包含超過 3 個、或超過 4 個連續 DNA 核苷組成之區域。
在一些實施例中，反義寡核苷酸不能夠媒介 RNAseH 截切。
在一些實施例中，反義寡核苷酸為嗎啉基（morpholino）反義寡核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含一個或更多個親和力增強之核苷，諸如 2’ 糖修飾之核苷，其增強反義寡核苷酸與互補 RNA 分子之間之結合親和力，例如且有利地，以提供較低吉布斯自由能，諸如低於 -10，諸如低於 -15 之吉布斯自由能。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含一個或多個經修飾之核苷，諸如一個或更多個親和力增強之 2’ 糖修飾核苷，諸如 2’ 糖修飾之核苷，其獨立地選自由以下所組成之群組：2'-O-烷基-RNA；2'-O-甲基 RNA (2'-OMe)；2'-烷氧基-RNA；2'-O-甲氧基乙基-RNA (2'-MOE)；2'-胺基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-DNA；阿拉伯糖核酸 (ANA)；2'-氟-ANA；鎖核酸 (LNA) 或其組合。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含 2'-O-甲氧基乙基-RNA (2'-MOE) 核苷。在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之所有核苷為 2'-O-甲氧基乙基-RNA (2'-MOE) 核苷，視情況藉由硫代磷酸酯核苷間鍵來連接。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含 2'-O-甲基核苷。在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之所有核苷為 2'-O-甲基核苷，視情況藉由硫代磷酸酯核苷間鍵來連接。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列內之一個或多個經修飾之核苷為鎖核酸核苷 (LNA)，諸如選自由以下所組成之群組的 LNA 核苷：限制性乙基核苷 (cEt) 或 β-D-氧-LNA。
在一些實施例中，反義寡核苷酸之連續核苷酸序列包含核苷 LNA 核苷及 DNA 核苷，視情況藉由硫代磷酸酯核苷間鍵來連接。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列為混聚體或總聚體。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 8 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 9 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 10 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 11 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 12 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 13 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 14 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 15 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 16 個連續核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID No 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列或其至少 17 個連續核苷酸。
在一些實施例中，其中存在於反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之胞嘧啶鹼基獨立地選自由胞嘧啶及 5-甲基胞嘧啶所組成之群組。
在一些實施例中，存在於反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之胞嘧啶鹼基為 5-甲基胞嘧啶。
在一些實施例中，存在於反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之 LNA 胞嘧啶鹼基為 LNA 5-甲基胞嘧啶。
在一些實施例中，存在於反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之 LNA 胞嘧啶鹼基為 LNA 5-甲基胞嘧啶，且 DNA 胞嘧啶鹼基為胞嘧啶。
有利地，位於連續核苷酸序列上之核苷之間的核苷間鍵中之一個或多個是經修飾的。在一些實施例中，位於連續核苷酸序列上之核苷之間的核苷間鍵中之至少約 75%、至少約 80%、至少約 85%、至少約 90%、至少約 95% 或約 100% 是經修飾的。
在一些實施例中，經修飾之核苷間鍵中之一個或多個或所有為硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，連續核苷酸序列內之鍵中之一個或多個或所有為硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，存在於連續核苷酸序列中之所有核苷間鍵皆為硫代磷酸酯核苷間鍵。
在某些實施例中，存在於反義寡核苷酸中之所有核苷間鍵皆為硫代磷酸酯核苷間鍵。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 8 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 8 – 20 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 12 – 18 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 13 – 18 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 14 – 18 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 10 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 20 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 21 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 22 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 23 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為 24 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為25 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為26 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列之長度為27 – 32 個核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸由連續核苷酸序列組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含選自由以下所組成之群組的寡核苷酸或由該寡核苷酸組成：16,1、8,3、18,3、18,4、16,2、18,2、7,2、15,2、16,3、15,3、8,1、8,2、7,3、6,4、6,3、18,1、7,1、14,2、6,2、14,4、15,4、10,1 及 15,5。
本發明提供選自由以下所組成之群組的反義寡核苷酸：(化合物 ID 號) 16,1、8,3、18,3、18,4、16,2、18,2、7,2、15,2、16,3、15,3、8,1、8,2、7,3、6,4、6,3、18,1、7,1、14,2、6,2、14,4、15,4、10,1 及 15,5。
本發明之寡核苷酸可包含一個或多個結合物基團，亦即，該寡核苷酸可為反義寡核苷酸結合物。
本發明提供一種包含根據本發明之寡核苷酸的結合物，以及至少一個共價接附至該寡核苷酸之結合物部分。
本發明提供一種鹽，諸如反義寡核苷酸之醫藥上可接受之鹽，或本發明之結合物，諸如鈉鹽或鉀鹽。
本發明提供一種醫藥組成物，其包含：請求項之寡核苷酸，或本發明之結合物，以及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
本發明提供一種醫藥組成物，其包含：本發明之寡核苷酸，或本發明之結合物，以及醫藥上可接受之稀釋劑或溶劑及陽離子。陽離子可例如為鈉陽離子或鉀陽離子。稀釋劑/溶劑可為水。
本發明提供一種用於增強表現 TDP-43 異常或耗盡水平之細胞中之 TDP-43 功能性的方法，諸如體內或體外方法，該方法包含向該細胞投予有效量的本發明之寡核苷酸或根據本發明之結合物或根據本發明之鹽或組成物。
本發明提供一種用於治療或預防受試者之 TDP-43 病變之方法，其包含向罹患或易患 TDP-43 病變之受試者投予治療或預防上有效量的本發明之寡核苷酸或根據本發明之結合物、或根據本發明之鹽或組成物。
本發明提供用為藥物的本發明之寡核苷酸或根據本發明之結合物或根據本發明之鹽或組成物。
本發明提供用於治療 TDP-43 病變的本發明之寡核苷酸或根據本發明之結合物、或根據本發明之鹽或組成物。
本發明提供本發明之寡核苷酸或根據本發明之結合物、或根據本發明之鹽或組成物之用途，其用於製備供治療或預防 TDP-43 病變之藥物。
本發明提供本發明之用途或方法，其中 TDP-43 病變為選自由以下所組成之群組的神經疾病：肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS)、額顳葉變性 (FTLD)、進行性核上神經麻痺症 (PSP)、原發性側索硬化症、進行性肌萎縮症、阿茲海默症、帕金森氏症、自閉症、海馬迴硬化性失智症、唐氏症、亨汀頓氏舞蹈症、多麩醯胺酸病 (諸如第三型脊髓小腦性失調症)、肌病變及慢性創傷性腦病變。
在一些實施例中，TDP-43 病變為選自由肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS)、額顳葉變性 (FTLD) 所組成之群組的神經疾病。
本發明提供醫藥組成物，其包含本發明之反義寡核苷酸和醫藥上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐劑。
本發明提供一種本發明之反義寡核苷酸之醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，醫藥上可接受之鹽為鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。
本發明提供一種本發明之寡核苷酸之醫藥溶液，其中該醫藥溶液包含本發明之寡核苷酸及醫藥上可接受之溶劑，諸如磷酸鹽緩衝生理鹽水。
本發明提供呈固體粉末形式，諸如凍乾粉末形式之本發明之寡核苷酸。
通常，本發明之反義寡核苷酸包含長度為至少 8 個或至少 10 個核苷酸，諸如長度為 10-32、15-32、20-32、21-32、22-32、23-32、24-32、25-32、26-32、27-32 或 10–20 個核苷酸之連續核苷酸序列，其中連續核苷酸序列與 TDP-43 RNA 結合序列至少 75% 互補，諸如至少 90% 互補，或完全互補。在一些實施例中，反義寡核苷酸的所有核苷形成連續核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠調節至少兩個人類前驅 mRNA 的剪接。舉例而言，如實例中所說明，人類 STMN2、CERT1、SLC5A7、ARHGAP32、CAMK2B、KALRN 及 UNC13A 前驅 mRNA 之剪接取決於 TDP-43 結合。
在又一態樣中，本發明提供用於治療或預防神經退化性疾病，諸如肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS) 之方法，該等方法包含向罹患或易患該疾病之受試者投予治療或預防上有效量的本發明之寡核苷酸。
在又一態樣中，本發明之寡核苷酸或組成物用於治療或預防神經退化性疾病，如特徵為 TDP-43 病變或 TDP-43 自核定位錯誤之神經退化性病症，諸如肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS)。
定義
RNA 結合蛋白擬態及 TDP-43 擬態
TDP-43 為 TAR RNA/DNA 結合蛋白，其在人體中在人類染色體 1：11,012,653-11,022,858 正向股上經編碼 (基因 ENSG00000120948，Chr 1：11,012,344 – 11,025,739，典型 TDP-43 轉錄本之實例 = ENST00000439080.6)，且廣泛地涉及 RNA 剪接、穩定性及代謝。在健康細胞中，TDP-43 蛋白位於細胞核中，然而在若干種神經退化性疾病中，功能異常 TDP-43 聚集體在細胞質中形成 (通常與過度磷酸化及泛素化 TDP-43 相關)。
TDP-43 為 RNA 結合蛋白之實例，其結合至多個獨立 RNA 轉錄本中之 GU 重複序列。RNA 結合蛋白，諸如 TDP-43 與多個 RNA 轉錄本之群體的相互作用對 RNA 轉錄本之生物，諸如前驅 mRNA 上之剪接、RNA 穩定性、RNA 纍積具有巨大的影響，且因此為實現細胞中之獨立 RNA 之群體的表現提供機制。此在 TDP-43 耗盡之情況下尤其重要，其中功能性 TDP-43 之 RNA 結合的喪失與神經退化性密切相關。
本發明提供與多個 RNA 轉錄本上之富含 GU 之區域互補的反義寡核苷酸，諸如前驅 mRNA 轉錄本群體上之保守 TDP-43 結合位點。如實例中所說明，本發明之寡核苷酸的投予可以復原多個獨立 RNA 轉錄本之功能處理，否則其在 RNA 結合蛋白，例如 TDP-43 之耗盡或不存在下被異常處理。因此，本發明之反義寡核苷酸 (亦稱為本發明之化合物) 可稱為 RNA 結合蛋白擬態或 TDP-43 擬態，因為其在調節多個 RNA 轉錄本之 RNA 生物方面復原了 RNA 結合蛋白，諸如 TDP-43 之功能性。
舉例而言，藉由使用本發明之化合物 (例如，在 TDP-43 耗盡細胞中) 復原或增強之 RNA 結合蛋白功能性，諸如 TDP-43 功能性為表現、處理，例如前驅 mRNA 轉錄本之剪接事件，其使得復原功能性基因表現，否則功能性基因表現在功能性 TDP-43 含量降低之細胞 (本文稱為 TDP-43 耗盡細胞) 中失調。此可能使得基因表現增強或基因表現品質提高。
有利地，本發明之化合物能夠在一個或多個 TDP-43 標靶 RNA 之表現方面模擬功能性 TDP-43，且復原 TDP-43 之核功能，並因此復原 TDP-43 標靶 RNA 之功能表型。
應理解，其他 RNA 結合蛋白可結合至 TDP-43 結合位點，且因此本文中提及之 TDP-43 擬態為寡核苷酸，其與一個或多個 RNA 標靶 (諸如多個核酸標靶 ( 亦即自不同基因座描述之 RNA 標靶)) 之 TDP-43 結合位點互補，且其能夠復原正常 (野生型) 之表現。
如 Arnold 等人, PNAS 2013 中所報導，一些 TDP-43 病變與某些 TDP-43 突變有關，且該等可不必要與 TDP-43 細胞質耗盡有關。在本發明之上下文中，TDP-43 之正常功能可能經基因破壞，且因此亦被視為耗盡之潛在來源或正常 TDP-43，其為使用本發明之 TDP-43 擬態所解決之表型。
TDP-43 標靶 RNA 標靶之實例
如圖 13 中所說明，神經細胞中之 TDP-43 之耗盡使得細胞中大量 RNA 轉錄本之 RNA 加工發生巨大變化 —在此實例中，749 個 RNA 轉錄本說明了在 TDP-43 耗盡後由 RNA 測序確定的替代性 RNA 處理。
實例說明七種該等 TDP-43 標靶 RNA： STMN2 、 ARHGAP32 、 SLC5A7、 CERT1、CAMK2B、KALRN 及 UNC13A。
Arnold 等人之 PNAS 2013 110 E736 – 745 鑑別了 TDP-43 耗盡細胞 (TDP-43 ASO 耗盡小鼠) 中 TDP-43 結合 RNA 之前驅 mRNA 剪接的廣泛異常，且說明了使用微陣列分析鑑別指示性 TDP-43 調節的剪接事件。其剪接由 TDP-43 調節之 Arnold 等人所鑑別之 RNA 包括 Eif4h 、 Taf1b 、 Kcnip2、(TDP-43 突變依賴性)、 Sort1 、 Kcnd3 、 Ahi1 、 Atxn2 、 Ctnnd(劑量依賴性)。
STMN2 (Klim et al., Nat Neurosci. 2019 Feb;22(2):167-179) – 神經元細胞中 (例如 ALS 中) 之 TDP-43 耗盡導致 STMN2 轉錄本之錯誤剪接。STMN2 編碼微管調節器，其表現在 TDP-43 敲落及 TDP-43 錯誤定位後以及在患者特異性運動神經元及死後患者脊髓中下降。
STMN2 的轉譯後穩定化挽救由 TDP-43 耗盡引起神經元突過度生長及軸突再生缺陷。TDP-43 耗盡導致在 STMN2 之外顯子 1 與 2 之間摻入一個隱蔽性內含子。WO2019/241648 揭示完全 MOE 修飾之硫代磷酸酯 ASO，其用於抑制 STMN2 的錯誤剪接。
上述轉錄本及相關 TDP-43 耗盡剪接事件可用於使用本發明之化合物分析 TDP-43 功能性的恢復。
TDP-43 病變
TDP-43 病變為與 TDP-43 之表現減少或異常有關的疾病，通常與細胞質 TDP-43、尤其過度磷酸化及泛素化的 TDP-43 的增加有關。
TDP-43 耗盡在一系列疾病中顯示，稱為 TDP-43 病變，且例如包括諸如以下之疾病：肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS)、額顳葉變性 (FTLD)、進行性核上神經麻痺症 (PSP)、原發性側索硬化症、進行性肌萎縮症、阿茲海默症、帕金森氏症、自閉症、海馬迴硬化性失智症、唐氏症、亨汀頓氏舞蹈症、多麩醯胺酸病 (諸如第三型脊髓小腦性失調症)、肌病變及慢性創傷性腦病變。
TDP-43 耗盡之細胞
TDP-43 耗盡之細胞係指 TDP-43 功能性含量降低之細胞。應理解，在 TDP-43 病變中，異常 TDP-43 表現使得功能異常的細胞質 TDP-43 纍積，以及功能性核 TDP-43 含量降低 — 因為 TDP-43 耗盡之該等細胞的特徵可為 TDP-43 之功能性含量，且因此可能與功能異常的 TDP-43 含量的增加有關。對於體外評估，TDP-43 耗盡可以例如藉由基因工程方法 (例如 CRISPR/CAS9)，或如實例中所說明，藉由使用 TDP-43 之反義寡核苷酸抑製劑 (藉由靶向人類 TDP-43 轉錄本之缺口體寡核苷酸進行說明) 進行工程改造。
在一些實施例中，TDP-43 耗盡之細胞為神經元細胞。
與 TDP-43 結合位點互補之序列
例如，TDP-43 結合位點由多 GU 模體表徵 (參閱 RNA 結合之 A 資料庫 https://attract.cnic.es/results/e9f29380-8921-406e-84a8-27ce9b9398b4#)，且對於反義寡核苷酸介入合適地，TDP-43 結合位點可包含 (GU)n 或 (UG)n 之模體，其中 n 為至少 3 或較佳地至少 4.  在一些實施例中，n 為 4、5、6、7、8、9 或 10。
在一些實施例中，TDP-43 結合位點可包含選自由以下所組成之群組的序列：(UG)n、(GU)n、UGUGUGUG、UGUGUGUGU、UGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGU、UGUGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGUGU、GUGUGUGU、GUGUGUGUG、GUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUG、GUGUGUGUGUGU (SEQ ID NO 42)、GUGUGUGUGUGUG 及 GUGAAUGA，其中 n 為 4 至 20。
在一些實施例中，TDP-43 結合位點可包含選自由以下所組成之群組的序列：GUGAAUGA、GUUGUGC、UGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 35)、GAAUGG、UGUGUGUG、GAAUGA、UGUGUG、GUUGUUC 及 GUUUUGC。在一些實施例中，TDP-43 結合位點可包含序列 UGUGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 46)。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可包含與一個或多個選自由以下所組成之群組的序列互補，諸如完全互補的序列：(UG)n、(GU)n、UGUGUGUG、UGUGUGUGU、UGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGU、UGUGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGUGU、GUGUGUGU、GUGUGUGUG、GUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUG、GUGUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUGUG 及 GUGAAUGA，其中 n 為 4 至 20。
本發明之寡核苷酸可包含與 TDP-43 結合位點序列，諸如一個或多個選自由以下所組成之群組的序列互補，諸如完全互補的序列：(GU)n、(UG)n、GUGAAUGA、GUUGUGC、GAAUGG、UGUGUGUG、GAAUGA、UGUGUG、UGUGUGUGUGUG (SEQ ID NO 35)、GUUGUUC 及 GUUUUGC。
寡核苷酸
本文所用的「寡核苷酸」一詞的定義如同具有通常技術者所知，是指包含兩個或多個共價連結核苷的分子。該等共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常係在實驗室中藉由固相化學合成再以純化及分離來製作。提及寡核苷酸的序列時，是指共價連結核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，且通常經過純化或分離。
本發明之寡核苷酸可包含一或多個修飾核苷，如 2’ 糖修飾核苷。本發明之寡核苷酸可包含一或多個經修飾的核苷間鍵，如一個或多個硫代磷酸酯核苷間鍵。
反義寡核苷酸
本文所用的「反義寡核苷酸」一詞定義為能夠藉由與標靶核酸雜交，具體地與標靶核酸上的連續序列雜交而調節標靶基因之表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸實質上並非雙股，因此不是 siRNA 或 shRNA。本發明之反義寡核苷酸可為單股。應了解的是，只要跨寡核苷酸全長的序列內或序列間自補程度低於大約 50%，本發明之單股寡核苷酸便可形成髮夾或分子間雙鏈體結構（同一寡核苷酸的兩個分子之間的雙鏈體）。
在某些實施例中，本發明之單股反義寡核苷酸可不含有 RNA 核苷。
有利地，本發明之反義寡核苷包含一或多個修飾核苷或核苷酸，例如 2’ 糖修飾核苷。此外，在本發明的某些反義寡核苷酸中，未修飾的核苷是DNA核苷可能是有利的。
連續核苷酸序列
術語「連續核苷酸序列」意指寡核苷酸的與標靶核酸互補的區域。在本文中，該術語可與「連續核鹼基序列」和「寡核苷酸模體序列」交替使用。在一些實施例中，反義寡核苷酸之所有核苷組成連續核苷酸序列。連續核苷酸序列為本發明之寡核苷酸中與標靶核酸或標靶序列互補，且在某些情況下完全互補的核苷酸序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，且可視情況進一步包含核苷酸，例如可用於將官能基 (例如，結合物基團) 連接至該連續核苷酸序列之核苷酸連接子區域。所述核苷酸連接子區域可與標靶核酸互補或不互補。應當理解，寡核苷酸的連續核苷酸序列不能長於寡核苷酸本身，並且寡核苷酸不能短於連續核苷酸序列。
核苷酸和核苷
核苷酸和核苷為寡核苷酸及聚核苷酸的建構組元，在本發明中，包括自然產生及非自然產生核苷酸和核苷。在本質上，例如 DNA 及 RNA 核苷酸等核苷酸包含核糖部分、核鹼基部分以及一個或多個磷酸根 (核苷中則無磷酸根)。核苷及核苷酸亦可互換稱為「單元」或「單體」。
修飾核苷
本文中所用的「修飾核苷」或「核苷修飾」一詞意指藉由導入糖部分或 (核) 鹼基部分的一個或多個修飾，對照相等 DNA 或 RNA 核苷進行修飾的核苷。有利地，本發明之反義寡核苷酸之一種或多種經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。修飾核苷一詞在本文中亦可與「核苷類似物」或修飾「單元」或修飾「單體」等詞互換使用。本文中將具有未修飾 DNA 或 RNA 糖部分的核苷稱為 DNA 或 RNA 核苷。在 DNA 或 RNA 核苷的鹼基區域中包含修飾的核苷，若允許瓦特生克立克 (Watson Crick) 鹼基配對，則大體上仍稱為 DNA 或 RNA。可用於本發明之化合物的例示性經修飾之核苷包括 LNA、2’-O-MOE 及嗎啉基核苷類似物。
修飾核苷間鍵
「經修飾的核苷間鍵」一詞，如具有通常技術者所知之定義，是指除磷酸二酯 (PO) 鍵以外，可將兩個核苷共價連結在一起的鍵。本發明之寡核苷酸可因此包含一個或多個經修飾之核苷間鍵，諸如一個或多個硫代磷酸酯核苷間鍵。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 50% 的核苷間鍵為硫代磷酸酯，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的諸如至少 60%，諸如至少 70%，諸如至少 75%，諸如至少 80% 或諸如至少 90% 的核苷間鍵為硫代磷酸酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的全部所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯。
有利的是，所述寡核苷酸的連續核苷酸序列的所有所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯，或所述寡核苷酸的所有所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯鍵聯。
核鹼基
核鹼基一詞包括存在於核苷及核苷酸中的嘌呤 (例如腺嘌呤及鳥嘌呤) 和嘧啶 (例如脲嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶) 部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明範圍內，核鹼基一詞亦涵蓋與自然產生核鹼基不同但在核酸雜交期間具有功能性的修飾核鹼基。於本說明書中，「核鹼基」意指例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、脲嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤等自然產生核鹼基以及非自然產生變體。此類變體例如是 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 中所描述的變體。
在一些實施例中，核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變為經修飾之嘌呤或嘧啶而經修飾，諸如經取代之嘌呤或經取代之嘧啶，諸如選自異胞嘧啶、偽異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及 2-氯-6-胺基嘌呤、5’ 硝基吲哚的核鹼基。
所述核鹼基部分可用每一對應核鹼基的字母代碼表示，例如 A、T、G、C 或 U，其中各字母可視情況包括對等功能的修飾核鹼基。例如，在例示的寡核苷酸中，所述核鹼基部分選自 A、T、G、C 及 5-甲基胞嘧啶。視情況，5-甲基胞嘧啶 LNA 核苷可用於 LNA 缺口體。
修飾寡核苷酸
修飾寡核苷酸一詞描述包含一個或多個糖修飾核苷及/或修飾核苷間鍵的寡核苷酸。「嵌合寡核苷酸」一詞在文獻中用於描述包含糖修飾核苷和 DNA 核苷的寡核苷酸。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸為嵌合寡核苷酸可能係有利的。
互補性
「互補性」一詞是用來形容核苷/核苷酸的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對能力。瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基對是鳥嘌呤 (G) - 胞嘧啶 (C) 及腺嘌呤 (A) - 胸腺嘧啶 (T)/脲嘧啶 (U)。應知寡核苷酸可包含具有修飾核鹼基的核苷，例如 5-甲基胞嘧啶經常用來取代胞嘧啶，因此互補性一詞包括非修飾核鹼基與修飾核鹼基之間的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對 (見例如 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl 37 1.4.1)。
本文所用之「% 互補」係指核酸分子 (例如寡核苷酸) 中的連續核苷酸序列中與參考序列 (例如標靶序列或序列模體) 互補的核苷酸所佔的比例 (百分比)，該核酸分子橫跨所述連續核苷酸序列。互補性百分率的計算方式是先算出兩個序列間互補（形成華生-克立克 (Watson-Crick) 鹼基對）的對齊核鹼基（當對齊於標靶序列 5’-3’ 及寡核苷酸序列 3’-5’）的數目，將該數字除以該寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。在該等比對中，未對齊 (形成鹼基對) 的核鹼基/核苷酸稱為錯配。計算連續核苷酸序列的 % 互補性時不可進行插入和刪除。應知在判定互補性時，只要核鹼基形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾 (例如在計算 % 相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
在本發明內，反義寡核苷酸之連續核苷酸序列與 TDP-43 結合位點或標靶序列之間之互補程度可為至少約 75%。
在本發明內，反義寡核苷酸之連續核苷酸序列與標靶 TDP-43 結合位點或標靶序列之間之互補程度可為至少約 80%。
在本發明內，反義寡核苷酸之連續核苷酸序列與 TDP-43 結合位點或標靶序列之間之互補程度可為至少約 85%。
在本發明內，反義寡核苷酸之連續核苷酸序列與 TDP-43 結合位點或標靶序列之間之互補程度可為至少約 90%。
在本發明內，反義寡核苷酸之連續核苷酸序列與 TDP-43 結合位點或標靶序列之間之互補程度可為至少約 95%。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可與 TDP-43 結合位點或標靶序列完全互補。「完全互補」意指具有 100% 互補性。
本發明之化合物與 TDP-43 標靶 RNA 中之 TDP-43 結合位點互補。
如實例中所說明，可能不需要完全互補，且在一些實施例中，寡核苷酸可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多個與其所有效地結合之 TDP-43 標靶 RNA TDP-43 RNA 結合位點之錯配。就此而言，寡核苷酸可經設計，其與不同 TDP-43 標靶 RNA 中之多個但不相同的 TDP-43 結合位點充分互補。在一些實施例中，通用鹼基，諸如肌苷可用於反義寡核苷酸中之互補位置，該等位置與多個 TDP-43 RNA 標靶中之 TDP-43 結合位點序列不完全相同。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可包括相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之一個或多個錯配。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可包括相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之兩個或更多個錯配。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可包括相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之三個或更多個錯配。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可包括相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之四個或更多個錯配。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可包括相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之五個或更多個錯配。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可包括相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之六個或更多個錯配。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可包括相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之七個或更多個錯配。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可包括相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之八個或更多個錯配。
在一些實施例中，含有一個或多個，諸如兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個或八個或更多個錯配的本發明之寡核苷酸可與對於長度為 10-32 個核苷酸之寡核苷酸的 ΔG° 估計值低於 -10 kcal 的標靶核酸雜交。
在一些實施例中，含有一個或多個，諸如兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個或八個或更多個錯配的本發明之寡核苷酸可與對於長度為 10-32 個核苷酸之寡核苷酸的 ΔG° 估計值低於-12 kcal、-15 kcal、-17 kcal、-20 kcal、-30 kcal、-40 kcal、-50 kcal 或 -60 kcal 的標靶核酸雜交。
ΔG° 值的計算在下文論述。
相同度
本文所用的「相同度 (Identity)」術語係指核酸分子 (例如寡核苷酸)中之連續核苷酸序列與參考序列 (例如序列模體) 完全相同的核苷酸所佔的比例 (以百分比表現)，該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。相同度百分比的計算方式是，算出兩個序列 (在本發明之化合物的連續核苷酸序列中及在參考序列中) 之間相同 (為一個匹配) 的對齊核鹼基的數目，將該數字除以寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。因此，相同度百分比 = (匹配數 x 100)/對齊區域 (例如連續核苷酸序列) 長度。計算連續核苷酸序列的相同度百分比時不可對序列進行插入和刪除。應知在判定相同度時，只要核鹼基形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾 (例如在計算 % 相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
雜交
本文所用的術語「雜交」是指兩股核酸 (例如一股寡核苷酸及一股標靶核酸) 在相對股上的鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙股螺旋。兩股核酸之間的結合親和力是指雜交的強度。其通常用融化溫度 (T m) 來描述，所述融化溫度的定義是一半寡核苷酸與標靶核酸形成雙鏈體時的溫度。在生理條件下，T m並非嚴格與親和力成比例 (Mergny 及 Lacroix, 2003, Oligonucleotides13:515–537)。標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 更能準確代表結合親和力，並且與反應的離解常數 (K d) 之間具有 ΔG°=-RTln(K d) 的關係，其中 R 是氣體常數，而 T 是絕對溫度。因此，寡核苷酸與標靶核酸之間反應的非常低的 ΔG° 體現所述寡核苷酸與標靶核酸之間的強勢雜交。ΔG° 是與含水濃度為 1M、pH 為 7、溫度為 37℃ 的反應關聯的能量。寡核苷酸與標靶核酸的雜交是自發性反應，而自發性反應的 ΔG° 小於零。 ΔG° 可經由實驗來測量，例如，利用等溫滴定熱量測定術 (ITC) 方法，如下列文件所述：Hansen 等人，1965, Chem. Comm.36–38 及 Holdgate 等人，2005, Drug Discov Today。具有通常技術者應知，市面上可購得用於測量 ΔG° 的商用設備。ΔG° 亦可透過數值方式進行估計，例如藉由利用 SantaLucia 於 1998 年在 Proc Natl Acad Sci USA.95: 1460–1465 中所描述的最近鄰模型或利用 Sugimoto 等人於 1995 年在 Biochemistry34:11211–11216 中及 McTigue 等人於 2004 年在 Biochemistry43:5388–5405 中所描述的適當取得的熱動力學參數。在一些實施例中，對於長度為 10-30 個核苷酸之寡核苷酸，本發明之寡核苷酸與ΔG° 估計值低於 -10 kcal 的標靶核酸雜交。在某些實施例中，雜交的程度或強度是以標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 來測量。長度為 8 至 30 個核苷酸的寡核苷酸可以低於 -10 千卡範圍的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸，例如低於 -15 千卡，例如低於 -20 千卡，及例如低於 -25 千卡。在一些實施例中，該寡核苷酸與ΔG° 估計值為 -10 至 -60 kcal、諸如 -12 至 -40 kcal、諸如 -15 至 -30 kcal、或 -16 至 -27 kcal、諸如 -18 至 -25 kcal 的標靶核酸雜交。
例示性 TDP-43 RNA 標靶
在一些實施例中，TDP-43 標靶 RNA 為哺乳動物蛋白，稱為 Stathmin 2 或 SCG10、SCGN10，例如如 Gene: ENSG00000104435 (ensemble.org) 所揭示，在人類染色體 8: 79,610,814-79,666,175 正向股 (GRCh38:CM000670.2) 上所編碼的人類 STMN2。
在一些實施例中，TDP-43 標靶 RNA 為哺乳動物蛋白，稱為神經醯胺轉運體 1 (CERT1)，例如如 Gene: ENSG00000113163 (ensemble.org) 所揭示，在人類染色體 5: 75,356,345-75,512,138 反向股 (GRCh38:CM000667.2) 上所編碼的人類 CERT1。
在一些實施例中，TDP-43 標靶 RNA 為哺乳動物蛋白，稱為溶質載劑家族 5 成員 7，例如如 Gene: ENSG00000115665(ensemble.org) 所揭示，在人類染色體 2: 107,986,523-108,013,994 正向股 (GRCh38:CM000664.2) 上所編碼的人類 SLC5A7。
在一些實施例中，TDP-43 標靶 RNA 為哺乳動物蛋白，稱為 Rho GTPase 活化蛋白 32，例如如 Gene: ENSG00000134909(ensemble.org) 所揭示，在人類染色體 11: 128,965,060-129,279,324 反向股 (GRCh38:CM000673.2) 上所編碼的人類 ARHGAP32。
在一些實施例中，TDP-43 標靶 RNA 為 CAMK2B。
在一些實施例中，TDP-43 標靶 RNA 為 KALRN。
在一些實施例中，TDP-43 標靶 RNA 為 UNC13A。
標靶細胞
如本文所用之術語「標靶細胞」係指表現所靶向之 TDP-43 RNA 標靶之細胞，該等 TDP-43 RNA 標靶之表現藉由投予本發明之化合物來校正。適合地，標靶細胞進一步為 TDP-43 耗盡細胞。對於實驗用途，可以將 TDP-43 耗盡工程改造至細胞中，例如藉由基因工程 (例如 CRISPR/CAS9) 或藉由使用 TDP-43 之 ASO 抑製劑。
在某些實施例中，所述標靶細胞可以是體內或體外的。在某些實施例中，標靶細胞為哺乳動物細胞，諸如囓齒動物細胞，諸如小鼠細胞或大鼠細胞，或靈長類動物細胞，諸如猴子細胞或人類細胞。
在一些實施例中，標靶細胞為神經元細胞。
對於體外評估，標靶細胞可為麩胺酸神經元 (本文亦稱為麩胺酸神經元細胞)，諸如人類麩胺酸神經元，諸如 TDP-43 耗盡之人類麩胺酸神經元。人類麩胺酸神經元可購自 Cellular Dynamics (iCell 麩胺酸神經元)。對於體外評估，標靶細胞，諸如麩胺酸神經元在體外。標靶細胞之 TDP-43 耗盡，例如用於體外評估，可以藉由例如使用反義寡核苷酸或 siRNA 試劑來實現，或者可以經工程改造至細胞中，例如藉由 CRISPR/Cas9 編輯或 shRNA 載體表現。如實例中進一步說明，例如用於體外使用之標靶細胞可為人類多能幹細胞衍生之神經元，例如該等可作為iCell麩胺酸神經元套組, 01279 Cat. R1034 (Fujifilm Cellular Dynamics) 獲得。
剪接調節
剪接調節可用於校正隱蔽剪接、調節選擇式剪接、復原開放閱讀框且誘導蛋白質敲落。
剪接調節可以藉由 RNA 定序 (RNAseq) 進行分析，該 RNA 定序允許對前驅 mRNA 之不同剪接產物，或藉由數位微滴式 PCR，使用經設計為特定於一種或其他剪接形式之 PCR 分析進行定量評估。在本發明之一些實施例中，反義寡核苷酸調節 STMN2 前驅 mRNA 之剪接，例如，其降低成熟 STMN2 mRNA 之含量，該 mRNA 包含位於外顯子 1 與外顯子 2 之間之 RNA 序列 (如實例中所說明)，例如在標靶細胞或 TDP-43 耗盡細胞中。在本發明之一些實施例中，反義寡核苷酸調節 STMN2 前驅 mRNA 之剪接，例如，其增強成熟正確剪接之 STMN2 mRNA 之含量，該 mRNA 不包含位於外顯子 1 與外顯子 2 (稱為 WT STMN2 轉錄本) 之間之 RNA 序列，例如在標靶細胞中。
在本發明之一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸調節標靶細胞中之 CERT1 之剪接，諸如藉由降低成熟 CERT1 mRNA 中異常外顯子之包含水平，如實例中所說明。
在本發明之一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸調節標靶細胞中之 SLC5A7 之剪接，諸如藉由降低成熟 SLC5A7 mRNA 中異常外顯子之包含水平，如實例中所說明。
在本發明之一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸調節標靶細胞中之 ARHGAP32 之剪接，諸如藉由降低成熟 ARHGAP32 mRNA 中異常外顯子之包含水平，如實例中所說明。
高親和力修飾核苷
高親和力修飾核苷是一種修飾核苷酸，當併入所述寡核苷酸中時，可提升所述寡核苷酸對其互補標靶的親和力，例如以融化溫度 (T m) 所測定者。本發明之高親和力經修飾之核苷較佳造成每一修飾核苷的融化溫度增加介於 +0.5 至 +12℃ 之間，更佳介於 +1.5 至 +10℃ 之間，且最佳介於 +3 至 +8℃ 之間。此技術領域中已有眾多為人所知的高親和力修飾核苷，包括例如許多 2’ 取代核苷以及鎖核酸 (LNA) (見例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
糖修飾
本發明之寡聚物可包含一個或多個具有修飾糖部分的核苷，亦即與 DNA 及 RNA 中的核糖部分相較為經過修飾的糖部分。
目前已製成了眾多包含經修飾核糖部分的核苷，主要目的為改善寡核苷酸的特定特性，例如親和力及/或核酸酶抗性。
這些修飾包括對核糖環結構的修飾，例如取代為己糖環 (HNA)，或通常在核糖環上的 C2 與 C4 碳原子之間具有雙自由基橋的雙環 (LNA)，或通常在 C2 與 C3 碳原子之間無鍵的未連結核糖環 (例如 UNA)。其他糖修飾核苷包括，例如，雙環己糖核酸 (WO2011/017521) 或三環核酸 (WO2013/154798)。修飾核苷也包括將糖部分取代為非糖部分的核苷，例如胜肽核酸 (PNA) 或嗎啉基核酸的情形。
糖修飾也包括經由將核糖環上的取代基團改變為除在 DNA 及 RNA 核苷中自然存有的氫或 2’-OH 基團以外的基團來進行修飾。取代基可例如在 2’、3’、4’ 或 5’位置導入。
2’ 糖修飾核苷
2’ 糖修飾核苷是在 2’ 位置 (2’ 取代核苷) 具有非 H 或 –OH 的取代基的核苷或包含能夠在核糖環中的 2’ 碳與第二碳之間形成架橋的 2’ 連結雙自由基的核苷，例如 LNA (2’ – 4’ 雙自由基架橋) 核苷。
更確切地，2’ 糖取代核苷的開發頗受關注，目前也已發現許多 2’ 取代核苷在併入寡核苷酸中時具有助益特性。例如，2’ 修飾糖可加強所述寡核苷酸的結合親和力及/或增加所述寡核苷酸的核酸酶抗性。2’ 取代修飾核苷的實例包括 2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟基-RNA 及 2’-F-ANA 核苷。更多實例請參看例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 以及 Deleavey 與 Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為 2’ 取代修飾核苷的圖解。
Figure 02_image001
在本發明中，2’ 取代糖修飾核苷並不包括 2’ 橋接核苷，如 LNA。
鎖核酸核苷 (LNA 核苷 )
「LNA 核苷」是一種 2’- 修飾核苷，所述 2’- 修飾核苷包含連結所述核苷的核糖環之 C2’ 與 C4’ 的雙自由基 (此雙自由基亦稱為「2’ - 4’ 架橋」)，其可限制或鎖定所述核糖環的構造。該等核苷於文獻中也稱為橋接核酸或雙環核酸 (BNA)。鎖定核糖的構造，可在將 LNA 併入寡核苷酸中而產生互補 RNA 或 DNA 分子時提升雜交親和力 (雙鏈體穩定化)。藉由測量寡核苷酸/補體雙鏈體的融化溫度，可對此進行常規的判定。
非限制性地，例示 LNA 核苷已於 WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita 等人，Bioorganic & Med.Chem.Lett.12, 73-76,Seth 等人 J. Org.Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81 及 Mitsuoka 等人，Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238 以及 Wan 與 Seth，J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645−9667 中揭露。
方案 1 中揭露了其他非限制性例示 LNA 核苷。 方案 1 ：
Figure 02_image003
特定 LNA 核苷為 β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基 LNA，如 (S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA (ScET) 及 ENA。
具有特定優勢的 LNA 為 β-D-氧基-LNA。
嗎啉基寡核苷酸
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含嗎啉基核苷 ( 亦即嗎啉基寡聚體且作為磷二醯胺酯嗎啉基寡聚體 (PMO)) 或由嗎啉基核苷組成。剪接調節嗎啉基寡核苷酸已被批准用於臨床-例如參見伊特普森 (eteplirsen)，一種靶向 DMD 中框移突變的 30 nt 的嗎啉基寡核苷酸，用於治療杜顯氏肌肉萎縮症。嗎啉基寡核苷酸具有接附至六員口末啉環上而非核糖上的核鹼基，諸如透過磷二醯胺酯基團連接的亞甲基口末啉環，例如以下 4 個連續的嗎啉基核苷酸的繪示：
Figure 02_image005
在某些實施例中，本發明的嗎啉基寡核苷酸的長度可為例如 20-40 個嗎啉基核苷酸，諸如長度為嗎啉基 25-35 個 核苷酸。
RNase H 活性與招募
反義寡核苷酸的 RNase H 活性是指當其與互補 RNA 分子在雙鏈體中時，招募 RNase H 的能力。WO01/23613 提供判定 RNaseH 活性的體外方法，可用於判定招募 RNaseH 的能力。通常，若當提供互補標靶核酸序列時，寡核苷酸具有初始速率 (以 pmol/l/min 來量測) 為當使用與所測試之修飾之寡核苷酸具有相同鹼基序列、但寡核苷酸中所有單體之間僅含有具有硫代磷酸酯鍵的 DNA 單體、且使用 WO01/23613 (以引用方式併入) 的實例 91 - 95 所提供的方法所判定之初始速率的至少 5%、諸如至少 10% 或多於 20%，則寡核苷酸被認為能夠募集 RNase H。在判定 RHase H 活性時可使用瑞士琉森 Lubio Science GmbH 的重組型 RNase H1。
已知 DNA 寡核苷酸可有效地招募 RNaseH，缺口體 (gapmer) 寡核苷酸也是，包含 DNA 核苷區域（通常至少 5 或 6 個連續的DNA核苷）、在 5’ 和 3’ 側翼為包含 2’ 糖修飾核苷的區域，通常具有高親和力 2’ 糖修飾的核苷，諸如 2-O-MOE 和/或 LNA。為了有效地調節剪接，前驅 mRNA 的降解是非所欲的，且由此較佳的是避免標靶的 RNaseH 降解。因此，本發明之寡核苷酸較佳不為缺口體寡核苷酸。藉由限制寡核苷酸中之連續 DNA 核苷酸的數量來避免 RNaseH 募集 – 因此對於有效剪接調節，可使用混聚體或總聚體設計。
混聚體和總聚體
對於剪接調節，使用不招募 RNAaseH 的反義寡核苷酸通常是有利的。由於 RNaseH 活性需要連續的 DNA 核苷酸序列，因此反義寡核苷酸的 RNaseH 活性可藉由設計不包含多於 3 個或多於 4 個連續 DNA 核苷區域的反義寡核苷酸來實現。這可藉由使用具有混聚體設計的反義寡核苷酸或其連續的核苷區域來實現，其包含糖修飾的核苷（諸如 2’ 糖修飾核苷）和 DNA 核苷的短區域（諸如 1、2 或 3 個 DNA 核苷）。在本文中，混聚體之例示為每二個設計，其中核苷在 1 個 LNA 及 1 個 DNA 核苷之間交替，例如 LDLDLDLDLDLDLDLL，具有 5’ 及 3’ 末端 LNA 核苷，以及每三個設計，諸如 LDDLDDLDDLDDLDDL，其中每三個核苷為 LNA 核苷。
總聚體為不包含 DNA 或 RNA 核苷的反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列，且可例如僅包含 2'-O-MOE 核苷，諸如完全 MOE 硫代磷酸酯，例如 MMMMMMMMMMMMMMMMMMMM，其中 M = 2'-O-MOE，其經報導為用於治療用途的有效剪接調節劑。或者，混聚體可包含修飾之核苷的混合物，諸如 MLMLMLMLMLMLMLMLMLML，其中 L ＝ LNA，且 M =非 LNA 修飾之核苷，諸如 2’-O-MOE 核苷。
有利地，混聚體和總聚體中的核苷間核苷可為硫代磷酸酯，或混聚體中的大多數核苷鍵結可為硫代磷酸酯。舉例而言，混聚體和總聚體可包含其他核苷間鍵，諸如磷酸二酯或硫代磷酸鍵結 (phosphorodithioate)。
寡核苷酸中的區域 D’ 或 D’’
本發明之寡核苷酸之核鹼基的連續序列通常與存在於不同 TDP-43 RNA 中的多個 TDP-43 結合位點互補。與 TDP-43 結合位點互補 (諸如完全互補) 之反義寡核苷酸區域稱為連續核苷酸序列。在一些實施例中，反義寡核苷酸之所有核苷皆在連續核苷酸序列內 ( 亦即反義寡核苷酸及連續核苷酸序列的核苷酸長度相同)。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列及視情況存在之基於核苷酸的連接子區域，該連接子區域可以將寡核苷酸連接至視情況存在之官能基，諸如結合物，或其他非互補末端核苷酸 (例如區域 D’ 或 D’’)。
本發明之反義寡核苷酸可在一些實施例中包含寡核苷酸的連續核苷酸序列或由該連續核苷酸序列組成，其與該標靶核酸互補，諸如混聚體及總聚體區域，以及進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷。所述進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷可與或不與所述標靶核酸為完全互補。該等進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷本文中可稱為區域 D’ 及 D’’。
區域 D’ 或 D’’ 的加入可用於將該連續核苷酸序列（諸如混聚體或總聚體）連接至結合物部分或另一官能基團。當用於接合所述連續核苷酸序列與結合物部分時，其可做為生物可切斷型連接子。或者其可用於提供核酸外切酶保護或促進合成或製造。
區域 D’ 或 D’’ 可獨立包含或具有 1、2、3、4 或 5 個外加核苷酸，其可與所述標靶核酸為互補或不為互補。鄰接 F 或 F’ 區域的核苷酸並非糖修飾核苷酸，例如 DNA 或 RNA 或其鹼基修飾版本。D’ 或 D’’ 區域可做為對核酸酶易感的生物可切斷型連接子 (見連接子定義)。在某些實施例中，所述外加 5’ 及/或 3’ 端核苷酸是與磷酸二酯鍵結連結，且為 DNA 或 RNA。適用為區域 D’ 或 D’’ 的核苷酸基生物可切斷型連接子可參照 WO2014/076195 的揭露，舉例而言可包括磷酸二酯連結 DNA 二核苷酸。生物可切斷型連接子在聚寡核苷酸構造中的使用是揭示於 WO2015/113922，在該案中其係用於連結單一寡核苷酸中的多重反義構造。
在一個實施例中，本發明之寡核苷酸除包含除組成混聚體及總聚體的該連續核苷酸序列之外，亦包含區域 D’ 及/或 D’’。
在某些實施例中，該位在區域 D’或 D’’與混聚體和總聚體之間的核苷間鍵是磷酸二酯鍵。
結合物
本文所用的「結合物 (conjugate)」術語係指共價連結至非核苷酸部分 (結合物部分或區域 C 或第三區域) 的寡核苷酸。結合物部分可視情況經由連接子基團 (諸如區域 D’ 或 D’) 共價連接至該反義寡核苷酸。
寡核苷酸結合物及其合成業經報導於 Manoharan 在 Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T.Crooke 編輯，第 16 章, Marcel Dekker, Inc., 2001 中之綜合評論及 Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103。
在一些實施例中，非核苷酸部分 (結合物部分) 選自由碳水化合物 (例如 GalNAc)、細胞表面受體配體、原料藥、荷爾蒙、親脂性物質、聚合物、蛋白質、胜肽、毒素 (例如細菌毒素)、維他命、病毒蛋白質 (例如殼體) 或其組合所組成之群組。
連接子
鍵結或連接子是兩個原子之間的連接，用以將一個關注中的化學基團或區段經由一或多個共價鍵連結至另一個關注中的化學基團或區段。結合物基團可直接或經由連結部分 (例如連接子或繫鏈) 連附至寡核苷酸。連接子可將第三區域，例如結合物部分 (區域 C)，共價連接至第一區域，例如與所述標靶核酸互補的寡核苷酸或連續核苷酸序列 (區域 A)。
在本發明之一些實施例中，本發明之結合物或寡核苷酸結合物可視情況包含連接子區域 (第二區域或區域 B 及/或區域 Y)，其位在互補於標靶核酸的寡核苷酸或連續核苷酸序列 (區域 A 或第一區域) 與結合物部分 (區域 C 或第三區域) 之間。
區域 B 意指包含或具有一個生理不安定鍵的生物可切斷型連接子，所述生理不安定鍵在哺乳動物體內常態存在或與之類似的條件下會成為可切斷的鍵。生理不安定連接子經歷化學轉換 (例如，切斷) 的條件包括化學條件，例如 pH、溫度、氧化或還原條件或作用劑，以及哺乳動物細胞內所常態存在或與之類似的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中的酵素活性，例如蛋白分解酶或水解酶或核酸酶的活性。在一實施例中，所述生物可切斷型連接子易感於 S1 核酸酶切斷。在一些實施例中，核酸酶敏感性連接子包含 1 至 5 個核苷，諸如包含至少兩個連續磷酸二酯鍵的一個或多個 DNA 核苷。在 WO 2014/076195 中更詳細地描述含有磷酸二酯之可生物裂解的連接子。
區域 Y 係指未必為生物可切斷型但主要功能是將結合物部分 (區域 C 或第三區域) 共價連接至寡核苷酸 (區域 A 或第一區域) 的連接子。區域 Y 連接子可包含鏈狀結構或諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基等重複單元的寡聚物。本發明之寡核苷酸結合物可由以下區域元素構建而成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C 或 A-Y-C。在一些實施例中，連接子 (區域 Y) 為胺基烷基，例如 C2 - C36 胺基烷基，包括例如 C6 至 C12 胺基烷基。在某些實施例中，該連接子 (區域 Y) 為 C6 胺基烷基團。
治療
本文所用的「治療」一詞意指治療既有疾病 (例如本文所提及之疾病或疾患)，或防範疾病，也就是預防。因此應知，本文中所稱的治療，於某些實施例中，是屬於預防疾病性質。在一些實施例中，治療非為預防性的，例如治療係對已在患者中診斷出的現有疾病病況的治療。 發明實施方式
本發明之寡核苷酸
本發明之寡核苷酸為反義寡核苷酸，其與多個獨立前驅 mRNA 轉錄本上之 RNA 結合位點互補，諸如與多個前驅 mRNA 轉錄本上之 TDP-43 RNA 結合位點互補。本發明之寡核苷酸能夠調節多個前驅 mRNA 轉錄本之表現，例如 (獨立地) 經由調節前驅 mRNA 剪接、增強 RNA 穩定化、增強經編碼之蛋白質之表現、減少由前驅 mRNA 編碼之截短蛋白質之表現。如實例中所說明，本發明之寡核苷酸可因此用於增強處理為編碼正確表現及功能性蛋白質之成熟 mRNA 的前驅 mRNA 之精準度。本發明之寡核苷酸可因此適用於治療與前驅 mRNA 成熟之失調相關的疾病。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可以在寡核苷酸與標靶核酸 TDP-43 結合區域之間包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多個錯配。儘管存在錯配，但與標靶核酸之雜交仍可能足以顯示出 TDP-43 RNA 標靶 RNA 的所期望的調節。可以有利地藉由增加反義寡核苷酸中核苷酸的數量及/或增加能夠增加與標靶 (諸如存在於反義寡核苷酸序列內包括 LNA 的 2’ 糖修飾核苷) 的結合親和力的經修飾之核苷的數量來補償由錯配導致的減少的結合親和力。
在一些實施例中，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多個通用核苷 (諸如肌苷) 可用於錯配位置。
肌苷為具有以下結構之核苷：
Figure 02_image007
當寡核苷酸靶向具有不相同 TDP-43 結合區域之不同 TDP-43 標靶 RNA 時，通用核苷尤其有用。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可在表示相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之錯配的位置處包括一個或多個通用核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可在表示相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之錯配的位置處包括兩個或更多個通用核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可在表示相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之錯配的位置處包括三個或更多個通用核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可在表示相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之錯配的位置處包括四個或更多個通用核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可在表示相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之錯配的位置處包括五個或更多個通用核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可在表示相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之錯配的位置處包括六個或更多個通用核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可在表示相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之錯配的位置處包括七個或更多個通用核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸序列可在表示相對於 TDP-43 結合位點或標靶序列之錯配的位置處包括八個或更多個通用核苷酸。
在一些實施例中，在表示錯配之位置處含有一個或多個，諸如兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個或八個或更多個通用核苷酸的本發明之寡核苷酸可與對於長度為 10-32 個核苷酸之寡核苷酸的 ΔG° 估計值低於 -10 kcal 的標靶核酸雜交。
在一些實施例中，含有一個或多個，諸如兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個或八個或更多個錯配的本發明之寡核苷酸可與對於長度為 10-32 個核苷酸之寡核苷酸的 ΔG° 估計值低於-12 kcal、-15 kcal、-17 kcal、-20 kcal、-30 kcal、-40 kcal、-50 kcal 或 -60 kcal 的標靶核酸雜交。
ΔG° 值的計算在上文論述。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列在長度上包含以下或由以下組成：10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個、17 個、18 個、19 個、20 個、21 個、22 個、23 個、24 個、25 個、26 個、27 個、28 個、29 個、30 個、31 個、32 個、33 個、34 個、35 個、36 個、37 個、38 個、39 個 或 40 個連續核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸序列包含以下序列或由選自由以下所組成之群組的序列組成：序列 SEQ ID NO 1 – 18 或選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列。應理解，SEQ ID NO 1 – 18 中所示之序列或選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 之序列可包括修飾核鹼基，其在鹼基配對中起所示的核鹼基的作用，例如，可使用 5-甲基胞嘧啶代替甲基胞嘧啶。肌苷可用以作為通用鹼基。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：長度為 8 至 30 或 8 至 40 個核苷酸，其與選自由 SEQ ID NO: 1 至 18 所組成之群組的序列或選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列具有至少 75%，諸如至少 80%、至少 85%、至少 90% 的相同性、至少 90% 或更多的相同性。在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：長度為 8 至 30 或 8 至 40 個核苷酸，其與選自由 SEQ ID NO: 1 至 18 所組成之群組的序列或選自 SEQ ID NO 1-34 及 SEQ ID NO 50-103 的序列具有 100% 的相同性。
應理解的是，可修飾連續核鹼基序列（模體序列）以例如增加核酸酶抗性和/或對標靶核酸的結合親和力。
將修飾核苷（諸如高親和力修飾核苷）併入寡核苷酸序列中的模式通常稱為寡核苷酸設計。
用經修飾之核苷和 DNA 核苷來設計本發明之寡核苷酸。有利地，使用高親和力修飾核苷。
在一些實施例中，寡核苷酸包含至少 1 個經修飾之核苷，諸如至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個、至少 8 個、至少 9 個、至少 10 個、至少 11 個、至少 12 個、至少 13 個、至少 14 個、至少 15 個、至少 16 個經修飾之核苷、至少 17 個經修飾之核苷、至少 18 個經修飾之核苷、至少 19 個經修飾之核苷、至少 20 個經修飾之核苷、至少 21 個經修飾之核苷、至少 22 個經修飾之核苷、至少 23 個經修飾之核苷、至少 24 個經修飾之核苷、至少 25 個經修飾之核苷、至少 26 個經修飾之核苷、至少 27 個經修飾之核苷、至少 28 個經修飾之核苷、至少 29 個經修飾之核苷、至少 30 個經修飾之核苷、至少 31 個經修飾之核苷、至少 32 個經修飾之核苷或更多。在一實施例中，寡核苷酸包含 1 至 10 個修飾核苷，諸如 2 至 9 個修飾核苷，諸如 3 至 8 個修飾核苷，諸如 4 至 7 個修飾核苷，諸如 6 或 7 個修飾核苷。合適的修飾在“定義”部分的“修飾核苷”，“高親和力修飾核苷”、“糖修飾”、“2’ 糖修飾”和“鎖核酸 (LNA)”下描述。
在一個實施例中，寡核苷酸包含一個或多個糖修飾的核苷，例如 2’ 糖修飾的核苷。較佳地，本發明之寡核苷酸包含一個或多個 2’ 糖修飾核苷，其獨立地選自由以下所組成之群組：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸 (ANA)、2’-氟基-ANA 及 LNA 核苷。若修飾核苷中的一個或多個為鎖核酸 (LNA)，則是有利的。
在一進一步實施例中，寡核苷酸包含至少一個修飾之核苷間鍵。合適的核苷間修飾在“定義”部分的“修飾核苷間鍵”下描述。如果連續核苷酸序列內的至少 75%（諸如所有）核苷間鍵是硫代磷酸酯或硼酸磷酸核苷間鍵，則是有利的。在某些實施例中，寡核苷酸的連續序列中的所有核苷酸間鍵是硫代磷酸酯鍵。
醫藥上可接受之鹽
本發明考慮本發明之反義寡核苷酸之醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，醫藥上可接受之鹽為鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。 製造方法
在又一態樣中，本發明提供用以製造本發明之寡核苷酸的方法，所述方法包含使核苷酸單元進行反應，藉此在所述寡核苷酸中形成共價連結連續核苷酸單元。較佳地，該方法使用亞磷醯胺化學方法 (參閱例如 Caruthers 等人，1987 年，Methods in Enzymology 第 154 卷, 第 287-313 頁)。在又一實施例中，所述方法進一步包含使所述連續核苷酸序列與一接合部分 (配體) 反應，以使結合物部分共價連附至所述寡核苷酸。在又一態樣中，提供一種用以製造本發明組成物的方法，所述方法包含將本發明之寡核苷酸或結合寡核苷酸與一種醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑混合。
醫藥組成物
在另一態樣中，本發明提供之醫藥組成物包含任一上述寡核苷酸及/或寡核苷酸結合物或其鹽以及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝生理鹽水 (PBS)，且醫藥上可接受之鹽包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸以 50 - 300 µM 溶液之濃度用於醫藥上可接受之稀釋劑。
應用
本發明之寡核苷酸可於例如診斷學、治療法及預防法等領域用為研究試劑。
在研究中，可利用該等寡核苷酸模擬 TDP-43 在細胞 (例如 體外細胞培養物，諸如在神經元細胞中) 及實驗動物中的活性，藉此促進標靶的功能性分析，或評估以其作為治療介入標靶的實用性。
本發明提供一種方法，用於增強表現 TDP-43 之異常或耗盡水平之細胞中之 TDP-43 功能性的方法，諸如體內或體外方法，該方法包含向該細胞投予根據本發明之寡核苷酸、結合物、鹽或組成物。在一些實施例中，標靶細胞為哺乳動物細胞，尤其人類細胞。標靶細胞可為 體外細胞培養或為哺乳動物組織中的 體內細胞形成部分。在較佳實施例中，標靶細胞為神經元細胞，諸如正常 TDP-43 活性耗盡之神經元細胞。在一些實施例中，標靶細胞可表現與 TDP-43 之變體相關之疾病，及/或表現功能異常的 TDP-43。
在治療方面，可對於疑似患有可藉由模擬 TDP-43 而治療之疾病或病症的動物或人類投予寡核苷酸。
本發明提供用以治療或預防疾病之方法，該方法包含向罹患或易患該疾病之受試者投予治療或預防有效量之本發明之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物。
本發明亦涉及如本文中定義而可用為藥劑的寡核苷酸、組成物或結合物。
依據本發明之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或藥物組成物通常是以有效量施用。
本發明亦提供如所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸結合物在製造用以治療本文中所述疾患的藥劑上的用途，或提供治療本文中所提及之疾患的方法。
本發明進一步涉及如本文所定義之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物在製備用於治療神神經疾病，如特徵為 TDP-43 病變或 TDP-43 自核定位錯誤之神經退化性病症，諸如 ALS 的用途。
本發明亦提供本發明之寡核苷酸或反義寡核苷酸，以用於治療如本文所提及之病症的方法中。
在一個實施例中，本發明涉及寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物，其用於治療神經疾病，如特徵為 TDP-43 病變或 TDP-43 自核定位錯誤之神經退化性病症，諸如 ALS。
投予
本發明之寡核苷酸或醫藥組成物可例如經由腦內、腦室內或鞘內投予而進行投予。
在一較佳實施例中，本發明之寡核苷酸或醫藥組成物藉由腸胃外途徑投予，該腸胃外途徑包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內註射或輸注、鞘內或顱內，例如腦內或腦室內、玻璃體內投予。在一個實施例中，靜脈內投予活性寡核苷酸或寡核苷酸結合物。在另一個實施例中，皮下投予活性寡核苷酸或寡核苷酸結合物。
實例
實例 1 - 評估一系列「 TDP-43 」擬態 ASO 在 TDP-43 耗盡神經元細胞中校正 STMN2 前驅 mRNA 剪接的能力
所用化合物：化合物 1, 1 – 19,1 (化合物 A)
材料及方法
細胞培養材料：96 孔，黑色/澄清，組織培養物處理之盤 – 有蓋平底，Falcon 353219 層連結蛋白 521 Biolamina DPBS (1X) CaCl2+/MgCl2+, Gibco 14040-091 DAPT Sigma Aldrich D5942 iCell Motor Neurons 套組, 01279 Cat. R1049 (Fujifilm Cellular Dynamics)
RNA 分離材料 ： Rneasy Plus 96 套組, Qiagen Cat No.: 74192 Rnase-Free Dnase Set, Qiagen Cat No.: 79254
庫製備材料： TruSeq® Stranded Total RNA Library Prep Gold, Illumina Cat No.: 20020599
細胞接種、維持及 LNA 寡核苷酸處理：
將人類麩胺酸神經元以 2.0 x 105 個細胞/cm2 塗鋪在塗布有多-L-鳥胺酸/層粘連蛋白的 96 孔盤上。為了進行 TDP-43 敲落，自第 3 天起將細胞與 5 uM 的化合物 A 一起培育。自第 10 天起，以 10 uM 將細胞用化合物 1,1 至 18,1 另外處理 72 小時，且隨後在溶解緩衝液 (以套組供應) 中溶解。對照細胞僅用稀稀釋劑 (PBS) 處理。RNA 分離根據包括 DNase 處理步驟之製造商之說明書進行。
TDP-43 LNA 寡核苷酸 –化合物 A：
SEQ ID NO 19,1 = TCcacactgaacaAACC (大寫字母為 β-D-氧基 LNA，小寫字母為 DNA，LNA C 為 5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵為硫代磷酸酯)。
移除介質，且加入 100 ul/孔 (96mwp) 溶解緩衝液 (PureLink® Pro96 Thermo Fisher 套組)。RNA 純化按照包括 DnaseI 處理步驟之製造商之說明書 (RNA Purification PureLink® Pro 96 Thermo Fisher Kit) 進行。
RNA 定序分析
使用 TruSeq 股總 RNA 庫製備方案與移除 rRNA (Illumina) 之 RiboZero 生成定序庫。庫在 NovaSeq6000 定序儀 (Illumina) 上進行配對端定序，讀取長度為 150 bp。
樣品：  人類運動神經元 (hMNS) 用或不用靶向 TARDBP(編碼 TDP-43) 之寡核苷酸 19,1 及一系列 TDP-43 擬態 ASO、化合物 1,1 – 18,1 處理。資料分析使用 Partek Flow (使用 hg38及 Cufflinks 映射) 進行。
含有隱蔽性外顯子之 STMN2 的表現量及野生型 STMN2 的表現量經被標準化為未處理的對照細胞中之表現量 (100%)，且顯示在結果表 A 中，且在圖 1-3 中說明。
以下化合物使得 WT STMN2 mRNA 在 TDP-43 耗盡細胞中之表現增強：  5,1、14,1、1,1、15,5、14,2、15,1、6,1、6,4、13,1、15,4、9,1、10,1、6,3、7,1、18,1、8,1、7,3、16,3、14,4、15,3、6,2、8,2、7,2、18,3、16,1、16,2、15,2、18,2 及 8,3。
以下化合物使得 WT STMN2 mRNA 在 TDP-43 耗盡細胞中之表現增強，高於對照細胞中之表現量：  18,1、8,1、7,3、16,3、14,4、15,3、6,2、8,2、7,2、18,3、16,1、16,2、15,2、18,2 及 8,3。該等尤其有效之化合物之長度在 12 – 18 nt 之範圍內。該等尤其有效之化合物之 dG 之吉布斯自由能在約 -12 至約 -21 之範圍內。
值得注意的，最有效的化合物具有 18 nt 之長度及約 -20 之吉布斯自由能，表明長度至少為 12 個核苷酸且吉布斯自由能為至少約 -12 的化合物為有利的。
以下化合物減少 TDP-43 耗盡細胞中之 STMN2 異常剪接之 mRNA 的表現：  18,4、16,1、14,2、6,4、8,3、18,3、8,1、16,3、14,3、6,3、16,2、7,1、3,1、15,5、7,3、18,1、5,1、15,3、18,2、2,1、15,4 及 12,1。
與 WT STMN2 轉錄本 (小於 150) 相比，以下 TDP-43 擬態寡核苷酸化合物使得含有 STMN2 轉錄本之 STMN2 隱蔽性外顯子的比率顯著降低：  16,1、8,3、18,3、18,4、16,2、18,2、7,2、15,2、16,3、15,3、8,1、8,2、7,3、6,4、6,3、18,1、7,1、14,2、6,2、14,4、15,4、10,1、15,5。
如圖 1-3 所說明，具有較長長度 (圖 1) 及/或較低吉布斯自由能 (ΔG) (圖 2) 之化合物在校正 TDP-43 媒介之正確剪接方面更有效。值得注意的，未發現寡核苷酸/RNA 雙鏈體的融化溫度與 TDP-43 媒介之剪接校正的校正相關 (圖 3)。 結果表 A
化合物 ID 編號 SEQ ID NO 鹼基序列 STMN2 隱蔽性外顯子 2a (A) STMN2 wt (B) 比率 (A/B)x100 寡聚物長度 Tm 吉布斯自由能
                     
1,1 1 5’-ACACACAC-3’ 140 78 180 8 64 -8,8
2,1 2 5’-ACACACACA-3’ 126 71 177 9 64 -11,2
3,1 3 5’-ACACACACAC-3’ 118 64 184 10 65 -13,3
4,1 4 5’-ACACACACACA-3’ 137 71 194 11 66 -14,9
5,1 5 5’-ACACACACACAC-3’ 124 72 171 12 63 -15,0
6,1 6 5’-ACACACACACACA-3’ 137 83 164 13 62 -14,9
6,2 6 5’-ACACACACACACA-3’ 150 126 119 13 54 -14,1
6,3 6 5’-ACACACACACACA-3’ 114 98 115 13 54 -13,2
6,4 6 5’-ACACACACACACA-3’ 98 86 114 13 53 -14,1
7,1 7 5’-ACACACACACACACAC-3’ 116 99 117 16 54 -15,7
7,2 7 5’-ACACACACACACACAC-3’ 131 136 96 16 49 -15,4
7,3 7 5’-ACACACACACACACAC-3’ 119 114 104 16 51 -16,3
8,1 8 5’-ACACACACACACACACAC-3’ 111 108 103 18 51 -18,5
8,2 8 5’-ACACACACACACACACAC-3’ 137 133 103 18 51 -18,1
8,3 8 5’-ACACACACACACACACAC-3’ 101 149 68 18 40 -20,2
9,1 9 5’-CACACAC-3’ 149 97 153 7 61 -9,8
10,1 10 5’-CACACACA-3’ 142 97 146 8 59 -13,1
10,2 10 5’-CACACACA-3’ 142 71 200 8 67 -9,2
11,1 11 5’-CACACACAC-3’ 133 66 200 9 67 -11,2
12,1 12 5’-CACACACACA-3’ 129 66 193 10 66 -14,5
13,1 13 5’-CACACACACAC-3’ 147 88 167 11 63 -14,9
14,1 14 5’-CACACACACACA-3’ 139 75 185 12 65 -14,9
14,2 14 5’-CACACACACACA-3’ 96 82 117 12 54 -13,6
14,3 14 5’-CACACACACACA-3’ 113 70 162 12 62 -12,6
14,4 14 5’-CACACACACACA-3’ 145 120 121 12 55 -12,6
15,1 15 5’-CACACACACACAC-3’ 133 82 163 13 62 -14,9
15,2 15 5’-CACACACACACAC-3’ 137 143 96 13 49 -12,1
15,3 15 5’-CACACACACACAC-3’ 124 125 99 13 50 -14,1
15,4 15 5’-CACACACACACAC-3’ 127 96 133 13 57 -11,6
15,5 15 5’-CACACACACACAC-3’ 118 79 149 13 60 -12,0
16,1 16 5’-CACACACACACACACA-3’ 87 138 63 16 39 -17,3
16,2 16 5’-CACACACACACACACA-3’ 115 139 83 16 45 -17,2
16,3 16 5’-CACACACACACACACA-3’ 111 116 96 16 49 -17,1
18,1 18 5’-CACACACACACACACACA-3’ 121 105 115 18 53 -20,2
18,2 18 5’-CACACACACACACACACA-3’ 124 146 85 18 46 -20,8
18,3 18 5’-CACACACACACACACACA-3’ 107 136 79 18 44 -20,6
18,4 18 5’-CACACACACACACACACA-3’ 48 60 80 18 44 -21,0
19,1 19 5’-TCCACACTGAACAAACC-3’ 130 71 183 - -  -
實例 2 - 人類多能幹細胞衍生之神經元培養、寡核苷酸處理及 RNA 分離 — 評估 TDP-43 擬態 ASO 校正 TDP-43 耗盡細胞中之多個獨立 RNA 的異常剪接
所用寡核苷酸 化合物 A：靶向 TDP-43 之 LNA 缺口體寡核苷酸，SEQ ID NO 19 TCcacactgaacaAACC (大寫字母為 β-D-氧基 LNA，小寫字母為 DNA，LNA C 為 5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵為硫代磷酸酯) - 在本文中稱為化合物 19,1 號。
化合物 B – STMN2靶向及上調 STMN2 之表現的 LNA/DNA 混聚體 化合物 ID 編號 36： mC sa sc sA sc sA sc sG sc sA sc sA sc sa sT sG (SEQ ID NO 36) 其中大寫字母為 β-D-氧基 LNA 核苷酸，小寫字母為 2’去氧核糖核苷 (DNA 核苷)， mC 為 5-甲基胞嘧啶 β-D-氧基 LNA 核苷，且下標 s 為硫代磷酸酯核苷間鍵。
化合物 C – TDP43具有下式之 LNA/DNA 18nt 混聚體 (化合物(8,3)) A s mC sA sc sa sc sA sc sA sc sa sc sA sc sA sc sa mC (SEQ ID NO 8) 其中大寫字母為 β-D-氧基 LNA 核苷酸，小寫字母為 2’去氧核糖核苷 (DNA 核苷)， mC 為 5-甲基胞嘧啶 β-D-氧基 LNA 核苷，且下標 s 為硫代磷酸酯核苷間鍵。
用於進行實驗之方法如實例 1 中所述，然而，在用化合物 A 預處理後，細胞用化合物 B 或化合物 C 處理，或不用額外化合物處理。
使用 TruSeq 股總 RNA 庫製備方案與移除 rRNA (Illumina) 之 RiboZero 生成定序庫。庫在 NovaSeq6000 定序儀 (Illumina) 上進行配對端定序，讀取長度為 150 bp，且平均輸出 1 億個配對端讀數。資料分析在調整讀數 (去除短讀數以及自 3' 端去除最後一個核苷酸) 後進行。藉由使用 TopHat 2 將讀數映射至 hg38，且藉由使用 Cufflinks 對轉錄本進行量化。藉由使用包括在 Partek Flow 中之管線來識別選擇式剪接轉錄本。
在 Fasteris (Swiss)- Sequencing 進行 mRNA 定序 - 三重複方式進行定序，平均輸出為 1 億個配對端讀數。資料分析在調整讀數 (去除短讀數以及自 3' 端去除最後一個核苷酸) 後進行。藉由使用 TopHat 2 將讀數映射至 hg38，且藉由使用 Cufflinks 對轉錄本進行量化。藉由使用包括在 Partek Flow 中之管線來識別選擇式剪接轉錄本。
結果
由於已知 TDP-43 在許多前驅 mRNA 的之規範剪接中很重要 (Conti 等人, 2015 及 Humphrey 等人 2017)，我們選擇對用化合物 A、A+B、A+C 以及未經處理之細胞處理的麩胺酸神經元進行定序。對分離的 mRNA 作為配對端 (PE) 定序 (2x150bp) 進行下一代定序 (Illumina) 以獲得超過 1 億個 PE 讀數。為了識別轉錄組內之選擇式剪接，對讀數數量進行二次採樣，每個樣品具有 1.04 億個 PE 讀數 (處理以三重複方式進行)。
為了確保在用針對 TARDBP 之缺口體處理後去除 TARDBP，我們根據 mRNA-Seq 資料研究了表現量。觀測到編碼 TDP-43 蛋白之 TARDBP敲落大約 75 倍 (剩餘的 TARDBP轉錄本低於 2%) (圖 4)。自相對表現可看出，與僅用 TARDBPASO (化合物 A) 處理相比，用化合物 A+B 或 A+C 處理不改變 TARDBP之表現量 (圖 4)。
STMN2
接下來，我們研究其他轉錄本，其在用化合物 A (TDP-43 KD) 處理後改變剪接模式，且在用模擬 TDP-43 之寡核苷酸 (化合物 C) 處理後可以復原。包括靶向 STMN2 之 TDP-43 結合位點的模擬 TDP-43 之 ASO 作為對照 (化合物B)。最初，查看先前公佈之新剪接受體位點之包含，其受 STMN2 特異性 ASO (化合物 B) 或一般的模擬 TDP-43 之 ASO (化合物 C) 的影響。分析表明，野生型 (wt) STMN2的量用化合物 A+B 處理完全復原，且用化合物 A+C 處理部分復原 (圖 5A 及 B)。野生型 STMN2的復原係由於阻斷與 TDP-43 結合位點之結合，且從而阻止了內含子 1 中之 STMN2剪接受體位點的使用。於 2019 年公佈 (Klim 等人 2019 及 Melamed 等人 2019) (位於 chr8:79,616,822) 的此新的剪接受體位點取代了通常用於 STMN2外顯子 2 之受體位點。使用此新的剪接受體位點會使得剪接變體縮短，因為使用了剪接受體位點 3' 處 203 個核苷酸的多腺苷酸化位點 (圖 6)。
STMN2 編碼正常 hMN 過度生長及修復所必需的蛋白質。重要地，我們確定 STMN2之轉譯後穩定化可以挽救由 TDP-43 敲落引起的運動神經元突過度生長及軸突再生的缺陷。
Klim, J.R., Williams, L.A., Limone, F. Et al.ALS 相關蛋白 TDP-43 維持 STMN2 之含量，該 STMN2 為運動神經元生長及修復的媒介。 Nat Neurosci 22,167–179 (2019)。 https://doi.org/10.1038/s41593-018-0300-4 ARHGAP32
藉由對所謂的替代轉錄本之充分研究，以前顯示的另一個基因名稱與神經元發育及維持有關。此基因 ARHGAP32編碼 Rho GTPase 活化蛋白 32，該蛋白主要在大腦中表現，且已被證明與適當的神經元發育及維持有關。TDP-43 敲落使得在 pos. Chr11:128992046 處使用選擇式剪接受體位點 (導致在基因中之 ENSG00000134909 位置 200153 中之選擇式最後一個外顯子，如圖 7 中所示利用實驗驗證，且參考圖 8 中之 ARHGAP32前驅 mRNA 序列進行說明- 選擇式剪接位點由 ∧ 指示，請注意，僅 ARHGAP32前驅 mRNA 之片段示於圖 8 中，在本文中亦揭示為 SEQ ID NO 35)。藉由使用選擇式剪接位點形成的新外顯子亦含有兩個可能的多腺苷酸化位點 2471 及 2532 nts，分別位於剪接受體位點的下游 (參閱圖 8，陰影文本)。用 TARDBP缺口體 (亦即 TDP-43 耗盡細胞) 對其中 TDP-43 減少的麩胺酸神經元的處理表明，本發明之寡核苷酸 (化合物 C) 的加入減少了選擇式剪接受體位點的使用，而靶向 STMN2之混聚體 (化合物 B) 沒有任何影響 (圖 7)。圖 8 中所說明之第二個多腺苷酸化位點之前為GU 重複序列 RNA 結合蛋白序列，其為潛在的 TDP-43 結合位點 (圖 8)。使用選擇式剪接受體位點之結果為其生成一個 C 端截短之 ARHGAP32蛋白 - 導致 Rho GTPase 活化蛋白 32 截短，因為開放閱讀框在此變體之新的最後一個外顯子中含有終止密碼子。與長度為 2,087 個胺基酸之野生型 Rho GTPase 活化蛋白 32 相比，新的蛋白變體長 390 個胺基酸，其中 C 端有 6 個新胺基酸。該變體中缺少大部分 Rho-GAP 域。已展示亦缺乏之野生型 Rho GTPase 活化蛋白 32 之 C 端部分與 TrkA 直接相互作用，該 TrkA 為一種神經生長因子 (NGF) 之高親和力受體，其調節神經元過度生長。
SLC5A7
另一個顯示選擇式剪接的前驅 mRNA 為編碼高親和力膽鹼轉運體 1 之 SLC5A7 轉錄本。TDP-43 蛋白之喪失增加了剪接受體位點 (chr2:108,007,307) 及剪接供體位點 (chr2:108,007,400) 的使用，導致長度為 94 個鹼基對的新外顯子之包含 (chr2:108,007,307-108,007,400) (圖 9)。自相對表現可看出，TDP-43 (化合物 A) 敲落後，新的同功型之表現增加超過 6 倍。然而，用模擬 TDP-43 之 ASO (化合物 C) 進行的後續處理完全消除此選擇式外顯子之包含，因此，該轉錄本變體之表現譜類似於未經處理之細胞 (圖 9A 及圖 9B)。此外顯子之包含導致轉譯過程中的框移及新外顯子內的過早終止密碼子，以產生 326 個胺基酸的潛在截短變體 (野生型蛋白質長 580 個胺基酸 (Uniprot 條目 Q9GZV3)。已證明，高親和力膽鹼轉運體 1 (SLC5A7) 之 C 端截短會導致運動神經元缺陷，且在某些情況下會導致 ALS 之初步診斷 (Salter et al. 2018; Neurol Genet. 2018 Apr; 4(2): e222)。此觀測到的外顯子包含之蛋白質結果類似於在具有導致 C 端截短之突變的該等患者中所觀察之 C 端截短。
CERT1
另一種顯示選擇式剪接的轉錄本為編碼神經醯胺轉移蛋白或 (CERT1) 的 CERT1mRNA。TDP-43 之喪失導致使用新的剪接供體及剪接受體位點，以包括位於 hg38chr5:75415197-75415235 (在 ENSG00000113163 中位置 96395-96433) 處的新外顯子 (圖 11 及 12)。TDP-43 (化合物 A) 之喪失使新的同功型之表現增加大約 18 倍，而用 STMN2ASO (化合物 A+B) 及模擬 TDP-43 之 ASO (化合物 A+C) 兩者進行之後續處理去除了此新的框內外顯子之包含，類似於野生型細胞 (圖 11)。在前驅 mRNA 中，隱蔽性外顯子後面為許多潛在的 TDP-43 結合位點 (圖 12)。隱蔽性外顯子長度為 39 個 bp，且因此不會改變 ORF，但會在神經醯胺轉移蛋白 (CERT1) 內引入 13 個胺基酸。此結果為未知。CERT1 負責將神經醯胺自內質網 (ER) 轉移至高基氏體 (Golgi apparatus)。神經醯胺在 ER 處合成，隨後由 CERT1 轉移到高基氏體，在那裡其轉化為鞘磷脂。鞘磷脂為一種在動物細胞膜中發現的鞘脂，尤其在圍繞一些神經細胞軸突的膜狀髓鞘中。神經醯胺傳訊通路的調節涉及多種神經退行性疾病及神經發炎性疾病 (Jana et al.J Neurol Sci. 2009 Mar 15;278(1-2):5-15)。
為了比較靶向 TDP-43 之 ASO (化合物 B 及化合物 C) 是否具有相似的標靶，分析選擇式剪接轉錄本，從中建立了一些新的選擇標準。p 值應小於 0.01，且與對照分析相比應有 2 倍以上的變化。在 TARDBP敲落時顯示選擇式剪接的轉錄本數量為 749 (化合物 A 相對於未處理的細胞)，而在初始 TARDBPKD 後使用靶向 STMN2之 ASO 進行選擇式剪接的轉錄本數為 691 個轉錄本 (化合物 A+B 相對於化合物 A)。在此 691 個替代表現之轉錄本中，483 個與自 TDP-43 KD 鑑定的轉錄本重疊。最後，將 TARDBP敲落 (KD，TDP-43 耗盡) 後模擬 TDP-43 之 ASO 與 TARDBP(化合物 A+C 相對於化合物 A) 進行比較。此揭示 502 個選擇式剪接之轉錄本，其相對於未處理之細胞與在初始 TDP-43 KD 中看到的相同 (圖 13)。該分析顯示，與特異性靶向 STMN2 之化合物相比，本發明之反義寡核苷酸對調節 RNA 剪接具有更全面的作用，結果與對 ARHGAP32、SLC5A7 及 CERT1的特異性轉錄本分析完全一致，其中 STMN2 特異性化合物 B 不能校正由 TDP-43 耗盡引起的異常剪接，而本發明之化合物係有效的。
實例 3 ：使用 CA- 重複序列 ASO 挽救由於缺乏 TDP43 引起之錯誤 mRNA 剪接。
在本文，我們展示了 CA-重複序列反義寡核苷酸在一些 TDP43 標靶 (STMN2、KALRN、CAMK2B、CERT1 及 UNC13A) 上誘導適當剪接的能力。
CAMK2B
另一種顯示選擇式剪接之前驅 mRNA 為 CAMK2B 轉錄本，其編碼鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II 型亞基 β，且參與樹突棘及突觸形成以及神經元可塑性。CAMK2B 位於染色體 7:44217150-44334577:-1 (hg38) (Ensembl 條目 ENSG00000058404)上。
TDP43 蛋白之喪失會減少位置 chr7:44,231,004-44,231,005 處的典型剪接供體位點的使用，且使得外顯子延伸。在此序列中，當位於 chr7:44,222,113-44,222,114 之 TDP43 蛋白喪失時，亦會使用新的剪接受體位點。新的外顯子因此位於 chr7: 44,222,115-44,231,054 上。此外顯子為 8938 個核苷酸長，且含有大量終止密碼子，導致無意義媒介之 CAMK2B mRNA 之衰變 (圖 14b)。
KALRN
KALRN 基因 (Ensembl 條目 ENSG00000160145) 位於染色體 3 (染色體 3：124,033,369-124,726,325) (hg38) 上。KALRN 編碼 kalirin RhoGEF 激酶，亦稱為亨廷頓 (Huntingtin) 相關蛋白相互作用蛋白、蛋白 Duo 或具有 Dbl 及普列克基質蛋白 (pleckstrin) 同源域之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶。
TDP43 蛋白之喪失增大 KALRN 前驅 mRNA 內 (chr3:124,700,977；位於 chr3:124,700,975-124,700,976 處之 AG) 之兩個新的選擇式剪接受體位點及位於 (chr3:124,701,255，位於chr3:124,701,256-124,701,257處之 GT) 處的剪接供體位點的使用 (圖 15a 及 15b)。這會導致 279 個核苷酸之新外顯子之包含 (chr3:124,700,977-124,701,255)，其可能編碼 93 個胺基酸。然而，如圖 15c 所示，ORF 迅速進入以斜體及加底線 TGA 顯示的無意義密碼子。
UNC13A
UNC13A 編碼蛋白質 unc-13 同系物 A。 UNC13A 基因 (Ensembl 條目，ENSG00000130477) 位於染色體 19:17601336-17688365:-1 (hg38) 上 (負股)。蛋白質 unc-13 同系物 A 藉由在囊泡融合之前作用於突觸囊泡啟動而涉及神經傳導物質釋放，且參與易釋放囊泡池 (RRP) 的活性依賴性再填充。在大多數興奮性/麩胺酸而非抑制性/GABA 媒介之突觸 (UniProt) 中，對於突觸囊泡成熟至關重要。長期以來，人們皆知道 UNC13A 基因內之突變會增加肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS) 及額顳葉型失智症 (FTD) 的風險，且在最近的兩篇論文中描述了在 TDP43 喪失時隱蔽性外顯子之包含 (Anna-Leigh Brown 等人,「Common ALS/FTD risk variants in UNC13A exacerbate its cryptic splicing and loss upon TDP-43 mislocalization」 bioRxiv 2021.04.02.438170; doi:’https://doi.org/10.1101/2021.04.02.438170; X. Rosa Ma 等人, TDP-43 represses cryptic exon inclusion in FTD/ALS gene UNC13A, bioRxiv 2021.04.02.438213; doi: https://doi.org/10.1101/2021.04.02.438213)。此外，兩種已知的多型性與 ALS/FTD 風險密切相關，其改變了 UNC13A 前驅 mRNA 內之 TDP-43 結合，並因此導致隱蔽性外顯子之包含 (Brown 等人, 2021)。
我們資料以類似的方式顯示 Brown 等人，2021 年描述的隱秘外顯子，如下所述。TDP43 喪失後，UNC13A 內之兩個外顯子可藉由使用選擇式剪接受體及剪接供體位點觀測到。一個外顯子長度為 128 個核苷酸，且位於染色體 19:17,642,414-17,642,541 上，且另一個外顯子長度為 178 個核苷酸，且位於染色體 19:17,642,414-17,642,591 上 (圖 16a)。兩個外顯子重疊且使用相同的剪接受體位點 chr19:17,642,414，而剪接供體位點不同，分別為 chr19:17,642,591 及 chr19:17,642,541 (圖 16b 及 16c)。兩個外顯子均破壞了 UNC13A 之開放閱讀框架 (圖 16a)。
在第 0 天，將人類麩胺酸神經元 (Fujifilms) 以每 96 孔盤板 60000 個細胞的數量塗鋪，該盤塗有含層粘連蛋白及聚(乙烯亞胺)溶液 (Sigma Aldrich) 之 200 ul 培養基。在整個實驗期間 (第 1、5、8、11、13、15 天)，一半的細胞培養基每週更換 3 次。為了進行 TDP-43 敲落，在第 1 天及第 8 天 (兩個對照孔除外) 將化合物 A (SEQ ID 19,1) 以 5 uM 加入培養基中。CA-重複序列反義寡核苷酸在第 5 天及第 13 天以 10 uM 加入至培養基中。總共加入了 48 種不同的 CA 重複序列反義寡核苷酸。12 個孔僅接受化合物 A (SEQ ID 19,1) 以用作基線參考。
在第 18 天使用 Magnapure 溶解緩衝液 (Roche) 收集細胞，且根據包括 DNase 處理步驟之製造商之說明書在 MagNA 純 96 系統 (Roche) 上分離 RNA。純化的 RNA 在 cDNA 合成前以 90 變性 30 秒。根據製造商之說明書，使用 RT-qPCR 之 iScript Advanced cDNA Synthesis 套組 (Biorad) 形成 cDNA。
使用 QX1 系統 (Bio-Rad) 藉由微滴式數位 PCR 進行標靶基因表現量的量測。用於量測正常剪接的標靶 mRNA 表現之 pcr 探針分析經設計為跨越兩個外顯子，在此兩個外顯子之間會出現新的「突變」外顯子。
結果表 B 中顯示之資料針對看家基因 HPRT1 之表現進行了標準化，且最後針對未接受任何 TDP43 敲落或 CA-重複序列反義寡核苷酸的兩個對照孔 (PBS) 的平均表現值進行了標準化。
使用在 (Integrated DNA technologies (IDT)) 處合成之以下 PCR 探針分析：
TARDBP引子 1：CAGCTCATCCTCAGTCATGTC (SEQ ID NO 44) 引子 2：GATGGTGTGACTGCAAACTTC (SEQ ID NO 45) 探針：/5Cy5/CAGCGCCCCACAAACACTTTTCT/3IAbRQSp/ SEQ ID NO 104)
STMN2引子 1：CTGCTCAGCGTCTGC (SEQ ID NO 105) 引子 2：GTTGCGAGGTTCCGG (SEQ ID NO 106) 探針：/5HEX/CTAAAACAG/ZEN/CAATGGCCTACAAGGAAAAAATGAAG/3IABkFQ/ (SEQ ID NO 107)
CERT1引子 1：CTAATGGTTAAACGTGAGGACAGC (SEQ ID NO 108) 引子 2：ATCTGGTCCTCCAAAGTGGG (SEQ ID NO 109) 探針：/5HEX/CAGAAGAGA/ZEN/CTGGATAAGGAAACTGAGAAGAAAAGAAGAACAG/3IABkFQ/ (SEQ ID NO 110)
KALRN引子 1：CGAGCCCTCGGAGTTTG (SEQ ID NO 111) 引子 2：TCCTTCCAAGAAATGGTGGC (SEQ ID NO 112) 探針：/5HEX/CGACTTCCA/ZEN/GAATATGATGCTGCTGCTGATG/3IABkFQ/ (SEQ ID NO 113)
CAMK2B引子 1：CTGACAGTGCCAATACCACC (SEQ ID NO 114) 引子 2：GCTGCTCCGTGGTCTTAAT (SEQ ID NO 115) 探針：/5Cy5/ATGAAGACGCTAAAGCCCGGAAGCAG/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO 116)
UNC13A引子 1：GATCAAAGGCGAGGAGAAGG (SEQ ID NO 117) 引子 2：TGGCATCTGGGATCTTCAC (SEQ ID NO 118) 探針：/56-FAM/ACCTGTCTG/ZEN/CATGAGAACCTGTTCCACTTC/3IABkFQ/ (SEQ ID NO 119)
以下 CY5.5 標記之 HPRT1 探針購自 BioRad: dHsaCPE13136107。
結果表 B：顯示基因 TARDBP、STMN2、CERT1、CAMK2B、KALRN 及 UNC13A 的表現值。表現顯示為與未經處理之麩胺酸神經元(PBS) 的平均值相比的表現百分比。可以看出，與僅用 TDP43 敲落反義寡核苷酸 TDP43 KD (Seq ID 19,1) 處理之細胞相比，一些 CA 重複序列反義寡核苷酸能夠提高標靶基因之表現。
化合物 SEQ ID NO 鹼基序列 挽救化合物類別 TARDBP STMN2 CERT1 CAMK2B UNC13A KALRN
TDP43 KD Seq ID 19,1       2.5 44.0 75.9 21.7 50.4 1.2
TDP43 KD Seq ID 19,1       2.0 35.8 60.6 21.9 35.4 2.2
TDP43 KD Seq ID 19,1       2.2 45.9 63.6 20.7 42.4 0.0
TDP43 KD Seq ID 19,1       2.2 46.4 68.2 16.4 40.9 1.4
TDP43 KD Seq ID 19,1       1.6 44.9 60.5 22.1 48.3 1.9
TDP43 KD Seq ID 19,1       2.1 42.2 60.9 21.5 38.6 2.1
TDP43 KD Seq ID 19,1       2.2 39.6 56.7 16.8 37.0 1.3
TDP43 KD Seq ID 19,1       1.7 46.7 51.4 18.7 26.7 1.1
TDP43 KD Seq ID 19,1       2.1 39.4 59.7 16.9 43.3 1.8
TDP43 KD Seq ID 19,1       1.4 39.5 64.8 19.3 34.4 2.2
TDP43 KD Seq ID 19,1       3.3 45.3 69.3 20.3 41.1 1.6
TDP43 KD Seq ID 19,1       3.8 46.0 79.9 25.4 47.2 0.9
PBS         91.0 92.7 92.9 91.2 95.2 112.5
PBS         109.0 107.3 107.1 108.8 104.8 87.5
SEQ ID 20 20 CACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 1.7 152.4 128.6 89.6 78.6 53.6
SEQ ID 21 21 ACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.8 48.1 96.7 28.8 41.5 8.0
SEQ ID 22 22,1 CACACACACACAACACACACACAC LNA 混聚體 2.7 74.9 132.0 37.6 29.2 19.3
SEQ ID 22 22,2 CACACACACACAACACACACACAC LNA 混聚體 1.6 37.0 78.2 25.8 23.6 4.7
SEQ ID 23 23,6 CACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.0 83.2 113.7 37.3 60.8 5.8
SEQ ID 23 23,7 CACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.0 95.7 96.1 25.9 25.7 6.0
SEQ ID 23 23,8 CACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 3.4 71.1 121.0 42.6 48.0 21.7
SEQ ID 23 23,9 CACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 1.9 81.3 115.5 35.4 51.5 15.1
SEQ ID 24 24 ACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 3.3 50.3 101.3 25.2 34.1 7.1
SEQ ID 25 25,1 CACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.2 87.1 113.9 37.7 47.6 14.6
SEQ ID 25 25,2 CACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 1.7 90.1 110.1 27.5 35.2 6.8
SEQ ID 25 25,3 CACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.7 56.4 100.3 34.2 42.7 16.4
SEQ ID 25 25,4 CACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.9 86.9 97.0 34.0 49.7 16.4
SEQ ID 26 26 ACACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.6 51.6 98.8 28.7 46.0 7.7
SEQ ID 27 27,1 CACACACACACACACACACACACACACA LNA 混聚體 2.3 88.2 118.9 36.8 65.3 14.4
SEQ ID 27 27,2 CACACACACACACACACACACACACACA LNA 混聚體 1.9 70.7 115.3 33.1 52.7 11.9
SEQ ID 27 27,3 CACACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.7 58.9 97.5 31.1 53.3 8.3
SEQ ID 27 27,4 CACACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.4 90.8 119.9 30.7 32.7 3.7
SEQ ID 28 28 ACACACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 1.8 41.6 94.0 29.1 43.2 8.5
SEQ ID 29 29,1 CACACACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 3.3 63.6 87.4 26.7 35.7 12.8
SEQ ID 29 29,2 CACACACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 3.4 70.9 123.3 34.3 46.1 7.9
SEQ ID 29 29,3 CACACACACACACACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.1 48.3 90.0 23.8 45.7 13.7
SEQ ID 29 29,4 CACACACACACACACACACACACACACACAC-3' LNA 混聚體 3.0 48.4 116.6 22.4 20.6 7.6
SEQ ID 30 30 5'-ACACACACACACACACACCACACACACACACACA LNA 混聚體 2.2 57.5 108.9 27.3 32.3 2.1
SEQ ID 31 31,1 CACACACACACACACACACACACACACACACACA-3' LNA 混聚體 2.6 61.7 105.6 29.7 45.1 10.2
 SEQ ID 31 31,2 CACACACACACACACACACACACACACACACACA LNA 混聚體 3.2 58.7 110.4 25.3 31.7 9.6
SEQ ID 32 32 CACACACACACACACACAACACACACACACACACAC LNA 混聚體 2.5 59.0 98.4 26.8 26.6 8.3
SEQ ID 33 33 ACACACACACACACACACCACACACACACACACACA LNA 混聚體 1.7 57.7 79.6 23.7 38.8 3.0
SEQ ID 22 22,3 CACACACACACAACACACACACAC MOE 2.2 60.6 100.3 31.6 55.3 12.3
SEQ ID 23 23,1 CACACACACACACACACACACACAC MOE 2.7 89.0 90.4 29.0 35.7 24.9
SEQ ID 25 25,5 CACACACACACACACACACACACACAC MOE 1.9 79.5 103.1 28.8 45.6 16.4
SEQ ID 27 27,5 CACACACACACACACACACACACACACAC MOE 3.0 91.3 95.3 24.9 37.8 22.5
SEQ ID 29 29,5 CACACACACACACACACACACACACACACAC MOE 2.5 87.3 109.4 30.8 37.4 18.1
SEQ ID 23 23,2 CACACACACACACACACACACACAC MOE 混聚體 4.3 36.1 75.8 25.9 37.8 1.5
SEQ ID 25 25,6 CACACACACACACACACACACACACAC MOE 混聚體 3.4 37.9 69.1 20.3 37.2 1.0
SEQ ID 23 23,3 CACACACACACACACACACACACAC MOE 混聚體 2.5 56.4 100.5 25.4 53.9 5.5
SEQ ID 25 25,7 CACACACACACACACACACACACACAC MOE 混聚體 2.0 52.7 101.9 24.2 42.1 5.2
SEQ ID 27 27,6 CACACACACACACACACACACACACACAC MOE 混聚體 3.2 42.2 93.1 27.2 51.9 1.2
SEQ ID 27 27,7 CACACACACACACACACACACACACACAC MOE 混聚體 2.2 58.0 97.3 24.9 44.0 1.8
SEQ ID 29 29,6 CACACACACACACACACACACACACACACAC MOE 混聚體 3.4 31.3 62.2 14.0 19.1 1.3
SEQ ID 29 29,7 CACACACACACACACACACACACACACACAC MOE 混聚體 2.4 60.2 97.6 26.0 41.7 5.3
SEQ ID 23 23,4 CACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基 2.9 42.5 96.4 26.2 43.0 3.2
SEQ ID 25 25,8 CACACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基 3.3 49.3 106.6 28.2 45.9 3.2
SEQ ID 27 27,8 CACACACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基 2.9 46.8 104.1 29.1 52.4 1.1
SEQ ID 29 29,8 CACACACACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基 2.4 46.2 96.5 27.1 33.9 1.0
SEQ ID 23 23,5 CACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基混聚體 2.6 31.7 72.1 17.6 25.7 2.0
SEQ ID 25 25,9 CACACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基混聚體 3.0 40.7 85.7 17.3 27.5 0.3
SEQ ID 27 27,9 CACACACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基混聚體 3.5 44.5 102.3 22.2 40.2 1.9
SEQ ID 29 29,9 CACACACACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基混聚體 2.4 42.3 85.0 15.7 37.7 1.4
SEQ ID 34 34 ACACACACACACACACACACACACACACACAC 2'O-甲基混聚體 2.4 52.0 110.4 30.1 40.4 9.2
實例 4 - 使用富含 CA- 重複序列之 ASO 挽救由於缺乏 TDP43 引起之錯誤 mRNA 剪接。
為了說明含有一些序列變異的 CA-重複序列 ASO 仍然能夠校正由於缺乏 TDP43 而導致的錯誤 mRNA 剪接，我們製備至多具有 5 個核苷酸變化之 CA-重複序列 ASO，且表明其仍然能夠校正 mRNA 剪接。測試了該等富含 CA 重複序列之 ASO 在無 TDP43 之情況下誘導在 3 個已知 TDP43 標靶 (STMN2、KALRN、CAMK2B) 上之適當剪接的能力。
在第 0 天，將人類麩胺酸神經元 (Fujifilms) 以每 96 孔盤板 60000 個細胞的數量塗鋪，該盤塗有含層粘連蛋白及聚(乙烯亞胺)溶液 (Sigma Aldrich) 之 200 ul 培養基。在整個實驗期間 (第 1、3、6、8、10、13、15 天)，一半的細胞培養基每週更換 3 次。為了敲落 TDP-43，在第 1 天及第 8 天 (四個對照孔除外) 將化合物 A (SEQ ID 19,1) 加入 5 uM 的培養基中。富含 CA 重複序列之 ASO 在第 10 天及第 13 天以 10 uM 加入至培養基中。加入 60 種不同的富含 CA 重複序列之 ASO，如下表 C 中所指示。10 個孔僅接受化合物 A (SEQ ID 19,1) 以用作基線參考。
在第 16 天使用 Magnapure 溶解緩衝液 (Roche) 收集細胞，且根據包括 DNase 處理步驟之製造商之說明書在 MagNA 純 96 系統 (Roche) 上分離 RNA。純化的 RNA 在 cDNA 合成前在 90℃ 下變性 30 秒。根據製造商之說明書，使用 RT-qPCR 之 iScript Advanced cDNA Synthesis 套組 (Biorad) 形成 cDNA。
使用 QX1 系統 (Bio-Rad) 藉由微滴式數位 PCR 進行標靶基因表現量的量測。用於量測正常剪接的標靶 mRNA 表現之 pcr 探針分析經設計為跨越兩個外顯子，在此兩個外顯子之間會出現新的「突變」外顯子。
表 C 中顯示之資料針對看家基因 HPRT1 之表現進行了標準化，且最後針對未接受任何 TDP43 敲落或 CA-重複序列 ASO 的兩個對照孔 (PBS) 的平均表現值進行了標準化。
在 (Integrated DNA technologies (IDT)) 處合成之以下 PCR 探針分析為所用 TARDBP： 引子 1：CAGCTCATCCTCAGTCATGTC (SEQ ID NO 44) 引子 2：GATGGTGTGACTGCAAACTTC (SEQ ID NO 45) 探針：/5Cy5/CAGCGCCCCACAAACACTTTTCT/3IAbRQSp/) (SEQ ID NO 104)
STMN2： 引子 1：CTGCTCAGCGTCTGC (SEQ ID NO 105) 引子 2：GTTGCGAGGTTCCGG (SEQ ID NO 106) 探針：/5HEX/CTAAAACAG/ZEN/CAATGGCCTACAAGGAAAAAATGAAG/3IABkFQ/) (SEQ ID NO 107)
KALRN： 引子 1：CGAGCCCTCGGAGTTTG (SEQ ID NO 111) 引子 2：TCCTTCCAAGAAATGGTGGC (SEQ ID NO 112) 探針：/5HEX/CGACTTCCA/ZEN/GAATATGATGCTGCTGCTGATG/3IABkFQ/) (SEQ ID NO 113)
CAMK2B： 引子 1：CTGACAGTGCCAATACCACC (SEQ ID NO 114) 引子 2：GCTGCTCCGTGGTCTTAAT (SEQ ID NO 115) 探針：/5Cy5/ATGAAGACGCTAAAGCCCGGAAGCAG/3IAbRQSp/) (SEQ ID NO 116)
以下 CY5.5 標記之 HPRT1 探針購自 BioRad: dHsaCPE13136107。
結果表 C - 顯示基因表現值： TDP43 、 CAMK2B 、 STMN2 及 KALRN 。表現顯示為與未經處理之麩胺酸神經元 (PBS) 的平均值相比的表現百分比。
化合物 SEQ ID NO TDP43 CAMK2B STMN2 KALRN
PBS      99.2 99.4 101.7 103.9
PBS    94.9 99.8 91.5 80.6
PBS    97.6 86.7 99.7 97.5
PBS      108.2 114.2 107.1 118.0
TDP43 KD Seq ID 19,1 2.3 26.7 34.1 3.1
TDP43 KD Seq ID 19,1 0.9 28.5 30.2 2.3
TDP43 KD Seq ID 19,1 1.2 24.9 35.4 1.9
TDP43 KD Seq ID 19,1 1.0 22.5 35.6 1.8
TDP43 KD Seq ID 19,1 1.5 25.4 40.0 3.2
TDP43 KD Seq ID 19,1 1.5 25.3 36.1 1.1
TDP43 KD Seq ID 19,1 2.1 25.1 34.0 1.6
TDP43 KD Seq ID 19,1 2.1 26.9 35.4 1.6
TDP43 KD Seq ID 19,1 2.1 19.8 30.5 1.7
TDP43 KD Seq ID 19,1 2.2 19.3 32.6 2.2
Seq ID 20 Seq ID 20 2.2 32.6 42.5 6.7
Seq ID 20 Seq ID 20,2 2.1 31.6 53.8 21.8
Seq ID 50 Seq ID 50 1.9 27.4 36.5 8.6
Seq ID 51 Seq ID 51 2.1 36.4 46.8 9.3
Seq ID 52 Seq ID 52 2.4 35.8 46.4 18.7
Seq ID 53 Seq ID 53 2.9 28.1 45.6 7.8
Seq ID 54 Seq ID 54 1.6 33.3 37.2 5.8
Seq ID 55 Seq ID 55 2.7 28.3 48.5 17.2
Seq ID 56 Seq ID 56 2.4 41.1 62.5 14.3
Seq ID 57 Seq ID 57 2.0 31.9 53.6 6.0
Seq ID 58 Seq ID 58 2.6 35.3 54.9 5.7
Seq ID 59 Seq ID 59 2.3 27.3 38.1 11.7
Seq ID 60 Seq ID 60 2.9 37.7 49.5 11.8
Seq ID 61 Seq ID 61 2.0 29.4 33.5 3.0
Seq ID 62 Seq ID 62 2.6 28.0 53.1 4.4
Seq ID 63 Seq ID 63 2.6 27.8 42.0 4.7
Seq ID 64 Seq ID 64 2.0 34.6 37.8 6.7
Seq ID 65 Seq ID 65 2.3 30.6 47.2 12.4
Seq ID 66 Seq ID 66 2.7 31.4 38.6 3.9
Seq ID 67 Seq ID 67 3.0 33.6 42.5 4.7
Seq ID 68 Seq ID 68 3.0 33.9 44.9 8.9
Seq ID 69 Seq ID 69 2.5 29.9 44.3 4.7
Seq ID 27 Seq ID 27,1 2.7 33.5 49.8 19.0
Seq ID 70 Seq ID 70 2.6 35.9 52.2 12.1
Seq ID 71 Seq ID 71,1 2.8 34.1 49.2 8.9
Seq ID 71 Seq ID 71,2 2.5 30.0 49.5 4.5
Seq ID 72 Seq ID 72 1.3 22.7 32.7 3.1
Seq ID 73 Seq ID 73 1.8 26.2 45.7 6.0
Seq ID 74 Seq ID 74 3.1 23.9 41.4 5.2
Seq ID 75 Seq ID 75 2.4 26.6 43.0 4.1
Seq ID 76 Seq ID 76 2.0 30.5 47.3 4.7
Seq ID 77 Seq ID 77 2.0 31.2 48.2 5.6
Seq ID 78 Seq ID 78 3.0 39.3 67.3 8.0
Seq ID 79 Seq ID 79 2.2 40.9 45.5 4.9
Seq ID 80 Seq ID 80 2.4 27.6 43.8 6.9
Seq ID 81 Seq ID 81 2.8 40.4 49.4 13.5
Seq ID 82  Seq ID 82 3.4 29.8 55.1 9.5
Seq ID 83 Seq ID 83 2.0 35.1 62.6 8.8
Seq ID 84 Seq ID 84 2.4 31.1 52.6 8.6
Seq ID 85 Seq ID 85 1.8 30.2 44.4 3.9
Seq ID 86 Seq ID 86 2.0 35.5 32.8 2.9
Seq ID 23 Seq ID 23,1 1.7 33.4 61.5 27.5
Seq ID 87 Seq ID 87 1.8 34.0 72.1 7.4
Seq ID 88 Seq ID 88 2.1 29.9 58.5 6.5
Seq ID 23 Seq ID 23,10 2.3 31.6 36.1 13.3
Seq ID 89 Seq ID 89 2.6 27.4 63.3 10.1
Seq ID 90 Seq ID 90 1.3 26.0 41.3 10.8
Seq ID 91 Seq ID 91 1.6 19.6 44.2 6.8
Seq ID 92 Seq ID 92 2.0 30.9 90.7 7.3
Seq ID 93 Seq ID 93 1.2 26.6 57.1 7.1
Seq ID 94 Seq ID 94 1.5 34.7 51.0 14.3
Seq ID 95 Seq ID 95 1.8 22.6 44.5 8.3
Seq ID 96 Seq ID 96 2.1 24.4 72.8 14.3
Seq ID 97 Seq ID 97 1.5 31.7 82.0 16.9
Seq ID 98 Seq ID 98 1.9 34.5 43.8 19.4
Seq ID 99 Seq ID 99 2.1 25.1 45.0 10.6
Seq ID 100 Seq ID 100 1.9 32.4 59.6 7.1
Seq ID 101 Seq ID 101 1.6 36.9 73.7 25.9
Seq ID 102 Seq ID 102 1.8 29.5 74.0 30.5
Seq ID 103 Seq ID 103 1.4 33.6 68.1 18.5
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實例 1 、 3 及 4 中所用之化合物
           
           
SEQ ID NO 鹼基序列 5’-3’ 化合物 ID 編號 HELM
1 ACACACAC 1,1 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
2 ACACACACA 2,1 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
3 ACACACACAC 3,1 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
4 ACACACACACA 4,1 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
5 ACACACACACAC 5,1 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
6 ACACACACACACA 6,1 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
6 ACACACACACACA 6,2 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
6 ACACACACACACA 6,3 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
6 ACACACACACACA 6,4 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
7 ACACACACACACACAC 7,1 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
7 ACACACACACACACAC 7,2 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
7 ACACACACACACACAC 7,3 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
8 ACACACACACACACACAC 8,1 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
8 ACACACACACACACACAC 8,2 [LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
8 ACACACACACACACACAC 8,3 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
9 CACACAC 9,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
10 CACACACA 10,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
10 CACACACA 10,2 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
11 CACACACAC 11,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
12 CACACACACA 12,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
13 CACACACACAC 13,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
14 CACACACACACA 14,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
14 CACACACACACA 14,2 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
14 CACACACACACA 14,3 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)
14 CACACACACACA 14,4 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
15 CACACACACACAC 15,1 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
15 CACACACACACAC 15,2 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
15 CACACACACACAC 15,3 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
15 CACACACACACAC 15,4 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
15 CACACACACACAC 15,5 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
16 CACACACACACACACA 16,1 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
16 CACACACACACACACA 16,2 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
16 CACACACACACACACA 16,3 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
18 CACACACACACACACACA 18,1 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
18 CACACACACACACACACA 18,2 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
18 CACACACACACACACACA 18,3 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
18 CACACACACACACACACA 18,4 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
19 TCCACACTGAACAAACC 19,1 [LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](G)[sP].[dR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
20 CACACACACACACACACACACAC 20, 1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
21 ACACACACACACACACACACACAC 21 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
22 CACACACACACAACACACACACAC 22,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
22 CACACACACACAACACACACACAC 22,2 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
23    CACACACACACACACACACACACAC 23,6 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,7 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,8 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,9 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
24 ACACACACACACACACACACACACAC 24 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,2 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,3 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,4 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
26 ACACACACACACACACACACACACACAC 26 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,2 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,3 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,4 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
28 ACACACACACACACACACACACACACACAC 28 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,2 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,3 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,4 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
29 ACACACACACACACACACCACACACACACACACA 30 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
31 CACACACACACACACACACACACACACACACACA 31,1 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
31 CACACACACACACACACACACACACACACACACA 31,2 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
31 CACACACACACACACACAACACACACACACACACAC 32 [LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
33 ACACACACACACACACACCACACACACACACACACA 33 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](A)
22 CACACACACACAACACACACACAC 22,3 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,1 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,5 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,5 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,5    [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,2 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,6 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,3 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,7 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,6 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,7 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,6 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,7 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,4 [mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,8 [mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,8 [mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,8 [mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,5 [mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)
25 CACACACACACACACACACACACACAC 25,9 [mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)
27 CACACACACACACACACACACACACACAC 27,9 [mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)
29 CACACACACACACACACACACACACACACAC 29,9 [mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[mR](C)
34 ACACACACACACACACACACACACACACACAC 34 [LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])
20 CACACACACACACACACACACAC 20,2 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
50 CACACACCCACICACACACGCAC 50 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
51 CACACICACACACACACACACAC 51 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
52 CACACACACACICACACACACAC 52 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
53 CACACICACACACACACACACTC 53 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])
54 CACATACACACCCACACACACAC 54 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
55 CACACACACACACACACGCACAC 55 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
56 CACICACICACACACICACICAC 56 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
57 CACACACACACACACTCTCACAC 57 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
58 CTCACACACACACACACACACAC 58 [LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
59 CACACACACACAAACACACACAC 59 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
60 CACACGCACGCACACACACACAC 60 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
61 CACGCACACACCCACACACTCAC 61 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
62 CACACACACACACTCTCTCACAC 62 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
63 CACACACACACACICICICICAC 63 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
64 CACTCACACACTCACACACACAC 64 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
65 CACGCACACACGCACACACACAC 65 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](G)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
66 CACCCACACACCCACACACACAC 66 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
67 CACACGCACATACACACACCCAC 67 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR]([In])[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
68 TTCACACACACACACACACACAC 68 [LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
69 CACACACACACACACACACACAA 69 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)
70 CACACACACACACACACACAIACACACAC 70 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR]([In])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
71 CACAIACACACACACACACACACACACAC 71,1 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR]([In])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
72 CATACACACACACACACACATACACACAC 72 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
73 CAAACACACACACACACACACACACACAC 73 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
74 CACACACACTCACACACACACACACACAC 74 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
75 CACAGACACACACACACACACACACACAC 75 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
71 CACAIACACACACACACACACACACACAC 71,2 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR]([In])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
76 CACAAACACACACACACACACACACACAC 76 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
77 CACATACACACACACACACACACACACAC 77 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
78 CATACGCACATACACGCACACACAAACAC 78 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
79 CACATATACACATACACACACACACACAC 79 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
80 CACACACACACACACACACTCTCTCTCTC 80 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])
81 CACGCACACACACACACACACACACACAC 81 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
82 CACACACACACACACAITITITCACACAC 82 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR]([In])[sP].[LR](T)[sP].[dR]([In])[sP].[LR](T)[sP].[dR]([In])[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
83 CGCACACACACACACACACACACACACAC 83 [LR]([5meC])[sP].[LR](G)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
84 CACACACACACACACAGACAGACAGACAC 84 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
85 CACACACACAAAAAAACACACACACACAC 85 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
86 CACACACACACCCCCCCACACACACACAC 86 [LR]([5meC])[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[LR]([5meC])
87 CACACACACTCTCTCACACACACAC 87 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
88 CACAAACACACACACACACACACAC 88 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
23 CACACACACACACACACACACACAC 23,10 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
89 CACTCACACACACACACACACACAC 89 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
90 CACACACACAAACACACACACACAC 90 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
91 CACCCACACACACACACACACACAC 91 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
92 CTCTCTCACACACACACACACACAC 92 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
93 CAAACACACACACACACACACACAC 93 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
94 CACACACACCCACACACACACACAC 94 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
95 CACACACACACACACCCACACACAC 95 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
96 CACACACACACACACGCACACACAC 96 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
97 CACACACACACACACTCACACACAC 97 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
98 CACACACACATACACACACACACAC 98 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
99 CACACACACAGACACACACACACAC 99 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
100 TTTACACACACACACACACACACAC 100 [MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
101 CACGCACACGCACACACACACACAC 101 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
102 CACGCACACACGCACACACACGCAC 102 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
103 CACACGCACACACACACACACACAC 103 [MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](G)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE]([5meC])
Helm 註解鍵：[LR](G) 為 β-D-氧基-LNA 鳥嘌呤核苷， [LR](T) 為 β-D-氧基-LNA 胸腺嘧啶核苷， [LR](A) 為 β-D-氧基-LNA 腺嘌呤核苷， [LR]([5meC] 為 β-D-氧基-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷， [dR](G) 為 DNA 鳥嘌呤核苷， [dR](T) 為 DNA 胸腺嘧啶核苷， [dR](A) 為 DNA 腺嘌呤核苷， [dR]([C] 為 DNA 胞嘧啶核苷， [sP] 為硫代磷酸酯核苷間鍵。 [mR]([C] 為 2’O-甲基胞苷核苷 [mR]([A] 為 2’O-甲基腺嘌呤核苷 [MOE]([5meC]) 為 2’O-MOE [2’O-(2-甲氧基乙基)] 5-甲基胞苷核苷 [MOE](A) 為 2’O-MOE [2’O-(2-甲氧基乙基)] 腺嘌呤核苷 [dR]([C] 為 DNA 肌苷核苷
圖 1 -寡核苷酸長度與在 TDP-43 耗盡細胞中處理的 STMN2 mRNA 之校正功效之間的相關性，其藉由異常 STMN2 mRNA 相對於 WT STMN2 mRNA 表現量的比率進行量測。值得注意地，更有效的化合物之長度為至少 12 個核苷酸。 圖 2 -寡核苷酸吉布斯自由能 (ΔG) 與在 TDP-43 耗盡細胞中處理的 STMN2 mRNA 之校正功效之間的相關性，其藉由異常 STMN2 mRNA 相對於 WT STMN2 mRNA 表現量的比率進行量測。值得注意地，更有效的化合物之吉布斯自由能為至少 -10 ΔG。 圖 3 -寡核苷酸融化溫度 (預測的 Tm) 與在 TDP-43 耗盡細胞中處理的 STMN2 mRNA 之校正功效之間的相關性的缺乏，其藉由異常 STMN2 mRNA 相對於 WT STMN2 mRNA 表現量的比率進行量測。 圖 4 -用化合物 A 處理後麩胺酸神經元中之 TARDBP敲落。未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元中之 TARDBP的相對表現。 圖 5 -用化合物 A 處理後麩胺酸神經元中之 STMN2野生型表現。A) 圖形化使用者介面，說明映射到未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元之 STMN2基因的 5' 端的標準化讀數。灰色矩形突出顯示使用選擇式剪接受體位點的比對讀數。B) 野生型 STMN2轉錄本在未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元中的相對表現。 圖 6 -導致 TDP-43 耗盡細胞中 STMN2 mRNA 中之隱蔽性外顯子包含的異常剪接事件之實例的圖示。該圖說明了含有 mRNA 轉錄本之 STMN2 隱蔽性外顯子之核苷酸序列 (SEQ ID NO 120)，胺基酸序列為所得截短的Stathmin-2 蛋白 (本文中稱為 STMN2 蛋白)。陰影粗體核苷酸序列為 STMN2 外顯子 1 序列，且加底線核苷酸序列為源自內含子 1 之隱蔽性外顯子序列，且該隱蔽剪接位點由 ˅ 符號指示。ATG 起始密碼子、TAG 終止密碼子及多腺苷酸化訊號突出顯示。 圖 7 - 用化合物 A、B 及 C 處理後麩胺酸神經元中的 ARHGAP32表現。A) 圖形化使用者介面，說明與未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元之 hg38(部分縮放至 ARHGAP32) 比對的標準化讀數。灰色矩形說明比對讀數，展示選擇式剪接受體位點的使用。B) 在未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元中， ARHGAP32同功型在具有選擇式最後一個外顯子之包含 (在 ENSG00000134909 中之位置 200153) 的情況下的相對表現。 圖 8 - ARHGAP32基因之新的最後一個外顯子的核苷酸序列 (SEQ ID NO 121)，新的隱蔽剪接位點用 ˄ 符號指示，非粗體文字表示在 TDP-43 耗盡細胞中富集之隱蔽性外顯子。隱蔽性外顯子之包含導致隱蔽性外顯子內之兩個多腺苷酸化位點 (陰影文本) 之包含，從而導致 Rho GTPase 活化蛋白 32 (由 ARHGAP32 編碼之蛋白質) 的截短版本的表現。斜體文本為富含 GT 之 RNA 結合蛋白結合位點。 圖 9 - 用化合物 A、B 及 C 處理後麩胺酸神經元中的 SLC5A7表現。A) 圖形化使用者介面，說明與未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元之 SLC5A7比對的標準化讀數。灰色矩形說明比對讀數，展示選擇式外顯子之包含。B) 在具有選擇式外顯子之包含之情況下 SLC5A7同功型在未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元中的相對表現。 圖 10 -自 SLC5A7基因待包括之新外顯子的核苷酸序列 (SEQ ID NO 122)。新的隱蔽剪接位點由 ˄ 符號指示，其中非粗體加底線文字表示 TDP-43 耗盡細胞中被富集之隱蔽性外顯子。斜體文本為富含 GT 之 RNA 結合蛋白結合位點 (TDP-43 結合位點)。 圖 11 - 用化合物 A、B 及 C 處理後麩胺酸神經元中的 CERT1表現。A) 圖形化使用者介面，說明與未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元之 CERT1比對的標準化讀數。灰色矩形示出比對讀數，展示選擇式外顯子之包含。B) 在具有選擇式外顯子之包含之情況下 CERT1同功型在未經處理之麩胺酸神經元、用化合物 A、化合物 A+B 及化合物 A+C 處理之麩胺酸神經元中的相對表現。 圖 12 -在 TDP-43 耗盡細胞中自 CERT1基因包括之新的 框內外顯子的核苷酸序列 (SEQ ID NO 123)。 CERT1之新外顯子以加底線文字顯示，且 TDP-43 結合位點呈斜體。 圖 13 - 文氏圖 (Venn diagram)。顯示 p 值低於 0.01 的選擇式剪接且與對照品相比顯示超過兩倍的變化的轉錄本數。化合物 A 之對照為未經處理之麩胺酸神經元，而化合物 A+B 及 A+C 的對照為 TDP-43 敲落（knock down）(化合物 A)。在 TDP-43 耗盡細胞 (僅用化合物 A 處理) 中，共有 925 個轉錄本由於 TDP-43 耗盡而經選擇式剪接。當 TDP-43 耗盡細胞隨後用靶向 STMN2 之寡核苷酸 (化合物B) 處理時，與化合物 A 處理之細胞相比，有 114 個轉錄本經選擇式剪接。當 TDP-43 耗盡細胞隨後用本發明之靶向 RNA 蛋白結合位點之寡核苷酸 (化合物 C) 之處理時，與化合物 A 處理之細胞相比，有 351 個轉錄本經選擇式剪接。此表明與靶向 STMN2 之寡核苷酸相比，本發明之化合物在調節整體 RNA 剪接方面更有效。 圖 14 – 圖 14A 顯示了一個圖示，顯示映射至 CAMK2B 基因之標準化讀數的圖譜。用經化合物 A 處理之麩胺酸神經元或未經處理之細胞 (PBS) 作為對照，隨後進行 mRNA 分離及 NGS。在 TDP43 蛋白喪失時，CAMK2B 基因內之新外顯子的位置用水平灰色矩形說明 (僅顯示 CAMK2B 之新外顯子周圍的外顯子)。新的剪接供體位點用灰色箭頭顯示。CAMK2B 前驅 mRNA 自負股轉錄。圖 14B 顯示，圖 14B 顯示在 TDP43 蛋白喪失時觀測到的新 CAMK2B 外顯子的序列。粗體為在麩胺酸神經元中觀測到的典型外顯子。加底線為新的外顯子，且斜體顯示許多終止密碼子中之第一個。∧顯示典型剪接位點，且∨顯示新剪接受體位點的位置。 圖 15 – 圖 15A 顯示圖示，顯示映射至 KALRN 基因之標準化讀數的圖譜。用經化合物 A 處理之麩胺酸神經元或未經處理之細胞 (PBS) 作為對照，隨後進行 mRNA 分離及 NGS。在 TDP43 蛋白喪失後，KALRN 基因內新外顯子之位置以灰色矩形說明 (僅顯示 KALRN 新外顯子周圍的外顯子)。圖 15B 顯示放大對應至含有異常剪接之外顯子的 KALRN 基因的標準化讀數之圖譜的圖示。用經化合物 A 處理之麩胺酸神經元或未經處理之細胞 (PBS) 作為對照，隨後進行 mRNA 分離及 NGS。在 TDP43 蛋白喪失時，KALRN 基因內新外顯子的位置以水平灰色矩形說明。箭頭指示在 TDP43 蛋白喪失時使用的剪接位點。圖 15C 顯示在 TDP43 蛋白喪失時觀測到的新 KALRN 外顯子之序列。粗體為在麩胺酸神經元中觀測到的新外顯子。斜體顯示編碼序列內許多終止密碼子中之第一個。∨顯示新剪接位點之位置。圖 15D 顯示在 TDP43 蛋白喪失時觀測到的新 KALRN外顯子之序列。粗體為在麩胺酸神經元中觀測到的新外顯子。斜體顯示編碼序列內許多終止密碼子中之第一個。∨顯示新剪接位點之位置。 圖 16 – 圖 16A 顯示導致 128 個核苷酸 (A) 或 178 個核苷酸 (B) 之隱蔽性外顯子之包含的異常剪接事件的圖示。粗體為 UNC13A 之兩個隱秘外顯子的核苷酸序列。剪接位點以 ∨ 進行說明，且外顯子 5' 及 3' 的內含子序列以常規大寫字母顯示。顯示反向互補序列，因為 UNC13A 基因位於染色體 19 之負股上。圖 16B 顯示一個圖示，顯示映射至 UNC13A 基因之標準化讀數的圖譜。用經化合物 A 處理之麩胺酸神經元或未經處理之細胞 (PBS) 作為對照，隨後進行 mRNA 分離及 NGS。在 TDP43 蛋白喪失後，UNC13A 基因內新外顯子之位置以灰色矩形說明 (僅顯示 UNC13A 新外顯子周圍的外顯子)。圖 16C 顯示圖示，顯示 TDP43 蛋白喪失後 UNC13A 基因內的新外顯子。用經化合物 A 處理之麩胺酸神經元或未經處理之細胞 (PBS) 作為對照，隨後進行 mRNA 分離及 NGS。箭頭說明新的剪接位點。 
<![CDATA[<110>  瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)]]>
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          cacacacaca cacacacaca cac                                               23
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          acacacacac acacacacac acac                                              24
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          cacacacaca caacacacac acac                                              24
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          cacacacaca cacacacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          acacacacac acacacacac acacac                                            26
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          cacacacaca cacacacaca cacacac                                           27
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          acacacacac acacacacac acacacac                                          28
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          cacacacaca cacacacaca cacacaca                                          28
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          acacacacac acacacacac acacacacac                                        30
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          cacacacaca cacacacaca cacacacaca c                                      31
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  34]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          acacacacac acacacacca cacacacaca caca                                   34
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  34]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          cacacacaca cacacacaca cacacacaca caca                                   34
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          cacacacaca cacacacaac acacacacac acacac                                 36
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          acacacacac acacacacca cacacacaca cacaca                                 36
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          acacacacac acacacacac acacacacac ac                                     32
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人 RNA TDP-43 結合位點]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          ugugugugug ug                                                           12
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  靶向及上調STMN2 之表現的 LNA/DNA 混聚體]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          cacacacgca cacatg                                                       16
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          ugugugugug                                                              10
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          ugugugugug u                                                            11
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          ugugugugug ugu                                                          13
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          gugugugugu                                                              10
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          gugugugugu g                                                            11
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          gugugugugu gu                                                           12
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          gugugugugu gug                                                          13
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          cagctcatcc tcagtcatgt c                                                 21
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          gatggtgtga ctgcaaactt c                                                 21
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          ugugugugug ugug                                                         14
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          gugugugugu gugu                                                         14
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          ugugugugug ugugugug                                                     18
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  與反義寡核苷酸互補的序列]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          gugugugugu gugugugu                                                     18
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (12)..(12)]]>
          <![CDATA[<223>  n 為肌核苷]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          cacacaccca cncacacacg cac                                               23
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  n 為肌核苷]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          cacacncaca cacacacaca cac                                               23
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
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          cacgcacaca cacacacaca cacacacac                                         29
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222>  (17)..(17)]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (19)..(19)]]>
          <![CDATA[<223>  n 為肌核苷]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (21)..(21)]]>
          <![CDATA[<223>  n 為肌核苷]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          cacacacaca cacacantnt ntcacacac                                         29
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  83]]>
          cgcacacaca cacacacaca cacacacac                                         29
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          cacacacaca cacacagaca gacagacac                                         29
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          cacacacaca aaaaaacaca cacacacac                                         29
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<400>  86]]>
          cacacacaca cccccccaca cacacacac                                         29
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  87]]>
          cacacacact ctctcacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  88]]>
          cacaaacaca cacacacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  89]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  89]]>
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          <![CDATA[<400>  90]]>
          cacacacaca aacacacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
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          <![CDATA[<400>  91]]>
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          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  92]]>
          ctctctcaca cacacacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
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          <![CDATA[<400>  93]]>
          caaacacaca cacacacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
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          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          cacacacaca cacacccaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          cacacacaca cacacgcaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          cacacacaca cacactcaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          cacacacaca tacacacaca cacac                                             25
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          <![CDATA[<211>  25]]>
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          <![CDATA[<400>  99]]>
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          <![CDATA[<400>  100]]>
          tttacacaca cacacacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
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          <![CDATA[<400>  101]]>
          cacgcacacg cacacacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          cacgcacaca cgcacacaca cgcac                                             25
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          cacacgcaca cacacacaca cacac                                             25
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  探針]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          cagcgcccca caaacacttt tct                                               23
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          ctgctcagcg tctgc                                                        15
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          gttgcgaggt tccgg                                                        15
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  探針]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          caatggccta caaggaaaaa atgaag                                            26
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          ctaatggtta aacgtgagga cagc                                              24
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          atctggtcct ccaaagtggg                                                   20
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  34]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  110]]>
          ctggataagg aaactgagaa gaaaagaaga acag                                   34
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          <![CDATA[<211>  17]]>
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          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          cgagccctcg gagtttg                                                      17
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          tccttccaag aaatggtggc                                                   20
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
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          gaatatgatg ctgctgctga tg                                                22
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          ctgacagtgc caataccacc                                                   20
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          gctgctccgt ggtcttaat                                                    19
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  探針]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          atgaagacgc taaagcccgg aagcag                                            26
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  117]]>
          gatcaaaggc gaggagaagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  118]]>
          tggcatctgg gatcttcac                                                    19
          <![CDATA[<210>  119]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  探針]]>
          <![CDATA[<400>  119]]>
          catgagaacc tgttccactt c                                                 21
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  333]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          agtcttctct ctcgctctct ccgctgctgt agccggaccc tttgccttcg ccactgctca       60
          gcgtctgcac atccctacaa tggctaaaac agcaatggga ctcggcagaa gaccttcgag      120
          agaaaggtag aaaataagaa tttggctctc tgtgtgagca tgtgtgcgtg tgtgcgagag      180
          agagagacag acagcctgcc taagaagaaa tgaatgtgaa tgcggcttgt ggcacagttg      240
          acaaggatga taaatcaata atgcaagctt actatcattt atgaatagca atactgaaga      300
          aattaaaaca aaagattgct gtctcaatat atc                                   333
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  2755]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  121]]>
          gaaattaatc cttttggtag tcatattagg tagaatcatg atgcacattc taataagtca       60
          cactgtactc atgtcccttt agcctggaaa ccatctccct gaaactggaa ctcagctttt      120
          tcgtctgtat ctgtaatgct ttcatgatgc ctggaaaata gaagagactt aataaataca      180
          tgattgatga gtgagtgagc gagtgaatga atgaagagaa aagagcagaa acgaaaccaa      240
          aactgtcaag aaaaaaaaat caaagatcaa ttcttgtcat acttacttcc tacttctttt      300
          agccatattc taatctaaag gatcatcgat tttaatttaa atatgtactt cttattctgt      360
          tgtcgtatga tgatatttta aaaactaaga atgtaaaatc aaagtaaatc agaagtgtat      420
          tatgtggaga atgtgggaat gattctgaaa gtcataccgt cttttggagg aagcattttg      480
          gaggtttcta atgttatatt ttgactgggt cattattcgc tgtgcatttg gctggtttgt      540
          tagatggttt gggggtagct agtaaatagc ctttttttaa aactaggatt ttttttacaa      600
          aatatattgg atttcttata ttgctttcct actctttcgt gaaaaaataa aacagatctt      660
          ttcttctttt ttcttctgac attgtttttc agtttttgct ccttttcttc aagattcaag      720
          tttatgcttt tctttcattt tgccacctat ttgtattaaa tgactcattt gtttccctta      780
          aacttataag taatagttat gtaattttat ttattaagct cattatgtga tttttgtgta      840
          gacattcagt ccttctactc agggaacaca aaatataaga aaacgattca gatgcttgcc      900
          atgaagtatt acgtgtgtag agacttggac atattatcag gaaaagacct ctaattctcc      960
          atattttcaa tgttttccta cttatttgga agaataaaca gatatgaatc taataacaca     1020
          cagatataca catccaatga aaattaccga tacttttttt tataaatggt agcttatttt     1080
          tatgaaaaat ttatgtgtgc tcggagagcc tgataatatg gaaataaaat actgtgctct     1140
          gaagggtttt tcttgaagac aaaccttttg tgtacctggg tgaatcagca tgctcatttg     1200
          gagcatatat aatgagaagc atcttctcag tgctttacag gaaagaattt taactatttt     1260
          cctaagtaat gatgttaatt atcccagtaa tctctaaata cattcccttt gaagcagaag     1320
          actgaaattt tgtagcccca aattttatta ttccacttcc agtttttaga attgaaacct     1380
          aagacaccaa gtttatcatt ggtgggacaa tgtgagaaat agaacccaag cttttataaa     1440
          gatgctatgt attttgcata tcatttcgac acagaggttg cttctaatat caattaaatc     1500
          cacaagaagt acccagcaat tctacctgcc cttcatcttt actacataac cataaccttt     1560
          tcttgttact gaaagtcttg aatattttta gaggtagaaa gcatgtagtt gaaaatgtat     1620
          tcatatgaaa actaaggttc cttccctgct aacttgacca gataatgacc atttcaggct     1680
          ctcagggcac tggtaaatta attcacttgc taattttata cattgtgtca ggacggtgtt     1740
          cctgagtttt aaatatacaa agatggacga tgcatggttt tgctcttgaa gagcccacag     1800
          tcagaaaagg gtaatagttg tatgaacaaa taaatgataa ttttgaaata tttttctatg     1860
          agcacataga acacagtgct cagccacctc tacttgtggg tattcaatga aggctcgcta     1920
          aagagtgata gtttacctgg attttgaaca atagccaaga attttttcta tacgaagagc     1980
          gttatgggag agagtccagc tagaggaaat tgttttgtga agaagtcata gcatggttgg     2040
          tttgtatggc aaaaggtaac acttcacttg gcctagggtt gtggaatatg gaaatacaat     2100
          aataattaaa tgtaaattat gaaaggcctt ctctgccagg cagtatattg cagtagtcaa     2160
          aagcattggc tctgactgga taaagaaaaa tgtggcacat atataccatg gaatactatg     2220
          cagccataaa aaaggatgag ttcatgtcct ttgcagggac atggatgaag ttggaagcca     2280
          tcattctcag caaactatca caagaacaga aaaccaaaca ccacatgttc tcactcataa     2340
          gtgggagttg aacaatgaga acacatggaa tagggagggg aacatcacac accagggcct     2400
          ctcggggggt tggggggcta ggggagggat aacattagga gaaatactca atgtagatga     2460
          tgggttgatg ggtgcagcaa accaccatgg catgtgtata cttacgtaac aaaactgcac     2520
          attctgcaca tgtaccccag aacttaaagt ataataaaaa aagatatatg tatgtgtgtg     2580
          tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgaaataaaa aacaaaacaa aagcattggc     2640
          tctgtacttg gactgcctga gttggaatct ctcacttctg ccagtgtttc ctgcctgccc     2700
          ttgggtaaaa cttactctct ctaagataca atttcttctc tgtaaaaatt gggaa          2755
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  352]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  122]]>
          cttttgtcct gtggtattct gtaaaggtga tccagggtga tgttcctaca gcaactttga       60
          ctttcgatta gtagagtctt ttattggatt gtttaacttt taggagagca gtcctggttc      120
          atagtgtaca ctctccattc cagttgttca tccaggagac agacacttca aaaatgtaaa      180
          gatgactgac gaaggtggta tgtagtgttt gtctctgaaa aaaaaaaaga tagtatttct      240
          ctcacaagca gaaaacatat atggacgtgt gtgtgtctgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt      300
          ctgtgtgtgt gtgtttattg taggaacaca ggctaacaga aacagcatta ag              352
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  404]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          acactctcca ccaaagaaca gccagaaaag atggcaggca gtattggtta aaatctggac       60
          actactgtgt tttatagtct tcttacagat ctatctgatg tcaaatttta ttaacctttt      120
          ccactgtaat tttttctcaa ggttgaaata actggatccc agttacattt tacatggaat      180
          gtaagtgtgt gtgtatttgc acatgtgtgt acacacagta tgtgtgtgtt catatatata      240
          tacataatat atgcagggta tgtgtgtatt tattggtaag caactctatt caagaacttt      300
          ctaatctttt gtatgtagag tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tatatataca cactaaagac      360
          tagaaagttc ttaaatagag aaagttgttt atcaacaaat acgt                       404
          <![CDATA[<210>  124]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  124]]>
          Met Ala Lys Thr Ala Met Gly Leu Gly Arg Arg Pro Ser Arg Glu Arg 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<211>  10231]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          gagtcttctg acagtgccaa taccaccata gaggatgaag acgctaaagg tacctgcact       60
          tgagtccttg cccccccagc ggccttggca ttgctgggtt gctctttgag gtgggtggga      120
          cttgggcagg gtcaactctc ctgcgacgcc tagtttatgc atgtgttgag gggctcaggg      180
          accctgtagc tgtaatcctg ctccaagcct gggtgtcagg cctgcccaga gcggagaagc      240
          atggcagaga tgaccgacag ctgggcagtc tcggtcaccg catccaagtg aggaagccac      300
          ggctttgcat ggaggcaggt tctccacacc aggaccctca cggggaaaca ggcccatggg      360
          tagaatttgt tccaagatgc tgtccttgtc ttaaagctcc ttaagcttgc gtttctgtcc      420
          agcatgcact tgccaagtgg ccgggcagct gggtgagtgt ttccgtgttt gcctttgctt      480
          agccaggagt gtcctgctgc ggtgggtttc tgcaccacag attccagggc cccctccctt      540
          gctcacccag gccaatgtct tgtgtgttcc ccaagaggcc cccagggcac caggcactgg      600
          ggcatgctcc atggattctg ccgcctccag accacccaca tggggcctcc tgaccctcat      660
          cgctcacacg gtcacctaat aagccttatg ctgttctcag ggctaccctg gtgcccaaaa      720
          agggtcagcc actctgccag tttaggggag aaaacttctc acctgtccaa agcatagcct      780
          tgctcctgcc cggcctaccc agctatgaca ctgtccctga gcagagatga gcacaggact      840
          ttgggccctg gatgccggag agtgggtgtt tgtgtgattc ccctgcagtc tggaacaggc      900
          cccaaaggca acagcatgaa ggctgtccag aggttctcca tcaccctcag ccgagtgggg      960
          tgctgagcag tgagggaggg gacctgggag gggggcccag cctggatcct gcaggggaga     1020
          agagaagaca gccagaagcc agcagctgtg gctcagatct gagcccgagc agcctctcga     1080
          ggtggaggca gacacccccc accccacccc gtgcagaaag aagccttgcc agcctgccct     1140
          gaggctggta cagagtccag gcaggctcag tggccatcat gcccctacga tgactgtcac     1200
          tccctctccg tgcgcctggc ctctgctggc tctggccagg ggtggtcaca gcactagggt     1260
          ggcagggtgg cctctgactc tgcgccagcc tgcactggcc tgtgctgccc tggcctctgc     1320
          tggctctggc tctggcaccg gtcccgtgtt ggctccttca gccttcacat acctgctgcg     1380
          gccaccacag gcccaggacc cccacaggtg gccaccccac ctccacccca ggagccccag     1440
          gtatccagct gtcaccccct ccctccctcc tggcctcccc ctgtccttct ccagttgcct     1500
          tcttttcctg cgggcgcacc acccacctgc ctgcctcacc tgttccgcct cagcccccag     1560
          ggtccccgac atcctgagct cagtgaggag gggctcggga gccccagaag ccgaggggcc     1620
          cctgccctgc ccatctccgg ctccctttag ccccctgcca gccccatgta agtagcctgg     1680
          gtcctgctgc tgtgggggtc atgttggagg gctggcaacc ccctagaggg gccactccag     1740
          agccgagggc aggctgagcg tggaccctgg ctccagcctc atcaccccac aatccctcac     1800
          tggggctttc cagggtggcc ccagcccatc gagccccacc tctttgtgag gagggccctg     1860
          gaccactttc ctgctcaagg ccactgggca ggatgggagg ccctggaggc tcgggcctca     1920
          attccagtct tcagggtcgg tgcaggcctc actccacctc agcttgcggg cgggggggct     1980
          ccctgctatt gaggcaggct ctgattcagg gcctgatccc agggcccaag gggtctagaa     2040
          cacgggaccc ctcccactgg cctcctccgc cttgccgccg cctcgtgtgt ctgtctgcct     2100
          catgttcacg tctcatctgt tccaccccag cccccaggat ctctgacatc ctgaactctg     2160
          tgagaagggg ttcaggaacc ccagaagccg agggccccct ctcagcgggg cccccgccct     2220
          gcctgtctcc ggctctccta ggccccctgt cctccccgtg taagtagtgg cccccaggcc     2280
          tgccgcctct gctgccggac agctccctgc gaatggccgg cgctcagcag cttcccacct     2340
          gcatgcacgg cccagctacc ctgccccggc gccgcagcct ggagtcctgc cctggcgggg     2400
          cttcctgtgg gctcccatgc taaccagcag ggcagctcct ggcttctccc taaggggccc     2460
          agacccctcc acggctcctg ctcccactgc cactccccgc tcgctgtcca gccccaggcc     2520
          cctctccaaa atgtctgtcc cagccctggg cagccctggc ccctccgagg ccccccatgc     2580
          ccctaggccc tctctgctga tcactgtccc agccccacag acttcacacc cacccagggg     2640
          ccctgcccat ggtgcccagg agctgcactc agggccaccc tggttcctga tgtggcccca     2700
          acccctgagc accctccctc agtctaggag gctgaggaag gtgccaaaac tggaaccccg     2760
          accagggtct ctggagctca ccaacaaggg gatagtacgg agaatcataa gcctggcctc     2820
          tgctgacctg ggctgtcctc atggggccag gccaggcctc ctctgtaacg cccgtgactc     2880
          cctcctctcc ctgtaacccc gtccagcgtt cctcaagggc cacttacctg acagcttctt     2940
          gctggccagc agcctctccc tggagggtgc cctctgcccc cagcagcttc agcccacgcc     3000
          acccgacagc cagagcatct gcccttcact cctgcagcct cctctccacg caccacgctg     3060
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          cccaaattcc cctctttccc tcatttccat tttcctcccc aaactctgct ctgcccctca     3240
          cattctccct ctgtccccca caccctcctc tgtcccccag actctccctc tgtcccccac     3300
          accctcctct gtcccccata tacccctctg tcccccacac ccaccttggt cccttcacgc     3360
          ccttttctgt cccccacacc ccctctgttc cctacactct ccctctgtcc tccagaccct     3420
          cctctgtccc ccacactccc tctgtccccc acaccccctg tcccccacac tctccctctg     3480
          ccccccagac cctcctctgt cccctacact ccctctgtcc cccatatccc cctctgtccc     3540
          ccacaccctc ctctgtcctc caccccctgc cccccatacc cccttctgtc ccccacactt     3600
          cctctgtctt ccacaccccc tcctgtcccc cacaccccct ctgtccccca gactctccct     3660
          ctgtccccca cactccgtct gtcccccaca cctcctgtct tccacacccc cttctgtccc     3720
          ccacaccccc tctgtccccc atactctcct ctgtccccca cctccccctc tgttccccac     3780
          accgccttct gtcccccaca ccccctctgt cttccacttc ccctctgtcc cccacatccc     3840
          cctctgtccc ctgcaccctc ctctgtcccc tgcaccctcc tctgtcccct gcacctctct     3900
          ctgtccccca catccccctc tgtcctccac actccctctg tcccccacat ccaccttggt     3960
          cccctcacgc acccccatcc cccatgaccc cttctgtccc ccacaccccc tctgtcttcc     4020
          acacccccct ctgtccccca cacccacctt ggtcccctca tgccccccat cccctacacc     4080
          cccactttgt ccccccacat gcccctctgt cccccacgtt cccttctgtc tcccacgtct     4140
          cctccatttc ccgtttccct ctctgtcccc caagctcccc tccatccccc acatcccctt     4200
          ctttccccta tatcccctct gtcggcccag gtccaccatc ttccccccac acccccccat     4260
          tctcccttcc tcccctctgt ccccttgtgc cccatccccc acatctgcct ctgtgcccct     4320
          caatctctgg cttggctgtc tgcccatggt ttctctcctg cgtgcccccc gtgcctgcct     4380
          tgtgttcacg tctcgtctgt tccgccccag cccccaggat ctctgacatc ctgaactctg     4440
          tgaggagggg ctcagggacc ccagaagccg agggcccctc gccagtgggg cccccgccct     4500
          gcccatctcc gactatccct ggccccctgc ccaccccatg taagtagcac cttgagtggc     4560
          cgtggcagcg gctgcccgga ggggctcggg gcgtgcgagc ctggcagtgg tgctctggga     4620
          agggccattc ttgcggagga gggcggggca caggatccct ctgctgggtc ccagggaatt     4680
          gctttgaagc acatgaaggt gccactgggt ctcagaaaat ggaggttatg gttatgaagt     4740
          gtgtatgaca tatgtgtata ggaagagcgt ccgaaagagc aggtttgttg ccgaccccag     4800
          cattcgcaac cctgaggtcc acagctttct cctgatggga ggggaatggg tggcaaaggg     4860
          tctgcgcgtg tggcaagggc tagcacgcca ggagctgctg gcttgggtca aggtggacct     4920
          gctgggccgg gacagaaaag tgtcagtccc ggcctgagac gctctagcat tagagctgtc     4980
          caagtccaga cagcagggag caggtgggga tcgggaggcg cggatctggg gggcagctgg     5040
          ggccaggctg aaacagagcg ggcgggacag gaagcacagg ctgggcagcc tccccggcca     5100
          gggaggagcc aggctgggcc acctcccggt ctgtctgccg actacccgca gtatcactta     5160
          cagggatgga tgacatccca gggctgctgc cacccccacc tgtggggaga caccagactg     5220
          ggggtggtgt ggagatactc ttagagaaga ggctgctggg ccacgggctc ggcatggcag     5280
          ggcagtggct aggtaagtac ttgagggaca ggtggggtct gcttgccacc gtcccctctg     5340
          caggctgggc ctgggggctg ctgcaggcgg ccagggcaga agggtgtggg gagagtgaac     5400
          ccacaggagc agcggctcga ggagggggat gcaggctgca ggctcaaagg ggcactggat     5460
          ccaccctggg tgcccgagag agcagggggc agcccctgga ggggtactca cccccagagc     5520
          ttctgtggtc ggctgaggac ccccagcagg ggttgactga ggggatcaga ggcaagcagc     5580
          tgaggggaga ggccaggttc ttgatgctga tagggtcggg gtgcctgggc gaccagaact     5640
          caaggaggga ggcatgggga ggggccgccg tgcagctggg gtgggtgcac cgcagagcct     5700
          ctgggagtgg tcagaacccc cgacacctgc cacttctaca gcagctcatc tgattttaag     5760
          gggcttgctg cccttgcaga agtggagggg tgtgcccaaa ggagcctgcc tggaaggtca     5820
          ccccatcagg ttggcatgac cccagcccag gactgcagcc tgccctcaag gtctgtgcag     5880
          tatctggggt gagtcctctg aggacagggc ccagggtggg tgtggagtgg ccagctcggg     5940
          gctcggtgtc caggctcacc ttcaggggcc acagcacaga cctgcccttc cagagtcttc     6000
          cctgagcttg gctggggagg agggggctgc aggaaggagc tgtgagcagg gcaggatgga     6060
          gattcgtgtg gccctcctgg gaggggctgg gcagggctgg gaaaggggtg ggtgagatgt     6120
          tccggaactc agggaaagga agagtctggg tactgccctg ggggcacctg ggcccaggtg     6180
          gcaggtggcc agctttctgc ctcctttcca cctcctttct ccagaaggca cccaccagct     6240
          gtgtaaatag ggcaggtgcc cacggcccgc ctcaggcccc gtctcctccc cacccacgct     6300
          ctctaatcgc ggattataca caatccagcc tgatccctgg gcagctgccc tccctcccgc     6360
          agccacctct ggctctgaga gatgggcttg gggccagcct ggggtcccag gagtccaggc     6420
          caggatgaga acctgctctg accccacctg gacgcattag gcctgcctgg acctgttgcc     6480
          tcaccccaag agagccacag gcaatgcaaa ggctcctgtt catgtcaggg cacctggaag     6540
          gcctgacttg cagaggctct tggctcgtgc agacccctcc aagcccaggc cctgcccacc     6600
          acctcccctt tgtctctgga actgccagga cagcttgtcc tcagccagca ggtttcccga     6660
          cccgggcacc tcttcatgtt gggcccccct cctttccctc catcagggat catgcccttc     6720
          ttcaggggcc tggatatcaa ggacacaaaa gctcccatgt gctatgtggg gaggcagagt     6780
          gggggctggg ttgagctggg gtctgggcag cgccattccg cagggcaggg gcagcctagg     6840
          cttcccatct gtggaatggg tgggtgggtc tcacaacgga cctgcttccc gtacttcagc     6900
          acggttacca ctcttgattg gaactctgac catgcatctc ctcttctgtt tacttcacgc     6960
          tttctcttcc catcaactcc cattttaatt acaatttgtt taaaagcact gcatattact     7020
          tcattaaaca gaagattagt ttcacttacc attagtgtaa ggtgactata gaaccaaagc     7080
          agactggaaa ccaaatgaca taatgtcatt ctcttctcca ttccagctgc ctgctgctgt     7140
          gcgcctgaga acccctgtgg agtgggaggg gcagctgtct ctgtacatta gaaagggagg     7200
          ttaactaagt gacaggaggt gtttgggaca tgtggacacc agacttctct cttgatgcaa     7260
          ggagggcaga gccaggcagc ctagtggggg ctggcttggg ggctgctgga aggactggct     7320
          acaggtggaa gagaggtcag acctgaagct tggggccacc tccaggaaag gacaggtgaa     7380
          agtggaggca tgaggcaggg gagaggcagg tgccaggcag agggtggaga ggaggcagga     7440
          acatagcagc tggggcgggg gcgggcctca agtgtcatat gctactttcc tggggcccag     7500
          gggcaaggac aggaacagcc acagcatgtg ttgggacaga gccctgtgcc ttcctagagc     7560
          tgggcaggtg gaatggggca ggaatgggac tcgtggtggc tgcagcagga actggagggg     7620
          aaggggcttc tggatcctgc agcctacctt cctagaggcc agctttccgg ggtccaccag     7680
          gtgggtggga actgggcttg tgtagcaaga ctgccctgag gaccatccat gacatggtct     7740
          agatgaaagt taggaaagaa agggagacaa gctggcagca gaagtacagc tgggtcagga     7800
          gcaagggcct ttccagatag ggacaaccca agagtgcaca tgtgcccacg ccacacaaca     7860
          caggcacaca cgacacgtgc acgctcatag gcactgcaca cacacatgca caggtgctca     7920
          tgcatatgta tgagcttcat ctacacacat tcacatgccg tcctgcttat gtgcatgttt     7980
          ccatacatgc acatgaatgc acaatcacgt gtacacacat gcatgtgatc acatacatga     8040
          acatgtgtgc accccactcc tcaggtgcca tcgggctcct cctgctgtca ctgtgcagca     8100
          ggggacatga ggccccagag cagacaggtg cagcacaggc gttcccaggc agtgccccac     8160
          acacatgcat gagcacaccc gggcatgtgg cgcctccttt gtggactcag tcacctgcca     8220
          ggtgggctcc ctggtggtgt gagctcccag aggtctggcg agagagataa aggcaacccc     8280
          accaccaggc gtgctgagaa ttccctcttc tggctgggca cagtggctca tacctgtaat     8340
          cccagcactt tgggaggccg aggtgggcag atcacttgag gttaggagtt tgagaccagc     8400
          ctggccaata tggtgaaacc tcatctccac taaaaatata cacacacaaa aattagctgg     8460
          gtgtggtggt gtgcacctgt agttccagct actcgggagg ctgaggcagg agaatcgctt     8520
          gaacctggga gtcagagact gcagtgagcc gagatcatgt cactgcactc cagcccgggt     8580
          gacagagtga gactccatct aaaaaaaaaa aagaattccc tcctctggga atttagacca     8640
          cagacaggtt gcatgtatgt ggccgttgga ggcagcactc acagcaaaga gtggaaacgt     8700
          caccacaggg cctgccttct ggtgaaaatg gtgtcctgca gggcgggcag ctgtttgagg     8760
          gcaggtgtcc caggtgcggc ctgcagcagc ctgagggtca cagagcgcag tgctgggagt     8820
          gcagagactt cccccacagg gagagttccc aggaacctgc ttccggtgca cttctggggg     8880
          tttgagtttt ttccacggac gaattacttt gagaaaccac tgttactcgt gtgtataggt     8940
          gagcgtgcgt gtgcatgtgt gttctgtgtg tgagtgtgca tgtatgtgcg tgcctgcgta     9000
          tatatcctcg cagatacggc tagggacctc actcaggaca gtagttctgc ctgaggagag     9060
          tgaatgcggc aagattgagg agaacacagg catcttcaaa ctacatgtgc ggtgctttat     9120
          ttctttaaaa atgcgtctaa agcaaatagg aaaatgttaa gatttgaatc cgtagagtgt     9180
          gggttctatt attctctcca catcttccat acgtttaaaa tcttttgcaa tgaaaataag     9240
          ctgtagttaa agcagcaatg caggctgcca gtgagcgccc cggaggccag tgaggaccag     9300
          catggctggg tggcctgttg gaatccaagg ggggcgggca ggagctgcag gcaggcgccc     9360
          gggagtagcc cgggcatggg ggtgcggggc aacagggatg tctgcagggg tagcatgtgg     9420
          gccccggact gcaagcaggt ggagccagcc ggatgcggct cctatgagaa aagcggggaa     9480
          caagagacca cgctcgttct tcctgctgcg gggacagccc tggtcatcgc tccggggaac     9540
          cctgcagcct gcgccgcacg tggccgcccc ctgctgcttc ctcctccccg gcctccgggt     9600
          ggccttgctg acggctcctt ctctgaggca ggtctctgcc ttctcgcctg gtgcctgcac     9660
          tcagtagccc cctcaccaga gctgctgggt gaaggaagca ctaagaaccc aaggctcggg     9720
          aggagagtgg ggccgggaag ctgcagggaa gcgcagggcc aggcctggtg ggcccagggg     9780
          ctggctcacg ggagggcagg agggagactg tggcggacag cacgtggggc caggaggtga     9840
          cctccaagtg gattgtgggt gggttttttg tcctctttct gcattttcca ggcattttgt     9900
          aatgtggata gaatatttct gttcttcaaa aatactttag ttaagaaaaa taagatggaa     9960
          gctgttgcac ttgaaaatga ggaagccact ggtgatgcag ggggggcggc ggagaggacc    10020
          tcttctgcaa atagcggcag gaacacggca tggatgcagc tcgcgctccc ccaggccctc    10080
          ccctgggctg tgtggagggg tccgggggga atgggccagc gcccagtggt cacctggcca    10140
          tgtctcccca cagcccggaa gcaggagatc attaagacca cggagcagct catcgaggcc    10200
          gtcaacaacg gtgactttga ggcctacgcg t                                   10231
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  291]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          ctcagaattc aagatggata agccgccttc agtctcagcc aggctgtgct ctgggaaacc       60
          tgagggaact ggctccaggg tcagctgagc caagctgctc atgtgacccc tctcctccca      120
          ggctgctcac ttgctccagc cccggatgat gctgtgtgtt ttgctatttg tgaaccttgg      180
          tccccaacag atgacacaaa tgcgtattgc tgtgcttgct ctgtgtgcgt gtgtgtgtgc      240
          acgcgtgcgt gaatcattgc caaggaattg acacatcaca caaggtaata c               291
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  175]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          cccaggctgc tcacttgctc cagccccgga tgatgctgtg tgttttgcta tttgtgaacc       60
          ttggtcccca acagatgaca caaatgcgta ttgctgtgct tgctctgtgt gcgtgtgtgt      120
          gtgcacgcgt gcgtgaatca ttgccaagga attgacacat cacacaaggt aatac           175
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  144]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          cttccagctg cctgggtttc ctggaaagaa ctcttatccc caggaactag tttgttgaat       60
          aaatgctggt gaatgaatga atgattgaac agatgaatga gtgatgagta gataaaagga      120
          tggatggaga gatgggtgag taca                                             144
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  192]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  129]]>
          tccagcccta accactcagg attgggccgt ttgtgtctgg gtatgtctct tccagctgcc       60
          tgggtttcct ggaaagaact cttatcccca ggaactagtt tgttgaataa atgctggtga      120
          atgaatgaat gattgaacag atgaatgagt gatgagtaga taaaaggatg gatggagaga      180
          tgggtgagta ca                                                          192
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
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Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043

Claims (57)

  1. 一種長度為 8 至 40 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為至少 8 個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組之序列互補：(5’ – 3’) (UG)n、(GU)n、UGUGUGUG、UGUGUGUGU、UGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGU、UGUGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGUGU、GUGUGUGU、GUGUGUGUG、GUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUG、GUGUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUGUG 和 GUGAAUGA，其中 n 為 4 至 20，其中該反義寡核苷酸能夠在 TDP-43 耗盡或表現異常 TDP-43 蛋白的細胞中復原一個或多個 TDP-43 標靶 RNA 的功能表型。
  2. 一種長度為 8 至 40 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為至少 8 個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組之序列具有至少 75%、諸如至少 90% 的互補性或 100% 的互補性：(5’ – 3’) (UG)n、(GU)n、UGUGUGUG、UGUGUGUGU、UGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGU、UGUGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGUGU、GUGUGUGU、GUGUGUGUG、GUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUGUG 和 GUGAAUGA，其中 n 為 4 至 20；該反義寡核苷酸用於藥物。
  3. 一種長度為 8 至 40 個核苷酸之反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度為至少 8 個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與選自由以下所組成之群組之序列具有至少 75%、諸如至少 90% 的互補性或 100% 的互補性：(5’ – 3’) (UG)n、(GU)n、UGUGUGUG、UGUGUGUGU、UGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGU、UGUGUGUGUGUG、UGUGUGUGUGUGU、GUGUGUGU、GUGUGUGUG、GUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUGU、GUGUGUGUGUGUG 和 GUGAAUGA，其中 n 為 4 至 20；該反義寡核苷酸用於治療以 TDP-43 病變為表徵之疾病。
  4. 如請求項 1 之反義寡核苷酸或如請求項 2 或請求項 4 所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含一個或多個經修飾之核苷。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含：序列 CACACACA 或 ACACACAC；或選自由 SEQ ID No: 1 – 18 所組成之群組之序列；或選自 SEQ ID NO: 1-34 及 SEQ ID NO: 50-103 之序列。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列之長度為至少 12 個核苷酸。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列之長度為至少 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31 或 32 個核苷酸。
  8. 如請求項 1 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與標靶序列至少 75% 互補。
  9. 如請求項 1 至 8 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與該標靶序列至少 80%、至少 85%、至少 90% 或至少 95% 互補。
  10. 如請求項 1 至 9 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含相對於該標靶序列之 1、2、3、4、5、6、7、8 或更多個錯配。
  11. 如請求項 1 至 10 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸相對於互補標靶 RNA 之吉布斯自由能低於約 -10 ΔG，諸如低於約 -15 ΔG、諸如低於約 -17 ΔG。
  12. 如請求項 1 至 11 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸能夠調節兩個或更多個 TDP-43 標靶前驅 mRNA 之剪接。
  13. 如請求項 1 至 12 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該兩個或更多個 TDP-43 標靶 RNA 獨立地選自由以下所組成之群組：STMN2 前驅 mRNA、ARHGAP32 前驅 mRNA、SLC5A7 前驅 mRNA、CAMK2B 前驅 mRNA、KALRN 前驅 mRNA、CERT1 前驅 mRNA、UNC13A 前驅 mRNA。
  14. 如請求項 1 至 13 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予 TDP-43 耗盡細胞時，該反義寡核苷酸能夠增強選自由以下所組成之群組之兩個或更多個 mRNA 的前驅 mRNA 剪接之精準度：STMN2 mRNA、ARHGAP32 mRNA、SLC5A7 mRNA、CERT1 mRNA、CAMK2B mRNA、KALRN mRNA 和 UNC13A mRNA。
  15. 如請求項 1 至 14 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予表現 STMN2 前驅 mRNA 的 TDP-43 耗盡細胞時，該反義寡核苷酸能夠增加 STMN2 之表現。
  16. 如請求項 1 至 15 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予表現 STMN2 前驅 mRNA 的 TDP-43 耗盡細胞時，相較於具有連續外顯子 1/外顯子 2 連結的野生型 STMN2 成熟 mRNA，該反義寡核苷酸能夠降低包含介於外顯子 1 與外顯子 2 之間的隱蔽性外顯子 (ce1) 之 STMN2 成熟 mRNA 的比例。
  17. 如請求項 1 至 16 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予表現 ARHGAP32 前驅 mRNA 的 TDP-43 耗盡細胞時，該反義寡核苷酸能夠減少異常剪接之 ARHGAP32 成熟 mRNA 的量。
  18. 如請求項 1 至 17 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予表現 SLC5A7 前驅 mRNA 的 TDP-43 耗盡細胞時，該反義寡核苷酸能夠降低 SLC5A7 mRNA 轉錄本中異常外顯子包含（exon inclusion）量。
  19. 如請求項 1 至 18 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予表現 CERT1 前驅 mRNA 的 TDP-43 耗盡細胞時，該反義寡核苷酸能夠降低 CERT1 mRNA 轉錄本中的異常外顯子包含量。
  20. 如請求項 1 至 19 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予表現 CAMK2B 前驅 mRNA 的 TDP-43 耗盡細胞時，該反義寡核苷酸能夠降低 CAMK2B mRNA 轉錄本中的異常外顯子包含量。
  21. 如請求項 1 至 20 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予表現 KALRN 前驅 mRNA 的 TDP-43 耗盡細胞時，該反義寡核苷酸能夠降低 KALRN mRNA 轉錄本中異常外顯子包含量。
  22. 如請求項 1 至 21 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中當該反義寡核苷酸投予表現 UNC13A 前驅 mRNA 的 TDP-43 耗盡細胞時，該反義寡核苷酸能夠降低 UNC13A mRNA 轉錄本中的異常外顯子包含量。
  23. 如請求項 1 至 14 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸能夠校正 TDP-43 耗盡細胞中的 STMN2、CERT1、SLC5A7 和 ARHGAP32、CAMK2B、KALRN 和 UNC13A 前驅 mRNA 中的兩者或更多者之異常剪接。
  24. 如請求項 1 至 23 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸不包含由多於 3 個或多於 4 個連續 DNA 核苷組成之區域。
  25. 如請求項 1 至 24 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸不能介導 RNAseH 切割。
  26. 如請求項 4 至 25 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為口末啉基反義寡核苷酸。
  27. 如請求項 4 至 26 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該一個或多個經修飾之核苷是 2’ 糖修飾核苷，諸如獨立地選自由以下所組成之群組之 2’ 糖修飾核苷：2'-O-烷基-RNA；2'-O-甲基 RNA (2'-OMe)；2'-烷氧基-RNA；2'-O-甲氧基乙基-RNA (2'-MOE)；2'-胺基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-DNA；阿拉伯糖核酸 (ANA)；2'-氟-ANA；鎖核酸 (LNA)；及其任意組合。
  28. 如請求項 27 之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該 2’ 糖修飾核苷是親和力增強型 2’ 糖修飾核苷。
  29. 如請求項 4 至 25、27 或 28 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸的該連續核苷酸序列包含 2'-O-甲氧基乙基-RNA (2'-MOE) 核苷。
  30. 如請求項 29 之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列的所有核苷均為 2'-O-甲氧基乙基-RNA (2'-MOE) 核苷，其視情況藉由硫代磷酸酯核苷間鍵來連接。
  31. 如請求項 4 至 25、27 或 28 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該等經修飾之核苷中的一者或多者為鎖核酸核苷 (LNA)，諸如選自由限制性乙基核苷 (cEt) 和 β-D-氧-LNA 所組成之群組之 LNA 核苷。
  32. 如請求項 31 之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸的該連續核苷酸序列包含 LNA 核苷和 DNA 核苷或由 LNA 核苷和 DNA 核苷組成。
  33. 如請求項 4 至 25 或請求項 27 至 32 之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列為混聚體或總聚體。
  34. 如請求項 1 至 33 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID NO: 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列、選自 SEQ ID NO: 1-34 及 SEQ ID NO: 50-103 之序列、或其至少 8 個連續核苷酸。
  35. 如請求項 34 之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含選自由 SEQ ID NO: 1 – 18 所組成之群組的核鹼基之序列或選自 SEQ ID NO: 1-34 及 SEQ ID NO: 50-103 之序列的至少 9、10、11、12、13、14、15、16 或 17 個連續核苷酸。
  36. 如請求項 4 至 35 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中存在於該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的胞嘧啶鹼基獨立地選自由胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶所組成之群組。
  37. 如請求項 4 至 36 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中存在於該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的胞嘧啶鹼基為 5-甲基胞嘧啶。
  38. 如請求項 4 至 37 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中位於該連續核苷酸序列上的核苷之間的該等核苷間鍵中的一者或多者是經修飾的。
  39. 如請求項 4 至 38 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中位於該連續核苷酸序列上的核苷之間的該等核苷間鍵中的至少約 75%、至少約 80%、至少約 85%、至少約 90%、至少約 95% 或約 100% 是經修飾的。
  40. 如請求項 38 或 39 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該等經修飾之核苷間鍵中的一者或多者或全部包含硫代磷酸酯鍵。
  41. 如請求項 4 至 25 或請求項 27 至 40 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中存在於該反義寡核苷酸中的所有該等核苷間鍵均為硫代磷酸酯核苷間鍵。
  42. 如請求項 1 至 41 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列的長度為 8 至 20 個核苷酸。
  43. 如請求項 1 至 41 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列的長度為 12 至 18 個核苷酸。
  44. 如請求項 1 至 41 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列的長度為 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。
  45. 如請求項 1 至 44 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸由該連續核苷酸序列組成。
  46. 如請求項 1 之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含選自由以下所組成之群組的寡核苷酸或由選自由以下所組成之群組的寡核苷酸所組成：16,1、8,3、18,3、18,4、16,2、18,2、7,2、15,2、16,3、15,3、8,1、8,2、7,3、6,4、6,3、18,1、7,1、14,2、6,2、14,4、15,4、10,1 和 15,5。
  47. 一種結合物，該結合物包含如請求項 1 至 46 中任一項之寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸，及至少一個共價接附至該寡核苷酸之結合物部分。
  48. 一種如請求項 1 至 46 中任一項之反義寡核苷酸或所使用之反義寡核苷酸或如請求項 47 之結合物之醫藥上可接受之鹽。
  49. 如請求項 46 之鹽，其中該鹽為鈉鹽或鉀鹽。
  50. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含：如請求項 1 至 46 中任一項之寡核苷酸或所使用之寡核苷酸、或如請求項 47 之結合物、或如請求項 48 或 49 之藥用鹽，以及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
  51. 一種增強表現異常或耗盡量TDP-43之細胞中的 TDP-43 功能性之方法，諸如體內或體外方法，該方法包含將有效量之如請求項 1 至 46 中任一項之寡核苷酸、或如請求項 47 之結合物、或如請求項 48 或 49 之鹽、或如請求項 50 之組成物投予該細胞。
  52. 一種治療或預防受試者之 TDP-43 病變的方法，該方法包含將治療或預防有效量的如請求項 1 至 46 中任一項之寡核苷酸或如請求項 47 之結合物、或如請求項 48 或 49 之鹽、或如請求項 50 之組成物投予患有或易罹患該 TDP-43 病變的受試者。
  53. 如請求項 1 至 46 中任一項之寡核苷酸、或如請求項 47 之結合物、或如請求項 48 或 49 之鹽、或如請求項 50 之組成物，其用為藥物。
  54. 如請求項 1 至 46 中任一項之寡核苷酸、或如請求項 47 之結合物、或如請求項 48 或 49 之鹽、或如請求項 50 之組成物，其用於治療 TDP-43 病變。
  55. 一種如請求項 1 至 46 之寡核苷酸、或如請求項 47 之結合物、或如請求項 48 或 49 之鹽、或如請求項 50 之組成物之用途，其用於製備供治療或預防 TDP-43 病變的藥物。
  56. 如請求項 1 至 55 中任一項之用途、寡核苷酸或方法，其中該 TDP-43 病變是選自由以下所組成之群組之神經疾病：肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS)、額顳葉變性 (FTLD)、進行性核上神經麻痺症 (PSP)、原發性側索硬化症、進行性肌萎縮症、阿茲海默症、帕金森氏症、自閉症、海馬迴硬化性失智症、唐氏症、亨汀頓氏舞蹈症、多麩醯胺疾病（諸如第三型脊髓小腦性失調症）、肌病變和慢性創傷性腦病變。
  57. 如請求項 1 至 56 中任一項之用途、寡核苷酸或方法，其中該 TDP-43 病變是選自由肌肉萎縮性側索硬化症 (ALS)、額顳葉變性 (FTLD) 所組成之群組之神經疾病。
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