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TW202214273A - 細菌在孩童發育評估和治療的應用 - Google Patents

細菌在孩童發育評估和治療的應用 Download PDF

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Publication number
TW202214273A
TW202214273A TW110121500A TW110121500A TW202214273A TW 202214273 A TW202214273 A TW 202214273A TW 110121500 A TW110121500 A TW 110121500A TW 110121500 A TW110121500 A TW 110121500A TW 202214273 A TW202214273 A TW 202214273A
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TW
Taiwan
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bacterial species
asd
child
children
composition
Prior art date
Application number
TW110121500A
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English (en)
Inventor
秀娟 黃
家亮 陳
徐之璐
萬亞婷
Original Assignee
香港中文大學
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Abstract

本發明在於發現與發育正常的兒童相比，在患有包括自閉症譜系障礙(ADS)的自閉症之兒童的胃腸道中，某些細菌菌種的存在和數量顯著改變。在兒童發育的不同階段期間，還發現兒童之腸道細菌譜演變。因此，提供用於評估兒童發育年齡和治療有其需要的兒童的方法。還提供用於該方法的套組和組合物。

Description

細菌在孩童發育評估和治療的應用
本發明關於細菌在兒童發育評估和治療的應用。 相 關 申 請
本申請案請求2020年6月15日提交申請的美國臨時專利申請案第63/039,034號和2020年12月3日提交申請的美國臨時專利申請案第63/121,198號的優先權，上述所有內容出於所有目的在此通過引用以其整體併入。
自閉症譜系障礙(ASD)是一組複雜的發育障礙，其特徵在於受損的社交互動和溝通以及重複行為。本研究的目的是確定患有自閉症的個體的細菌生物標誌物及鑑定自閉症的益生菌/治療性細菌。自閉症兒童與正常發育兒童之間的腸道細菌譜是不同的，並且該細菌譜也隨著兒童的生長和發育而演變。腸道微生物群被認為是ASD發展的重要因素，也是兒童生長和發育年齡的指標。目前沒有診斷或治療自閉症的有效方法，特別是沒有使用微生物標誌物來預測兒童之自閉症風險的現有模型，也沒有使用微生物標誌物來評估兒童發育年齡的任何模式。本發明提供用於預測兒童之自閉症風險的新方法、通過微生物轉移和/或補充來改善自閉症患者的行為症狀的新方法及基於兒童的腸道微生物譜來評估兒童發育年齡的新方法。
本發明涉及用於治療自閉症譜系障礙(ASD)的症狀的新方法和組合物。特別地，本申請案的發明人發現某些微生物菌種，尤其是某些細菌，在處於患有ASD風險或患有ASD的兒童的胃腸(GI)道中處於改變的狀態。可以通過調節患者腸道中相關微生物的水平，例如通過糞便微生物群移植(FMT)治療或口服施用有益細菌菌種或通過阻抑有害細菌菌種的水平來實現健康益處，諸如改善行為症狀和減輕有害影響。這些發現還提供指示兒童之ASD存在或風險的新方法。因此，在第一方面，本發明提供用於治療ASD的新方法，其包括通過在罹患ASD的兒童的胃腸道中增加表1界定的一或多種細菌菌種的水平來減輕ASD症狀。
在一些實施方案中，引入步驟包含將包含有效量的所述一或多種細菌菌種的組合物經口服施用至所述個體。在一些實施方案中，引入步驟包含將包含有效量的所述一或多種細菌菌種的組合物遞送至所述個體的小腸、回腸或大腸。在一些實施方案中，引入步驟包含糞便微生物移植(FMT)。在一些實施方案中，FMT包含向所述兒童施用包含經處理的供體糞便材料的組合物。在一些實施方案中，口服施用所述組合物；或者所述組合物直接沉積到所述兒童的胃腸道。在一些實施方案中，在引入步驟之前從所述兒童獲得的第一糞便樣品和在該引入步驟之後從所述兒童獲得的第二糞便樣品中測定所述一或多種細菌菌種的水平或相對豐度。在一些實施方案中，通過聚合酶鏈反應(PCR)，特別是定量PCR來測定所述一或多種細菌菌種的水平。
在第二方面，本發明提供用於治療ASD的方法，其包括通過在罹患ASD的兒童的胃腸道中降低表2的一或多種細菌菌種的水平來減輕ASD症狀。
在一些實施方案中，降低步驟包括FMT。在一些實施方案中，降低步驟包含使用抗細菌劑治療所述個體。在一些實施方案中，在使用所述抗細菌劑治療所述個體之後，將包含經處理的供體糞便材料的組合物引入所述個體的胃腸道。例如，口服施用所述組合物，或者所述組合物直接沉積到所述兒童的胃腸道。在一些實施方案中，在降低步驟之前從所述兒童獲得的第一糞便樣品和在該降低步驟之後從所述兒童獲得的第二糞便樣品中測定所述一或多種細菌菌種的水平或相對豐度。在一些實施方案中，通過PCR，尤其是通過定量PCR來測定所述一或多種細菌菌種的水平。
在相關方面，提供用於治療ASD症狀的套組。所述套組包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一組合物，所述第一組合物包含(i)有效量的表1所示的第一細菌菌種或(ii)有效量的抗細菌劑，所述抗細菌劑阻抑表2所示的第一細菌菌種的生長，且所述第二容器含有第二組合物，所述第二組合物包含(i)有效量的表1所示的第二細菌菌種或(ii)有效量的抗細菌劑，所述抗細菌劑阻抑表2所示的第二細菌菌種的生長。
在一些實施方案中，所述第一組合物包含用於FMT的經處理的供體糞便材料，例如該材料已被處理和配製以用於口服施用，諸如經乾燥、經冷凍或經凍乾，並放置在適於口服攝入的膠囊。在一些實施方案中，所述第二組合物被配製以用於口服施用。在一些實施方案中，所述第一組合物和所述第二組合物均被配製以用於口服施用。在一些情況下，所述套組可包括兩種或更多種組合物，每種組合物包含(i)有效量的表1所示的至少一種(可能兩種或更多種)細菌菌種和/或(ii)有效量的抗細菌劑，其阻抑表2所示的至少一種(可能兩種或更多種)細菌菌種的生長。所述套組的組合物可各自包含生理上可接受的載體或賦形劑。
在第三方面，提供用於確定人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的風險的方法。所述方法包含以下步驟：(1)測定取自所述兒童的糞便樣品中表1或表2所示的任一種細菌菌種的相對豐度；及(2)檢測步驟(1)的相對豐度不低於表1的截止值或標準對照值或低於表2的截止值或標準對照值，並確定所述兒童不具有增加的ASD風險；或者，檢測步驟(1)的相對豐度低於表1的截止值或標準對照值或不低於表2的截止值或標準對照值，並確定所述兒童具有增加的ASD風險。在一些實施方案中，通過PCR，例如定量PCR，測定兒童糞便樣品中細菌菌種的相對豐度。
在相關方面，提供用於評估兩個人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的風險的方法。所述方法包含以下步驟：(1)測定來自所述兩個兒童的每一者的糞便樣品中表1或表2所示的任一種細菌菌種的相對豐度；(2)確定步驟(1)的表1所示的細菌菌種的相對豐度在來自第一兒童的糞便樣品中較高或確定步驟(1)的表2所示的細菌菌種的相對豐度在來自第一兒童的糞便樣品中較低；及(3)確定第二兒童具有比第一兒童更高的ASD風險。在一些實施方案中，通過PCR，例如定量PCR測定兩個兒童糞便樣品中細菌菌種的相對豐度。
此外，提供用於確定人類兒童之ASD風險的方法，其包括以下步驟：(1)在來自所述兒童的糞便樣品中測定以下值：(a)隱紋條另枝菌( Alistipes indistinctus)(Ai)或人腸道厭氧棒狀菌( Anaerotruncus colihominis)(Ac)的相對豐度或(b)三種細菌菌種Ai、Ac及霍氏真桿菌(Eh)的水平的綜合評分，所述綜合評分通過I1+β1*Ai+β2*Eh+β3*Ac計算；及(2)檢測所述值高於標準對照值，並確定所述個體具有增加的ASD風險。
類似地，提供用於確定人類兒童之ASD風險的方法，其包括以下步驟：(1)測定來自所述兒童的糞便樣品中霍氏真桿菌(Eh)的相對豐度；及(2)檢測來自步驟(1)的相對豐度低於標準對照值，並確定所述個體具有增加的ASD風險。
在第四方面，提供用於評估人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的風險的方法。所述方法包含以下步驟：(1)測定來自所述兒童的糞便樣品中表3所示的一或多種細菌菌種的水平或相對豐度；(2)測定來自包含正常和ASD兒童的參考群組的糞便樣品中相同細菌菌種的水平或相對豐度；(3)使用從步驟(2)獲得的數據通過隨機森林模型以生成決策樹，並沿著所述決策樹運行來自步驟(1)的一或多種細菌菌種的水平或相對豐度以生成風險評分；及(4)將風險評分大於0.5的兒童確定為具有增加的ASD風險，且將風險評分不大於0.5的兒童確定為沒有增加的ASD風險。
在一些實施方案中，所述一或多種細菌菌種包含隱紋條另枝菌或由其組成。在一些實施方案中，所述一或多種細菌菌種包含隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物( candidate division TM7 single-cell isolate)TM7c和脊鏈球菌( Streptococcus cristatus)或由彼等組成。在一些實施方案中，所述一或多種細菌菌種包含隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌和寡醱酵鏈球菌( Streptococcus_oligofermentans)或由彼等組成。
在相關方面，本發明提供用於評估個體發展自閉症譜系障礙(ASD)的風險的套組。所述套組包含用於檢測表1、表2或表3所示的一或多種細菌菌種的試劑。在一些實施方案中，所述試劑包含一組寡核苷酸引子，所述寡核苷酸引子係用於擴增表1、表2或表3所示的任一種細菌菌種的多核苷酸序列。在一些實施方案中，所述擴增是PCR，例如定量PCR。
第五方面，本發明提供用於確定兒童生長或發育年齡的方法。所述方法包含以下步驟：(a)定量測定取自所述兒童的糞便樣品中選自表8或表9的一或多種細菌菌種的相對豐度；(b)定量測定取自由正常發育兒童組成的參考群組的糞便樣品中所述一或多種細菌菌種的相對豐度；(c)使用從步驟(b)獲得的數據通過隨機森林模型以生成決策樹；及(d)沿著步驟(b)的決策樹運行從步驟(a)獲得的相對豐度以產生所述兒童的發育年齡。在一些實施方案中，所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌( Streptococcus gordonii)、鳥腸球菌( Enterococcus avium)、真桿菌_3_1_31 ( Eubacterium_sp_3_1_31)、哈氏梭菌( Clostridium hathewayi)及堅硬棒桿菌( Corynebacterium durum)。在一些實施方案中，所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31及哈氏梭菌。在一些實施方案中，所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌、鳥腸球菌和真桿菌_3_1_31。在一些實施方案中，所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌和鳥腸球菌。在一些實施方案中，所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌。在一些實施方案中，所述兒童為約3歲至約6歲。
在相關方面，提供用於確定兒童生長或發育年齡的套組。所述套組包括第一容器和第二容器，所述第一容器含有用於檢測表8或表9所示的第一細菌菌種的第一試劑，且所述第二容器含有用於檢測表8或表9所示的第二不同細菌菌種的第二試劑。在一些實施方案中，所述套組包括3個或更多個容器，所述容器的每一者含有用於檢測表8或表9所示的不同細菌菌種的試劑。在一些實施方案中，所述套組包括2個或更多個容器，所述容器的每一者含有用於檢測不同細菌菌種的試劑，所述細菌菌種選自：(1)格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌及堅硬棒桿菌；(2)格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31及哈氏梭菌；(3)格氏鏈球菌、鳥腸球菌及真桿菌_3_1_31；或(4)格氏鏈球菌和鳥腸球菌。在一些實施方案中，所述試劑包含一組寡核苷酸引子，所述寡核苷酸引子係用於擴增來自表8或表9所示的任一種細菌菌種的多核苷酸序列。在一些實施方案中，擴增是PCR，例如定量PCR(qPCR)。
在第六方面，本發明提供促進兒童生長和發育的方法，其包含向所述兒童施用有效量的選自表8的一或多種細菌菌種。在一些實施方案中，所述兒童的生物學年齡為約3歲至約6歲。
在相關方面，提供用於促進兒童生長和發育的套組。所述套組包括第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一組合物，所述第一組合物包含(i)有效量的表8所示的一種細菌菌種，且所述第二容器含有第二組合物，所述第二組合物包含(i)有效量的表8所示的另一種不同的細菌菌種。在一些實施方案中，所述第一組合物或第二組合物包含用於FMT的經處理的供體糞便材料。在一些實施方案中，所述第一組合物或第二組合物被配製用於口服施用。在一些實施方案中，所述第一組合物和第二組合物均被配製用於口服攝入。
定 義
術語“糞便微生物群移植(FMT)”或“糞便移植”是指一種醫療程序，於該程序期間從健康個體獲得的含有活的糞便微生物(細菌、真菌、病毒等)的糞便物質被轉移到接受體的胃腸道中以恢復已被各種醫學病況中任一種(例如自閉症譜系障礙(ASD))破壞或摧毀的健康腸道微生物叢。通常，來自健康供體的糞便物質首先被加工成用於移植的適當形式，所述移植可以通過直接沉積到下胃腸道中，如通過結腸鏡檢查、或通過鼻插管，或通過口服攝入含有經處理的(例如經乾燥和冷凍或經凍乾)糞便物質的封裝材料來實現。
本文所用的術語“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指對目標生物過程，諸如目標基因的RNA/蛋白表現、目標蛋白的生物活性、細胞信號轉導、細胞增殖等的任何可檢測的負作用。通常，抑制反映當與對照相比時，目標過程(例如某些種類的微生物(例如表2所示的一或多種細菌)的生長或增殖)或以上提及的下游參數中任一者的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的減少。“抑制”還包括100%的減少，即目標生物過程或信號的完全消除、預防或廢除。其他相關術語，如“阻抑(suppressing)”、“阻抑(suppression)”、“減少(reducing)”、“減少(reduction)”、“降低(decrease)”、“降低(decreasing)”、“較低(lower)”和“較少(less)”在本文中以類似的方式用於指不同水平的減少(例如，與對照水平(即抑制之前的水平)相比，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的減少)，直至完全清除目標生物過程或信號。另一方面，術語，諸如“激活(activate)”、“激活(activating)”、“激活(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促進(promote)”、“促進(promoting)”、“提高(enhance)”、“提高(enhancing)”、“提高(enhancement)”、“較高”和“更多”在本文中用於涵蓋目標過程或信號的不同水平的正變化(例如，與對照水平(活化之前)，例如表1所示的一或多種細菌菌種的對照水平相比，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更大，諸如3倍、5倍、8倍、10倍或20倍的增加)。相比之下，術語“基本上相同”或“基本上沒有變化”表示從比較基礎(諸如標準對照值)的量幾乎沒有變化，通常在比較基礎的±10%內，或者在比較基礎的±5%、4%、3%、2%或1%內，或甚至更少的變化。
如本文所用的“標準對照”是指對應於從未患有ASD或發育延遲的個體獲得的特定類型的樣品(例如糞便樣品)中發現的預選細菌菌種的平均水平，或者由取自此類個體的樣品類型中發現的多種細菌菌種的平均水平計算的綜合評分值。例如，為檢查兒童之ASD的風險的目的，建立“標準對照”值以提供截止值從而指示被檢查的兒童是否具有升高的ASD風險。為適當地建立“標準對照”，必須在對照組中包括足夠數量的個體(例如，至少10個、12個、15個、20個、24個或更多個個體)，以提供用於確定一或多種預選的細菌菌種的平均水平或者由代表ASD風險的多種細菌菌種的水平計算的綜合評分的樣品。
術語“抗細菌劑”是指能夠分別抑制、阻抑或防止細菌菌種，尤其是表2所示的生長或增殖的任何物質。已知具有抗細菌活性的試劑包括通常阻抑廣譜的細菌菌種的增殖的各種抗生素以及能夠抑制特定細菌菌種的增殖的試劑，如反義寡核苷酸、小抑制性RNA等。術語“抗細菌劑”類似地定義為涵蓋具有殺死幾乎所有細菌菌種的廣譜活性的試劑及特異性地阻抑靶細菌菌種增殖的試劑。這種特異性抗細菌劑可以是天然的短多核苷酸(例如，小抑制性RNA、微RNA、微小微小RNA、lncRNA或反義寡核苷酸)，其能夠破壞靶細菌菌種的生命週期中關鍵基因的表現，因此能夠僅特異性地阻抑或消除該菌種而不會顯著影響其他密切相關的細菌菌種。
“相對豐度百分比”，當在描述與同一環境中存在的所有細菌菌種相關的特定細菌菌種(例如，表1至11中任一者所示的任一種)存在的上下文中時，是指以百分比形式表示的所有細菌菌種的量中該細菌菌種的相對量。例如，一種特定細菌菌種的相對豐度百分比可以通過將一個給定樣品中該菌種特異的DNA數量(例如通過定量聚合酶鏈反應測定)與同一樣品中所有細菌DNA數量(例如，通過定量聚合酶鏈反應PCR和基於16s rRNA序列的定序測定)比較來測定。
“絕對豐度”，當在描述糞便中特定細菌菌種(例如，表1至11中所示的任一種)存在的上下文中時，是指糞便樣品中所有DNA量中來自細菌菌種的DNA量。例如，一種細菌的絕對豐度可以通過將一個給定樣品中該細菌菌種特異的DNA數量(例如，通過定量PCR測定)與同一樣品中所有糞便DNA數量比較來測定。
如本文所用，糞便樣品的“總細菌負荷”是指糞便樣品中所有DNA量中所有各別細菌DNA量。例如，可以通過將一個給定樣品中細菌特異性DNA(例如，通過定量PCR測定的16 srRNA)的數量與同一樣品中所有糞便DNA的數量進行比較來測定細菌的絕對豐度。
如本文所用，術語“自閉症譜系障礙(ASD)”是指與大腦發育相關的病況，其影響一個人對他人的感知和社交，導致社交互動和溝通困難。ASD始于兒童早期，並最終導致患者不能在社會、學校和工作中正常發揮作用的問題。自閉症譜系障礙中的術語“譜系”是指廣泛的症狀和嚴重程度。ASD包括以前被認為是獨立的病況，如自閉症、阿斯伯格症候群(Asperger's syndrome)、兒童崩解症和未指明形式的普遍發育障礙。該障礙還包括有限的和重複的行為模式。
本文使用的術語“治療(treat)”或“治療(treating)”描述導致消除、減少、減輕、逆轉、預防和/或延遲預定醫學病況的任何症狀的發作或復發的行為。換句話說，“治療”病況涵蓋針對該病況的治療性和預防性干預，其包括促進患者從病況中恢復。
如本文所用，術語“有效量”是指使用或施用物質(例如，抗細菌劑)而產生期望效果(例如，對一或多種有害細菌菌種(例如，表2所示的細菌菌種)的生長或增殖的抑制或阻抑作用)的該物質的量。效果包括防止、抑制或延遲細菌增殖期間任何相關的生物過程至任何可檢測出的程度。確切的量將取決於物質(活性劑)的性質、使用/施用方式及應用目的，並且將由本領域技術人員使用已知的技術及本文描述的技術確定。在另一環境下，當將“有效量”的一或多種有益或期望的細菌菌種(例如，表1列出者)人工引入旨在引入患者的胃腸道，例如待在FMT中使用的組合物時，意味所引入的相關細菌的量足以賦予接受者健康益處，如減少的恢復時間或對相關病症(諸如ASD)的治療干預降低的需要，其包括但不限於藥物(如抗精神病藥和抗抑鬱藥)和多種治療中的任一種，如行為和溝通治療、教育治療、家庭治療、言語或物理治療等。
如本文所用，術語“生長/發育年齡”是指以時間單位表示並基於其胃腸道中存在的微生物狀態/分佈評估兒童的發育階段。在兒童的生物學(出生)年齡與生長/發育年齡之間的比較反映兒童的生長和發育是否與其出生或實齡或“適齡”一致。
如本文所用，術語“約”表示值的範圍，其為指定值的+/-10%。例如，“約10”表示9至11(10+/-1)的值範圍。 發 明 詳 述I. 引言
本發明提供用於評估兒童發生自閉症譜系障礙(ASD)的風險、用於評估兒童的生長或發育年齡及用於治療ASD症狀的新方法。在研究期間，本申請案的發明人發現某些細菌菌種的存在和相對豐度由於ASD而在患者的胃腸道中顯著改變，特定菌種的增加或減少與疾病嚴重程度相關。例如，發現如表2所示的細菌菌種在ASD兒童的胃腸道中處於升高的水平，然而發現如表1所示的細菌菌種在ASD兒童的胃腸道中處於降低的水平。另一方面，已經觀察到兒童糞便樣品中某些細菌菌種(如表3所示者)的水平或相對豐度與兒童在隨後時間發生ASD的可能性相關。最後，本申請案的發明人發現，兒童胃腸道內微生物的存在和分佈隨著兒童的生長和發育過程的進展而演變。因此，這些最新發現的結果提供如下的有用工具：用於治療ASD症狀、用於評估兒童的ASD風險、用於指導已被鑑定為處於ASD高風險或表現出ASD症狀的兒童的必要治療(如本文描述的藥物和/或療法)及用於評估兒童的生長發育年齡以確定是否適合與生物學或出生年齡相關的發育過程，然後可便於隨後確定是否需要某些治療，例如出於促進生長發育的目的，對發現在該兒童的胃腸道中缺乏的某些細菌菌種進行補充施用。 II. FMT供體/接受者的選擇和準備
遭受破壞狀態的胃腸道微生物叢的ASD兒童被認為是FMT治療的接受者，以便恢復微生物的正常健康分佈。如本申請案的發明人所揭示的，ASD的存在或風險易於導致細菌菌種(如表1所示者)的水平降低，糞便材料含有高於這些細菌菌種中一或多種的平均水平的FMT供體特別有利於此目的而受到青睞。例如，對於糞便樣品中這些細菌菌種中每一種，期望的供體可以較佳具有高於總細菌的約0.01%、0.02%、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.50%、0.60%、0.80%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、8.5%、9.0%或更高的相對豐度。
另一方面，ASD兒童具有表2列出的異常高水平的細菌菌種。因此，為恢復他們的正常和健康的胃腸道細菌譜，使用從健康的人捐贈的糞便材料進行FMT是適當的，所述健康的人的糞便樣品中這些細菌菌種(如表2所示者)的水平是天然低的或人工降低的，例如通過使用特異性殺死或阻抑某些目標細菌菌種而不顯著影響其他細菌菌種的特定抗細菌劑。較佳地，在加工用於FMT之前，這些細菌菌種中每一種的相對豐度不超過總細菌的約0.01%、0.02%、0.05%、0.07%、0.08%、0.10%、0.13%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.50%、0.70%或更高。
在FMT中使用的糞便物質從健康供體獲得，然後加工成用於在即將進行的FMT程序中預期遞送手段的適當形式。雖然來自同一家族或家庭的健康個體通常充當供體，但在實施本發明時，供體微生物譜是一個重要的考慮因素，並且可以反而傾向於選擇不相關的供體。製備用於移植的供體材料的方法包括乾燥、冷凍或凍乾以及配製或包裝的步驟，這取決於例如通過口服攝入或通過直腸沉積遞送至接受者的精確遞送途徑。
在FMT治療的準備中，預期的接受者，例如已經被診斷患有ASD或被認為具有發生ASD的增加風險但尚未表現出該疾病的任何明確症狀(例如，具有ASD的家族史或其他已知的風險因素)的患者，可以在FMT之前首先接受阻抑其胃腸道中細菌水平的治療。所述治療可以包括施用抗細菌劑(廣譜抗生素或特定抗細菌劑)以消除或降低由於ASD的存在或風險而升高的不期望的細菌菌種的水平，例如表2指定的一或多種細菌。
文獻已經報導用於測定樣品中所有細菌菌種的水平的各種方法，例如利用通常共有的16S rRNA細菌序列的序列相似性，進行細菌多核苷酸序列的擴增(例如通過PCR)和定序。另一方面，任何給定細菌菌種的水平可以通過其獨特基因組序列的擴增和定序測定。豐度百分比通常用作指示給定環境中細菌菌種的相對水平的參數。 III. 通過調節細菌水平的治療方法
本申請案的發明人的發現揭示ASD與ASD兒童腸道中某些細菌菌種(例如表1或表2中所示者)的增加或減少之間的直接相關性。該揭示使通過經由例如FMT程序調整或調節這些患者胃腸道中這些細菌菌種的水平，以將有效量的表1所示的細菌菌種中的一或多種遞送至該患者的胃腸道，或者例如通過遞送抗細菌劑以阻抑目標細菌菌種來降低表2列出的一或多種細菌菌種的水平而實現用於治療ASD症狀的不同方法，尤其是用於幫助ASD兒童從諸如藥物和/或多種治療的不同治療方案中獲益。
當提議的FMT供體的糞便經測試並發現含有不足水平的一或多種有益細菌菌種，如表1所示者(例如，每種都小於糞便樣品中總細菌的約0.01%、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.50%、0.80%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，6.0%、7.0%或8.0%)時，提議的供體被認為是旨在治療ASD症狀或降低接受者(例如兒童)未來發生ASD的風險的FMT的不適合供體，其可能被取消作為供體的資格，以支持糞便樣品表現出更有利的細菌譜的另一個體，並且彼之糞便材料由於缺乏賦予此類有益健康效果的前景而不應立即用於FMT，除非該糞便材料被適當地改變。鑑於本申請案的發明人的發現，在這些預期缺乏FMT治療的健康益處可以容易地改善的情況下，例如可以將一或多種細菌菌種，如表1所示者從外源性來源引入供體糞便材料中，使得該糞便材料的細菌菌種的水平增加(例如達到糞便材料的總細菌中至少約0.01%、0.02%、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.50%、0.60%.0.80%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、8.5%、9.0%或10%)，然後將其加工用於FMT以治療ASD症狀或用於降低兒童的ASD風險。具有類似的預期目標的治療前方案可以用於準備即將接受FMT治療的患者，以便獲得諸如本文所述的健康益處的潛力最大化。
作為替代方案，有益的細菌菌種(如表1所示者的一或多種)可以從足夠量的細菌培養物中獲得，然後配製成合適的組合物，該組合物不含取自供體的任何糞便材料，以用於遞送到ASD患者的腸道。與FMT類似，這種組合物可以通過口服、鼻腔或直腸施用而被引入到患者。
另一方面，由於存在ASD或ASD的風險，發現某些細菌菌種(例如表2所示者)的相對豐度升高。因此，治療ASD患者或ASD高風險患者以降低這些細菌菌種的水平，以便改善患者與疾病相關的症狀。有幾種選擇可以降低這些細菌菌種的水平：首先，可以給予患者特定的抗細菌劑以特異性地殺死或阻抑目標細菌菌種，從而降低這些細菌的異常高水平。
第二，可以首先給予患者抗細菌劑，如用於殺死或阻抑所有細菌菌種的廣譜抗生素，或者特異性抗細菌劑以特異性殺死或阻抑目標細菌菌種；然後，可以將組合物施用至患者(例如，通過FMT)以將平衡良好的混合細菌培養物引入患者的胃腸道。
可以在一個組合步驟中執行這些選項中的每一個以實現第一和第二處理方法目標，即使用一種單一組合物(如來自FMT供體的經處理的糞便材料)來增加某些細菌菌種(如表1所示者一或多種)的水平，以及降低某些其他細菌菌種(例如表2列出者的一或多種)的水平，所述單一組合物含有彼此在適當比例範圍內的相關細菌菌種。
在完成將有效量的期望細菌菌種引入患者的胃腸道的步驟(例如，經由FMT程序)和/或阻抑不期望的細菌水平的步驟之後，立即可以通過每天連續測試糞便樣品中細菌菌種的水平或相對豐度來進一步監測接受者，直至程序後5天，同時治療ASD的臨床症狀以及監測患者的一般健康狀況以便評估治療結果和接受者胃腸道中相關細菌的相應水平：可以結合觀察所實現的健康益處(如行為、語言或社交技能的改善)來監測細菌菌種(如表1所示者的一或多種)的水平。 IV. 評估疾病嚴重程度及相應的治療
本申請案的發明人還發現，某些細菌菌種的水平改變可以指示ASD的存在或風險：揭示人類兒童糞便樣品中某些細菌菌種(例如，表1所示者)的降低水平與這些兒童後來被診斷為ASD的可能性之間的相關性。類似地，已經確立兒童胃腸道中某些其他細菌菌種(例如，表2所示者)的增加水平與兒童後來被診斷為ASD的可能性之間的相關性。此外，已經揭示某些細菌菌種(如表3所示的一或多種菌種)的水平或相對豐度，以指示當使用某些特定的數學工具正確計算時個體後來發生ASD的風險。
例如，當從兩名或更多名兒童中獲取糞便樣品時，可以例如通過PCR，尤其是定量PCR來測定樣品中表1或2中細菌菌種的水平或相對豐度。對於表1列出的細菌菌種，在兒童糞便樣品中發現的較低水平指示兒童中存在ASD或ASD風險增加的可能性較高；相反，對於表2列出的細菌菌種，在兒童糞便樣品中發現的較高水平指示兒童中存在ASD或ASD風險的可能性較高。在測量和比較多種菌種的水平的情況下，基於來自所測量的大多數相關細菌菌種的指示來進行風險測定。
一旦作出ASD風險評估，例如兒童被認為患有ASD或處於以後發生ASD的增加的風險中，可以採取適當的治療步驟作為解決兒童增加的風險的措施。例如，可以向兒童給予藥物，如抗精神病藥和/或抗抑鬱藥，或者可以給予療法，如專門設計用於解決行為問題和/或改善語言、溝通或社交技能者。 V. 評估兒童的生長/發育年齡
另外，本申請案的發明人揭示存在於兒童胃腸道的細菌菌種的分佈隨著兒童繼續發育而繼續演變以作為正常生長過程的一部分。因此，本文的結果還允許使用本文描述的方法，基於某些相關腸道細菌菌種的水平，設計用於評估兒童發育年齡的有效且準確的手段。更具體地，首先從正在測試生長或發育年齡的兒童中獲取糞便樣品。然後，使用在相關領域中已知或本文描述的方法來定量測定多種預選的細菌菌種(如表8或表9中所示的細菌菌種)的水平或相對豐度。使用這些細菌菌種的水平，可以隨後使用本文具體描述的數學工具來計算兒童的發育年齡。
一旦使用本發明的方法確定兒童的生長或發育年齡，出於促進其生長或發育的目的，如果需要，可以給予兒童適當的治療。例如，如果發現兒童的發育年齡遠遠落後於其生物學年齡，例如晚於其生物學年齡超過約6個月或9個月或12個月，或者晚於其生物學年齡超過約10%、20%、25%、33%或甚至50%，則可以通過施用有效量的表8或表9中指定的並且在其胃腸道中缺乏的一或多種細菌菌種給予治療。一種治療方法是FMT，例如口服施用或直接沉積富含期望細菌菌種的預處理材料。 VI. 用於ASD治療的套組和組合物
本發明提供新的套組和組合物，其可以用於在ASD的治療性和/或預防性治療中減輕症狀並賦予健康益處，其包括通過設計用於治療ASD的常規療法促進患者改善。例如，提供套組，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一組合物，所述第一組合物包含(i)有效量的表1或表14所示的一或多種細菌菌種或(ii)有效量的阻抑表2或表13所示的一或多種細菌菌種生長的抗細菌劑，且所述第二容器含有第二組合物，所述第二組合物包含有效量的已知用於治療ASD的藥物(如抗精神病藥或抗抑鬱藥)。在一些變型中，所述套組可含有兩種或更多種組合物，所述組合物的每一者包含有效量的(1)表1或表14中一或多種有益細菌菌種、(2)抗細菌劑及(3)單獨或任意組合的用於治療ASD的藥物。
在一些情況下，所述第一組合物包含來自供體的糞便材料，所述糞便材料已經根據FMT程序中的遞送手段被加工、配製和包裝成適當的形式，其可以通過直接沉積在接受者的下胃腸道(例如，濕的或半濕的形式)或通過口服攝入(例如，冷凍、乾燥/凍乾、封裝的)。可選地，所述第一組合物可不含有任何供體糞便材料，而是人工混合物，其含有適當比例和數量的較佳細菌菌種，如表1或表14所示的一或多種細菌菌種。此外，所述第一組合物可含有適當量的抗細菌劑，其阻抑表2或表13所示的一或多種細菌菌種的生長。在一些情況下，所述抗細菌劑可以是廣譜抗細菌劑；或者在其他情況下，所述抗細菌劑可以是僅靶向特定細菌菌種的特定抗細菌劑(例如，表2或表13所示者)：所述抗細菌劑可以是短多核苷酸，例如小抑制性RNA、微RNA、微小RNA、lncRNA或反義寡核苷酸，其能夠特異性地靶向一或多種預定的細菌菌種而不顯著影響其他密切相關的細菌菌種。
在其他情況下，所述第一組合物可以是一種組合物(例如，經處理的FMT供體糞便材料)，所述組合物包含適當比例和數量的較佳細菌菌種(如，表1或表14所示的一或多種細菌菌種)以及僅靶向特定細菌菌種的特定抗細菌劑(例如，表2或表13中指定者)。所述第一組合物根據對患者的預期遞送手段，例如通過口服攝入、鼻腔遞送或直腸沉積而進行配製和包裝。
在一些情況下，所述第二組合物可包含足夠量或有效量的有效治療ASD的治療劑，例如抗精神病藥或抗抑鬱藥。所述組合物被配製成用於益生菌或治療劑的預期遞送方法，例如通過注射(靜脈內、腹膜內、肌內或皮下注射)或通過口服/鼻腔施用或通過局部沉積(例如栓劑)。
所述第一組合物和第二組合物通常分別保存在套組的兩個不同容器中。在一些情況下，可以將用於增加某些細菌菌種(如表1或表14所示的一或多種細菌菌種)的水平的組合物及用於阻抑其他細菌菌種(例如表2或表13所示的一或多種細菌菌種)的組合物組合，以形成用於一起施用至患者的單一組合物，例如通過口服或局部遞送。在一些情況下，所述第一組合物和第二組合物可以組合在單一組合物中，使得它們可以例如通過口服或局部遞送同時施用至患者。
此外，提供用於定量檢測一或多種細菌菌種(如表1、表2、表13和表14所示的細菌菌種)的套組。所述套組包含用於定量檢測每種細菌菌種的試劑，例如此類試劑可包含用於擴增(如PCR，尤其是定量PCR)多核苷酸序列的一組寡核苷酸引子，所述多核苷酸序列來源於相關細菌菌種(如表1至3所示的任一種或多種細菌菌種)，尤其是表1、表2、表13和表14所示者的每一種，並且較佳為以上細菌菌種所特有的。
另外，本發明提供用於評估兒童的生長或發育年齡及用於促進或增強兒童的生長或發育的套組和組合物。通常，用於確定兒童發育年齡的套組包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有用於檢測表8或表9所示的第一細菌菌種的第一試劑，且所述第二容器含有用於檢測表8或表9所示的第二細菌菌種(不同於第一細菌菌種)的第二試劑。例如，所述套組可包含三個或更多個容器，所述容器的每一者含有用於檢測表8或表9所示的不同細菌菌種的試劑。作為另一個實例，所述套組可包含兩個或更多個容器，所述容器的每一者含有用於檢測不同細菌菌種的試劑，所述細菌菌種選自以下組中的任一種：(1)格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌和堅硬棒桿菌；(2)格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31和哈氏梭菌；(3)格氏鏈球菌、鳥腸球菌和真桿菌_3_1_31；或(4)格氏鏈球菌和鳥腸球菌。包含在用於檢測預選的細菌菌種的套組中的試劑可包含用於擴增多核苷酸序列的一組寡核苷酸引子，所述多核苷酸序列來自細菌菌種(並且較佳地是特有的)，例如表8或表9所示的任一種細菌菌種。常用的擴增方法是PCR，如定量PCR(qPCR)。
用於通過向兒童施用有效量的選自表8的一或多種細菌菌種來促進兒童(例如，約3歲至約6歲的生物學或出生年齡的兒童)生長發育的套組通常包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一組合物，所述第一組合物包含(i)有效量的表8所示一種細菌菌種，且所述第二容器含有第二組合物，所述第二組合物包含(i)有效量的表8所示的另一種細菌(且與第一種不同)菌種。在示例性實施方案中，所述第一和/或第二組合物可以是或包含用於FMT的經處理的供體糞便材料。所述第一組合物和第二組合物中任一種或兩種可以被配製用於口服施用，例如用於FMT過程中。除了活性組分之外，本文描述的所有組合物還可含有一或多種生理學上可接受的賦形劑或載體。 實 施例
以下實施例僅通過說明的方式，而不是通過限制的方式提供。本領域技術人員將容易地認識到可以改變或修改多種非關鍵參數以產生基本相同或類似的結果。 實 施例 I ： ADS 和正常 兒 童 中的 腸 道 細 菌 譜背景
本申請案的發明人通過比較自閉症兒童的胃腸道中存在的細菌菌種的分佈與發育正常兒童的胃腸道中存在的細菌菌種的分佈，研究由於自閉症譜系障礙(ASD)的存在或風險引起的腸道微生物群的變化。已經發現在自閉症兒童中以降低的水平或相對豐度存在的細菌菌種(例如，表1所示的任一種)及已經發現在自閉症兒童中以升高的水平或相對豐度存在的細菌菌種(例如，表2所示的任一種)可以被定量地測量以評估個體以後發生ASD的風險。另一方面，可以對這些細菌菌種的水平或相對豐度進行調節，以便通過減輕ASD症狀的一些來治療ASD。 方法 群 組 描述和研究 個體
總共招募128名中國兒童(年齡為3-6歲)，其包括64名患有自閉症譜系障礙的兒童和64名正常發育兒童。男性(83%)多於女性。大多數病例在大約3歲時被診斷為ASD。該研究由聯合香港中文大學新界東聯網臨床研究倫理委員會(The JointCUHK-NTEC CREC, CREC Ref. No: 2016.607)批准。所有個體都同意捐贈糞便樣品並進行問卷調查，其中獲得書面知情同意。來自研究個體的糞便樣品儲存在-80℃，用於下游微生物組分析。包括由兒科醫生或臨床心理學家根據第四版或第五版的《精神疾病診斷和統計手冊》(DSM-IV或DSM-V)標準診斷患有ASD的兒童。沒有ASD、沒有運動和語言發育延遲及沒有由他們的父母報告的行為延遲的兒童和沒有一級親屬患有ASD的兒童被包括作為正常發育兒童。 糞 便 DNA 提取和 DNA 定 序
通過經修改以提高DNA產量的Maxwell ®RSC PureFood GMO and Authentication Kit(Promega)提取糞便細菌DNA。將每個糞便樣品約100mg進行預處理：將糞便樣品懸浮在1ml ddH 2O中，並通過以13,000×g離心1分鐘(min)沉澱。向洗滌的樣品中加入800ul TE緩衝液(pH7.5)、16ul β-巰基乙醇和250U裂解酶，充分混合並在37℃下裂解90分鐘。以13,000×g離心3分鐘進行沉澱。
預處理後，將沉澱物重懸在800μl CTAB緩衝液(Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit，按照製造商的說明)中並充分混合。將樣品在95℃下加熱5分鐘並冷卻後，通過在2850rpm下用0.5mm和0.1mm珠粒渦旋15分鐘從樣品中釋放核酸。隨後，加入40ul蛋白酶K和20ul RNase A，並在70℃下裂解核酸10分鐘。最後，在以13,000×g，離心5分鐘後獲得上清液，並將其置於用於DNA提取的Maxwell® RSC儀器中。提取的糞便DNA經由Ilumina Novaseq 6000(Novogene, Beijing, China)用於超深總體基因組定序。 原始序列的 質 量控制
首先通過Trimmomatic 1(v0.38)修剪原始序列讀取，然後將非人類讀取與污染物宿主讀取分離。進行以下一些步驟獲得乾淨的讀取：1)去除連接蛋白；2)用4鹼基寬的滑動窗口掃描讀取，當每鹼基的平均質量降至20以下時去除讀取；3)將讀取長度降至50個鹼基以下。通過KneadData(v0.7.2)將修剪的序列讀取映射到人類基因組(參考數據庫：GRCh38 p12)以去除源自宿主的讀數。將配對末端兩個讀取連接在一起。 細 菌 微生物 組 的 分析
經由MetaPhlAn2(v2.7.5) 2對總體基因組修剪的讀取進行細菌群落組成的分析。通過Bowtie2(v2.3.4.3) 3完成將讀取映射到進化枝特異性標誌物基因和菌種泛基因組(pangenomes)的注釋。輸出表含有從界到菌株水平的不同水平的細菌菌種及其相對豐度。使用tidyverse (v1.2.1) 4、ggpubr(v0.2, 網址:github.com/kassambara/ggpubr)和phyloseq (v1.24.2) 5在R v3.6.1中分析所得數據。經由線性判別分析效應大小(LEfSe)分析 6，比較患有自閉症譜系障礙(ASD)的兒童與正常發育兒童之間的人類腸道細菌組成並定義有差別的細菌菌種。 機 器 學習 模型
使用糞便微生物(由於其具有利用二元特徵進行分類的優越性能)，選擇隨機森林(RF)來建立ASD對比正常發育兒童預測模型。隨機森林 7是總體基因組數據分析中最流行的方法之一，以鑑定區別特徵和構建預測模型。作為廣泛使用的集成學習算法，隨機森林由一系列分類和回歸樹(CART)組成，以形成強的分類器。從具有替換的原始數據集中隨機抽樣的數據的子集被稱為自助抽樣，用於構建樹。當通過自助法繪製當前樹的訓練數據集時，從總體數據集中省略
Figure 02_image001
觀察。在無窮大的N的情況下，有36.8%的數據未出現在稱為袋外(OOB)觀察的訓練樣品中，這些數據將不會用於構造樹。另外，當每個決策樹基於從總體特徵中選擇的特徵的隨機子集分割節點時，將額外的隨機性引入到隨機森林。將具有最小基尼(Gini)(基尼用於評價節點的純度)的特徵用於在每次迭代中分割節點以生成樹。對於不同的數據和特徵子集，該算法能夠訓練不同的樹並通過對來自樹模型的結果進行平均來獲得最終分類。除了預測模型之外，隨機森林還具有評估變量重要性的能力 8。OOB觀察用於估計森林中每個樹的分類誤差。為測量給定變量的重要性，隨機改變OOB數據中變量的值，然後改變的OOB數據被用於生成新的預測。將改變的與原始的OOB觀察之間的誤差率之差除以標準誤差計算為變量的重要性。為對新樣品進行分類，將樣品的特徵向下傳遞到每個樹以估計分類的概率。隨機森林使用所有樹的平均概率來確定分類的最終結果。
包括總計64名患有ASD患者的兒童和64名正常發育兒童作為用於建模的發現群組。通過遞歸特徵消除來評價每個菌種對分類模型的重要值。如果其與模型中任何已經存在的探針的皮爾森(Pearson)相關值＜0.7，根據遞減的重要值，將所選菌種逐個添加到隨機森林模型中。每次向模型添加新特徵時，使用10倍交叉驗證重新評價模型的性能。這些模型根據二元分類器與接受者操作特性(ROC)曲線中的曲線下面積(AUC)進行比較。當達到最佳精度和kappa時選擇最終模型。使用R包randomForest v4.6-14 7和pROC v1.15.3 9進行這些分析。 結果 腸 道 細 菌 譜 在自 閉 症 譜 系障 礙兒 童 與 正常 發 育 兒 童之 間 是不同的
利用LEfSe分析，發現與患有ASD的兒童相比，菌種普氏棲糞桿菌、食葡糖羅斯拜瑞氏菌( Roseburia inulinivorans)、霍氏真桿菌( Eubacterium hallii)、長鏈多爾氏菌( Dorea longicatena)、惰性真桿菌( Eubacterium siraeum) (圖1，表1)以較高的相對豐度存在。相比之下，與正常發育兒童相比，在患有ASD的兒童中富集菌種系結梭菌( Clostridium nexile)、微好氣戴阿利斯特菌( Dialister invisus)、鮑氏梭菌( Clostridium bolteae)、共生梭菌( Clostridium symbiosum)、黏液真桿菌( Eubacterium limosum)、細菌梭菌 _1_7_47FAA( Clostridiales bacterium_1_7_47FAA)、梨狀史雷克氏菌( Slackia piriformis) 、韋榮球菌科細菌_6_1_45 ( Erysipelotrichaceae_bacterium_6_1_45) 、多枝梭菌( Clostridium ramosum)、人腸道厭氧棒狀菌、奇特龍梭菌( Clostridium citroniae)、隱紋條另枝菌( Alistipes indistinctus) (圖1，表2)。
Figure 02_image003
Figure 02_image005
表1和表2列出的細菌可以不同的組合使用以確定ASD的風險。例如，可使用一組qPCR引子或通過總體基因組定序來測定相對豐度以計算風險。
此外，表1列出的細菌可以施用至患有ASD或處於發展ASD風險的兒童以改善ASD的症狀或降低以後發生ASD的風險。相反地，對患有ASD或處於發生ASD風險的兒童，可靶向表2列出的細菌進行阻抑以改善ASD的症狀或降低以後發生ASD的風險。 用於 預測 ASD 的 機 器 學習 模型
在機器學習模型中使用5種細菌標誌物，其包括隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌及寡醱酵鏈球菌(表3)。使用這5種標誌物的最終模型在接受者操作特性(ROC)曲線中具有79.1%的曲線下面積(AUC)(圖2)。
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為確定個體中ASD的風險，將進行以下步驟： (1)通過測定選自表3的菌種在正常發育兒童和患有ASD的患者的群組中的相對豐度來獲得一組訓練數據。 (2)測定這些菌種在個體中的相對豐度，所述個體由於其ASD的風險而正在進行測試。 (3)使用隨機森林模型將個體中這些菌種的相對豐度與訓練數據進行比較。 (4)決策樹將由訓練數據通過隨機森林生成。相對豐度將沿著決策樹運行並生成風險評分。如果模型中至少50%的樹認為兒童患有自閉症，則被測試的兒童被認為具有增加的ASD風險。如果在模型中小於50%的樹認為兒童正常發育，則被測試的兒童被認為不具有增加的ASD風險。
在執行以上步驟(1)時，選自表3的細菌菌種應包括(a)隱紋條另枝菌(前1種菌種；AUC：61.6%；圖2)；(b)隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c和脊鏈球菌(前3種菌種; AUC: 74.4%; 圖2)；或(c)隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌和寡醱酵鏈球菌(所有5種菌種；AUC 79.1%；圖2)。 研究1
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定來自64名患有ASD的兒童和64名正常發育兒童的表3列出的5種菌種的相對豐度(表4中列出的相對豐度)。決策樹由表4的數據通過隨機森林生成，參數為：樹=801，mtry=2。
確定3歲兒童的ASD風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法測定表3列出的5種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度(表5)。相對豐度沿著決策樹運行並生成風險評分。兒童的評分為0.78(圖3a)，因此該兒童被認為處於ASD風險中。 研究2
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定來自64名患有ASD的兒童和64名正常發育兒童的選自表3的隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c及脊鏈球菌的相對豐度(表4中列出的相對豐度)。決策樹由表4的數據通過隨機森林生成，參數為：樹=801，mtry=2。
確定3歲兒童的ASD風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法測定以上3種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度(表5)。相對豐度沿著決策樹運行並生成風險評分。兒童的評分為0.833(圖3b)，因此該兒童被認為處於ASD風險中。 研究3
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定來自64名患有ASD的兒童和64名正常發育兒童的表3列出的5種菌種的相對豐度(表4中列出的相對豐度)。決策樹由表4的數據通過隨機森林生成，參數為：樹=801，mtry=2。
確定20歲女性個體的ASD風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法測定表3列出的5種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度(表6)。相對豐度沿著決策樹運行並生成風險評分。兒童的評分為0.77(圖4a)，因此該個體被認為處於ASD風險中。該個體自2020年起被診斷患有ASD。 研究4
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定來自64名患有ASD的兒童和64名正常發育兒童的選自表3的隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c及脊鏈球菌的相對豐度(表4中列出的相對豐度)。決策樹由表4的數據通過隨機森林生成，參數為：樹=801，mtry=2。
確定20歲女性的ASD風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法測定以上3種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度(表6)。相對豐度沿著決策樹運行並生成風險評分。兒童的評分為0.79(圖4b)，因此該個體被認為處於ASD風險中。該個體自2020年起被診斷患有ASD。
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參考文獻
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實 施例 II ：微生物 組確 定 的自 閉 症方法 群 組 描述和研究 個體
招募ASD(n=8)和正常發育(TD)兒童(n=10)的獨立驗證群組以驗證實施例I(第1部分)中描述的機器學習模型。如實施例I(第1部分)，使用表3列出的5種菌種生成機器學習模型。簡言之，通過如第1部分的方法所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定來自64名患有ASD的兒童和64名TD兒童的表3列出的5種菌種的相對豐度(所得相對豐度列於表4)。決策樹由表4的數據通過隨機森林生成，參數：樹=801，mtry=2。
使用由64名ASD兒童和64名TD兒童生成的該機器學習模型來確定驗證群組中18名兒童的每一名兒童的ASD風險。通過如第1部分的方法所述的總體基因組定序和指定的分類法測定5種菌種在來自驗證群組的糞便樣品的相對豐度。所得相對豐度列於表7。這些相對豐度沿著決策樹運行並生成風險評分。該模型顯示在驗證群組中區分ASD和TD的AUC為0.762(圖5)。ASD和TD兒童的平均風險評分分別為0.76和0.43(圖6)。
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實 施例 III ：微生物 組確 定 的生 長 / 發 育年 齡方法 群 組 描述和研究 個體
總共招募64名正常發育兒童(年齡為3-6歲)。男性(84%)多於女性。該研究由聯合香港中文大學新界東聯網臨床研究倫理委員會(The Joint CUHK-NTEC CREC, CREC Ref. No: 2016.607)批准。所有個體都同意捐贈糞便樣品並進行問卷調查，其中獲得書面知情同意。來自研究個體的糞便樣品儲存在-80℃，用於下游微生物組分析。沒有ASD、沒有運動和語言發育延遲及沒有由他們的父母報告的行為延遲的兒童和沒有一級親屬患有ASD的兒童被包括作為正常發育兒童。 糞 便 DNA 提取和 DNA 定 序
通過經修改以提高DNA產量的Maxwell ®RSC PureFood GMO and Authentication Kit(Promega)提取糞便細菌DNA。將每個糞便樣品約100mg進行預處理：將糞便樣品懸浮在1ml ddH 2O中，並通過以13,000×g離心1min沉澱。向洗滌的樣品加入800ul TE緩衝液(pH7.5)、16ul β-巰基乙醇和250U裂解酶，充分混合並在37℃下裂解90分鐘。以13,000×g離心3分鐘進行沉澱。
預處理後，將沉澱物重懸在800μl CTAB緩衝液(Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit，按照製造商的說明)中並充分混合。將樣品在95℃下加熱5分鐘並冷卻後，通過在2850 rpm下用0.5mm和0.1mm珠粒渦旋15分鐘從樣品中釋放核酸。隨後，加入40ul蛋白酶K和20ul RNase A，並在70℃下裂解核酸10分鐘。最後，在以13,000×g，離心5分鐘後獲得上清液，並將其置於用於DNA提取的Maxwell® RSC儀器中。提取的糞便DNA經由Ilumina Novaseq 6000(Novogene, Beijing, China)用於超深總體基因組定序。 原始序列的 質 量控制
首先通過Trimmomatic 1(v0.38)修剪原始序列讀取，然後將非人類讀取與污染物宿主讀取分離。獲得乾淨的讀取有以下一些步驟：1)去除連接蛋白；2)用4鹼基寬的滑動窗口掃描讀取，當每鹼基的平均質量降至20以下時去除讀取；3)將讀取長度降至50個鹼基以下。通過KneadData(v0.7.2)將修剪的序列讀取映射到人類基因組(參考數據庫：GRCh38 p12)以去除源自宿主的讀數。將配對末端兩個讀取連接在一起。 細 菌微生物 組 的分析
經由MetaPhlAn2(v2.7.5) 2對總體基因組修剪的讀取進行細菌群落組成的分析。通過Bowtie2(v2.3.4.3) 3完成將讀取映射到進化枝特異性標誌物基因和菌種泛基因組(pangenomes)的注釋。輸出表含有從界到菌株水平的不同水平的細菌菌種及其相對豐度。經由R中的psych包(1.9.12.31)通過斯皮爾曼相關性分析進行的細菌菌種與實齡相關性。 機 器 學習 模型
使用來自64名正常發育兒童的糞便微生物，選擇隨機森林(RF)來建立微生物群年齡預測模型(由於其具有利用回歸學習方法進行均值預測的優越性能)。隨機森林 7是總體基因組數據分析中最流行的方法之一，以鑑定區別特徵和構建預測模型。作為廣泛使用的集成學習算法，隨機森林由一系列分類和回歸樹(CART)組成，以形成強的均值預測。從具有替換的原始數據集中隨機抽樣的數據的子集被稱為自助抽樣，用於構建樹。在當前樹的訓練數據集由模型投票或求平均值繪製成單個集成模型(該模型最終勝過任何單獨決策樹的輸出)時，自助法
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觀測從總體數據集中省略。在無窮大的N的情況下，有36.8%的數據未出現在稱為袋外(OOB)觀測的訓練樣品中，這些數據將不會用於構建樹。另外，當每個決策樹基於從總體特徵中選擇的特徵的隨機子集分割節點時，將額外的隨機性引入到隨機森林。具有較高%IncMSE(均方誤差增加(%))的特徵表示在預測模型中具有更大貢獻的特徵。對於不同的數據和特徵子集，該算法能夠訓練不同的樹並通過對來自樹模型的結果進行平均來獲得最終結果。除了預測模型之外，隨機森林還具有評估變量重要性的能力 8。為獲得單個OOB觀測的單個預測，可對這些預測的反應進行平均。為測量給定變量的重要性，隨機改變OOB數據中變量的值，然後改變的OOB數據被用於生成新的預測。將改變的與原始的OOB觀測之間的誤差率之差除以標準誤差計算為%IncMSE(用袋外估計的)，即變量的重要性。為預測新樣品，將樣品的特徵向下傳遞到每個樹以估計平均值。隨機森林使用所有樹的平均概率來確定最終結果。
包括總計64名正常發育兒童作為用於建模的發現群組(discovery cohort)。通過遞歸特徵消除來評價每個菌種對回歸模型的重要值。根據遞減的重要值，選擇前5種細菌分類群來構建模型。使用R包randomForest v4.6-14 7進行分析。 結果 腸 道 細 菌菌種 與 正常 發 育 兒 童 的 實齡 相 關
為評估細菌菌種與兒童實齡之間的相關性，計算這2種因素之間的斯皮爾曼相關性係數。確定所有成對比較的統計顯著性。存在正相關(相對豐度隨年齡增加)和負相關(相對豐度隨年齡減少)。在下表中僅顯示絕對係數＞0.2的統計顯著相關性。例如，隨著兒童年齡的增長，菌種多形擬桿菌( Bacteroides thetaiotaomicron)顯著增加。當兒童具有豐富的富含碳水化合物的飲食時，多形擬桿菌能夠幫助兒童代謝多種多樣的多糖。
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因此，表8列出的細菌可以不同的組合來構建評估模型，以確定兒童的生長發育年齡及是否需要微生物組恢復治療或補充。可使用一組qPCR引子或通過總體基因組定序來測定相對豐度，以確定腸道微生物群的發育。
此外，表8列出的具有正相關係數(斯皮爾曼相關性係數)的細菌可補充給兒童以支持兒童的生長發育。相對豐度應增加到高於或等於表8列出的正常發育兒童的平均相對豐度的水平。 使用 機 器 學習 模型 確 定 生 長發 育年 齡
通過回歸隨機森林分析，發現菌種格氏鏈球菌 、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌及堅硬棒桿菌(圖7，表9)是正常發育兒童中前5種最重要的預測變量。所述5種細菌分類群用於建立機器學習模型以預測微生物群的年齡。從數據計算% IncMSE。在隨機森林建模中使用的變量的重要性，其指示當隨機排列給定變量時均方誤差的增加。使用這5種標誌物的最終模型具有r均方(r-squared)(0.85)(圖8)。
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因此，為確定兒童生長和發育延遲的風險，將進行以下步驟： 1. 通過測定選自表9*的菌種在正常發育兒童的群組中的相對豐度來獲得一組訓練數據。 2. 測定這些菌種在其生長發育延遲風險待被確定的兒童中的相對豐度。 3. 使用隨機森林模型將個體中這些菌種的相對豐度與訓練數據進行比較。 4. 決策樹將由訓練數據通過隨機森林生成。相對豐度將沿著決策樹運行並生成對應於預測的生長發育年齡的均值預測。如果預測的生長發育年齡低於兒童的實齡，則兒童處於生長和發育延遲的風險中。 *選自表9的菌種可包含： 1. 5種細菌菌種(格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌、堅硬棒桿菌；圖8)， 2. 4種菌種(格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌；圖9)， 3. 3種菌種(格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31；圖10)， 4. 2種菌種(格氏鏈球菌和鳥腸球菌；圖11)，或 5. 1種菌種(格氏鏈球菌；圖12)。 研究1
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定來自64名正常發育兒童的表9列出的5種菌種(格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌、堅硬棒桿菌)。決策樹由表10的數據通過隨機森林生成，參數為：ntree=10000，接近性=TRUE，重要性=TRUE，nPerm=10。
確定3歲兒童的生長發育延遲的風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定以上5種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度。相對豐度沿著決策樹運行並生成預測的生長發育年齡。該兒童的預測年齡為48.3個月(圖8)。該兒童被認為具有低的生長發育延遲風險。 研究2
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定來自64名正常發育兒童的表9列出的4種菌種(格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌)。決策樹由表10的數據通過隨機森林生成，參數為：ntree= 10000，接近性=TRUE，重要性=TRUE，nPerm=10。
確定3歲兒童的生長發育延遲的風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定以上4種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度。相對豐度沿著決策樹運行並生成預測的生長發育年齡。該兒童預測的微生物群年齡為48.3個月(圖9)。該兒童被認為具有低的生長發育延遲風險。 研究3
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定來自64名正常發育兒童的表9列出的3種菌種(格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31)。決策樹由表10的數據通過隨機森林生成，參數為：ntree=10000，接近性=TRUE，重要性=TRUE，nPerm=10。
確定3歲兒童的生長發育延遲的風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定以上3種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度。相對豐度沿著決策樹運行並生成預測的生長發育年齡。該兒童的預測年齡為52.6個月(圖10)。該兒童被認為具有低的生長發育延遲風險。 研究4
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定格氏鏈球菌和鳥腸球菌在64名正常發育兒童的相對豐度(表10所列的相對豐度)。決策樹由表10的數據通過隨機森林生成，參數為：ntree=10000，接近性=TRUE，重要性=TRUE，nPerm=10。
確定3歲兒童的生長發育延遲的風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定以上2種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度。相對豐度沿著決策樹運行並生成預測的生長發育年齡。該兒童的預測年齡為53.2個月(圖11)。該兒童被認為具有低的生長發育延遲風險。 研究5
通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定格氏鏈球菌在64名正常發育兒童的相對豐度(表10所列的相對豐度)。決策樹由表10的數據通過隨機森林生成，參數為：ntree=10000，接近性=TRUE，重要性=TRUE，nPerm=10。
確定3歲兒童的生長發育延遲的風險。通過如方法中所述的總體基因組定序和指定的分類法來測定上述1種菌種在該兒童的糞便樣品的相對豐度。相對豐度沿著決策樹運行並生成預測的生長發育年齡。該兒童的預測年齡為64.9個月(圖12)。該兒童被認為具有低的生長發育延遲風險。
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ASD 和年 齡對兒 童 腸 道 微生物 組 具有 最 顯 著 的影 響
在香港招募年齡為3至6歲的中國兒童(64名ASD兒童對比64名TD兒童)，並檢查宿主因素對兒童糞便微生物組組態的影響。在檢查的宿主因素中，ASD、實齡和身體質量指數(BMI)對根據效應大小排名的糞便微生物組顯示最顯著的影響(圖13A，PERMANOVA)。ASD和年齡對改變的腸道微生物組的影響單獨獨立於其他宿主因素(圖18A)。為進一步探索宿主因素如何影響微生物組組成，詢問單獨宿主因素與細菌菌種之間的相關性。鑑定111種細菌菌種與ASD、實齡、BMI、母乳餵養的持續時間、體重、身高、飲食評分(食物頻率)、性別、胎齡和分娩方式顯著相關(所有FDR調整P值＜ 0.05，斯皮爾曼和肯德爾相關值＞ 0.2或＜ -0.2，圖13B至C)。菌種普氏棲糞桿菌和解木聚糖擬桿菌的豐度與兒童的實齡正相關，而菌種鳥腸球菌、格氏鏈球菌和前庭鏈球菌與兒童的實齡負相關(圖13B)。菌種隱紋條另枝菌、候選TM7b、TM7c、黏液真桿菌和脊鏈球菌與ASD正相關(與TD兒童相比，ASD兒童的豐度顯著較高，圖13C)。經由剖腹產分娩的兒童顯示與糞副擬桿菌相關，與通過陰道分娩出生的兒童相比，經由剖腹產分娩的兒童的糞副擬桿菌顯著減少，並且在兩種分娩模式中，在ASD中的分類群減少(圖18B)。總之，這些數據表明，宿主因素在塑造兒童腸道微生物群中具有顯著的影響；其中，ASD、實齡、BMI在微生物組變異中具有強的效應大小。 將糞 便 細 菌 菌種 鑑 定 為 ASD 的 潛 在生物 標誌 物
與TD兒童相比，患有ASD的兒童的腸道微生物組組成在多種分類水平上發生改變。患有ASD的兒童的微生物組豐富度高於年齡和BMI匹配的TD兒童(BMI：分別為15.31±1.87對比15.38±1.42)(t檢驗，p值=0.021，圖14A)。在患有ASD的兒童中，組內細菌豐富度的個體差異也更高(在ASD對比TD中，分別為54.0[47.0-59.3]對比51.0[46.8-54.0])。在組成水平上，患有ASD的兒童和TD兒童中的腸道微生物組結構顯著不同，如通過在主坐標分析(PCoA)圖中的不同聚類和分離所示(圖14B，t-檢驗，p=0.0390和0.0136，基於在兩個PCoA軸上呈現的Bray-Curtis差異)。另外，患有ASD的兒童的腸道微生物組比TD兒童更混雜(圖14B)。
在屬水平上，梭菌屬和糞芽孢菌屬在患有ASD的兒童中大量富集(圖19A，Kruskal-Wallis檢驗，p值分別為0.032和0.022)，然而與TD兒童相比，已知產生丁酸鹽的糞桿菌屬(Machiels等人, Gut63(8): 1275-1283, 2014)在患有ASD的兒童中顯著降低(圖19A，Kruskal-Wallis檢驗，p值=0.013)。在種水平上，患有ASD的兒童和TD兒童之間有五種細菌菌種不同，包括隱紋條另枝菌、候選分支TM分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌和寡醱酵鏈球菌(通過隨機森林經由10倍交叉驗證而鑑定，圖14C)。基於5種潛在的菌種標誌物，隨機森林模型顯示在發現集中區分ASD與TD的曲線下面積(AUC)值為80.3%。在獨立驗證集(10名TD兒童和8名患有ASD的兒童)中，相同模型的AUC達到76.2%(圖14D)。與TD相比，預測兒童患有ASD的隨機生成的決策樹的概率增加(圖19B)。 腸 道 細 菌 - 細 菌生 態網絡 在患有 ASD 的 兒 童中 受 損
接下來通過評價細菌菌種之間的斯皮爾曼相關性來評估ASD與TD組的腸道中細菌-細菌的生態相互作用。ASD和TD兒童中的大多數細菌-細菌相關性為正相關(圖15)。與TD兒童中的稀疏相關網絡相比，在ASD組中觀察到更強的相關網絡，如通過兩者數量(671對比368)所示，並且與TD相比，顯著的細菌-細菌相關性的相關係數在ASD的腸道微生物群落中較高(圖15，p值＜0.05，|相關係數|＞0.5)。在TD兒童中，來自厚壁菌門的細菌顯示出最多的種間相互作用，然而來自擬細菌門的菌種在ASD的生態網絡中顯示出穩健的細菌-細菌相關性(圖15)。特別地，充當機會致病菌的不解糖卟啉單胞菌( Porphyromonas asaccharolytica)的相關性在ASD兒童中加強。腸道微生物組生態網絡中的這種變化表明種間交流/相互作用在ASD兒童的腸道中顯著改變。 與 神 經傳遞物 生物合成相 關 的途 徑 在 ASD 的 腸 道微生物 組 中 減 少
為理解與ASD的組成變化相關的腸道微生物組功能的變化，使用HUMAnN2對組成功能模組(基因家族)的基因豐度進行分析(Franzosa等人, Nature methods15(11): 962-968, 2018)。在ASD兒童中，必需胺基酸生物合成(L-蘇胺酸、L-異亮胺酸、L-亮胺酸、L-纈胺酸)、葡萄糖代謝、核苷酸生物合成和維生素B生物合成的途徑顯著減少(圖20A)。重要的是，其中與TD相比，與神經傳遞物生物合成相關的途徑在ASD的腸道微生物組中減少(圖16A)。與TD組相比，在ASD組的腸道微生物組中，涉及分支酸(色胺酸生物合成的前體)生物合成的途徑ARO-PWY和PWY-6163顯著減少(FDR校正的p值＜0.05，圖16A)。伴隨地，對應於芳香族胺基酸(包括L-色胺酸、L-苯丙胺酸、L-酪胺酸)的生物合成的COMPLETE-ARO-PWY功能也在ASD中降低(圖16A)，所述生物合成全部從主要的共同前體分支酸開始(Pittard和Yang, EcoSal Plus3(1), 2008)。色胺酸是代謝物犬尿胺酸和血清素的關鍵前體，彼等都是與對抗抑鬱症和其他精神病症有關的關鍵神經傳遞物(Vaswani等人, Progress in neuro-psychopharmacology and biological psychiatry27(1): 85-102, 2003)。另外，在患有ASD的兒童的糞便微生物組中甘胺酸(抑制性神經傳遞物)生物合成的途徑被耗損(圖16A)。總體而言，神經傳遞物能夠使信號傳輸穿過突觸而到神經細胞，其中突觸功能障礙被認為關鍵地促成ASD的病理生理(Zoghbi和Bear (2012), "Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities." Cold Spring Harbor perspectives in biology4(3): a009886)。因此，ASD微生物組的功能中這些途徑的變化，特別是色胺酸和甘胺酸的合成代謝/代謝的變化，可能導致異常的神經傳遞物合成，從而傳遞給宿主。菌種瘤胃球菌 5_1_39BFAA( Ruminococcus sp. 5_1_39BFAA) 、直腸真桿菌( Eubacterium rectale)和布氏瘤胃球菌( Ruminococcus bromii)、普氏棲糞桿菌分別是L-色胺酸和甘胺酸生物合成的主要貢獻者(圖16B-C)。值得注意的是，與TD兒童相比，在患有ASD的兒童中，普氏棲糞桿菌在絲胺酸-甘胺酸代謝途徑的貢獻顯著降低(圖20B)。總之，這些數據表明，與神經傳遞物合成相關的微生物組功能在ASD兒童中顯著降低，這可能對ASD中的精神異常具有深遠的功能後果。
除此之外，與TD兒童相比，ASD兒童中編碼麩胺酸合成酶的微生物基因的豐度也顯著降低(圖20C)。麩胺酸合成酶是一種生產麩胺酸的酶，麩胺酸是脊椎動物神經系統中最豐富的興奮性神經傳遞物(Zhou和Danbolt, Journal of neural transmission121(8): 799-817, 2014)。麩胺酸合成酶編碼基因豐度的紊亂可能對宿主精神反應具有有害作用。
基於研究個體的腸道微生物組功能特徵和臨床參數，本申請案的發明人經由相關性分析探索微生物組功能模組的豐度與宿主因素之間的關係。發現年齡在塑造兒童腸道微生物組的功能中具有最深遠的影響，如通過所檢查的宿主因素中的兒童年齡與微生物功能模組的豐度之間最豐富的關聯所示(30個顯著關聯，P值＜0.05，斯皮爾曼相關值＞0.2或＜-0.2，圖16D)。在這些關聯中，能量代謝相關的微生物功能途徑(糖降解；羧酸鹽降解)隨年齡增加，然而嘌呤核苷酸生物合成途徑隨年齡減少(圖16D)。總體而言，實齡對兒童中腸道微生物組的功能具有總體大的影響。 ASD 中生 長 相 關細 菌 發 展 的畸 變
考慮到宿主實齡對腸道微生物組的組成和功能的影響，假設在健康兒童中觀察到的年齡相關細菌可能在ASD兒童的腸道中異常發展。在TD兒童中鑑定年齡有差別的分類群，隨後在ASD兒童中研究它們的豐度與年齡的關聯。經由隨機森林利用5次10倍交叉驗證，糞便細菌菌種的相對豐度針對在糞便樣品收集時TD兒童的實齡回歸。因此，識別出26種年齡有差別的細菌菌種，作為兒童腸道微生物群隨年齡“正常”發展的代表(圖17A和圖17B，左圖)。與在TD兒童中觀察到的具有兒童實齡的年齡有差別的細菌分類群的逐漸發展模式(圖17B，左圖)相反，這些年齡有差別的細菌分類群的豐度和模式在ASD兒童中基本上被破壞，變得與年齡無關(圖17B，右圖)。例如，在TD兒童中，菌種黏液真桿菌和短雙岐桿菌( Bifidobacterium breve)的相對豐度隨年齡而減少，然而菌種短真桿菌、副流感嗜血桿菌( Haemonphilus parainfluenzae)、解纖維素擬桿菌( Bacteroides cellulosilyticus)和毛螺菌科細菌 3_1_46FAA的豐度隨年齡而增加(圖17B，左圖)。與此結果一致，這些年齡有差別的細菌先前與兒童的健康生長相關(Wong等人, Nutrients11(8): 1724, 2019)。然而，這些菌種的年齡相關模式在患有ASD的兒童中丟失(圖17B，右圖)，表明與年齡匹配的同齡人相比，在ASD兒童的早期生命生長和發育期間腸道微生物群的異常發展。
為驗證發現，本申請案的發明人基於26種年齡有差別的菌種豐度開發作為TD兒童實齡函數的稀疏微生物組-年齡預測模型(圖17C)。在TD兒童中，預測的微生物組-年齡與兒童的實齡成線性增長，說明具有兒童年齡的腸道微生物組的穩定發展前景。然而，當使用在TD兒童中開發的微生物組年齡模型來預測ASD兒童的微生物組年齡時，本申請案的發明人發現ASD兒童的腸道微生物組在與宿主的實齡顯示出發育不足，如針對ASD兒童的實齡模型，在微生物組-年齡中觀察到的斜率比在TD兒童中觀察到的斜率更平穩(線性模型的斜率：分別為0.10對比0.31，圖17C)。這些數據共同表明，與同齡人相比，ASD兒童在童年生長過程中其腸道微生物組發育受損。腸道微生物組與兒童共同進化以形成互惠共生關係，童年時期的異常腸道微生物發展可能對宿主健康具有持久的影響。 參考文獻
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實 施例 IV ：自 閉 症的微生物 標誌 物
自閉症譜系障礙(ASD)是一組複雜的發育障礙，其特徵在於受損的社交互動和溝通及重複行為。本研究的目的是確定患有自閉症的個體的細菌生物標誌物，以及查明自閉症的益生菌/治療性細菌。自閉症兒童與正常發育兒童之間的腸道細菌譜是不同的。腸道微生物群被認為是ASD發展的重要因素。該發現的實際應用包括預測兒童自閉症的風險以及微生物轉移和/或補充作為改善自閉症個體的行為症狀的潛在手段。 方法 群 組 描述和研究 個體
總共招募120名中國兒童(年齡為3至6歲)，61名自閉症譜系障礙兒童和59名正常發育兒童。群組招募的男性(83%)多於女性(17%)，大多數ASD兒童在大約3歲時被診斷為ASD。
該研究由聯合香港中文大學新界東聯網臨床研究倫理委員會(The Joint CUHK-NTEC CREC, CREC Ref. No: 2016.607)批准。所有個體都同意捐贈糞便樣品並進行問卷調查，其中獲得書面知情同意。來自研究個體的糞便樣品儲存在-80℃，用於下游微生物組分析。
將包括由兒科醫生或臨床心理學家根據第四版或第五版的《精神疾病診斷和統計手冊》(DSM-IV或DSM-V)標準診斷患有ASD的兒童的家庭。沒有ASD、沒有運動和語言發育延遲以及沒有由他們的父母報告的行為延遲的兒童和沒有一級親屬患有ASD的兒童被包括作為正常發育兒童。將65個具有中國血統的ASD兒童的家庭和65個具有正常發育兒童的家庭分為2組：病例組和對照組。 糞 便 DNA 提取及 DNA 定 序
通過經修改以提高DNA產量的Maxwell ®RSC PureFood GMO and Authentication Kit(Promega)提取糞便細菌DNA。將每個糞便樣品約100mg進行預處理：將糞便樣品懸浮在1ml ddH 2O中，並通過以13,000×g離心1min沉澱。向洗滌的樣品中加入800ul TE緩衝液(pH7.5)、16ul β-巰基乙醇和250U裂解酶，充分混合並在37℃下裂解90分鐘。以13,000×g離心3分鐘進行沉澱。
預處理後，將沉澱物重懸在800μl CTAB緩衝液(Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit，按照製造商的說明)中並充分混合。將樣品在95℃下加熱5分鐘並冷卻後，通過在2850rpm下用0.5mm和0.1mm珠粒渦旋15分鐘從樣品中釋放核酸。隨後，加入40ul蛋白酶K和20ul RNase A，並在70℃下裂解核酸10分鐘。最後，在以13,000×g，離心5分鐘後獲得上清液，並將其置於用於DNA提取的Maxwell® RSC儀器中。提取的糞便DNA經由Ilumina Novoseq 6000(Novogen, Beijing, China)用於超深總體基因組定序。 原始序列的 質 量控制
首先通過Trimmomatic 1(Trimmomatic-0.36)修剪原始序列讀取，然後將非人類讀取與污染物宿主讀取分離。獲得乾淨的讀取有以下一些步驟：1)去除連接蛋白；2)用4鹼基寬的滑動窗口掃描讀取，當每鹼基的平均質量降至20以下時去除讀取；3)將讀取長度降至50個鹼基以下。通過KneadData(參考數據庫：GRCh38 p12)使用修剪的序列讀取以將非人類讀取與人類讀取分開。將配對末端兩個讀取連接在一起。 細 菌 微生物 組 的 分析
經由MetaPhlAn2(v2.7.5) 2對總體基因組修剪的讀取進行細菌群落組成的分析。通過Bowtie2(v2.3.4.3) 3完成將讀取映射到進化枝特異性標誌物基因和菌種泛基因組的注釋。輸出表含有從界到菌株水平的不同水平的細菌菌種及其相對豐度。 引子和探 針 的 設計
基於細菌16S rRNA基因中的保守片段手動設計用於內部對照的引子和探針序列，然後使用用於測定Tm、GC含量和可能的二級結構的工具PrimerExpress v3.0 (Applied Biosystems)對它們進行測試。在引子和探針中包括簡併位點以增加目標覆蓋率；簡併位點不靠近引子的3’端和探針的5’端。擴增子靶標是相應大腸桿菌基因組的nt 1063-1193。
選擇通過先前的總體基因組定序鑑定的三種細菌標誌物候選物用於qPCR定量，其包括隱紋條另枝菌(Ai)、人腸道厭氧棒狀菌(Ac)和霍氏真桿菌(Eh)。通過總體基因組研究中的AUC值排名來鑑定這些候選物。從MetaPhlAn2數據庫中提取靶向基因標誌物的引子和探針序列。在NCBI中使用Primer-BLAST設計引子，並手動設計探針。引子-探針組特異性地檢測靶標而不是任何其他已知序列，如通過Blast搜索確認。每個探針攜帶5’報告染料FAM(6-羧基螢光素)或VIC(4,7,20-三氯-70-苯基-6-羧基螢光素)和3’淬滅染料TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)。通過BGI合成引子和水解探針。下面列出引子和探針的核苷酸序列。PCR擴增特異性通過PCR產物的直接Sanger定序確認。
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定量 PCR
在用黏合劑封口的MicroAmp快速光學96孔反應板(Applied Biosystems)中，在含有0.3毫莫耳(mmol)/L的每種引子和0.2mmol/L的每種探針的TaqMan通用預混合物II(Applied Biosystems)的20uL反應系統中進行定量PCR(qPCR)擴增。ABI PRISM 7900HT序列檢測系統的熱循環儀參數是95℃，10分鐘以及(95℃ 15秒，60℃ 1分鐘)x45個循環。在每個實驗中包括陽性/參考對照和陰性對照(H2O作為模板)。對每個樣品以一式兩份進行測量。使用Sequence DetectionSoftware (Applied Biosystems)分析qPCR數據，其中對於所有臨床樣品，手動設置閾值=0.05，以及3至15個循環的基線。如果實驗的陰性對照Cq值＜42，則實驗不合格。數據分析是根據∆Cq方法進行的，其中∆Cq=Cq 靶 標-Cq 對 照以及相對豐度=POWER(2,-∆Cq)。 結果和發現 ASD 兒 童 與 正常 發 育 兒 童 之 間腸 道 細 菌分 佈 的差 異
根據分類的性能，菌種隱紋條另枝菌和人腸道厭氧棒狀菌(表13)在患有ASD的兒童中顯示出比正常發育兒童更高的相對豐度。相比之下，與正常發育兒童相比，菌種霍氏真桿菌(表14)在患有ASD的兒童中被耗損。每個單獨的標誌物和組合的性能顯示在表15。圖22顯示組合評分的ROC曲線。對於組合評分，使用邏輯回歸模型計算(組合評分=I1+β1*Ai+β2*Eh+β3*Ac)。在回歸模型中，I代表截距，β代表回歸係數，標誌物代表相應的Cp值。
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這些細菌標誌物可以單獨使用或組合使用以確定個體中發生ASD的風險。可以建立標準對照值(在正常發育兒童中發現的細菌菌種的相對豐度或其組合評分)以提供截止值，以指示被檢查的個體是否具有升高的ASD風險。對於單一標誌物和組合評分，截止值由使約登(Youden)指數(J=靈敏度+特異性-1)最大化的接收者操作特性(ROC)分析來確定。使用非參數方法針對每個方法/每種標誌物進行ROC下面積(AUROC)的成對比較。
例如，該群組中的Ai和Ac的截止值分別為0.000000019和0.000000758。該群組中的組合評分的截止值為0.531(圖22)。具有大於這些截止值的組合值的個體被認為具有較高的ASD風險。Eh的截止值為0.00129794。具有小於或等於該截止值的值的個體被認為具有較高的ASD風險。
在本文中引用的所有專利案、專利申請案和其他出版物(包括GenBank登錄號等)出於所有目的通過引用以其整體併入。
[圖1]：自閉症譜系障礙兒童與正常發育兒童之間的細菌菌種差異。綠色條代表正常發育兒童所富集的菌種，而紅色條代表ASD兒童所富集的菌種。
[圖2]：機器學習模型的接受者操作特性(ROC)曲線和曲線下面積(AUC)。使用前1種標誌物(紅色，底線)-隱紋條另枝菌( Alistipes indistinctus)、前3種標誌物(綠色，中間的線)-隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c和脊鏈球菌、所有5種標誌物(深藍色，頂線)-隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌和寡醱酵鏈球菌的隨機森林模型的AUC。
[圖3]：使用(a)5種標誌物：隱紋條另枝菌( Alistipes indistinctus)、候選分支TM7單細胞分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌和寡醱酵鏈球菌和(b)3種標誌物：隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c和脊鏈球菌之3歲兒童與ASD兒童和正常發育兒童相比的風險評分。
[圖4]：使用(a)5種標誌物：隱紋條另枝菌( Alistipes indistinctus)、候選分支TM7單細胞分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌和寡醱酵鏈球菌和(b)3種標誌物：隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c和脊鏈球菌之20歲女性與ASD兒童和正常發育兒童相比的風險評分。
[圖5]：機器學習模型的接受者操作特性(ROC)曲線和曲線下面積(AUC)。使用所有5種標誌物-隱紋條另枝菌( Alistipes indistinctus)、候選分支TM7單細胞分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌和寡醱酵鏈球菌的隨機森林模型的AUC。
[圖6]：顯示原始群組(64名ASD對比64名正常發育(TD)兒童)和獨立驗證群組(8名ASD對比10名TD兒童)中ASD和TD兒童的平均風險評分的箱形圖。
[圖7]：使用來自64名正常發育個體的糞便微生物作為訓練群組，使用隨機森林回歸來鑑定用於確定生長和發育延遲的風險的細菌菌種。變量重要性的點圖由%IncMSE(均方誤差增加(%))顯示。紅色框表示前5種最重要的細菌菌種。
[圖8]：使用5種細菌標誌物，即格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌及堅硬棒桿菌，通過隨機森林回歸預測3歲兒童的生長發育年齡。紅色三角形表示該3歲兒童的預測生長發育年齡。藍色點表示64名正常發育個體的預測生長發育年齡。
[圖9]：使用4種細菌標誌物，即格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31及哈氏梭菌，通過隨機森林回歸預測3歲兒童的生長發育年齡。紅色三角形表示該3歲兒童的預測生長發育年齡。藍色點表示64名正常發育個體的預測生長發育年齡。
[圖10]：使用3種細菌標誌物，即格氏鏈球菌、鳥腸球菌及真桿菌_3_1_31，通過隨機森林回歸預測3歲兒童的生長發育年齡。紅色三角形表示該3歲兒童的預測生長發育年齡。藍色點表示64名正常發育個體的預測生長發育年齡。
[圖11]：使用2種細菌標誌物，即格氏鏈球菌和鳥腸球菌，通過隨機森林回歸預測3歲兒童的生長發育年齡。紅色三角形表示該3歲兒童的預測生長發育年齡。藍色點表示64名正常發育個體的預測生長發育年齡。
[圖12]：使用1種細菌標誌物，即格氏鏈球菌，通過隨機森林回歸預測3歲兒童的生長發育年齡。紅色三角形表示該3歲兒童的預測生長發育年齡。藍色點表示64名正常發育個體的預測生長發育年齡。
[圖13]：宿主因素影響兒童的腸道微生物組。(a)宿主因素對兒童腸道細菌組變異的效應大小。經由PERMANOVA確定效應大小和統計顯著性。僅顯示顯著的宿主因素，*p＜0.05，**p＜0.01。(B-C)單獨宿主因素與腸道細菌菌種之間的相關性熱圖。分別通過斯皮爾曼(Spearman) (B)和肯德爾(Kendall)(C)相關係數分析來計算相關係數。確定所有成對比較的統計顯著性。僅繪製絕對係數＞0.2的統計顯著相關性。底部條的顏色強度與相關係數成正比，其中藍色表示正相關且黃色表示負相關。
[圖14]：在患有ASD的中國兒童中腸道微生物組的改變。(A)ASD與TD之間糞便細菌豐度的比較。對於箱形圖，箱從第1四分位數延伸到第3四分位數(第25百分位數延伸到第75百分位數)，中位數用水平線描繪。通過t檢驗確定ASD與TD組之間的統計顯著性，*p＜0.05。(B)基於Bray-Curtis相異度的ASD與TD組中細菌群落組成的主坐標分析(PCOA)，通過t檢驗確定統計顯著性，*p＜0.05。(C)ASD與TD之間5種細菌菌種的相對豐度的比較。通過隨機森林和10倍交叉驗證鑑定5種細菌菌種標誌物。(D)用於ASD對比TD微生物組分類的隨機森林分類器性能。接受者操作特性(ROC)曲線描繪當分類嚴格度變化時RF分類器真陽性率與假陽性率之間的權衡。以紅色、藍色和綠色給出所表示的訓練集、測試集和驗證集的AUC值。
[圖15]：患有ASD的兒童對比TD兒童的腸道細菌-細菌生態網絡。分別在ASD和TD中菌種水平的細菌與細菌之間的相關性。通過斯皮爾曼(Spearman)相關性分析計算分類群之間的相關性。確定所有成對比較的統計顯著性。僅繪製|相關係數|＞0.5的統計上顯著相關性。相關網絡通過 Cytoscape(3.8.1)可視化。對應於單個微生物菌種的節點大小與顯著菌種間連接的數量成正比。節點的顏色指示相應微生物菌種所屬的門。連接線的顏色強度與相關係數成正比，其中藍色線表示負相關且紅色線表示正相關。
[圖16]：ASD中腸道微生物組的功能改變。(A)在ASD對比TD中與神經傳遞物生物合成相關的途徑的豐度。通過t檢驗確定顯著性並表示為∗ p＜0.05。分別在ASD和TD兒童的腸道微生物組中，菌種對指示的微生物功能、芳香族胺基酸(B)和甘胺酸生物合成(C)的貢獻。在每個功能模組中，生物合成由腸道中菌種混合物(每個堆疊的條塊)貢獻，並且每個堆疊條代表個體總體基因組之一。(D)宿主因素與腸道微生物功能途徑的豐度之間的相關性。通過斯皮爾曼相關性分析計算相關性。確定所有成對比較的統計顯著性。僅繪製絕對係數＞0.2的統計顯著相關性。顏色強度與相關係數成正比，其中藍色表示正相關且黃色表示負相關。
[圖17]：ASD中年齡差別性的分類群的發育不足。(A)在TD個體中，通過糞便細菌菌種的相對豐度對宿主實齡的隨機森林回歸，將26個菌種鑑定為年齡差別性的細菌分類群。按該細菌分類群對模型精確度的重要性，排序年齡差別性菌種。當隨機排列每個分類群的相對豐度值時，基於微生物群年齡預測的均方誤差的增加百分比來確定重要性。插圖顯示5次10倍交叉驗證誤差作為輸入細菌菌種的數量的函數(藍色線)。(B)在TD和ASD兒童中分別繪製26個年齡差別性細菌分類群的相對豐度對實齡譜(月)的熱圖。(C)在ASD兒童對比TD兒童中，腸道微生物組的發育不足。在TD個體中建立作為生物學年齡的函數的微生物群年齡預測模型，然後針對ASD中實齡，將其用於預測微生物組年齡。
[圖18]：宿主因素與腸道細菌組組成之間的相關性。(A)對應ASD和TD的元數據的微生物群組成的冗餘分析(RDA)。RDA中箭頭表示宿主因素在塑造中國兒童腸道微生物組的影響大小和方向。(B)在ASD和TD個體中分別通過陰道分娩的兒童與剖腹產的兒童之間的糞副擬桿菌( Parabacteroides merdae)豐度的比較。通過Kruskal-Wallis檢驗進行統計檢驗，* P＜0.05, ** P＜0.01。
[圖19]：ASD與TD之間有差別的屬及ASD的預測模型。(A)屬水平的有差別的細菌屬。LDA評分表示TD與ASD之間的細菌豐度差異的效應大小(閾值LDA評分＞2)。紅色條表示ASD中富含的分類群且綠色條表示TD中富含的分類群。(B)分別對於發現集和驗證集中每個參與者的ASD的風險評分。風險評分代表被預測為ASD的隨機生成的決策樹的可能性。
[圖20]：患有ASD的兒童中腸道微生物組功能改變。(A)通過LefSE鑑定的ASD和TD兒童中有差別的微生物功能。效應大小顯示為LDA評分。僅示出LDA評分＞1的菌種。紅色條表示在ASD中富集的功能且綠色條表示在TD中富集的功能。(B)在ASD對比TD兒童的腸道微生物組中，由普氏棲糞桿菌( Faecalibacterium prausnitzii)菌種貢獻的L-絲胺酸和甘胺酸生物合成途徑的豐度。通過t檢驗進行統計檢驗，* P＜0.05。(C)在ASD對比TD兒童的腸道微生物組中，麩胺酸合成酶編碼基因的豐度。通過t檢驗進行統計檢驗，* P＜0.05。
[圖21]：患有ASD的兒童與正常發育兒童之間3種細菌標誌物的相對豐度比較。ASD：自閉症譜系障礙；TD：正常發育兒童。
[圖22]：細菌標誌物在預測ASD風險的診斷功能。在區分ASD和正常發育兒童中組合評分的接受者操作特性(ROC)曲線分析和診斷功能。

Claims (54)

  1. 一種用於治療人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的症狀的方法，其包含將有效量的一或多種細菌菌種引入所述兒童的胃腸道，所述細菌菌種為普氏棲糞桿菌( Faecalibacterium prausnitzi)、食葡糖羅斯拜瑞氏菌( Roseburia inulinivorans)、霍氏真桿菌( Eubacterium hallii)、長鏈多爾氏菌( Dorea longicatena)或惰性真桿菌( Eubacterium siraeum)。
  2. 如請求項1所述的方法，其中所述引入步驟包含向所述個體口服施用包含有效量的所述一或多種細菌菌種的組合物。
  3. 如請求項1所述的方法，其中所述引入步驟包含將包含有效量的所述一或多種細菌菌種的組合物遞送至所述個體的小腸、回腸或大腸。
  4. 如請求項1所述的方法，其中所述引入步驟包含糞便微生物群移植(FMT)。
  5. 如請求項4所述的方法，其中所述FMT包含向所述兒童施用包含經處理的供體糞便材料的組合物。
  6. 如請求項2所述的方法，其中口服施用所述組合物。
  7. 如請求項2所述的方法，其中所述組合物直接沉積到所述兒童的胃腸道。
  8. 如請求項1所述的方法，其中在所述引入步驟之前從所述兒童獲得的第一糞便樣品和在所述引入步驟之後從所述兒童獲得的第二糞便樣品測定所述一或多種細菌菌種的水平或相對豐度。
  9. 如請求項8所述的方法，其中通過定量聚合酶鏈反應(PCR)測定所述一或多種細菌菌種的水平。
  10. 一種用於治療人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的症狀的方法，其包含降低所述兒童的胃腸道中一或多種細菌菌種的水平或相對豐度，所述細菌菌種為系結梭菌( Clostridium nexile)、微好氣戴阿利斯特菌( Dialister invisus)、鮑氏梭菌( Clostridium bolteae)、共生梭菌( Clostridium symbiosum)、黏液真桿菌( Eubacterium limosum)、細菌梭菌 _1_7_47FAA( Clostridiales bacterium_1_7_47FAA)、多枝梭菌( Clostridium ramosum)、人腸道厭氧棒狀菌( Anaerotruncus colihominis)、奇特龍梭菌( Clostridium citroniae)或隱紋條另枝菌( Alistipes indistinctus)。
  11. 如請求項10所述的方法，其中所述降低步驟包含FMT。
  12. 如請求項10所述的方法，其中所述降低步驟包含使用抗細菌劑治療所述個體。
  13. 如請求項12所述的方法，其中在使用所述抗細菌劑治療所述個體之後，將包含經處理的供體糞便材料的組合物引入所述個體的胃腸道。
  14. 如請求項13所述的方法，其中口服施用所述組合物。
  15. 如請求項13所述的方法，其中所述組合物直接沉積到所述兒童的胃腸道。
  16. 如請求項10所述的方法，其中在所述降低步驟之前從所述兒童獲得的第一糞便樣品和在所述降低步驟之後從所述兒童獲得的第二糞便樣品測定所述一或多種細菌菌種的水平或相對豐度。
  17. 如請求項16所述的方法，其中通過定量聚合酶鏈反應(PCR)測定所述一或多種細菌菌種的水平。
  18. 一種用於治療ASD的症狀的套組，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一組合物，所述第一組合物包含(i)有效量的表1所示的一種細菌菌種或(ii)有效量的抗細菌劑，所述抗細菌劑阻抑表2所示的一種細菌菌種的生長，且所述第二容器含有第二組合物，所述第二組合物包含(i)有效量的表1所示的另一種細菌菌種或(ii)有效量的抗細菌劑，所述抗細菌劑阻抑表2所示的另一種細菌菌種的生長。
  19. 如請求項18所述的套組，其中所述第一組合物包含用於FMT的經處理的供體糞便材料。
  20. 如請求項18或19所述的套組，其中所述第一組合物被配製用於口服施用。
  21. 如請求項18所述的套組，其中所述第二組合物被配製用於口服施用。
  22. 如請求項19所述的套組，其中所述第一組合物和第二組合物均被配製用於口服攝入。
  23. 一種用於確定人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的風險的方法，其包含： (1)測定來自所述兒童的糞便樣品中表1或表2所示的任一種細菌菌種的相對豐度；及 (2)檢測步驟(1)的相對豐度不低於表1的截止值或標準對照值或低於表2的截止值或標準對照值，並確定所述兒童不具有增加的ASD風險；或者，檢測步驟(1)的相對豐度低於表1的截止值或標準對照值或不低於表2的截止值或標準對照值，並確定所述兒童具有增加的ASD風險。
  24. 一種用於評估兩個人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的風險的方法，其包含： (1)測定來自所述兩個兒童的每一者的糞便樣品中表1或表2所示的任一種細菌菌種的相對豐度； (2)確定步驟(1)的表1所示的細菌菌種的相對豐度在來自第一兒童的糞便樣品中較高或確定步驟(1)的表2所示的細菌菌種的相對豐度在來自第一兒童的糞便樣品中較低；及 (3)確定第二兒童具有比第一兒童更高的ASD風險。
  25. 一種用於確定人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的風險的方法，其包含： (1)由來自所述兒童的糞便樣品獲得以下的值：(a)隱紋條另枝菌(Ai)或人腸道厭氧棒狀菌(Ac)的相對豐度或(b)三種細菌菌種Ai、Ac及霍氏真桿菌(Eh)的水平的綜合評分，所述綜合評分通過I1+β1*Ai+β2*Eh+β3*Ac計算；及 (2)檢測所述值高於標準對照值，並確定所述個體具有增加的ASD風險。
  26. 一種用於確定人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的風險的方法，其包含： (1)獲得來自所述兒童的糞便樣品中霍氏真桿菌(Eh)的相對豐度值；及 (2)檢測所述值低於標準對照值，並確定所述個體具有增加的ASD風險。
  27. 如請求項23至26中任一項所述的方法，其中通過定量PCR測定所述細菌菌種的相對豐度。
  28. 一種用於評估人類兒童之自閉症譜系障礙(ASD)的風險的方法，其包含： (1)測定來自所述兒童的糞便樣品中表3所示的一或多種細菌菌種的水平或相對豐度； (2)測定來自包含正常和ASD兒童的參考群組的糞便樣品中相同細菌菌種的水平或相對豐度； (3)使用從步驟(2)獲得的數據通過隨機森林模型以生成決策樹，並沿著所述決策樹運行來自步驟(1)的一或多種細菌菌種的水平或相對豐度以生成風險評分；及 (4)將風險評分大於0.5的兒童確定為具有增加的ASD風險，且將風險評分不大於0.5的兒童確定為沒有增加的ASD風險。
  29. 如請求項28所述的方法，其中所述一或多種細菌菌種包含隱紋條另枝菌。
  30. 如請求項28所述的方法，其中所述一或多種細菌菌種包含隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c和脊鏈球菌( Streptococcus cristatus)。
  31. 如請求項28所述的方法，其中所述一或多種細菌菌種包含隱紋條另枝菌、候選分支TM7單細胞分離物TM7c、脊鏈球菌、黏液真桿菌及寡醱酵鏈球菌( Streptococcus_oligofermentans)。
  32. 一種用於評估自閉症譜系障礙(ASD)的風險的套組，其包含用於檢測表1、表2或表3所示的一或多種細菌菌種的試劑。
  33. 如請求項32所述的套組，其中所述試劑包含一組寡核苷酸引子，所述寡核苷酸引子係用於擴增表1、表2或表3所示的任一種細菌菌種的多核苷酸序列。
  34. 如請求項33所述的套組，其中所述擴增是PCR，較佳定量PCR。
  35. 一種用於確定兒童發育年齡的方法，其包含以下步驟： (a)定量測定取自所述兒童的糞便樣品中選自表8或表9的一或多種細菌菌種的相對豐度； (b)定量測定取自由正常發育兒童組成的參考群組的糞便樣品中所述一或多種細菌菌種的相對豐度； (c)使用從步驟(b)獲得的數據通過隨機森林模型以生成決策樹；及 (d)沿著步驟(b)的決策樹運行從步驟(a)獲得的相對豐度以產生所述兒童的發育年齡。
  36. 如請求項35所述的方法，其中所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌( Streptococcus gordonii)、鳥腸球菌( Enterococcus avium)、真桿菌_3_1_31( Eubacterium_sp_3_1_31)、哈氏梭菌( Clostridium hathewayi)及堅硬棒桿菌( Corynebacterium durum)。
  37. 如請求項35所述的方法，其中所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31及哈氏梭菌。
  38. 如請求項35所述的方法，其中所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌、鳥腸球菌及真桿菌_3_1_31。
  39. 如請求項35所述的方法，其中所述一或多種細菌菌種包含格氏鏈球菌和鳥腸球菌。
  40. 如請求項35所述的方法，其中所述一或多種細菌菌種包括格氏鏈球菌。
  41. 如請求項35所述的方法，其中所述兒童為約3歲至約6歲。
  42. 一種用於確定兒童發育年齡的套組，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有用於檢測表8或表9所示的第一細菌菌種的第一試劑，且所述第二容器含有用於檢測表8或表9所示的第二細菌菌種的第二試劑。
  43. 如請求項42所述的套組，其包含3個或更多個容器，所述容器的每一者含有用於檢測表8或表9所示的不同細菌菌種的試劑。
  44. 如請求項42所述的套組，其包含2個或更多個容器，所述容器的每一者含有用於檢測不同細菌菌種的試劑，所述不同細菌菌種選自由以下組成的組：(1)格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31、哈氏梭菌及堅硬棒桿菌；(2)格氏鏈球菌、鳥腸球菌、真桿菌_3_1_31及哈氏梭菌；(3)格氏鏈球菌、鳥腸球菌及真桿菌_3_1_31；或(4)格氏鏈球菌和鳥腸球菌。
  45. 如請求項42所述的套組，其中所述試劑包含一組寡核苷酸引子，所述寡核苷酸引子係用於擴增表8或表9所示的任一種細菌菌種的多核苷酸序列。
  46. 如請求項45所述的套組，其中所述擴增是PCR。
  47. 如請求項46所述的套組，其中所述PCR是定量PCR(qPCR)。
  48. 一種促進兒童生長和發育的方法，其包含向所述兒童施用有效量的選自表8的一或多種細菌菌種。
  49. 如請求項48所述的方法，其中所述兒童為約3歲至約6歲。
  50. 一種用於促進兒童生長和發育的套組，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一組合物，所述第一組合物包含(i)有效量的表8所示的一種細菌菌種，且所述第二容器含有第二組合物，所述第二組合物包含(i)有效量的表8所示的另一種細菌菌種。
  51. 如請求項50所述的套組，其中所述第一組合物或第二組合物包含用於FMT的經處理的供體糞便材料。
  52. 如請求項50或51所述的套組，其中所述第一組合物被配製用於口服施用。
  53. 如請求項50或51所述的套組，其中所述第二組合物被配製用於口服施用。
  54. 如請求項51所述的套組，其中所述第一組合物和第二組合物均被配製用於口服攝入。
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