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TW202208412A - 對酪胺酸蛋白激酶樣７（ｐｔｋ７）特異的經掩蔽的嵌合抗原受體和表現其的免疫細胞 - Google Patents

對酪胺酸蛋白激酶樣７（ｐｔｋ７）特異的經掩蔽的嵌合抗原受體和表現其的免疫細胞 Download PDF

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TW202208412A
TW202208412A TW110116261A TW110116261A TW202208412A TW 202208412 A TW202208412 A TW 202208412A TW 110116261 A TW110116261 A TW 110116261A TW 110116261 A TW110116261 A TW 110116261A TW 202208412 A TW202208412 A TW 202208412A
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TW
Taiwan
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car
masked
seq
cells
ptk7
Prior art date
Application number
TW110116261A
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English (en)
Inventor
傑森 薩格特
西蒙斯 瑞 杜塔
喬納森 亞歷山大 特雷特
Original Assignee
瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本文提供了經掩蔽的嵌合抗原受體（CAR）構建體，其包含細胞外抗原結合結構域特異性酪胺酸蛋白激酶樣7（PTK7），該PTK7連接到阻斷經掩蔽的CAR與PTK7結合的掩蔽肽。本文還提供了表現對PTK7特異的經掩蔽的CAR的基因工程化T細胞及其治療用途。

Description

對酪胺酸蛋白激酶樣7（PTK7）特異的經掩蔽的嵌合抗原受體和表現其的免疫細胞
相關申請的交叉引用。本申請要求2020年5月6日提交的美國臨時申請案號63/020,794的提交日期之權益，其全部內容藉由引用結合在此。
本發明係關於一種對酪胺酸蛋白激酶樣7（PTK7）特異的經掩蔽的嵌合抗原受體和表現其的免疫細胞。
嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法使用經基因修飾的T細胞來更特異性和有效地靶向和殺傷癌細胞。從血液中收集T細胞後，對細胞進行工程改造，使其表面上表現CAR。可以使用CRISPR/Cas9基因編輯技術將CAR引入T細胞。將該等CAR T細胞注射入患者體內時，受體使T細胞能夠殺傷癌細胞。
蛋白酪胺酸激酶7（PTK7），也稱為大腸癌激酶4（CCK4），係受體蛋白酪胺酸激酶，其參與非經典Wnt傳訊並包含胞外結構域。儘管PTK7缺乏可檢測的催化酪胺酸激酶活性，但它具有訊息傳遞活性並推測在細胞黏附中起作用。進一步認為，PTK7係癌症中腫瘤進展的標誌物，因為它在各種癌細胞系中表現，例如大腸癌細胞系和乳癌細胞系。
本揭露至少部分地基於阻斷抗PTK7抗體與PTK7抗原結合的掩蔽肽的開發。包含這種掩蔽肽的經掩蔽的抗PTK7抗體顯示出與PTK7抗原的結合活性降低，並且通過蛋白酶切割除去掩蔽肽後結合活性恢復。此外，如在動物模型中所觀察到的，表現經掩蔽的抗PTK7嵌合抗原受體的T細胞成功地抑制腫瘤的生長。預期此類T細胞顯示出有希望的抗腫瘤作用且毒性降低。
因此，本揭露之一方面提供了酪胺酸蛋白激酶樣7（PTK7）特異的經掩蔽的嵌合抗原受體（CAR），該經掩蔽的CAR包含：(i) 細胞外抗原結合結構域，其包含結合PTK7的單鏈可變片段（scFv）和經由蛋白酶切割位點與scFv的N末端連接的掩蔽肽；和一或多個細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，掩蔽肽的長度可為13-25個胺基酸。
在一些實施方式中，掩蔽肽包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成： (a) EVAPGKRWFYNHVKQVPHLV（SEQ ID NO: 1）， (b)      HEEVHMRPNKLSLTWAYTGPQLR（SEQ ID NO: 2），和 (c) X1 CX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 ，其中X1 係V、W、或不存在；X2 係T、H、或Y；X3 係M、F、Y、I、或H；X4 係P、G、或V；X5 係P、N、S、Y、K、L、V、或A；X6 係S、T、W、A、H、R、或Q；X7 係P、T、V、H、I、M、A、F、或W；X8 R、M、A、H、V、Y、或不存在；X9 係S、Q、Y、T、P、A、M、或I；X10 係K、R、I、C、S、Q、H、或不存在；X11 係V、T、R、L、F、W、或A；X12 係I、F、L、W、或H；並且X13係C、I、或M。
在一些實例中，掩蔽肽包含 (c) 的胺基酸序列，其可為以下之一： (c1)    CTMPPSPRSKVIC（SEQ ID NO: 3）， (c2)    CTFPNTTMQRTFC（SEQ ID NO: 4）， (c3)    CTYPSWVAYIRFC（SEQ ID NO: 5）， (c4)    VCTYPPAHRTRFC（SEQ ID NO: 6）， (c5)    CTMPYHIHSIGLC（SEQ ID NO: 7）， (c6)    WCTIPSSMSIRLC（SEQ ID NO: 8）， (c7)    CHIGKRPVPCLWI（SEQ ID NO: 9）， (c8)    CYIGLRMVPCFHM（SEQ ID NO: 10）， (c9)    CTMPSHAVASFLC（SEQ ID NO: 11）， (c10)  CTMPVHTYSQWLC（SEQ ID NO: 12）， (c11)  CTYPPRFHMHWLC（SEQ ID NO: 13），或 (c12)  CTHVAQWAIKAFC（SEQ ID NO: 14）。
在具體實例中，掩蔽肽可為以下之一： (a)     EVAPGKRWFYNHVKQVPHLV（SEQ ID NO: 1）， (b)     HEEVHMRPNKLSLTWAYTGPQLR（SEQ ID NO: 2）， (c1)    CTMPPSPRSKVIC（SEQ ID NO: 3）， (c2)    CTFPNTTMQRTFC（SEQ ID NO: 4）， (c3)    CTYPSWVAYIRFC（SEQ ID NO: 5）， (c4)    VCTYPPAHRTRFC（SEQ ID NO: 6）， (c5)    CTMPYHIHSIGLC（SEQ ID NO: 7）， (c6)    WCTIPSSMSIRLC（SEQ ID NO: 8）， (c7)    CHIGKRPVPCLWI（SEQ ID NO: 9）， (c8)    CYIGLRMVPCFHM（SEQ ID NO: 10）， (c9)    CTMPSHAVASFLC（SEQ ID NO: 11）， (c10)  CTMPVHTYSQWLC（SEQ ID NO: 12）， (c11)  CTYPPRFHMHWLC（SEQ ID NO: 13），或 (c12)  CTHVAQWAIKAFC（SEQ ID NO: 14）。
在一些實施方式中，可以藉由在蛋白酶切割位點處的蛋白酶切割來去除掩蔽肽。在一些實例中，蛋白酶切割位點係例如包含PLGLA（SEQ ID NO: 15）的模體的基質金屬蛋白酶（MMP）的切割位點。
在一些實施方式中，掩蔽肽可以經由第一肽連接子與蛋白酶切割位點連接。在一些實施方式中，蛋白酶切割位點經由第二肽連接子與抗PTK7抗體的重鏈或輕鏈的N末端連接。第一肽連接子或第二肽連接子，或兩者可為G/S肽連接子。在一些實例中，掩蔽肽按以下式與結合PFK7的scFv連接：M-L1 -P-L2 -scFv，其中M代表所述掩蔽肽，L1 和L2 代表該第一和第二肽連接子，並且P代表該蛋白酶切割位點。
在一些實施方式中，結合PTK7的scFv包含重鏈可變結構域（VH ），其包含與抗體Ab181的重鏈CDR相同的重鏈互補決定區（CDR）。可替代地或另外，抗PTK7抗體包含輕鏈可變結構域（VL ），其包含與抗體Ab181的輕鏈CDR相同的輕鏈互補決定區（CDR）。在一些實例中，結合PTK7的scFv包含與抗體Ab181相同的VH 和/或與抗體Ab181相同的VL 。在一些具體實例中，細胞外抗原結合結構域包含選自由SEQ ID NO: 120-134組成之群組的胺基酸序列。
本文揭露的任何經掩蔽的抗PTK7 CAR可以包含一或多個細胞內傳訊結構域，其視需要可以包含共刺激結構域、CD3ζ胞質傳訊結構域或其組合。在一些實例中，共刺激結構域係CD28共刺激結構域。在其他實例中，共刺激結構域係4-1BB共刺激結構域。本文揭露的任何經掩蔽的抗PTK7 CAR可以進一步包含位於細胞外抗原結合結構域和一或多個細胞內傳訊結構域之間的跨膜結構域。在一些實例中，跨膜結構域係CD8跨膜結構域。另外，經掩蔽的CAR可以進一步在經掩蔽的CAR的N末端包含訊息肽。
在具體實例中，本文揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR可包含SEQ ID NO: 106-119（例如SEQ ID NO: 91-105）之一的胺基酸序列。
本文還提供了核酸，其包含編碼本文揭露的任何經掩蔽的抗PTK7 CAR的核苷酸序列。
在另一方面，本揭露之特徵在於基因工程化T細胞，其包含編碼本文揭露的任何一種經掩蔽的抗PTK7 CAR的核酸，並表現由該核酸編碼的經掩蔽的CAR。在一些實施方式中，基因工程化T細胞可以進一步包含被破壞的TRAC 基因、被破壞的B2M 基因或其組合。在一些實例中，基因工程化T細胞可包含被破壞的TRAC 基因，其中插入了編碼經掩蔽的CAR的核酸，從而破壞TRAC 基因的表現。
在一些實施方式中，基因工程化T細胞包含被破壞的TRAC 基因，其包含含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列之片段的缺失。編碼經掩蔽的CAR的核酸可以插入到TRAC 基因中的缺失的位點。在一些實例中，編碼經掩蔽的CAR的核酸可以替代被破壞的TRAC 基因中的包含SEQ ID NO: 40的片段。
另外，本揭露提供了基因工程化T細胞的群體，其包括表現經掩蔽的抗PTK7 CAR的T細胞，例如本文揭露的那些。在一些實施方式中，基因工程化T細胞可具有被破壞的TRAC 基因、被破壞的B2M 基因或其組合。在一些實例中，T細胞可具有被破壞的TRAC 基因，其中插入了編碼經掩蔽的CAR的核酸，從而破壞TRAC 基因的表現。
在一些實施方式中，基因工程化T細胞包含被破壞的TRAC 基因，其包含含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列之片段的缺失。編碼經掩蔽的CAR的核酸可以插入到TRAC 基因中的缺失的位點。在一些實例中，編碼經掩蔽的CAR的核酸可以替代被破壞的TRAC 基因中的包含SEQ ID NO: 40的片段。
在一些實施方式中，本文揭露的基因工程化T細胞的群體可包含共同表現經掩蔽的CAR、具有被破壞的TRAC 基因和具有被破壞的B2M 基因的T細胞。
在另一方面，本文提供了用於治療受試者中的癌症之方法，其包括向有需要的受試者投與有效量的本文揭露的基因工程化T細胞的群體中的任何。在一些實施方式中，該受試者係患有癌症的人癌症患者，該癌症包含PTK+ 癌細胞並且呈現識別經掩蔽的CAR中的蛋白酶切割位點的蛋白酶。在一些實例中，受試者可為患有選自以下群組的癌症的人癌症患者，該群組由以下組成：非小細胞肺癌、大腸癌、卵巢癌和乳癌，其視需要是三陰性乳癌。
也在本揭露之範圍內的係藥物組成物，其提供如本文揭露的用於治療如本文揭露的靶疾病（例如癌症）的基因工程化T細胞的群體，或提供該基因工程化T細胞的群體用於製造用於治療靶疾病的藥物的用途。
此外，本揭露提供了產生基因工程化CAR-T細胞之方法，其包括：(a) 將編碼本文揭露的任何經掩蔽的CAR的核酸遞送至T細胞，和 (b) 產生表現該經掩蔽的CAR的基因工程化CAR-T細胞。
在一些實施方式中，步驟 (a) 可以藉由包括遞送至T細胞的過程進行：(i) RNA指導的核酸酶，(ii) 靶向TRAC 基因中的位點的第一指導RNA（gRNA），以及 (iii) 載體，其包含左同源臂、編碼經掩蔽的CAR的核酸和右臂同源臂。左同源臂和右同源臂可以與目的基因組位點（例如，TRAC 基因座）同源，從而產生基因工程化CAR-T細胞，其具有被破壞的TRAC 基因以及在該目的基因組位點插入的編碼經掩蔽的CAR的核酸。在一些實例中，左同源臂與在第一gRNA靶向的位點左側的TRAC 基因座同源，並且右同源臂與在第一gRNA靶向的位點右側的TRAC 基因座同源。
在一些實例中，步驟 (a) 可進一步包括將靶向B2M 基因中位點的第二指導RNA遞送至T細胞。在一些實例中，該RNA指導的核酸酶係Cas9核酸酶，視需要是釀膿鏈球菌（S. pyogenes ）Cas9核酸酶。在一些實例中，載體係AAV載體。
在一些實施方式中，可以將RNA指導的核酸酶， 靶向TRAC 基因的第一gRNA和視需要的靶向B2M 基因的第二gRNA以核糖核蛋白（RNP）複合物的形式遞送至T細胞。在一些實例中，可以藉由電穿孔將RNP複合物和載體遞送至T細胞。
藉由本文揭露的任何方法產生的基因工程化T細胞的群體也在本揭露之範圍內。
本發明的一或多個實施方式的細節在以下說明中闡述。從以下附圖和幾個實施方式的詳細描述，以及從所附申請專利範圍，本發明的其他特徵或優點將變得顯而易見。
多個與腫瘤相關的抗原靶已進入臨床試驗，主要是使用以下邏輯選擇：癌組織中的表現應相比於正常組織具有選擇性，以避免毒性。據報導PTK7在各種癌細胞上表現，因此可以作為潛在的腫瘤治療靶。但是，在正常組織，包括肺、平滑肌、胃、腎和膀胱中，也發現了PTK7的過度表現。因此，需要開發減少在抗PTK7藥物的腫瘤療法中對正常組織和細胞的攻擊的技術。
本揭露至少部分地基於經掩蔽的抗PTK7 CAR（也稱為經掩蔽的CAR或mCAR）的開發，其包含（完全或部分地）抑制CAR與PTK7抗原結合的掩蔽肽。掩蔽肽被設計為例如經由蛋白酶切割在期望部位（例如在腫瘤部位）可去除。因此，經掩蔽的抗PTK7 CAR與PTK7抗原的結合活性降低或沒有結合活性，直到經掩蔽的肽在期望位點被去除為止。因此，經掩蔽的抗PTK7 CAR對正常細胞和組織的細胞毒性低或沒有細胞毒性，從而解決了與常規抗PTK7療法相關的潛在毒性問題。
本文描述了對PTK7（抗PTK7 CAR）特異的經掩蔽的嵌合抗原受體（CAR），編碼其的核酸，表現其的基因工程化T細胞，這樣的基因工程化T細胞的治療應用以及產生表現經掩蔽的CAR的基因工程化T細胞的方法和由此產生的T細胞。
I. 對 PTK7 特異的經掩蔽的嵌合抗原受體
如本文所用，嵌合抗原受體（CAR）係指人工免疫細胞受體，其經工程改造以識別並結合不希望的細胞表現的抗原，例如疾病細胞表現的抗原，例如癌細胞表現的抗原。可以將CAR多肽引入免疫細胞例如T細胞中以進行表面表現以產生CAR T細胞。CAR具有以非MHC限制的方式將T細胞特異性和反應性重定向至所選靶標的能力。非MHC限制性抗原識別賦予CAR-T細胞識別獨立於抗原加工的抗原的能力，從而繞開了腫瘤逃逸的主要機制。此外，當在T細胞上表現時，CAR不會有利地與內源性T細胞受體（TCR）α和β鏈二聚。
CAR的設計多種多樣，每者含有不同組分。在一些實施方式中，CAR可以通過鉸鏈結構域和跨膜結構域將抗體衍生的scFv與T細胞受體的CD3ζ（CD3ζ）細胞內傳訊結構域連接。在一些實施方式中，CAR摻入了另外的共刺激結構域，例如CD28、4-1BB（41BB）或ICOS，以提供共刺激訊息。在其他實施方式中，CAR包含與TCR CD3ζ鏈融合的兩個共刺激結構域（例如，CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40的組合）。Maude等人 , Blood[血液]. 2015; 125(26):4017-4023; Kakarla和Gottschalk, Cancer J.[癌症雜誌] 2014; 20(2):151-155)。CAR構建體的各代中的任何一代都在本揭露之範圍內。
在一些情況下，CAR可為融合多肽，其包含識別靶抗原的細胞外抗原結合結構域（例如，抗體的單鏈可變片段（scFv）或其他抗體片段）和細胞內結構域，該細胞內結構域包含T細胞受體（TCR）複合物的傳訊結構域（例如，CD3ζ），並且在大多數情況下包含共刺激結構域。（Enblad等人, Human Gene Therapy[人基因療法]. 2015; 26(8):498-505）。CAR構建體還可在細胞外結構域和細胞內結構域之間包含鉸鏈和跨膜結構域。本文揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR進一步包含與細胞外抗原結合結構域的N末端連接的掩蔽肽。在一些情況下，訊息肽可以位於經掩蔽的CAR的N末端，以促進細胞表面表現。訊息肽之實例包括MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP（SEQ ID NO: 16）和MALPVTALLLPLALLLHAARP（SEQ ID NO: 17）。可以使用其他訊息肽。
本文揭露的經掩蔽的抗PTK7嵌合抗原受體（CAR），也稱為經掩蔽的抗PTK7 CAR，包含與對PTK7抗原（例如人PTK7抗原）特異的細胞外抗原結合結構域（例如單鏈可變片段或scFv）連接的掩蔽肽。掩蔽肽完全或部分抑制細胞外抗原結合結構域與PTK7抗原的結合。掩蔽肽以可以在某些條件下例如經由蛋白酶切割釋放的方式與細胞外抗原結合結構域連接。
(a)  掩蔽肽
如本文所用，用於構建經掩蔽的抗PTK7 CAR的「掩蔽肽」可為能夠例如完全或部分抑制包含其的CAR與PTK7抗原結合的肽。例如，與相同的未掩蔽的抗PTK7 CAR相比，掩蔽肽可將包含其的經掩蔽的抗PTK7 CAR的結合活性降低至少2倍（例如至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少800倍、至少1000倍、至少2000倍、至少3000倍、至少4000倍或至少5000倍）。在一些實施方式中，掩蔽肽可基本上抑制包含其的經掩蔽的抗PTK7 CAR的結合活性，從而導致經掩蔽的抗PTK7 CAR與PTK7抗原基本上不結合，例如，藉由常規測定檢測不到結合或熟悉該項技術者認為生物學上不重要的非常低的結合。
本文揭露的任何掩蔽肽可包含約5-25個胺基酸殘基，例如約7-25個胺基酸殘基。在一些實例中，掩蔽肽的長度可為13-25個胺基酸殘基，例如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸殘基。在一些具體實例中，本文揭露的掩蔽肽的長度可為13個胺基酸殘基。在其他具體實例中，本文揭露的掩蔽肽的長度可為20個胺基酸殘基。在其他具體實例中，本文揭露的掩蔽肽的長度可為23個胺基酸殘基。
在一些實施方式中，本文揭露的掩蔽肽可包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。參見下表 4 。在其他實施方式中，本文揭露的掩蔽肽可包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有基本同源性的胺基酸序列，例如與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同源。
用Karlin和Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 87:2264-68, 1990的演算法，如Karlin和Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 90:5873-77, 1993中所修改，確定兩個胺基酸序列的「百分比同一性」。這種演算法被併入Altschul等人. J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 215:403-10, 1990的NBLAST和XBLAST程序（2.0版）中。可以用XBLAST程序（分值 = 50，字長 = 3）進行BLAST蛋白檢索，以獲得與目的蛋白分子同源的胺基酸序列。在兩個序列之間存在缺口的情況下，可以如Altschul等人,Nucleic Acids Res .[核酸研究] 25(17):3389-3402, 1997中所述利用Gapped BLAST。當利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各程序（例如，XBLAST和NBLAST）的默認參數。
在一些實例中，本文揭露的掩蔽肽可包含相對於SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有不超過5個胺基酸變異（例如，包含5、4、3、2或1個胺基酸變異）的胺基酸序列。在某些情況下，這種胺基酸變異可為胺基酸殘基取代，例如保守胺基酸殘基取代。
如本文所用，「保守胺基酸取代」係指不改變進行胺基酸取代的蛋白質的相對電荷或大小特徵的胺基酸取代。可以根據本領域的普通技術者已知的用於改變多肽序列的方法來製備變體，例如改變多肽序列的方法在編譯此類方法的以下參考文獻中可以找到：例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊]，J.Sambrook等人編輯，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989，或Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學的當前方案],F.M. Ausubel等編輯，約翰威利父子出版社（John Wiley＆Sons,Inc.），紐約。胺基酸的保守取代包括在以下組內的胺基酸之間進行的取代：(a) M、I、L、V；(b) F、Y、W；(c) K、R、H；(d) A、G；(e) S、T；(f) Q、N；和 (g) E、D。
在一些實施方式中，本文揭露的掩蔽肽可包含X1 CX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 的模體，其中X1 係V、W、或不存在；X2 係T、H、或Y；X3 係M、F、Y、I、或H；X4 係P、G、或V；X5 係P、N、S、Y、K、L、V、或A；X6 係S、T、W、A、H、R、或Q；X7 係P、T、V、H、I、M、A、F、或W；X8 R、M、A、H、V、Y、或不存在；X9 係S、Q、Y、T、P、A、M、或I；X10 係K、R、I、C、S、Q、H、或不存在；X11 係V、T、R、L、F、W、或A；X12 係I、F、L、W、或H；並且X13 係C、I、或M。
在一些實例中，X1 係V、W或不存在，X2 係T，X3 係M、F、Y或I；X4 係P；X5 係P、N、S、Y或V；X6 係S、T、W、A、H或R；X7 係P、T、V、H、I、M、A或F；X8 R、M、A、H、V、Y、或不存在；X9 係S、Q、Y、T、A或M；X10 係K、R、I、S、Q、H或不存在；X11 係V、T、R、F或W；X12 係I、F或L；並且X13係C。
在一些實施方式中，X1 不存在；X2 係H或Y；X3 係I；X4 係G；X5 係K或L；X6 係R；X7 係P或M；X8 係V；X9 係P；X10 係C；X11 係L或F；X12 係W或H；並且X13 係I或M。
在一些實例中，掩蔽肽可包含SEQ ID NO: 3-14中任一個的胺基酸序列。在其他實例中，本文揭露的掩蔽肽可包含與SEQ ID NO: 3-14中的任一個具有基本同源性的胺基酸序列，例如與SEQ ID NO: 3-14中的任何一個至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%同源。可替代地或另外地，本文揭露的掩蔽肽可包含相對於SEQ ID NO: 3-14中的任一個具有不超過4個胺基酸變異（例如，包含4、3、2或1個胺基酸變異）的胺基酸序列。在某些情況下，這種胺基酸變異可為胺基酸殘基取代，例如保守胺基酸殘基取代。
在一些實例中，本文揭露的掩蔽肽可為SEQ ID NO: 1-14之一。在一些實例中，掩蔽肽可為SEQ ID NO: 1-14中任一個的片段，該片段可以具有至少5個連續的胺基酸殘基（例如、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或更多）。
本文揭露的任何掩蔽肽可與本文揭露的任何抗PTK7 CAR的細胞外抗原結合結構域的N末端連接。切割位點例如蛋白酶切割位點可位於掩蔽肽和細胞外抗原結構域之間。如本文所用，切割位點係指肽模體，其可在某些條件下被切割，從而將其N末端片段與其C末端片段分開。藉由在掩蔽肽和CAR之間包含切割位點，可以在設計的條件下在切割位點去除掩蔽肽，從而釋放全功能的抗PTK7 CAR。
在一些實施方式中，切割位點係蛋白酶切割的蛋白酶切割位點。合適的蛋白酶切割位點的選擇將取決於抗PTK7 CAR的期望作用部位。例如，當腫瘤部位係期望的作用部位時，對腫瘤特異的蛋白酶的切割位點用於構建旨在作用於腫瘤部位的掩蔽抗PTK7 CAR。腫瘤特異性蛋白酶係指相對於正常組織在腫瘤部位具有升高的水平和/或活性的任何蛋白酶。
在一些實例中，蛋白酶切割位點可為基質金屬蛋白酶（MMP）的切割位點。在具體實例中，蛋白酶切割位點可為MMP14的切割位點，例如PLGLA的模體（SEQ ID NO: 15）。在其他實例中，蛋白酶切割位點可為絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶的切割位點。在具體實例中，蛋白酶切割位點可為間質蛋白酶（matriptase）的切割位點，例如，具有LSGRSDNH（SEQ ID NO: 18）的模體的切割位點。在其他具體實例中，蛋白酶切割位點可為尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）的切割位點，例如具有TGRGPSWV（SEQ ID NO: 19）的模體的切割位點。關於腫瘤特異性蛋白酶和相應切割位點的另外資訊在本領域中係已知的，例如，在Vasiljeva等人,Scientific Reports [科學報導], 10:5894, 2020中揭露，其相關揭露內容藉由引用結合用於本文引用的主題和目的。
在一些情況下，可將一或多個胺基酸殘基添加至掩蔽肽的N末端以維持或改善肽的穩定性。在一實例中，可將二肽QG添加至掩蔽肽（例如，包含SEQ ID NO: 3-14之一的胺基酸序列的掩蔽肽）的N末端。不受理論的束縛，麩醯胺酸殘基（特別是當其位於N末端時）可以自發形成焦麩胺酸，這有助於保護N末端免受蛋白水解作用。
本文揭露的任何掩蔽肽（具有或不具有上述另外的胺基酸殘基）可以與蛋白酶切割位點（例如，本文揭露的那些，例如MMP14切割位點）的N末端連接。在一些實例中，掩蔽肽直接連接至蛋白酶切割位點的N末端。在其他實例中，掩蔽肽可經由肽連接子與蛋白酶切割位點的N末端連接。蛋白酶切割位點可以連接至本文揭露的抗PTK CAR的細胞外抗原結合結構域（例如，scFv片段）的N末端。在一些實例中，蛋白酶切割位點可直接連接至細胞外抗原結合結構域的N末端。在其他實例中，蛋白酶切割位點可以經由肽連接子與細胞外抗原結合結構域的N末端連接。在一些實例中，可以在掩蔽肽和蛋白酶切割位點之間以及蛋白酶切割位點和細胞外抗原結合結構域之間使用相同的肽連接子。在其他實例中，可以使用不同的肽連接子。
在具體實例中，本文揭露的掩蔽肽可以以式M-L1 -P-L2 -scFv連接到細胞外抗原結合結構域（例如，scFv片段），其中M代表掩蔽肽，L1 和L2 代表肽連接子，並且P代表蛋白酶切割位點。L1 和L2 在一些情況下可為相同的。在其他情況下，L1 和L2 可為不同的。
用於連接融合多肽中的兩個肽或多肽片段的本領域已知的任何肽連接子都可以用於製備本文揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR。這樣的肽連接子通常富含柔性胺基酸殘基，例如Gly和Ser（富含G/S的連接子），使得連接子側翼的片段可以相對於彼此自由移動。用於經掩蔽的抗PTK7 CAR的肽連接子可以包含約5-20個胺基酸殘基長度。當使用兩個連接子（本文揭露的L1 和L2 ）時，兩個連接子可以具有相同的長度。可替代地，它們可以具有不同的長度。示例性的富含G/S的連接子包括但不限於GSSGGSGGSGGSGGG（SEQ ID NO: 20）、GGSSG（SEQ ID NO: 21）、含有一或多個GGGGS拷貝的肽（SEQ ID NO: 22）或含有GS重複序列的肽。
(b)  抗原細胞外結合結構域
細胞外抗原結合結構域係本文揭露的任何經掩蔽的抗PTK7 CAR的區域，當CAR在細胞表面表現時，該區域暴露於細胞外流體。在一些實施方式中，抗原結合結構域可為單鏈可變片段（scFv，其可以包括抗體重鏈可變區（VH ）和抗體輕鏈可變區（VL ）（在任一取向上）。在一些情況下，VH 和VL 片段可通過肽連接子連接。在一些實施方式中，連接子包括親水性殘基，即，多段甘胺酸和絲胺酸用於柔性，以及多段麩胺酸和離胺酸用於增加溶解度。scFv片段保留了scFv片段衍生自的親本抗體的抗原結合特異性。在一些實施方式中，scFv可包含人源化VH 和/或VL 結構域。在其他實施方式中，scFv的VH 和/或VL 結構域完全是人的。
本文揭露的CAR多肽中的細胞外抗原結合結構域對PTK7（例如人PTK7）具有特異性。在一些實例中，細胞外抗原結合結構域可包含能夠結合PTK7抗原的scFv細胞外結構域。抗PTK7 scFv可以衍生自抗體Ab181。
在一些實施方式中，衍生自Ab181的抗PTK7 scFv可包含具有與抗體Ab181中的那些相同的重鏈互補決定區（CDR）的重鏈可變結構域（VH ）和/或具有與Ab181中的那些相同的輕鏈CDR的輕鏈可變結構域（VL ）。具有相同VH 和/或VL CDR的兩種抗體意味著當藉由相同的方法（例如，本領域已知的Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、Contact方法或IMGT方法）確定時，它們的CDR是相同的。參見例如，Kabat, E.A., 等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫學意義的蛋白質的序列], 第十五版, U.S. Department of Health and Human Services[美國衛生與公共服務部], NIH[美國國立衛生研究院]） 公佈號 91-3242, Chothia 等人, (1989) Nature[自然] 342:877; Chothia, C. 等人 (1987) J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 196:901-917, Al-lazikani等人 (1997) J. Molec. Biol.[分子生物學雜誌] 273:927-948; 和Almagro, J. Mol. Recognit.[分子識別雜誌] 17:132-143 (2004)。另請參見hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs. bioinf.org.uk/abs/。Ab181的重鏈和輕鏈CDR，及其VH 和VL 序列在下面的表 1 中提供。
在其他實施方式中，衍生自Ab181的抗PTK7 scFv可為Ab181的功能性變體。這種功能性變體在結構和功能上與Ab181基本相似。功能性變體包含與Ab181基本相同的VH 和VL CDR。例如，其在總CDR區域中相對於AB181中的那些僅包含多達8個（例如8、7、6、5、4、3、2或1個）胺基酸殘基變異，並且以基本相似的親和力結合PTK7的相同表位（例如具有相同階的KD 值）。在一些情況下，功能性變體可以具有與Ab181相同的重鏈CDR3，並且視需要具有與Ab181相同的輕鏈CDR3。與Ab181的VH 相比，這樣的抗PTK7 scFv可包含VH 片段，其僅在重鏈CDR1和/或CDR2中具有CDR胺基酸殘基變異（例如，多達5個，例如5、4、3、2和1個）。可替代地或另外地，抗scFv抗體可進一步包含VL 片段，與Ab181的VL 相比，該VL 片段僅在輕鏈CDR1和/或CDR2中具有CDR胺基酸殘基變異（例如，多達5個，例如5、4、3、2和1個）。在一些實例中，胺基酸殘基變異可為保守的胺基酸殘基取代。
在一些實施方式中，衍生自Ab181的抗PTK7 scFv可為從N末端到C末端的VH -連接子-VL 的形式。在一些實例中，抗PTK7 scFv包含SEQ ID NO: 29的VH 片段和SEQ ID NO: 30的VL片段。在特定實例中，任何經掩蔽的抗PTK7 CAR中的抗PTK7 scFv可包含SEQ ID NO: 31的胺基酸序列。
(c)  跨膜結構域
本文揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR多肽可以包含跨膜結構域，其可為跨膜的疏水性α螺旋。如本文所用，「跨膜結構域」係指在細胞膜較佳的真核細胞膜中熱力學穩定的任何蛋白質結構。跨膜結構域可以提供含有其的CAR的穩定性。
在一些實施方式中，如本文提供的CAR的跨膜結構域可為CD8跨膜結構域。在其他實施方式中，跨膜結構域可為CD28跨膜結構域。在還其他實施方式中，跨膜結構域係CD8和CD28跨膜結構域的嵌合體。如本文提供的，可以使用其他跨膜結構域。在具體實例中，抗PTK7 CAR中的跨膜結構域係具有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的CD8α跨膜結構域。
(d)  鉸鏈結構域
在一些實施方式中，鉸鏈結構域可以位於CAR的胞外結構域（包含抗原結合結構域）與跨膜結構域之間或者CAR的胞質結構域與跨膜結構域之間。鉸鏈結構域可為起到將跨膜結構域連接至多肽鏈中的胞外結構域和/或胞質結構域的功能的任何寡肽或多肽。鉸鏈結構域可以起到向CAR或其結構域提供柔性或防止CAR或其結構域的空間位阻的功能。
在一些實施方式中，鉸鏈結構域可以包含多達300個胺基酸（例如，10至100個胺基酸或5至20個胺基酸）。在一些實施方式中，一或多個鉸鏈結構域可以包括在CAR的其他區域中。在一些實施方式中，鉸鏈結構域可為CD8鉸鏈結構域。可以使用其他鉸鏈結構域。
(e)  細胞內傳訊結構域
本文揭露的任何經掩蔽的抗PTK7 CAR構建體均包含一或多個細胞內傳訊結構域（例如，CD3ζ，和視需要一或多個共刺激結構域），其係受體的功能性末端。抗原識別後，受體聚簇，並且訊息被傳遞到細胞。
CD3ζ係T細胞受體複合物的細胞質傳訊結構域。CD3ζ包含三（3）個基於免疫受體酪胺酸的激活模體（ITAM），在T細胞與關聯抗原結合後，它們將激活訊息傳輸到T細胞。在許多情況下，CD3ζ提供主要的T細胞激活訊息，但不提供完全感受態的激活訊息，這需要共刺激傳訊。在一些實例中，本文揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR構建體包含CD3ζ細胞質傳訊結構域，其可以具有SEQ ID NO: 39的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本文揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR多肽可進一步包含一或多個共刺激傳訊結構域。例如，CD28和/或4-1BB的共刺激結構域可用於傳遞完整的增殖/生存訊息，以及CD3ζ介導的主要傳訊。在一些實例中，本文揭露的CAR包含CD28共刺激分子，例如，具有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的CD28共刺激傳訊結構域。在其他實例中，本文揭露的CAR包含4-1BB共刺激分子，例如具有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的4-1BB共刺激訊息結構域。
在具體實例中，本文揭露的抗PTK7 CAR可包括CD3ζ傳訊結構域（例如，SEQ ID NO: 39）和CD28共刺激結構域（例如，SEQ ID NO: 37）。
應當理解，本文描述的方法涵蓋多於一種可用於產生表現CAR的基因工程化T細胞的合適的CAR，例如，本領域已知的或本文揭露的那些。實例可以在例如2019年11月7日提交的國際專利申請案號PCT/IB 2019/059585和2020年11月7日提交的美國專利申請案號16/677207中找到，每個在先申請的相關揭露藉由引用結合於此以用於本文引用之目的和主題。
在特定實例中，本文揭露的抗PTK7 CAR可包含SEQ ID NO: 32-33的胺基酸序列中的任一個。參見下表 1 。示例性抗PTK7 CAR的組分的胺基酸序列在下面的表 1 中提供。
表 1. 抗 PTK7 CAR 組分：
組分 序列 SEQ ID NO
Ab181 VH CDR1 SYGMH 23  
Ab181 VH CDR2 VIWDDGSNKYYVDSVKG 24  
Ab181 VH CDR3 DDYYGSGSFNSYYGTDV 25  
Ab181 VL CDR1 RASQSVSIYLA 26  
Ab181 VL CDR2 DASNRAT 27  
Ab181 VL CDR3 QQRSNWPPFT 28  
Ab181 VH CDR-粗體 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH WVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDV WGQGTTVTVSS 29  
Ab181 VL CDR - 粗體 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLA WYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFT FGPGTKVDIK 30  
Ab181 scFv (連接子帶下劃線) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK 31  
抗PTK7 CAR CD28共刺激   MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 32  
抗PTK7 CAR 41BB共刺激 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 33  
CD8訊息肽 MALPVTALLLPLALLLHAARP 34  
CD8a跨膜 + 5’連接子（帶下劃線的） SAAA FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR 35  
CD8a跨膜 （無連接子） FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR 36  
CD28共刺激 SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 37  
41BB共刺激 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 38  
CD3ζ   RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 39  
也在本文揭露的範圍內的係編碼本文揭露的任何經掩蔽的抗PTK7 CAR構建體的核酸。核酸可以位於合適的載體中，例如病毒載體，例如AAV載體。包含這樣的核酸或載體的宿主細胞也在本揭露之範圍內。
II. 表現經掩蔽的抗 PTK7 CAR 的基因工程化 T 細胞
本揭露之另一方面提供了表現經掩蔽的抗PTK7 CAR（諸如本文揭露的那些）的基因工程化T細胞或基因工程化T細胞的群體。在一些實施方式中，T細胞係人T細胞。可以將用於產生經掩蔽的抗PTK7 CAR的表現盒插入目的基因組位點中。除了編碼經掩蔽的抗PTK7 CAR的核苷酸序列外，表現盒還可包含與CAR編碼序列可操作連接的啟動子，以及視需要一或多個用於調節CAR表現的調節元件。實例包括增強子、緘默子、轉錄因子結合位點、聚腺苷酸化訊息序列或其任何組合。
表現經掩蔽的抗PTK7 CAR的任何基因工程化T細胞可包含一或多個其他基因修飾。在一些實施方式中，表現經掩蔽的抗PTK7 CAR的基因工程化T細胞可以進一步具有被破壞的TRAC 基因、被破壞的B2M 基因或其組合。TRAC 位點的破壞導致T細胞受體（TCR）表現缺失，目的係降低移植物抗宿主病（GvHD）的概率，而β2M 基因座的破壞導致主要組織相容性複合物I型（MHC I）蛋白表現缺失，目的係藉由降低宿主排斥的概率來改善持久性。
如本文所用，術語「被破壞的基因」係指基因含有相對於野生型對應物的一或多個突變（例如，插入、缺失或核苷酸取代等）以實質上減少或完全消除編碼的基因產物的活性。該一或多個突變可以位於非編碼區，例如，啟動子區，調節轉錄或翻譯的調節區；或內含子區。可替代地，該一或多種突變可以位於編碼區（例如，外顯子中）。在一些情況下，被破壞的基因不表現或以大大降低的水平表現編碼蛋白。在其他情況下，被破壞的基因以突變形式表現編碼的蛋白質，該蛋白質沒有功能性或活性大大降低。在一些實施方式中，被破壞的基因係不編碼功能蛋白的基因。在一些實施方式中，包含被破壞的基因的細胞不表現（例如，不在細胞表面表現）該基因編碼的可檢測水平（例如，藉由抗體，例如，藉由流動式細胞分析術）的蛋白質。不表現可檢測水平的蛋白質的細胞可以稱為敲除細胞。例如，如果使用特異性結合β2M 蛋白的抗體在細胞表面不能檢測到β2M 蛋白，則具有β2M 基因編輯的細胞可以認為是β2M 敲除細胞。
在一些實施方式中，可將被破壞的基因描述為包含相對於野生型對應物突變的片段。該突變的片段可以包含缺失、核苷酸取代、添加或其組合。在其他實施方式中，可將被破壞的基因描述為缺失野生型對應物中存在的片段。在一些情況下，該缺失片段的5'末端可以位於設計的指導RNA（如本文揭露的那些）的靶標基因區域內（稱為中靶序列），並且該缺失片段的3'端可以超出靶標區域。可替代地，該缺失片段的3'末端可以位於靶標區域內，而該缺失片段的5'端可以超出靶標區域。
在一些情況下，本文揭露的基因工程化T細胞中的被破壞的TRAC 基因可以包含缺失，例如TRAC 基因座的外顯子1中之片段的缺失。在一些實例中，被破壞的TRAC 基因包含含有SEQ ID NO: 40的核苷酸序列之片段的缺失，該核苷酸序列係TRAC 指導RNA TA-1的靶位點。參見下表 2 。在一些實例中，SEQ ID NO: 40的片段可以被編碼經掩蔽的抗PTK7 CAR的核酸替代。
本文揭露的基因工程化T細胞中的被破壞的B2M 基因可以使用CRISPR/Cas技術產生。在一些實例中， 可以使用表 2 中提供的B2M gRNA。被破壞的B2M基因可包含SEQ ID NO: 60-65中任一個的核苷酸序列。
在一些實施方式中，本文提供了基因工程化免疫細胞（例如，T細胞，例如人T細胞）的群體，其共同（即，在整個細胞群體中）表現本文揭露的任何經掩蔽的抗PYK7 CAR（例如，包含SEQ ID NO: 106-119的胺基酸序列，例如SEQ ID NO: 91-105的經掩蔽的抗PTK7 CAR）、被破壞的TRAC 基因和被破壞的B2M 基因，也如本文所揭露。可以將編碼經掩蔽的抗PTK7 CAR的核酸插入目的基因組位點，例如，在被破壞的TRAC 基因中，從而破壞TRAC 基因的表現。在一些實例中，可以將CAR編碼序列插入SEQ ID NO: 40的位點，例如替代TRAC基因中包含SEQ ID NO: 40的片段。
本文揭露的基因工程化T細胞的群體可為包含具有本文揭露的一或多個基因修飾的T細胞的異質細胞群體，例如，表現經掩蔽的抗PTK7 CAR、具有被破壞的TRAC 基因、具有被破壞的B2M 基因或其組合。
在一些實例中，基因工程化T細胞的群體的至少30%表現可檢測水平的經掩蔽的抗PTK7 CAR。例如，基因工程化T細胞中的至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%表現可檢測水平的經掩蔽的抗PTK7 CAR。
在一些實施方式中，基因工程化T細胞的群體中的至少30%的T細胞可以不表現可檢測水平的β2M表面蛋白。例如，群體中的至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或更多的T細胞可以不表現可檢測水平的β2M表面蛋白。
可替代地或另外地，基因工程化T細胞的群體中的至少50%的T細胞可以不表現可檢測水平的TCR表面蛋白。例如，群體中至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或更多的T細胞可以不表現可檢測水平的TCR表面蛋白。
在一些實施方式中，基因工程化T細胞的群體中相當大百分比的細胞可包含多於一個基因編輯，這導致一定百分比的細胞不表現多於一個基因和/或蛋白。例如，基因工程化T細胞的群體中至少50%的細胞可以不表現可檢測水平的兩種表面蛋白，例如，不表現可檢測水平的β2M和TRAC 蛋白。在一些實例中，群體中50%-100%、50%-90%、50%-80%、50%-70%、50%-60%、60%-100%、60%-90%、60%-80%、60%-70%、70%-100%、70%-90%、70%-80%、80%-100%、80%-90%或90%-100%的細胞不表現可檢測水平的TRAC 和B2M 表面蛋白。
在一些實施方式中，基因工程化T細胞的群體中相當大百分比的細胞可以表現任何經掩蔽的抗PTK7 CAR，具有被破壞的TRAC 基因和被破壞的B2M 基因。可以將編碼經掩蔽的抗PTK7 CAR的表現盒插入到被破壞的TRAC基因中，從而破壞其表現。在一些實例中，被破壞的TRAC基因包含含有SEQ ID NO: 40的核苷酸序列之片段的缺失。可以將CAR表現盒插入缺失位點，例如，替代包含SEQ ID NO: 40的片段。
III. 基因工程化免疫細胞的製備
可以使用本領域已知的任何合適的基因編輯方法來製備本文揭露的基因工程化免疫細胞（例如，表現經掩蔽的抗PTK7 CAR的T細胞，例如人T細胞），例如，使用鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALEN）或RNA指導的CRISPR-Cas9核酸酶（CRISPR/Cas9；聚簇規則間隔短回文重複序列相關9）來進行核酸酶依賴性靶向編輯。在具體實例中，藉由CRISPR技術結合同源重組，使用腺相關病毒載體（AAV）作為供體模板，產生基因工程化免疫細胞，例如T細胞。
(i) CRISPR-Cas9 介導的基因編輯系統
CRISPR-Cas9系統係原核生物中天然存在的防禦機制，其已被重新用作用於基因編輯的RNA指導的DNA靶向平臺。它依賴於DNA核酸酶Cas9和兩個非編碼RNA（crisprRNA (crRNA)和反式激活RNA（tracrRNA））來靶向DNA的切割。CRISPR係聚簇規則間隔短回文重複序列的縮寫，係在細菌和古細菌基因組中發現的DNA序列家族，其包含與先前暴露於細胞（例如病毒）的外源DNA（例如，由感染或攻擊原核生物的病毒暴露於細胞的外源DNA）相似的DNA片段（間隔DNA）。該等DNA片段被原核生物用來在重新引入後，例如在隨後的攻擊中從相似的病毒中檢測和破壞相似的外源DNA。CRISPR基因座的轉錄導致包含間隔子序列的RNA分子的形成，該RNA分子締合併靶向Cas（CRISPR相關）蛋白以能夠識別和剪切外源（外源DNA）。已經描述了許多類型和種類的CRISPR/Cas系統（參見例如，Koonin等人, (2017) Curr Opin Microbiol [微生物學當前觀點]37:67-78）。
crRNA通過典型地與靶DNA中的20個核苷酸（nt）序列的沃森-克裡克鹼基配對來驅動CRISPR-Cas9複合物的序列識別和特異性。改變crRNA中5’ 20nt的序列可將CRISPR-Cas9複合物靶向特定基因座。如果靶序列後面係特定的短DNA序列（序列為NGG）作為原型間隔子相鄰模體（PAM），CRISPR-Cas9複合物僅結合包含與crRNA的前20 nt序列匹配的DNA序列。
TracrRNA與crRNA的3’末端雜交形成RNA雙鏈體結構，該雙鏈體結構與Cas9內切核酸酶結合形成催化活性的CRISPR-Cas9複合物，其然後可以切割靶DNA。
一旦CRISPR-Cas9複合物在靶位點與DNA結合，Cas9酶內的兩個獨立的核酸酶結構域各自切割PAM位點上游的DNA鏈之一，從而留下雙鏈斷裂（DSB），在這裡DNA的兩條鏈以鹼基對（平末端）終止。
CRISPR-Cas9複合物在特定靶位點處與DNA結合並形成位點特異性DSB之後，下一個關鍵步驟係修復DSB。細胞使用兩種主要的DNA修復途徑來修復DSB：非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復（HDR）。
NHEJ係一種穩健的修復機制，在包括非分裂細胞在內的大多數細胞類型中顯現出高活性。NHEJ容易出錯，並且通常會在DSB的位點導致在一個到幾百個核苷酸之間的去除或添加，儘管此類修飾典型地 ＜ 20 nt。產生的插入和缺失（插缺）可以破壞基因的編碼或非編碼區域。可替代地，HDR使用內源性或外源性提供的長段同源供體DNA來以高保真度修復DSB。HDR僅在分裂的細胞中有效，並且在大多數細胞類型中以相對較低的頻率發生。在本揭露之許多實施方式中，NHEJ被作為自發的修復來利用。
(a)  Cas9
在一些實施方式中，Cas9（CRISPR相關蛋白9）核酸內切酶用於CRISPR方法中，該方法用於製備本文揭露的基因工程化T細胞。Cas9酶可為釀膿鏈球菌中的一種，儘管也可以使用其他Cas9同源物。應當理解，如本文所提供的，可以使用野生型Cas9或可以使用Cas9的修飾版本（例如，Cas9的進化版本，或Cas9直向同源物或變體）。在一些實施方式中，Cas9包含釀膿鏈球菌衍生的Cas9核酸酶蛋白，其已被工程改造為包括C末端和N末端SV40大T抗原核定位序列（NLS）。所得的Cas9核酸酶（sNLS-spCas9-sNLS）係162 kDa蛋白，其藉由重組大腸桿菌發酵產生並藉由層析法純化。spCas9胺基酸序列可作為UniProt登錄號Q99ZW2找到，其在本文中作為以下表 2 中提供的SEQ ID NO:69提供。
(b)  指導RNA（gRNA）
如本文所述，CRISPR-Cas9介導的基因編輯包括指導RNA或gRNA的使用。如本文所用，「gRNA」係指基因組靶向核酸，其可以將Cas9引導至TRAC 基因或β2M 基因內的特定靶序列，以在特定靶序列處進行基因編輯。指導RNA至少包含與靶基因內用於進行編輯的靶核酸序列雜交的間隔子序列，以及CRISPR重複序列。
SEQ ID NO: 42或45中提供了靶向TRAC 基因的示例性gRNA。參見下表 2 。還參見WO 2019/097305 A2，其相關揭露內容藉由引用結合於此用於本文引用的主題和目的。可以使用位於第14號染色體上的TRAC 基因序列（GRCh38：第14號染色體：22,547,506-22,552,154；Ensembl；ENSG00000277734）設計其他gRNA序列。在一些實施方式中，靶向TRAC基因組區域的gRNA和Cas9在TRAC基因組區域中產生斷裂，導致TRAC 基因中的插入缺失，其破壞mRNA或蛋白質的表現。
SEQ ID NO: 58或59中提供了靶向β2M 基因的示例性gRNA。參見下表 2 。還參見WO 2019/097305 A2，其相關揭露內容藉由引用結合於此用於本文引用之目的和主題。可以使用位於第15號染色體上的β2M 基因序列（GRCh38座標：染色體15：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710）設計其他gRNA序列。在一些實施方式中，靶向β2M基因組區域的gRNA和RNA指導的核酸酶在β2M 基因組區域中產生斷裂，導致β2M 基因中的插入缺失，其破壞mRNA或蛋白質的表現。
在II型系統中，gRNA還包含稱為tracrRNA序列的第二RNA。在II型gRNA中，CRISPR重複序列和tracrRNA序列彼此雜交形成雙鏈體。在V型gRNA中，crRNA形成雙鏈體。在這兩個系統中，雙鏈體都結合定點多肽，使得指導RNA和定點多肽形成複合物。在一些實施方式中，靶向基因組的核酸由於其與定點多肽的締合而為複合物提供了靶特異性。因此，靶向基因組的核酸指導定點多肽的活性。
如熟悉該項技術者所理解的，每個指導RNA設計為包括與其基因組靶序列互補的間隔子序列。參見Jinek等人, Science [科學], 337, 816-821 (2012)和Deltcheva等人, Nature [自然], 471, 602-607 (2011)。
在一些實施方式中，靶向基因組的核酸（例如，gRNA）係雙分子指導RNA。在一些實施方式中，靶向基因組的核酸（例如，gRNA）係單分子指導RNA。
雙分子指導RNA包含兩條鏈的RNA分子。第一條鏈在5'至3'方向上包含視需要的間隔子延伸序列、間隔子序列和最小CRISPR重複序列。第二條鏈包含最小tracrRNA序列（與最小CRISPR重複序列互補）、3'tracrRNA序列和視需要的tracrRNA延伸序列。
II型系統中的單分子指導RNA（稱為「sgRNA」）在5'至3'方向上包含視需要的間隔子延伸序列、間隔子序列、最小CRISPR重複序列、單分子指導連接子、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和視需要的tracrRNA延伸序列。視需要的tracrRNA延伸序列可以包含為指導RNA貢獻另外的功能（例如，穩定性）的元件。單分子嚮導連接子將最小CRISPR重複序列和最小tracrRNA序列連接起來以形成髮夾結構。視需要的tracrRNA延伸包括一或多個髮夾。V型系統中的單分子指導RNA在5’至3'方向上包含最小CRISPR重複序列和間隔子序列。
「靶序列」在與PAM序列相鄰的靶基因中，並且是要被Cas9修飾的序列。「靶序列」在「靶核酸」中的所謂的PAM鏈上，該靶核酸係包含PAM鏈和互補的非PAM鏈的雙鏈分子。熟悉該項技術者認識到，gRNA間隔子序列與位於目的靶核酸的非PAM鏈中的互補序列雜交。因此，gRNA間隔子序列係靶序列的RNA等同物。
例如，如果TRAC靶序列係'5-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3'（SEQ ID NO: 40），則gRNA間隔子序列係5'-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3'（SEQ ID NO: 43）。在另一個實例中，如果β2M靶序列係5'-GCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3'（SEQ ID NO: 54），則gRNA間隔子序列係5'-GCUACUCUCUCUUUCUGGCC-3'（SEQ ID NO: 56）。gRNA的間隔子經由雜交（即，鹼基配對）以序列特異性方式與目的靶核酸相互作用。因此，間隔子的核苷酸序列根據目的靶核酸的靶序列而變化。
在本文的CRISPR/Cas系統中，將間隔子序列設計成與靶核酸的區域雜交，該區域位於該系統中使用的Cas9酶可識別的PAM的5'。間隔子可以與靶序列完全匹配或可以有錯配。每個Cas9酶都有特定的PAM序列，使得該酶識別靶DNA。例如，釀膿鏈球菌識別靶核酸中的包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N係任何核苷酸並且N緊鄰由間隔子序列靶向的靶核酸序列的3'。
在一些實施方式中，靶核酸序列的長度係20個核苷酸。在一些實施方式中，靶核酸的長度小於20個核苷酸。在一些實施方式中，靶核酸的長度超過20個核苷酸。在一些實施方式中，靶核酸的長度係至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個或更多個核苷酸。在一些實施方式中，靶核酸的長度係至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個或更多個核苷酸。在一些實施方式中，靶核酸序列具有20個緊鄰PAM第一個核苷酸的5'的鹼基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'的序列中，靶核酸可為對應於該多個N的序列，其中N可為任何核苷酸，並且該加下劃線的NRG序列係釀膿鏈球菌PAM。實例提供為SEQ ID NO: 41和55。
本文揭露的指導RNA可以經由crRNA中的間隔子序列靶向任何目的序列。在一些實施方式中，指導RNA的間隔子序列與靶基因中的靶序列之間的互補程度可為約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。在一些實施方式中，指導RNA的間隔子序列與靶基因中的靶序列係100%互補的。在其他實施方式中，指導RNA的間隔子序列和靶基因中的靶序列可以包含多達10個錯配，例如， 多達9個、多達8個、多達7個、多達6個、多達5個、多達4個、多達3個、多達2個或多達1個錯配。
在WO 2019/097305 A2和WO 2019/215500中提供了可如本文所提供的那樣使用的gRNA的非限制性示例，其中每一個的相關揭露內容藉由引用結合在此用於本文所引用之目的和主題。對於本文提供的任何gRNA序列，未明確指示修飾的那些意在包括未修飾的序列和具有任何合適的修飾的序列。
本文揭露的任何gRNA中的間隔子序列的長度可以取決於CRISPR/Cas9系統和用於編輯本文揭露的任何靶基因的組分。例如，來自不同細菌物種的不同Cas9蛋白具有不同的最佳間隔子序列長度。因此，間隔子序列的長度可以具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、或超過50個的核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度可以具有18-24個核苷酸。在一些實施方式中，靶向序列的長度可以具有19-21個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度可包含20個核苷酸。
在一些實施方式中，gRNA可為sgRNA，其可以在sgRNA序列的5'末端包含20個核苷酸間隔子序列。在一些實施方式中，sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含少於20個核苷酸的間隔子序列。在一些實施方式中，sgRNA可以在sgRNA序列的5’末端包含大於20個核苷酸的間隔子序列。在一些實施方式中，sgRNA在sgRNA序列的5’末端包含具有17-30個核苷酸的可變長度的間隔子序列。
在一些實施方式中，sgRNA在sgRNA序列的3’末端不包含尿嘧啶。在其他實施方式中，sgRNA可以在sgRNA序列的3’末端包含一或多個尿嘧啶。例如，sgRNA可以在sgRNA序列的3'末端包含1-8個尿嘧啶殘基，例如，在sgRNA序列的3’末端包含1、2、3、4、5、6、7或8個尿嘧啶殘基。
本文揭露的任何gRNA，包括任何sgRNA，可為未修飾的。可替代地，它可以包含一或多個經修飾的核苷酸和/或經修飾的主鏈。例如，經修飾的gRNA（例如sgRNA）可以包含一或多個2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸，其可以位於5’末端、3'末端或這兩個末端。
在某些實施方式中，一種以上的指導RNA可以與CRISPR/Cas核酸酶系統一起使用。每種指導RNA可包含不同的靶向序列，以使CRISPR/Cas系統切割一種以上的靶核酸。在一些實施方式中，一或多種指導RNA可以在Cas9 RNP複合物中具有相同或不同的性質，例如活性或穩定性。當使用一種以上指導RNA時，每種指導RNA可以在相同或不同的載體上編碼。用於驅動一種以上指導RNA表現的啟動子是相同或不同的。
應當理解，在本文所述之方法中可以使用一種以上的合適的Cas9和一種以上的合適的gRNA，例如，本領域已知的或本文揭露的那些。在一些實施方式中，方法包括本領域已知的Cas9酶和/或gRNA。實例可在例如WO 2019/ 097305 A2和WO2019/215500中找到，其中每一個的相關揭露內容藉由引用結合在此用於本文所引用之目的和主題。
以下表 2 提供了用於TRAC和B2M基因的基因編輯的示例性組分。
表 2. 用於 TRAC和 B2M 基因的基因修飾的示例性組分
描述 序列 SEQ ID NO
TRAC 靶序列 AGAGCAACAGTGCTGTGGCC 40
具有（PAM）的TRAC靶序列 5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC (TGG)-3' 41
未修飾的TRAC sgRNA（TA-1） AGAGCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU 42
未修飾的TRAC sgRNA間隔子 AGAGCAACAGUGCUGUGGCC 43
經修飾的TRAC sgRNA間隔子 A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCC 44
經修飾的TRAC sgRNA（TA-1） A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U 45
TRAC 基因編輯 AAGAGCAACAAATCTGACT 46
TRAC 基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 47
TRAC 基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 48
TRAC 基因編輯 AAGAGCAACAGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 49
TRAC 基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGACTAAGAGCAACAAATCTGACT 50
TRAC 基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGTGGGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 51
TRAC 基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 52
TRAC 基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGTGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAAATCTGACT 53
B2M 靶序列 GCTACTCTCTCTTTCTGGCC 54
具有（PAM）的B2M靶序列 GCTACTCTCTCTTTCTGGCC（TGG） 55
未修 飾的56B2M sgRNA間隔子 GCUACUCUCUCUUUCUGGCC 56
經修飾的B2M sgRNA間隔子 G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCC 57
未修飾的B2M sgRNA GCUACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU 58
經修飾的B2M sgRNA G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U 59
B2M 基因-編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 60
B2M 基因-編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 61
B2M 基因-編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 62
B2M 基因-編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGATAGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 63
B2M 基因-編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 64
B2M 基因-編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 65
sgRNA nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu 66
sgRNA nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc 67
sgRNA n(17-30) guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuagu c cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu(1-8) 68
spCas9 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD 69
*指示具有2’-O甲基硫代磷酸酯修飾的核苷酸。 「n」係指5’末端處的間隔子序列。
(ii) 用於將 CAR 構建體遞送至 T 細胞的 AAV 載體
可使用腺相關病毒（AAV）將編碼本文揭露的任何經掩蔽的抗PTK7 CAR構建體的核酸遞送至細胞。AAV係小病毒，其位點特異性整合到宿主基因組中，並且因此可以遞送轉基因，例如CAR。存在反向末端重複序列（ITR），位於AAV基因組和/或目標轉基因的側翼，並用作複製起點。AAV基因組中還存在rep和cap蛋白，它們在轉錄時形成衣殼，該衣殼封裝了AAV基因組以遞送到靶細胞中。該等衣殼上的表面受體會賦予AAV血清型，其決定衣殼主要結合哪個靶器官，並且因此決定AAV將最有效地感染哪些細胞。目前已知十二種人AAV血清型。在一些實施方式中，用於遞送CAR編碼核酸的AAV係AAV血清型6（AAV6）。
出於多種原因，腺相關病毒係用於基因治療的最常用病毒之一。首先，AAV在投與於包括人在內的哺乳動物後不會引起免疫反應。第二，將AAV有效地遞送至靶細胞，尤其是在考慮選擇合適的AAV血清型時。最後，因為基因組可以在宿主細胞中持續存在而不整合，AAV具有感染分裂和非分裂細胞的能力。這種特性使它們成為基因治療的理想候選。
可以設計編碼經掩蔽的抗PTK7 CAR的核酸，以插入宿主T細胞中之目的基因組位點中。在一些實施方式中，靶基因組位點可以在安全港基因座中。
在一些實施方式中，編碼經掩蔽的抗PTK7 CAR的核酸（例如，經由供體模板，其可由病毒載體例如腺相關病毒（AAV）載體攜帶）可被設計成使得其可插入TRAC 基因內的位置以破壞基因工程化T細胞中的TRAC 基因並表現CAR多肽。TRAC 的破壞導致內源性TCR的功能喪失。例如，TRAC 基因中的破壞可以用核酸內切酶（如本文所述之那些）和靶向一或多個TRAC 基因組區域的一或多個gRNAs來產生。對TRAC 基因和靶區域特異的任何gRNA可用於此目的，例如，本文揭露的那些。
在一些實例中，TRAC 基因中的基因組缺失和由CAR編碼片段的替換可以藉由同源定向修復或HDR（例如，使用供體模板，其可為病毒載體例如腺相關病毒（AAV）載體的一部分）來產生。在一些實施方式中，TRAC 基因中的破壞可以利用核酸內切酶（如本文所揭露的那些）和靶向一或多個TRAC 基因組區域的一或多個gRNA並將CAR編碼片段插入TRAC 基因中來產生。
如本文揭露的供體模板可以包含CAR的編碼序列。在一些實例中，CAR編碼序列的兩側可以有兩個同源區，以允許使用CRISPR-Cas9基因編輯技術在目的基因組位置處（例如，在TRAC 基因處）的有效HDR。在這種情況下，靶基因座處的DNA的兩條鏈都可以被CRISPR Cas9酶切割，該CRISPR Cas9酶由靶位點特異性的gRNA指導。然後發生HDR，以修復雙鏈斷裂（DSB）並插入編碼CAR的供體DNA。為了使此正確發生，設計供體序列的側翼殘基與靶基因（例如TRAC 基因）中DSB位點周圍的序列（以下簡稱「同源臂」）互補。該等同源臂用作DSB修復的模板，並使HDR成為基本無錯誤的機制。同源定向修復（HDR）的速率係突變與切割位點之間的距離的函數，因此選擇重疊或附近的靶位點很重要。模板可以包括同源區側翼的額外序列或者可以含有與基因組序列不同的序列，從而可以進行序列編輯。
可替代地，供體模板可以與DNA中的靶位置不具有同源區域，並且可以藉由在靶位點切割後藉由NHEJ依賴性末端連接而整合。
供體模板可為單鏈和/或雙鏈的DNA或RNA，並且可以線性或環狀形式引入細胞中。如果以線性形式引入，則可以藉由熟悉該項技術者已知的方法保護供體序列的末端（例如，以防止核酸外切降解）。例如，將一或多個雙去氧核苷酸殘基添加至線性分子的3'末端和/或將自身互補的寡核苷酸連接至一個或兩個末端。參見，例如，Chang等人，（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 84:4959-4963；Nehls等人 (1996) Science [科學] 272:886-889。保護外源多核苷酸免於降解的其他方法包括但不限於一或多個末端胺基基團的添加和經修飾的核苷酸間鍵的使用，例如硫代磷酸酯、胺基磷酸酯和O-甲基核糖或去氧核糖殘基。
可以將供體模板作為載體分子的一部分引入細胞中，該載體分子具有另外的序列，例如複製起點、啟動子和編碼抗生素抗性的基因。此外，供體模板可以作為裸露的核酸引入細胞（作為與試劑（例如脂質體或泊洛沙姆）複合的核酸引入），或可以藉由病毒遞送（例如，腺病毒、AAV、皰疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒（IDLV））。
在一些實施方式中，供體模板可以插入在內源啟動子附近的位點（例如，下游或上游），從而其表現可以由內源啟動子驅動。在其他實施方式中，供體模板可包含外源啟動子和/或增強子，例如組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性啟動子，以控制CAR基因的表現。在一些實施方式中，外源啟動子係EF1α啟動子。可以使用其他啟動子。
此外，外源序列還可包括轉錄或翻譯調節序列，例如啟動子、增強子、絕緣子、內部核糖體進入位點、編碼2A肽的序列和/或聚腺苷酸化訊息。
以下表 3 提供了用於在TRAC基因座中插入編碼經掩蔽的抗PTK7 CAR的核酸的示例性供體模板組分。示例性供體結構可以從5'末端到3'末端包含：TRAC[LHA]-EF1a[啟動子]-經掩蔽的CAR-聚A-TRAC[RHA]。
表 3. 供體模板組分的序列
名稱 序列 SEQ ID NO
TRAC-LHA GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCA 70
EF1α啟動子 GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA 71
合成的聚(A)訊息 AATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG 72
TRAC-RHA TGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG 73
為了製備基因工程化免疫細胞（例如，本文揭露的T細胞），可以從合適的來源獲得免疫細胞，例如T細胞，例如，來自人供體的血細胞，人供體可為健康供體或需要CAR-T細胞療法的患者。可以使用來自一或多個健康人供體的血細胞製備基因工程化細胞。由健康的供體細胞製造可最大程度地減少意外轉導惡性淋巴瘤/白血病細胞的風險，並可以潛在地改善CAR T細胞的功能。CRISPR系統的組分（例如Cas9蛋白和gRNA），視需要AAV供體模板，可以通過常規方法遞送到宿主免疫細胞中。在一些實例中，Cas9和gRNA可以形成核糖核蛋白複合物（RNP），其可以藉由電穿孔遞送至宿主免疫細胞。視需要，可以將AAV供體模板與RNP複合物同時遞送至免疫細胞。可替代地，可以順序地執行RNP和AAV供體模板的遞送。在一些實例中，可以在遞送基因編輯組分之前激活T細胞。
遞送基因編輯組分和視需要的供體模板後，可回收細胞並在體外擴增。可以使用常規方法評估基因編輯效率，以確認經掩蔽的抗PTK7 CAR的敲入和靶基因（例如TRAC ，B2M 或兩者）的敲除。在一些實例中，可以去除TCRαβ+ T細胞。
IV. 治療方法和組成物
在另一方面，本文提供表現經掩蔽的抗PTK7 CAR的任何基因工程化免疫細胞，例如本文揭露的T細胞的治療應用。這樣的治療應用包括消除表現PTK7的疾病細胞，例如PTK7+ 癌細胞。
任何基因工程化免疫細胞，例如本文揭露的T細胞（例如，表現本文也揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR並具有一或多個另外的遺傳編輯，例如被破壞的TRAC基因和/或被破壞的B2M基因的那些細胞）可以配製成藥物組成物，該藥物組成物可以進一步包含一或多種藥學上可接受的賦形劑。這樣的藥物組成物也在本揭露之範圍內。該藥物組成物可用於治療應用，例如在人患者中的癌症治療，其也在本文中揭露。
如本文所用，術語「藥學上可接受的」係指在合理醫學判斷的範圍內適合於與受試者的組織、器官和/或體液接觸使用而無過多毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的效益/風險比相稱的那些化合物、材料、組成物、和/或劑型。如本文所用，術語「藥學上可接受的載劑」係指生理上相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑、抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑或類似物。組成物可以包含藥學上可接受的鹽，例如酸加成鹽或鹼加成鹽。參見，例如，Berge 等人 , (1977) J Pharm Sci[ 藥物科學雜誌 ] 66:1-19 。
在一些實施方式中，該藥物組成物進一步包括藥學上可接受的鹽。藥學上可接受的鹽之非限制性實例包括酸加成鹽（由多肽的游離胺基與無機酸或有機酸形成）。在一些實施方式中，與游離羧基形成的鹽衍生自無機鹼或有機鹼。在一些實施方式中，本文揭露的藥物組成物包括懸浮在低溫保存溶液（例如，CryoStor® C55）中的表現本文揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR的基因工程化CAR-T細胞的群體。
在一些實施方式中，表現如本文揭露的經掩蔽的抗PTK7 CAR的任何基因工程化T細胞可用於減少或消除表現PTK7的疾病細胞，並因此治療涉及這樣的疾病細胞的疾病。例如，本文揭露的治療方法可以應用於患有癌症的患者（ 例如，人患者），特別是相對於正常組織呈現蛋白酶水平（例如，蛋白水平或生物活性水平）升高的癌症。為了治療這樣的癌症，可以使用基因工程化T細胞，該基因工程化T細胞表現包含蛋白酶裂解位點的經掩蔽的抗PTK CAR，該蛋白酶裂解位點可被呈現在癌症部位的蛋白酶識別。
非限制性靶癌症（例如實性瘤）包括胰臟癌、胃癌、卵巢癌、大腸癌、子宮癌、乳癌（例如三陰性癌）、食管癌、前列腺癌、睪丸癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、膠質母細胞瘤、神經元癌、軟組織肉瘤、黑色素瘤。在其他實例中，靶癌症係白血病，例如成人急性髓細胞性白血病（AML）。
如本文所用，術語「治療」係指將包括一或多種活性劑的組成物應用或投與給具有靶疾病或障礙、該疾病/障礙的症狀或對該疾病/障礙的易感的受試者，目的係治癒、癒合、減輕、緩解、改變、補救、改善、改進或影響該障礙、該疾病的症狀或對該疾病或障礙的易感。
緩解靶疾病/障礙包括延遲疾病的發展或進展，或降低疾病嚴重程度或延長生存期。緩解疾病或延長生存期並不一定需要治癒性結果。如本文所用，「延遲」靶疾病或障礙的發展係指推遲、阻礙、減緩、減慢、穩定、抑制和/或延緩疾病的進展。該延遲可以具有不同的時間長度，其取決於疾病的歷史和/或被治療的個體。「延遲」或緩解疾病的發展或延遲疾病的發作的方法是當與不使用該方法相比時，在給定時間框架內降低出現該疾病的一或多個症狀的概率和/或在給定時間框架內降低症狀的程度的方法。這種比較通常基於臨床研究，使用足夠多的受試者來給出統計上有意義的結果。
疾病的「發展」或「進展」係指疾病的最初表現和/或隨後的進展。可以使用本領域公知的標準臨床技術檢測和評估疾病的發展。但是，發展也指可能無法檢測到的進展。為了本揭露之目的，發展或進展係指症狀的生物學過程。「發展」包括發生、復發和發病。如本文所用，靶疾病或障礙的「發病」或「發生」包括最初發病和/或復發。
為了執行本文揭露的方法，可向需要治療的受試者（例如，具有本文揭露的靶癌症的人患者）投與有效量的表現經掩蔽的抗PTK7 CAR和視需要的一或多個另外基因修飾（例如，被破壞的TRAC基因和/或被破壞的B2M基因）的基因工程化T細胞。受試者可為期望對其進行診斷，治療或療法的任何受試者。在一些實施方式中，受試者係哺乳動物。在一些實施方式中，受試者係人。
如本文所用，「有效量」係指單獨或與一或多種其他活性劑組合對受試者產生治療效果所需的每種活性劑的量。對熟悉該項技術者來說，確定抗體的量是否達到治療效果係明顯的。如熟悉該項技術者所認識到的，有效量根據所治療的特定病症，病症的嚴重程度，包括年齡、身體狀況、體型、性別和體重的個體患者參數，治療的持續時間，並行療法的性質（如果有的話），特定投與途徑以及醫療保健從業人員的知識和專長範圍內的類似因素而變化。該等因素係熟悉該項技術者所熟知的，並且可以僅通過常規實驗來解決。通常較佳的是使用單個組分或其組合的最大劑量，即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。
在一些實施方式中，有效量係指預防或減輕醫學病症（例如，癌症）的至少一或多種體征或症狀所需的如本文揭露的工程改造的T細胞的群體的量，並且涉及足以提供所希望的效果（例如，治療患有醫學病症的受試者）的組成物的量。有效量還包括足以預防或延遲疾病症狀的發展、改變疾病症狀的進程（例如但不限於減慢疾病症狀的進展）或逆轉疾病症狀的量。應當理解，對於任何給定的情況，本領域的普通技術者可以使用常規實驗來測定適當的有效量。
為了在本文描述的各個方面中使用，有效量的細胞（例如工程改造的T細胞）可以包括至少5 X 105 個細胞、至少1 X 106 個細胞、至少5 X 106 個細胞、至少1 X 107 個細胞或至少5 X 107 個細胞。
在一些實例中，基因工程化T細胞衍生自待治療的患者，即，該細胞係自體細胞；即，該等工程改造的T細胞係從受試者獲得或分離並投與給相同受試者的。
在其他實施方式中，基因工程化T細胞衍生自一或多個供體（例如，健康人供體），用於同種異體過繼細胞療法。「同種異體」係指從相同物種的一或多個不同供體獲得的細胞、細胞群、或包含細胞的生物學樣本，其中一或多個基因座處的基因與受體不同。例如，投與於受試者的工程改造的T細胞群體可以衍生自一或多個不相關的供體，或衍生自一或多個不同的同胞。供體係非正在治療的受試者的個體。在一些實施方式中，供體係不患有或不懷疑患有要治療的癌症的個體。
在一些實施方式中，可以使用多個供體，例如兩個或更多個供體。在本文所述之一些實例中，將細胞在投與給有需要的受試者之前在培養中擴增。
投與步驟可包括藉由引入的細胞至少部分定位在所希望位點（例如，腫瘤）的方法或途徑將細胞（例如，工程改造的T細胞）放置（例如，移植）到受試者體內，從而產生所希望的一或多種效果。工程改造的T細胞可以藉由任何適當的途徑投與，該途徑導致遞送至受試者中的所需位置，在該位置中至少一部分植入的細胞或細胞組分保持活力。在投與於受試者後，細胞的活力期可以短至數小時（例如二十四小時）、幾天，長達數年，或甚至受試者的壽命（即長期植入）。例如，在本文所述之一些方面，有效量的工程改造的T細胞係經由全身性投與途徑（如腹膜內或靜脈內途徑）投與的。
投與模式包括注射、輸注、滴注或攝取。注射包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、心室內、囊內、眶內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、被膜下、蛛網膜下、脊柱內、脊髓內和胸骨內注射和輸注。在一些實施方式中，該途徑係靜脈內。
在一些實施方式中，全身性投與工程改造的T細胞，這係指將細胞群體以不同於直接投與至靶部位、組織或器官的方式投與，而是使其進入受試者的循環系統，從而經受代謝和其他類似過程。
適用於本文揭露的治療方法的任何受試者（例如，人患者）可接受淋巴消耗療法，以減少或消耗受試者的內源性淋巴細胞。淋巴消耗係指內源性淋巴細胞和/或T細胞的破壞，該破壞常用於免疫移植和免疫療法前。淋巴消耗可以藉由輻照和/或化療來實現。「淋巴消耗劑」可為當投與給受試者時能夠減少、消耗或消除內源性淋巴細胞和/或T細胞的任何分子。在一些實施方式中，淋巴消耗劑以將淋巴細胞數量與投與前的淋巴細胞數量相比有效減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、96%、97%、98%或至少99%的量投與。在一些實施方式中，淋巴消耗劑以有效減少淋巴細胞數量的量投與，使得受試者中的淋巴細胞數量低於檢測限度。在一些實施方式中，給受試者投與至少一種（ 例如2、3、4、5或更多種）淋巴消耗劑。
在一些實施方式中，淋巴消耗劑係特異性殺傷淋巴細胞的細胞毒性劑。淋巴消耗劑之實例包括但不限於氟達拉濱、環磷醯胺、苯達莫司汀、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、甲胺蝶呤、達卡巴𠯤、馬法蘭、阿黴素、長春鹼、順鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多西他賽、伊立替康、依託泊甙磷酸酯、米托蒽醌、克拉屈濱、地尼介白素（denileukin diftitox）或DAB-IL2。在一些情況下，淋巴消耗劑可能伴隨低劑量輻照。調理方案的淋巴消耗效果可以經由常規實踐進行監測。
本文揭露的治療的功效可由熟練的臨床醫生確定。如果疾病（例如，癌症）的任何一種或所有體征或症狀（舉一個例子，以有益的方式改變功能性靶標的水平（例如，增加至少10%））或其他臨床上可接受的症狀或標誌物得到改善或減輕，則該治療可以被認為是「有效治療」。功效還可以藉由如藉由住院治療或需要醫療干預所評估的受試者惡化的失敗（例如，疾病進展停止或至少減慢）來測量。測量該等指標的方法係熟悉該項技術者已知的和/或本文所述的。治療功效包括但不限於，(1) 抑制疾病，例如，阻止或減緩症狀的進展；或 (2) 減輕疾病，例如引起症狀消退；以及（3）預防或降低症狀發展的可能性。
V. CAR-T 細胞療法套組
本揭露還提供了用於在治療靶疾病（例如癌症，例如本文揭露的那些）之方法中使用的套組（kit），該套組用於基因工程化免疫細胞（例如T細胞）的群體的使用，該免疫細胞表現經掩蔽的抗PTK7 CAR並且視需要具有一或多個另外的基因修飾，如本文所述之被破壞的TRAC和/或被破壞的B2M。這樣的套組可以包括一或多個容器，該容器包含第一藥物組成物和第二藥物組成物以及藥學上可接受的載劑，該第一藥物組成物包含一或多種淋巴消耗劑，該第二藥物組成物包含任何核酸或基因工程化T細胞的群體（例如，本文描述的那些）。
在一些實施方式中，套組可包含用於本文所述任何方法的說明書。所包括的說明書可以包括對受試者投與第一和/或第二藥物組成物以在人患者中實現預期活性的描述。套組還可以包括基於鑒定人患者是否需要治療來選擇適合於治療的人患者的描述。在一些實施方式中，說明書包括對需要治療的人患者投與第一和第二藥物組成物的描述。
與使用本文所述之基因工程化T細胞的群體有關的說明書通常包括關於劑量、給藥時間表和用於預期治療的投與途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝包裝（例如，多劑量包裝）或亞單位劑量。在本揭露之套組中提供的說明書通常是在標籤或包裝插頁上的書面說明書。標籤或包裝插頁指示基因工程化T細胞的群體用於治療、延遲發作和/或緩解受試者的癌症。
本文提供的套組在適當的包裝中。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐子、柔性包裝等等。還考慮了與特定裝置（例如吸入器、鼻投與裝置或輸注裝置）組合使用的包裝。套組可以具有無菌的進口端（例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有能夠被皮下注射針刺破的塞子的小瓶）。容器還可以具有無菌的進入口。藥物組成物中的至少一種活性劑係本文揭露的基因工程化T細胞的群體。
套組可以視需要提供另外組分，例如緩衝液和解釋性資訊。通常，套組包含容器和在容器上或與容器相關的標籤或一或多個包裝插頁。在一些實施方式中，本揭露提供了包含上述套組的內容物的製品。
通用技術
除非另有指示，否則本揭露之實踐將採用分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，該技術在本領域的技術範圍內。此類技術在文獻中有充分說明，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual[ 分子選殖：實驗室手冊 ], 第二版 (Sambrook,等人, 1989) Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社];Oligonucleotide Synthesis [寡核苷酸合成] (M. J. Gait編輯 1984);Methods in Molecular Biology [分子生物學方法], Humana Press[哈瑪納出版社];Cell Biology: A Laboratory Notebook [細胞生物學：實驗室筆記本] (J. E. Cellis編輯, 1989) Academic Press[學術出版社]; Animal Cell Culture[動物細胞培養] (R. I. Freshney編輯 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture[細胞和組織培養導論] (J. P. Mather和P. E. Roberts, 1998) Plenum Press[普萊紐姆出版社]; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures[細胞和組織培養：實驗室程序] (A. Doyle, J. B. Griffiths, 和D. G. Newell編輯 1993-8) J. Wiley and Sons[威利父子出版社]; Methods in Enzymology[酶學方法] (Academic Press, Inc.[學術出版社公司]); Handbook of Experimental Immunology[實驗免疫學手冊] (D. M. Weir和C. C. Blackwell編輯): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[哺乳動物細胞的基因轉移載體] (J. M. Miller和M. P. Calos編輯, 1987); Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學當前方案] (F. M. Ausubel,等人 編輯 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction[PCR: 聚合酶鏈反應], (Mullis,等人編輯 1994); Current Protocols in Immunology[免疫學當前方案] (J. E. Coligan等人編輯, 1991); Short Protocols in Molecular Biology[分子生物學簡短方案] (Wiley and Sons[威利父子出版社], 1999); Immunobiology[免疫生物學] (C. A. Janeway 和P. Travers, 1997); Antibodies[抗體] (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach[抗體：實用方法] (D. Catty.編輯, IRL Press[IRL出版社], 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach[單株抗體：實用方法] (P. Shepherd和C. Dean編輯, Oxford University Press[牛津大學出版社], 2000); Using antibodies: a laboratory manual[使用抗體：實驗室手冊] (E. Harlow 和D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社], 1999); The Antibodies[抗體] (M. Zanetti 和J. D. Capra編輯 Harwood Academic Publishers[哈伍德學術出版社], 1995);DNA Cloning: A practical Approach[DNA 選殖：實用方法 ], 第I和II卷 (D.N. Glover 編輯 1985);Nucleic Acid Hybridization[ 核酸雜交 ] (B.D. Hames & S.J. Higgins 編輯(1985»;Transcription and Translation[ 轉錄和翻譯 ] (B.D. Hames & S.J. Higgins編輯 (1984»;Animal Cell Culture[ 動物細胞培養 ] (R.I. Freshney編輯 (1986»;Immobilized Cells and Enzymes[ 固定化細胞和酶 ] (lRL Press[lRL出版社], (1986»; 和B. Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning[ 分子選殖實用指南 ] (1984); F.M. Ausubel等人 (編輯)。
無需進一步詳細闡述，相信本領域的普通技術者可以基於以上描述在其最大程度上利用本發明。因此以下特定實施方式將被解釋為僅是說明性的，並且無論如何並非以任何方式限制本揭露之其餘內容。本文引用的所有出版物均為本文引用之目的或主題藉由引用併入。
實例
實例 1 ：抗 PTK7 抗體 Ab181 特異的掩蔽肽的鑒定。
本實例描述了使用兩種不同的噬菌體展示篩選測定法鑒定能夠阻斷抗PTK7抗體Ab181與PTK7抗原結合的掩蔽肽。篩選1使用X15 /X19 肽的肽庫格式。篩選2使用Xn CXn CXn 肽的肽庫格式。篩選1和篩選2都使用了一系列嚴格程度越來越高的篩選輪來鑒定特定的肽結合物。
篩選1產生了2個獨特肽序列（表 4 ），作為針對抗體和CAR的掩蔽肽進行測試。篩選2共產生27個獨特肽序列，從中根據序列富集水平和篩選後驗證分析的性能選擇12個獨特的肽序列（表 5）進行測試。
表 4. 篩選 1 中掩蔽鑒定的 Ab181 結合結構域的獨特肽序列。
掩蔽名稱 序列 SEQ ID NO:
P1 EVAPGKRWFYNHVKQVPHLV 1
P2 HEEVHMRPNKLSLTWAYTGPQLR 2
表 5. 篩選 2 中掩蔽鑒定的 Ab181 結合結構域的獨特肽序列。
掩蔽名稱 家族 選定的名單 序列 SEQ ID NO:
M3 1 CSP_R2_38 CTMPPSPRSKVIC 3
M4 1 CSP_R2_29 CTFPNTTMQRTFC 4
M5 1 CSP_R2_10 CTYPSWVAYIRFC 5
M6 1 CSP_R2_2 VCTYPPAHRTRFC 6
M7 1 CSP_R2_28 CTMPYHIHSIGLC 7
M8 1 CSP_R2_19 WCTIPSSMSIRLC 8
M9 2 CSP_R2_22 CHIGKRPVPCLWI 9
M10 2 CSP_R2_39 CYIGLRMVPCFHM 10
M11 1 CSP_R3P2_25 CTMPSHAVASFLC 11
M12 1 CSP_R3P3_53 CTMPVHTYSQWLC 12
M13 1 CSP_R3P2_26 CTYPPRFHMHWLC 13
M14 3 CSP_R2_25 CTHVAQWAIKAFC 14
實例 2 ：工程改造經掩蔽的抗體和經掩蔽的 CAR 構建體。
使用實例1中描述的噬菌體展示庫篩選中鑒定的序列設計經掩蔽抗體和經掩蔽的CAR。對於經掩蔽的抗體構建體，藉由柔性連接模體列將掩蔽肽添加到Ab181 IgG1κ重鏈（HC），該柔性連接模體列還包含用於基質金屬蛋白酶（MMP）切割的底物序列（PLGLA；SEQ ID NO: 15）（表 6 ）。藉由包括經由柔性PLGLA-底物連接子與PTK7 CAR CTX-181的scFv連接的掩蔽肽序列來設計經掩蔽的CAR，保持CTX-181序列的其他元件與未掩蔽CAR相同（表 7 ）。
表 6. 經掩蔽的抗體序列。
抗體 重鏈序列 輕鏈序列
Ab181 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA VIWDDGSNKYYVDSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DDYYGSGSFNSYYGTDV WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 75) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQSVSIYLA WYQQKPGQAPRLLIY DASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQRSNWPPFT FGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 74)
Ab181.P1 EVAPGKRWFYNHVKQVPHLV GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 76) 與Ab181 相同
Ab181.P2 HEEVHMRPNKLSLTWAYTGPQLR GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 77) 與Ab181 相同
Ab181.M3 QG CTMPPSPRSKVIC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 78) 與Ab181 相同
Ab181.M4 QG CTFPNTTMQRTFC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 79) 與Ab181 相同
Ab181.M5 QG CTYPSWVAYIRFC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 80) 與Ab181 相同
Ab181.M6 QG VCTYPPAHRTRFC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 81) 與Ab181 相同
Ab181.M7 QG CTMPYHIHSIGLC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 82) 與Ab181 相同
Ab181.M8 QG WCTIPSSMSIRLC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 83) 與Ab181 相同
Ab181.M9 QG CHIGKRPVPCLWI GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 84) 與Ab181 相同
Ab181.M10 QG CYIGLRMVPCFHM GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 85) 與Ab181 相同
Ab181.M11 QG CTMPSHAVASFLC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 86) 與Ab181 相同
Ab181.M12 QG CTMPVHTYSQWLC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 87) 與Ab181 相同
Ab181.M13 QG CTYPPRFHMHWLC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 88) 與Ab181 相同
Ab181.M14 QG CTHVAQWAIKAFC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 89) 與Ab181 相同
每個經掩蔽的抗體（表 6 ）或經掩蔽的CAR（表 7 ） 中的掩蔽肽用黑體並加下劃線表示。親本Ab181中的重鏈和輕鏈互補決定區（遵循Kabat編號方案）用黑體並斜體表示。還參見以上表 1 。CAR序列（表 7 ） 中的訊息序列被斜體化，每個CAR構建體中的細胞外抗原結合結構域（不包括訊息肽）被加下劃線。
表 7. 經掩蔽的 CAR 序列。
經掩蔽的 CAR CAR 序列
CTX181 （未掩蔽的 CAR ） MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （具有訊息肽SEQ ID NO: 90；無訊息肽SEQ ID NO: 105；胞外結構域SEQ ID NO: 120）
CTX181.P1 MALPVTALLLPLALLLHAARP EVAPGKRWFYNHVKQVPHLV GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （具有訊息肽SEQ ID NO: 91；無訊息肽SEQ ID NO: 106；胞外結構域SEQ ID NO: 121）
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CTX181.M8 MALPVTALLLPLALLLHAARP QGWCTIPSSMSIRLC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （具有訊息肽SEQ ID NO: 98；無訊息肽SEQ ID NO: 113；胞外結構域SEQ ID NO: 128）
CTX181.M9 MALPVTALLLPLALLLHAARP QGCHIGKRPVPCLWI GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （具有訊息肽SEQ ID NO: 99；無訊息肽SEQ ID NO: 114；胞外結構域SEQ ID NO: 129）
CTX181.M10 MALPVTALLLPLALLLHAARP QGCYIGLRMVPCFHM GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （具有訊息肽SEQ ID NO: 100；無訊息肽SEQ ID NO: 115；胞外結構域SEQ ID NO: 130）
CTX181.M11 MALPVTALLLPLALLLHAARP QGCTMPSHAVASFLC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （具有訊息肽SEQ ID NO: 101；無訊息肽SEQ ID NO: 116；胞外結構域SEQ ID NO: 131）
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CTX181.M14 MALPVTALLLPLALLLHAARP QGCTHVAQWAIKAFC GSSGGSGGSGGSGGGPLGLAGGSSGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDDYYGSGSFNSYYGTDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSIYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK SAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （具有訊息肽SEQ ID NO: 104；無訊息肽SEQ ID NO: 119；胞外結構域SEQ ID NO: 134）
實例 3 ：確定經掩蔽的抗 PTK7 抗體的結合親和力和藉由 MMP14 處理逆轉結合抑制。
為了測試不同的掩蔽肽掩蔽抗PTK7抗體和/或抑制抗PTK7抗體結合的能力，對PTK7陽性細胞系SaOS-2（骨肉瘤）進行了結合滴定測定。將細胞鋪板（0.2 x 106 細胞/每個孔），並與劑量滴定（500 nM至0.011 nM）的表 6 中所列抗體孵育。將細胞與抗體在4°C孵育30分鐘，然後洗滌並與通用第二抗體，軛合至APC的鼠抗人Fc（生物傳奇公司（Biolegend）cat #409305）在4°C孵育30分鐘。洗滌後，將細胞以1 : 1的比例在固定緩衝液（IC固定緩衝液，e生物科學公司（eBioscience）cat #00-8222-49）中固定，總體積為200 µL，並在流式細胞儀（新賽特公司（Novocyte））上運行，每孔收集10,000個事件。根據無抗體對照（0 nM）設定的基線計算陽性細胞百分比，並使用總單線體細胞群體的幾何平均螢光強度（MFI）使用4參數非線性回歸公式（Prism Graphpad）建立結合滴定曲線（圖 1A ）。根據結合曲線計算表觀EC50 值，並且掩蔽肽按照最低到最高的EC50 的順序排列，如圖 1B 所示。
該等結果證明了不同的掩蔽肽在經掩蔽的抗體形式下的結合親和力範圍，這使得在經掩蔽的抗體形式下的掩蔽肽能夠用於抑制Ab181與靶細胞上的抗原PTK7的結合。
除了評估掩蔽肽用於抑制抗體與細胞表面的PTK7結合的強度外，還證明當經掩蔽的抗體被MMP處理時，這種抑制係可逆的，MMP係蛋白酶，其切割將掩蔽肽與抗體連接的連接子。使用體外結合測定測試了MMP2、MMP9和MMP14切割該序列的能力。MMP14提供比MMP2和MMP9更穩健的切割，因此使用MMP14進行掩蔽逆轉研究。根據結合曲線譜、序列相似性和表觀EC50 從14個候選抗體中選出經掩蔽的抗體的子集（6）。經掩蔽的和未掩蔽的抗體在室溫下分別與500 nM MMP14（恩佐生物科學公司（Enzo Biosciences）Cat# ALX-201-098-C010）孵育1小時，然後與未處理的抗體一起用於劑量滴定測定，如實例1所述。如實例1所述計算結合滴定曲線（圖 2A- 圖 2E ）和表觀EC50 值（圖 2G ）。
該等結果表明MMP14對經掩蔽的抗體的處理導致其掩蔽作用的有效逆轉，而與掩蔽肽的強度無關，從而突出表明掩蔽肽的活性係可以調節的。
實例 4 ： CAR 在經掩蔽的 CAR T 細胞中的表現和檢測。
用Cas9:gRNA RNP複合物和腺相關腺病毒載體（AAV）電穿孔激活的原代人T細胞,產生TRAC- /β2M- /抗PTK7 CAR+ 或TRAC- /β2M- /經掩蔽的抗PTK7 CAR+ T細胞。包含編碼抗PTK7 CAR（上文表 7 中的SEQ ID NO: 90）或經掩蔽的抗PTK7 CAR（經掩蔽的CAR；上文表 7 中的SEQ ID NO: 91-104）的核苷酸序列之一的重組AAV血清型6（AAV6）與Cas9:sgRNA RNP（1 µM Cas9，5 µM gRNA）一起遞送至激活的同種異體人T細胞。在一些實例中，可以使用靶向TRAC基因位點的sgRNA（例如，SEQ ID NO: 40）和/或靶向β2M位點的sgRNA（例如，SEQ ID NO: 54），其係經修飾的或未修飾的。
電穿孔後約一（1）週，對細胞進行流動式細胞分析術處理，以評估TRAC和β2M敲除水平，以及經編輯的細胞群體的細胞表面上的抗PTK7 CAR/經掩蔽的抗PTK7 CAR表現水平(圖 3 )。在所有測試的CAR T細胞和TRAC- /β2M- 對照細胞中，＞ 90%的活細胞缺乏TCR的表現，＞ 65%缺乏β2M的表現。活CAR T細胞藉由它們的前向散射（FSC）和側向散射（SSC）譜和7-AAD染料（BD生物科學公司（BD Biosciences）cat #559925）進行門控。然後用表 8 所示的一組抗體對細胞進行染色。
表 8. CAR T 細胞表面表現抗體組。
抗體 公司 目錄 # 選殖 Fluor 稀釋
IgG，F(ab')₂片段特異性 傑克遜免疫研究公司（Jackson Immuno-research） 109-006-097 多選殖的 生物素標記用SA-APC檢測 1 : 20
TCRαβ 梅旖旎公司（Miltenyi） 130-099-661 BW242/412 PE 1 : 100
β2M 生物傳奇公司 316318 2M2 PECy7 1 : 100
CD8 生物傳奇公司 344742 SK1 BV605 1 : 100
CD4 生物傳奇公司 300546 RPA-T4 BV510 1 : 100
鏈黴親和素-APC（SA-APC） 賽默飛世爾公司（ThermoFisher）eBioscience 17-4317-82 N/A APC 1 : 100
7-AAD BD生物科學公司 559925 N/A PerCP範圍 1 : 500
除檢測表面CAR表現外，還測定了CAR T細胞和經掩蔽的CAR T細胞檢測靶抗原的能力。活CAR T細胞藉由它們的前向散射（FSC）和側向散射（SSC）譜和DAPI染料（英傑公司（Invitrogen），目錄#: D3571）進行門控。然後用10 µg/mL重組人PTK7.Fc（R和D系統公司（R and D Systems），目錄# 9799-TK Lot DHMC0219041）染色細胞，如實例3中所述，並用與APC（Biolegend cat# 409305）軛合的小鼠抗人Fc作為第二檢測抗體（圖 3 ）染色。表面CAR表現和抗原檢測陽性群體百分比如表 9 所示。
表 9. 對於抗 PTK7 CAR 和經掩蔽的抗 PTK7 CAR 而言的 CAR 表面表現和抗原檢測水平。
CAR 構建體 CAR 表現 % 抗原檢測 %
CTX181 64.9 61.9
CTX181.P1 56.5 42.7
CTX181.M3 60.2 25.3
CTX181.M4 46.2 32.6
CTX181.M5 59.1 18.5
CTX181.M6 51.3 14.7
CTX181.M7 56.3 28.0
CTX181.M8 55.2 20.2
CTX181.M9 65.5 35.1
CTX181.M10 57.8 28.0
CTX181.M11 60.7 30.3
CTX181.M12 57.0 22.6
CTX181.M13 57.5 37.5
CTX181.M14 63.0 36.2
AAV陰性 15.9 13.0
RNP陰性 16.9 11.0
總之，該等結果表明CAR和經掩蔽的CAR構建體在T細胞表面以相似的水平表現，並且與未掩蔽的CAR CTX181相比，經掩蔽的CAR能夠掩蔽/抑制與靶抗原PTK7.Fc的結合。該等結果與經掩蔽的抗體與靶細胞結合所觀察到的掩蔽親和力範圍一致，並證明掩蔽CAR影響與靶的結合，但不影響CAR在T細胞上的表現。
實例 5 ：經掩蔽的 CAR T 細胞的細胞殺傷功能。
用細胞殺傷（細胞毒性）測定評估了TRAC- /β2M- /抗PTK7 CAR T細胞和經掩蔽的CAR T細胞（TRAC- /β2M- /經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞）引起骨肉瘤、乳癌和黏附性腎癌細胞系（分別是SaOS-2、MCF7和A498）（其在不同程度上表現PTK7）細胞裂解的能力。黏附細胞以每孔12,500或25,000個細胞每孔接種在96孔板中，並在37°C下孵育過夜。在接下來的一天中，將CAR T細胞和經掩蔽的CAR T細胞以1 : 0.5或1 : 1的比例加入到含有靶細胞的孔中。AAV陰性（TRAC- /β2M- ）和RNP陰性（未編輯的）T細胞作為陰性對照。約20小時後，取出120 µL上清液進行細胞介素定量。藉由抽吸從培養物中去除T細胞，並將100 μL Cell titer-Glo（普洛麥格公司（Promega））添加到板的每個孔中以評估剩餘的存活細胞數。然後使用酶標儀對每孔發射的光量進行定量。
抗PTK7 CAR和經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞對SaOS-2（高PTK7；圖 4A ）和MCF-7（中PTK7；圖 4B ）細胞均顯示出一定範圍的細胞毒活性，並且對很少表現或不表現PTK7的A498細胞顯示出不顯著的作用。未掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞（CTX181細胞）用作對照。將經掩蔽的CAR T細胞根據其對SaOS-2細胞的細胞毒性進行排序（表 10 ），這表明體外效力似乎隨著用可溶性重組人PTK7.Fc觀察到的掩蔽水平而呈現趨勢，如表 9 所示。該等結果提示，本文揭露的掩蔽肽可以抑制未掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞的細胞毒作用。
表 10. 在 E : T = 1 : 0.5 的比例下，基於 SaOS-2 細胞中的 % 細胞毒性對經掩蔽的抗 PTK7 CAR 進行排序。
樣本 細胞殺傷 % ，當 E : T = 1 : 0.5 時 細胞殺傷 % ，當 E : T = 1 : 1 時
CTX-181 97.1 96.6
CTX-181.P1 92.7 79.1
CTX-181-M4 78.4 54.6
CTX-181-M13 68.6 41.3
CTX-181-M14 52.8 29.5
CTX-181-M9 43.3 31.9
CTX-181-M6 42.4 13.9
CTX-181-M3 39.0 17.8
CTX-181-M7 37.5 10.2
CTX-181-M10 32.7 25.8
CTX-181-M5 29.6 -0.8
CTX-181-M12 29.5 18.5
CTX-181-M11 20.1 12.7
CTX-181-M8 15.4 3.9
AAV- -7.0 -18.2
RNP- -7.1 -13.1
實例 6 ：經掩蔽的 CAR T 細胞的效應細胞介素分泌。
使用細胞介素釋放測定法針對干擾素γ（IFNγ）和介白素2（IL2）進一步評估了經掩蔽的CAR T細胞的功能活性。未掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞（CTX181 T細胞）用作對照。將T細胞以實例5所述之細胞比例與以不同程度地表現PTK7的靶細胞SaOS-2、MCF7和A498孵育。20小時後，收集來自共培養細胞的上清培養基，並按照製造商的說明使用ELISA（RD系統公司）測量IFNγ和IL2的水平。使用MILLIPLEX套組（密理博公司（Millipore），目錄# HCYTOMAG-60K）（其分別使用磁性微球、HCYIFNG-MAG（密理博公司，目錄# HCYIFNG-MAG）和HIL2-MAG（密理博公司，目錄# HIL2-MAG）來定量來自細胞毒性測定的樣本中的IFNγ和IL-2分泌。根據製造商的方案進行測定。
結果表明，當以1 : 0.5或1 : 1效應細胞:靶細胞比例共培養時，抗PTK7 CAR T細胞和經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞在表現PTK7的癌細胞系SaOS-2（圖 5A 和表 11 ）和MCF7（圖 5B ）存在下分泌IFNγ。在A498（低至陰性的PTK7表現細胞系）存在下，抗PTK7 CAR T細胞和經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞分泌很少IFNγ或不分泌IFNγ（圖 5C ）。從與經掩蔽的CAR T細胞孵育的SaOS-2培養物中檢測到低IL2水平，並且在經掩蔽的CAR構建體之間未觀察到顯著差異（圖 5D ）。對照細胞TCR- /β2M- （AAV陰性）和未編輯細胞（RNP陰性）在所列任何癌細胞系存在下均無特異性IFNγ或IL2分泌反應。
表 11. 在E : T = 1 : 0.5的比例下，基於SaOS-2細胞中的IFNγ分泌對經掩蔽的抗PTK7 CAR進行排序。
樣本 IFNγ (pg/mL) ，當 E : T = 1 : 0.5 時 IFNγ (pg/mL) ，當 E : T = 1 : 1 時
CTX-181 22,298.0 34,931.0
CTX-181.P1 13,629.0 20,498.0
CTX-181-M4 9,554.0 13,206.0
CTX-181-M13 4,860.0 6,172.0
CTX-181-M9 4,364.0 4,611.0
CTX-181-M12 2,422.2 1,766.2
CTX-181-M10 2,113.0 1,877.3
CTX-181-M14 1,756.7 1,925.2
CTX-181-M7 885.4 829.7
CTX-181-M11 883.9 886.9
CTX-181-M3 833.0 798.6
CTX-181-M6 734.9 715.1
CTX-181-M5 522.7 459.2
CTX-181-M8 400.2 442.8
RNP- 184.2 125.1
AAV- 165.8 96.7
總之，本文所述之功能測定證明，抗PTK7 CAR T細胞對表現PTK7的細胞具有細胞毒性，並且在表現PTK7的細胞存在時分泌IFNγ，並且經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞在體外表現出該等活性的不同水平的降低。因此，使用本文揭露的掩蔽肽可以抑制抗PTK7 CAR T細胞的功能作用。
實例 7 ：在異種移植小鼠模型中抗 PTK7 CAR T 細胞和經掩蔽的抗 Ptk7 CAR T 細胞的體內功效。
先前的體內異種移植物研究一致顯示，在用抗PTK7 CAR處理的小鼠中，暫態體重下降和CAR T細胞水平升高，這表明抗PTK7 CAR識別小鼠中的抗原，從而導致CAR T細胞增殖。這一觀察表明在小鼠組織中表現的鼠PTK7與抗PTK7 CAR之間存在交叉反應性。本實例測試了經掩蔽的CAR T格式將減輕用未掩蔽的抗CAR T細胞觀察到的毒性並因此緩解中靶/組織外毒性的能力。
使用人胰腺Hs766T腫瘤異種移植小鼠模型在體內測試抗PTK7 CAR T細胞 和經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞的功效。當腫瘤（皮下注射進入右脅的細胞系）平均達到55 mm3 時，向小鼠給予抗PTK7 CAR T細胞或經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞。在本文所述之研究中，以兩個劑量水平（1x107 個細胞/小鼠和3 x 106 個細胞/小鼠）在單個時間點IV給予5隻雌性（5-8週）NOG小鼠TRAC-/β2M-/抗PTK7 CAR T細胞CTX181或TRAC-/β2M-/經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞CTX181.P1（如上所述產生）。測量體重（在給藥後的前9天每天記錄，然後每週2次）和腫瘤體積。當腫瘤達到終點大小（對於Hs766T，2000 mm3 ）或90天（以先到者為準）時終止研究。在無病原體條件和IACUC標準下飼養和監測小鼠。
在Hs766T胰臟癌異種移植模型中，抗PTK7 CAR T細胞（CTX181）和經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞（CTX181.P1）均有效地降低腫瘤負荷，不同劑量水平顯示不同程度的效力（圖 6A ）。出人意料的是，較高和較低劑量水平的經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞均能減輕在較高劑量的抗PTK7 CAR T細胞（CTX181）情況下觀察到的急性和潛在毒性，這表明經掩蔽的CAR策略可以有效地降低中靶/組織外毒性（圖 6B ）。
其他實施方式
在本說明書中討論的所有特徵能以任何組合來組合。在本說明書中討論的每個特徵可以由用於相同，等同或類似目的替代特徵替換。因此，除非另有說明，所討論的每個特徵僅僅是等效或類似特徵的通用系列的示例。
通過以上的說明，本領域的技術者可以很容易地確定本發明的實質特徵並且在不偏離本發明的精神和範圍的情況下，可以對本發明作不同變化和變更，以使它適應不同用途和條件。因此，其他實施方式也在申請專利範圍範圍內。
等效物
儘管已經在此描述並展示幾個發明實施方式，但熟悉該項技術者將容易想像用於執行功能和/或獲得結果和/或在此描述的優點中的一或多個的多種其他裝置和/或結構，並且此類變型和/或修改中的每一個被視為是在在此描述的發明實施方式的範圍內。更一般地說，本領域的技術者將容易理解，在此描述的所有參數、尺寸、材料以及配置意味著為示例性的，並且實際參數、尺寸、材料和/或配置將取決於發明傳授內容所用於的一或多種具體應用。本領域的技術者僅僅使用常規實驗將認識到或能夠確認在此描述的具體發明實施方式的許多等效物。因此，應瞭解，前述實施方式係僅藉助於實例來呈現，並且在所附申請專利範圍和其相等形式的範圍內，發明實施方式可以按與具體地描述和要求不同的方式實踐。本揭露之發明實施方式涉及在此描述的每個單獨特徵、系統、物品、材料、套件和/或方法。此外，如果此類特徵、系統、物品、材料、套件和/或方法並不相互矛盾，兩個或更多個此類特徵、系統、物品、材料、套件和/或方法的任意組合包括在本揭露之發明範圍內。
在此限定並使用的所有定義應當被理解成淩駕於所限定術語的字典定義、藉由引用而結合的文件中的定義、和/或一般含義。
在此揭露的所有參考文獻、專利和專利申請都相對於每個被引用的主題藉由引用而併入，這在一些情況下可以包括文件的全部內容。
除非清楚地作相反指示，否則在說明書中和在請求項中，如在此使用的不定冠詞「一個/種）」（a/an）應當理解為意思指「至少一個（種）」。
在說明書中和在請求項中，如在此使用的短語「和/或」應當理解為意思指如此聯在一起的要素中的「任何一個或兩個」，即，要素在一些情形中聯合地存在並且在其他情形中分離性地存在。用「和/或」列出的多個元素應當以相同的方式來解釋，即，這樣結合的元素中的「一或多個」。除了由「和/或」從句具體識別的元素，其他元素可以視需要存在，無論是與具體識別的那些元素相關還是不相關。因此，作為非限制性實例，當結合開放式語言諸如「包括」使用時，對「A和/或B」的提及可以在一個實施方式中僅指A（視需要包括除了B的元素）；在另一個實施方式中，僅指B（視需要包括除了A的元素）；在又一個實施方式中，指A和B（視需要包括其他元素）；等。
在說明書中和在請求項中，如在此使用的「或」應理解為具有與如以上所定義的「和/或」相同的含義。例如，當分隔一個清單中的項目時，「或」或「和/或」應當解釋為包容性的，即，包括多個元素或元素清單中的至少一個，而且包括其中的多於一個，以及視需要，另外的未列出的項目。僅相反地清楚指示的術語，諸如「……中的僅一個」或「……中的恰好一個」，或者當用於請求項中時，「由……組成」將指恰好包括一些或一列元素中的一個元素。總體而言，如在此使用的術語「或」當前面加有排他性的術語，諸如「任何一個」、「……中一個」、「……中僅一個」或「……中只有一個」時，應當僅解釋為指示排他性的替代形式（即，「一個或另一個，但非兩者」）。「主要由……組成」當用於請求項中時，應具有如在專利法領域中所用的其普通含義。
在說明書中和在請求項中，如在此所使用，關於具有一或多個要素的清單的短語「至少一個」應理解為意思指選自該要素清單中的任一或多個要素的至少一個要素，但未必包括在該要素清單內具體地列出的每一個要素中的至少一個，並且不排除該要素清單中多個要素的任何組合。這一定義還允許，可以視需要存在除該短語「至少一個」所指元素清單內具體地鑒別出的元素外的元素，無論是與具體地鑒別出的那些元素相關還是不相關。因此，作為非限制性實例，「A和B中的至少一個」（或等效地，「A或B中的至少一個」，或等效地「A和/或B中的至少一個」）在一個實施方式中可為指至少一個、視需要包括多於一個A，而不存在B（並且視需要包括除了B的元素）；在另一個實施方式中，可為指至少一個、視需要包括多於一個B，而不存在A（並且視需要包括除了A的元素）；在又一個實施方式中，可為指至少一個、視需要包括多於一個A，以及至少一個、視需要包括多於一個B（並且視需要包括其他元素）；等。
還應當理解，除非明確指出相反，在包括多於一個步驟或動作的在此所要求保護的任何方法中，方法的步驟或動作的順序不一定限於其中方法的步驟或動作被列舉的順序。
無
以下附圖構成本說明書的一部分，並且被包括在內以進一步說明本揭露之某些方面，該某些方面藉由參考附圖並結合本文給出的具體實施方式的詳細描述可以更好地被理解。
圖 1A- 圖 1B 包括顯示了測試經掩蔽的抗PTK7抗體與PTK7陽性細胞（SaOS-2細胞；骨肉瘤）結合的結果的數據。圖 1A ： 顯示了經掩蔽的抗PTK7抗體與PTK7陽性細胞的結合曲線的圖。圖 1B ： 顯示了經掩蔽的抗PTK7抗體的表觀KD 值的圖。
圖 2A- 圖 2G 包括顯示了掩蔽肽抑制抗PTK7抗體與PTK7陽性細胞（SaOS-2細胞；骨肉瘤）結合的數據。經掩蔽的抗PTK7抗體的結合抑制藉由用MMP（其係裂解連接掩蔽肽與抗體的連接子的蛋白酶）處理經掩蔽的抗體而破壞。圖 2A 至圖 2F ： 顯示了在不存在和存在MMP14的情況下，經掩蔽的抗PTK7抗體與PTK7陽性細胞的結合曲線的圖。圖 2G ：顯示了在不存在和存在MMP14的情況下，所指示的經掩蔽的抗PTK7抗體的表觀KD的圖。
圖 3 包括流動式細胞分析術數據，其顯示了抗PTK7 CAR和經掩蔽的抗PTK7 CAR具有相似的表面表現，但是經掩蔽的CAR上的掩蔽肽減少了與可溶性抗原PTK7的結合。
圖 4A 和圖 4B 包括顯示了經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞對表現PTK7的細胞的細胞殺傷的圖。圖 4A ： SaOS-2細胞。圖 4B ： MCF-7細胞。
圖 5A-5D 包括顯示了在存在表現PTK7的細胞的情況下測試經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞的細胞介素分泌的結果的數據。圖 5A ： 顯示了以指定的比例與PTK7+ 細胞（SaOS-2細胞）共培養的經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞的IFNγ水平的圖。圖 5B ： 顯示了以指定的比例與PTK7+細胞（MCF-7細胞）共培養的經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞的IFNγ水平的圖。圖 5C ：顯示了以指定的比例與PTK7-細胞（A498細胞）共培養的經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞的IFNγ水平的圖。圖 5D ：顯示了以指定的比例與PTK7+ 細胞（SaOS-2細胞）共培養的經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞的IL-2水平的圖。
圖 6A- 圖 6B 包括顯示了在人胰腺Hs766T腫瘤異種移植小鼠模型中測試經掩蔽的抗PTK7 CAR T細胞的結果的圖。圖 6A ： 顯示了腫瘤體積的圖。圖 6B ： 顯示了體重變化百分比的圖。1E7和3E6指的是本研究中使用的兩種劑量1 x 107 和3 x 106 。
無
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Claims (48)

  1. 一種對酪胺酸蛋白激酶樣7（PTK7）特異的經掩蔽的嵌合抗原受體（CAR），該經掩蔽的CAR包含： (i) 細胞外抗原結合結構域，其包含結合PTK7的單鏈可變片段（scFv）和經由蛋白酶切割位點與該scFv的N末端連接的掩蔽肽；以及 (ii)      一或多個細胞內傳訊結構域。
  2. 如請求項1之經掩蔽的CAR，其中該掩蔽肽包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下組成： (a) EVAPGKRWFYNHVKQVPHLV（SEQ ID NO: 1）， (b) HEEVHMRPNKLSLTWAYTGPQLR（SEQ ID NO: 2），和 (c) X1 CX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 ，其中X1 係V、W、或不存在；X2 係T、H、或Y；X3 係M、F、Y、I、或H；X4 係P、G、或V；X5 係P、N、S、Y、K、L、V、或A；X6 係S、T、W、A、H、R、或Q；X7 係P、T、V、H、I、M、A、F、或W；X8 R、M、A、H、V、Y、或不存在；X9 係S、Q、Y、T、P、A、M、或I；X10 係K、R、I、C、S、Q、H、或不存在；X11 係V、T、R、L、F、W、或A；X12 係I、F、L、W、或H；並且X13 係C、I、或M。
  3. 如請求項2之經掩蔽的CAR，其中該掩蔽肽包含 (c) 的胺基酸序列，其係： (c1)     CTMPPSPRSKVIC（SEQ ID NO: 3）， (c2)     CTFPNTTMQRTFC（SEQ ID NO: 4）， (c3)     CTYPSWVAYIRFC（SEQ ID NO: 5）， (c4)     VCTYPPAHRTRFC（SEQ ID NO: 6）， (c5)     CTMPYHIHSIGLC（SEQ ID NO: 7）， (c6)     WCTIPSSMSIRLC（SEQ ID NO: 8）， (c7)     CHIGKRPVPCLWI（SEQ ID NO: 9）， (c8)     CYIGLRMVPCFHM（SEQ ID NO: 10）， (c9)     CTMPSHAVASFLC（SEQ ID NO: 11）， (c10)   CTMPVHTYSQWLC（SEQ ID NO: 12）， (c11)   CTYPPRFHMHWLC（SEQ ID NO: 13），或 (c12)   CTHVAQWAIKAFC（SEQ ID NO: 14）。
  4. 如請求項1-3中任一項之經掩蔽的CAR，其中該掩蔽肽的長度係13-25個胺基酸。
  5. 如請求項2之經掩蔽的CAR，其中該掩蔽肽係： (a) EVAPGKRWFYNHVKQVPHLV（SEQ ID NO: 1）， (b)      HEEVHMRPNKLSLTWAYTGPQLR（SEQ ID NO: 2）， (c1)     CTMPPSPRSKVIC（SEQ ID NO: 3）， (c2)     CTFPNTTMQRTFC（SEQ ID NO: 4）， (c3)     CTYPSWVAYIRFC（SEQ ID NO: 5）， (c4)     VCTYPPAHRTRFC（SEQ ID NO: 6）， (c5)     CTMPYHIHSIGLC（SEQ ID NO: 7）， (c6)     WCTIPSSMSIRLC（SEQ ID NO: 8）， (c7)     CHIGKRPVPCLWI（SEQ ID NO: 9）， (c8)     CYIGLRMVPCFHM（SEQ ID NO: 10）， (c9)     CTMPSHAVASFLC（SEQ ID NO: 11）， (c10)   CTMPVHTYSQWLC（SEQ ID NO: 12）， (c11)   CTYPPRFHMHWLC（SEQ ID NO: 13），或 (c12)   CTHVAQWAIKAFC（SEQ ID NO: 14）。
  6. 如請求項1-5中任一項之經掩蔽的CAR，其中藉由在該蛋白酶切割位點處的蛋白酶切割來去除該掩蔽肽。
  7. 如請求項1-6中任一項之經掩蔽的CAR，其中該蛋白酶切割位點係基質金屬蛋白酶（MMP）的切割位點。
  8. 如請求項7之經掩蔽的CAR，其中該蛋白酶切割位點係MMP14切割位點，其包含PLGLA（SEQ ID NO: 15）的模體。
  9. 如請求項1-8中任一項之經掩蔽的CAR，其中該掩蔽肽經由第一肽連接子與所述蛋白酶切割位點連接。
  10. 如請求項1-9中任一項之經掩蔽的CAR，其中該蛋白酶切割位點經由第二肽連接子與抗PTK7抗體的重鏈或輕鏈的N末端連接。
  11. 如請求項8或請求項10之經掩蔽的CAR，其中該第一肽連接子、該第二肽連接子或兩者均為G/S肽連接子。
  12. 如請求項9-11中任一項之經掩蔽的CAR，其中該掩蔽肽按下式與結合PFK7的scFv連接：M-L1 -P-L2 -scFv，其中M代表該掩蔽肽，L1 和L2 代表該第一和第二肽連接子，並且P代表該蛋白酶切割位點。
  13. 如請求項1-12中任一項之經掩蔽的CAR，其中該結合PTK7的scFv包含重鏈可變結構域（VH ），該VH 包含與抗體Ab181的重鏈CDR相同的重鏈互補決定區（CDR）；和/或其中抗PTK7抗體包含輕鏈可變結構域（VL ），該VL 包含與抗體Ab181的輕鏈CDR相同的輕鏈互補決定區（CDR）。
  14. 如請求項13之經掩蔽的CAR，其中該結合PTK7的scFv包含與抗體Ab181相同的VH 和/或與抗體Ab181相同的VL 。
  15. 如請求項13之經掩蔽的CAR，其中該細胞外抗原結合結構域包含選自由SEQ ID NO: 120-134組成之群組的胺基酸序列。
  16. 如請求項1-15中任一項之經掩蔽的CAR，其中該一或多個細胞內傳訊結構域包含共刺激結構域、CD3ζ細胞質傳訊結構域或其組合。
  17. 如請求項16之經掩蔽的CAR，其中該共刺激結構域係CD28共刺激結構域或4-1BB共刺激結構域。
  18. 如請求項16或請求項17之經掩蔽的CAR，該經掩蔽的CAR進一步包含位於該細胞外抗原結合結構域和該一或多個細胞內傳訊結構域之間的跨膜結構域。
  19. 如請求項18所述之經掩蔽的CAR，其中該跨膜結構域係CD8跨膜結構域。
  20. 如請求項1-19中任一項所述之經掩蔽的CAR，該經掩蔽的CAR進一步在該經掩蔽的CAR的N末端包含訊息肽。
  21. 如請求項1所述之經掩蔽的CAR，該經掩蔽的CAR包含選自由SEQ ID NO: 106-119組成之群組的胺基酸序列。
  22. 一種核酸，該核酸包含編碼如請求項1-21中任一項所述之經掩蔽的CAR的核苷酸序列。
  23. 一種基因工程化T細胞，該基因工程化T細胞包含如請求項22所述之核酸並表現由該核酸編碼的經掩蔽的CAR。
  24. 如請求項23之基因工程化T細胞，其中該T細胞進一步包含被破壞的TRAC 基因、被破壞的B2M 基因或其組合。
  25. 如請求項22之基因工程化T細胞，其中該T細胞包含被破壞的TRAC 基因，其中插入了編碼該經掩蔽的CAR的核酸，從而破壞TRAC 基因的表現。
  26. 如請求項24或請求項25之基因工程化T細胞，其中該T細胞包含被破壞的TRAC 基因，該被破壞的TRAC 基因包含含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列之片段的缺失。
  27. 如請求項26之基因工程化T細胞，其中編碼該經掩蔽的CAR的核酸插入到TRAC 基因中的該缺失的位點。
  28. 如請求項27之基因工程化T細胞，其中編碼該經掩蔽的CAR的核酸替代該被破壞的TRAC 基因中的包含SEQ ID NO: 40的片段。
  29. 一種基因工程化T細胞的群體，該群體包含表現如請求項1-21中任一項之經掩蔽的CAR的T細胞。
  30. 如請求項29之基因工程化T細胞的群體，其中該T細胞具有被破壞的TRAC 基因、被破壞的B2M 基因或其組合。
  31. 如請求項30之基因工程化T細胞的群體，其中該T細胞具有被破壞的TRAC 基因，其中插入了編碼該經掩蔽的CAR的核酸，從而破壞TRAC 基因的表現。
  32. 如請求項30或請求項31之基因工程化T細胞的群體，其中該T細胞包含被破壞的TRAC 基因，該被破壞的TRAC 基因包含含有SEQ ID NO: 40的胺基酸序列之片段的缺失。
  33. 如請求項32之基因工程化T細胞的群體，其中編碼該經掩蔽的CAR的核酸插入到TRAC 基因中的該缺失的位點。
  34. 如請求項33之基因工程化T細胞的群體，其中編碼該經掩蔽的CAR的核酸替代該被破壞的TRAC 基因中的包含SEQ ID NO: 40的片段。
  35. 如請求項30-35中任一項之基因工程化T細胞的群體，其中該T細胞共同表現經掩蔽的CAR，具有該被破壞的TRAC 基因並且具有該被破壞的B2M 基因。
  36. 一種在受試者中治療癌症之方法，該方法包括向有需要的受試者投與有效量的如請求項29-35中任一項之基因工程化T細胞的群體。
  37. 如請求項36之方法，其中該受試者係患有癌症的人癌症患者，該癌症包含PTK+ 癌細胞並且呈現識別該經掩蔽的CAR中的蛋白酶切割位點的蛋白酶。
  38. 如請求項36或請求項37之方法，其中該受試者係患有選自以下群組的癌症的人癌症患者，該群組由以下組成：非小細胞肺癌、大腸癌、卵巢癌和乳癌，該乳癌視需要是三陰性乳癌。
  39. 一種產生基因工程化CAR-T細胞之方法，該方法包括： (a) 將編碼如請求項1-21中任一項之經掩蔽的CAR的核酸遞送至T細胞；並且 (b)      產生表現該經掩蔽的CAR的基因工程化CAR-T細胞。
  40. 如請求項39之方法，其中步驟 (a) 藉由包括遞送至該T細胞的過程進行：(i) RNA指導的核酸酶，(ii) 靶向TRAC 基因中的位點的第一指導RNA（gRNA），和 (iii) 載體，其包含左同源臂、編碼該經掩蔽的CAR的核酸和右同源臂，其中該左同源臂和該右同源臂與目的基因組位點同源，從而產生具有被破壞的TRAC 基因和在該目的基因組位點插入的、編碼該經掩蔽的CAR的核酸的基因工程化CAR-T細胞。
  41. 如請求項40之方法，其中步驟 (a) 進一步包括將靶向B2M 基因中的位點的第二指導RNA遞送至該T細胞。
  42. 如請求項40或請求項41之方法，其中該目的基因組位點位於TRAC 基因座中。
  43. 如請求項42之方法，其中該左同源臂與在所述第一gRNA靶向的位點左側的TRAC 基因座同源，並且該右同源臂與在所述第一gRNA靶向的位點右側的TRAC 基因座同源。
  44. 如請求項39-43中任一項之方法，其中該RNA指導的核酸酶、第一gRNA和視需要的第二gRNA以核糖核蛋白（RNP）複合物遞送至該T細胞。
  45. 如請求項44之方法，其中藉由電穿孔將該RNP複合物和該載體遞送至該T細胞。
  46. 如請求項39-45中任一項之方法，其中該RNA指導的核酸酶係Cas9核酸酶，視需要是釀膿鏈球菌Cas9核酸酶。
  47. 如請求項39-46中任一項之方法，其中該載體係AAV載體。
  48. 一種基因工程化T細胞的群體，該群體藉由如請求項39-47中任一項之方法產生。
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