TW202144778A - 檢測攝護腺癌之方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種用於檢測和治療攝護腺癌之體液檢測方法，特別是侵襲性攝護腺癌。本發明還涉及針對具有低風險攝護腺腫瘤之患者的監測、進行攝護腺活組織檢查的患者選擇以及進行攝護腺手術或治療的患者選擇。

Description

檢測攝護腺癌之方法

本發明涉及一種用於檢測和治療攝護腺癌之體液檢測方法，特別是侵襲性攝護腺癌。本發明還涉及針對具有低風險攝護腺腫瘤之患者的監測、進行攝護腺活組織檢查的患者選擇以及進行攝護腺手術或治療的患者選擇。

攝護腺癌(prostate cancer，PCa)是好發在男性中具有高死亡率的常見疾病。PCa是美國男性中僅次於肺癌的第二大癌症死因，也是全球第五大死因。

通常藉由陽性PSA(攝護腺特異性抗原)血液檢驗或DRE(肛門指診)發現攝護腺癌，DRE是指醫生將戴手套且潤滑過手指插入直腸以感覺攝護腺表面是否有任何異常。血液中高PSA濃度(通常＞3ng/ml) 及/或異常DRE結果是懷疑有PCa的原因，但PCa通常也經由各種非特異性症狀或其他癥狀而被發現，其可能包含排尿困難、頻尿、排尿疼痛、血尿、血汙精液、勃起障礙和坐立時不適。如果癌症已經轉移，症狀還可能包含骨痛、小腿腫脹、體重減輕或疲勞。

通常對疑似患有PCa的男性進行攝護腺活組織檢查，以透過辨別攝護腺組織中的異常癌細胞確認該診斷。攝護腺活組織檢查是一種高度侵入性的手術，包含將針穿過直腸壁插入攝護腺。通常藉由經直腸超音波檢查(TRUS)進行引導，多次插入活組織檢查針以取出多達20個小組織樣本以進行病理分析。進行前列線活組織檢查的風險包含活組織檢查部位的直腸出血、精液中的血液、尿液中的血液、排尿困難和感染。由於對一線檢測的鑑定力很差，大多數被轉診的男性活組織檢查的結果為陰性並未發現癌細胞。

陽性攝護腺活組織檢查結果(其中發現了癌組織)通常以格里森(Gleason)分級系統表示，該系統將癌組織分為1-5級。格里森分數為7(3+4)或以下的癌症被視為低惡性度癌症。患有低惡性度PCa的男性通常不會接受癌症治療，但會接受監測以確保癌症沒有進展。格里森分數為7(4 + 3)或以上的癌症被視為高惡性度癌症。通常會對患有高惡性度癌症的男性進行治療。

臨床醫生使用格里森分數與PSA濃度、DRE結果及腫瘤TNM分類和其他因子相結合，將患者臨床分類為低風險、中風險或高風險，以確定是否應該治療PCa或監測。TNM分類涉及腫瘤的大小和擴散程度(T)、腫瘤是否擴散到淋巴結以及有多少個淋巴結(N)以及癌症是否已轉移到身體的其他部位(M)。

患者的風險類別是根據血清PSA濃度、格里森分數以及疾病的臨床大小和程度而定。根據Memorial Sloan-Kettering和Seattle小組使用的風險分級系統，攝護腺癌隨著臨床風險的增加可分為低風險到中風險和高風險的各種類別(Humphrey；2014；Barry和Nelson； 2015)。對於患有低風險攝護腺癌的男性通常不會進行癌症的治療，但會進行監測以確保癌症仍然處於低風險狀態。高風險癌症被認為具有侵略性，並且可能致命，因此通常會對患有高風險癌症的男性進行治療。中度治療及/或監測適合患有中風險癌症的男性。

臨床風險分級可進一步完善，例如將中風險組分為中度有利風險組和中度不利風險組(NCCN；2018)。中風險類的患者可根據其他因素並與患者討論後接受治療。

可用於PCa的治療包括手術、包含近接治療在內的放射療法、包含手術及藥物去勢在內的激素療法以及各種藥物治療。治療可能會導致副作用，對生活品質造成嚴重後果。不應對患有低惡性度PCa疾病的男性施予不適當的治療。為了避免不適當的治療，可透過觀察式等待(除非症狀發生，否則長期監測低惡性度PCa以避免治療)或透過積極監控(透過包含重複的攝護腺活組織檢查和核磁共振成像(MRI)的定期醫院檢查進行監測)對患有低惡性度疾病的男性進行數年的監控。對於沒有疾病進展的大多數男性，重複活組織檢查代表不必要的侵入性干擾。

大部分具有升高的PSA濃度的男性並沒有高惡性度PCa，而大多數接受攝護腺活組織檢查的男性則沒有癌症或低惡性度惰性癌症，它們在患者的自然生命過程中緩慢生長且沒有造成生命危險，特別是如果其被診斷出在老年男性中。研究表明，儘管透過PSA測試篩檢男性確實增加了PCa診斷的頻率，但並沒有降低死亡率。英國最近對419,582名年齡在50-69歲之間的男性進行了一項研究，調查了針對PCA進行PSA測試所篩檢的男性超過10年的結果。篩檢使PCa診斷率從未篩檢組的3.6%男性增加到篩檢組的4.3%，但有更多被篩檢出的癌症被診斷為格里森分數為6或更低的低惡性度癌症。儘管PCa的診斷率有所增加，但篩檢組的PCa死亡率相對不受影響，每1000人-年有0.30例死亡，而未經篩檢組中每1000人-年有0.31例死亡(Martin等; 2018)。這意味著許多額外的男性都進行了侵入性活組織檢查和其他治療而沒有明顯的好處。

大多數具有升高的PSA濃度的男性患有良性攝護腺症狀，並且沒有癌症。該領域工作者已開發了血液、尿液和組織測試，試圖滿足對於PCa與良性疾病需要更精準檢測的需求，該良性疾病包含良性攝護腺肥大(BPH)、攝護腺上皮內瘤(PIN)以及非典型小腺泡增生(ASAP)。這些測試包含一系列的PSA測量、攝護腺健康指數、4K分數和攝護腺癌抗原3。攝護腺健康指數和4K分數還提供了有關高和低惡性度PCa區分的一些訊息。

一系列的PSA測量是根據PCa被發現與升高的PSA濃度以及高絕對值有關。

攝護腺健康指數(Phi)的計算為Phi = (p2PSA/fPSA x √PSA)，其中p2PSA為攝護腺特異性抗原，而fPSA是游離PSA。在研究中，Phi將用於檢測PCA的ROC曲線(接收者操作曲線)的AUC(曲線下面積)從PSA的56%增加到了Phi的74%。此外，如果使用高臨界值，則發現約50%的Phi陽性男性具有格里森分數≥7的PCA。然而，在此臨界值下，高惡性度PCa的敏感性為61%，代表39%的高惡性度癌症將被遺漏(Stephan等； 2013)。

4K分數可測量血液中的4個激肽釋放酶部分(總PSA、游離PSA、完整PSA和人類腺體激肽釋放酶2)，並將這些結果與患者的臨床訊息和先前的活組織檢查結果組合在演算法中，以預測患有高惡性度PCa相對於惰性癌症或無癌症的風險。

攝護腺癌抗原3(PCA3)測試可測量非編碼傳訊RNA，該傳訊RNA在PCa男性的尿液中升高，但在正常攝護腺的男性或BPH中則未升高。在PCa檢測方面，PCA3的AUC值(66-72%)比PSA的AUC值(54-63%)高，並且FDA批准PCA3可在先前陰性攝護腺活組織檢查的情況下作為PCa的檢測方法。PCA3也被認為有助於決定何時再次進行活組織檢查，以及在積極監控下有助於病患的後續追蹤(Crawford 等；2014)

技術人員也開發了使用在活組織檢查材料的基因組織測試以更好地對患者風險分級(Cuchiarra等；2018)。ConfirmMDx是一種三基因表觀遺傳甲基化測定法，其具有大於90%的高陰性預測值，用於陰性活組織檢查材料以確認該材料真的為陰性，幫助避免需要重複進行活組織檢查(Crawford 等； 2014)。類似地，Oncotype DX攝護腺癌檢測法可測量活組織檢查組織中12種與癌症相關的基因和5種參考基因的表現，並將它們組合在演算法中以計算基因組攝護腺分數。結合PSA濃度、格里森分數和TNM分期，基因組攝護腺分數可改良PCa的風險分級至非常低度、低度和經修正的中度風險，以幫助臨床醫生選擇適合的候選人進行積極監控。

本領域的技術人員還研究了許多其他用於檢測及/或分級PCa的生物標記，包括循環游離細胞核小體(如WO2005019826、WO2013030577、WO2013030579和WO2013084002所述)。亦已開發出包括多參數MRI掃描在內的掃描方法，以鑑定沒有PCa的男性避免不必要的攝護腺活組織檢查。

IL-6在腫瘤形成中的角色已在多種人類癌症中被認證，包括PCa、大腸直腸癌(CRC)、淋巴瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、腎癌和胰臟癌(Wang和Sun；2014年) 。 上升的循環IL-6濃度與許多癌症的腫瘤生成、疾病進展和不良預後有關，該些癌症包含PCa、CRC、皮膚癌、乳癌、肺癌、食道癌、肝癌、胰臟癌、胃癌、婦科癌症、腎癌、膀胱癌和血癌(Taniguchi和Karin；2014)。

IL-8也已知與許多癌症有關，包括PCa(Xie；2001)。在許多癌症中循環IL-8濃度都有增加，包括PCa、CRC、胃癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌和乳癌。據報導，循環IL-8濃度在正常男性中為6.8 pg/ml，在臨床A至C期PCa患者中上升至15.6 pg/ml，以及在轉移性PCa患者中增至27.8 pg/ml(Veltri等；1999)。最近，據Chadha等人(2014)報導，PCa的中位循環IL-8濃度在健康男性中為4.00 pg/ml，在具有升高的PSA濃度但為陰性攝護腺活組織檢查之男性中的顯著上升(P ＜0.001)至8.13 pg/ml，在具有侷限性PCa之男性中上升至16.90 pg/ml，在具有去勢抗性PCa之男性中上升至43.50 pg/ml。此外，PCa細胞中增加的細胞IL-8產出在惡性PCa疾病進展中具有作用。當注入小鼠體內時，升高的細胞內IL-8濃度導致PCa細胞致瘤性的增加，IL-8的消耗導致致瘤性降低(Xu等；2009)。類似地，PCa細胞產生的高IL-8產出可促進腫瘤細胞的存活以及對細胞毒性藥物和放射療法的抵抗力。相反地，據報導，低的細胞內IL-8濃度會導致對放射療法的抵抗力降低(Xu等；2012)、對細胞毒性化療藥物(包括多西紫杉醇，星形孢菌素和雷帕黴素)的抵抗力降低以及導致細胞週期停滯和凋亡(Singh和Lokeshwar；2009)。

在其他癌症中也有類似的發現。根據18篇探討IL-8濃度對於CRC診斷的準確性的文章的彙總分析，其報導一個結論，即上升的IL-8血清濃度對於CRC具有高診斷準確性，其敏感性為0.70且特異性為0.91，並且和不良CRC預後顯著相關(Xia 等；2015)。此外，與PCa細胞一樣，CRC細胞中的高IL-8濃度與細胞毒性藥物耐藥性相關(Du等人; 2018)。

據報導，循環白介素濃度的平衡紊亂出現在診斷為具有胃癌的患者中，該胃癌包括Lauren分類法所定義的瀰漫性與腸道胃癌類型、以及混和類型胃癌(Madej-Michniewicz等；2015)。在胃癌中，觀察到循環IL-6濃度升高，但循環IL-8和白介素-10(IL-10)濃度低於健康主體。然而，同一作者所研究的其他胃腸道癌症類型並未顯示出這種作用，包括胰臟癌、淋巴瘤、胃腸道間質瘤和神經內分泌腫瘤。

雖然有上述所記載的進步，但PSA仍然是PCa檢測、分級和管理所使用的主要非侵入性測試。攝護腺癌的過度診斷是攝護腺疾病管理中的主要難題。PSA測試對於檢測男性中PCa是普通有效的。然而，這不能確定哪些男性需要治療。需要一種用於患者分級的非侵入性方法，以鑑定需要治療的具有高惡性度PCa的男性。理想的測試應與格里森分數及/或臨床風險分級(包括格里森分數、TNM分期和PSA)相關。這種方法具有改善攝護腺癌患者的診斷和管理、減少患有低惡性度疾病男性不必要的侵入性活組織檢查和過度治療以及降低醫療院所成本的潛力。對於低惡性度疾病患者的非侵入性監測、觀察性等待及/或積極監控、決定何時重新進行活組織檢查以及檢測治療後或攝護腺切除術後患者復發的情況，也會是有用的。

根據本發明之第一態樣，提供一種白介素-8 (Interleukin-8)在血液、血清或血漿樣本中作為生物標記以診斷及/或監測攝護腺癌之用途，其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8係攝護腺癌存在及/或進展的指標。

根據本發明之另一態樣，提供一種診斷攝護腺癌患者之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的白介素-8及/或白介素-6濃度，可選地結合至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由攝護腺特異性抗原(PSA)及核小體或其組分所組成之清單， 其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8及/或較高濃度的白介素-6係攝護腺癌存在的指標。

根據本發明之另一態樣，提供一種評估患者是否適合攝護腺活組織檢查之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的白介素-8及/或白介素-6濃度，可選地結合至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由攝護腺特異性抗原(PSA)及核小體或其組分所組成之清單， 其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8及/或較高濃度的白介素-6係該患者需要攝護腺活組織檢查的指標。

根據本發明之另一態樣，提供一種治療攝護腺癌的方法，包含： (i)從一主體獲得血液、血清或血漿樣本； (ii)測量樣本中白介素-8濃度； (iii)根據與一對照組相比具有較低濃度的白介素-8，鑑定該主體為患有攝護腺癌；以及 (iv)對該主體施行治療。

根據本發明之另一態樣，提供一種包含檢測白介素-8、白介素-6以及選自由PSA及核小體或其組分所組成之清單之一或多種生物標記之試劑之套組。

根據本發明之另一態樣，提供一種診斷患者攝護腺癌之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的PSA濃度，結合其他至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由白介素-6、白介素-8及核小體或其組分所組成之清單。

出乎意料的是，我們已經表明，與低風險PCa男性或無PCa男性相比，在高惡性度或高風險攝護腺癌(PCa)患者中，IL-6濃度增加，而循環IL-8濃度卻下降，這兩個發炎分子可用於檢測PCa。現在，我們報導基於PSA、核小體以及發炎標記物測量的非侵入性血液測試和治療方法的發展，可準確地將攝護腺活組織檢查的高惡性度PCa男性從低惡性度PCa或無癌症男性中區別出來。此外，測試結果在數值上與患者的格里森分數相關。類似地，標記物測量結果可準確地將攝護腺活組織檢查的高惡性度PCa男性從低惡性度PCa或無癌症男性中區別出來，且測試結果在數值上與活組織檢查中確定的患者風險類別相關。

我們對於循環IL-6、IL-8和核小體的測量進行PCa臨床研究。該研究涉及84名隨機選擇的接受攝護腺活組織檢查以調查疑似有PCa的男性。35名無癌症男性的活組織檢查結果為陰性。49例男性的活組織檢查結果為陽性，其中16例男性患有格里森6級之PCa，17例男性患有格里森7級(3+4)，6例男性患有格里森7級(4+3)，3例男性患有格里森8級，以及7例男性患有格里森9級。我們測量了男性血液樣本中PSA的血清濃度、含有組織蛋白變體H3.1的核小體(H3.1-核小體)、含有組織蛋白H1的核小體(H1-核小體)、IL-6和IL-8。絕大多數接受活組織檢查的男性之PSA濃度升高，包括那些在活組織檢查中隨後被發現沒有癌症的男性(圖1和圖2)。

我們還展示了結合血液、血清或血漿中的PSA測量以及白介素濃度測量及/或核小體濃度測量可用作為攝護腺癌(PCa)的生物標記套組，其中結合測量可以採用以下形式：循環PSA和白介素濃度的差值、循環PSA/白介素濃度的比例或循環PSA/核小體濃度的比例，對於鑑定侵襲性/高惡性度PCa患者有用。這些男性需要活組織檢查以及藉由手術、放射療法、化學療法或其他方法的治療。可監測患有低惡性度疾病的男性，而沒有疾病的男性可能不需要進一步的治療。

因此，根據本發明的第一態樣，提供一種白介素-8(Interleukin-8)在血液、血清或血漿樣本中作為生物標記以診斷及/或監測攝護腺癌之用途，其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8係攝護腺癌存在及/或進展的指標。

白介素-8(IL-8，也稱為CXCL8)是一種趨化因子，可吸引諸如嗜中性白血球(neutrophils)、嗜鹼性白血球(basophils)及T細胞的免疫細胞。它從幾種細胞類型中釋放出來以回應發炎刺激。人類IL-8的序列是本領域眾所皆知的，並記載在UniProt登錄號P10145中。

對於本領域技術人員將清楚的是，可以在多種基礎上選擇對照組主體，例如其可以包含已知為沒有疾病之主體或可以是有不同疾病的主體(例如，用於鑑別診斷調查)。「對照組」可包括健康主體、未罹病主體及/或沒有癌症的主體。本發明特別適合檢測高惡性度攝護腺癌的患者，因此在此實施例中，對照組也可以是患有低惡性度攝護腺癌的主體。與對照組的比較在診斷領域是眾所皆知的。

應當理解的是沒有必要為了比較目的在任何場合測量健康/未罹病的控制組，因為一旦建立了「正常範圍」，就可以將其用作所有後續測試的基準。可以透過從多個沒有癌症的對照組主體取得樣本並測試生物標記濃度來建立正常範圍。然後可以檢查疑似患有癌症的主體的結果(即生物標記濃度)，以查看是否落在各自的正常範圍之內或之外。使用「正常範圍」是檢測疾病的標準做法。

如果主體被確定為沒有攝護腺癌，則本發明仍可以用於監測疾病進展之目的。例如，如果用途包括來自被確定未罹患攝護腺癌或患有低惡性度攝護腺癌的主體的血液、血清或血漿樣本，則可以在另一時間點重複進行生物標記濃度的測量，以確定生物標記濃度是否已經改變。

在一實施例中，該用途還包含白介素-6 (Interleukin-6) 作為生物標記，其中，與一對照組相比，較高濃度的白介素-6係攝護腺癌存在及/或進展的指標。

白細胞介素-6(IL-6)是一種具有多種生物學功能的細胞因子。它是發燒和急性期反應的有效誘發物。人類IL-6的序列是本領域已知的，並記載在UniProt登錄號P05231中。

在一實施例中，該用途還包含一或多種生物標記，該一或多種生物標記係選自由：PSA及核小體或其組分所組成之清單。在另一實施例中，核小體之組分係核小體之一表觀遺傳特徵。於再另一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵選自：轉譯後修飾、組織蛋白變體/異形體、修飾核苷酸及/或與核小體結合的蛋白質(即核小體-蛋白質加合物)，特別是組織蛋白變體/異形體。於再另一實施例中，組織蛋白變體/異形體是組織蛋白H3的變體/異形體，例如組織蛋白H3.1。

PSA(攝護腺特異性抗原，也稱為γ-精漿蛋白或激肽釋放酶-3)是當前在本領域中使用的生物標記，其在血清中升高的濃度與攝護腺癌或其他攝護腺疾病的存在相關。PSA的高血液濃度(通常大於3 ng/ml)表示應該轉診患者進行活組織檢查。在一個實施例中，該用途還包含PSA作為生物標記。

於一實施例中，該用途另外包含核小體或其組分作為生物標記。所述核小體可作為血液、血清或血漿樣本中的循環核小體被測得，即，其為游離細胞核小體。

核小體是染色質結構的基本單元，且是由八個高度保留的核心組織蛋白的蛋白質複合物組成(包含各一對的組織蛋白H2A、H2B、H3和H4)。在這個複合體周圍包覆著大約146個鹼基對的DNA。另一種組織蛋白H1或H5作為連接子並且參與染色質的壓實。DNA被連續的核小體纏繞在一個所謂的「串珠」結構中，並且形成了開放或常染色質的基本結構。在壓實或異染色質中，該串被螺旋且超螺旋成封閉且複雜的結構(Herranz和Esteller(2007))。

「核小體本身」指涉樣本中存在的總核小體濃度。總核小體濃度可透過檢測所有核小體都有的組織蛋白來檢測，例如組織蛋白H4。如先前報導的WO2016067029(透過引用併入本文)，含有特定組織蛋白變體/異形體(例如，組織蛋白H3.1、H3.2或H3t)之核小體可用於分離源自腫瘤細胞的游離細胞核小體。因此，可檢測到包含源自腫瘤的游離細胞核小體的表觀遺傳子集。本文所使用之術語「其組分」指涉核小體的一部分，即，並不需要檢測整個核小體。舉例而言，在一實施例中，其組分是組織蛋白H1。在一實施例中，核小體的組分是(核小體的)表觀遺傳特徵。因此，在一實施例中，該用途另外包括核小體本身、含有組織蛋白H3.1及/或組織蛋白H1的核小體作為生物標記。

在檢測體液樣本時提及的「核小體」可指涉「游離細胞核小體」。將認知到的是，貫穿本文使用的術語「游離細胞核小體」旨在包含任何游離細胞染色質片段，其包含一或多個核小體。本文所指的游離細胞核小體的表觀遺傳訊號結構/特徵可包括但不限於一或多種組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白異形體、修飾的核苷酸及/或與核小體結合的蛋白質以作為核小體-蛋白質加合物。

成年人的正常細胞更新涉及每天透過細胞分裂產生10¹¹ 個細胞及相似數量的死亡，主要是透過細胞凋亡。在細胞凋亡過程中，染色質分解為單核小體及寡核小體，其從細胞中釋放出來。據報導，在正常情況下，健康主體中發現的循環核小體濃度較低。在患有包含許多癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病、中風及心肌梗塞的多種疾病的主體中發現升高的濃度(Holdenrieder及Stieber，2009)。

可透過酵素免疫測定法(ELISA)檢測單核小體及寡核小體，並且已報導了幾種方法(Salgame等，1997；Holdenrieder等，2001；van Nieuwenhuijze等，2003；WO2005019826；WO2013030577；WO2013030579；及WO2013084002，所有這些都透過引用併入本文)。這些測定法通常使用作為捕獲抗體及檢測抗體(依據要檢測的部分而有所不同)的抗組織蛋白抗體(例如，抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3及H4)。於一實施例中，抗組織蛋白抗體包括抗H3抗體或抗H1抗體。

循環核小體不是蛋白質核苷酸複合物的均質群。相反地，它們是染色質片段的異質群，該染色質片段起源於細胞死亡時對染色質的消化並包含大量表觀遺傳結構，該些表觀遺傳結構包含特定組織蛋白異形體或變體、轉譯後組織蛋白修飾、核苷酸或修飾核苷酸及蛋白質加合物。對本領域技術人員而言，核小體濃度的升高將與某些循環核小體子群的升高相關，這些子群含有特定表觀遺傳訊號，其包含包括特定組織蛋白異形體或變體、包括特定轉譯後組織蛋白修飾、包括特定的核苷酸或修飾核苷酸以及包括特定核小體加合物的核小體。這些類型的染色質片段的測定法為本領域眾所皆知的(例如，參見WO2005/019826、WO2013/030579、WO2013/030578、WO2013/084002，其透過引用併入本文)。

於一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵是選自由：轉譯後組織蛋白修飾、組織蛋白變體、特定核苷酸以及蛋白質加合物所組成之群組。應當理解的是，術語「表觀遺傳訊號結構」及「表觀遺傳特徵」在本文中可互換使用，其是指可檢測到的核小體的特定特徵。

於一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包含一或多種轉譯後組織蛋白修飾。核小體的結構可透過組織蛋白的轉譯後修飾(PTM)來改變。組織蛋白的PTM通常發生在核心組織蛋白的尾部，而常見的修飾包含離胺酸殘基的乙醯化、甲基化或泛蛋白化以及精胺酸殘基的甲基化及絲胺酸殘基的磷酸化等。已知組織蛋白修飾涉及基因表現的表觀遺傳調控(Herranz和Esteller(2007))。例如，在一實施例中，轉譯後組織蛋白修飾是H3K9Me3。

於本發明之一實施例中，檢測到一組或一類相關的組織蛋白修飾(非單一修飾)。此實施例的典型實例，但不限於，涉及2位點免疫測定法，其是使用一種抗體或其他選擇性結合劑直接與核小體結合，以及一種抗體或其他選擇性結合劑直接與有問題的組織蛋白修飾組結合的。出於說明性目的，這些直接與組織蛋白修飾組結合的抗體實例包含但不限於，抗泛乙醯化(anti-pan-acetylation)抗體(例如，泛乙醯H4抗體)、抗瓜胺酸化(anti-citrullination)抗體或抗泛蛋白化(anti-ubiquitin)抗體。

於一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包括一或多種組織蛋白變體或異形體。術語「組織蛋白變體」和「組織蛋白異形體」在本文中可以互換使用。核小體的結構也可透過包含選擇性組織蛋白異形體或變體而改變，該選擇性組織蛋白異形體或變體為不同基因或剪切產物，且具有不同的胺基酸序列。組織蛋白變體可分為許多家族，其再被細分為個別的類型。數量龐大的組織蛋白變體的核苷酸序列為習知的且可公開獲得，例如在國家人類基因研究所NHGRI組織蛋白資料庫(Mariño-Ramírez, L., Levine, K.M., Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D., and Landsman, D. The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol.2011. 以及 http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank (NIH基因序列)資料庫、EMBL核苷酸序列資料庫、EMBL核苷酸序列資料庫和日本DNA資料庫(DDBJ)。舉例而言，組織蛋白H2的變體包括H2A1、H2A2、mH2A1、mH2A2、H2AX和H2AZ。再一實例，組織蛋白H3的變體包括H3.1、H3.2和H3t。

於一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包括一或多種DNA修飾。除了由核小體組織蛋白異形體和PTM組成物介導的表觀遺傳訊號外，核小體的核苷酸和修飾的核苷酸的組成也不同。全面性的DNA低度甲基化是癌細胞的標誌，並且一些核小體可包含比其他核小體更多的5-甲基胞嘧啶殘基(或5-羥甲基胞嘧啶殘基或其他核苷酸或修飾的核苷酸)。在一實施例中，DNA修飾係選自5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。

於一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包括一或多種蛋白質-核小體加合物或複合物。另一類的循環核小體子集是核小體蛋白質加合物。多年來已知的是，染色質包含大量的與其組成DNA及/或組織蛋白結合的非組織蛋白蛋白質。這些染色質相關蛋白質具有許多類型，且具有多種功能，包括轉錄因子、轉錄增強因子、轉錄抑制因子、組織蛋白修飾酵素、DNA損傷修復蛋白以及其他。這些染色質片段包括核小體和其他非組織蛋白染色質蛋白或DNA，並且在本領域中對於其他非組織蛋白染色質蛋白已有所描述。

於一實施例中，加合到核小體的蛋白質(因此可作為生物標記)係選自：轉錄因子、高遷移率族蛋白質或染色質修飾酵素。「轉錄因子」是指與DNA結合且透過促進(即活化劑)或抑制(即抑制劑)轉錄以調節基因表現的蛋白質。轉錄因子含有一或多個DNA結合域(DBD)，附著於與其調控的基因相鄰的特定DNA序列。本文所述的所有循環核小體和核小體部分、類型或亞組均可用於本發明。

應理解的是，本發明的方法和用途特別適用於從患者獲得的血液、血清或血漿樣本。於一實施例中，該樣本是血液、血漿或血清樣本。於另一實施例中，樣本是血漿樣本。

於一實施例中，生物標記是用於診斷攝護腺癌惡性度的診斷。攝護腺癌可分為低惡性度或高惡性度。患有低惡性度攝護腺癌的男性通常不會接受癌症治療，但要進行監控以確保癌症仍然維持在低風險。高惡性度癌症被認為是高風險、侵襲性和潛在致命性的，因此，通常會對患有高惡性度癌症的男性進行治療。在另一實施例中，攝護腺癌的分期是高惡性度攝護腺癌。

已經發現的是，本文所述的生物標記套組與格里森分級系統相當相關。在格里森(Gleason)分級系統中，癌組織的等級分為1-5級。在顯微鏡下，癌組織的外觀與正常攝護腺組織相似則定為1級。偏離正常細胞特徵的癌組織將被定為較高級，而大幅偏離正常細胞特徵的癌組織將被定為5級。將兩個格里森等級指定為(i)活組織檢查材料中最主要的癌組織和(ii)最高等級的其他組織。將這兩個數字相加，得出的格里森分數為2-10。例如，格里森分數為7可源自(3+4)，其中所見的主要癌症為3級，而所見的任何其他癌症的最高級別為4級或(4+3)。格里森分數為7 (3+4)或以下的癌症被視為低惡性度癌症。格里森分數為7 (4+3)或更高的癌症被認為是高惡性度癌症。

於一實施例中，生物標記用於疑似有攝護腺癌的患者的風險分級。於另一實施例中，患者患有高風險攝護腺癌。所述生物標記可用於預測或診斷攝護腺癌的風險分級，即，預測或診斷具有低風險、中風險或高風險的攝護腺癌患者。攝護腺癌隨著風險增加從低風險到高風險可分為不同類型。風險分級系統的舉例包括Memorial Sloan-Kettering和Seattle組(Humphrey; 2014 和Barry和Newman; 2015)和國家綜合癌症網路(NCCN)攝護腺癌腫瘤臨床實踐指南(NCCN; 2018)。患有低風險攝護腺癌的男性通常不會接受癌症治療，但要接受監控以確保癌症仍然維持在低風險。高風險癌症被認為是高危險的、侵襲性以及潛在致命性的，因此，通常會對患有高風險癌症的男性進行治療。患有中風險攝護腺癌(可進一步分為中度有利風險或中度不利風險)的男性可視情況接受治療，具體取決於其他因素和患者的意見。

已經發現，本文所述的生物標記套組產生的結果和中值結果與臨床風險分類相當相關，如圖9所示。中位數生物標記結果從低風險增加到中度有利風險，再到中度不利風險到高風險PCa。圖9中的生物標記套組能夠以高特異性(95%)區分大多數高風險疾病的男性(65%)，並且還可以排除大多數無癌症或低風險疾病的男性(＞70%)，且沒有偽陰性病例(即沒有遺漏任何高風險的癌症病例)。這種區分度高於圖10所示的觀察到的PSA測試區分度(22%)。因此，本發明的生物標記測試可預測大多數患者的臨床風險類別，並可用於幫助根據風險對患者分級，且可用於避免PCa的偽陽性和過度診斷，因此避免許多男性進行不必要的活組織檢查。本發明的測試還可以連續地用於監測具有低風險PCa的男性的疾病進展。

於一實施例中，本文所述的生物標記(或方法)用於鑑定患有高風險攝護腺癌的患者，例如格里森分數為7(4+3)或更高的患者。

根據本發明之另一態樣，提供一種診斷攝護腺癌患者之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的白介素-8及/或白介素-6濃度，可選地結合至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由PSA及核小體或其組分所組成之清單， 其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8及/或較高濃度的白介素-6係攝護腺癌存在的指標。

本發明在評估患者是否需要攝護腺活組織檢查中有特殊用途。攝護腺活組織檢查是侵入性的，並且對於醫療院所來說是相對昂貴的，因此需要減少送往進行不必要活組織檢查的患者數量。因此，根據本發明的另一態樣，提供一種評估患者是否適合攝護腺活組織檢查之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的白介素-8及/或白介素-6濃度，可選地結合至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由PSA及核小體或其組分所組成之清單；以及， 其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8及/或較高濃度的白介素-6係該患者需要攝護腺活組織檢查的指標。

根據本發明的另一態樣，提供了一種對疑似攝護腺癌患者進行風險分級的方法，包括： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的白介素-8及/或白介素-6濃度，可選地結合至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由PSA及核小體或其組分所組成之清單；以及， 將患者分為高風險、中風險或低風險， 其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8及/或較高濃度的白介素-6被用於將患者分類為高風險。

本發明的方法具有避免不必要的活組織檢查的用途，並且可用於改善疾病結果，其係藉由在風險分級的過程中併入該方法改良攝護腺癌患者的風險分級。將理解的是，如果將患者分類為高風險，則隨後應對其進行治療，而分類為低風險的患者則不需要進行治療，但可以對其進行積極監測。

於一實施例中，該方法還包含確定該患者之至少一臨床參數。此參數可用於結果的解讀。臨床參數可以包含任何相關的臨床訊息，例如但不限於性別、體重、身體質量指數(BMI)、吸煙狀況和飲食習慣。因此，於一實施例中，臨床參數係選自由年齡、性別以及身體質量指數(BMI)所組成的群組。

年齡被發現為高惡性度PCa的獨立預測因子，且以90%的特異性從所有其他群中鑑定出39%的高惡性度PCa男性， AUC=72%。僅透過年齡可將少於20%的無癌症或低惡性度癌症男性鑑定為不需要攝護腺活組織檢查，不會遺漏任何高惡性度癌症。年齡作為參數被發現在許多測試的演算法或模型中有效作用。表1列出使用血清樣本中獲得的結果及其AUC所得出的一些模型/演算法，用於將患有高格里森級別PCa的男性與所有其他男性(低格里森級別PCa男性或無癌症的男性)區分開來。

表1. 示例性測試套組和演算法及所觀察之AUC和p值

套組和演算法	AUC	p
分數 = a[IL-6] -b[IL-8] +c[PSA/H3.1-核小體] +d[PSA/H1-核小體]	94%	＜0.01
分數 = -a[IL-8] +b[PSA/H3.1-核小體] +c[PSA/H1-核小體]	89%	＜0.05
分數 = a[IL-6] +b[PSA/H3.1-核小體] +c[PSA/H1-核小體]	87%	＜0.01
分數 = a[年齡] +b[PSA/H3.1-核小體] +c[PSA/H1-核小體]	87%	＜0.05
分數 = a[年齡] -b[IL-8] +c[PSA/H3.1-核小體]	85%	＜0.02
分數 = -a[IL-8] +b[PSA/H1-核小體]	81%	＜0.03
分數 = a[PSA] -b[IL-8]	81%	＜0.04
分數 = a[PSA/IL-8]	79%	＜0.02
分數 = a[PSA/H3.1-核小體] +B[PSA/H1-核小體]	79%	＜0.03
分數 = a[IL-8] +b[PSA/H3.1-核小體]	79%	＜0.02
分數 = a[年齡] -b[IL-8]	79%	＜0.03
分數 = a[PSA/H3.1-核小體]	77%	＜0.02
分數 = a[PSA/H3.1-核小體] +b[年齡]	82%	＜0.06
分數 = a[IL-6] -b[IL-8]	75%	＜0.05
分數 = a[IL-6] -b[IL-8] +c[年齡]	83%	＜0.06
分數 = a[IL-6]/[IL-8] +c[年齡]	78%	＜0.07
分數 = a[PSA] + b[IL-6]/[IL-8]	77%	＜0.08
分數 = [IL-6]/[IL-8]	71%	＜0.02

我們還使用在血漿樣本中確定的核小體和白介素所獲得的結果得到模型，以區分高風險攝護腺癌的男性和無癌症或低風險攝護腺癌的男性。如圖9所示，示例性模型為：分數=a[IL-6]-b[IL-8] +c[H3.1-核小體] +d[PSA]，其AUC = 92%。

於一實施例中，測量步驟包括使用圖9、表1或表2中列出的演算法。用於推導諸如表1或表2所列之模型或演算法的方法是本領域所習知的，並且合適的軟體包是可買到的。用於此目的的典型軟體工具包括SPSS(社會科學統計軟體包)和「R」。這些軟體包提供了臨床數據的線性和非線性數據建模。

本領域技術者將清楚的是，本文揭露之生物標記的任何組合可用於檢測攝護腺癌的套組和演算法中，特別是高惡性度PCa，且可將另外的標記物加至包含這些標記物的套組中。同樣清楚的是，任何涉及比例的演算法也可以使用反比例(即[A]/[B]或[B]/[A])。與模型相關的p值是重要的，並且預估在較大的研究規模中會更低。

於一實施例中，測量白介素-8。於另一實施例中，白介素-8的測量還包括確定臨床參數，例如年齡。於另一實施例中，白介素-8的測量還包括測量PSA濃度。於一實施例中，測量白介素-8和PSA，組合測量係採取白介素-6和白介素-8濃度的比例或差值形式。

於另一實施例中，白介素-8的測量還包括測量PSA和核小體或其組分濃度，例如H3.1及/或H1濃度。於一實施例中，測量PSA和核小體，且組合測量係採取PSA和核小體濃度的比例或差值形式。於另一實施例中，白介素-8、PSA和核小體的組合測量還包括確定臨床參數，例如年齡。

於一實施例中，測量白介素-6。於另一實施例中，白介素-6的測量還包括確定臨床參數，例如年齡。於另一實施例中，白介素-6的測量還包括測量PSA濃度。於一實施例中，測量白介素-6和PSA，且組合測量係採取白介素-6和PSA濃度的比例或差值形式。

於另一實施例中，白介素-6的測量還包括測量PSA和核小體或其組分濃度，例如H3.1及/或H1濃度。於一實施例中，測量PSA和核小體，且組合測量係採取PSA和核小體濃度的比例或差值形式。於另一實施例中，白介素-6、PSA和核小體的組合測量還包括確定臨床參數，例如年齡。

於一實施例中，測量白介素-6和白介素-8，且組合測量係採取白介素-6和白介素-8濃度的比例或差值形式。於另一實施例中，白介素-6和白介素-8的組合測量還包括確定臨床參數，例如年齡。於另一實施例中，測量PSA、白介素-6和白介素-8。

於一實施例中，測量PSA、白介素-6、白介素-8和核小體或其組分，例如H1。於一實施例中，測量PSA和核小體，且組合測量係採取PSA和核小體濃度的比例或差值形式。

根據本發明的另一態樣，提供結合劑用於製備試劑盒之用途，該試劑盒係用於診斷體液樣本中的攝護腺癌之方法，其中所述結合劑對IL-8具有特異性。該方法包括使用結合劑以檢測或測量來自患者的體液樣本中的IL-8濃度，其中，與一對照組相比，較低濃度的IL-8係攝護腺癌存在的指標。如本文所述，所述用途可另外包含對IL-6、PSA及/或核小體或其組分具有特異性的結合劑。

根據本發明之另一實施例，提供一種治療攝護腺癌的方法，包含： (i)從一主體獲得血液、血清或血漿樣本； (ii)測量樣本中白介素-8濃度； (iii)根據與一對照組相比具有較低濃度的白介素-8，鑑定該主體為患有攝護腺癌；以及 (iv)對該主體施行治療。

於一個實施例中，測量白介素-8濃度作為測量套組的一部分，該測量套組包含PSA及/或白介素-6及/或核小體或其組分。於另一實施例中，測量套組包含白介素-8以及PSA、白介素-6、組織蛋白H1和組織蛋白H3.1中的其中一或多種。

可用於PCa的治療包括手術、包含近接治療在內的放射療法、包含手術及藥物去勢在內的激素療法以及各種藥物治療。於一實施例中，所施行之治療係選自：攝護腺活組織檢查、手術、放射療法、激素療法及/或化學療法。

於一實施例中，攝護腺癌是高惡性度攝護腺癌。「高惡性度」是指格里森分數為7 (4+3)或更高的攝護腺癌。其亦可稱為「分化不良」或「侵襲性」攝護腺癌。

根據本發明之一態樣，提供一種套組測試之用途，以檢測高惡性度攝護腺癌(PCa)患者，其中該套組測試包含檢測PSA、白介素-6 (IL-6)、白介素-8 (IL-8)以及核小體或其組分測量之試劑。於一實施例中，該套組測試是用於來自患者的血液、血清或血漿樣本。

根據本發明之另一態樣，提供了一種治療攝護腺癌(PCa)的方法，包括使用一套組測試來鑑定需要PCa治療之患者以及提供該治療，其中，該套組測試包含檢測白介素-6 (IL-6)和白介素-8 (IL-8)之試劑，其中患有PCa之主體與一對照組相比具有較高IL-6濃度以及較低IL-8濃度。

於一實施例中，對照組包括健康的主體、未患病的主體及/或無癌症的主體。於一實施例中，對照組包括患有低惡性度攝護腺癌的主體。於一實施例中，該方法包括將來自主體的血液、血清或血漿樣本中存在的生物標記濃度與獲自正常主體的血液、血清或血漿樣本中存在的生物標記濃度進行比較 。將理解的是，「正常」的主體是指健康/未患病的主體。

根據本發明的另一態樣，提供一種鑑定需要攝護腺穿刺活組織檢查的患者的方法，該方法包括獲得所述患者的血液、血清或血漿樣本，將該樣本用於本文定義的套組測試，以及使用從套組測試中獲得的結果，以鑑定患者是否需要進行攝護腺活組織檢查。

於一實施例中，本文所描述的方法在多種情況下重複進行。此實施例提供了允許在一段時間內監測檢測結果的優點。這樣的安排將提供監測或評估疾病狀態的治療功效的益處。本發明的此類監測方法可用於監測發作、進展、穩定、改善、復發及/或緩解。

因此，本發明還提供了一種監測疑似患有這種疾病的主體對於疾病狀態的治療功效的方法，包括檢測及/或定量存在於來自該主體的生物樣本中的生物標記。於監測方法中，可兩次或多次採集樣本。該方法可進一步包括將測試樣本中存在的生物標記濃度與一或多對照組進行比較，及/或與較早(例如，在開始治療之前)從相同測試主體取得的一或多個先前的測試樣本進行比較，及/或與在較早治療階段從相同測試主體採集的一或多個先前的測試樣本進行比較。該方法可包括檢測在不同情況下採集的測試樣本中生物標記的性質或量的變化。

因此，根據本發明的另一態樣，提供了一種用於監測針對人或動物主體的疾病狀態的治療功效的方法，包括： (a)  定量本文所定義的生物標記套組；以及 (b) 比較測試樣本中所述生物標記濃度與一或多對照組及/或一或多較早從相同測試主體取得的一或多測試樣本。

相對於較早取自相同測試主體的先前測試樣本中的濃度，測試樣本中生物標記濃度的改變可以指出該療法對疾病或疑似疾病的有益效果(例如，穩定或改善)。此外，一旦治療完成，就可以週期性地重複本發明的方法，以監測疾病的復發。

監測治療功效的方法可用於監測現有療法及新療法在人類主體及非人類動物(例如在動物模型中)的療效。這些監測方法可以納入新藥物質及物質組合的篩選之中。

於另一實施例中，由速效療法而引起的更快速變化的監測可以以幾小時或幾天的較短間隔進行。

根據本發明的另一態樣，提供本文所定義的套組測試用於鑑定需要PCa治療的患者之用途。

根據本發明之另一態樣，提供本文定義之套組測試之用途，用於監測患者的PCa疾病進展。此態樣的實施例包括用於在觀察式等待、積極監控和監測術後或其他復發的治療中的疾病進展。

根據本發明的另一態樣，提供本文所定義的套組測試(或本發明的方法)在攝護腺癌患者的治療前風險分級中的用途(Humphrey；2014以及Barry和Nelson；2015)。「風險分級」是指根據患者的風險將患者分為不同組的過程，例如，將患者分類為高風險、中風險或低風險。可進一步細分風險類別，例如可將中風險類別細分為中度有利和中度不利風險類別(NCCN；2018)。本文所述之發明可用於確定患者是否為高風險，並因此需要治療攝護腺癌(例如，參考實施例3和實施例5)。顯而意見的是，本發明之方法優於單獨使用PSA測量，並且可以在風險分級標準中作為PSA測量的補充或替代使用。

根據本發明之另一態樣，提供如本文所定義的套組測試用於評估PCa治療在患者中的效用之用途。

根據本發明的另一態樣，提供如本文所定義的套組測試用於為PCa患者選擇治療方案之用途。

於一較佳實施例中，套組測試包括(可選地除此之外)檢測PSA和IL-8的試劑。在具有較高格里森分數(即，高惡性度攝護腺癌)的患者中的IL-8濃度較低，例如7(4+3)級和以上，如8級、9級或10級。用於解釋結果的示例演算法可以採用以下形式：套組分數 = a[PSA] – b[IL-8]或套組分數= a[PSA]/[IL-8] 。

於另一實施例中，套組測試包括(可選地除此之外) 檢測IL-6和IL-8的試劑。在具有較高格里森分數(即，高惡性度攝護腺癌)的患者中的IL-8濃度較低，例如7(4+3)級和以上，如8級、9級或10級。用於解釋結果的示例演算法可以採用以下形式：套組分數 = a[IL-6] – b[IL-8]  或套組分數 = a[IL-6]/[IL-8] 。

於另一實施例中，PSA測量與血液、血清或血漿中的白介素-8濃度的測量及/或白介素-6濃度的測量及/或核小體濃度的測量結合使用作為攝護腺癌的生物標記。組合測量可採取循環PSA/白介素濃度的比例或循環PSA/核小體濃度的比例的形式。本領域技術人員將清楚的是，可以以這種方式使用任何核小體測量，包括核小體本身(即，總核小體濃度)，以及具有本文所述之特定結構及/或表觀遺傳特徵的核小體的任何子集。

於一較佳實施例中，套組測試包含用於檢測PSA、核小體或其組分、IL-6和IL-8的試劑。用於解釋結果的示例演算法可以採用以下形式：套組分數=a[IL-6]-b[IL-8]+c[PSA/H3.1-核小體]+d[PSA/H1-核小體]。用於解釋結果的另一示例演算法可為以下形式：套組分數=a[IL-6]-b[IL-8]+c[H3.1-核小體]+d[PSA]。與IL-8濃度有關的係數「b」的負值與在較高惡性度或較高風險疾病中出現的較低濃度有關。

於另一實施例中，套組測試包括檢測PSA、核小體或其組分和IL-8的試劑。用於解釋結果的示例演算法可為以下形式：套組分數 = -a[IL-8]+b[PSA/H3.1-核小體]+c[PSA/H1-核小體]。

於其他實施例中，該套組可能包括檢測總核小體濃度及/或H1-核小體濃度的試劑、及/或可以包括其他核小體測量。一些另外的實施例無限制地被列於表1作為示例演算法形式。

於另一實施例中，IL-8作為參數被包括在攝護腺癌風險分級系統中。

我們發現年齡是高惡性度PCa的獨立預測因子。亦有報導指出PSA濃度與年齡有關(Heidegger 等人；2015)。因此，可以將年齡與其他演算法以圖形格式組合，演算法分數= a[IL-6] -b[IL-8] +c[PSA/H3.1-核小體] +d[PSA/H1-核小體]，如圖7所示。該方法的一個優點在於，其可用於完善演算法，以隔出圖的年齡/演算法區域，其中出現了所有或大多數具有給定條件的主體(對於納入測試為陽性選擇)，或者很少或沒有個別受試者具有給定條件(對於排除測試為陰性選擇)。

在本發明之一實施例中，與年齡相關的臨界值用於演算法的輸出。根據日、月、年或任何其他時間單位計算的年齡，用於將樣本分為陽性或陰性的可變臨界值可能會有所不同。舉例而言，臨界值在70歲時可能取值為[a]，在71歲時為[b]，在72歲時為[c]。於一實施例中，演算法包括與年齡有關的臨界值。

提及到的「主體」或「患者」在本文中可互換地使用。於一實施例中，患者是人類患者。本文所述的用途、套組及方法可以在體外、體內或離體進行。

於一實施例中，所述檢測或測量包括免疫測定、免疫化學法、質譜法、色析法、染色質免疫沉澱法或生物感測器法。

於一實施例中，檢測或測量包含免疫測定。於本發明一較佳實施例中，提供一種2位點免疫測定方法。特別地，這種方法較佳用於含有表觀遺傳特徵的核小體的原位測量，其係使用固定的抗-核小體結合劑與標記的抗-組織蛋白修飾或抗-組織蛋白變體或抗-DNA修飾或抗-加合蛋白偵測結合劑。於本發明的另一實施例中，提供了2位點免疫測定，其係使用標記的抗-核小體偵測結合劑與固定的抗-組織蛋白修飾或抗-組織蛋白變體或抗-DNA修飾或抗-加合蛋白結合劑 。

可使用一或多種試劑，例如合適的結合劑，以檢測或測量生物標記濃度。於一實施例中，該一或多種結合劑包含一種針對欲測得的生物標記具有特異性之配體或結合劑，該生物標記諸如IL-8、IL-6、PSA、核小體或其組分(例如核小體的表觀遺傳特徵)或核小體或其組分的結構/形狀模擬物。

對於本領域技術人員將清楚的是，就本發明的任何態樣而言，術語「抗體」、「結合劑」或「配體」不限於但旨在包含能夠與特定分子或實體結合的任何結合劑，並可以在本發明的方法中使用任何適合的結合劑。還將清楚的是，術語「核小體」旨在包含單核小體及寡核小體及可以在流體介質中分析的任何此種染色質片段。

檢測生物標記的方法是本領域眾所皆知的。於一實施例中，該試劑包括一或多種配體或結合劑。於一實施例中，本發明的配體或結合劑包含天然存在或化學合成的化合物，其能夠與所需的標靶特異性結合。配體或結合劑可包括能夠與所需標靶特異性結合的胜肽、抗體或其片段、或合成的配體(諸如，塑性抗體、或適體或寡核苷酸)。該抗體可為單株抗體或其片段。配體可用可檢測標記物來標記，例如發光、螢光、酵素或放射性標記物；替代性地或額外地，可用親和標幟來標記根據本發明的配體，例如，生物素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素或His(例如hexa-His)標幟。或者，可以使用例如ForteBio Inc.的無標記技術測定配體結合。

提供診斷或監測試劑盒(或套組)以進行本發明的方法。這樣的試劑盒將適當地包括一或多種用於檢測及/或定量依據本發明的生物標記的配體、及/或生物感測器、及/或如本文所述陣列、可選地連同該試劑盒的使用說明。

本發明之另一態樣是用於檢測疾病狀態的存在的試劑盒，其包括能夠檢測及/或定量一或多種如本文所定義的生物標記的生物感測器。如本文所用，術語「生物感測器」是指任何能夠檢測生物標記的存在的物質。本文記載了生物感測器的實例。生物感測器可包括如本文所述能夠與生物標記特異性結合的配體結合劑或配體。此種生物感測器可用於檢測及/或定量本發明的生物標記。

適當地，用於檢測本發明的一或多種生物標記的生物感測器將生物分子辨識與適當的方法相結合，以將樣本中生物標記的存在或定量的檢測轉換為訊號。生物感測器可適用於「替代場所」診斷測試，例如在病房裡、門診部、手術室、家庭、田野及工作場所。用於檢測本發明的一或多種生物標記的生物感測器包含聲學、電漿共振、全像攝影、生物層干涉法(BLI)及微工程感測器。印記辨識元件、薄膜電晶體技術、磁聲諧振器裝置及其他新穎的聲電系統可用於生物感測器中，以檢測本發明的一或多種生物標記。

用於檢測疾病的存在的生物標記是發現新型標靶及延緩或阻止疾病進展的藥物分子的基本目標。由於生物標記的濃度為疾病和藥物反應的指標，因此該生物標記可用於體外及/或體內試驗以鑑定新型治療化合物。本發明的生物標記可用於篩選調節生物標記活性的化合物的方法。

因此，於本發明的另一態樣，提供如前所述的結合劑或配體的用途，該結合劑或配體可為針對依據本發明的生物標記之胜肽、抗體或其片段或適體或寡核苷酸；或提供依據本發明的生物感測器、陣列或試劑盒的用途，以鑑定能夠促進及/或抑制生物標記產生的物質。

術語「生物標記」是指過程、事件、或狀況的特殊生物學或生物學所衍生的指標。生物標記可用於診斷方法，例如臨床篩檢、預後評估及監測治療結果、鑑定最有可能對特定治療方法產生反應的主體、藥物篩選及開發。生物標記及其用途對於新藥治療的鑑定及藥物治療的新標靶的發現是有價值的。

如本文所用的術語「檢測」或「診斷」涵蓋疾病狀態的鑑定、確認及/或特徵化。依據本發明的檢測、監測及診斷的方法可用於確認疾病的存在、透過評估發作及進展來監測疾病的發展、或評估疾病的改善或消退。檢測、監測及診斷的方法也可用於評估臨床篩檢、預後、治療的選擇、評估治療效益的方法，即用於藥物篩選及藥物開發。

鑑定及/或定量可以透過適合於鑑定來自主體的生物樣本中或生物樣本的純化物或萃取物或其稀釋液中特定蛋白質的存在及/或量的任何方法來進行。於本發明的方法中，可以透過測量一或多個樣本中標靶的濃度來進行定量。可以用本發明的方法測試的生物樣本包含上文所定義者。樣本舉例可在適當稀釋或濃縮的情況下製備，且以常規方式儲存。

生物標記的鑑定及/或定量可透過檢測生物標記或其片段來進行，例如，具有C端截短或具有N端截短的片段。片段長度較佳為大於4個胺基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。特別注意的是，與組織蛋白末端胜肽相同或相關序列的胜肽是組織蛋白特別有用的片段。

舉例而言，可以使用諸如免疫測定法的免疫學方法來進行檢測及/或定量。免疫測定法包含使用一或多種抗體或其他特異性結合劑直接與本文所定義的生物標記結合的任何方法。免疫測定法包含2位點免疫測定法或採用酶檢測方法的免疫測定法(例如，ELISA)、螢光標記免疫測定法、時差性螢光標記免疫測定、化學發光免疫測定法、免疫比濁測定法、微粒標記免疫測定法及免疫放射測定法以及單位點免疫測定法、試劑限制免疫測定、競爭性免疫測定方法，該競爭性免疫測定方法包含標記抗原及標記抗體單抗體免疫測定方法，其具有多種標記類型，包含放射性標記、酶標記、螢光標記、時差性螢光標記及微粒標記。所有所述免疫測定方法都是本領域所熟知的，參見例如Salgame等人(1997)和van Nieuwenhuijze等人(2003年)。

於另一實例中，檢測及/或定量可透過一或多種方法進行，其係選自由：SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、一維電泳分析(1-D gel-based analysis)、二維電泳分析(2-D gel-based analysis)、質譜(MS)、逆相(RP)LC、尺寸滲透(凝膠過濾)、離子交換、親和力、HPLC、UPLC和其他基於LC或LC MS的技術所組成的群組。適合的LC MS技術包括ICAT® (Applied Biosystems, CA, USA)或iTRAQ® (Applied Biosystems, CA, USA)。也可以使用液相層析(例如高壓液相層析(HPLC)或低壓液相層析(LPLC))、薄層層析、NMR(核磁共振)光譜。

涉及本發明的一或多種生物標記的鑑定及/或定量的方法可以在實驗臺儀器上進行，或可以結合到可在非實驗室環境(例如，在醫師的辦公室或主體床邊)中使用的一次性、診斷或監測平台上。用於進行本發明的方法的適合的生物感測器包含具有光學或聲學讀取器的「信用」卡。生物感測器可被設計為將收集到的數據以電子方式傳輸給醫師以進行解讀，並因此可以形成電子醫學的基礎。

用於疾病狀態的生物標記的鑑定整合診斷程序及治療方案。本發明的生物標記的檢測可用於在主體參加臨床試驗之前對其進行篩檢。生物標記提供了指示治療反應、無反應、不良反應、藥物依從性及達到足夠血清藥物量的方法。生物標記可用於提供藥物不良反應的警示。生物標記可用於個人化療法的開發，因為對反應的評估可用於微調劑量、最少化處方藥的數量、減少獲得有效治療的延遲並避免藥物不良反應。因此，透過監測本發明的生物標記，可以精確地制定主體照護以符合由疾病和對象的藥物基因組學特徵所定的需求，因此該生物標記可以用於滴定最佳劑量、預測陽性治療反應並鑑定那些有嚴重副作用的高風險主體。

基於生物標記的測試提供了對「新」主體的第一線評估，並提供了準確及快速診斷的客觀方法，而這是使用當前方法無法實現的。

生物標記監測方法、生物感測器及試劑盒作為主體監測工具也相當重要，使醫師能夠判斷復發是否是由於疾病惡化而引起的。如果藥理學治療被評估為不適當，則可以恢復治療方法或增加治療方法；如果適當的話，可以改變治療方法。由於生物標記對疾病狀態是敏感的，因此其可提供藥物治療效果的指標。

根據本發明之另一態樣，提供一種診斷患者攝護腺癌之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的PSA濃度，結合其他至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由白介素-6、白介素-8及核小體或其組分所組成之清單。

於一實施例中，相對於其他生物標記濃度而有理化PSA濃度。舉例而言，將PSA濃度的測量與核小體或其組分濃度的測量組合，且該組合測量係採取PSA與核小體濃度的比例的形式。示例演算法包括分數＝PSA/核小體濃度，例如a[PSA/H3.1-核小體濃度]+b[PSA/H1核小體濃度]。

應當理解的是，本文所述之實施例可應用於本發明的所有態樣，即所述之用途的實施例可等同地應用於所要求保護的方法等。

本發明現在將參考以下的非限制性實施例進行說明。

實例

實例1

從84名接受攝護腺活組織檢查的男性中抽取靜脈血樣本，以調查疑似PCa。將全血添加到標準凝膠SST(血清分離管)中，並在離心前凝結30-60分鐘。將分離的血清成份轉移至標準冷凍管中並冷凍直至測定。

所有的男性都進行了攝護腺活組織檢查，至少取出了12個攝護腺組織的粗針樣本。對這些組織樣本進行顯微鏡檢查以檢查異常組織的存在。在被診斷為無癌症的35名男性中，未觀察到異常的癌組織(陰性活組織檢查結果)。在診斷出患有PCa的49名男性中觀察到異常的癌組織(陽性活組織檢查結果)，並且根據本領域已知的格里森分級系統對這些男性的攝護腺組織樣本進行分類，如先前所述。在49名陽性PCa活組織檢查結果的男性中，有16名男性被分類為格里森6級，17名男性為7(3+4)級，6名男性為7(4+3)級，3名男性為8級以及7名男性為9級。

我們測量了男性血液中PSA、含有組織蛋白H3.1的核小體、含有組織蛋白H1的核小體、IL-6和IL-8的血清濃度。使用市售的免疫測定方法測量PSA、IL-6和IL-8。使用ELISA測量H3.1-核小體，所述ELISA是使用一種直接結合組織蛋白H3.1的抗體和一種直接結合完整核小體中存在的表位的抗體。使用ELISA測量含有組織蛋白H1的核小體，所述ELISA是使用一種直接結合組織蛋白H1的抗體和一種直接結合完整核小體中存在的表位的抗體。

接受活組織檢查的絕大多數男性具有升高的PSA濃度，包括之後發現在活組織檢查中無癌症的男性，單單進行PSA的測量並不能區分高惡性度癌症(圖1和圖2)。

將標記物結合到標記套組並且用演算法解讀時，發現了極高的區分。使用統計程式語言R (R Core Team；2017)得出模型/演算法。使用rms軟體包(Harrell Jr; 2018)中的R函數lrm對測定結果、患者變數以及臨床參數的組合進行邏輯迴歸(LR)。使用R函數pROC(Robin et al；2011)計算接收者操作特徵(ROC)曲線。

測試程式生成的模型的整個模型以及構成術語的統計顯著性(p值)，並透過交叉驗證對其中的模型進行隨機選擇的數據子集的可靠性檢查。表2列出一些模型/演算法，以及他們用來區分高惡性度PCa男性與其他所有等級的男性(即，低惡性度PCa或無癌症的男性)的AUC。可選擇性地使用常數項移動臨界點至一方便的值(例如，零)。

表2. 示例演算法以及觀察到的AUC和p值

套組和演算法	AUC	p
分數 = 0.49[IL-6] -0.14[IL-8] +0.061[PSA/H3.1-核小體] -0.027[PSA/H1-核小體]	94%	＜0.01
分數 = -0.14[IL-8] +0.016[PSA/H3.1-核小體] -0.028[PSA/H1-核小體]	89%	＜0.05
分數 = 0.37[IL-6] +0.02[PSA/H3.1-核小體] -0.049[PSA/H1-核小體]	87%	＜0.01
分數 = 0.093[年齡] +0.012[PSA/H3.1-核小體] - 0.026[PSA/H1-核小體]	87%	＜0.05
分數 = 0.13[年齡] - 0.10[IL-8] + 0.0032[PSA/H3.1-核小體]	85%	＜0.02
分數 = - 0.105[IL-8] + 0.0094 [PSA/H1-核小體]	81%	＜0.03
分數 = 0.044[PSA] -0.072[IL-8] – 0.30	81%	＜0.04
分數 = [PSA/IL-8]	79%	＜0.02
分數 = 0.015[PSA/H3.1-核小體] - 0.034[PSA/H1-核小體]	79%	＜0.03
分數 = - 0.078[IL-8] + 0.0042[PSA/H3.1-核小體]	79%	＜0.02
分數 = 0.12 [年齡] - 0.074[IL-8]	79%	＜0.03
分數 = [PSA/H3.1-核小體]	77%	＜0.02
分數 = 0.0025[PSA/H3.1-核小體] + 0.10 [年齡]	82%	＜0.06
分數 = 0.24[IL-6] - 0.061[IL-8]	75%	＜0.05
分數 = 0.28[IL-6] - 0.088[IL-8] + 0.12[年齡]	83%	＜0.06
分數 = 5.8[IL-6]/[IL-8] + 0.11[年齡]	78%	＜0.07
分數 = 0.032[PSA] -0.053[IL-8]/[IL-6]	77%	＜0.08
分數 = [IL-8]/[IL-6]	71%	＜0.02

其結果可以解釋如下：

患有格里森8級或9級PCa之男性的中位PSA濃度高於患有低惡性度癌症或無癌症的男性，但無法區別PCa為7(4+3)級之男性與具有低惡性度癌症之男性。整體而言，單用PSA可從所有其他的男性中鑑定出33%具有高惡性度PCa的男性，其特異性為90%以及AUC為74%。然而，僅透過低PSA濃度即可確定少於20%的無癌症或低惡性度癌症的男性為不需要攝護腺活體組織檢查，而不會遺漏任何高惡性度癌症(圖1和圖2)。

類似地，我們發現，格里森8級或9級PCa男性的中位IL-6濃度高於低惡性度癌症或無癌症的男性，但PCa為7(4+3)級的男性再次難以區分。高惡性度PCa的整體敏感性為17%，特異性為90%，AUC為59%。僅透過低IL-6濃度即可確定少於3%的無癌症或低惡性度癌症的男性為不需要攝護腺活體組織檢查，而不會遺漏任何高惡性度癌症。

相比之下，我們發現較高等級PCa(格里森等級為7(4+3)級或以上)男性比低惡性度或無癌症男性具有較低IL-8濃度。觀察到的高惡性度PCa的整體敏感性為33%，特異性為90%，AUC為62%，並且我們觀察到IL-8濃度隨著格里森等級普遍下降(圖3)。僅透過低IL-8濃度即可確定少於10%的無癌症或低惡性度癌症的男性為不需要攝護腺活體組織檢查，而不會遺漏任何高惡性度癌症。

當使用套組分數=a[IL-6]-b[IL-8]之形式的演算法組合IL-6和IL-8濃度時，我們觀察到高惡性度PCa的敏感性為33%，特異性為90%，AUC為74%。將近50%無癌症或低惡度癌症的男性可被確定為不需要進行攝護腺活體組織檢查，而遺漏5%高惡性度癌症。這顯示出，針對PCa患者中IL-6濃度的增加和IL-8濃度的減少而設計的診斷演算法比目前最常使用的PSA測試更為準確。實施例可包括如上所述的IL-6和IL-8濃度的差值的形式，或IL-6和IL-8濃度的比例。

當使用套組分數= a[PSA]-b[IL-8]之形式的演算法組合PSA濃度和IL-8濃度時，我們觀察到高惡性度PCa的敏感性為72%，特異性為90%，AUC為81%，且演算法結果隨著格里森等級的提高而逐步提高(圖4)。類似地，涉及PSA/IL-8濃度的比例的演算法對高惡性度PCa的敏感性為50%，特異性為90%，AUC為79%。因此，和單獨使用PSA相比，在一演算法中組合PSA和IL-8的測量值大幅提高診斷準確性。實施例可包括PSA和IL-8濃度的差值的形式，或PSA和IL-8濃度的比例。

在高惡性度PCa中，含有組織蛋白H3.1的核小體以及含有組織蛋白H1的核小體所觀察到的各自濃度並沒有大幅改變。然而，當使用形式為比例的演算法「套組分數=a[PSA/H3.1-核小體]」組合PSA濃度與含有組織蛋白H3.1的核小體濃度時，我們觀察到對高惡性度PCa的敏感性為39%，特異性為90%，AUC為79%。此外，大約50%的無癌症或低惡性度癌症的男性可被確定為不需要進行攝護腺活組織檢查，而遺漏了＜6%的高惡性度癌症。我們還觀察到比例水平隨著格里森等級的提高而逐步提高(圖5)。因此，和單獨使用PSA相比，組合PSA和H3.1-核小體的測量值提高了診斷準確性。實施例可包括PSA和IL-8濃度的比例形式或PSA和IL-8濃度之差形式。

當使用形式為「套組分數= a[PSA/H1-核小體]」的演算法組合PSA濃度與含有組織蛋白H1的核小體濃度時，我們觀察到對高惡性度PCa的敏感性為25%，特異性為90%，AUC為73%。將近30%的無癌症或低惡性度癌症的男性可被確定為不需要進行攝護腺活組織檢查，而未遺漏高惡性度癌症。

當使用形式為「套組分數= a[IL-6]+b[PSA/H3.1-核小體]+c[PSA/H1-核小體]」的演算法組合PSA濃度、IL-6濃度、含有組織蛋白H3.1的核小體濃度以及含有組織蛋白H1的核小體濃度時，我們觀察到對高惡性度PCa的敏感性為63%，特異性為90%，AUC為87%。儘管研究規模小，該演算法仍具有統計學意義，並且與模型及其各個組成部分相關的所有p值均具有統計學意義(p ＜0.005)。

當使用形式為「套組分數=-a[IL-8] +b[PSA/H3.1-核小體]+c[PSA/H1-核小體]」的演算法組合PSA濃度、IL-8濃度、含有組織蛋白H3.1的核小體濃度以及含有組織蛋白H1的核小體濃度時，我們觀察到對高惡性度PCa的敏感性為88%，特異性為89.7%，AUC為89%。使用此演算法，將近25%的無癌症或低惡性度癌症的男性可被確定為不需要進行攝護腺活組織檢查，而未遺漏高惡性度癌症。儘管研究規模小，該演算法仍具有統計學意義，並且與模型及其各個組成部分相關的所有p值均具有統計學意義(p ＜0.05)。

當使用形式為「套組分數= a[IL-6]-b[IL-8] +c[PSA/H3.1-核小體]+d[PSA/H1-核小體]」的演算法組合PSA濃度、IL-6濃度、IL-8濃度、含有組織蛋白H3.1的核小體濃度以及含有組織蛋白H1的核小體濃度時，我們觀察到對高惡性度PCa的敏感性為94%，特異性為88%，AUC為94%。使用此演算法，將近45%的無癌症或低惡性度癌症的男性可被確定為不需要進行攝護腺活組織檢查，而未遺漏高惡性度癌症。此外，該模型產生的中位數結果隨著格里森等級的提高而明顯逐步提高(圖6)。與模型關聯的所有p值及其所有組成項均具有統計學意義(所有p值中的最高者為p＜0.007)，並且該模型對於交叉驗證分析具有可靠性。

實例2

實例1中最準確的模型能夠在45%的無癌症或低惡性度癌症而無高惡性度癌症的男性中排除高惡性度PCa(即確定不需要立即治療的男性)。可以藉由對演算法使用與年齡相關的臨界值來改善這一點，所以對於大約≤67歲的男性，使用恆定的臨界值，而對於年齡大於67歲的男性，使用的臨界值會降低，對於67歲以上的男性，每年臨界值會減少大約0.7 。結果如圖7所示。圖7中左下方的區域排除了演算法分數高於年齡相關臨界值的主體。結果為圖7中的左下區域不包含患有高惡性度癌症的個體，可以用於鑑定沒有高惡性度疾病的個體，具有高陰性預測值。在此處所示的實例中，在高惡性度癌症判定中可以預測＞70%的無癌症患者和＞40%的低惡性度癌症患者為陰性，且偽陰性為零。

實例3

隨後，根據公認的治療前危險分級標準，包括PSA濃度、格里森分數和以下臨床分期，將實例1中患有PCa且被分配了格里森評分的主體分為低風險、中風險或高風險(Humphrey；2014年和Barry和Nelson；2015年)。

表3. PCa主體的分類

風險類別	臨床分期	格里森分數	血清PSA
低風險	≤T2a	≤6	＜10ng/ml
中風險	一高風險因素： 臨床分期≥T2a疾病，格里森分數≥7，PSA≥10 ng/mL
高風險	二高風險因素

在這種風險系統中，應治療高風險患者，並應監測低風險患者。對中風險患者進行治療的決定權在於臨床醫生和患者，但他們至少應受到積極監控，並有可能接受激素治療。

我們重新應用了透過對風險分級數據對實例1中的風險分類患者進行格里森分數建模而得出的演算法，以將高風險男性從低風險男性或無癌症的男性區分開。單獨的血清PSA是比格里森分數更好的風險分級模型，這是可以預期的，因為其構成了風險分級過程的一部分。血清PSA將高風險患者與低風險或無癌症的患者區分開，AUC為84%，敏感性為80%，特異性為85%。在比例演算法「分數= [PSA]/[IL-8]」中添加IL-8作為標記後AUC增至87%，敏感性為80%，特異性為85%，並且可以區分40%的低風險或沒有癌症的男性，且對於患有高風險PCa的男性沒有偽陰性結果(即，沒有「遺漏」患有高風險癌症的男性)。演算法「分數= -0.14[IL-8] +0.016[PSA/H3.1-核小體] -0.028[PSA/H1-核小體」應用於風險分級數據所得的AUC為86%，敏感性為84%，特異性為93%。因此，白介素和核小體標記物的使用極大地改善了PSA的單獨表現，甚至可以預測包括PSA在內的風險分級程序的結果。

然後，我們重新應用了透過對風險分級數據對實例1中的風險分類患者進行格里森分數建模而得出的演算法，以將高風險或中風險男性從低風險或無癌症的男性區分開。再次地，單獨的血清PSA是比格里森分數更好的風險分級模型，這是可以預期的，因為其構成了風險分級過程的一部分。血清PSA將高風險或中風險患者從低風險或無癌症患者區分開，AUC為69%，敏感性為36%，特異性為90%。在比例演算法「分數= [PSA]/[IL-8]」中添加IL-8作為標記後AUC增至72%，敏感性為44%，特異性為90%，並且可以區分40%的低風險或沒有癌症的男性，高風險或中風險PCa男性有15%偽陰性，但在上述先前的結果顯示，高風險PCa男性的遺漏率為零，因此這些錯誤分類的男性推測為中風險。演算法「分數= 0.49[IL-6] -0.14[IL-8] +0.061[PSA/H3.1-核小體] -0.027[PSA/H1-核小體]」應用於風險分級數據所得的AUC為75%，敏感性為52%，特異性為92%。再次地，白介素和核小體標記物的使用極大地改善了PSA的單獨表現，甚至預測包括PSA在內的風險分級程序的結果。

這些數據表示，除了預測在活組織檢查中發現的癌症等級之外，本發明的方法還可以預測患者的組合風險分級程序的結果。因此，清楚的是，本發明的方法可用於避免不必要的活組織檢查，並且亦可用於改善疾病結果，其是透過將該方法包含在風險分級程序中以改善攝護腺癌的風險分級。

實例4

從實例1所述之84名接受攝護腺活組織檢查以調查疑似PCa的男性中抽取EDTA血漿樣本。血清和血漿樣本是同時採集的。將分離的血漿成份轉移至標準冷凍管中並冷凍直至測定。

我們測量了男性血液樣本中H3.1-核小體、IL-6和IL-8的血漿濃度。將這些標記物濃度與血清PSA濃度組合成標記套組，並使用將結果與疾病格里森等級進行比較的演算法進行解讀。圖8展示了形式為「套組分數=0.80[IL-6] -0.25[IL-8] +0.79[H3.1-核小體] +0.044[PSA]」之迴歸分析演算法的結果以及攝護腺活組織檢查中確定的格里森等級。清楚的是，患有高惡性度疾病的男性可與患有低惡性度疾病或沒有癌症的男性區分開。此外，可鑑定將近70%的低惡性度或無癌症男性而沒有產生任一高惡性度疾病男性的偽陰性錯誤分類。因此，本發明的方法可用於避免不必要的活組織檢查。

實例5

將實施例4中所述之EDTA血漿樣本的結果與血清PSA濃度組合成標記套組，並使用將結果與疾病風險分級進行比較的演算法進行解讀。圖9展示了形式為「套組分數= 0.603[IL-6] -0.105[IL-8] +0.892[H3.1-核小體] +0.080[PSA]」之迴歸分析演算法的結果，以及攝護腺活組織檢查中確定的疾病風險分級(低風險、中風險有利、中風險不利或高風險癌症)。該演算法是開發為迴歸方程式，以最佳化高風險PCa男性與低風險疾病或無癌症男性的區分。結果與臨床風險類別相關，中位數水平隨風險增加而逐步增加。在圖9中的ROC曲線展示了演算法的區分(AUC=92%)，其係用於區分隨後診斷出患有高風險PCa的男性與活組織檢查中具有低風險PCa或無癌症的男性。該檢測套組和演算法在特異性為96%時檢測出65%的高風險PCa。此外，在沒有高風險PCa的男性中有74%被確定為高風險PCa陰性，偽陰性結果為零(100%檢出高風險PCa)。該演算法將54%的中度有利風險患者和38%的中度不利風險患者歸類為低風險。因此，在此基礎上排除活組織檢查是表示將監測某些中度風險疾病男性，而不是對其進行治療。然而，無論如何，這是該些男性常見的臨床結果。

為了進行比較，PSA測試檢測出42%具有高風險疾病的男性，其特異性為96%，並且鑑定出22%沒有高風險PCa的男性且偽陰性為零，如圖10所示。

與PSA測試相比，本發明的血液測試可提供與患者的臨床風險有關的更準確的訊息，並可用於對患者進行分級、對最需要治療的患者進行分類、透過重複測試監測患者隨時間推移所增加的風險類別，並避免不必要的攝護腺活組織檢查。

文獻 Barry & Nelson, J Urol, 194: 1534, 2015 Chadhaet al , Clin Cancer Investig J, 3: 72–79, 2014 Crawfordet al , Cancernetwork, 28(2), 2014 Cuchiarraet al , Eur Urol, 73: 572-582, 2018 Duet al , Cancer Chemother Pharmacol, 81: 1111-1119, 2018 Filellaet al , Pharmacogenomics Pers Med, 11: 83–94, 2018 Harrell Jr, rms: Regression Modeling Strategies. R package version 5.1-2. https://CRAN.R-project.org/package=rms, 2018 Heideggeret al , PLoS ONE, 10(7): e0134134, 2015 Herranz and Esteller, Methods Mol Biol, 361: 25-62, 2007 Holdenriederet al, Int J Cancer, 95: 114–20, 2001 Holdenrieder & Stieber, Crit Rev Clin Lab Sci, 46(1): 1–24, 2009 Humphrey. Cancers of the male reproductive organs. In: World Cancer Report, World Health Organization, Lyon, 2014 Madej-Michniewiczet al , Nature Scientific Reports, 5: 14382, 2015 Martinet al , JAMA, 319: 883-895, 2018 NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. Prostate Cancer. Version 4, 2018 R Core Team (2017). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. https://www.R-project.org/, 2017 Robinet al , BMC Bioinformatics, 12: 77, 2017 Salgameet al, Nucleic Acids Res, 25(3): 680-681, 1997 Singh and Lokeshwar, Mol Cancer, 8: 57, 2009 Stephanet al , Clin Chem, 59: 306–314, 2013 Taniguchi and Karin, Semin Immunol, 26: 54–74, 2014 van Nieuwenhuijzeet al, Ann Rheum Dis, 62: 10–14, 2003 Veltriet al , Urology, 53: 139-47, 1999 Wang and Sun, Int J Oncology, 44: 1032-1040, 2014 Xiaet al , PLoS ONE, 10(4): e0123484, 2015 Xie, Cytokine Growth Factor Rev, 12: 375–391, 2001 Xuet al , Cancer Res, 69: 3267–3271, 2009 Xuet al , PLoS ONE, 7(3): e32905, 2012

無

圖1：在接受攝護腺活組織檢查的男性中測量的PSA濃度(ng/ml)的變化，這些男性隨後被發現在活組織檢查中為無癌症、低惡性度或高惡性度癌症。水平虛線表示PSA濃度為3 ng/ml。垂直箭頭表示樣本具有超出圖表刻度的高或低濃度。ROC曲線顯示，隨後被診斷為高惡性度PCa的男性與其他接受活組織檢查具有低惡性度癌症或無癌症的男性之間的區別。ROC曲線上的虛線表示曲線上95%的誤差界線。 圖2：PSA濃度(ng/ml)隨攝護腺活組織檢查中格里森等級的變化。 圖3：IL-8濃度(pg/ml)隨攝護腺活組織檢查中格里森等級的變化。ROC曲線顯示，隨後被診斷為高惡性度PCa的男性與其他接受活組織檢查具有低惡性度癌症或無癌症的男性之間的IL-8的區別。 圖4：PSA濃度(ng/ml)及IL-8濃度(pg/ml)的差值隨著攝護腺活組織檢查中格里森等級的變化。ROC曲線顯示了對隨後被診斷為高惡性度PCa的男性與其他接受活組織檢查具有低惡性度癌症或無癌症的男性之間的[PSA - IL-8]的區別。 圖5：[PSA/H3.1-核小體濃度]之比例之結果隨著攝護腺活組織檢查中格里森等級的變化。ROC曲線顯示了對隨後被診斷為高惡性度PCa的男性與其他接受活組織檢查具有低惡性度癌症或無癌症的男性之間的比例的區別。 圖6：IL-8、IL-6、PSA、H3.1-核小體和H1-核小體套組的結果(使用「套組分數 = 0.49[IL-6] -0.14[IL-8] +0.061[PSA/H3.1-核小體] -0.027[PSA/H1-核小體] 」的演算法)隨著攝護腺活組織檢查中格里森等級的變化。ROC曲線顯示了對隨後被診斷為高惡性度PCa的男性與其他接受活組織檢查具有低惡性度癌症或無癌症的男性之間的演算法的區別。 圖7：IL-8、IL-6、PSA、H3.1-核小體和H1-核小體套組的結果(使用「套組分數 = 0.49[IL-6] -0.14[IL-8] +0.027[PSA/H3.1-核小體] -0.061[PSA/H1-核小體] 」的演算法)，相對於患者年齡作圖。所繪的線代表連續年齡相關的臨界值，可作為排除試驗的基礎，以鑑定出沒有高惡性度PCa的男性(在該線之下並未發現具有高惡性度PCa的患者)。 圖8：形式為「套組分數 = 0.80[IL-6] -0.25[IL-8] +0.79[H3.1-核小體] +0.044[PSA]」之迴歸分析演算法之結果，表示為每個患者具有高惡性度癌症之機率，相對於由攝護腺活組織檢查確定的格里森等級作圖。虛線為演算法臨界值，在其以下並未觀察到具有格里森分數≥7(4+3)的高惡性度癌症的患者。ROC曲線顯示了對隨後被診斷為高惡性度PCa的男性與其他接受活組織檢查具有低惡性度癌症或無癌症(AUC=89%)的男性之間的演算法的區別。所有核小體和白介素濃度的測量均在血漿中進行。PSA濃度的測量在血清中進行。 圖9：形式為「套組分數 = 0.603[IL-6] -0.105[IL-8] +0.892[H3.1-核小體] +0.080[PSA]」之血漿測量之迴歸分析演算法之結果，表示為每個患者具有高惡性度癌症之機率，相對於由攝護腺活組織檢查確定的風險等級作圖。虛線為演算法臨界值，在其之下並未觀察到具有高風險癌症患者。ROC曲線顯示了對隨後被診斷為高風險PCa的男性與其他接受活組織檢查具有低風險癌症或無癌症(AUC=92%)的男性之間的演算法的區別。所有核小體和白介素濃度的測量均在血漿中進行。PSA濃度的測量在血清中進行。 圖10：以Log(10)形式表示的PSA結果相對於攝護腺活組織檢查確定的風險等級繪製的圖。虛線為PSA臨界值，在其之下沒有觀察到患有高惡性度癌症的患者。ROC曲線顯示了對隨後被診斷為高風險PCa的男性與其他接受活組織檢查具有低風險癌症或無癌症(AUC=84%)的男性之間的PSA濃度的區別。PSA濃度的測量在血清中進行。

Claims (25)

1. 一種白介素-8(Interleukin-8)在血液、血清或血漿樣本中作為生物標記以診斷及/或監測攝護腺癌之用途，其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8係攝護腺癌存在及/或進展的指標。
2. 如請求項1所述之用途，其還包含白介素-6 (Interleukin-6) 作為生物標記，其中，與一對照組相比，較高濃度的白介素-6係攝護腺癌存在及/或進展的指標。
3. 如請求項2所述之用途，用於診斷及/或監測攝護腺癌，還包含一或多種生物標記，該一或多種生物標記係選自由攝護腺特異性抗原(PSA)及核小體或其組分所組成之清單。
4. 如請求項3所述之用途，其中，核小體之組分係核小體之一表觀遺傳特徵。
5. 如請求項4所述之用途，其中，核小體之該表觀遺傳特徵係組織蛋白H3.1。
6. 如請求項1至5中任一項所述之用途，用於診斷攝護腺癌的分級。
7. 如請求項6所述之用途，其中，攝護腺癌的分級為高惡性度攝護腺癌。
8. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其用於疑似攝護腺癌患者之風險分級。
9. 一種診斷攝護腺癌患者之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的白介素-8及/或白介素-6量，可選地結合至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由攝護腺特異性抗原(PSA)及核小體或其組分所組成之清單， 其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8及/或較高濃度的白介素-6係攝護腺癌存在的指標。
10. 一種評估患者是否適合攝護腺活組織檢查之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的白介素-8及/或白介素-6濃度，可選地結合至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由攝護腺特異性抗原(PSA)及核小體或其組分所組成之清單；以及 其中，與一對照組相比，較低濃度的白介素-8及/或較高濃度的白介素-6係該患者需要攝護腺活組織檢查的指標。
11. 如請求項9或請求項10所述之方法，其中，還包含確定該患者之至少一臨床參數。
12. 如請求項11所述之方法，其中，該臨床參數係選自年齡、性別以及身體質量指數(BMI)。
13. 如請求項9至12中任一項所述之方法，其中，該測量步驟包含使用表1或表2中所列之演算法。
14. 如請求項9至13中任一項所述之方法，其中，測量白介素-6和白介素-8，且其中組合測量係採取白介素-6和白介素-8濃度的比例或差值形式。
15. 如請求項9至14中任一項所述之方法，其中測量PSA、白介素-6和白介素-8。
16. 如請求項9至15中任一項所述之方法，其中測量PSA、白介素-6、白介素-8和核小體或其組分。
17. 一種治療攝護腺癌的方法，包含： (i)從一主體獲得血液、血清或血漿樣本； (ii)測量樣本中白介素-8濃度； (iii)根據與一對照組相比具有較低濃度的白介素-8，鑑定該主體為患有攝護腺癌；以及 (iv)對該主體施行治療。
18. 如請求項17所述之方法，其中，測量白介素-8濃度作為包含PSA及/或白介素-6及/或核小體或其組分之測量的套組的其中之一。
19. 如請求項17或請求項18所述之方法，其中，所施行之治療係選自：攝護腺活組織檢查、手術、放射療法、激素療法以及化學療法。
20. 如請求項17至19中任一項所述之方法，其中，該攝護腺癌為高惡性度攝護腺癌。
21. 一種包含檢測白介素-8、白介素-6以及選自由PSA及核小體或其組分所組成之清單之一或多種生物標記之試劑之套組。
22. 如請求項21所述之套組，其包含檢測白介素-8、白介素-6、核小體或其組分以及PSA之試劑。
23. 如請求項21或請求項22所述之套組，其用於檢測攝護腺癌。
24. 一種診斷患者攝護腺癌之方法，包含： 檢測或測量來自該患者血液、血清或血漿樣本的PSA濃度，結合其他至少一種生物標記，該至少一種生物標記係選自由白介素-6、白介素-8及核小體或其組分所組成之清單。
25. 如請求項24所述之方法，其中相對於其他生物標記濃度而有理化PSA濃度。

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