TW202106325A - 重瓣玫瑰萃取物用於製備抑止肌膚老化的組合物之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種重瓣玫瑰萃取物用於製備抑止肌膚老化的組合物之用途，其中該組合物用於抑制藍光所致的黑色素生成、抑制皮膚細胞因藍光所致的活性氧物質生成、提升皮膚細胞抗氧化能力以及提升粒線體活性。
Description
本案係關於重瓣玫瑰萃取物的應用，特別是關於一種重瓣玫瑰萃取物用於製備抑止肌膚老化的組合物的用途。
皮膚對於人類個體提供對抗陽光中紫外線（ultraviolet，UV）輻射、病原體、摩擦力等環境因子的第一階段保護。皮膚由外向內依序包含表皮層、主要由結締組織所構成的真皮層、及皮下組織。
肌膚會隨年齡增長而正常老化，產生各種受損的肌膚狀態。例如肌膚彈力下降、保水度不足（肌膚較為乾燥、無光澤）、毛孔粗大、皺紋、肌膚產生斑點及/或整體較為暗沈、蠟黃等老化態樣。
然而，在某些環境因素下，則會加速肌膚老化的進程。舉例而言，一般常見的自然因素例如陽光中的紫外線。當暴露於紫外線中，紫外線將會導致前述的各項肌膚老化態樣加速生成。
此外，由於在現代生活中，人們使用帶有螢幕的電子產品的時間大幅增加，螢幕所發出的具有較短波長、較高能量的可見光（後稱藍光）在長時間照射肌膚的情況下，也會導致前述的各項肌膚老化態樣加速生成。因此，對於肌膚老化，藍光亦成為不可被忽視的一項因素。
有鑑於此，本發明提供一種重瓣玫瑰萃取物的用途，其是用於製備抗肌膚老化的組合物。其中，重瓣玫瑰萃取物可減緩肌膚因紫外線或藍光所造成的損害，以提供肌膚對於紫外線或藍光保護，進而減緩皮膚老化，據以維持或改善肌膚外觀。
在一些實施例中，一種重瓣玫瑰萃取物的用途，其是用於製備抑制藍光所致的黑色素生成的組合物。
在一些實施例中，一種重瓣玫瑰萃取物的用途，其是用於製備抑制皮膚細胞因藍光所致的活性氧物質（reactive oxygen species，ROS）的生成的組合物。
在一些實施例中，一種重瓣玫瑰萃取物的用途，其是用於製備提升皮膚細胞抗氧化能力的組合物。
在一些實施例中，一種重瓣玫瑰萃取物的用途，其是用於製備提升粒線體活性的組合物。
在一些實施例中，前述的組合物係醫藥組合物。
在一些實施例中，前述的組合物係食品組合物或保養品組合物。
在一些實施例中，前述的組合物為內服組合物或外用組合物。
由於本案證實重瓣玫瑰萃取物可抑制自由基產生、抑制黑色素生成，故重瓣玫瑰萃取物可有效防止由紫外線或藍光所產生的多種肌膚老化現象，提供肌膚對於紫外線以及藍光的防護。
此外，本案另亦證實重瓣玫瑰萃取物可提升粒線體的活性。據此，重瓣玫瑰萃取物不僅可被動地減少皮膚受自由基影響的耗損，亦可主動地提升粒線體的活性，使肌膚狀態更為健康。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
關於本文中所使用之濃度符號「wt %」通常是指重量百分濃度，而濃度符號「vol %」通常是指體積百分濃度。
圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t
檢驗（student’st
-test）進行分析。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。
在一些實施例中，由重瓣玫瑰（Rosa rugosa
）的花苞所獲得的重瓣玫瑰萃取物可具有下列至少一種能力：抑制自由基生成、抑制黑色素生成以及提升粒線體活性。因此，重瓣玫瑰萃取物可用於製備具有下列至少一種能力的組合物：抑制自由基生成、抑制黑色素生成以及提升粒線體活性。
在一些實施例中，重瓣玫瑰萃取物可有效防止由紫外線或藍光所產生的肌膚老化現象，以提供肌膚對於紫外線以及藍光的防護，進而減緩紫外線或藍光所致的皮膚老化，據以維持或改善肌膚外觀。
在一些實施例中，重瓣玫瑰萃取物是藉由下列至少一種作用來有效防止由紫外線或藍光所產生的肌膚老化現象：抑制藍光所致的黑色素生成、抑制皮膚細胞因藍光所致的活性氧物質的生成、提升皮膚細胞抗氧化能力以及提升粒線體活性。
於此，紫外線或藍光皆會促使肌膚細胞產生活性氧物質。又因活性氧物質具有高度活性，其將會與肌膚中的膠原蛋白分子產生反應，進而裂解膠原蛋白。由於膠原蛋白有如肌膚中的「支架」，係用以賦予肌膚支撐性以及彈性，當肌膚在缺乏膠原蛋白的情況下，將會加速肌膚老化，使肌膚產生彈力下降、保水度不足（肌膚較為乾燥、無光澤）、毛孔粗大、以及皺紋等老化現象。另一方面，紫外線或藍光亦會誘發肌膚中的黑色素細胞產生黑色素，使得肌膚產生斑點及/或整體較為暗沈或蠟黃等老化現象。
換言之，重瓣玫瑰萃取物可有效防止下列至少一種肌膚老化現象：抑制肌膚彈力下降、防止保水度不足（肌膚較為乾燥、無光澤）、抑制毛孔粗大、抑制皺紋產生、抑制肌膚產生斑點以及防止肌膚暗沈或蠟黃。
在一些實施例中，重瓣玫瑰是指花瓣數目在17片以上的玫瑰，特別是具有17-25片花瓣的玫瑰。在一些實施例中，重瓣玫瑰可為紫花重瓣玫瑰（Rosa rugosa cv.plena
）及/或白花重瓣玫瑰（Rosa rugosa cv. albo-plena
）。
在一些實施例中，前述的組合物可為醫藥組合物、保養品組合物或食品組合物。
其中，前述的醫藥組合物包含有效含量的重瓣玫瑰萃取物。
在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列一種或多種載劑：乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些載劑的選用與數量是熟習此項技術人員可視情況進行選擇的。
在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可進一步包含下列任一種溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）以及其他任何合適的溶劑。
在一些實施例中，醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道地（enterally）、非經腸道地（parenterally）、口服地、或局部地（topically）投藥的劑型。醫藥組合物的劑型例如可為：注射品（injection）[例如，無菌的水性溶液（sterile aqueous solution）或分散液（dispersion）]、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或其他類似物。
在一些實施例中，醫藥組合物可由下列所述的任一種非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑（external preparation）。舉例而言，外部製劑可為下列所述的任一種，但不限於此：乳劑（emulsion）、凝膠（gel）、軟膏（ointment）、乳霜（cream）、貼片（patch）、擦劑（liniment）、粉末（powder）、氣溶膠（aerosol）、噴霧（spray）、乳液（lotion）、乳漿（serum）、糊劑（paste）、泡沫（foam）、滴劑（drop）、懸浮液（suspension）、油膏（salve）以及繃帶（bandage）。
在一些實施例中，外部製劑是藉由將有效含量的重瓣玫瑰萃取物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底（base）相混合而製成。
在一些實施例中，基底可包含下列一種或多種的添加劑（additives）：水、醇（alcohols）、甘醇（glycol）、碳氫化合物（hydrocarbons）[諸如石油膠（petroleum, jelly）以及白凡士林（white petrolatum,）]、蠟（wax）[諸如石蠟（paraffin）以及黃蠟（yellow wax）]、保存劑（preserving agents）、抗氧化劑（antioxidants）、界面活性劑（surfactants）、吸收增強劑（absorption enhancers）、安定劑（stabilizing agents）、膠凝劑（gelling agents）[諸如卡波普®974P （carbopol®974P）、微結晶纖維素（microcrystalline cellulose）以及羧基甲基纖維素（carboxymethylcellulose）]、活性劑（active agents）、保濕劑（humectants）、氣味吸收劑（odor absorbers）、香料（fragrances）、pH調整劑（pH adjusting agents）、螯合劑（chelating agents）、乳化劑（emulsifiers）、閉塞劑（occlusive agents）、軟化劑（emollients）、增稠劑（thickeners）、助溶劑（solubilizing agents）、滲透增強劑（penetration enhancers）、抗刺激劑（anti-irritants）、著色劑（colorants）以及推進劑（propellants）等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
其中，前述的保養品組合物包含有效含量的重瓣玫瑰萃取物。
在一些實施例中，保養品組合物可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑（acceptable adjuvant）。例如，可接受的佐劑可包含下列一種或多種佐劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑（screening agent）、螯合劑、界面活性劑、染色試劑（coloring agent）、增稠劑（thickening agent）、填料（filler）、香料以及氣味吸收劑。可根據實際需求對這些試劑的選用與數量進行合適的調整。
在一些實施例中，保養品組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚（skincare）或化妝（makeup）的型態。其中，適合於護膚或化妝的型態可為下列中的任一種，但不限於此：水性溶液（aqueous solution）、水-醇溶液（aqueous-alcohol solution）、油性溶液（oily solution）、呈水包油型（oil-in-water type）、油包水型（water-in-oil type）或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜（mask）、貼片、貼布（pack）、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯（mousse）、防曬油（sunblock）、化妝水（tonic water）、粉底（foundation）、卸妝產品（makeup remover products）、肥皂（soap）以及其他身體清潔產品（body cleansing products）等。
在一些實施例中，保養品組合物亦可進一步包含有下列中之已知活性的外用劑（external use agents）中的一種或多種：美白劑（whitening agents）[諸如維生素A酸（tretinoin）、兒茶素（catechin）、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、殺菌劑（bactericides）、紫外線吸收劑（ultraviolet absorbers）、植物萃取物（plant extracts）[諸如蘆薈萃取物（aloe extract）]、皮膚營養劑（skin nutrients）、麻醉劑（anesthetics）、抗痘劑（anti-acne agents）、止癢劑（antipruritics）、止痛劑（analgesics）、抗皮膚炎劑（antidermatitis agents）、抗過角化劑（antihyperkeratolytic agents）、抗乾皮膚劑（anti-dry skin agents）、抗汗劑（antipsoriatic agents）、抗老化劑（antiaging agents）、抗皺劑（antiwrinkle agents）、抗皮脂溢出劑（antiseborrheic agents）、傷口治療劑（wound-healing agents）、皮質類固醇（corticosteroids）以及激素（hormones）。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
其中，前述的食品組合物包含有效含量的重瓣玫瑰萃取物。
在一些實施例中，食品組合物可以口服方式施予個體。其中，食品組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。個體可為人。
在一些實施例中，食品組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。
在一些實施例中，食品添加物可藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）或膳食補充品（dietary supplements）。
在一些實施例中，「重瓣玫瑰萃取物」亦可為使用合適的萃取溶劑於特定萃取溫度下以適當萃取時間萃取重瓣玫瑰的花苞而得到的萃取液。舉例而言，可將重瓣玫瑰的花苞於特定萃取溫度下浸泡於水（即萃取溶劑）中適當浸泡時間（即萃取時間），於浸泡後冷卻至25 ℃-30 ℃，以得到重瓣玫瑰瓣萃取物。
在一些實施例中，萃取溶劑與重瓣玫瑰的花苞的重量比亦可為1:5-1:15。特定萃取溫度可為50-80 ℃。適當萃取時間可為1-3小時。其中，若萃取溶劑過少或萃取時間過短，則萃取效率將會明顯下降；若萃取時間過長，則萃取物中的有效成分可能會產生降解。
在一些實施例中，重瓣玫瑰的花苞可為完整花苞，或為經物理前處理而分離成碎片、顆粒或粉末等型態之花苞。其中，物理前處理可包括下列至少一種：切碎、剪碎、搗碎及研磨。
在一些實施例中，於重瓣玫瑰的花苞於水中浸泡適當浸泡時間，以形成含固體的第一萃取液。第一萃取液再經過濾以去除固態雜質，並於過濾後得到重瓣玫瑰萃取物。換言之，可視實際需求，重瓣玫瑰萃取物可為過濾前的第一萃取液，或為過濾後的濾液。
在一些實施例中，過濾後的濾液可再進行減壓濃縮，並於減壓濃縮後得到重瓣玫瑰萃取物。可視實際需求，重瓣玫瑰萃取物可為減壓濃縮前的濾液，或為減壓濃縮後的濃縮液。在一些實施例中，過濾後的濾液可於45 ℃-70 ℃下進行減壓濃縮。
下列範例中的實驗步驟若無特別敘明，即在室溫（25 ℃-30 ℃）、常壓（1 atm）下進行。
[例1]製備重瓣玫瑰萃取物
材料與儀器
1. 重瓣玫瑰花（產地：伊朗）
2. 離心機（廠牌/型號：Thermo Scientific Heraeus Fresco 17）
3. 濃縮機（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100）
實驗步驟
1. 將水與重瓣玫瑰花的花苞以1:10的重量比混合，並於65±5 ℃下浸泡約2小時，以形成含有固體的第一萃取液。
2. 冷卻第一萃取液至室溫。
3. 將冷卻後的第一萃取液經離心機離心約10分鐘，並於離心後取其上清液（以下稱第一萃取上清液）。
4. 將第一萃取上清液以400目數的濾網進行過濾，以去除細微固體。
5. 過濾後的第一萃取上清液以濃縮機在60 ℃±5 ℃下進行減壓濃縮，直至濃縮液的白利糖度值（Degrees Brix）為10±0.5時停止濃縮，以得到重瓣玫瑰萃取物。換言之，重瓣玫瑰萃取物的白利糖度值為10±0.5。
[例2]效性定量實驗-多酚含量測定
材料與儀器
1. 沒食子酸（gallic acid，購自Sigma，產品型號G7384）。
2. 佛蕭酚試劑（Folin-Ciocalteu’s phenol reagent，購自Merck，產品型號1.09001）。
3. 碳酸鈉（sodium carbonate，購自Sigma，產品型號31432）。
4. 酵素免疫分析儀（BioTek Epoch）
首先，製備標準溶液及繪製標準曲線。將10 mg的沒食子酸溶於水中並於量瓶中以水定量至10 mL，以得到沒食子酸的儲備溶液（stock solution）。於此，沒食子酸的儲備溶液可儲存於-20 ℃備用。之後，將儲備溶液稀釋10倍至100 μg/mL的濃度，以得到沒食子酸的初始溶液（即含1000 ppm的沒食子酸）。未使用完之沒食子酸的初始溶液可儲存於-20 ℃。接著，依據下表一於玻璃試管中分別配製0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL及100 μg/mL的沒食子酸標準溶液。
表一
| 濃度 （μg/mL） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 初始溶液（μL） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 水（μL） | 100 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
之後，分別取100 μL之各濃度的標準溶液至玻璃試管中，於各玻璃試管中添加500 μL的佛蕭酚試劑，將二者混合均勻並靜置3分鐘。接而再於各玻璃試管中添加400 μL的7.5%碳酸鈉、將各玻璃試管中的溶液混合均勻並反應30分鐘，以得到標準反應溶液。接著，標準反應溶液經由渦旋（vortex）確保無氣泡後，取200 μL的標準反應溶液，以於750 nm下測量吸光值，並繪製標準曲線。
另外，將例1得到之重瓣玫瑰萃取物以水予以稀釋10倍，以得到稀釋溶液。取100 μL的稀釋溶液至玻璃試管中。之後，添加500 μL的佛蕭酚試劑至玻璃試管中，以與稀釋溶液混合均勻並靜置3分鐘。接而再於玻璃試管中添加400 μL的7.5%碳酸鈉、將玻璃試管中的溶液混合均勻並反應30分鐘~1小時，以得到待測反應溶液。接著，待測反應溶液經由渦旋確保無氣泡後，取200 μL的待測反應溶液以酵素免疫分析儀於750 nm下測量吸光值。
然後，利用標準曲線以內差法將待測反應溶液的吸光值換算成濃度後再回乘稀釋倍數以取得重瓣玫瑰萃取物的總多酚含量。
於此，可得到重瓣玫瑰萃取物之總多酚含量3500 ppm（萃取物以1:10稀釋後，最終結果為3500 ppm）。
[例3]細胞實驗-皮膚細胞粒線體活性實驗
為探討重瓣玫瑰萃取物對皮膚細胞粒線體功能的影響，本實施例以流式細胞儀評估人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966sk經重瓣玫瑰萃取物處理後，其粒線體活性的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（生物資源保存及研究中心（BCRC），No. 60153），以下簡稱CCD-966sk細胞。
2. 細胞培養基：含有10 vol% FBS（fetal bovine serum，購自Gibco，產品編號10437-028）之基礎培養基。Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，產品編號11360-070）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma，產品編號31432-500G）及0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，產品編號11140-050）所配製而成。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. 粒線體膜電位偵測套組（BDTM
MitoScreen （JC-1） kit，型號551302）。其中，粒線體膜電位偵測套組具有JC-1染料（凍乾）及10X分析緩衝液。於使用前，以1X PBS將10X分析緩衝液稀釋10倍，以形成1X分析緩衝液。加入130 μL二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO；購自Sigma，產品編號：D4540）至JC-1染劑（凍乾）中，以形成JC-1儲備溶液。然後，再以1X分析緩衝液稀釋JC-1儲備溶液，以形成JC-1工作試劑（JC-1 working solution；即JC-1粒線體特異性染劑）。稀釋倍率為JC-1儲備溶液比1X分析緩衝液為1:100。
5. 胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco；產品編號15400-054）以1X PBS溶液稀釋10倍。
6. 流式細胞儀（Flow cytometry）：購自BD Pharmingen公司，型號BDTM Accuri C6 Plus。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組以及控制組（未添加重瓣玫瑰萃取物的組別）二組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將CCD-966sk細胞以每孔1×105
個的方式，接種於每孔含2 mL細胞培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤的各孔中的培養基更換成2 mL實驗培養基。其中，實驗組的實驗培養基取例1得到的重瓣玫瑰萃取物10 μL，加入2 ml的培養基，即可得到含有5 μL/mL的例1得到的重瓣玫瑰萃取物之細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含重瓣玫瑰萃取物）。
3. 將培養盤置於5%CO2
、37 ℃下，培養24小時。
4. 移除培養盤中的實驗培養基並以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次。
5. 將200 μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6 mL細胞培養基終止反應。將各孔中之細胞與細胞培養基收集至個別對應的15 mL離心試管內，並將含有細胞與細胞培養基之離心試管以400 xg離心10分鐘。
6. 於離心後移除上清液，再以1 mL的1X PBS溶液重新回溶或轉移細胞沉澱物至1.5 mL試管以形成細胞懸浮液。
7. 將含有細胞懸浮液的試管以400 xg離心5分鐘。
8. 於離心後移除各試管中的上清液並加入100 μL的JC-1工作試劑至各試管。
9. 將各試管中的細胞沉澱物與JC-1工作試劑渦旋均勻並在避光處理下培養15分鐘。
10. 15分鐘後，將各試管以400 xg離心5分鐘。
11. 於離心後，移除各試管中的上清液、以1 mL的1X PBS溶液回溶各試管中的細胞沉澱物並以400 xg離心5分鐘。
12. 於離心後，移除各試管中的上清液、以1 mL的1X PBS溶液回溶各試管中的細胞沉澱物並以400 xg離心5分鐘。
13. 於離心後，移除各試管中的上清液、以500 μL之含有2%FBS的1X PBS重新懸浮細胞，以得到待測細胞液。
14. 以流式細胞儀量測各孔的待檢測細液中細胞粒線體的膜電位，以進行粒線體活性分析。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之結果平均以得平均值，然後以控制組的平均值為100%之相對JC-1聚集量，將實驗組的平均值換算為相對JC-1聚集量，如圖1所示。
由圖1之結果可知，以控制組作為100%的參照基準，實驗組有經過重瓣玫瑰萃取物處理後，其相對JC-1聚集量約為155%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的人類皮膚纖維母細胞的粒線體活性有顯著提升（約1.5倍）。顯示重瓣玫瑰萃取物可提升皮膚細胞之粒線體活性，而達到提升皮膚細胞活性之效果。
[例4]細胞實驗-重瓣玫瑰萃取物抑制ROS生成（藍光照射）
於此，以螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀，測定CCD-966sk細胞經重瓣玫瑰萃取物處理並照射藍光後，其活性氧物質含量的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（BCRC，No. 60153）。
2. 細胞培養基：含有1：1比例之DMEM培養液（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，購自Gibco，產品編號12100-046）與漢氏F12培養液（Ham’s F12 Nutrient Mixture，購自Gibco，產品編號12500-026），其中加入0.5 mM之丙酮酸鈉（購自Gibco，產品編號11360-070）以及15 mM之4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES）以及10 vol% FBS（購自Gibco，產品編號10437-028）。
4. DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯（2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883-50MG，購自Sigma）溶於DMSO以配製成5 mg/mL 的DCFH-DA溶液。
5. 流式細胞儀：購自Beckman，產品型號660519。
6. 藍光箱（波長400 nm-500 nm）。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、控制組（未添加重瓣玫瑰萃取物，亦無經過藍光照射的組別）、以及對照組（未添加重瓣玫瑰萃取物，但經藍光照射的組別）三組進行，各組分別進行二重複試驗：
1. 將CCD-966sk細胞以每孔2×105
個的方式，接種於每孔含2 mL培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5%CO2
、37 ℃下，培養24小時。
3. 移除培養盤的各孔中的細胞培養基。
4. 加入2mL實驗培養基至培養盤的各孔中，並於37 ℃下培養1小時。
實驗組的實驗培養基取例1得到的重瓣玫瑰萃取物10 μL，加入2 ml的培養基，即可得到含有5 μL/mL的例1得到的重瓣玫瑰萃取物之細胞培養基。
控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含重瓣玫瑰萃取物）。
對照組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含重瓣玫瑰萃取物）。
5. 添加含有5 mg/mL的DCFH-DA溶液之2 μL細胞培養基於每孔中，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。
6. 於DCFH-DA處理後，各組以下述條件培養15分鐘。
實驗組：將DCFH-DA處理後的6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫下接受藍光照射15分鐘。
控制組：將DCFH-DA處理後的6孔培養盤置於暗處，於室溫下靜置15分鐘。
對照組：將DCFH-DA處理後的6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫下接受藍光照射15分鐘。
7. 15分鐘後，每孔以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次。
8. 將200 μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6 mL細胞培養基終止反應。
9. 將各孔中之細胞與細胞培養基個別收集至對應的1.5 mL離心試管內，並將含有細胞與細胞培養基之離心試管以400 xg離心10分鐘。
10. 離心後，移除上清液，並以1X PBS溶液回溶細胞沉澱物為細胞懸浮液。
11. 再將細胞懸浮液以400 xg離心10分鐘。
12. 離心後，移除上清液，以1 mL的1X PBS溶液於暗處再次懸浮細胞，以得到待測細胞液。
13. 使用流式細胞儀偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490 nm，放射波長為510-550 nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH（二氯二氫螢光素），再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF（二氯螢光素），經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以得平均值，然後以控制組的平均值為100%之相對ROS的生成量，將對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖2所示。
實驗結果
如圖2所示，由比較控制組以及對照組可知，在經過藍光照射後，具有較高的相對ROS的生成（高螢光表現），即相對控制組，對照組的ROS的生成大幅增加（約5.4倍）；其顯示藍光照射確實會導致細胞內產生活性氧物質，進而對皮膚纖維母細胞產生後續傷害。另一方面，由比較對照組以及實驗組可知，當細胞經過重瓣玫瑰萃取物處理後，相對ROS的生成量相較於對照組明顯減少約21%；其顯示重瓣玫瑰萃取物可有效減少活性氧物質在細胞內的產生或累積。換言之，重瓣玫瑰萃取物可作為一種活性氧物質清除劑。亦即，重瓣玫瑰萃取物可透過降低細胞內活性氧物質含量，減少細胞受到藍光、紫外線等所導致的氧化傷害。
[例5]細胞實驗-重瓣玫瑰萃取物降低黑色素生成
於此，以ELISA讀盤機（enzyme-linked immunosorbent assay reader）測定黑色素瘤細胞B16F10經重瓣玫瑰萃取物處理並經藍光照射後，其黑色素含量的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞B16F10（ATCC CRL-6475），購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC），以下簡稱B16F10細胞。
2. 細胞培養基： DMEM培養液（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，購自Gibco，產品編號12100-046），其中加入1 vol%之青黴素-鏈黴素二合一抗生素（Penicillin-streptomycin，購自Gibco，產品編號15140122）以及10 vol% FBS（購自Gibco，產品編號10437-028）。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. 以二次蒸餾水配製1N NaOH溶液，其中，NaOH購自Sigma，產品編號221465。
5. 酵素免疫分析儀：購自BioTek，產品型號FLx 800。
6. 藍光箱：波長400 nm-500 nm。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、控制組（未添加重瓣玫瑰萃取物、亦無經過藍光照射的組別）、以及對照組（未添加重瓣玫瑰萃取物，但經藍光照射的組別）三組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將B16F10細胞以每孔1.5×105
個的方式，接種於每孔含3 mL細胞培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5%CO2
、37 ℃環境下，培養24小時。
3. 而後，在不干擾附著細胞的情況下，移除每孔之細胞培養基。
4. 加入3 mL實驗培養基至培養盤的各孔中，並於37 ℃下培養1小時。
實驗組的實驗培養基取例1得到的重瓣玫瑰萃取物10 μL，加入2 ml的培養基，即可得到含有5 μL/mL的例1得到的重瓣玫瑰萃取物之細胞培養基。
控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含重瓣玫瑰萃取物）。
對照組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含重瓣玫瑰萃取物）。
5. 於1小時培養後，各組以下述條件培養3小時。
實驗組：將6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫下接受藍光照射3小時。
控制組：將6孔培養盤移至暗室中，使其在室溫下靜置3小時。
對照組：將6孔培養盤移至藍光箱中，使其在室溫下接受藍光照射3小時。
6. 於3小時培養後，將各組培養盤於37 ℃下培養48小時。
7. 而後，移除培養基，並以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次。
8. 添加200 μL的胰蛋白酶至培養盤的各孔中並在室溫下反應3分鐘，使細胞由培養盤上脫落，並以細胞培養液將各孔的細胞收集至個別對應的1.5 mL離心試管。然後，將各離心試管以400 xg離心5分鐘，並於離心後移除上清液。
9. 以1X PBS溶液回溶細胞沉澱物後，以400 xg再次離心10分鐘。於再次離心後，移除上清液，再以200μL 1X PBS溶液重新懸浮細胞，以得細胞懸浮液。
10. 將各離心試管的細胞懸浮液以液態氮冷凍10分鐘，再置於室溫約30分鐘至完全解凍。
11. 完全解凍後，將各離心試管以12,000 xg離心30分鐘。
12. 於離心後移除上清液，再以120μL 1 N氫氧化鈉溶液重新懸浮細胞沉澱物後，使各離心試管於60 ℃乾浴1小時，以獲得待檢測樣本。
13. 將100 μL待檢測樣本移入96孔盤，使用ELISA讀盤機測量細胞溶液在450 nm的光密度（optical density）值（下稱OD450
值）。因實驗係進行三重複，故將各組三重複實驗之量測值平均以得到各組的OD450
值。
實驗結果
實驗組、控制組、以及對照組的相對黑色素表現量係依下列公式計算：相對黑色素表現量（%）=（各組OD450
值/控制組OD450
值）×100%，如圖3所示。
如圖3所示，由比較控制組以及對照組的結果可知，在經過藍光照射後，細胞中的相對黑色素表現量將明顯增加（約1.8倍）；其顯示藍光照射確實會促使黑色素瘤細胞產生黑色素，而這將使得肌膚產生斑點、或使肌膚整體較為暗沈。而另一方面，比較對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過重瓣玫瑰萃取物處理後，其在藍光下的相對黑色素表現量是低於未經過重瓣玫瑰萃取物處理的細胞（降低約72%）；其顯示重瓣玫瑰萃取物可有效減少黑色素細胞因藍光所生成之黑色素。
[例6]細胞實驗-重瓣玫瑰萃取物抑制ROS生成（雙氧水處理）
於此，以螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀，測定CCD-966sk細胞經重瓣玫瑰萃取物處理及雙氧水反應後，其活性氧物質含量的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（BCRC No. 60153）。
2. 細胞培養基：含有10 vol% FBS（購自Gibco，產品編號10437-028）之基礎培養基。Eagle’s最低限度基本培養基（購自Gibco，產品編號15188-319）。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，產品編號11360-070）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma，產品編號31432-500G）及、0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，產品編號11140-050）所配製而成。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯（產品編號SI-D6883-50MG，購自Sigma）溶於二甲基亞碸以配製成5 mg/mL 的DCFH-DA溶液。
5. 雙氧水（H2
O2
）：購自Sigma。
6. 流式細胞儀：購自Beckman，產品型號660519。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組、控制組（未添加重瓣玫瑰萃取物，亦無經過雙氧水處理的組別）、以及對照組（未添加重瓣玫瑰萃取物，但經雙氧水處理的組別）三組進行，各組分別進行二重複試驗：
1. 將CCD-966sk細胞以每孔2×105
個的方式，接種於每孔含2 mL細胞培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5%CO2
、37 ℃下，培養24小時。
3. 移除細胞培養基。
4. 加入2 mL實驗培養基至培養盤的各孔中，並於37 ℃下培養1小時。
實驗組的實驗培養基取例1得到的重瓣玫瑰萃取物10 μL，加入2 ml的培養基，即可得到添加有5 μL/mL的例1得到的重瓣玫瑰萃取物之2 mL細胞培養基。
控制組的實驗培養基為單純的2 mL細胞培養基（即不含重瓣玫瑰萃取物）。
對照組的實驗培養基為單純的2 mL細胞培養基（即不含重瓣玫瑰萃取物）。
5. 添加濃度為5 mg/mL的DCFH-DA溶液2 μL至於每孔中的細胞培養基，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。
6. 於DCFH-DA處理後，於實驗組的實驗培養基以及對照組的實驗培養基分別加入H2
O2
，並於37 ℃下反應1小時。具體來說，35% wt的雙氧水先稀釋成100 mM（將10 μL的雙氧水加入990 μL的二次蒸餾水），再取20 μL的100 mM的雙氧水加入 2 mL的細胞培養盤中。
7. 反應後，每孔以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次。
8. 將200 μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6 mL細胞培養基終止反應。
9. 將各孔中之細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5 mL離心試管內，並將含有細胞與培養基之離心試管以400 xg離心10分鐘。
10. 離心後，移除上清液，並以1X PBS溶液回溶細胞沉澱物。
11. 再以400 xg離心10分鐘。
12. 離心後，移除上清液，於暗處以1 mL的1X PBS溶液再次懸浮細胞，以得到待測細胞液。
13. 使用流式細胞儀偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490 nm，放射波長為510-550 nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH，再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF，經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以得平均值，然後以控制組的平均值為100%之相對ROS的生成量，將對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖4所示。
實驗結果
如圖4所示，由比較控制組、對照組的結果可知，在經過雙氧水處理後，相對ROS的生成量（高螢光表現）會大幅增加；其顯示雙氧水處理確實會導致細胞內產生活性氧物質，進而對皮膚纖維母細胞產生後續傷害。另一方面，比較對照組以及實驗組的結果可知，當細胞經過重瓣玫瑰萃取物處理後，相對ROS的生成量明顯減少約97%，甚至低於控制組；其顯示重瓣玫瑰萃取物可有效減少活性氧物質在細胞內的產生或累積。換言之，重瓣玫瑰萃取物可作為一種活性氧物質清除劑。亦即，重瓣玫瑰萃取物可透過降低細胞內活性氧物質含量，減少細胞受到活性氧物質所導致的氧化傷害。
綜合前述，本案證實重瓣玫瑰萃取物可抑制自由基產生及/或抑制黑色素生成，故重瓣玫瑰萃取物可有效防止由紫外線或藍光所產生的多種肌膚老化現象，進而提供肌膚對於紫外線或藍光的防護。此外，本案另亦證實重瓣玫瑰萃取物可提升粒線體的活性。據此，重瓣玫瑰萃取物不僅可被動地減少皮膚受自由基影響的耗損，亦可主動地提升粒線體的活性，使肌膚狀態更為健康。
無
圖1係控制組與實驗組的相對JC-1聚集量之結果比較圖。
圖2係控制組、對照組及實驗組的相對活性氧物質（ROS）生成量之結果比較圖。
圖3係控制組、對照組及實驗組的黑色素表現量之結果比較圖。
圖4係控制組及實驗組之高ROS表現的細胞比例之結果比較圖。
Claims (8)
- 一種重瓣玫瑰萃取物用於製備抑制藍光所致的黑色素生成的組合物的用途。
- 一種重瓣玫瑰萃取物用於製備抑制皮膚細胞因藍光所致的活性氧物質（ROS）的生成的組合物的用途。
- 一種重瓣玫瑰萃取物用於製備提升皮膚細胞抗氧化能力的組合物的用途。
- 一種重瓣玫瑰萃取物用於製備提升粒線體活性的組合物的用途。
- 如請求項1至請求項4中任一項所述的用途，其中該組合物係醫藥組合物。
- 如請求項1至請求項4中任一項所述的用途，其中該組合物係食品組合物或保養品組合物。
- 如請求項1至請求項4中任一項所述的用途，其中該組合物為內服組合物。
- 如請求項1至請求項4中任一項所述的用途，其中該組合物為外用組合物。
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