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TW202043481A - 治療ｂｉｅｔｔｉ晶體營養不良之組成物及方法 - Google Patents

治療ｂｉｅｔｔｉ晶體營養不良之組成物及方法 Download PDF

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TW202043481A
TW202043481A TW109106055A TW109106055A TW202043481A TW 202043481 A TW202043481 A TW 202043481A TW 109106055 A TW109106055 A TW 109106055A TW 109106055 A TW109106055 A TW 109106055A TW 202043481 A TW202043481 A TW 202043481A
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TW
Taiwan
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seq
sequence
viral vector
nucleotide sequence
cyp4v2
Prior art date
Application number
TW109106055A
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English (en)
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克里斯蒂 Ｌ 貝爾
雅克 克羅
約瑟芬 朱特納
泰瑞 麥吉
波托德 羅斯卡
Original Assignee
瑞士商諾華公司
瑞士弗里德里克米謝爾生物醫學研究所
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Abstract

本文提供了將異源CYP4V2基因遞送至視網膜例如視網膜的RPE細胞之病毒載體，以治療患有Bietti晶體營養不良之受試者。

Description

治療BIETTI晶體營養不良之組成物及方法 相關申請之交叉引用及序列表之併入
本申請根據35 U.S.C.§ 119(e)要求於2019年2月25日提交的美國臨時申請案號62/810,257的權益，該臨時申請藉由引用以其全文結合入本文。隨此提交了包含在名為「PAT058468-WO-PCT SQL_ST25」的文件中之序列表並藉由引用併入本文，該序列表係156,133位元組(在作業系統MS-Windows中測量)並且於2020年2月22日創建。
Bietti晶體營養不良(BCD)係一種常染色體隱性遺傳障礙，其中許多小的、黃色或白色晶體狀脂質沈積物積聚在視網膜中，繼而引起脈絡膜視網膜萎縮和進行性視力喪失。患有BCD之受試者通常會在十幾歲或二十多歲時開始注意到視力問題。除了視力下降外，他們還經常經歷夜盲症。他們通常還會失去視力區域，最常見的是周圍視力。色覺也可能受損。
每隻眼的視力問題可能以不同的速率惡化，並且受影響的對象之間，甚至在同一家庭中，症狀的嚴重程度和進展也存在很大差異。然而，大多數患有BCD之受試者在40或50歲時成為法律上的盲人。大多數受影響之受試 者通常在視野的中央保持一定程度的視力，儘管通常視物模糊並且無法藉由處方鏡片矯正。
BCD係由CYP4V2基因突變引起的。該基因位於人類4號染色體的長臂上，編碼細胞色素P450家族4亞家族V成員2。作為細胞色素P450酶家族之成員，ω-羥化酶參與脂質代謝，特別是多不飽和脂肪酸例如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的氧化。在患有BCD之受試者中鑒定出至少80種不同的CYP4V2基因突變(Zhang等人，Mol Vis[分子視覺]24：700-711,2018)。導致BCD的CYP4V2基因突變損害或消除了酶的功能，且被認為會影響脂質分解。然而，尚不清楚它們如何導致BCD的特定體征和症狀。
BCD估計將影響全球約65,000人(Xiao等人，Biochem Biophys Res Comm[生物化學與生物物理研究通訊]409：181-186,2011；和Mataftsi等人，Retina[視網膜]24：416-426,2004)。它在東亞血統的人中更常見，尤其是中國和日本背景的人。目前，尚無適用於BCD之治療方法。
本發明一般關於重組病毒載體和使用重組病毒載體在患有視網膜疾病和失明例如BCD之受試者的視網膜(例如視網膜色素上皮(RPE)細胞)中表現蛋白質之方法。
在一個方面，本發明關於能夠將異源基因遞送至視網膜，例如人視網膜之病毒載體。本發明還關於能夠將異源基因導入視網膜(例如視網膜的RPE細胞)之病毒載體。本發明還關於作為重組腺相關病毒載體之病毒載體(rAAV)。在某些實施方式中，rAAV病毒載體可以選自本領域已知的任何AAV 血清型，包括但不限於AAV1至AAV12。在某些實施方式中，該rAAV載體衣殼係AAV8血清型。在某些其他實施方式中，該rAAV載體衣殼係AAV9血清型。在某些實施方式中，該rAAV載體衣殼係AAV2血清型。在某些實施方式中，該rAAV載體衣殼係AAV5血清型。在某些實施方式中，該rAAV載體係衍生自修飾的野生型AAV衣殼序列的新穎的合成AAV血清型。
在一個方面，提供了病毒載體，其中該病毒載體包含載體基因組，該載體基因組以5’到3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(iv)聚腺苷酸化(聚A)訊息序列；以及
(v)3’ITR。
在一個實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)內含子；
(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(v)聚A訊息序列；以及
(vi)3’ITR。
在一些實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(iv)調節元件；
(v)聚A訊息序列；以及
(vi)3’ITR。
在一個實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)內含子；
(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(v)調節元件；
(vi)聚A訊息序列；以及
(vii)3’ITR。
在一些實施方式中，該載體基因組包含之長度大於或約4.1kb且小於或約4.9kb。在另一個實施方式中，該載體基因組包含之長度小於或約5kb。
在一個實施方式中，該載體基因組包含位於聚A訊息序列和3’ITR之間的填充序列。在一些實施方式中，該填充序列之長度在約1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、或2,500-3,000個核苷酸之間。
在一個實施方式中，該5’ITR包含與SEQ ID NO：1具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
在一個實施方式中，該啟動子係視網膜色素上皮(RPE)-特異性啟動子，例如ProA18啟動子或ProB4啟動子，例如，其中該啟動子包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有大於或約90%同一性之核苷酸序列，並促進CYP4V2優先在RPE細胞中之表現。
因此，本發明提供了一種分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO：2的核酸序列或與SEQ ID NO：2的所述核酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的核酸序列或由其組成。SEQ ID NO：2的分離的核酸導致在人或NHP視網膜細胞例如人或NHP RPE細胞中表現與SEQ ID NO：2的核酸序列可操作地連接的基因。
因此，本發明提供了一種分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO：3的核酸序列或與SEQ ID NO：3的所述核酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的核酸序列或由其組成。SEQ ID NO：3的分離的核酸導致在人或NHP視網膜細胞例如人或NHP RPE細胞中表現與SEQ ID NO：3的核酸序列可操作地連接的基因。
在一些實施方式中，該CYP4V2編碼序列包含與SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、或SEQ ID NO：49具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
在一個實施方式中，該聚A訊息序列包含牛生長激素或猿猴病毒40聚A核苷酸序列，例如，其中聚A訊息序列包含與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
在一些實施方式中，該3’ITR包含與SEQ ID NO：22具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
在一個實施方式中，該內含子包含人類生長激素、猿猴病毒40或人類β戈賓(gobin)內含子序列，例如，其中該內含子包含與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
在一些實施方式中，該調節元件包括乙型肝炎病毒或土撥鼠肝炎病毒序列，例如，其中該調節元件包含與SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
在一個實施方式中，該載體基因組包含科紮克(Kozak)序列，該序列位於緊靠包含CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列的上游，例如，其中該科紮克序列包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53之核苷酸序列。
在一些實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22：
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22：
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；以及
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22。
在一個實施方式中，該載體基因組以在5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；以及
viii)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22。
在一些實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；以及
viii)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22。
在一個實施方式中，該載體基因組以在5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
viii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
在一些實施方式中，該載體包含腺相關病毒(AAV)血清型8、9、2或5衣殼。在一個實施方式中，該AAV8衣殼包含分別與SEQ ID NO：24、25和26具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列。在一些實施方式中，該AAV8衣殼由與SEQ ID NO：23具有大於或約90%同一性之核苷酸 序列編碼。在一個實施方式中，該AAV9衣殼包含分別與SEQ ID NO：28、29和30具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列。在一些實施方式中，該AAV9衣殼由與SEQ ID NO：27具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。在一個實施方式中，該AAV2衣殼包含分別與SEQ ID NO：32、33和34具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列。在一些實施方式中，該AAV2衣殼由與SEQ ID NO：31具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。在一個實施方式中，該AAV5衣殼包含分別與SEQ ID NO：36、37和38具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列。在一些實施方式中，該AAV5衣殼由與SEQ ID NO：35具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。
在另一方面，本揭露提供了包含本文所述之病毒載體之組成物。在一個實施方式中，該組成物進一步包含藥學上可接受的賦形劑。在一些實施方式中，該組成物用於治療患有BCD之受試者，例如，用於改善患有BCD之受試者的視力。
本文還提供了一種在視網膜細胞中表現異源CYP4V2基因之方法，其中該方法包括使視網膜細胞與本文所述之病毒載體接觸。在一些實施方式中，該視網膜細胞係RPE細胞。
在另一方面，提供了一種治療患有Bietti晶體營養不良(BCD)之受試者之方法，其中該方法包括向受試者投與有效量的包含本文該病毒載體之組成物，例如，其中該組成物進一步包含藥學上可接受的賦形劑。
在又另一方面，提供了一種在患有BCD之受試者中改善視力、改善視功能或功能性視力或抑制視功能或功能性視力下降之方法，其中該方法包括向受試者投與有效量的包含本文所述病毒載體之組成物，例如，其中該組成物進一步包含藥學上可接受的賦形劑。
在一個方面，提供了一種包含基因盒的核酸，其中該基因盒以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(iv)聚A訊息序列；以及
(v)3’ITR。
在一個實施方式中，該包含基因盒的核酸係質體。在一些實施方式中，該載體基因盒以5’到3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
定義
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的那些普通技術人員通常理解之相同含義。
術語「衣殼」係指病毒或病毒載體的蛋白質外殼。術語「AAV衣殼」係指腺相關病毒(AAV)的蛋白質外殼，其由總共60個亞基組成；每個亞基都是胺基酸序列，可以是病毒蛋白1(VP1)、VP2或VP3(Muzyczka N和 Berns KI(2001)第69章，Fields Virology[費氏病毒學].Lippincott Williams & Wilkins[威爾金斯出版公司])。
術語「基因盒」係指攜帶並能夠表現一種或多種目的基因或編碼序列的DNA的可操縱片段，例如，在一組或多組限制位點之間，儘管不需要跨界限制位點。藉由使用限制酶切掉片段並將其連接回新的背景，例如，新的質體骨架，可以將基因盒或其一部分從一個DNA序列(通常在質體載體中)轉移到另一個DNA序列中。
術語「異源基因」或「異源核苷酸序列」通常是指病毒中非天然存在的基因或核苷酸序列。可替代地，異源基因或異源核苷酸序列可以指置於非天然環境中的病毒序列(例如，藉由與病毒中不天然相關的啟動子關聯)。
術語「反向末端重複」或「ITR」係指存在於腺相關病毒(AAV)和/或重組腺相關病毒載體(rAAV)中之核苷酸序列段，可以形成T形回文結構，係完成野生型AAV裂解和潛伏生命週期所需的(Muzyczka N和Berns KI(2001)第69章，Fields Virology[費氏病毒學].Lippincott Wiliiams & Wilkins[威爾金斯出版公司])。在rAAV中，該等序列在基因組包裝和第二股合成中發揮功能性作用。
術語「可操作地連接」係指兩個或更多個多核苷酸(例如DNA)區段之間的功能關係。典型地，該術語係指轉錄調節序列與要轉錄序列的功能性關係。例如，如果啟動子或增強子序列在適當的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子序列可操作地連接至編碼序列。通常，與可轉錄序列可操作地連接的啟動子轉錄調節序列與可轉錄序列鄰接，即它們係順式作用的。然而，一些轉錄調控序列如增強子不需要在物理上鄰接或位於極為接近該等轉錄調控序列增強其轉錄的編碼序列的位置。
如本文所用，術語「序列同一性百分比」係指任何給定查詢序列與主題序列之間的同一性程度。主題序列具有之長度通常為查詢序列長度的約百分之80至百分之250，例如，查詢序列長度的百分之82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115、或120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、或250。為了確定兩個核苷酸序列或兩個胺基酸序列的百分比同一性，出於最佳比較目的對序列進行比對(例如，在第一胺基酸和第二胺基酸或第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的一者或二者中引入空位以用於最佳比對，並且出於比較目的，非同源序列可以忽略)。然後比較相應核苷酸位置或胺基酸位置的核苷酸或胺基酸殘基。當第一序列中的位置被與第二序列中的對應位置相同的核苷酸或胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則該等分子在該位置係相同的(如本文所用，核苷酸或胺基酸「同一性」等同於核苷酸或胺基酸「同源性」)。兩個序列之間的百分比同一性係該序列共用的相同位置的數量的函數，考慮了空位數量以及每個空位之長度，需要引入它們以用於兩個序列的最佳比對。
在另一個實施方式中，可以將兩個胺基酸序列的同一性百分比評估為在兩個胺基酸序列中相應位置處的同一胺基酸家族(例如，正電荷、負電荷、極性並且不帶電荷、疏水性)內的胺基酸殘基保守性的函數(例如，在兩個序列中特定位置的丙胺酸殘基代替纈胺酸殘基顯示出高水平的保守性，但在兩個序列中特定位置的精胺酸殘基代替天冬胺酸殘基顯示低水平之保守性)。為了本發明之目的，兩個序列的比較和兩個序列之間同一性百分數的確定可以使用具有空位罰分12、空位延伸罰分4、以及移碼空位罰分5的Blosum 62評分矩陣實現。
術語「啟動子」係指調節可操作地連接的基因或編碼蛋白質之核苷酸序列的轉錄之序列。啟動子提供足以指導轉錄之序列，以及有效轉錄所需 的RNA聚合酶和其他轉錄因子的識別位點，並可以指導細胞特異性表現。除了足以指導轉錄之序列之外，本發明之啟動子序列還可以包括參與調節轉錄的其他調控元件之序列(例如增強子、最小啟動子、科紮克序列和內含子)。本領域已知的並且可用於本文所述之病毒載體的啟動子的實例包括RPE特異性啟動子例如ProA18啟動子(例如SEQ ID NO：2)和ProB4啟動子(例如SEQ ID NO：3)。此外，藉由混合和匹配已知的調節元件產生功能性啟動子的標準技術係本領域已知的。「截短的啟動子」也可以由啟動子片段或藉由混合和匹配已知調節元件的片段產生。
術語「CYP4V2」係指細胞色素P450家族4亞家族V成員2。人CYP4V2基因被發現在染色體4上，其核苷酸編碼序列例如SEQ ID NO：13所示。在一個實施方式中，可以使用人CYP4V2基因的密碼子優化之序列。這種密碼子優化的CYP4V2基因的一個實例具有如SEQ ID NO：14所示的核苷酸編碼序列。「CYP4V2基因產物」係由CYP4V2基因編碼的蛋白質。在一個實施方式中，示例性的人CYP4V2基因產物具有如SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。在一個實施方式中，CYP4V2編碼序列編碼SEQ ID NO：15的胺基酸序列或其功能變體或片段。可以在表2中發現其他物種的CYP4V2編碼序列和CYP4V2基因產物的實例(例如SEQ ID NO：39-50)。術語「CYP4V2編碼序列」或「CYP4V2基因CDS」或「CYP4V2 CDS」係指編碼CYP4V2基因產物之核苷酸序列。熟悉該項技術者將理解，CYP4V2編碼序列可包括編碼CYP4V2基因產物或其功能變體或片段的任何核苷酸序列。在一個實施方式中，該CYP4V2編碼序列編碼SEQ ID NO：15、40、42、44、46、48、50的胺基酸序列或其功能變體或片段。CYP4V2編碼序列可能包含或可能不包含中間調節元件(例如，內含子、增強子或其他非編碼序列)。
術語「受試者」包括人類和非人動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、小鼠、大鼠、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非在指出時，否則術語「患者」或「受試者」在本文中可互換地使用。
如本文所用，任何疾病或障礙(例如，BCD)的術語「治療(treating或treatment)」係指減輕疾病或障礙，例如，藉由減緩或阻止或減少疾病或其至少一種臨床症狀的發展。「治療(treating或treatment)」也可以是指緩解或減輕至少一種身體參數，包括不能被受試者辨別的那些。「治療(treating或treatment)」也可以是指在身體上(例如，可辨別的症狀的穩定化)或在生理上(例如，身體參數的穩定化)或二者調節疾病或障礙。更具體地，BCD的「治療」意指導致患有BCD之受試者改善或保持視功能、功能性視力、視網膜解剖學和/或生活品質的任何措施。如本文所用，「治療」可以表示BCD的一種或多種症狀得到減輕或其他有益地改變的任何方式。如本文所用，BCD症狀的減輕係指可以歸因於或與本發明之組成物及方法的治療有關的任何減輕，無論是永久的還是暫時的、持久的或短暫的。如本文所用，「預防(preventing或prevention)」係指預防或延遲疾病或障礙的發病或發展或進展。涉及BCD的「預防」係指在患有BCD且有惡化風險的患者中，預防或減緩視功能、功能性視力、視網膜解剖結構、生活品質和/或BCD疾病參數惡化的任何措施，如下所述。用於評估疾病的治療和/或預防之方法為本領域已知並在下文描述。
術語「病毒載體(virus vector或viral vector)」旨在指充當基因遞送運載體並且包含包裝在病毒(例如，AAV)衣殼內的重組病毒基因組的非野生型重組病毒顆粒(例如，細小病毒等)。病毒載體的特定類型可以是「重 組腺相關病毒載體」或「rAAV載體」。包裝在病毒載體中的重組病毒基因組在本文中也稱為「載體基因組」。
[圖1]為顯微照片，顯示ChR2d-eGFP在後眼杯的鋪片中之表現。從固定PFA的眼中分離出眼杯，切成翼瓣，並分析eGFP螢光。
[圖2A和圖2B]係顯示藉由ddPCR測量的ChR2d-eGFP的mRNA表現水平的圖。對於(圖2A)後眼杯和(圖2B)神經視網膜都顯示了相對於TM073的表現倍數變化。將每個樣本的ChR2d-eGFP表現標準化為Rab7對照表現。
本揭露部分基於以下發現：CYP4V2從重組腺相關病毒載體(rAAV)(該重組腺相關病毒載體具有選定的啟動子、AAV基因組和衣殼血清型的組合)的表現可為例如，CYP4V2基因突變之受試者提供強力且有效的BCD治療(表1)。因此，本揭露提供了指導CYP4V2編碼序列向視網膜表現的重組病毒載體，病毒載體組成物、用於產生病毒載體的質體、向視網膜遞送CYP4V2編碼序列之方法、在視網膜RPE細胞中表現CYP4V2編碼序列之方法、以及此類病毒載體的使用方法。
Figure 109106055-A0202-12-0015-1
Figure 109106055-A0202-12-0016-2
Figure 109106055-A0202-12-0017-3
除非另外指明，使用攜帶病毒基因盒的重組質體、表現細小病毒rep和/或cap序列的包裝質體以及暫態和穩定轉染的包裝細胞，可以使用熟悉該項技術者已知的標準方法來構建重組細小病毒和rAAV載體。此類技術係熟悉該項技術者已知的。(例如，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL 2nd Ed[分子選殖：實驗室手冊第2版].(Cold Spring Harbor[冷泉港實驗]，N.Y.,1989)；Choi等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY[分子生物學最新方案](2007))。
當病毒載體表現特定蛋白質或活性時，一種或多種相關基因不必與自然界發現或本文揭露的一種或多種相應基因相同。只要該蛋白質係有功能的，就可以根據本發明之一方面使用。熟悉該項技術者可以藉由檢測羥化酶活性來容易地確定CYP4V2編碼序列是否編碼功能性ω-羥化酶。簡而言之，將目的蛋白質與脂肪酸和其他必需因素混合，然後孵育以使羥化反應發生。然後，可以藉由質譜法測量羥基化的脂肪酸。參見，例如，功能測定，如Nakano等人，在Drug Metab Dispos[藥物代謝和處置]37：2119-2122,2009中所述。然而，通常較佳的是與天然蛋白具有非常高之序列同一性。例如，根據本發明之某些實施方式，通常應避免大的缺失(例如，大於約50個胺基酸)。因此，熟練的從業人員將理解，本發明之病毒載體序列可不同於本文所述之序列。在一些實施方式中，該病毒核苷酸或胺基酸序列與本文提供之序列具有大於或約80%的同一 性，例如，與本文提供之序列具有大於或約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的同一性。
在一些實施方式中，序列改變係保守的取代。這種變化包括用異白胺酸(I)、纈胺酸(V)和白胺酸(L)中的任何一種取代該等疏水性胺基酸中的任何其他胺基酸；用天冬胺酸(D)取代麩胺酸(E)，反之亦然；用麩醯胺酸(Q)取代天冬醯胺(N)，反之亦然；用絲胺酸(S)取代蘇胺酸(T)，反之亦然。根據特定胺基酸的環境及其在蛋白質三維結構中的作用，其他取代也可以被認為係保守的。例如，甘胺酸(G)和丙胺酸(A)經常可以互換，丙胺酸(A)和纈胺酸(V)也可以互換。相對疏水的蛋胺酸(M)經常可以與白胺酸和異白胺酸互換，有時與纈胺酸互換。離胺酸(K)和精胺酸(R)在胺基酸殘基的顯著特徵係其電荷的位置方面經常互換並且這兩個胺基酸殘基的pK差異不顯著。在特定環境中，其他變化也可以視為「保守」(參見，例如，US 20110201052的表III；第13-15頁「Biochemistry」2nd Ed[生物化學第2版].Stryer編輯(斯坦福大學)；Henikoff等人，Proc Natl Acad Sci USA[美國國家科學院院刊]89：10915-10919,1992；Lei等人，J Biol Chem[生物化學雜誌]270：11882-11886,1995)。
病毒載體
本發明關於指導異源基因向視網膜，例如人視網膜表現之病毒載體。在本發明之某些方面，表現優先定向到視網膜的RPE細胞。熟悉該項技術者可以將本領域已知的多種病毒載體用於本發明，例如，重組腺相關病毒、重組腺病毒、重組逆轉錄酶病毒、重組痘病毒、和重組桿狀病毒。
特別地，預期本發明之病毒載體可以是重組腺相關(rAAV)載體。AAV係小的單股DNA病毒，需要輔助病毒才能促進有效複製(Muzyczka N和Berns KI (2001)第69章，Fields Virology[費氏病毒學].Lippincott Williams & Wilkins[威爾金斯出版公司])。病毒載體包含載體基因組和蛋白質衣殼。病毒載體衣殼可以由本領域已知的任何AAV血清型提供，包括目前鑒定的人和非人AAV血清型和尚未鑒定的AAV血清型(參見，例如，Choi等人，Curr Gene Ther[當前基因治療]5：299-310,2005；Schmidt等人，J Virol[病毒學雜誌]82：1399-1406,2008；美國專利案號9,193,956；9；186；419；8,632,764；8,663,624；8,927,514；8,628,966；8,263,396；8,734,809；8,889,641；8,632,764；8,691,948；8,299,295；8,802,440；8,445,267；8,906,307；8,574,583；8,067,015；7,588,772；7,867,484；8,163,543；8,283,151；8,999,678；7,892,809；7,906,111；7,259,151；7,629,322；7,220,577；8,802,080；7,198,951；8,318,480；8,962,332；7,790,449；7,282,199；8,906,675；8,524,446；7,712,893；6,491,907；8,637,255；7,186,522；7,105,345；6,759,237；6,984,517；6,962,815；7,749,492；7,259,151；和6,156,303；美國公開案號2013/0295614；2015/0065562；2014/0364338；2013/0323226；2014/0359799；2013/0059732；2014/0037585；2014/0056854；2013/0296409；2014/0335054 2013/0195801；2012/0070899；2011/0275529；2011/0171262；2009/0215879；2010/0297177；2010/0203083；2009/0317417；2009/0202490；2012/0220492；2006/0292117；和2004/0002159；歐洲公開案號2692731 A1；2383346 B1；2359865 B1；2359866 B1；2359867 B1；和2357010 B1；1791858 B1；1668143 B1；1660678 B1；1664314 B1；1496944 B1；1456383 B1；2341068 B1；2338900 B1；1456419 B1；1310571 B1；1456383 B1；1633772 B1；和1135468 B1；和PCT公開案號WO 2014/124282；WO 2013/170078；WO 2014/160092；WO 2014/103957；WO 2014/052789；WO 2013/174760；WO 2013/123503；WO 2011/038187；WO 2008/124015；和WO 2003/054197)。
為了本文揭露的目的，AAV係指病毒本身及其衍生物。除非另外指明，否則術語係指所有亞型或血清型以及複製型和重組型。術語「AAV」 包括，但不限於，AAV 1型(AAV1)、AAV 2型(AAV2)、AAV 3A型(AAV3A)、AAV 3B型(AAV3B)、AAV 4型(AAV4)、AAV 5型(AAV5)、AAV 6型(AAV6)、AAV 7型(AAV7)、AAV 8型(AAV8)、AAV 9型(AAV9)、AAV 10型(AAV 10或AAVrh10)、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、山羊AAV、馬AAV、靈長類AAV、非靈長類AAV、和綿羊AAV。「靈長類AAV」係指感染靈長類的AAV，「非靈長類AAV」係指感染非靈長類哺乳動物的AAV，「牛AAV」係指感染牛哺乳動物的AAV等。
各種血清型AAV的基因組序列，以及天然反向末端重複(ITR)序列，Rep蛋白和衣殼亞基之序列係本領域已知的。此類序列可以在文獻中或在諸如GenBank的公共資料庫中找到。參見，例如，GenBank登錄號NC_002077.1(AAV1)、AF063497.1(AAV1)、NC_001401.2(AAV2)、AF043303.1(AAV2)、J01901.1(AAV2)、U48704.1(AAV3A)、NC_001729.1(AAV3A)、AF028705.1(AAV3B)、NC.001829.1(AAV4)、U89790.1(AAV4)、NC_006152.1(AA5)、AF085716.1(AAV-5)、AF028704.1(AAV6)、NC 006260.1(AAV7)、AF513851.1(AAV7)、AF513852.1(AAV8)NC 006261.1(AAV8)、AY530579.1(AAV9)、AAT46337(AAV10)、和AAO88208(AAVrh10)；藉由引用將其揭露內容併入本文以教導AAV核酸和胺基酸序列。還參見，例如，Srivastava等人，J Virol[病毒學雜誌].45：555-564,1983；Chiorini等人，J Virol[病毒學雜誌]71：6823-6833,1998；Chiorini等人，J Virol[病毒學雜誌]73：1309-1319,1999；Bantel-Schaal等人，J Virol[病毒學雜誌]73：939-947,1999；Xiao等人，J Virol[病毒學雜誌]73：3994-4003,1999：Muramatsu等人，Virology[病毒學]221：208-217,1996；Shade等人，J Virol[病毒學雜誌]58：921-936,1986；Gao等人，Proc Natl Acad Sci USA[美國國家科學院院刊]99：11854-11859,2002；PCT公開案號WO 00/28061、WO 99/61601、和WO 98/11244；和美國專利案號6,156,303。
病毒衣殼可以與其他載體組分混合並匹配以形成雜合假型病毒載體，例如，病毒載體的ITR和衣殼可以來自不同的AAV血清型。在一個方面，ITR可以來自AAV2血清型，而衣殼則來自，例如AAV8、AAV9、AAV2或AAV5血清型。此外，熟悉該項技術者將認識到，載體衣殼也可以是鑲嵌衣殼(例如，由來自不同血清型的衣殼蛋白的混合物組成的衣殼)，甚至是嵌合衣殼(例如，含有外來或無關蛋白質序列(用於產生標誌物和/或改變組織嗜性)的衣殼蛋白)。預期本發明之病毒載體可包含AAV8衣殼(例如，SEQ ID NO：24、25、和26，由例如SEQ ID NO：23編碼)。還預期本發明之病毒載體可包含AAV9衣殼(例如，SEQ ID NO：28、29、和30，由例如SEQ ID NO：27編碼)。還預期本發明之病毒載體可包含AAV2衣殼(例如，SEQ ID NO：32、33、和34，由例如SEQ ID NO：31編碼)。進一步預期本發明可以包括AAV5衣殼(例如，SEQ ID NO：36、37、和38，由例如，SEQ ID NO：35編碼)。
在一個方面，AAV係一種自我互補的腺相關病毒(scAAV)。
在其他特定方面，載體基因組，例如單股載體基因組，具有大於或約4.1kb且小於或約4.9kb之長度，例如，大於或約4.2kb且小於或約4.9kb、大於或約4.3kb且小於或約4.9kb、大於或約4.4kb且小於或約4.9kb、大於或約4.5kb且小於或約4.9kb、大於或約4.6kb且小於或約4.9kb、大於或約4.7kb且小於或約4.9kb、大於或約4.8kb且小於或約4.9kb、大於或約4.1kb且小於或約4.8kb、大於或約4.1kb且小於或約4.7kb、大於或約4.1kb且小於或約4.6kb、大於或約4.1kb且小於或約4.5kb、大於或約4.1kb且小於或約4.4kb、大於或約4.1kb且小於或約4.3kb、大於或約4.1kb且小於或約4.2kb、大於或約4.2kb且小於或約4.8kb、大於或約4.3kb且小於或約4.7kb、大於或約4.4kb且小於或約4.6kb、約4.1kb、約4.2kb、約4.3kb、約4.4kb、約4.5kb、約4.6kb、約4.7kb、約4.8kb、或約4.9kb。
在某些方面，本發明關於載體基因組，例如載體基因組，例如單股載體基因組，該載體基因組以5’至3’方向包含：(i)選自ProA18啟動子和ProB4啟動子的啟動子，以及其活性片段；和(ii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2(例如，人CYP4V2)編碼序列。
在某些方面，本發明關於載體基因組，例如單股載體基因組，該載體基因組以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)啟動子，(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列，(iv)聚腺苷酸化(聚A)訊息序列，以及(v)3’ITR。在本發明之某些方面，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)啟動子，(iii)內含子，(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列，(v)聚A訊息序列，以及(vi)3’ITR。在一些實施方式中，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)啟動子，(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列，(iv)調節元件，(v)聚A訊息序列，以及(vi)3’ITR。在本發明之某些方面，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR，(ii)啟動子，(iii)內含子，(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列，(v)調節元件，(vi)聚A訊息序列，以及(vii)3’ITR。載體的元件可以具有與表2中描述之序列具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之序列。
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在一些實施方式中，5’和3’ITR分別包含約130至約145個核苷酸。ITR係AAV基因組高效擴增所必需的，該等序列的對稱特徵使其具有形成髮夾的能力，有助於所謂的自引發作用，使第二條DNA股不依賴於引發酶進行 合成。預期可以使用AAV 2血清型的5’和3’ITR(例如，分別與SEQ ID NO：1和22具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的同一性之核苷酸序列)。在其他方面，如本文所述，來自其他合適血清型的ITR可以選自本領域已知的任何AAV血清型，例如ITR可以來自AAV8、AAV9或AAV5。該等ITR或其他AAV組分可以使用熟悉該項技術者可以容易地從已知的任何AAV血清型或尚未鑒定的血清型中分離出來，例如，AAV序列可以是合成的，也可以藉由參考文獻或資料庫(例如GenBank、PubMed等)中公開之序列，藉由其他合適的方式獲得。可替代地，此類AAV組分也可以從學術、商業或公共來源分離或獲得(例如，美國標準菌庫(American Type Culture Collection)，馬納薩斯，維吉尼亞州)。
在一些實施方式中，將AAV載體的5’或3’ITR區域突變以形成△ITR，例如，藉由缺失/突變末端解析位點(trs)，並藉由形成二聚的反向重複DNA分子，使所得的AAV基因組變成自我互補(sc)。在一個實施方式中，△ITR序列包含SEQ ID NO：54。另外的△ITR序列係本領域已知的，例如，描述於如Wang等人，在Gene Therapy[基因療法]，2003,10：2105-2111；McCarty等人，Gene Therapy[基因療法]，2003,10：2112-2118；和McCarty等人，Gene Therapy[基因療法]，2001,8：1248-1254，該等文獻各自藉由引用以其全文併入。
在某些實施方式中，RPE特異性啟動子可用於CYP4V2優先在視網膜的RPE細胞(例如，人RPE細胞)中的靶向表現。RPE特異性啟動子的實例包括ProA18啟動子或ProB4啟動子。例如，ProA18啟動子可以具有與SEQ ID NO：2具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列，並且ProB4啟動子啟動子可以具有與SEQ ID NO：3具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列。
在一些實施方式中，載體基因組，例如，單股載體基因組，可能包含內含子序列。例如，該內含子可以是人類生長激素(hGH)內含子、猿猴病毒40(SV40)內含子、或人類β戈賓內含子，例如，與SEQ ID NO：9、10或11分別具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列。
在一個實施方式中，載體基因組，例如單股載體基因組，包含含有CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列。CYP4V2編碼序列可具有與SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列。在一個特定的實施方式中，載體基因組包含含有與SEQ ID NO：14具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性的CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列。
此外，載體基因組，例如，單股載體基因組，可能包括與異源CYP4V2基因可操作地連接的調控元件。調控元件可以包括適當的轉錄起始、終止和增強子序列，有效的RNA加工訊號，例如剪接訊號；穩定細胞質mRNA之序列；增強翻譯效率之序列；增強蛋白質穩定性之序列；以及當需要時，增強編碼產物分泌之序列。許多調節序列係本領域已知的並且可以被利用。本發明之調控元件序列包括表2中描述的那些，例如，乙型肝炎病毒調控元件(HPRE)和土撥鼠肝炎病毒調控元件(WPRE)，其可以具有分別與SEQ ID NO：16和17具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列。
在一個實施方式中，載體基因組，例如，單股載體基因組，包含聚A訊息序列。本發明之聚A訊息序列包括表2中所述之序列，例如，牛生長激素(bGH)聚A訊息序列和猿猴病毒40(SV40)聚A訊息序列，其可以具有 分別與SEQ ID NO：18和19具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列。在一個特定的實施方式中，載體基因組包含bGH聚A訊息序列，其可具有與SEQ ID NO：18具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列。
因此，在一個方面，本發明關於載體基因組，例如單股載體基因組，該載體基因組以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO：1)，(ii)啟動子(例如，SEQ ID NO：2或3)，(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列(例如，SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49)，(iv)聚A訊息序列(例如，SEQ ID NO：18或19)，以及(v)3’ITR(例如，SEQ ID NO：22)。在本發明之某些方面，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO：1)，(ii)啟動子(例如，SEQ ID NO：2或3)，(iii)內含子(例如，SEQ ID NO：9、10、或11)，(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列(例如，SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49)，(v)聚A訊息序列(例如，SEQ ID NO：18或19)，以及(vi)3’ITR(例如，SEQ ID NO：22)。在一些實施方式中，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO：1)，(ii)啟動子(例如，SEQ ID NO：2或3)，(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列(例如，SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49)，(iv)調節元件(例如，SEQ ID NO：16或17)，(v)聚A訊息序列(例如，SEQ ID NO：18或19)，以及(vi)3’ITR(例如，SEQ ID NO：22)。在本發明之某些方面，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO：1)，(ii)啟動子(例如，SEQ ID NO：2或3)，(iii)內含子(例如，SEQ ID NO：9、10、或11)，(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列(例如，SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49)，(v)調節 元件(例如，SEQ ID NO：15或17)，(vi)聚A訊息序列(例如，SEQ ID NO：18或19)，以及(vii)3’ITR(例如，SEQ ID NO：22)。
在一些實施方式中，載體基因組，例如，單股載體基因組，可能進一步包含填充多核苷酸序列。填充多核苷酸序列可以在載體序列中位於任何期望的位置，以使得它不會阻止載體的功能或活性。在一個方面，填充多核苷酸序列位於聚A訊息序列和3’ITR之間。通常，填充多核苷酸序列係惰性的或無害的且沒有功能或活性。在各個特定方面，填充多核苷酸序列不是細菌多核苷酸序列；填充多核苷酸序列不是編碼蛋白質或肽之序列；且該填充多核苷酸序列不同於ITR序列、啟動子、包含CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列和聚A訊息序列。在一些實施方式中，該填充序列可以是與SEQ ID NO：20或21具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列。在其他各個方面，填充多核苷酸序列之長度在約1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、或2,500-3,000個核苷酸之間。
因此，在某些實施方式中，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO：1)，(ii)啟動子(例如，SEQ ID NO：2或3)，(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列(例如，SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49)，(iv)聚A訊息序列(例如，SEQ ID NO：18或19)，(v)填充序列(例如，SEQ ID NO：20或21)，以及(vi)3’ITR(例如，SEQ ID NO：22)。在本發明之某些方面，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO：1)，(ii)啟動子(例如，SEQ ID NO：2或3)，(iii)內含子(例如，SEQ ID NO：9、10、或11)，(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列(例如，SEQ ID NO：13、14、39、41、 43、45、47、或49)，(v)聚A訊息序列(例如，SEQ ID NO：18或19)，(vi)填充序列(例如，SEQ ID NO：20或21)，以及(vii)3’ITR(例如，SEQ ID NO：22)。在一些實施方式中，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO：1)，(ii)啟動子(例如，SEQ ID NO：2或3)，(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列(例如，SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49)，(iv)調節元件(例如，SEQ ID NO：16或17)，(v)聚A訊息序列(例如，SEQ ID NO：18或19)，(vi)填充序列(例如，SEQ ID NO：20或21)以及(vii)3’ITR(例如，SEQ ID NO：22)。在本發明之某些方面，載體基因組，例如單股載體基因組，以5’至3’方向包含：(i)5’ITR(例如，SEQ ID NO：1)，(ii)啟動子(例如，SEQ ID NO：2或3)，(iii)內含子(例如，SEQ ID NO：9、10、或11)，(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列(例如，SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49)，(v)調節元件(例如，SEQ ID NO：16或17)，(vi)聚A訊息序列(例如，SEQ ID NO：18或19)，(vii)填充序列(例如，SEQ ID NO：20或21)，以及(viii)3’ITR(例如，SEQ ID NO：22)。
在一些實施方式中，載體基因組，例如，單股載體基因組，可能還包含科紮克序列。科紮克序列係在真核mRNA上出現之序列，具有共有的(gcc)gccRccAUGG序列，並在翻譯過程的啟動中起作用。科紮克序列可以位於緊靠包含CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列的上游。在一些實施方式中，該科紮克序列係GCCACC(SEQ ID NO：12)。可替代地，該載體基因組，例如單股載體基因組，包含GCCGCC(SEQ ID NO：51)、GACACC(SEQ ID NO：52)、或GCCACG(SEQ ID NO：53)之科紮克序列。
在本發明之某些方面，病毒載體包含AAV8衣殼，該衣殼包含VP1、VP2和VP3胺基酸序列，分別與SEQ ID NO：24、25和26具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 或100%的同一性，由例如與SEQ ID NO：23具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列和以5’至3’方向包含與以下核苷酸序列組之一具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列之載體基因組編碼：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
在一些實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含與以下具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；或SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22。在某些實施方式中，該AAV8衣殼可以包含衣殼蛋白VP1、VP2和/或VP3的亞組合。
預期本發明之病毒載體可以包含AAV9衣殼，該衣殼包含VP1、VP2和VP3胺基酸序列，分別與SEQ ID NO：28、29和30具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100% 的同一性，由例如與SEQ ID NO：27具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列和以5’至3’方向包含與以下核苷酸序列組之一具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列之載體基因組編碼：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
在一些實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含與以下具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；或SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22。在某些實施方式中，該AAV9衣殼可以包含衣殼蛋白VP1、VP2和/或VP3的亞組合。
在本發明之某些方面，病毒載體包含AAV2衣殼，該衣殼包含VP1、VP2和VP3胺基酸序列，分別與SEQ ID NO：32、33和34具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 或100%的同一性，由例如與SEQ ID NO：31具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列和以5’至3’方向包含與以下核苷酸序列組之一具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列之載體基因組編碼：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
在一些實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含與以下具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；或SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22。在某些實施方式中，該AAV2衣殼可以包含衣殼蛋白VP1、VP2和/或VP3的亞組合。
在本發明之某些方面，病毒載體包含AAV5衣殼，該衣殼包含VP1、VP2和VP3胺基酸序列，分別與SEQ ID NO：36、37和38具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 或100%的同一性，由例如與SEQ ID NO：35具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列和以5’至3’方向包含與以下核苷酸序列組之一具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列之載體基因組編碼：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
在一些實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含與以下具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；或SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22。在某些實施方式中，該AAV5衣殼可以包含衣殼蛋白VP1、VP2和/或VP3的亞組合。
用於產生病毒載體之方法係本領域熟知的並且將允許技術人員產生本發明之病毒載體(參見，例如，美國專利案號7,465,583)，包括表3中所述之病毒載體。通常，產生rAAV載體之方法適用於產生本發明之病毒載體； 該等方法之間的主要區別係要包裝的遺傳元件的結構。為了產生根據本發明之病毒載體，表2中描述的遺傳元件之序列可以用於產生衣殼化的病毒基因組。
表2中描述的遺傳元件係在環狀質體或病毒基因組(例如，單股或自身互補的病毒基因組)的背景下，但是熟悉該項技術者將理解，DNA底物可以以本領域已知的任何形式提供，包括但不限於質體、裸DNA載體、細菌人工染色體(BAC)、酵母菌人工染色體(YAC)或病毒載體(例如，腺病毒、皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、AAV、桿狀病毒、逆轉錄病毒載體等)。可替代地，表2中的產生本文所述病毒載體所必需的遺傳元件可以穩定地摻入包裝細胞的基因組中。
可以藉由本領域已知的任何方法來產生根據本發明之病毒載體顆粒，例如，藉由將要複製和包裝之序列引入允許細胞或包裝細胞中，如那些術語在本領域中理解的那樣(例如，病毒可以感染或轉導「允許」細胞；「包裝」細胞係提供協助工具的穩定轉化的細胞)。
在一個實施方式中，提供了一種用於產生CYP4V2病毒載體之方法，其中該方法包括向允許細小病毒複製的細胞提供：(a)含有用於產生本發明之載體基因組的遺傳元件之核苷酸序列(如下面和表2中詳細描述的)；(b)足以用於(a)中之載體基因組序列的複製以產生載體基因組之核苷酸序列；(c)在足以使包含載體基因組之病毒載體在有待在細胞中產生的細小病毒衣殼內衣殼化的條件下，足以將載體基因組包裝入細小病毒衣殼之核苷酸序列。較佳的是，細小病毒複製和/或衣殼編碼序列係AAV序列。
可以採用將攜帶下述基因盒之核苷酸序列引入細胞宿主進行複製和包裝的任何方法，包括但不限於，電穿孔、磷酸鈣沈澱、線性聚乙烯亞胺聚合物沈澱、顯微鏡下注射、陽離子或陰離子脂質體、和脂質體結合核定位訊號。
本文所述之病毒載體可以使用本領域已知之方法產生，例如，三重轉染或桿狀病毒介導的病毒產生。可以採用本領域已知的任何合適的允許細胞或包裝細胞來產生載體。較佳的是哺乳動物細胞。還較佳的是反式互補包裝細胞系，其提供從複製缺陷性輔助病毒中缺失的功能，例如，293細胞或其他E1a反式互補細胞。還較佳的是本領域已知的DNA修復缺陷的哺乳動物細胞或細胞系，因為該等細胞系在校正引入本文所述之質體中的突變的能力上將受到損害。
基因盒可以包含細小病毒(例如，AAV)帽和rep基因的一些或全部。較佳的是，然而，藉由將編碼衣殼和/或Rep蛋白的一種或多種包裝載體引入細胞中，反式提供了一些或全部的帽和rep功能。最較佳的是，基因盒不編碼衣殼或Rep蛋白。可替代地，使用包裝細胞系，其被穩定轉化以表現cap和/或rep基因(參見，例如，Gao等人，Hum Gene Ther[人類基因治療]9：2353-2362,1998；Inoue等人，J Virol[病毒學雜誌]72：7024-7031,1998；美國專利案號5,837,484；WO 98/27207；美國專利案號5,658,785；WO 96/17947)。
此外，較佳的是為病毒載體提供輔助病毒功能，以傳播新的病毒顆粒。腺病毒和單純皰疹病毒均可作為AAV的輔助病毒。參見，例如，Bernard N.Fields等人，VIROLOGY[病毒學]，第2卷，第69章(第3版，Lippincott-Raven Publishers[Lippincott-Raven出版社])。示例性輔助病毒包括但不限於單純皰疹(HSV)水痘帶狀皰疹、巨細胞病毒和Epstein-Barr病毒。感染複數(MOI)和感染的持續時間將取決於所用病毒的類型和所使用的包裝細胞系。可以採用任何合適的輔助載體。較佳的是，輔助載體為質體，例如，描述於Xiao等人，J Virol[病毒學雜誌]72：2224,1998。如上所述，可以藉由本領域已知的任何合適方法將載體引人包裝細胞。
可以藉由本領域已知的任何方法獲得不含污染性輔助病毒之載體儲備液。例如，重組單股或自身互補病毒和輔助病毒可根據大小容易地區分。還可以根據對肝素底物的親和力將病毒與輔助病毒分開(Zolotukhin等人，Gene Ther[基因療法]6：973-985,1999)。較佳的是，使用缺失的複製缺陷型輔助病毒，以便任何污染性輔助病毒都不具有複製能力。作為進一步的選擇，可以使用缺乏晚期基因表現的腺病毒輔助，因為僅需要腺病毒早期基因表現來介導雙鏈病毒的包裝。晚期基因表現有缺陷的腺病毒突變體係本領域已知的(例如，ts100K和ts149腺病毒突變體)。
提供協助工具的一種方法係使用非感染性腺病毒小質體，該質體攜帶有效產生AAV所需的所有輔助基因(Ferrari等人，Nat Med[自然醫學]3：1295-1297,1997；Xiao等人，J Virol[病毒學雜誌]72：2224-2232,1998)。用腺病毒小質體獲得的rAAV滴定度比用常規野生型腺病毒感染方法獲得的rAAV滴定度高40倍(Xiao等人，J Virol[病毒學雜誌]72：2224-2232,1998)。這種方法消除了與腺病毒進行共轉染的需要(Hölscher等人，J Virol[病毒學雜誌]68：7169-7177,1994；Clark等人，Hum Gene Ther[人類基因治療]6：1329-1341,1995；Trempe和Yang,(1993),in,Fifth Parvovirus Workshop[在第五次細小病毒研討會中]，Crystal River,FL)。
已經描述了其他生產rAAV儲備液之方法，包括但不限於將rep和cap基因分開到單獨的表現盒上以防止產生具有複製能力的AAV之方法(參見，例如，Allen等人，J Virol[病毒學雜誌]71：6816-6822,1997)，採用包裝細胞系之方法(參見，例如，Gao等人，Hum Gene Ther[人類基因治療]9：2353-2362,1998；Inoue等人，J Virol[病毒學雜誌]72：7024-7031,1998；美國專利案號5,837,484；WO 98/27207；美國專利案號5,658,785；WO 96/17947)以及其他無輔助病毒的系統(參見，例如，美國專利案號5,945,335)。
皰疹病毒也可以在AAV包裝方法中用作輔助病毒。編碼一種或多種AAV Rep蛋白的雜合皰疹病毒可以有利地促進更可擴展的AAV載體產生方案。已經描述了表現AAV-2rep和cap基因的雜合單純皰疹病毒I型(HSV-1)載體(Conway等人，Gene Ther[基因療法]6：986-993,1999，和WO 00/17377)。
總之，將要複製和包裝的基因盒、細小病毒帽基因、適當的細小病毒rep基因和(較佳的是)協助工具提供給細胞(例如，允許細胞或包裝細胞)，以產生攜帶載體基因組的rAAV顆粒。由基因盒和/或一種或多種包裝載體和/或穩定轉化的包裝細胞編碼的rep和cap基因的聯合表現導致產生病毒載體顆粒，其中病毒載體衣殼包裝了根據本發明之病毒載體基因組。使病毒載體，例如單股載體在細胞內組裝，然後可以藉由熟悉該項技術者已知的並且在實例中描述的任何方法回收。例如，病毒載體可以藉由標準的CsCl離心方法(Grieger等人，Nat Protoc[自然實驗手冊]1：1412-1428,2006)、碘克沙醇離心方法或技術人員已知的各種柱層析法來純化(參見，例如，Lock等人，Hum Gene Ther[人類基因治療]21：1259-1271，2010；Smith等人，Mol Ther[分子療法]17：1888-1896,2009；和Vandenberghe等人，Hum Gene Ther[人類基因治療]21：1251-1257,2010)。
本文公開的試劑和方法可用於產生本發明病毒載體的高滴定度儲備液，較佳的是基本以野生型滴定度。還較佳的是該細小病毒儲備液具有約1010vg/mL至約1013vg/mL的滴定度，例如，至少或約1010vg/mL、6.6 x 1010vg/mL、1011vg/mL、5 x 1011vg/mL、1012vg/mL、5 x 1012vg/mL、1013vg/mL、5 x 1013vg/mL，或更高。
用於生成病毒載體的核酸
本發明還關於可用於產生病毒載體的核酸。在本發明之某些方面，用於產生病毒載體的核酸可以是質體形式。用於產生病毒載體的質體，也稱為 病毒載體質體，可包含基因盒。病毒載體質體的基因盒至少包含：啟動子，異源CYP4V2基因，聚A訊息序列，以及5’和3’ITR。
異源基因和其他元件的組成取決於所得載體之用途。例如，一種類型的異源基因序列包括報告序列，其在表現時產生可檢測的訊號。此類報告序列包括但不限於編碼β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、螢光素酶、膜結合蛋白(包括例如CD2、CD4、CD8、流感血凝素蛋白和存在針對其的高親和力抗體或可以藉由常規方法產生的本領域熟知的其他蛋白)、以及包含膜結合蛋白的融合蛋白(該膜結合蛋白適當融合至來自血凝素或Myc的抗原標籤結構域)的DNA序列。例如，如果報告序列係LacZ基因，則藉由檢測β-半乳糖苷酶活性來檢測帶有訊號之載體的存在。當報告序列係GFP或螢光素酶時，可以藉由在發光計中藉由顏色或發光來目測測量攜帶訊號之載體。
異源基因序列與驅動其表現的元件相關聯時，提供可藉由常規手段檢測到的訊號，包括酶促、射線照相、比色、螢光或其他光譜測定、螢光活化細胞分選測定和免疫測定、包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和免疫組織化學。
異源基因也可以是編碼在生物學和醫學上有用的產物(例如蛋白質、肽、RNA、酶、顯性負突變體或催化RNA)的非標誌物序列。理想的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖體RNA、催化RNA、siRNA、小髮夾RNA、反式剪接RNA和反義RNA。有用的RNA序列的一個實例係在處理的動物中抑制或消除靶核苷酸序列的表現之序列。
異源基因還可以用於糾正或減輕基因缺陷，其中可能包括正常基因的表現水平低於正常水平的缺陷或功能基因產物未表現的缺陷。預期本發明 之異源基因序列可以是CYP4V2編碼序列。表2提供了CYP4V2編碼序列之實例：SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47和49。
本發明之一個方面關於包含基因盒的核酸，該基因盒以5’至3’方向包含與以下核苷酸序列組之一具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
在一些實施方式中，該基因盒以5’至3’方向包含與以下具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；或SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22。在某些實施方式中，該包含基因盒的核酸可以是質體。
將表2中的元件摻人之方法係本領域眾所周知的，並且將允許技術人員使用本文所述之方法產生本發明之核酸和質體。
藥物組成物
在一個方面，本發明提供了包含與藥學上可接受之載體一起配製的本發明之病毒載體之藥物組成物。該組成物可另外含有適用於治療或預防BCD的一種或多種其他治療劑。藥學上可接受之載體增強或穩定該組成物，或可用於促進組成物的製備。藥學上可接受之載體包括生理上相容的溶劑、表面活性劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。
本發明之藥物組成物可藉由本領域已知的各種方法投與。投與途徑和/或方式根據所希望的結果而變化。較佳的是視網膜下投與。藥學上可接受之載體應適合於視網膜下、玻璃體內、靜脈內、皮下或局部投與。
該組成物應該是無菌和流動的。可以例如藉由使用包衣(如卵磷脂)、藉由在分散液的情況下維持所需顆粒大小以及藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，較佳的是在組成物中包含等滲劑例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)和氯化鈉。在一個實施方式中，該組成物可以包括具有1X PBS和0.001% PLURONICTM F-68作為表面活性劑的緩衝液，其pH為約6.5至8.0，例如pH 6.5至7.5和pH 6.5至7.0。
本發明之藥物組成物可以按照本領域公知和常規實施之方法製備。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy[藥學科學與實踐]，Mack Publishing Co[麥克出版社].，第20版，2000；和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems[持續控制釋藥物遞送系統]，J.R.Robinson，編輯，馬塞爾．德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，紐約，1978。藥物組成物較佳的是在GMP條件下製造。通常，治療有效(effective或efficacious)劑量之病毒載體用於本發明之藥物組成物中。藉由熟悉該項技術者已知的常規方法可以將病毒載體配製成藥學上可接受的劑型。調整劑量方案以提供最佳的所需反應(例如，治療反應)。例如，如由治療情況的緊急狀態所指示的，可以投與單次推注，可以隨著時間投與若干個劑量，或可以按比例減少或增加劑量。可以特別有利地以 劑量單位形式配製胃外組成物以易於投與和實現劑量均勻性。如本文所使用，單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療受試者的物理上離散單位；每個單位含有經計算產生期望治療作用的預定量之活性化合物以及所需藥物載劑。
可以改變本發明藥物組成物中活性成分的實際劑量水平，以便獲得一定量之活性成分，該活性成分之量有效地實現對於特定的患者、組成物和投與方式的所需的治療反應，而對該患者沒有毒性。所選擇的劑量水平取決於各種藥物動力學因素，包括所採用的本發明特定組成物之活性、投與途徑、投與時間、與所採用的特定組成物組合的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況和先前病史、以及類似因素。
醫生或獸醫可以以低於達到期望治療效果所需的水平開始藥物組成物中使用的本發明之病毒載體的劑量，並逐漸增加劑量直至達到期望效果。通常，用於治療如本文所述之BCD的本發明之組成物的有效劑量根據不同因素而變化，包括投與方式、靶位點、患者的生理狀態、患者係人還是人動物、投與的其他藥物以及治療係預防性的還是治療性的。需要滴定治療劑量以優化安全性和功效。對於視網膜下投與病毒載體，劑量可以在約1 x 108個載體基因組(vg)/眼至約1 x 1012vg/眼的範圍內。例如，該劑量可以大於或約1 x 108vg/眼、2.5 x 108vg/眼、5 x 108vg/眼、7.5 x 108vg/眼、1 x 109vg/眼、2.5 x 109vg/眼、5 x 109vg/眼、7.5 x 109vg/眼、1 x 1010vg/眼、2.5 x 1010vg/眼、5 x 1010vg/眼、7.5 x 1010vg/眼、1 x 1011vg/眼、2 x 1011vg/眼、2.5 x 1011vg/眼、5 x 1011vg/眼、7.5 x 1011vg/眼、或1 x 1012vg/眼。
本文所述之病毒載體主要用作每隻眼一次劑量，具有重複給藥的可能性以治療先前給藥中未覆蓋的視網膜區域。投與的劑量可以根據治療係預防性的還是治療性的而變。
在上面單個章節和實施方式中提及的本發明之各種特徵和實施方式，作必要的修正的情況下適當時適用於其他章節和實施方式。因此，在一個章節或實施方式中指定的特徵可以適當地與在其他章節或實施方式中指定的特徵組合。
治療用途
藉由向有需要之受試者投與有效量的本發明之病毒載體，可以以治療上有用的濃度將本文所述之病毒載體用於治療與眼有關的疾病。例如，該病毒載體可以包含AAV8衣殼，該衣殼包含VP1、VP2和VP3胺基酸序列，分別與SEQ ID NO：24、25和26具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的同一性，由例如與SEQ ID NO：23具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列和以5’至3’方向包含與以下核苷酸序列組之一具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之核苷酸序列之載體基因組編碼：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
在一些實施方式中，該載體基因組以5’至3’方向包含與以下具有大於或約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、或100%同一性之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、2、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；或SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22。在某些其他實施方式中，該AAV8衣殼可以包含衣殼蛋白VP1、VP2和/或VP3的亞組合。
需要治療之受試者可能包括那些CYP4V2基因有一個或多個突變(例如，表1)之受試者。更具體地，本發明提供了一種治療BCD之方法，其藉由向有需要之受試者投與有效量的包含CYP4V2編碼序列序列(例如，編碼人CYP4V2蛋白之核苷酸序列，例如，SEQ ID NO：15)之病毒載體。在一些方面，本文提供的是改善患有BCD之受試者的視力之方法，其藉由向有需要之受試者投與有效量的包含CYP4V2編碼序列(例如，編碼人CYP4V2蛋白之核苷酸序列，例如，SEQ ID NO：15)之病毒載體。在一些方面，本文提供的是預防患有BCD之受試者的視力下降之方法，其藉由向有需要之受試者投與有效量的包含CYP4V2編碼序列(例如，編碼人CYP4V2蛋白之核苷酸序列，例如，SEQ ID NO：15)之病毒載體。在具體的方面，本發明提供了用於治療患有BCD之受試者的包含CYP4V2編碼序列之病毒載體。在一個實施方式中，可以使用熟悉該項技術者已知之方法藉由視網膜下或玻璃體內投與本文所述之病毒載體。在一個實施方式中，該方法可以包括對受試者進行基因分型以確定其是否具有與BCD相關的一種或多種CYP4V2突變(參見，例如，表1)，以及藉由投與如本文所述之病毒載體來治療患有與BCD相關的一種或多種CYP4V2突變之受試者的BCD。在具體的實施方式中，用於治療BCD之方法的本文提供之病毒載體包含可操作地連接至啟動子例如ProA18或ProB4啟動子的CYP4V2編碼序列序列(例如，編碼人CYP4V2蛋白之核苷酸序列，例如SEQ ID NO：15)。
重組AAV的使用已被證明對視網膜疾病的治療係可行和安全的。參見，例如，Bainbridge等人，N Engl J Med[新英格蘭醫學雜誌]358：2231-2239,2008；Bainbridge等人，Gene Ther[基因療法]15：1191-1192,2008；Hauswirth等人，Hum Gene Ther[人類基因治療]19：979-990,2008；Maguire等人，N Engl J Med[新英格蘭醫學雜誌]358：2240-2248,2008；Bennett等人，Lancet[柳葉刀]388：661-672,2016；和Russell等人，Lancet[柳葉刀]390：849-860,2017。本文所述之病毒載體尤其可以用於治療和預防BCD的進展並減少視力喪失。
本發明還關於藉由將本發明之病毒載體投與給有需要之受試者例如其CYP4V2基因中具有一個或多個突變(例如，表1)之受試者而在RPE細胞中表現CYP4V2編碼序列之方法。本發明還關於用於在有需要之受試者的視網膜的RPE細胞中表現CYP4V2編碼序列的本發明之病毒載體。本發明還考慮了向患有BCD之受試者的視網膜，特別是視網膜中的RPE細胞遞送和表現CYP4V2編碼序列之方法。預期藉由使受試者的視網膜和/或RPE細胞與本文所述之病毒載體接觸(例如，視網膜下或玻璃體內投與)，將CYP4V2編碼序列遞送至有需要之受試者。可替代地，藉由向受試者投與如本文所述之病毒載體，將CYP4V2編碼序列遞送至受試者。
在一些方面，本發明進一步包括藉由使受試者的視網膜與本發明之病毒載體接觸，在具有BCD之受試者的視網膜中的RPE細胞中表現CYP4V2編碼序列之方法。在某些方面，使受試者視網膜的RPE細胞與本發明之病毒載體接觸。
眼科醫師、驗光師或醫療保健專業人員可以使用視功能、功能性視力、視網膜解剖結構和/或生活品質的臨床相關測量值來確定眼科疾病(例如BCD)的治療和/或預防。BCD的治療意指改善或保持視功能、功能性視力、視網膜解剖和/或生活品質的任何措施(例如，投與本文所述之病毒載體)。此外， 與BCD相關的預防係指在受試者中，抑制、預防或減緩本文定義的視功能、功能性視覺、視網膜解剖結構和/或BCD表型惡化的任何措施(例如，投與本文所述之病毒載體)，例如，減少視網膜中黃色或白色晶體狀沈積物的數量和/或大小，該受試者具有上述惡化風險。
視功能可以包括例如視力、低照度視力、視野、中央視野、周邊視力、對比敏感度、暗適應、光應力恢復、辨色力、閱讀速度、輔助裝置依賴性(例如大字體、放大裝置、望遠鏡)、面部識別、駕駛機動車熟練程度、進行日常生活中的一項或多項活動的能力、和/或患者報告的視功能相關滿意度。因此，在某些實施方式中，BCD的治療可以說是在以下情況中發生：受試者的前述暗適應程度時間至少減少10%、20%、或30%或缺少10%、20%、或30%或更多的增加。此外，BCD的治療可以說是在以下情況中發生：受試者在年輕時表現出早期嚴重的夜盲症和緩慢的黑暗適應能力，然後視力、視野和色覺逐漸喪失，導致法律上的盲症，這係由合格的醫療保健人員例如眼科醫師和驗光師決定。
視覺功能的示例性測量包括Snellen視力、ETDRS視力、低照度視力、Amsler方格表、Goldmann視野、標準自動視野檢查、微視野檢查(microperimetry)、Pelli-Robson圖表、SKILL卡片、Ishihara色板、Farnsworth D15或D100色彩測試、標準視網膜電描記術、多焦視網膜電描記術、經驗證的閱讀速度測試、面部識別、駕駛模擬和患者報告的滿意度。因此，BCD的治療可以說是藉由獲得或未喪失ETDRS量表上的2或更多行(或10字母)的視力後來達到。此外，在某些方面，BCD的治療可以說是在以下後發生：例如藉由視網膜電描記法測量的視網膜功能喪失的改善或減緩；例如藉由光學相干斷層掃描(OCT)進行測量的視網膜結構進展的改善或減緩；例如藉由在各種光照強度下的迷宮的動態導航喪失的改善或減緩；和/或閱讀速度至少增加10%、20% 或30%，或者閱讀速度沒有降低10%、20%或30%(每分鐘字數)。此外，在一些方面，BCD的治療可以說是在以下情況中發生：受試者顯示Ishihara測試上正確鑒別的板或Farnsworth測試上正確排序的盤的比例至少增加20%或沒有降低20%。因此，BCD的治療可藉由例如改善黑暗適應、改善視力或減緩視力喪失速度來確定。
可能被治療或預防的視網膜解剖結構的不良方面包括，例如，視網膜中脂質的小、黃色或白色晶體狀沈積物的積累、視網膜萎縮、視網膜色素上皮萎縮、視網膜血管變窄、色素結塊和視網膜下液。評估視網膜解剖學的示例性手段包括眼底鏡檢查、眼底照相術、螢光素血管造影、靛青綠血管造影、OCT、譜域光學相干斷層掃描、掃描雷射檢眼鏡檢查、共焦顯微術、自我調整光學、眼底自發螢光、活組織檢查、屍體剖檢和免疫組織化學。因此，如本文所述，本文所述之病毒載體可用於治療受試者的BCD，例如，視網膜萎縮的發生率降低和/或視網膜中黃色或白色晶體狀沈積物的數量和/或大小減少。
BCD的治療還可以藉由例如改善或維持生活品質來確定。技術人員將理解，生活品質可以藉由許多不同的測試來確定，例如，美國國立眼科研究所NEI-VFQ25問卷(National Eye Institute NEI-VFQ25 questionnaire)。
用本發明之治療劑治療之受試者還可以被投與具有治療視網膜營養不良的已知功效的其他治療劑或裝置，例如維生素和礦物質製劑、弱視輔助、導盲犬或其他已知可以說明弱視患者的裝置。
當前，沒有其他批准的BCD治療劑。隨著其他新療法的出現，本發明之組成物和較新的療法可以按臨床指示順序地或同時地依序投與。
以下是本發明之示例性實施方式。
1.一種包含載體基因組之病毒載體，該載體基因組以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(iv)聚腺苷酸化(聚A)訊息序列；以及
(v)3’ITR。
2.如實施方式1所述之病毒載體，其中該載體基因組以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)內含子；
(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(v)聚A訊息序列；以及
(vi)3’ITR。
3.如實施方式1所述之病毒載體，其中該載體基因組以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(iv)調節元件；
(v)聚A訊息序列；以及
(vi)3’ITR。
4.如實施方式1所述之病毒載體，其中該載體基因組以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)內含子；
(iv)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(v)調節元件；
(vi)聚A訊息序列；以及
(vii)3’ITR。
5.如實施方式1至4中任一項所述之病毒載體，其中該載體基因組包含之長度大於或約4.1kb且小於或約4.9kb。
6.如實施方式1至5中任一項所述之病毒載體，其中該載體基因組包含位於聚A訊息序列和3’ITR之間的填充序列。
7.如實施方式6所述之病毒載體，其中該填充序列之長度在約1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、或2,500-3,000個核苷酸之間。
8.如實施方式1至7中任一項所述之病毒載體，其中該5’ITR包含與SEQ ID NO：1具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
9.如實施方式1至8中任一項所述之病毒載體，其中該啟動子係視網膜色素上皮(RPE)-特異性啟動子。
10.如實施方式9所述之病毒載體，其中該啟動子係ProA18啟動子或ProB4啟動子。
11.如實施方式10所述之病毒載體，其中該啟動子包含與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有大於或約90%同一性之核苷酸序列，並促進CYP4V2在RPE細胞中之表現。
12.如實施方式1至11中任一項所述之病毒載體，其中該CYP4V2編碼序列包含與SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、或SEQ ID NO：49具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
13.如實施方式1至12中任一項所述之病毒載體，其中該聚A訊息序列包含牛生長激素或猿猴病毒40聚A核苷酸序列。
14.如實施方式13所述之病毒載體，其中該聚A訊息序列包含與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
15.如實施方式1至14中任一項所述之病毒載體，其中該3’ITR包含與SEQ ID NO：22具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
16.如實施方式2和4中任一項所述之病毒載體，其中該內含子包含人類生長激素、猿猴病毒40、或人類β戈賓內含子序列。
17.如實施方式16所述之病毒載體，其中該內含子包含與SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
18.如實施方式3和4中任一項所述之病毒載體，其中該調節元件包含乙型肝炎病毒或土撥鼠肝炎病毒序列。
19.如實施方式18所述之病毒載體，其中該調節元件包含與SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
20.如實施方式1至19中任一項所述之病毒載體，其中該載體基因組包含位於緊靠包含CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列的上游之科紮克序列。
21.如實施方式20所述之病毒載體，其中該科紮克序列包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53之核苷酸序列。
22.如實施方式1所述之病毒載體，其中該載體基因組以5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；以及
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22。
23.如實施方式2所述之病毒載體，其中該載體基因組以5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；以及
viii)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22。
24.如實施方式3所述之病毒載體，其中該載體基因組以5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；以及
viii)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22。
25.如實施方式4所述之病毒載體，其中該載體基因組以5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
viii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
26.如實施方式1至25中任一項所述之病毒載體，其中該載體包含腺相關病毒(AAV)血清型8、9、2或5衣殼。
27.如實施方式26所述之病毒載體，其中該AAV8衣殼包含分別與SEQ ID NO：24、25和26具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列。
28.如實施方式26所述之病毒載體，其中該AAV8衣殼由與SEQ ID NO：23具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。
29.如實施方式26所述之病毒載體，其中該AAV9衣殼包含分別與SEQ ID NO：28、29和30具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列。
30.如實施方式26所述之病毒載體，其中該AAV9衣殼由與SEQ ID NO：27具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。
31.如實施方式26所述之病毒載體，其中該AAV2衣殼包含分別與SEQ ID NO：32、33和34具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列。
32.如實施方式26所述之病毒載體，其中該AAV2衣殼由與SEQ ID NO：31具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。
33.如實施方式26所述之病毒載體，其中該AAV5衣殼包含分別與SEQ ID NO：36、37和38具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列。
34.如實施方式26所述之病毒載體，其中該AAV5衣殼由與SEQ ID NO：35具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。
35.一種組成物，其包含如前述實施方式中任一項所述之病毒載體。
36.如實施方式35所述之組成物，其中該組成物還包含藥學上可接受的賦形劑。
37.在視網膜細胞中表現異源CYP4V2基因之方法，該方法包括使該視網膜細胞與前述實施方式中任一項所述之病毒載體接觸。
38.如實施方式37所述之方法，其中該視網膜細胞係RPE細胞。
39.一種治療患有Bietti晶體營養不良(BCD)之受試者之方法，該方法包括向該受試者投與有效量的如實施方式36所述之組成物。
40.一種在患有BCD之受試者中改善視力、改善視功能或功能性視力或抑制視功能或功能性視力下降之方法，該方法包括向該受試者投與有效量的如實施方式36所述之組成物。
41.如實施方式36所述之組成物，用於治療患有BCD之受試者。
42.如實施方式36所述之組成物，用於改善患有BCD之受試者的視力。
43.一種包含基因盒的核酸，其中該基因盒以5’至3’方向包含：
(i)5’ITR；
(ii)啟動子；
(iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
(iv)聚A訊息序列；以及
(v)3’ITR。
44.如實施方式43所述之核酸，其中該核酸係質體。
45.如實施方式43所述之核酸，其中該基因盒以5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
46.一種包含載體基因組之病毒載體，該載體基因組包含與包含CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列可操作地連接的啟動子，其中該啟動子係ProA18啟動子。
47.一種包含載體基因組之病毒載體，該載體基因組包含與包含CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列可操作地連接的啟動子，其中該啟動子係ProB4啟動子。
實例
提供以下實例以進一步說明本發明，但不限制本發明之範圍。本發明之其他變型對熟悉該項技術者而言將是顯而易見的，且也為所附申請專利範圍所涵蓋。
實例1：AAV-ITR質體的構建
1.1. AAV-ITR質體的選殖：
各個質體元件之核苷酸序列在表2中描述。該序列係合成的或可商購的。表3描述了所構建的每個質體中存在的元件。使用標準分子生物學選 殖技術生成表3中所述之質體。具有康黴素抗性的質體骨架用作骨架和起始材料。將各個序列元件選殖到限制性酶切位點或使用平末端選殖。
由於質體骨架中包含的抗生素抗性基因盒在AAV載體的生產中不起作用，熟悉該項技術者可以使用替代質體骨架和/或抗生素抗性基因盒並產生相同之病毒載體。
1.2.三重質體轉染以產生rAAV載體：
重組AAV(rAAV)病毒載體係藉由三重轉染方法生成的。三重轉染之方法係本領域已知的(Ferrari等人，Nat Med[自然醫學]3：1295-1297,1997)。簡而言之，將含AAV-ITR的質體(表3中所述)、含AAV-RepCap的質體(攜帶Rep2和Cap8)和腺輔助質體(攜帶輔助完成AAV複製週期的基因)共轉染293細胞。將細胞培養4天。在培養期結束時，裂解細胞，並使用AVB瓊脂糖親和柱(GE健康醫療生命科學公司(GE Healthcare Life Sciences))藉由柱層析法純化培養上清液和細胞裂解物中之載體。技術人員將理解，也可以使用標準的CsCl梯度離心方法(基於Grieger等人，Nat Protoc[自然實驗手冊]1：1412-1428,2006之方法)。
可替代地，可以藉由上述細胞轉染和培養方法產生GMP樣rAAV載體。然後，基於Lock等人，Hum Gene Ther[人類基因治療]21：1259-1271,2010中描述之方法，藉由柱層析法處理收穫的細胞培養物材料；Smith等人，Mol Ther[分子療法]17：1888-1896,2009；和Vandenberghe等人，Hum Gene Ther[人類基因治療]21：1251-1257,2010。
Figure 109106055-A0202-12-0077-23
Figure 109106055-A0202-12-0078-24
Figure 109106055-A0202-12-0079-25
Figure 109106055-A0202-12-0080-26
Figure 109106055-A0202-12-0081-27
Figure 109106055-A0202-12-0082-28
Figure 109106055-A0202-12-0083-29
Figure 109106055-A0202-12-0084-30
實例2：包含hGH內含子、bGH聚A訊息序列和HPRE提供eGFP的增強的表現
設計表現ChR2d-eGFP的AAV8載體，其中包含不同的元件，包括不同的內含子，不同的聚A訊息序列，並帶有或不帶有HPRE，以確定在視網膜中最佳基因表現的最佳組合。
方法
向C57BL/6小鼠視網膜下注射1 x 109vg的AAV8載體，該載體表現融合至eGFP的光敏感通道蛋白(ChR2d-eGFP)並含有不同的元件，例如不同的內含子(例如，hGH內含子和SV40內含子)、聚A訊息序列(例如，bGH聚A訊息序列和SV40聚A訊息序列)以及帶有或不帶有HPRE。四週後，從小鼠身上收穫眼，並一些在4℃下用1ml 4%多聚甲醛(PFA)固定劑固定過夜，然後將其置於磷酸鹽緩衝液(PBS)中。然後用紙巾擦乾該等眼，並轉移到35mm培養皿中。從眼外以及角膜和晶狀體上去除多餘的組織，然後將眼杯浸入1ml PBS中。然後將視網膜從眼杯中移出，將它們都切成翼瓣並固定在載玻片上。使用Zeiss Axio Imager M1螢光顯微鏡和AxioVision軟體獲得eGFP螢光圖像。所有圖像均以2.5倍的放大倍率和相同的曝光時間拍攝。
將其他收穫的眼分成神經視網膜和後眼杯，並冷凍，以使用液滴數字PCR(ddPCR)分析ChR2d-eGFP mRNA表現。簡而言之，使用Qiagen RNeasy Mini套組(kit)從組織樣本中分離出RNA，然後使用賽默飛世爾科技公司的高容量cDNA逆轉錄套組使用200ng RNA生成cDNA。將每個樣本1ng的cDNA添加到ddPCR Supermix中，並將識別eGFP(Mr04097229_mr；賽默飛世爾科技公司(ThermoFisher Scientific))和小鼠Rab7(Mm00784318_sH；賽默飛世爾科技公司(ThermoFisher Scientific))的引物和探針添加到每個反應中。ddPCR 係根據製造商的規程(伯樂公司(Bio-Rad))進行的。將每個樣本的ChR2d-eGFP表現標準化為Rab7對照表現。
結果和結論
構建了五種不同的AAV8載體並視網膜下注射到小鼠中。注射後四週，從小鼠收穫眼，並藉由鋪片和ddPCR檢查ChR2d-eGFP表現。後眼杯的鋪片顯示，在注射含有hGH內含子之載體的眼中，eGFP螢光最高(圖1)。此外，與具有SV40聚A訊息序列的相同載體相比，包含bGH聚A訊息序列顯示出略高的螢光(AAV8-TM078相比於AAV8-TM073)。
為了獲得ChR2d-eGFP表現水平的更定量分析，對從分離的神經視網膜和後眼杯樣本中分離的mRNA進行了ddPCR。結果顯示，在眼後杯中，添加HPRE可以最明顯地增強表現(AAV8-TM075)(圖2A)。而且，與分別包含SV40聚A訊息序列之載體相比，包含bGH聚A訊息序列之載體表現出更高的表現(比較AAV8-TM078與AAV8-TM073，和比較AAV8-TM079與AAV8-TM074)。在神經視網膜中，HPRE的添加再次導致eGFP(AAV8-TM075)的表現水平增強，但是藉由添加bGH聚A訊息序列觀察到最大的表現增加(AAV8-TM078和AAV8-TM079)(圖2B)。
綜上所述，該等結果表明，用於在視網膜中表現基因的最佳表現盒可能包括hGH內含子、bGH聚A訊息序列和HPRE元件。因此，構建了包含一個、兩個或所有三個元件之載體，用於遞送CYP4V2 cDNA，用於治療BCD。
實例3：向Cyp4v3敲除小鼠視網膜下注射AAV-CYP4V2載體防止疾病進展。
Cyp4v3係人類CYP4V2的小鼠直系同源物(82%同一性)。使用CRISPR/Cas9敲除Cyp4v3基因，並向Cyp4v3敲除小鼠注射表現CYP4V2的AAV載體，每隻眼大約1 x 10 9 vg。在注射後的不同時間點，藉由眼底成像和光學相干斷層掃描檢查小鼠，以確定視網膜中存在的晶體沈積物的數量和大小。 此外，對小鼠進行視功能(例如視力，黑暗適應)和功能性視力(例如，流動性測試)評估。與注射對照(AAV-eGFP載體)的眼相比，注射表現CYP4V2之載體的眼顯示出晶體沈積物的數量和/或大小減少和/或視功能和/或功能性視力的改善，證明了CYP4V2在RPE細胞中的成功表現和CYP4V2蛋白功能的恢復。
實例4：向非人靈長類動物視網膜下注射AAV-ProA18或AAV-ProB4載體導致RPE細胞中的基因表現
合成啟動子序列由GENEWIZ化學合成，具有包含MluI/NheI/AscI和BamHI/EcoRI/BglII限制性位點的短側翼。使用合適的限制性位點組合將ProB18和ProB4啟動子序列亞選殖到pAAV-EF1a-CatCh-GFP中替換EF1a或hRO啟動子。藉由銜接子PCR和Clontech In-Fusion套組使用pcDNA3.1(-)-CatCh-GFP構建pAAV-EF1a-CatCh-GFP質體。
使用分支聚乙烯亞胺(聚科學公司(Polysciences))用AAV轉基因質體，編碼用於選定衣殼(BP2)的AAV Rep2和Cap蛋白的AAV輔助質體以及帶有腺病毒基因的pHGT1-Adenol輔助質體共轉染HEK293T細胞。在HEK293T細胞80%匯合的情況下，將一個直徑為15cm的細胞培養皿與質體混合物一起共轉染。將含有在5μml DMEM中的7μg AAV轉基因質體、7μg編碼Rep2和Cap的質體、20μg AAV輔助質體和6.8μM聚乙烯亞胺的細胞轉染混合物在室溫下孵育15min，然後添加到含有10ml DMEM的細胞培養皿。轉染後60h，收集細胞並將其重懸於含有150mM NaCl和20mM Tris-HCl，pH 8.0的緩衝液中。藉由反復的凍融循環裂解細胞，並添加MgCl2使其終濃度為1mM。將質體和基因組DNA藉由在37℃下用250U ml-1的TurboNuclease處理10min去除。藉由在4,000r.p.m下離心30min除去細胞碎片。純化AAV顆粒，並在Millipore Amicon 100 K柱(目錄號UFC910008；默克密理博公司(Merck Millipore))中濃縮。使用蛋白酶K使AAV顆粒變性後，藉由TaqMan逆轉錄PCR對衣殼化的病毒DNA進行定量；滴定度計算為基因組拷貝數/ml。
為了在小鼠中投與AAV，在用2.5%異氟烷麻醉的小鼠上進行眼注射。用鋒利的30-G針在晶狀體附近的鞏膜上做一個小切口，並用一個裝在顯微操縱器中的鈍的5μl漢密爾頓(漢密爾頓公司(Hamilton Company))注射器通過該切口將2μl AAV懸浮液注入視網膜下/玻璃體內間隙。
對於在非人靈長類動物中進行AAV投與，與中國昆明的眼科醫師和第三方承包商合作進行了視網膜下注射50微升的AAV顆粒懸浮液。3個月後，將分離的眼杯在PBS中的4% PFA中固定過夜，接著是在4℃下在PBS中的洗滌步驟。接受固定的眼杯後，解剖感染的視網膜區域，並在室溫下用PBS中的10%正常驢血清(NDS)、1% BSA、0.5% Triton X-100處理1h。在室溫下用在PBS中的3% NDS、1% BSA、0.5%曲通X-100中的單株大鼠抗GFP抗體(分子探針公司(Molecular Probes Inc.)；1：500)和多株山羊抗-ChAT(密理博公司(Millipore)：1：200)處理5天。用驢抗大鼠Alexa Fluor-488二抗(分子探針公司；1：200)、抗山羊Alexa Fluor-633和Hoechst處理2小時。洗滌切片，用ProLong Gold抗褪色試劑(分子探針公司)封固在載玻片上，並使用Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2雷射掃描共聚焦顯微鏡(卡爾．蔡司公司(Carl Zeiss Inc.))拍照。
下表4和5總結了合成的啟動子ProA18和ProB4驅動在小鼠和NHP視網膜細胞中表現的能力。ProA18和ProB4均導致在NHP中的RPE細胞中表現基因。
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Figure 109106055-A0202-12-0089-32
Figure 109106055-A0202-12-0089-33
 MG=米勒神經膠質細胞；C=視錐細胞；s-(作為前綴)=稀少表現；RPE=視網膜色素上皮細胞；BC=雙極細胞
實例5：向食蟹猴視網膜下注射AAV載體，以確定用於靶向RPE細胞的最佳衣殼血清型。
將從CMV啟動子表現GFP的AAV2、AAV6、AAV8和AAV9載體以每眼1 x 1011vg的劑量經視網膜下注射到食蟹猴中。注射後四週，藉由眼底自發螢光成像檢查活體猴子眼睛中的GFP表現，並藉由免疫組織化學檢查收穫後猴子眼睛中的GFP表現。此外，藉由原位雜交評估GFP mRNA和AAV基因組DNA的水平和定位。
測試的所有四種血清型均能促進GFP在感光細胞和RPE細胞中之表現。在注射部位附近觀察到表現，其中以不同程度擴散到周圍區域。對於任何測試的血清型，在視神經或腦切片中均未檢測到GFP表現。
實例6：向食蟹猴視網膜下注射AAV載體，以確定用於RPE特異性表現的最佳啟動子。
將從RPE特異性啟動子表現GFP的AAV載體以每眼1 x 1011vg的劑量經視網膜下注射到食蟹猴中。該RPE特異性啟動子包括ProA18和ProB4。注射後四週，藉由眼底自發螢光成像檢查活體猴子眼睛中的GFP表現，並藉由免疫組織化學檢查收穫後猴子眼睛中的GFP表現。此外，藉由原位雜交評估GFP mRNA和AAV基因組DNA的水平和定位。兩種不同的啟動子都顯示RPE特異性的GFP表現，但表現水平是可變的。
實例7：人類視網膜組織中AAV驅動的基因表現
人視網膜組織係由去核的人眼球製備的，用細剪刀將視網膜與人眼球切開。將從RPE特異性啟動子表現GFP的AAV載體與人視網膜組織一起孵育。該RPE特異性啟動子包括ProA18和ProB4。病毒投與後6-8週檢查AAV誘導的GFP表現。注射後六週，藉由免疫螢光和成像檢查人視網膜組織中的GFP表現。兩種不同的啟動子均顯示RPE特異性GFP表現。
實例8：在NHP和人體組織中在ProA18或ProB4啟動子下的AAV驅動的CYP4V2表現
如實例7所述，將在ProA18或ProB4啟動子下表現人CYP4V2的AAV載體(「AAV-ProA18-CYP4V2載體」或「AAV-ProB4-CYP4V2載體」)與人視網膜組織一起孵育。病毒投與後6-8週檢查CYP4V2基因表現。注射後六週，在人視網膜組織中檢測到CYP4V2表現。
AAV-ProA18-CYP4V2或AAV-ProB4-CYP4V2載體以每眼1 x 1011vg的劑量經視網膜下注射到食蟹猴中。注射後4週，藉由免疫組織化學檢查收穫後猴眼中CYP4V2之表現。此外，藉由原位雜交評估CYP4V2 mRNA和 AAV基因組DNA的水平和定位。ProA18和ProB4啟動子在猴眼中誘導CYP4V2基因的RPE特異性表現。
已經詳細描述了本揭露，將顯而易見的是，在不脫離如本文和所附申請專利範圍中所描述的本揭露的精神和範圍的情況下，修改、變化和等同方面係可能的。此外，應當理解，本揭露中的所有實例均作為非限制性實例提供。本文引用的任何參考文獻，包括例如所有專利，公開的專利申請和非專利出版物，均藉由引用全文併入。
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> ProA18啟動子
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<213> 人工序列
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<223> ProB4啟動子
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 猿猴病毒40
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 未知
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<223> 科紮克序列
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 密碼子優化的CYP4V2序列
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 乙型肝炎病毒
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<212> DNA
<213> 土撥鼠肝炎病毒
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<212> DNA
<213> 牛
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<212> DNA
<213> 猿猴病毒40
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<210> 20
<211> 2454
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 突觸核蛋白內含子序列作為填充序列
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<212> DNA
<213> 未知
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<223> RLBP1內含子序列作為填充序列
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<212> PRT
<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<213> 腺相關病毒
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<212> PRT
<213> 腺相關病毒
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<212> PRT
<213> 腺相關病毒
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<213> 獼猴
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<213> 獼猴
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<212> DNA
<213> 牛
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<212> PRT
<213> 牛
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<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 43
Figure 109106055-A0202-12-0147-125
Figure 109106055-A0202-12-0148-126
<210> 44
<211> 525
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 44
Figure 109106055-A0202-12-0148-127
Figure 109106055-A0202-12-0149-128
Figure 109106055-A0202-12-0150-129
<210> 45
<211> 1578
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 45
Figure 109106055-A0202-12-0150-130
Figure 109106055-A0202-12-0151-131
<210> 46
<211> 525
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 46
Figure 109106055-A0202-12-0151-132
Figure 109106055-A0202-12-0152-133
Figure 109106055-A0202-12-0153-134
<210> 47
<211> 1593
<212> DNA
<213> 原雞
<400> 47
Figure 109106055-A0202-12-0153-136
<210> 48
<211> 530
<212> PRT
<213> 原雞
<400> 48
Figure 109106055-A0202-12-0154-137
Figure 109106055-A0202-12-0155-138
<210> 49
<211> 1134
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 49
Figure 109106055-A0202-12-0156-139
<210> 50
<211> 377
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 50
Figure 109106055-A0202-12-0156-140
Figure 109106055-A0202-12-0157-141
<210> 51
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 科紮克序列
<400> 51
Figure 109106055-A0202-12-0158-143
<210> 52
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 科紮克序列
<400> 52
Figure 109106055-A0202-12-0158-144
<210> 53
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 科紮克序列
<400> 53
Figure 109106055-A0202-12-0158-145
<210> 54
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> δ ITR
<400> 54
Figure 109106055-A0202-12-0158-146

Claims (20)

  1. 一種包含載體基因組之病毒載體，該載體基因組以5’至3’方向包含：
    (i)5’ITR；
    (ii)啟動子；
    (iii)重組核苷酸序列，其包含CYP4V2編碼序列；
    (iv)聚腺苷酸化(聚A)訊息序列；以及
    (v)3’ITR。
  2. 如請求項1所述之病毒載體，其中該啟動子是視網膜色素上皮(RPE)-特異性啟動子。
  3. 如請求項1或2所述之病毒載體，其中該啟動子是ProA18啟動子。
  4. 如請求項1或2所述之病毒載體，其中該啟動子包含與SEQ ID NO：2具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
  5. 如請求項1或2所述之病毒載體，其中該啟動子是ProB4啟動子。
  6. 如請求項1或2所述之病毒載體，其中該啟動子包含與SEQ ID NO：3具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之病毒載體，其中該載體基因組包含位於聚A訊息序列和3’ITR之間的填充序列。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之病毒載體，其中該5’ITR包含與SEQ ID NO：1具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之病毒載體，其中該CYP4V2編碼序列包含與SEQ ID NO：13、14、39、41、43、45、47、或49具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之病毒載體，其中該聚A訊號包含與SEQ ID NO：18或19具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之病毒載體，該病毒載體還包含內含子序列，該內含子序列包含與SEQ ID NO：9、10或11具有大於或約90%同一性之核苷酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之病毒載體，該病毒載體還包含1)調節元件，該調節元件包含乙型肝炎病毒或土撥鼠肝炎病毒序列和/或2)位於緊靠包含該CYP4V2編碼序列的重組核苷酸序列的上游的科紮克序列。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之病毒載體，其中該載體基因組以5’至3’方向包含選自由以下組成之群組之核苷酸序列：
    i)SEQ ID NO：1、2、13、18和22；
    ii)SEQ ID NO：1、3、13、18和22；
    iii)SEQ ID NO：1、2、14、18和22；
    iv)SEQ ID NO：1、3、14、18和22；
    v)SEQ ID NO：1、2、13、19和22；
    vi)SEQ ID NO：1、3、13、19和22；
    vii)SEQ ID NO：1、2、14、19和22；
    viii)SEQ ID NO：1、3、14、19和22；
    ix)SEQ ID NO：1、2、9、13、18和22；
    x)SEQ ID NO：1、3、9、13、18和22；
    xi)SEQ ID NO：1、2、9、14、18和22；
    xii)SEQ ID NO：1、3、9、14、18和22；
    xiii)SEQ ID NO：1、2、9、13、19和22；
    xiv)SEQ ID NO：1、3、9、13、19和22；
    xv)SEQ ID NO：1、2、9、14、19和22；
    xvi)SEQ ID NO：1、3、9、14、19和22；
    xvii)SEQ ID NO：1、2、13、16、18和22；
    xviii)SEQ ID NO：1、3、13、16、18和22；
    xix)SEQ ID NO：1、2、14、16、18和22；
    xx)SEQ ID NO：1、3、14、16、18和22；
    xxi)SEQ ID NO：1、2、13、16、19和22；
    xxii)SEQ ID NO：1、3、13、16、19和22；
    xxiii)SEQ ID NO：1、2、14、16、19和22；
    xxiv)SEQ ID NO：1、3、14、16、19和22；
    xxv)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、18和22；
    xxvi)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、18和22；
    xxvii)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、18和22；
    xxviii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、18和22；
    xxix)SEQ ID NO：1、2、9、13、16、19和22；
    xxx)SEQ ID NO：1、3、9、13、16、19和22；
    xxxi)SEQ ID NO：1、2、9、14、16、19和22；以及
    xxxii)SEQ ID NO：1、3、9、14、16、19和22。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之病毒載體，該病毒載體還包含腺相關病毒(AAV)血清型8、9、2或5衣殼。
  15. 如請求項14所述之病毒載體，該病毒載體還包含1)AAV9衣殼，該衣殼包含分別與SEQ ID NO：28、29和30具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列；或2)AAV9衣殼，該衣殼由與SEQ ID NO：27具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。
  16. 如請求項14所述之病毒載體，該病毒載體還包含1)AAV8衣殼，該衣殼包含分別與SEQ ID NO：24、25和26具有大於或約90%同一性之VP1、VP2和VP3胺基酸序列；或2)AAV8衣殼，該衣殼由與SEQ ID NO：23具有大於或約90%同一性之核苷酸序列編碼。
  17. 一種組成物，該組成物包含如請求項1至16中任一項所述之病毒載體。
  18. 如請求項1至16中任一項所述之病毒載體在製造用於在視網膜細胞中表現異源CYP4V2基因的藥物中之用途。
  19. 如請求項17所述之組成物在製造用於治療患有Bietti晶體營養不良(BCD)的受試者之藥物中之用途。
  20. 如請求項17所述之組成物在製造藥物中之用途，該藥物用於在患有BCD之受試者中改善視力、改善視功能或功能性視力或抑制視功能或功能性視力下降。
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