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TW201934582A - 抗pd-1/抗her2天然抗體結構樣異源二聚體形式雙特異抗體及其製備 - Google Patents

抗pd-1/抗her2天然抗體結構樣異源二聚體形式雙特異抗體及其製備 Download PDF

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Abstract

本發明涉及抗PD-1/抗HER2天然抗體結構樣異源二聚體形式雙特異抗體及其製備。具體而言，本發明提供了一種具有天然IgG特點、並且沒有重輕鏈錯配的高度穩定的異源二聚體形式的抗PD-1/抗HER2雙特異抗體及其製備方法。該雙特異抗體能同時結合兩種靶分子並且在治療複雜疾病方面會更有效。

Description

抗PD-1/抗HER2天然抗體結構樣異源二聚體形式雙特異抗體及其製備
發明領域
本發明涉及抗PD-1/抗HER2天然抗體結構樣異源二聚體形式雙特異抗體及其製備。具體而言，本發明提供了一種具有天然IgG特點、並且沒有重輕鏈錯配的高度穩定的異源二聚體形式的抗PD-1/抗HER2雙特異抗體及其製備方法。
發明背景
單克隆抗體是只作用於單一抗原表位的高度特異性抗體，已被廣泛用於許多疾病的治療，例如，癌症、炎症和自身免疫性疾病、感染性疾病。但是，此類治療分子如果單獨使用，沒有一種能夠顯示出足夠的藥效，這是由於疾病的複雜性，如癌症或炎症性疾病通常涉及多種疾病介導的分子通路以及信號通路之間的相叉作用。在這些情況下，靶向單一的分子不能提供最佳的治療效果，而同時阻斷多個靶點或者同一靶點的多個位點的分子能夠改善治療效果。同時，使用多特異性如雙特異性分子的雙靶向治療可以簡化新藥開發過程，因為它是單一分子。和使用多個單特異分子的聯合用藥相比，對於患者和醫療工作者都是更方便的。
許多不同形式的雙特異抗體或雙功能分子在該領域已被報導。最初的雙特異抗體是應用化學方法使用雙功能偶聯試劑將兩個現有的IgG分子、Fab’或(Fab’)2片段連接起來。但是，這種化學偶聯的雙特異抗體存在很多的局限性，例如生產的工作強度，純化異源偶聯物、去除同源偶聯物及原單特異抗體或片段的複雜性和低收率。
用於產生雙特異性抗體的另一種方法是使用雜種-雜交瘤(或四源雜交瘤)技術，其是通過體細胞融合兩種分泌不同抗體的雜交瘤細胞系而生產的。由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機配對，僅有抗體混合物的1/10是所需要的功能性雙特異性抗體，這使純化過程複雜並使生產收率減少。
WO2013060867描述了一種大規模生產異二聚體雙特異抗體的方法，該方法先還原兩種混合的同源二聚體形式抗體，然後通過在這兩種同源二聚體抗體的CH3區引入不對稱氨基酸突變從而促使不同抗體的Fab臂發生交換，最後通過氧化鉸鏈區的鏈間二硫鍵形成穩定的雙特異抗體。
WO2009089004描述了一種製備異源二聚體蛋白的方法，該方法通過突變CH3-CH3介面處的氨基酸為帶電荷氨基酸，從而通過靜電作用力促進異源二聚體形成，而不利於同源二聚體形成。
US5731168描述了一種利用“杵－臼”策略來製備異源二聚體IgG的方法。該方法將第一條鏈CH3區介面處的小氨基酸替換成大氨基酸，從而形成“杵”；同時將第二條鏈上CH3介面處相應的大氨基酸突變成小氨基酸，從而形成“臼”。杵和臼的相互作用有利於異源二聚體IgG的形成，而不利於同源二聚體的形成。
WO2012058768描述了一種穩定的和高特異的異源二聚體IgG製備方法。該方法組合採用陰性和陽性設計以及結構和電腦模型指導的蛋白工程技術來突變IgG1 CH3結構域的多個氨基酸，從而形成穩定的並且同源二聚體雜質含量低的異源二聚體IgG。
程式性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)是近期炙手可熱的免疫檢查點(immune checkpoint)，主要參與T細胞的活化調控，可以調節免疫應答的強弱程度和持續時間。在正常情況下，PD-1可以介導和維持機體組織的自身免疫耐受，防止在炎症反應過程中免疫系統過度活化傷害自身組織，對避免自身免疫性疾病的發生具有積極作用；在病理情況下，其參與腫瘤免疫以及多種自身免疫病的發生發展過程(Anticancer Agents Med Chem. 2015;15(3):307-13. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2014 Mar;7(1):1-17. Trends Mol Med. 2015 Jan;21(1):24-33. Immunity. 2013 Jul 25;39(1):61-73. J Clin Oncol. 2015 Jun 10;33(17):1974-82.)。
PD-1屬於CD28家族成員，但不同於CD28家族其它成員如CTLA4能以二硫鍵形成共價二聚體，PD-1以單體形式存在。PD-1的結構主要包括胞外免疫球蛋白可變區樣結構域、疏水的跨膜區和胞內區，其胞內區含有兩個獨立的磷酸化作用位點，分別為免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受體酪氨酸轉移基序(ITSM)。PD-1主要誘導性表達於活化的T細胞表面，也表達於B細胞、NK細胞、單核細胞、DC細胞。PD-1的配體包括PD-L1(programmed death ligand 1)、PD-L2 (programmed death ligand 2)，其配體屬於B7家族，其中PD-L1誘導性表達於多種免疫細胞表面包括T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、DC細胞、以及內皮細胞、表皮細胞等，而PD-L2僅誘導性表達於一些免疫細胞，包括巨噬細胞、DC細胞、B細胞(Autoimmun Rev, 2013, 12(11): 1091-1100. Front Immunol, 2013, 4: 481. Nat Rev Cancer, 2012, 12(4): 252-264. Trends Mol Med. 2015 Jan;21(1):24-33.)。
在二十世紀80年代，Denis Slamon首次在189個原發性乳腺癌病例中發現HER2(人表皮生長因子受體2)基因在30%的病例中都過度擴增，並表明HER2與總存活率及復發時間密切相關 (Salman DJ, 等人，Science, 235:177-182, 1985)。目前的研究表明，大約25~30%的乳腺癌病人中的HER2都是過表達的 (Revillion F, 等人，Eur J Cancer, 34:791-808, 1998)，並且其與腫瘤的惡性生長程度相關 (Wright C, 等人，Cancer Res, 49:2087-2090, 1989)。
曲妥珠單抗(Trastuzumab)是一個抗HER2胞外區的人源化單克隆抗體 (Carter P, 等人，PNAS, 89(10):4285-4289, 1992)。然而其在臨床應用中的抗腫瘤效果往往沒有臨床前實驗那麼好，所以通常需要與化療藥等聯合用藥 (Slamon DJ, 等人，N Engl J Med, 344:783-792, 2001)。
設計一種可以募集效應細胞的雙功能抗體是提高抗體效能的有效手段。目前為止，研究最多的是利用CD3分子的功能。通過CD3分子將殺傷性T細胞啟動，可以有效地清除目的腫瘤 (Haas C, 等人，Immunobiology, 214: 441-453, 2009)。其中Micormet公司開發的一種重組雙功能T細胞激動抗體為BiTE，具有很好的前景，但是其最大的問題在於血漿半衰期非常短，人體半衰期僅為1小時(Loffler A, 等人，Blood, 95: 2098-2103)。這是由BiTE本身的結構所導致的，其由兩個單鏈抗體片段組成，分子量僅60kDa，並且缺失了抗體分子中對延長半衰期有重要作用的Fc片段。
卡妥索單抗(Catumaxomab)是另一種具有前景的多功能抗體，是一種靶向CD3及EpCAM的雜合Ig分子，目前該產品已經被批准用於腹水癌的治療 (Jager M, 等人，Cancer Res, 72:24-32, 2012)。另一種處於臨床二期的多功能抗體為厄妥索單抗(Ertumaxomab)，其靶向CD3及HER2。這種雜合抗體的一條重鏈及輕鏈來源於大鼠的IgG，靶向CD3；另一條重鏈及輕鏈來源於小鼠的IgG，靶向HER2。由此而帶來的問題就是這種產品的生產非常困難，因為，為了獲得表達雙功能厄妥索抗體的細胞系，首先要獲得一株表達CD3抗體的二倍體雜交瘤，以及一株表達HER2抗體的二倍體雜交瘤，然後將兩株雜交瘤再次雜交，獲得四倍體雜交瘤，其可以表達抗CD3以及HER2的雙功能抗體。而生產普通的單個靶點的抗體，只需要獲得一株二倍體雜交瘤，與此相比較，雙功能抗體的生產過程更複雜，而且四倍體雜交瘤的獲得更加困難，並且由於其鼠源的來源，導致其免疫原性很高。
另外，由於抗CD3的抗體最明顯的副反應是導致體內的細胞因子在短時間內增高，也稱為細胞因子風暴。因此需要開發一種新的將免疫細胞招募至腫瘤細胞的雙功能抗體。
聯合給藥需要依次注射兩種或多種抗體，或將抗體做成同一種劑型。然而，一方面，依次注射抗體會降低患者的治療依從性，並增加疼痛。另一方面，由於不同抗體的物化性質存在差異，很難或幾乎不太可能將不同抗體做成同一種劑型。
鑒於此，仍然有必要研究一種同時阻斷PD-1和HER2信號通路的新型治療藥物。
發明概要
本發明提供了一種新的具有天然IgG結構特點、並且沒有重輕鏈錯配的高度穩定的異源二聚體形式的能同時阻斷PD-1和HER2的雙功能抗體及其製備方法，該雙功能抗體傾向於選擇性結合同時高表達PD-1和HER2的腫瘤細胞，從而發揮高效、特異的殺傷效果，同時具有較低的毒副作用。
本發明的第一方面涉及一種異源二聚體形式的雙特異抗體，其包含能與PD-1特異性結合的第一個抗原結合功能區和能與HER2特異性結合的第二個抗原結合功能區，其中所述雙特異抗體包含通過一個或多個二硫鍵鏈間連接的第一Fc鏈及第二Fc鏈，該第一Fc鏈和第二Fc鏈通過共價鍵或連接體分別連接到PD-1抗原結合功能區和HER2抗原結合功能區上，或者該第一Fc鏈和第二Fc鏈通過共價鍵或連接體分別連接到HER2抗原結合功能區和PD-1抗原結合功能區上；其中PD-1抗原結合功能區中的免疫球蛋白輕鏈可變區氨基酸序列選自SEQ ID NO.10，PD-1抗原結合功能區中的免疫球蛋白重鏈可變區氨基酸序列選自SEQ ID NO.12，並且第一Fc鏈和第二Fc鏈在如下位置包含5個氨基酸的替換：
第一Fc鏈上366位及399位氨基酸替換，第二Fc鏈上351位、407位及409位氨基酸的替換，
包含上述氨基酸替換的第一Fc鏈與第二Fc鏈更傾向於互相形成異源二聚體而不傾向於各自形成同源二聚體，
其中氨基酸位置根據Kabat EU指數編號系統編號。
在一些實施方案中，第一Fc鏈及第二Fc鏈氨基酸替換如下，
a)L351G、L351Y、L351V、L351P、L351D、L351E、L351K或L351W；
b)T366L、T366P、T366W或T366V；
c)D399C、D399N、D399I、D399G、D399R、D399T或D399A；
d)Y407L、Y407A、Y407P、Y407F、Y407T或Y407H；和
e)K409C、K409P、K409S、K409F、K409V、K409Q或K409R。
在一些實施方案中，氨基酸替換包括：
a)第一Fc鏈T366L及D399R替換，第二Fc鏈L351E、Y407L及K409V替換；
b)第一Fc鏈T366L及D399C替換，第二Fc鏈L351G、Y407L及K409C替換；
c)第一Fc鏈T366L及D399C替換，第二Fc鏈L351Y、Y407A及K409P替換；
d)第一Fc鏈T366P及D399N替換，第二Fc鏈L351V、Y407P及K409S替換；
e)第一Fc鏈T366W及D399G替換，第二Fc鏈L351D、Y407P及K409S替換；
f)第一Fc鏈T366P及D399I替換，第二Fc鏈L351P、Y407F及K409F替換；
g)第一Fc鏈T366V及D399T替換，第二Fc鏈L351K、Y407T及K409Q替換；
h)第一Fc鏈T366L及D399A替換，第二Fc鏈L351W、Y407H及K409R替換。
在一些實施方案中，第一Fc鏈的氨基酸替換為T366L和D399R，第二Fc鏈的氨基酸替換為L351E、Y407L和K409V。
在一些實施方案中，Fc鏈來源於IgG。
在一些實施方案中，PD-1和HER2抗原結合功能區是Fab片段或scFv片段。
在一些實施方案中，PD-1和HER2抗原結合功能區都是Fab片段。
在一些實施方案中，PD-1和HER2抗原結合功能區一個是Fab片段，另一個是scFv。
在一些實施方案中，Fab片段包含不同的第一重鏈可變區及第二重鏈可變區，以及不同的第一輕鏈可變區及第二輕鏈可變區。
在一些實施方案中，第一Fc鏈及其相連接的PD-1抗原結合功能區和第二Fc鏈及其相連接的HER2抗原結合功能區，或者第一Fc鏈及其相連接的HER2抗原結合功能區和第二Fc鏈及其相連接的PD-1抗原結合功能區，在單獨存在並且同時存在還原劑時其形成同源二聚體的重量比例均低於50%。
在一些實施方案中，雙特異抗體的氨基酸序列選自：SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12和14。在一些實施方案中，雙特異抗體的氨基酸序列是SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12和14的相應組合。
本發明的第二方面涉及一種分離的多核苷酸，其編碼如第一方面所述的異源二聚體形式的雙特異抗體。
在一些實施方案中，多核苷酸的序列選自：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11和13。在一些實施方案中，多核苷酸的序列是SEQ ID NO. 1、3、5、7、9、11和13的相應組合。
本發明的第三方面涉及一種重組表達載體，其包含第二方面所述的分離的多核苷酸。
在一些實施方案中，表達載體為基於pCDNA改造得到的質粒載體X0GC。
本發明的第四方面涉及一種宿主細胞，其包含第二方面所述的分離的多核苷酸，或第三方面所述的重組表達載體。
在一些實施方案中，宿主細胞選自人胚腎細胞HEK293或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E；倉鼠卵巢細胞CHO或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO。
本發明的第五方面涉及一種組合物，其包含第一方面所述的異源二聚體形式的雙特異抗體或第二方面所述的分離的多核苷酸或第三方面所述的重組表達載體或第四方面所述的宿主細胞，及藥學上可接受的載體。
本發明的第六方面涉及一種生產如第一方面所述的異源二聚體形式的雙特異抗體的方法，其包括步驟：
1)將第二方面所述的分離的多核苷酸或第三方面所述的重組表達載體分別在宿主細胞中進行表達；
2)將在宿主細胞中分別表達的蛋白進行還原；以及
3)將還原的蛋白混合，然後將混合物進行氧化。
在一些實施方案中，宿主細胞選自人胚腎細胞HEK293或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293F；倉鼠卵巢細胞CHO或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr- 、CHO/DG44、ExpiCHO。
在一些實施方案中，還原步驟包括：1)進行還原反應，所述還原劑選自：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦或其化學衍生物，或者其組合；2)去除還原劑。
在一些實施方案中，氧化步驟為在空氣中氧化，也包括在氧化劑存在下進行氧化反應，所述氧化劑選自：L-脫氫抗壞血酸或其他化學衍生物。
在一些實施方案中，所述的方法還包括分離純化的步驟。
本發明的第七方面涉及第一方面所述的異源二聚體形式的雙特異抗體和/或第二方面所述的分離的多核苷酸和/或第三方面所述的重組表達載體和/或第四方面所述的宿主細胞和/或第五方面所述的組合物在製備用於預防和/或治療受試者疾病的藥物中的用途。
本發明的第八方面涉及第一方面所述的異源二聚體形式的雙特異抗體和/或第二方面所述的分離的多核苷酸和/或第三方面所述的重組表達載體和/或第四方面所述的宿主細胞和/或第五方面所述的組合物，其用做用於預防和/或治療受試者疾病的藥物。
本發明的第九方面涉及一種預防和/或治療疾病的方法，包括將第一方面所述的異源二聚體形式的雙特異抗體和/或第二方面所述的分離的多核苷酸和/或第三方面所述的重組表達載體和/或第四方面所述的宿主細胞和/或第五方面所述的組合物施予有需求的受試者。
在一些實施方案中，受試者是哺乳動物，優選地，人類受試者。
在一些實施方案中，所述疾病選自如下腫瘤：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。
本發明設計了一種全新的抗PD-1/抗HER2天然抗體結構樣異源二聚體形式雙特異抗體，其具有天然IgG特點，並且沒有重輕鏈錯配，是高度穩定的異源二聚體形式的抗PD-1/抗HER2雙特異抗體。該雙特異抗體能同時結合兩種靶分子PD-1和HER2並且在治療複雜疾病方面會更有效。
定義：
共價連接是指異源二聚體形式的雙特異抗體中，兩個Fc鏈之間，任一個Fc鏈及與其相連接的抗原結合功能區之間，是通過共價鍵而連接成為一個分子。其中Fc鏈包含通過一個或多個通過共價連接(如二硫鍵鏈)而連接的第一抗原結合功能區及第二抗原結合功能區；該第一Fc鏈及第二Fc鏈分別通過共價連接(如亞胺鍵或醯胺鍵)而連接到一個抗原結合功能區上；
抗原結合功能區是指可以與目標分子如抗原發生特異性相互作用的區域，其作用具有高度選擇性，識別一種目標分子的序列通常不能識別其他分子序列。代表性的抗原結合功能區包括：抗體的可變區、抗體可變區的結構變構體、受體的結合域、配體結合域或酶結合域。
一個或多個二硫鍵鏈間連接是指第一Fc鏈及第二Fc鏈通過一個或多個二硫鍵鏈間連接，形成異源二聚體片段。在本發明中，一個或多個二硫鍵的形成可以是第一Fc鏈及第二Fc鏈或者第一Fc鏈及第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區在同一個細胞內合成時形成，也可以是第一Fc鏈及第二Fc鏈或者第一Fc鏈及第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區在不同細胞內分別合成，之後通過體外還原氧化的方法形成。
第一Fc鏈及第二Fc鏈是指通過共價連接而組成結合片段，共價連接包括二硫鍵，每條鏈至少包含免疫球蛋白重鏈恒定區的一部分；並且該第一Fc鏈及第二Fc鏈在氨基酸序列上是不同的，至少包括了一位氨基酸的不同。在此發明中的第一Fc鏈及第二Fc鏈，相同鏈之間存在強烈的相互排斥作用，而不同鏈之間存在吸引作用，因此當在細胞內共同表達時，第一Fc鏈及第二Fc鏈，或者第一Fc鏈及第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區，更傾向於形成異源二聚體。將第一Fc鏈及第二Fc鏈，或者第一Fc鏈及第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區分別在兩個宿主細胞內表達時，第一Fc鏈或者第一Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區不傾向於形成同源二聚體，第二Fc鏈或者第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區不傾向於形成同源二聚體。在本發明中，當第一Fc鏈及第二Fc鏈，或者第一Fc鏈及第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區分別在兩個宿主細胞內表達時，並且在存在還原劑時，同源二聚體的比例低於50%，即單體(一條Fc鏈或者一條Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區)比例大於50%。
免疫球蛋白是具有四條多肽鏈的對稱結構，其中兩條較長、相對分子量較大的相同的重鏈，含450~550個氨基酸殘基，相對分子質量在55000~70000Da之間；兩條較短、相對分子量較小的相同的輕鏈(L鏈)，含約210個氨基酸殘基，相對分子質量約24000Da。不同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈在靠近N端的約110個氨基酸的序列變化很大，稱為可變區(variable region，V區)，而靠近C端的其餘氨基酸序列相對穩定，稱為恒定區(constant region，C區)。重鏈中可變區約占重鏈長度的1/4，恒定區約占重鏈長度的3/4。對於已知五種Ig來說，IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、IgM(μ)和IgE(ε)，其中前三類Ig的H鏈內有三個恒定區，即CH1、CH2和CH3組成。後兩類(IgM和IgE)的H鏈中有一個VH區和四個恒定區，即CH1至CH4。恒定區既是免疫球蛋白分子的骨架，又是啟動免疫反應的部位之一。
本發明中的恒定區一部分至少包括了第一Fc鏈和第二Fc鏈相互作用的區域，該區域對於IgG來說，是位於CH3區域的一部分氨基酸，至少包括GLN347、TYR349、THR 350、LEU 351、SER 354、ARG 355、ASP 356、GLU 357、LYS 360、SER 364、THR 366、LEU 368、LYS 370、ASN390、LYS392、THR394、PRO395、VAL 397、ASP399、SER400、PHE405、TYR407、LYS409、LYS439。
第一Fc鏈及第二Fc鏈分別通過共價鍵或連接體連接到一個抗原結合功能區上是指第一Fc鏈及第二Fc鏈分別通過共價鍵或連接體連接到一個抗體的抗原結合片段，或可以識別抗原的單鏈抗體，或可以識別抗原的其他抗體片段變構體，或可以識別配體的受體，或可以識別受體的配體，其中所述共價鍵是指是化學鍵的一種，兩個或多個原子共同使用它們的外層電子，在理想情況下達到電子飽和的狀態，由此組成比較穩定的化學結構叫做共價鍵，或者說共價鍵是原子間通過共用電子對所形成的相互作用。同一種的元素的原子或不同元素的都可以通過共價鍵結合，對於本發明的第一Fc鏈及第二Fc鏈間的共價鍵，包括但不限於一分子氨基酸的氨基與另一分子氨基酸的羧基脫水反應形成的醯胺鍵，或者乙二醇或聚乙二醇或其他化合物或其多聚物的醛基與一分子氨基酸的氨基形成醯胺鍵或亞胺鍵，其中連接體是可以將兩條多肽鏈通過共價鍵連接起來的一段氨基酸序列或者一種化合物或者一種化合物的多聚體，其中一段氨基酸序列包括但不限於一段小肽，如GGGGSGGGGSGGGGS，通過醯胺鍵將第一Fc鏈或第二Fc鏈，以及可以識別抗原的單鏈抗體，或可以識別抗原的其他抗體片段結構變構體連接起來。
第一Fc鏈與第二Fc鏈更傾向於形成異源二聚體而不傾向於各自形成同源二聚體是指，由於在第一Fc鏈與第二Fc鏈中，相同的多肽鏈間存在互相排斥的作用，而不同的多肽鏈間存在吸引作用，因此當在細胞內共同表達時，第一Fc鏈及第二Fc鏈，或者第一Fc鏈及第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區，更傾向於形成異源二聚體。將第一Fc鏈及第二Fc鏈，或者第一Fc鏈及第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區分別在兩個宿主細胞內表達時，第一Fc鏈或者第一Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區不傾向於形成同源二聚體，第二Fc鏈或者第二Fc鏈及其相連接的抗原結合功能區不傾向於形成同源二聚體。
Kabat EU指數編號系統是指，Kabat利用一種方法將一個編號指定給抗體序列的每個氨基酸並且這種指定每個殘基的編號的方法已經成為本領域的標準方法。Kabat方案可以延伸到不存在於他的研究中的其它抗體，基於保守的氨基酸，將目標抗體與Kabat鑒定的共有序列之一進行比對。
Fc結構域是指可結晶段(fragment crystallizable,Fc)，相當於Ig的CH2和CH3結構域，是Ig與效應分子或者細胞相互作用的部位。
IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的縮寫，是血清主要的抗體成分，根據IgG分子中的r鏈抗原性差異，人IgG有四個亞型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
半抗體分子是指抗體的一條重鏈與一條輕鏈形成的結構，其中重鏈與輕鏈間可以通過共價鍵連接，也可以不通過共價鍵連接，是一種識別抗原的單價抗體結構。
Fab片段是一種分子識別序列，是抗原結合片段(fragment of antigen binding,Fab)，相當於抗體分子的兩個臂，由一個完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1結構域組成。scFv是一種分子識別序列，是一種由抗體的輕鏈可變區與重鏈可變區通過基因工程改造而得到的抗體片段的結構異構體。膜受體的細胞外區是一種分子識別序列，膜受體通常包括位於細胞外部的可以識別並結合相應抗原或者配體的細胞外區域，將受體錨定在細胞表面的跨膜區，以及在胞內的具有激酶活性或者可以傳遞信號通路的胞內區。細胞膜受體的配體是指能被膜受體胞外區識別並結合的蛋白質，小肽或化合物。細胞因子是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞產生的低分子量可溶性蛋白質，具有調節固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長、APSC多能細胞以及損傷組織修復等多種功能。細胞因子可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。蛋白表達標籤指在目標蛋白的N端或C端加入的一段氨基酸序列，可以是小肽也可以是長的氨基酸，標籤的加入可以有利於蛋白質的正確折疊，可以有利於蛋白質的分離純化，可以有利於降低蛋白質在胞內的降解，常用的標籤包括但不限於HA、SUMO、His、GST、GFP、Flag。
可應用於本發明的異源二聚體形式的雙特性抗體中的抗體並無任何限制。優選地，現有技術中已知可以用於治療和/或預防疾病的抗體均可以用於本發明。
本發明的異源二聚體形式的雙特性抗體可具有一個或多個替換、缺失、添加和/或插入。例如，某些氨基酸可以替換在蛋白質結構中的其它氨基酸而沒有明顯損失與其它多肽(如抗原)或細胞結合的能力。由於結合能力和蛋白性質決定了蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列上進行某些氨基酸序列的替換而不會明顯損失它們的生物效用或活性。
在許多情況中，多肽變體含有一個或多個保守替換。“保守替換”是指其中氨基酸被其它具有類似性質的氨基酸所替換，使得肽化學領域中技術人員可預期多肽的二級結構和親水性質基本上不發生變化。
氨基酸替換通常是基於氨基酸側鏈取代基的相對相似性，如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮了各種前述特徵的示例性替換是本領域技術人員公知的並包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
本發明使用的術語“同一性”具有本領域通常已知的含義，本領域技術人員也熟知測定不同序列間同一性的規則、標準，是指在序列比對和引入缺口(如果必要的話，以獲得最大百分比同源性)後，多核苷酸或多肽序列變體的殘基與非變體序列的相同的百分比。。在本發明中，在滿足同一性限定的情況下，還需要所獲得的變體序列具有母體序列所具有的生物活性。本領域技術人員公知如何利用上述活性篩選變體序列的方法和手段。本領域技術人員可以在本申請公開內容的教導下容易地獲得這樣的變體序列。在具體實施方式中，多核苷酸和多肽變體與本文所述的多核苷酸或多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、或至少約99%，或至少約99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%的多核苷酸或多肽同一性。由於遺傳密碼的冗餘性，將存在編碼相同氨基酸序列的這些序列的變體。
本發明的另一個實施方式中，提供了能夠在中度至高度嚴格條件下與本發明提供的多核苷酸序列或其片段或其互補序列相雜交的多核苷酸組合物。雜交技術是分子生物學領域公知的。為了說明的目的，用於測試本發明的多核苷酸與其他多核苷酸雜交的合適中等嚴格條件包括在5×SSC、0.5%SDS、1.0 mM EDTA(pH8.0)的溶液中預洗；在50-60ºC、5×SSC、過夜的條件下雜交；再於65ºC下20分鐘用含0.1%SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗滌兩次。本領域技術人員理解，可容易地操縱雜交的嚴格性，例如通過改變雜交溶液的鹽含量和/或進行雜交的溫度。例如，在另一個實施方式中，合適的高嚴格雜交條件包括上述的條件，所不同的是雜交溫度升高了，例如達到60-65℃或65-70℃。
本發明的宿主細胞可以是用於外源基因表達的所有細胞，包括但不限於大腸桿菌，酵母，昆蟲細胞，植物細胞，哺乳動物細胞。
本發明的載體包括可以在任何類型的細胞或生物體中進行複製的載體，包括如質粒、噬菌體、黏粒和迷你染色體。在一些實施方式中，包括本發明多核苷酸的載體是適合於多核苷酸繁殖或複製的載體，或者是適合於表達本發明多肽的載體。這樣的載體是本領域已知並可以購買的。
“載體”包括穿梭載體和表達載體。通常，質粒構建體也包括分別用於細菌中質粒複製和選擇的複製起點(如複製的ColE1起點)和選擇標記(如氨苄青黴素或四環素抗性)。“表達載體”是指包含用於在細菌或真核細胞中表達本發明的抗體包括抗體片段所需要的控制序列或調控元件的載體。
本發明的載體可以是用於外源基因表達的所有載體，包括但不限於質粒載體，其中質粒載體至少包含複製起始位點、啟動子、目的基因、多克隆位點、篩選標記基因，優選地，本發明所述載體包括但不限於基於pCDNA改造得到的質粒載體，比如X0GC載體。
本發明的受試者包括禽類、爬行動物、哺乳動物等。優選地，哺乳動物包括齧齒類動物、靈長類動物，優選地，靈長類動物包括人。
本發明所涉及的疾病的範圍包括但不限於腫瘤，優選的，所述腫瘤包括：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。
藥學上可接受的載體是指是指藥學領域常規的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑和水等，填充劑如澱粉、蔗糖，乳糖、微晶纖維素等；黏合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；潤濕劑如甘油；崩解劑如羧甲基澱粉鈉，羥丙纖維素，交聯羧甲基纖維素，瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇，十二烷基硫酸鈉；吸附載體如高齡土和皂黏土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、微粉矽膠和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的範圍。
下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。本發明下述實施例中使用的各種抗體均來源於商業途徑的標準抗體。
實施例1 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子的載體構建
構建分別含抗人PD-1的抗體重鏈和輕鏈的X0GC表達載體。其中輕鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；輕鏈恒定區核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；重鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；重鏈恒定區核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。通過PCR的方法分別擴增輕鏈可變區以及輕鏈恒定區，重鏈可變區以及重鏈恒定區。本申請中所有PCR反應均使用NEB公司的Phusion超保真DNA聚合酶(F-530L)。PCR引物根據鹼基互補原則以及酶切位點的需要進行常規設計。反應體系均為：H2 O 8.9μl，5×Phusion超保真DNA聚合酶緩衝液4μl，1mM dNTP 4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.1μl，模板1μl。將可變區及恒定區PCR產物，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳後用DNA回收試劑盒(Promega，A9282，下同)回收相應片段。以回收的可變區片段與恒定區片段作為模板，使用可變區上游引物及恒定區下游引物，再進行一輪PCR反應，然後再回收相應片段，得到重鏈和輕鏈的全長片段。將X0GC載體及全長片段，用EcoRI(NEB，貨號R3101L)及HindIII(NEB，貨號R3104L)酶切，酶切反應體系為：10×緩衝液3 2μl，EcoRI及HindIII各0.5μl，膠回收獲得的全長片段3μl，H2 O 14.5μl。酶切體系於37℃條件下反應3小時。將酶切產物用T4 DNA連接酶(NEB，貨號M0202V)連接，反應體系為：10×連接酶緩衝液2μl，連接酶 0.5μl，膠回收獲得的全長片段3μl，膠回收獲得的X0GC載體3μl，H2 O 11.5μl。連接於室溫反應12小時。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α(天根，貨號CB104)，分別獲得抗體重鏈和輕鏈的X0GC表達載體，用於在真核細胞中表達抗體的重鏈和輕鏈。
分別構建含抗人HER2的抗體重鏈和輕鏈的X0GC表達載體，其中抗體可變區序列來源於http://www.drugbank.ca/drugs/DB00072。輕鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；輕鏈恒定區核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；重鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；重鏈恒定區核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。通過如上所述同樣的方法分別獲得抗體重鏈和輕鏈的X0GC表達載體，用於在真核細胞中表達抗體的重鏈和輕鏈。
實施例2 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子的表達
分別將含抗人PD-1抗體的重鏈和輕鏈的表達載體轉染293F細胞(FreeStyle™ 293-F Cells, 貨號R79007, invitrogen)，另外分別將含抗人HER2的抗體的重鏈和輕鏈的表達載體也轉染293F細胞。轉染前一天接種細胞，轉染當天將細胞離心收集細胞，將細胞重懸於新鮮的FreeStyle™ 293表達培養基(FreeStyle™ 293 Expression Medium，貨號12338001，Gibco)中，細胞密度為200*105 細胞/mL。按照轉染體積加入質粒，終濃度為36.67ug/mL，輕輕混勻；然後加入線性PEI(聚乙烯亞胺，線形，M.W. 25000，貨號43896，Alfa Aesar)，終濃度為55ug/mL，輕輕混勻。之後放入細胞培養箱，120rpm搖床37℃培養1小時。之後加入19倍轉染體積的新鮮培養基。繼續120rpm搖床37℃培養。離心收集轉染5~6天的細胞培養上清。
通過ELISA的方法測定表達量。在應用層析柱純化之前，以0.2µm濾膜過濾以去除沉澱物。此步驟在4℃下進行。
實施例3 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子表達產物的純化
採用AKTA explorer 100型蛋白純化系統(GE Healthcare)以及親和色譜柱rProtein A Sepharose Fast Flow(16 mm I.D.，22 ml，GE Healthcare)於4℃下進行純化。首先以流動相A(20mM磷酸鈉緩衝液，150mM氯化鈉，pH7.4)平衡色譜柱，在基線穩定後將經過上述處理的細胞上清液進行上樣，流速為5ml/min，並在上樣後以流動相A進行平衡。樣品分別為抗PD-1表達產物和抗HER2表達產物。之後，首先以流動相B1(含有0.5M精氨酸的流動相A)沖洗5個柱體積；然後以流動相B2(100 mM檸檬酸，pH3.0)洗脫5個柱體積，收集洗脫峰即為目的蛋白峰；以上洗脫步驟流速都為5 ml/min。抗PD-1表達產物的洗脫峰色譜圖如圖1所示，抗HER2表達產物的洗脫峰與之類似(結果未包括)。收集標示的洗脫峰(圖示灰色區域)，並通過滴加1 M醋酸鈉溶液將pH調至5.0。
實施例4 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子的製備和純化
抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體分子的結構如圖2所示。
將上述rProtein A Sepharose Fast Flow(16 mm I.D.，22 ml，GE Healthcare)方法純化獲得的抗PD-1和抗Her2表達產物進行體外重組以獲得異源二聚體。首先將上述純化收集的蛋白溶液通過超濾濃縮管超濾濃縮(標稱截留分子量10KDa)，將溶液置換為磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer saline，PBS)PBS(pH=7.4)。將獲得的抗PD-1和抗HER2純化表達產物溶液分別加所述PBS調整到1mg/ml, 加入1/200倍終體積的1M DTT，DTT終濃度分別為5mM，在4℃條件下進行還原(3-8小時)，通過還原的過程，二硫鍵被打開，抗PD-1以及抗HER2表達產物中含有的少量的抗體同源二聚體分子鉸鏈區二硫鍵也打開，形成了含有一條重鏈和一條輕鏈的半抗體分子，結構如圖3所示。還原的樣品經流動相緩衝液中包含1mM DTT還原劑的SEC-HPLC(TOSOH，TSKgel superSW3000)分析，結果如圖4的A和B所示，抗PD-1半抗體分子的比例為100%，抗HER2半抗體分子的比例為89.3%，其餘10.7%為聚集體，但是並不存在二硫鍵不能打開的同源二聚體。
然後將還原的抗PD-1以及抗HER2半抗體分子等摩爾比例混合，在4℃條件下進行重組反應24小時，在重組的過程中，抗PD-1及抗HER2半抗體分子通過CH2以及CH3間的非共價作用力形成了同時含有抗PD-1以及抗HER2半抗體分子的異源二聚體的雙特異抗體，之後將蛋白溶液通過超濾濃縮管超濾濃縮(標稱截留分子量10KDa)，將溶液置換為磷酸鹽溶液(PBS，pH=7.4)終止還原，通過空氣或者氧化劑進行氧化反應，使異源二聚體的雙特異抗體的二硫鍵重新形成。氧化反應的條件為加入氧化劑100mM L-脫氫抗壞血酸，蛋白終濃度1mg/ml，氧化劑終濃度1mM，在4℃條件下進行氧化，反應進行24小時。將上述氧化反應獲得的樣品進行SEC-HPLC分析，結果如圖5所示。
上述抗PD-1以及抗HER2半抗體分子經還原氧化得到的異源二聚體抗體分子通過超濾濃縮管超濾濃縮(標稱截留分子量10KDa)，將溶液置換為10 mM磷酸鈉緩衝液，pH5.8。採用AKTA explorer 100型蛋白純化系統(GE Healthcare)以及離子色譜柱Source 15S(16mm I.D.，17ml，GE Healthcare)於4℃下進行純化。首先以流動相A(10mM 磷酸鈉，pH7.0)平衡色譜柱，在基線穩定後將經過上述處理的蛋白溶液進行上樣，流速為3ml/min，並在上樣後以流動相A進行平衡，之後以A(10mM 磷酸鈉，pH5.8)到B(10mM磷酸鈉，pH5.8)梯度沖洗20個柱體積(0%B-100%B，170min，流速2ml/min)，收集洗脫主峰，收集的蛋白溶液通過超濾濃縮管超濾濃縮(標稱截留分子量10KDa)，將溶液置換為磷酸鹽溶液(PBS，pH=7.4)，過濾除菌4℃保存。將純化產物通過SEC-HPLC進行純度分析，結果如圖6所示，純度為99.96%。
實施例5. 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子的穩定性
分別將充分密封的1mg/mL的抗PD-1/抗HER2異源二聚體樣品放置於40℃恒溫箱(BINDER KBF240)，在相應時間點(基線(第0天)、第2周、第4周)取20µg樣品進行高效排阻液相色譜(SEC-HPLC)分離。上述SEC-HPLC條件如下：(1)排阻色譜柱：TSKgel G3000SWx (Tosoh Bioscience)，5µm，7.8mm×30cm；(2)流動相：5 mM PBS，150mM NaCl，pH6.7；(3)流速：0.6 mL/min；(4)紫外檢測波長：280nm；(5)採集時間：30min。所用儀器是Agilent 1200 Infinity色譜儀，利用Agilent ChemStation記錄圖譜並計算剩餘單體的比例。如表1所示，在40℃實驗條件下，所述二聚體不會發生明顯的聚集；故認為所述抗PD-1/抗HER2異源二聚體具備較好的熱穩定性。
表1 抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體分子的穩定性

實施例6. 抗PD-1 / 抗HER2 異源二聚體抗體的體外靶點結合活性
用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體與單個抗原的結合能力。
ELISA具體實施過程如下：用pH=9.6的碳酸鹽緩衝溶液(0.05M)在96孔高吸附酶標板(Costar，貨號42592)上包被重組人PD-1(北京義翹神州，貨號10377-H08H)或者人HER2(北京義翹神州，貨號10004-H08H)，包被濃度為1μg/mL，包被量為每孔100μL，包被在4℃過夜進行。PBST洗滌5次。用含1%BSA的PBST按300μL/孔封閉，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。加入序列稀釋在含1%BSA的PBST裡的異源二聚體抗體樣品以及對照，每孔加入100μL，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。然後加入1:2000稀釋在含1%BSA的PBST裡的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體 (Chemicon，貨號AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室溫顯色10分鐘。加入1M H2 SO4 ，100μL/孔，終止顯色。在酶標儀上讀取450nm處的吸光度。
結果如圖7的A和B所示，抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體具有對PD-1和HER2的高親和力，保持了雙價單抗的抗原親和活性。
實施例7. 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體的雙靶點同時結合活性
用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體與兩個不同抗原的同時結合能力。
ELISA具體實施過程如下：用pH=9.6的碳酸鹽緩衝溶液在96孔高吸附酶標板上包被重組人HER2(北京義翹神州, 貨號10004-H08H)，包被濃度為1μg/mL，每孔100μL，包被在4℃過夜進行。PBST洗滌5次。用含1%BSA的PBST按300μL/孔封閉，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。加入序列稀釋在含1%BSA的PBST裡的異源二聚體抗體樣品以及對照，每孔加入100μL，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。然後加入稀釋在含1%BSA的PBST裡的生物素標記的PD-1-Fc(北京韓美藥品)，0.5μg/mL，每孔100μL，25℃孵育1小時。加入1:1000稀釋在含1%BSA的PBST裡的鏈黴親和素-辣根過氧化物酶偶聯物 (BD Pharmingen，貨號554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室溫顯色10分鐘。加入1M H2 SO4 ，100μL/孔，終止顯色。在酶標儀上讀取450nm處的吸光度。
結果如圖8所示，PD-1單抗(其重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列與抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體中的PD-1結合功能區中的相應序列相同)和HER2單抗(曲妥珠單抗(Trastuzumab))的組合不能同時結合PD-1，HER2，只有抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體具有同時結合兩種抗原的活性。
用流式細胞術(FCM，FACS Calibur, 購自BD Biosciences)在高表達PD-1的CHO/PD-1(GenScript, 貨號M00529)細胞和高表達HER2的SK-BR-3細胞上測定抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體與雙靶點抗原的同時結合能力。
參照PKH26試劑盒(Sigma，貨號SLBH4568V)使用說明書染色CHO/PD-1細胞。簡要的說，收集CHO/PD-1細胞，無血清培養基洗滌一次後，用PKH26試劑盒裡的Diluent C分別將CHO/PD-1製備成2×107 /mL細胞懸液，將PKH26染料稀釋到4μM, 然後1:1混合在一起，此混合懸液的細胞密度為1×107 /mL，PKH26的濃度為2μM，室溫孵育1分鐘，再用同等體積的FBS孵育1分鐘終止染色。400g離心10分鐘，用完全培養基洗滌兩次，再重懸於完全培養基備用。參照CFSE試劑盒(Life technology，貨號C34554)使用說明書染色SK-BR-3細胞。簡要的說，用PBS稀釋CFSE到工作濃度0.5μM並在37℃預熱，1000rpm離心5分鐘收集SK-BR-3細胞，用預熱的CFSE工作溶液重懸SK-BR-3，在37℃孵育15分鐘，1000rpm離心5分鐘收集細胞，再重懸於完全培養基中，孵育30分鐘，用完全培養基洗滌一次，再重懸於完全培養基備用。離心收集以上已經染色的細胞，並用含2%FBS的冷PBS洗滌一次。將細胞重懸於含2%FBS的冷PBS中，細胞密度為5×106 /mL。將SK-BR-3和CHO/PD-1按1:1混合，然後每個流式管取100μL(即2.5×105 SK-BR-3和2.5×105 CHO/PD-1)，再加入100μL稀釋於含2%FBS的冷PBS中的異源二聚體抗體樣品，對照以及同型對照(人免疫球蛋白，江西博雅生物製藥股份有限公司，國藥准字S19993012)，終濃度為5nM。流式管於冰上孵育30分鐘。用含2% FBS的PBS洗滌兩次。再重懸於500μL冷PBS中，該細胞懸液於流式細胞儀上進行檢測分析。
結果如圖9所示，通過異源二聚體抗體同時結合高表達PD-1的CHO/PD-1細胞和高表達HER2的SK-BR-3細胞，抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體能夠引發SK-BR-3和CHO/PD-1細胞的相互靠近。
實施例8. 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子對PD-1 與配體PD-L1 ，PD-L2 結合的阻斷活性
用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體對PD-1/PD-L1結合、PD-1/PD-L2結合的阻斷活性。
用pH=9.6的碳酸鹽緩衝溶液在96孔高吸附酶標板上包被重組人PD-1-Fc，包被濃度為1μg/mL，包被量為100μL每孔，包被在4℃過夜進行。PBST洗滌5次。用含1%BSA的PBST按300μL/孔封閉，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。加入序列稀釋在含1%BSA的PBST裡的異源二聚體抗體樣品以及對照，並同時加入終濃度為1μg/mL的生物素標記的PD-L1-Fc或者終濃度為4μg/mL的生物素標記的PD-L2，100μL/孔，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。然後加入1:1000稀釋在含1%BSA的PBST裡的辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素(BD，貨號554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1小時。PBST洗滌5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室溫顯色10分鐘。加入1M H2 SO4 ，100μL/孔，終止顯色。在酶標儀上讀取450nm處的吸光度。
結果如圖10的A和B所示，抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體能夠阻斷PD-1/PD-L1結合、PD-1/PD-L2結合，較好的保持了雙價單抗的阻斷活性。
實施例9. 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子的T 細胞調控活性
用混合淋巴細胞反應(MLR)測定抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體對T細胞免疫反應的調控活性。
人樹突狀細胞(DC)的獲取：復蘇收集人PBMC細胞(Lonza，貨號CC-2702)。將人PBMC細胞按細胞密度為5×106 /mL重懸於無血清的RPMI 1640培養基並接種在細胞培養瓶中，在37℃二氧化碳培養箱中孵育90分鐘。棄除培養上清及懸浮細胞，貼壁細胞在完全培養基(RPMI 1640含10%FBS)中培養，並加入100ng/mLGM-CSF(北京義翹神州, 貨號10015-HNAH)和100ng/mL IL-4(北京義翹神州, 貨號11846-HNAE)。孵育3天，換液，再孵育3天。然後將培養基更換為完全培養基(RPMI 1640含10%FBS)中含100ng/mLGM-CSF，100ng/mL IL-4以及20ng/mL TNF-α，孵育1天。即得DC細胞。
人T細胞的獲取：復蘇收集人PBMC細胞(Lonza，貨號CC-2702)，保證此PBMC與誘導DC細胞的PBMC來自不同個體。參照Pan T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotech，貨號5150414820)使用說明書分離人T細胞。簡要的說，先用PBS洗滌PBMC一次，再將PBMC按107 細胞每40μL分離緩衝液(PBS含2mM EDTA, 0.5%BSA, pH=7.2)重懸(以下使用量均按107 細胞計)，並加入10μL Pan T cell Biotin Antibody Cocktail，在4℃孵育5分鐘。再加入30μL分離緩衝液和20μL Pan T cell MicroBead Cocktail，在4℃孵育10分鐘。過MACS分離柱，即得T細胞。
將收集到的人DC細胞和人T細胞重懸於完全培養基(RPMI 1640含10%FBS)中，接種於96孔板，接種的DC細胞和T細胞分別為1×104 /孔，1×105 /孔，混合培養。並加入用完全培養基序列稀釋的異源二聚體抗體樣品以及對照。將培養板置於37℃二氧化碳培養箱中孵育5天。孵育結束之後，取出孔內上清，按照試劑盒使用手冊檢測細胞因子IFN-γ(RayBiotech, 貨號ELH-IFNg)。
如圖11所示，人T細胞在同種異體DC細胞的刺激下，會活化分泌IFN-γ。加入PD-1單抗會增強T細胞的活化，促進細胞因子的分泌，而HER2單抗沒有此活性。抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體也顯示了與PD-1單抗相當的T細胞調控活性，顯著的促進細胞因子IFN-γ的分泌。
實施例10. 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子的腫瘤細胞抑制活性
在人PBMC的存在下，檢測抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體對人乳腺癌細胞SK-BR-3的殺傷抑制活性。
SK-BR-3細胞在含10% FBS的RPMI 1640培養基(即完全培養基)中培養。收集SK-BR-3細胞，重懸於完全培養基中，細胞密度為5×104 /mL，100μL/孔接種於96孔細胞培養板，即每孔5000個細胞。復蘇收集人PBMC細胞(Lonza，貨號CC-2702)，將人PBMC細胞按細胞密度為5×105 /mL重懸於RPMI 1640完全培養基中，50μL/孔接種96孔細胞培養板，即每孔25000個細胞，效靶細胞比率為5:1。加入50μL/孔用完全培養基序列稀釋的異源二聚體抗體樣品以及對照。將培養板置於37℃，5% CO2培養箱中孵育3天。在孵育終點，用培養基洗去細胞培養板中的PBMC，再加入完全培養基100μL和MTS(CellTiter96 Aqueous One Solution，Promega, 貨號: G358B)20μL來檢測SK-BR-3細胞。細胞培養板在培養箱中繼續孵育3-4小時，然後在酶標儀上讀取490nm處的吸光度。
如圖12所示，加入HER2單抗會殺傷抑制SK-BR-3，而PD-1單抗在體外沒有此活性。抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體也顯示了與HER2單抗相當的腫瘤細胞殺傷抑制活性。
實施例11. 抗PD-1/ 抗HER2 異源二聚體抗體分子在動物體內的抗腫瘤藥效研究
實驗材料選用免疫缺陷的NCG小鼠(南京生物醫藥研究院)，雌性，6-8周齡。小鼠適應環境一周後，每只小鼠於右側背部皮下接種5 x 106 個HCC1954人乳腺癌細胞。待腫瘤體積長至約100mm3 時，根據腫瘤體積進行分組，每組8只荷瘤小鼠。先給予人PBMC將小鼠免疫系統部分人源化，每只小鼠接種5 x 106 個細胞，靜脈注射。再分別給予溶媒 (PBS)，PD-1單抗35nmol/kg (5mg/kg)，HER2單抗 35nmol/kg (5mg/kg)，PD-1單抗35nmol/kg加HER2單抗35nmol/kg的組合，以及抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體35nmol/kg (5mg/kg)，每週給藥2次，連續給藥2周，給藥方式為腹腔注射。自給藥之日起，每週測量3次腫瘤體積，測量其長徑a，短徑b，腫瘤體積計算公式為：腫瘤體積 (mm3) = (a x b2 )/2。腫瘤體積測量持續時間為3周，即停藥後，再觀察一周。
結果如圖13所示，抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體具有比PD-1單抗、HER2單抗更強的抗腫瘤藥效，且在停藥後依然顯示出了良好的腫瘤控制作用。
圖1：示出了抗PD-1表達產物的洗脫峰色譜圖。
圖2：示出了抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體分子的結構。
圖3：示出了一條重鏈和一條輕鏈的半抗體分子結構圖。
圖4：示出了一條重鏈和一條輕鏈的半抗體分子的SEC-HPLC分析結果。其中A圖和B圖分別表示抗PD-1半抗體分子和抗HER2半抗體分子的結果。
圖5：示出了抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體分子的SEC-HPLC分析結果。
圖6：示出了純化的抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體分子的SEC-HPLC純度分析結果。
圖7：A圖示出了抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體對PD-1的親和力，B圖示出了抗PD-1 /抗HER2異源二聚體抗體對HER2的親和力。
圖8：示出了PD-1單抗和HER2的組合不能同時結合PD-1和HER2，只有抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體具有同時結合兩種抗原的活性。
圖9：示出了抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體能夠引發SK-BR-3和CHO/PD-1細胞的相互靠近。
圖10：A圖和B圖分別示出了抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體能夠阻斷PD-1/PD-L1結合、PD-1/PD-L2結合，較好的保持了雙價單抗的阻斷活性。
圖11：示出了抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體顯示了與PD-1單抗相當的T細胞調控活性，顯著的促進細胞因子IFN-γ的分泌。
圖12：示出了抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體顯示了與HER2單抗相當的腫瘤細胞殺傷抑制活性。
圖13：示出了抗PD-1/抗HER2異源二聚體抗體具有比PD-1單抗、HER2單抗更強的抗腫瘤藥效，且在停藥後依然顯示出了良好的腫瘤控制作用。

Claims (28)

  1. 一種異源二聚體形式的雙特異抗體，其包含能與PD-1特異性結合的第一個抗原結合功能區和能與HER2特異性結合的第二個抗原結合功能區，其中所述雙特異抗體包含通過一個或多個二硫鍵鏈間連接的第一Fc鏈及第二Fc鏈，該第一Fc鏈和第二Fc鏈通過共價鍵或連接體分別連接到PD-1抗原結合功能區和HER2抗原結合功能區上，或者該第一Fc鏈和第二Fc鏈通過共價鍵或連接體分別連接到HER2抗原結合功能區和PD-1抗原結合功能區上；其中PD-1抗原結合功能區中的免疫球蛋白輕鏈可變區氨基酸序列選自SEQ ID NO.10，PD-1抗原結合功能區中的免疫球蛋白重鏈可變區氨基酸序列選自SEQ ID NO.12；並且第一Fc鏈和第二Fc鏈在如下位置包含5個氨基酸的替換： 第一Fc鏈上366位及399位氨基酸替換，第二Fc鏈上351位、407位及409位氨基酸的替換， 包含上述氨基酸替換的第一Fc鏈與第二Fc鏈更傾向於互相形成異源二聚體而不傾向於各自形成同源二聚體， 其中氨基酸位置根據Kabat EU指數編號系統編號。
  2. 如請求項1所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中第一Fc鏈及第二Fc鏈氨基酸替換如下， a)L351G、L351Y、L351V、L351P、L351D、L351E、L351K或L351W; b)T366L、T366P、T366W或T366V; c)D399C、D399N、D399I、D399G、D399R、D399T或D399A； d)Y407L、Y407A、Y407P、Y407F、Y407T或Y407H; 和 e)K409C、K409P、K409S、K409F、K409V、K409Q或K409R。
  3. 如請求項1或2所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中氨基酸替換包括： a)第一Fc鏈T366L及D399R替換，第二Fc鏈L351E、Y407L及K409V替換； b)第一Fc鏈T366L及D399C替換，第二Fc鏈L351G、Y407L及K409C替換； c)第一Fc鏈T366L及D399C替換，第二Fc鏈L351Y、Y407A及K409P替換； d)第一Fc鏈T366P及D399N替換，第二Fc鏈L351V、Y407P及K409S替換； e)第一Fc鏈T366W及D399G替換，第二Fc鏈L351D、Y407P及K409S替換； f)第一Fc鏈T366P及D399I替換，第二Fc鏈L351P、Y407F及K409F替換； g)第一Fc鏈T366V及D399T替換，第二Fc鏈L351K、Y407T及K409Q替換； h)第一Fc鏈T366L及D399A替換，第二Fc鏈L351W、Y407H及K409R替換。
  4. 如請求項1所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中第一Fc鏈的氨基酸替換為T366L和D399R，第二Fc鏈的氨基酸替換為L351E、Y407L和K409V。
  5. 如請求項1-4任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中Fc鏈來源於IgG。
  6. 如請求項1-5任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中PD-1和HER2抗原結合功能區是Fab片段或scFv片段。
  7. 如請求項1-6任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中PD-1和HER2抗原結合功能區都是Fab片段。
  8. 如請求項1-6任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中PD-1和HER2抗原結合功能區一個是Fab片段，另一個是scFv。
  9. 如請求項6-8任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其Fab片段包含不同的第一重鏈可變區及第二重鏈可變區，以及不同的第一輕鏈可變區及第二輕鏈可變區。
  10. 如請求項1-9任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中第一Fc鏈及其相連接的PD-1抗原結合功能區和第二Fc鏈及其相連接的HER2抗原結合功能區，或者第一Fc鏈及其相連接的HER2抗原結合功能區和第二Fc鏈及其相連接的PD-1抗原結合功能區，在單獨存在並且同時存在還原劑時其形成同源二聚體的重量比例均低於50%。
  11. 如請求項1-10任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體，其中雙特異抗體的氨基酸序列選自：SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12和14。
  12. 一種分離的多核苷酸，其編碼如請求項1-11任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體。
  13. 如請求項12所述的分離的多核苷酸，其序列選自：SEQ ID NO. 1、3、5、7、9、11和13。
  14. 一種重組表達載體，其包含請求項12或13所述的分離的多核苷酸。
  15. 如請求項14所述的重組表達載體，其中表達載體為基於pCDNA改造得到的質粒載體X0GC。
  16. 一種宿主細胞，其包含請求項12或13所述的分離的多核苷酸，或請求項14或15所述的重組表達載體。
  17. 如請求項16所述的宿主細胞，其選自人胚腎細胞HEK293或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293E、HEK293F；倉鼠卵巢細胞CHO或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr- 、CHO/DG44、ExpiCHO。
  18. 一種組合物，其包含請求項1-11任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體或請求項12或13所述的分離的多核苷酸或請求項14或15所述的重組表達載體或請求項16或17所述的宿主細胞，及藥學上可接受的載體。
  19. 一種生產如請求項1-11任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體的方法，其包括步驟： 1)將請求項12或13所述的分離的多核苷酸或請求項14或15所述的重組表達載體分別在宿主細胞中進行表達； 2)將在宿主細胞中分別表達的蛋白進行還原；以及 3)將還原的蛋白混合，然後將混合物進行氧化。
  20. 如請求項19所述的方法，其中宿主細胞選自人胚腎細胞HEK293或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293F；倉鼠卵巢細胞CHO或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr- 、CHO/DG44、ExpiCHO。
  21. 如請求項19或20所述的方法，其中還原步驟包括：1)進行還原反應，所述還原劑選自：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、三(2-羧乙基)膦或其化學衍生物，或者其組合；2)去除還原劑。
  22. 如請求項19-21任一項所述的方法，其中氧化步驟為在空氣中氧化，也包括在氧化劑存在下進行氧化反應，所述氧化劑選自：L-脫氫抗壞血酸或其他化學衍生物。
  23. 如請求項19-22任一項所述的方法，其還包括分離純化的步驟。
  24. 請求項1-11任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體和/或請求項12或13所述的分離的多核苷酸和/或請求項14或15所述的重組表達載體和/或請求項16或17所述的宿主細胞和/或請求項18所述的組合物在製備用於預防和/或治療受試者疾病的藥物中的用途。
  25. 請求項1-11任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體和/或請求項12或13所述的分離的多核苷酸和/或請求項14或15所述的重組表達載體和/或請求項16或17所述的宿主細胞和/或請求項18所述的組合物，其用做用於預防和/或治療受試者疾病的藥物。
  26. 一種預防和/或治療疾病的方法，包括將請求項1-11任一項所述的異源二聚體形式的雙特異抗體和/或請求項12或13所述的分離的多核苷酸和/或請求項14或15所述的重組表達載體和/或請求項16或17所述的宿主細胞和/或請求項18所述的組合物施予有需求的受試者。
  27. 如請求項24所述的用途，請求項25所述的異源二聚體形式的雙特異抗體、分離的多核苷酸、重組表達載體、宿主細胞或組合物，或請求項26所述的方法，其中受試者是哺乳動物，優選地，人類受試者。
  28. 如請求項24所述的用途，請求項25所述的異源二聚體形式的雙特異抗體、分離的多核苷酸、重組表達載體、宿主細胞或組合物，或請求項26所述的方法，其中所述疾病選自如下腫瘤：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。
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