TW201540297A - 蛇床子素用於製備治療局部腎絲球硬化症之組合物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於蛇床子素用於製備治療局部腎絲球硬化症之組合物的用途。具體而言，本發明係揭露蛇床子素具局部腎絲球硬化症之治療效果，其可減緩局部腎絲球硬化症之各種病徵，包括蛋白尿、腎組織纖維化、上皮增生病變、淋巴球浸潤等。

Description

蛇床子素用於製備治療局部腎絲球硬化症之組合物的用途

本發明係關於蛇床子素用於製備治療局部腎絲球硬化症之組合物的用途。具體而言，本發明係揭露蛇床子素具局部腎絲球硬化症之治療效果，其可減緩局部腎絲球硬化症之各種病徵，包括蛋白尿、腎組織纖維化、上皮增生病變、淋巴球浸潤等。

局部腎絲球硬化症(Focal Segmental Glomerulosclerosis,FSGS)是一種在腎絲球產生血管硬化現象之腎組織病變疾病。臨床上展現腎病症候群特徵，包含嚴重蛋白尿、高血壓、低白蛋白血症、血尿等(Cattran DC,Rao P.American Journal of Kidney Disease.21(3)：344-9,1998.Chun MJ et al.,Journal of the American Society of Nephrology.15：2169,2004.Rydel JJ et al.,American Journal of Kidney Disease.25(4)：534-42,1995.)。病理上在初期出現腎臟腎絲球之基底膜變厚、腎絲球之細胞外基質增加、血管內出現玻璃樣沉澱物等病徵，最終形成以膠原蛋白纖維為主的疤痕組織，也有伴隨微血管管壁泡沫細胞堆積、微血管塌陷、臟層上皮細胞增殖與肥大、足突細胞融合等，且隨著疾病進展硬化部位逐漸擴大(D'Agati VD.Curr Opin Nephrol Hypertens.17(3)：271-81,2008.Hodgin JB et al.,American Journal of Clinical Pathology.177(4)：1674-86,2010.Thomas DB.The Archives of Pathology and Laboratory Medicine.133(2)：217-23,2009.)。足突細胞主要分布於腎絲球基底膜，功能為血液的過濾作用，目前利用超顯微技術可發現FSGS患者腎臟腎絲球之足突細胞具受損情形，被認為是導致腎絲球走向硬化的重要原因之一(Kriz W et al.,Kidney International.54(3)：687-97,1998.Pagtalunan ME et al.The Journal of Clinical Investigation.99(2)：342-8,1997.Wiggins JE et al.Journal of the American Society of Nephrology. 16(10)：2953-66,2005.Yang HC et al.,Kidney International.69(10)：1756-64,2006.)。

局部腎絲球硬化症之患病人數於世界各國皆逐年上升，然疾病機轉仍尚未完全明白，可能由其他腎炎導致，如局部增生型腎炎、血管炎、狼瘡性腎炎、腎臟移植，也可能是毒物傷害造成(Bahiense-Oliveira M et al.Clinical Nephrology.61：90-7,2004.D'Agati V.Seminars in Nephrology.23：117,2003.)。臨床上使用細胞毒性藥物(如，環磷醯胺(cyclophosphamide))、免疫抑制劑(如，環孢靈素(cyclosporine)、馬替麥考酚酯(Mycophenolate Mofetil))、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)、血管擴張劑、或單純使用皮質類固醇(如，潑尼松龍(prednisolone))治療，但其中僅有20%至40%患者對類固醇治療有反應，且必須長期服用才能發揮效果，而即使在服用類固醇治療後，患者仍有機會進展至末期腎病(Beba N et al.,Turkish Journal of Pediatric.52(3)：255-61,2010.Daskalakis N,Winn MP.Cellular and Molecular Life Sciences.63(21)：2506-11,2006.Gipson DS et al.,Kidney International.80(8)：868-78,2011.Daskalakis N,Winn MP.Cellular and Molecular Life Sciences.63(21)：2506-11,2006.Gipson DS et al.,Kidney International.80(8)：868-78,2011.Kanjanabuch T et al,Journal of The Medical Association of Thailand.2：S262-79,2006.)。此外，這些藥物常產生不良副作用，如抗藥性及腎毒性，對人體產生更大危害，還有停藥後復發之類的問題。

蛇床子素(osthole)，化學名稱為7-甲氧基-8-(3-甲基丁-2-烯基)-2-二氫苯并-γ-哌喃酮(7-methoxy-8-(3-methylbut-2-enyl)-2-chromanone)，分子式為C₁₅H₁₆O₃，結構如下：

蛇床子素可由傘形科植物蛇床(Cnidium monnieri)的種子萃取而得，已知具有抗微生物感染、抗增生、抗過敏等功效。然而，並無任何先前技藝文獻揭示蛇床子素針對局部腎絲球硬化症具有治療或減緩其各種病徵之護腎效果。

本發明首次提出蛇床子素針對局部腎絲球硬化症具有減緩其各種病徵之護腎效果。

因此，本發明提供一種蛇床子素用於製備供治療局部腎絲球硬化症或減緩其病徵之組合物的用途。此外，本發明還提供了一種護腎組合物，其包括有效量的蛇床子素，以及一或多種生理上可接受的載體。本發明也提供了將蛇床子素投予有需要的個體以治療局部腎絲球硬化症或減緩其病徵的方法。

在一具體實例中，蛇床子素可用以改善局部腎絲球硬化症之腎組織病變情形，包括降低腎絲球細胞外基質增生、玻璃樣物沉積、腎組織纖維化、上皮增生病變(EPHL)或淋巴球浸潤之情形。

在一具體實例中，蛇床子素可用以改善局部腎絲球硬化症之腎病症候群病徵，包括降低蛋白尿或血清尿素氮或血清肌酸酐之含量。

在一具體實例中，蛇床子素可與一或多種治療局部腎絲球硬化症之藥劑併用，該藥劑包括但不限於皮質類固醇藥物、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)、免疫抑制劑、細胞毒性藥物、或血管擴張劑。

本發明之其他特徵將經由以下詳細說明、各個具體實例及申請專利範圍而清楚呈現。

圖式中所示具體實施例係供例示本發明之目的。然則應了解本發明並不限於所示之較佳具體實施例。在圖式中：圖1顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之尿蛋白及腎功能變化，包括尿蛋白與肌酸酐比例(A)、血清尿素氮含量(B)，以及血清中肌酸酐含量(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示 無顯著差異。

圖2顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之組織型態學變化，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之染色圖(A)及單核白血球浸潤(B)及腎絲球硬化(C)之量化圖。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

圖3顯示以蛇床子素療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之膠原蛋白IV之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

圖4顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之組織纖維化情形(天狼星紅染色)，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

圖5顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之反應性氧化物(ROS)之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之血清ROS表現(A)以及腎臟ROS表現(B)。RLU，相對光單位(relative light unit)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

圖6顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎臟組織Nrf2及HO-1之表現情形以及Gpx酵素活性，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之Nrf2西方墨點轉漬法分析結果(A)及其量化圖(B)，以及HO-1西方墨點轉漬法分析結果量化圖(C)及Gpx酵素活性(D)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

圖7顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之巨噬細胞浸潤情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局 部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之F4/80⁺染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

圖8顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎臟組織NF-κB之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。。

圖9顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎臟組織之Cox-2及PGE2之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之Cox-2西方墨點轉漬法分析結果(A)及其量化圖(B)，以及PGE2的濃度測量結果(ELISA)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

圖10顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之細胞凋亡情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、蛇床子素治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

圖11顯示以蛇床子素治療局部腎絲球硬化症小鼠之細胞凋亡路徑分析結果，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組(病理對照組)、蛇床子素治療組之前凋亡酶-3及前凋亡酶-9及活化態之西方墨點轉漬法分析結果(A)及凋亡酶-3活化態及凋亡酶-9活化態之量化圖(B)至(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，n.s.表示無顯著差異。

除非另有限定，本文中使用之所有技術性及科學性辭彙具有熟習本發明所屬技藝之人通常瞭解之意義。如有衝突，則以本文件，包括其定義為主。

當用於此處時，本文所使用之冠詞「一」或「該」意指該冠詞文法上之受詞為一或一以上(亦即至少為一)。舉例而言，「一元件」代 表一元件或多於一元件。

在本發明中，非可預期地發現將蛇床子素投予局部腎絲球硬化症之小鼠有效改善或減緩蛋白尿、改善腎功能及減少發炎細胞的浸潤、組織纖維化及硬化情形，具有治療局部腎絲球硬化症及減緩其病徵之優異護腎效果。本發明亦提出蛇床子素可經由Nrf2及其下游基因降低氧化壓力，透過NF-kB降低發炎現象，以及降低凋亡酶-3及凋亡酶-9而減少細胞凋亡情形。

因此，本發明提供一種蛇床子素用於製備供治療局部腎絲球硬化症或減緩其病徵之組合物的用途。此外，本發明還提供了一種護腎組合物，其包括有效量的蛇床子素，以及一或多種生理上可接受的載體。本發明也提供了將蛇床子素投予有需要的個體以治療局部腎絲球硬化症或減緩其病徵的方法。根據本發明之組合物，其作為藥物形式或添加於食品中。

本發明使用之蛇床子素的化學名稱為7-甲氧基-8-(3-甲基丁-2-烯基)-2-二氫苯并-γ-哌喃酮(7-methoxy-8-(3-methylbut-2-enyl)-2-chromanone)，分子式為C₁₅H₁₆O₃，結構如下：

蛇床子素可由商業上獲得，或由天然植物產物萃取而得，包括但不限於蛇床(C.monnieri)的種子萃取而得，可以採用本領域已熟知的方法萃取(參見J.Agric.Food Chem.2010,58,10445-10451)，例如，以酒精萃取蛇床種子(如浸泡95%酒精約10天，重複三次)，再以層析方法純化，獲得純化的蛇床子素。當本發明描述蛇床子素係可經分離或純化時，可理解為其非指絕對的分離或純化，而是相對的分離或純化。例如，純化的蛇床子素是指相較於天然存在狀態更為純化者。在一具體實例中，一含有純 化的蛇床子素之製備物可含有蛇床子素達製備物總量之50%以上，60%以上，70%以上，80%以上，90%以上，或達100%(w/w)。可理解的是，當本文提到特地數值表示比例或劑量時，該數值一般而言包括其上下10%範圍內或更特定而言為上下5%範圍內的劑量。

本文所描述的「局部腎絲球硬化症(Focal Segmental Glomerulosclerosis,FSGS)」是一種在腎絲球產生血管硬化現象之腎組織病變疾病，臨床上展現腎病症候群特徵，包含嚴重蛋白尿、高血壓、低白蛋白血症、血尿等，病理上在初期出現腎臟腎絲球之基底膜變厚、腎絲球之細胞外基質增加、血管內出現玻璃樣沉澱物等病徵，最終形成以膠原蛋白纖維為主的疤痕組織，也有伴隨微血管管壁泡沫細胞堆積、微血管塌陷、臟層上皮細胞增殖與肥大、足突細胞融合等，且隨著疾病進展硬化部位逐漸擴大。

在本發明之實例中，在FSGS動物模式的實驗發現，投予蛇床子素可達以下效果：(1)減少蛋白尿及腎功能損害、抑制腎臟組織之病理變化及降低膠原蛋白IV表現以抑制腎臟組織纖維化；(2)降低全身性活性氧化物(ROS)表現量、增加了Nrf-2轉錄蛋白及其下游調控基因HO-1蛋白之表現量，並增加GPx活性；(3)抑制巨噬細胞浸潤及NF-κB路徑活化與降低發炎因子第二型環氧化酵素(cyclooxygenase-2,COX-2)及前列腺素E2(PGE2)蛋白質表現；及(4)抑制腎臟組織中細胞凋亡路徑。這些結果顯示蛇床子素具有治療局部腎絲球硬化症及減緩其病徵之優異護腎效果，並與活化Nrf2抗氧化路徑、降低NF-κB發炎路徑活化及抑制腎臟組織細胞凋亡之功效高度相關。

此處所使用的「個體」乙詞包括人類及非人類動物，例如，伴侶動物(如，狗、貓及類似者)、農場動物(如，牛、羊、豬、馬及類似者)或實驗動物(如，大鼠、小鼠、天竺鼠及類似者)。

此處所使用的「治療」乙詞是指為了治癒、癒合、減輕、舒緩、改變、矯正、改善、改進或影響該疾病、該疾病的症狀、該疾病引起的殘疾或罹患該疾病的傾向的目的，而將包含一或多種活性成分的組合物施用或投與至患有該疾病、該疾病的症狀或有罹患該疾病的傾向的個體。

此處所使用的「有效量」或「治療上有效量」乙詞是指相較於未接受該量的對應個體，一組合物或藥劑可造成治療或減緩症狀之目的的有效成分的含量。例如，治療局部腎絲球硬化症有效量為可防止、改善或減緩一或多種相關腎組織病變情形之劑量，包括降低腎絲球細胞外基質增生、玻璃樣物沉積、腎組織纖維化、上皮增生病變(EPHL)或淋巴球浸潤，或可防止、改善或減緩一或多種相關腎病症候群病徵之劑量，包括降低蛋白尿之情形或降低血清尿素氮(BUN)或血清肌酸酐(Cr)之含量。該等病徵可使用本領域已知方法並基於各種與病程相關的指標進行測定及評估，例如，分析尿蛋白、血液或尿素氮及血清肌酸酐的含量或腎切片評估腎組織病變。治療有效量可視各種因素而變動，例如，投藥途徑及頻率、接受該藥劑的個體的體重及物種，以及投藥目的。本領域技術人員可根據此處的揭示及已建立的方法依經驗決定每一個別案例的劑量。例如，在一具體實例中，本發明使用蛇床子素之劑量為每日1至1,000mg/kg，較特定為每日5至500mg/kg，更特定為每日10至250mg/kg，又更特定為每日20至175mg/kg。可視需要每日投與一或多次劑量。

根據本發明，蛇床子素可作為治療局部腎絲球硬化症或減緩其症狀之有效成分。在一具體實例中，一有效量的有效成分可與生理上可接受載體調配成適當劑型的組合物，以達輸送及吸收的目的。視投用模式而定，本發明的組合物較佳含有約0.1重量%至約100重量%的有效成份，重量百分比是以總組合物計。

此處「生理上可接受」是指該載體可與組合物內所含的有效成分相容，其較佳為能穩定該活性成分並且對被治療的個體無害。該載體可作為活性成分的稀釋劑、載體、賦形劑或基質。一些適當賦形劑的實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、褐藻酸鹽、黃蓍樹膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、滅菌水、糖漿和甲基纖維素。組合物可另外包括潤滑劑，例如，滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化和懸浮劑；保存劑，例如，羥基苯甲酸甲酯和丙酯；甜味劑；以及調味劑。本發明的組合物通過本領域已知的方法配製後，能在投與至病人後提供活性成分的快速、持續或延遲釋 放的效果。

根據本發明該組合物的形式可為錠劑、藥丸、粉末、糖錠、藥包、藥片、酏劑、懸浮液、乳劑、溶劑、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、滅菌注射液和包裝粉末。

本發明的組合物可經由任何生理上可接受途徑，例如，口服、腸道外(例如，肌肉、靜脈、皮下、腹腔內)、經皮、直腸、吸入等方式予以輸送。對於非經腸道的投藥，最佳是以無菌水溶劑形式使用，其可含有其它物質，例如，足夠的鹽或葡萄糖以使此溶液與血液呈等滲壓。水溶液需要時需被適當緩衝(較佳為pH值為3至9)。于無菌條件下製備適合的非經腸道組成物可通過本領域技術人員所熟知的標準藥學技術方法完成，而不需要付出額外的創造性勞動。

根據本發明，蛇床子素或含有蛇床子素為活性成分之組合物可用於治療患有局部腎絲球硬化症之個體或用於減緩其症狀，以達治療或護腎作用。具體而言，可將蛇床子素或含有蛇床子素為活性成分之組合物施用於患有局部腎絲球硬化症之個體，或具有產生局部腎絲球硬化症風險之個體，以避免疾病之發生或改善病徵或延遲病徵之惡化。

根據本發明，蛇床子素或含有蛇床子素為活性成分之組合物可與現有治療方式或藥物併用，例如，血漿過濾術(plasmapheresis)或蛋白質吸收法(protein adsoption)，或藥物治療，包括但不限於，皮質類固醇(corticosteroids)，如潑尼松龍(prednisolone)，非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)，細胞毒性藥物(如，環磷醯胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、硫唑嘌呤(azathioprine))，免疫抑制劑(如，環孢靈素(cyclosporine)、馬替麥考酚酯(Mycophenolate Mofetil))，或血管擴張劑(如，血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE inhibitor))等。在一具體實例中，藥物或治療方式之併用可同時(並行)或依序施用。藥物之併用可將藥物混合於相同劑型，或分別置於不同劑型中，如分開的膠囊、片劑、錠劑、注射劑。

根據本發明，蛇床子素或含有蛇床子素為活性成分之組合物可直接投予個體，或製備成藥劑，或作為食品添加物添加至食品中。在使用上，蛇床子素無細胞毒性，可供患者服用或添加於飲食中，簡單達成治 療或減緩病徵之護腎功效。

現參考以下具體實施例更明確地描述本發明，其目的為用以說明而非作為限制。

實例

1. 材料及方法

1.1 局部腎絲球硬化動物模型

使用雌性BALB/c小鼠建立局部腎絲球硬化動物模型。於小鼠8週大時，將之分為3組，其中1組於尾部靜脈注射一般生理食鹽水作為正常控制組，病理對照組及蛇床子素處理組則於尾部靜脈注射給予單一劑量0.1mg/10g體重之艾黴素(Adriamycin)誘發小鼠局部腎絲球硬化症，其中蛇床子素處理組於誘發疾病前6小時以腹腔注射方式每日給予30mg/kg體重之蛇床子素，靜脈注射艾黴素後，持續以腹腔注射方式每日給予30mg/kg體重之蛇床子素直至犧牲日，病理對照組則每日以腹腔注射方式給予安慰劑。在第3、7、14、21日以代謝籠收集小鼠尿液，並分別於誘發疾病後第7及28天予以犧牲，收取腎臟(皮質組織)、脾臟及血清進行後續分析。

1.2 蛇床子素

蛇床子素係由蛇床(C.monnieri)的種子萃取而得(J.Agric.Food Chem.2010,58,10445-10451)，使用95%(v/v)酒精萃取種子，濃縮後再溶於酒精，並以高效能液相層析(HPLC)純化，獲得純化的蛇床子素。

1.3 尿液及腎功能分析

以代謝籠收集小鼠尿液，先以試紙檢測蛋白尿，隨後以蛋白質濃度分析套組(BCA Protein Assay Kit,PIERCE)測量蛋白濃度，尿蛋白指數以24小時蛋白尿(尿液蛋白質濃度/尿液肌酸酐濃度)來表示。此外，經眼窩收集血液，分離後取得血清檢體，吸至檢驗試片(Fuji Ori-Chem Slide)並經儀器測量(Fuji Photo Film Co.,Tokyo,Japan)讀取數據。

1.4 病理分析

製備經福馬林固定及石蠟包埋之腎臟切片，以蘇木紫(Hematoxylin,Surgipath Co.,USA)與伊紅(Eosin,Surgipath Co.,U.S.A) 染色，封片完置於光學顯微鏡下觀察，進行病理分析及腎損傷評分。為評估腎絲球之上皮增生病變(epithelial hyperplasia lesion,EPHL)及硬化現象(sclerosis)，於每一隻小鼠之腎臟組織至少取50個腎絲球進行評估。

此外，亦進行免疫組織化學分析(IHC)，在腎臟切片上，以針對小鼠F4/80(Serotec,NC,USA)、NF-κB p65(Cell Signaling Technology,USA)及膠原蛋白IV(Collagen IV,Southern Biotech,USA)之初級抗體，接著以生物素化之二級抗體(Dako,Glostrup,Denmark)及卵白素-生物素-過氧化酶複合物(Dako)放大訊號以進行偵測。以Pax-it影像分析軟體量化染色結果(Paxcam,IL,USA)。

1.5 腎臟組織蛋白抽取及西方墨點轉漬法

使用核蛋白萃取套組(Active Motif,USA)依據生產商指示由腎臟組織水解物中萃取細胞質及細胞核蛋白質。將蛋白萃取物以電泳分離並經轉漬後，使用針對小鼠Nrf2(Santa Cruz,USA)、COX-2(Santa Cruz,USA)、凋亡酶-3(Cell Signaling,USA)、凋亡酶-9(Cell Signaling,USA)之初級抗體以西方墨點分析量測目標蛋白質，使用組蛋白H3(Cell Signaling,USA)及β-肌動蛋白(Santa Cruz,USA)之抗體分別作為細胞核及細胞質之內部對照，加入二級抗體，最後以冷光反應壓片。

1.6 酵素連結免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay)

依據製造商(R&D,U.S.A.,Active Motif)附上之標準流程測定小鼠腎臟組織中的PGE2及HO-1的含量。

1.7 Gpx酵素活性分析

以市售的穀胱甘鈦過氧化酶(glutathione peroxidase，Gpx)分析套組，依據製造商(Cayman,MI,USA)附上之標準流程測定小鼠腎臟組織中的Gpx酵素活性。

1.8 測量反應性氧化物(ROS)

以亮光素(Lucigenin)與尿液與血清中之反應性氧化物進行反應，並以微量冷光儀(Hidex microplate luminometer,Finland)偵測，以每毫克乾重每15分鐘之活性激光單位(RLU)(亦即RLU/15分/mg乾重) 表示。腎臟組織中之反應性氧化物以二氫乙啶(DHE)標定法測定，藉由計數每個腎臟橫切面總細胞核中陽性細胞核百分比來定量螢光影像。

1.9 測量腎臟組織之細胞凋亡

以TUNEL法(末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端标记，Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)進行腎臟組織細胞凋亡分析，製備經福馬林固定及石蠟包埋之腎臟切片，使用市售套組(ApopTaq Plus Peroxidase in Situ Apoptosis Detection kit，Chemicon,USA)依據生產商指示藉由TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)酵素將鏈接毛地黃素(digoxigenin)之dUTPs標定於DNA斷裂端點處，接續以鏈接HRP之抗毛地黃素抗體放大訊號並以DAB呈色。

1.10 統計分析

結果係以平均值±SEM表示。兩個組別間之比較係使用ANOVA或學生氏t試驗進行。小於0.05之p值被認為在統計上具有顯著性。

2. 結果

2.1 蛇床子素改善局部腎絲球硬化小鼠之腎病症候群病徵(蛋白尿及腎功能評估)

為分析蛇床子素對於局部腎絲球硬化症小鼠之影響，持續觀察各組小鼠之尿蛋白及腎功能指數之變化，其結果如圖1(A)至(C)所示。以艾黴素誘發局部腎絲球硬化之病理對照組小鼠，自第7天開始顯現尿液蛋白質濃度上升之現象，並且持續上升至第28天，然而蛇床子素治療可幾乎完全抑制此現象，其尿液蛋白質濃度與正常控制組小鼠相當。此外，血清尿素氮(BUN)及血清肌酸酐(Cr)之分析亦顯示病理對照組小鼠血清尿素氮及肌酸酐之顯著上升(第28天)，相較於此，蛇床子素處理組具有顯著較低的血清尿素氮及血清肌酸酐濃度，其血清濃度分別與正常控制組相當。

這些結果顯示蛇床子素可明顯降低腎絲球硬化小鼠之蛋白尿並改善腎功能。

2.2 蛇床子素改善局部腎絲球硬化小鼠之腎組織病變情形

2.2.1 形態學變化

以腎臟切片進行組織病理學檢驗，可觀察到病理對照組於疾病誘發後第7天，腎絲球開始顯現胞外基質增生及玻璃樣物之沉積，到了第28天則產生明顯的硬化損傷。此外，於誘發疾病後第28天，病理檢驗顯示顯著比例之腎絲球呈現上皮增生病變(EPHL)，且腎絲球之周圍顯現大量單核白血球之浸潤(Peri-glomerular mononuclear leukocyte infiltration)，代表疾病進程之惡化。相較於此，投予蛇床子素可顯著抑制腎絲球硬化之疾病進程，如圖2(A)、(B)及(C)所示。

2.2.2 纖維化評估

局部腎絲球硬化症是腎絲球硬化、纖維化之腎臟疾病，因此以第IV型膠原蛋白之組織免疫染色及Sirius red染色評估腎臟纖維化。圖3(A)、(B)及(C)顯示第IV型膠原蛋白免疫染色之結果，顯示投予蛇床子素可顯著抑制腎絲球組織第IV型膠原蛋白之表現，表現量與正常控制組相當。另一方面，如圖4(A)、(B)及(C)所示，天狼星紅染色結果顯示於疾病誘發第28天後產生顯著纖維化現象，相對於此蛇床子素可抑制腎臟組織之纖維化，與正常控制組相當。

這些結果顯示蛇床子素可明顯降低腎絲球硬化小鼠之腎臟纖維化現象。

2.3 蛇床子素經由Nrf2路徑降低腎臟活性氧化物

為分析蛇床子素之抗氧化活性，測量血清或腎臟組織中反應性氧化物(ROS)含量，並以西方墨點法分析抗氧化訊息傳遞路徑之活化。如圖5(A)至(B)所示，於誘發疾病後28天，病理對照組中無論血清或腎臟組織皆可偵測到大量過氧化物陰離子之產生，顯示高度之氧化壓力，但投予蛇床子素之小鼠則顯著抑制此現象。進一步分析抗氧化訊息傳遞路徑之活化，分別偵測Nrf2之入核作用、HO-1表現量以及GPx活性，如圖6(A)、(B)、(C)及(D)所示，發現相較於病理控制組，投予蛇床子素可顯著增加Nrf2之入核作用，以及病理對照組之腎臟組織中GPx活性顯著降低，投予蛇床子素可顯著增加HO-1表現量以及GPx活性(圖5(A)、(B)及(C))。

這些結果顯示蛇床子素可經由Nrf2路徑降低腎絲球硬化小 鼠之ROS表現。

2.4 蛇床子素降低發炎細胞浸潤及發炎反應

以F4/80免疫染色偵測腎臟組織中單核球/巨噬細胞浸潤之情形。如圖7(A)、(B)及(C)所示，於誘發疾病後第28天，可於腎絲球及其周圍間質觀察到單核球/巨噬細胞之大量浸潤，但投予蛇床子素之小鼠腎臟組織，細胞浸潤情形顯著下降，與正常控制組相當。

進一步以組織免疫染色探討NF-κB於腎臟組織活化的狀態，如圖8(A)、(B)及(C)所示，相較於正常控制組，於誘發疾病後第28天，病理對照組顯示出顯著的NF-κB p65入核作用(nuclear translocation)，代表發炎反應之活化，然此現象可為蛇床子素所抑制。

接著，分析COX-2及PGE2蛋白質表現量以評估腎臟之發炎反應。如圖9(A)、(B)及(C)所示，於誘發疾病後28天，疾病對照組之COX-2及PGE2蛋白質表現量皆顯著提升，而投予蛇床子素後該些蛋白質之表現量明顯下降，回復至與正常控制組相當。

這些結果顯示蛇床子素抑制腎臟組織之發炎細胞浸潤及發炎反應。

2.5 蛇床子素抑制抑制腎組織細胞凋亡

腎絲球組織之細胞凋亡已知為局部腎絲球硬化症惡化原因之一，其伴隨胞外基質之產生與沉澱，造成不可逆之生理變化。此處探討蛇床子素對於腎絲球細胞凋亡之影響。以TUNEL染色評估腎臟組織細胞凋亡情形，圖10(A)、(B)及(C)之結果顯示誘發疾病後28天腎臟組織出現大量細胞凋亡，而投予蛇床子素可抑制此現象，其腎臟組織之染色表現與正常控制組相當。

進一步分析蛇床子素抑制細胞凋亡之分子機制，以西方墨點分析偵測凋亡酶-3、凋亡酶-8、凋亡酶-9之表現量。凋亡酶-8之表現量無明顯差異(數據未顯示)。圖11(A)、(B)至(C)之分析結果顯示，病理對照組之小鼠腎臟組織中活化態之凋亡酶-3及凋亡酶-9(p17及p37片段)之表現量隨疾病進程顯著上升，投予蛇床子素可顯著抑制該等蛋白之表現量。

這些結果顯示蛇床子素降低活化態之凋亡酶-9及凋亡酶-3 之表現而減少細胞凋亡情形。

3. 結論

本發明非可預期地發現將蛇床子素投予局部腎絲球硬化症之小鼠，可顯著抑制該疾病之進展，包括降低蛋白尿、改善腎功能、減少發炎細胞的浸潤及組織纖維化與硬化情形。在機制的探討上，蛇床子素涉及經由Nrf2及其下游基因降低氧化壓力，透過NF-kB降低發炎現象，以及降低凋亡酶-9及凋亡酶-3而減少細胞凋亡情形。

因此，本發明提出蛇床子素具有治療局部腎絲球硬化症及減緩其病徵之優異護腎效果。根據本發明，蛇床子素可作為藥物，其可與現有藥物併用，以降低藥物劑量減少副作用。

咸信本發明所屬技藝中具一般知識者基於本文之敘述，無須進一步之例示即可將本發明應用至其最廣泛之範圍。因此，應了解此處所提供之敘述及申請專利範圍係供例示目的而非以任何方式限制本發明之範疇。

Claims (5)

1. 一種蛇床子素用於製備供治療局部腎絲球硬化症之組合物的用途。
2. 如請求項1之用途，其中該組合物可改善局部腎絲球硬化症之腎組織病變情形，包括降低腎絲球細胞外基質增生、玻璃樣物沉積、腎組織纖維化、上皮增生病變(EPHL)或淋巴球浸潤之情形。
3. 如請求項1之用途，其中該組合物可改善局部腎絲球硬化症之腎病症候群病徵，包括降低蛋白尿或血清尿素氮或血清肌酸酐之含量。
4. 如請求項1之用途，其中該組合物可與一或多種治療局部腎絲球硬化症之藥劑併用，該藥劑包括皮質類固醇、非類固醇抗發炎藥物、細胞毒性藥物或血管擴張劑。
5. 如請求項1之用途，其中該組合物可做為藥物。