TW201424746A

TW201424746A - 用以治療腸激躁症之山薑屬植物萃取物

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Publication number: TW201424746A
Application number: TW102148998A
Authority: TW
Inventors: Jui-Ching Chen; Che-Yi Lin; Chih-Sheng Hung; Pei-Fan Wu; Fen Chen
Original assignee: Medical & Pharm Ind Tech & Dev
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2014-07-01
Also published as: JP6062065B2; CN104902890B; US20150306167A1; WO2014101873A1; JP2016504341A; CN104902890A; DE112013006260T5; TWI472335B

Abstract

在此揭示山薑屬(Alpinia spp.)植物萃取物的用途，其係用於製備一種可供治療腸激躁症之藥物。所述萃取物係萃取自山薑屬植物之新鮮及/或乾燥果實，並使用如超臨界流體、水、10-95%(體積%)乙醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷等溶劑來進行萃取，以得到適用於製備腸激躁症藥物之萃取物。在某些實施方式中，由山薑屬植物之水萃取物中，分離出具有改善排便異常和/或改善腹痛/腹部不適之活性化合物；因此該些化合物為具有發展潛力的先導化合物，可用以製備治療腸激躁症之藥物。

Description

用以治療腸激躁症之山薑屬植物萃取物

本揭示內容是有關於治療腸激躁症(Irritable Bowel Syndrome,IBS)。更具體而言，本發明係有關於以山薑屬植物萃取物來製造一種可供治療腸激躁症之藥物的用途。

腸激躁症是一種常見的功能性腸胃疾病，其無法由異常的生理數值來進行診斷。腸激躁症是腸道運動反應量出現差異加上對刺激或自發性收縮敏感度增加後的結果。因此，腸激躁症又名痙攣性腸症候群(spastic bowl syndrome)、黏液性腸症候群(mucous bowl syndrome)或神經性腸症候群(nervous bowl syndrome)；然而，腸激躁症與痙攣性結腸炎(spastic colitis)或潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)(例如，克隆氏病(Crohn’s disease))乃屬不同之疾病。此外，其他常見的腸激躁症別名還包括過敏性大腸、大腸躁鬱症、大腸急躁症、腸躁症、刺激性腸症候群、急躁性腸症候群、腸躁症候群等。

依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所頒佈之「腸激躁症臨床試驗評估藥物治療效果(Irritable Bowel Syndrome-Clinical Evaluation of Drugs for Treatment)」，腸激躁症的兩種主要病徵為排便異常(abnormal defecation)及腹痛/腹部不適(abdominal pain or discomfort)。因此，唯有能同時改善或減緩病人排便異常及腹痛/腹部不適之化合物或組合物，才是合格有效可用來治療患有腸激躁症病患之化合物或組合物。

目前治療腸激躁症的治療藥物包括第3型5- 羥基色胺受體拮抗劑(5-Hydroxytryptamine 3 receptor antagonist,5-HT₃)(例如，昂丹司瓊(ondansetron)、阿洛司瓊(alosetron)、西蘭司瓊(cilansetron)及/或格拉司瓊(granisetron))、第4型5-羥基色胺受體促效劑(5-Hydroxytryptamine 4 receptor agonist,5-HT₄)(例如，替加色羅(tegaserod))、鎮痙劑(antispasmodic agents)、肌肉鬆弛劑(muscle relaxant)及三環抗抑鬱劑(tricyclic antidepressants)。其中，阿洛司瓊約有50%的腸激躁症臨床症狀改善率，但可能導致30-35%的便秘及發生缺血性結腸炎(ischemia colitis)這類嚴重副作用。5-HT₄受體促效劑-替加色羅的治療效果有限，且因會增加心臟病風險而於2007年經美國食品藥物管理局裁決後下市。

有鑑於此，相關領域亟需提出一種用以治療腸激躁症之新方法及/或藥劑。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施方式的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。

本揭示內容部份係基於發明人首度發現山薑屬植物萃取物可作為一種有效藥劑，其係用以治療經診斷或疑似患有腸激躁症之個體。因此，本發明的一態樣是有關於利用山薑屬植物萃取物來備製一種能治療患有腸激躁症之個體的藥物，其中該藥物可有效治療腸激躁症之排便異常及腹痛/腹部不適的病徵。

依據本發明的實施方式，山薑屬植物可以是益智仁(Alpinia oxyphylla)、月桃(Alpinia zerumbet)、草荳蔻(Alpinia hainanensis)或紅荳蔻(Alpinia galanga)。山薑屬植物萃取物是由山薑屬植物之植物部份所製得，具體而言，是由山薑屬植物之新鮮或乾燥果實所製得。

依據本發明的實施方式，山薑屬植物萃取物之製備方法包含以下步驟：(a)利用一第一溶劑來萃取山薑屬植物，其中該第一溶劑是選自由一超臨界流體(supercritical fluid,SFC)、水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷所組成之群組；以及(b)將步驟(a)所得之萃取物進行乾燥處理。

依據本揭示內容之某些實施方式，該第一溶劑為超臨界流體，其係選自由二氧化碳、水、甲烷、乙烷、丙烷、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇及丙酮所組成之群組。在一實施例中，超臨界流體為液態的二氧化碳。依據本揭示內容之其他實施方式，該方法更可包含一種超臨界流體之共溶劑(co-solvent)。該共溶劑可以是甲醇或乙醇。

依據本揭示內容的選擇性實施方式，該方法更可包含步驟(a-1)：在執行步驟(b)前，加入一第二溶劑至萃取物中，該第二溶劑可以是水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷。在一實施例中，該第一溶劑為水，而該第二溶劑為95%(體積%)乙醇。

在某些實施方式中，該方法更可包含步驟 (a-2)：在執行步驟(b)前，對步驟(a-1)之萃取物進行管柱層析(column chromatography)。

在其他實施方式中，該方法更可包含步驟(c)：將步驟(b)所得之冷凍乾燥產物溶於一第二溶劑中，該第二溶劑可以是水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；以及步驟(d)：將步驟(c)所得之產物進行濃縮或乾燥處理。

在第一溶劑為50%(體積%)乙醇且第二溶劑為95%(體積%)乙醇的實施例中，該方法更包含步驟(e)：在執行步驟(d)前，對步驟(c)之溶液進行管柱層析，其係依序以20%(體積%)乙醇、95%(體積%)乙醇及丙酮來洗提該管柱。

在第一溶劑為水且第二溶劑為95%(體積%) 乙醇的實施例中，該方法更包含步驟(f)：在執行步驟(d)前，對步驟(c)之溶液進行管柱層析，其係依序以正己烷、乙酸乙酯及70-80%(體積%)乙醇來洗提該管柱。

依據本揭示內容的實施方式，可以將步驟(b) 及(d)之產物，以及由管柱層析所收集之洗出物進行濃縮或乾燥，以作為一種供以治療腸激躁症之藥物。

本發明的另一態樣是有關於一種治療腸激躁症的方法，其係對一有需要的個體施予一有效量之本發明的山薑屬植物萃取物，特別是山薑屬植物的水萃物(water extract)，來治療腸激躁症之排便異常及腹痛/腹部不適的病徵。

依據本揭示內容的實施方式，益智仁萃取物包含香科酮(teucrenone)或伊砂黄素(isalpinin)；以及至少一種選自下列群組的活性化合物：由(4S,5S,6R)-5,6-二羥基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氫萘-1-酮((4S,5S,6R)-5,6-dihydroxy-6-methyl-4-propan-2-yl-2,3,4,5,7,8-hexahydronaphthalen-1-one(或稱oxyphellenodiol A)、6-α-羥基-7-表-α-莎草酮(6-α-hydroxy-7-epi-α-cyperone)、7-表-香科酮(7-epi-teucrenone)、及甲金黃酮(tectochrysin)所組成之群組。

在由山薑屬植物萃取物(特別是益智仁萃取物)所分離出的化合物中，有六種已被證實具有治療腸激躁症典型病徵(即伴隨排便改變之腹痛/腹部不適的功效；因此該些化合物為具有發展潛力的先導化合物，可作為一種用以製備治療腸激躁症之藥物的活性劑。依據本揭示內容之特定實施方式，(4S,5S,6R)-5,6-二羥基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氫萘-1-酮、6-α-羥基-7-表-α-莎草酮、7-表-香科酮、香科酮及甲金黃酮分別具有抗排便異常之活性；而香科酮及伊砂黄素則被證實具有抗腹痛/腹部不適之活性(anti-abdominal pain or discomfort activity)。因此，香科酮或伊砂黄素，再加上至少一種選自由(4S,5S,6R)-5,6-二羥基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氫萘-1-酮、6-α-羥基-7-表-α-莎草酮、7-表-香科酮、及甲金黃酮所組成之群組的化合物，可製成一種能治療腸激躁症之病徵的萃取物。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他特徵、態樣及優點能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例1.1.2之精製水萃物(refined water extract)與劑量-相關(dose-dependent)之抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第1B圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例1.1.2之精製水萃物抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第1C圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.1.3之精製水萃物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第1D圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.1.3之精製水萃物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第1E圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.1.1.1之水萃膏(water extract paste)及實施例1.2.1.1之乙醇萃膏(ethanol extract paste)的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第1F圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.1.1.1之水萃膏及實施例1.2.1.1之乙醇萃膏的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第2A圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例1.1.1.1之水萃膏與劑量-相關之抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中每組老鼠為10隻，而*表示p<0.05；第2B圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例1.1.1.1之水萃膏與劑量-相關的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第2C圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例1.2.1.1之乙醇萃膏與劑量-相關之抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第2D圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例1.2.1.1之乙醇萃膏與劑量-相關之抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第2E圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.1.1.1之水萃膏及實施例1.2.1.1之乙醇萃膏的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第2F圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.1.1.1之水萃膏及實施例1.2.1.1之乙醇萃膏的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第2G圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.1.1.1.1之精製水萃膏(refined water extract paste)的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第2H圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.1.1.1.1之精製水萃膏的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第2I圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.2.1.1.2之精製乙醇萃膏(refined ethanol extract paste)的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第2J圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.2.1.1.2之精製乙醇萃膏的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第2K圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.3.1之丙酮萃物(acetone extract)及實施例1.4.1之乙酸乙酯萃物(ethyl acetate extract)的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第2L圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.3.1之丙酮萃物及實施例1.4.1之乙酸乙酯萃物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第3A至3C圖為線性圖，其係依據本發明一實施方式來闡述(A)實施例1.1.2水萃膏(water extract pastes)、(B)實施例1.1.3水萃膏及(C)格拉司瓊的抗臟器過度敏感效果，其中*代表投予PDC-1850、PDC-1918或格拉司瓊與5-HTP的大鼠間具有顯著差異(p<0.05)，而#代表基線(baseline)與投予5-HTP的大鼠間具有顯著差異(p<0.05)；第4A及4B圖為線性圖，其係依據本發明一實施方式來闡述(A)30mg/kg及(B)100mg/kg之實施例1.1.1.1水萃膏的抗臟器過度敏感效果，其中*表示p<0.05，而#代表基線(baseline)與投予5-HTP的大鼠間具有顯著差異(p<0.05)；第4C圖為依據本發明一實施方式來闡述200mg/kg之實施例1.1.1.1.1精製水萃膏的抗臟器過度敏感效果線性圖；第5A、5B及5C圖為線性圖，其係依據本發明一實施方式來闡述(A)100mg/kg、(B)300mg/kg之實施例1.2.1.1乙醇萃膏，以及(C)10μg/kg格拉司瓊的抗臟器過度敏感效果，其中*表示p<0.05，而#代表基線(baseline)與投予5-HTP的大鼠間具有顯著差異(p<0.05)；第5D圖為依據本發明一實施方式來闡述100mg/kg之實施例1.2.1.1.2精製乙醇萃膏的抗臟器過度敏感效果線性圖；第6A及6B圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例1.3.1之丙酮萃物及實施例1.4.1之乙酸乙酯萃物的抗臟器過度敏感效果線性圖，其中每組老鼠為3隻，且此處繪示一特定老鼠之結果；第7A圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例2.1之水萃膏及實施例2.2之乙醇萃膏的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第7B圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例2.1之水萃膏及實施例2.2之乙醇萃膏的抗排便異常效果柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第8A及8B圖為線性圖，其係依據本發明一實施方式來分別闡述(A)實施例2.1水萃膏及(B)實施例2.2乙醇萃膏的抗臟器過度敏感效果，其中每組老鼠為2隻，且此處繪示一特定老鼠之結果；第9A圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例3.1.1之水萃粉末及3.1.2之水萃膏的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第9B圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例3.1.1之水萃粉末及3.1.2之水萃膏的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中每組老鼠為10隻，且*表示p<0.05；第9C圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例3.1.2之乙醇萃膏(即PDC-1885)的抗臟器過度敏感效果線性圖，其中每組老鼠為6隻，且*表示p<0.05，而#代表基線(baseline)與投予5-HTP的大鼠間具有顯著差異(p<0.05)；第10A圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例3.1.3之水萃膏及實施例3.2.1.1之乙醇萃物(ethanol extract)的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第10B圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例3.1.3之水萃膏及實施例3.2.1.1之乙醇萃物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第10C圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例3.1.3之水萃膏(即PDC-2469)的抗臟器過度敏感效果線性圖，其中每組老鼠為2隻；第10D圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例3.2.1.1之乙醇萃膏(即PDC-2470)的抗臟器過度敏感效果線性圖，其中每組有2隻老鼠，但此處繪示一特定老鼠之結果；第11A圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例4.1之水萃膏及實施例4.2之乙醇萃物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中*表示p<0.05；第11B圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例4.1之水萃膏及實施例4.2之乙醇萃物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中*表示p<0.05；第11C圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例4.1之水萃膏(即PDC-2473)的抗臟器過度敏感效果線性圖，其中每組有2隻老鼠，但此處繪示一特定老鼠之結果；第12A圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例5.1、5.2、5.3及5.4之化合物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中每組老鼠為5隻，且*表示p<0.05；第12B圖為依據本發明一實施方式來分別闡述實施例5.1、5.2、5.3及5.4之化合物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以30分鐘所排出之糞便量來表示，其中每組老鼠為5隻，且*表示p<0.05；第12C圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例5.5之化合物的抗排便異常效果的柱狀圖，其係以腹瀉分數來表示，其中每組老鼠為5隻，且*表示p<0.05；以及第12D圖為依據本發明一實施方式來闡述實施例5.5之化合物的抗腹痛效果柱狀圖，其係以30分鐘內所排出之糞便量來表示，其中每組老鼠為5隻，且*表示p<0.05。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型，同時，在此處「至少一」以及「一或多」等詞彙當包含一、二、三或更多種。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施方式的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

在此處「治療」(treatment)一詞包含部份或完全地預防、改善、減緩及/或管理腸激躁症之相關病徵(symptom)、次要病徵(secondary disorder)或症狀(condition)。「治療」(treating)一詞此處亦指施用或應用本發明之山薑屬植物萃取物至一患有腸激躁症病徵、症狀、腸激躁症次要病徵之個體或腸激躁症高危險群(predisposition)，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及/或降低一或多個腸激躁症病徵、症狀、或次要病徵之發生。腸激躁症之病徵、症狀及/或次要病徵，包含但不限於，腹痛/腹部不適(abdominal pain or discomfort)、排便頻率異常(abnormal stool frequency)、排便形態異常(abnormal stool consistency)、腹瀉和便秘。在此「治療」亦可以是施用至患有腸激躁症早期病徵或症狀之個體，以降低該個體病徵、次要病徵或相關症狀發展成為腸激躁症之風險。在此「治療」為可以有效地減少一個或多個病徵或臨床標記。換句話說，在此治療亦可以是降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展。

「有效量」(effective amount)一詞在此處係指一藥物的用量足以產生所欲的療效反應。具體的有效量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。習知技藝者可依據動物模式的劑量來計算藥物(如山薑屬植物萃取物或由此分離之化合物)的人體等效劑量(human equivalent dose,HED)。舉例來說，習知技藝者可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。

「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其係依據本揭示內容之方法，能接受山薑屬植物萃取物及/或由此分離之化合物的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性，且可以是任何年齡，例如兒童或成人。

在本說明書中，「新鮮」(fresh)一詞係指於採收後，尚未經過處理或僅經過最少處理(如，切段、切片及/或包裝)的植物部份，且亦未基於保藏之目的而經過大幅乾燥。此外，「新鮮」一詞不必然與採收時間有嚴格的相關性。反之，「新鮮」在此只是用來區隔經乾燥的植物部份以及未經乾燥的植物部份。

「乾燥」(dried)一詞在此係用來形容植物部份經脫水後的含水量情形，乾燥植物部份的含水量通常為1-20%(重量百分比)，較佳為約2-5%(重量百分比)。可利用任何習知的方法來進行乾燥，包括利用日曬(sun drying)、烘乾(oven drying)與冷凍乾燥(freeze drying)等方式。

「山薑屬植物萃取物」以及其他類似用語在此係指將山薑屬植物(特別是選自由益智仁、月桃、草荳蔻或紅荳蔻所組成之群組的山薑屬植物)和一溶劑接觸後，利用本文所述方法製得的混合物。當可想見，所述的萃取物包含了粗萃取物(crude extract)以及經處理、純化後的精製萃取物(refined extract)。更明確地說，粗萃取物是由簡單萃取所得的產物，其中所選的植物部分和至少一萃取劑(即，萃取溶劑)接觸。在可任選的情形中，之後可將所得的粗萃取物進行一或多種分離及/或純化處理，以得到精製萃取物。植物萃取物可以是液體形式(如，溶液、濃縮物或蒸餾物)，也可以是去除溶劑的固形物(如，膏、顆粒或粉末)。

本發明提供治療患有腸激躁症之個體的方法，以及供予實行該方法之藥物製劑或膳食補充劑。

本發明的一態樣是關於活性劑(active agents)的發現，該活性劑可有效治療腸激躁症，特別是減緩腸激躁症的相關病徵。「減緩」(ameliorating或ameliorate)一詞在此處係指能有效的治療腸激躁症之病徵或症狀，包含任何客觀或主觀參數，例如減輕(abatement)、減緩(remission)或減少(diminishing)病徵或可改善病人生理狀況(基於生理檢查之結果)。

依據本發明的實施方式，該方法包含施予一經診斷或疑似患有腸激躁症之個體一有效量的山薑屬植物萃取物或由此所純化之化合物。該個體可以利用Rome II或Rome III步驟，佐以病歷、生理檢查及基本關於腸激躁症的檢測，來診斷患有腸激躁症。

在某些實施方式中，山薑屬植物萃取物是經由口服途徑施予至個體。然而，本發明並不侷限於此。

依據本揭示內容的實施方式，適用於治療腸激躁症之山薑屬植物萃取物是依據實施例所闡述之步驟所製備。依據本揭示內容的實施例，將收集自山薑屬植物的植物部份，特別是果實的部份，切成碎片並以適當的溶劑萃取以得到粗萃取物。在本發明的某些實施方式中，是使用益智仁的新鮮或乾燥果實來製得本發明的萃取物。粗萃取物可依序經由濃縮及/或冷凍乾燥處理，以製成一粗萃取物粉末或膏(paste)。另外，亦可將產物進一步進行如管柱層析的純化或沈澱，以得到一精製萃取物或一純化的化合物。

適用於萃取山薑屬植物之例示性溶劑包含，但不限於超臨界流體(如二氧化碳、水、甲烷、乙烷、丙烷、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇及丙酮)、水、C₁至C₄醇(如甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、異丁醇及三丁醇(ter-butanol))、丙酮、乙酸乙酯及正己烷。依據本發明的某些實施方式，將山薑屬植物的新鮮或乾燥果實切碎後是以水進行萃取；而在其他實施方式中，則是以由水和10-95%(體積%)乙醇所組成的乙醇溶液進行萃取。舉例來說，該乙醇溶液可以是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90及95%(體積%)乙醇。在進一步的實施方式中，將山薑屬植物的新鮮或乾燥果實切碎後是以丙酮進行萃取。在更進一步的實施方式中，是使用乙酸乙酯作為萃取劑。依據本揭示內容的實施方式，將山薑屬植物的果實碎片與萃取劑以重量比約1：5至1：50之比例混合，其中該比例可以是1：5、1：7、1：9、1：10、1：12、1：15、1：17、1：20、1：22、1：25、1：27、1：30、1：32、1：35、1：37、1：40、1：42、1：45、1：47及1：50；較佳的比例約為1：10至1：35，如1：5、1：7、 1：10、1：15、1：20、1：22、1：25、1：27、1：30、1：32及1：35。在其他實施方式中，使用超臨界流體作為萃取劑，其係可以添加或不添加一如甲醇或乙醇之共溶劑。

在可任選的實施方式中，將粗萃取物過濾、濃縮及/或乾燥後，可供以作為一種治療腸激躁症之相關病徵的藥物。

在可任選的實施方式中，進一步將帶有相反極性之溶劑(如20-95%(體積%)乙醇)加入至粗水萃物(Crude Water Extract)等粗萃取物中，藉此產生一沈澱物。該上清液及/或沈澱物經濃縮及/或乾燥後，可供作為一種可治療腸激躁症之藥物。

在再一實施方式中，可將該些由粗水萃物所得到的乾燥上清液及/或沈澱物進一步利用管柱層析作純化。再將該管柱層析洗出物進行濃縮及乾燥處理，以製得一精製萃取物粉末，其係適於供製備一種可治療腸激躁症之藥物。適用於管柱層析之例示性的洗提液包含，但不限於水、10-95%(體積%)乙醇(其包含，但不限於10%、15%、20%、25%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%(體積%)乙醇)，以及丙酮。在一實施例中，依序以水、30%及95%乙醇來洗提該管柱。在另一實施例中，依序以20%、50%及95%乙醇來洗提該管柱。在其他實施例中，依序以20%及95%乙醇，以及丙酮來洗提該管柱。在再另一實施例中，依序以40%、70%及95%乙醇，以及丙酮來洗提該管柱。

本發明的另一態樣是有關於一化合物，其係由上述之山薑屬植物萃取物所分離出來，例如由益智仁的粗水萃膏(crude water extract paste)所分離。

依據本揭示內容的實施方式，對山薑屬植物萃取物進行一系列的管柱層析，例如矽膠層析(silica gel chromatography)及/或高效液體層析(high pressure liquid chromatography,HPLC)，並依據本揭示內容實施例所述之流程產生不同分餾(fraction)。之後對各分餾進行檢測且利用光譜分析來鑑定其中各活性化合物之結構，其中光譜分析包含但不限於質譜分析(Mass spectrometry,MS)、¹H-NMR及¹³C-NMR分析。再將鑑別出來的各分餾化合物進行是否能改善腸激躁症之相關病徵(即，排便異常及腹痛)的功能檢測。該些化合物為具有發展潛力之先導化合物，可供發展適用於治療腸激躁症之藥物。

在特定實施例中，所鑑別出來的化合物是選自以下群組：

本揭示內容因此是關於一種可供治療腸激躁症的醫藥組合物。在某些實施方式中，山薑屬植物萃取物或本揭示內容之活性化合物可以與醫藥上可接受的載體(carriers)或賦形劑(excipients)配製成醫藥組合物，其可以是固體、半固體或液體形式，例如錠片、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑和注射劑。因此，活性化合物可以經由不同途徑施予，包含口服、頰內(buccal)、直腸(rectal)、非口服(parenteral)及腹腔(intraperitoneal)等方式。在藥劑的形式上，山薑屬植物萃取物或活性化合物可以單獨或與其他已知的藥學活性劑合併施予以治療腸激躁症。各途徑所適用之不同藥劑型式為該技術領域習知技藝者所熟知的。需知在任何情況下，最佳施予途徑取決於疾病的本質或嚴重程度，或是治療的特定狀況。

在某些實施方式中，本揭示內容之藥學組合物是以固體劑型作口服施予。該些固體劑型可以是膠囊、密封袋、錠片、丸劑、錠劑、粉末或顆粒。在該些劑型中，將活性成分(如山薑屬植物萃取物或任一種上述化合物)與至少一種藥學上可接受之賦形劑混合。任何上述之固體劑型可選擇性地包含包衣(coatings)和殼層(shells)，例如腸溶包衣(enteric coatings)及用以改善任何成分之釋放率的包衣。該些包衣的範例為該技術領域所熟知的。在一實施例中，本揭示內容的醫藥組合物為錠片，例如快速釋放錠片(quick-release tablets)。在另一實施例中，本揭示內容的醫藥組合物配製為持續釋放劑型(sustained release forms)。在再另一實施方式中，本揭示內容的醫藥組合物為粉末，其係包覆於軟式及硬式明膠膠囊中。

在某些實施方式中，本揭示內容的醫藥組合物是以液體劑型作口服施予。液體劑型可以更包含一緩衝藥劑以維持一期望的pH值。亦可將液體劑型填充於軟式明膠膠囊中。舉例來說，液體可以包含一溶液、懸浮液、乳膠、微浮膠、沈澱物或任何期望的液體介質，其係帶有山薑屬植物萃取物或任何上述之化合物，或一藥學上可接受之衍生物、鹽類或其溶劑合物，或其組合。液體可加以設計來改善山薑屬植物萃取物或上述化合物之溶解度，以形成一包含藥物的乳膠或經釋放後的分散質(disperse phase)。

在某些實施方式中，本揭示內容的醫藥組合物是適用於非口腔施予的劑型，例如注射施予，其係包含但不限於皮下、彈丸注射(bolus injection)、肌肉、腹腔及靜脈注射。醫藥組合物可以配製成油性或水性的等張懸浮液、溶液或乳膠，且可以包含處方藥劑(formulatoary agents)，例如懸浮、穩定或分散藥劑。另外，組合物可以製成乾燥形式，例如粉末、晶體或冷凍乾燥的固體，並附與使用前為無菌且無熱原(pyrogen-free)的水或等張生理食鹽水。組合物亦可置於無菌的安瓶(ampoules)或小瓶(vials)中。

下文舉出多種實施例來闡明本發明之部分態樣，以使本發明所屬技術領域中具有通常知識者能藉以實踐本發明。因此不應將這些實施例視為對本發明範圍之限制。本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處提的說明，當可在不需過度推衍的情形下運用本發明。此處提及的所有文獻，皆視為已完全引用而成為本說明書的一部份。

實施例實施例1 製備益智仁萃取物 1.1 粗水萃物(Crude Water Extract)

將乾燥且切碎的益智仁(購買自海南，中國)果實以1：10比例與逆滲透(reverse osmotic，RO)水混合後，煮沸且迴流1小時，可得一粗萃取物。以350篩目的濾網過濾該粗萃取物，以濾除益智仁的部份。保留其濾液，並將益智仁的部份以相同方式進行另一水萃取後，合併兩次萃取濾液以得到一粗水萃物。

1.1.1 粗水萃粉末(Crude Water Extract Powders)(PDC-2014)

藉由冷凍乾燥來濃縮實施例1.1所述之粗水萃物，以得到粗水萃粉末(PDC-2014)。

1.1.1.1 水萃膏(Water Extract Paste)(PDC-2363)

進一步將95%(體積%)乙醇加至粗水萃粉末(PDC-2014)並過濾(2號濾紙)後，濃縮濾液至乾燥以得到一水萃膏(PDC-2363)。

1.1.1.1.1 精製水萃膏(Refined Water Extract Pastes)A(PDC-2529)及B(PDC-2530)

將20%(體積%)乙醇加至水萃膏(PDC-2363)後，注入HP-20大孔隙管柱(HP-20 Diaion column)以進行純化。依序以20%(體積)乙醇、95%(體積)乙醇及丙酮來洗提該管柱。將20%乙醇之洗出物進行濃縮，以得到一精製水萃膏A(PDC-2529)；分別收集且合併95%乙醇及丙酮之洗出物，以得到一精製水萃膏B(PDC-2530)。

1.1.2 精製水萃物(Refined Water Extract)(PDC-1850)

以1：1體積比將95%(體積)乙醇加至實施例1.1所述之粗水萃物，以350篩目的濾網過濾該混合物；將濾液進行離心、濃縮及冷凍乾燥以得到一精製水萃膏(PDC-1850)。

1.1.3 精製水萃物(PDC-1918)

以1：1體積比將95%(體積)乙醇加至實施例1.1所述之粗水萃物，並以350篩目的濾網過濾混合物；將濾液進行離心，且將體積濃縮至原體積之1/3。

以1：1體積比將水加至上述之濃縮水萃取物後，將混合物注入一HP-20大孔隙管柱(Diaion,Mitsubishi Chemistry Inc.)，其中濃縮物與乾燥管柱填充材料之重量比約為1：20。依序以3倍柱床體積之RO水、1倍柱床體積之30%(體積%)乙醇及3倍柱床體積之95%(體積)乙醇來洗提該管柱。分別收集且合併兩種乙醇洗出物。然後在減壓下濃縮該合併之洗出物，直至大致將乙醇移除後，冷凍乾燥殘留物以得到精製水萃膏(refined water extract pastes)(PDC-1918)。

1.2 粗乙醇萃物(Crude Ethanol Extract)

將乾燥且切碎的益智仁(購買自海南，中國)果實以1：10(體積%)的比例與50%(體積%)乙醇混合，煮沸且迴流1小時，以得到一粗乙醇萃物。以350篩目的濾網過濾該粗乙醇萃物，且將益智仁的果實部份以50%(體積%)乙醇再一次利用相同方式進行萃取後，收集且合併兩次濾液，以得到一粗乙醇萃物。

1.2.1 粗乙醇萃粉末(Crude Ethanol Extract Powders)(PDC-1941)

先以350篩目過濾實施例1.2所述之粗乙醇萃物，在減壓下濃縮該濾液，直至大致將溶劑移除後，再冷凍乾燥殘留物以得到粗乙醇萃粉末(PDC-1941)。

1.2.1.1 乙醇萃膏(Ethanol Extract Paste) (PDC-2364)

將95%乙醇加至實施例1.2.1所述之粗乙醇萃粉末且利用2號濾紙過濾，再濃縮乾燥該濾液以得到一乙醇萃膏(PDC-2364)。

1.2.1.1.1 精製乙醇萃膏(Refined Ethanol Extract Pastes)A(PDC-2371)、B(PDC-2372)、C(PDC-2373)及D(PDC-2374)

將40%(體積%)乙醇加至乙醇萃膏(PDC-2364)後，注入HP-20大孔隙管柱以進行純化。依序以40%(體積)乙醇、70%(體積)乙醇、95%(體積)乙醇及丙酮來洗提該管柱。分別收集40%及70%乙醇之洗出物後，進行濃縮及冷凍乾燥，以得到萃膏A(PDC-2371)及B(PDC-2372)；分別收集95%乙醇及丙酮之洗出物後，進行濃縮以得到精製萃膏C(PDC-2373)及D(PDC-2374)。

1.2.1.1.2 精製乙醇萃膏E(PDC-2531)及F(PDC-2532)

將20%(體積%)乙醇加至乙醇萃膏(PDC-2364)後，注入HP-20大孔隙管柱以更進一步進行純化。依序以20%(體積)及95%(體積)乙醇來洗提該管柱。分別濃縮該洗出物以得到精製萃膏E(PDC-2531)及F(PDC-2532)。

1.3 粗丙酮萃物(Crude Acetone Extract)

益智仁之粗丙酮萃物是依照實施例1.2所述之相似步驟所製備，除了將乙醇置換為丙酮。

1.3.1 粗丙酮萃膏(Crude Acetone Extract Pastes) (PDC-2479)

在減壓下，濃縮實施例1.3所述之粗丙酮萃物，直至大致將溶劑移除後，冷凍乾燥殘留物以得到粗丙酮萃膏。

1.4 粗乙酸乙酯萃物(Crude Ethyl Acetate Extract)

益智仁之乙酸乙酯粗萃物是依照實施例1.2所述之相似步驟所製備，除了將乙醇置換為乙酸乙酯。

1.4.1 粗乙酸乙酯萃膏(Crude Ethyl Acetate Extract Pastes)(PDC-2478)

在減壓下，濃縮實施例1.4所述之粗乙酸乙酯萃物，直至大致將溶劑移除後，冷凍乾燥殘留物以得到粗乙酸乙酯萃膏。

1.5 超臨界流體萃物(Supercritical Fluid Extract,SCF)

在此特定實施例中，益智仁是在超臨界溫度及壓力下，以含或不含改善之共溶劑(例如，乙醇)的超臨界流體(例，二氧化碳)來進行萃取。

1.5.1 SCF萃物A

將乾燥且切碎的益智仁果實置於壓力盤(pressure cell)，在低於5℃的溫度下打入液態二氧化碳至壓力盤的熱區(heating zone)，其中壓力及溫度分別設置為300巴(bar)及50℃。接著，依序擴充流體至第一及第二分離器(separators)，以將萃取物質由CO₂分離出，其中該第一及第二分離器的壓力及溫度分別設置為60及45巴，以及45及20℃。萃取過程約耗時150分鐘，且由此得到SCF萃物A。

1.5.2 SCF萃物B

SCF萃物B是依照實施例1.5.1所述之相似步驟所製成，除了在萃取流程中包含一共溶劑一乙醇；藉此得到一SCF萃物B。

實施例2 製備草荳蔻萃取物 2.1 水萃膏(PDC-2471)

草荳蔻之水萃膏是依序依照實施例1.1、1.1.1及1.1.1.1所述之相似步驟所製成。

2.2 乙醇萃膏(PDC-2472)

草荳蔻之粗乙醇萃物是依序依照實施例1.2、1.2.1及1.2.1.1所述之相似步驟所製成。

實施例3 製備紅荳蔻萃取物 3.1 粗水萃物

紅荳蔻之粗水萃物是依照實施例1.1所述之相似步驟所製成。

3.1.1 粗水萃粉末(PDC-2147)

在減壓下，濃縮實施例3.1所述之粗水萃物，直至得到一水萃粉末。

3.1.2 水萃膏(PDC-1885)

以1：1之體積比將95%(體積%)乙醇加至實施例3.1所述之粗水萃物，且形成一沈澱物。接著以 10,000rpm離心混合物5分鐘，以移除沈澱物。收集上清液，且在減壓下進一步進行離心，直至大致將溶劑移除。冷凍乾燥殘留物以得到水萃膏。

3.1.3 水萃膏(PDC-2469)

於實施例3.1.1所述之粗水萃粉分加入95%(體積%)乙醇(1公克的粉末於30毫升乙醇)，利用超音波震盪該混合液至少1小時，並以2號濾紙過濾，在減壓下濃縮該濾液以得到一水萃膏。

3.2 粗乙醇萃物

紅荳蔻之粗乙醇萃物是依照實施例1.2所述之相似步驟所製成。

3.2.1 粗乙醇萃粉末

在減壓下，濃縮實施例3.2所述之粗乙醇萃物，直至大致將溶劑移除，且冷凍乾燥殘留物以得到粗乙醇萃粉末。

3.2.1.1 乙醇萃膏(PDC-2470)

將95%乙醇加至實施例3.2.1所述之粗乙醇萃粉末且以2號濾紙過濾，接著濃縮該濾液至乾燥以得到一乙醇萃膏。

實施例4 製備月桃萃取物 4.1 水萃膏(PDC-2473)

月桃之粗水萃膏是依序依照實施例1.1、1.1.1及1.1.1.1所述之相似步驟所製成。

4.2 乙醇萃膏(PDC-2474)

月桃之乙醇萃膏是依序依照實施例1.2、1.2.1及1.2.1.1所述之相似步驟所製成。

實施例5 純化及鑑別實施例1之益智仁活性化合物

利用層析法分離及純化化合物，且藉由MS及NMR來確認及鑑別該些化合物個別之結構。

5.1 鑑別6-α-羥基-7-表-α-莎草酮(化合物PDC-2460)

將實施例1.1.1.1所述之水萃膏注入矽膠過濾(silica gel filtration，默克，台灣)，再以正己烷及乙酸乙酯來洗提該管柱，由此可得到7個分餾部分(FR-1、FR-2、FR-3、FR-4、FR-5、FR-6及FR-7)。接著將7個分餾部分中的第二分餾部分(即FR-2)注入RP-18膠管柱(RP-18 gel column，默克，台灣)，且以80%甲醇來洗提該管柱，由此可再得到6個分餾部分(FR-21、FR-22、FR-23、FR-24、FR-25及FR-26)。合併分餾FR-25及FR-1部分後，將該合併分餾部分注入另一RP-18膠管柱，且以80%甲醇來洗提該管柱以製得另外3個分餾部分(FR-25(1)1、FR-25(1)2及FR-25(1)3)。將FR-25(1)2分餾部分注入另一矽膠純化以產生另外5個分餾部分(FR-25(1)21、FR-25(1)22、FR-25(1)23、FR-25(1)24及 FR-25(1)25)。以製備型HPLC分析(preparative HPLC analysis)由第三分餾部分(FR-25(1)23)來純化出化合物PDC-2460。

MS：分子量(Mw.)234(Bruker MS)[M-H]^-(233).(C₁₅H₂₂O₂)

¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 1.60(1H,m,H-1)、1.83(1H,m,H-1)、2.42(1H,m,H-2)、2.62(1H,m,H-2)、4.90(1H,s,H-6)、2.53(1H,br,s,H-7)、1.52(1H,m,H-8)、2.19(1H,m,H-8)、1.35(1H,m,H-9)、1.47(1H,m,H-9)、4.38(1H,s,H-12)、4.81(1H,s,H-12)、1.73(3H,s,H-13)、1.38(3H,s,H-14)及1.88(3H,s,H-15)。

¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ 38.84(C-1)、34.17(C-2)、199.90(C-3)、132.11(C-4)、159.94(C-5)、69.60(C-6)、47.64(C-7)、18.57(C-8)、35.02(C-9)、35.03(C-10)、145.25(C-11)、111.46(C-12)、22.96(C-13)、25.72(C-14)、10.43(C-15)。

5.2 鑑別7-表-香科酮(化合物PDC-2453)

將實施例5.1所述之7個分餾部分中的第四分餾部分(即，FR-4)注入一RP-18膠管柱(默克，台灣)，且以70%甲醇洗提該管柱，可由此得到5個分餾部分(FR-41、FR-42、FR-43、FR-44及FR-45)。將FR-43分餾部分注入另一RP-18膠管柱，且以70%甲醇洗提該管柱，可再得到6個分餾部分(FR-431、FR-432、FR-433、FR-434、FR-435及FR-436)。合併FR-432及FR-433分餾部分後，將該合併分餾部分注入另一矽膠純化，以進一步得到7個分餾部分(FR-432(433)1、FR-432(433)2、FR-432(433)3、FR-432(433)4、FR-432(433)5、FR-432(433)6及FR-432(433)7)。以製備型HPLC分析由第四分餾部分(FR-432(433)4)中純化出化合物PDC-2453。

MS：Mw.234(Bruker MS)[M-H]^-(233).(C₁₅H₂₂O₂)

¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 2.10(1H,d,J=15Hz,H-1)、2.26(1H,d,J=15Hz,H-1)、5.86(1H,br,s,H-3)、2.28(1H,br,d,J=13Hz,H-5)、1.52(1H,m,H-6)、2.34(1H,m,H-6)、1.75(1H,m,H-8)、2.05(1H,m,H-8)、1.42(1H,m,H-9)、1.45(1H,m,H-9)、5.08(2H,br,s,H-12)、1.83(3H,s,H-13)、0.95(3H,s,H-14)、1.91(3H,s,H-15)。

¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ 54.09(C-1)、198.95(C-2)、126.92(C-3)、162.24(C-4)、44.87(C-5)、33.05(C-6)、74.69(C-7)、31.55(C-8)、37.63(C-9)、37.43(C-10)、146.02(C-11)、114.13(C-12)、18.63(C-13)、16.89(C-14)、21.96(C-15)。

5.3 鑑別香科酮(化合物PDC-2464)

將實施例5.1所述之7個分餾部分中的第三分餾部分(即，FR-3)注入一RP-18膠管柱(默克，台灣)，且以70%甲醇洗提該管柱，可由此得到6個分餾部分(FR-31、FR-32、FR-33、FR-34、FR-35及FR-36)。將FR-34分餾部分注入另一RP-18膠管柱，且以70%甲醇洗提該管柱，可再得到6個分餾部分(FR-341、FR-342、FR-343、FR-344、FR-345及FR-346)。合併FR-343及FR-4分餾部分後，將該合併分餾部分注入另一矽膠純化，以進一步得到7個分餾部分(FR-341(4)1、FR-341(4)2、FR-341(4)3、FR-341(4)4、FR-341(4)5、FR-341(4)6及FR-341(4)7)。將FR-341(4)4分餾部分注入另一以RP-18膠管柱，且以70%甲醇洗提該管柱，以製得另外的6各分餾部分(FR-341(4)41、FR-341(4)42、FR-341(4)43、FR-341(4)44、FR-341(4)45及FR-341(4)46)。再進一步將FR-341(4)44分餾部分注入矽膠純化，並以製備型HPLC由第六分餾部分(即，FR-341(4)46)純化出化合物PDC-2464。

MS：Mw.234(Bruker MS)[M-H]^-(233)(C₁₅H₂₂O₂)

¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 2.26(2H,d,J=3.5Hz,H-1)、5.88(1H,br,s,H-3)、2.93(1H,m,H-5)、1.64(1H,t,J=13.1Hz,H-6)、1.78(1H,m,H-6)、1.46(1H,m,H-8)、1.92(1H,m,H-8)、1.36(1H,m,H-9)、1.84(1H,m,H-9)、4.85(1H,t,J=1.4Hz,H-12)、5.07(1H,s,H-12)、1.83(3H,s,H-13)、0.87(3H,s,H-14)、1.83(3H, s,H-15)。

¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ 54.04(C-1)、199.12(C-2)、127.12(C-3)、163.27(C-4)、42.61(C-5)、33.42(C-6)、74.33(C-7)、30.89(C-8)、35.26(C-9)、37.12(C-10)、151.68(C-11)、109.51(C-12)、19.02(C-13)、15.80(C-14)、21.87(C-15)。

5.4 鑑別(4S,5S,6R)-5,6-二羥基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氫萘-1-酮(或稱Oxyphellenodiol A)(化合物PDC-2454)

將實施例5.1所述之7個分餾部分中的第四分餾部分(即，FR-4)注入一RP-18膠管柱，且以70%甲醇洗提該管柱，可由此得到5個分餾部分(FR-41、FR-42、FR-43、FR-44及FR-45)。將FR-44分餾部分注入另一RP-18膠管柱，且以70%甲醇洗提該管柱，可再得到5個分餾部分(FR-441、FR-442、FR-443、FR-444及FR-445)。以製備型HPLC由第二分餾部分(即，FR-442)中純化出化合物PDC-2454。

MS：Mw.238(Bruker MS)[M-H]^-(237)(C₁₄H₂₂O₃)

¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 2.18(1H,m,H-1)、2.45(1H,m,H-1)、1.63(1H,m,H-2)、1.75(1H,m, H-2)、4.15(1H,br,s,H-4)、2.60(1H,m,H-6)、1.92(2H,m,H-7)、2.26(1H,m,H-8)、2.45(1H,m,H-8)、2.18(H,m,H-11)、0.86(3H,d,J=6.9Hz,H-12)、1.02(3H,d,J=6.9Hz,H-13)、1.18(3H,s,H-14)。

¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ 21.40(C-1)、32.08(C-2)、72.31(C-3)、75.08(C-4)、157.81(C-5)、40.00(C-6)、22.21(C-7)、34.94(C-8)、199.95(C-9)、132.41(C-10)、29.76(C-11)、19.11(C-12)、21.53(C-13)、21.72(C-14)。

5.5 鑑別甲金黃酮(化合物PDC-2521)

將實施例5.1所述之7分餾中的第一分餾部分(即，FR-1)注入一RP-18膠管柱，且以75%甲醇洗提該管柱，可由此得到5個分餾部分(FR-11、FR-12、FR-13、FR-14及FR-15)。進一步以製備型HPLC分析FR-12分餾部分，可得到化合物PDC-2521。

MS：268(Bruker MS)[M+H]⁺(269)(C₁₆H₁₂O₄)

¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 6.66(1H,d,H-3)、6.36(1H,d,J=2.1Hz,H-6)、6.49(1H,d,J=2.1Hz,H-8)、7.87-7.89(1H,m,H-2’)、7.49-7.55(1H,m,H-3’)、7.49-7.55(1H,m,H-4’)、7.49-7.55(1H,m, H-5’)、7.87-7.89(1H,m,H-6’)、3.87(1H,s,OME)。

¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ 163.98(C-2)、105.83(C-3)、182.51(C-4)、162.10(C-5)、98.17(C-6)、165.55(C-7)、92.66(C-8)、157.75(C-9)、105.67(C-10)、131.24(C-1’)、126.28(C-2’)、129.08(C-3’)、131.85(C-4’)、129.08(C-5’)、126.28(C-6’)、55.82(OME)。

5.6 鑑別伊砂黄素(化合物PDC-2524)

將實施例5.1所述之7個分餾部分中的第一分餾部分(即，FR-1)注入一RP-18膠管柱，且以75%甲醇洗提該管柱，可由此得到5個分餾部分(FR-11、FR-12、FR-13、FR-14及FR-15)。進一步對FR-12分餾部分進行製備型HPLC分析，可以得到化合物PDC-2524。

MS：284(Bruker MS)[M+H]⁺(285)(C₁₆H₁₂O₅)

¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 6.36(1H,d,J=2.1Hz,H-6)、6.49(1H,d,J=2.1Hz,H-8)、8.19-8.17(1H,m,H-2’)、7.46-7.51(1H,m,H-3’)、7.46-7.51(1H,m,H-4’)、7.46-7.51(1H,m,H-5’)、8.19-8.17(1H,m,H-6’)、3.87(1H,s,OME)。

¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ 145.20(C-2)、136.54(C-3)、175.41(C-4)、160.74(C-5)、98.01(C-6)、 165.88(C-7)、92.18(C-8)、156.96(C-9)、103.97(C-10)、130.64(C-1’)、127.57(C-2’)、128.61(C-3’)、130.28(C-4’)、128.61(C-5’)、127.57(C-6’)、55.87(OME)。

實施例6 山薑屬植物萃取物有效治療由 dl-5-羥基色胺酸(dl-5-Hydroxytryptophan,5-HTP)所引發之排便異常及/或臟器過度敏感

在腸道神經系統中，血清素(serotonin)是一種主要且重要的單胺型神經傳導物(monoamine-type neurotransmitter)。體內有95%血清素表現於腸道中，其主要是由似腸親鉻細胞(enterochromaffin like cells,ECL cells)及腸道神經元所表現；其餘血清素則是表現於中樞神經系統中。血清素可以增加介於腸胃道及中樞神經系統間之內臟神經元的敏感度，且參與腸道的整合功能。由於血清素在腸激躁症中係為一種新興的神經傳導物質，本發明利用可轉化為血清素的dl-5-羥基色胺酸(dl-5-Hydroxytryptophan,5-HTP)作為腸激躁症之刺激劑(stimulant)，並以此來評估實施例1至4所述之山薑屬植物萃取物於治療腸激躁症之排便異常病徵的功效。同時，利用5-HTP作為刺激劑，亦可以腸激躁症發病之決定性因素-腹痛/腹部不適，以及動物體所表現的行為反應，來評估實施例1至4所述之山薑屬植物萃取物於治療腸激躁症之腹痛/腹部不適病徵的功效。

實驗流程通過台灣汎球藥理股份有限公司研究所、陽明大學與輔仁大學的動物管理及使用委員會的核准，並遵循國家動物保護相關規範。

評估由5-HTP所引發腹瀉及/或排便異常之動物模式

雄性ICR小鼠(樂斯科公司，台灣)飼育於有溫度與濕度控制的飼養籠中，飼養溫度約22℃至24℃，濕度約40%至50%，光暗循環為12小時。在試驗開始時，每一隻小鼠的體重約為30至34克。試驗過程中提供飲水與標準囓齒類飼料供任意取食。

每組小鼠為10隻，且於第一天口服施予測試組老鼠二劑本發明之山薑屬植物萃取物(即500mg/kg、1,000mg/kg或2,000mg/kg)，而於第二天施予第三劑；另外於施予第三劑山薑屬植物萃取物60分鐘後，施予一劑5-HTP(腹腔注射，10mg/kg)。在某些情況下，是以腹腔注射來取代口服方式來施予本發明之山薑屬植物萃取物。為比對目的，於施予5-HTP之30分鐘前分別給予對照組動物一劑鹽酸樂必寧(loperamide hydrochloride)(口服，2mg/kg)、鹽酸昂丹司瓊(ondansteron hydrochloride)(口服，2mg/kg)或鹽酸格拉司瓊(graniserton hydrochloride)(口服，2mg/kg)。於5-HTP注射30分鐘後，觀察各動物的排便狀況，並依此記錄30分鐘的排便數量及腹瀉分數。腹瀉分數是以由0至3的分數表來描述糞便的黏稠度，其中0代表糞便為固體狀，1代表糞便為鬆散狀，2代表糞便為部份液體狀，及3代表糞便為水狀。

評估由5-HTP所引發臟器過度敏感之動物模式

雄性Sprague-Dawley大鼠(樂斯科公司，台灣) 飼育於有溫度與濕度控制的飼養籠中，飼養溫度約22℃至24℃，濕度約40%至50%，光暗循環為12小時。在試驗開始時，每一隻大鼠的體重約為200至350克。試驗過程中提供飲水與標準囓齒類飼料供任意取食。

除非另有說明，本實驗每一實驗組包括6隻大鼠，並在非空腹狀態下進行實驗，待測藥物與陽性對照藥物皆以口服方式或腹腔注射投予各組大鼠。於第一天，在乙醚麻醉下，將肌電圖(electromyogram,EMG)電極植入各老鼠的腹外斜肌(abdominal external oblique muscle)；之後予以6天術後恢復期。於第8天，以皮下注射方式施予各動物一劑5-HTP(10mg/kg)來引發臟器過度敏感，並進行結直腸擴張刺激(colorectal distentin,CRD)，以肌電圖(electromyogram,EMG)紀錄之。此外，對各載體組動物分別施用與實驗組相應的載體，其給藥方式與劑量和各相應的實驗組相同。

由屈肌反射異常(Abnormal Withdrawal Reflex,AWR)來評估慢性臟器過度敏感之動物模式

在此模式中，藉由測量AWR來研究行為反應，其中AWR是一種與內臟運動反射(visceromotor reflex)類似的不自主運動反射(involuntary motor reflex)。AWR是依刺激的強度來評分。

雄性Sprague-Dawley大鼠(樂斯科公司，台灣)飼育於有溫度與濕度控制的飼養籠中，飼養溫度約22℃至24℃，濕度約40%至50%，光暗循環為12小時。在試驗開始時，每一隻大鼠的體重約為200至為350克。試驗過程中提供飲水與標準囓齒類飼料供任意取食。除非另有說明，本實驗每一實驗組包括6隻大鼠，並在非空腹狀態下進行實驗，待測藥物與陽性對照藥物皆以口服方式或腹腔注射投予各組大鼠。

行為研究是依據前述流程來進行 (AL-CHAER et al.,Gastroenterology 2000,119：1276-1285)。簡言之，將大鼠置於小留西特(Lucite)隔間(20 x 8 x 8公分)之一高架有機玻璃平台(elevated Plexiglas platform)上，且容許試驗動物有充分的時間清醒及適應(1小時)。除非另有說明，實驗組每隻大鼠以腹腔注射方式施用5-HTP(10mg/kg)引發大鼠的臟器過度敏感，實驗動物出現動物行為模式AWR現象，AWR的測量是由遮盲觀察員(blinded observers)目測動物的反應及AWR的分數所組成，其中AWR之分數標準如下：0為沒有行為反應；1為無法移動，僅頭部能簡單動作；2為腹部肌肉輕度收縮，但無法由平台抬起腹部；3為腹部肌肉強力收縮，且可由平台抬起腹部；4為腹部肌肉劇烈收縮，且將身體拱起並抬起盆腔結構。行為測量是以二位不同的遮盲觀察員進行重複。

所有的結果皆表示成平均值±標準差；n為各組的動物隻數。以單向(one-way)ANOVA分析搭配杜納氏t檢定(Dunnett’s t test)來比較各組動物間的差異。當p值小於或等於0.05時代表具有統計上的顯著差異。

6.1 實施例1之益智仁可有效治療腸激躁症之排便異常及腹痛/腹部不適

第1圖及第2圖闡述了實施例1所述之益智仁於治療腸激躁症之排便異常的效果。分別藉由測量腹瀉分數及30分鐘內的糞便計數來評估其效果。如第1圖所示，相對於施予一鴉片類受體之致效劑(opioid receptor agonist)-樂必寧或一5-HT₃受體之拮抗劑(5-HT₃ receptor antagonist)-昂丹司瓊，口服施予一最小劑量(1,000mg/kg)之實施例1.1.2、1.1.3、1.1.1.1、1.1.1.1.1、1.2.1.1及1.2.1.1.2所述的水及乙醇萃取物，可有效治療腸激躁症之排便異常。當以腹腔施予的方式給予實施例1.1.1.1所述之益智仁萃取物時，可更顯注地改善腸激躁症的排便異常，其中一30mg/kg低劑量的施予即足以產生抗排便異常的作用，而100mg/kg的劑量則可展現一顯著的效果，其僅為口服施予的1/10劑量(第2A至2J圖)。相似地，益智仁的丙酮萃物或乙酸乙酯萃物亦能治療腸激躁症之排便異常(第2K及2L圖)。

在治療腸激躁症的相關病徵上，亦將實施例 1所述之萃取物的抗排便異常效果同時與另一常見之處方鎮痙劑-玫若雷(mepenzolate)進行比對，且實施例1.1.1.1及1.2.1.1所述之萃取物皆較玫若雷(50mg/kg，口服施予3次)更為有效地舒緩相關病徵(結果未顯示)。

第3至6圖闡述了實施例1所述之益智仁萃取物的抗臟器過度敏感效果。如第3圖及第4圖所述，實施例1.1.2之精製水萃膏(即PDC-1850)、實施例1.1.3之精製水萃膏(即PDC-1918)、實施例1.1.1.1之水萃膏(即PDC-2363)及實施例1.1.1.1.1之精製水萃膏(即PDC-2530) 皆能治療由5-HTP所引發的臟器過度敏感(即與載體組相比)，且其效果甚至較5-HT₃受體拮抗劑-格拉司瓊更為顯著。相似地，50%的益智仁乙醇萃物(即實施例1.2.1.1或PDC-2364及實施例1.2.1.1.2或PDC-2532)(第5A、5B及5D圖)，以及益智仁EA(即實施例1.4.1或PDC-2478)及丙酮萃物(即實施例1.3.1或PDC-2479)(第6A及6B圖)亦分別具有相同抗5-HTP所引發之臟器過度敏感的效果。

表1及表2總結以AWR分數所評估的行為反應。

如表1所示，施以實施例1.1.1.1水萃膏(即 PDC-2363)進行治療的大鼠，其AWR分數會顯著地低於對照組或接受格拉司瓊治療的大鼠。由此可證，實施例1.1.1.1的益智仁萃取物可有效治療5-HTP所引發的臟器過度敏感。

相似地，於表2中，施以實施例1.2.1.1.2精製乙醇萃膏(即PDC-2532)進行治療的大鼠，其AWR分數會顯著地低於該些對照組之大鼠。由此可證，實施例1.2.1.1.2的益智仁萃取物可有效地治療5-HTP所引發的臟器過度敏感。

綜觀以上，該些結果指出由上述方法所製備的益智仁萃取物，可用以治療腸激躁症的相關病徵，具體來說，是指排便異常及腹痛/腹部不適。

6.2 實施例2之草荳蔻萃取物可有效治療腸激躁症之排便異常及腹痛/腹部不適

依據上述之相似步驟來評估實施例2所述之草荳蔻萃取物於治療腸激躁之相關症病徵的效果。第7圖及第8圖闡述該些結果。於患有腸激躁症的動物中，相對於該些對照組，草荳蔻之水萃物(即PDC-2471)及乙醇萃物(即PDC-2472)皆能降低動物體之腹瀉分數及/或糞便量，以及由5-HTP所引發的臟器過度敏感(第8A及8B圖)。

6.3 實施例3之紅荳蔻萃取物可有效治療腸激躁症之排便異常及腹痛/腹部不適

第9圖及第10圖闡述了實施例3所述之紅荳蔻萃取物於治療腸激躁症之相關病徵的效果。於患有腸激躁症的動物中，相對於該些對照組，草荳蔻的水萃物(即PDC-2147及PDC-1885)能降低動物體之腹瀉分數及/或糞便量(可見於第9A及9B圖)，以及由5-HTP所引發的臟器過度敏感(第9C圖)。紅荳蔻之乙醇萃物亦展現相似的效果(第10圖)。

6.4 實施例4之月桃萃取物可有效治療腸激躁症之排便異常及腹痛/腹部不適

第11圖闡述了實施例4所述之月桃萃取物於治療腸激躁症之相關病徵的效果。於患有腸激躁症的動物中，相對於該些對照組，水萃物(即PDC-2473)及乙醇萃物(即PDC-2474)皆能降低動物體之腹瀉分數及/或糞便量(可見於第11A及11B圖)，以及由5-HTP所引發的臟器過度敏感(第11C圖)。

實施例7 實施例5之化合物能有效抑制腸激躁症之排便異常

利用實施例6所述之相似步驟來評估由實施例1.1.1.1益智仁水萃膏所分離且純化的化合物(即PDC-2363)之抗排便異常的效果。第12圖闡明該些結果。

純化的化合物PDC-2453、PDC-2454、PDC-2460及PDC-2464皆能抑制由5-HTP所引發之腹瀉(第12A圖)且減少糞便量(第12B圖)。化合物PDC-2521亦呈現相似之抗排便異常的效果(第12C及12D圖)。因此，該些化合物具有發展為治療腸激躁症之藥物的潛力。

實施例8 實施例5之化合物可有效治療腸激躁症之腹痛/腹部不適

藉由AWR分數所評估的動物行為反應，可探討實施例5所述之化合物抗臟器過度敏感效果，且表3總結該些結果。

如表3所示，施予實施例5.3之化合物(即 PDC-2464)或實施例5.6之化合物(即PDC-2524)的大鼠，其AWR分數顯著地低於對照組之大鼠。由此可證該些由益智仁所分離的活性化合物可有效治療與IBS相關的腹痛/腹部不適。

當可理解上述實施方式與實施例僅為例示，且熟習此技藝者可對齊進行各種修飾。上文提出之說明書、實施例與資料的目的在於使本說明書的結構完備，並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種山薑屬(Alpinia spp.)植物萃取物，包含：香科酮或伊砂黄素；以及至少一種選自以下之活性化合物：(4S,5S,6R)-5,6-二羥基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氫萘-1-酮、6-α-羥基-7-表-α-莎草酮、7-表-香科酮或甲金黃酮。
如請求項1所述之萃取物，其中該山薑屬植物可以是益智仁(Alpinia oxyphylla)、月桃(Alpinia zerumbet)、草荳蔻(Alpinia hainanensis)或紅荳蔻(Alpinia galanga)。
如請求項2所述之萃取物，其中該萃取物是由包含下述步驟的方法所製成：(a)以一第一溶劑萃取該山薑屬植物，其中該第一溶劑是選自由一超臨界流體、水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷所組成之群組；以及(b)乾燥步驟(a)之萃取物。
如請求項3所述之萃取物，其中該超臨界流體可以是二氧化碳、水、甲烷、乙烷、丙烷、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇或丙酮。
如請求項4所述之萃取物，其中該步驟(a)更包含一超臨界流體之共溶劑，該共溶劑為甲醇或乙醇。
如請求項3所述之萃取物，其中該第一溶劑可以是水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；且藉由將該山薑屬植物與該第一溶劑以重量比約為1：1至1：50的比例混合來進行萃取。
如請求項6所述之萃取物，其中該方法更包含下述步驟：(a-1)在執行步驟(b)前，加入一第二溶劑至該萃取物，該第二溶劑可以是水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷。
如請求項7所述之萃取物，其中該方法更包含下述步驟：(a-2)在執行步驟(b)前，對步驟(a-1)之萃取物進行管柱層析。
如請求項8所述之萃取物，其中該管柱層析係依序以水、30%(體積%)乙醇及95%(體積%)乙醇來洗提該管柱；且乾燥該洗出物以製備該萃取物。
如請求項3所述之萃取物，其中該方法更包含下述步驟： (c)將步驟(b)之冷凍乾燥產物溶於一第二溶劑中，該第二溶劑可以是水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；以及(d)濃縮或乾燥步驟(c)之產物。
如請求項10所述之萃取物，其中該第一溶劑為水，且該第二溶劑為95%(體積%)乙醇。
如請求項10所述之萃取物，其中該第一溶劑為50%(體積%)乙醇，且該第二溶劑為95%(體積%)乙醇。
如請求項12所述之萃取物，其中該方法更包含下述步驟：(e)在執行步驟(d)前，對步驟(c)之溶液進行管柱層析，其係依序以20%(體積%)乙醇、95%(體積%)乙醇及丙酮來洗提該管柱。
如請求項11所述之萃取物，其中該方法更包含下述步驟：(f)對步驟(d)之產物進行管柱層析，其係依序以正己烷、乙酸乙酯及70-80%(體積%)乙醇來洗提該管柱。
如請求項14所述之萃取物，其中步驟(f)之產物包含香科酮。
一種山薑屬(Alpinia spp.)植物萃取物之用途，其係可用來製造一種可治療腸激躁症之藥物，其中該山薑屬植物萃取物包含：香科酮或伊砂黄素；以及至少一種選自以下的活性化合物：(4S,5S,6R)-5,6-二羥基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氫萘-1-酮、6-α-羥基-7-表-α-莎草酮、7-表-香科酮或甲金黃酮。
如請求項16所述之用途，其中該山薑屬植物可以是益智仁(Alpinia oxyphylla)、月桃(Alpinia zerumbet)、草荳蔻(Alpinia hainanensis)或紅荳蔻(Alpinia galanga)。
如請求項17所述之用途，其中該萃取物是由包含下述步驟的方法所製成：(a)以一第一溶劑萃取該山薑屬植物，其中該第一溶劑是選自由一超臨界流體、水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷所組成之群組；以及(b)乾燥步驟(a)之萃取物。
如請求項18所述之用途，其中該超臨界流體可以是二氧化碳、水、甲烷、乙烷、丙烷、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇或丙酮。
如請求項19所述之用途，其中該步驟(a)更包含一超臨界流體之共溶劑，該共溶劑為甲醇或乙醇。
如請求項18所述之用途，其中該第一溶劑可以是水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；且藉由將該山薑屬植物與該第一溶劑以重量比約為1：1至1：50的比例混合來進行萃取。
如請求項21所述之用途，其中該方法更包含下述步驟：(a-1)在執行步驟(b)前，加入一第二溶劑至該萃取物，該第二溶劑可以是水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷。
如請求項22所述之用途，其中該方法更包含下述步驟：(a-2)在執行步驟(b)前，對步驟(a-1)之萃取物進行管柱層析。
如請求項23所述之用途，其中該管柱層析係依序以水、30%(體積%)乙醇及95%(體積%)乙醇來洗提該管柱；且乾燥該洗出物以製備該萃取物。
如請求項18所述之用途，其中該方法更包含下述步驟：(c)將步驟(b)之冷凍乾燥產物溶於一第二溶劑中，該第二溶劑可以是水、C₁至C₄醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；以及(d)濃縮或乾燥步驟(c)之產物。
如請求項25所述之用途，其中該第一溶劑為水，且該第二溶劑為95%(體積%)乙醇。
如請求項25所述之用途，其中該第一溶劑為50%(體積%)乙醇，且該第二溶劑為95%(體積%)乙醇。
如請求項27所述之用途，其中該方法更包含下述步驟：(e)在執行步驟(d)前，對步驟(c)之溶液進行管柱層析，其係依序以20%(體積%)乙醇、95%(體積%)乙醇及丙酮來洗提該管柱。
如請求項26所述之用途，其中該方法更包含下述步驟：(f)對步驟(d)之產物進行管柱層析，其係依序以正己烷、乙酸乙酯及70-80%(體積%)乙醇來洗提該管柱。
如請求項29所述之用途，其中步驟(f)之產物包含香科酮。